Reinigung, Faltung undCharakterisierung von GFP

Erster Praktikumsteil zum Modul

Proteinchemie 2

ifmbInstitut für Mikrobiologie

der Leibniz-Universität Hannover

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 4

2 Theorie 4

2.1 GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.2 Expressionssystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.3 Proteinfaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.3.1 Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.3.2 Inclusion bodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.3.3 IB–Präparation und Faltung von GFP . . . . . . . . . . . . . . 8

2.4 Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4.1 CD–Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4.2 Fluoreszenzspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3 Praktikum 11

3.1 Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.2 Zellanzucht und –ernte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Anzucht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Ernte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3.3 Zellaufschluss und IB-Präparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Aufschluss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

IB–Präparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.4 Ni–IMAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

Äquilibrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

Beladen und Waschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

Elution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Dialyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

3.5 Proteinkonzentrationsbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

3.6 SDS–PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Herstellung der Gele . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Beladung und Lauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Gelscan und –färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2

3.7 CD–Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

3.8 Fluoreszenzspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4 Protokoll 17

Generelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Materialien und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Ergebnisse und Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Literaturverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Format . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Einheiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Gene und Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Rechtschreibung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Abbildungen, und: Präsens oder Perfekt? . . . . . . . . . . . . . 19

3

1 Einleitung

Die Produktion großer Proteinmengen ist sowohl für die grundlagenorientierten mo-

lekularen Biowissenschaften als auch die Biotechnologie von immenser Wichtigkeit.

Erstere benötigen hochreines Protein zur Aufklärung von Strukturen und Wirkmecha-

nismen, während letztere große Menge für die Herstellung von Medikamenten (Insulin)

oder Enzymen (in Waschmitteln etc.) benötigt. In einem Großteil aller Fälle wird dabei

auf ein bakterielles Produktionssystem zurückgegriffen, welches Proteine einfach und

effizient produzieren kann.

Damit erlangt auch die Charakterisierung von Proteineigenschaften große Bedeutung:

Welche Struktur besitzt mein Protein? Wie stabil ist es? Sind seine Eigenschaften unter

der Bedingung X die gleichen wie unter Bedingung Y?

In diesem Praktikum wird anhand des Proteins GFP gezeigt, wie Proteine überpro-

duziert werden können, wie sie von einer aggregierten Form in ihre native und damit

funktionsfähige Form überführt werden können und mit welchen Methoden die Struk-

tur und Stabilität von Proteinen analysiert werden kann.

2 Theorie

2.1 GFP

Das Grün Fluoreszierende Protein (green fluorescent protein, GFP) ist ein etwa 27 kDa

großes Protein, welches 1962 von Shimomura Osamu aus der Qualle Aequorea victo-

ria isoliert werden konnte. In seiner natürlichen, zellulären Umgebung absorbiert es

blaues Licht, welches vom Protein Aequorin produziert wird und strahlt es als grünes

Licht wieder ab (Fluoreszenz). Nachdem Anfang der 1990er Jahre die Klonierung des

Gens und seine rekombinante Expression in E. coli gelang, zeigte sich, dass GFP (ne-

ben blauem Licht) keine weiteren Cofaktoren benötigt und stabil aus dem Bakterium

gereinigt werden kann. Darüberhinaus zeigte die Aufklärung der Kristallstruktur, dass

es die Form einer aus 12 β–Faltblättern aufgebaute „Tonne“ einnimmt (sog. β–barrel,

Abb.2.1), in deren Mitte ein Chromophor mittels zweier kurzer α–Helices „eingespannt“

vorliegt. Dieser Chromophor entsteht autokatalytisch durch die Zyklisierung des Pro-

teinrückgrats der Serin 65, Tyrosin 66 und Glycin 67, wodurch die Absorption blauen

4

Lichts mit anschließender Fluoreszenz ermöglicht wird (Abb.2.1). N– und C–Terminus

des Proteins liegen zugänglich auf der Außenseite des Proteins, sodass sich GFP auch

für Fusionsexperimente sehr gut eignet. Durch geringe Veränderungen der Aminosäure-

sequenz konnten in anderen Wellenlängenbereichen fluoreszierende Varianten von GFP

hergestellt werden, unter anderem die blau, gelb und rot fluoreszierenden Varianten

CFP, YFP und RFP. Für die Entdeckung, Klonierung und Charakterisierung erhiel-

ten Martin Chalfie, Shimomura Osamu und Roger Y. Tsien 2008 den Nobelpreis für

Chemie.

Abbildung 2.1: Struktur des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP). Links: Darstellung der Ober-fläche des Proteins. Rechts: Darstellung der β–barrel–Sekundärstruktur mit dem innenliegenden Chro-mophor (grün).

2.2 Expressionssystem

Für die Reinigung und Analyse von GFP bietet sich die rekombinante Expression des

entsprechenden Gens in E. coli an. Im Praktikum wird der E. coli–Stamm BL21(DE3)

verwendet. Er ist ein für hohe Proteinproduktion optimierter Stamm, welcher in der hier

verwendeten Form noch ein auf dem Genom eingefügtes Phagen–RNA–Polymerasegen

(für die T7–Polymerase) trägt. Kontrolliert wird die Expression dieses zusätzlichen

Gens durch Voranstellung des lac–Promotors, welcher bekanntlichermaßen durch Zuga-

be von Laktose (oder ihres nicht abbaubaren Analogons IPTG) induziert werden kann.

Wird nun ein Plasmid in die Zelle eingebracht, welches ein Gen mit T7–Polymerase–

Bindesequenz enthält, wird dieses von der sehr effizienten T7–Polymerase erkannt und

die entsprechende mRNA mit einer hohen Transkriptionsrate produziert.

5

Abbildung 2.2: Detailansicht des durch zwei Helices mit der β–barrel–Struktur verknüpften GFP–Chromophors. Die durch Autokatalyse entstandene Bindung ist mit einem Pfeil markiert.

Im Rahmen des Praktikums wird ein solches Konstrukt, gfp–H6 im pET–Vektorsystem,

verwendet. Das Gen besitzt einen 3’–Anhang an der gfp–Basensequenz, welcher im fer-

tigen Protein zur Anfügung von sechs Histidinen führt (Hexahistidin-Tag, His-Tag),

was für die Reinigung des Proteins von entscheidender Bedeutung sind.

2.3 Proteinfaltung

2.3.1 Grundlagen

Alle Proteine müssen eine gefaltete Konformation einnehmen, um ihre zelluläre Aufgabe

übernehmen zu können. Die Faltungsreaktion läuft unter physiologischen Bedingungen

spontan ab, und führt von einer größtenteils ungefalteten Polypeptidkette über die

Ausbildung kleinerer Strukturelemente bis zu einem funktionalen Protein.

Dieser Weg lässt sich aus dem natürlichen Bestreben des Systems (Protein + Umwelt)

verstehen, die Freie Reaktionsenthalpie (Gibbs–Energie, G) zu minimieren. Jede Ver-

änderung, welche G verringert (also Gvorher −Gnachher =∆G= negativ), findet spontan

statt. Der korrekt gefaltete Zustand eines Proteins muss folglich also jener Zustand

6

sein, welcher bei physiologischen Verhältnissen unter allen möglichen Konformationen

des Proteins die geringste Freie Reaktionsenthalpie besitzt und damit den größten ∆G

zum ungefalteten Zustand.

Welche Faktoren spielen nun bei der Proteinfaltung eine Rolle? Aus der Gibbs–Gleichung

∆G=∆H - T∆S wird ersichtlich, dass sowohl die Reaktionsenthalpie (H) als auch die

Entropie des Systems (S, Maß für die „Unordnung“) die Gibbs–Energie beeinflussen.

Die Faltung selbst wird unter anderem dadurch vorangetrieben, dass hydrophobe Sei-

tenketten durch den Hydrophoben Effekt zusammengelagert und vom polaren Medium

abgeschirmt werden. Dadurch nimmt die Entropie des Systems teilweise ab (da gefal-

tete Polypeptidketten höher geordnet sind als frei bewegliche), aber auch zu (da vorher

um hydrophobe Seitenketten strukturiert vorliegende Wassermoleküle frei werden). Zu

diesem Einfluss von ∆S auf ∆G kommen noch Veränderungen von ∆H hinzu, die

durch die Ausbildung von z.B. Wasserstoffbrücken und Interaktionen geladener Res-

te (Salzbrücken) einen negativen Wert aufweisen, sodass ∆G für die Faltungsreaktion

schlussendlich negativ wird und die Reaktion somit spontan abläuft.

2.3.2 Inclusion bodies

Inclusion bodies (IBs) sind große Aggregate aus falsch– bzw. ungefalteten Proteinen.

Sie entstehen spontan unter bestimmten zellulären Bedingungen. Da zu IBs aggregierte

Proteine von den Organismen nicht mehr genutzt werden können, und für sie damit

ausschließlich einen Verlust an Aminosäuren und Energie bedeuten, sind sowohl die

Proteinproduktion als auch die Proteine selbst evolutionär so entwickelt, dass in nicht–

manipulierten Organismen keine nennenswerte IB–Bildung auftritt.

IBs entstehen aus einer Konkurrenzsituation zweier Reaktionswege: 1. der korrekten

Faltung eines Proteins und 2. Interaktion eines ungefalteten bzw. falschgefalteten Pro-

teins mit einem anderen. Proteine falten größtenteils spontan in eine korrekte Form,

wobei die Reaktion einer Kinetik 1. Ordnung folgt (Reaktionsgeschwindigkeit hängt nur

von der Proteinkonzentration ab). Aggregationsreaktionen sind aber immer von der In-

teraktion der Proteine abhängig, und sind damit mindestens Reaktionen 2. Ordnung

(Geschwindigkeit abh. vom Quadrat der Konzentration des ungefalteten Proteins).

Das bedeutet im Organismus, dass IB–Bildung immer dann stattfinden kann, wenn die

Geschwindigkeit der Aggregationsreaktion größer ist als die der korrekten Faltung. Um-

7

so geringer die Menge des ungefalteten Proteins, umso schneller die Faltungsreaktion

und umso stabiler der gefaltete Zustand, desto weniger Protein wird in IBs aggregieren.

Andersherum gilt: Umso länger die korrekte Proteinfaltung dauert und umso höher die

Konzentration an ungefaltetem Protein in der Zelle, desto mehr Protein wird in IBs

aggregieren. Da die Geschwindigkeit bei Reaktionen 2.Ordnung exponentiell mit der

Proteinkonzentration steigt, können Aggregationsreaktionen damit die Faltungsreakti-

on vollständig verdrängen (Abb.2.3).

Abbildung 2.3: IB–Bildung ist abhängig von der Konzentration ungefalteten Proteins. [A] wenigungefaltetes Protein führt zu hoher Ausbeute an gefaltetem Protein [B] viel ungefaltetes Protein führtzu hoher IB–Bildungsrate. In [A] sind die jeweiligen Reaktionsordnungen angegeben (weiteres sieheText), die Pfeildicken geben die Reaktionsgeschwindigkeit an.

2.3.3 IB–Präparation und Faltung von GFP

Im Praktikum wird GFP–H6 so stark produziert, dass es in E. coli inclusion bodies

bildet. Die Zellen werden mittels Hochdruckhomogenisation bzw. Ultraschall aufge-

schlossen, und die sehr dichten IBs zusammen mit den Zelltrümmern abzentrifugiert.

8

Daraufhin werden die Proteine aus den IBs in Lösung gebracht. Dies geschieht durch

Zugabe großer Mengen Harnstoff, was dazu führt, dass die Lösung der Proteine im Puf-

fer energetisch günstiger wird als die Aggregationsreaktion, sodass sich die IBs spontan

auflösen und die Proteine damit in Lösung vorliegen.

Aus dieser Protein–Harnstofflösung können die Proteine nun mittels einer Nickelchelat–

Affinitätschromatographie (Ni–IMAC für immobilized metal ion affinity chromatogra-

phy) gereinigt werden. Der His–Tag des rekombinant produzierten GFP komplexiert

die an die Säulenmatrix gebundenen Nickelionen, wodurch das Protein auf der Säule

zurückgehalten wird. Während das Protein auf der Säule gebunden bleibt, wird die

Harnstoffkonzentration des Säulenpuffers sukzessive verringert, sodass das Protein auf

der Säulenmatrix gebunden seine native Konformation einnehmen kann.

Durch Zugabe großer Mengen Imidazol, welches strukturell mit dem für die Komple-

xierung verantwortlichen Ringsystem des Histidins übereinstimmt, wird das Protein

von den Nickelionen verdrängt und somit von der Säulenmatrix getrennt.

2.4 Spektroskopie

2.4.1 CD–Spektroskopie

Die in der Proteinchemie eingesetzte Circulardichroismus–Spektroskopie (CD-Spektroskopie)

macht sich die Eigenschaft von Proteinen zunutze, dass rechts– und links–circular pola-

risiertes Licht vom Proteinrückgrat unterschiedlich stark absorbiert wird. Dabei ist die

Absorption abhängig von der Orientierung der Peptidbindungen zueinander, wodurch

sich die regelmäßigen Sekundärstrukturelemente wie α–Helix und β–Sheet anhand ihres

CD–Spektrums unterscheiden lassen (Abb.2.4).

2.4.2 Fluoreszenzspektroskopie

Fluoreszenz ist die Eigenschaft eines Moleküls, Licht einer gewissen Wellenlänge zu

absorbieren (also Photonen mit einer definierten Enerige), und mit geringer Verzöge-

rung (Sekundenbruchteile) langwelligeres Licht wieder abzustrahlen. Die Absorption

der Photonen führt dabei zu einer Energetisierung des Fluorophors, dessen Hüllelek-

tronen damit vom Grundzustand in einen angeregten Zustand überführt werden. In

kürzester Zeit verliert das angeregte Molekül jedoch Energie durch Vibration und an-

dere molekulare Effekte, sodass das beim Zurückfallen in den Grundzustand abgegebene

9

Abbildung 2.4: Unterschiedliche Proteinsekundärstrukturen liefern unterschiedliche CD–Spektren,links ideale Spektren homogener Sekundärstrukturen, rechts Spektren von Proteinen mit verschiedenenAnteilen der entsprechenen Sekundärstrukturen (aus Greenfield, Nature Protocols, 2007)

Photon nur noch geringere Energie besitzt und demnach längerwelliges Licht abgegeben

wird.

Im Praktikum wird die Fluoreszenz des gereinigten GFP bestimmt, und hierbei sowohl

die Anregungs– als auch Emissionsspektren des Proteins mit ihren Maxima bestimmt.

10

3 Praktikum

3.1 Lösungen

Folgende Puffer werden benötigt:

Aufschlusspuffer (200ml)

20mM TRIS/HCl pH 8,0

Renaturierungspuffer (100ml)

20mM TRIS/HCl pH 8,0, 8M Harnstoff, 2,5mM DTT, 20mM Imidazol

Waschpuffer A (10ml)

20mM TRIS/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 8M Harnstoff, 20mM Imidazol

Waschpuffer B (10ml)

20mM TRIS/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 4M Harnstoff, 20mM Imidazol

Waschpuffer C (10ml)

20mM TRIS/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 20mM Imidazol

Elutionspuffer (10ml)

20mM TRIS/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 250mM Imidazol

Dialysepuffer (1 l für 2 Gruppen

50mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0), 100mM NaCl

Vorhandene Stammlösungen:

1M TRIS/HCl pH 8,0

1M NaCl

100mM DTT (Handschuhe tragen)

1M Natriumphosphatpuffer pH 8,0

1M Imidazol (Handschuhe tragen)

11

3.2 Zellanzucht und –ernte

Anzucht Die Anzucht der Zellen erfolgt in LB-Medium (10 g NaCl, 10 g Trypton,

5 g Hefeextrakt pro Liter H2O). Ein Liter LB–Medium wird mit einer Übernachtkultur

des Stammes E. coli BL21(DE3) pET–H6–gfp inokuliert und bei 37 °C bis zum Erreichen

von OD600=0,6 schüttelnd inkubiert. Daraufhin erfolgt die Induktion der Genexpression

mit IPTG (Endkonzentration 1mM im Medium) und weiteres Wachstum der Zellen

für 3 h.

Unter dem Fluoreszenzmikroskop werden Bakterien nach der Induktion mit denen einer

nichtinduzierten Kultur verglichen.

Ernte Ein Mililiter der Zellkulturen wird in einem 1,5ml–Eppendorf–Tube in der

Tischzentrifuge bei maximaler Drehzahl für 5min abzentrifugiert, der Überstand ver-

worfen, und das Zellpellet in 100µl SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert (B SDS–

Probe „NI“). Die Zellen werden in 1 l–Zentrifugenbechern für 10min in der Cryofuge

6–6 bei 3000U/min abzentrifugiert. Der Überstand wird in die leeren Kolben zurück-

geschüttet (nicht mehr als 1 l pro Kolben, da sonst beim Autoklavieren die Gefahr des

Überlaufens besteht) und autoklaviert. Die Zellpellets werden in den Bechern bei -20 °C

über Nacht gelagert, bzw. mittels Löffeln aus den Bechern in 50ml–Greiner–Röhrchen

überführt und dann bei -20 °C über Nacht gelagert (je nach Absprache).

3.3 Zellaufschluss und IB-Präparation

I Die Lagerung der Zellen, Zellfraktionen und Puffer erfolgt durchgehend

auf Eis.

Aufschluss Die Zellpellets werden aufgetaut und im 5–fachen Volumen (w/v)1 eis-

kalten Aufschlusspuffers (20mM TRIS/HCl pH 8,0, eine Spatelspitze DNAse zugeben)

mit einer Plastikpipette vollständig resuspendiert. Die Zellen werden dann entweder

mittels Hochdruckhomogenisation (French Press, zwei Durchgänge bei 1250 psi) oder

Ultraschall aufgeschlossen (Einteilung nach Absprache).1weight per volume, d.h. pro 1 g Zellgewicht 1ml Puffer

12

IB–Präparation Die Zellsuspension wird bei 15000U/min für 20min zentrifugiert

(Sorvall RC5C, SS34–Rotor, austarieren auf ±0,1 g, Zentrifuge vorkühlen). Dadurch

werden die Zelltrümmer sowie inclusion bodies von den Membranvesikeln und den

löslichen Bestandteilen des Cyto– und Periplasmas getrennt (B SDS–Probe „ÜS“ des

Überstandes). Der Überstand wird verworfen.

Das Zelltrümmerpellet wird zweimal mit Aufschlusspuffer (5–faches Volumen) gewa-

schen (d.h. resuspendiert und wie oben abzentrifugiert). Nach dem zweiten Wasch-

schritt wird das Pellet in Renaturierungspuffer (20mM TRIS/HCl pH 8,0, 8M Harn-

stoff, 2,5mM DTT, 20mM Imidazol) resuspendiert und 1 h auf Eis rührend inkubiert.

Die Zelltrümmer werden nun von den gelösten Proteinen der inclusion bodies durch

Zentrifugation getrennt. Die Zentrifugation erfolgt bei 15000U/min für 15min (Sor-

vall RC5C, SS34–Rotor, austarieren auf ±0,1 g, Zentrifuge vorkühlen). Der Überstand

wird in ein neues 50ml–Greiner–Röhrchen überführt und für die Ni-IMAC verwendet.

Das Zelltrümmerpellet wird nochmals in 5–fachem Puffervolumen (Aufschlusspuffer)

aufgenommen und eine SDS–PAGE–Probe genommen (B SDS–Probe „ZT“ des Zell-

trümmerpellets)

3.4 Ni–IMAC

Äquilibrierung In eine Säule werden etwa 1ml einer 50%igen Ni–NTA–Lösung pi-

pettiert (Lösung vorher gut schütteln), sodass durch das Abfließen der Lagerlösung eine

Ni-NTA-Säule mit einem Säulenvolumen von etwa 0,5ml entsteht. Die Säule wird nun

mit 10 Säulenvolumen Renaturierungspuffer (20mM TRIS/HCl pH 8,0, 8M Harnstoff,

2,5mM DTT, 20mM Imidazol) äquilibriert (entsprechendes Volumen mit Greiner–

Röhrchen abmessen und auf die Säule geben, Durchfluss in Abfallbecher auffangen).

Das Austrocknen der Säule muss durch Verschließen der oberen Öffnung mit dem Säu-

lendeckel verhindert werden (Unterdruck hält Lösung zurück).

Beladen und Waschen Den Überstand der Zelltrümmerzentrifugation wird nun auf

die Säule gegeben, und der Durchlauf mit einem frischen Becherglas aufgefangen (B

SDS–Probe „D“ des Durchlaufs) und nach vollständigem Durchfluss in ein Greiner–

Röhrchen überführt. Die Säule wird nun zuerst mit 2 Säulenvolumen Waschpuffer A

(20mM TRIS/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 8M Harnstoff, 20mM Imidazol) gewaschen

(im Abfallbecher auffangen), und dann durch Waschen mit 2 Säulenvolumen Wasch-

13

puffer B (20mM TRIS/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 4M Harnstoff, 20mM Imidazol)

und 2 Säulenvolumen Waschpuffer C (20mM TRIS/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 20mM

Imidazol) die Harnstoffkonzentration auf der Säule veringert (Waschpuffer C separat

auffangen, B SDS–Probe„W“ des Waschens mit Waschpuffer C).

Elution Die Elution des Proteins erfolgt in 7 Schritten: Elutionen 1 bis 4 mit 1/2

Säulenvolumen, Elutionen 5 bis 7 mit 1 Säulenvolumen des Elutionspuffers (20mM

TRIS/HCl pH 8,0, 100mM NaCl, 250mM Imidazol). Jeder Elutionsschritt wird se-

parat in einem 1,5ml–Eppendorf–Tube aufgefangen und auf Eis gelagert (B SDS–

Probe„E1–E7“ der Elutionsfraktionen). Die Säule wird daraufhin mit 10 Säulenvolu-

men Waschpuffer C gewaschen und die Ni-NTA-Agarose aller Praktikumsgruppen in

einem Greiner–Röhrchen gesammelt (Lagerung im Kühlschrank).

Dialyse Zur Dialyse wird die am stärksten leuchtende Elutionsfraktion verwendet.

Diese wird in einem Dialyseschlauch zweimal gegen 1 l Phosphatpuffer (50mM Natri-

umphosphatpuffer (pH 8,0), 100mM NaCl) bei 4 °C rührend dialysiert (erst für 2 h,

dann nach Pufferwechsel über Nacht). I Für’s Protokoll: Warum wird für spektro-

skopische (Temperaturstabilitäts-)Messungen Phosphatpuffer statt z.B. TRIS–Puffer

verwendet?

3.5 Proteinkonzentrationsbestimmung

Die Menge bzw. Konzentration des gereinigten GFPs (dialysierte Elutionsfraktionen)

muss vor den weiteren Schritten bestimmt werden. Die Bestimmung erfolgt mittels

Roti–Nanoquant.

Die Roti–Nanoquant Stammlösung wird in einer 1:5–Verdünnung verwendet. Der ganze

Kurs stellt nur eine Eichreihe her, die BSA-Stammlösung steht in einer Konzentration

von 100µg/ml zur Verfügung. Die Eichreihe wird wie in Tabelle 1 beschrieben pipet-

tiert. Die Proben des eigenen, dialysierten GFPs werden von jeder Gruppe 1:20 und

1:100 mit H2O verdünnt (Endvolumen: je 200µl).

Alle Eichlösungen sowie alle verdünnten GFP-Proteinlösungen werden mit 800µl Roti-

Nanoquant-Lösung gemischt und nacheinander die OD bei 590 und 450 nm bestimmt.

Der Quotient von OD590 zu OD450 der Eichreihenlösungen wird dann gegen die BSA-

Endkonzentration (BSA-Konzentration auf x-Achse) aufgetragen. Über die resultieren-

14

de Geradengleichung einer linearen Regression kann der Quotient der GFP-Proteinlösungen

einer Proteinkonzentration zugeordnet werden (Verdünnungsfaktoren nicht vergessen!).

Tabelle 1: BSA–Eichreihe

BSA–Endkonz. (µg/ml) µl BSA-Stammlsg. µl H2O

0 - 200

10 20 180

20 40 160

30 60 140

40 80 120

50 100 100

60 120 80

70 140 60

80 160 40

90 180 20

100 200 0

3.6 SDS–PAGE

Herstellung der Gele Die Gele werden nach den während des Praktikums bespro-

chenen Angaben hergestellt. Alle hierzu benötigten Lösungen und Materialien werden

bereitgestellt.

Beladung und Lauf Je 10µl der SDS–PAGE–Proben (gut mischen, evtl. noch ein-

mal kurz vortexen und anzentrifugieren, NICHT erhitzen! I Für’s Protokoll: Warum?)

werden in folgender Reihenfolge auf das Gel aufgetragen: M, VI, NI, ÜS, ZT, D, W,

E1–7.

Gelscan und –färbung Die Gele werden auf dem Typhoon–Gelscanner mit passen-

dem Anregungs– und Detektionsfilter eingescannt. Daraufhin werden sie in Coomassie–

Färbelösung für mindestens 1 h inkubiert und das überschüssige Coomassie mit Ent-

färberlösung entfernt (über Nacht).

15

3.7 CD–Spektroskopie

Für die CD–Spektroskopie werden 500µl einer 100µg/ml GFP-Lösung angesetzt (abh.

von der gemessenen Proteinkonzentration). Zur Verdünnung wird der schon für die

Dialyse verwendete Phosphatpuffer (50mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0), 100mM

NaCl) verwendet.

Messung Die CD–Spektren werden im Bereich von 250 nm bis 195 nm aufgenommen.

Die Scangeschwindigkeit beträgt 50 nm/min mit einer Signalintegrationszeit (D.I.T)

von 125ms, die Temperatur 20 °C. Jeweils drei Durchgänge werden gemittelt.

Mit einer GFP–Probe wird exemplarisch die Temperaturstabilität von GFP gemes-

sen. Hierzu wird das CD–Signal einer GFP–Probe bei einer konstanten Wellenlänge

von 218 nm in einem Temperaturbereich von 20 °C bis 90 °C gemessen. Die Tempera-

turrampe wird mit einem Anstieg von 1 °C/min gemessen, und danach wiederum ein

Spektrum bei 20 °C gemessen.

3.8 Fluoreszenzspektroskopie

Für diese Messungen wird ein Teil der dialysierten GFP-Lösung mit Phosphatpuf-

fer(50mM Natriumphosphatpuffer (pH 8,0), 100mM NaCl) auf eine Endkonzentration

von 50µg/ml (Endvolumen: 2ml) verdünnt. Verwendet werden Suprasil–Quarzglasküvetten

mit einer Schichtdicke von 1 cm. Angaben zu den Einstellungen wie Scangeschwindig-

keit und Temperatur, sowie der Aufnahme von Anregungs– und Emissionsspektren

werden vor der Messung besprochen.

16

4 Protokoll

Das Protokoll sollte innerhalb von 14 Tagen nach Beendigung des Praktikums fertig-

gestellt und persönlich oder per E-Mail (hendrik.osadnik@ifmb.uni-hannover.de) beim

Betreuer abgeliefert worden sein. Als Anreiz: Wenn das Protokoll innerhalb einer Wo-

che (ordentlich) angefertigt und beim Betreuer abgegeben wurde, kann die Erwähnung

und Beschreibung einer wissenschaftlichen Veröffentlichung zu GFP (siehe weiter un-

ten) weggelassen werden.

Generelles Alle im Skript mit „I Für’s Protokoll:“ markierten Fragen sollten an

einer geeigneten Stelle im Protokoll beantwortet werden. Ein Inhaltsverzeichnis ist nicht

erforderlich.

Einleitung Es sollte hier eine kurze Einführung in das bearbeitete Thema gegeben

werden. Dazu gehören einige Worte zu Punkten wie z.B. dem verwendeten Organis-

mus, dem gereinigten Protein und den Funktionsweisen der verwendeten Methoden.

Es ist hier keine vollständige Nacherzählung des Skripts notwendig. In der Einleitung

sollte mit einer kurzen Zusammenfassung (wenige Sätze!) auf eine Veröffentlichung zu

GFP eingegangen werden (Suche unter: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/), um

auf die Einsatzmöglichkeiten von GFP einzugehen. Dabei ist unerheblich, in welchem

Zusammenhang GFP (oder andere Varianten wie z.B. CFP) verwendet wird, und ob

es Hauptgegenstand oder nur Mittel zum Zweck ist.

Materialien und Methoden Auch hier ist keine Nacherzählung notwendig. Ein

Satz als Hinweis auf das Skript reicht aus, nur eventuelle Veränderungen sollten aufge-

führt werden.

Ergebnisse und Diskussion Diese beiden — eigentlich streng getrennten — Tei-

le einer wissenschaftlichen Arbeit sollten hier zusammen behandelt werden. Alle im

Verlauf des Praktikums erhaltenen Ergebnisse sollten aufgeführt und diskutiert wer-

den (Was wurde gemacht? Was kam raus? Welche Fehler sind aufgetreten? etc.). Um

die Nachvollziehbarkeit für den Leser zu erhöhen, kann zur Verbindung der einzelnen

Ergebnisse kurz auf den Ablauf des Experiments eingegangen werden. Beispiel: „Die

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Elutionsfraktion mit dem höchsten Proteingehalt wurde daraufhin für die nachfolgen-

den kalorimetrischen Messungen eingesetzt.“

Literaturverzeichnis Alle verwendeten Literaturstellen und Veröffentlichungen sind

hier anzugeben.

Format Grundsätzlich gilt wie bei allen anderen wissenschaftlichen Arbeiten: Schrift

mit Serifen (also Times, Garamond usw. aber nicht Arial, Calibri usw.), Schriftgröße

12, 1,5–facher Zeilenabstand, Blocksatz, einseitiger Druck, Seitennummerierung (bis

auf Deckblatt). Variabler sind meist Angaben zu Seitenrändern, hier bitte: links 4 cm,

rechts 1,5 cm, oben 2,5 cm, unten 2,0 cm.

Einheiten Auch hier gilt analog zu anderen wissenschaftlichen Arbeiten: Zwischen

Zahl und Einheit wird ein geschütztes Leerzeichen gesetzt (unter Word: Strg+ Um-

schalt+ Leertaste) um Zeilenumbrüche und Vergrößerung des Zwischenraumes im Block-

satz zu verhindern. Das Prozentzeichen wird ebenso behandelt (also: 5% SDS). Bei

Angaben in Grad Celsius wird zwischen Zahl und °C ein geschütztes Leerzeichen ge-

setzt (also: 5 °C). Als Einheitenzeichen für Liter wird das kleine „l“ verwendet (also

auch ml und nicht mL). Damit wird der älteren Definition des Einheitenzeichens der

Vorzug vor dem alternativen Zeichen „L“ gegeben, und damit dem weit überwiegenden

Teil der internationalen Fachpresse (u.a. Science und Nature) gefolgt.

Gene und Proteine In der Bakteriologie werden Proteinnamen generell groß ge-

schrieben (TorA), die entsprechenden Gennamen klein und kursiv (torA). Für nicht

aus Bakterien stammende Proteine/Gene weicht die Benennung oft ab, z.B. bei GFP

(Protein komplett groß geschrieben) und gfp. Da die Schreibweise den Bezug zum Pro-

tein oder Gen eindeutig determiniert, kann auf redundante Begriffe wie „das TorA-

Protein“ oder „das torA-Gen“ verzichtet werden. Die Protein-/Genbezeichnungen wer-

den zu Eigennamen, d.h. man sagt und schreibt „MscL (mechanosensitive channel of

large conductance) ist ein interessantes Protein“ und nicht „Der MscL ist ein interessan-

tes Protein“, ebenso wie „BMW (Bayerische Motoren Werke) baut schnelle Autos“ statt

„Die BMW bauen schnelle Autos“.

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Rechtschreibung Da es sich um einen sehr häufig auftretenden Fehler handelt: Die

deutsche Sprache kennt sog. Nominalkomposita (zusammengesetzte Substantive). Un-

zulässig ist daher generell das einfache Aneinanderreihen von Substantiven, z.B. „Tryp-

tophan Fluoreszenz Spektroskopie“, auch wenn dies im Englischen („tryptophane fluo-

rescence spectroscopy“) der Norm entspricht. Es heißt also in diesem Fall korrekt „Tryp-

tophanfluoreszenzspektroskopie“. Um die Lesbarkeit zu erhöhen, kann ein Bindestrich

zur Gliederung verwendet werden, also: „Tryptophan-Fluoreszenzspektroskopie“. Auch

Zusammensetzungen, die Abkürzungen/Zahlen enthalten, sind von dieser Regel nicht

ausgeschlossen: „TorA-Enzym“ statt „TorA Enzym“, „6-fach“ statt „6 fach“. Englische

Fachbegriffe, die (noch) nicht eingedeutscht wurden, sollten im Text durch Kursivset-

zung hervorgehoben werden, also z.B. „coiled coil “. Kursivsetzung gilt ebenfalls für

alle Artennamen. Wird der Begriff in einem zusammengesetzten Substantiv verwen-

det, wird das gesamte Wort mit Bindestrichen durchgekoppelt und groß geschrieben:

„Das Coiled-coil–Protein“. Dies gilt ebenso für „E.–coli–Stämme“.

Abbildungen, und: Präsens oder Perfekt? Als Richtwert gilt: Alle erhaltenen

Ergebnisse sind in der Vergangenheitsform zu präsentieren. Dabei wird niemals auf

Abbildungen beschreibend eingegangen (also nicht: „Auf dem Gel in Abbildung 2“

oder „Die Kurven in Abbildung 2“ etc.) sondern nur auf sie hingewiesen. Abbildun-

gen dienen nur dem Leser als Hilfe zum Nachvollziehen der erhaltenen Ergebnisse. Der

Autor selbst wertet seine Ergebnisse aus, nicht Bilder, die seine Ergebnisse für die

Nachwelt dokumentieren. Demnach wäre also z.B. richtig: „Mittels SDS–PAGE konn-

te GFP in allen Elutionsfraktionen nachgewiesen werden (Abb.2, Spur E1 bis E7).“

oder „Es zeigte sich eine deutliche Verschiebung des Intensitätsmaximums auf 300 nm

(Abb.2, gestrichelte Kurve)“. Alle Abbildungen werden durchnummeriert und müs-

sen eine unterhalb des Bildes stehende Legende besitzen, die für sich stehend Aufbau

und Inhalt des Bildes verständlich macht. Dazu gehört eine kurze Abbildungsbeschrei-

bung (Inhalt) sowie eine Erklärung aller Abkürzungen, z.B. bei einer SDS–PAGE „

Abb.2: Reinigung von rekombinantem TorA mittels Ni-IMAC. SDS–PAGE der Reini-

gungsfraktionen, Coomassiefärbung. M = Marker, W = Waschschritt usw.). Tabellen

werden ebenfalls durchnummeriert, jedoch oberhalb der eigentlichen Tabelle mit ei-

ner Überschrift versehen (also: „Tab.1: Verwendete Plasmide“), die Legende steht hier

aber wieder unter der Tabelle. Sobald von den erhaltenen Ergebnissen ausgehend ei-

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ne theoretische Aussage zu einem Sachverhalt getroffen wird, deren Aussagekraft über

das eigentliche Experiment hinaus Gültigkeit besitzt, wird von der Vergangenheits–

in die Gegenwartsform gewechselt. Der Autor beschreibt nun Allgemeingültigkeiten —

oder zumindest hofft er das. Hier kann als Faustregel gelten, dass all jene Sätze im

Präsens geschrieben werden können, welche Aussagen betreffen, in die man „im Allge-

meinen“ einfügen kann (ohne den Satz logisch zu verfälschen). Beispiel: „Somit konnte

gezeigt werden, dass GFP (im Allgemeinen) bei einem pH-Wert von 5,0 fluoresziert“

oder „Demnach ist PspA (im Allgemeinen) ein membranassoziiertes Protein“.

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