Real-time-PCR-Nachweissystem für Hefen und Schimmelpilze ... · Real-time-PCR-Nachweissystem für...

Real-time-PCR-Nachweissystem für Hefen und

Schimmelpilze in Getränken

vorgelegt von

Master of Science

Silvana Schulz

geb. in Ludwigslust

von der Fakultät III Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin,

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. –

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Lothar W. Kroh

Gutachter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. Ulf Stahl

Gutachterin: Dr.-Ing. Kornelia Berghof-Jäger, BIOTECON Diagnostics GmbH

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 09. Juni 2015

Berlin 2015

II

DANKSAGUNG

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr.-Ing. Ulf Stahl der TU Berlin für die wissenschaftliche

Betreuung dieser Arbeit.

Frau Dr. Kornelia Berghof-Jäger danke ich für die stetige Begleitung bei der Entwicklung des

Themas und die hilfreichen Diskussionsrunden.

Ich danke Herrn Dr. Cordt Grönewald für die wissenschaftlichen Hilfestellungen und

Ratschläge, die mir sowohl in den vergangenen Jahren, aber auch gegenwärtig oftmals

weitergeholfen haben. Vielen Dank für die Geduld beim Korrigieren dieser Arbeit.

Natürlich danke ich allen Mitarbeitern der BIOTECON Diagnostics, insbesondere den

Mitarbeitern der F&E-Abteilung. Ihr hattet stets ein offenes Ohr und einen passenden Tipp

bei kleineren und mittleren Katastrophen des Laboralltags. Vielen Dank für die schöne Zeit

bei euch!

Mein besonderer Dank gilt meiner Familie. Mit ihrer Unterstützung ist diese Arbeit

schlussendlich doch noch fertig geworden.

III

INHALTSVERZEICHNIS

DANKSAGUNG .............................................................................................................. II

INHALTSVERZEICHNIS ................................................................................................... III

ABBILDUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................... VII

TABELLENVERZEICHNIS .............................................................................................. VIII

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................ X

ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................. XIV

SUMMARY .................................................................................................................. XV

1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1

1.1 Einführung ............................................................................................................... 1

1.2 Taxonomie und Phylogenie ..................................................................................... 2

1.3 Morphologie ............................................................................................................ 4

1.4 Bedeutung von Pilzen in Lebensmitteln ................................................................... 5

1.4.1 Allgemeine Bedeutung – vom Produzenten zum Destruenten .......................... 5

1.4.2 Kontamination von alkoholfreien Getränken ..................................................... 6

1.5 Angewandte Methoden zum Nachweis von Pilzen .................................................. 8

1.5.1 Mikrobiologischer Nachweis ............................................................................. 9

1.5.2 Molekularbiologische Nachweismethoden .......................................................12

1.5.3 Lebend/Tot-Differenzierung .............................................................................15

1.6 Ziele der Arbeit .......................................................................................................18

2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................................... 19

2.1 Geräte ....................................................................................................................19

2.2 Reagenzien ............................................................................................................20

2.3 Verbrauchsmaterialien ...........................................................................................21

2.4 Puffer und Lösungen ..............................................................................................21

2.5 Nährmedien ...........................................................................................................22

2.5.1 Gebrauchsfertige Nährmedien ........................................................................22

2.5.2 Hergestellte Nährmedien .................................................................................22

2.6 Oligonukleotide ......................................................................................................23

IV

2.6.1 Sequenzen zur Amplifikation der 28S rDNA-Sequenz .....................................24

2.6.2 Primersequenzen zur Amplifikation eines pflanzenspezifischen Fragments ....24

2.7 Probenmatrices ......................................................................................................24

2.8 Primer Design ........................................................................................................24

2.9 Stammanzucht .......................................................................................................25

2.10 Gewinnung von RNA-freier, quantifizierbarer DNA .................................................25

2.11 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration ............................................25

2.12 Gelelektrophorese ..................................................................................................25

2.13 Herstellung kompetenter E.coli XL1-blue-Zellen .....................................................26

2.14 Klonierung ..............................................................................................................26

2.14.1 Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats .........................................26

2.14.2 Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats für die Positivkontrolle .............27

2.14.3 Ligation mit pGEM®-T-Vektorsystem ..............................................................27

2.14.4 Transformation und Blau-Weiß-Selektion ........................................................28

2.14.5 PCR-Klonanalyse mittels Colony-PCR ............................................................28

2.14.6 Plasmidpräparation .........................................................................................28

2.15 Sequenzierung .......................................................................................................28

2.16 Sequenzanalyse .....................................................................................................28

2.17 Berechnung von Genomäquivalenten ....................................................................28

2.18 Real-time-PCR .......................................................................................................29

2.18.1 Gradienten-PCR ..............................................................................................29

2.18.2 Temperaturprofile für Real-time-PCR-Cycler ...................................................30

2.19 Herstellung des Mastermixes für Pilzgesamtnachweis-Assay ................................30

2.20 Spezifitätstestungen ...............................................................................................31

2.21 Probenaufarbeitung ................................................................................................31

2.21.1 Herstellung einer Sporensuspension ...............................................................31

2.21.2 Aufbereitung filtrierbarer Proben mit Lebend/Tot-Differenzierung ....................31

2.21.3 Anreicherung und Aufbereitung nicht-filtrierbarer Flüssigkeiten mit Lebend/Tot-

Differenzierung ..............................................................................................................31

2.22 Sensitivitätstestungen ............................................................................................32

V

2.22.1 Sensitivitätstestung des PCR-Assays mit quantifizierbarer DNA .....................32

2.22.2 Sensitivitätstestung mit dotierten Probenmatrices ...........................................32

2.22.2.1 Untersuchung von Flüssigkeiten auf Wiederfindungsraten .......................32

2.22.3 Sensitivitätstestung bei hoher Begleitflora .......................................................32

2.22.4 Dotierungen mit inaktivierten Zellen für die Lebend/Tot-Differenzierung ..........32

3 ERGEBNISSE ........................................................................................................ 33

3.1 Auswahl und Beschreibung der Zielregion .............................................................33

3.2 Generierung eines Plasmids mit plantaespezifischer DNA .....................................34

3.3 Primermodifikationen zur Erhöhung der Spezifität ..................................................36

3.4 Generierung der Positivkontrolle ............................................................................40

3.5 Einbringen einer internen Amplifikationskontrolle ...................................................41

3.6 Spezifitätstestungen ...............................................................................................42

3.6.1 Inklusivität .......................................................................................................42

3.6.2 Exklusivität ......................................................................................................43

3.7 Sensitivitätstestung des Assays mit quantifizierbarer DNA .....................................44

3.8 Weitere Optimierung des Real-time-PCR-Assays ..................................................47

3.8.1 Blockierung der Taq-Polymerase bei Raumtemperatur ...................................47

3.8.2 Gradienten-PCR ..............................................................................................48

3.8.3 Überprüfung der Performance .........................................................................51

3.9 Probenaufarbeitung für Fungi in Getränkematrices ................................................51

3.9.1 Aufarbeitung filtrierbarer Flüssigkeiten ............................................................51

3.9.2 Probenaufarbeitung für nicht-filtrierbare Flüssigkeiten .....................................54

3.9.2.1 Wiederfindungsrate in nicht-filtrierbaren Flüssigkeiten .............................54

3.9.2.1.1 Kohlensäurehaltige Flüssigkeiten ..........................................................54

3.9.2.1.2 Einsatzstoffe und Halbware ...................................................................56

3.9.2.2 Anreicherungs- und Detektionsdauer verschiedener Keime .....................59

3.9.2.3 Sensitivität bei hoher Begleitflora .............................................................60

3.10 Optimierung der Lebend/Tot-Differenzierung .........................................................62

4 DISKUSSION ......................................................................................................... 70

VI

4.1 Beurteilung der 28S rDNA als Zielregion ................................................................70

4.2 Spezifität des Real-time-PCR-Assays ....................................................................72

4.3 Sensitivität des Real-time-PCR-Assays (LOD und LOQ) ........................................76

4.4 Beurteilung der Methode zur Lebend/Tot-Differenzierung ......................................80

4.5 Beurteilung der Probenaufarbeitung .......................................................................87

4.6 Ausblick ..................................................................................................................93

LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................. XVI

NORMEN UND RICHTLINIEN ...................................................................................... XXIV

MANUALS ............................................................................................................... XXIV

ANHANG ................................................................................................................. XXV

I. Alignment der 28S-rDNA-Sequenzen repräsentativer Pflanzen von Position 120-

1080 unter Angabe der Primerpositionen ...................................................................... XXV

II. Alignment der in den pGEM®-T-Vektor eingebrachten pflanzlichen 28S-rDNA-

Sequenzen .................................................................................................................. XXIX

III. Klonierungsvektor pGEM®-T-57f(+) mit plantaespezifischem 28S-rDNA-Insert XXXI

IV. Klonierungsvektor pGEM®-T-57(+) mit fungispezifischem 28S-rDNA-Insert als

Positivkontrolle............................................................................................................ XXXII

V. Einstellen des Positivkontrollplasmids als Quantifizierungsstandard ............... XXXIII

VI. Stämme für Inklusivität .................................................................................... XXXIV

VII. Stämme für Exklusivität .................................................................................. XXXVII

VIII. Daten zur LOD/LOQ-Bestimmung ................................................................... XXXIX

IX. Anreicherungs- und Detektionszeitpunkt von verschiedener Hefen in Matrices .. LVIII

X. Absterbekinetik von Aspergillus-brasiliensis-Sporen............................................. LIX

VII

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 1: Darstellung der gegenwärtigen Systematik der Pilze ........................................................ 3

Abbildung 2: Einteilung der alkoholfreien Getränke ................................................................................ 6

Abbildung 3: Prinzip der TaqMan-PCR ................................................................................................. 14

Abbildung 4: Darstellung des rDNA-Repeats und des 28S-rDNA-Genabschnitts ................................ 33

Abbildung 5: UV-Visualisierung des Agarosegels mit pflanzenspezifischen Amplifikaten .................... 35

Abbildung 6: UV-Visualisierung der mittels Colony-PCR untersuchten Klonkandidaten ...................... 36

Abbildung 7: Struktur einer LNA™-Base ............................................................................................... 37

Abbildung 8: ΔCp-Werte der Mixe mit modifizierten Primern im Vergleich............................................ 39

Abbildung 9: Amplifikationskurven zur Einstellung der Positivkontrolle auf Genomäquivalente ........... 41

Abbildung 10: Amplifikationskurven taxonomisch verschiedener Fungi-Spezies ................................. 42

Abbildung 11: Amplifikationskurven der internen Amplifikationskontrolle bei der Exklusivitätstestung 43

Abbildung 12: Amplifikationskurven von Z. bailii und A. brasiliensis zur LOD/LOQ-Bestimmung ........ 45

Abbildung 13: Linearisierte Standardkurve zur interspezifischen Korrelation der LOD/LOQ-

Bestimmung ..................................................................................................................... 47

Abbildung 14: Amplifikationskurven der Reaktionsmixe mit antikörper- bzw. aptamergeblockter Taq-

Polymerase ...................................................................................................................... 48

Abbildung 15: Amplifikationskurven bei 63°C Annealingtemperatur ..................................................... 50

Abbildung 16: Amplifikationskurven bei 60°C Annealingtemperatur ..................................................... 50

Abbildung 17: Performanceprüfung mit einer Vielzahl an Negativkontrollen ........................................ 51

Abbildung 18: Wiederfindungsrate von A. brasiliensis-Sporen nach Filtration ..................................... 52

Abbildung 19: Amplifikationskurven von 1:10-verdünnten Colaproben ................................................ 55

Abbildung 20: Detektion von 1x103 KBE S. cerevisiae mit Begleitflora (E. coli) ................................... 61

Abbildung 21: Amplifikationskurven von S. cerevisiae nach Inaktivierung bei 80°C ............................ 63

Abbildung 22: S. cerevisiae und D. anomala (lebend und inaktiviert) mit differenten Dunkelphasen ... 64

Abbildung 23: Z. bailii und A. brasiliensis (lebend und inaktiviert) mit differenten Dunkelphasen ........ 65

Abbildung 24: Resultate der PCR-Analytik von A. brasiliensis-Sporen bei differenten Dunkelphasen 66

Abbildung 25: Verschiebung der Detektionszeitpunkte (ΔCp) bei zunehmender Inaktivierungszeit ..... 66

Abbildung 26: Saccharomyces cerevisiae in verschiedenen Zellzuständen ......................................... 68

Abbildung 27: Funktionalität der Lebend/Tot-Differenzierung in Getränkematrix ................................. 69

Abbildung 29: Grafische Darstellung des Klonierungsvektors pGEM®-T-57f(+) mit

pflanzenspezifischem Insert ......................................................................................... XXXI

Abbildung 30: Klonierungsvektor pGEM®-T-57(+)f mit eingebauter 28S rDNA-Sequenz aus

D. anomala .................................................................................................................. XXXII

VIII

TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle 1: Auflistung der Methoden zum Nachweis von Fungi ............................................................... 9

Tabelle 2: Übersicht der verwendeten Geräte....................................................................................... 19

Tabelle 3: Übersicht der eingesetzten Reagenzien .............................................................................. 20

Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Verbrauchsmaterialien ............................................................. 21

Tabelle 5: Übersicht der gebrauchsfertigen Nährmedien ...................................................................... 22

Tabelle 6: Sequenzen der 28S rDNA-spezifischen Primer ................................................................... 24

Tabelle 7: Sequenzen der pflanzenspezifischen Primer ....................................................................... 24

Tabelle 9: Protokoll zur Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats ........................................ 26

Tabelle 10: Temperaturprofil zur Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats ......................... 27

Tabelle 11: Protokoll zur Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats .............................................. 27

Tabelle 12: Temperaturprofil zur Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats ................................. 27

Tabelle 13: Pipettierschema für den Ligationsansatz ........................................................................... 27

Tabelle 14: Übersicht der verwendeten Genomgrößen/–gewichte zur LOD/LOQ-Bestimmung .......... 29

Tabelle 15: Temperaturprofil für die Real-time-PCR ............................................................................. 30

Tabelle 16: Zusammensetzung des Mastermixes für den Pilzgesamtnachweis-Assay ....................... 30

Tabelle 17: Einfluss verschiedener Primermodifikationen auf Cp-Werte bei Einsatz eines

pflanzenspezifischen Plasmids ........................................................................................ 38

Tabelle 18: Korrelation der Cp-Werte von DNA und Positivkontrollplasmid .......................................... 41

Tabelle 19: Taxonomie der zur LOD/LOQ-Bestimmung eingesetzten Spezies .................................... 44

Tabelle 20: Statistische Auswertung zur interspezifischen Korrelation ................................................. 46

Tabelle 21: FAM-Cp-Werte des antikörper- bzw. aptamerhaltigen Reaktionsmixes ............................. 48

Tabelle 22: FAM-Cp-Werte zur Bestimmung der Wiederfindungsrate von Aspergillus-Sporen nach

Filtration ........................................................................................................................... 53

Tabelle 23: Gegenüberstellung der erhaltenen Cp-Werte für (un)-verdünnte Colaproben ................... 55

Tabelle 24: Gegenüberstellung der Resultate der mikro- und molekularbiologischen Analyse ............ 57

Tabelle 25: PCR-Analyse nach Anreicherung in SSL bei grenzwertiger Dotierung .............................. 57

Tabelle 26: Cp-Werte zur Bestimmung der Wiederfindungsrate in nicht-filtrierbaren Proben ............... 58

Tabelle 27: Gegenüberstellung der Resultate zur Detektionszeit verschiedener Hefespezies nach

Anreicherung in Fruchtkonzentraten/Nektar .................................................................... 60

Tabelle 28: Detektion von S. cerevisiae in Anwesenheit von Begleitflora (E.coli) ................................ 62

Tabelle 29: Resultate zur Einstellung des Positivkontrollplasmids auf Genomäquivalente ............ XXXIII

Tabelle 30: Übersicht der untersuchten Pilz-Stämme ..................................................................... XXXIV

Tabelle 31: Eingesetzte DNA-Proben für Exklusivitätstestung ...................................................... XXXVII

Tabelle 32: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Rhodotorula mucilaginosa-DNA ................... XXXIX

Tabelle 33: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Cryptococcus curvatus-DNA............................... XL

Tabelle 34: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Mucor racemosus-DNA ..................................... XLI

Tabelle 35: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Absidia corymbifera-DNA ................................. XLII

Tabelle 36: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Schizosaccharomyces pombe-DNA ................ XLIII

Tabelle 37: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Fusarium oxysporum-DNA ............................. XLIV

Tabelle 38: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Cladosporium cladosporioides-DNA ................ XLV

IX

Tabelle 39: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Alternaria citri-DNA ......................................... XLVI

Tabelle 40: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Penicillium chrysogenum-DNA ...................... XLVII

Tabelle 41: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Aspergillus brasiliensis-DNA ......................... XLVIII

Tabelle 42: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Candida albicans-DNA ................................... XLIX

Tabelle 43: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Issatchenkia orientalis-DNA.................................. L

Tabelle 44: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Pichia anomala-DNA ........................................... LI

Tabelle 45: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Zygosaccharomyces bailii-DNA .......................... LII

Tabelle 46: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Dekkera anomala-DNA ...................................... LIII

Tabelle 47: LOD/LOQ: Cp-Werte der Negativkontrollen ...................................................................... LIV

Tabelle 48: Statistische Gesamtauswertung zur LOD/LOQ-Untersuchung .......................................... LV

Tabelle 49: Ausführliche Darstellung der Resultate für PCR und Mikrobiologie für die

Anreicherungsdauer vier verschiedener Hefen in drei Matrices ................................... LVIII

Tabelle 50: Absterbekinetik von Aspergillus-Sporen bei Hitzebehandlung .......................................... LIX

X

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

6-FAM 6-Carboxyfluorescein - Fluoreszenzfarbstoff

Abkz. Abkürzung

AfG Alkoholfreie Getränke

Amp Ampicillin

aw Wasseraktivität

BHQ1 engl. black hole quencher – Fluoreszenzfarbstoff

bp Basenpaare

BSA bovines Serumalbumin

CASO Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar

cfu engl. colony forming units – Koloniebildende Einheiten

Cp engl. crossing point – Kreuzungspunkt

CT engl. threshold cycle – Schwellenwertzyklus

demin demineralisiert

DG18 Dichloran-Glycerin-18-Agar

dNTP Desoxynukleosidtriphosphat

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

dTTP Desoxythymintriphosphat

dUTP Desoxyuraciltriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EF-3 Elongationsfaktor 3 – DNA-Bereich

ELISA engl. enzyme linked immunosorbent assay – antikörperbasiertes

Nachweisverfahren

engl. englisch

EMA Ethidiummonoazid(-bromid)

et al. lat.: et alii (mask.), et aliae (fem.), et alia (neut.) - und andere

evtl. eventuell

FACS engl. fluorescence activated cell sorting – Fluoreszenzaktivierte

Zellsortierung

FungiFw Vorwärtsprimer des pilzspezifischen Assays

FungiP Sonde des pilzspezifischen Assays

FungiRv Rückwärtsprimer des pilzspezifischen Assays

G50 Glucose-50-Agar

GÄ Genomäquivalent

griech. griechisch

HEX Hexachloro-6-carboxy-flurorescein

HSTE Heringssperma-Tris-EDTA-Puffer

XI

IAK interne Amplifikationskontrolle

inc. sed. lateinisch: incertae sedis - unsichere Stellung

IPC engl. internal positive control - interne Positivkontrolle

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

ISO engl. International Organization für Standardization

ITS engl. internal transcribed spacer – DNA-Bereich

Kap. Kapitel

kb Kilobasen

KBE Koloniebildende Einheiten

lat. lateinisch

LC480 LightCycler® 480

LED engl. light emitting diode – Licht emittierende Diode

LFGB Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch

LNA engl. locked nucleic acids – fixierte Nukleinsäuren

LOD engl. limit of detection - Nachweisgrenze

LOQ engl. limit of quantification – Bestimmungsgrenze

µm Mikrometer

µl Mikroliter

mM millimolar

M molar

MA Malzextraktagar

MRS deMan-Rogosa-Sharpe-Agar

MW engl. molecular weight - Molekulargewicht

NC-IUB engl. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry

nm Nanometer

NCBI engl. National Center for Biotechnology Information

NOR engl. nucleolus organizer region – DNA-Bereich

NTC engl. No Template Control - Negativkontrolle

NTS engl. non-transcribed spacer – DNA-Bereich

OFS Orangenfruchtsaftagar

PCR engl. polymerase chain reaction – Polymerase-Kettenreaktion

PET Polyethylenterephthalat

PDA engl. potato dextrose agar - Kartoffeldextroseagar

PES Polyethersulfon

pH lat. potentia Hydrogenii – negative, dekadischer Logarithmus der

Wasserstoffionenaktivität

PI Propidiumiodid

XII

Pl. Plural

PK Positivkontrolle

PMA Propidiummonoazid

PS Polysulfon

PVPP Polyvinylpolypyrrolidon

qPCR quantitative Polymerase-Kettenreaktion

RAPD engl. randomly amplified polymorphic DNA – zufällig vervielfältigte

polymorphe DNA

rDNA ribosomale Desoxyribonukleinsäure

rRNA ribosomale Ribonukleinsäure

RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus

RT Raumtemperatur

Rxn. Reaktionen

S Svedberg-Einheit, Sedimentationskoeffizient

SELEX engl. systematic evolution of ligands by exponential enrichment -

Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung

SNP engl. single nucleotid polymorphism - Einzelnukleotidpolymorphismus

sp. lat. species – eine Spezies der Gattung

spp. Mehrzahl von sp.

SSL schneller Spurennachweis für Limonadenschädlinge

Taq lat. Thermus aquaticus - Spezies

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TE Tris-EDTA-Puffer

TG Glasübergangstemperatur

TGYA engl. trypton glucose yeast extract agar – Trypton-Glucose-Hefeextraktagar

tntc engl. totally not to count – nicht auszählbar

U Units

UDG Uracil-DNA-Glykosylase

unmod. unmodifiziert

UV ultraviolettes Licht

VE voll entmineralisiert

VIC patentierter Fluoreszenzfabstoff der Fa. Applied Biosystems

vgl. vergleiche

v-PCR engl. viable PCR – Lebend-PCR

WSH Wasser standardisierter Härte

w/v engl. weight per volume percent - Massenprozent

X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid

XIII

YGC engl. yeast extract-glucose-chloramphenicol agar – Hefeextrakt –Glucose-

Chlorampenicol-Agar

YM engl. yeast extract malt extract agar – Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

z.B. zum Beispiel

zusätzl. zusätzlich

ZNA engl. zip nucleic acid - Reißverschlussnukleinsäuren

z.T. zum Teil

λexc. engl. excitation – Anregung; Anregungswellenlänge

λemi. engl. emission – Aussendung; Emissionswellenlänge

XIV

ZUSAMMENFASSUNG

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time-PCR-Assay entwickelt, das den universellen

Nachweis von Pilzen ermöglicht. Mit der Vorauswahl an Primer- und Sondenkandidaten,

welche einen hoch konservierten DNA-Abschnitt der 28S-rDNA flankieren, wurden in-silico-

Analysen durchgeführt, die zeigen konnten, dass das Phylum der Mucoromycotina nicht

100% erfasst wurde. Nach Zusatz eines weiteren Primers konnten über 250 verschiedene

Pilzspezies der relevanten Phyla mit dem Real-Time-PCR-Assay nachgewiesen werden. Die

Detektionsgrenze des Assays liegt im Bereich von 1,6 Genomäquivalenten. Die

Quantifizierung fungoider DNA wurde mit 15 lebensmittelrelevanten Spezies vorgenommen.

Es konnte gezeigt werden, dass die Quantifizierung der Pilze trotz verschiedener Gen-

Kopienzahlen und Genomgrößen reproduzierbar möglich ist. Durch das Mitführen einer

Plasmidpositivkontrolle, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurde, kann der

Kontaminationsgrad einer Probe bestimmt werden. Exklusivitätsprüfungen mit DNA aus

Zelllinien sowie bakterieller und pflanzlicher DNA haben die Spezifität des Verfahrens

bestätigt. Der Assay beinhaltet Mechanismen zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen

wie z.B. die Verwendung von Uracil-DNA-Glykosylase.

Das Probenaufarbeitungssystem ist für die Anwendung in der Getränkeindustrie vorgesehen.

Alkoholfreie Getränke und ihre Einsatzstoffe können auf den Befall mit Verderbsorganismen

hin geprüft werden. Es werden zwei Extraktionsverfahren vorgestellt: filtrierbare

Flüssigkeiten werden filtriert und der Filter anschließend weiter aufgearbeitet; nicht-

filtrierbare Flüssigkeiten können nach einer möglichen Voranreicherung direkt ins

Reaktionsgefäß überführt werden. Die Nachweisgrenze liegt bei 1,5x101 KBE (in 100 ml) für

filtrierbare Flüssigkeiten und 5x101 KBE (in 100 µl) für nicht-filtrierbare Flüssigkeiten. Um nur

die Kontamination lebensfähiger Pilze anzuzeigen, beinhaltet die Probenaufarbeitung ein

Verfahren zur Lebend/Tot-Differenzierung mithilfe eines interkalierenden Farbstoffs. Die

Anwendbarkeit der Aufarbeitung wird mit Brauereieinsatzstoffen sowie Realproben

untersucht.

XV

SUMMARY

This graduate thesis describes the development of a real-time PCR assay for the universal

detection of fungi. The preselected primer and probes candidates flank the highly conserved

28S rDNA region but insilico analyses showed that they did not fit optimal for the phylum

Mucoromycotina. With an additional primer, it was possible to detect more than 250 fungi

species. The limit of detection for this assay is 1.6 genome equivalents. The quantification of

fungal DNA was evaluated using 15 food-relevant microorganisms. Although, fungi differ in

the gene copy numbers and the genome size it was shown that the quantification of the DNA

is reproducible using the artificial positive control. The exclusivity of the assay was proofed

with DNA extracted from bacteria, plants and cell cultures. The real-time PCR assay contains

several reagents to avoid cross contaminations, for example the enzyme uracil-DNA-

glycosylase.

The sample preparation system was made for the beverage industry. Soft drinks and their

raw material can be checked for fungal contaminations using the following two extraction

methods: filterable fluids are filtered and the whole filter passes the sample preparation while

non-filterable fluids are transferred to the reaction tube directly after an optional pre-

enrichment. The limit of the detection of the sample preparation system is 1.5x101 cfu (per

100 ml) for filterable and 5x101 cfu (per 100 µl) for non-filterable fluids. With the addition of

an intercalating dye, only the DNA of living fungi can be detected in the real-time PCR. The

applicability of the preparation system was tested with brewery raw material and real

samples.

1 EINLEITUNG

1

1 Einleitung

1.1 Einführung

Hefen und Schimmelpilze sind sowohl bei der Herstellung als auch dem Verderb von

Lebensmitteln und Getränken beteiligt. Der Verderb resultiert aus dem Zusammenspiel der

mikrobiellen Aktivität und dem Wachstum von Mikroorganismen in Abhängigkeit von den

eingesetzten Rohmaterialien und der Produktzusammensetzung (van der Vossen und

Hofstra 1996; Loureiro 2000). Für die Qualität des Produktes ist somit die Qualität der

Einsatzstoffe ausschlaggebend (Back 2008).

Wirtschaftliche Verluste infolge von Rückrufaktionen stellen für Produktionsbetriebe

schwerwiegende Konsequenzen dar (van der Vossen und Hofstra 1996; Back 2000, 2008;

Loureiro 2000; Boekhout und Robert 2003; Rawsthorne und Phister 2006). In den

vergangenen Jahren waren Verbraucher immer wieder aufgefordert, belastete Getränke in

die Filialen zurückzubringen oder zu entsorgen. Im August 2008 wurden hefeinfizierte, in

Glasflaschen abgefüllte Apfelschorlen wegen Explosionsgefahr zurückgerufen.

Sechstausend Flaschen einer Orangenlimonade wurde im Juli 2009 ebenfalls wegen einer

Hefebelastung und der bestehenden Berstgefahr zurückbeordert. In Energy Drinks konnte im

März 2010 eine Schimmelpilzbelastung beobachtet werden. Im Juli 2010 wurde der

Milchschimmel Geotrichum candidum in einer für Kleinkinder ausgelobten Bio-Fruchtschorle

nachgewiesen sowie 50 000 Flaschen einer Apfelschorle, abgefüllt in PET-Flaschen (Abkz.

Polyethylenterephthalat), nach Feststellung eines Hefebefalls und der bestehenden

Explosionsgefahr zurückgerufen (Beckmann et al. 2011). Auch wenn in den meisten Fällen

keine konkrete Gefahr für die Gesundheit der Verbraucher besteht, sind die Produkte nicht

für den menschlichen Verzehr geeignet (Loureiro 2000; Beckmann et al. 2011).

Für Produktionsbetriebe stellt die Auffindung von Kontaminationsquellen und die Feststellung

über die Identität der vorgefundenen Mikroorganismen eine besondere Herausforderung dar.

Allein mit mikrobiologischen Methoden sind Aussagen darüber, ob es sich um Verderbs-

oder harmlose Begleitflora handelt, teilweise schwierig und zeitintensiv (Loureiro 2000). Ein

schnelles Eingreifen in den Produktionsprozess zum Vermeiden weiterer Kontaminationen ist

faktisch nicht möglich.

Erschwerend kommt hinzu, dass der Verbraucher in den letzten Jahren zunehmend nach

minimal prozessierten Lebensmitteln verlangt (Loureiro 2000). Hersteller müssen demnach

neue Wege für Präventionsmaßnahmen gehen: der Zusatz natürlicher antimikrobieller

Substanzen oder nur geringe physikalische Behandlungen stellen den Anfang dar (Juvonen

et al. 2011).

1 EINLEITUNG

2

Eine kontinuierliche Routineüberwachung des gesamten Produktionsprozesses – von der

Rohware bis zum abgefüllten Produkt – ist damit zur Gewährleistung eines sicheren und

unverdorbenen Produktes unerlässlich. Dies lässt sich nur mit schnellen, sensitiven und

einfach zu handhabenden Nachweismethoden erreichen, die zum frühestmöglichen

Zeitpunkt ein Eingreifen in den laufenden Prozess erlauben.

1.2 Taxonomie und Phylogenie

Das heute gängige Wort „Pilz― leitet sich vom Althochdeutschen Wort buliz ab. Etymologen

gehen davon aus, dass sich der Begriff aus dem lateinischen bōlētus entwickelt hat (Kluge

and Seebold 1989). Die wissenschaftliche Bezeichnung Fungus (Pl. fungi = Pilz) entstammt

dem Lateinischen (Alexopoulos 1952). Die Lehre der Pilze wird Mykologie genannt (griech.

mýkēs = Pilz, logos = Lehre (Alexopoulos 1952)).

In der Domäne der Eukaryonten stellen Fungi neben den Protozoen, Chromista, Animalia

und Plantae ein eigenständiges Reich dar (Cavalier-Smith 1998). Der Systematik der

Eukaryonten von Adl et al. aus dem Jahr 2012 folgend werden Pilze zusammen mit den

Choanomonada (Kragengeißeltierchen) und Metazoa (vielzellige Tiere) der Gruppe der

Opisthokonta zugeordnet (Adl et al. 2012). Der Rang der Fungi untergliedert sich dabei in

mindestens sechs Phyla (siehe Abbildung 1): Asco-, Basidio-, Neocallimastigo-, Chytridio-

und Blastocladiomycota sowie Microsporidia. Die Subphyla, die diesen nicht zugeordnet

werden konnten (Mucoro-, Mortierello-, Entomophthoro-, Zoopago- und Kickxellomycotina),

verbleiben jeweils als Subphylum incertae sedis (Hibbett et al. 2007). Bisher nicht eindeutig

geklärt ist die Stellung der Cryptomycota: Jones et al. plädieren auf ein eigenständiges

Phylum innerhalb der Fungi, obwohl die Charakteristik eines Pilzes nur teilweise gegeben ist

(Jones et al. 2011b). Um diese Unklarheiten aufzuzeigen, ist dieses Phylum in der

dargestellten Systematik (siehe Abbildung 1) andersfarbig hervorgehoben.

Um Gemeinsamkeiten zwischen Asco- und Basidiomyceten zu verdeutlichen, werden diese

beiden Phyla im Unterreich Dikarya zusammengefasst. Die Ascomycota (griech. askos =

Beutel, Schlauch (Alexopoulos 1952)), welche etwa 64 000 Spezies umfassen und damit das

größte Phylum darstellen, untergliedern sich in drei Subphyla (Bellemain et al. 2010):

Pezizomycotina (Echte Schlauchpilze), Taphrinomycotina und Saccharomycotina (Echte

Hefen). Die Abteilung der Basidiomycota (griech. basidion = kleiner Fuß (Alexopoulos 1952))

umfasst etwa 30 000 Spezies, gegliedert in drei Unterabteilungen sowie zwei Subphyla

incertae sedis (Bellemain et al. 2010): Wallemiomycetes und Entorrhizomycetes werden

derzeit auf Grundlage verschiedener DNA-Analysen als Schwestergruppen zu den

Basidiomyceten gezählt, da sie keinem anderen Subphylum zugeordnet werden konnten

(Hibbett et al. 2007).

3

Abbildung 1: Darstellung der gegenwärtigen Systematik der Pilze Nach Adl et al. (2012) wird das Reich der Fungi der Gruppe Opisthokonta zugewiesen. Es untergliedert sich in 6 Phyla. Hibbett et al. stellten die Mucoro-, Entomophthoro-, Zoopago- und Kickxellomycotina erstmals als Subphyla incertae sedis dar (Hibbett et al. 2007). Adl et al. fügten das Subphylum Mortierellomycotina hinzu. Nach Jones und Richards (2011) stehen die Cryptomycota innerhalb dieses Reiches.

Neocallimastigo-

mycota Neocallimastigo-

mycotina Neocallimastigales

Chytridiomycota Chytridiomycetes

Chytridiales Cladochytriales Rhizophydiales Polychytriales

Spizellomycetales Rhizophlyctidales

Lobulomycetaceae

Monoblepharidales

Saccharomycotina Saccharomycetes

Taphrinomycotina

Schizosaccharomycetes Taphrinomycetes

Archaeorhizomycetes Neolectomycetes

Pneumocystidomycetes

Pezizomycotina

Arthoniomycetes Dothideomycetes Eurotiomycetes

Geoglossomycetes Laboulbeniomycetes Lecarnoromycetes

Leotiomycetes Lichinomycetes Orbiliomycetes Pezizomycetes

Sordariomycetes

Blastocladio- mycota Blastocladiales

Kickxellomycotina

Asellariales Dimargaritales

Harpellales Kickxellales

Glomeromycota

Zoopagomycotina Zoopagales

Entomophthoro-mycotina

Entomophthorales

Mucoromycotina Mucorales Endogonales

Microsporidia

Opisthokonta

Fungi

Ascomycota

Dikarya

Basidiomycota

Wallemiomycetes Wallemiales

Pucciniomycotina

Agaricostilbomycetes Atractiellomycetes Classiculomycetes

Cryptomycocolacomycetes Cystobasidiomycetes Microbotryomycetes

Mixiomycetes Pucciniomycetes

Ustilaginomycotina Exobasidiomycetes Ustilaginomycetes

inc. sed. Malasseziales

Entorrhizomycetes Entorrhizales

Agaricomycotina Agaricomycetes Tremellomycetes

Mortierellomycotina Mortierellales

Cryptomycota Rozella

1 EINLEITUNG

4

Arten, die den anaeroben Pilzen Neocallimastigomycota zugeschrieben werden, leben

ausschließlich im Verdauungstrakt von Säugetieren. In früheren Systematiken wurden sie

den Chytridiomycota zugeordnet, da sie mit ihnen die Ausbildung beweglicher Zoosporen

(griech. zoön = tierisch, sporos = Samen (Alexopoulos 1952)) gemein haben. Ebenfalls

Zoosporen besitzen Pilze des Phylums Cryptomycota, deren Zuordnung jedoch nicht

ausreichend geklärt ist. Jones et al. haben in den drei bisher untersuchten Lebenszyklen des

Wasserkeims keine Anzeichen für eine chitin- bzw. cellulosehaltige Zellwand gefunden

(Jones et al. 2011b). Dies wurde bis dato als eine charakteristische Eigenschaft der Fungi

aufgefasst, obwohl Protisten gleichermaßen eine chitinhaltige Zellwand besitzen. Ungeklärt

ist weiterhin die Zugehörigkeit des Phylums Microsporidia. Die Ursache hierfür liegt in einer

zellulären Besonderheit: anstelle der Mitochondrien besitzen sie Mitosomen, welche als

Rudimente früherer Mitochondrien angesehen werden und nur in anaeroben oder

mikroaerophilen Einzellern zu finden sind. Für die weitergehende Untergliederung des

Phylums Microsporidia gibt es zum derzeitigen Stand nicht genügend Untersuchungen (Adl

et al. 2012). Neueste phylogenetische Analysen von James et al. lassen jedoch vermuten,

dass Microsporidia und Cryptomycota ein gemeinsames Phylum von Endoparasiten bilden

könnten (James et al. 2013). Unter den Blastocladiomycota sind begeißelte, saprobische

und/oder parasitäre Pilze zusammengefasst.

1.3 Morphologie

Ganz allgemein versteht man unter Pilzen Mikroorganismen, die entweder als Einzelzellen

(Hefen) oder multizelluläre Kolonien (Schimmelpilze) wachsen. Während sich die Größe

einer Hefezelle mit etwa 3-10 µm beschreiben lässt, ist die des Schimmelpilzes aufgrund

seines Zellverbundes nicht definierbar (Kayser et al. 1989). Er zeigt als Grundgestalt oftmals

eine verzweigte Struktur mit einem Durchmesser von etwa 2-10 µm, welche als Hyphe

(griech. hyphe = Netz) bezeichnet wird (Kayser et al. 1989). Hyphen können sowohl septiert

(Latein: septum = Abtrennung, Abteilung) als auch unseptiert vorliegen und mehrere

Zellkerne besitzen (Kayser et al. 1989; Weber 2010). Das beim Koloniewachstum

entstehende Geflecht aus Hyphen wird in seiner Gesamtheit Myzel genannt. Derjenige Teil,

der in das Nährsubstrat eindringt, markiert das vegetatives Myzel, während der an der

Oberfläche verbleibende Teil als Luftmyzel charakterisiert ist (Kayser et al. 1989; Weber

2010). Hefen sind nur unter bestimmten Umständen in der Lage sog. Pseudohyphen zu

bilden (Dimorphismus): bei der Knospung spalten sich dabei die Tochterzellen nicht

vollständig von den Mutterzellen ab. Dabei entstehen typische Einschnürungen der

Zellwände. Dimorphismus tritt auch bei einigen Schimmelpilzen unter anaeroben

Bedingungen auf: einige Mucor-Arten bilden bei Abwesenheit von Sauerstoff Hyphen und

auch Einzelzellen wie Hefen aus (Kayser et al. 1989; Weber 2010; Baumgart et al. 2012).

1 EINLEITUNG

5

Die meisten bekannten Arten besitzen eine chitin- und glucanhaltige Zellwand. Eine

Ausnahme stellt hier Rozella dar: dieser Pilz weist nur ein zellwandumhülltes und damit

umweltresistentes Sporangium auf (James et al. 2006; Jones et al. 2011a, 2011b; Livermore

und Mattes 2013).

1.4 Bedeutung von Pilzen in Lebensmitteln

1.4.1 Allgemeine Bedeutung – vom Produzenten zum Destruenten

Prinzipiell gibt es drei Gründe, warum die Anwesenheit eines Mikroorganismus in einem

Lebensmittel wichtig sein kann (Fleet 1992):

1. Der Mikroorganismus führt eine gewünschte Veränderung des Produktes wie

z.B. eine Fermentation durch.

2. Der Mikroorganismus verändert das Produkt auf unerwünschte Weise und

kann damit den Verderb einleiten.

3. Der Mikroorganismus ist pathogen und stellt damit ein potentielles Risiko für

die Gesundheit dar.

Hefen und Schimmelpilzen kann jede dieser drei Rollen in Lebensmitteln zugeschrieben

werden. Sie sind bei der Herstellung von Bier, Wein, Joghurt und Käse beteiligt (Baleiras

Couto et al. 1996; Boekhout und Robert 2003; Hatoum et al. 2012), können aber gleichzeitig

zum Verderb führen (Fleet 1992). Außerdem kann der Befall eines Lebensmittels mit

mykotoxinbildenden Hyphomyceten vor allem bei immungeschwächten Menschen (und

Tieren) zu gesundheitlichen Schäden führen (Baumgart et al. 2012). Weniger als ein

Dutzend Pilze sind für über 90 Prozent aller Pilzinfektionen, welche durch Allergene oder

Toxine bzw. einen direkten Wirtbefall eine Immunantwort auslösen, verantwortlich

(Yamaguchi et al. 2007).

Jeder Prozessschritt und die Lagerung eines Produktes birgt die Gefahr einer Kontamination

mit Pilzen (Baleiras Couto et al. 1996). Durch ihre lipolytischen und proteolytischen

Eigenschaften können sie das Lebensmittel stark verändern, so dass neben der strukturellen

Modifikation oft auch eine Beeinträchtigung des Geschmacks, des Geruches und/oder der

Farbe registriert werden kann (z.B. Debaryomyces hansenii, Yarrowia lipolytica) (Fleet 1992;

Boekhout und Robert 2003; Rawsthorne und Phister 2006; Lucera et al. 2012). Bei

Fruchtsäften kann es zur Ausbildung einer Trübung oder eines Bodensatzes kommen (Back

2000; Baumgart et al. 2012). Diese Veränderungen können letztlich bis zum Verderb des

Produktes führen, welcher mit wirtschaftlichen Verlusten einhergeht (Back 2000; Boekhout

und Robert 2003; Rawsthorne und Phister 2006; Baumgart et al. 2012).

Grundlegend werden zwei Arten von Kontaminationen unterschieden: Bei der

Primärkontamination liegt bereits ein Befall des eingesetzten Rohstoffes wie z.B. Früchten

1 EINLEITUNG

6

vor, während bei der Sekundärkontamination der Befall während des Prozessablaufs auftritt

(Back 2000). Dies kann beispielsweise im Abfüllbereich eines Getränkeherstellers durch

unzureichend gesäuberte Flaschen, Sporen in der Raumluft oder über Schwitz-, Tropf- und

Sprühwasser vor dem Verschließen der Flaschen geschehen (Back 2000, 2008). Prinzipiell

ist eine Kontamination von intrinsischen (z.B. pH-Wert, Sauerstoffverfügbarkeit, Inhaltsstoffe,

Wasseraktivität) und extrinsischen Faktoren (z.B. Lagerungstemperatur, Lagerungsdauer,

Luftfeuchtigkeit) abhängig (Fleet 1992; Baumgart et al. 2012; Lucera et al. 2012).

Verderbspilze gehören meist den Phyla Asco- und Basidiomycota sowie dem Subphylum

Mucoromycotina an. Hefen zeigen einen meist stark ausgeprägten fermentativen Charakter

und eine hohe Osmotoleranz. Einige Arten wie z.B. Zygosaccharomyces bailii sind resistent

gegenüber bestimmten Konservierungsmitteln (Fleet 1992; Back 2000; Baumgart et al.

2012). Hyphomyceten können Produkte mit geringer Wasseraktivität befallen: der extrem

xerophile Pilz Xeromyces bisporus kann bei einem aw-Wert von 0,62 noch wachsen (Leong

et al. 2011). In Abhängigkeit der Säure tolerieren Schimmelpilze pH-Werte von etwa 3,0 bis

8,0 (Baumgart et al. 2012). Es finden sich psychrotrophe bis thermophile Vertreter, die meist

aerob, aber teilweise auch anaerob wachsen können (Baumgart et al. 2012).

1.4.2 Kontamination von alkoholfreien Getränken

Der Begriff der Alkoholfreien Getränke (Abk. AfG) umfasst lebensmittelrechtlich

eigenständige Getränkegattungen wie Fruchtsäfte, -nektare und Erfrischungsgetränke sowie

deren Erzeugnisse, aber auch Tafel-, Quell- und natürliche Mineralwässer (Back 2000).

Alkoholfreie Getränke (AfG)

hochsafthaltige

Getränke

nichtalkoholische aromatisierte

Getränke

Wässer

Abbildung 2: Einteilung der alkoholfreien Getränke Nach Back (Back 2000)

Säfte und Nektare

Fruchtsäfte

Fruchtnektare

Fruchtsirupe

Gemüsesäfte

Gemüsenektare

milchsauer vergorene

Gemüsesäfte bzw. -nektare

Erfrischungsgetränke

Fruchtsaftgetränke

X-Saftgetränke

Limonade

Cola-Limonaden

Brausen

Mineralstoff-Getränke

„Mineralwasser plus

Frucht―-Getränke

Brennwertreduzierte und –

arme Erfrischungsgetränke

Tafelgetränke

natürliches Mineralwasser

Quellwasser

Tafelwasser

Diätnektare Diätgetränke Heilwasser

1 EINLEITUNG

7

Dabei dürfen Fruchtsäfte einen Alkoholgehalt von 0,5% Vol. aufweisen - eine Ausnahme

stellt Traubensaft dar: hier wird nach der Verordnung EWG 822/87 des Rates vom 16. März

1987 über die gemeinsame Marktorganisation für Wein Anhang I (Nr. L84/43 ff.) bis zu

1% Vol. Alkohol geduldet.

Säfte und Nektare sind im Allgemeinen sehr nährstoffreich und bilden damit eine geeignete

Wachstumsgrundlage für Mikroorganismen. Aufgrund ihrer hohen Konzentration an

Fruchtsäuren und dem damit verbundenen niedrigen pH-Wert von etwa 2,5 - 4,5 begrenzt

sich das Spektrum möglicher Kontaminanten jedoch auf acidophile bzw. -tolerante Hefen,

Schimmelpilze und Alicyclobacillus sowie Essig- und Milchsäurebakterien (Pettipher et al.

1997; Back 2000; Wareing und Davenport 2000; Arias et al. 2002; Ros-Chumillas et al. 2002;

Baumgart et al. 2012). Ätherische Öle, die vor allem bei der Verarbeitung von Zitrusfrüchten

frei werden, hemmen das Wachstum von Kontaminanten. Bei stillen Getränken wird, sofern

die Verpackung dies zulässt, eine schonende Hitzebehandlung zur Abtötung von

Kontaminanten durchgeführt (Fleet 1992; Arias et al. 2002), so dass lediglich ein Restrisiko

des Befalls durch hitzeresistente, aber meist seltene Keime wie Byssochlamys fulva,

Neosartorya fischeri und Talaromyces flavus besteht (Back 2000; Wareing und Davenport

2000; Baumgart et al. 2012). In karbonisierten Getränken engt das anaerobe Milieu die

Gruppe möglicher Verderbsorganismen zusätzlich stark ein. Durch die zugesetzte

Kohlensäure muss der Organismus acidophil, (fakultativ) anaerob oder zumindest

mikroaerophil sein. Dies trifft nur noch auf gärfähige Hefen und Milchsäurebakterien zu.

Damit kann – bei gewährleisteter Keimfreiheit der Rohstoffe und Betriebsanlagen – eine

Kaltabfüllung des Getränks stattfinden (Back 2000; Arias et al. 2002). Erfrischungsgetränke

wie Brausen und Limonaden haben neben der zugesetzten Kohlensäure noch das geringe

Nährstoffangebot als Kontaminationsschutz (Back 2008).

Sowohl in stillen als auch karbonisierten Getränken kann ein Befall mit Saccharomyces

cerevisiae auftreten (Arias et al. 2002; Casey und Dobson 2004), welcher als häufigster

Limonadenschädling anzusehen ist (Back 2000). Die Hefe kann den im Getränk

vorhandenen Zucker (z.B. Glucose, Fructose, Maltose) verwerten, was zur Entstehung von

typischen fruchtesterartigen Gäraromen und Alkoholen führt (Fleet 1992; Back 2000). Dies

geht z.T. mit unangenehmen Geschmacks- und Geruchsänderungen einher. Durch das bei

der Gärung entstehende Kohlenstoffdioxid kommt es zu Verpackungsbombagen (Fleet

1992). Infolge der pektolytischen Aktivität klaren fruchttrübe Getränke aus und zeigen eine

verstärkte Bodensatzbildung. Stämme, die in alkoholfreien Getränken auftreten, sind meist

säuretoleranter als Brauereihefen (Back 2008). Prinzipiell ist auch eine Kontamination mit

einem Brauereistamm möglich (Back 2000, 2008).

In Fruchtzubereitungen wie Fruchtsirupen, -konzentraten, -pürees und Fruchtmark findet sich

am häufigsten ein Befall durch Zygosaccharomyces bailii (Back 2000, 2008; Casey und

1 EINLEITUNG

8

Dobson 2004; Rawsthorne und Phister 2006), da dieser Keim eine hohe Osmo- und

Säuretoleranz aufweist und zudem bei niedrigen Wasseraktivitäten und geringem

Sauerstoffgehalt wachsen kann (Fleet 1992; Steels et al. 1999; Back 2000, 2008;

Rawsthorne und Phister 2006). Wie Saccharomyces-Stämme bildet Zygosaccharomyces

unerwünschte Alkohole und Kohlensäure, wodurch Geschmacks- und Geruchsänderungen

eintreten (Steels et al. 1999; Back 2000).

Eine Kontamination mit Hyphomyceten ist nur in stillen Getränken möglich. Aufgrund ihres

Sauerstoffbedarfs können sie nur an der Flüssigkeitsoberfläche, im Flaschenhals oder den

Verschlüssen wachsen (Back 2000, 2008; Boekhout und Robert 2003). Sie bilden meist

einen sichtbares Myzel im Getränk aus (Back 2008). Die metabolische Umsetzung der

zugegebenen Konservierungsstoffe ist z.B. durch Arten wie Penicillium roquefortii möglich

(Back 2000, 2008). Sichtbar wird eine Kontamination vor allem bei abgefüllten, fruchttrüben

Getränken: infolge der pektolytischen Aktivität zeigt sich zunächst ein Wasserkragen am

Flaschenhals, welcher sich letztlich durch das gesamte Getränk zieht. Die abgebauten

Pektine fallen flockig zu einem starken Bodensatz aus (Back 2000, 2008). Penicillium- und

Aspergillus-Arten gelten als häufigste Luftkeime, während hitzeresistente Askosporen von

Schimmelpilzen wie Byssochlamys Primärkontaminationen auslösen (Back 2000, 2008;

Wareing und Davenport 2000).

Weitere Kontaminanten stiller Getränke sind verschiedene Candida-Arten wie C. parapsilosis

oder C. intermedia, Torulaspora delbrueckii, Pichia spp., Hanseniaspora spp. und

Metschnikowia spp. (Back 2000; Arias et al. 2002; Casey und Dobson 2004). Rhodotorula

und Cryptococcus können sich aufgrund des hohen Sauerstoffbedarfs selbst in stillen

Getränken kaum vermehren und treten daher als Latenzkeime in Erscheinung (Back 2008).

1.5 Angewandte Methoden zum Nachweis von Pilzen

Besonders für den Nachweis von Fungi in Lebensmitteln wurde in den letzten Jahrzehnten

bereits eine Vielzahl an mikro- und molekularbiologischen Detektionsverfahren entwickelt

und beschrieben.

Prinzipiell gilt es zwei Arten zu unterscheiden:

1. direkte Methoden, z.B. Anzucht der Organismen auf Agar oder in Flüssigkultur

2. indirekte Methode, bei der ein Genprodukt des Organismus nachgewiesen wird, z.B.

Enzymassays

Die angewandten Detektionsverfahren decken beinahe alle Bereiche der mikro- und

molekularbiologischen Methoden ab. Auf einige wichtige soll in den nächsten Abschnitten

genauer eingegangen werden.

1 EINLEITUNG

9

Tabelle 1: Auflistung der Methoden zum Nachweis von Fungi

Methode Prinzip Identifikation Quantifizierung

mikrobiologisch

Universalmedien Beurteilung des Koloniewachstums (Morphologie, Koloniezahl etc.) und evtl. Gasbildung

(X) X Selektiv-/Differentialmedien

X X

Durchflußzytometrie und FACS

Nachweis von Zielorganismen über Fluoreszenz*

X X

Impedanz

Messung des Wechselstromwiderstands an Elektroden durch Wachstum/Absterben

- X

molekularbiologisch

(Real-time)-PCR Nachweis eines Genabschnittes mit universellen oder spezies-/artspezifischen Primern

X X

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (Abkz. RFLP)

Nachweis eines Genabschnittes mit universellen Primern mit anschl. Restriktionsverdau und Gelelektrophorese

X -

Randomly amplified polymorphic DNA Assay (Abkz. RAPD)

Zufälliger Nachweis von undefinierten Genabschnitten und anschl. gelelektrophoretische Auftrennung

X -

ELISA Nachweis von Proteinen X X

Chromatographie Nachweis bestimmter Metabolite (z.B. Alkohole, Säuren, Mykotoxine)

X X

Spektroskopie Analyse bestimmter Metabolite X X

Kolorimetrie Bestimmung einer Farbänderung in Flüssigkeit

- X

Fluorenzmikroskopie

Markierung von Zellen/Zellbestandteilen mit bestimmten Farbstoffen/ Gensonden

X X

(Loureiro 2000; Huang et al. 2003) X zur Identifikation/Quantifizierung anwendbar (X) zur Identifikation/Quantifizierung eingeschränkt anwendbar - zur Identifikation/Quantifizierung nicht anwendbar * nicht anwendbar für Hyphomyceten (nur für Einzelzellen)

1.5.1 Mikrobiologischer Nachweis

In der Lebensmittelindustrie ist die konventionelle, mikrobiologische Untersuchung einer

Probe auf Abwesenheit bzw. das Auszählen von Organismen auf Nährbodenplatten mit

anschließender makro- und/oder mikroskopischer Betrachtung häufig noch der Goldstandard

(Hierro et al. 2006). Aus diesem Grund wurde in den letzten Jahrzehnten eine Vielzahl an

Nährmedien zur Anzucht, Isolation und Selektion von Hefen und Schimmelpilzen entwickelt,

welche sich in Universal- und Selektivnährmedien untergliedern lassen.

Universalmedien variieren zumeist in der eingesetzten Zucker- (z.B. Glucose, Fructose,

Sucrose) und Stickstoffquelle (z.B. Pepton, Trypton, Casein) sowie den weiteren komplexen

Zusätzen (z.B. Hefe-, Malzextrakt) (Wareing und Davenport 2000). Gemein haben sie die

Anforderung durch ein breites Nährstoffangebot das Wachstum möglichst vieler relevanter

1 EINLEITUNG

10

Pilze zu erlauben und zu fördern, während Fremdkeime wie Bakterien unterdrückt werden

sollten. Letzteres wird durch die Zugabe von Antibiotika wie z.B. Chloramphenicol,

Chlortetracycline, Oxytetracycline oder Streptomycin oder das Senken des pH-Wertes auf

3,5 erreicht. Üblich ist jedoch die Verwendung von Antibiotika, da die Wiederfindungsrate

höher ist. Chloramphenicol eignet sich besonders, da es hitzestabil ist und daher vor dem

Autoklavieren dem Medium zugesetzt werden kann (Baumgart et al. 2012). Derzeit existiert

allerdings kein Medium, das den Anforderungen aller Pilze genügt, da in vielen Fällen

entweder Hefen oder Hyphomyceten im Fokus stehen. Des Weiteren ist die Wahl des

Mediums von der zu untersuchenden Probe abhängig (Baumgart et al. 2012). Das

Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Medium (engl. yeast extract glucose chloramphenicol

broth, Abkz. YGC), das Hefeextrakt-Malzextrakt-Glucose-Medium (engl. yeast extract malt

extract glucose broth; Abkz. YM), der Malzextrakt-Agar (Abkz. MA bzw. MEA), der Würze-

Agar sowie der Trypton-Glucose-Hefeextrakt-Agar (Abkz. TGYA) unterstützen dennoch das

Wachstum einer großen Bandbreite an Pilzen und können demnach als Universalmedien

bezeichnet werden (Baumgart et al. 2012). Es ist ersichtlich, dass eine Vielzahl dieser

Medien einen sehr hohen Zuckergehalt aufweist, welches eine zusätzliche Hemmung

bakteriellen Wachstums zur Folge hat. Nährlösungen wie YGC oder YM werden zur

Untersuchung schwach kontaminierter Lebensmittel als Anreicherungsmedium verwendet.

Selektivnährmedien fördern das Wachstum eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von

Mikroorganismen und sind demnach auf ihre Ansprüche und Fähigkeiten hin angepasst.

Hefearten, von denen eine gewisse Konservierungsstoffresistenz bekannt ist, werden auf

schwach sauren Nährböden wie z.B. Malzextrakt-Agar oder TGYA mit 0,5-1 % Essigsäure

angezogen (Rawsthorne und Phister 2006; Baumgart et al. 2012). Proben, in denen eine

hohe Keimzahl osmotoleranter Hefen erwartet wird, werden auf Glucose-50- (Abkz. G50)

oder Kartoffel-Dextrose-Agar (Abkz. PDA) mit 60 % Saccharose ausgespatelt (Baumgart et

al. 2012). Bei Lebensmitteluntersuchungen werden häufig Dichloran-Glycerin-Agar (DG18)

oder Dichloran-Bengalrot-Agar herangezogen (Baumgart et al. 2012). Mit der Zugabe von

18 % Glycerin wird der aw-Wert des Mediums herabgesetzt, wodurch xerophile

Schimmelpilze einen geeigneten Nährboden finden. Dichloran und Bengalrot sind

fungistatische Substanzen, die eine inhibierende Wirkung auf schnell wachsende Pilze

haben. Die Identifizierung langsam wachsender Arten wird infolge der Vermeidung von

Überwucherungen ermöglicht (Baumgart et al. 2012).

In der Mikrobiologie finden zwei grundlegende Arten der Keimzahlbestimmung Anwendung:

das Oberflächenverfahren sowie das Koch'sche Plattengussverfahren (Loureiro 2000).

Während das Plattengussverfahren eine Differenzierung zwischen Gär- und Atmungshefen

ermöglicht, aber gleichzeitig durch den erwärmten Agar einen Hitzestress auf die Keime

ausüben kann, werden mit Hilfe des Oberflächenverfahrens höhere Zellzahlen erzielt

1 EINLEITUNG

11

(Boekhout und Robert 2003). Allerdings stößt es infolge des geringen Probevolumens bei

geringen Keimzahlen an Nachweisgrenzen. Diese können durch den Einsatz der

Membranfiltration (Fleet 1992), welche sich mit dem Oberflächenverfahren kombinieren

lässt, oder einer vorhergehenden Anreicherung in Flüssigmedium umgangen werden.

Der Goldstandard in der Fruchtsaftindustrie ist das sog. SSL-Verfahren (Abkz. schneller

Spurennachweis für Limonadenschädlinge), das dem Nachweis osmophiler Hefen dient

(Back 2000; Baumgart et al. 2012). Eine Flüssiganreicherung der Probe unter optimierten

Bedingungen resultiert in einer recht kurzen lag-Phase und begünstigt zudem das

Auskeimen von Sporen (Back 2000). Die Zellvermehrung wird auch in schwach

kontaminierten Proben derart unterstützt, dass ein Überimpfen in eine Gussplatte mit

Orangenfruchtsaft-Agar (Abkz. OFS) bereits nach 24h bis 48h möglich ist. Dieser Agar weist

eine ähnliche Zusammensetzung wie die eingesetzten Getränkeproben auf: Zusatzstoffe wie

ätherische Öle in Kombination mit einem niedrigen pH-Wert bieten den Getränkeschädlingen

bessere Wachstumsbedingungen als der harmlosen Begleitflora (Baumgart et al. 2012).

Nach weiteren 2-5 Tagen kann die makro- und mikroskopische Auswertung erfolgen. In

Abhängigkeit der Probenbeschaffenheit (kohlensäurehaltig, (un-)konservierte Halbware wie

Konzentrat oder Püree, Zuschlagsstoffe, fruchttrübe und klare Getränke etc.) ist festgelegt,

welches Mischungsverhältnis von Probe zu Medium gewählt wird und ob eine direkte

Gusskultur in OFS-Agar sinnvoll ist. Das SSL-Verfahren zeichnet sich durch den geringen

Kostenfaktor und Materialaufwand sowie der relativen Zeitersparnis aus. Eine quantitative

Aussage kann infolge der Anreicherung nicht erfolgen – die Beurteilung der Kontaminanten

steht hier im Vordergrund (Back 2000).

Regelmäßige Qualitätskontrollen können den Befall und damit den Verderb reduzieren

(Casey und Dobson 2004), führen aber bei der mikrobiologischen Durchführung schnell zu

einem enormen Proben- und Arbeitsaufwand. Der hohe Zeitaufwand ist ein weiterer Nachteil

der kultivierungsabhängigen Techniken (Dlauchy et al. 1999; Arias et al. 2002; Bleve et al.

2003; Phister und Mills 2003; Casey und Dobson 2004; Hierro et al. 2006; Nocker und

Camper 2006). Hinzukommen die teilweise schwierige Beurteilung der Resultate und deren

ungenügende Reproduzierbarkeit, da je nach eingesetztem Medium und

Inkubationstemperatur variable Resultate erhalten werden (Baleiras Couto et al. 1996;

Nocker und Camper 2006). Gerade in industriellen Prozessen muss ein zeitsparendes,

sicheres Verfahren eingesetzt werden, das ein frühestmögliches Eingreifen in den

Produktionsprozess zulässt (Arias et al. 2002; Bleve et al. 2003; Martorell et al. 2005; Józwa

und Czaczyk 2012). Des Weiteren ist die quantitative Analyse von Schimmelpilzen in einer

Probe nicht möglich, da der Zerschlagenheitsgrad des Myzels der entscheidende Faktor für

die KBE-Bestimmung auf einem Nährboden ist. Die Methode der mikrobiologischen

Kultivierung ist außerdem stark abhängig vom physiologischen Zustand einer Zelle: im sog.

1 EINLEITUNG

12

VNBC-Status (engl. viable but non-culturable – lebend, aber nicht kultivierbar) sind Zellen

zwar metabolisch aktiv, bilden aber auf Nährböden keine Kolonien aus, wodurch eine

Zellzahlbestimmung nicht möglich ist (Bleve et al. 2003; Nocker und Camper 2009; Salinas

et al. 2009; Paparella et al. 2012).

Ein weiteres Verfahren zur Analyse vor allem flüssiger Lebensmittel ist die

Durchflußzytometrie. Der Probe wird hierbei ein fluoreszierender Farbstoff oder ein

fluoreszenzmarkierter Antikörper zugesetzt, welcher sich in oder an den entsprechenden

Zielkeim anlagert. Das Gerät verfügt über eine schmale Küvette, in der die Zellen einzeln per

Überdruck an einem Laserstrahl vorbei geleitet werden, wobei der Strahl in seiner

Wellenlänge mit dem Absorptionsspektrum des eingesetzten Farbstoffs übereinstimmen

muss. Je nach Zellgröße und –form werden Signale zu einem Detektor zurückgeworfen und

aufgenommen. Es werden dabei verschiedene Parameter wie Streulicht und

Fluoreszenzintensität gemessen (Józwa und Czaczyk 2012; Paparella et al. 2012). Aus den

Daten können schließlich quantitative Analysen und Aussagen über den Zellzustand

(Stadium des Zellzyklus, Analyse bestimmter Oberflächenmarker etc.) getroffen werden. Mit

der Weiterentwicklung zum FACS-System (Abkz. Fluorescence activated cell sorting)

werden die identischen Parameter wie bei der Durchflußzytometrie erfasst, gleichzeitig wird

allerdings noch eine Sortierung der Zellen in sterile Auffanggefäße nach den jeweils

ausgesendeten Signalen vorgenommen (Paparella et al. 2012). Voraussetzung zur Nutzung

dieser beiden Techniken ist das Vorliegen einer Einzelzellsuspension (Paparella et al. 2012).

Die Untersuchung schimmelpilzbelasteter Proben ist somit unmöglich. Es müssen Sporen

oder Konidien vorliegen, um zumindest eine qualitative Aussage erhalten zu können. Die

Durchflußzytometrie hat als schnelle, vollautomatisierte Methode Einzug in die

Lebensmittelindustrie gehalten, da sie die Identifikation von Einzelzellen in einer

Zellpopulation sowie zeitgleich die Differenzierung zwischen lebenden, metabolisch aktiven

und toten Zellen ermöglicht (Józwa und Czaczyk 2012; Paparella et al. 2012).

1.5.2 Molekularbiologische Nachweismethoden

Molekularbiologische Nachweisverfahren beruhen auf der Identifikation von Genen oder

Genprodukten eines Organismus oder einer Gruppe von Organismen. Mit der erstmaligen

Erwähnung der Polymerase-Kettenreaktion (Abkz. PCR) durch Saiki et al. im Jahr 1985 und

ausführlichen Beschreibung durch Mullis et al. 1986 wurden viele Varianten hiervon

entwickelt (Saiki et al. 1985; Mullis et al. 1986). Bei der klassischen PCR findet eine

enzymatisch katalysierte Vervielfältigung eines von zwei Primern flankierten DNA-

Abschnittes in einem mehreren Zyklen der Denaturierung, Primeranlagerung und

Strangverlängerung durchlaufenden Temperaturprofils statt (Saiki et al. 1985). Das

entstandene Amplifikat wird entweder direkt gelelektrophoretisch aufgetrennt oder mit

1 EINLEITUNG

13

Restriktionsenzymen verdaut, so dass auf dem Gel ein spezifisches Fragmentmuster

entsteht (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, Abkz. RFLP) (van der Vossen und

Hofstra 1996). Diese Methode ist jedoch sehr zeitaufwändig. Gerade zu Beginn der PCR-

Analytik existierten nur wenige sequenzierte Genome von Mikroorganismen, wodurch

spezies- oder artspezifische Primer Designs nicht möglich waren. Mit der Methode der

Randomly amplified polymorphic DNA (Abkz. RAPD) werden kurze, unspezifische Primer in

einen Reaktionsansatz eingebracht, die dann beliebig DNA-Abschnitte vervielfältigen. Auch

hier liefert die gelelektrophoretische Auftrennung ein spezifisches Muster, das zur

Identifizierung herangezogen werden kann – beispielsweise erlaubt es die Unterscheidung

unter- und obergäriger Hefen von Verderbsorganismen in der Brauerei und liefert dabei

schnellere Resultate als Flokkulationstests (Coakley und Ross 1996). Diese Verfahren

haben gemein, dass eine quantitative Aussage immer nur bedingt möglich, der

Arbeitsaufwand enorm hoch und dabei die Reproduzierbarkeit eingeschränkt ist.

Mit dem Einsatz der thermostabilen Thermus-aquaticus-DNA-Polymerase (Abkz. Taq)

anstelle des Klenow-Fragments der E.coli-DNA-Polymerase I konnten Arbeitsschritte und

Kreuzkontaminationen verringert werden ((Saiki et al. 1988) zitiert nach (Holland et al.

1991)). Die Ausstattung des PCR-Cyclers mit UV-Lampe und Kamera sowie dem

Hinzufügen von Ethidiumbromid, welches später durch andere interkalierende Farbstoffe wie

Hoechst 33258 oder SYBR® Green ersetzt wurde, erlaubten erstmals eine direkte, visuelle

Auswertung (Higuchi et al. 1992, 1993). Eine quantitative Aussage ist aufgrund der

unspezifischen Bindung an jede verfügbare DNA nur in gewissem Maße möglich. Erste

Versuche durch Holland et al. zur Generierung eines spezifischen Produktsignals während

der Amplifikationsphase sollten die weitere Reduzierung des Arbeitsaufwandes,

insbesondere nach erfolgter PCR, einleiten (Holland et al. 1991).

Beim TaqMan-Prinzip wird ein (früher radioaktiv-)markiertes Oligonukleotid, das spezifisch

für den von beiden Primern flankierten Bereich ist, nach Hybridisierung am komplementären

Strang über die 5‗3‗-Exonukleaseaktivität des Enzyms in Mono- und Dinukleotide

abgebaut. Heutzutage weist das Oligonukleotid am 5‗-Ende einen Reporterfarbstoff auf,

dessen Extinktionswellenlänge mit der Absorptionswellenlänge des Quenchers – einem

Fluorophor am 3‗-Ende – übereinstimmt (Cardullo et al. 1988). Durch die räumliche Nähe

beider Fluorophore wird somit bei Anregung des Reporters dessen emittiertes Licht

strahlungsfrei vom Quencher aufgenommen und seinem Emissionsspektrum entsprechend

abgestrahlt. Dieser Effekt wird FRET- oder Förster-Effekt genannt (Förster 1948). Erst bei

Hydrolyse der Sonde und der räumlichen Trennung der Farbstoffe kann das vom Reporter

emittierte Licht einer bestimmten Wellenlänge in Echtzeit von einem Detektor nachgewiesen

und in ein Signal umgewandelt werden. Durch die Online-Überwachung des Experimentes

mittels Computer wird das Verfahren Real-time-PCR genannt (Mülhardt 2009).

1 EINLEITUNG

14

Abbildung 3: Prinzip der TaqMan-PCR Dargestellt ist das Prinzip der TaqMan-PCR nach Holland et al. (Holland et al. 1991). Das Enzym verlängert den von den Primern definierten Genabschnitt. Aufgrund der 5‗3‗-Exonukleaseaktivität hydrolysiert es den doppelsträngigen DNA-Abschnitt, an dem die TaqMan-Sonde spezifisch gebunden hat. Mit der räumlichen Trennung der beiden Farbstoffe (R = Reporter; Q = Quencher) verringern sich die Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, so dass die vom Reporterfluorophor emittierte Strahlung detektiert werden kann (Förster 1948).

Bei Hybridisierungssonden hingegen wird nach der Hybridisierung zweier unterschiedlicher

Oligonukleotide am Zielmolekül in räumlicher Nähe zueinander – ebenfalls unter Ausnutzung

des FRET-Effektes – nur die Lichtstärke des zweiten Farbstoffes gemessen (Mülhardt 2009).

Als Weiterentwicklung zu den TaqMan-Sonden traten in den 90er Jahren Molecular

Beacons - eine Sonderform der Hybridisierungssonden - in Erscheinung, bei denen am 5‗-

und 3‗-Ende zueinander komplementäre Sequenzen liegen, was zur Ausbildung einer

Haarnadelstruktur führt. Damit liegen beide Farbstoffe garantiert räumlich beieinander und

liefern erst bei der Hybridisierung an den komplementären DNA-Strang die gewünschte

Fluoreszenz (Tyagi und Kramer 1996). Nach EN ISO 20838:2006, welche die

„Anforderungen an Amplifikation und Nachweis bei qualitativen Verfahren― festschreibt, sind

spezifische Sonden als eine Möglichkeit zur Identitätsprüfung des generierten Amplifikats in

einem PCR-Reaktionsmix erklärt.

In den ersten Amplifikationszyklen kann eine exponentielle Vermehrung der DNA stattfinden

(Mülhardt 2009). Mit der zunehmenden Produktmenge treten dann erste Störfaktoren in

Erscheinung: Primer, Sonden und Nukleotide werden aufgebraucht und infolge der

wiederkehrend hohen Temperaturen verliert die Polymerase an Effizienz (Mülhardt 2009).

Dies führt schließlich zu einer verlangsamten Reaktion, welches sich in einem linearen

Anstieg der Fluoreszenzsignalkurve wiederspiegelt (Mülhardt 2009). Beim endgültigen

Stillstand der Reaktion ist schließlich keine weitere Erhöhung der Fluoreszenzsignale zu

verzeichnen (Mülhardt 2009). Für die Quantifizierung einer Probe wird die Reaktionskinetik

genutzt: derjenige Zyklus der exponentiellen Phase, in dem das spezifische Produktsignal

erstmals das Hintergrundsignal überschreitet (Abkz. CT, engl. threshold cycle oder Cp, engl.

Crossing point), ist bedeutend (Mülhardt 2009). Durch das Mitführen eines Standards

bekannter DNA-Menge kann die ursprüngliche DNA-Menge der Probe ermittelt werden,

indem man die CT-Werte des Standards gegen den Logarithmus der anfangs eingesetzten

DNA–Mengen aufträgt. Mit der erhaltenen Standardkurve kann über den CT-Wert der Probe

der Gehalt an Ziel-DNA bestimmt werden (Mülhardt 2009).

1 EINLEITUNG

15

Die Polymerase-Kettenreaktion zeichnet sich vor allem durch ihre hohe Spezifität aus: sie

ermöglicht die Identifikation von Organismusgruppen (Gattungen, Familien, Ordnungen)

ebenso wie die einer Spezies oder Subspezies in verschiedenen Matrizes (alkoholfreie und –

haltige Getränke, Milchprodukte, Kosmetika, klinische Proben etc.) (Arias et al. 2002; Ros-

Chumillas et al. 2002; Bleve et al. 2003; Brinkman et al. 2003; Casey und Dobson 2004;

Martorell et al. 2005; Hierro et al. 2006; Rawsthorne und Phister 2006; Yamaguchi et al.

2007; Vollmer et al. 2008; Salinas et al. 2009). Prinzipiell besteht beim Einsatz von Matrizes

die Gefahr der Freisetzung von Störstoffen für die PCR. Dies können Polyphenole, Fette,

Proteine und Polysaccharide sein, die dann zur Inhibition oder zum kompletten Verhindern

einer Reaktion führen (Ros-Chumillas et al. 2002). Um dennoch Aussagen darüber zu

erhalten, ob eine PCR-Reaktion erfolgreich verlaufen ist, wurden interne

Amplifikationskontrollen (Abkz. IAK) eingeführt (Fittipaldi et al. 2012): bei der homologen IAK

wird die Amplifikation mit denselben Primern wie für die Ziel-DNA durchgeführt, während die

Zielregionen für die Sonden unterschiedlich und sie selbst verschieden fluoreszenzmarkiert

sind. Heterologe IAKs hingegen sehen die Amplifikation mit einem zweiten Primerpaar vor,

wobei auch hier die gleiche, aber modifizierte (Mutagenese, Sequenzvariationen) Zielregion

genutzt werden kann (Lee et al. 2004). Da die Reagenzien für die IAK grundsätzlich im PCR-

Mix zugesetzt sind, kann für jede einzelne Probe der Amplifikationserfolg festgestellt werden.

Das Mitführen einer internen Amplifikationskontrolle ist mittlerweile in den ISO-Normen EN

ISO 22174:2005 und EN ISO 20383:2006 festgeschrieben.

1.5.3 Lebend/Tot-Differenzierung

Ein wesentlicher Nachteil der Polymerase-Kettenreaktion ist die fehlende Differenzierung

zwischen lebenden und toten Zellen. Insbesondere nach der Durchführung entsprechender

Keimabtötungsverfahren verbleibt die DNA toter bzw. inaktivierter Zellen im System und

liefert ein falsches Bild über den Dekontaminationserfolg. Bereits im Jahr 1993 konnte

Josephson festhalten, dass die DNA inaktivierter Organismen - in diesem Fall

hitzebehandelte E. coli-Kulturen – nach bis zu 3 Wochen Lagerung bei 4°C in der PCR

nachgewiesen werden kann, während auf Nährmedien kein Wachstum mehr zu verzeichnen

war (Josephson et al. 1993). Falschpositive Resultate oder eine erhöhte Wertausgabe bei

der DNA-Quantifizierung sind die Folge (Nocker und Camper 2006). Ein Umstieg vom DNA-

auf den RNA-Nachweis kann dieses Problem vermeiden und wurde gerade in den 90er

Jahren als Detektionsverfahren für metabolisch aktive Zellen eingesetzt (McKillip et al. 1998;

Fittipaldi et al. 2012). Nur wenige RNA-Moleküle sind über einen längeren Zeitraum stabil.

Dies ist vor allem von der verwendeten Extraktionsmethode und den extrinsischen Faktoren

abhängig (Nocker und Camper 2009). Man geht davon aus, dass infolge des hohen

Degradierungsgrades nur RNA lebender Zellen in der PCR nachgewiesen wird. Die Methode

1 EINLEITUNG

16

stößt jedoch an ihre Grenzen, da zum einen bei der RNA-Extraktion eine Kontamination mit

RNasen, also RNA degradierenden Enzymen, nicht ausgeschlossen werden kann und damit

eine Reproduzierbarkeit erschwert ist und zum anderen die RNA-Expression vom jeweiligen

physiologischen Zustand der Zelle abhängig ist, wodurch eine quantitative Aussage

problematisch ist (Fittipaldi et al. 2012). Weiterhin wird der RNA-Anteil jeweils nur indirekt

nachgewiesen, da sie zunächst von der Reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben

wird und damit bereits eine gewisse Fehlerquote in Abhängigkeit von der Enzymaktivität etc.

vorliegt (Mülhardt 2009).

Einen weiteren Differenzierungsnachweis liefert der Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen mit

anschließender Betrachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Als Fluorophore werden

u. a. Fluoresceindiacetat, Propidiumiodid (Abkz. PI) oder Ethidiummonoazid (Abkz. EMA)

verwendet (Nelson et al. 2000; Hickey et al. 2004). Während Fluoresceindiacetat als

Enzymsubstrat agiert, kann es nur von lebenden Zellen aufgenommen und umgewandelt

werden, wogegen Propidiumiodid und Ethidiummonoazid nur geschädigte Zellmembranen

durchdringen können und anschließend in die DNA interkalieren (Hickey et al. 2004; Fittipaldi

et al. 2012). Eine quantitative Auswertung ist durch Auszählen der jeweiligen Zellen zwar

möglich, aber bei einem hohen Durchsatz ein enormer Arbeits- und Zeitaufwand. Schneller

und präziser ginge es mit einem Durchflußzytometer oder FACS, wobei die quantitative

Bestimmung von Hyphomyceten nicht realisierbar ist. Diese Geräte bedürfen zudem

enormer Anschaffungskosten und sehr geschultem Personal, da eine Auswertung durchaus

komplex sein kann.

Im Jahr 2003 setzte die Arbeitsgruppe um Nogva erstmals den interkalierenden Farbstoff

Ethidiummonoazid (auch Ethidiumbromidmonoazid genannt) zur Lebend/Tot-Differenzierung

von Bakterien in Kombination mit der PCR-Reaktion ein (Nogva et al. 2003). Rudi et al.

schlossen sich mit einer Differenzierung in komplexen Matrices an (Rudi et al. 2005).

Ethidiummonoazid (3-Amino-8-azido-5-ethyl-6-phenyl-phenanthridiniumbromid) ist ein

Analogon zu Ethidiumbromid und verhält sich demzufolge ähnlich. Es weist eine komplexe

Ringstruktur mit einer Azid-, einer Amino- und einer Ethylgruppe sowie einen Phenylrest auf

(Laugaa et al. 1983). EMA interkaliert stöchiometrisch ungefähr alle 10 bis 80 bp über

elektrostatische Wechselwirkungen zwischen dem negativgeladenen Phosphatrest der DNA

und dem positivgeladenen Stickstoffatom der Ringstruktur in die DNA (Marx et al. 1997;

Garbett et al. 2004; Fittipaldi et al. 2012). Liegt der Ligand in sehr hoher Konzentration vor,

kann als zweite Bindungsart eine Ionenbindung mit dem Phosphatrückgrat eintreten,

wodurch sich EMA in die DNA-Furchen einlagert (Laugaa et al. 1983; Fittipaldi et al. 2012).

Setzt man den Ligand-DNA-Komplex nach einer Inkubationszeit einer Lichtquelle mit einer

Wellenlänge von etwa 460 nm aus, findet eine photolytische Reaktion statt: die Azidgruppe

der Ringstruktur wird zu einem Nitrenradikal (enthält Doppelbindungen) modifiziert, welches

1 EINLEITUNG

17

hochreaktiv mit organischen Molekülen agiert (Nocker und Camper 2009; Fittipaldi et al.

2010, 2012). Da der Farbstoff zu diesem Zeitpunkt direkt in die DNA eingelagert ist, wird eine

kovalente Bindung mit ihr eingegangen (Nocker und Camper 2009; Agustí et al. 2013). Nicht

gebundene EMA-Moleküle reagieren mit umliegenden Wassermolekülen zu nicht-reaktiven

Hydroxylaminen (Nocker und Camper 2006, 2009; Fittipaldi et al. 2012)

Dieser Effekt kann für eine Lebend/Tot-Differenzierung ausgenutzt werden, sofern eine

Behandlung der Probe vor die eigentliche DNA-Extraktion geschaltet wird. Nach Zugabe

einer EMA-haltigen Lösung lagert sich der Farbstoff an freie DNA an oder dringt in

geschädigte Zellen bzw. Hyphen ein und interkaliert dort in die verfügbare DNA (Rawsthorne

and Phister 2006; Nocker und Camper 2009). Da EMA eine lichtempfindliche Agenz ist,

müssen Zugabe und Inkubation ohne direkte Lichtquelle durchgeführt werden. Nach der

Photolyse kann die DNA inaktivierter Organismen nicht mehr in der PCR nachgewiesen

werden. Hierfür existieren verschiedene Annahmen: Fittipaldi et al. gehen davon aus, dass

durch die Anlagerung des Farbstoffs eine strukturelle Modifikation eintritt, die dem Enzym die

Amplifikation dieses DNA-Abschnittes nicht ermöglicht (Fittipaldi et al. 2012). Die

Arbeitsgruppe um Nocker zieht in Erwägung, dass durch die Anlagerung des Farbstoffs die

DNA unlöslich wird und während der weiteren DNA-Extraktion zusammen mit Zelldebris

ausfällt. In einer Studie konnten sie zeigen, dass bei Extraktionen unter Einsatz von

Silikakugeln deutlich rotgefärbte Zelldebris ausfallen, sofern inaktivierte Zellen in der Probe

vorhanden waren (Hein et al. 2006). Dies wird mit den elektrostatischen Interaktionen

zwischen dem positivgeladenem Farbstoff und der negativgeladenen DNA, welche an

Silikaharzen haftet, erklärt (Hein et al. 2006; Fittipaldi et al. 2012). Eine weitere Ursache für

die fehlende Amplifikation kann in einer Fragmentierung der DNA nach der Photolyse liegen,

welche durch elektronenmikroskopische Bilder sichtbar wurde (Soejima et al. 2008; Fittipaldi

et al. 2012).

Neben Ethidiummonoazid kann auch Propidiummonoazid (Abkz. PMA, 3-Amino-8-azido-5-

[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridiniumdichlorid) als interkalierender

Farbstoff zur Lebend/Tot-Differenzierung eingesetzt werden (Nocker und Camper 2006;

Schmidlin et al. 2010). PMA gehört zu den Propidiumiodid-Derivaten und weist im Vergleich

zu EMA ein zusätzliches positivgeladenes Stickstoffatom innerhalb der Propylseitenkette auf

(Nocker und Camper 2006; Fittipaldi et al. 2012). Da für EMA in Abhängigkeit von

Konzentration, Einwirkzeit und zu behandelnder Spezies eine gewisse Zytotoxizität infolge

des Eindringens in intakte Zellen berichtet wurde, wurde vor allem bei Bakterienkulturen der

Einsatz von PMA bevorzugt (Nogva et al. 2003; Rudi et al. 2005; Nocker und Camper 2006).

Anfällig sind auch alternde oder sich teilende Zellen. Aufgrund der höheren Ladung ist PMA

weitgehend impermeabel und liefert damit weniger suppressive Daten (Nocker und Camper

2006).

1 EINLEITUNG

18

1.6 Ziele der Arbeit

Die Ziele dieser Arbeit sollten die Entwicklung und Optimierung eines sensitiven und

spezifischen Real-time-PCR-Assays auf Basis der TaqMan®-Sondentechnologie zur

Quantifizierung von Pilz-DNA sowie einer dazugehörigen Probenaufbereitung sein. Die

Probenaufarbeitung sollte eine Differenzierung zwischen lebenden und toten

Mikroorganismen erlauben, um den Erfolg von Dekontaminationsverfahren sinngetreu

abbilden zu können. Je nach zu untersuchendem Produkttyp sollte eine vorherige

Anreicherung in geeignetem Medium optimiert werden. Das Verfahren sollte für den Einsatz

in der getränkeindustriellen Qualitätssicherung geeignet sein.

Zunächst sollten bereits vorliegende Primerkandidaten mit einer Vielzahl unterschiedlicher

Ziel-DNA überprüft werden. Wichtig war vor allem die eindeutige Abgrenzung zu

Organismen, die als Begleitflora in den Matrices anwesend sein könnten. Hierfür sollte die

DNA von Bakterien und Pflanzen mit den jeweiligen Primerkandidaten getestet werden.

Weiterhin spielte die Implementierung einer internen Amplifikationskontrolle als Indikator

einer möglichen Inhibition der PCR-Reaktion sowie die Generierung eines Positivstandards

zur späteren Quantifizierung des DNA-Gehaltes eine wesentliche Rolle. Für den PCR-Assay

sollte eine geeignete Probenaufarbeitungsmethode erarbeitet werden, mit der ein schneller,

sensitiver Nachweis fungoider Organismen in alkoholfreien Getränken erreicht würde. Für

Proben, die auf Abwesenheit pilzlicher Verderbskeime untersucht werden sollten, sollte eine

optimierte Anreicherungsphase entwickelt werden. Klare, nicht-karbonisierte Getränke

sollten für ein höheres Probevolumen mit einer Filtrationstechnik behandelt werden. Von

besonderer Wichtigkeit war die Entwicklung eines Verfahrens auf Basis eines

interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs zur Lebend/Tot-Differenzierung, so dass nur die DNA

lebender/metabolisch aktiver Zellen in der PCR nachgewiesen würde.

2 MATERIAL UND METHODEN

19

2 Material und Methoden

2.1 Geräte

Tabelle 2: Übersicht der verwendeten Geräte

Art Gerätename Hersteller

Autoklav Typ 5075 ELV Systec, Wettenberg

Elektrophoresekammer Mini horizontal Midi horizontal

BaackLab, Schwerin

Feinwaage BP 2100 S ALJ 220-4NM

Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen

Kamera, Geldokumentation DP-CF-110.C Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell

LED-Lichtquelle PhAST Blue GenUIL

Magnetheizrührer RH basic 2 IKAMAG® IKA

®-Werke GmbH & Co. KG,

Staufen

Mikroskop Eclipse E400 Nikon Instruments Europe BV, Amsterdam (NL)

Mikrowelle Typ 7839, 700W Severin Elektrogeräte GmbH, Sundern

Minizentrifuge Spectrafuge™ Mini Axon Labortechnik, Kaiserslautern

PCR-Arbeitshaube CleanCab Herolab GmbH Laborgeräte. Wiesloch

PCR-Arbeitshaube mit Cross-Linker

Clean Cab Plus Herolab GmbH Laborgeräte. Wiesloch

PCR-Arbeitshaube PCR Chamber BÄRO GmbH & Co. KG Lufthygiene, Leichlingen

PCR-Gerät GeneAmp® PCR System 9700 PE Applied Biosystems

Deutschland GmbH, Darmstadt

pH-Meter 766 Calimatic Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin

Photometer NanoPhotometer IMPLEN GmbH, München

Pipetten 0,5-1000µl Eppendorf Reference Eppendorf Deutschland, Wesseling-Berzdorf

Real-Time-PCR-Gerät für Kapillaren

LightCycler® 2.0 Roche Diagnostics GmbH, Berlin

Real-Time-PCR-Gerät LightCycler® 480

LightCycler® 480 II

LightCycler® 96

Roche Diagnostics GmbH, Berlin

Real-Time-PCR-Gerät Stratagene Mx3005P Agilent Technologies Deutschland GmbH, Böblingen

Schüttelinkubator Certomat® BS-T B. Braun Biotech International,

Melsungen

Spannungsquelle für Elektrophoresekammer

Electrophoresis PowerSupply EPS 301

Amersham pharmacia biotech Europe GmbH, Nümbrecht

Sterilwerkbank Typ 8511 Köttermann GmbH & Co. KG, Uetze/Hänigsen

Sterilwerkbank Antares, Fisher Bioblock Scientific

Thermoblock QBT CLF Analytische Laborgeräte GmbH, Emersacker

Thermoschüttler Eppendorf 5436 Eppendorf comfort

Eppendorf Deutschland, Wesseling-Berzdorf

UV-Transilluminator ECX-20.M (6x8W 312nm Tube)

Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell

Vakuumpumpe mit Abfallbehälter

Hersteller nicht bekannt


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Art Gerätename Hersteller

Vortexer Reax Top Reax 2000

Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach

Vortexer Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York (USA)

Wasserbad Typ 1083 GFL, Burgwedel

Zellaufschlussgerät Disruptor Genie 2 Scientific Industries, New York (USA)

Zellaufschlussgerät MagNA Lyser Roche Diagnostics GmbH, Berlin

Zentrifuge Centrifuge 5403 Centrifuge 5415 C Centrifuge 5415 D Centrifuge 5417 R Centrifuge 5804

Eppendorf Deutschland, Wesseling-Berzdorf

Zentrifuge Spectrafuge 16M ABIMED GmbH, Langenfeld

2.2 Reagenzien

Tabelle 3: Übersicht der eingesetzten Reagenzien

Reagenz Hersteller

Agarose Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf

Ampicillin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

AntiTaq 2 µg/µl GeneOn GmbH, Ludwigshafen am Rhein

Aqua B. Braun B. Braun Melsungen AG, Melsungen

Buffer P1 Resuspensionspuffer QIAGEN Biotech GmbH, Hamburg

Chelex® 100 BIO-RAD Laboratories GmbH, München

dNTPs (je 100mM) Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

EDTA-Lösung, 0,5M, pH 8 AppliChem GmbH, Gatersleben

Enzyme Solution BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam

Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt

Ethidiumbromid Merck KGaA, Darmstadt

Glycerin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Heringssperma-DNA Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim

Taq Polymerase (DNA free) BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam

Reaktionspuffer (10X) BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam

Isopropanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Magnesiumchlorid Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim

Natriumchlorid Merck KGaA, Darmstadt

Proteinase K Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim

Lyophilisationsreagenz BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam

Reagent D BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam

RNase A QIAGEN Biotech GmbH, Hamburg

10x TBE-Puffer AppliChem GmbH, Gatersleben

Trizma® Hydrochlorid, 1M, pH 7,6 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Tween 80 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) Bioron GmbH, Ludwigshafen am Rhein


21

2.3 Verbrauchsmaterialien

Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterial Hersteller

96x0,2ml Tear-Off 8-Tube Strip-Mat (LP), white + Optical Wide area 8-Cap Strip, natural

BIOplastics, Landgraaf (NL)

0,1 mm bzw. 0,5 mm Zirconia/Glas-Beads Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

foodproof® Sample Preparation Kit II BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam

foodproof® StarPrep Two BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam

LightCycler® 480 Multiwell Plate 96, white +

LightCycler® 480 Sealing Foil

Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim

PCR Clean-Up & Gel Extraction Kit Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting

pGEM®-T Vector System I Promega GmbH, Mannheim

QIAGEN Plasmid Mini Kit QIAGEN Biotech GmbH, Hamburg

Whirl-Pak® (mit/ohne Filter) VWR International, Darmstadt

Farbfixierte Indikatorstäbchen pH-Fix 0.0-6.0 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

PES-Membranfilter Ø25 mm, 0,2 µm Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Polysulfon-Filterhalter Ø25 mm Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

250ml-Duran-Schottflasche mit Zweifach- Flaschenverteiler


Minischlauchverbinder Y-Form Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Silikonschlauch Versilic Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Druckausgleichsset Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Laborverschraubungen für Zweifach-Flaschenverteiler


Luer-Stopfen Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Petrischalen PS, 92x14mm nerbe plus GmbH, Winsen/Luhe

2.4 Puffer und Lösungen

Für die Herstellung von Puffern und Lösungen wurden Reagenzien der Firmen Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe), Sigma-Aldrich/Fluka (Taufkirchen) und Merck KgAa (Darmstadt) verwendet.

1X TE-Puffer (Tris-EDTA-Puffer)

10 mM Trizma® Hydrochlorid (pH 8)

1 mM EDTA

HSTE (Heringssperma-Tris-EDTA-Puffer)

10 µg/ml Heringssperma-DNA 0,5 mM EDTA

1 mM Trizma® Hydrochlorid (pH 8)

pH 7,6

6X Gelladepuffer

125 g/100ml Glycerin 40 ml Xylen Cyanol FF 100 mg 0,1 g/ml Bromphenolblau 1 ml dest. H2O 100 ml

WSH (Wasser standardisierter Härte)

Lösung A: MgCl2 (wasserfrei) 19,84 g/l CaCl2 (wasserfrei) 46,24 g/l

Lösung B: NaHCO3 35,02 g/l Die Lösung B wurde per Membranfiltration sterilisiert.


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WSH: Lösung A 6 ml Lösung B 8 ml auffüllen mit VE-Wasser auf 1000 ml pH 7,0 ± 0,2

Die Wasserhärte beträgt 300 ppm für Kalziumkarbonat. Die Lösung wurde bei 121°C für 15 min autoklaviert.

0,85% Saline mit 0,1% Tween 80

Die Lösung wurde bei 121°C für 15min autoklaviert.

2.5 Nährmedien

Die Angaben zu den pH-Werten verwendeter Medien beziehen sich jeweils auf den Wert bei 25°C Umgebungstemperatur.

2.5.1 Gebrauchsfertige Nährmedien

Tabelle 5: Übersicht der gebrauchsfertigen Nährmedien

Nährmedium Hersteller

Gepuffertes Peptonwasser SIFIN GmbH, Berlin

Orangenfruchtsaftagar Döhler, Darmstadt

SSL-Bouillon Döhler, Darmstadt

2.5.2 Hergestellte Nährmedien

Die für die Nährmedienherstellung benötigten Reagenzien wurden von den Firmen Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe), Merck KgAa (Darmstadt) und AppliChem GmbH (Gatersleben) bezogen. Alle Chemikalien sind vom Hersteller für den Einsatz in der Mikrobiologie ausgewiesen und wurden jeweils in voll entmineralisiertem (Abkz. VE) Wasser gelöst. Angesetzte Nährmedien wurden jeweils bei 121°C für 15 min autoklaviert.

YM-Medium mit Chloramphenicol (yeast extract malt extract broth)

Hefeextrakt 3 g/l Malzextrakt 3 g/l Pepton aus Soja 5 g/l D(+)-Glucose 10 g/l Chloramphenicol 0,1 g/l pH 5,5

Durch die Zugabe von 15 g Agar-Agar wurde festes Nährmedium hergestellt. YGC-Medium (yeast glucose chloramphenicol broth)

Hefeextrakt 5 g/l D(+)-Glucose 20 g/l Chloramphenicol 0,1 g/l pH 6,6

Durch die Zugabe von 15 g Agar-Agar wurde festes Nährmedium hergestellt.

NaCl 8,5 g/l Tween 80 1,0 g/l Auffüllen mit VE-Wasser auf 1000 ml pH 7,2 ± 0,2


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CASO-Bouillon (Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon)

Pepton aus Casein 17 g/l Pepton aus Soja 3 g/l D(+)-Glucose 2,5 g/l NaCl 5 g/l K2HPO4 2,5 g/l pH 7,3 ± 0,2

LB-Medium (lysogeny broth (Bertani 2004), häufig auch: Luria-Bertani)

Trypton 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl 5 g/l Ampicillin 0,1 g/l pH 7

Die Antibiotikazugabe erfolgt erst nach Abkühlung des autoklavierten Mediums auf etwa 50°C.

LB/X-Gal/IPTG-Agarplatten

Trypton 10,0 g/l Hefeextrakt 5,0 g/l NaCl 5,0 g/l Ampicillin 0,1 g/l X-Gal 0,08 g/l IPTG 0,5 mM Agar 15,0 g/l

Die Antibiotikazugabe erfolgt erst nach Abkühlung des autoklavierten Mediums auf etwa 50°C. X-Gal und IPTG wurden kurz vor Verwendung der Agarplatten auf der Oberfläche ausgestrichen.

Malzextrakt-Agar

Malzextrakt 30 g/l Pepton aus Soja 3 g/l Agar 15 g/l

Glucose-50-Agar

D-Glucose 500 g/l Hefeextrakt 5 g/l Malzextrakt 10 g/l Agar-Agar 15 g/l H2O demin. 500 g/l pH 4,5

Natriumchlorid-Peptonpuffer

KH2PO4 18 g/l Na2HPO4x2H2O 36 g/l NaCl 21,5 g/l Pepton aus Casein 5 g/l pH 7±0,2

2.6 Oligonukleotide

Die eingesetzten Primer wurden bei den Firmen Ella Biotech GmbH (Martinsried) bzw. eurofins MWG GmbH (Ebersberg) synthetisiert, während Sonden bei der Metabion International AG (Martinsried) bzw. biomers.net GmbH (Ulm) bezogen wurden. Oligonukleotide mit LNA™-Basen wurden bei der Firma Exiqon A/S (Dänemark) in Auftrag gegeben. Der verwendete Nukleotidcode beruht auf den Vorgaben des Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (Abkz. NC-IUB) (Cornish-Bowden 1985). Lyophilisierte Oligonukleotide wurden mit Aqua B.Braun entsprechend den Herstellerangaben resuspendiert.


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2.6.1 Sequenzen zur Amplifikation der 28S rDNA-Sequenz

Tabelle 6: Sequenzen der 28S rDNA-spezifischen Primer

Die Sequenzen der Hydrolysesonden (Abkz. FungiP) sowie der zusätzlichen Primer sind nicht gezeigt, da diese nicht im Rahmen dieser Arbeit erstellt wurden. Der Primer FungiRv3LNA enthält an Position 18 eine LNA™-Base. Der Primer PlantBlock ist am 3‗-Ende mit einem C3-Spacer blockiert.

2.6.2 Primersequenzen zur Amplifikation eines pflanzenspezifischen Fragments

Tabelle 7: Sequenzen der pflanzenspezifischen Primer

Bezeichnung Sequenz 5‘3‘ Funktion

VegFw1 TAGTCTGGAGAAGCGTCCTCAGC Vorwärtsprimer

VegRv1 TGGCTTTACCCGATAGAACTCG Rückwärtsprimer

2.7 Probenmatrices

Tabelle 8: Übersicht der eingesetzten Getränkematrices

Name der Probe Hersteller/Lieferant

Bananennektar, 25% Fruchtgehalt Eckes-Granini Deutschland GmbH, Nieder-Olm

Fruchtsaftkonzentrat Schwarze Johannisbeere, 100% Fruchtgehalt

Dein Saft GmbH, Dresden

Fruchtsaftkonzentrat Multivitamin, 100% Fruchtgehalt

Dein Saft GmbH, Dresden

Kirsch-Bananensaft Kaiser´s Tengelmann GmbH, Mühlheim/Ruhr

Vita Cola Thüringer Waldquell Mineralbrunnen GmbH, Schmalkalden

Colagrundstoff Brauerei-Probe

Zitronenaroma Brauerei-Probe

Vitaminmischung Brauerei-Probe

Apfelgrundstoff Brauerei-Probe

Malz-Rhabarber-Mischung Brauerei-Probe

Malz-Zitronen-Limetten-Mischung Brauerei-Probe

Invertzucker Brauerei-Probe

2.8 Primer Design

Es galt, eine Zielregion ausfindig zu machen, welche infolge der geringen intraspezifischen Variabilität den Nachweis einer großen Bandbreite fungoider DNA zulässt. Ein solch hochkonservierter Genabschnitt ist die 28S rDNA-Region. Eine Vielzahl an DNA-Sequenzen unterschiedlicher Fungi wurde aus der NCBI-Datenbank (engl. National Center for Biotechnology Information) bezogen und anschließend in das Geneious-Programm eingebunden. Mittels ClustalW-Algorithmus wurden sie aligniert und entsprechende Primerkandidaten festgelegt. Dabei sollte das nachzuweisende Fragment in Hinblick auf eine spätere Quantifizierung eine Sequenzlänge von ca. 100 bis 200bp aufweisen. Eine Vorauswahl geeigneter Kandidaten konnte bereits zu Beginn des Projektes übernommen werden.

Bezeichnung Sequenz 5’ 3’ Funktion

FungiFw1 Vorwärtsprimer

FungiFw2 GTCAGGTTGTTTGGGAATGC Vorwärtsprimer

FungiRv1 Rückwärtsprimer



FungiRv3LNA Rückwärtsprimer mit LNA™-Base


PlantBlock 3‗-Spacer C3 modifizierter Primer für Pflanzen


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Für die Herstellung eines pflanzenspezifischen Plasmids war die Generierung eines DNA-Abschnittes notwendig, welcher den Sequenzbereich der 28S rDNA umfasst. Nach Alignierung von Sequenzen verschiedener Pflanzenspezies, von denen DNA verfügbar war, wurde ein Primerpaar nach den allgemeinen Richtlinien zum Primer Design ausgewählt.

2.9 Stammanzucht

Zur Anzucht von Mikroorganismen wurden Kulturen der hauseigenen Stammsammlung herangezogen. Aus den bei -80°C gelagerten Kulturen wurde mit einer Impföse Zellmaterial entnommen und auf das entsprechende Medium ausgestrichen. Hefen und Schimmelpilze wurden auf YM- bzw. YGC-Agar für 3 bis 7 Tage bei 30°C inkubiert. Xerophile Pilze wurden auf G50- bzw. Malzextrakt-Agar ebenfalls für 3 bis 7 Tage angezogen. Bakterien wurden je nach Nährstoffbedarf auf CASO- oder MRS-Agar bei 30 bis 37°C für 1 bis 2 Tage inkubiert.

2.10 Gewinnung von RNA-freier, quantifizierbarer DNA

Von einer bewachsenen Agarplatte wurde Zellmaterial mithilfe einer Impföse entnommen und in ein Reaktionsgefäß mit Zirkonium-/Glaskügelchen überführt. Bei Schimmelpilzen, die ein Substratmycel gebildet hatten, wurden zuvor Agarreste beseitigt. Für den Aufschluss bakterieller Zellen wurden 150mg Zirkonium-/Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 mm und für Hefen und Schimmelpilze 500 mg Zirkonium-/Glaskügelchen mit 0,5 mm Durchmesser verwendet. Nach Zugabe von 1 ml TE-Puffer wurden die Proben für 1 min bei 8000 xg zentrifugiert (Bei Einsatz von 1 ml Sporensuspension z.B. aus Rhizophagus irregularis entfiel die Zugabe von TE-Puffer). Das Zellpellet wurde anschließend in 200 µl Lysepuffer resuspendiert und bei 95°C für 10 min inkubiert. Der mechanische Aufschluss wurde im MagNA Lyser der Firma Roche Diagnostics für 1 min bei 6500 U vorgenommen. Alternativ kann ein Disruptor Genie Instrument herangezogen werden (10 min). Die aufgeschlossenen Zellen inkubierten anschließend für weitere 15 min bei 95°C. Zur Aufreinigung der DNA wurde dem Protokoll des foodproof

® Sample Preparation Kit II der Firma BIOTECON

Diagnostics GmbH gefolgt. Zur eluierten DNA wurden anschließend 100 µl eines RNase-A-haltigen Puffers (QIAGEN) pipettiert und der Ansatz für 10 min bei 37°C inkubiert. Das Extrakt wurde erneut dem Protokoll der Sample Preparation Kits folgend behandelt. Das finale Elutionsvolumen betrug ebenfalls 100 µl. Verdünnungen der Eluate wurden jeweils mit Heringssperma-TE-Puffer hergestellt. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.

2.11 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration

Die Konzentration der RNAse-verdauten DNA, Plasmid-DNA und Oligonukleotiden wurde mittels Absorptionsspektrometrie bestimmt. Bei einer Wellenlänge von 260 nm wurde die optische Dichte im Nanophotometer der Firma IMPLEN GmbH gemessen. Ein OD260-Wert von 1 entspricht einer Konzentration an doppelsträngiger DNA von etwa 50 µg/ml.

2.12 Gelelektrophorese

Zur visuellen Kontrolle von PCR-Amplifikaten, genomischer DNA und Plasmiden wurde in Abhängigkeit der Fragmentgrößen ein Gel mit 1-2% (w/v) Agarose in 0,5X TBE-Puffer hergestellt und mit je 1 µl je 10 ml Gelvolumen 0,3 µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die Proben wurden im Verhältnis 1:5 mit dem Gelladepuffer gemischt. Als Längenstandards wurden DNA-Leitern der Firma AppliChem (DNA Ladder 100 bp, DNA Ladder 1 kb; jeweils 0,025 µg/µl) aufgetragen. Als Laufpuffer wurde ebenfalls 0,5X TBE-Puffer verwendet. Bei einer Spannung von 120 V erfolgte die elektrophoretische Auftrennung der Fragmente. Zur Visualisierung und Dokumentation der DNA-Banden wurde das System der Firma Vilber Lourmat Deutschland GmbH genutzt.


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2.13 Herstellung kompetenter E.coli XL1-blue-Zellen

Mithilfe der Magnesiumchlorid-Calciumchlorid-Methode wurden kompetente Zellen für eine spätere Transformation hergestellt. Zunächst wurde aus einer bei -80 °C gelagerten E.coli XL1-blue-Stammkultur (Stratagene/Agilent Technologies, Santa Clara (USA)) mit einer Impföse Zellmaterial in 10 ml LB-Medium überführt und über Nacht bei 150 rpm und 37°C inkubiert. Mit 500 µl dieser Vorkultur wurden 50 ml LB-Medium beimpft und aerob bei 37°C und 150 rpm inkubiert bis eine OD550nm von ca. 0,5 erreicht war. Alle nachfolgenden Arbeiten wurden mit vorgekühlten Lösungen und bei 4°C durchgeführt. Der Ansatz wurde zunächst für 15 min auf Eis gelagert und anschließend für 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert. Nachdem der Überstand vorsichtig abgetrennt wurde, wurde das Pellet in 20ml 0,1 M MgCl2 resuspendiert. Nach einer 20minütigen Inkubation auf Eis wurde erneut zentrifugiert (4000 rpm, 10 min). Das Zellpellet wurde in 10 ml 0,1 M CaCl2 aufgenommen, wiederum 20 min auf Eis inkubiert und zentrifugiert (4000 rpm, 10 min). Nach Abnehmen des Überstandes wurde der Ansatz in 1 ml 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert, 250 µl 85%iges Glycerin zugefügt und für 5 min auf Eis inkubiert. Anschließend konnte der Ansatz in Aliquots á 100 µl bei -80°C weggefroren werden.

2.14 Klonierung

In Vorbereitung einer Klonierung mussten zunächst jeweils klonierfähige Amplifikate in einer Polymerasekettenreaktion hergestellt werden. Wichtig war hierbei der Einsatz eines dTTP-haltigen dNTP-Mixes. Die erhaltenen Amplifikate wurden zur Visualisierung in einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die spezifischen Banden wurden unter UV-Licht (70%, 365 nm) mit einem gesäuberten Skalpell ausgeschnitten, in ein 2ml-Reaktionsgefäß überführt und mithilfe des PCR Clean-Up & Gel Extraction Kits der Firma SLG den Herstellerangaben folgend aufgearbeitet. Die eluierte DNA wurde anschließend in der Ligation eingesetzt.

2.14.1 Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats

Zur Überprüfung einer erfolgreichen Unterdrückung der DNA aus Pflanzen, als phylogenetische Verwandte zu Pilzen, wurden 28S-rDNA-spezifische Primer designt. Diese wurden zur Amplifikation eines DNA-Fragmentes in einen PCR-Mastermix eingebracht. Als Ziel-DNA wurde extrahierte DNA aus Banane (lat. Musa acuminata), Erdbeere (lat. Fragaria ananassa), Karotte (lat. Daucus carota, Konz. 110 ng/µl), Erdnuss (lat. Arachis hypogaea, Konz. 25,5 ng/µl), Reis (lat. Oryzae sativa), Soja (lat. Glycine max) und Kürbis (lat. Cucurbita pepo, Konz. 12,5 ng/µl) eingesetzt und in einem Block-Thermocycler vervielfältigt.

Tabelle 9: Protokoll zur Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats

Reagenz Stammlösung Endkonzentration

Enzyme Solution 1,5 U/µl 1,5 U

HTB Puffer 10x 0,6x

MgCl2 50 mM 5 mM

BSA 30 mg/ml 0,75 mg/ml

dNTP (100%T) 10 mM 0,2 mM

Primer VegFw1 10 µM 0,4 µM

Primer VegRv1 10 µM 0,4 µM

H2O Ad 45 µl


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Tabelle 10: Temperaturprofil zur Herstellung eines pflanzenspezifischen Amplifikats

Programmschritt Temperatur (°C) Zyklenanzahl Zeit (hh:mm:ss)

Initialisierung 95 1x 00:10:00

Denaturierung 95

40x

00:00:10

Annealing 53 00:00:30

Elongation 72 00:00:30

Kühlung 4 1x ∞

2.14.2 Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats für die Positivkontrolle

In Vorbereitung der Herstellung einer Positivkontrolle wurde zunächst ein pilzspezifisches Amplifikat – identisch zur Zielsequenz – generiert. Als Ziel-DNA wurde RNA-freie, quantifizierbare DNA der Hefe Dekkera anomala (DSM 70727, Konzentration 56,5 ng/µl) mit einem Volumen von 5 µl eingesetzt.

Tabelle 11: Protokoll zur Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats

Reagenz Stammlösung Endkonzentration

Enzyme Solution 1,5 U/µl 3 U

HTB Puffer 10x 0,6x

MgCl2 50 mM 5 mM

BSA 30 mg/ml 0,75 mg/ml

dNTP (100%T) 10 mM 0,2 mM

FungiFw1 12,5 µM 0,4 µM

FungiFw2 12,5 µM 0,4 µM

FungiRv1 12,5 µM 0,4 µM

FungiRv2 12,5 µM 0,4 µM

FungiRv3LNA 12,5 µM 0,4 µM

FungiRv 12,5 µM 0,4 µM

PlantBlock 125 µM 4 µM

H2O Ad 45 µl

Tabelle 12: Temperaturprofil zur Herstellung eines pilzspezifischen Amplifikats

Programmschritt Temperatur (°C) Zyklenanzahl Zeit (hh:mm:ss)

Initialisierung 95 1x 00:10:00

Denaturierung 95

45x

00:00:15

Annealing 63 00:01:00

Elongation 72 00:00:30

Kühlung 4 1x ∞

2.14.3 Ligation mit pGEM®-T-Vektorsystem

Alle Arbeitsschritte zur Ligation wurden auf Eis durchgeführt. Der Ligationsansatz wurde durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt und über Nacht bei 4°C inkubiert.

Tabelle 13: Pipettierschema für den Ligationsansatz

Reagenz Stammlösung Endkonzentration Volumen in µl

Rapid Ligation Buffer 2x 1x 5

Insert-DNA 2,5

Aqua B.Braun 1,3

pGEM®-T-Vektor 50ng/µl 2 ng/µl 0,4

T4 DNA Ligase 3 Weiss Units/µl 0,24 Weiss Units/µl 0,8


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2.14.4 Transformation und Blau-Weiß-Selektion

Zur Transformation kompetenter XL-1 Blue E.coli-Zellen wurden 100 µl dieser aufgetaut und der gesamte Ligationsansatz hinzugegeben. Das Zell-Vektor-Gemisch inkubierte für 20 min auf Eis. Mit dem Überführen des Ansatzes in einen auf 42°C geheizten Thermoblock für 2 min wurde ein Hitzeschock induziert. Anschließend wurden die Zellen erneut auf Eis inkubiert (10 min). Nach der Zugabe von 450 µl LB-Medium wurde das Gemisch für eine Stunde bei 37°C und 350 rpm geschüttelt. Für das Blau-Weiß-Screening wurden 50 bzw. 250 µl des Ansatzes auf LB/IPTG/X-Gal-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Zur deutlichen Blaufärbung der unerwünschten Kolonien wurden die Nährböden anschließend für kurze Zeit bei 4°C gelagert. Weiße Kolonien wurden markiert, mit einer sterilen Impföse gepickt und in 20 ml LB/Amp-Medium überführt. Die Anreicherung wurde über Nacht unter leichtem Schütteln (150 rpm) bei 37°C inkubiert. Von diesen Klonen wurden bei erfolgreicher Klonierung Glycerinkulturen (1 Teil 85%iges Glycerin zu 4 Teilen Kultur) für die Stammsammlung angelegt und bei -80°C gelagert.

2.14.5 PCR-Klonanalyse mittels Colony-PCR

Zur Kontrolle der erfolgreichen Transformation wurden 100 µl der Übernachtkultur abgenommen und für 10 min bei 95°C aufgekocht. Nach einer kurzen Zentrifugation wurde der Ansatz im Verhältnis 1:10 verdünnt und als Template in die spezifische PCR eingesetzt. Wurde ein positives Signal generiert, konnten die Plasmide aus den Klonen isoliert werden.

2.14.6 Plasmidpräparation

Jeweils 1 ml der Übernachtkultur der Positivklone wurde für 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wurden den Herstellerangaben des QIAGEN Plasmid Mini Prep Kits folgend aufgearbeitet. Die Konzentration des erhaltenen Plasmids wurde mittels Absorptionsspektrometrie bestimmt. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.

2.15 Sequenzierung

Zur Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente wurden diese an die Firma GATC Biotech AG nach Köln versandt. Die Analyse wurde mit den Standardprimern M13-for bzw. M13-rev vorgenommen.

2.16 Sequenzanalyse

Es wurden Alignierungen mit aus der NCBI-Datenbank geladenen Sequenzen der 28S rDNA von Pilzen und Pflanzen oder von der Firma GATC sequenzierten DNA-Abschnitten (Plasmide etc.) mit dem Programm Geneious R6 (Version 6.1.5, Firma Biomatters) vorgenommen. Dieses verwendet den ClustalW-Algorithmus.

2.17 Berechnung von Genomäquivalenten

Die Genomgewichte repräsentativer Pilze für die Berechnung der LOD/LOQ-Werte wurden auf Grundlage der in der NCBI-Genomdatenbank angegebenen Genomgrößen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/; letzter Stand: 01.02.2015) näherungsweise berechnet (National Library of Medicine 1993). Aufgrund der ständigen Aktualisierung der Daten haben sich einige wichtige Genomgrößen geändert. Diese sind mit (*) für den Stand vom Oktober 2011 bzw. (**) für den Stand vom Februar 2015 gekennzeichnet. Verwendet wurden jeweils die mit (*) markierten Einträge. Sofern keine Daten zum gewünschten Keim vorlagen, wurden die Werte nahverwandter Arten herangezogen. Bei mehreren vorliegenden Daten wurden jeweils Mittelwerte zur weiteren Berechnung genutzt.


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Tabelle 14: Übersicht der verwendeten Genomgrößen/–gewichte zur LOD/LOQ-Bestimmung

Zu untersuchende Spezies

Spezies zur Berechnung Stamm-nummer

Genomgröße in Mb

Genomäquivalent

(= GÄ) in fg Absidia corymbifera Lichtheimia corymbifera 008-049 36,58 41,00 Alternaria citri Alternaria arborescens EGS 39-128 33,89 37,99

Alternaria brassicicola ATCC 96836 29,54 33,11 Aspergillus brasiliensis Aspergillus niger (**) ATCC 1015 34,85 39,06

Aspergillus niger (*) CBS 513.88 35,74 40,05 Candida albicans Candida albicans (*) WO-1 21,74 24,7

Candida albicans (**) WO-1 14,473 16,22 Cladosporium cladosporioides

Cladosporium sphaerospermum

UM843 26,89 30,14

Cryptococcus curvatus Cryptococcus neoformans var. neoformans

B-3501A 19,7 22,08

Dekkera anomala Dekkera bruxellensis AWRI 1499 12,68 14,21 Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum FOSC3-a 47,91 53,7

Fusarium oxysporum Fo47 49,66 55,66 Fusarium oxysporum Fo5176 54,77 61,39

Mucor racemosus Mucor circinelloides f. circinelloides

1006PhL 36,35 40,74

Penicillium chrysogenum Penicillium chrysogenum(*) Wisconsis

64,45 72,24

Penicillium chrysogenum(**) 32,52 36,56

Pichia anomala Pichia kudriavzevii M12 10,45 11,71 Pichia pastoris 9,2 10,31

Rhodotorula mucilaginosa Rhodotorula glutinis ATCC 204091 20,47 22,94 Zygosaccharomyces bailii Zygosaccharomyces bailii CLIB 213 10,27 11,51

(*) Stand Oktober 2011; (**) Stand Februar 2015, Quelle: (National Library of Medicine 1993)

Zunächst erfolgte die Berechnung des Molekulargewichts der einzelnen Spezies unter Einbeziehung der Genomgröße (in bp), des mittleren Molekulargewichtes eines Basenpaares und der Umrechnungskonstante u. Dies sei am Beispiel von Zygosaccharomyces bailii (Abkz. Z. bailii) gezeigt:

𝑀𝑊𝑍.𝑏𝑎𝑖𝑙𝑖𝑖 = 𝐺𝑒𝑛𝑜𝑚𝑔𝑟öß𝑒 ∗ 𝑀𝑊𝐵𝑎𝑠𝑒𝑛𝑝𝑎𝑎𝑟 ∗ 𝑢 = 10,27 ∗ 106𝑏𝑝 ∗ 675𝑔

𝑚𝑜𝑙∗ 1,66054 ∗ 10−27𝑘𝑔

𝑀𝑊𝑍.𝑏𝑎𝑖𝑙𝑖𝑖 = 1,151 ∗ 10−17𝑘𝑔 = 11,51𝑓𝑔 Gleichung 1 und 2

Das Genomgewicht von Zygosaccharomyces bailii beträgt demnach 11,51fg.

2.18 Real-time-PCR

2.18.1 Gradienten-PCR

Zur Feststellung der optimalen Annealingtemperatur wurde eine Gradienten-PCR mit dem LightCycler

® 96 durchgeführt. Hierfür wurde sowohl Schimmelpilz- (Aspergillus brasiliensis,

ATCC 1988) als auch Hefe-DNA (Dekkera anomala, DSM 70727) mit jeweils zwei Konzentrationen (100, 25GÄ) eingesetzt. Zudem wurde das Plasmid mit pflanzenspezifischem Insert (vgl. Kapitel

2.14.1) mit 2,3x104 bis 2,3x10

6 Kopien/Reaktion sowie eine Negativkontrolle pipettiert. Es wurde

ausschließlich Mastermix mit aptamergeblockter Taq-Polymerase (siehe Kapitel 2.19) verwendet. Unter Beachtung der Schmelztemperaturen der Primer und des Amplifikats wurde ein Temperaturbereich von 53°C ≤ T ≤ 67°C gewählt.


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2.18.2 Temperaturprofile für Real-time-PCR-Cycler

Real-Time-PCR-Experimente wurden auf dem LightCycler® 480 I bzw. II Instrument der Firma Roche

Diagnostics (Software 1.5.0), dem Stratagene Mx3005P der Firma Agilent Technologies (Software MxPro v.4.10) durchgeführt. Die Detektion der spezifischen Ziel-DNA sowie der Positivkontrolle wurde im FAM-Kanal (LC480: 483-533 nm; Mx3005P: 492-513 nm) vorgenommen. Die interne Amplifikationskontrolle erzeugte ein Signal im HEX-Kanal (LC480: 533-580 nm; Mx3005P: 535-555 nm). Zur Auswertung wurden folgende Einstellungen vorgenommen: LightCycler: Abs Quant/2nd Derivative Max mit Color Compensation (FAM/VIC); Stratagene Mx3005p: Background based threshold mit Baseline Correction (Adaptive baseline mit Mx4000 v1.00 to v3.00 algorithm).

Tabelle 15: Temperaturprofil für die Real-time-PCR

Programmschritt Zyklenanzahl Analysemodus Zieltemperatur (°C) Inkubationszeit

(hh:mm:ss)

UDG-Inkubation und Denaturierung

1 none 37

95

00:05:00

00:05:00

Amplifikation 45 Quantifizierung 95

60

00:00:10

00:01:00

Kühlung 1 none 40 00:00:30

Es wurden jeweils die vom Hersteller eingetragenen Temperaturanstiegsraten verwendet. Versuche zur Bestimmung der LOD/LOQ-Werte des Assays wurden mit einer Annealingtemperatur von 63°C durchgeführt. Nach Austausch des Antikörpers durch ein Aptamer wurde die Annealingtemperatur nach unten korrigiert.

2.19 Herstellung des Mastermixes für Pilzgesamtnachweis-Assay

Das Gesamtvolumen des Mastermixes betrug 15 µl je Reaktion. Zunächst wurde ein Enzymmix aus Polymerase, Uracil-DNA-Glykosylase (Abkz. UDG) und Aptamer bzw. Antikörper vorbereitet, welcher 15 min bei RT inkubierte, um eine vollständige Blockierung des aktiven Zentrums des Enzyms zu gewährleisten. Anschließend wurden die verbleibenden Komponenten hinzugefügt. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen wurde anstelle von dTTP dUTP eingesetzt. Im zuvor hergestellten dNTP-Mix wies jedes Desoxynukleotid eine Konzentration von 10 mM auf. Versuche zur Bestimmung der LOD/LOQ-Werte wurden mit antikörpergeblockter Polymerase durchgeführt. Anstelle des Aptamers wurde AntiTaq des Herstellers GeneOn GmbH (Stammkonzentration 2 µg/µl) in einer Endkonzentration von 0,575 µg/µl zugegeben.

Tabelle 16: Zusammensetzung des Mastermixes für den Pilzgesamtnachweis-Assay

Reagenz Stammkonzentration Endkonzentration

Polymerase 5 U/µl 2,500 U

Uracil-DNA-Glykosylase 10 U/µl 0,100 U/µl

Aptamer bzw.

AntiTaq

100 µM

2 µg/µl

20,00 µM

0,575 µg/µl

HTB Puffer 10x 1,000x

Lyophilisierungsadditiv 25 % w/v 7,5 %w/v

BSA Sigma 30 mg/ml 1,500 mg/ml

dNTP-Mix (100% U) 10 mM 0,200 mM

MgCl2 1000 mM 4,000 mM

Sonden Je 100 µM 0,200 µM

Primer Je 100 µM 0,500 µM

PlantBlock 100 µM 5,000 µM

IAK-Primer Je 100 µM 0,250 µM

IAK-Sonde 100 µM 0,050 µM

IAK-Plasmid in HSTE 1 fg/µl 0,008 fg/µl

H2O ad.15 µl

Zu je 15 µl Mastermixvolumen wurden 10 µl Probevolumen pipettiert. Zu lyophilisierten Mastermixen in 8-well-Streifen wurden 25 µl Probevolumen hinzugegeben.


31

2.20 Spezifitätstestungen

Die Überprüfung des spezifischen Nachweises wurde durch den Einsatz der DNA von Ziel- und Nicht-Zielorganismen erzielt. Zelllinien wurden von Mitarbeitern der Firma AnalytiCon Discovery GmbH (Potsdam) unter den optimalen und sterilen Bedingungen kultiviert und Überstände zur weiteren Analyse übergeben. Die verwendete DNA wurde entweder nach der Extraktionsmethode des Kapitels 2.10 bzw. mittels foodproof

® StarPrepTwo (siehe Kapitel 2.21.2) bei Pilzen, Zellkulturen und Bakterien

oder Magnetic Preparation Kit III bei pflanzlicher DNA gewonnen. Eingesetzt wurden 50 pg je Reaktion bei Inklusivitäts- und 100 pg je Reaktion bei Exklusivitätsprüfungen. Alle DNAs wurden im Vorfeld mit spezifischen Assays auf ihre Amplifizierbarkeit hin geprüft.

2.21 Probenaufarbeitung

2.21.1 Herstellung einer Sporensuspension

Für die Quantifizierung von Schimmelpilzen wurde auf Sporensuspensionen zurückgegriffen. Der entsprechende Keim wurde auf YM-Nähragar ausplattiert und für ca. 1 Woche bei 25-30°C inkubiert. Die sporulierten Hyphomyceten wurden mit 10 ml Saline mit 0,1%Tween 80 abgeschwemmt und in ein mit sterilen Glasperlen (ca. 1 cm Höhe) gefüllten 15ml-Falcon-Tube überführt. Die Suspension wurde für etwa 1 min gevortext und anschließend mikroskopisch in einer Thoma-Kammer ausgezählt. Es wurde auf das Vorhandensein von Myzelrückständen geachtet. Gegebenenfalls wurde die Suspension erneut gevortext. Für die Langzeitlagerung bei -20°C wurden 20%ige Glycerinkulturen mit einer Sporenkonzentration von 1x10

6 KBE/ml hergestellt.

2.21.2 Aufbereitung filtrierbarer Proben mit Lebend/Tot-Differenzierung

Filtrierbare Flüssigkeiten umfassen klare Wässer aller Art ohne Kohlensäure. Je Probe wurden 100 ml Volumen in eine sterile Schottflasche überführt und mit einem Zweifach-Flaschenverteilerdeckel verschlossen. Über einen, in einem Polysulfon-Membranhalter befindlichen, Polyethersulfon-Membranfilter (Abkz. PES) wurde die Probe filtriert. Nach vollständigem Durchfluss der Probe wurde der Filter in ein vorbereitetes StarPrepTwo-Reaktionsgefäß überführt (300 µl StarPrepTwo bei 300 rpm auf Magnetrührer). Für die Lebend/Tot-Differenzierung wurden 300 µl Reagent D-Lösung (10 µg/ml) hinzupipettiert und für 10 min lichtgeschützt inkubiert. Nach 5minütiger Photolyse im PhAST Blue oder auf einem Kühlblock unter einer Halogenlampe (20 cm Abstand zur Lampe) erfolgte der mechanische Aufschluss im MagNA Lyser bei 7000 U/min für 60 s. Anschließend wurden die Proben für 5 Minuten bei 95°C aufgekocht. Vor dem Einsatz in die PCR sollten die Proben bei 13000 rpm für 2 min zentrifugiert werden.

2.21.3 Anreicherung und Aufbereitung nicht-filtrierbarer Flüssigkeiten mit Lebend/Tot-

Differenzierung

Proben, bei denen auf die Abwesenheit von Pilzen getestet wurde, wurden zunächst im Verhältnis 1:10 in SSL-Medium verdünnt und für bis zu 48 h bei 27-30°C inkubiert. Zum Teil wurden grenzwertige Dotierungen vorgenommen. Vor der Probenentnahme wurden die Anreicherungen durchmischt. Jeweils 100 µl wurden entnommen und in ein StarPrepTwo-Gefäß überführt. Proben, bei denen eine quantitative Analyse durchgeführt werden sollte, wurden direkt in die Reaktionsgefäße pipettiert. Die Aufarbeitung wurde dem StarPrepTwo-Protokoll folgend vorgenommen (siehe Kapitel 2.21.2).


32

2.22 Sensitivitätstestungen

2.22.1 Sensitivitätstestung des PCR-Assays mit quantifizierbarer DNA

Zur Bestimmung der Sensitivität des Pilzgesamtnachweissystems wurde quantifizierbare, RNAse-verdaute DNA von einer Vielzahl von Pilzen (siehe Anhang VI) eingesetzt. Die DNA-Konzentrationen wurden in Hinblick auf die Genomgrößen (siehe Kapitel 2.17) der einzelnen Spezies in entsprechende Genomäquivalente (Abkz. GÄ) umgerechnet. In die PCR wurden jeweils 100 000, 10 000, 1 000, 100, 25, 6.25, 1.56 und 0.3 GÄ als Replikate (11 – 12fache Wiederholung) eingesetzt. Dabei wurde jede Verdünnungsreihe einzeln hergestellt, um Varianzen des Pipettiervorganges mit einzubeziehen. Weiterhin wurden Versuche mit 12 Verdünnungsreihen auf zwei Cyclerläufe á sechs Reihen aufgeteilt, damit eventuell auftretende Unterschiede aufgrund der eingesetzten Gebrauchsmaterialien und die Variabilität des Assays erkannt werden konnten. Alle Läufe wurden ausschließlich auf dem LightCycler480

®-II durchgeführt.

Als Analysemodus wurde jeweils „Abs Quant / 2nd Derivative Max― gewählt. Mit den erhaltenen Daten wurden zunächst Standardkurven für die Replikate eines Durchlaufs einer Spezies generiert. Weiterhin wurden von allen Replikaten der Mittelwert der Cp-Werte jeder Verdünnungsstufe sowie die dazugehörigen Standardabweichungen und die intraspezifische Korrelation berechnet. Auf Grundlage der erhaltenen Daten wurden der Mittelwert der Verdünnungsstufen, die Standardabweichung und Korrelation für alle Spezies zusammen erhoben, um letztlich Aussagen über interspezifische Abweichungen geben zu können.

2.22.2 Sensitivitätstestung mit dotierten Probenmatrices

2.22.2.1 Untersuchung von Flüssigkeiten auf Wiederfindungsraten

Zu 100 ml WSH wurden 100 µl einer 1,5x106 bis 1,5x10

2 KBE/ml Sporensuspension (Aspergillus

brasiliensis) unter sterilen Bedingungen hinzugegeben und dem Protokoll (Kapitel 2.21.2) folgend aufgearbeitet. Nicht-filtrierbare Flüssigkeiten wurden direkt mit 1x10

4 KBE Saccharomyces cerevisiae

dotiert (in Medium verdünnt) und anschließend nach dem unter dem Kapitel 2.21.3 beschriebenen Verfahren aufgearbeitet. Zur Überprüfung der Lebendkeimzahl wurden ebenfalls 100 µl einer geeigneten Verdünnungsstufe auf YM-/YGC-Agar ausplattiert.

2.22.3 Sensitivitätstestung bei hoher Begleitflora

Zur Spezifitätstestung der Aufarbeitung und des PCR-Systems wurden Proben artifiziell kontaminiert: Dekadisch in SSL-Medium verdünnte Fruchtsäfte bzw. –konzentrate wurden mit etwa 100 KBE/100 µl

Saccharomyces cerevisiae und 106 KBE/100 µl E. coli dotiert. Die Aufarbeitung – inklusive

Lebend/Tot-Differenzierung – wurde dem Aufarbeitungsprotokoll unter Punkt 2.21.2 (ohne Voranreicherung) folgend durchgeführt. Es wurde jeweils eine mikrobiologische Kontrolle beider Verdünnungen angelegt.

2.22.4 Dotierungen mit inaktivierten Zellen für die Lebend/Tot-Differenzierung

Versuche zur Optimierung der Lebend/Tot-Differenzierung wurden mit inaktivierten Zellen durchgeführt. Zellen bzw. Sporen wurden in SSL-Medium auf eine geeignete Zellzahl eingestellt und anschließend für 20 min bei 80°C im Thermoblock erhitzt. Zur Überprüfung der Behandlung wurden die Zellen unverdünnt auf YM-Agar ausplattiert und bei 27-30°C für bis zu einer Woche inkubiert.

3 ERGEBNISSE

33

3 Ergebnisse

3.1 Auswahl und Beschreibung der Zielregion

Voraussetzung für einen Assay, der es erlaubt, eine große Bandbreite unterschiedlicher

Hefen und Schimmelpilze sensitiv zu detektieren, war die Auswahl einer konservierten

Region. Für eine spätere Quantifizierung eignet sich ein multi-copy-Gen besonders. Mit dem

28S (Abkz: Svedberg-Einheit, Sedimentationskoeffizient) rDNA-Abschnitt, der bereits im

Vorfeld zu dieser Arbeit gewählt wurde, sollte ein solcher Bereich gefunden werden.

Ribosomale DNA kodiert für die ribosomale RNA, welche für die Proteinsynthese essentiell

ist, da sie als Strukturbestandteil der Ribosomen fungiert. Ein Ribosom besteht aus vier

(Prokaryonten: drei) verschiedenen RNA-Molekülen: 28S (23S in Prokaryonten, etwa 4000-

5000 Nukleotide), 18S (16S in Prokaryonten, etwa 2000 Nukleotide), 5.8S (160 Nukleotide)

und 5S (120 Nukleotide) (Graw 2006). Ribosomale DNA ist in der nucleolus organizer region

(Abkz. NOR) auf einem oder mehreren Chromosomen ubiquitär verteilt (Prokopowich et al.

2003; Rooney und Ward 2005). Ein rDNA-Repeat besteht aus zwei variablen, nicht-

codierenden Bereichen, den sog. internal transcribed spacer (Abkz. ITS), die eingebettet

zwischen den Genen der 18S und 28S rDNA und durch die 5.8S rDNA getrennt sind

(Gardes und Bruns 1993; Horton und Bruns 2001; Bellemain et al. 2010).

Abbildung 4: Darstellung des rDNA-Repeats und des 28S-rDNA-Genabschnitts Ribosomale DNA-Repeats wiederholen sich tandemartig bis zu 250 Mal in Fungi, wobei die einzelnen Abschnitte durch non transcribed spacer voneinander abgegrenzt sind. Ein rDNA-Repeat besteht aus dem 18S- und dem 28S-rDNA-Gen, die durch die zwei nicht-codierenden internal transcribed spacer getrennt sind. Zwischen diesen

wiederum findet sich der 5.8S-rDNA-Abschnitt. Die ausgewählte Zielsequenz befindet sich im Bereich der 28S-rDNA-Region.

18S 5.8S 28S

NTS NTS NTS NTS

NTS NTS

28S LSU

≈3950bp

rDNA repeat

rDNA repeat rDNA repeat

Primer 1 Primer 2 Sonde

ITS1 ITS2

5'

5'

5'

3'

3'

3'

3 ERGEBNISSE

34

Die rDNA-Repeats wiederholen sich in Fungi bis zu 250 Mal, wobei die einzelnen Bereiche

durch non-transcribed spacer (Abkz. NTS) voneinander abgegrenzt werden (Bellemain et al.

2010). Der gesamte DNA-Bereich weist sowohl variable, als auch konservierte Regionen auf,

so dass einige Abschnitte für die Speziesidentifikation (z.B. ITS1 und ITS2) und andere für

den allgemeinen Nachweis von Pflanzen, Pilzen u.a. Verwendung finden (Gardes und Bruns

1993; Henry et al. 2000; Sugita und Nishikawa 2003; Bellemain et al. 2010; Schoch et al.

2012) .

DNA-Sequenzen des betreffenden Genabschnittes, davon 139 Hefe- und 94

Schimmelpilzsequenzen, wurden zunächst aus der NCBI-Datenbank ausgewählt, im

Sequenzanalyseprogramm alignt und dienten anschließend als Ausgangspunkt für das

Primer- und Sonden-Design sowie der theoretischen Bewertung der Spezifität (Auswahl der

relevanten Spezies im Anhang VI). Fluoreszenzmarkierte Sonden können nach DIN EN ISO

20838:2006 zudem als Nachweis über die Amplifikation des korrekten Produkts eingesetzt

werden.

Insbesondere der vordere Genbereich zeichnete sich durch einen hohen

Konservierungsgrad aus, der es erlaubte, eine Vorauswahl an potentiellen Oligonukleotiden

zu treffen. Da innerhalb der platzierten Oligonukleotide einzelne Basenvariationen auftraten,

sollten diese durch den Einsatz weiterer Primer und Sonden abgedeckt werden. Eine

gleichmäßige Amplifikation des Genabschnittes möglichst vieler Fungi sollte dadurch erreicht

werden. Somit wurden drei weitere 3‗-Primer sowie ein zusätzlicher Forwardprimer empirisch

untersucht.

3.2 Generierung eines Plasmids mit plantaespezifischer DNA

Aufgrund des hohen Konservierungsgrades des 28S-rDNA-Gens war zu klären, ob mit den

ausgewählten Primern und Sonden auch nicht-fungoide Organismen detektiert werden

würden. Demzufolge wurden DNA-Sequenzen verschiedener Pflanzenarten der NCBI-

Datenbank entnommen und erneut eine theoretische Überprüfung der

Oligonukleotidspezifität vorgenommen. Beide pilzspezifischen Forwardprimer weisen an

Position 4 bzw. 5 des 5‗-Endes eine Fehlpaarung auf, welche eine Amplifikation pflanzlicher

DNA jedoch nicht unterbindet. Weiterhin unterscheidet sich die Sequenz des Reverseprimers

FungiRv3LNA in nur einer Base von der der pflanzlichen DNA.

Zur praktischen Überprüfung der Oligonukleotide und etwaiger Modifikationen war es

grundlegend, eine geeignete Probe pflanzlicher DNA zu verwenden. Bei der DNA-Extraktion

aus Pflanzenmaterial konnte nicht zweifelsfrei sichergestellt werden, dass nicht auch geringe

Mengen an fungoider DNA enthalten sein könnten. Daher sollte eine artifizielle Pflanzen-

DNA in Form eines Plasmids generiert werden, welches anschließend in den weiteren

Experimenten eingesetzt werden sollte. Zunächst wurde aus den vorliegenden DNA-

3 ERGEBNISSE

35

Sequenzen ein potentielles Primerpaar (VegFw1, VegRv1) abgeleitet, welches mit einer

Länge von 868 bp den 28S-rDNA-Zielbereich flankiert (siehe Anhang I). Nach erfolgreicher

Amplifikation des Abschnittes und Visualisierung mittels Agarosegelelektrophorese (siehe

Abbildung 5) wurden die spezifischen Banden aus Bananen-, Erdnuss- und Kürbis-DNA

ausgeschnitten, aufgereinigt und in den pGEM®-T-Vektor ligiert. Die Amplifikation von Soja-

und Karotten-DNA war aufgrund von Sequenzunterschieden im Bereich des Forwardprimers

nicht erfolgreich. Den herangezogenen NCBI-Datenbanksätzen für Erdbeere (Acc.No.

X58118) und Reis (Acc.No. M11585.1) nach, ist das Primerpaar komplementär zum DNA-

Strang, so dass das ausbleibende PCR-Produkt eine Folge der DNA-Degradierung ist.

Abbildung 5: UV-Visualisierung des Agarosegels mit pflanzenspezifischen Amplifikaten Die PCR zur Generierung des pflanzenspezifischen Amplifikats mit 868bp Länge wurde mit sieben verschiedenen DNAs und einer Negativkontrolle durchgeführt. Die Ergebnisse wurden schließlich mittels Gelelektrophorese visualisiert und ausgewertet. Beladung: 1: 1kb Marker, 2: Musa acuminata, 3: Fragaria ananassa, 4: Arachis hypogaea, 5: Daucus carota, 6: Cucurbita pepo, 7: Oryzae sativa, 8: Glycine max, 9: Negativkontrolle, 10: 100bp

Marker. Die spezifischen Banden der Taschen 2, 4 und 6 wurden für die Klonierung eingesetzt.

Nach Transformation in XL1 Blue E. coli-Zellen und anschließender Blau-Weiß-Selektion

konnten drei positive Klone von den Selektivnährböden entnommen und erfolgreich

angereichert werden. Die Insertion der DNA aus Musa acuminata (Banane) war nicht

erfolgreich: in keiner der untersuchten Kolonien konnte über die PCR die DNA-Sequenz

nachgewiesen werden (siehe Abbildung 6 Tasche 1 bis 3). Erfolgreich waren die

Transformationen mit dem A. hypogaea-Insert (sog. Plasmid 1, siehe Abbildung 6 Tasche 5)

und dem C. pepo-Insert (Plasmid 2 und 3, siehe Abbildung 6 Tasche 9 und 10). Die aus den

gewählten Klonen präparierten Plasmide wurden letztlich sequenziert, um nochmals die

Richtigkeit des Inserts prüfen zu können (siehe Anhang II). In zwei von drei Klonen (Plasmid

1 und 3) konnten die Abschnitte der verwendeten Oligonukleotide wiedergefunden werden.

Die Sequenzierung des zweiten Plasmids (aus Cucurbita pepo) gelang nicht vollständig. Mit

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1000 bp

800 bp

500 bp

300 bp

10000 bp

500 bp

3 ERGEBNISSE

36

der Colony-PCR (siehe Kapitel 2.14.5 und Abbildung 6) konnte allerdings gezeigt werden,

dass das Insert die korrekte Amplifikatlänge aufweist und somit eingebaut wurde.

Mit Hilfe des Plasmids mit pflanzenspezifischer DNA (siehe Abbildung 28 in Anhang III)

konnte nun die Spezifität der Oligonukleotide des Pilzgesamtnachweissystems getestet

werden. Dafür wurde ein Plasmid mit zunehmender Kopienzahl in den Assay eingebracht. Es

wurde geprüft, ob der Einsatz eines mit einer Locked nucleic acid-Base modifizierten Primers

und eines C3-Spacer-geblockten Primers sinnvoll ist.

3.3 Primermodifikationen zur Erhöhung der Spezifität

Unter dem Begriff Locked nucleic acid versteht man ein Nukleinsäureanalogon, dass durch

die hohe Bindungsaffinität zum Komplementärstrang eine enorme Spezifität aufweist und

daher vor allem im Bereich der single nucleotide polymorphisms (Abkz. SNPs) zur

Mutationsanalyse Anwendung findet (Ballantyne et al. 2008). In der Pentose des DNA- oder

RNA-Nukleotids wird mit einer zusätzlichen Methylenverbindung zwischen dem Sauerstoff

des C2-Atoms und dem C4-Atom eine strukturelle Änderung vorgenommen (siehe Abbildung

7), die den Zucker in der bevorzugten N-Stellung (C3'-endo-Pucker in A-DNA) festsetzt

(Obika et al. 1998; Braasch et al. 2002; Devor 2005). Dadurch wird eine hohe

Diskriminierung von Fehlpaarungen erreicht, da sich die Base einzig an die

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1000 bp

800 bp

500 bp

300 bp

200 bp

Abbildung 6: UV-Visualisierung der mittels Colony-PCR untersuchten Klonkandidaten Jeweils drei Klonkandidaten wurden je eingesetzter Pflanzen-DNA mit einer Pipettenspitze von einem Selektivnährmedium gepickt und vor dem Überführen in das Anreicherungsmedium in den pflanzenspezifischen Mastermix eingebracht. Beladung: 1: 100bp Marker, 2-4: Kandidaten Musa acuminata, 5-7: Kandidaten Arachis hypogaea, 8-10: Kandidaten Cucurbita pepo.

3 ERGEBNISSE

37

Komplementärbase anlagern kann (Ballantyne et al. 2008). Der DNA-Komplex weist nach

erfolgreicher Hybridisierung der Base eine große Stabilität auf, was in einer wesentlich

höheren Schmelztemperatur mündet (Quelle: Exiqon 2009).

Abbildung 7: Struktur einer LNA™-Base In der Pentose sind das 2‗-Sauerstoffatom und das C4-Atom über eine Methylenbrücke (gelb markiert) miteinander verbunden. Das Nukleotid wird in der bevorzugten N-Konformation gehalten, woraus eine hohe Affinität zur Komplementärbase hervorgeht (Braasch et al. 2002).

Im vorliegenden Assay weist ein Reverseprimer nur eine Base Unterschied im Vergleich zur

pflanzlichen Sequenz auf. Es galt zu klären, ob die Umwandlung in eine LNA™-Base in einer

Verbesserung der Spezifität resultiert.

Zur weiteren Erhöhung der Spezifität sollte ein C3-Spacer untersucht werden. Am 3‗-

Phosphatrest der letzten Primerbase wird dabei eine Propylgruppe angehangen, welche eine

Elongation des modifizierten Primers infolge der Strukturänderung unterdrücken soll (Zhou et

al. 2004; Dames et al. 2007). Der Blockprimer wurde der pflanzlichen 28S rDNA-Sequenz

entsprechend designt und sollte demzufolge an pflanzliche DNA, wie sie in realen Proben –

insbesondere Fruchtsäften - stets präsent sein kann, hybridisieren und eine Vervielfältigung

des Abschnitts unterbinden.

Die durch den Einsatz von LNA™- und C3-Spacer-geblocktem Primer auftretenden Effekte

sollten in direktem Vergleich zum Reverseprimer untersucht werden. Es wurden Mastermixe

produziert, die den unmodifizierten Primer FungiRv3 oder den LNA-Primer FungiRv3LNA

und/oder den Blockprimer PlantBlock enthielten. Der unmodifizierte Primer FungiRv3 wies

zwei zusätzliche Basen am 3‗-Ende auf, wodurch seine Schmelztemperatur jedoch nur 2 °C

über der des LNA™-Primers lag.

Effekte der einzelnen Primervarianten wurden mit fünf Konzentrationen des generierten

Pflanzenplasmids analysiert: es wurden Kopienzahlen von 1,1x107 bis 1,1x10

9 Kopien je

Reaktion eingesetzt. Jede Konzentration wurde als Duplikat untersucht. Für jeden Mix wurde

die Positivkontrolle (100 000 GÄ; Duplikat) mitgeführt. Die erhaltenen Cp-Werte jedes

Reaktionsmixes sowie die Auswertung sind in Abhängigkeit von der eingesetzten Plasmid-

Konzentration in Tabelle 17 aufgelistet. Es ist zu erkennen, dass bei Einsatz des

unmodifizierten Reverseprimers FungiRv3 in jeder Probe ein Signal generiert wurde. Höhere

Plasmidkonzentrationen resultierten in frühen Cp-Werten: 1,1x109 Kopien entsprechen einer

3 ERGEBNISSE

38

DNA-Menge von 5 ng und erreichten bereits bei Zyklus 9,77 den Schwellenwert. Die Cp-

Werte dieses Mastermixes dienten als Grundlage zur Beurteilung der Effekte der

Primermodifikationen.

Tabelle 17: Einfluss verschiedener Primermodifikationen auf Cp-Werte bei Einsatz eines pflanzenspezifischen Plasmids

Kopien (Plasmid)

unmod. Primer unmod. Primer und

Blockprimer LNA™-Primer

LNA™- und Blockprimer

1,14E+07 Cp 16,53 16,52 22,60 22,49 33,73 33,53 - -

x̅ (Cp) 16,52 22,54 33,63 -

σ (Cp) 0,01 0,08 0,14 -

Δ Cp (1) x -6,02 -17,21 -28,48*

Δ Cp (2) x x -11,19 -22,46*

Δ Cp (3) x x x -11,47*

2,28E+07 Cp 15,63 16,71 22,20 22,68 33,66 33,86 - -

x̅ (Cp) 16,17 22,44 33,76 -

σ (Cp) 0,76 0,34 0,14 -

Δ Cp (1) x -6,27 -17,59 -28,83*

Δ Cp (2) x x -11,32 -22,56*

Δ Cp (3) x x x -11,24*

1,14E+08 Cp 12,76 13,67 19,98 19,24 - 31,38 35,62 35,15

x̅ (Cp) 13,22 19,61 31,38 35,38

σ (Cp) 0,65 0,52 0,00 0,33

Δ Cp (1) x -6,39 -18,16 -22,16

Δ Cp (2) x x -11,77 -15,77

Δ Cp (3) x x x -4,00

2,28E+08 Cp 12,03 11,63 17,26 17,91 29,67 30,57 35,34 35,40

x̅ (Cp) 11,83 17,59 30,12 35,37

σ (Cp) 0,29 0,47 0,64 0,04

Δ Cp (1) x -5,76 -18,29 -23,54

Δ Cp (2) x x -12,53 -17,78

Δ Cp (3) x x x -5,25

1,14E+09 Cp 9,76 9,78 15,98 15,80 26,43 27,23 33,79 34,07

x̅ (Cp) 9,77 15,89 26,83 33,93

σ (Cp) 0,01 0,13 0,57 0,20

Δ Cp (1) x -6,12 -17,06 -24,16

Δ Cp (2) x x -10,94 -18,04

Δ Cp (3) x x x -7,10

x̅ (Δ Cp (1)) x -6,112 -17,66 -25,43

x̅ (Δ Cp (2)) x x -11,55 -17,10

x̅ (Δ Cp (3)) x x x -7,79

Der Versuch wurde auf dem LightCycler®480-II durchgeführt. Es wurden 5 Konzentrationen des Pflanzenplasmids

(1,1x107 bis 1,1x109 Kopien je Reaktion) jeweils als Duplikat mit den 4 Mastermixen getestet. Die Werte von Δ Cp

geben jeweils die Differenz zu den Cp-Werten eines Reaktionsmixes an: (1): Differenz zu Mix mit unmodifiziertem (Abkz. unmod.) Primer FungiRv3; (2): Differenz zu Mix mit unmodifiziertem Primer und Blockprimer; (3): Differenz zu Mix mit LNA™-Primer.(*) Bei Proben, in denen kein Signal generiert wurde, wurde von einem Cp-Wert von 45,

also der Zyklenanzahl, zur Berechnung ausgegangen. Aus den erhaltenen Differenzwerten (∆Cp (x)) wurde letztlich der mittlere ∆Cp-Wert (x̅ (∆Cp(x))) als Kennzeichen für die durchschnittliche Cp-Wert-Verschiebung im Vergleich zum Standardmix oder einem der modifizierten Reaktionsmixe berechnet. Während der Mix mit Standardprimern die Amplifikation des Plasmids ermöglichte, konnte unter Einsatz der Reaktionsmixe mit modifizierten Primern eine Amplifikation hinausgezögert bzw. unterbunden werden.

3 ERGEBNISSE

39

Abbildung 8: ΔCp-Werte der Mixe mit modifizierten Primern im Vergleich Grafische Darstellung der Effekte verschiedener Primermodifikationen bei Einsatz unerwünschter DNA. ΔCp-Werte sind als Mittelwerte aller eingesetzten Plasmidkonzentrationen errechnet und geben jeweils die Verschiebung des Cp-Wertes im Vergleich zu einem bestimmten Mastermix an: x̅ (Δ Cp (1)): in Bezug auf Standardmix; x̅ (Δ Cp (2)): in Bezug auf Standardmix mit Blockprimer; x̅ (Δ Cp (3)): in Bezug auf Mix mit LNA™-Primer. Es ist deutlich, dass mit den Modifikationen eine Verschiebung der Cp-Werte des pflanzenspezifischen Plasmids erreicht werden konnte und damit beide Primer einen positiven Effekt auf die Spezifität erzielten. Im Vergleich zum Standardmix konnte der Cp-Wert unter Verwendung des LNA™- und des C3-Primers um 25,43 Zyklen verzögert werden.

Zunächst sollte der Einfluss der Zugabe des Blockprimers PlantBlock, welcher spezifisch an

pflanzliche DNA hybridisieren sollte, analysiert werden (Tabelle 17, Abbildung 8). Eine

Amplifikation pflanzlicher DNA erfolgte unabhängig von deren Konzentration im Schnitt um

x̅ (Δ Cp (1)) = 6,11 Zyklen später als im Standardmix. Eine vollständige Unterdrückung der

Amplifikation konnte nicht verzeichnet werden. Mit Austausch des Reverseprimers durch

einen LNA™-modifizierten Primer wurden weiterhin alle Proben detektiert. Allerdings war

hier im Vergleich zum Standardmix im Mittel eine Verzögerung des Cp-Wertes von 17,66

Zyklen erkennbar. So wurden beispielsweise 1,1x109 Kopien des Plasmids erst ab Cp 26,43

bzw. 27,23 statt bereits ab Cp 9,77 nachgewiesen. Der Blockprimer in Kombination mit dem

Standardprimer erzielte noch im Schnitt um 11,55 Zyklen frühere Signale. Gab man

zusätzlich zum LNA™-Primer den mit einem C3-Spacer geblockten Primer im Überschuss

hinzu, wurden die Proben mit bis zu 2,28x107 Kopien nicht detektiert. Ab 1,1x10

8 Kopien

wurden Cp-Werte erhalten, die im Vergleich zum Standardprimer um 25,43 (x̅ (Δ Cp (1)))

Zyklen, zum Standardprimer mit C3-Primer um 17,10 Zyklen und zum Reaktionsmix mit

LNA™-Primer um 7,79 Zyklen (x̅ (Δ Cp (3))) später detektiert wurden. Auf Grundlage dieser

Resultate wurden alle weiteren Experimente mit einem Reaktionsmix durchgeführt, der

sowohl den LNA™-Primer als auch den Blockprimer enthielt.

-6,11

-17,66

-25,43

-11,55

-17,1

-7,79

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

∆C

p x ̅(Δ Cp (1))

x ̅(Δ Cp (2))

x ̅(Δ Cp (3))

mit Blockprimer mit LNA™-Primer mit LNA™- und Blockprimer

3 ERGEBNISSE

40

3.4 Generierung der Positivkontrolle

Unter dem Begriff der positiven PCR-Kontrolle ist nach DIN EN ISO 22174:2005 diejenige

Reaktion definiert, die die Ziel-DNA in einer festgelegten Menge oder Anzahl an Kopien

enthält und bei jedem PCR-Lauf mitgeführt werden muss. So kann zum einen die

Funktionalität der Oligonukleotide zur Vermeidung falsch-negativer Resultate geprüft und

zum anderen beim Einsatz einer Verdünnungsreihe eine Quantifizierung der Probe erreicht

werden.

Zur Generierung des Plasmids wurde RNA-freie, quantifizierte Dekkera-anomala-DNA

amplifiziert (siehe Kap. 2.14.2), mit dem Vektor pGEM®-T ligiert (Kap. 2.14.3) und

anschließend in E. coli-XL1-Blue-Zellen transformiert (Kap. 2.14.4). Nach der Präparation

und Aufreinigung des Plasmids (Yeast Mold PK 1) konnte es sequenziert werden1. Eine

schematische Darstellung des Plasmids ist im Anhang gegeben (Anhang IV, Abbildung 29).

Sie kongruiert in vollem Umfang mit der in der NCBI-Datenbank hinterlegten D. anomala-

Sequenz (Gen Bank Acc. No. DQ406714).

Um eine Verwendung als Quantifizierungsstandard zu ermöglichen, war es notwendig, das

generierte Plasmid mit einer auf Genomäquivalente eingestellten chromosomalen DNA zu

korrelieren. Es wurde RNA-freie, quantifizierte Dekkera anomala-DNA (Genomgewicht:

1 GÄ ≈ 14,51 fg) verschiedener Konzentrationen eingesetzt und eine Standardkurve erstellt.

Vom zu untersuchenden Kontrollplasmid wurden verschiedene Kopienzahlen jeweils als

Duplikate in die Reaktion eingebracht und über die Standardkurve ein Zusammenhang

zwischen eingesetzter Kopienzahl und zugehörigen Genomäquivalenten hergestellt.

Demzufolge entsprechen 100 Plasmidkopien etwa einem Genomäquivalent. Hierzu sei auf

Abbildung 9 verwiesen, welche den beinahe kongruenten Verlauf der Amplifikationskurven

von Kontrollplasmid und dazugehöriger DNA-Konzentration zeigt. Die tabellarische Übersicht

aller Cp-Werte ist dem Anhang V beigefügt. Die Auswertung der Cp-Werte und die

errechneten DNA-Konzentrationen der Duplikate sind in Tabelle 18 aufgelistet. Die

Korrelation zwischen Plasmid und eingesetzter DNA-Menge wird darin deutlich: 1,02x104 GÄ

entsprechen 9x103 Kopien des Kontrollplasmids (Berechnung mit LightCycler®480

Software 1.5.0). Die Ausgangskonzentration des Positivkontrollplasmids wurde auf 4x106

Plasmidkopien je Mikroliter eingestellt. Zur Verwendung als Positivkontrolle genügte eine

Verdünnung auf 1x103 Plasmidkopien.

1 Aus patentrechtlichen Gründen ist die Positivkontrollsequenz nicht aufgeführt.

3 ERGEBNISSE

41

Abbildung 9: Amplifikationskurven zur Einstellung der Positivkontrolle auf Genomäquivalente Die Verdünnungsstufen des Positivkontrollplasmids (blau) wurden jeweils als Duplikat aufgetragen

(LightCycler®480-II): 1x10

6 – 1x10

5 – 1x10

4 – 2,5x10

3 – 6,25x10

2–1,56x10

2 Kopien. RNA-freie, quantifizierte DNA

aus Dekkera anomala (rot) wurde mit folgenden Genomäquivalenten aufgetragen: 10 000 GÄ – 1 000 GÄ – 100 GÄ – 25 GÄ – 6,25 GÄ – 1,56 GÄ. Mengenangaben sind jeweils Gesamtmenge je Reaktion. Negativkontrollen sind grün hervorgehoben. Es ist ersichtlich, dass DNA und Positivkontrollplasmid beinahe kongruent zueinander verlaufen. Demnach entsprechen 1x10

6 Plasmidkopien etwa 10 000 Genomäquivalenten.

Auch die nachfolgenden Verdünnungsstufen verlaufen annähernd identisch.

Tabelle 18: Korrelation der Cp-Werte von DNA und Positivkontrollplasmid

D. anomala-DNA Kontrollplasmid

Standard (GÄ) Cp Konzentration

(GÄ)

Standard (Kopien)

x̅ (Cp) Konzentration

(GÄ)

1,00E4 21,74 1,02E4 1,00E6 21,93 9,00E3

1,00E3 25,32 9,64E2 1,00E5 25,48 8,71E2

1,00E2 28,74 1,02E2 1,00E4 29,01 8,52E1

2,50E1 30,88 2,49E1 2,50E3 31,12 2,13E1

6,25E0 32,73 6,12E0 6,25E2 32,89 5,34E0

1,56E0 34,18 1,57E0 1,56E2 34,06 1,78E0

Gegenübergestellt sind die erhaltenen Cp-Werte der Dekkera-anomala-DNA, eingestellt auf Genomäquivalente, und des Positivkontrollplasmids mit den per Software (LightCycler

® Software 1.5.0) ermittelten DNA-Gehalten

(grün markiert) des in Abbildung 9 gezeigten Experimentes. Auch hier ist eine Korrelation von DNA und Plasmid

ersichtlich: 10 000 GÄ generieren einen Cp-Wert von 21,74, während 1x106 Plasmidkopien im Zyklus 21,93

detektiert werden. Die nachfolgenden Verdünnungsstufen weisen ebenfalls homogene Cp-Werte auf.

3.5 Einbringen einer internen Amplifikationskontrolle

Die interne Amplifikationskontrolle ist nach DIN EN ISO 22174:2005 diejenige DNA, „die zu

jeder Reaktion in einer festgelegten Menge oder Anzahl an Kopien hinzugefügt wird und die

als interne Kontrolle hinsichtlich der Amplifikation dient―. Das Mitführen einer solchen

Kontrollreaktion ist nach DIN EN ISO 20838:2006 vorgeschrieben.

Für die interne Amplifikationskontrolle dieses Assays wurde ein bereits synthetisiertes

Zielprodukt mit artifizieller DNA-Sequenz verwendet, dessen Basenabfolge nachweislich in

keinem Mikroorganismus auftritt. Geeignete Oligonukleotide wurden ebenfalls im Vorfeld

designt. Es galt dasjenige Primerpaar der homologen Amplifikationskontrolle zu wählen,

dessen Produkt eine größere Basenlänge wie das eigentliche Zielprodukt aufweist. Die

y = - 3,5x+35,23

R2 = 0,9963

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

-0,681

32,319

Zyklen 5 15 25 35 45

3 ERGEBNISSE

42

Reaktionsbedingungen für die IAK sollten suboptimal gewählt werden, d.h. es werden

geringere Primer- und Sondenkonzentrationen verwendet, um trotz Konkurrenz um dNTPs

und Polymerase die Reaktion in Richtung des kleineren Zielproduktes zu lenken (Prohaska

2009). Das Kontrollprodukt wies letztlich eine Basenlänge von 122 bp auf und ist damit

geringfügig länger als die Zielsequenz2. Das linearisierte IAK-Plasmid wurde in einer

Endkonzentration von 0,008fg/µl zum Mastermix (25 µl Reaktionsvolumen) hinzugegeben.

Die Detektion erfolgte im HEX-Kanal.

3.6 Spezifitätstestungen

3.6.1 Inklusivität

Der Norm DIN EN ISO 16140:2003 (Mikrobiologie von Lebensmitteln und Futtermitteln –

Arbeitsvorschrift für die Validierung alternativer Verfahren) und der amtlichen Sammlung von

Untersuchungsverfahren nach §64LFGB L 00.00-138 (Untersuchung von Lebensmitteln)

folgend wurden zur Inklusivitätsprüfung empirische Ergebnisse mit den Zielorganismen

erhoben. Anforderung war eine vergleichbare Amplifikationseffizienz der verschiedenen

Sequenzvarianten einer Vielzahl an Pilzen.

Abbildung 10: Amplifikationskurven taxonomisch verschiedener Fungi-Spezies Dargestellt sind die Amplifikationskurven taxonomisch verschiedener Fungi-Spezies aus 3 (Sub-)Phyla. Blau: Ascomycota: Fusarium poae (BCD 149), Pachysolen tannophilus (CBS 4044), Lipomyces kononenkoae (DSM 70302), Pichia farinosa (BCD 861), Citeromyces matritensis (BCD 1062), Eurotium amstelodami (BCD 3557), Scytalidium lignicola (BCD 3602), Candida glabrata (BCD 8932), Talaromyces flavus (BCD 12179), Diaporthe citri (DSM 1159), Aureobasidium pullulans (BCS 14484); Rot: Mucoromycotina: Zygorhynchus macrocorpus (BCD 2609), Radiomyces spectabilis (BCD 3505), Mycotypha africana (CBS 122.64), Mycotypha microspora (CBS 230.32); Dunkelgrün: Basidiomycota: Sterigmatomyces elviae (DSM 70852), Cryptococcus albidus (DSM 70197); Grün: PCR-NTCs. Es wurde jeweils eine DNA-Menge von 50 pg eingesetzt. In allen

Proben zeichnete sich ein gleichmäßiger und sigmoider Kurvenverlauf ab. Die Negativkontrollen sind negativ.

2 Aus patentrechtlichen Gründen sind weder Plasmidsequenz noch Hybridisierungsstellen abgebildet.

Zyklen 5 15 25 35 45

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

0,513

33,513

3 ERGEBNISSE

43

Es wurde RNA-freie DNA, die jedoch nicht auf Genomäquivalente eingestellt war, mit einer

Endkonzentration von 50 pg/Rxn. eingesetzt. Insgesamt wurden 243 Fungi-Spezies (285

Stämme) getestet: darunter befanden sich 201 (240) Ascomyceten, 21 (23) Basidiomyceten,

19 (20) Mucoromycotina-Spezies sowie je eine Kickxellomycotina- und Blastocladiomycota-

Spezies. Alle im Anhang VI aufgeführten Pilzstämme wurden in der Real-time-PCR

detektiert.

3.6.2 Exklusivität

Nach §64LFGB L00.00-138 soll bei der Entwicklung von Polymerase-

Kettenreaktionssystemen untersucht werden, ob Nicht-Ziel-Organismen eine Störung des

Assays verursachen. Taxonomisch nahverwandte und nicht nahverwandte Mikroorganismen,

die aber in Lebensmittelmatrices präsent sein können, sollten untersucht werden. Hierfür

wurden 60 RNA-freie, quantifizierte DNAs, die mit anderen Assays3 auf ihre

Amplifizierbarkeit hin untersucht wurden, mit einem Gehalt von 100 pg je Reaktion

eingebracht. Darunter befanden sich 25 Bakterien, 20 Pflanzenspezies sowie 10 humane, 4

murine und 1 canine Zelllinie (detaillierte Auflistung unter Anhang VII, Tabelle 31). Keine der

aufgeführten Spezies generierte ein positives Signal im pilzspezifischen FAM-Kanal,

während die amplifizierte IPC im HEX-Kanal eine Inhibition des Assays ausschließen ließ

(siehe Abbildung 11).

Abbildung 11: Amplifikationskurven der internen Amplifikationskontrolle bei der Exklusivitätstestung Abgebildet sind die Amplifikationskurven der internen Amplifikationskontrolle für 20 Bakterienspezies und 10 Pflanzen (DNA-Menge jeweils 100 pg). Alle Proben wurden im FAM-Kanal negativ getestet. Der HEX-Kanal zeigt einen korrekten Reaktionsablauf ohne Inhibitionen an.

3 Die DNAs wurden im Rahmen anderer Entwicklungsprojekte innerhalb des Unternehmens

erfolgreich eingesetzt.

Zyklen 5 15 25 35 45

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

-0,052

14,948

3 ERGEBNISSE

44

3.7 Sensitivitätstestung des Assays mit quantifizierbarer DNA

Mit der Überprüfung des limit of quantification (engl. Bestimmungsgrenze, Abkz. LOQ) soll

die kleinste Menge des Analyten, die mit definierter Richtigkeit und Präzision unter den

gegebenen Versuchsbedingungen gemessen und quantitativ bestimmt werden kann,

ermittelt werden. Das limit of detection (Abkz. LOD) beschreibt dagegen die absolute

Nachweisgrenze. Sie legt die niedrigste Konzentration des Target bezogen auf eine

definierte Menge an Matrix fest, die unter den gegebenen Versuchsbedingungen

reproduzierbar nachgewiesen werden kann (§64 LFGB L00.00-138).

Zur Testung der Sensitivität und damit der Feststellung der geringsten nachzuweisenden

DNA-Menge wurden 15 verschiedene Fungi-Stämme mit Hinblick auf eine gewisse

phylogenetische Varianz und Lebensmittelrelevanz ausgewählt. Vom größten Phylum, den

Ascomycota, wurden 11 verschiedene Spezies untersucht. Weiterhin wurden zwei

Basidiomycota- und zwei Mucoromycotina-Spezies herangezogen. Die Taxonomie ist

nachfolgend in Tabelle 19 dargestellt. Von allen eingesetzten Spezies wurde RNA-freie DNA

extrahiert, welche auf eine mögliche Degradierung hin mittels Agarosegelelektrophorese

geprüft wurde.

Tabelle 19: Taxonomie der zur LOD/LOQ-Bestimmung eingesetzten Spezies

Spezies Phylum Subphylum Klasse Ordnung

Cladosporium cladosporioides

Ascomycota Pezizomycotina Dothideomycotina Capnodiales

Alternaria citri Ascomycota Pezizomycotina Dothideomycetes Pleosporales

Aspergillus brasiliensis Ascomycota Pezizomycotina Eurotiomycetes Eurotiales

Penicillium chrysogenum

Ascomycota Pezizomycotina Eurotiomycetes Eurotiales

Fusarium oxysporum Ascomycota Pezizomycotina Sordariomycetes Hypocreales

Zygosaccharomyces bailii

Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales

Dekkera anomala Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales

Issatchenkia orientalis Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales

Pichia anomala Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales

Candida albicans Ascomycota Saccharomycotina Saccharomycetes Saccharomycetales

Schizosaccharomyces pombe

Ascomycota Taphrinomycotina Schizosaccharo-

mycetes Schizosaccharo-

mycetales

Rhodotorula mucilaginosa

Basidiomycota Pucciniomycotina Microbotryomycetes Sporidiobolales

Cryptococcus curvatus Basidiomycota Agaricomycotina Tremellomycetes Tremellales

Absidia corymbifera Mucoromycotina Mucorales

Mucor racemosus Mucoromycotina Mucorales

Pro Experiment wurden jeweils 2 verschiedene Spezies untersucht. Diese Vorgehensweise

ermöglichte einen direkten Vergleich der Amplifikationskurven - in Fluoreszenzhöhe und

erreichten Cp-Wert je DNA-Konzentration - verschiedener Spezies. Alle Versuche wurden auf

3 ERGEBNISSE

45

dem LightCycler®480-II durchgeführt. Die Cp-Wert-Berechnung erfolgte unter Anwendung

des 2nd Derivative Max der LightCycler®480-II Software.

Von den acht Verdünnungsstufen wurden 171 Replikate für die höchste DNA-Menge

(100 000 GÄ) und jeweils 173 Replikate für den Bereich von 10 000 bis 0,39 GÄ generiert.

Die Negativkontrolle wurde 140mal mitgeführt. Zunächst kann festhalten werden, dass alle

eingesetzten DNA-Proben mit dem pilzspezifischen Assay im FAM-Kanal detektiert wurden

(tabellarische Übersicht aller Daten pro Spezies im Anhang VIII). Die erhaltenen Cp-Werte

waren gleichmäßig verteilt, alle Kurven zeigten einen sigmoiden Verlauf. Es traten

Unterschiede in den finalen Fluoreszenzwerten auf (vgl. Abbildung 12). Das limit of detection

beträgt 0,39 GÄ, da keine niedrigere DNA-Menge getestet wurde.

Abbildung 12: Amplifikationskurven von Z. bailii und A. brasiliensis zur LOD/LOQ-Bestimmung Dargestellt sind die Verdünnungsreihen von Z. bailii (blau, 5 Replikate) und A. brasiliensis (rot, 6 Replikate). Es wurden zudem 8 Negativkontrollen (grün) aufgetragen, von denen drei im FAM-Kanal ein Signal lieferten. Die Amplifikationskurven der beiden Ascomyceten, die ein Genomgewicht von 11,5 fg (Z. bailii) und 40 fg (A. brasiliensis) aufweisen, verlaufen äußerst gleichmäßig und sigmoid. Die einzelnen Verdünnungsstufen sind optisch zu unterscheiden. Die Fluoreszenzen der Amplifikationskurven von Z. bailii erreichen höhere Werte. Das Experiment wurde auf dem LightCycler

®480-II durchgeführt.

Bei der genaueren statistischen Auswertung ist ersichtlich, dass im FAM-Kanal die

Standardabweichung der intraspezifischen Cp-Werte meist deutlich unter 0,5 lag (vgl. Tabelle

48). In denjenigen Fällen, wo sie darüber lag, kann dies auf Fehler beim Erstellen der

Verdünnungsreihe (siehe Replikat 10 bei C. albicans, Tabelle 42) oder das Auftragen einer

falschen Probe (siehe Replikat 10 bei A. citri, Tabelle 39) zurückgeführt werden. Des

Weiteren traten im niedrigen Konzentrationsbereich (0,39 GÄ) größere Schwankungen des

Cp-Wertes auf, was sich auch bei der interspezifischen Korrelation mit einer

Standardabweichung von 0,4 widerspiegelt. Ursache hierfür ist, dass im unteren

Konzentrationsbereich selbst eine geringe absolute Abweichung vom Standardwert stärker

Zyklen 5 15 25 35 45

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

-1,053

58,947

3 ERGEBNISSE

46

ins Gewicht fällt als sie es bei hohen Konzentrationen würde. Die relative Abweichung vom

Standardwert ist dementsprechend hoch.

Die Templates – Pilz-DNA und IPC-Plasmid – konkurrieren um dNTPs, Enzym und andere

Einsatzstoffe. Daher verschiebt sich die Amplifikation der IPC bei sehr hohen Pilz-DNA-

Mengen um einige Cp-Werte nach hinten, was in einer Standardabweichung von bis zu 0,5

resultiert (vgl. Tabelle 20). Dagegen bleibt der Cp-Wert des IPC-Signals im geringen

Konzentrationsbereich (< 100 GÄ) gleich.

Cp-Werte gegen den Logarithmus der Genomäquivalente aufgetragen, ergaben letztlich eine

linearisierte Standardkurve, deren Steigung s einen Wert von -3,40 annahm (vgl. Abbildung

13). In einer optimalen PCR-Reaktion mit einer Effizienz von 2 verdoppelt sich ein Produkt je

Zyklus (Mülhardt 2009). Das bedeutet, dass es 3,32 Zyklen benötigt, bis aus einem Molekül

10 Moleküle entstanden sind. Die Cp-Werte einer dekadischen Verdünnungsreihe sollten

demnach eine Differenz von 3,32 aufweisen. Dieser Wert entspricht der Steigung der

Standardkurve. In der Realität wird der Wert selten erreicht, da er von der Templatemenge

und damit von der Amplifikationswahrscheinlichkeit (u.a. Zusammenfinden von Enzym,

Template und Nukleotiden) und den Reaktionsbedingungen abhängig ist (Mülhardt 2009).

Die Steigung s der linearisierten Standardkurve aller untersuchten Proben zeugt mit einem

Wert von -3,40 von einer sehr guten PCR-Effizienz mit geringer Fehlerrate (R2 = 1,00).

Auffällig ist die hohe Anzahl an positiv getesteten Negativkontrollen: von 140 eingesetzten

Proben lieferten 30 ein Signal im FAM-Kanal. Dies entspricht einem relativen Wert von

21,4%. Negativkontrollen wurden jeweils auf denselben Mikroplatten pipettiert wie die

Verdünnungsreihen. Alle getesteten Proben, sowohl NTCs als auch DNAs, waren bei der

internen Kontrolle positiv.

Tabelle 20: Statistische Auswertung zur interspezifischen Korrelation

Genomäquivalente je Reaktion (Detektion FAM / HEX)

100 000 GÄ 10 000 GÄ 1 000 GÄ 100 GÄ 25 GÄ 6,25 GÄ 1,56 GÄ 0,39 GÄ 0 GÄ (NTC)

FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX

∑ Replikate

171 171 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 173 140 140

% Positive

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 21,4 100

x̅ (Cp) 16,6 33,2 20,2 32,0 23,7 30,9 27,1 30,4 29,2 30,6 31,2 30,8 33,1 30,9 35,0 31,0 38,8 31,0

σ (Cp) 0,1 0,5 0,0 0,4 0,1 0,2 0,3 0,0 0,1 0,0 0,1 0,0 0,2 0,0 0,4 0,0 2,67 0,19

Die Tabelle zeigt die zusammengefasste, statistische Auswertung aller untersuchten Replikate (∑ Replikate). Für jede Verdünnungsstufe wurden der prozentuale Anteil an positiv getesteten Proben (% Positive), der Mittelwert der erhaltenen Cp-Werte (x̅) sowie die dazugehörige Standardabweichung (σ) für den FAM- und HEX-Kanal berechnet. Die Replikate der verschiedenen Standardkonzentrationen wurden jeweils vollständig detektiert: Die Standardabweichungen (FAM-Kanal) liegen im Bereich von 0,0 bis 0,4. Aufgrund der Konkurrenz zwischen Pilz- und IPC-Template um PCR-Einsatzstoffe schwankt das IPC-Signal bei hohen Pilz-DNA-Mengen (σ100 000 GÄ = 0,5). Mit 21,4% wurde ein Fünftel aller Negativkontrollen positiv getestet.

3 ERGEBNISSE

47

Abbildung 13: Linearisierte Standardkurve zur interspezifischen Korrelation der LOD/LOQ-Bestimmung Aufgetragen sind die Cp-Werte mit jeweiliger Standardabweichung jeder Verdünnungsstufe gegen den Logarithmus der Genomäquivalenten (grün), generiert aus allen Cp-Werten der einzelnen Experimente jeder Spezies. Daraus ergibt sich eine linearisierte Standardkurve (schwarz) mit der Steigung s = -3,40.

3.8 Weitere Optimierung des Real-time-PCR-Assays

3.8.1 Blockierung der Taq-Polymerase bei Raumtemperatur

Die Untersuchungen zur Festlegung des LOD und LOQ wurden mit einem PCR-Mix

durchgeführt, der antikörpergeblockte, DNA-freie Taq-Polymerase enthielt. Da eine

Lyophilisation des Reaktionsmixes vorgesehen war, wurde auf den weiteren Einsatz des

glycerinhaltigen Antikörpers verzichtet. Glycerin stört den Gefriertrocknungsprozess aufgrund

seiner niedrigen Glasübergangstemperatur, wodurch die Flüssigkeit im System am

Tripelpunkt nicht vollständig sublimieren kann (Ringler 2000). Stattdessen wurde ein

Aptamer mit einer zuckerhaltigen Lyophilisationsreagenz eingesetzt.

Aptamere sind funktionelle Nukleinsäuren mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität zu ihrem

Zielmolekül. Die Ausbildung von Sekundär- und Tertiärstrukturen erlaubt die passgenaue

Bindung an das Molekül (Friedrichs und Simmel 2007). Es war zu klären, ob nach der

Gefriertrocknung die Effizienz der Polymerase beeinträchtigt ist und die neue Blockierungsart

eine vergleichbare Amplifikation ermöglicht. Die Untersuchungen wurden auf dem

LightCycler®480 mit einer Standardreihe für beide Ansätze vorgenommen. Die Amplifikation

der eingesetzten D. anomala-DNA zeigte bei beiden Reaktionsmixen einen gleichmäßigen

Verlauf (siehe Abbildung 14). Die Cp-Werte der jeweiligen Verdünnungsstufen weisen keine

Unterschiede auf (vgl. Tabelle 21). Der Mastermix mit aptamergeblockter Taq-Polymerase

erreicht etwa 10 % höhere Fluoreszenzwerte. Die Steigungen der Standardkurven liegen mit

Werten von sAntikörper = -3,424 und sAptamer = -3,395 nah beieinander. Die Negativkontrollen

generieren bei der internen Kontrolle Signale.

y = -3,40x + 33,80R² = 1,00

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

x ̅ (C

p)

log 10 (Genomäquivalente)

Interspezifische Korrelation

Standardkurve y

3 ERGEBNISSE

48

Tabelle 21: FAM-Cp-Werte des antikörper- bzw. aptamerhaltigen Reaktionsmixes

Genomäquivalente je Reaktion (Nominalkonzentration) – Detektion FAM

10 000 GÄ 1 000 GÄ 100 GÄ 25 GÄ 6,25 GÄ 1,56 GÄ

Antikörper Cp 20,60 24,03 27,51 29,48 31,19 32,33

GÄ (real) 1,01E4 1,00E3 9,46E1 2,57E1 5,95E0 1,56E0

Aptamer Cp 20,76 23,63 27,26 29,52 31,06 32,55

GÄ (real) 8,61E3 1,23E3 1,05E2 2,26E1 6,74E0 1,53E0

Gegenübergestellt sind die Cp-Werte (FAM) für eine Standardreihe von 10 000 bis 1,56 GÄ, die mit beiden Reaktionsmixen (Antikörper bzw. Aptamer) untersucht wurde. Die jeweils von der LightCycler

®-Software

berechneten Gehalte an Genomäquivalenten (GÄ (real)) sind für jede Verdünnungsstufe aufgeführt (grün). Im Vergleich liegen die Werte beider Reaktionsmixe beinander.

Abbildung 14: Amplifikationskurven der Reaktionsmixe mit antikörper- bzw. aptamergeblockter Taq-Polymerase Abgebildet sind die Amplifikationskurven zwei verschiedener Blockierungsarten der Taq-Polymerase nach der Lyophilisierung der Mastermixe (LightCycler

® 480): Rot: Aptamer, Blau: Antikörper. Grün dargestellt sind die

Negativkontrollen. Aufgetragen wurde eine Verdünnungsreihe mit D. anomala-DNA: 10 000 GÄ – 1 000 GÄ –

100 GÄ – 25 GÄ – 6,25 GÄ – 1,56 GÄ. Es ist ersichtlich, dass die Amplifikationskurven der aptamergeblockten Taq-Polymerase ebenso gleichmäßig verlaufen wie mit dem bisherigen Mastermix. Dabei werden zugleich höhere Fluoreszenzwerte erreicht. Die Steigung s der Standardkurve des aptamergeblockten Mixes (s = -3,395) ist der einer optimalen PCR näher (s = -3,32 bei Effizienz von 2), weist aber eine höhere Fehlerrate auf

(R2 = 0,9799).

3.8.2 Gradienten-PCR

Mit dem Einsatz der aptamergeblockten Taq-Polymerase war eine Prüfung der

Annealingtemperatur mittels Gradienten-PCR auf dem LightCycler® 96 notwendig. Hierfür

wurde unter Beachtung der Schmelztemperaturen von Primer und Amplifikat ein erster

Untersuchungsbereich von 53 bis 67°C gewählt. Neben dem Einsatz von zwei Ziel-DNAs

(A. brasiliensis, D. anomala) wurde auch ein pflanzenspezifisches Plasmid (siehe Kapitel

2.14.1 und 3.2) zugegeben. Dies sollte eine Aussage darüber erlauben, bei welcher

Annealingtemperatur unerwünschte Amplifikate am stärksten unterdrückt würden. Zum

gleichen Zweck wurde jeweils eine Negativkontrolle mitgeführt.

yAntikörper = -3,424x+33,51

yAptamer = -3,395x+33,53

R2Antikörper = 0,9949

R2Aptamer = 0,9799

Zyklen 5 15 25 35 45

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

16,606

0,106

3 ERGEBNISSE

49

Die Beurteilung und die Auswahl einer Annealingtemperatur wurden stets unter

Berücksichtigung der bisherigen Resultate vorgenommen. Das Experiment mit dem

großzügig gewählten Temperaturbereich hat gezeigt, dass die relevante

Annealingtemperatur zwischen 60 und 63 °C liegt (Daten nicht gezeigt). Die Cp-Werte der

eingesetzten DNA-Mengen waren im Vergleich zu den Erfahrungswerten aus LOD- und

LOQ-Bestimmung nicht verschoben, die Fluoreszenzwerte im niedrigen Temperaturbereich

(60°C) um ca. 10% höher und unerwünschte Amplifikate wurden weitestgehend unterdrückt.

Die Amplifikate der Pilz-DNAs zeigten dagegen in den Abschnitten von 53 bis 59°C sowie

von 63 bis 67°C einen flachen Kurvenanstieg und niedrige Fluoreszenzwerte. Aus dem

zugegebenen Pflanzenplasmid und den Negativkontrollen wurden unspezifische PCR-

Produkte und Dimere generiert, die falschpositive Resultate lieferten. Obwohl auch bei 58 °C

gute Resultate erzielt werden konnten, musste dieses Temperaturspektrum aufgrund der

deutlich verminderten IPC-Amplifikation ausgeschlossen werden.

Zur Festlegung der optimalen Annealingtemperatur wurde ein direkter Vergleich der

Temperaturen von 60 und 63°C auf dem Stratagene Mx3005p durchgeführt. Aufgetragen

wurden eine Standardverdünnungsreihe von Dekkera anomala (DSM 70727), das Pflanzen-

Plasmid (10 pg, 4 Replikate) sowie 18 NTCs. Für beide Untersuchungen wurden dieselben

Verdünnungen verwendet. Beim Betrachten der Amplifikationskurven fällt zunächst auf, dass

der Verlauf der Proben mit Pilz-DNA in beiden Fällen sigmoid erfolgte und alle

Verdünnungsstufen detektiert wurden (vgl. Abbildung 15 und Abbildung 16). Der Anstieg war

im Experiment mit 60°C Annealingtemperatur flacher, was jedoch nicht in einer Cp-

Verschiebung resultierte. Während die höhere Annealingtemperatur deutliche

Amplifikationskurven aller plasmidhaltigen Proben und einiger Negativkontrollen generierte,

traten im Vergleichslauf (60°C) weniger unerwünschte Signale auf. Keine der eingesetzten

Pflanzen- und Negativkontrollen wurden als positive Probe detektiert. Nachfolgende

Experimente wurden somit mit der Annealingtemperatur von 60°C durchgeführt.

3 ERGEBNISSE

50

Abbildung 15: Amplifikationskurven bei 63°C Annealingtemperatur Abgebildet sind die Amplifikationskurven (Stratagene Mx3005p) einer Standardreihe von Dekkera anomala (rot), Plasmid mit pflanzenspezifischem Insert (4 Replikate, 10 pg, blau) sowie NTCs (18 Replikate, grün). Neben dem

gleichmäßigen Verlauf der Ziel-DNA sind Fluoreszenzsignale beim Plasmid sowie 5 Negativkontrollen gemessen worden, die jeweils in einer Kurve resultierten, die zwar hinter der des geringsten Standards (1,56 GÄ) verliefen, aber dennoch als positiv detektiert wurden.

Abbildung 16: Amplifikationskurven bei 60°C Annealingtemperatur Abgebildet sind die Amplifikationskurven (Stratagene Mx3005p) einer Standardreihe von Dekkera anomala (rot), Plasmid mit pflanzenspezifischem Insert (4 Replikate, 10 pg, blau) sowie NTCs (18 Replikate, grün). Die

Amplifikationskurven der Standardreihe verliefen im Vergleich zu Abbildung 15 etwas flacher aufgrund eines geringeren Anstiegs, aber dennoch sigmoid. Es wurden höhere Fluoreszenzwerte erzielt (ca. 40%) und keine unerwünschten Produkte generiert.

1000

Flu

ore

szen

z (

dR

)

3000

1000

Flu

ore

szen

z (

dR

)

4000

6000

26 Zyklen 6 12 18 32 38 44

44

26 Zyklen 6 12 18 32 38 44

44

3 ERGEBNISSE

51

3.8.3 Überprüfung der Performance

Mit den Erkenntnissen in Bezug auf die aptamergeblockte Taq-Polymerase und der

Annealingtemperatur sollte geprüft werden, ob die Anzahl falschpositiver Resultate, wie sie

bei der LOQ- und LOD-Bestimmung im Kapitel 3.7 auftraten (21,4% positive Proben bei

Negativkontrollen), verringert werden konnte. Neben dem Einsatz des Aptamers und des

neuen PCR-Temperaturprofils wurden zusätzliche Dekontaminationsmaßnahmen4 getroffen.

Es wurde lyophilisierter Mastermix herangezogen, der mit 32 Negativkontrollen und einer

Standardverdünnungsreihe von Dekkera anomala auf dem LightCycler®480 untersucht

wurde (siehe Abbildung 17).

Abbildung 17: Performanceprüfung mit einer Vielzahl an Negativkontrollen Dargestellt sind die Amplifikationskurven des PCR-Laufs zur Prüfung der Spezifität des Mastermixes mit aptamergeblockter Taq-Polymerase bei einer Annealingtemperatur von 60 °C (LightCycler

®480). A: FAM-Kanal:

Als Positivkontrolle wurde eine Standardverdünnungsreihe von Dekkera anomala (DSM 70727, rot) aufgetragen. Zusätzlich wurden 32 Negativkontrollen (grün) mitgeführt. Aus der Verdünnungsreihe ergaben sich gleichmäßig, sigmoide Kurven. Alle Negativkontrollen sind negativ. B: HEX-Kanal: Alle eingesetzten Proben generierten ein

Internes Kontrollsignal.

Es konnte gezeigt werden, dass mit den neuen Reaktionsbedingungen die Amplifikation der

Positivkontrollreihe (10 000 bis 1,56 GÄ) wie in vorherigen Experimenten sigmoide Kurven

hervorbrachte und alle Verdünnungsstufen detektiert wurden (siehe Abbildung 17 A). Alle

Negativkontrollen waren infolge der Dekontaminationsmaßnahmen im FAM-Kanal negativ.

Im HEX-Kanal waren alle Kontrollen IPC-positiv (siehe Abbildung 17 B).

3.9 Probenaufarbeitung für Fungi in Getränkematrices

3.9.1 Aufarbeitung filtrierbarer Flüssigkeiten

Zu den filtrierbaren Flüssigkeiten gehören klare Wässer ohne Kohlensäure, die sich mit

einem Volumen von 100 ml durch einen Polysulfonfilter (Abkz. PS-Filter) mit einer

Porengröße von 0,2 µm absaugen lassen. Als Modellmedium wurde Wasser mit

4 Alle Plastikmaterialien (Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße etc.) wurden vor dem Gebrauch 30 min

unter der PCR-Arbeitsbank mit UV (Abkz. ultraviolettes Licht) bestrahlt.

Flu

ore

szen

z (

533-5

80n

m)

A B

Zyklen 4 12 30 44

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

32,420

-0,580

Zyklen 5 15 35 45

32,420

-0,137

13,863

36

3 ERGEBNISSE

52

standardisierter Härte (Abkz. WSH) verwendet. Verdünnungen von Hefezellen- oder

Sporensuspensionen wurden ebenfalls in WSH hergestellt.

Zur Bestimmung der Sensitivität wurden 100 µl einer dekadisch verdünnten Aspergillus-

brasiliensis-Sporensuspension von 1,5x106 bis 1,5x10

1 KBE/ml zu 100 ml WSH zugesetzt.

Jede Verdünnungsstufe wurde als Duplikat untersucht. Als Negativkontrolle der

Aufarbeitungsmethode wurde WSH mitgeführt (Einfachbestimmung). Die Anzahl

koloniebildender Einheiten wurde mikrobiologisch auf YGC-Agar überprüft (Ausplattieren der

letzten beiden Verdünnungsstufen). Nach vollständigem Absaugen der Flüssigkeit wurden

die Filter in vorbereitete StarPrepTwo-Reaktionsgefäße überführt und dem Protokoll unter

Kapitel 2.21.2 folgend bearbeitet. Der Mastermix wurde in lyophilisierter Form verwendet,

wodurch sich das Probevolumen für die PCR auf 25 µl erhöhte. Die PCR wurde auf dem

Stratagene Mx3005p durchgeführt.

Abbildung 18: Wiederfindungsrate von A. brasiliensis-Sporen nach Filtration Dargestellt sind die Amplifikationskurven der mittels Filtration und mechanisch-thermischer Lyse aufbereiteten

Duplex-Proben einer A. brasiliensis-Sporensuspension in jeweils 100 ml WSH. Dotierungslevel: Blau: 1,5x105

KBE; Gelb: 1,5x104 KBE; Orange: 1,5x10

3 KBE; Hellblau: 1,5x10

2 KBE; Rot: 1,5x10

1 KBE; Grün: PCR-NTCs

und WSH. Es wurden alle Dotierungen eindeutig nachgewiesen, während die entsprechenden Negativkontrollen kein Signal im FAM-Kanal ausgaben. Die Kurven wiesen einen gleichbleibenden Abstand zueinander auf, so dass der Verdünnungsfaktor gut erkennbar ist. Ein Filter der Probe mit 1x103 KBE wurde durch eine ungenügend

gesäuberte Flasche kontaminiert, wodurch eine frühzeitige Amplifikation zustande kam. Die Cp-Werte sind der nachstehenden Tabelle 22 zu entnehmen.

Bei der Betrachtung der Amplifikationskurven ist ersichtlich, dass alle Dotierungsstufen

nachgewiesen werden konnten (siehe Abbildung 18). Zudem sind alle mitgeführten

Negativkontrollen eindeutig negativ, so dass Kontaminationen der Reagenzien

ausgeschlossen werden konnten. Die zusammengehörigen Proben – als Duplikate

aufgetragen - verliefen beinahe kongruent zueinander, so dass die Reproduzierbarkeit des

Assays gegeben ist. Eine Ausnahme stellte hierbei eine Probe des Dotierungslevels von

Zyklen 6 12 18 32 38 44

44

Flu

ore

szen

z (

dR

)

1000

6000

3 ERGEBNISSE

53

1x103 KBE dar: aufgrund einer unzureichend gesäuberten Flasche wurde diese kontaminiert,

woraus ein verfrühtes Signal (Cp 25,56 zu 28,76) resultierte. Dies ergab bei der statistischen

Auswertung eine hohe Standardabweichung von σ = 1,6. Die weiteren dekadischen

Verdünnungsstufen wiesen einen gleichmäßigen Abstand von 2,9 bis 3,8 Zyklen auf.

Tabelle 22: FAM-Cp-Werte zur Bestimmung der Wiederfindungsrate von Aspergillus-Sporen nach Filtration

Dotierungslevel (KBE/100 ml): Mikrobiologie

Detektion FAM

Dotierungslevel (KBE/25 µl):

Mikrobiologie

Dotierungslevel (GÄ/25 µl):

PCR-Quantifizierung

1,5x105 Cp 22,22/22,04 6,90E3 GÄ 1,89E3/2,98E3

x̅ (Cp) 22,13

x̅ (GÄ) 2,43E3

σ (Cp) 0,09

σ (GÄ) 5,5E2

1,5x104 Cp 24,68/24,93 6,90E2 GÄ 5,70E2/4,70E2

x̅ (Cp) 24,805

x̅ (GÄ) 5,20E2

σ (Cp) 0,125

σ (GÄ) 5,0E1

1,5x103 Cp 25,56/28,76 6,90E1 GÄ 2,00E2/5,00E1

x̅ (Cp) 27,16

x̅ (GÄ) 1,25E2

σ (Cp) 1,6

σ (GÄ) 7,5E1

1,5x102 Cp 32,20/32,03 6,90E0 GÄ 7,52E0/8,85E0

x̅ (Cp) 32,115

x̅ (GÄ) 8,185E0

σ (Cp) 0,085

σ (GÄ) 6,65E-01

1,5x101 Cp 36,07/35,21 6,90E-1 GÄ 3,00E-1/1,11E0

x̅ (Cp) 35,64

x̅ (GÄ) 7,05E-1

σ (Cp) 0,43

σ (GÄ) 4,0E-1

undotiert Cp - - - GÄ - -

Eine dekadische Verdünnungsreihe mit Aspergillus-Sporen (1,5x105 – 1,5x10

1, undotiert), deren KBE-Zahl zu

Beginn des Experimentes mikrobiologisch bestimmt wurde, wurde in WSH angesetzt und als Duplikate jeweils durch einen PS-Filter mit 0,2 µm Porengröße filtriert. Der Filter wurde anschließend in das StarPrepTwo-Reaktionsgefäß überführt. Nach der mechanisch-thermischen Behandlung wurden 25 µl des Lysats in der PCR untersucht. Dargestellt sind die Cp-Werte der Einzelreaktionen für jede Dotierungsstufe sowie der aus den Duplikaten erhaltene Cp-Mittelwert und die Standardabweichung. Des Weiteren sind die Dotierungslevel für 25 µl Probevolumen – berechnet aus der erneuten mikrobiologischen Kontrolle (Ausplattieren von 100µl Suspension) und über die PCR-Standardreihe – beider Methoden gegenübergestellt. Zudem sind für die Duplikate der mittlere GÄ-Gehalt und die Standardabweichung aufgeführt. Der Vergleich beider Methoden zeigt, dass KBE- und GÄ-

Gehalt zueinander in Beziehung stehen: mit Ausnahme der kontaminierten Probe (1x103 KBE/100ml) liegen die

Werte beider Berechnungen stets im selben Bereich. In 25 µl Sporensuspension befanden sich nach

mikrobiologischer Auswertung 6,9x102 KBE, die Auswertung über die Stratagene-Software ergab 5,2x10

2 GÄ. Für

die weiteren Verdünnungsstufen stimmen die Werte ebenfalls überein.

Mittels Korrelation der Cp-Werte der Dotierungsstufen mit einer Standardkurve (D. anomala,

DSM 70727) über den Modus der Multiple Experiment Analysis (Software MxPro) war eine

Quantifizierung möglich. Vergleichend sind in Tabelle 22 die KBE-Werte der

mikrobiologischen Auswertung (Umrechnung aus 100µl ausplattierter Suspension) und die

GÄ-Gehalte der quantitativen Bestimmung gegenübergestellt. Es wurden die DNA-Mengen

der Einzel- als auch der Duplexproben analysiert. Bei einem mikrobiologisch bestätigten

Dotierungslevel von 1,5x105 KBE entspräche dies bei einem PCR-Volumen von 25 µl etwa

6,9x103 KBE. Mittels softwarebasierter Quantifizierung ergab sich in diesem Fall ein DNA-

Gehalt von 1,89x103 bzw. 2,98x10

3 GÄ. Ein Zusammenhang zwischen eingesetzter KBE-

3 ERGEBNISSE

54

Zahl und errechneten Genomäquivalenten in der Reaktion ist somit erkennbar. Die Werte der

weiteren Verdünnungsstufen lagen ebenfalls beieinander: während laut mikrobiologischer

Kontrolle etwa 6,9x102 KBE in 25 µl Probe enthalten waren, ergab die Auswertung über die

Standardkurve einen mittleren DNA-Gehalt von 5,2x102 GÄ. Ebenso verhält es sich mit den

niedrigeren Dotierungsstufen (5,0x101, 8,1x10

0 und 7,05x10

-1 GÄ).

3.9.2 Probenaufarbeitung für nicht-filtrierbare Flüssigkeiten

3.9.2.1 Wiederfindungsrate in nicht-filtrierbaren Flüssigkeiten

3.9.2.1.1 Kohlensäurehaltige Flüssigkeiten

Aufgrund der Kohlensäure kann die Flüssigkeit mit dem gewählten System nicht mechanisch

abgesaugt werden. Ein Ausschlagen der Kohlensäure ist jedoch ein zusätzlicher

Arbeitsschritt, der die Gefahr der Kreuzkontaminationen durch nicht sterile Arbeitsmaterialien

etc. birgt. Zudem sollte das Verfahren die Bearbeitung des finalen Produktes ohne

zusätzliche Arbeitsschritte ermöglichen. Als Modellmatrix für kohlensäurehaltige

Flüssigkeiten wurde handelsübliche Cola herangezogen, welche mit einem Probevolumen

von 100 µl aufgearbeitet wurde. Neben der undotierten Kontrolle wurde je eine Probe mit

Saccharomyces cerevisiae (1x103 bzw. 1x10

2 KBE) artifiziell kontaminiert. Das

Dotierungslevel wurde per Oberflächenverfahren mikrobiologisch bestätigt. Da in

vorangegangenen Versuchen stets vollständige Inhibitionen der PCR-Reaktion auftraten

(nicht gezeigt), erkennbar am fehlenden IPC-Signal, wurde im vorliegenden Experiment eine

Anpassung des pH-Wertes auf pH 5 bzw. 7 sowie eine Verdünnung des Lysats getestet.

Das PCR-Probevolumen betrug 10 µl. Die Auswertung der PCR hat gezeigt, dass

unverdünnte Colalysate weder im FAM- noch im IPC-Kanal ein Signal ausgeben. Die PCR-

Reaktion ist trotz unterschiedlicher pH-Werte vollständig inhibiert (vgl. Tabelle 23). Ein

neutraler pH-Wert hat damit keinen positiven Einfluss auf die Reaktion.

Die 1:10-Verdünnung der Lysate in Wasser konnte Störstoffe beseitigen und eine Inhibition

verhindern (vgl. Abbildung 19). Beide Dotierungsstufen generierten ein FAM-Signal:

zwischen den beiden Dotierungsstufen ergab sich ein Abstand der Cp-Werte von 3,68 (pH 5)

bzw. 3,79 (pH 7) Zyklen. Trotz unterschiedlicher pH-Werte stimmten die Cp-Werte eines

Dotierungslevels überein. Das Gesamtvolumen der Präparation betrug 640 µl. Unter

Berücksichtigung des PCR-Volumens und des Verdünnungsfaktors waren demnach 2,5

bzw. 0,25 GÄ in einer Reaktion vorhanden. Die erhaltenen Cp-Werte von 31,63/32,02 bzw.

35,21/35,81 spiegelten unter Berücksichtigung der Werte zur Sensitivitätstestung (vgl.

Kapitel 3.7) den Kontaminationsgrad wider. Verdünnte, aber undotierte Matrixkontrollen

sowie PCR-Negativkontrollen zeigten wie erwartet nur im IPC-Kanal eine erfolgreiche PCR-

Reaktion an.

3 ERGEBNISSE

55

Abbildung 19: Amplifikationskurven von 1:10-verdünnten Colaproben Dargestellt sind die Amplifikationskurven dotierter (S. cerevisiae) und undotierter Colaproben, welche verdünnt in die PCR eingesetzt wurden. Der pH-Wert der Ausgangsprobe wurde auf pH 5 bzw. pH 7 erhöht. Das Probevolumen betrug 10 µl. Proben: Dunkelblau: 1,6x10

3 KBE, pH 5; Orange: 1,6x10

2 KBE, pH 5; Blau: 1,6x10

3

KBE, pH 7; Rot: 1,6x102 KBE, pH 7; Hellgrün: undotiert, pH 5 und pH 7; Grün: PCR-NTCs. Trotz verschiedener

pH-Werte verliefen die identisch dotierten Proben gleich. Undotierte Matrix sowie PCR-Negativkontrollen zeigten keine Kontamination an.

Tabelle 23: Gegenüberstellung der erhaltenen Cp-Werte für (un)-verdünnte Colaproben

pH Dotierungslevel

(KBE/100µl) Unverdünnte Probe (Cp) 1:10-verdünnte Probe (Cp)

FAM HEX FAM HEX

5 1,6x103 - - 31,63 31,91

7 1,6x103 - - 32,02 32,13

5 1,6x102 - - 35,21 32,02

7 1,6x102 - - 35,81 31,12

5 undotiert - - - 32,22

7 undotiert - - - 32,04

NTC undotiert - 32,30 - 32,48

NTC undotiert - 32,30 - 32,09

Aufgeführt sind die Cp-Werte (FAM/HEX) für beide Dotierungsstufen (1,6x103 bzw. 1,6x10

2 KBE/100µl) mit den

jeweils eingestellten pH-Werten (5 bzw. 7). Die Lysate wurden sowohl als Original-DNA sowie 1:10 verdünnt in die PCR eingesetzt. Zusätzlich wurden undotierte Matrixproben und NTCs untersucht. Keines der Originallysate lieferte ein Signal im FAM- oder HEX-Kanal. Das IPC-Signal der No Template Control bestätigte allerdings die Funktionalität des PCR-Reaktionsmixes. Erst mit der Verdünnung der Lysate wurden dotierte Proben im FAM-Kanal detektiert. Zudem konnte in allen Proben die IPC amplifiziert und detektiert werden. Die Cp-Werte einer Dotierungsstufe waren trotz unterschiedlicher pH-Werte identisch. Der pH hat somit keinen Einfluss auf die Sensitivität des Assays. Die Wiederfindungsrate liegt für kohlensäurehaltige Getränke umgerechnet bei 0,25GÄ.

Zyklen 6 12 18 32 38 44

44

Flu

ore

szen

z (

dR

)

0

1500

0

3 ERGEBNISSE

56

3.9.2.1.2 Einsatzstoffe und Halbware

Für die Untersuchung nicht-filtrierbarer Flüssigkeiten, die als Grundstoffe zur Produktion von

Limonaden, Säften oder Brausen eingesetzt werden, wurde zunächst eine Anreicherung der

Probe in SSL-Medium im Verhältnis 1 zu 10 vorgenommen. SSL-Medium wird in der

Industrie bei Durchführung des SSL-Verfahrens als Standardmedium verwendet. Als

Matrices konnte auf reale Brauereiproben zurückgegriffen werden. Neben sehr dunklen

Matrices wie Cola-, Apfelgrundstoff und Malz-Mischungen war auch hochviskoser

Invertzucker verfügbar. Alle Probemuster wurden stets auf ihre Kontaminationsfreiheit hin

getestet. Die 7 Matrices wurden über einen Zeitraum von 48 h bei 30°C bebrütet. Dabei

wurden sowohl undotierte als auch grenzwertig mit Saccharomyces cerevisiae dotierte

Ansätze (0 bis 10 KBE) mitgeführt. Nach 24 und 48 h erfolgte die Probenahme (Duplikate).

Undotierte, inkubierte Proben wurden zudem mit 1x104 KBE S. cerevisiae artifiziell

kontaminiert, um Aussagen zur Wiederfindungsrate nach der Aufarbeitung treffen zu können.

Mikrobiologische Kontrollen der Ansätze wurden sowohl als Gusskultur in OFS-Agar als

auch mittels Oberflächenverfahren analysiert.

Eine Gegenüberstellung der mikro- und molekularbiologischen Analyse kann der Tabelle 24

entnommen werden. Die mittels PCR erhaltenen Resultate beider Entnahmezeitpunkte sind

ausführlich in Tabelle 25 zusammengefasst. Zunächst wurde festgestellt, dass alle Matrices

kontaminationsfrei waren. Weder bei der mikrobiologischen noch der PCR-analytischen

Kontrolle wurden Kolonien bzw. Signale im FAM-Kanal detektiert. Die grenzwertige

Dotierung mit Saccharomyces cerevisiae zeigte nach Beurteilung der YM-Agarplatten

lediglich 0 - 2 KBE an, so dass präsumtiv nicht alle Proben erfolgreich beimpft wurden. Nach

Auswertung der Resultate beider Methoden hat sich diese Annahme bestätigt: lediglich zwei

von sieben Matrices (Apfelgrundstoff, Malz-Rhabarber-Mischung) wurden mit der Hefe

versetzt. In beiden Fällen konnte diese Kontamination bereits nach 24 h Anreicherungsdauer

bestätigt werden, wobei wiederum dekadisch verdünnte Lysate in die PCR eingesetzt

werden mussten, da sonst eine vollständige Inhibition der Reaktion beobachtet wurde. Die

Betrachtung und Beurteilung der Agarplatten konnte nach weiteren 24 Stunden

vorgenommen werden. Eine Auszählung der Einzelkolonien gestaltete sich aufgrund der

enormen Anzahl derer schwierig: die Analyse der OFS-Platten war nicht realisierbar, auf YM-

Platten wuchsen etwa 300 bzw. 500 Kolonien.

Die weitergehende Anreicherung ermöglichte schließlich die Detektion des Hefebefalls im

unverdünnten Lysat des Apfelgrundstoffs. Allerdings wurde ein Cp-Wert generiert, der weit

hinter dem des verdünnten Lysats lag, so dass hier eine Inhibition der PCR-Reaktion

vorliegen musste. Unterstützt wird diese Vermutung durch ein ausbleibendes IPC-Signal. In

der Malz-Rhabarber-Mischung konnte die Hefe erneut nur im verdünnten Lysat

nachgewiesen werden.

3 ERGEBNISSE

57

Tabelle 24: Gegenüberstellung der Resultate der mikro- und molekularbiologischen Analyse

Matrix Dotierung 24h Anreicherung 48h Anreicherung

PCR OFS YM PCR OFS YGC

Colagrundstoff - - 0 0 - 0 0

Zitronenaroma - - 0 0 - 0 0

Vitaminmischung - - 0 0 - 0 0

Apfelgrundstoff - - 0 0 - 0 0

Malz-Rhabarber - - 0 0 - 0 0

Malz-Zitrone-Limette - - 0 0 - 0 0

Invertzucker - - 0 0 - 0 0

Colagrundstoff + - 0 0 - 0 0

Zitronenaroma + - 0 0 + 0 0

Vitaminmischung + - 0 0 - 0 0

Apfelgrundstoff + + tntc ≈500 + tntc tntc

Malz-Rhabarber + + tntc ≈300 + tntc tntc

Malz-Zitrone-Limette + - 0 0 - 0 0

Invertzucker + - 0 0 - 0 0

Brauereigrundstoffe wurden auf ihre mikrobiologische Reinheit geprüft und anschließend mit S. cerevisiae beimpft, wobei das Dotierungslevel so niedrig gewählt wurde, dass präsumtiv nicht alle Proben erfolgreich mit der Hefe versetzt wurden. Alle Proben wurden mikrobiologisch (Oberflächenverfahren auf YM-Agar und Gusskultur in OFS-Agar) und molekularbiologisch (PCR) nach 24h und 48h Anreicherung in SSL-Medium untersucht. Die Grundstoffe waren mikrobiologisch rein – dies konnte sowohl in der PCR, als auch auf den Agarplatten bestätigt werden. Nur zwei der Matrices konnten mit der Hefe beimpft werden. In beiden Fällen war der Befall bereits nach 24h mit allen Nachweismethoden erkennbar. Mit den mikrobiologischen Verfahren war eine quantitative Aussage über den Befall allerdings aufgrund der hohen Koloniezahl (totally not to count, Abkz. tntc) und dem Wachstum in

den OFS-Agar erschwert.

Tabelle 25: PCR-Analyse nach Anreicherung in SSL bei grenzwertiger Dotierung

Unverdünnte Proben 1:10-verdünnte Proben

FAM (24h)

FAM (48h)

HEX (24h)

HEX (48h)

FAM (24h)

FAM (48h)

HEX (24h)

HEX (48h)

Colagrundstoff -/- -/- -/- -/- -/- -/- 32,64

32,18

32,80

32,90

Zitronenaroma -/- -/- 30,03

30,59

31,74

31,40 -/-

41,06

-

32,32

33,02

32,05

32,02

Vitaminmischung -/- -/- 38,57

34,43

35,74

- -/- -/-

32,99

32,70

31,97

32,49

Apfelgrundstoff -/- 28,61

28,42 -/- -/-

32,14

31,61

19,93

19,45

32,19

31,74

-

32,97

Malz-Rhabarber-Mischung

-/- -/- -/- -/- 36,05

35,52

26,73

27,11

32,03

31,94

32,22

31,65

Malz-Zitronen-Limetten-Mischung

-/- -/- -/- -/- -/- -/- 32,80

32,45

32,14

32,02

Invertzucker -/- -/- 34,43

-

32,23

32,18 -/- -/-

32,75

32,90

32,14

32,41

Aufgeführt sind die Ergebnisse aus der PCR-Analyse (FAM/HEX) der grenzwertig dotierten und in SSL-Medium verdünnten Brauereigrundstoffe. Die Probenahmen erfolgten nach 24 und 48h jeweils in Duplikaten. Die Proben wurden original und 1:10 verdünnt untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass auch hier die unverdünnten, dunklen Matrices verstärkt zu einer Inhibition der PCR-Reaktion führten: so konnten weder beim Colagrundstoff noch bei den Malzmischungen IPC-Signale detektiert werden. Dies wurde erst durch eine Verdünnung des Lysats möglich. Die grenzwertige Dotierung war im Apfelgrundstoff und der Malz-Rhabarber-Mischung erfolgreich und konnte bereits nach 24h, jedoch nur im verdünnten Lysat, nachgewiesen werden.

3 ERGEBNISSE

58

Zusätzlich wurde ein Signal im FAM-Kanal beim verdünnten Zitronenaroma gemessen,

deren Amplifikationskurve jedoch keinen typisch sigmoiden Verlauf nahm. Zudem wurde kein

Wachstum auf oder in den Agarplatten festgestellt. Eine Kontamination oder erfolgreiche

Dotierung war somit ausgeschlossen. Es handelte sich somit um ein falschpositives Signal.

Inkubierte, undotierte Einsatzstoffe wurden nach 24 bzw. 48 Stunden mit 1x104 KBE

Saccharomyces cerevisiae versetzt und aufgearbeitet, um Aussagen zur Wiederfindungsrate

in schwierigen Matrices zu erhalten. Die Lysate wurden wiederum unverändert als auch

verdünnt in die PCR eingesetzt. Alle erhaltenen Daten sind in Tabelle 26 aufgelistet.

Sehr dunkle Proben wie Cola- und Apfelgrundstoff, aber auch Malz-Zitrone-Limetten- und

Malz-Rhabarber-Mischung ließen als unverdünntes Lysat keine Amplifikation in der PCR zu,

so dass weder ein pilzspezifisches noch ein IPC-Signal erzeugt werden konnte bzw. das

IPC-Signal sehr stark verzögert detektiert wurde. Eine Erkennung des Hefebefalls fand bei

den Vitaminmischungsproben zwar statt, aber hier waren sowohl FAM- als auch HEX-

Signale verspätet, was ebenfalls eine Inhibition vermuten ließ. Dagegen konnte sowohl im

Invertzucker als auch Zitronenaroma, beides viskose, aber klare Produkte, die Kontamination

zweifelsfrei festgestellt werden. Insgesamt wurde demnach in 16 von 28 Proben Hefe-DNA

nachgewiesen, so dass die Wiederfindungsrate 42,9% betrug. Verdünnte man die Lysate

allerdings in NTC-Wasser, so konnte der Nachweis zu 100% erfolgen. Die Cp-Werte

variieren, allerdings wird bei Einsatzstoffen zunehmend auf mikrobiologische Abwesenheit

getestet, weshalb eine quantitative Aussage nicht zwingend notwendig ist.

Tabelle 26: Cp-Werte zur Bestimmung der Wiederfindungsrate in nicht-filtrierbaren Proben

Unverdünnte Proben 1:10-verdünnte Proben

FAM (24h)

FAM (48h)

HEX (24h)

HEX (48h)

FAM (24h)

FAM (48h)

HEX (24h)

HEX (48h)

Colagrundstoff -/- -/- -

32,12 -/-

34,93

36,28

34,15

32,65

33,01

32,68

32,38

32,57

Zitronenaroma 26,14

26,23

26,57

25,26

33,25

32,84

36,94

30,89

29,05

29,57

28,59

29,35

31,52

31,98

32,62

32,75

Vitaminmischung 32,55

37,04

37,86

39,05

34,00

41,21 -/-

29,40

27,87

28,93

29,35

31,90

31,53

31,91

31,98

Apfelgrundstoff -/- -/- -/- -/- 28,92

29,34

30,02

29,81

32,24

32,69

33,12

32,30

Malz-Rhabarber-Mischung

-/- -/- -/- 38,34

-

32,70

33,79

31,46

31,84

32,99

32,30

33,27

32,46

Malz-Zitronen-Limetten-Mischung

-/- -/- -/- 41,03

-

31,39

31,72

29,99

30,38

31,97

32,28

33,21

32,81

Invertzucker 27,26

27,95

26,25

27,29

32,82

32,01

36,63

35,38

28,79

29,09

28,69

29,33

31,85

31,82

32,01

32,93

Undotierte, aber vorinkubierte Brauereigrundstoffe (1:10 in SSL-Medium) wurden in Duplikaten nach 24 und 48h

mit 1x104 KBE Saccharomyces cerevisiae je StarPrepTwo-Reaktionsgefäß versetzt und aufgearbeitet. In

Zitronenaroma und Invertzucker wurden die Hefen in unverdünnten Proben zu beiden Untersuchungszeitpunkten mit gleichen Cp-Werten eindeutig detektiert. Die Inhaltsstoffe der Vitaminmischung inhibierten die PCR-Reaktion, so dass hier sowohl im FAM- als auch HEX-Kanal verspätete Signale gemessen wurden. In verdünnten Lysaten wurde in allen Fällen der Hefebefall erkannt, obwohl dunkle Matrices eine Verzögerung des Cp-Wertes hervorriefen (Cola, Malzmischungen). Das IPC-Signal ist bei verdünnten Lysaten stets amplifiziert worden.

3 ERGEBNISSE

59

3.9.2.2 Anreicherungs- und Detektionsdauer verschiedener Keime

Für jeden Mikroorganismus existieren Optima in Hinblick auf ex- und intrinsischen Faktoren

der Anreicherung. Bei der Prüfung eines Lebensmittels können jedoch nicht alle Parameter

berücksichtigt werden, so dass eine Methode gewählt werden muss, die für eine große

Bandbreite an Erreger geeignet ist. Bei der Kontrolle von alkoholfreien Getränken und ihren

Einsatzstoffen spielen vor allem Hefen eine bedeutende Rolle. Daher wurden die gewählten

Anreicherungsbedingungen mit 4 Hefen als Modellorganismen durchgeführt. Die Matrices

(Bananennektar, Schwarze-Johannisbeere-Fruchtkonzentrat, Multivitamin-Fruchtkonzentrat)

wurden pro Keim mit 2 verschiedenen Dotierungsleveln beimpft. Zudem wurden stets eine

undotierte Kontrolle sowie mikrobiologische Kontrollen auf YM-Agar mitgeführt. Nach 24 und

48 Stunden wurden aus den bei 27-30°C inkubierten und in SSL-Medium (1:10-Verhältnis)

angereicherten Säften bzw. Fruchtkonzentraten Proben entnommen. Die

mechanisch/thermische Aufarbeitung inklusive Lebend/Tot-Differenzierung erfolgte nach den

Vorgaben in Kapitel 2.22.2. Lysate der Matrices Schwarze Johannisbeere und Multivitamin

wurden vor der PCR-Analytik 1:10 verdünnt. Das Probevolumen betrug 10 µl.

Die ausführliche Auflistung der Resultate für PCR und Mikrobiologie (inkl. Cp-Werte und

KBE) ist im Anhang IX (Tabelle 49) hinterlegt. Von allen Matrices war die artifizielle

Kontamination bei den vier Spezies im Bananennektar als Erstes nachweisbar (Tabelle 27).

Trotz der geringen Dotierungen mit 1x100 bzw. 4x10

0 KBE S. cerevisiae war der Erreger in

beiden Fällen eindeutig nach 24h detektierbar. Gleiches gilt für die Dotierung in

Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat, während nur eine (mit 4x100 KBE dotiert) von zwei

Anreicherungen im Multivitaminkonzentrat innerhalb dieses Zeitraums positiv getestet

werden konnte. Nach 48 Stunden Anreicherungsdauer wurde in den dotierten Proben der

Keim detektiert, wobei in der eben benannten Multivitaminprobe (mit 1x100 KBE dotiert) nur

ein „uncertain“ Signal erkannt wurde. Da die mikrobiologische Kontrolle keine Kolonien auf

dem YM-Nährboden anzeigt, ist eindeutig, dass in diese Probe keine Hefe eingebracht

wurde. Die KBE der weiteren dotierten Proben waren bereits nach 24h aufgrund der hohen

Zellzahlen nicht mehr auswertbar.

Die Dotierungslevel der Erreger Candida parapsilosis und Yarrowia lipolytica lagen im

Bereich von 101 bis 10

2 KBE. Yarrowia wurde mit beiden Dotierungsleveln bereits nach 24h

Anreicherung sowohl in der PCR (Cp 37,43/35,87) und auf dem Agar (59/252 KBE) im

Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat nachgewiesen, während die Candida-Hefe trotz hoher

KBE-Zahl (250 KBE/tntc) erst nach 48 h eindeutig identifiziert werden konnte

(Cp 31,51/29,81). Dagegen konnte Candida wiederum in beiden Multivitaminanreicherungen

nach der ersten Probennahme erkannt werden. Die mikrobiologische Analyse ergab

504 KBE bei geringster Dotierungsstufe; in der PCR betrugen die Cp-Werte 36,93 und 36,38.

3 ERGEBNISSE

60

Zygosaccharomyces bailii war in diesem Anreicherungsversuch die am langsamsten

wachsende Hefe: in keiner der Matrices konnte mittels PCR ein Nachweis nach 24h erzielt

werden. Die mikrobiologische Kontrolle konnte bei allen Matrices nach 24h jeweils nur bei

der höher dotierten Probe den Hefebefall aufzeigen. Erst nach 2 Tagen konnte die PCR in

lediglich zwei von sechs dotierten Proben der Keim bestätigen, während auf dem Agar

infolge der hohen Koloniezahlen keine quantitative Analyse mehr möglich war. Allerdings

waren auch die Bebrütung und Auswertung der Nährplatten sehr zeitintensiv (bis zu 1

Woche).

Tabelle 27: Gegenüberstellung der Resultate zur Detektionszeit verschiedener Hefespezies nach Anreicherung in Fruchtkonzentraten/Nektar

Spezies Dotierungs-

level (KBE/100ml)

Nach 24h Anreicherung Nach 48h Anreicherung

Bananen-

nektar

Johannis-

beere (1:10)

Multivitamin (1:10)

Bananen-

nektar

Johannis-

beere (1:10)

Multivitamin (1:10)

PCR YM PCR YM PCR YM PCR YM PCR YM PCR YM

Z. bailii

4x100 - - - - - - - + - + - +

4,8x101 - + - + - + + + - + + +

undotiert - - - - - - - - - - - -

Y. lipolytica

1,6x101 + + + + - - + + + + + +

1,53x102 + + + + + + + + + + + +

Undotiert - - - - - - - - - - - -

C. parapsilosis

6,8x101 + + - + + + + + + + + +

7x102 + + - + + + + + + + + +

Undotiert - - - - - - - - - - - -

S. cerevisiae

1x100 + + + + - - + + + + - -

4x100 + + + + + + + + + + + +

Undotiert - - - - - - - - - - - -

Vier Hefespezies wurden in 3 Matrices (Bananennektar, Johannisbeer- und Multivitaminfruchtsaftkonzentrat; jeweils 1:10 in SSL) über einen Zeitraum von 48h bei 30°C inkubiert und nach 24h und 48h Proben entnommen, welche mit StarPrepTwo aufgearbeitet wurden. Zudem wurden undotierte Matrixkontrollen mitgeführt. Die

Dotierungslevel lagen im Bereich von 1x100 bis 7x10

2 KBE/100ml. Trotz des geringen Dotierungslevels war

Saccharomyces cerevisiae in 5 von 6 Proben bereits nach 24h in der PCR nachweisbar. Sehr spät war die Hefe Zygosaccharomyces bailii detektierbar: sie wurde selbst nach 48h Inkubationszeit in nur zwei von 6 Proben erkannt. Es zeigen sich bei Z. bailii Unterschiede zwischen den Resultaten aus PCR-Analytik und Mikrobiologie

(rot hinterlegt).

3.9.2.3 Sensitivität bei hoher Begleitflora

Lebensmittel bieten ein geeignetes Milieu für unterschiedliche Mikroorganismen, so dass der

Assay auch in Anwesenheit von Fremdkeimen reproduzierbare Resultate liefern muss. Zu

diesem Zweck wurde das Standardprotokoll zum qualitativen Nachweis in drei

Getränkematrices in Anwesenheit von 8x107 KBE E.coli (BCD 4692) angewandt. In jeweils 2

Proben jeder Matrix war zudem die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (1x103 KBE)

3 ERGEBNISSE

61

enthalten. Proben, die aus Johannisbeer- und Multivitaminfruchtsaftkonzentrat gewonnen

wurden, wurden erneut vor der PCR 1:10 verdünnt. Das Probevolumen betrug 25 µl.

Bei der Betrachtung der Amplifikationssignale war erkennbar, dass alle mit Hefe dotierten

Proben ein Signal im FAM-Kanal ausgaben. Das nur mit E.coli dotierte

Multivitaminkonzentrat zeigte einen unerwarteten Cp-Wert im FAM-Kanal, wobei dieses

Resultat nach Beurteilung der Amplifikationskurve vernachlässigt werden konnte, da die

Kurve (siehe Abbildung 20, orange Kurve) keinen Anstieg zeigt und deutlich unterhalb der

Negativkontrolle verläuft. Proben ohne Hefe-DNA zeigten zudem im HEX-Kanal eine

korrekte Amplifikation der IPC an. Die Hefe konnte demnach in Anwesenheit hoher

Begleitflora nachgewiesen werden (vgl. Abbildung 20 und Tabelle 28), wobei der Cp-Wert –

unter Berücksichtigung der bisherigen Resultate zur LOD/LOQ-Bestimmung (vgl. Kapitel 3.7)

sowie der Wiederfindungsrate (vgl. Kapitel 3.9.2.1) - infolge störender Matrix und der

Begleitflora verzögert ist. Innerhalb der untersuchten Matrices dieses Versuches sind die

Resultate zwar homogen – so sind die Cp-Werte unter Einbeziehung der

Verdünnungsfaktoren (1:10 in PCR für Konzentrate) identisch (Nektar: 32,15/32,78;

Fruchtsaftkonzentrate: 35,87/35,49/35,70/35,25) – im Vergleich zu den

Sensitivitätsbestimmungen aber um eine Log-Stufe verspätet. Eine quantitative Aussage

wird damit erschwert; eine qualitative Aussage ist möglich.

Abbildung 20: Detektion von 1x103 KBE S. cerevisiae mit Begleitflora (E. coli)

Zur vereinfachten Darstellung ist jeweils nur eine mit S. cerevisiae und E. coli dotierte Probe je Matrix abgebildet: Blau: Bananennektar mit E. coli und S. cerevisiae; Schwarz: Bananennektar mit E. coli; Dunkelgrün: Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat mit E. coli und S. cerevisiae (1:10); Grün: Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat mit E. coli (1:10); Rot: Multivitaminfruchtsaftkonzentrat mit E. coli und S. cerevisiae (1:10); Orange: Multivitaminfruchtsaftkonzentrat mit E. coli (1:10); Gelb: PCR-NTC. In allen Matrices wurde die Hefe trotz der hohen E.coli-Konzentration nachgewiesen, während Proben ohne Hefe-DNA entsprechend negativ waren. Die

KBE-Zahlen wurden auf CASO- bzw. YM-Platten bestimmt.

Zyklen 5 15 25 35 45

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

26,265

-3,735

3 ERGEBNISSE

62

Tabelle 28: Detektion von S. cerevisiae in Anwesenheit von Begleitflora (E.coli)

Matrix Dotierungslevel

(KBE/ml) Cp-Werte mit E. coli

FAM HEX

Bananennektar 1x10

4

32,15

32,78

31,72

31,76

undotiert - 32,10

Johannisbeer-fruchtsaftkonzentrat

1x104

35,87

35,49

31,82

31,94

undotiert - 31,87

Multivitamin-

fruchtsaftkonzentrat

1x104

35,70

35,25

32,07

32,10

undotiert 36,62 31,96

Drei Matrices (Bananennektar, Schwarze-Johannisbeere- und Multivitaminfruchtsaftkonzentrat) wurden 1:10 in

SSL-Medium verdünnt und mit 8x107 KBE E. coli versetzt. Zwei von drei Ansätzen wurden zusätzlich mit 1x10

4

KBE/ml S. cerevisiae dotiert (1x103 KBE im Aufarbeitungsgefäß). Die Proben wurden dem Standardprotokoll (inkl.

Lebend/Tot-Differenzierung) folgend aufgearbeitet. Alle mit Hefen versetzten Proben werden im FAM-Kanal eindeutig identifiziert, wobei die Cp-Werte im Vergleich zu Vorversuchen um etwa eine Log-Stufe verspätet auftraten. Undotierte Proben des Bananennektars und des Johannisbeerkonzentrats waren negativ. Die undotierte Probe des Multivitaminkonzentrats lieferte ein Signal.

3.10 Optimierung der Lebend/Tot-Differenzierung

Zur Visualisierung der Effekte, die bei der Behandlung mit einer interkalierenden Agenz zur

Differenzierung von lebenden und toten Zellen, auftraten, wurden zunächst Hefezellen –

später auch Schimmelpilzsporen – in SSL-Medium bei 80°C über einen Zeitraum von

mindestens 20 min inaktiviert. In regelmäßigen Abständen wurden dabei Proben entnommen

und der mechanisch/thermischen Aufarbeitung (inkl. Lebend/Tot-Differenzierung) zugeführt.

Als Ausgangswert wurden lebende Zellen zum Zeitpunkt t = 0 min verwendet.

Mikrobiologische Kontrollen auf YM-Platten wurden ebenfalls zu definierten Zeitpunkten

angelegt. Die Dunkelphase zur Anlagerung des Farbstoffs an die DNA war in den ersten

Versuchen auf 5 min festgelegt und damit identisch zur Belichtungsphase.

Im vorliegenden Experiment war zunächst festzustellen, ab welchem Zeitpunkt die Hefe

Saccharomyces cerevisiae bei einer thermischen Behandlung vollständig inaktiviert wird.

Dazu wurde der Keim über 40 min bei 80°C inkubiert und entsprechend mit Reagent-D-

Lösung versetzt. Je Aufarbeitung waren 1x103 KBE (in 100 µl) enthalten. Die Probenahme

(Duplikate) erfolgte nach 2, 5, 10, 15, 20 und 40 min, mikrobiologische Kontrollen wurden

zudem nach 5 und 15 min ausgestrichen.

In der PCR wurde wie erwartet für die lebenden Zellen (t = 0 min) ein Signal im FAM-Kanal

generiert, womit die Aktivität der Zellen bestätigt werden konnte (Abbildung 21). Nach einer

2minütigen Inkubationszeit bei 80°C konnten ebenfalls Hefezellen in der PCR nachgewiesen

werden, wobei der Cp-Wert (33,14/33,36) identisch zum Vorwert (33,21/32,78) war. Bereits

nach 5 Minuten wurde allerdings kein Signal mehr erhalten. Da im HEX-Kanal alle weiteren

Proben mit einer erfolgreichen Amplifikation der IPC die Funktionalität des Assays

3 ERGEBNISSE

63

bestätigten, konnte davon ausgegangen werden, dass alle Hefezellen bereits nach dieser

Zeit vollständig inaktiviert wurden. Diese Annahme ließ sich auch mit den mikrobiologischen

Kontrollen (t = 5 min / t = 15 min) untermauern, da auf den Nährböden kein

Koloniewachstum zu verzeichnen war. Es kann somit festgehalten werden, dass die DNA

inaktivierter Hefezellen mit der Reagent-D-Lösung bis unterhalb der Nachweisgrenze

gebunden und eine Amplifikation unterdrückt wurde.

Abbildung 21: Amplifikationskurven von S. cerevisiae nach Inaktivierung bei 80°C Es wurden vegetative Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae in SSL-Medium bei 80°C inaktiviert. Der Ausgangswert mit t = 0 min (orange) wurde bestimmt und nach 2 (blau), 5 (grün), 10 (hellblau), 15 (rot), 20 (gelb) und 40 min (lila) Probematerial entnommen und nach Zugabe der Reagent-D-Lösung für 5 min im Dunkeln

gelagert. Bereits nach 5 min Inaktivierungszeit konnte keine Hefe-DNA mehr nachgewiesen werden

(LightCycler®480). Die DNA inaktivierter Zellen wurde gebunden.

Protokollen von Nocker und Agustí folgend wurde eine Verlängerung der Dunkelphase auf

10 min und die damit verbundenen Auswirkungen auf das Lebend-Zellsignal von vier

verschiedenen Spezies – 3 Hefen und 1 Schimmelpilz – untersucht (Nocker und Camper

2006; Agustí et al. 2013). Je Zellzustand (nach Kapitel 2.22.4) und Inkubationszeit wurde

jeweils eine Probe pro Spezies mitgeführt und dem Protokoll unter Kapitel 2.21.3

entsprechend aufgearbeitet. Zudem wurde eine nicht dotierte WSH-Kontrolle eingesetzt.

Angaben zu Zell- bzw. Sporenzahlen wurden jeweils mittels mikrobiologischer Kontrollen auf

YM-Platten erzielt. Das Probevolumen für die PCR-Analytik betrug 10 µl.

Saccharomyces cerevisiae wurde mit einer Zellzahl von 1,6x103 KBE je Probe eingebracht.

Die molekularbiologische Analyse hat gezeigt, dass die Amplifikationskurven der

Lebendzellen nach 5- und 10minütiger Dunkelphase ohne nennenswerte Unterschiede

verliefen. Dies bestätigten die Cp-Werte bei 29,06 für 5 min und 28,83 für 10 min

Inkubationszeit. Inaktivierte Hefezellen generierten ebenso wie die WSH-Kontrolle ein Signal

(siehe Abbildung 22), das allerdings mit der LightCycler®-Analysemethode des 2nd

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

25,050

6,265

0,050

Zyklen 5 15 25 35 45

3 ERGEBNISSE

64

Derivative Max nicht zur Berechnung eines Cp-Wertes genügte (geringe Fluoreszenz, kein

Überschreiten des Hintergrundsignals). Die DNA abgestorbener Zellen konnte vollständig

geblockt werden.

Abbildung 22: S. cerevisiae und D. anomala (lebend und inaktiviert) mit differenten Dunkelphasen Dargestellt sind die Amplifikationskurven von lebenden bzw. inaktivierten Saccharomyces-cerevisiae- (A) bzw. Dekkera anomala-Zellen (B) in SSL-Medium, die für 5 bzw. 10 min im Dunkeln mit Reagent D inkubiert wurden. Proben: Hellbraun: 5 min, lebend; Braun: 10 min, lebend; Blau: 5 min, inaktiviert; Rot: 10 min, inaktiviert; Grün: WSH-Kontrolle; Gelb: PCR-NTC. Es ist in beiden Fällen keine Verschiebung des FAM-Signals der lebenden

Zellen bei längerer Dunkelphase zu beobachten gewesen. Proben mit inaktivierten Zellen lieferten keinen Cp-

Wert (LightCycler®480).

Dekkera-anomala-Zellen wurden mit einem Dotierungslevel von 2x103 KBE je Probe

untersucht. In der PCR-Analytik konnte gezeigt werden, dass sich die Ergebnisse für beide

Inkubationsbedingungen kaum unterschieden (siehe Abbildung 22). Der um einen Zyklus

frühere Cp-Wert der längeren Dunkelphase hängt mit dem insgesamt höheren

Fluoreszenzverlauf dieser Probe zusammen. Inaktivierte Hefezellen und die WSH-Kontrolle

zeigten hier ebenfalls eine beginnende Amplifikation an, bei der die gemessene Fluoreszenz

zwar die Hintergrundfluoreszenz überschreitet, aber der Anstieg so gering ist, dass die Probe

von der Software als negativ eingestuft wurde.

Die Resultate der Hefe Zygosaccharomyces bailii (Dotierungslevel 1x102 KBE je Probe) und

des Schimmelpilzes Aspergillus brasiliensis (Dotierungslevel 1x103 KBE je Probe)

bestätigten die bisherigen Ergebnisse: bei beiden Spezies war keine Verschlechterung der

Amplifikationskurve lebender Zellen bzw. Sporen bei längerer Inkubationszeit der Reagent-

D-Lösung erkennbar (vgl. Abbildung 23). Allerdings wurde in beiden Fällen nach einer

fünfminütigen Inkubation das Signal, das von inaktivierten Zellen bzw. Sporen ausging, nicht

vollständig unterdrückt. Dies wird erst nach 10 min Dunkelphase erreicht. Es kann somit

festgehalten werden, dass eine zehnminütige Inkubationszeit keine messbaren toxischen

Effekte auf lebende Zellen ausübte.

A B

Flu

ore

szen

z (

465

-510n

m)

-0,677

Zyklen 5 15 35 45

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

21,323

0,155

18,155

Zyklen 5 15 35 45

3 ERGEBNISSE

65

Insbesondere Schimmelpilzsporen sind äußerst widerstandsfähige, hitzeresistente Hüllen,

die Heißsterilisationsprozesse überstehen können (Wareing und Davenport 2000). Im

Vorversuch, in dem die Inkubationszeit der Dunkelphase ausgetestet wurde, trat bei den

inaktivierten Aspergillus-Sporen ein nicht eindeutiges Resultat auf, welches mit einer

erweiterten Dunkelphase beseitigt werden könnte. Daher sollten die Sporen bei einer auf

20 min ausgedehnten Dunkelphase untersucht und die Inaktivierung bzw. Abtötung der

Sporen mikro- und molekularbiologisch dokumentiert werden. Hierfür wurde eine Aspergillus-

brasiliensis-Sporensuspension (DSM 1988) mit einer Konzentration von

1,4x104 Sporen/100 µl in YGC-Medium bei 80°C im Thermomixer inkubiert und nach 5, 10,

15, 20, 30, 40 und 60 min Proben entnommen. Als Referenzwert wurden nicht-

hitzebehandelte Sporen (t = 0 min) verwendet. Die Dunkelphase wurde für je eine Probe auf

20 min ausgedehnt und gegen eine 10minütige Inkubationsdauer getestet. Mikrobiologische

Kontrollen auf YGC-Platten wurden für jeden Zeitpunkt der Probenahme angelegt. Das

Probevolumen der PCR betrug 25 µl.

Bei der Betrachtung der Amplifikationskurven fiel zunächst eine stetige Verschiebung des Cp-

Wertes bei länger andauernder Inaktivierungszeit auf (siehe Abbildung 24). Ab einer

30minütigen, thermischen Behandlung traten die Signale der nachfolgenden Proben um den

Zyklus 32/33 auf. Eine vollständige Inhibierung des Signals inaktivierter Zellen war nicht zu

verzeichnen. Mitgeführte, undotierte Matrices (YGC-Medium und PCR-NTC) konnten eine

Kontamination ausschließen. Die Auswertung der mikrobiologischen Kontrollen ergab, dass

bereits nach 5 Minuten bei 80 °C kein Koloniewachstum mehr erkennbar war. Die Sporen

Abbildung 23: Z. bailii und A. brasiliensis (lebend und inaktiviert) mit differenten Dunkelphasen Dargestellt sind die Amplifikationskurven von lebenden bzw. inaktivierten Zygosaccharomyces-bailii-Zellen (A,

1x102 KBE) bzw. Aspergillus-brasiliensis-Sporen (B, 1x10

3 KBE) in SSL-Medium, die für 5 bzw. 10 min im

Dunkeln mit Reagent D inkubiert wurden. Proben: Hellbraun: 5 min, lebend; Braun: 10 min, lebend; Blau: 5 min, inaktiviert; Rot: 10 min, inaktiviert; Grün: WSH-Kontrolle; Gelb: PCR-NTC. Es ist bei beiden Pilzen keine

Verschiebung des FAM-Signals lebender Zellen bei längerer Dunkelphase zu beobachten gewesen. Inaktivierte Zellen, die nur 5 min inkubiert wurden, erzeugen eindeutige FAM-Cp-Werte (Z. bailii: 34,76, A. brasiliensis: 35,32). Nach einer zehnminütigen Dunkelphase werden keine Cp-Werte gemessen. Einzige Ausnahme ist die A. brasiliensis-Probe (rot, Cp 35,03), die von der LC-480-Software als Uncertain eingestuft wurde. Die Kurve

übersteigt zwar die Hintergrundfluoreszenz, verläuft aber parallel zur WSH-Kontrolle bei nur gering höheren Fluoreszenzwerten. Diese Probe kann daher als negativ angesehen werden.

3 ERGEBNISSE

66

sind zu diesem frühen Zeitpunkt durch die Hitzeeinwirkung geschwächt, so dass sie auf

optimalem Nährboden keine Regeneration erfahren.

Abbildung 24: Resultate der PCR-Analytik von A. brasiliensis-Sporen bei differenten Dunkelphasen Es wurden Sporen des Pilzes Aspergillus brasiliensis (1,4x10

4 Sporen/100µl) in YGC-Medium (grün) über einen

Zeitraum von 60 min bei 80°C inaktiviert. Zu Beginn (t = 0min, blau) wurde der Ausgangswert (Lebendwert) bestimmt und nach 5 (dunkelgrün), 10 (lila), 15 (cyan), 20 (hellblau), 30 (orange), 40 (türkis) und 60 min (rot)

jeweils Probematerial entnommen und zusammen mit der Reagent-D-Lösung für 10 bzw. 20 min im Dunkeln inkubiert. Es schloss sich die mechanisch-thermische Lyse an. Die Proben wurden mit dem Standardtemperaturprofil in der PCR (Stratagene Mx3005p) untersucht. Keine der inaktivierten Sporen konnte von der interkalierenden Agenz vollständig gebunden werden. Eine längere Dunkelphase hat somit keinerlei positiven Einfluss auf die Lebend/Tot-Differenzierung von Sporen.

Abbildung 25: Verschiebung der Detektionszeitpunkte (ΔCp) bei zunehmender

Inaktivierungszeit Dargestellt ist die mittlere Verzögerung des Positivsignals einer thermobehandelten Probe bei zunehmender Inkubationszeit in Bezug auf den Ausgangswert zum Zeitpunkt t = 0 min sowie der dazugehörigen Standardabweichung. Nach 30 min Hitzeeinwirkung war keine weitere Verschiebung des Cp-Wertes zu verzeichnen. Die verlängerte Dunkelphase lieferte exakt gleiche Resultate wie die 10minütige Dunkelphase.

-10

-9

-8

-7

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

5 10 15 20 30 40 60

ΔC

p

t in min

Δ Cp (t = 0 min)

Zyklen 6 12 18 32 38 44

44

Flu

ore

szen

z (

dR

)

3500

4000

0

3 ERGEBNISSE

67

In Abbildung 25 ist die Verzögerung der Detektionszeitpunkte als ΔCp in Bezug auf den

Referenzwert (Lebendwert, t = 0 min) bestimmt. Bereits zum ersten Entnahmezeitpunkt

verschiebt sich der Cp-Wert um 1,5 Zyklen im Vergleich zum Vorwert. Nach 10 minütiger

Inaktivierungszeit verschob sich das Signal um mehr als vier Zyklen. Eine thermische

Behandlung für 15 min verzögert die Detektion um 8 Zyklen. Die nachfolgenden

Probenahmen zeigten in der PCR eine Verschiebung des Detektionszeitpunktes um 9 Zyklen

im Vergleich zum Lebendwert. Korreliert man diesen Versuch mit einer Standardkurve

(Software MxPro: Multiple Experiment Analysis) und deren Anstieg, kann unter

Berücksichtigung der PCR-Effizienz berechnet werden, wie viel Prozent der Ausgangsmenge

nach Erreichen eines bestimmten Cp-Wertes in der Reaktion verblieben sind. Die PCR-

Effizienz ergibt sich aus der Gleichung:

𝐸 = 10−1

𝑚 − 1 = 10−1

3,269 − 1 = 102,25% Gleichung 3

Bei einer Effizienz von 100% (=2) wird eine Verdopplung des Produkts erreicht (Mülhardt

2009). Hier liegt die PCR-Effizienz knapp oberhalb von 100%, so dass pro Zyklus das

Produkt um das 2,04fache vermehrt wird. Es soll der verbliebene DNA-Gehalt zum Zeitpunkt

t = 60 min (Cp2) in Bezug auf den Ausgangswert t = 0 min (Cp1) ermittelt werden. Daher

werden die dazugehörigen Cp-Werte in die nachstehende Gleichung eingebracht:

𝑛 % =100%

2,04 𝐶𝑝 2−𝐶𝑝 1 =100%

2,04(33,25−24,36) =100%

2,048,89 = 0,177% Gleichung 4

Demnach verbleiben in der Reaktion 0,177% der ursprünglichen DNA-Menge. Die Dotierung

erfolgte mit 1,4x104 KBE in 640µl Präparationsvolumen und 25µl PCR-Volumen. In der PCR-

Reaktion (t = 0 min) lagen somit etwa 546 GÄ vor. Nach der Hitzebehandlung werden die

verbliebenen 0,177% (≈ 0,97 GÄ) eindeutig nachgewiesen. Eine vollständige Inaktivierung

der Sporen ist nicht erzielt worden. Eine weitere Verlängerung der Dunkelphase auf 20 min

konnte keine weiteren positiven Effekte erzielen. Daher wurde die 10minütige Inkubationszeit

belassen.

Die Lebend/Tot-Differenzierung sollte in Anwesenheit eines Überschusses an inaktivierten

Zellen geprüft werden. Dafür wurden Hefezellen von Saccharomyces cerevisiae

(1x105 KBE/ml) nach bekanntem Protokoll (siehe Kapitel 2.22.4) behandelt. Als Referenz

wurden nicht-inaktivierte Zellen (100% lebend) mitgeführt. Eine Mischung aus lebenden

(10%) und inaktivierten Zellen (90%) wurden ebenso wie die Referenzprobe und einer

Probe, die nur aus inaktivierten Zellen bestand (0% lebend), nach Zugabe der Reagent-D-

3 ERGEBNISSE

68

Lösung und 10minütiger Dunkelphase belichtet und anschließend lysiert. In die PCR-

Reaktion wurden jeweils 10 µl der Lysate eingesetzt (siehe Abbildung 26).

Abbildung 26: Saccharomyces cerevisiae in verschiedenen Zellzuständen Abgebildet sind die Amplifikationskurven von Saccharomyces cerevisiae nach der Lebend/Tot-Differenzierung mit 10minütiger Dunkelphase und mechanisch/thermischer Lyse. Proben: Rot: 100% lebende Zellen, Blau: 10% Lebende mit 90% inaktivierten Zellen, Grün: 100% inaktivierte Zellen. Es ist gezeigt, dass ein Überschuss an

inaktivierten Zellen eine genaue Amplifikation des Lebend-Anteils ermöglicht.

Die Amplifikation der DNA, die nur aus lebenden Zellen stammte, zeigte den gewohnten,

sigmoiden Verlauf und überschritt die Hintergrundfluoreszenz bei Zyklus 29,88. In der Probe

mit inaktivierten Zellen (0% lebend) wurde keine Amplifikation vorgenommen. Da die IPC-

Kontrolle detektiert wurde, konnte die vollständige Blockierung fungoider DNA bestätigt und

eine Inhibition der Reaktion ausgeschlossen werden. Lag DNA aus inaktivierten Zellen im

Überschuss vor, konnte die DNA aus lebenden Zellen ohne Sensitivitätsverlust

nachgewiesen werden, wobei der auftretende Cp-Shift von 3,72 Zyklen der Verringerung des

DNA-Gehaltes um eine Zehnerpotenz widerspiegelte.

Abschließend sollte die Effektivität der Lebend/Tot-Differenzierung in einer Getränkematrix

untersucht werden. Dazu wurde handelsüblicher Bananensaft 1:10 in YM-Medium verdünnt

und mit lebenden bzw. inaktivierten Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae (2x104 KBE)

versetzt. Als Referenzwert wurde zudem Saft ohne Zellzusatz mitgeführt. Für jede Probe

wurde der Vergleich der direkten Lyse und der Lyse mit vorgeschalteter Lebend/Tot-

Differenzierung (5 min Dunkelphase) erstellt. Lysate wurden mit einem Volumen von 10 µl in

die PCR eingesetzt.

Zyklen 5 15 35 45

Flu

ore

szen

z (

465-5

10n

m)

0,383

25,383

3 ERGEBNISSE

69

In Abbildung 27 sind die zugehörigen Amplifikationskurven beider Extraktionen dargestellt:

der Detektionszeitpunkt der Extrakte mit lebenden Zellen war in beiden Ansätzen identisch.

Eine Amplifikation der DNA aus inaktivierten Zellen ist nur in der Probe ohne Reagent-D-

Zugabe erkennbar. Sofern die Agenz zugesetzt wird, kann die DNA abgetöteter Hefe-Zellen

blockiert werden und steht der Polymerase nicht zur Verfügung. Eine Lebend/Tot-

Differenzierung ist in Getränkematrix anwendbar.

Abbildung 27: Funktionalität der Lebend/Tot-Differenzierung in Getränkematrix Bananennektar (1:10 in YM-Medium) wurde mit lebenden bzw. inaktivierten Saccharomyces-cerevisiae-Zellen (1x10

4 KBE) versetzt sowie als undotierte Matrix mitgeführt und mechanisch/thermisch aufgearbeitet (A). Im

rechten Bild wurde eine Behandlung mit Reagent D vorgeschaltet (B). Proben: Blau: mit lebenden Zellen; Rot: mit inaktivierten Zellen; Grün: undotiert; Gelb: PCR-NTC. Während die DNA inaktivierter Zellen im linken Bild noch

deutlich amplifiziert wurde, konnte das Signal nach Zusatz des Reagent D unterdrückt werden.

4 DISKUSSION

70

4 Diskussion

Das Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war die Entwicklung eines Real-time-PCR-

Nachweissystems auf Grundlage des TaqMan-Prinzips mit Hydrolysesonden für Pilze in

alkoholfreien Getränken sowie der dazugehörigen Probenaufarbeitung, die die

Unterscheidung lebender und toter Organismen ermöglichen sollte. Der

molekularbiologische Assay enthält sowohl eine interne Amplifikations- als auch eine

Positivkontrolle, mit denen jeder Versuch auf seine Funktionalität hin getestet werden kann.

Mit der Überprüfung einer Vielzahl an Sequenzdaten für den Genabschnitt der 28S rDNA

konnte die Vorauswahl an geeigneten Primer- und Sondenkandidaten bestätigt und für den

Nachweis zusätzlicher Spezies erweitert werden. Die Sensitivität und Spezifität des Assays

konnte mit RNA-freier, quantifizierter DNA getestet und auf weniger als einen

Genomäquivalenten festgelegt werden. Insgesamt konnten 243 verschiedene Pilzspezies

unterschiedlicher taxonomischer Gruppen mit dem vorliegenden Verfahren eindeutig

nachgewiesen werden. Die Abgrenzung zu Nicht-Zielorganismen konnte durch den Einsatz

modifizierter Primer erreicht und mit der Untersuchung von 60 Spezies bestätigt werden.

Bei der mechanisch/thermischen DNA-Extraktion sind zwei Methoden optimiert worden:

filtrierbare Flüssigkeiten können mit einem Gesamtvolumen von 100 ml über einen Filter mit

0,2 µm Porengröße abgesaugt werden, welcher anschließend im Ganzen weiter bearbeitet

wird; nicht-filtrierbare Flüssigkeiten werden je nach Anforderung direkt aufgearbeitet und

quantifiziert oder zunächst einer Flüssiganreicherung zugeführt. Die Sensitivität der

Probenaufarbeitung bewegt sich für filtrierbare Proben im Bereich von 1x101 KBE/100 ml und

für nicht-filtrierbare im Bereich von 5x101 KBE/100 µl. Gering kontaminierte Matrices können

zumeist bereits nach 24 h positiv in der PCR getestet werden. Bei sehr gestressten oder

langsam wachsenden Keimen muss die Anreicherung auf 48 h ausgedehnt werden. Die

Methode wurde mit handelsüblichen Säften und Fruchtsaftkonzentraten sowie alkoholfreien

Brauereiproben angepasst.

4.1 Beurteilung der 28S rDNA als Zielregion

Hefen und Schimmelpilze üben nicht nur gewünschte Effekte auf eine Lebensmittelmatrix

aus: Produkte sind bei jedem Prozessschritt anfällig für Kontaminationen mit Fungi, die zu

Veränderungen der Produktmorphologie und des Geschmacks oder dem Verderb führen

können (Fleet 1992; Boekhout et al. 1994; Back 2000; Rawsthorne und Phister 2006;

Baumgart et al. 2012; Lucera et al. 2012). Des Weiteren besteht bei einem Befall mit

Schimmelpilzen wie Aspergillus spp. oder Fusarium spp. die Gefahr der Synthese von

Mykotoxinen, die insbesondere für immungeschwächte Menschen und Tiere problematisch

sein können (Baumgart et al. 2012).

4 DISKUSSION

71

Produktschädigungen können bei jeder Getränkegattung auftreten, wobei Einsatzstoffe,

zugeführte Wässer oder die Raumluft nur einige Beispiele für denkbare

Kontaminationsquellen sind (Back 2000, 2008). Insbesondere in industriellen Prozessen, bei

denen wirtschaftliche Faktoren bedeutend sind, ist die frühzeitige Registrierung einer

Kontamination und das damit verbundene rechtzeitige Eingreifen in den Prozess von großer

Wichtigkeit (Arias et al. 2002; Bleve et al. 2003; Martorell et al. 2005). Das derzeit

angewandte SSL-Verfahren erfüllt diese Anforderung nicht, da die Beurteilung der

Orangenfruchtsaftagarplatten mindestens 2 bis 7 Tage in Anspruch nimmt.

Das zu entwickelnde Real-time-PCR-Kit sollte zwingend den Nachweis einer Vielzahl an

Pilzen ermöglichen, da es idealerweise nicht nur für die Matrix der alkoholfreien Getränke

eingesetzt werden sollte. Damit war die Auswahl einer Genregion, die ubiquitär verbreitet

und trotzdem über das Taxon konserviert ist, unumgänglich. Des Weiteren liegt in

prozessierten Lebensmitteln DNA vermehrt in degradierter Form vor, so dass die Analyse

eines kurzen DNA-Segments bevorzugt werden sollte (Codex Alimentarius CAC/GL 74-

2010) (Demeke und Jenkins 2010).

Als Zielregion für den pilzspezifischen Assay wurde der vordere Genabschnitt der 28S rDNA

gewählt, welcher zusammen mit den Bereichen der 5.8S und 18S rDNA sowie den beiden

ITS-Regionen in einem rDNA-Repeat organisiert ist. Nach Alignierung und Beurteilung der

Sequenzdaten von 139 Hefe- und 94 Schimmelpilzen im Sequenzanalyse-Programm konnte

mit der D1/D2-Domäne ein geeigneter Zielbereich identifiziert werden. Im gewählten

Abschnitt der D1-Region geht die 28S rDNA in einen hochkonservierten Bereich über, der

mit dem Erreichen der D2-Region endet (Wesselink et al. 2002). Innerhalb der

taxonomischen Varianz unterscheidet sich der gewählte Sequenzbereich in nur wenigen

Basen (16 von 53 Oligonukleotidpositionen), wobei die verschiedenen Kombinationen durch

die eingesetzten Primer weitestgehend abgedeckt waren. Zur bereits bestehenden

Vorauswahl wurde ein zusätzlicher Forwardprimer in den Assay eingebracht, der mit der

Detektion von Mucoromycotina-Gattungen wie Actinomucor spp., Cunninghamella spp.,

Mucor spp., Mycotypha spp., Pilaira spp. oder Zygorhynchus spp. das Feld der

nachzuweisenden Pilze um eine wichtige Gruppe erweitern konnte. Mucorales beispielweise

infizieren Pflanzenbestandteile, vor allem Früchte wie Erdbeeren und sind damit als

potentielle Kontaminanten von Einsatzstoffen für die Getränkeindustrie bedeutend (Hoffmann

et al. 2013). Rhizopus spp., Mucor spp. und Thamnidium spp. sind weiterhin als Erreger in

gekühlten, tiefgefrorenen und frischen Fleisch- und Wurstwaren bekannt, so dass die

Erfassung dieser Gattungen in Hinblick auf die Adaption auf andere Lebensmittelmatrices

unumgänglich ist (Baumgart et al. 2012).

4 DISKUSSION

72

4.2 Spezifität des Real-time-PCR-Assays

Die Zielregion des zu entwickelnden Real-time-PCR-Assays zeichnet sich im gewählten

Abschnitt durch einen hohen Konservierungsgrad aus, so dass die Sequenz selbst bei

Betrachtung einer enormen taxonomischen Breite beinahe unverändert bleibt (Prokopowich

et al. 2003; Kobayashi 2011). Aus diesem Grund war die Abgrenzung zu taxonomisch

verwandten Gruppierungen - insbesondere den Pflanzen – problematisch und für die

Beurteilung des Assays entscheidend. Dennoch sollten möglichst viele Pilzspezies erfasst

werden, um der Funktion eines Pilzgesamtnachweissystems gerecht zu werden.

Nach Beurteilung des Alignments von 139 Hefe- und 94 Schimmelpilzsequenzen wurden die

Primer- und Sondenkandidaten ausgewählt. Zunächst belief sich die Zusammensetzung des

Assays auf einen Forward- und 4 Reverseprimer sowie dem Blockprimer. Damit wurden

anfänglich gute Resultate erzielt. Da mit dem Forwardprimer FungiFw1 die Gruppe der

Mucoromycotina jedoch nicht ausreichend erfasst wurde, wurde ein zusätzliches

Oligonukleotid eingebracht. FungiFw1 und FungiFw2 unterscheiden sich lediglich in der

Basenabfolge an Position 4 und 5 des 5‗-Primerbereichs. Mit den Untersuchungen zur

LOD/LOQ-Bestimmung, in denen die Pilze Absidia corymbifera (DSM 1144) und Mucor

racemosus (CBS 225.37) mitgeführt wurden (vgl. Kapitel 3.7), sowie zur Inklusivität und der

damit verbundenen Prüfung von 17 weiteren Spezies konnte gezeigt werden (vgl. Kapitel

3.6.1), dass die Amplifikation von Mucoromycotina-Spezies ebenso gut verläuft wie bei den

verbleibenden Pilzen.

Von den Phyla Asco-, Basidio- und Blastocladiomycota sowie den Subphyla insertae sedis

Mucoro- und Kickxellomycotina konnten Sporen bzw. Kolonien zur Spezifitätstestung genutzt

werden (Auflistung der Spezies und Stämme im Anhang VI). Insgesamt wurden 243 Fungi-

Spezies bzw. 285 verschiedene Stämme mit dem entwickelten Real-time-PCR-Assay positiv

getestet. Die Liste umfasst dabei nicht nur lebensmittelrelevante Pilze: der arbuskuläre

Mykorrhiza-Pilz Rhizophagus irregularis (Phylum: Kickxellomycotina) wird ebenso detektiert

wie der Blastocladiomycet Allomyces arbuscula. Eine ausführliche, quantitative Analyse

wurde aufgrund der Vielzahl an Fungi nicht durchgeführt.

Es war nicht möglich, Probematerial jedes Pilzphylums zu erhalten, da einige Fungi bis dato

nicht einzeln kultivierbar sind (Blackwell 2010; James und Berbee 2011): Genomische und

morphologische Analysen des Phylums Cryptomycota – mit dem bisher einzig benannten

Genus Rozella – konnten beispielsweise nur über die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung und

Antikörpermarkierung von (marinen) Wasserproben bzw. der Kultivierung im

Wirtsorganismus Allomyces und anschließender Sequenzierung erhalten werden (Jones et

al. 2011a; James et al. 2013). Von denjenigen Phyla, von denen keine DNA-Probe verfügbar

war, existierten teilweise auch keine aussagekräftigen 28S-rDNA-Sequenzen in der NCBI-

4 DISKUSSION

73

Datenbank, so dass eine Überprüfung der Oligonukleotidkompatibilität nicht möglich war:

Vom Endoparasit Rozella liegen aufgrund seiner schwierigen Kultivierungsbedingungen

insgesamt nur 1080 Einträge in der Nukleotiddatenbank vor (insgesamt; Stand 01.02.2015);

das Phylum Microsporidia (64,052 insgesamt, davon 342 Einträge für rDNA; Stand

01.02.2015) sowie das Subphylum Zoopagomycotina (53 Einträge insgesamt; Stand

01.02.2015) lassen sich ebenfalls nicht abschließend beurteilen. In-silico-Analysen konnten

dagegen bei den Phyla Chytridio- und Blastocladiomycota sowie von den Subphyla

Mortierello-, Kickxello-, Neocallimastigo- und Entomophthoromycotina durchgeführt und der

zu den Oligonukleotiden komplementäre Abschnitt identifiziert werden. Allerdings hat sich

gezeigt, dass bei Neocallimastigomycotina und Blastocladiomycota der Forwardprimer

FungiFw1 nur mit jeweils einer Fehlpaarung im Bereich des 5‗-Endes hybridisieren kann. Wie

die Untersuchung von Allomyces arbuscula jedoch beweist, ist eine Detektion des

Blastocladiomycets möglich (siehe Anhang VI). Ob die quantitative Analyse gewährleistet ist,

konnte aufgrund des geringen Probematerials nicht geprüft werden.

Ein Nachweis aller Vertreter des Reiches ist aufgrund der Vielzahl an Pilzen nicht

überprüfbar: Experten gehen davon aus, dass momentan weniger als 10% der geschätzten

1,5 Millionen Spezies bekannt sind (Stajich et al. 2009; James und Berbee 2011). Andere

Quellen gehen von 5,1 Millionen Pilzspezies aus (Blackwell 2011). Ein Großteil der

neuidentifizierten Pilze kann einem Phylum zugeordnet werden, aber manche Spezies

beschreiben bis dato unbekannte Taxa. Daher können mit der hier getroffenen Auswahl aus

lebensmittelrelevanten und/oder ubiquitär verbreiteten Fungi nur die wichtigsten Phyla

(Basidio-, Asco-, Blastocladiomycota, Mucoro- und Kickxellomycotina) abgedeckt werden,

wobei Asco- und Basidiomycota etwa 98% aller beschriebenen Pilze umfassen (Stajich et al.

2009). Spezies, die in der Inklusivitätsprüfung nicht berücksichtigt wurden, aber für

Produktionsbetriebe von Bedeutung sind, müssen insbesondere für die quantitative Analytik

bei Bedarf nachgetestet werden.

Ein kritischer Punkt war die anfängliche Amplifikation pflanzlicher DNA und die Frage nach

einer 100%ig pilzfreien Pflanzenprobe, um definitive Aussagen über diese Problematik

erhalten zu können. Bei der DNA-Extraktion pflanzlicher Bestandteile wie Blättern oder

Früchten war die Anwesenheit von Pilzen – insbesondere Schimmelpilzen, die im Erdreich

vorkommen sowie Endophyten – denkbar: So befällt der Mucorales-Pilz Rhizopus stolonifer

Obst wie z.B. Erdbeeren, Spezies der Gattung Ustilaginomycotina sind als Pflanzenparasiten

bekannt (Stajich et al. 2009; Hoffmann et al. 2013). Ob durch Methoden wie der

Oberflächensterilisation mit Agenzien wie Natriumhypochlorit oder der DNA-Extraktion aus

dem Pflanzeninneren eine Keimfreiheit erreicht werden würde, war ebenfalls fraglich (Schulz

et al. 1993). Daher wurde beschlossen, eine artifizielle Pflanzen-DNA in Form eines

Plasmids zu generieren (vgl. Kapitel 3.2). Hierfür war zunächst das Entwickeln von Primern

4 DISKUSSION

74

notwendig, die den Zielbereich der 28S rDNA flankieren und dabei hoch spezifisch für

Pflanzen sind. Nach Beurteilung der Sequenzen relevanter Pflanzen mit verfügbarer DNA,

die aus der NCBI-Datenbank geladen wurden, und der Feststellung der geringen Divergenz

zu den Pilzen konnten die Primer VegFw1 und VegRv1 abgeleitet werden (siehe Anhang I).

Damit wurde ein 868 bp langes DNA-Fragment gewählt, das auf der 28S-rDNA-Sequenz des

Cucurbita pepo die Positionen 140 bis 1008 bp einnimmt (GenBank Acc. No. AF479108). Mit

der erfolgreichen Klonierung des Fragments konnten Versuche zur Erhöhung der Spezifität

vorgenommen werden.

Die Schlüsselstelle zur erhöhten Spezifität war dem Reverseprimer FungiRv3

zugeschrieben, da sich dieser in nur einer Base von der pflanzlichen Sequenz unterschied:

in 5‗-3‗-Richtung an Position 3 der Matrize ist anstelle einer Thyminbase bei den Plantae ein

Cytosin eingebaut. Unspezifische Amplifikate infolge von Mismatching waren die Folge.

Deutlich wurde dies vor allem in den Versuchen mit Primern, die Modifikationen zur

Unterbindung der Amplifikation pflanzlicher DNA aufwiesen (vgl. Kapitel 3.3).

Zunächst wurde der Einfluss eines LNA™-Primers geprüft. In locked nucleic acids (engl.

fixierte Nukleinsäuren) sind eine oder mehrere Basen durch den Einbau einer

Methylenbrücke zwischen dem Sauerstoffatom des C2-Atoms und dem C4-Atom strukturell

verändert (Koshkin et al. 1998; Obika et al. 1998; Braasch et al. 2002; Devor 2005;

Ballantyne et al. 2008). Damit ist das Molekül in der idealen Konformation festgesetzt; die

strukturelle Flexibilität geht aufgrund der erhöhten thermodynamischen Stabilität verloren

(Braasch et al. 2002; Devor 2005). Eine Hybridisierung kann demnach nur an den 100%ig

komplementären Strang erfolgen, zu dem eine verstärkte Bindungsaffinität herrscht

(Ballantyne et al. 2008). Diese zeigt sich in der Erhöhung der Schmelztemperatur des

Doppelstrangs um 2 bis 8 °C je LNA™-Monomer (Devor 2005; Ballantyne et al. 2008;

Exiqon 2009). Dadurch ergibt sich ein Vorteil der LNA™- gegenüber den Standard-Primern:

beim Einsatz kürzerer Primer und Sonden können dennoch stringente

Annealingbedingungen mit guter Performance angewandt werden (Latorra et al. 2003; Devor

2005; Dörries 2006). Zudem zeichnet sich ein LNA™-Primer durch eine hohe

Amplifikationseffizienz aus, wodurch selbst geringe DNA-Mengen problemlos vervielfältigt

werden können. Dies ist im Besonderen für forensische Analysen, bei denen oftmals nur

sehr geringe DNA-Mengen vorliegen, interessant (Ballantyne et al. 2008). Weitere

Anwendungen finden sich bei der allelspezifischen PCR, Real-time-PCR (als TaqMan-

Sonde, Molecular Beacons u.a.) und Microarrays (Latorra et al. 2003; Devor 2005;

Ballantyne et al. 2008). Im klinischen Bereich ist der Einsatz als Antisense-Oligonukleotid,

welches nach dem Andocken den Zielbereich einer DNA oder RNA für nachfolgende

Prozesse blockiert und damit als Genregulator dient, vielversprechend (Braasch et al. 2002;

Latorra et al. 2003; Tolstrup 2003; Ballantyne et al. 2008). Im vorliegenden Assay sollte der

4 DISKUSSION

75

Einsatz eines LNA™-Primers die Amplifikation fungoider DNA verstärken, während

pflanzliche DNA mittels C3-Spacer-gelinktem Primer unterdrückt werden sollte. Die am 3‗-

Ende des Oligonukleotids angehängte Propylgruppe verursacht eine strukturelle Modifikation

des Primers, welche ein Ablesen durch die Polymerase und damit die Amplifikation

unterbindet. Vor allem in Hybridisierungssonden ist dies ein vielfach genutztes Prinzip (Zhou

et al. 2004).

Als Alternative zum LNA™-Primer wurden zip nucleic acids (engl.

Reißverschlussnukleinsäuren, Abkz. ZNA) getestet. Hierbei handelt es sich um

Oligonukleotid-Oligokation-Konjugate mit kationischen Sperminresten, welche die

elektrostatische Abstoßung zweier negativ geladener DNA-Stränge verringern und somit ihre

Hybridisierung fördern sollen (Pons et al. 2006; Noir et al. 2008; Moreau et al. 2009). Wie

LNAs™ weisen sie höhere Schmelztemperaturen und eine gute Diskriminierung von

Fehlpaarungen auf, wodurch sich ihre Anwendungsbereiche überschneiden (Moreau et al.

2009). ZNAs haben im vorliegenden Assay als Singleprimer verwertbare Resultate erzielt,

konnten diese aber im Multiplex-Ansatz nicht beibehalten (Daten nicht gezeigt). Daher wurde

die Optimierung des Mastermixes unter Einsatz des LNA™-Primers fortgeführt.

Die Effekte, die durch den Einsatz der modifizierten Primer erzielt wurden, konnten in den

Versuchen des Kapitels 3.3 aufgezeigt werden. Unter Verwendung verschiedener

Mastermixvarianten konnte bewiesen werden, dass sowohl Block- als auch LNA™-Primer

großen Einfluss auf die Amplifikation pflanzlicher DNA ausüben. Durch Zusatz des LNA™-

Primers fand im Vergleich zum unmodifizierten Primer FungiRv3 eine Verzögerung des

pflanzlichen Signals um im Schnitt 17 Zyklen statt. Der Blockprimer erhöhte den Cp-Wert um

etwa 6 Zyklen. Aber erst durch die Kombination beider Primer können pflanzliche Signale bis

zu einer gewissen Konzentration vollständig unterdrückt werden: Im Falle des eingesetzten

Pflanzenplasmids bewegt sich der Grenzwert zwischen 2,3x107 und 1,1x10

8 Kopien. Dort,

wo trotz Einsatz beider Varianten noch Signale zu verzeichnen sind, werden diese in starker

Abhängigkeit zur DNA-Konzentration nochmals um 4 bis 7 Zyklen im Vergleich zum Mix, der

nur den LNA™-Primer enthält, hinausgezögert.

Die Spezifität des Real-time-PCR-Assays wurde durch die Verwendung des LNA™- und des

C3-Spacer-gelinkten Primers deutlich verbessert. Es konnte gezeigt werden, dass eine

Abgrenzung zu taxonomisch nahverwandten Pflanzen möglich ist. Die bestätigt sich auch

durch den Einsatz RNA-freier, quantifizierter Pflanzen-DNA (100 pg je Reaktion) zur

Exklusivitätstestung. Keine der getesteten DNAs lieferte ein Positivsignal im FAM-Kanal. Es

wäre denkbar, dass bei einer sehr hohen DNA-Konzentration die Amplifikation nach

Verbrauch der Primer nicht weiter unterbunden wird. Dies ist in nachfolgenden Versuchen,

die vorzugsweise mit Fruchtsäften/-konzentraten durchgeführt wurden, allerdings nicht

erkennbar gewesen. Die Ursache hierfür liegt darin, dass prozessierte Matrices einen

4 DISKUSSION

76

gewissen Anteil an freier DNA bzw. DNA inaktivierter Zellen aufweisen, der bei der

Lebend/Tot-Aufbereitung durch den interkalierenden Farbstoff des Reagent D inaktiviert

wird, während neu freigesetzte DNA (aus der Lyse) schließlich in der PCR blockiert wird.

Die Exklusivitätsprüfung hat weiter zeigen können, dass die Abgrenzung zu Bakterien und

Zelllinien verschiedener Herkunft gegeben ist und eine Spezifität für Pilze vorliegt. Die

Beschaffung pilzfreier Proben kann sich - wie schon bei den Pflanzen – problematisch

gestalten, da Fungi als ubiquitäre Organismen beinahe jeden Lebensraum und als

Pathogene eine Vielzahl an Wirten besiedeln können: Vertreter der Familie Mucorales sind

als Parasiten von Pflanzen, Tieren und anderen Pilzen bekannt (Hoffmann et al. 2013).

Durch die regelmäßige Überprüfung und Kontrolle der hausinternen Stammsammlung

konnte die Richtigkeit der bakteriellen Stämme und der daraus erhaltenen DNA gewährleistet

werden. Es wurden ausschließlich steril bearbeitete Zellkulturüberstände verwendet, welche

regelmäßig mikroskopisch beurteilt wurden, um Kontaminationen auszuschließen.

4.3 Sensitivität des Real-time-PCR-Assays (LOD und LOQ)

Nachdem die Selektivität des Assays durch Inklusivitäts- und Exklusivitätsuntersuchungen

nach ISO 22118:2011 (§64 LFGB L00.00.138) bestätigt werden konnte, schlossen sich

ausführliche Versuche zur Bestimmung des limit of detection und limit of quantification an,

mit denen die Sensitivität beurteilt werden sollte. Die RNA-freie DNA von 15

lebensmittelrelevanten Pilzen, welche ein breites phylogenetisches Spektrum abdeckten,

konnte nach einer Konzentrationsbestimmung mittels Absorptionsspektroskopie quantifiziert

und in gewünschter DNA-Konzentration in die Reaktion zur Bestimmung von LOD und LOQ

eingesetzt werden. Die untersuchten Pilzspezies weisen unterschiedliche Genomgrößen

(von 10 bis 72 fg) und mit großer Wahrscheinlichkeit auch eine Varianz der rDNA-Kopien

innerhalb des Genoms auf (Prokopowich et al. 2003). Die exakten Kopienzahlen der 15

Spezies sind nicht bekannt. Innerhalb des Reiches der Fungi wird jedoch von 10 bis 250

rDNA-Repeats ausgegangen (Ashbya gossypii: 50 Kopien, Saccharomyces cerevisiae: 150

Kopien, Aspergillus nidulans: 45 Kopien, Cryptococcus neoformans: 55 Kopien) (Kobayashi

et al. 1998; Wendland et al. 1999; Prokopowich et al. 2003; Ganley und Kobayashi 2007).

Zur Bestimmung der LOD und der LOQ wurden die DNAs zur besseren Vergleichbarkeit auf

Genomäquivalente eingestellt. Damit variieren sowohl DNA-Gehalt als auch rDNA-

Kopienzahl bei identischen Genomkopien in der Reaktion. Unter Beachtung der

unterschiedlichen Genkopienanzahl (Varianz von 10 bis 250 Kopien) ist davon auszugehen,

dass die resultierenden Cp-Werte zweier Pilze mit identischem Genomäquivalenten bis zu

einer Log-Stufe – also bei optimaler PCR-Effizienz um 3,32 Zyklen – auseinander liegen

können. Genau dies ist bei den Einzeluntersuchungen jeder Spezies zu erkennen: die Cp-

4 DISKUSSION

77

Werte für 10 000 GÄ liegen beispielsweise im Bereich von x̅ = 15,16 (I. orientalis) bis

x̅ = 18,98 (Cl. cladosporoides) und weisen damit eine Differenz von 3,82 Zyklen auf. In den

weiteren Stufen der Verdünnungsreihen tritt eine solche Differenz wiederholt auf. Dies lässt

auf rDNA copy numbers schließen, die sich in etwa um den Faktor 10 voneinander

unterscheiden. Infolge der interspezifischen Korrelation aller Werte werden die Cp-Werte der

beiden stark vom Mittel (x̅ = 16,6) abweichenden Spezies jedoch relativiert, so dass die

Gesamtstandardabweichung nur bei 0,1 liegt. Es zeigt sich somit, dass die Kopienzahl des

rDNA-Gens zwar einen Einfluss auf den Amplifikationszeitpunkt hat, aber eine

Quantifizierung dennoch realisierbar ist. Die Effizienz des Assays liegt deutlich über 90% für

alle quantifizierten Pilzspezies und erfüllt damit die Anforderungen an ein robustes System

(siehe Anhang VIII) (Codex Alimentarius CAC/GL 74-2010). Die Robustheit wird mit der

Adaption auf verschiedene Cycler-Plattformen nochmals unterstrichen.

Quantitative Analysen sollten in jedem PCR-Lauf realisierbar sein, um genaue Aussagen

über den Kontaminationsgrad zu erhalten. Hierfür wurde eine Plasmidpositivkontrolle auf

Basis eines pGEM®-T-Vektors erstellt, welche nach ISO 22174:2005 und ISO 20838:2006

auch die Funktionalität der zielgenspezifischen Reagenzien bestätigen sollte. Nach

Amplifikation des Zielbereichs aus D. anomala-DNA wurde das PCR-Produkt

gelelektrophoretisch aufgetrennt und die spezifische Bande (ca. 106bp) heraus geschnitten.

Das aufgereinigte DNA-Fragment konnte anschließend in einen Vektor ligiert und dieser in

kompetente XL-1 Blue E. coli-Zellen transformiert werden. Es befindet sich somit in einem

Plasmid eine Kopie des 28S-rDNA-Zielbereichs. Mit der Sequenzierung der erhaltenen

Positivkontrolle konnte dies bestätigt werden. Die Untersuchung zur Einstellung der

Positivkontrolle (siehe Kap. 3.4) hat gezeigt, dass eine Korrelation zwischen dem single-

copy-Plasmid und der eingesetzten DNA-Menge hergestellt werden kann: 106 Kopien

erreichen den gleichen Cp-Wert (21,93) wie 10 000 GÄ von D. anomala (21,74), 105 Plasmid-

Kopien (Cp 25,48) den gleichen wie 1 000 GÄ (Cp 25,32) usw. Damit ließe sich theoretisch

herleiten, dass die Hefe D. anomala etwa 100 Kopien des rDNA-Gens im Genom aufweisen

muss. Der Wert liegt real allerdings deutlich darunter, da zwei unterschiedliche Fragmente,

die insbesondere in ihrer Länge (3100bp Plasmid gegen Gesamt-DNA) verschieden sind, in

der PCR-Reaktion nicht identisch amplifiziert werden können (Mülhardt 2009). Eine direkte

Bestimmung der rDNA-Kopienzahl der Hefe ist damit nicht machbar. Es ermöglicht jedoch

eine Quantifizierung an eingesetzten Genomäquivalenten. In der vorliegenden Arbeit wurde

die Kontrolle für Dekkera-anomala-DNA eingestellt; eine Anpassung an die interspezifischen

Werte der Sensitivitätsbestimmung (Kap. 3.7) ist sinnvoll, da diese als Mittelwert aus den 15

Pilzstämmen errechnet wurden.

Durch die Auswahl eines multi-copy-Gens können sehr niedrige Nachweisgrenzen erreicht

werden. Der vorliegende Assay erzielt einen LOD- bzw. LOQ-Wert von 0,39 GÄ. Unter der

4 DISKUSSION

78

Annahme, dass in Fungi das 28S-rDNA-Gen etwa 10 bis 250 Mal vorhanden ist, kann selbst

ein einziger Organismus damit noch ausreichend Zielmoleküle in die PCR-Reaktion

einbringen, um eine Detektion sowie eine Quantifizierung zu ermöglichen. Dies ist

gleichzeitig der sensibelste Punkt des Systems: geringste Kreuzkontaminationen (unsaubere

Reagenzien etc.) können bereits zu einem falschpositiven Resultat führen. Die eingesetzten

Materialien (Reagenzien, Pipettenspitzen etc.) sollten damit möglichst DNA-frei sein.

Die Falschpositivrate pf+ errechnet sich nach §64 LFGB 00.00-138 folgendermaßen:

𝑝𝑓+ =𝑛𝑓+

𝑛𝑟−+𝑛𝑓+∗ 100% Gleichung 5

nf+ … Anzahl falsch eingestufter bekanntermaßen negativen Proben nr- … Anzahl der tatsächlich negativen Untersuchungsergebnisse

Ergänzt man die Werte der Negativkontrollen aus der Sensitivitätsbestimmung (vgl. Kap.

3.7und Anhang VIII), erhält man:

𝑝𝑓+ =30

110+30∗ 100% = 21,43% Gleichung 6

Die hohe Falschpositivrate der Negativkontrollen im Sensitivitätstest in Höhe von 21% zeigt

die Gefahr der Kreuzkontaminationen deutlich. Betrachtet man die hundertprozentige

Nachweisquote der 0,39 GÄ-Stufe und die hohe Positivrate der NTCs im Zusammenhang, ist

eine Unterscheidung zwischen „falschpositiv― und „richtigpositiv― in diesem Bereich nicht

eindeutig möglich. Daher sollte die Nachweis- und Quantifizierungsgrenze des Assays auf

1,56 GÄ festgelegt werden. Die klare Unterscheidung zu den Negativkontrollen kann damit

erreicht werden. Negativkontrollen sind ebenso wie Positivkontrollen in jedem PCR-

Experiment mitzuführen, um falschpositive Resultate erkennen zu können (ISO 22174:2005

und ISO 20838:2006).

Der Assay enthält Mechanismen zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen: die Hot-Start-

Funktion der Polymerase (ISO 20838:2006) sowie den Einsatz der Uracil-DNA-Glykosylase

(ISO 22174:2205). Für die Hot-Start-Funktion ist ein spezifischer Antikörper oder ein

passendes Aptamer notwendig. Antikörper werden meist in einer glycerinhaltigen Lösung

gelagert, um ein komplettes Einfrieren und die daraus resultierende Schädigung des

Antikörpers zu verhindern. Glycerin hindert aufgrund seiner niedrigen

Glasübergangstemperatur (TG = -65°C) allerdings auch den Einfrierprozess vor der

Gefriertrocknung, bei dem sich eine Eiskristall- und eine aufkonzentrierte, amorphe

Glasphase, die die Wertstoffe umschließt und konserviert, ausbilden (Ringler 2000). Die

Glas-Dynamik-Hypothese nach Chang et al. erklärt, dass zugesetzte Stabilisatoren wie

Zucker eine starre, inerte Matrix bilden, in der das Enzym beim Einfrieren eingelagert wird

(Chang et al. 2005). Die Bewegungsfreiheit als Grundvoraussetzung für chemische Prozesse

wie Umfaltung und Denaturierung ist in diesem Stadium stark eingeschränkt (Chang et al.

2005). Der Hypothese des water substitute (engl. Wasserersatz) folgend, stehen bei der

4 DISKUSSION

79

eigentlichen Lyophilisation nach dem vollständigen Entzug des Wassers freie

Hydroxylgruppen des zugesetzten Zuckers zur Ausbildung von Wasserstoffbrücken zur

Verfügung (Chang et al. 2005). Dies reduziert die freie Enthalpie, da mehr Energie zum

Umfalten des Proteins benötigt werden würde (Chang et al. 2005). Damit ist das native

Proteingerüst der Polymerase stabilisiert (Chang et al. 2005). Glycerin- und DNA-freie

Antikörper waren für den Assay nicht verfügbar. Aus diesem Grund musste das Enzym mit

einem geeigneten Aptamer blockiert werden.

Die Auswahl eines Aptamers erfolgt nach einem unter zunehmend stringenten Bedingungen

verlaufenden Selektionsprozess aus einer Kandidatenbibliothek heraus (SELEX-Verfahren,

Abkz. systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (Ikebukuro und Noma

2003; Friedrichs und Simmel 2007). Essentielle Eigenschaften für das vorliegende Assay

waren eine reversible Bindung an das Enzym und die Hot-Start-Funktion. PCR-Artefakte, die

durch Fehlhybridisierung und Primerdimerbildung entstehen, können durch einen Antikörper

oder einem speziellen Oligonukleotid vermieden werden, da diese Moleküle das aktive

Zentrum des Enzyms bei Umgebungstemperatur blockieren. Erst bei Temperaturen über

70°C zersetzt sich der Komplex infolge der Denaturierung des Blockmoleküls und gibt damit

das aktive Zentrum frei. Die Sensitivität und Spezifität einer PCR-Reaktion ist damit

gegenüber der konventionellen Methode deutlich erhöht (Mülhardt 2009). Dies zeigte sich

auch in den sich anschließenden Versuchen: obwohl auch die antikörpergeblockte

Polymerase in Bezug auf Sensitivität und Spezifität gute Resultate erzielte, konnte nach der

Umstellung auf das Aptamer und dem Herabgesetzten der Annealingtemperatur auf 60°C bei

gleichbleibender Sensitivität die Spezifität nochmals verbessert werden. Die

Falschpositivrate von Negativkontrollen konnte reduziert werden (0 von 30), so dass die

Bestimmungen der ISO-Norm5 erfüllt werden (ISO 22118:2011); die Amplifikation pflanzlicher

DNA – getestet durch den Einsatz eines Plasmids mit pflanzenspezifischem Insert – konnte

weiter unterdrückt werden.

Mit dem Einsatz einer Uracil-DNA-Glykosylase und dUTP anstelle von dTTP können – der

ISO 20838:2006 folgend - carry-over-Kontaminationen aus vorangegangenen PCR-

Reaktionen vermieden werden (Mülhardt 2009). In das Amplifikat wird für jede Thymin- eine

Uracilbase eingebaut. Die nachfolgende PCR-Reaktion beginnt zunächst mit einem 37°C-

Schritt, bei dem die UDG alle uracilhaltigen PCR-Produkte durch die Spaltung der N-

glycosidischen Bindung abbaut, so dass diese nicht mehr amplifizierbar sind. Das Enzym

selbst wird während der initialen Denaturierungsphase inaktiviert und stört den weiteren

Amplifikationsprozess nicht (Mülhardt 2009).

5 Eine Falschpositiv- bzw. Falschnegativrate von 5% und weniger erfüllt die Anforderungen nach ISO

22118:2011.

4 DISKUSSION

80

Neben der Positivkontrolle, die zur Quantifizierung genutzt werden kann, wurde eine interne

Amplifikationskontrolle in den Assay eingebracht. Nach ISO 22174:2005 und ISO

20838:2006 soll in jeder PCR-Reaktion eine interne oder externe Amplifikationskontrolle

mitgeführt werden, da das Risiko besteht infolge einer Inhibition (z.B. durch DNA-Extraktion

freigesetzte Schwebstoffe, Farbstoffe, Polyphenole etc.) falschnegative Resultate zu

erhalten. Die IAK muss prinzipiell immer amplifiziert werden. Eine Ausnahme tritt ein, wenn

viel Ziel-DNA in den Assay eingebracht wird und die IAK als Folge der Konkurrenz um

dNTPs, Polymerase etc. nicht oder nur unzureichend amplifiziert wird. Die Ziel-DNA für die

IAK wird in Form eines Plasmids mit synthetisiertem Insert eingesetzt, wobei die

Konzentration des Plasmids so gewählt wird, dass die Amplifikation des PCR-Produktes im

Vordergrund steht. Die Detektion der IAK findet zu einem späten Zeitpunkt der Reaktion statt

(Cp > 30). Die nicht-kompetitive Amplifikationskontrolle, welche über ein eigenständiges

Primerpaar und eine spezifische Sonde detektiert wird, hat ein geringfügig längeres

Fragment als das PCR-Produkt, um möglichst identische Amplifikationsbedingungen zu

schaffen, aber dabei die Reaktion zugunsten des kleineren PCR-Produktes zu verlagern.

Abschließend kann festgehalten werden, dass ein Real-time-PCR-Assay entwickelt wurde,

welches unter Einsatz von RNA-freier DNA ein Detektions- und Quantifizierungslimit von

1,6 GÄ aufweist. Die Identifikation der Ziel-DNA wird über spezifische Primerpaare und

Sonden erreicht, wobei im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein zusätzlicher Forwardprimer

in das System eingebracht wurde, um den Nachweis und die Quantifizierung der

Mucoromycotina zu ermöglichen. Durch die Verwendung zweier Primermodifikationen

konnte die Spezifität des Assays verbessert und die Amplifikation unerwünschter DNAs (z.B.

pflanzlichen Ursprungs) weitestgehend blockiert werden. Durch die Anpassung der

Reaktionsbedingungen (Polymerase-Blockierung mit Aptamer, Herabsetzen der

Annealingtemperatur) sowie der Verwendung DNA-freier Materialien wurde die Rate an

falschpositiven Resultaten deutlich reduziert. Mit der internen Amplifikations- und der

Positivkontrolle erfüllt der Multiplex-Assay die Anforderungen nach ISO 22174:2005 und ISO

20838:2006.

4.4 Beurteilung der Methode zur Lebend/Tot-Differenzierung

Der Nachweis von Mikroorganismen in Getränken ist von großer Wichtigkeit, da diese u.a.

zum Verderb des Produkts führen, schädliche Mykotoxine bilden oder allergische Reaktionen

nach dem Verzehr hervorrufen können (Fleet 1992; Back 2000; Boekhout und Robert 2003;

Rawsthorne und Phister 2006; Baumgart et al. 2012; Lucera et al. 2012). Neben dem

gesundheitlichen Risiko für den Verbraucher verlangt der mögliche wirtschaftliche Verlust

4 DISKUSSION

81

des Herstellers nach einem Untersuchungsverfahren, das die Erfolge der durchgeführten

Sterilisationsmaßnahmen aufzeigt (Arias et al. 2002; Bleve et al. 2003; Martorell et al. 2005).

Die in der Industrie angewandten Sterilisationsmaßnahmen sind auf das jeweilige Produkt

und seine Verpackung abgestimmt, aber kein Verfahren scheint gegen alle Arten von

Erregern wirksam. In Getränken, in denen aufgrund der Abfüllung in PET-Flaschen keine

Heißabfüllung möglich ist (z.B. Cola, Limonaden, stille Getränke u.Ä.), kommt häufig das

Kaltentkeimungsmittel Velcorin® (Dimethyldicarbot, E242) zum Einsatz (Zink 1997; Wareing

und Davenport 2000), welches zur Abtötung von Kahm- und Gärhefen sowie

gärungserregenden Bakterien zugesetzt wird (Pollmer 2000). In höherer Konzentration ist es

auch gegen Schimmelpilze und Wildhefen effektiv (Pollmer 2000). Allerdings konnten bereits

Velcorin®-tolerante Hefen identifiziert werden: Zygosaccharomyces lentus ist zudem tolerant

gegenüber den Konservierungsmitteln Sorbin- und Benzoesäure, niedrigen pH-Werten und

hohen Zuckerkonzentrationen und damit ein schwer zu beseitigender Verderbsorganismus

(Steels et al. 1999; Pollmer 2000). Laut Hersteller ist das Produkt zudem im Vorfeld auf

Sporenfreiheit zu testen und die Keimbelastung zu reduzieren (Lanxess 2009). Stille

Getränke, die mittels Hitzesterilisation behandelt werden können, bergen auch nach dem

Prozess die Gefahr einer Kontamination mit hitzeresistenten Askosporen der Spezies

Byssochlamys fulva, Talaromyces flavus oder Neosartorya fischeri (Fleet 1992; Back 2000;

Wareing und Davenport 2000; Arias et al. 2002; Baumgart et al. 2012).

Zur korrekten Darstellung des Dekontaminationserfolges genügt der entwickelte PCR-Assay

alleine nicht, da jede zugängliche DNA, auch diejenige aus Erregern, die bei den

Sterilisationsmaßnahmen abgetötet werden konnten, nachgewiesen werden würde (Fittipaldi

et al. 2012). Eine Aussage darüber, wie viel lebende Pilze tatsächlich im System verblieben

sind, kann damit nicht getroffen werden. Eine Differenzierung zwischen lebenden und toten

Zellen ist somit für die Probenaufarbeitungsmethode essentiell.

In den letzten Jahren hat sich der Einsatz interkalierender Agenzien in Kombination mit der

DNA-Amplifikation als sogenannte viable-PCR (engl. PCR zum Nachweis lebensfähiger

Organismen, Abkz. v-PCR) – auch in Form einer isothermalen Amplifikation - für die

Lebend/Tot-Differenzierung vermehrt durchgesetzt (Fittipaldi et al. 2012). Als interkalierende

Agenzien werden vorwiegend Propidiummonoazid oder Ethidiumbromidmonoazid

zugegeben, wobei ihre Anwendung für verschiedene Mikroorganismen untersucht wurde:

vegetative Bakterienzellen, bakterielle Sporen, Fungi, Viren und Protozoen wurden hierfür

herangezogen (Fittipaldi et al. 2012). Welches Agenz in welcher Konzentration eingesetzt

wird, ist dabei vom zu beseitigenden Organismus abhängig: während PMA aufgrund seiner

höheren, positiven Ladung bei Bakterien bevorzugt wird, findet EMA häufig bei Pilzen und

gramnegativen Bakterien Anwendung (Nocker und Camper 2009; Minami et al. 2010;

Fittipaldi et al. 2012). Für den vorliegenden Assay wurde das Produkt Reagent D (Fa.

4 DISKUSSION

82

BIOTECON Diagnostics), eingesetzt welches für die Beseitigung der DNA toter

Enterobacteriaceae in Milchprodukten vorgesehen ist. Das vorgegebene Protokoll wurde für

die ersten Analysen übernommen.

Zur Beurteilung der Effektivität der interkalierenden Agenz wurden Hefezellen und

Schimmelpilzsporen (1x102 bzw. 1x10

3 KBE) in SSL-Medium über einen bestimmten

Zeitraum (min. 20min) bei 80°C in einem Thermomixer inaktiviert. Zum Vergleich wurden

neben den Untersuchungen mittels PCR Kulturen auf YM-Agar angelegt. Unter Anwendung

des Standardprotokolls (nach Herstellerangaben) konnte bereits nach 5minütiger

Dunkelphase die DNA inaktivierter Saccharomyces- und Dekkera--Zellen vollständig

unterdrückt werden. Für Aspergillus-Sporen und Zygosaccharomyces bailii genügte die

kurze Einwirkzeit des Reagent D nicht: die inaktivierten Sporen generierten nach 5minütiger

Inkubationszeit einen Cp-Wert von 35,32, die Hefen einen Wert von 34,76. Wie in Studien

bereits vermutet wurde, scheint die Effektivität der interkalierenden Agenz somit vom Zelltyp

(Spore oder vegetative Zelle) und der Spezies abhängig zu sein (Fittipaldi et al. 2010, 2012).

Eine Erhöhung der Einwirkzeit birgt jedoch – vor allem bei Verwendung von EMA für

Bakteriensuspensionen - die Gefahr des Eindringens in lebende Zellen und damit

verbundene zytotoxischer Effekte, welche letztlich zu einer Unterschätzung des tatsächlichen

Lebendbefalls der Probe führen können (Nogva et al. 2003; Rudi et al. 2005; Nocker und

Camper 2006; Fittipaldi et al. 2010, 2012). Eine Verlängerung der Dunkelphase auf zunächst

10min sollte darüber Aufschluss geben: im direkten Vergleich zur 5minütigen Dunkelphase

war jedoch bei allen vier Spezies keine Verschiebung des Cp-Wertes der Lebendprobe, was

auf einen negativen Effekt auf die aktiven Zellen schließen ließe, zu verzeichnen. Sollten die

Zellen infolge der verdoppelten Dunkelphase geschädigt worden sein, resultiert dies nicht in

signifikanten Unterschieden in der PCR. Das Signal der inaktivierten Zygosaccharomyces-

Zellen konnte nun ebenso wie das der inaktivierten Saccharomyces- und Dekkera-Zellen

vollständig unterdrückt werden. Dagegen generierte die Probe der inaktivierten Aspergillus-

Sporen ein Signal, das die LightCycler®-Software als „uncertain“ deklarierte. Insbesondere in

diesem Experiment war in den Proben mit DNA aus inaktivierten Zellen bzw. Sporen sowie

der WSH-Kontrolle ein leichter Anstieg im letzten Abschnitt der PCR zu erkennen, was auf

eine Kontamination mit geringen DNA-Mengen hinweist.

Da nach der 10minütigen Einwirkzeit das Signal der inaktivierten Aspergillus-Sporen nicht

vollständig beseitigt war, wurde eine Ausdehnung der Dunkelphase auf 20min getestet. Über

einen Zeitraum von 60min wurden die Sporen (1,4x104 KBE) bei 80°C thermisch behandelt

und in regelmäßigen Zeitabständen Proben entnommen, welche parallel für 10 bzw. 20min

mit der Agenz inkubiert wurden. Zum einen konnte festgestellt werden, dass keine

Signalverschiebung bei längerer Dunkelphase zu verzeichnen ist. Zum anderen nimmt ab

4 DISKUSSION

83

einer 30minütigen Hitzebehandlung das in der PCR generierte Signal nicht weiter ab.

Vielmehr treten die Signale aller nachfolgend entnommenen Proben um den Cp 32/33 auf.

Eine vollständige Unterdrückung der Signale aus inaktivierten Sporen wurde somit nicht

erreicht. Auf den ersten Blick spricht es für die Ineffektivität der Agenz. Bei genauerer

Betrachtung liegt dies allerdings in der hohen Sensitivität des Real-time-PCR-Assays und

der möglichen Thermotoleranz einiger Sporen begründet. Wie in Kapitel 3.10 (Gleichung 3

und 4) beschrieben, können mithilfe einer Standardkurve die nach der Thermobehandlung im

System verbliebenen Sporen im Vergleich zur Ausgangsmenge berechnet werden. Da der

Cp-Wert über den gesamten Behandlungszeitraum um ca. 9 Zyklen erhöht wird, verbleiben

rechnerisch etwa 0,177% vom Ausgangswert in der PCR-Reaktion. Umgerechnet entspricht

dies etwa einem Genomäquivalenten. Die Analysen zur LOD- und LOQ-Bestimmung haben

deutlich gezeigt, dass mit der Auswahl des multi-copy-Gens genügend Ziel-DNA für den

Nachweis und die Quantifizierung von weniger als 1 GÄ zur Verfügung steht.

Der Verbleib einer geringen Anzahl aktiver Sporen im System konnte bereits von Fujikawa

und Itoh beobachtet werden: in einer Studie inaktivierten sie Aspergillus-Sporen mittels

Hitzebehandlung und konnten feststellen, dass jede thermische Inaktivierung einem Muster

folgt (Fujikawa und Itoh 1996): in einer semilogarithmischen Darstellung, in der die

Lebendanzahl der Sporen N im Verhältnis zur Ausgangslebendanzahl N0 (entspricht log 𝑁

𝑁𝑜 )

über den Zeitpunkt t abgebildet ist, bildet sich im vorderen Bereich eine Schulter, die in ein

Gefälle übergeht und in einem Auslauf endet. In der Schulter zeigt sich diejenige Zeit, die

benötigt wird, um eine Inaktivierung der Sporen in Gang zu setzen. Die zunehmende Anzahl

inaktivierter Sporen spiegelt sich im Gefälle wieder, deren Steilheit ebenso wie die Länge der

Schulter temperaturabhängig ist. Zum Ende des Gefälles geht die Kurve in den Auslauf über,

der in Abhängigkeit von der Ausgangskonzentration und der Inaktivierungstemperatur gegen

einen bestimmten Wert p strebt. Dieser gibt letztlich die Überlebensrate der Sporen nach der

Thermobehandlung an. Die Studie bewies, dass ab einer Ausgangskonzentration von 103

Sporen pro Milliliter eine gewisse Anzahl während der Behandlung eine Thermotoleranz

entwickeln kann, welche jedoch nur einmalig gegeben ist: eine Anzucht der Sporen auf Agar

und eine erneute Thermobehandlung führen wiederum zu sensitiven und thermotoleranten

Sporen. Die Toleranz scheint damit eher zufällig als konsistent. Sinnvoller als eine einmalige

Hitzebehandlung ist die wiederholte Wärmezufuhr, wodurch die Sporen stufenweise

vollständig inaktiviert werden können. Für die Untersuchung der Lebend/Tot-Differenzierung

wurde diese Vorgehensweise jedoch nicht angewandt. Demnach verblieben wahrscheinlich

thermotolerante Aspergillus-Sporen im System, welche nach der Probenaufarbeitung in der

PCR detektiert werden konnten. Die mikrobielle Anzucht zeigt an dieser Stelle Schwächen:

4 DISKUSSION

84

bereits nach 5min Inaktivierungsdauer konnte kein Koloniewachstum auf den Agarplatten

festgestellt werden.

Die Konzentration des interkalierenden Farbstoffs im Reagent D ist gering6. Dadurch werden

die Pilzzellen auch bei längerer Dunkelphase keinen signifikanten, zytotoxischen Effekten

ausgesetzt, welche die Beurteilung des Lebendanteils beeinflussen (Fittipaldi et al. 2012).

Eine Dunkelphase von mehr als 5 Minuten ist damit unproblematisch und, wie der Test mit

10minütiger Inkubationszeit zeigt, effektiver bei der Unterdrückung des Signals inaktivierter

Zellen. Der Fluoreszenzfarbstoff hat mehr Zeit in membrangeschädigte Zellen einzudringen

und sich an die DNA zu binden (Fittipaldi et al. 2012). Eine weitere Verlängerung ist nach

bisherigen Untersuchungen nicht notwendig und wurde in Bezug auf ein kurzes

Bearbeitungsprotokoll nicht weiter verfolgt. Andorrà et al. haben in ihrer Studie sowohl für

EMA als auch PMA ebenfalls die 10minütige Inkubation als Optimum zur Beseitigung

inaktivierter Hefezellen herausgefunden (Andorrà et al. 2010).

Für die optimale Beseitigung der DNA geschädigter Organismen spielt die

Inkubationstemperatur eine bedeutende Rolle. Der Fluoreszenzfarbstoff muss in die

aufgebrochenen Zellen eindringen können. Wählt man eine Temperatur um 0°C

(Dunkelinkubation im Kühlschrank), wird die freie Diffusion durch eine starre Membran

erschwert (Fittipaldi et al. 2012). Bei Umgebungstemperatur besitzt die Membran dagegen

die natürliche Beweglichkeit, was die Diffusion des Farbstoffs ins Zellinnere fördert. Die

herabgesetzte Temperatur wird im Review von Fittipaldi et al. als Mittel zur Verminderung

der zytotoxischen Effekte und dem damit fälschlich abgebildeten Kontaminationsgrad infolge

des Eindringens in intakte Zellen verstanden (Fittipaldi et al. 2012). Eine exakte Abwägung

zwischen tatsächlicher Zytotoxizität und bestmöglichem Resultat muss damit für die jeweilige

Anwendung geprüft werden. Insbesondere beim Einsatz von PMA, dessen Aufnahme

aufgrund seiner erhöhten Ladung bereits vermindert ist, erzielt eine niedrige Temperatur

einen gegenteiligen Effekt. Dies konnte in Versuchen mit hitzeinaktivierten Salmonella- und

Listeria-Zellen, bei denen die Inkubation bei 0°C die geringste Signalunterdrückung aufwies,

bestätigt werden (Nkuipou-Kenfack et al. 2013). Da im vorliegenden Assay keine

signifikanten Schädigungen durch den Farbstoff bei verlängerter Inkubationszeit beobachtet

werden konnte, ist eine Inkubation bei 0°C nicht notwendig. Für die verbesserte Diffusion der

Agenz wurde die Dunkelphase bei Raumtemperatur durchgeführt.

Weitere wichtige Faktoren zur erfolgreichen Beseitigung der DNA abgetöteter Organismen

sind der Trübungsgrad der Lösung und die Anzahl an inaktivierten Zellen sowie die Auswahl

einer geeigneten Lichtquelle und der Belichtungszeit (Fittipaldi et al. 2012).

6 Die exakte Konzentration und die Art des Farbstoffs können aus patentrechtlichen Gründen nicht

genannt werden.

4 DISKUSSION

85

Das Verhältnis von lebenden und inaktivierten Zellen beeinflusst die Quantifizierung des

Lebendanteils: in verschiedenen Studien – vorwiegend mit PMA und Bakterien durchgeführt

- konnte beobachtet werden, dass bei einem Überfluss an toten Zellen (> 3 Log10) zu wenig

Farbstoff zur Bindung an die DNA zur Verfügung steht (Fittipaldi et al. 2012). Der

Lebendanteil würde infolge der unzureichenden Signalunterdrückung überschätzt (Fittipaldi

et al. 2012). Bei Erwartung sehr hoher Zahlen an inaktivierten Zellen sollte daher eine

Erhöhung der Farbstoffkonzentration in Erwägung gezogen werden.

Der Trübungsgrad ist abhängig von der Konzentration an Mikroorganismen und freien

Schwebstoffen in der Suspension. Die eingesetzte Lichtquelle muss für die erfolgreiche

kovalente Bindung an die DNA bzw. die Hydrolyse der freien Farbstoffmoleküle Zugang zum

Farbstoff finden und sollte nicht durch Schwebteilchen abgelenkt werden (Wagner et al.

2008; Fittipaldi et al. 2012). Bei sehr trübem Probematerial ist daher eine Verdünnung

sinnvoll, da sonst auch eine Beeinflussung bzw. Inhibition der PCR-Reaktion denkbar ist.

Als geeignete Lichtquelle werden Halogenlampen mit 500 – 750 W beschrieben, die mit

einem Abstand von 20 – 30 cm auf die Probe gerichtet sein sollten (Fittipaldi et al. 2012).

Aufgrund der enormen Hitzeentwicklung müssen die Proben auf Eis gestellt werden, um eine

Überhitzung des Probematerials zu vermeiden. Damit sind reproduzierbare Bedingungen

jedoch nicht realisierbar, da Wärmeentwicklung, Lichteinfall und Kühlungsgrad

unterschiedlich sein können. Zudem sind Resultate nur bedingt mit anderen Studien

vergleichbar, da je nach verwendeter Lampe auch andere Wellenlängen ausgesandt werden,

die dem Absorptionsmaximum des jeweiligen Farbstoffs verschieden genügen. Als

Alternative bieten sich LEDs (Abkz. light emitting diode) an, wie sie beispielsweise im PhAST

Blue verwendet werden. Es werden stets gleichbleibende Bedingungen geschaffen, da jede

Probe mit derselben Wellenlänge von einzelnen LEDs angestrahlt wird. Nach Ablauf der

Inkubationszeit stellt sich das System automatisch ab. Eine Kühlung der Proben ist nicht

notwendig.

Je nach verwendeter Differenzierungsmethode definiert sich der Begriff „lebensfähig― über

einen anderen Begriff (Nocker und Camper 2009). Die Lebend/Tot-Differenzierung per

interkalierenden Farbstoff ist über die Membranintegrität der Zelle gekennzeichnet. Sofern

der Farbstoff aufgrund von Membranschädigungen in das Zellinnere eindringen kann, ist sie

„nicht lebensfähig― (Nocker und Camper 2009). Bei der traditionellen mikrobiologischen

Anzucht wird die „Lebensfähigkeit― mit dem Begriff der Kultivierbarkeit gleichgesetzt. Dies

birgt jedoch die Gefahr, Zellen, die sich im viable-but-non-culturable-Stadium befinden, nicht

zu erfassen. Zellen dieses Stadiums weisen eine intakte Membran und metabolische

Aktivität auf, sind aber auf Standardmedien nicht kultivierbar und würden demnach nicht

detektiert werden (Bleve et al. 2003; Nocker und Camper 2009; Salinas et al. 2009;

Paparella et al. 2012). In der v-PCR werden sie allerdings nachgewiesen und quantifiziert, da

4 DISKUSSION

86

der Farbstoff nicht ins Zellinnere eindringen kann. Die benötigte Zeit bis zu den ersten

Analyseergebnissen ist mit der v-PCR natürlich deutlich verkürzt. Die mikrobielle

Untersuchung bedarf einer tage- oder wochenlangen Kultivierung der Proben auf z.T.

speziellen Nährmedien und verschiedenen Inkubationstemperaturen, um für die relevanten

Mikroorganismen auch geeignete Wachstumsbedingungen zu schaffen und ein korrektes

Abbild der Kontamination zu erhalten (Dlauchy et al. 1999; Arias et al. 2002; Bleve et al.

2003; Phister und Mills 2003; Casey und Dobson 2004; Hierro et al. 2006; Nocker und

Camper 2006).

Die Lebensfähigkeit definiert sich bei mRNA-Analysen über den Begriff der metabolischen

Aktivität, da der Expressionsgrad eines Gens untersucht wird (Nocker und Camper 2009).

Allerdings sind Genexpressionen vom Zellzustand (Zellstadium, Alter, Zelltyp usw.)

abhängig, so dass – vor allem in Mischkulturen - kaum reproduzierbare Resultate erhalten

werden. Des Weiteren lässt sich RNA nicht direkt nachweisen, sondern muss zunächst

mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben werden, was wiederum von der

Enzymaktivität abhängig ist (Caradec et al. 2010). Um die Effektivität des Umschriebs in

verschiedenen Proben beurteilen zu können, ist ein zusätzlicher spezifischer Housekeeping-

Gen-Assay z.B. für β-Actin, der Unterschiede in differenten Cp-Werten anzeigen würde,

denkbar (Caradec et al. 2010). Damit würde sich jedoch der Analyseaufwand und

Materialeinsatz erhöhen. Außerdem wurde in neueren Studien gezeigt, dass auch

Housekeeping-Gene in vitro und in vivo große Variationen aufweisen können (Caradec et al.

2010). Zudem birgt die Handhabung von RNA stets die Gefahr der Kontamination mit RNA-

abbauenden RNasen und einem daraus resultierenden falschen Abbild des

Lebendkeimzahlgehaltes (Mülhardt 2009).

Abschließend bleibt festzuhalten, dass mit der ausgewählten Methode zur Lebend/Tot-

Differenzierung ein schnelles und leicht zu handhabendes Verfahren gefunden wurde. Mit

den vorliegenden Ergebnissen ist bewiesen worden, dass es möglich ist, das PCR-Signal

abgetöteter Zellen sowohl im Kulturmedium als auch in realer Probe vollständig zu

unterdrücken. Bei reinen Sporensuspensionen konnte die Detektion um 3 Log10-Stufen

verzögert werden. Eine vollständige Unterdrückung war aufgrund der möglichen

Thermotoleranz der Sporen nicht realisierbar. Die Anwendbarkeit der Methode sollte bei

besonders trüben Proben explizit untersucht werden, um eine mögliche Optimierung der

Farbstoffkonzentration und Inkubationsbedingungen vorzunehmen.

4 DISKUSSION

87

4.5 Beurteilung der Probenaufarbeitung

In der Getränkeindustrie finden sich verschiedene Anforderungen und Richtwerte für

Verfahren zum Nachweis von Pilzen. Zum einen wird häufig eine Unterscheidung zwischen

Hefen und Schimmelpilzen vorgenommen, zum anderen verlangen die verschiedenen

Produkttypen nach unterschiedlichen mikrobiologischen Nachweismethoden (Baumgart et al.

2012). Im Handbuch zu „Mikrobiologischen Untersuchungsmethoden in Lebensmitteln―

werden 7 Produkttypen vermerkt, die nach dem Ausgangsstoff und dem jeweiligen

Endprodukt hin unterteilt werden in (Baumgart et al. 2012):

1. Konservierte Halbware zur Herstellung von Limonaden und Brausen (z.B. Konzentrat,

Püree, Mark, Fruchtzubereitung)

2. Konservierte Halbware zur Herstellung von stillen Getränken (wie 1)

3. spezielle Zuschlagsstoffe (z.B. Dickungsmittel, Zuckersirup, Vitaminmischung)

4. fruchttrübe Getränke mit pH-Wert < 5 (z.B. Säfte, Nektare, Fruchtsaftgetränke,

Limonaden), zusätzl. Unterteilung in (nicht-)karbonisierte Produkte

5. klare Getränke mit pH-Wert < 5 (z.B. Limonaden, Brausen) und Spülwasserproben,

zusätzl. Unterteilung in (nicht-)karbonisierte Produkte

6. empfindliche Getränke mit pH-Wert > 5 (z.B. Gemüsesaft, Gemüsetrunk,

Mischgetränke)

7. Wasserproben.

In diese Kategorien lassen sich alle Getränkegattungen, wie sie in Abbildung 2 dargestellt

sind, einordnen. Bei den angewandten Verfahren handelt es sich um das klassische SSL-

Verfahren, bei dem nach einer Voranreicherung ein Teil der Flüssigkultur auf OFS-Agar

ausgegossen oder eine direkte Anzucht auf OFS vorgenommen wird, und die

Membranfiltration, bei der der Filter schließlich submers bzw. anaerob inkubiert wird

(Baumgart et al. 2012). Das eingesetzte Probevolumen und das Probe-Medium-Verhältnis

variieren beim SSL-Verfahren (20 bis 100 ml Probe zu 50 ml Medium) (Baumgart et al.

2012). Die Anreicherungsdauer beträgt drei bis sieben Tage. Mit der Unterscheidung von

Hefe- und Schimmelpilzen gehen auch verschiedene Richtwerte der mikrobiellen Belastung

einher. In einigen Produktgruppen ist eine geringe Hefekeimzahl erlaubt, während die

Abwesenheit von Schimmelpilzen gefordert ist. Die Richtwerte sind dabei auf das jeweilige

Endprodukt abgestimmt: so sollten CO2-freie Getränke grundsätzlich keimfrei sein, um ein

mikrobielles Wachstum im zuckerhaltigen Milieu auszuschließen, während in CO2-haltigen

Getränken aufgrund der wachstumsunfreundlichen Umgebung (Sauerstoffmangel, Säure

etc.) ein Richtwert von 10 Zellen/Sporen in 10 ml Probe angegeben ist (Baumgart et al.

2012). Das bisherige Standardverfahren für Schimmelpilze in alkoholfreien Getränken bedarf

einer sehr langen Inkubationszeit.

4 DISKUSSION

88

Mit der hier beschriebenen Probenaufarbeitung sollte ein vereinfachtes Verfahren zur

Detektion von Pilzen in alkoholfreien Getränken und deren flüssige Einsatzstoffe entwickelt

werden. Mit einer klaren Unterteilung in filtrierbare und nicht-filtrierbare Flüssigkeiten wurde

der Ausgangspunkt für zwei Systeme gelegt, die letztlich in einer identischen Aufarbeitung

münden. Der entwickelte PCR-Assay ermöglicht keine Identifikation von Pilzspezies, so dass

eine Unterscheidung von Hefen und Schimmelpilzen nicht möglich ist. Demzufolge können

die von Baumgart gelisteten Richtwerte nicht adaptiert werden (Baumgart et al. 2012).

Vielmehr ist der jeweils niedrigere Richtwert zu wählen und auf das Produkt anzuwenden,

um eine Erfüllung der Kriterien zu gewährleisten. Damit wird zudem ein weiterer Schritt zur

Reinheit des Produktes vorgenommen.

Stille Wässer und stille Mineralwässer mit Frucht werden einem Filtrationssystem zugeführt,

welches im Unternehmen entwickelt wurde. Dieses ermöglicht die parallele Untersuchung

von bis zu 12 Proben á 100 ml. Die Proben werden in sterile Schottflaschen umgefüllt,

welche mit einer Absaugeinheit verbunden sind. Mittels einer Pumpe wird die Flüssigkeit aus

der Flasche in einen Abfallbehälter befördert, wobei sie jeweils einen Filter mit 0,2 µm

Porengröße passiert. Der Filter wird anschließend aus dem Filterhalter unter sterilen

Bedingungen entnommen und direkt der Probenaufarbeitung zugeführt. Beim Einbringen in

das StarPrepTwo-Gefäß ist darauf zu achten, dass die Filteroberseite mit den potentiellen

Mikroorganismen ins Gefäßinnere zeigt, damit eine vollständige Benetzung dieser mit der

Reagent-D-Reagenz gewährleistet ist. Bei der Zugabe des Farbstoffs kann der Filter auch

mit der Flüssigkeit abgespült werden. Während der Dunkelinkubation sollte das Gefäß

regelmäßig gewendet werden, um die Benetzung aufrechtzuerhalten. Nach der Photolyse

erfolgen die mechanisch-thermische DNA-Extraktion sowie die PCR-Analytik. Mit dieser

Untersuchungsmethode kann ein großes Probevolumen ohne vorherige Verdünnungsschritte

analysiert werden. Damit ist der Nachweis von sehr kleinen Keimbelastungen möglich. So

konnten unter Einsatz einer dekadisch verdünnten Aspergillus-brasiliensis-

Sporensuspension selbst 1,5x101 KBE in 100 ml Volumen vollständig wiedergefunden

werden. Mittels Korrelation der Verdünnungsreihe mit einer Standardkurve des

Positivkontrollplasmids über den Multiple-Experiment-Analysis-Modus der Stratagene-

Software MxPro, der den Vergleich verschiedener PCR-Läufe ermöglicht, konnten die

Quantifizierung und der Vergleich zur mikrobiologischen Anzucht erfolgen. Diese hat

bestätigt, dass beide Verfahren vergleichbare Resultate hervorbringen. Unter Einhaltung der

beschriebenen Vorgehensweise tritt kein messbarer Verlust an Probematerial ein, z.B. durch

das Hängenbleiben am Filter, so dass aussagekräftige Ergebnisse in der PCR erhalten

werden. Dieses Verfahren ist somit zur quantitativen, aber auch zur qualitativen Analyse

geeignet und könnte auch für Limonaden und Brausen vor der Karbonisierung durchgeführt

werden.

4 DISKUSSION

89

Nicht-filtrierbare Flüssigkeiten wie Zuckersirupe, Fruchtkonzentrate oder Pürees werden dem

zweiten Verfahren zugeführt, bei dem insgesamt weniger Probevolumen analysiert und das

Produkt je nach Anforderung zunächst vorangereichert wird. Eine Voranreicherung wird in

den Fällen durchgeführt, in denen die mikrobielle Reinheit des Produktes bestätigt werden

muss. Dies ist nach Baumgart für die Gruppen der konservierten Halbwaren (1), der

fruchttrüben (4) und klaren Getränke (5) sowie der empfindlichen Getränke (6) der Fall

(Baumgart et al. 2012). Für die Voranreicherung kann SSL-Medium, aber auch ein anderes

geeignetes Medium wie z.B. YM herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die

Anreicherung mit SSL vorgenommen. Da es sich häufig um viskose, farbintensive oder mit

Schwebstoffen (z.B. Fruchtfleisch) versetzte Flüssigkeiten handelt, wird mit der Zugabe zum

Medium auch ein erster Verdünnungsschritt erzielt. Die Inkubation sollte – in Abhängigkeit

vom erwarteten Organismus – bei 27-30°C für 24h erfolgen. Ein Versuch mit 7

verschiedenen Brauereieinsatzstoffen (z.B. Apfel- und Colagrundstoff) hat zeigen können,

dass eine Dotierung mit 2 KBE der Hefe Saccharomyces cerevisiae bereits nach 24 h

eindeutig nachweisbar ist. Die genaue Auswertung der Agarplatten war aufgrund der hohen

Koloniezahlen nicht möglich. Vor dem Einbringen in die PCR wurden die Lysate nochmals

1:10 verdünnt, um Inhibitionen der Reaktion zu vermeiden. Durch diesen zusätzlichen

Verdünnungsschritt muss eine Probe mit mindestens 500 KBE kontaminiert sein, damit der

LOD von 1,56 GÄ erreicht und eine eindeutig positive Aussage erzielt werden kann7. In

Proben, die nicht zusätzlich verdünnt werden müssen, z.B. kohlensäurehaltige Wässer, wird

bei 50 KBE je Aufarbeitung (je 100µl) der Befall eindeutig identifiziert.

Diejenige Zeit, die benötigt wird, um eine potentielle Kontamination eines Produktes soweit

fortschreiten zu lassen, dass sie in der PCR detektiert wird, ist vom Keim und dem

umgebenden Milieu abhängig. Ein Versuch mit 4 verschiedenen Hefen (S. cerevisiae, Z.

bailii, Y. lipolytica und C. parapsilosis) und 3 Matrices (Bananennektar, Johannisbeer- und

Multivitaminfruchtsaftkonzentrat) konnte die kurze Anreicherungsdauer von S. cerevisiae

nochmals bestätigen (1x100 bis 4x10

0 KBE in 100ml). Yarrowia lipolytica ließ sich bei einem

Dotierungslevel von 101 KBE in allen Matrices ebenfalls nach 24 h nachweisen. Candida

parapsilosis wuchs in Johannisbeerfruchtsaftkonzentrat etwas verlangsamt: nach 24 h

konnte nur die mikrobielle Anzucht die Kontamination anzeigen. Mit gezählten 250 KBE trat

hier der soeben beschriebene Effekt ein: durch den zusätzlichen Verdünnungsschritt reicht

die in die PCR gelangende DNA-Menge nicht mehr aus, um eine Kontamination anzuzeigen,

da die Detektionsgrenze unterschritten wurde. Inwieweit gestresste Keime angereichert

werden können, lässt sich anhand des Keims Z. bailii in diesem Versuch erkennen: die bei

7 Befinden sich 500 KBE in einem StarPrepTwo-Gefäß mit 640 µl Gesamtvolumen, entspricht dies

0,8 GÄ/µl. Eine 1:10-Verdünnung ergibt 0,08 GÄ/µl. Mit 25µl PCR-Volumen gelangen rechnerisch 2 GÄ in die Reaktion.

4 DISKUSSION

90

4°C gelagerte Stammkultur der Hefe zeigt sehr langsames Wachstum in der Anreicherung

unter optimalen Bedingungen. In der PCR kann der Keim nur in 2 von 6 Proben

nachgewiesen werden, während die mikrobielle Anzucht bei allen dotierten Proben

Koloniewachstum bestätigt. Allerdings betrug die Inkubation bis zur Auswertung der Platten

eine Woche, was für Hefen ein ungewöhnlich langer Zeitraum ist. In vorhergehenden

Experimenten waren die Hefekolonien von Z. bailii nach 1-2 Tagen bereits gut auswertbar.

Die lange Inkubationszeit unterstützt demnach die Annahme einer gestressten Kultur. Es ist

denkbar, dass die Zellen geschädigt waren und bei der Lebend/Tot-Differenzierung den

Farbstoff ins Zellinnere aufnahmen, wodurch ihre DNA nicht mehr amplifizierbar war. Hier

stößt die PCR-Analytik an ihre Grenzen, da sich die Zellen z.B. nach der Sterilisation in der

PCR nicht nachweisen ließen, aber die Gefahr besteht, dass sie sich über einen längeren

Zeitraum im nährstoffreichen Milieu des Produktes regenerieren und später auch

reproduzieren können. Genau dies tritt bei der Voranreicherung ein, wodurch die Zellen nach

dem Ausplattieren und der weiteren Inkubation unter optimalen Bedingungen anhand des

Koloniewachstums nachweisbar sind. An dieser Stelle können schließlich nur die

regelmäßige Produktkontrolle über einen definierten Zeitraum, bevor das Produkt in den

Handel gelangt, oder eine stufenweise Hitzeinaktivierung der Keime den Nachteil der

Lebend/Tot-Differenzierung ausgleichen. Der Versuch zur Sporeninaktivierung (Kapitel 3.10

und 4.4) hat allerdings aufgezeigt, dass auch die Mikrobiologie falsche Abbilder der

Kontamination nach einer Sterilisationsmaßnahme darstellen kann. Hier wurde die

hitzeinaktivierte Sporensuspension direkt ausplattiert, wodurch die Sporen nicht in die

Regenerationsphase eintraten und demnach auch unter den angegebenen

Inkubationsbedingungen keine Kolonien wuchsen. Die Kombination des SSL-Verfahrens mit

der entwickelten DNA-Extraktionsmethode führt zu einer enormen Zeitersparnis, die ein

frühzeitiges Eingreifen in den Produktionsprozess ermöglicht.

Die Wiederfindungsrate dieser zweiten Aufarbeitungsmethode wurde durch die Dotierung mit

1x104 KBE (S. cerevisiae) mit den 7 Brauereieinsatzstoffen, die bereits in SSL-Medium

verdünnt wurden, untersucht. Ein direktes Überführen in die PCR nach der Lyse ermöglichte

nur bei den klaren Flüssigkeiten (Zitronenaroma, Vitaminmischung und Invertzucker) den

Nachweis des Keims. Wurden die Lysate wiederum verdünnt in die PCR eingesetzt, konnte

bei allen Matrices die Hefe detektiert werden. Sehr trübe oder dunkle Einsatzstoffe und

Halbwaren sollten demnach immer 1:100 verdünnt (1:10 in Medium sowie nochmals 1:10 in

die PCR) der PCR-Reaktion zugeführt werden, um Inhibitionen auszuschließen.

Sowohl PCR-Mastermix als auch StarPrepTwo-Reagenz enthalten Stoffe, die der

Vermeidung von Inhibitionen dienen. Der Lysepuffer enthält Chelex® 100, ein

Styrendivinylbenzen-Copolymer mit Iminodiacetationen, welches aufgrund seiner hohen

Affinität zu polyvalenten Metallionen diese binden kann (BIO-RAD Laboratories Instruction

4 DISKUSSION

91

Manual). Zudem zeichnet sich das Chelex-Harz durch eine hohe Alkalinität aus, welches

während der thermischen Lyse zur Destabilisierung der Zellmembran führt und gleichzeitig

die DNA vor Degradation schützt (Walsh et al. 1991; Möhlenhoff et al. 2001). Um

freiwerdende Phenole, die einer Studie von Mullen zufolge vor allem in Trauben-,

Granatapfel-, Moosbeeren- und trübem Apfelsaft vorkommen, effektiv abzufangen, enthält

der Lysepuffer zudem Polyvinylpolypyrrolidon (Abkz. PVPP) (Mullen et al. 2007; Demeke

und Jenkins 2010). Phenole können mit Magnesiumionen, die als Cofaktoren für die DNA-

Polymerase dienen und damit für die Enzymaktivität grundlegend sind, Komplexe bilden,

was zu Inhibitionen oder dem Ausfall der PCR-Reaktion führen kann (Wilson 1997). Der

PCR-Reaktionsmix beinhaltet außerdem bovines Serumalbumin (Abkz. BSA), welches

ebenfalls die von Phenolen ausgehenden Inhibitionen vermindern kann (Garland et al. 2010).

Mit diesen drei Reagenzien ist das System, das in sehr dunklen Matrices aufgrund des

notwendigen Verdünnungsschritts an Sensitivität verliert, robust. Anhand der

implementierten Amplifikationskontrolle des PCR-Reaktionsmixes können auftretende

Inhibitionen erkannt werden. Es ist denkbar, dass die Zentrifugation der Probe und die

Abnahme des Überstandes vor Zugabe des StarPrepTwo-Puffers eine Verringerung bzw.

Beseitigung der inhibitorischen Effekte mit sich brächte. Allerdings geht mit dieser

Vorgehensweise die erhöhte Gefahr der Kreuzkontamination einher. Mit dem derzeitigen

Verfahren muss das Probegefäß nur einmalig für die Zugabe der Probe und des Reagent-D

geöffnet werden.

Das vorliegende Verfahren nutzt das Prinzip der mechanisch/thermischen Lyse, bei dem die

Zellen zunächst durch Kugeln aufgebrochen werden. Die Effizienz des Aufschluss ist dabei

abhängig von der Kollisionsrate und der Aufprallenergie – beides ist abhängig von der

Geschwindigkeit – sowie der Schwere des Kugelmaterials (Müller et al. 1998; Klimek-Ochab

et al. 2011). Pilzzellwände bestehen aus mehreren Schichten quervernetzter Chitin-, β-

Glucan-, Lipid- und Peptidmoleküle, wodurch sie widerstandsfähiger sind als die

Zellmembranen aus Lipiddoppelschichten anderer Organismen (Karakousis et al. 2006). Da

in den Produkten vorwiegend vegetative Zellen und Sporen vorkommen, konnten die

StarPrepTwo-Beads (0,1 mm) gewählt werden, die eine möglichst große Kollisionsfläche

schaffen. Um alle Zellen/Sporen aufzuschließen, wurde bei Verwendung des MagNA Lysers

die höchste Umdrehungsgeschwindigkeit eingestellt. Bei der Extraktion intrazellulärer

Bestandteile (Proteine, DNA etc.) aus Schüttelkulturen oder festen Nährmedien werden

dagegen großflächig verzweigte Konidien und Hyphen zersetzt, so dass eher größere und

dementsprechend schwerere Beads eingesetzt werden (Klimek-Ochab et al. 2011).

Die thermische Lyse unterstützt den mechanischen Aufschluss und führt zur Denaturierung

der freiwerdenden Proteine. DNA-abbauende Enzyme wie DNasen würden sonst die

Kontamination in der PCR falsch abbilden. Neben den wenigen Prozessschritte, dem

4 DISKUSSION

92

geringen Material-, Geräte- und Arbeitsaufwand zeichnet sich das Verfahren durch seine

Effizienz für Hefen und Schimmelpilzen (quantitative Bestimmung für Sporen und vegetative

Zellen, qualitative Bestimmung für Hyphen) aus.

Neben dem hier vorgestellten Verfahren existieren natürlich eine Reihe anderer

Aufschlussmethoden. Karakousis et al. haben in einer Studie die Effizienz verschiedener

Methoden anhand einiger Pilzspezies u.a. mikroskopisch verglichen (Karakousis et al. 2006).

Sie konnten zeigen, dass die Effizienz einer Lyse mit den zellwandabbauenden Enzymen

Proteinase K bzw. Lyticase morphologieabhängig ist: in Spezies, die vorwiegend in

Konidienform vorliegen (hier: A. fumigatus), werden nur 10% der Kultur aufgeschlossen,

während hefeartige Zellen (hier: C. albicans) bis zu 100% lysiert werden können.

Reproduzierbare Resultate können somit nicht erzielt werden. Bereits Müller konnte

feststellen, dass die Konidien filamentöser Pilze häufig resistent gegen den enzymatischen

Aufschluss sind (Müller et al. 1998). Enzyme bedürfen zudem einer langen Inkubationszeit,

wodurch sich der Zeitaufwand erhöht. Sie eignen sich daher lediglich als Hilfsstoffe anderer

Extraktionsmethoden (Karakousis et al. 2006). Chemische Aufschlussmethoden mit Säuren

bzw. Laugen sind ebenfalls zeitintensiv und für hohe Probenaufkommen ungeeignet. Zudem

besteht die Gefahr von DNA-Schädigungen (z.B. Depurinierung, Degradierung), welches die

Quantifizierung negativ beeinflusst (Karakousis et al. 2006). Eine Kombination aus flüssigem

Stickstoff und dem mechanischen Aufschluss mittels Mörser und Pistille mit anschließender

Phenol-Chloroform-Fällung zeigt sehr gute Resultate für Konidien und Hyphen (bis 100%

Lyseeffizienz) (Karakousis et al. 2006). Allerdings ist dieses Verfahren nur für größere

Probevolumina (z.B. Kulturen aus Fermentern) und geringen Probezahlen anwendbar. Die

Phenol-Chloroform-Extraktion, die der Ausfällung der störenden Proteine dient, muss

zwingend unter einem Laborabzug durchgeführt werden, da Phenol zu starken Reizungen

der Atemwege führen kann und Chloroform betäubend wirkt. Die Entsorgung organischer

Lösungsmittel ist aufwendig und teuer (Mülhardt 2009). Zudem müssen Mörser und Pistille

nach jeder Extraktion aufwendig gereinigt werden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

In den letzten Jahren wurden vermehrt DNA-Extraktionsverfahren aus schwierigen Matrices

mit Einsatz von Magnetic Beads entwickelt (Mülhardt 2009). Sie spielen vor allem im Bereich

der Laborautomation eine große Rolle, können aber auch händisch als Einzelreaktion

angewandt werden. Die paramagnetischen Kugeln können sich frei in der Lösung bewegen

und freiliegende DNA über ihre positive Ladung an sich binden (Mülhardt 2009). Führt man

einen Magneten an die Gefäßwand, werden die beladenen Beads an dieser Stelle

konzentriert, so dass Waschschritte ohne Verlust an Kugeln mehrfach durchgeführt werden

können. Nach Zugabe eines Elutionspuffers wird die DNA in den Puffer abgegeben, wobei

ein geringer Anteil an den Kugeln verbleiben kann. Der Verlust beträgt in – ähnlich wie bei

Silica/Glasmilch-Membranen - etwa 5-10%, kann aber durch die Menge an eingesetzten

4 DISKUSSION

93

Kügelchen verringert werden (Mülhardt 2009). Magnetic Beads sind wesentlich teurer als

einfache Kügelchen und benötigen spezielle, magnetische Reaktionsgefäßständer. Für die

Laborautomation sind zudem Roboter notwendig, deren Anschaffung nicht für jedes Labor

rentabel ist. Es ist jedoch möglich, dass unter Verwendung dieser Methode eine bessere

Sensitivität in den dunklen, trüben Probenmatrices erzielt werden könnte, da die gebundene

DNA mehreren Reinigungsschritten zugeführt werden könnte. PCR-inhibierende Stoffe

können damit beseitigt werden.

Im Vergleich zu den aufgeführten Verfahren ist das entwickelte Probenaufarbeitungssystem

durch seine zeitsparende und einfache Handhabung, den geringen Gerätebedarf und dem

geringen Kostenaufwand hervorzuheben. Die Gefahr von Kreuzkontaminationen ist auf ein

Minimum reduziert worden. Das System ist robust und auch in Anwesenheit einer hohen

Konzentration von Begleitorganismen stabil.

4.6 Ausblick

Mit dem Real-time-PCR-Assay und dem Probenaufarbeitungssystem inklusive Lebend/Tot-

Differenzierung kann ein Nachweis von lebensfähigen Pilzen in alkoholfreien Getränken

erzielt werden. Die DNA-Extraktion kann dabei individuell angepasst werden: die Dauer der

Anreicherungsphase kann in Hinblick auf sehr langsam wachsende Keime verlängert bzw.

für sehr schnell wachsende Hefen verkürzt werden; das Filtrationsvolumen kann

herabgesetzt werden. Das entwickelte Extraktionsprotokoll kann als Grundgerüst für die

Adaption auf weitere Lebensmittelmatrices dienen. So kann das Verfahren für den Nachweis

von Pilzen in Milch-, Fleisch- und Fischerzeugnissen sowie Getreideprodukten ausgeweitet

werden. Insbesondere schwierige Matrices, bei denen eine PCR-Inhibition auftreten kann,

sollten mit automatischen Systemen aufgearbeitet werden. Dies führt zu einem geringeren

Arbeitsaufwand und kann in einer Sensitivitätssteigerung münden. Es ist denkbar, dass die

Anreicherungszeit nochmals reduziert werden könnte.

Um das universelle Nachweisverfahren als solches bestätigen zu können, müssen

fortlaufend relevante Keime mit dem Real-time-PCR-Assay untersucht werden. Eine

Optimierung der Primer- und Sondensequenzen kann notwendig sein, sofern ein

Verderbsorganismus mit den bisherigen Oligonukleotiden wiedererwartend nicht identifiziert

werden sollte. Weiterhin besteht die Möglichkeit, das System auf weitere

Organismusgruppen zu erweitern. Ein universelles Gesamtnachweissystem für Pilze und

Bakterien ist denkbar: eine Quantifizierung und Identifikation könnte über verschiedene

Fluoreszenzfarbstoffe realisiert werden.

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§64 LFGB L 00.00-138 – Untersuchung von Lebensmitteln: Leistungsmerkmale zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

§64 LFGB L 00.00-139 – Untersuchung von Lebensmitteln: Leistungsmerkmale zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von pathogenen Mikroorganismen in Lebensmitteln mit der Real-time-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

MANUALS

BIO-RAD Laboratories: Chelex® 100 and Chelex 20 Chelating Ion Exchange Resin – Instruction

Manual; Download: 04.05.2014

ANHANG

XXV

ANHANG

I. Alignment der 28S-rDNA-Sequenzen repräsentativer Pflanzen von Position 120-

1080 unter Angabe der Primerpositionen

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

125 135 145 155 165 175

M11585O.sativa GCGCGACCCC AGGTCAGGCG GGACTACCCG TCCGAATTGT AGTCTGGAGA GGCGTCCTCA

AY049041T.aest TGAG------ AATCGGGCGG CTGTGCC--G TCCGAATTGT AGTCTGGAGA GGCGTCCTCA

AY686777H.lupu --AG------ AATCGGACGT CTTCGGC--G TTCGAATTGT AGTCTGAAGA AGCGTCCTCA

AY189058D.caro TGAA------ AATTGAGCAG CTACGCT--G TTCAAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTGTTCA

AY727975C.sine TGAA------ AATCGAGCGA CCCCGTCG-- TTCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

AY177420C.aura TGAA------ AATCGGGCGC CCCCGGCG-- TCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

X05910C.lemon TGAA------ AATCGGGCGC CCCCGGCG-- TCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

AF479108C.pepo TGAG------ AATCGGGCGC CCTCGGCG-- TTCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

EF135611E.coca TGAG------ AATCGGATGC CCCTGGTG-- TTCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

X58118F.anana TGAG------ AATCTGGCGC CGCCGCG--T GCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

AF479172N.taba TTAG------ AATCGGGCGG CTCCGCC--G TTCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

EU161982S.lyco TTAG------ AATCGGGCGG CTCCGTC--G TCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

DQ122982P.edul TGAG-A---- -ATCGGGCGC CCCCGGCG-- TCCGAATTGT AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------T AGTCTGGAGA AGCGTCCTCA

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

185 195 205 215 225 235

M11585O.sativa GCG-ACGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTAG AAAGGGGCGC CTGGGAGGGT GAGAGCCCCG

AY049041T.aest GCG-ACGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAGGGGCGC CTGGGAGGGT GAGAGCCCCG

AY686777H.lupu GCG-GCGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAGGGGCGC CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG

AY189058D.caro GTG-ACGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAGGGGTCGC CAGAGAGGGT GAGAGCCCCG

AY727975C.sine GCG-GCGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAGGGGCGC CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG

AY177420C.aura GCG-GCGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAG-GGCGG CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG

X05910C.lemon GCG-GCGG-A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAAG-GGCGG CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG

AF479108C.pepo GCG-ACGG-A CCGGGCACAA GTCC-CCTGG AAGGGGGCGC CAGAGAGGGT GAGAGCCCCG

EF135611E.coca GCG-GCGG-A CCGGGCTCAA GTCC-CCTGG AAGGGGGCGC CGGAGAAGGT GAGAGCCCCG

X58118F.anana GCGTACGGTA TCGGGAACAA CTCCC--TGG AA--GGGCGC CGCAGAGGGT GAGACCCCCC

AF479172N.taba GCGGCGG--A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAGGGGGCGC CAGAGAGGGT GAGAGCCCCG

EU161982S.lyco GCGGCGG--A CCGGGCCCAA GTCC--CTGG AAGG-GGCGC CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG

DQ122982P.edul GCGGCGG--A CCGGGCCCAA GTCC-CCTGG AAGGGGGCGC CGGAGAGGGT GAGAGCCCCG

VegFw1 GC-------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

245 255 265 275 285 295

M11585O.sativa TCCG-GCCCG GAC--CCTGT CGCCCCACGA GGCGCCGTCA ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA

AY049041T.aest TCCG-GCCCG GAC--CCTGT CGCCCCACGA GGCGCCGTCA ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA

AY686777H.lupu T-CGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCG GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA

AY189058D.caro T-CGTGCCCG GAC--CCTGT TGCACCACGA GGCGCTGTCT ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA

AY727975C.sine T-CGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCC GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA

AY177420C.aura T-CGCGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA

X05910C.lemon T-CGCGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA

AF479108C.pepo T-TGCGCTCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCA ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA

EF135611E.coca T-CGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA

X58118F.anana GTTGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCG GCGAGTCGGG TTGTTTGGGA

AF479172N.taba T-TGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA

EU161982S.lyco T-CGTGCCCG GAC--CCTGT CGCACCACGA GGCGCTGTCT ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA

DQ122982P.edul T-CGTGTCCG GACC--CTGT CGCATCACGA GGCGCTGTCT ACGAGTCGGG TTGTTTGGGA

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

305 315 325 335 345 355

M11585O.sativa ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TAAACTCCGT CC-AAGGCTA AATACAGGCG AGAGACCGAT

AY049041T.aest ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TAGACTCCGT CC-AAGGCTA AATACAGGCG AGAGACCGAT

AY686777H.lupu ATGCAGCCCC AATCGGGCGG TAAATTCCGT C-CAAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT

AY189058D.caro ATGCAGCCCC AATCGGGCGG TAAATTCCGT C-CAAGGCTA AATACAGGCG AGAGACCGAT

AY727975C.sine ATGCAGCCCT AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT

AY177420C.aura ATGCGGCCCA AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT

X05910C.lemon ATGCGGCCCA AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT

AF479108C.pepo ATGCAGCCCC AATCGGGCGG TAAATTCTGT CC-AAGGCTA AATATGGGCG AGAGACCGAT

EF135611E.coca ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT

X58118F.anana ATGCAGCCCC AATAGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT

AF479172N.taba ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TGAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGACCGAT

EU161982S.lyco ATGCAGCCCA AATCGGGCGG TGAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACTGGCG AGAGACCGAT

DQ122982P.edul ATGCAGCCCC AATCGGGCGG TAAATTCCGT CC-AAGGCTA AATACGGGCG AGAGGCCGAT

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

ANHANG

XXVI

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

365 375 385 395 405 415

M11585O.sativa AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

AY049041T.aest AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

AY686777H.lupu AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

AY189058D.caro AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

AY727975C.sine AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

AY177420C.aura AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

X05910C.lemon AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

AF479108C.pepo AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAATAGT

EF135611E.coca AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAACAGT

X58118F.anana AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

AF479172N.taba AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

EU161982S.lyco AGCGAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

DQ122982P.edul AGCAAACAAG -TACCGCG-A GGGAAAGATG AAAAGGACTT TGAAAAGAGA GTCAAAGAGT

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

425 435 445 455 465 475

M11585O.sativa GCTTGAAATT GCCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT G--CCCCGGC

AY049041T.aest GCTTGAAATT GCCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGC

AY686777H.lupu GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCTCCGGT

AY189058D.caro GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GATCGGCGAT GCGCCCCGGT

AY727975C.sine GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCTGGCGAT GCGCCCCGGT

AY177420C.aura GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT

X05910C.lemon GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT

AF479108C.pepo GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GTGCTCCAGT

EF135611E.coca GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGAA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCTCGGT

X58118F.anana GCTTGAAATT GTCGGGAGGG CAAAGCC--- -G-----ATG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT

AF479172N.taba GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT

EU161982S.lyco GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- -T-----GGG GGCCGGCGAT GCGCCCCGGT

DQ122982P.edul GCTTGAAATT GTCGGGAGGG AAGCGGA--- ------TGGG GGCCGGCGAT GCGTCCCGGT

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

485 495 505 515 525 535

M11585O.sativa CGTATGC-GG AACGGCTTCG -GCTG-GTCC GTCGATCGGC TCGGGGCGTG GACTGTTGTC

AY049041T.aest CGTATGC-GG AACGGC--TC TTGCTGGTCC GCCG-----C TCGGNNNNNN NNNNNNNNNN

AY686777H.lupu CGGATGT-GG AACGGTGA-G AGCCG-GTCC GCCGATCGAC TCGGAGCGCG GACCGATGCG

AY189058D.caro CGGATGT-GG AACGGTGTCA AGCCG-GTCT GCCGATCGAC TCGGGGTGTG GACCTGTGCG

AY727975C.sine CGGATGT-GG AACGGCGTCC AGCCG-GTCC GCCGATCGAC TCGGGGCGTG GACCGGTGCG

AY177420C.aura CGGATGC-GG AACGGCGA-G AGCCG-GTCC GCCGATCGGC TCGGGGCGCG GACCGATGCG

X05910C.lemon CGGATGC-GG AACGGCGA-G AGCCG-GTCC GCCGATCGGC TCGGGGCGCG GACCGATGCG

AF479108C.pepo CGGATGT-GG AAAGGTGATA AGCCA-GTCC GCCAATCGAC TTGGGGCATG GACCGATGCG

EF135611E.coca CGGATGC-GG AACGGCGA-G AGCCG-GTCC GCCGATCGGC TCGGGGCGTG GACCGACGCG

X58118F.anana CGGATGT-GG AACGGTCAC- AGCCG-GTCC GCCGCTCGAC TCGGGGCGTG GACCGTTGCG

AF479172N.taba CGGATGT-GG AACGGTGACG AGCCG-GTCC GCCGATCGAC TCGGGGCGTG GACCAGCGTG

EU161982S.lyco CGGATGT-GG AACGGCGACG AGCCG-GTCC GCCGATCAGC TCGGGGCGTG GACCAGCGTG

DQ122982P.edul CGGATGC-GG AACGGCGAC- AGCCG-GTCT GCCGATCGGC TCGGGACGTG GACCGGTGCG

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

545 555 565 575 585 595

M11585O.sativa CGGC---CGC GCCGGCGGCC AAAGCCCGGG GGCTC--CGC GCCCCCGGCA GCCGTCGTC-

AY049041T.aest NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNG CCGTCGTCGG

AY686777H.lupu GA---TTGGG GGGGCGGCCC AAGCCCGGGC TGTTGATA-T GCCTGTGGAG ATGTCGTCCC

AY189058D.caro GA---TTGGT GCGGCGGCCA AAGCCCGGGT TGTAGATA-C GCCTGTGGAG ACGCCGTCGC

AY727975C.sine GA---TCGGG GCGGAGGCCA AAGCCCGGGC AGTCGAAA-A GCCCGCGGAG ACGCCTTCGC

AY177420C.aura GA---TTGCG GCGGCGGCCC AAGCCCGGGC CTTCGATA-A GCCTGTGGAG ACGTCGTCAC

X05910C.lemon GA---TTGCG GCGGCGGCCC AAGCCCGGGC CTTCGATA-A GCCTGTGGAG ACGTCGTCAC

AF479108C.pepo GA---TTGAG ACGGCGGCCA AAGCCCAGGC CTTTGTTA-C GCTTGTGGAG ACGTCGTCGT

EF135611E.coca GG---TTGCG GGGGCGTCCC AAGCCCGGGC CTTTGATA-C GCCCGTGGAG ACGTCGCCCT

X58118F.anana GA---TTGCG GCGGCGGCCA AAGCCCGGGC TGTCGACATG --CCGTGGAG ACGTCGTCGA

AF479172N.taba GA---TTGGG GGGGCGGCCA AAGCCCGGGC TTTCGATAC- GCCCGTGGA- ACGCCGTCTC

EU161982S.lyco GA---TTGGG GGGGCGGCCA AAGCCCGGGC TCTCGATAC- GCCCGTGGA- ACGCCGTCTC

DQ122982P.edul GA---TCGGG GCGGCGGCCC AAGCCCGGGC TCTCGATA-C GCCCGCGGAC ATGCCGTCTC

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

605 615 625 635 645 655

M11585O.sativa ---GGACGCA GCCGGTCACC GCGCGCCTCT ---GGCCGGC CCCTCGGGGC GTCGCGCC--

ANHANG

XXVII

AY049041T.aest CACGGCCGGT ACC------- -CGCGCGCCG AAAGGCGTGC CCCTCGGGGC ACTGCGCTG-

AY686777H.lupu CTCGATTGTG GAATACAG-C GCGCGCCG-T CTCGGCGTGC TTC---GGCA TCTGCGCGCT

AY189058D.caro GTCAATTGTG GTTGGCA--- GCACGCGCCT CTTGGCGTGC CT---CGGCA TCTGCGTGCT

AY727975C.sine CCCGATCGTG GCTGGCA--- GCGCGCGCCC TCGGGCGTGC TCC---GGCA TCTGCGCGCT

AY177420C.aura CGCGATCGTG GCTGGCA--- GCGCGCGCCT TCGGGCGTGC TTC--GCGCA CCTGCGCGCT

X05910C.lemon CGCGATCGTG GCTGGCA--- GCGCGCGCCT TCGGGCGTGC TTC--GCGCA CCTGCGCGCT

AF479108C.pepo CCCGATCGTG GCTGGCA--- GCACGCGCCT TTTGGCGTGC TTC---GGCA TCTGCGTGCT

EF135611E.coca CGCGATCGTG GAACACA--- GCGCGCGCCT TTGGCGCTCA C------GCA ---GCGCGCT

X58118F.anana CGCGATCATG GCTGGCA--- GCGCGCGCCT TCGGGCCTGC CTC---GCGA CCTGCGTGCT

AF479172N.taba CTTGATTGTG GTAGGCA--- GCGCGCGCCT CC-GGCGTGC TTC---GGCA TCTGCGCGCT

EU161982S.lyco CCCGATTGTG GAAGGCA--- GCGCGCGCCT CC-GGCGTGC TTC---GGCA TCTGCGCGCT

DQ122982P.edul CCCGATCGTG GATGGCAG-C GCGCGC-CGT CACGGCGTGC CTC---GGCA CCTGCGCGCT

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

665 675 685 695 705 715

M11585O.sativa ----GCAACG GCCTGCGGGC TCCC-CATCC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

AY049041T.aest -----CAACG CCCTGCGGGC TCCC-CATCC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

AY686777H.lupu CCAGGCATCG GCCTGCGGGC TCCC-CATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

AY189058D.caro CCTGGCACAG GCCTGCGGGT TCCC-CATTC GGCCCGTCTT GAA-CACGGA CCAAGGAGTC

AY727975C.sine CCCGGCGCCG GCCTGCGAGC TCCC-CATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

AY177420C.aura CCCGGCATCG GCCTGCGGGC TCCCCCATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

X05910C.lemon CCCGGCATCG GCCTGCGGGC TCCCCCATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

AF479108C.pepo CCTGGCATCG GCCTGTGGGC TCCC-CATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

EF135611E.coca CCTGGCGTCG GCCTGCGGGC TCCC-CATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

X58118F.anana CCTGGTAACG GC-TGCGGGC TCCCC-ATTC GGCCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

AF479172N.taba CCGGACGCTG GCCTGTGGGC TCCC-CATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

EU161982S.lyco CCGGACGCTG GCCTGTGGGC TCCC-CATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

DQ122982P.edul CCAGGCACCG GCCTGCGGGC TCCC-CATTC GACCCGTCTT GAAACACGGA CCAAGGAGTC

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

725 735 745 755 765 775

M11585O.sativa TGACATG-CG TGCGAGTCGA CGGGTTCTGA AACCTGGGAT GCGCAAGGAA GCTGACGAGC

AY049041T.aest TGACATG-CG TGCGAGTCGA CGGGTTCTGA AACCTGGGAT GCGCAAGGAA GCTGACGAGC

AY686777H.lupu TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCTAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGACTGGC

AY189058D.caro TGACATGT-G TGCGAGTCAA CGGGTGATTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGATTGGC

AY727975C.sine TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGACCGAC

AY177420C.aura TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCCAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGATTGGC

X05910C.lemon TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCCAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGATTGGC

AF479108C.pepo TGACATG-TG TGCGAGTTAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGACTGGT

EF135611E.coca TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCRYAAGGAA GCTGACTGGC

X58118F.anana TGACATGT-G TGCGAGTCAA CGGGTGATTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTAATGCGC

AF479172N.taba TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGTAAGGAA GCTGATTGGT

EU161982S.lyco TGACATG-TG TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGTAAGGAA GCTGATTGGT

DQ122982P.edul TGACATGT-G TGCGAGTCAA CGGGCGAGTA AACCCGTAAG GCGCAAGGAA GCTGACTGGC

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

785 795 805 815 825 835

M11585O.sativa GGGAGGCCCT CACG-----CCGCACCGCTGG CCGACCCTGA TCT-TCTGTG AAGGGTTCGA

AY049041T.aest GGGAGGCCCT CACG---GCC GCACCGCTGG CCGACCCTGA TCT-TCTGTG AAGGGTTCGA

AY686777H.lupu GGGATC--CC CTTGTGGGTT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA

AY189058D.caro GGGATCCCCC T--GTGGGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA

AY727975C.sine GGGATCCCCT CGCG---GTT GCACCGTCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA

AY177420C.aura GGGATCCCTC GC----GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA

X05910C.lemon GGGATCCCTC GC----GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA

AF479108C.pepo GGGATCCCTT TGTG--GGTT GCACCACCGA CCGACCTTGA TCT-TTTGAG AAGGGTTCGA

EF135611E.coca GGGATCCCCT CGTG--GGTT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TTTGAG AAGGGTTCGA

X58118F.anana GGGATCCCTT TAC---GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA

AF479172N.taba GGGATCCCCC TGAG--GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGTG AAGGGTTCGA

EU161982S.lyco GGGATCCCCT GA----GGGT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA

DQ122982P.edul GGGATCCCCT CCGAG-GGTT GCACCGCCGA CCGACCTTGA TCT-TCTGAG AAGGGTTCGA

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

845 855 865 875 885 895

M11585O.sativa GTTGGAGCAC GCC-TGTCGG --GACC--CG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

AY049041T.aest GTTGGAGCAC GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

AY686777H.lupu GTGAGAGCAT GCC-TGTCGG --GACC--CG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

AY189058D.caro GTGTGAGCAT TCC-TGTCGG --GACC--CG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

AY727975C.sine GTGCGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

ANHANG

XXVIII

AY177420C.aura GTGTGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

X05910C.lemon GTGTGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

AF479108C.pepo GTGTGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

EF135611E.coca GTGAGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

X58118F.anana GTGTGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

AF479172N.taba GTGTGAGCAT ACC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

EU161982S.lyco GTGTGAGCAT ACC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGC-GGGCG

DQ122982P.edul GTGAGAGCAT GCC-TGTCGG ----GACCCG AAAGATGGTG AACTATGCCT GAGCGGGGCG

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

905 915 925 935 945 955

M11585O.sativa AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCTCGA AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

AY049041T.aest AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCTCGA AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

AY686777H.lupu AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

AY189058D.caro AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

AY727975C.sine AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

AY177420C.aura AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

X05910C.lemon AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

AF479108C.pepo AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

EF135611E.coca AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

X58118F.anana AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTC

AF479172N.taba AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

EU161982S.lyco AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

DQ122982P.edul AAGCCAGAGG AAACTCTGGT GGAGGCCCGC AGCGATACTG ACGTGCAAAT CGTTCGTCTG

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

965 975 985 995 1005 1015

M11585O.sativa ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCATCTAG TAGCTGGTTC CCTCCGAA-G

AY049041T.aest ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCATCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

AY686777H.lupu ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCATCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

AY189058D.caro ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

AY727975C.sine ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

AY177420C.aura ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

X05910C.lemon ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

AF479108C.pepo ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

EF135611E.coca ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

X58118F.anana ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

AF479172N.taba ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

EU161982S.lyco AC--TTGGTA TAGG-GCGAA AGACTAATCG AACCGTCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

DQ122982P.edul ACT-TGGGTA TAGGGGCGAA AGACTAATCG AACCATCTAG TAGCTGGTTC CCTCCG-AAG

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

1025 1035 1045 1055 1065 1075

M11585O.sativa TTTCCCTCAG GATAGCT--G GAGCCCATTA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

AY049041T.aest TTTCCCTCAG GATAGCT--G GAGCCCATTA CGAGTTCTAT CAGGTAAAGC CAA-TGATTA

AY686777H.lupu TTTCCCTCAG GATAGCT-GG AGCTCGTAGA CGAGTTCTAT CAGGTAAAGC CAA-TGATTA

AY189058D.caro TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGGGTG CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

AY727975C.sine TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGGGCG CGAGTTCTAT CAGGTAAAGC CAA-TGATTA

AY177420C.aura TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGGAAA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

X05910C.lemon TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGGAAA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

AF479108C.pepo TTTCCCTCAG GATAGCTG-G AGCCCGCGTG CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

EF135611E.coca TTTCCCTCAG GATAGCTGG- -AGCTCGGCA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

X58118F.anana TTTCCCTCAG GATAGCTTGG AGCCCGTGAA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

AF479172N.taba TTTCCCTCAN GATAGCT-GG AGCTCGCGTG CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

EU161982S.lyco TTTCCCTCAG GATAGCT-GG AGCTCGCGTG CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

DQ122982P.edul TTTCCCTCAG GATAGCTGG- -AGCTCGGCA CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CAA-TGATTA

VegFw1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------

VegRv1 ---------- ---------- ---------- CGAGTTCTAT CGGGTAAAGC CA--------

Abgebildet ist das Alignment verschiedener, lebensmittelrelevanter Pflanzenspezies mit den daraus abgeleiteten

Primersequenzen (gelb markiert). Die Sequenzen wurden der NCBI-Datenbank entnommen. Die Accession Numbers der

Einträge sind im Namen enthalten. Spezies: O.sativa: Oryza sativa; T.aest: Triticium aestivum; H.lupu: Humulus lupulus;

D.caro: Daucus carota; C.sine: Camellia sinensis; C.aura: Citrus aurantium; C.lemon: Citrus lemon; C.pepo: Cucurbita pepo;

E.coca: Erythroxylum coca; F.anana: Fragaria ananassa; N.taba: Nicotiana tabacum; S.lyco: Solanum lycopersicum; P.edul:

Passiflora edulis.

ANHANG

XXIX

II. Alignment der in den pGEM®-T-Vektor eingebrachten pflanzlichen 28S-rDNA-

Sequenzen

1 10 20 30 40 50 60

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 ------GGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTTAGT

Insertsequenz Plasmid 3 TCTNNGGGCGATTGGGCC-GACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTTAGT

Insertsequenz Plasmid 1 -----------------------------------------------ANTAGTGATTAGT

VegFw1 --------------------------------------------------------TAGT

VegRv1 ------------------------------------------------------------

61 70 80 90 100 110 120

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 CTGGANNAGCGTCCTCAGCGACGGACCGGGCACAAGTCCCCTGGAAGGGGGCGCCAGAGA

Insertsequenz Plasmid 3 CTGGAGAAGCGTCCTCAGCGACGGACCGGGCACAAGTCCCCTGGAAGGGGGCGCCAGAGA

Insertsequenz Plasmid 1 CTG-AGAAGN-TCCTCAGCNN-GGACCGGGCCCA-GTCCCCTNGAAGGGG-CNCCGAGAG

VegFw1 CTGGAGAAGCGTCCTCAGC-----------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

121 130 140 150 160 170 180

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 GGGTGAGAGCCCCGTTGCGCTCGGACCCTGTCGCACCACGAGGCGCTGTCAACGAGTCGG

Insertsequenz Plasmid 3 GGGTGAGAGCCCCGTTGCGCTCGGACCCTGTCGCACCACGAGGCGCTGTCAACGAGTCGG

Insertsequenz Plasmid 1 GNNNNAGAGCCCCGTTGNGCTCGGACCNNGTCGCACCACGAGGCGCTGTCGGCGAGTCGG

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

181 190 200 210 220 230 240

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 GTTGTTTGGGAATGCAGCCCCAATCGGGCGGTAAATTCTGTCCAAGGCTAAATATGGGCG

Insertsequenz Plasmid 3 GTTGTTTGGGAATGCAGCCCCAATCGGGCGGTAAATTCTGTCCAAGGCTAAATATGGGCG

Insertsequenz Plasmid 1 GNNGTTTGG-AATGCAGCCCCAATCGGGCGGTAA-TTCCGTCCAAGGCTAAATATTGGCG

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

241 250 260 270 280 290 300

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 AGAGACCGATAGCAAACAAGTACCGCGAGGGAAAGATGAAAAGGACTTTGAAAAGAGAGT

Insertsequenz Plasmid 3 AGAGACCGATAGCAAACAAGTACCGCGAGGGAAAGATGAAAAGGACTTTGAAAAGAGAGT

Insertsequenz Plasmid 1 AGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGCGAGGGAAAGATGAAAAGGACTT-GAAAAGAGAGT

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

301 310 320 330 340 350 360

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 CAAATAGTGCTTGAAATTGTCGGGAGGGAAGCGGATGGGGGCCGGCGATGTGCCCCAGTC

Insertsequenz Plasmid 3 CAAATAGTGCTTGAAATTGTCGGGAGGGAAGCGGATGGGGGCCGGCGATGTGCTCCAGTC

Insertsequenz Plasmid 1 CAAAGAGTGCTTGAAATTGTCGGGAGGGAAGCGGATGGGGGCCGGCGATGTGTCTCGGTC

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

361 370 380 390 400 410 420

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 GGATGTGGAAAGGTGATAAGCCAGTCCGCCAATCGACTTGGGGCATGGACCGATGCGGAT

Insertsequenz Plasmid 3 GGATGTGGAAAGGTGATAAGCCAGTCCGCCAATCGACTTGGGGCATGGACCGATGCGGAT

Insertsequenz Plasmid 1 GGATGTGGAACGGTT-TGTGCCGGTCCGCCAATCGACTCGAGACATTGACCGACGCGGAT

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

421 430 440 450 460 470 480

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 TGAGACGGCGGCCAAAGCCCAGGCCTTTGTTACGCTTGAGGAGACGTCGTCGTCCCGATC

Insertsequenz Plasmid 3 TGAGACGGCGGCCAAAGCCCAGGCCTTTGTTACGCTTGTGGAGACGTCGTCGTCCCGATC

Insertsequenz Plasmid 1 TGTGATGGTGGCCCAAGCCTGGGTTGTTGAGATGCTCGCGGAGACGTCATCATCACGATT

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

481 490 500 510 520 530 540

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 GTGGCTGGCAGCACGCGCC-ATTTGGCGTGCTTCGGCATCTGCGTGCTCCTGGCATCGGC

Insertsequenz Plasmid 3 GTGGCTGGCAGCACGTGCC-TTTTGGCGTGCTTCGGCATCTGCGTGCTCCTGGCATCGGC

Insertsequenz Plasmid 1 GTGGACGGCAGCGCGCGCTGATTCGGCGTGCTTCGGCACTTGCGCGCTCCTGGCGTCGGC

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

541 550 560 570 580 590 600

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 CTGTGGGCTCCCCATTCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTGACATGTGTGCG



VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

ANHANG

XXX

601 610 620 630 640 650 660

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 AGTTAACGGGCGAGTAAACCCGTAAGGCGCAAGGAAGCTGACTGNNGGGATCCCTTTGTG

Insertsequenz Plasmid 3 AGTTAACGGGCGAGTAAACCCGTAAGGCGCAAGGAAGCTGACTGGTGGGATCCCTTTGTG

Insertsequenz Plasmid 1 AGTCAACGGGCGAGTAAACCCGTAAGGCGCAAGGAAGCTGATTGGTGGGATCCTCTTGTG

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

661 670 680 690 700 710 720

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 GGTTGCACCACCGACCGACNNNGATCTTTTTGAGAAGGGTTCGAGTGTGAGCATGCCCTG

Insertsequenz Plasmid 3 GGTTGCACCACCGACCGACCTTGATCTTTT-GAGAAGGGTTCGAGTGTGAGCATGCC-TG

Insertsequenz Plasmid 1 GGTTGCACCGCCGACCGACCCTGATCTTTT-GTGAAGGGTTCGAGTGAGAGCATACC-TG

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

721 730 740 750 760 770 780

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 TCGGGGACCCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAGCGGGGCGAAGCCAG-----------

Insertsequenz Plasmid 3 TCGGGA--CCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAGCGGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTG

Insertsequenz Plasmid 1 TCGGGA--CCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGAGCGGGGCGAAGCCAGAGGAAACTCTG

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

781 790 800 810 820 830 840

| | | | | | |

Insertsequenz Plasmid 2 ------------------------------------------------------------

Insertsequenz Plasmid 3 GTGGAGGCCCGCAGCGATACTGACGTGCAAATCGTTCGTCTGACTTGGGTATAGGGGCGA

Insertsequenz Plasmid 1 GTGGAGGCCCGCAGCGATGCTGACGTGCAAATCGTTCGTCTGACTTGGGTATAGGGGCGA

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

841 850 860 870 880 890 900

| | | | | | |


Insertsequenz Plasmid 3 AAGACTAATCGAACCGTCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGA

Insertsequenz Plasmid 1 AAGACTAATCGAACCGTCTAGTAGCTGGTTCCCTCCGAAGTTTCCCTCAGGATAGCTGGA

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ------------------------------------------------------------

901 910 920 930 940 950 960

| | | | | | |


Insertsequenz Plasmid 3 GCCCGCGTGCGAGTTCTATCGGGTAAAGCCAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGA

Insertsequenz Plasmid 1 GCCCGAGGGCGAGTTCTATCGGGTAAAGCCAAATCCCGCGGCCATGGCGGCCGGGAGCAT

VegFw1 ------------------------------------------------------------

VegRv1 ---------CGAGTTCTATCGGGTAAAGCCA-----------------------------

961 970

| |

Insertsequenz Plasmid 2 -----------------

Insertsequenz Plasmid 3 CC---------------

Insertsequenz Plasmid 1 GCGACGTCGGCCCAATC

VegFw1 -----------------

VegRv1 -----------------

ANHANG

XXXI

III. Klonierungsvektor pGEM®-T-57f(+) mit plantaespezifischem 28S-rDNA-Insert

Abbildung 28: Grafische Darstellung des Klonierungsvektors pGEM®-T-57f(+) mit pflanzenspezifischem Insert Generiert aus DNA von Cucurbita pepo (Steierischer Kürbis). Bearbeitet und erstellt mit dem Sequenzanalyseprogramm Geneious (Kearse et al. 2012). Die Hybridisierungsstellen der pflanzenspezifischen Primer VegFw1 und VegRv1 sind grün hervorgehoben.

ANHANG

XXXII

IV. Klonierungsvektor pGEM®-T-57f(+) mit fungispezifischem 28S-rDNA-Insert als

Positivkontrolle

Abbildung 29: Klonierungsvektor pGEM®-T-57(+)f mit eingebauter 28S rDNA-Sequenz aus D. anomala Bearbeitet und erstellt mit dem Sequenzanalyseprogramm Geneious (Kearse et al. 2012). Die Primer- (grün) und Sondenhybridisierungsstellen (rot) sind markiert.

ANHANG

XXXIII

V. Einstellen des Positivkontrollplasmids als Quantifizierungsstandard

Tabelle 29: Resultate zur Einstellung des Positivkontrollplasmids auf Genomäquivalente Die beim Probennamen angegebenen, erwarteten Konzentrationen sind jeweils auf die DNA-Gesamtkonzentration je Reaktion gesehen. In einem PCR-Lauf wurde, auf Genomäquivalente bereits eingestellte, Dekkera anomala-DNA als Standardreihe definiert und verschiedene Plasmidkopienzahlen in Relation gesetzt.

Probenname Probeart Cp Errechnete

Konzentration in GÄ

𝒙 (Cp) 𝝈(Cp) 𝒙 (GÄ) 𝝈(GÄ)

D. anomala-DNA (1E4 GÄ)

Standard 21,74 1,02E4 - - - -


Standard 25,32 9,64E2 - - - -


Standard 28,74 1,02E2 - - - -

D.anomala-DNA (2,5E1 GÄ)

Standard 30,88 2,49E1 - - - -

D. anomala-DNA (6,25E0 GÄ)

Standard 32,73 6,12E0 - - - -

D. anomala-DNA (1,56E0 GÄ)

Standard 34,18 1,57E0 - - - -

Kontrollplasmid

1,56E2 Kopien

Unbekannt 34,14 1,65E0 34,06 0,11 1,78E0 1,92E-1

unbekannt 33,98 1,92E0

Kontrollplasmid 6,25E2 Kopien

Unbekannt 32,89 5,36E0 32,89 0,00 5,34E0 1,92E-2

Unbekannt 32,89 5,33E0

Kontrollplasmid

2,5E3 Kopien

Unbekannt 31,13 2,11E1 31,12 0,02 2,13E1 2,81E-1


Kontrollplasmid 1E4 Kopien

Unbekannt 29,03 8,39E1 29,01 0,03 8,52E1 1,85E0



Unbekannt 25,46 8,83E2 25,48 0,03 8,71E2 1,68E1



Unbekannt 21,95 8,86E3 21,93 0,03 9,00E03 1,95E2


NTC Negativkontrolle - 0 - - - -

Negativkontrolle - 0 - - - -

ANHANG

XXXIV

VI. Stämme für Inklusivität

Tabelle 30: Übersicht der untersuchten Pilz-Stämme Spezies Stamm Spezies Stamm

Absidia corymbifera DSM 1144 Humicola fuscoatra BCD 3590 Absidia glauca CBS 100.48 Humicola grisea DSM 2691 Absidia spinosa BCD 3485 Hyalodendron lignicola DSM 1877 Acremonium strictum BCD 6986 Hyphopichia burtonii DSM 3505; DSM 70355 Actinomucor elegans BCD 3486 Issatchenkia orientalis CBS 5147 Alternaria alternata BCD 12263 Kazachstania exigua MUCL 29838 Alternaria citri CBS 106.27 Kazachstania unispora BCD 877 Allomyces arbuscula DSM 954 Kloeckera apiculata ATCC 9774 Ascochyta BCD 8541 Kodamaea ohmeri BCD 862 Aspergillus aculaetus DSM 63261 Kluyveromyces lactis DSM 70807 Aspergillus brasiliensis DSM 1988 Kluyveromyces marxianus BCD 811; BCD 2563;

BCD 5186; DSM 70106; DSM 70792

Aspergillus candidus BCD 12139; BCD 14518 Lachancea kluyveri DSM 70517 Aspergillus carneus DSM 1518 Lachancea

thermotolerans CBS 6340

Aspergillus clavatus DSM 817 Lecythophora hofmannii DSM 2693 Aspergillus fumigatus DSM 819 Lipomyces kononenkoae DSM 70302 Aspergillus glaucus BCD 124 Lipomyces lipofer DSM 70305 Aspergillus ochraceus BCD 12158 Lipomyces starkeyi BCD 852 Aspergillus parasiticus DSM 2038 Lipomyces tetrasporus DSM 70314 Aspergillus penicillioides DSM 1623 Lodderomyces

elongisporus DSM 70320

Aspergillus ruber BCD 482 Metschnikowia lunata CBS 5946 Aspergillus sydowi DSM 63373 Metschnikowia

pulcherrima DSM 70321

Aspergillus tamarii BCD 5441 Millerozyma farinosa BCD 861 Aspergillus terreus DSM 826 Monascus purpureus BCD 286 Aspergillus ustus BCD 12168 Monilia fructigena DSM 2678 Aspergillus versicolor DSM 1943 Monilia spec. BCD 8535 Aspergillus wentii DSM 3701 Moniliella suaveolens DSM 2400 Aureobasidium pullulans DSM 3042 Mortierella macrocystis BCD 3494 Aureobasidium spec. BCD 3118; BCD 5649 Mucor circinelloides BCD 6069 Beauveria bassiana DSM 875 Mucor genevensis BCD 3496 Botrytis spp. BCD 3776 Mucor hiemalis BCD 3498 Bullera dendrophila DSM 70745 Mucor racemosus CBS 225.37 Byssochlamys fulva BCD 955 Mycosphaerella pinodes DSM 62763 Byssochlamys nivea BCD 956 Mycotypha africana CBS 122.64 Candida albicans ATCC 10231 Mycotypha microspora CBS 230.32 Candida beechii CBS 4261 Myrothecium sp. BCD 12984 Candida boidinii DSM 70024;DSM 70033;

DSM 70034 Neosartorya fischeri DSM 3700

Candida catenulata DSM 70136 Nigrospora clurus CBS 313.36 Candida diddensiae BCD 800 Ogatea methanolica DSM 2147 Candida ernobii DSM 70858 Ogatea polymorpha DSM 70277 Candida freyschussii DSM 70047 Ogatea trehalophila DSM 70391 Candida friedrichii DSM 70050 Pachylosen tannophilus CBS 4044 Candida glaebosa CBS 5691 Paecilomyces variotii CBS 628.66 Candida glabrata BCD 8932 Penicillium

aurantiogriseum BCD 12165

Candida haemulonii DSM 70624 Penicillium brevicompactum

DSM 2215

Candida inconspicua MUCL 27868 Penicillium camembertii DSM 1995 Candida intermedia BCD 685 Penicillium citrinum DSM 1997 Candida krusei DSM 70075 Penicillium chrysogenum DSM 1075 Candida magnoliae DSM 70638 Penicillium corylophilum BCD 12182 Candida maltosa BCD 806 Penicillium crustosum BCD 6994 Candida multigemmis DSM 70862 Penicillium digitatum DSM 2750 Candida norvegica DSM 70863 Penicillium griseofulvum DSM 896 Candida rugosa BCD 814 Penicillium italicum DSM 2755 Candida sake BCD 1054; CBS 2920 Penicillium nalgiovense DSM 897 Candida solani BCD 818 Penicillium pinophilum DSM 1960 Candida tenuis BCD 819 Penicillium purpurogenum BCD 3006

ANHANG

XXXV

Spezies Stamm Spezies Stamm

Candida tropicalis ATCC 20247; ATCC 20326

Penicillium roquefortii BCD 3599

Candida vini DSM 70184 Penicillium simplicissimum

DSM 1097

Candida zeylanoides BCD 690 Penicillium thomii BCD 2001 Candida parapsilosis ATCC 20384 Penicillium verrucosum DSM 1836 Cephalosporium roseum BCD 2980 Penicillium viridicatum DSM 62878 Ceratocystis paradoxa MUCL1869 Phanerochaete

chrysosporium CBS 316.75

Ceratocystis piliferum ATCC 60758 Phoma spec. BCD 3114 Chaetomium globosum BCD 1181; ATCC 6205 Phomopsis phaseoli CBS 422.50 Choanephora infundibulifera var. cucurbitarum

DSM 960 Pichia anomala DSM 70783

Chrysosporium farinicola CBS 624.83 Pichia canadensis CBS 601 Citeromyces matritensis BCD 1062 Pichia fermentans BCD 711; DSM 70090 Cladosporium cladosporioides

BCD 12266 Pichia guilliermondii BCD 804

Claviceps pupurea DSM 714 Pichia membranefaciens DSM 70178 Clavispora lusitaniae DSM 70102 Pilaira anomala BCD 3504 Colletotrichum gloeosporioides

BCD 7988 Pithomyces chartarum DSM 62925

Cryptococcus albidus DSM 70197 Pleospora herbarum DSM 62928 Cryptococcus curvatus BCD 2578; DSM 70022 Priceomyces carsonii DSM 70392 Cryptococcus flavus BCD 823 Purpureocillium lilacinum BCD 3595 Cryptococcus humicola DSM 70067 Radiomyces spectabilis BCD 3505 Cryptococcus laurentii BCD 824 Rhizoctonia solani BCD 7224 Cryptococcus neoformans

BCD 3511 Rhizophagus irregularis MUCL43194 (SYMPLANTA-001)

Rhizopus nigricans BCD 3506 Cunninghamella elegans BCD 164; BCD 3491 Rhodotorula glutinis BCD 3530 Curvularia geniculata CBS 333.64 Rhodotorula minuta DSM 70408 Cylindrocarpon sp. BCD 12950 Rhodotorula sp. ATCC 20254 Debaryomyces etchellsii ATCC 20126 Rhodotorula rubra BCD 4081 Debaryomyces hansenii BCD 589; BCD 3512 Saccharomyces bayanus BCD 1392; DSM 70412 Debaryomyces marama ATCC 11627 Saccharomyces

carlsbergensis BCD 728

Dekkera anomala DSM 70727 Saccharomyces cerevisiae

ATCC 9763; ATCC 12341; ATCC 18790; DSM 1333; DSM 70416; DSM 70452

Dekkera bruxellensis DSM 70001 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus

BCD 14525; BCD 14526; BCD 14527; DSM 70487

Diaporthe citri DSM 1159 Saccharomyces pastorianus

DSM 6580; NCYC 73

Dipodascopsis uninucleata var. uninucleata

BCD 3552 Saccharomycopsis figuligera

BCD 3514

Drechslera sp. BCD 7979 Saitoella complicata BCD 14119 Endomycopsis fibuliger DSM 70554 Schizosaccharomyces

octosporus DSM 70573

Emericella nidulans BCD 3554 Schizosaccharomyces pombe

BCD 773

Emericella rugulosa DSM 945 Sclerotinia sclerotiorum DSM 1946 Epicoccum nigrum DSM 2586 Scopulariopsis brevicaulis DSM 1218 Eremascus albus BCD 12125 Scytalidium lignicola BCD 3602 Eremascus fertilis BCD 12124; CBS 103.09 Septoria BCD 8386 Eupenicillium abidjanum DSM 2207 Sporidiobolus johnsonii BCD 778; DSM 70847 Eurotium amstelodami BCD 467; BCD 3557;

BCD 12175

Sporidiobolus salmicolor BCD 4982

Eurotium chevalieri DSM 62064 Stachybotrys chartarum DSM 2144 Eurotium rubrum BCD 12172; BCD 14524 Sterigmatomyces elviae DSM 70852 Filobasidium capsuligenum

DSM 70253 Syncephalastrum racemosum

BCD 162; BCD 296; BCD 480; BCD 3507

Fusarium acuminatum BCD 7005 Talaromyces flavus BCD 12179 Fusarium bulbicum BCD 133 Thielaviopsis spp. BCD 3558; BCD 7384

ANHANG

XXXVI

Spezies Stamm Spezies Stamm

Fusarium avenaceum BCD 119 Torulaspora delbrueckii CBS 5636; CBS 6339; DSM 70607

Fusarium cerealis BCD 14058 Trichoderma hamatum BCD 6990 Fusarium concolor DSM 62179 Trichoderma spp. BCD 5666 Fusarium culmorum DSM 62184 Trichoderma viride BCD 352 Fusarium equiseti BCD 110 Trichophyton

mentagrophytes BCD 6061

Fusarium moniliforme BCD 120 Trichosporon cutaneum DSM 70684 Fusarium moniliforme var. subglutanis

BCD 114 Trichothecium roseum BCD 318; DSM 860

Fusarium oxysporum BCD 14059; DSM 841 Ulocladium chartarum DSM 63070 Fusarium poae BCD 149 Venturia inaequalis DSM 1002 Fusarium proliferatum BCD 253 Verticillium lecanii ATCC 28300 Fusarium sambucinum BCD 14062 Verticillium sp. BCD 13586 Fusarium solani BCD 7100 Verticimonosporium

ellipticum

Fusarium sporotrichioides

DSM 62423 Wallemia sebi DSM 5329

Gaeumannomyces graminis var. graminis

DSM 1463 Xeromyces bisporus CBS 347.94

Geomyces pannorum DSM 2689 Yarrowia lipolytica ATCC 20225; ATCC 20226; BCD 2556

Geotrichum candidum BCD 985 Zygorhynchus macrocorpus

BCD 2609

Gibberella zeae BCD 14056 Zygorhynchus moelleri CBS 501.66 Gliocladium spp. BCD 4093 Zygosaccharomyces bailii DSM 70492 Gloeosporium pedemontanum

CBS 273.51 Zygosaccharomyces bisporus

DSM 70415

Guilliermondella selenospora

DSM 3431 Zygosaccharomyces cidri MUCL 31280

Hanseniaspora guilliermondii

DSM 70285 Zygosaccharomyces fermentati

MUCL 27824

Hanseniaspora uvarum BCD 3526 Zygosaccharomyces florentinus

DSM 70506

Hanseniaspora vinea DSM 70283 Zygosaccharomyces lentus

CBS 8516

Hansenula anomala BCD 1082 Zygosaccharomyces microellipsoides

DSM 6959

Helminthosporium spp. BCD 3588 Zygosaccharomyces rouxii

ATCC 48230; DSM 70835

ANHANG

XXXVII

VII. Stämme für Exklusivität

Sofern nicht anders benannt, wurde die DNA aus Plantae jeweils aus der Frucht oder den Blättern dem Herstellerprotokoll des Magnetic Preparation Kit III (Biotecon Diagnostics GmbH, Potsdam) folgend extrahiert. Bakterien-DNA wurde teilweise der betriebsinternen DNA-Datenbank entnommen.

Tabelle 31: Eingesetzte DNA-Proben für Exklusivitätstestung Art der Probe Spezies/Zelllinienname Stammnummer

Bakterien Alicyclobacillus acidocaldarius Aliivibrio fischeri DSM 507

Alteromonas macleodii DSM 6062 Bacillus subtilis DSM 10 Brochothrix thermosphacta DSM 20171 Citrobacter freundii DSM 30040 Clostridium sporogenes DSM 1664 Edwardsiella tarda DSM 30052 Enterococcus faecalis Escherichia coli DSM 30083 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 Lactobacillus delbrueckii DSM 20074 Lactococcus garvieae DSM 20385 Micrococcus luteus BCD 10938 Pleosiomonas shigelloides DSM 8224 Photobacteria phosphoreum BCD 5162 Proteus vulgaris DSM 2140 Pseudomonas aeruginosa Salmonella enterica Salmonella enteritidis Shigella sonnei BCD 7889 Vibrio cholerae ATCC 14034 Vibrio parahaemolyticus DSM 10027 Vibrio vulnificus DSM 10143 Yersinia enterocolitica DSM 4780

Pflanzen Allium sativum (Pulver) Anethum graveolens (gemahlen) Beta vulgaris Capsicum sp. Carum carvi Cocos nucifera (geraspelt) Cucurbita pepo Foeniculum vulgare Fragaria vescana Malus domestica Musa acuminata Pimpinella anisum Prunus cerasus Prunus domestica Rubus fruticosus Rubus idaeus Solanum lycopersicum Syzygium aromaticum (getrocknet) Thymus vulgaris (gehackt) Zingiber officinale (Pulver)

humane Zelllinien A375 A549 A2058 FaDu H9 HaCaT Jurkat

ANHANG

XXXVIII

Art der Probe Spezies/Zelllinienname Stammnummer

QgP SW480

Murine Zelllinien 3T3 B16-F10 R1-H Renca

Canine Zelllinien MDCK2

ANHANG

XXXIX

VIII. Daten zur LOD/LOQ-Bestimmung

Tabelle 32: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Rhodotorula mucilaginosa-DNA

Rhodotorula mucilaginosa (DSM 70403) – Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)

PCR-Lauf Replikat 100 000 10 000 1 000 100 25 6,25 1,56 0,39

FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX

1 1 16,45 30,61 20,07 30,54 23,63 30,43 26,98 30,63 28,66 30,68 30,74 30,89 32,27 30,85 34,27 31,16

1 2 16,69 30,68 20,35 30,44 23,84 30,67 27,12 30,71 29 30,87 30,83 30,85 32,28 30,92 35,42 30,96

1 3 16,58 30,51 20,2 30,68 23,85 30,56 26,94 30,71 29,04 30,95 30,86 30,89 32,79 30,97 40 31

1 4 16,56 30,65 20,34 30,64 23,76 30,3 27,05 30,61 28,69 30,75 31,14 30,74 33,07 30,65 35,44 30,87

1 5 16,28 30,51 20 30,66 23,53 30,7 26,82 30,56 28,94 30,64 30,81 30,8 32,73 30,86 34,3 31,04

1 6 16,58 30,56 20,37 30,48 23,8 30,6 26,99 30,73 28,88 30,8 30,81 30,89 33,07 30,63 34,15 30,97

2 7 16,56 30,62 20 30,63 23,59 30,71 27,25 30,59 29,16 30,78 31,13 31,08 32,95 30,91 34,23 31,08

2 8 16,62 30,51 19,85 30,61 23,61 30,66 26,99 30,7 28,98 30,69 31,25 30,87 33 30,94 34,59 31,1

2 9 16,34 30,99 19,94 30,73 23,84 30,49 26,93 30,79 29,04 30,7 31,15 30,91 32,79 30,98 34,99 30,85

2 10 16,29 30,68 20,55 30,46 23,74 30,61 27,28 30,75 29,58 30,61 31,12 30,82 32,83 31,24 34,25 31,02

2 11 17,14 30,33 20,07 30,52 24,1 30,25 27,56 30,59 29,36 30,81 31,25 30,89 33,3 30,67 35,5 30,89

2 12 16,91 30,49 20,3 30,63 24,15 30,44 27,28 30,49 29,42 30,77 31,41 30,63 33,52 30,61 33,71 30,85

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 16,58 30,60 20,16 30,58 23,75 30,54 27,08 30,67 29,03 30,75 31,01 30,88 32,83 30,87 35,19 30,99

(σ) 0,24 0,16 0,21 0,09 0,15 0,15 0,20 0,07 0,25 0,10 0,19 0,08 0,30 0,17 1,60 0,09

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,396 − 1) ∗ 100% = 96,99%

y = -3,396x + 33,73R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp

Log 10 Genomäquivalente

Rhodotorula mucilaginosa

Standardkurve

ANHANG

XL

Tabelle 33: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Cryptococcus curvatus-DNA

Cryptococcus curvatus (DSM70022) – Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)



1 1 16,36 30,57 20,16 30,55 23,51 30,41 27,06 30,63 28,97 30,81 30,72 30,83 32,7 30,97 33,88 30,99

1 2 16,47 30,69 20,02 30,63 23,46 30,59 26,83 30,73 28,79 30,72 30,58 30,88 32,44 30,91 34,07 31,08

1 3 16,49 30,62 19,93 30,43 23,52 30,53 26,66 30,64 28,76 30,81 30,65 30,9 32,4 31,06 34,9 30,85

1 4 16,45 30,57 19,89 30,65 23,35 30,62 26,96 30,78 29,03 30,69 30,79 30,97 32,18 30,93 34,14 31,11

1 5 16,37 30,59 20,04 30,58 23,6 30,59 26,92 30,6 28,93 30,87 30,73 31 32,14 30,89 33,96 31,31

1 6 16,22 30,79 19,71 30,67 23,18 30,6 26,32 30,84 28,86 30,89 30,59 30,84 32,04 30,95 33,63 31,18

2 7 16,52 30,56 20,2 30,48 23,59 30,61 27 30,57 29,04 30,73 30,58 30,72 32,44 30,96 35,09 31,16

2 8 16,56 30,88 20,1 30,62 23,36 30,49 26,77 30,56 29 31,09 30,96 30,93 32,83 31,12 33,99 30,97

2 9 16,61 30,74 20,08 30,28 23,54 30,31 27,18 30,67 29,06 30,7 30,95 30,98 32,59 31 35,19 31,18

2 10 16,51 30,62 20,01 30,52 23,58 30,31 26,98 30,69 28,89 30,75 30,98 30,87 33,09 30,84 34,03 30,9

2 11 16,32 30,68 20,47 30,63 23,8 30,28 27,28 30,88 29,26 30,77 31,5 30,9 33,36 31 35,01 31,03

2 12 16,61 30,63 20,73 30,66 24,25 30,52 27,95 30,65 29,73 30,86 31,66 31,1 33,86 31,1 36,95 30,92

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 16,46 30,66 20,06 30,55 23,50 30,49 26,91 30,69 28,96 30,80 30,82 30,89 32,56 30,97 34,35 31,07

(σ) 0,11 0,10 0,18 0,11 0,15 0,13 0,25 0,10 0,13 0,11 0,26 0,08 0,39 0,07 0,54 0,13

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,318 − 1) ∗ 100% = 97,5%

y = -3,318x + 33,33R² = 0,998

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Cryptococcus curvatus

Standardkurve

ANHANG

XLI

Tabelle 34: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Mucor racemosus-DNA

Mucor racemosus (CBS 225.37) – Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)



1 1 15,32 30,56 18,98 30,49 22,59 30,58 25,83 30,69 27,76 30,65 29,72 30,77 31,52 30,97 33,58 30,82

1 2 15,55 30,65 19,11 30,48 22,78 30,63 26,01 30,67 27,98 30,84 29,82 30,73 32,1 30,91 36,8 31,01

1 3 15,39 30,62 19,03 30,56 22,49 30,48 26,07 30,65 27,8 30,76 29,74 30,73 31,87 30,88 34,13 30,99

1 4 15,6 30,73 19,01 30,45 22,57 30,5 25,87 30,51 27,95 30,67 29,81 30,76 31,66 31,08 33,89 30,94

1 5 15,64 30,6 19,17 30,52 22,93 30,44 26,08 30,75 28,04 30,69 29,91 30,88 32,15 31 34,03 30,92

1 6 15,46 30,73 19,12 30,46 22,66 30,54 26,17 30,64 28,22 30,85 30,17 30,87 31,89 30,95 33,85 31,04

2 7 15,55 30,83 19,16 30,43 22,53 30,49 26,02 30,76 28,02 30,74 30,03 30,96 32,04 30,95 35,45 31,01

2 8 15,7 30,37 19,1 30,42 22,72 30,56 25,97 30,62 28,12 30,79 29,36 30,45 32,08 30,94 37,94 30,9

2 9 15,53 30,75 19,22 30,5 22,61 30,45 25,94 30,7 28,01 30,61 29,9 30,79 31,77 30,98 35,19 31,01

2 10 15,85 30,77 19,58 30,46 22,98 30,72 26,33 30,6 28,31 30,84 30,19 31,09 31,94 31,01 34,14 30,96

2 11 15,7 30,74 19,16 30,27 22,77 30,72 25,91 30,69 27,96 30,76 29,9 30,77 31,91 31,06 33,13 31

2 12 15,32 31,05 19,07 30,91 22,35 30,54 25,67 30,6 29,33 30,88 30,18 31,05 31,54 31,23 32,85 31,07

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 15,55 30,67 19,15 30,46 22,69 30,56 26,02 30,66 28,02 30,75 29,87 30,80 31,90 30,98 34,74 30,96

(σ) 0,15 0,12 0,15 0,07 0,15 0,09 0,14 0,07 0,15 0,08 0,22 0,15 0,18 0,06 1,41 0,06

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,454 − 1) ∗ 100% = 94,77%

y = -3,454x + 32,89R² = 0,998

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Mucor racemosus

Standardkurve

ANHANG

XLII

Tabelle 35: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Absidia corymbifera-DNA

Absidia corymbifera (DSM 1144) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)



1 1 15,54 30,52 19,32 30,58 22,53 30,74 25,99 30,52 27,97 30,74 29,86 30,92 32,07 31,23 32,8 31,06

1 2 15,62 30,33 18,87 30,66 22,51 30,8 26,22 30,71 28,02 30,69 29,94 31,15 32,23 30,77 34,13 31,48

1 3 15,6 30,61 19,11 30,33 22,52 30,76 26,04 30,52 28,14 30,88 29,97 30,9 32,2 31,12 34,29 30,92

1 4 15,77 30,49 19,13 30,35 22,84 30,53 26,85 30,55 28,88 30,81 31,06 30,9 32,71 30,92 35,17 31,03

1 5 15,72 30,28 18,67 30,94 22,38 30,61 26,04 30,76 28,08 30,86 30,01 30,75 32,33 31,01 34,79 30,72

1 6 15,63 30,65 18,97 30,92 23,09 30,64 27,04 30,16 28,74 30,8 30,68 30,86 32,98 30,63 34,53 30,91

2 7 15,73 30,58 19,29 30,31 22,64 30,25 26,16 30,64 28,17 30,54 29,81 30,7 31,9 30,7 33,59 30,88

2 8 15,74 30,88 19,04 30,5 22,83 30,57 26,61 30,59 28,5 30,57 30,23 30,64 32,06 30,82 34,01 30,87

2 9 15,65 30,74 19,07 30,18 22,58 30,5 25,91 30,53 28,13 30,55 29,84 30,76 31,7 30,85 33,38 30,87

2 10 15,83 30,47 19,14 30,55 22,92 30,32 26 30,53 28,12 30,7 29,92 30,77 32,32 30,8 33,93 30,87

2 11 15,92 30,63 19,03 30,33 22,65 30,54 26,1 30,45 28,16 30,57 30,13 30,68 31,75 30,96 34,05 30,75

2 12 N/A N/A 19,01 30,25 22,54 30,49 25,94 30,53 28,09 30,71 29,91 30,86 31,33 30,93 35,06 31,05

% positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 15,70 30,56 19,06 30,51 22,68 30,57 26,27 30,54 28,26 30,70 30,13 30,82 32,20 30,89 34,06 30,94

(σ) 0,11 0,16 0,17 0,24 0,20 0,16 0,37 0,15 0,29 0,12 0,38 0,14 0,37 0,17 0,63 0,19

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,418 − 1) ∗ 100% = 96,14%

y = -3,418x + 32,87R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Absidia corymbifera

Standardkurve

ANHANG

XLIII

Tabelle 36: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Schizosaccharomyces pombe-DNA

Schizosaccharomyces pombe (DSM 70572) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)



1 1 16,36 34,07 19,83 33,25 23,23 31,74 26,62 30,44 28,91 30,61 30,91 30,64 32,87 30,92 30,69 30,86

1 2 16,75 34,11 20,22 33,05 23,71 31,65 26,97 30,25 29,09 30,58 30,77 30,83 32,55 30,84 34,6 31,29

1 3 16,11 34,64 19,76 33,73 23,06 32,03 26,31 30,36 28,45 30,47 30,49 30,7 32,54 31,04 33,95 31,17

1 4 16,3 34,223 19,84 33,32 23,24 31,14 26,55 30,31 28,64 30,35 30,67 30,56 32,66 30,78 34,11 31,03

1 5 16,43 33,91 20,28 33,22 23,44 31,77 26,54 30,56 28,71 30,36 30,77 30,64 32,69 31,1 34,17 30,98

1 6 16,51 34,24 20,13 32,76 23,49 31,12 26,68 30,36 28,73 30,46 30,89 30,86 32,79 30,93 34,7 30,95

2 7 16,47 34,08 20,12 33,41 23,64 32,18 27,07 30,64 29,2 30,79 31,3 31,07 33,38 31,19 34,91 31,09

2 8 16,47 35,17 19,99 34,38 23,59 32,62 26,85 30,49 29,01 30,79 31,14 30,92 32,94 31,23 34,88 31,24

2 9 16,28 34,46 19,86 33,93 23,33 32,66 26,93 30,49 28,87 30,73 30,88 31,07 33,94 31,31 34,76 31,22

2 10 16,21 35,06 19,78 34,1 23,28 31,96 26,85 30,52 28,89 30,79 30,91 30,97 34,13 31 34,97 31,46

2 11 16,47 35,07 19,97 34,22 23,49 31,99 26,83 30,48 29,03 30,65 30,9 30,84 32,79 31,26 34,91 31,52

2 12 16,47 34,49 19,99 34,6 23,49 32,03 26,89 30,69 29,03 30,7 30,94 30,98 32,99 31,22 34,6 31,5

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 16,40 34,46 19,98 33,58 23,41 31,90 26,75 30,45 28,87 30,60 30,88 30,83 33,03 31,05 34,24 31,16

(σ) 0,16 0,44 0,17 0,50 0,19 0,48 0,22 0,11 0,21 0,16 0,21 0,17 0,53 0,17 1,17 0,20

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,358 − 1) ∗ 100% = 98,52%

y = -3,358x + 33,4R² = 0,998

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Schizosaccharomyces pombe

Standardkurve

ANHANG

XLIV

Tabelle 37: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Fusarium oxysporum-DNA

Fusarium oxysporum (DSM 841) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)



1 1 15,63 33,03 19,18 33,75 22,88 30,87 26,18 30,15 28,46 30,44 30,15 30,51 32,3 30,9 34,3 30,81

1 2 15,62 33 19,16 33,87 22,96 30,67 26,49 30,24 28,74 30,43 30,58 30,8 32,53 30,83 34,23 30,9

1 3 15,67 32,99 19,19 33,3 22,82 31,2 26,54 30,18 28,53 30,2 30,54 30,64 32,52 30,8 34,03 31,08

1 4 15,65 32,76 19,53 32,03 22,67 32,05 26,26 30,23 28,53 30,47 30,31 30,62 32,36 30,79 33,94 30,97

1 5 15,65 32,91 19,2 34,48 22,76 31,92 26,61 30,1 28,45 30,19 30,54 30,7 32,61 30,9 34,73 31,05

1 6 15,67 32,69 19,78 31,65 23,18 31,09 26,79 30,33 28,87 30,45 30,87 30,81 33,01 30,74 34,54 30,93

2 7 15,71 33,6 19,09 33,73 22,74 31,52 26,12 30,17 28,43 30,28 30,72 30,61 32,51 30,73 34,88 30,96

2 8 15,69 33,21 19,16 34 22,75 31,17 26,28 30,26 28,52 30,54 30,53 30,77 32,65 30,96 34,24 30,83

2 9 15,96 32,28 19,23 33,98 22,85 31,49 26,32 30,44 28,65 30,59 30,48 30,68 32,51 30,84 34,4 31,05

2 10 15,8 32,81 18,97 34,17 22,55 31,77 26,12 30,55 28,29 30,44 30,47 30,91 32,52 31,03 34,12 31,11

2 11 15,77 32,55 19,12 33,87 22,7 31,28 26,19 30,49 28,46 30,58 30,53 30,74 32,21 30,88 34,19 31,1

2 12 N/A N/A 19,04 34,09 22,8 31,07 26,07 30,51 28,45 30,31 30,48 30,59 32,55 30,75 32,47 30,84

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 15,71 32,89 19,24 33,53 22,81 31,37 26,35 30,29 28,54 30,42 30,52 30,71 32,52 30,85 34,33 30,98

(σ) 0,10 0,33 0,21 0,85 0,16 0,41 0,21 0,14 0,15 0,13 0,18 0,11 0,20 0,09 0,28 0,10

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,472 − 1) ∗ 100% = 94,10%

y = -3,472x + 33,18R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Fusarium oxysporum

Standardkurve

ANHANG

XLV

Tabelle 38: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Cladosporium cladosporioides-DNA

Cladosporium cladosporioides (DSM 62121) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)



1 1 19,01 33,6 22,73 31,06 26,06 30,16 29,74 30,52 31,8 31,01 33,77 31,09 34,7 31,07 36,91 31,11

1 2 19,11 32,72 22,79 31,05 26,16 30,32 29,79 30,59 31,9 30,76 33,52 30,97 35,71 30,86 36,89 30,98

1 3 18,99 33,59 22,67 31,29 26,26 30,29 29,71 30,64 31,77 30,84 33,51 31,16 35,76 31,08 36,85 31,06

1 4 18,99 33,19 22,64 31,67 26,03 30,27 29,52 30,52 31,59 30,87 33,63 31,16 34,96 31,09 40 30,92

1 5 18,83 34,01 22,45 31,92 26,03 30,45 29,33 30,6 31,6 30,67 33,54 31,17 34,74 30,99 36,16 31,14

1 6 19,06 33,6 22,64 31,69 26,17 30,28 29,68 30,74 31,81 30,8 33,74 31,01 35,33 31,05 37,35 31,13

2 7 18,94 33,77 22,73 30,92 26,13 30,29 29,55 30,51 31,82 30,76 33,29 30,93 35,52 30,97 36,26 31,04

2 8 18,99 32,99 22,64 31,27 26,03 30,3 29,9 30,58 31,69 30,96 33,9 31,21 35,36 31,09 36,59 30,95

2 9 18,97 34,15 22,65 31,8 26,07 30,59 29,46 30,63 31,77 30,94 33,79 30,71 35,44 30,96 36,45 31,03

2 10 18,95 33,29 22,88 30,78 26,35 30,19 29,95 30,63 32,03 30,96 33,89 30,92 36,06 30,92 37,95 31,06

2 11 18,93 33,27 22,79 30,75 26,29 30,33 29,9 30,47 31,97 30,91 34,13 31,06 35,64 31,3 37,62 31,06

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 18,98 33,47 22,69 31,29 26,14 30,32 29,68 30,58 31,80 30,86 33,70 31,04 35,38 31,03 37,18 31,04

(σ) 0,07 0,41 0,11 0,40 0,11 0,11 0,19 0,07 0,13 0,10 0,22 0,14 0,41 0,11 1,04 0,07

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,3381 − 1) ∗ 100% = 97,56%

y = -3,381x + 36,19R² = 0,998

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Cladosporium cladosporoides

Standardkurve

ANHANG

XLVI

Tabelle 39: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Alternaria citri-DNA

Alternaria citri (CBS 106.27) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)



1 1 17,29 33,11 20,84 32,44 24,65 30,53 27,97 30,18 30,16 30,54 31,92 30,78 34,23 30,94 35,76 31,02

1 2 17,48 33,07 20,89 32,46 24,51 30,35 28 30,2 30,32 30,51 32,26 30,83 34,31 30,78 36,18 30,89

1 3 17,23 33,49 20,84 32,55 24,42 30,8 27,98 30,18 30,24 30,6 32,14 30,8 33,98 30,76 35,9 30,79

1 4 17,14 33,76 20,91 32,49 24,44 30,55 27,85 30,44 29,98 30,46 31,95 30,81 34,22 31 35,82 30,73

1 5 17,43 32,97 20,89 32,2 24,44 30,51 27,82 30,28 30,06 30,53 31,92 30,83 34,15 31,12 35,54 30,88

1 6 17,2 33,94 20,9 31,88 24,53 30,32 27,76 30,16 29,92 30,63 32,03 30,8 33,85 30,92 35,74 30,97

2 7 17,58 33,65 21,14 32,23 24,61 30,63 28,32 30,25 30,15 30,53 32,21 30,75 34,63 30,87 35,96 31,18

2 8 17,63 34,45 21,43 32,45 24,74 30,73 28,21 30,21 30,33 30,51 32,34 30,75 33,93 30,97 35,47 30,97

2 9 17,64 34,7 21,19 32,82 24,85 30,65 28,19 30,25 30,36 30,71 32,58 30,94 34,84 30,94 36,05 30,86

2 10 17,65 33,73 21,3 32,57 24,87 30,3 24,48 30,22 30,45 30,84 32,76 30,84 34,78 30,89 36,56 30,85

2 11 17,78 32,94 21,42 31,85 24,78 30,76 28,45 30,42 30,11 30,55 31,97 30,76 33,9 30,96 35,86 30,92

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 17,46 33,62 21,07 32,36 24,62 30,56 27,73 30,25 30,19 30,58 32,19 30,81 34,26 30,92 35,89 30,91

(σ) 0,21 0,56 0,22 0,28 0,16 0,17 1,05 0,09 0,16 0,10 0,27 0,05 0,34 0,10 0,29 0,12

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,438 − 1) ∗ 100% = 95,37%

y = -3,438x + 34,79R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Alternaria citri

Standardkurve

ANHANG

XLVII

Tabelle 40: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Penicillium chrysogenum-DNA

Penicillium chrysogenum (DSM 848) –Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)



1 1 16,18 35,03 19,77 33,42 23,06 31,55 26,52 30,15 29,22 30,44 31,01 30,67 32,76 30,83 32,86 30,73

1 2 16,22 35,34 19,78 33,24 22,93 31,66 26,23 30,28 28,37 30,27 30,48 30,75 32,74 30,84 34,44 31,02

1 3 16,31 34,96 19,79 33,09 23,02 31,63 26,47 30,29 28,55 30,5 30,54 30,55 32,54 30,86 34,49 30,87

1 4 16,35 34,68 19,96 32,61 22,98 31,66 26,15 30,11 28,31 30,3 30,25 30,63 32,37 30,88 34,04 30,9

1 5 16,36 35,1 20,19 30,57 23,15 30,46 26,16 30,24 28,31 30,45 30,23 30,51 32,15 30,91 34,04 30,99

1 6 16,33 35,51 19,93 33,21 22,92 31,55 26,29 30,03 28,32 30,16 30,36 30,53 32,06 30,83 33,97 31,07

2 7 16,36 35,01 19,7 33,29 22,84 31,5 26,34 30,21 28,46 30,12 30,22 30,55 32,5 30,72 33,83 30,87

2 8 16,24 35,48 19,67 33,65 22,99 31,7 26,22 30,22 28,17 30,15 30,34 30,52 32,28 30,69 34,41 30,97

2 9 16,33 35,22 19,84 32,95 23 31,2 26,53 30,2 28,53 30,21 30,54 30,59 32,42 30,74 34,38 30,92

2 10 16,18 35,29 19,7 34,15 22,92 31,95 26,1 30,36 28,28 30,21 30,05 30,65 32,23 30,88 34,16 31,02

2 11 16,36 34,53 19,85 33,66 22,95 31 26,37 30,26 28,22 30,34 30,31 30,59 32,46 30,82 34,33 30,91

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 16,29 35,10 19,83 33,08 22,98 31,44 26,31 30,21 28,43 30,29 30,39 30,59 32,41 30,82 34,09 30,93

(σ) 0,07 0,29 0,14 0,88 0,08 0,39 0,14 0,09 0,27 0,13 0,24 0,07 0,21 0,07 0,44 0,09

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,307 − 1) ∗ 100% = 100,62%

y = -3,307x + 32,94R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp



Standardkurve

ANHANG

XLVIII

Tabelle 41: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Aspergillus brasiliensis-DNA

Aspergillus brasiliensis (DSM 1988) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)



1 1 17,29 33,66 20,41 32,94 24 31,01 27,31 30,49 29,69 30,29 31,84 30,82 33,17 30,94 35,48 30,85

1 2 17,28 33,58 20,45 32,82 23,84 30,92 27,24 30,47 29,43 30,43 31,38 30,73 33,24 31,14 35,29 30,93

1 3 17,26 33,82 20,52 32,48 23,95 30,91 27,46 30,65 29,59 30,77 31,71 30,8 33,58 31,04 35,49 30,97

1 4 17,33 33,58 20,56 31,88 23,89 30,85 27,28 30,49 29,56 30,51 31,46 30,85 33,14 30,88 35,29 31,15

1 5 17,34 33,11 20,55 31,26 23,86 30,68 27,3 30,24 29,27 30,28 30,97 30,31 32,7 30,81 34,23 30,98

1 6 17,46 33,1 20,94 32,27 24,15 30,91 27,45 30,55 29,61 30,45 31,75 30,55 33,66 30,97 35,12 30,96

2 7 17,27 34,58 20,77 33,25 23,93 31,17 27,35 30,3 29,47 30,52 31,26 30,72 33,04 31,06 35,67 31,24

2 8 17,26 33,72 20,95 31,77 24,25 30,77 27,76 30,34 29,7 30,49 31,64 30,87 33,73 31,09 35,52 31,02

2 9 17,04 35,06 20,74 32,94 23,9 31,66 27,51 30,34 29,34 30,31 31,57 30,68 33,63 31,13 35,37 31,05

2 10 17,53 33,5 20,96 31,94 24,19 30,75 27,63 30,31 29,61 30,47 31,06 30,76 33,49 30,92 35,49 30,98

2 11 17,44 34,07 20,88 33,09 24,19 30,66 27,46 30,15 29,46 30,31 31,52 30,6 33,33 30,74 34,8 31,24

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 17,32 33,80 20,70 32,42 24,01 30,94 27,43 30,39 29,52 30,44 31,47 30,70 33,34 30,97 35,25 31,03

(σ) 0,12 0,56 0,20 0,61 0,14 0,27 0,15 0,14 0,13 0,14 0,27 0,16 0,30 0,12 0,39 0,12

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,329 − 1) ∗ 100% = 99,71%

y = -3,329x + 34,03R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Aspergillus brasiliensis

Standardkurve

ANHANG

XLIX

Tabelle 42: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Candida albicans-DNA

Candida albicans (ATCC 10231) – Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM/HEX)



1 1 15,86 35,27 19,66 33,72 22,92 31,58 26,33 30,15 28,61 30,44 30,27 30,62 32,56 30,85 34,08 31,01

1 2 15,77 35,47 19,48 33,78 22,68 31,51 26,11 30,36 28,57 30,53 30,13 30,64 31,92 30,7 34,51 30,88

1 3 15,84 34,95 19,57 32,95 23,1 30,3 26,33 30,27 28,35 30,54 30,26 30,64 32,53 30,83 34,45 30,99

1 4 15,79 35,8 19,88 30,56 23,06 31,76 26,79 30,33 28,94 30,24 30,65 30,7 32,74 31,06 34,3 30,82

1 5 15,73 35,62 19,58 31,22 23,26 30,08 26,31 30,2 28,5 30,34 30,65 30,6 32,47 30,89 33,77 31,2

1 6 15,85 33,94 19,34 33,52 23,33 30,09 26,53 30,06 28,77 30,3 30,64 30,61 32,57 30,83 34,33 31,17

2 7 15,93 35,84 19,58 34,65 23,19 30,78 26,51 30,36 28,94 30,43 30,69 30,54 32,57 31,02 34,36 31,11

2 8 16,01 35,13 19,47 35,11 23,83 31,39 26,84 30,49 28,89 30,47 31,04 30,69 32,82 30,97 34,81 31,07

2 9 15,82 35,76 19,51 33,57 22,85 31,82 26,6 30,2 28,75 30,61 30,65 30,61 32,61 31,03 34,62 30,79

2 10 15,98 34,91 19,62 33,62 23,07 31,2 29,66 30,45 30,65 30,68 32,48 30,78 34,88 31,13 36,45 30,8

2 11 15,92 34,9 19,78 32,33 22,81 32,06 26,63 30,34 28,67 30,35 30,76 30,76 33,58 30,23 34,93 30,88

2 12 16,62 30,87 19,96 32,42 23,81 30,07 27,13 30,21 28,86 30,48 30,85 30,75 32,61 30,9 34,92 31,06

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 15,93 35,24 19,59 33,18 23,10 31,14 26,79 30,29 28,88 30,45 30,75 30,65 32,84 30,87 34,60 30,97

(σ) 0,22 0,54 0,14 1,30 0,30 0,68 0,93 0,12 0,59 0,13 0,60 0,07 0,74 0,23 0,66 0,14

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3475 − 1) ∗ 100% = 93,96%

y = -3,475x + 33,49R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Candida albicans

Standardkurve

ANHANG

L

Tabelle 43: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Issatchenkia orientalis-DNA

Issatchenkia orientalis (CBS 5147) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)



1 1 15,04 32,58 18,91 31,97 22,61 31,1 26,11 30,27 28,06 30,26 30,11 30,61 31,97 30,88 34,18 31,14

1 2 15,05 32,28 18,78 32,09 22,3 31,55 25,63 30,34 27,85 30,29 29,79 30,64 31,92 30,72 33,54 30,87

1 3 15,18 32,05 18,74 31,84 22,15 31,19 25,69 30,33 27,85 30,27 29,95 30,59 31,81 30,81 33,9 31,06

1 4 15,07 32,7 18,7 32,55 22,14 31,36 25,62 30,48 27,81 30,48 29,9 30,64 31,71 30,85 33,65 30,91

1 5 14,99 32,79 18,62 31,99 22,13 31,74 25,61 30,13 27,73 30,31 29,81 30,57 31,53 30,74 33,58 30,81

1 6 15,05 32,63 18,77 31,55 22,47 30,49 25,76 30,29 27,82 30,34 29,61 30,32 31,62 30,76 33,37 30,89

2 7 15,19 32,66 18,92 31,78 22,32 31,63 25,93 30,19 27,92 30,55 30,04 30,65 31,93 30,82 33,8 31,08

2 8 15,25 33,11 18,88 32,42 22,29 31,1 25,81 30,49 28,06 30,32 29,98 30,51 31,65 30,9 33,83 31,07

2 9 15,33 32,56 18,81 32,27 22,25 31,55 25,81 30,2 27,89 30,24 29,95 30,56 31,61 30,89 33,57 30,79

2 10 15,11 33,71 18,81 32,49 22,12 31,69 25,81 30,18 27,99 30,36 29,95 30,52 31,88 30,82 33,71 30,99

2 11 15,27 32,78 18,88 32,12 22,33 31,14 26,05 30,24 27,88 30,29 30,28 30,69 31,9 30,63 33,79 31,03

2 12 15,33 32,8 18,91 31,93 22,45 30,99 25,91 30,19 27,99 30,35 30,1 30,55 31,82 30,89 33,89 30,9

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 15,16 32,71 18,80 32,10 22,28 31,32 25,80 30,29 27,90 30,34 29,94 30,57 31,78 30,80 33,72 30,97

(σ) 0,11 0,41 0,09 0,30 0,15 0,35 0,16 0,11 0,10 0,09 0,17 0,10 0,15 0,08 0,21 0,11

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,439 − 1) ∗ 100% = 95,33%

y = -3,439x + 32,54R² = 0,999

15

20

25

30

35

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Issatchenkia orientalis

Standardkurve

ANHANG

LI

Tabelle 44: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Pichia anomala-DNA

Pichia anomala(DSM 70783) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)



1 1 17,05 34,9 20,59 32,78 24,03 30,96 27,57 30,54 29,75 30,56 31,52 30,73 33,54 31,06 35,19 30,95

1 2 17,16 33,95 20,66 32,27 24,05 30,85 27,67 30,36 29,67 30,59 31,49 30,7 33,51 30,91 35,15 31,17

1 3 17,07 34,26 20,72 31,96 24,15 30,76 27,63 30,19 29,59 30,51 31,59 30,77 33,71 30,98 34,96 31,04

1 4 17,19 34,24 20,5 32,39 24,02 30,68 27,37 30,33 29,44 30,67 31,21 30,67 33,29 30,87 35,46 30,98

1 5 17,22 33,1 20,73 32,44 23,99 30,84 27,51 30,28 29,54 30,61 31,53 30,75 33,62 30,89 35,73 30,96

1 6 16,72 38,77 20,63 34,13 23,97 31,76 27,63 30,2 29,45 30,59 31,54 30,73 33,37 30,75 35,25 30,99

2 7 16,33 40 20,7 31,77 24 31,01 27,58 30,1 29,42 30,56 31,62 30,76 33,25 31,08 35,52 31,21

2 8 16,94 36,67 20,55 34,51 24,13 30,8 27,44 30,45 29,64 30,67 31,43 30,83 33,04 31,07 35,34 30,95

2 9 16,93 35,9 20,87 30,95 24,05 30,97 27,67 30,14 29,93 30,6 31,55 30,82 33,66 30,91 35,43 30,94

2 10 17,01 36,02 20,93 31,08 24,45 30,22 27,58 30,47 29,51 30,61 32,06 30,56 33,63 30,87 35,26 31,2

2 11 17,12 33,6 20,71 31,87 24,19 30,35 27,76 30,25 30,15 30,62 31,92 30,69 33,83 31 35,46 30,97

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 16,98 35,58 20,69 32,38 24,09 30,84 27,58 30,30 29,64 30,60 31,59 30,73 33,50 30,94 35,34 31,03

(σ) 0,25 2,09 0,12 1,06 0,13 0,38 0,11 0,14 0,22 0,04 0,22 0,07 0,22 0,10 0,20 0,10

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,392 − 1) ∗ 100% = 97,16%

y = -3,392x + 34,20R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Pichia anomala

Standardkurve

ANHANG

LII

Tabelle 45: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Zygosaccharomyces bailii-DNA

Zygosaccharomyces bailii (DSM 70492) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)



1 1 16,92 33,87 20,49 32,14 23,9 31,01 27,69 30,24 29,75 30,48 31,51 30,78 33,71 31,08 35,13 31,06

1 2 16,67 34,93 20,17 34,22 23,59 32,01 27,29 30,56 29,1 30,52 31,32 30,83 33,62 30,82 35,27 31,22

1 3 16,86 34,43 20,3 34,71 23,94 30,46 27,6 30,34 29,95 30,6 31,79 30,87 33,28 30,85 35,31 31,1

1 4 16,91 32,6 20,41 32,54 23,9 30,47 27,25 30,26 29,24 30,59 31,26 30,71 33,34 30,92 34,92 31,34

1 5 16,98 33,8 20,49 32,48 23,47 33,84 27,54 30,23 29,78 30,55 32,04 30,83 33,79 30,76 35,41 30,7

1 6 16,46 38,07 20,61 30,77 23,71 30,85 27,43 30,47 29,94 30,48 31,36 30,86 33,77 30,84 35,89 31

2 7 17,17 33,26 20,6 32,8 24,18 30,25 27,89 30,47 29,89 30,67 32,05 30,66 33,74 30,87 36,22 31,01

2 8 16,86 34,58 20,54 32,89 23,92 30,74 27,58 30,14 29,52 30,32 31,26 30,69 33,38 30,78 35,46 30,96

2 9 16,93 34,72 20,6 32,84 23,99 30,69 27,58 30,11 29,71 30,47 31,58 30,65 33,55 30,82 35,19 30,77

2 10 17,01 33,8 20,83 31,5 24,06 30,75 27,56 30,18 29,8 30,56 31,62 30,6 33,68 30,77 34,93 30,94

2 11 16,87 34,82 20,5 33,46 24 30,62 27,27 30,2 29,49 30,53 31,67 30,77 33,95 30,85 35,86 30,83

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 16,88 34,44 20,50 32,76 23,88 31,06 27,52 30,29 29,65 30,52 31,59 30,75 33,62 30,85 35,42 30,99

(σ) 0,18 1,33 0,17 1,07 0,20 0,98 0,19 0,14 0,27 0,09 0,27 0,09 0,20 0,09 0,40 0,18

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,449 − 1) ∗ 100% = 94,96%

y = -3,449x + 34,27R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp


Zygosaccharomyces bailii

Standardkurve

ANHANG

LIII

Tabelle 46: LOD/LOQ: Cp-Werte der Replikate von Dekkera anomala-DNA

Dekkera anomala (DSM 70727) - Genomäquivalente je Reaktion (Cp-Werte FAM / HEX)



1 1 17,7 33,78 21,22 32,49 24,91 30,65 28,14 30,33 30,16 30,67 32,46 30,88 34,43 31,00 35,53 30,81

1 2 17,83 33,64 21,18 32,03 24,79 30,24 28,36 30,24 30,53 30,6 32,32 30,93 34,66 31,15 36,17 31,04

1 3 17,79 33,68 21,26 32,28 24,8 30,44 28,02 30,30 30,19 30,46 32,05 30,69 34,15 30,79 35,69 30,96

1 4 17,73 33,97 21,15 31,89 24,8 30,43 28,20 30,24 30,43 30,73 32,50 30,91 34,54 30,96 36,09 30,97

1 5 17,72 33,66 21,22 31,64 24,8 30,52 28,10 30,45 30,21 30,67 32,51 30,92 34,49 31,15 35,31 31,04

1 6 17,80 33,77 21,3 31,69 24,69 30,69 28,30 30,44 30,59 30,68 32,57 30,97 34,26 30,79 36,34 31,00

2 7 17,6 35,6 21,20 32,63 24,71 30,40 27,92 30,65 30,16 30,73 31,87 30,94 33,9 31,03 35,89 31,10

2 8 17,62 35,21 21,21 33,11 24,93 30,27 28,41 30,46 30,14 30,52 32,18 30,92 33,92 31,04 36,44 31,06

2 9 17,62 34,87 21,51 31,05 25,12 31,02 28,45 30,33 30,33 30,64 32,41 30,81 33,94 31,22 36,06 31,23

2 10 17,62 35,69 21,65 30,59 24,81 30,97 28,03 30,35 30,12 30,66 32,55 30,80 34,56 30,94 37,08 30,97

2 11 17,56 35,01 21,26 31,02 25,01 30,06 28,15 30,26 30,47 30,66 32,26 30,76 34,48 30,93 35,95 31,00

% Positive 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

(x̅) 17,69 34,44 21,29 31,86 24,85 30,52 28,19 30,37 30,30 30,64 32,33 30,87 34,30 31,00 36,05 31,02

(σ) 0,09 0,79 0,15 0,73 0,12 0,28 0,16 0,12 0,17 0,08 0,21 0,08 0,27 0,13 0,46 0,10

𝐸 = (10−1

𝐴𝑛𝑠𝑡𝑖𝑒𝑔 − 1) ∗ 100% = (10−1

−3,411 − 1) ∗ 100% = 96,4%

y = -3,411x + 34,94R² = 0,999

15

20

25

30

35

40

-1 0 1 2 3 4 5 6

(x̅)

Cp

LOG 10 Genomäquivalente

Dekkera anomala

Standardkurve

ANHANG

LIV

Tabelle 47: LOD/LOQ: Cp-Werte der Negativkontrollen

NTC-Replikate (Cp-Werte FAM / HEX)

PCR-

Lauf

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX FAM HEX

1 - 30,89 - 31,19 40,00 31,06 37,97 30,89 28,92 30,97 33,18 30,84 - 30,99 - 31,05 - 30,84 - 30,97 38,98 30,98 N/A N/A

2 - 31,28 - 31,07 - 30,98 - 30,94 - 31,07 - 30,84 30,54 30,96 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

3 - 30,77 38,06 30,98 - 30,95 - 30,96 - 30,94 40,00 N/A - 30,9 - 30,9 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

4 - 30,94 - 31,02 - 30,9 40,00 31,15 - 31,22 40,00 30,99 - 31,22 - 31,09 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

5 - 31,03 - 30,86 37,64 30,9 - 30,93 40,00 31,47 - 31,23 - 31,14 - 31,01 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

6 - 31,00 - 31,17 - 31,00 39,59 31,00 - 30,85 - 31,02 - 30,91 - 30,86 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

7 - 31,04 40,00 31,05 40,00 31,15 - 30,99 - 31,21 - 31,18 - 31,15 40,00 30,99 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

8 - 31,18 - 30,96 - 30,88 40,00 31,03 40,00 30,57 40,00 31,13 - 31,04 - 31,15 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

9 - 31,23 - 29,94 40,00 29,93 - 31,11 - 31,16 - 31,07 - 31,17 - 31,14 40,00 31,07 N/A N/A N/A N/A N/A N/A

10 40,00 31,25 - 31,05 - 30,87 - 31,17 - 31,11 - 30,82 - 30,92 - 31,11 - 30,93 - 30,94 - 31,06 - 31,10

11 - 31,21 40,00 30,93 39,97 31,19 39,54 31,07 - 31,04 - 30,85 - 31,18 - 30,90 - 30,84 - 30,84 - 30,95 - 31,03

12 40,00 30,62 - 30,99 - 30,87 - 31,05 - 30,92 - 31,13 - 30,92 - 31,01 - 31,18 40,00 30,83 - 30,83 - 30,94

13 - 31,07 - 30,97 - 30,35 - 31,14 - 30,90 - 31,10 - 30,88 - 30,99 - 30,89 - 31,27 - 30,83 40,00 30,95

14 - 30,82 - 31,12 - 30,70 - 31,00 - 30,87 - 31,00 38,13 30,76 - 30,76 - 30,86 N/A N/A N/A N/A N/A N/A

15 - 31,00 - 31,04 - 31,25 - 30,82 - 31,03 - 31,03 40,00 31,04 - 30,98 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

∑ Replikate 140

% Positive 21,43 100

(x̅) 38,75 30,99

(σ) 2,67 0,19

ANHANG

LV

Tabelle 48: Statistische Gesamtauswertung zur LOD/LOQ-Untersuchung

Spezies

Genomäquivalente je Reaktion (x̅ und σ FAM / HEX)

100 000 GÄ 10 000 GÄ 1 000 GÄ 100 GÄ 25 GÄ 6,25 GÄ 1,56 GÄ 0,39 GÄ NTC


Rhodotorula mucilaginosa (DSM 70403)

∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A

x̅ (Cp) 16,58 30,60 20,17 30,59 23,79 30,54 27,10 30,66 29,06 30,75 31,04 30,86 32,88 30,85 35,07 30,98 N/A N/A

σ (Cp) 0,24 0,15 0,20 0,09 0,18 0,15 0,20 0,09 0,27 0,09 0,21 0,10 0,35 0,18 1,59 0,10 N/A N/A

Cryptococcus curvatus

(DSM 70022)

∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A

x̅ (Cp) 16,46 30,66 20,11 30,56 23,56 30,49 26,99 30,69 29,03 30,81 30,89 30,91 32,67 30,98 34,57 31,06 N/A N/A

σ (Cp) 0,11 0,09 0,26 0,11 0,25 0,12 0,37 0,10 0,25 0,11 0,34 0,09 0,52 0,08 0,89 0,13 N/A N/A

Mucor racemosus (CBS 225.37)

∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A

x̅ (Cp) 15,55 30,70 19,14 30,50 22,67 30,55 25,99 30,66 28,13 30,76 29,89 30,82 31,87 31,00 34,58 30,97 N/A N/A

σ (Cp) 0,15 0,16 0,15 0,14 0,17 0,09 0,16 0,07 0,39 0,08 0,23 0,16 0,20 0,09 1,45 0,07 N/A N/A

Absidia corymbifera (DSM

1144)

∑ Replikate 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 40 40

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 22,5% 100%

x̅ (Cp) 15,70 30,56 19,05 30,49 22,67 30,56 26,24 30,54 28,25 30,70 30,11 30,82 32,13 30,90 34,14 30,95 39,95 30,98

σ (Cp) 0,11 0,16 0,17 0,24 0,20 0,16 0,36 0,14 0,28 0,12 0,37 0,13 0,43 0,16 0,66 0,19 0,14 0,28

Schizo-saccharomyces

pombe (DSM 70572)

∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A

x̅ (Cp) 16,40 34,46 19,98 33,66 23,42 31,91 26,76 30,47 28,88 30,61 30,88 30,84 33,02 31,07 34,27 31,19 N/A N/A

σ (Cp) 0,16 0,42 0,17 0,56 0,18 0,46 0,21 0,13 0,20 0,16 0,20 0,17 0,50 0,17 1,13 0,21 N/A N/A

Fusarium oxysporum (DSM

841)

∑ Replikate 11 11 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 40 40

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 22,5% 100%

x̅ (Cp) 15,71 32,89 19,22 33,58 22,81 31,34 26,33 30,30 28,53 30,41 30,52 30,70 32,52 30,85 34,17 30,97 39,95 30,98

ANHANG

LVI

Spezies




σ (Cp) 0,10 0,33 0,21 0,83 0,15 0,40 0,22 0,15 0,15 0,13 0,17 0,11 0,19 0,09 0,58 0,10 0,14 0,28

Cladosporium cladosporoides (DSM 62121)

∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 25% 100%

x̅ (Cp) 18,98 33,47 22,69 31,29 26,14 30,32 29,68 30,58 31,80 30,86 33,70 31,04 35,38 31,03 37,18 31,04 39,41 31,07

σ (Cp) 0,07 0,41 0,11 0,40 0,11 0,11 0,19 0,07 0,13 0,10 0,22 0,14 0,41 0,11 1,04 0,07 1,02 0,16

Alternaria citri (CBS 106.27)

∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 25% 100%

x̅ (Cp) 17,46 33,62 21,07 32,36 24,62 30,56 27,73 30,25 30,19 30,58 32,19 30,81 34,26 30,92 35,89 30,91 39,41 31,07

σ (Cp) 0,21 0,56 0,22 0,28 0,16 0,17 1,05 0,09 0,16 0,10 0,27 0,05 0,34 0,10 0,29 0,12 1,02 0,16


(DSM 848)

∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 12,5% 100%

x̅ (Cp) 16,29 35,10 19,83 33,08 22,98 31,44 26,31 30,21 28,43 30,29 30,39 30,59 32,41 30,82 34,09 30,93 39,80 31,00

σ (Cp) 0,07 0,29 0,14 0,88 0,08 0,39 0,14 0,09 0,27 0,13 0,24 0,07 0,21 0,07 0,44 0,09 0,20 0,11

Aspergillus brasiliensis (DSM

1988)

∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 37,5% 100%

x̅ (Cp) 17,32 33,80 20,70 32,42 24,01 30,94 27,43 30,39 29,52 30,44 31,47 30,70 33,33 30,97 35,25 31,03 40,0 31,1

σ (Cp) 0,12 0,56 0,20 0,61 0,14 0,27 0,15 0,14 0,13 0,14 0,27 0,16 0,30 0,12 0,39 0,12 0,0 0,1

Candida albicans (ATCC 10231)

∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A

x̅ (Cp) 15,93 34,87 19,62 33,12 23,16 31,05 26,81 30,29 28,88 30,45 30,76 30,66 32,82 30,87 34,63 30,98 N/A N/A

(Cp) 0,22 1,31 0,17 1,26 0,35 0,72 0,90 0,12 0,56 0,12 0,58 0,07 0,71 0,22 0,64 0,14 N/A N/A

Issatchenkia orientalis

(CBS 5147)

∑ Replikate 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 N/A N/A

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% N/A N/A

x̅ (Cp) 15,16 32,72 18,81 32,08 22,30 31,29 25,81 30,28 27,90 30,34 29,96 30,57 31,78 30,81 33,73 30,96 N/A N/A

ANHANG

LVII

Spezies




σ (Cp) 0,11 0,39 0,09 0,29 0,15 0,35 0,16 0,11 0,10 0,09 0,17 0,09 0,14 0,08 0,20 0,11 N/A N/A

Pichia/Hansenula anomala

(DSM 70783)

∑ Replikate 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 26 26

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 31% 100%

x̅ (Cp) 17,02 35,25 20,69 32,38 24,09 30,84 27,58 30,30 29,64 30,60 31,59 30,73 33,50 30,94 35,34 31,03 34,93 30,97

σ (Cp) 0,27 2,28 0,12 1,06 0,13 0,38 0,11 0,14 0,22 0,04 0,22 0,07 0,22 0,10 0,20 0,10 4,28 0,11

Zygo-saccharomyces

bailii (DSM 70492)

∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 16 16

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 37,5% 100%

x̅ (Cp) 16,88 34,44 20,50 32,76 23,88 31,06 27,52 30,29 29,65 30,52 31,59 30,75 33,62 30,85 35,42 30,99 40,0 31,1

σ (Cp) 0,18 1,33 0,17 1,07 0,20 0,98 0,19 0,14 0,27 0,09 0,27 0,09 0,20 0,09 0,40 0,18 0,0 0,1

Dekkera anomala (DSM 70727)

∑ Replikate 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 26 26

% Positive 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 31% 100%

x̅ (Cp) 17,69 34,44 21,29 31,86 24,85 30,52 28,19 30,37 30,30 30,64 32,33 30,87 34,30 31,00 36,05 31,02 34,93 30,97

σ (Cp) 0,09 0,79 0,15 0,73 0,12 0,28 0,16 0,12 0,17 0,08 0,21 0,08 0,27 0,13 0,46 0,10 4,28 0,11

ANHANG

LVIII

IX. Anreicherungs- und Detektionszeitpunkt von verschiedener Hefen in Matrices

Tabelle 49: Ausführliche Darstellung der Resultate für PCR und Mikrobiologie für die Anreicherungsdauer vier verschiedener Hefen in drei Matrices

Spezies Dotierungslevel

(KBE/100ml) Nach 24h Anreicherung Nach 48h Anreicherung

Bananen-

nektar

Johannis-

beere (1:10) Multivitamin (1:10)

Bananen-

nektar

Johannis-

beere (1:10) Multivitamin (1:10)

PCR (Cp)

YM (KBE/100µl)

PCR (Cp)

YM (KBE/100µl)

PCR (Cp)

YM (KBE/100µl)

PCR (Cp)

YM (KBE/100µl)

PCR (Cp)

YM (KBE/100µl)

PCR (Cp)

YM (KBE/100µl)

Z. bailii

4x100 - 0 - 0 - 0 - 315 - 528 - 218

4,8x101 - 7 - 12 - 5 34,88 tntc - tntc 35,94 tntc

undotiert - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0

Y. lipolytica

1,6x101 35,20 149 37,43 59 - 0 23,35 tntc 28,76 tntc 28,58 tntc

1,53x102 33,27 tntc 35,87 252 36,22 149 22,65 tntc 27,52 tntc 29,19 tntc

Undotiert - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0

C. parapsilosis

6,8x101 35,83 tntc - 250 36,93 504 25,70 tntc 31,51 tntc 29,34 tntc

7x102 32,91 tntc - tntc 36,38 tntc 24,08 tntc 29,81 tntc 28,96 tntc

Undotiert - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0

S. cerevisiae

1x100 35,97 tntc 34,17 tntc - 0 16,60 tntc 20,93 tntc 40,00 tntc

4x100 33,79 tntc 30,30 tntc 35,67 tntc 16,13 tntc 20,52 tntc 21,60 tntc

Undotiert - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0

Gelistet sind die Cp-Werte der PCR-Reaktionen sowie die ausgezählten KBE der angelegten YM-Nährmedien zu den Beprobungszeitpunkten nach 24h und 48h Anreicherung. Untersucht wurde die optimale Anreicherungsdauer der vier Hefen Zygosaccharomyces bailii, Yarrowia lipolytica, Candida parapsilosis und Saccharomyces cerevisiae in den Matrices Bananennektar, Johannisbeer- und Multivitaminfruchtsaftkonzentrat. Die Matrices wurden im Verhältnis 1:10 mit SSL-Medium versetzt und nach der Dotierung bei 27 bis 30°C inkubiert. Eine undotierte Kontrollprobe wurde mitgeführt. Die Hefen Y. lipolytica, C. parapsilosis und S. cerevisiae wurden in allen Matrices bereits nach 24h in der PCR detektiert, während Z. bailii nach 48h nur in 2 von drei Matrices nachgewiesen werden konnte.

ANHANG

LIX

X. Absterbekinetik von Aspergillus-brasiliensis-Sporen

Tabelle 50: Absterbekinetik von Aspergillus-Sporen bei Hitzebehandlung

t in min Cp 1 Cp 2 x̅ (Cp) σ (Cp) Δ Cp (t = 0 min)

0 24,36 24,36 24,36 0 0

5 25,68 26,42 26,05 0,52 -1,69

10 28,94 28,91 28,925 0,02 -4,57

15 32,33 32,11 32,22 0,15 -7,86

20 30,66 31,07 30,87 0,29 -6,51

30 32,93 33,19 33,06 0,18 -8,7

40 33,31 32,94 33,13 0,26 -8,77

60 33,35 33,15 33,25 0,14 -8,89

Aspergillus-brasiliensis-Sporen (1x104

Sporen/100 µl) wurden über einen Zeitraum von 60 min thermisch

behandelt (80°C). Zu definierten Zeitpunkten (min) wurden Proben als Duplikate entnommen. Als Referenzwert wurde Sporensuspension zum Zeitpunkt t = 0 min, also ohne thermische Behandlung, mitgeführt. Alle Proben wurden mit Reagent D behandelt, lysiert und mittels PCR analysiert. Es sind die Cp-Werte der Einzelproben (Cp 1, Cp 2) zu jedem Entnahmezeitpunkt sowie der sich daraus ergebende Cp-Mittelwert (x̅ (Cp)) und die Standardabweichung (σ (Cp)) berechnet worden.

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