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1 Eine Einführung für Auszubildende in biologischen und chemischen Berufen High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Rüdiger Kuhnke v1.3, 14.4.2008

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Eine Einführung fürAuszubildende inbiologischen undchemischen Berufen

High Performance LiquidChromatography (HPLC)

Rüdiger Kuhnke

v1.3, 14.4.2008

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Übersicht

1. Analytische Chemie2. Prinzip der Chromatographie3. Die Komponenten einer HPLC-Anlage4. Detektion und Quantifizierung5. Reversed Phase HPLC6. Abschluß und Zusammenfassung

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Analytische Chemie

• Analyse und Analytik• Wie macht man eine Analyse?• Instrumentelle Analytik

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Analyse und AnalytikAnalyse:Ermittlung der Zusammensetzung von Stoffen und Stoffgemischen• Qualitative Analyse: Was ist in der Probe enthalten?• Quantitative Analyse: Wieviel von einer bestimmten Substanz ist in der Probe ent- halten?

Analytische Chemie (Analytik):Die Wissenschaft von der chemischen Ana- lyse: wie und mit welchen Mitteln wird eine Analyse durchgeführt?Entweder mit klassischen naßchemischen Methoden wie Gravimetrie, Titration etc. oder mit instrumenteller Analytik...

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Instrumentelle Analytik

Anwendung findet die HPLC in allen denkbaren Bereichen: Pharmazie, Lebensmittelchemie, Chemische Industrie, Petrochemie, Biochemische Analytik, forensische Biochemie, in der Medizin mit all ihren Teilbereichen etc.Es gibt kaum Substanzklassen, die nicht mit HPLC analysiert werden können, und ihre Anzahl wächst ständig.

•Optische Methoden, z. B. Spektroskopie

•Elektroanalytische Methoden, z. B. Elektrophorese

•Trennmethoden, z. B. Chromatographie

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Wie macht man eine Analyse?

1. Probenahme, Probenvorbereitung (z. B. Anreicherung, Aufschluß, Lösung)

2. Auftrennung in die (interessierenden) Komponenten

3. Identifizierung der gefundenen Komponenten (Qualitative Analyse)

4. Mengenbestimmung der gefundenen Komponenten (Quantitative Analyse)

Probenahme,Probenaufbereitung

Identifizierung

Trennung

Quantifizierung

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1. Einführung: Analytische Chemie2. Prinzip der Chromatographie3. Die Komponenten einer HPLC-Anlage4. Detektion und Quantifizierung5. Reversed Phase HPLC6. Abschluß und Zusammenfassung

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Prinzip der Chromatographie

• Chromatographische Trennung• Zentrale Begriffe: mobile und stationäre

Phase, Probe

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Chromatographische Trennung

Ein einfacher Versuch zur Chromatographie ist die Trennung organischer Farbstoffe in einem Stück Tafelkreide.Die Trennung beruht auf der unterschiedlich starken Wechselwirkung der Farbstoffe mit der Kreide:Ist die Wechselwirkung stark, so wird das Weiterwandern des Farbstoffs mit der Flüssigkeit erschwert.Ist die Wechselwirkung schwach, so wandert der Farbstoff schneller.Das Ergebnis ist eine Auftrennung des Farbstoffgemisches in seine Bestandteile.

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Wichtige Begriffe

Stationäre Phase

Mobile Phase(Eluent)

AufgetrennteProbe

Anhand des Beispiels der Trennung des Farbstoffs in der Kreide lernen wir folgende Begriffe kennen:•Die Kreide heißt stationäre Phase.•Die in der Kreide aufsteigende Flüssigkeit heißt mobile Phase oder Laufmittel oder Eluent.•Der Farbstoff ist das, was analysiert werden soll und heißt Analyt oder einfach Probe.Es liegt hier also eine chemische Wechsel- wirkung zwischen drei Substanzen vor.

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1. Einführung: Analytische Chemie2. Prinzip der Chromatographie3. Die Komponenten einer HPLC-Anlage4. Detektion und Quantifizierung5. Reversed Phase HPLC6. Abschluß und Zusammenfassung

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Die Komponenten einer HPLC- Anlage

• Die Trennsäule• Die Pumpe• Der Probengeber

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Die TrennsäuleÜblicherweise wird als stationäre Phase keine Kreide verwendet; ein häufig anzutreffendes Material ist chemisch behandeltes Kieselgel.Das Kieselgel wird in eine Stahlkar- tusche gepackt, damit haben wir das „Herzstück“ einer jeden HPLC- Anlage: die Trennsäule.Die Kieselgelpartikel eines Säulen- materials mit 5 µm Korngröße wer- den beim Einatmen von den Bron- chien nicht zurückgehalten und kön- nen in die Lunge gelangen. Öffnen Sie keine HPLC-Säulen!

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Pumpe und Probengeber• Wie kommt die mobile Phase zur Säule?Mit einer Pumpe (dazu gehören Vorrats- und Abfallbehälter).•Wie kommt die Probe zur Säule?Mit einem Injektor oder Proben- geber.

Die Bezeichnung HPLC bedeutete ursprünglich „High Pressure Liquid Chromatography“. Heute steht die Abkürzung für „High Performance Liquid Chromatography“

Pumpe

Laufmittel

Abfall

Injektor

Säule

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Die PumpeWichtigste Anforderung an eine HPLC - Pumpe ist eine pulsationsfreie Förderung mit konstantem Fluß.Eine HPLC-Pumpe ist ein hochwertiges elektromechanisches Gerät und sollte so sorgfältig wie eine Analysenwaage be- handelt werden! •Die Pumpe nimmt Schaden, wenn sie trockenläuft, d. h. Luft statt mobiler Phase fördert! •Gelegentlich werden der mobilen Phase Puffersubstanzen, d. h. Salze zugesetzt. Nach der Analyse darf keine Puffer- lösung in der Pumpe stehen bleiben!

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Der ProbengeberDie Funktion des Probengebers ist es, eine genau dosierte Menge der Probe in den Laufmittelfluß zu geben. Dies geschieht über eine sogenannte Dosierschleife mit einem Rheodyne®-6-Wege-Ventil. Dabei ist das Probenvolumen durch die Dosier- schleife festgelegt.

Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung einer Injektionsspritze, mit der das gewünschte Volumen direkt eingespritzt wird.

Heute werden üblicherweise automatische Probengeber, sog. Autosampler verwendet.

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Injektionsvorgang bei einem Autosampler

Wenn die Nadel in die Probe ein- taucht und die Spritze ansaugt, wird ein genau definiertes Probenvolumen in die mit Laufmittel gefüllte Dosierschleife gezogen.

Während der Injektion durchströmt das Laufmittel auf dem Weg zur Säule die Dosierschleife und nimmt das zuvor eingesaugte Probenmaterial mit.

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1. Einführung: Analytische Chemie2. Prinzip der Chromatographie3. Die Komponenten einer HPLC-Anlage4. Detektion und Quantifizierung5. Reversed Phase HPLC6. Abschluß und Zusammenfassung

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Detektion und Quantifizierung I

• Was passiert mit der Probe hinter der Säule?• Ein einfacher Detektor• Im Chromatogramm enthaltene

Informationen• Quantifizierung

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Was passiert hinter der Säule?Im Kreideexperiment war nach der Trennung Schluß, die Komponen- ten blieben in der Säule/Kreide.Wird aber Laufmittel durch die Säule gepumpt, laufen die Kompo- nenten hinter der Säule weiter, man sagt, sie werden eluiert.Diese hinter der Säule erschei- nende Substanz heißt Eluat und kann mit einem Detektor unter- sucht werden...

Pumpe

Laufmittel

Abfall

Injektor

Säule

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Ein einfacher DetektorEin mit geringem Aufwand zu realisie- render Detektor besteht aus einer Lichtquelle und einer Photodiode.Das Laufmittel durchströmt eine Meß- zelle, eine mit Fenstern versehene Kammer mit genau definiertem Volumen.Läuft nur die mobile Phase durch die Meßzelle, wird das einfallende Licht geringfügig abgeschwächt. Läuft aber zusätzlich die stärker lichtabsorbieren- de Probe durch die Zelle, wird das Licht stärker abgeschwächt. Die Photo- diode reagiert darauf und die nach- geschaltete Elektronik erzeugt ein Signal, das auf einem Monitor sichtbar wird.

Abfall

Meßzelle

Lampe

Fotodiode

Schreiber

Pumpe

Laufmittel

Injektor

Säule

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Im Chromatogramm enthaltene Informationen

Die verschiedenen Komponenten erscheinen in der Reihenfolge der Eluation im Chromatogramm. Die Zeit vom Eintritt in die Säule bis zu ihrer Detektion heißt Retentionszeit.Bei ausgearbeiteten chromatographischen Methoden, mit denen bekannte Substanzen untersucht werden, sind die Retentionszeiten der Komponenten bekannt. Sie werden also anhand ihrer Retentionszeiten identifiziert.

Neo

- 2,

366

Vio

- 2,8

613,

035

3,61

8An

t - 3

,942

4,52

6 Lut -

5,0

58

Zea

- 5,4

96

Chl b

- 8,

378

8,71

89,

075

Chl a

- 9,

371

9,58

3

10,0

31

10,6

14

a-Ca

r - 1

1,60

6b-

Car

- 11

,872

12,2

52

AU

0,00

0,20

0,40

0,60

Minutes2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

Die Abbildung zeigt eine typische Trennung pflanzenphysiologisch bedeutender Pigmente.

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Ein Beispiel für Substanzen, die mittels HPLC analysiert werden: Pflanzenpigmente

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QuantifizierungDie eluierte Komponente bildet auf dem Weg von der Säule zum Detektor einen etwas auseinandergezogenen Substanz- pfropfen, dessen Konzentration in der Mitte am höchsten ist und zu den Enden hin abnimmt.Läuft dieser Pfropfen in die Meßzelle, so steigt die Absorption deshalb zunächst langsam an und erreicht bei der höchsten Konzentration ihren Maximalwert.•Je höher die Konzentration ist, desto größer größer wird die maximale Absorption.•Weiter hat die Konzentration der Probe Einfluß auf die Dauer des Verweilens in der Meßzelle.

Die Fläche des Peaks ist proportional der Konzentration der eluierten Komponente.

t=4, A=1

t=5, A=2

t=6, A=4

t=7, A=6

t=8, A=8

t=1, A=0

Mit gutem Willen läßt sich aus den Modellwerten einannähernd realistischer Peak bilden...

...und so sehen zwei “richtige” Peaks aus:

Chlb -8,378 8,7

18

AU

0,00

0,05

0,10

0,15

Minutes

8,00 8,20 8,40 8,60 8,80 9,00

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Detektion und Quantifizierung II

• Ein Detektor zur Spektrenaufnahme• Zusätzliche Informationen im

Chromatogramm• Das dreidimensionale Chromatogramm I• Zweidimensionale Chromatogramme• Der Photodiodenarraydetektor (PDA)• Das dreidimensionale Chromatogramm II

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Ein Detektor zur Spektrenaufnahme

Wir verbessern nun den vorhin entwor- fenen Detektor dahingehend, daß er Farben “sehen” kann.Statt einer Photodiode verwenden wir nun mehrere und setzen Farbfilter zwi- schen die Meßzelle und die einzelnen Dioden.Läuft nun eine grüne Substanz durch die Meßzelle, verläßt grünes Licht die Zelle. Das rote und das blaue Filter lassen dieses Licht nicht durch, es kommt also bei der entsprechenden Diode nichts an und es wird kein Signal erzeugt. Das grüne Filter läßt das Licht durch und die Photodiode spricht an.

400 nm 700 nm

Fotodioden

Farbfilter

Lampe

Meßzelle

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Zusätzliche Informationen im Chromatogramm

Mit den durch den “farbensehen- den” Detektor gelieferten Daten stehen nun für jede eluierte Kom- ponente zwei Informationen zur Verfügung, die eine Identifizierung ermöglichen:

* das Spektrum* die Retentionszeit

Fotodioden

Farbfilter

Lampe

Meßzelle

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Das dreidimensionale Chromatogramm I

Die Chromatogramme mit den Retentionszeiten und den Spektren lassen sich nun in einer dreidimen- sionalen Anordnung gemeinsam darstellen. λ

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Zweidimensionale Chromatogramme

Aus dem dreidimensionalen Chro- matogramm lassen sich mehrere zweidimensionale Chromato- gramme extrahieren.

Wir haben jetzt also drei Spektren (für jede Komponente eines) und vier Chromatogramme (je eines bei drei verschiedenen Farben / Wellenlängen und ein aus den dreien durch Überlagerung entstandenes).

λ

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Der Photodiodenarraydetektor (PDA)

Photodioden sind heute so klein, daß man sehr viele davon auf kleiner Fläche unterbringen kann. Ein solches Feld (ein ”Array”) kann z. B. 512 einzelne Dioden enthalten, so daß man ein den ganzen Bereich von 180 nm (UV) bis 700 nm (roter Bereich des sichtbaren Lichts) bei mit 1 nm Auflö- sung erhält. (Das heißt sozusagen, der Detektor kann 512 Farben erkennen; der eben konstruierte Detektor konnte nur 3 Farben erkennen.)Statt der im „Selbstbaudetektor“ verwendeten Filter hat man hier ein Beugungsgitter, welches das aus der Meßzelle austretende Licht in die Spektralfarben zerlegt.

DeuteriumlampeMeßzelle

BeugungsgitterPDA

2,873 V io

441,0 470 ,1

AU

0 ,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

0,090

0,100

nm400,00 420,00 440,0 0 46 0,00 480,00 500,00 520, 00

9,373 Chl a

431,3

618,0

664,6

AU

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

nm400,00 450,00 500,00 550,00 600,00 650,00 700,00

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Das dreidimensionale Chromatogramm II

Die mit einem PDA-Detektor gewonnenen dreidimensionalen Daten liefern Chromato- gramme und Spektren.Da der Detektor Daten bei 512 verschiede- nen Wellenlängen aufnimmt, liegen auch 512 einzelne “normale”, d. h. zweidimen- sionale Chromatogramme vor. Um daraus ein “brauchbares” Chromatogramm z u extrahieren, kann man z. B. das mit der höchsten Absorption auswählen. Auf der Wellenlängenachse befinden sich die Spektren der einzelnen Komponenten. Hat man z. B. den Detektor so eingestellt, daß jede Sekunde ein Spektrum aufgenommen wird, so erhält man bei 20 Minuten Laufzeit 1200 Spektren.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

AU

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00Minutes

400,00

450,00

500,00

550,00

600,00

650,00

700,00

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1. Einführung: Analytische Chemie2. Prinzip der Chromatographie3. Die Komponenten einer HPLC-Anlage4. Detektion und Quantifizierung5. Reversed Phase HPLC6. Abschluß und Zusammenfassung

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Reversed Phase HPLC

• Elektronegativität• Polarität• Polare und unpolare stationäre Phasen

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ElektronegativitätDie chromatographische Trennung der Substanzen erfolgt häufig aufgrund der unterschiedlichen Polarität von mobiler Phase, stationärer Phase und Probensubstanz.Die Polarität eines Moleküls beruht auf der Elektronegativität seiner Atome.

Atome innerhalb eines Moleküls haben mehr oder weniger die Fähigkeit, Elektronen (genauer: Bindungselektronen) anzuziehen. Die Elektronegativität (EN) ist ein Maß für Stärke dieser Anziehung.Die Ausprägung dieser Fähigkeit ist von der Größe der (positiven) Kernladung und von der Größe des Atoms abhängig. Es spielt ebenso eine Rolle, wie stark die Kernladung durch innere Elektronen abgeschirmt wird. (Siehe nächste Folie)

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EN und PSEDie schwächsten EN-Werte findet man im Periodensystem links unten, die stärksten Werte rechts oben.

Beispiel: Cäsium hat eine große Ladung im Kern: 55 Protonen. Da das Cäsiumatom aber auch viele Elektronen enthält und vergleichsweise groß ist, wird die Ladung nicht nur abgeschirmt, sondern auch der Abstand zu den Bindungselektronen ist recht groß. Die Fähigkeit, Elektronen anzuziehen, ist also nur schwach ausgeprägt, d. h. der EN-Wert ist mit 0,85 klein. Das Fluoratom hat zwar nur 9 positive Ladungen im Kern, die aber durch viel weniger Elektronen abgeschirmt werden, als beim Cäsium. Auch ist der Durchmesser der Fluoratoms dreimal kleiner, so daß die Bindungselektronen in Reichweite der Kernladung befinden. Fluor hat mit einem EN-Wert von 4,17 die stärkste Elektro- negativität aller Elemente.

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PolaritätBestehen Moleküle aus Atomen mit verschiedener Elektronega- tivität, so werden die Elektronen- wolken innerhalb des Moleküls verschoben, das Molekül wird polarisiert.

Je stärker der Unterschied zwi- schen den Elektronegativitäten der beteiligten Atome ist, desto stärker polar ist die Verbindung.

H-C

H C-CH -CH -CH -CH -CH

HO

H

OH C-C-CH

3 2 2 2 2 3

3 3

H C-C N3

Eine sehr schwach polare Bindung

n-Hexan ist praktisch unpolar

Wasser ist polar

Aceton

Acetonitril

2,2 2,5

3,5

3,1

2,5

2,5

3,5

2,2

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Polare und unpolare stationäre Phase

Ein häufig angewendetes Verfah- ren ist die Umkehrphasen- oder Reversed Phase-HPLC. Dabei ist das Laufmittel polarer als die stationäre Phase.

Kreide (Calciumcarbonat CaCO3) ist polar, Kieselgel mit ange- hängten Octadecylketten ist wegen dieser Ketten unpolar.

CH

CH

3

3

§ - Si - (CH ) - CH2 17 3

CH

CH

3

3

§ - Si - (CH ) - CH2 17 3

CH

CH

3

3

§ - Si - (CH ) - CH2 17 3

§ ist die Kieselgelmatrix:HO O O Si SiHO O O

Si

Si

UnpolareKetten ander Kiesel-gelmarix

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1. Einführung: Analytische Chemie2. Prinzip der Chromatographie3. Die Komponenten einer HPLC-Anlage4. Detektion und Quantifizierung5. Reversed Phase HPLC6. Abschluß und Zusammenfassung

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Übersicht: eine komplette HPLC

Abfall

Säule

Säulenofen

Autosampler

Detektor

Pumpe 2

Pumpe 1

Laufmittel 2Laufmittel 1

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Wichtig: Systemplan erstellen!Behalten Sie die Übersicht: Erstellen Sie einen Systemplan Ihrer Anlage, der alle Lauf- und Hilfsmittelwege so- wie alle elektrischen Verbindungen enthält.Ein Beipiel zeigt die Abbildung rechts.

717510

510

996

ColumnA

B

PCM

IEEE

Bus LAC/E

Computer

Waste

Waste

Con

trol C

able

Con

trol C

able

Signal Cable Signal Cable

Blue Red

Teflon tube

Teflon tube

10% MeOH

Needle WashGreen

Yello

w

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Testen Sie die Anla- ge regelmäßig mit bekannten Substan- zen und notieren Sie wichtige Daten. Sie haben damit im Problemfall immer eine Referenz zur Verfügung.

Auch wenn keine akuten Probleme auf- treten, sollten Sie die Leistung des Systems regelmäßig mit den Normalwerten ver- gleichen.

Läuft die Anlage nicht einwandfrei, no- tieren Sie alle Symp- tome im Anlagenlog- buch und gehen Sie anhand bekannter Da- ten bei der Fehlersu- che systematisch vor.