Reinigung, Klonierung und heterologe Expression der Methyljasmonat-Esterase aus

Lycopersicon esculentum

Christiane Stuhlfelder

Würzburg 2004

Reinigung, Klonierung und heterologe Expression der Methyljasmonat-Esterase aus

Lycopersicon esculentum

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Christiane Stuhlfelder

aus

Rosenheim

Würzburg, 2004

Eingereicht am:

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Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender: ………………………………

1. Gutachter: Prof. Dr. M. J. Müller

2. Gutachter: Prof. Dr. W. Kaiser

Tag des Promotionskolloquiums:

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Promotionsurkunde ausgehändigt am:

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In Liebe meinen Eltern und meinem Bruder Thorsten

Große Liebe und großer Erfolg sind stets mit großem Risiko verbunden.

Dalai Lama

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis I. Einleitung …............................................................................................ 1 1. Jasmonate ……...................................................................................... 1

1.1. Biosynthese der Jasmonate ……............................................................. 3 1.2. Regulation und Lokalisation der Enzyme der Jasmonat-Biosynthese .... 7

2. Jasmonsäure-vermittelter Signalübertragungsweg ............................... 10

2.1. JA-Biosynthese vorgeschalteter Signalübertragungsweg ....................... „Upstream Signalling“ ............................................................................... 11 2.2. JA-Biosynthese nachgeschalteter Signalübertragungsweg .................... „Downstream Signalling“ ......................................................................... 12

3. Flüchtige Signalstoffe in der pflanzlichen Abwehr ................................. 14

3.1. Rolle der Jasmonate bei Interaktionen zwischen pflanzlichen und ......... tierischen Organismen ............................................................................ 15 3.2. Rolle der Jasmonate bei Interaktionen zwischen Pflanzen ..................... „Airborne Signalling“ ............................................................................... 16

4. Welche Jasmonate sind biologisch aktiv und wirken als intrazelluläre .. Signalstoffe? .......................................................................................... 18

5. Methyljasmonat als Signalstoff .............................................................. 20

6. Zielsetzung der Arbeit ……..................................................................... 21 II. Material .………....................................................................................... 22 1. Pflanzenmaterial …………….................................................................. 22

2. Bakterienstämme ...........………............................................................. 23

3. Züchtungsbedingungen und Stammhaltung ……................................... 23

4. Kulturmedien …….................................................................................. 24

5. Pufferlösungen ……............................................................................... 24

6. Nucleinsäuren und Nucleotide ……....................................................... 25

7. Enzyme und Molekularbiologische Kits …….......................................... 27

8. Chemikalien ………................................................................................ 28

9. Verbrauchsmaterialien .………............................................................... 29

10. Geräte ..………....................................................................................... 30 III. Methoden ……....................................................................................... 34 1. Darstellung chemischer Verbindungen ..........................................….... 34

1.1. Synthese von racemischem [Methyl-3H]Methyljasmonat ........................ 34 1.2. Herstellung von Diazomethan ................................................................. 34 1.3. Herstellung potentieller Substrate für Enzymaktivitätsbestimmungen .... durch Methylierung mit Diazomethan ...................................................... 35 1.4. Herstellung von Diazoethan .................................................................... 35 1.5. Ethylierung freier Säuren bzw. umgesetzter MeJA-Esterase-Substrate .. mit Diazoethan ........................................................................................ 36

Inhaltsverzeichnis II

2. Chromatographische Methoden .................................…….................... 36

2.1. Dünnschichtchromatographie ................................................................. 36 2.2. Festphasenextraktion (SPE) ................................................................... 37 2.3. Gaschromatographie (GC) ...................................................................... 38

3. Massenspektrometrie (MS) ...........................................……................. 38

4. Radioaktivitätsbestimmungen ...................................................……….. 39

5. Proteinbiochemische Methoden ............................................................ 39

5.1. Proteingehaltsbestimmungen .................................................................. 39 5.2. SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ............................. 39 5.3. Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen ........................................ 41 5.4. Konservierung gefärbter Gele ................................................................. 42 5.5. Größenbestimmung von Proteinen in Gelen ........................................... 42 5.6. Transfer von Proteinen (Western-Blot) und Immunodetektion ................ 43

6. Reinigung von Proteinen ....................................................................... 44

6.1. Konzentrieren, Entsalzen und Umpuffern von Proteinlösungen ............. 44 6.2. Gewinnung zellfreier Enzympräparationen aus pflanzlichen .................. Zellsuspensionskulturen und differenziertem Pflanzengewebe .............. 45 6.3. Protein-Überexpression der rekombinanten MeJA-Esterase .................. 46 6.4. Chromatographische Aufreinigung von Proteinen .................................. 47 6.4.1. Anionenaustausch-Chromatographie .................................................. 47 6.4.2. Hydroxyapatit-Chromatographie an einer Bio-Scale CHT5 ................. Chromatographiesäule .......................................................................... 49 6.4.3. Größenausschluss-Chromatographie ...................…............................ 50 6.4.4. Affinitätschromatographische Reinigung an immobilisierten ................ Metallionen (BD Talon™-Material) ....................................................... 51 6.4.5. Isoelektrische Fokussierung an einer Mono P HR 5/5 ......................... Chromatographie-Säule ....................................................................... 52

7. Mikrosequenzierung von Proteinen ....................................................... 53

7.1. Sequenzierung von Peptidfragmenten .................................................... 53 7.2. N-terminale Sequenzierung von Proteinen ............................................. 54

8. Molekularbiologische Methoden ............................................................ 55

8.1. Nukleinsäuregehaltsbestimmung ............................................................ 55 8.2. Präparation von Nucleinsäuren ............................................................... 55 8.2.1. RNA-Präparation nach der Lithiumchlorid-Methode ............................ 55 8.2.2. RNA-Präparation mit der Trizol-Methode ............................................. 56 8.2.3. RNA-Präparation mit dem Qiagen-Kit RNeasy Plant Mini ................... 56 8.2.4. Präparation genomischer DNA aus Pflanzenzellen ............................. 57 8.2.5. Präparation von Plasmid-DNA ............................................................. 58 8.2.6. Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ................................ 59 8.3. Agarosegele ............................................................................................ 59 8.4. Transfertechniken ................................................................................... 60 8.5. Hybridisierung von Nucleinsäuren .......................................................... 62 8.6. Herstellung und Transformation kompetenter Zellen .............................. 64 8.7. Polymerasekettenreaktion (PCR) ............................................................ 65 8.8. PCR als Reihentest auf positive Transformanten ................................... 66 8.9. Enzymatische Modifikationen von Nucleinsäuren ................................... 66 8.9.1. Restriktionsanalyse .............................................................................. 66 8.9.2. Ligation ................................................................................................. 67 8.9.3. Dephosphorylierung ............................................................................. 67 8.9.4. Reverse Transkription (RT) .................................................................. 68

Inhaltsverzeichnis III

8.10. Amplifizierung von 5´-Enden (5´-RACE) oder 3´-Enden (3´-RACE) ....... von cDNA-Fragmenten ........................................................................... 69

9. Sequenzierung von DNA ....................................................................... 69

10. Computeranalysen und Datenbankvergleiche ....................................... 69 IV. Ergebnisse ........................................................................................... 70 1. Reinigung der Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase) ................... 70

1.1. Synthese von racemischem [Methyl-3H]Methyljasmonat ........................ ([Methyl-3H]MeJA) ................................................................................... 71 1.2. Entwicklung von Methoden zur Messung der Methyljasmonat- .............. Esterase (MeJA-Esterase) Aktivität ........................................................ 73 1.2.1. Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit Methyl-[2-14C] jasmonat (Methyl-[2-14C]JA) ................................................................. 73 1.2.2. Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit [Methyl-3H]..................... Methyljasmonat ([Methyl-3H]MeJA) ...................................................... 76 1.2.3. Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit p-Nitrophenylacetat ...... 77 1.3. MeJA-Esterase Aktivität in verschiedenen Zellsuspensionskulturen ...... 79 1.4. Kinetische Untersuchungen zur MeJA-Esterase Aktivität in ................... Lycopersicon esculentum-Zellkulturen .................................................... 81 1.5. Reinigung der MeJA-Esterase ................................................................ 82 1.5.1. Herstellung eines Rohextraktes und fraktionierte ................................. Ammoniumsulfatfällung ........................................................................ 82 1.5.2. Ionenaustausch-Chromatographie an Q-Sepharose „Fast Flow“ ........ (2.6 cm x 20 cm) .................................................................................. 84 1.5.3. Größenausschluss-Chromatographie an HiLoad Superdex 200 ......... (1.6 cm x 60 cm) .................................................................................. 85 1.5.4. Hydroxyapatit-Chromatographie an Bio-Scale CHT5 (1.0 x 6.4 cm) ... 87 1.5.5. Ionenaustausch-Chromatographie an Bio-Scale Q2 (0.7 x 5.2) .......... 88 1.5.6. Ionenaustausch-Chromatographie an Mono-Q HR 5/5 ........................ (0.5 cm x 5.0 cm) ................................................................................. 90 1.5.7. Zusammenfassende Übersicht der Reinigung des Enzyms ................ MeJA-Esterase ..................................................................................... 91 1.6. Bestimmung des Molekulargewichts ....................................................... 94 1.6.1. Gelfiltration ........................................................................................... 94 1.6.2. SDS-PAGE ........................................................................................... 95 1.7. Bestimmung interner und N-terminaler Aminosäuresequenzen ............ 97 1.7.1. Bestimmung interner Aminosäuresequenzen ...................................... 97 1.7.2. Bestimmung einer N-terminalen Aminosäuresequenz ......................... 98 1.8. Datenbankrecherche ............................................................................... 99 1.9. Darstellung der Homogenität .................................................................. 102

2. Klonierung der MeJA-Esterase .............................................................. 103

2.1. Strategie zum Klonieren der MeJA-Esterase .......................................... 103 2.2. Klonierung eines internen cDNA-Fragmentes der MeJA-Esterase ......... 104 2.2.1. Entwurf degenerierter Primer zur Klonierung der MeJA-Esterase ....... 104 2.2.2. Auswahl eines geeigneten Klonierungsvektors und Subklonierung ..... der PCR-Fragmente ............................................................................. 109 2.2.3. Sequenzierung des internen cDNA-Fragmentes ................................. 110 2.3. RACE – Isolierung der Volllängen-cDNA und Sequenzanalyse ............. 112 2.3.1. Prinzip der RACE ................................................................................. 112 2.3.2. Erststrangsynthese .............................................................................. 113 2.3.3. Entwicklung der Primer und Vortest für die 5´- und 3´-RACE-PCR ..... 113 2.3.4. Amplifizierung der cDNA-Enden (Zweitstrangsynthese) ...................... 116

Inhaltsverzeichnis IV

2.3.5. Subklonierung und Sequenzierung der 5´- und 3´-RACE .................... cDNA-Fragmente ................................................................................. 118

3. Übersicht über die Klonierung der MeJA-Esterase ............................... 119

4. Nucleotid- und Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase ...................... 120

5. Experimente zur Untersuchung des MeJA-Esterasegens ..................... 121

6. Klonierung eines Expressionskonstruktes der MeJA-Esterase ............. 123

6.1. Entwurf spezifischer Primer zur Klonierung eines Expressions- ............. konstruktes der MeJA-Esterase .............................................................. 123 6.2. Amplifizierung der Volllänge-cDNA und Subklonierung .......................... 124 6.3. Konstruktion des Expressionsvektors ..................................................... 127

7. Übersicht über die Konstruktion des Expressionsvektors ..................... 131

8. Protein-Überexpression und chromatographische Reinigung der ......... MeJA-Esterase ...................................................................................... 132

8.1. Protein-Überexpression .......................................................................... 132 8.2. Reinigung der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase ...................... 133 8.2.1. Ionenaustausch-Chromatographie an Q-Sepharose „Fast Flow“ ........ (2.6 cm x 20 cm) .................................................................................. 133 8.2.2. Größenausschluss-Chromatographie an Sephacryl S-100 HR ........... 26/60 (2.6 cm x 60 cm) ........................................................................ 133 8.2.3. Ionenaustausch-Chromatographie an Mono Q HR 5/5 ........................ (0.5 cm x 5.0 cm) ................................................................................. 134 8.2.4. Affinitäts-Chromatographie an Talon™-Material .................................. 134 8.2.5. Darstellung der Homogenität und Western-Blot der rekombinanten .... MeJA-Esterase ..................................................................................... 135 8.2.6. Zusammenfassende Übersicht über die Reinigung der rekombinant .. exprimierten MeJA-Esterase ................................................................ 136

9. Identifizierung des Reaktionsproduktes der nativen und rekombinant .. exprimierten MeJA-Esterase ................................................................. 137

9.1. Identifizierung des Reaktionsproduktes von MeJA nach Inkubation ....... mit der nativen MeJA-Esterase ............................................................... 137 9.2. Identifizierung des Reaktionsproduktes von MeJA nach Inkubation ....... mit der rekombinanten MeJA-Esterase ................................................... 139

10. Vergleichende Charakterisierung der rekombinant exprimierten .......... und der nativen MeJA-Esterase ............................................................ 140

10.1. Biochemische Charakterisierung der nativen MeJA-Esterase ................ 140 10.1.1. pH-Optimum ......................................................................................... 140 10.1.2. Temperaturoptimum ............................................................................. 141 10.1.3. Isoelektrischer Punkt ............................................................................ 141 10.1.4. Hemmung der MeJA-Esterase durch Proteaseinhibitoren ................... 143 10.1.5. Analyse der Proteinmasse der nativen MeJA-Esterase mittels ........... ESI-TOF MS (Electrospray Ionization Time of Flight ………………….. Mass Spectrometry) ……………………………………………................. 144 10.2. Vergleichende Substratspezifität der nativen und der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase ................................................................... 144 10.2.1. Substratspezifität der nativen MeJA-Esterase ..................................... 144 10.2.2. Substratspezifität der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase ........ 146 10.3. Vergleichende enzymologische Charakterisierung der nativen .............. und der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase ................................. 147

Inhaltsverzeichnis V

11. Untersuchungen zur mRNA-Expression und spezifischen Aktivität ...... 149

11.1. Gewebsspezifische Expression der MeJA-Esterase ............................... 149 11.2. Spezifische Aktivität der MeJA-Esterase in verschiedenen Geweben .... von L. esculentum cv. Moneymaker ........................................................ 150 11.3. MeJA-Esterase Expression nach Zugabe von Methyljasmonat, ............. Methylsalicylat, Chitosan zu Zellsuspensionskulturen von L. esculentum 151 V. Diskussion ............................................................................................. 153 1. Reinigung, Klonierung und Überexpression der MeJA-Esterase .......... 153

1.1. Reinigung und Identifizierung der MeJA-Esterase .................................. 154 1.2. Klonierung der MeJA-Esterase ............................................................... 155 1.3. Heterologe Expression und Reinigung der rekombinanten MeJA- ......... Esterase .................................................................................................. 156

2. Biochemische Charakterisierung der MeJA-Esterase ........................... 158

2.1. Substratspezifität und Reaktionskinetik .................................................. 158 2.2. Bestimmung der apparenten molekularen Masse der MeJA-Esterase ... 159

3. Datenbankvergleiche („Multiple Sequence Alignment“) ........................ 161

3.1. Die „α/β-Fold“-Hydrolase-Superfamilie ................................................... 162 3.2. Katalytische Triade der MeJA-Esterase .................................................. 164

4. Funktion pflanzlicher Esterasen ............................................................ 165

5. Signaltransduktion in der Wundreaktion ................................................ 166

6. Biologische Aktivität von Methyljasmonat .............................................. 169

7. Ausblick ................................................................................................. 170 VI. Zusammenfassung ............................................................................. 172 VII. Literaturverzeichnis .......................................................................... 178

Abkürzungsverzeichnis VI

Abkürzungsverzeichnis APS Ammoniumpersulfat bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin CTAB Hexadecyltrimethyl-Ammoniumbromid DEPC Diethylpyrocarbonat DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EtOH Ethanol EtSH β-Mercaptoethanol FA Formaldehyd-Puffer HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl.: high

performance liquid chromatography) IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid JA Jasmonsäure kat Katal (Enzymmenge, die 1 Mol Substrat pro Sekunde umsetzt) kb Kilobasen MeJA Methyljasmonat MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure MS Massenspektroskopie m/z Verhältnis Masse zu Ladung PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR Polymerase-Kettenreaktion PVDF Polyvinylidendifluorid PVPP Polyvinylpolypyrrolidon Rf relative Laufstrecke zur Front RNase Ribonuklease rpm rounds per minute RT Raumtemperatur, reverse Transkriptase SSC Natriumchlorid/Natriumcitrat-Puffer SDS Natriumdodecylsulfat SPE Festphasenextraktion (engl.: solid phase extraction) SV Säulenvolumen TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TE Tris-EDTA-Puffer TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin TLE Tris-Lithiumchlorid-EDTA-Puffer Tricin N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycin Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan v/v Volumen pro Volumen VT Volumenteil w/v Gewicht pro Volumen

I. Einleitung 1

I. Einleitung

Die Sonne spricht zu uns mit Licht, Mit Duft und Farbe spricht die Blume,

Mit Wolken, Schnee und Regen spricht die Luft.

Farbe und Duftstoffe, die von Pflanzen produziert werden, sollen nicht nur Menschen „ansprechen“ wie es Hermann Hesse in seinem Gedicht „Sprache“ formuliert. Vielmehr handelt es sich um eine „lautlose“ Kommunikation der Pflanzen mit ihrer Umgebung, die auf chemischer und physikalischer Ebene stattfindet. Bei vielzelligen höheren Tieren kann die Abstimmung zwischen den einzelnen Teilen des Organismus sowohl durch nervöse als auch hormonale Signale über den Blutkreislauf erfolgen. Pflanzen besitzen kein Nervensystem, so dass hier die Koordination zwischen einzelnen Zellen, Geweben oder Organen durch chemische Signale erfolgen kann. Handelt es sich nun bei diesen chemischen Mediatoren der Pflanze um Hormone im klassischen Sinne? Hormone sind chemische Botenstoffe des menschlichen und tierischen Körpers. Ihrer historischen Definition entsprechend werden sie in bestimmten Organen (Drüsen mit innerer Sekretion, endokrine Gewebe) gebildet und in die Blutbahn abgegeben werden, um an anderer Stelle des Organismus ihre spezifische, für die Aufrechterhaltung der Körperfunktion notwendige Wirkung zu entfalten. Analog zum tierischen Organismus bezeichnet man als Pflanzenhormon oder auch Phytohormon eine organische Substanz, die in (sub-)mikromolaren Konzentrationen an einem Syntheseort gebildet wird, in der Pflanze zum Wirkort transportiert wird und eine spezifische Reaktion auslösen kann. Allerdings können einige Phytohormone auch intrazellulär in den Erzeugerzellen zur Wirkung kommen. Streng genommen dürfen sie dann nicht mehr als Hormone im „klassischen Sinn“ bezeichnet werden (DAVIES, 1995). Zu den ersten fünf Pflanzenhormonen, die entdeckt wurden zählen Gibberellinsäure, Abscisinsäure, Ethylen, Auxin und Cytokinin (GAZZARRINI und MCCOURT, 2003; VOGLER und KUHLEMEIER, 2003; KAKIMOTO, 2003). Inzwischen konnte auch gezeigt werden, dass Brassinosteroide (CLOUSE, 2002), Polyamine (PANDEY et al., 2000), Salicylsäure (OVERMYER et al., 2003) und Jasmonsäure (DEVOTO und TURNER, 2003) regulatorische Effekte auf die Pflanzenentwicklung haben. 1. Jasmonate Der Begriff „Jasmonate“ leitet sich vom Phytohormon Jasmonsäure ab und umfasst Jasmonsäure, Jasmonsäure-Metabolite und alle biochemischen Vorstufen, die zur Bildung von Jasmonsäure führen (WEBER, 2002). Im Fall der Jasmonate vergingen

I. Einleitung 2

fast 20 Jahre intensiver Forschung, bis man ausgehend von der Isolierung der Jasmonsäure (JA) und Jasmonsäuremethylester (Methyljasmonat, MeJA), ihre Rolle als Regulatoren pflanzlicher Abwehrreaktionen und Entwicklungsprozesse erkannte. Nicht der physiologischen Bedeutung der beiden Verbindungen, sondern der Attraktivität des Jasminöls als Duftstoff und seiner aufwendigen Gewinnung (zur Produktion von 1 kg Jasminöl werden etwa 8 Mio. Jasminblüten benötigt) war es zu verdanken, dass 1962 Methyljasmonat als Hauptkomponente des Jasminduftes (Jasminum grandiflorum) isoliert wurde (DEMOLE et al., 1962). Abb. I.1.: Jasminum grandiflorum L.: Methyljasmonat wurde 1962 erstmals als Hauptduftstoffkomponente des

ätherischen Öles isoliert (DEMOLE et al., 1962). Zehn Jahre später konnte die freie Jasmonsäure aus dem Filtrat des Pilzes Botryodiploida (syn. Lasiodiploida theobromae) (ALDRIDGE et al., 1971) gewonnen werden. Zahlreiche Jasmonate, zu denen Tuberonsäure, Cucurbinsäure, Aminosäure-Konjugate und Glucoseester der JA zu zählen sind, wurden nachfolgend in höheren Pflanzen identifiziert (HAMBERG und GARDNER, 1992; SEMBDNER und PARTHIER 1993). JA konnte bisher in allen soweit untersuchten Pflanzen nachgewiesen werden. Der Funktion eines Phytohormons entsprechend, wird eine ubiquitäre Verbreitung in Pflanzen postuliert (CREELMAN und MULLET, 1997a). Jasmonate beeinflussen viele physiologische Prozesse in der Pflanze. Einerseits hemmen sie auxininduziertes Streckungswachstum, zytokinin- und auxinreduziertes Kalluswachstum, Samenkeimung, Wurzelwachstum und Photosynthese der Pflanzen, andererseits induzieren sie Rankenspiralisierung, Proteinspeicherung, Knollenbildung, Fruchtreifung und Samenentwicklung (Übersichten in CREELMAN und MULLET, 1997b; MUELLER, 1997; SEMBDNER und PARTHIER, 1993). Ursprünglich ging man davon aus, dass Jasmonate vorwiegend eine Rolle in der pflanzlichen Entwicklung spielen. Ihre Signalwirkung bei der Herbivor- und Pathogenabwehr wurde erst Anfang der 90er Jahre deutlich (FARMER und RYAN, 1990). Pflanzen ist es gemeinsam, dass sie auf biotische und abiotische Stressfaktoren mit einem Anstieg von Jasmonaten reagieren (Abb. I.2). Exogen applizierte Jasmonate induzieren eine

I. Einleitung 3

Reihe von stressinduzierten Genen, weshalb Jasmonate als Stressmediatoren angesehen werden (KRAMELL et al., 2000; WASTERNACK und HAUSE, 2000). Bekanntestes Beispiel einer Signalwirkung von Jasmonaten ist die Induktion von Proteinaseinhibitoren in Blättern von Solanaceen wie z. B. Tomate, als Abwehrstrategie der Pflanze zum Schutz vor Schädlingen (FARMER und RYAN, 1992).

Abb. I.2.: Bildung von Jasmonaten in Abhängigkeit von entwicklungsphysiologischen Faktoren und

Umwelteinflüssen. Jasmonate wirken als zelluläre Regulatoren verschiedener Entwicklungsprozesse und sind an Mechanismen der Pflanze zur Abwehr von Pathogenen, Herbivoren und zur Kompensation abiotischer Stressfaktoren beteiligt (CHEONG und CHOI, 2003; modifiziert).

1.1. Biosynthese der Jasmonate Jasmonate werden überwiegend über den sogenannten Octadecanoidweg gebildet. Als Octadecanoide werden alle Verbindungen bezeichnet, die sich von C18-Fettsäuren ableiten, darunter Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure. In Arabidopsis thaliana wird neben dem Octadecanoidweg die Existenz eines zweiten Stoffwechselweges vermutet, der zur Biosynthese von JA führen kann. Dieser Biosyntheseweg wird als Hexadecanoidweg bezeichnet. Als Ausgangsverbindung für die Synthese der JA dient Hexadecatriensäure (16:3) und nicht α-Linolensäure (18:3) wie beim Octadecanoidweg. Als einziges Intermediat des Hexadecanoidweges konnte bisher dnOPDA identifiziert werden (WEBER, 1997). Die Aufklärung der einzelnen Biosyntheseschritte des Octadecanoidweges wurde 1978 durch die Arbeitsgruppen um Vick und Zimmermann begonnen (VICK und ZIMMERMANN, 1979, 1983, 1984). Die Bildung der JA beginnt vermutlich mit der Freisetzung von α-Linolensäure, die durch Lipasen aus Membranen herausgelöst wird (WEILER et al., 1998). Bestätigt wurde diese Hypothese durch die

I. Einleitung 4

Charakterisierung der männlich sterilen Arabidopsis thaliana-Mutante dad1 („defective in anther dehiscence“; ISHIGURO et al., 2001), die einen Defekt in der JA-Biosynthese aufweist. Allerdings sind nur die Antheren von diesem Defekt betroffen, während in den übrigen Geweben JA synthetisiert werden kann. Der Phänotyp der dad1-Mutante weist signifikant niedrigere JA-Spiegel im Vergleich zum Wildtyp auf und ist in seiner Blütenentwicklung gestört. Der Defekt kann durch die Gabe von α-Linolensäure oder JA komplementiert werden. Das isolierte DAD1-Gen codiert für eine chloroplastidäre Phospholipase A1 (PLA1) und hat hohe Homologie zu Triacylglycerid-Lipasen. DAD1 katalysiert in reproduktivem Gewebe die Freisetzung von α-Linolensäure als ersten Schritt der JA-Biosynthese (ISHIGURO et al., 2001). DAD1 ist hingegen nicht beteiligt an der wund-induzierten Biosynthese von JA. Nach Verwundung stiegen die JA-Spiegel sowohl in Blättern der dad1-Mutante als auch im Wildtyp mehr als 100-fach an. Dieser Befund deutet darauf hin, dass es neben DAD1 weitere lipolytische Enzyme gibt, die für die Freisetzung von freien Fettsäuren nach Verwundung verantwortlich sind. Nach Verwundung von Tomatenblättern konnte eine erhöhte Phospolipaseaktivität (Phospholipase A2, PLA2) nachgewiesen werden (NARVÁEZ-VÁSQUEZ et al., 1999). Die Beteiligung der Phospholipase D (PLD) an der wund-induzierten JA-Akkumulation in A. thaliana konnte mittels eines Antisense-Konstruktes, das die Expression einer PLD unterdrückt, gezeigt werden (WANG et al., 2000). Möglicherweise spielen PLA2 und PLD nur eine Rolle bei der wund-induzierten Akkumulation von JA, während DAD1 α-Linolensäure in den Antheren für die Biosynthese von JA bereitstellt. Nach Bereitstellung von α-Linolensäure durch ein lipolytisches Enzym, kann Linolenat durch eine 13-Lipoxygenase zur 13-(S)-Hydroxyperoxyoctadecatriensäure (HPOT) oxygeniert werden. Das entstehende Hydroperoxid kann auch durch Hydroperoxidlyase, Divinylethersynthase, Epoxyalkohol-Synthase, Lipoxygenase und Peroxidase in andere Stoffwechselwege eingeführt werden (BLEE, 1998). Die Biosynthese von JA ist somit einer von sechs möglichen Wegen zur Metabolisierung von Hydroxyperoxyverbindungen, die durch eine Lipoxygenase bei der Lipidperoxidation entsteht. Die Produkte dieser Lipidperoxidation werden als Oxylipine zusammengefasst (WASTERNACK und HAUSE, 2000). Die „Jasmonsäure-Kaskade“ startet mit der Umsetzung von 13-(S)-Hydroxyperoxyoctadecatriensäure (HPOT) durch die Allenoxidsynthase (AOS). Hierbei wird ein chemisch instabiles Allenepoxid, 12,13-(S)-Epoxy-9,11,15-Octadecatriensäure (EOT), gebildet (BRASH et al., 1988; HAMBERG, 1988). Das Allenoxid kann anschließend durch das Enzym Allenoxid-Cyclase in ein Cyclopentenon-Derivat, 9(S),13(S)-12-Oxo-Phytodiensäure (OPDA), überführt werden. Die entstandene OPDA wiederum kann durch eine NADPH-abhängige Reduktase zu 10,11-Dihydro-12-Oxo-Phytodiensäure hydriert

I. Einleitung 5

Abb. I.3.: Biosynthese und Wirkung von Jasmonaten (nach TURNER und DEVOTO, 2002; modifiziert) HPOTE:

Hydroxyperoxyoctadecatriensäure; EOT: 12,13(S)-Epoxy-9(Z),11E,15(Z)-octadecatriensäure.

I. Einleitung 6

werden. Nach drei Runden β-Oxidation an der Carboxylseitenkette entsteht 3(R),7(S)-(+)-7-epi-JA, die im Gleichgewicht mit der isomeren 3(R),7(R)-(-)-JA steht (LEÓN und SÁNCHEZ-SERRANO, 1999; WEILER et al., 1998). Betrachtet man die Konfiguration der gebildeten Jasmonate, so zeigt sich, dass während der gesamten Biosynthese die thermodynamisch ungünstigere cis-Konfiguration für die Seitenketten beibehalten wird, so dass ausschließlich 3(R),7(S)-(+)-7-epi-JA entsteht. Erst durch eine Epimerisierung in der Pflanze oder während eines Extraktionsprozesses entsteht vorwiegend 3(R),7(R)-(-)-JA. Im thermodynamischen Gleichgewicht beträgt das Verhältnis des trans-(3R,7R)-Epimers zum cis-(3R,7S)-Epimer ca. 9:1 (MÜLLER, 1997). Käufliches Methyljasmonat, das synthetisch hergestellt wird, enthält außerdem neben den beiden Diastereomeren noch die entsprechenden Enantiomere. Die Bildung des Methyljasmonats in A. thaliana wurde kürzlich durch SEO et al. (2001) aufgeklärt. Eine Methylgruppe von S-Adenosyl-L-Methionin wird hierbei durch die Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT) auf JA übertragen. Neben Methyljasmonat kann Jasmon, eine weitere flüchtige Komponente aus JA in einigen Pflanzen gebildet werden. Dabei durchläuft JA eine vierte Runde β-Oxidation. Bei Jasmon handelt es sich nicht wie lange angenommen, um ein Abfallprodukt der JA-Biosynthese, sondern eine weitere Verbindung, die die pflanzliche Abwehr beeinflussen kann (BIRKETT et al., 2000). Abb. I.4.: Stereoisomere von Jasmonsäure

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1.2. Regulation und Lokalisation der Enzyme der Jasmonat-Biosynthese Eine Regulation der Jasmonat-Biosynthese ist durch die Verfügbarkeit der Ausgangsverbindung α-Linolensäure und durch eine transkriptionelle Regulation der beteiligten Enzyme möglich. Die Freisetzung der α-Linolensäure durch Lipasen aus Membranlipiden kann ein erster geschwindigkeitsbestimmender Schritt der JA-Biosynthese sein (FARMER und RYAN, 1992). Da freie α-Linolensäure und 13-Lipoxygenase konstitutiv in Zellen vorkommen, sind Substrat und Enzym möglicherweise unterschiedlich kompartimentiert. Appliziert man α-Linolensäure an Pflanzen, beobachtet man eine sofortige Synthese von JA. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die JA-Kaskade durch das Substrat limitiert ist. Die in der Zelle konstitutiv vorhandene, freie Linolensäure übersteigt um ein Vielfaches die Menge an JA, die als Reaktion auf eine Induzierung gebildet wird und könnte zur Deckung des Substratbedarfs für die JA-Neusynthese ausreichen. Dennoch verdoppelt sich der Linolensäuregehalt in der Zelle nach Verwundung (CONCONI et. al., 1996; RYU und WANG, 1998) und nach Behandlung von Zellsuspensionskulturen mit einem Hefezellwand-Elicitor (MÜLLER et al., 1993). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Linolensäure durch eine Lipase aus Membranlipiden freigesetzt werden muss und nicht freie Linolensäure für eine JA-Synthese rekrutiert wird. In den Antheren von A. thaliana kann die Freisetzung von α-Linolensäure durch eine Phospholipase A1 (PLA1) reguliert werden (ISHIGURO et al. 2001). Zur Regulation der Lipasen, die für eine wund-induzierte JA-Synthese verantwortlich sind, gibt es bislang keine Daten. Eine erhöhte Aktivität von Phospholipase A2 (PLA2) konnte nach Verwundung von Tomatenblättern (NARVÁEZ-VÁSQUEZ et al., 1999) und Infektion von Tabakblättern mit dem Tabakmosaikvirus nachgewiesen werden (DHONDT et al., 2000). Hinweise für eine Rolle der Phospholipase D (PLDα) bei der Stressantwort und einer damit verbundenen Umgestaltung und Reorganisation von Membranen lieferten Studien von WANG et al. (1999, 2000). Bislang konnte nur eine Korrelation zwischen PLA2, PLDα-Aktivität und einem Anstieg von Jasmonaten und kein direkter Zusammenhang hergestellt werden. Die nächsten drei enzymatischen Schritte, katalysiert durch 13-Lipoxygenase (LOX), Allenoxidsynthase (AOS) und Allenoxidcyclase (AOC) sind in Chloroplasten lokalisiert. In A. thaliana konnten sechs verschiedene LOX-Gene (AtLox1 bis AtLox6) kloniert werden, wobei bislang nur AtLox1 und AtLox2 näher charakterisiert sind. AtLox1 codiert vermutlich für ein cytosolisches Enzym (FEUSSNER und WASTERNACK, 2002). Das Genprodukt von AtLox2 hingegen ist eine plastidäre LOX (LOX2), die im Stroma lokalisiert ist und für die wund-induzierte JA-Biosynthese verantwortlich ist. Transgene Arabidopsis-Pflanzen, welche eine verminderte Expression der AtLOX2 aufwiesen, zeigten nach Verwundung im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen keinen

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Abb. I.5.: Kompartimentierung der Jasmonsäurebiosynthese (WEILER et al., 1998; modifiziert). LA(18:3):

α-Linolensäure; 13(S)-HPOT: 13(S)-Hydroxyperoxyoctadecatriensäure; EOT: 12,13(S)-Epoxy-

9(Z),11(E), 15(Z)-octadecatriensäure; OPDA: 12-Oxo-Phytodiensäure; dH-OPDA: 10,11-

Dihydro-12-Oxo-Phytodiensäure; JA: Jasmonsäure; MeJA: Methyljasmonat.

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Anstieg von JA (BELL et al., 1995). Allerdings scheint AtLOX2 nicht für die Aufrechterhaltung der JA-Konzentration unter normalen Bedingungen essentiell zu sein, da transgene Pflanzen, in denen die LOX2 Akkumulation durch Cosuppression reduziert war, ähnliche basale JA-Konzentrationen wie der Wildtyp aufwiesen. Für eine plastidäre LOX aus Tomate (TomLoxD) konnten HEITZ et al. (1997) zeigen, dass Verwundung, Behandlung mit Systemin und MeJA zu einem transienten Anstieg von LOX mRNA führt. Die Enzyme AOS und AOC sind in Chloroplasten lokalisiert (BLEE und JOYARD, 1996; FRÖHLICH et al., 2001; ZIEGLER et al., 2000). AOS gehört zur Familie der Cytochrom P450 Enzyme (CYP74A) (CREELMAN und RAO, 2002). Verwundung führte zu einem schnellen, transienten Anstieg der AOS-mRNA und zur Zunahme der AOS-Aktivität, die in verwundeten Blättern stärker induziert wurde als in benachbarten, distalen Blättern von Arabidopsis (LAUDERT und WEILER, 1998). Wird AOS in Arabidopsis- oder Tabakpflanzen überexprimiert, so zeigen die transgenen Pflanzen keine Änderung der JA-Spiegel im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen. Nach Verwundung hingegen stiegen die JA-Spiegel der transgenen Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen signifikant stärker an (LAUDERT et al., 2000). Diese Befunde lassen vermuten, dass neben der Freisetzung von α-Linolensäure auch die Kapazität zur Bildung von JA eine wichtige Rolle spielt: Die Menge an LOX, AOS und AOC determiniert nämlich, wie viel Substrat dem JA-Weg auf Kosten anderer Wege zugeführt wird. Eine kürzlich aus Tomate klonierte AOC (ZIEGLER et al., 2000) wird durch ein Gen kodiert, das spezifisch in Samenanlagen junger Blüten und Leitbündeln exprimiert wird (HAUSE et al., 2000). Eine Systemin-abhängige AOC-Expression und eine AOC-abhängige Amplifikation der lokalen Wundantwort über eine Leitbündel-spezifische Generierung von Jasmonaten konnten STENZEL et al. (2003) durch Versuche an transgenen Tomatenpflanzen nachweisen. Die JA-Biosynthese kann somit durch Substratverfügbarkeit, möglicherweise durch eine Aktivitätskontrolle bereits vorhandener Enzyme und auf transkriptionellem Wege kontrolliert werden. Diese Mechanismen können ein positives Feedback auslösen. In Chloroplasten wird die Existenz eines 12-Oxo-Phytodiensäure-Synthasekomplexes, bestehend aus AOS und AOC diskutiert (WEILER et al., 1998). Da das Allenepoxid, das Produkt der AOS sehr instabil ist, wird ein kurzer Diffusionsweg von der AOS zur AOC diskutiert (BLEE, 1998). Die Bildung der 12-Oxophytoensäure (OPC-8) erfolgt durch eine 12-Oxo-Phytodiensäure-Reduktase (OPR) (SCHALLER und WEILER, 1997). Inzwischen sind in A. thaliana (AtOPR) und Tomate (LeOPR) drei Isoformen von OPDA-Reduktasen (OPR 1, 2 und 3) identifiziert worden. Bei AtOPR1, AtOPR2, AtOPR3, LeOPR 1 und LeOPR 3 handelt es sich um NADPH-abhängige Flavoproteine der Familie der „Old

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Yellow Enzymes“ aus Hefen. LeOPR 2 zeigt hohe Homologie zu LeOPR1 und LeOPR3, gehört aber nicht zu dieser Klasse von Enzymen und besitzt keinen Flavin-Cofaktor wie die übrigen Enzyme. LeOPR2 ist nicht in der Lage 9(S),13(S)-12-Oxo-Phytodiensäure zu reduzieren und die endogenen Substrate dieses Enzyms sind noch nicht bekannt. AtOPR1, AtOPR2 und LeOPR1 akkzeptieren eine große Zahl α,β-ungesättigter Carbonylverbindungen als Substrate (STRASSNER et al., 1999, BREITHAUPT et al., 2001). Lediglich OPR3 ist in der Lage, das für die Biosynthese der JA relevante cis-(+)-Enantiomer der 12-Oxo-Phytodiensäure zu reduzieren (SCHALLER et al., 2000). Lange wurde angenommen, dass OPR-Reduktasen ausschließlich im Cytosol vorkommen. STRASSNER et al. (2002) konnten hingegen zeigen, dass OPR3 ein peroxisomales Enzym ist, während OPR1 und OPR2 cytosolische Enzyme sind. 12-Oxo-Phytodiensäure wird möglicherweise über Transporter in die Peroxisomen eingeschleust und anschließend durch OPR3 zur 10,11-Dihydro-12-Oxo-Phytodiensäure reduziert. Die β-Oxidation der 10,11-Dihydro-12-Oxo-Phytodiensäure zur JA findet vermutlich in Peroxisomen statt (VICK und ZIMMERMANN, 1984; SCHALLER, 2001). Um wirksam zu werden, muss JA anschließend ins cytosolische Kompartiment wechseln. Dieser Vorgang wird vermutlich ebenfalls durch Transporterproteine katalysiert. Im Cytosol kann die Methylierung von JA zu MeJA durch die Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT) mit S-Adenosyl-L-Methionin als Kofaktor erfolgen. Die JMT konnte bislang noch nicht mit immunologischen Methoden im Cytosol detektiert werden. Fehlende Transitsequenzen oder hydrophobe Bereiche, welche eine Integration in Membranen erlauben würden, lassen jedoch eine cytosolische Lokalisation vermuten. Darüberhinaus konnte NTR1, ein orthologes Protein der JMT durch Immunolokalisation im Cytoplasma nachgewiesen werden (SONG et al., 2000). Primäre Orte der Jasmonat-Bildung sind somit Chloroplasten, Peroxisomen und das Cytplasma (Abb. I.4.). Unbekannt ist noch, wie der Transport zwischen den Organellen und dem Cytoplasma abläuft und ob dieser Transport ein weiterer Kontrollpunkt der JA-Biosynthese sein kann. 2. Jasmonsäure-vermittelter Signalübertragungsweg Der Jasmonsäure-vermittelte Signalübertragungsweg umfasst mehrere Prozesse: die Wahrnehmung (Perzeption) eines primären Wund- oder Stressstimulus, die intrazelluläre JA-Biosynthese, die intrazelluläre JA-Wirkung und die Bildung eines systemischen Signals (DEVOTO und TURNER, 2003, FARMER, 2003). Nachfolgend soll zunachst der Signaltransduktionsprozess näher besprochen werden, welcher der

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JA-Biosynthese vorgeschaltet („Upstream-Signalling“) und nachgeschaltet („Downstream-Signalling“) ist. 2.1. JA-Biosynthese vorgeschalteter Signalübertragungsweg -

„Upstream Signalling“ Neben pflanzlichen Entwicklungsprozessen können biotische und abiotische Stressfaktoren über einen endogenen Anstieg von Jasmonaten zur Induktion spezifischer Gene führen. Wie diese Stress- oder Entwicklungssignale wahrgenommen und weitergeleitet werden ist noch weitgehend unbekannt. Nicht nur Verwundung, sondern auch Elicitoren (PARCHMANN et al., 1997), Pathogenbefall (PENNINCKX et al., 1996), osmotischer Stress (KRAMELL et al., 2000), und Behandlung mit Chitosan (pilzlicher Elicitor) und Oligogalacturoniden (pflanzlicher Elicitor) (DOARES et al., 1995) induzieren die JA-Biosynthese und nachgeschaltete JA-Wirkungen. Eines der experimentell am besten untersuchten Systeme einer JA-vermittelten Antwort, stellt die Wundabwehrreaktion in Tomate dar (RYAN und PEARCE, 1998; RYAN, 2000). Eine lokale Verwundung von Tomatenblättern führt zu einer Expression des Prosystemin-Gens in Leitbündeln (JACINTO et al., 1997; MCGURL et al., 1994). Prosystemin ist ein Propeptid, das sich aus 200 Aminosäuren zusammensetzt. Durch Prozessierung von Prosystemin entsteht Systemin, das wiederum aus 18 Aminosäuren besteht (RYAN et al., 2002; RYAN und PEARCE, 2003). Inzwischen konnten auch in Tabak zwei Peptide identifziert werden (Tobacco Systemin I und II), die hohe Homologie zu Systemin aus Tomate aufweisen (PEARCE et al. 2001). Systemin kann die Produktion von Wasserstoffperoxid, eine nachfolgende Biosynthese von JA und eine Induktion von Abwehrgenen induzieren (OROZCO-CARDENAS et al., 2001). Seine Wirkung vermittelt Systemin über einen membranständigen Rezeptor (bezeichnet als Systemin Receptor 160, mit einem Molekulargewicht von 160 kD; SR160), dessen cDNA-Sequenz kürzlich ermittelt werden konnte (SCHEER und RYAN, 2002; MONTOYA et al., 2002). SR 160 gehört zu den „Leucine-Rich Repeat (LRR)-Receptor Like Kinases (RLK) einer Klasse von Rezeptoren, die oft an der Erkennung von Hormonen beteiligt ist und Antworten auf Pathogenbefall weiter leiten kann (YIN et al., 2003). Es konnte gezeigt werden, dass der Systemin-Rezeptoraktivierung eine transkriptionell regulierte MAP-Kinase (mitogen-aktivierte Proteinkinase) nachgeschaltet ist (STRATMANN et al., 2000). Ein Anstieg des intrazellulären Calciumspiegels, Inaktivierung einer membranständigen ATPase, schnelle Alkalisierung des extrazellulären Mediums, Synthese von Calmodulin und anschließende Aktivierung von Lipasen führen dazu, dass

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Linolensäure als Substrat der JA-Biosynthese freigesetzt werden kann und JA sowie OPDA als Regulatoren von Abwehrgenen gebildet werden können (RYAN, 2000). Abb. I.6.: Schema der Systemin-vermittelten Signalübertragung. Die Signaltransduktionskaskade zeigt wichtige

Schritte, die an der Induktion von Abwehrgenen beteiligt sind (RYAN und PEARCE, 2003).

Verwundet man Tabakpflanzen, so wird innerhalb von Minuten eine mitogen-aktivierte Proteinkinase (WIPK) transkribiert (SEO et al., 1999). In verwundeten Wildtyp-Tabakpflanzen kommt es zur Akkumulation von JA und MeJA, während in transgenen Pflanzen, in welchen die WIPK-Expression unterdrückt wird, kein Anstieg der Jasmonate beobachtet werden kann. Dieses Experiment zeigt an, dass die Expression von WIPK für die wund-induzierte JA-Biosynthese benötigt wird. In A. thaliana wird eine MAP-Kinase (MPK4) nach Verwundung innerhalb von zwei bis fünf Minuten aktiviert (ICHIMURA et al., 2000). Im Unterschied zu WIPK aus Tabakpflanze gibt es für MPK4 Hinweise dafür, dass die A. thaliana MAP-Kinase nicht an der Regulation der JA-Biosynthese sondern vielmehr an der JA-Perzeption beteiligt ist. MPK4 würde somit an einer anderen Stelle in der Signaltransduktionskaskade aktiv sein als WIPK. 2.2. JA-Biosynthese nachgeschalteter Signalübertragungsweg -

„Downstream Signalling“ Über den genauen Mechanismus, welcher der JA-Biosynthese nachgeschaltet ist und zur Genaktivierung führt, ist bislang noch wenig bekannt. Eine mögliche Bindung von JA an einen Rezeptor, der das Signal weiterleitet, konnte bisher nicht gezeigt

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werden. Versuche mit jasmonat-insensitiven Mutanten gaben erste Hinweise darauf, wie die Weiterleitung des JA-Signals erfolgen könnte. Mit coi1 wurde eine Arabidopsis-Mutante identifiziert, die insensitiv gegenüber Coronatin und Methyljasmonat ist (FEYS et al., 1994). Coronatin ist ein Phytotoxin, dessen chemische Struktur und biologische Aktivität der Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure ähnelt (WEILER, 1994). Coi1-Mutanten sind männlich steril, weisen einen Defekt in der Expression JA-regulierter Gene wie z.B. VSP (vegetative storage protein) (BENEDETTI et al., 1995), Thi2.1 (Thionin2.1) und PDF1.2 (Plant defensin 1.2) auf und sind darüber hinaus anfällig gegenüber Pathogenen und Herbivoren (MCCONN et al., 1997; THOMMA et al., 1998). Das COI1 Genprodukt kodiert für ein Leucin-reiches Protein, das eine F-Box enthält (XIE et al. 1998). F-Box-Proteine fungieren als Rezeptoren, die regulatorische Proteine als Substrate eines Ubiquitin-vermittelten Abbaus rekrutieren können. Zusammen mit den Proteinen SKP1, Cullin und RBX1 kann COI1 in vivo den SCFCOI1-Komplex formen und eine funktionelle E3-Typ-Ligase ausbilden (DEVOTO et al., 2002; XU et al., 2002). Entsprechend wird vermutet, dass das COI1-Protein am Abbau regulatorischer Proteine beteiligt ist. Die Substrate des SCFCOI1-Komplexes sind bislang unbekannt. Aufgrund übereinstimmender Proteinkomponenten des SCFCOI1-Komplexes mit dem SCFTIR1-Komplex, der Auxin-vermittelte Antworten reguliert, wird eine Interaktion zwischen JA- und Auxin-Signalübertragungsweg diskutiert (DEVOTO und TURNER, 2003). Abb. I.7.: COI1-vermittelte Signalübertragung: Repressorproteine werden mit Ubiquitin markiert und damit zum

Abbau in Proteasomen freigegeben. COI1, Skp1, Cullin und Rbx1 bilden einen SCFCOI1-Komplex. Ein

Signal aktiviert die JA-Biosynthese und führt zur Phosphorylierung eines Target-Proteins, das als

negativer Regulator Jasmonat-responsiver Gene wirken kann. Das posphorylierte Protein bindet an

COI1 und wird anschließend im Proteasom abgebaut. K: Kinase, U: Ubiquitin, R: Target-Protein, das

als negativer Regulator wirkt, P: Phosphorylierung. (DEVOTO und TURNER, 2003).

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Neben der coi1-Mutante besitzt auch die jar1-Mutante (Jasmonic Acid Resistant1) aus A. thaliana einen Defekt in der JA-vermittelten Signalübertragung. JAR1 ist ein adenylierendes Protein, das in der Lage ist JA, nicht aber weitere Jasmonate wie z. B. MeJA zu modifizieren (STASWICK et al., 2002). Im Vergleich zur männlich sterilen coi1-Mutante ist die jar1-Mutante männlich fertil. Demzufolge ist JAR1 offensichtlich nicht essentiell für Staubblatt- und Pollenentwicklung, sondern für JA-vermittelte Abwehrreaktionen. In A. thaliana werden folglich mindestens zwei verschiedene Signaltransduktionswege diskutiert, die durch Jasmonate reguliert werden. Ein Signalübertragungsweg, der die Staubblatt- und Pollenentwicklung reguliert und COI1 benötigt. Ein zweiter Signalübertragungsweg, der die pflanzliche Abwehr reguliert und sowohl COI1 als auch JAR1 benötigt (TURNER et al., 2003). 3. Flüchtige Signalstoffe in der pflanzlichen Abwehr Bei der Auseinandersetzung von Pflanzen mit Mikroorganismen und Fraßfeinden sind Jasmonsäure und Salicylsäure intrazelluläre Mediatoren, die rasch de novo biosynthetisiert werden und eine Vielzahl von Abwehrgenen induzieren. Die freien Säuren können in vivo rasch durch Methyltransferasen zu Methylestern umgesetzt werden. Flüchtiges MeJA könnte sowohl über die Gasphase verbreitet werden und als Kommunikationsmittel zwischen Pflanzen dienen (FARMER und RYAN 1990, PRESTON et. al., 2001) als auch Signalfunktion in der Pflanze übernehmen und als lokales Frühwarnsystem in einem Gewebsverband fungieren. Die meisten Pflanzen emittieren eine Vielzahl verschiedener flüchtiger Verbindungen, darunter Isoprenoide (Terpene), Benzenoide, Phenylpropane und Fettsäurederivate. Diese Verbindungen erfüllen die unterschiedlichsten Funktionen. Offensichtlich spielen sie eine wichtige Rolle in der intra- und interspezifischen Kommunikation zwischen Organismen. Dabei können Duftstoffe Insekten sowohl anziehen als auch abschrecken und als ein direkter Abwehrmechanismus dienen (PIECHULLA und POTT, 2003). Auf großflächige Verwundung durch Fraß von Insektenraupen, Käfern und Milben reagieren viele Pflanzen mit systemischer Freisetzung von verschiedenen flüchtigen Substanzen (TAKABAYASAHI und DICKE, 1996). Durch diesen Cocktail flüchtiger Substanzen kann die Attraktivität der Pflanzen für natürliche Feinde des Herbivors erhöht werden und eine de novo Synthese von Duftstoffen erfolgen (TURLINGS und TUMLINSON, 1992).

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3.1. Rolle der Jasmonate bei Interaktionen zwischen pflanzlichen und tierischen Organismen

Pflanze, Tier und Parasit sind Mitglieder dreier Lebensbereiche und können in einer „Tritrophen Interaktion“ miteinander verbunden sein. Dabei nimmt die Pflanze das Tier (Herbivor) wahr und induziert die Synthese von spezifischen, flüchtigen Verbindungen, die wiederum von einem Parasitoiden erkannt werden können. Beispielsweise reagieren Maispflanzen (Zea mays) auf Fraßschäden, hervorgerufen durch die Raupen der Zuckerrübeneule (Spodoptera exigua), indem sie flüchtige Stoffe abgeben, welche wiederum die parasitische Wespe Cotesa marginiventris zu Angriffen gegen den Herbivoren anlocken. Die Produktion der flüchtigen Verbindungen erfolgt in der gesamten Pflanze und nicht nur am Ort der Verwundung (TURLINGS und TUMLINSON, 1992). Analog zur Bildung von Phytoalexinen, handelt es sich um eine pflanzliche Abwehrstrategie, die auf der induzierten Synthese von Sekundärmetaboliten beruht. Es existieren Hinweise, dass Jasmonate an Wechselwirkungen zwischen pflanzlichen und tierischen Organismen beteiligt sind. So führt Herbivorbefall zu einer Aktivierung des JA-Signalübertragungsweges. Eine Verwundung der Pflanze die durch Herbivoren ausgelöst wird unterscheidet sich in der Genexpression allerdings von einer mechanischen Verwundung. Bislang ist noch wenig darüber bekannt, wie eine Pflanze zwischen mechanischer Verwundung und Verwundung durch einen Herbivor unterscheiden kann (REYMOND, et al. 2000). KORTH und DIXON (1997) konnten Unterschiede bei der Expression wund-induzierter Gene an Kartoffeln nach Befall durch Raupen des Tabakschwärmers feststellen. Kartoffelblätter die von Manduca sexta Raupen befallen waren, akkumulierten Transkripte für Proteinase Inhibitor II (Pin II) und 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A Reduktase schneller als mechanisch verwundete Kontrollpflanzen. Im Vergleich zur mechanischen Verwundung führten Frassschädlinge bei einer Pflanze nicht nur zu einem unterschiedlichen Genexpressionsmuster, sondern auch zu einer unterschiedlichen Produktion flüchtiger Verbindungen (PARE und TUMLINSON, 1997). Im Speichel der Zuckerrübeneule (Spodoptera exigua) wurde Volicitin, ein Elicitor der tritrophen Interaktion bei Maispflanzen gefunden. Die strukturelle Verwandtschaft von Volicitin zu Jasmonaten führte zu der Vermutung, dass bei diesem Elicitor eine Verbindung zur Octadecanoid-Signalkaskade besteht (SCHMELZ et al., 2003). Im Vergleich zur mechanischen Verwundung kann Volicitin sowohl einen Anstieg von JA als auch von flüchtigen Sesquiterpenen in Maispflanzen induzieren. Weitere Hinweise für die Beteiligung von Jasmonaten an der Interaktion zwischen Pflanze und Herbivor lieferten Experimente mit transgenen Pflanzen. Es konnte gezeigt werden, dass Resistenzmechanismen der Pflanze gegenüber herbivoren

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Insekten und pilzlichen Pathogenen von der Wundantwort abhängig sind, welche durch JA oder Ethylen vermittelt wird (MALECK und DIETRICH, 1999). Mutationen, die eine JA-Biosynthese vermindern, resultieren in einer gesteigerten Anfälligkeit gegenüber Herbivoren. Der Tripel-Mutante fad3-2fad7-2fad8 aus A. thaliana fehlt die zur Bildung von JA notwendige Ausgangsverbindung α-Linolensäure. Der Defekt entsteht durch das Fehlen von drei ω-3-Desaturase (MCCONN und BROWSE, 1996). Die Blüten der fad3-2fad7-2fad8-Mutante sind männlich steril und können keine lebensfähigen Pollen freisetzen. Wird die fad3-2fad7-2fad8–Mutante oder auch die coi-Mutante aus A. thaliana von dem Saprophagen Bradysia befallen, so reagieren die Mutanten sensitiver auf den Befall als Wildtyp-Pflanzen (MCCONN et al., 1997, XIE et al., 1998). Die Mutanten jin1 und jin4 (jasmonic acid insensitive) hingegen zeigten keinen Unterschied in einer Sensitvität gegenüber der Kohlmotte Plutella xylostella im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen. Es ist noch nicht klar, ob die unterschiedliche Sensitivität der Mutanten auf eine schwächere Ausprägung des Phänotyps zurückzuführen ist, oder ob die Reaktion abhängig ist von der Insektenart. Die Tomatenmutante def1 (defenseless 1), die 13-Hydroxyperoxylinolensäure nicht zu 12-Oxophytodiensäure umsetzen kann, ist nicht in der Lage Proteinaseinhibitoren zu akkumulieren und ist signifikant anfälliger gegenüber Herbivorenbefall (Manduca sexta) als Wildtyp-Tomatenpflanzen (HOWE et al., 1996). 3.2. Rolle der Jasmonate bei Interaktionen zwischen Pflanzen –

„Airborne Signalling“ Versuche von FARMER und RYAN (1990), die zeigten, dass flüchtiges Methyljasmonat eine ähnliche Abwehrantwort in Tomatenpflanzen auslösen kann wie Verwundung oder Befall mit Herbivoren, entfachten eine Diskussion, ob Pflanzen mittels flüchtiger Signalstoffe kommunizieren können. Aufgrund ihrer Flüchtigkeit könnte nicht nur Methyljasmonat, sondern auch Methylsalicylat und Ethylen als Kommunikationsmittel zwischen Pflanzen dienen. FARMER und RYAN (1990) konnten unter Laborbedingungen zeigen, dass MeJA, welches von Artemisia tridentata freigesetzt wird, die Produktion von Proteinaseinhibitoren in benachbarten Tomatenpflanzen induziert. Während FARMER und RYAN (1990) die Experimente mit Tomate und Artemisia tridentata in luftdicht abgeschlossenen Kammern durchführten, wählten KARBAN und BALDWIN (2000) eine ökologisch relevante Interaktion im Freiland zwischen Artemisia tridentata und Nicotiana attenuata. Interessanterweise wurde von Artemisia tridentata hauptsächlich Methyl-(3R,7S)-epi-JA freigesetzt und hatte stärkere Wirkung auf Tabakpflanzen als das stabilere Isomerisierungsprodukt

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Methyl-(3R,7R)-JA. Tabakpflanzen die sich in der Nähe von Artemisia tridentata im Freiland befanden, hatten erhöhte Polyphenoloxidase-Aktivität und wurden weniger häufig von Herbivoren befallen. Da die meisten Pflanzen MeJA jedoch nur in geringen Mengen emittieren, ist es fraglich, ob MeJA als Signal zwischen Pflanzen fungiert (FARMER, 2001). Für Ethylen konnte gezeigt werden, dass Ethylen-insensitive Tabak-Mutanten ein verändertes „soziales Verhalten“ gegenüber benachbarten Pflanzen aufweisen. Unter Laborbedingungen stellen die Pflanzen normalerweise ihr Wachstum ein, wenn sie benachbarte Pflanzen erreichen. Somit sparen die Pflanzen Energie, indem keine Blätter beschattet werden. Ein weiteres Beispiel intraspezifischer Kommunikation bei Tabakpflanzen ist die Beteiligung von Methylsalicylat (Übersicht: DICKE und BRUIN, 2001) in der Abwehr von Pathogenen. Werden Tabakpflanzen mit Tabak-Mosaik-Virus infiziert, produzieren sie Methylsalicylat, welches bei benachbarten Pflanzen zur Induktion der PR1-Gene führt und eine erhöhte Resistenz gegenüber dem Virus bewirkt (SHULAEV et al., 1995) (Abb. I.8.)

Abb. I.8.: Dargestellt sind vier Modelle einer Signalübermittlung durch flüchtige Verbindungen wie z.B.

Methyljasmonat nach Verwundung von Pflanzen: 1a. Signalweiterleitung im Pflanzengewebe („Auto-

signalling“). 1b. Signalweiterleitung innerhalb einer Pflanze von Blatt zu Blatt („Auto-signalling“). 2.

Signalweiterleitung zwischen zwei Pflanzen der gleichen Art („Intraspecific signalling“). 3.

Signalweiterleitung zwischen zwei Pflanzen unterschiedlicher Art („Interspecific signalling“) (FARMER,

2001).

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4. Welche Jasmonate sind biologisch aktiv und wirken als intrazelluläre Signalstoffe?

Immer wieder stellt sich die Frage nach der biologischen Aktivität der einzelnen Jasmonate. Aufgrund der großen strukturellen Ähnlichkeit von JA zu Prostaglandinen, wurde lange Zeit vermutet, dass nicht nur JA, sondern auch ihre biosynthetischen Vorstufen biologisch aktiv sind. Erste Hinweise auf die Aktivität von 12-Oxo-Phytodiensäure (OPDA) lieferten Experimente mit Zellsuspensionskulturen, die einen starken Anstieg defensiv wirksamer Sekundärmetabolite zeigten (GUNDLACH und ZENK, 1998). Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Jasmonaten in einem Testsystem von Eschscholtzia californica Zellsuspensionskulturen belegten eine qualitativ gleiche Wirkung von JA und JA-Metaboliten auf den Sekundärstoffwechsel (HAIDER et al., 2000). Ein Nachweis der biologischen Aktivität von OPDA gelang anhand der Rankenspiralisierung von Bryonia dioica. Wurden Ranken von Bryonia dioica mechanisch stimuliert, so fiel eine Spiralisierung zeitgleich zusammen mit einem starken transienten Anstieg der OPDA, nicht aber mit einem Anstieg von JA. Desweiteren konnte exogen applizierte OPDA die Rankenkrümmung in wesentlich geringeren Konzentrationen induzieren als JA. Hieraus wurde gefolgert, dass OPDA und nicht JA in diesem System als Signal fungiert (STELMACH et al., 1997; BLECHERT et al., 1999). Innerhalb des Octadecanoidweges spielt das Enzym 12-Oxo-Phytodiensäure-Reduktase (OPR) eine wichtige Rolle. Mit der Reduktion der OPDA kontrolliert sie die relativen Konzentrationen der Cyclopentenone (z. B. OPDA) und Cyclopentanone (z. B. JA), zweier verschiedener Klassen von Signalmolekülen. Rückschlüsse auf die unterschiedlichen Aktivitäten der Signalstoffe OPDA und JA ermöglichte die Identifizierung der opr3-Mutante aus A. thaliana, die einen Defekt im Gen der OPR-Reduktase besitzt (STINTZI et al, 2000). Die Mutante ist männlich steril und nicht mehr zur Synthese von JA befähigt. Applikation von JA, nicht aber von OPDA kann die gestörte Pollenbildung und –freisetzung und somit männliche Sterilität der Mutante rekonstituieren, was die Notwendigkeit von JA für die Fertilität widerspiegelt. Darüber hinaus waren opr3-Mutanten im Gegensatz zu den JA-insensitiven Mutanten fad3-2fad7-2fad8 und coi1 aus A. thaliana weniger anfällig gegenüber der Trauermücke Bradysia impatiens und resistent gegenüber dem Pilz Alternaria brassicicola (Übersicht: BERGER, 2002). Verwundung von Blättern der opr3-Mutante führte zu einem Anstieg der OPDA und dnOPDA-Spiegel. Das biologisch aktive Isomer (3R,7S)-JA konnte nicht detektiert werden, (3R,7R)-JA konnte hingegen in Spuren nachgewiesen werden (STINTZI et al., 2000). Diese Ergebnisse zeigen, dass JA, nicht aber OPDA, für die Reproduktion der Pflanze essentiell ist. OPDA hingegen ist ausreichend, um eine Abwehrreaktion der Pflanze auszulösen.

I. Einleitung 19

Verwundet man Arabidopsis-Pflanzen, so können zwei Gruppen von Genen angeschaltet werden, die wie folgt unterteilt werden können: COI1-abhängige Gene (reguliert durch JA) und COI1-unabhängige Gene (benötigen ein anderes Signal als JA zur Induktion) (REYMOND et al., 2000). Untersuchungen des Transkript-Musters der opr3-Mutante zeigten, dass trotz Abwesenheit von JA, Gene induziert wurden, von denen man bislang annahm, dass sie JA und COI1-abhängig sind. Vermutlich sind OPDA und dnOPDA an der Induktion dieser Gene beteiligt. Wurde OPDA exogen an die opr3-Mutante appliziert, so konnten sowohl COI1-abhängige als auch COI1-unabhängige Gene angeschaltet werden. Cyclopentanone (JA) und Cyclopentenone (OPDA und dnOPDA) können folglich verschiedene, aber auch teilweise überlappende biologische Wirkungen entfalten. Inzwischen gibt es Anhaltspunkte, dass sich die Gruppe der Cyclopentanone wie JA und MeJA ebenfalls in ihrer Funktionalität unterscheiden könnten (SEO et al., 2001; STASWICK et al., 2002) (Abb. I.9.). Abb. I.9.: Unterschiedliche Signalübermittlung durch Mitglieder der Jasmonat-Familie: 1. Jasmonsäure und 12-

Oxo-Phytodiensäure übermitteln Signale über einen genetisch determinierten Weg und kontrollieren

die JA-vermittelte Genaktivierung. α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen wie z.B. 12-Oxo-

Phytodiensäure und andere Oxylipine mit elektrophilen Eigenschaften können ebenfalls über eine

noch unbekannte Signaltransduktionskaskade zur Genaktivierung führen (FARMER, 2003; modifiziert)

I. Einleitung 20

5. Methyljasmonat als Signalstoff Im Gegensatz zu Jasmonaten mit Säurefunktion wie JA kann MeJA, als neutrales Molekül leicht durch Membranen diffundieren. In Headspace-Analysen oberhalb des Gasraumes verwundeter Tomatenpflanzen, konnte kürzlich MeJA nachgewiesen werden (MEYER et al., 2003). MeJA kann schnell von Zellen aufgenommen werden und wird als interzellulärer Signalstoff diskutiert (SEO et al., 2001, LI et al., 2002). Darüber hinaus könnte MeJA als Langstreckensignal seine Wirkungen über die Gasphase des Interzellularraums einer Pflanze vermitteln (Abb. I.10). Kürzlich zeigten Verwundungsexperimente mit Arabidopsis-Mutanten, die einen Defekt in der JA-Biosynthese bzw. in der Jasmonaterkennung aufwiesen, dass die Biosynthese von Jasmonaten an der Verwundungsstelle essentiell ist, um eine systemische Expression von JA-responsiven Genen zu induzieren. In distalen, unverwundeten Blättern ist für die Expression der Abwehrgene lediglich die Jasmonaterkennung wichtig – die lokale Neusynthese aber entbehrlich. Die einfachste Erklärung für diese Experimente ist die systemische Verbreitung und Rekrutierung eines Jasmonats oder einer verwandten Verbindung durch unverwundete Pflanzenteile. Mögliche Kandidaten sind MeJA (LI et al., 2002) oder OPDA-Methylester. Abb. I.10.: Hypothese einer Wirkung von MeJA als Signalstoff. JA ist ein pflanzlicher Signalstoff, der in

Reaktion auf Verwundung de novo synthetisiert wird und eine Reihe von Abwehrgenen induziert. Im Gegensatz zu JA ist MeJA in der Lage leicht durch Membranen zu diffundieren und kann schnell von Zellen aufgenommen werden. MeJA wird deshalb als interzellulärer Signalstoff diskutiert. Darüber hinaus könnte MeJA als Langstreckensignal seine Wirkungen über die Gasphase des Interzellularraums einer Pflanze vermitteln. Eine Esterase (MJE) ist bislang unbekannt, die MeJA zu JA hydrolysiert. 18:3: α-Linolensäure, MJE: Methyljasmonat-hydrolysierende Esterase.

Fragen zur unterschiedlichen Funktion von JA und MeJA wirft das kürzlich klonierte JAR1-Gen auf. JAR1 codiert für ein Protein, das an einem Signalübertragungsweg

I. Einleitung 21

beteiligt ist, welcher der JA-Biosynthese nachgeschaltet ist. JAR1 gehört zur Superfamilie der „Firefly Luciferasen“ und adenyliert selektiv JA, nicht aber MeJA. Vermutlich spielt das JAR1 Protein eine Rolle bei der Modifikation von JA (STASWICK et al., 2002). Werden JA und MeJA an jar1-Mutanten appliziert, so inhibieren beide Substanzen das Wurzelwachstum gleich stark (STASWICK et al., 1998). Dieser biologische Test lässt vermuten, dass einer Antwort auf MeJA eine Demethylierung und anschließende Adenylierung des Methylesters vorangeht, da JAR1 MeJA nicht als Substrat akzeptiert. Inwieweit eine exogene Applikation von JA und MeJA an Wurzeln die tatsächlich in vivo ablaufenden Prozesse widerspiegelt, ist noch ungeklärt. Eine Überproduktion von MeJA konnte durch Überexpression der Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT) in Arabidopsis herbeigeführt werden. Die transgenen Pflanzen wiesen eine konstitutive Aktivierung von Abwehrgenen auf, darunter PDF1.2, welches für ein antimikrobielles Peptid kodiert. Die Pflanzen zeigten Resistenz gegenüber dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea, obwohl die JA-Konzentrationen nicht höher waren als im Wildtyp (SEO et. al., 2001). Diese Experimente werfen ebenfalls die Frage nach einer Signalfunktion von MeJA auf. 6. Zielsetzung der Arbeit Unklar ist derzeit, ob MeJA, JA oder beide Verbindungen primär biologisch aktiv sind, da beide Verbindungen in vivo rasch durch eine Methyltransferase (JMT) und eine bisher noch nicht näher charakterisierte MeJA-Esterase ineinander umgewandelt werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Esterase aus Zellsuspensionskulturen zu isolieren, welche Methyljasmonat zu Jasmonsäure hydrolysieren kann. Das gereinigte Enzym sollte anschließend durch klassische Edman-Sequenzierung untersucht werden. Anhand der gewonnen Proteinpartialsequenzen könnte die cDNA der MeJA-Esterase kloniert werden und anhand der Nucleinsäure-Abfolge die Sequenz der Aminosäuren im Enzym determiniert werden. Die Kenntnis der Primärstruktur des Proteins würde einen Vergleich mit verwandten Enzymen ermöglichen und Rückschlüsse auf die biologische Funktion zulassen. Darüberhinaus sollte mittels heterologer Expression der MeJA-Esterase die Identität der klonierten cDNA bestätigt werden. Desweiteren würde hierdurch eine Möglichkeit geschaffen werden, ausreichend große Mengen homogenen Enzyms für proteinchemische Untersuchungen bereitzustellen. Eine Verteilung der mRNA-Transkripte der MeJA-Esterase sollte in verschiedenen Geweben bestimmt werden.

II.Material 22

II. Material 1. Pflanzenmaterial Frische Pflanzen und Pflanzenorgane Die verwendeten Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) stammten aus den Gewächshäusern des Lehrstuhles für Pharmazeutische Biologie des Julius-von-Sachs Institutes für Biowissenschaften in Würzburg. Für die einzelnen Untersuchungen wurden 4 - 8 Wochen alte Pflanzen verwendet. Die Pflanzen unterlagen einem normalen Tag-Nacht-Zyklus (16 h : 8 h). Die Kultivierung erfolgte im Gewächshaus bei Temperaturen zwischen 16 und 22 ºC und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 - 70 %. Zur RNA-Isolierung benötigte Pflanzenteile wurden sofort mit flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei – 80 °C gelagert. Zellsuspensionskulturen Die verwendeten pflanzlichen Zellsuspensionskulturen stammten aus der Sammlung des Lehrstuhls für Pharmazeutische Biologie der Ludwig-Maximilians-Universität München. Die Anzucht der Zellsuspensionkulturen wurde im Medium nach LINSMAIER und SKOOG (1965) durchgeführt, das 25 min bei 121 ºC, 2 bar autoklaviert wurde. Die Kultivierung der Zellsuspensionskulturen erfolgte bei 24 ± 2 ºC im diffusen Dauerlicht (600 lux) auf Rotationsschüttlern (Fa. New Brunswick Scientific) bei 100 rpm. Erhaltungskulturen wurden nach sieben Tagen in 1 l-Erlenmeyerkolben mit 250 ml frischem Medium und 150 ml Inokulum überimpft. Die Produktion größerer pflanzlicher Gewebemengen erfolgte in Fernbachkolben mit 1 l Medium und 300 ml sieben Tage altem Inokulum. Zur Gewinnung von Enzympräparationen und RNA, wurden die Pflanzenzellen mittels Vakuumfiltration durch ein Polyamidnetz vom Medium abgetrennt, mit wenig destilliertem Wasser gespült und für weitere Versuche sofort mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Zur kurzfristigen Lagerung (1 - 2 Monate) wurden die Zellkulturen in Kunststoffbeuteln bei – 24 ºC aufbewahrt. Wurden die Pflanzenzellen für die RNA-Isolierung benötigt, war eine Lagerung bei – 80 ºC erforderlich.

II.Material 23

Kalluskulturen werden auf LS-Medium mit Zusatz von 1 % Agar, in Kunststoffpetrischalen im Dunkeln gezogen und nach 25 Tagen auf frisches Medium übertragen. Alle Arbeiten erfolgten unter sterilen Bedingungen. 2. Bakterienstämme Escherichia coli TOP 10 F: F´{lacIqTn10(TetR)} mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nup Escherichia coli M 15 [pREP4]: NaIS StrS RifS Thr- Lac- Ara+ Gal+ Mtl- F- RecA+ Uvr+ Lon+

3. Züchtungsbedingungen und Stammhaltung Die Stämme wurden auf Agarplatten oder als Suspensionskultur mit LB-Medium (MANIATIS et al.,1982) kultiviert (II.4.2). Um auf Antibiotika-Resistenz vermittelnde Plasmide zu selektieren, wurden nach dem Autoklavieren sterilfiltrierte Antibiotika-Lösungen folgender Endkonzentrationen zugesetzt: Ampicillin (100 mg/l in dH2O); Kanamycin (50 mg/l in dH20); Die Flüssigkulturen wurden in Erlenmeyerkolben in einem Wasserbadschüttler bei 300 Upm geschüttelt. LB-Platten wurden über Nacht bei 37 ºC inkubiert und anschließend bei 4 ºC gelagert. Alle vier bis sechs Wochen wurden die Stämme auf frische Platten überimpft. Die Lagerung der Bakterien über längere Zeiträume (≥ 2 Monate) erfolgte in glycerolhaltigem Medium (15 % v/v) bei – 80 °C.

II.Material 24

4. Kulturmedien Medien für die Pflanzenzellkultur LS-Medium:

Das LS-Medium wurde nach LINSMAIER und SKOOG (1965) unter Zusatz von 1 x 10-6 mol/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und 1 x 10-6 mol/l 1-Naphtylessig-säure angefertigt und mit NaOH auf pH 6.0 eingestellt.

Medien für die Anzucht von Bakterien LB-Medium (MANIATIS et al. 1982) LB-Nähragar 1.0 % (w/v) Trypton; 1.0 % (w/v) NaCl; 0.5 % (w/v) Hefeextrakt; Eingestellt auf pH 7.0 mit NaOH;

LB-Medium, 1.5 % (w/v) Agar;

SOB-Medium (MANIATIS et al. 1982)

2.0 % (w/v) Trypton; 0.5 % (w/v) Hefeextrakt; 0.05 % (w/v) NaCl; 2.5 mM KCl, pH 7.0; 10 mM MgCl2 (nach dem Autoklavieren steril zusetzen); 10 mM MgSO4 x 7H2O (nach dem Autoklavieren steril zusetzen);

5. Pufferlösungen Die im folgenden aufgeführten Puffer wurden meistens in zehnfacher Konzentration (10x) angesetzt und sterilisiert oder sterilfiltriert. Der pH-Wert wurde mit NaOH oder HCl eingestellt.

Puffer Bestandteile (1x) pH-Wert FA 20 mM MOPS 7.0

II.Material 25

5 mM Natriumacetat 1 mM EDTA

SSC 150 mM NaCl 30 mM Natriumcitrat

7.0

TAE 40 mM Tris-Acetat 1 mM EDTA

TE 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA

7.5

TfB 1 100 mM RbCl 50 mM MnCl2 x 4 H2O 30 mM Kaliumacetat 10 mM CaCl2 x H2O 15 % Glycerin

5.8

TfB 2 10 mM MOPS 10 mM RbCl 75 mM CaCl2 15 % Glycerin

6.8

TLE 200 mM Tris-HCl 100 mM LiCl 5 mM EDTA

8.2

KPi 1 M KH2PO4

1 M K2HPO4

7.5

NaPi 1 M Na2HPO4

1 M NaH2PO4

6.5

6. Nucleinsäuren und Nucleotide DNA-Längenstandards

Gene Ruler ™ 100 bp DNA-Leiter, MBI-Fermentas (St. Leon-Rot); 1 kb DNA-Leiter, MBI-Fermentas (St. Leon-Rot);

Desoxynucleotide

dNTPs MBI-Fermentas (St. Leon-Rot); Oligonucleotide Die verwendeten Oligonucleotid-Primer wurden von den Fimen Invitrogen (Groningen-Niederlande) und Qiagen (Hilden) synthetisiert.

II.Material 26

Primer Sequenz in 5`→ 3`-Orientierung MJE for 1 CAY AAR GTI WSI GTI YTI GAY ATG GCN GC MJE for 31 GAY ATG GCN GCN WSN GGN ATH AAY CC MJE for 4 GAR GAN YWN GAR YTN GCN AAR ATG MJE N 1 AAR GGN GAY AAR AAY CAY TTY GT MJE rev 2 TT RTC RCA IAC IAC RTA IAC ICK RTG NAC MJE rev 4 YTT RTC RCA NAC NAC RTA NAC NCK RTG NAC

NSW NCC RTA RACE for GTG ACA GCT TTC ATG CCT GG RACE rev ATC CTG TCC GTT GTT GTA AAC Full MJE for MEK AAG CAT GCA AAA GGG TGA TAA AAA TC Full MJE for MQ GCA TGC AGG GTG ATA AAA ATC ACT TTG TA Full MJE rev AAG GAT CCA TAA TAT TTT TGC GAA ATC Sequenzierprimer Sequenz in 5`→ 3`-Orientierung T7ht TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG SP6ht ATT TAG GTG ACA CTA TAG AAT AC M13 for GTAAAACGACGGCCAGT M13 rev AACAGCTATGACCATG Plasmide

pGEM®-T (Promega, Mannheim) ist ein 3.0 kb großer linearisierter Klonierungsvektor, der durch sein 3´-überhängendes Thymidin an beiden Enden der Insertionsstelle für die Klonierung von PCR-Produkten besonders geeignet ist. pDrive® (Qiagen, Hilden) ist ein 3.85 kb großer linearisierter Klonierungsvektor mit einem 3´-terminalen Uridinüberhang zur direkten Ligation von PCR-Produkten. pQE70® (Qiagen, Hilden) ist ein 3431 bp großer Vektor, der den T5-Promotor PN25 (GENTZ und BUJARD, 1985), zwei lac-Operationserkennungssequenzen und eine synthetische ribosomale Bindungsstelle besitzt, die auf hohe Expressionsraten in E. coli optimiert ist.

II.Material 27

7. Enzyme und Molekularbiologische „Kits“ Amplifizierung und Klonierung der 5´- und 3´-Enden von cDNA:

SMART™ RACE cDNA Amplification Kit, BD Biosciences Clontech (Heidelberg);

DNA-Elution aus Agarosegelen:

QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen (Hilden); DNA-Klonierung:

T4-DNA-Ligase, MBI-Fermentas (St. Leon-Rot); Shrimp Alkaline Phosphatase 1 U/µl, MBI-Fermentas (St. Leon-Rot);

DNA-Synthese:

RT-PCR Kit®, Qiagen (Hilden); RevertAid™ M-MLV reverse Transkriptase, 200 U/µl, MBI-Fermentas (St. Leon-Rot) ; Taq DNA-Polymerase 5 U/µl, MBI-Fermentas (St. Leon-Rot); Pfu DNA-Polymerase 3 U/µl, Promega (Mannheim);

Plasmidpräparationen:

QIAfilter™ Plasmid Midi Kit®, Qiagen (Hilden); RNase A (100mg/ml), Qiagen (Hilden);

Restriktionsendonukleasen:

BamHI 10 U/µl, EcoRI 10 U/µl, PaeI (SpHI) 10 U/µl, MBI-Fermentas (St. Leon-Rot);

mRNA-Isolierung aus Gesamt-RNA Präparationen:

RNeasy Plant Mini Kit®, Qiagen (Hilden); TRIzol, AppliChem (Darmstadt);

Synthese von DIG-dUTP markierter cDNA für Northern-Blot Analysen:

PCR Dig Probe Synthesis Kit, Roche Diagnostics (Mannheim);

II.Material 28

8. Chemikalien Die handelsüblichen Chemikalien der erforderlichen Reinheit wurden bei den Firmen Aldrich (Steinsheim), AppliChem (Darmstadt), Biomol (Hamburg), Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) oder Sigma (Deisenhofen) bezogen. Spezielle Chemikalien Enzymtests:

Methyljasmonat, Serva (Heidelberg); Oktadekyl (C18)-Phase, Macherey-Nagel (Düren) in 1 ml Festphasen-extraktions-Säulchen, Amchro (Hattersheim);

Enzymreinigung:

β-Mercaptoethanol, Merck (Darmstadt); Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP), (unlöslich), AppliChem (Darmstadt); Unstained Precision Protein Standards™ Broad Range, Bio-Rad Laboratories (München);

Northern-, Southern-Transfer:

Anti-DIG-alkaline phospatase/Fab fragments, Roche Diagnostics Mannheim); Blocking Reagent, Roche Diagnostics (Mannheim); CDP-Star, Roche Diagnostics (Mannheim); DIG Easy Hyb Granules (Granulat zur Herstellung von DIG Easy Hyb Puffer), Roche Diagnostics (Mannheim);

Säulenchromatographie: Bio-Scale CHT5, Bio-Scale Q2 Chromatographiesäule, Bio-Rad Laboratories (München); Mono P HR 5/20, MonoQ HR 5/5, Sephacryl S-100 HR 26/60, Superdex 200 Chromatographiesäule, PD-10 desalting column mit Sephadex G25 Chromatographiematerial, Q-Sepharose Fast Flow® Chromatographiematerial, Amersham Biosciences (Freiburg), Polybuffer 74, Amersham Biosciences (Freiburg);

II.Material 29

Synthese von [Methyl-3H]MeJA: Wasserfreies Ethylacetat (über Molekularsieb getrocknet), Fluka (Neu-Ulm); Kaliumcarbonat p.A., Roth (Karlsruhe); Aminopropyl-Phase, Macherey-Nagel (Düren) in 1 ml Festphasen-extraktions-Säulchen, Amchro (Hattersheim);

Szintillationsflüssigkeit: Ultima Gold®, Packard (Groningen, Niederlande);

Überexpression: Isopropyl-1-thio-β-D-galacto-pyranoside (IPTG), Qiagen (Hilden); Imidazol (AppliChem, Darmstadt); Talon™-Metal Affinity Material, BD Biosciences Clontech (Heidelberg);

Western-Transfer: Tropix DEA-Lösung, Tropix Nitroblock-Lösung, Applied Biosystems, (Weiterstadt);

Radioaktiv markierte Chemikalien Synthese des Methyl-[2-14C]jasmonat:

[2-14C]Jasmonsäure nach KNÖFEL und GROSS (1988); Synthese des [Methyl-3H]MeJA:

[Methyl-3H]Methyljodid (spez. Aktivität 3.15 TBq/mmol) Amersham Biosciences (Freiburg);

9. Verbrauchsmaterialien Chromatographie

DC-Kieselgelfolien Polygram SIL G/UV 254 mit Fluoreszenz-Indikator, Macherey-Nagel (Düren); 1 ml Festphasenextraktions-Säulchen, Amchro (Hattersheim);

II.Material 30

Filme: Lumi-Film Chemiluminescent Detection Film, Roche Diagnostics (Mannheim);

Filmentwicklung:

Röntgen Rapid Fixiersalz und Entwickler, Adefo-Chemie (Nürnberg);

Filter und Membranen: Nitrocellulose-Rundfilter (0,45µm), Millipore (Eschborn); Rund-, Faltenfilter, Schleicher & Schüll (Dassel); Filtrationseinheit, bestehend aus Glas-Filterhalter einschließlich Trichter, Millipore (Eschborn); Nitrocellulose-Membran (Western-Transfer), Schleicher & Schüll (Dassel); Membran Hybond-N® (Northern-Transfer), Amersham Biosciences (Freiburg); Positiv geladene Nylon-Membran (Southern-Transfer), Roche Diagnostics (Mannheim); PVDF-Membran (Western-Transfer), Fa. Millipore (Eschborn);

(Sterile) Einmalartikel: Falcon-Röhrchen, Kultur-Röhrchen, Mikrotiterplatten, Petrischalen, PCR-Gefäße, Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße, Serologische Pipetten, Greiner bio-one (Essen);

10. Geräte Dokumentationssysteme:

Video Copy Processor Darkroom CN-TFX, LTF Labortechnik (Wasserburg);

Elektrophorese/Transfer:

Vertikalelektrophoresekammern Hoefer mini VE, Amersham Biosciences (Freiburg); Tank-Blot-Apparatur, Biometra (Göttingen); Nucleinsäure Elektrophorese Kammer GNA-100 Submarine Unit, Amersham Biosciences (Freiburg); Power Supply EPS 301, Amersham Biosciences (Freiburg);

II.Material 31

Gaschromatograph-Massenspektrometer: Gaschromatograph Varian 3400, Varian (Darmstadt), gekoppelt mit einem SSQ 700 Quadrupol-Massenspektrometer, Finnigan MAT (Bremen);

Geltrocknung: Geltrockenrahmen, Amersham Biosciences (Freiburg);

Glasgeräte:

Diazomethangenerator Aldrich, (Steinsheim); HPLC zur Proteinreinigung:

HPLC-Anlage „Äkta Purifier“, Amersham Biosciences (Freiburg): Zwei analytische Pumpen P-900 (Maximaler Fluss 10ml/min), UV-Monitor 900 mit Xenonblitzlampe (variabler Wellenlänge von 190-700 nm) und 10 mm Durchflußzelle (xenon flash lamp), Injektionsventil INV-907, Probenaufgabenventil PV-908, Mischerkammer M-925, Leitfähigkeitszelle C-900, pH Elektrode pH-900, Fraktionskollektor Frac-950;

Homogenisieren:

Sonifier Cell Disruptor B15, Branson (Großbritannien); Ultraschallbad Sonorex TK52, Bandelin (Berlin);

Hybridisierung:

Hybridisierungsofen, Uni Equip (Martinsried); Messen/Wiegen:

Analysenwaage BP 211 D und Laborwaage BP 3100 S, Sartorius (Göttingen); Eppendorf Reference Kolbenhubpipetten, Eppendorf (Hamburg);

PCR-Geräte:

PCR Express und Sprint, Thermo Hybaid (Ulm);

II.Material 32

pH-Messung: pH-Meter 766 Calimatic, Knick (Berlin);

Photometer:

Photometer Specord 200, Analytik Jena (Jena); Microplate Reader MRX, Dynex Technologies (Frankfurt); Gene Quant, Amerham Biosciences (Freiburg);

Probenkonzentrierung:

Rotavapor R 110, Büchi (Flawil, Schweiz); Centricon® Plus 20 Zentrifugen-Filtereinheiten (Membrantyp PL-10), Centricon® Zentrifugen-Filtereinheiten (Membrantyp Ultracel YM, max.), Microcon® Zentrifugen-Filtereinheiten (Membrantyp Ultracel YM, max.), Millipore (Eschborn);

Radioaktivitätsmessung:

Flüssigszintillationszähler Wallac 1409 System 1400, EG&G Company (Finnland); Dünnschicht-Scanner Automatic TLC-Linear Analyzer RITA, Raytest (Straubenhardt);

Rotationsschüttler:

Rotationsschüttler G53, New Brunswick Scientific (Nürtingen); Köttermann 4020-Schüttler, Köttermann (Hänigsen);

Rühren/Durchmischen:

Überkopfschüttler, Heidolph (Kehlheim); Magnetrührer der IKA-Werke, Janke & Kunkel (Staufen); Vortex, Heidolph (Kelheim);

Steriltechnik:

Laminar-Flow-Box, Prettl (Pfullingen);

II.Material 33

Wärme-und Kältetechnik: Thermostatierbare Wasserbäder Julabo EM und Haake G, Braun (Melsungen); Thermomixer Thermostat plus und comfort, Eppendorf (Hamburg); Wasserbadschüttler Gyrotory Model G76, New Brunswick Scientific (Nürtingen); Brutschrank, Heraeus-Christ (Osterode); Trockenschrank, Heraeus-Christ (Osterode); Kühlschrank, Liebherr (Ochsenhausen); -20°C-Gefrierschrank, Bauknecht (Schorndorf); -80°C-Gefrierschrank, New Brunswick Scientific (Nürtingen);

Zentrifugen:

Kühlzentrifugen Sorvall RC-5B und RC-5C mit SS34- und GSA-Rotoren, DuPont (Bad Homburg); Eppendorf-Tischzentrifuge 5414, Eppendorf (Hamburg); Eppendorf–Kühlzentrifuge 5417 R und 5804 R, Eppendorf (Hamburg); Tischkühlzentrifuge Megafuge 1.0R, Heraeus-Christ (Osterode);

Sonstige Geräte:

UV-Lampe MinUVIS mit λ = 254 nm und 356 nm, Desaga (Heidelberg);

III.Methoden 34

III. Methoden 1. Darstellung chemischer Verbindungen 1.1. Synthese von racemischem [Methyl-3H]Methyljasmonat Zur Überprüfung der Substratspezifität der MeJA-Esterase wurde [Methyl-3H]Methyljasmonat synthetisiert. Die Synthese wurde nach einem modifizierten Verfahren für langkettige Fettsäuren (KNAPP et al., 1979) durchgeführt. Racemische Jasmonsäure, die durch alkalische Hydrolyse aus Methyljasmonat (GUNDLACH et al., 1992) gewonnen wurde, diente als Ausgangssubstanz für die Synthese von racemischem [Methyl-3H]Methyljasmonat. In fest verschließbare Glasreaktionsgefäße (0.5 ml) wurde 1 mg getrocknetes Kaliumcarbonat vorgelegt. Racemische Jasmonsäure (500µg) wurden in 100 µl Ethylacetat gelöst und dem Reaktionsansatz zugesetzt. Die Methylierungsreaktion wurde durch den Zusatz von 1 mCi [Methyl-3H]Methyljodid (Spezifische Aktivität 8.5 Ci/mmol) gestartet und für 1 h im Wasserbad bei 90 ºC inkubiert. Im Abstand von 10 min wurde das Reaktionsgefäß in ein Ultraschallbad für 30 sec gestellt, um eine Durchmischung des Ansatzes mit dem Kaliumcarbonat, das sich sonst rasch am Boden absetzte, zu erreichen. Die Aufreinigung des synthetisierten, racemischen [Methyl-3H]Methyljasmonat erfolgte über Festphasenextraktion (SPE) wie unter III.2.2. beschrieben. 1.2. Herstellung von Diazomethan Fettsäurederivate wurden mittels Diazomethan methyliert. Diazomethan ist ein leichtflüchtiges, hochreaktives Gas, das durch Hydrolyse von Diazald (N-Methyl-N-Nitroso-p-Toluolsulfonamid) gewonnen wurde. Hierfür wurden 5.3 g Diazald (Aldrich, Steinheim) in einem 100 ml-Rundkolben eingewogen und in 30 ml Diethylether gelöst. Nach Zugabe von 5 ml Ethanol und 2 g KOH, gelöst in 3.2 ml Wasser, wurde das Reaktionsgemisch unter ständigem Rühren leicht erhitzt. Das entstandene Diazomethan wurde über eine Destillationsbrücke in einen gekühlten 100 ml-Spitzkolben, in dem 3 ml Diethylether vorgelegt wurden, überdestilliert. Nach Beendigung der Destillation wurde zu dem verbleibenden Reaktionsansatz Essigsäure hinzugefügt, um das restliche Reagenz in Methylacetat zu überführen. So konnte die Reaktion gestoppt werden und noch vorhandenes Diazomethan wurde vollständig umgesetzt.

III.Methoden 35

1.3. Herstellung potentieller Substrate für Enzymaktivitäts-bestimmungen durch Methylierung mit Diazomethan

Die Analytik der potentiellen Substrate der MeJA-Esterase durch gaschromatographische Trennung (GC) und nachfolgende Messung im Massenspektrometer (MS) durch positive chemische Ionisation erforderte eine Veresterung der Säuregruppen zum Methylester. Die zu methylierenden Substrate wurden in 100 µl MeOH (12.5 mM) gelöst und mit ca. 300 µl Diazomethan bis zur bleibenden Gelbfärbung versetzt. Der Reaktionsansatz wurde für 10 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom eingeblasen und dadurch entfernt. Die Lagerung der Methylester erfolgte in einem Volumen von 100 µl MeOH bei 4 ºC im Kühlschrank. Jasmonsäure, [2-14C]Jasmonsäure, Salicylsäure, Linolsäure, Linolensäure, Abscissinsäure, Indolessigsäure, Zimtsäure und Benzoesäure wurden methyliert. Die Methylester wurden auch als Referenzsubstanzen bei der Bestimmung von Retentionszeiten für die spätere GC-MS-Analyse verwendet. 1.4. Herstellung von Diazoethan Diazoethan wurde mittels eines Diazomethangenerators (Aldrich, Steinsheim) aus 1-Ethyl-3-Nitro-1-Nitrosoguanidin (ENNG) hergestellt. Der Diazomethangenerator ist ein Glasgerät, das aus zwei Glasröhrchen besteht, die durch eine kleine Öffnung im oberen Drittel des inneren Glasröhrchen miteinander verbunden sind. Den Angaben des Herstellers entsprechend (Aldrich, Steinsheim, Technical Bulletin AL-180) wurden 133 mg ENNG in das innere Glasröhrchen des Diazomethangenerators eingefüllt. 500 µl Wasser wurden auf das ENNG pipettiert, um die entstehende Hitze während der Reaktion abzufangen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 600 µl 5 N NaOH zum ENNG gestartet. Die Natronlauge wurde mit 1 Tropfen/5 sec mit einer Spritze (Kanüle mit gauge No.22) zugetropft. Das entstandene Diazoethan wurde in das äußere gekühlte Glasröhrchen, in dem 3 ml Diethylether vorgelegt wurden, überdestilliert. Nach 45 min war die Reaktion beendet. Noch nicht vollständig umgesetztes ENNG im Inneren des Glasröhrchen wurde durch Essigsäure in Ethylacetat überführt und die Reaktion hierdurch gestoppt.

III.Methoden 36

1.5. Ethylierung freier Säuren bzw. umgesetzter MeJA-Esterase-Substrate mit Diazoethan

Die in III.1.3. hergestellten Methylester stellten potentielle Substrate für die MeJA-Esterase dar. Im Falle einer Hydrolyse des Esters im Enzymtest durch die MeJA-Esterase musste die freie Säure zuerst in einen Ethylester überführt werden, damit sie anschließend gaschromatographisch getrennt und mittels Massenspektrometrie (MS) im positiven chemischen Ionisationsmodus (engl.: positive ion chemical ionization) bestimmt werden konnte. Nach entsprechender Probenaufbereitung wurden die Methanol- oder Diethyletherextrakte mit 300 µl Diazoethan versetzt, für 10 min bei RT stehen gelassen, bis auf ein Volumen von 100 µl vorsichtig unter einem Stickstoffstrom eingeblasen und mit GC-MS vermessen. 2. Chromatographische Methoden 2.1. Dünnschichtchromatographie Die dünnschichtchromatographische Auftrennung von Jasmonaten wurde auf Polygram SIL G/UV254 Kieselgelfolien mit Fluoreszenzindikator, 20 x 20 cm, Schichtdicke 0.25 mm (Macherey-Nagel, Düren). Dabei fand folgendes Laufmittelsystem Verwendung: LM: Hexan/Ethylacetat/Eisessig 70:30:1 (v/v) Die Substanzen wurden nach der Entwicklung des Dünnschicht-Chromatogrammes in einer Iodkammer detektiert. Elementares Jod sublimiert und lagert sich an Doppelbindungen an, dadurch können Jasmonate durch die entstehende Gelbfärbung auf dem Dünnschicht-Chromatogramm detektiert werden. Die Identifizierung der Substanzen erfolgte über parallel aufgetragene Referenzsubstanzen. Jasmonsäure und Methyljasmonat, die mit [14C] markiert waren, wurden mit dem Dünnschicht-Scanner „Automatic TLC-Linear Analyzer RITA“ (Raytest, Straubenhardt) qualitativ und quantitativ bestimmt.

III.Methoden 37

2.2. Festphasenextraktion (SPE) Die Festphasenextraktion (engl. solid phase extraction, SPE) diente als schneller Reinigungsschritt während der Probenaufarbeitung. Sie beruht auf der quantitativen Adsorption des Analyten aus der mobilen an eine stationäre Phase. Als feste Phasen wurden Aminopropyl- (NH2) und endcapped Octadecyl- (C18 ec) Säulenmaterial verwendet. Die Elution der Probe von der Säule erfolgte unter leichtem Druck. Dabei musste darauf geachtet werden, dass die Säulen nicht trocken liefen, da sonst ihre Kapazität und die Wiederfindungsrate rapide sanken. Die Festphasen-extraktionssäulen wurden mehrfach verwendet. Aufreinigung des synthetisierten, racemischen [Methyl-3H]Methyl-jasmonat Freie Jasmonsäure, die während der Synthese des [Methyl-3H]Methyljasmonat nicht umgesetzt wurde, konnte durch Aminopropyl-Festphasenextraktion (NH2-SPE) aus dem Reaktionsansatz entfernt werden. Jeweils 200 mg Aminopropylphase wurden in 1 ml Glassäulen gefüllt und mit Diethylether equilibriert. Der Reaktionsansatz aus III.1.1. wurde auf die Säule geladen und mit 1 ml Diethylether eluiert. Das [Methyl-3H]Methyljasmonat enthaltende Eluat wurde vorsichtig unter einem Stickstoffstrom eingeblasen und der verbleibende Rückstand in 50 µl Toluol aufgenommen. Das Säulenmaterial der NH2-SPE wurde wie folgt gereinigt und regeneriert: Elution von Jasmonsäure 5 ml 2 % (v/v) Essigsäure/Diethylether Entfernung von Verunreinigungen 5 ml 5 % (v/v) 37 %ige HCl/Methanol Regenerierung der NH2-Gruppen 5 ml 5 % (v/v) Triethylamin/Methanol Abtrennung von [Methyl-3H]Methanol aus dem Enzymtest nach Inkubation mit [Methyl-3H]Methyljasmonat Das im Enzymtest (IV.1.2.2.) gebildete [Methyl-3H]Methanol wurde durch Octadecyl-Festphasenextraktion (C18 ec-SPE) abgetrennt und anschließend durch Szintillationsmessung (III.4.) bestimmt. Hierfür wurden 1 ml Polypropylensäulen mit 50 mg der stationären Phase befüllt. Die C18 ec-SPE-Säulen wurden mit zwei SV Methanol gewaschen und mit zwei SV 10 % (1:10, v/v) Methanol/Wasser equilibriert. Nach der Elution der Probe mit 900 µl 10 % (1:10, v/v) Methanol/Wasser wurde die Säule mit Methanol regeneriert.

III.Methoden 38

Das Säulenmaterial der C18 ec-SPE wurde wie folgt gereinigt und regeneriert: Elution von Jasmonsäure 2 ml 50 % (1:1, v/v) Methanol/Wasser Elution von Methyljasmonat 2 ml Methanol 2.3. Gaschromatographie (GC) Proben wurden mittels eines Varian 3400-Gaschromatographen (Varian, Darmstadt) analysiert. Als stationäre Phase diente eine Optima 5-Säule (25 m x 0.25 mm, Macherey-Nagel, Düren). Ihr wurde eine Vorsäule (methyldesaktivierte Säule, 10 m x 0.25 mm, Macherey-Nagel, Düren) vorgeschaltet, um die Lebensdauer der Trennsäule zu erhöhen. Als Trägergas wurde Helium mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 23 cm/s verwendet. Der Injektor (Insert-Liner mit silanisierter Glaswolle gepackt) wurde auf 300 °C geheizt und der Split wurde nach 1 min geöffnet. Die Detektion erfolgte mit einem angekoppelten SSQ 700-Massenspektrometer (Finnigan MAT, Bremen). Folgendes Temperatur-Zeitprogramm wurde zur Analyse von Methyl- und Ethylestern gewählt: Gesamtzeit [min] ∆T [°C/min] Endtemperatur

[°C] 0 - 90 3 - 90 10 30 300 18 - 300 3. Massenspektrometrie (MS) Die massenspektrometrischen Untersuchungen wurden an einem SSQ 700-Massenspektrometer der Firma Finnigan MAT, Bremen, vorgenommen. Mit diesem Gerät wurde im chemischen Ionisations (CI)-Modus gemessen. Die Aufnahme von positiv-CI-Spektren wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Ionenquellentemperatur: 150 °C; Elektronenenergie: 70 eV; Reaktandgas: Isobutan; Quellendruck 2.0-2.5 x 10-5 Torr;

III.Methoden 39

4. Radioaktivitätsbestimmungen Tritium-markierte Proben wurden mit 2 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt und in einem Szintillationszähler „Wallac 1409 System 1400“ gemessen. Die qualitative und quantitative Auswertung von Methyl-[2-14C]jasmonat und [2-14C]Jasmonsäure auf Dünnschichtchromatogrammen wurde mit dem Dünnschicht-Scanner „Automatic TLC-Linear Analyzer RITA“ durchgeführt. 5. Proteinbiochemische Methoden 5.1 Proteingehaltsbestimmungen Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Methode von BRADFORD (1979) mit Rinderserumalbumin als Standard. Das Prinzip dieses Tests basiert auf der in saurer Lösung unspezifischen Bindung von Coomassie Brilliant Blue G250 an Proteine. Die Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nach 595 nm wurde photometrisch bestimmt. Das frisch angesetzte Coomassie-Reagenz (0.01 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G250, 5 % (v/v) EtOH (96 %), 10 % (v/v) Phosphorsäure (85 %)) wurde für drei Tage auf einem Magnetrührer durchmischt. Abschließend wurde es über einen Faltenfilter abfiltriert und konnte zur Proteinbestimmung verwendet werden. 5.2 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) Denaturierende SDS-Polyarylamidgel-Elektrophorese, die zur Bestimmung des Molekulargewichtes und zur Prüfung auf Homogenität und Reinheit des Proteins diente, wurde nach dem von LAEMMLI (1970) beschriebenen und von BLACKSHEAR (1984) modifizierten Verfahren durchgeführt. Das anionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) lagert sich dabei an die Proteine an und hebt Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen auf. Da bei größeren Proteinen mehr SDS-Moleküle angelagert werden, nimmt die Ladung proportional mit der Molekülgröße zu. In dem diskontinuierlichen Gelsystem ergibt sich dadurch eine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus der relativen Molekülmasse und den Wanderungsstrecken der anionischen SDS-Proteinmizellen. Zusätzlich werden reduzierende Thiolverbindungen zugegeben, um Disulfidbrücken aufzuspalten. Proteinkomplexe können dabei in einzelne Fragmente zerfallen.

III.Methoden 40

Polyacrylamidgele wurden in der unter II.10. beschriebenen Apparatur angefertigt. Dabei wurden zwischen zwei Glasplatten (10 cm x 10.5 cm, mit 1.5 mm Abstandshaltern) zuerst ein engmaschigeres Trenngel, anschließend ein weitmaschigeres Sammelgel auspolymerisiert. Folgende Lösungen wurden für ein 12.5 %iges SDS-Polyacrylamidgel verwendet: Acrylamid-Stammlösung: 29.2 % (w/v) Acrylamid; 0.8 % (w/v) Bis-Acrylamid;

Laufpuffer: 25 mM Tris-HCl, pH 8.3; 0.192 M Glycin; 0.1 % (w/v) SDS;

Trenngel-Lösung: 6.3 ml Acrylamid-Stammlösung; 3.8 ml 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8; 4.8 ml H2O; 150 µl 10 % (v/v) SDS-Lösung; 75 µl 10 % (w/v) APS-Lösung; 5 µl TEMED;

Sammelgel-Lösung: 0.88 ml Acrylamid-Stammlösung; 1.66 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8; 4.06 ml H2O; 66 µl 10 % (v/v) SDS-Lösung; 33.4 µl 10 % (w/v) APS-Lösung; 3.3 µl TEMED;

Butanol (H2O gesättigt): 10 % (v/v) H2O;

Trenngelüberschichtungs-Lösung: 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8; 10 % (v/v) SDS-Lösung;

2 x Probenpuffer: 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8; 20 % (v/v) Glycerin; 4 % (w/v) SDS; 0.02 % (w/v) Bromphenolblau;

5 x Probenpuffer: 0.313 M Tris-HCl, pH 6.8; 50 % (v/v) Glycerin; 10 % (v/v) SDS; 0.05 % (w/v) Bromphenolblau;

Die Trenngellösung wurde sofort nach der Herstellung 10 cm hoch zwischen die Glasplatten gegossen und die Oberflächenspannung durch die Zugabe von 10 µl wassergesättigtem Butanol herabgesetzt. Nach 30 min wurde das Gel mit Trenngelüberschichtung-Lösung überschichtet. Nach zweistündiger Polymerisation des Trenngels wurde die Trenngelüberschichtungs-Lösung entfernt und der noch nicht gefüllte Gelkammerabschnitt mit H2O ausgespült. Der verbliebene Gelkammerraum wurde mit Sammelgel-Lösung gefüllt und ein Kamm der zehn Probetaschen formte, eingefügt. Nach 30 min Polymerisation des Sammelgels wurde das Gel zusammen mit den Glasplatten in den Elektrophoresetank gebracht und mit Laufpuffer überschichtet. Erst jetzt wurde der Kamm entfernt und die einzelnen

III.Methoden 41

Probentaschen nochmals mit Laufpuffer ausgespült, um freie Polyacrylsäuren zu entfernen. Vor der Aufgabe der Probe wurde die Proteinlösung je nach Proteinmenge mit 2 x oder 5 x Probenpuffer versetzt und für 10 min auf 95 ºC erhitzt. 20 µl Proteinlösung wurden in die Probentaschen pipettiert. Die Proben ließ man mit 50 V Anfangsspannung in das Gel überführt. Nachdem der im Probenpuffer enthaltener Farbstoff (Bromphenolblau) das Trenngel erreicht hatte, wurde die angelegte Spannung auf 150 V erhöht. Der Lauf war beendet, wenn die Bromphenolblau-Front fast das Ende des Gels erreicht hatte und das Gel konnte mit Coomassie Brilliant Blue oder Silber gefärbt werden. 5.3. Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen Coomassie-Färbung von Proteinen Für die Färbung der Proteine im SDS-Polyacrylamidgel wurde Coomassie Brilliant Blue R250 verwendet. Coomassie Brilliant Blue bindet dabei nicht-kovalent an die Aminosäurereste der Proteine. Man erreicht bei dieser Methode Nachweisempfindlichkeiten je nach Farbstoffbindevermögen der Proteine von 100 ng bis 1 µg. Zur Färbung wurden die Polyacryamidgele mit „Coomassie“-Lösung (0.02 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R250, 50 % (v/v) Ethanol, 10 % (v/v) Essigsäure) über Nacht inkubiert und anschließend mit Entfärberlösung (50 % (v/v) Ethanol, 10 % (v/v) Essigsäure) wieder entfärbt. Die Aufbewahrung der Gele erfolgte wie unter III.5.4. beschrieben. Mit Coomassie Brilliant Blue gefärbte Gele konnten zur Visualisierung geringer Mengen an Protein noch einer Silberfärbung unterzogen werden. Silberfärbung Die Silberfärbung ist im Gegensatz zur „Coomassie“-Färbung deutlich empfindlicher und kann Subnanogramm-Mengen an Protein nachweisen. Bei der Silberfärbung werden die Proteine durch Essigsäure im Gel fixiert und dann in eine Silbernitratlösung eingelegt. Einige Silber-Ionen werden von den Proteinen gebunden und durch Reduktion, initiiert von den funktionellen Gruppen und Peptidbindungen in Silberkeime umgewandelt. Anschließend werden durch ein starkes Reduktionsmittel alle Silber-Ionen im Gel zu metallischem Silber reduziert. Dies findet in der Nähe der Silberkeime viel schneller statt als im übrigen Gel. Daher färben sich Proteinbanden schnell dunkelbraun bis schwarz. Gestoppt wird die Reaktion durch eine starke pH-Änderung von basisch nach sauer.

III.Methoden 42

Zur Färbung der Proteinbanden mit Silbernitrat (BLUM et al., 1987) wurden die SDS-Polyacrylamidgele für 30 min in Fixierer inkubiert. Anschließend erfolgten drei zehnminütige Waschschritte mit 50 % (v/v) Ethanol zum Neutralisieren. Es erfolgte eine einminütige Inkubation mit 0.02 % (w/v) Natriumthiosulfat-Lösung und nach kurzem Waschen mit Wasser (3 x 20 sec) wurde für 20 min mit Silbernitratlösung inkubiert. Nach erneutem Waschen mit Wasser wurde das Gel mit Entwickler gefärbt und die Farbreaktion durch Ansäuern mittels Zugabe von Stopplösung beendet. Abschließend erfolgte ein Waschschritt mit 50 % (v/v) Ethanol und die Konservierung des Gels (III.5.4.). Fixierer/ Stopplösung: 50 % (v/v) Methanol; 12 % (v/v) Essigsäure; 0.05 % (v/v) Formaldehyd (37 %);

Silbernitratlösung: 0.1 % (w/v) Silbernitrat; 0.1 % (v/v) Formaldehyd (37 %);

Entwickler: 6 % (w/v) Natriumcarbonat; 0.4 % (w/v) Natriumthiosulfat; 0.05 % (v/v) Formaldehyd (37 %);

5.4. Konservierung gefärbter Gele Gefärbte Gele konnten durch Trocknen zwischen zwei Lagen Einmachzellophan dauerhaft konserviert werden. Dazu wurden die Gele zunächst in 5 % Glycerin für ca. 20 min gelegt und anschließend in einen Gel-Trockenrahmen zwischen zwei Lagen Einmachzellophan eingespannt. Das Gel wurde im Gel-Trockenrahmen für zwei Tage bei RT getrocknet. 5.5. Größenbestimmung von Proteinen in Gelen Zur Bestimmung der relativen Molekülmasse wurde ein Markerproteingemisch eingesetzt, das fünf verschiedene Proteine im Größenbereich zwischen 15 kDa und 75 kDa enthält. Nach der Trennung wurde für jede Bande die elektrophoretische Mobilität (Rf-Wert) bestimmt und halblogarithmisch gegen die Molekülmasse aufgetragen. Mit Hilfe der resultierenden Gerade konnte anhand des Rf-Wertes des unbekannten Proteins dessen Molekülmasse grob bestimmt werden.

III.Methoden 43

5.6. Transfer von Proteinen (Western-Blot) und Immunodetektion Transfer von Proteinen (Western-Blot) Die im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine wurden nach dem Semidry-Blotting-Verfahren auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Auf die Kathodenplatte wurden zunächst drei mit Kathodenpuffer (40 mM 6-Aminocapronsäure, 20 % (v/v) Methanol) getränkte Filterpapiere von der Größe des Gels gelegt. Anschließend wurden darauf das Gel, die mit Anodenpuffer 2 (25 mM Tris-Puffer, pH 8.8; 20 % (v/v) Methanol) gesättigte Membran, drei weitere mit diesem Puffer angefeuchtete Filterpapiere und drei Filterpapiere die mit Anodenpuffer 1 (300 mM Tris-Puffer pH 8.8; 20 % (v/v) Methanol) getränkt waren, in der aufgeführten Reihenfolge platziert. Nachdem die Anodenplatte installiert war, erfolgte der Transfer bei 0.8 mA/cm² über 60 min. Die Proteine wurden auf der Membran mit Ponceau-Lösung (0.1 % (w/v) Ponceau S in Essigsäure) angefärbt und fixiert. Der Farbstoff ließ sich durch Waschen mit Wasser wieder entfernen. Immunodetektion (Antikörpernachweis) Nach elektrophoretischer Auftrennung und Übertragung auf Nitrocellulose-Membranen lassen sich Proteine mit spezifischen Bindungseigenschaften über Antikörper nachweisen. Zur Detektion des Protein-Antikörper-Konjugates trägt der Antikörper als Reportergruppe Alkalische Phosphatase. Die an den Antikörper gekoppelte Alkalische Phosphatase wird mit dem Chemilumineszenz Substrat CDP-Star versetzt und das emittierte Licht mittels eines Röntgenfilms detektiert. Für den immunobiochemischen Nachweis wurde die Membran mit den gebundenen Proteinen mindestens 1 h in Blocklösung inkubiert. Nach einstündiger Inkubation mit einem primären Antikörper (Antikörper gegen Hexahistidin-Rest, aus Ziege gewonnen, Amersham Pharmacia, 1:1.000 in Blockpuffer verdünnt) wurde ungebundener Antikörper mit 1 x PBS/Tween (3 x 5 min) entfernt. Die Bindung des sekundären Antikörpers (Antikörper gegen Ziege, aus Maus gewonnen, Sigma, 1:30.000 verdünnt in Blockpuffer), der an Alkalische Phosphatase gekoppelt ist, erfolgte über 1 h und abschließend wurde die Membran mit 1 x PBS/Tween (3 x 5 min) und 1 x TBS (2 x 5 min) gewaschen. 10 x PBS (pH 7.3-7.4): 0.23 M Na2HPO4; 0.17 M NaH2PO4; 1 M NaCl;

1 x PBS/Tween: 0.1 % (v/v) Tween 20;

III.Methoden 44

Blockpuffer: 5% (w/v) Milchpulver (fettfrei); 1 x PBS/Tween;

10 x TBS: 1.5 M NaCl; 0.5 M Tris/HCl pH 7.5;

Als Chemilumineszenz-Substrat für die Alkalische Phosphatase wurde CDP-Star (10 µl CDP-Star; 1 ml Diethanolamin-Lösung pH 10.0) eingesetzt. CDP-Star ist ein Chlor-substituiertes 1,2-Dioxetan-Chemilumineszenz-Substrat der Alkalischen Phosphatase. Die enzymatische Dephosphorylierung von CDP-Star führt zur Bildung eines meta-stabilen Dioxetan Phenolat-Anions, welches zerfällt und in gepufferter Lösung Licht bei 466 nm emittiert. Zur Detektion mittels CDP-Star wurde die Membran für 5 min in Nitroblock-Lösung und zweimal für 5 min in DEA-Lösung geschwenkt. 1 ml CDP-Star Substrat wurde gleichmäßig auf der Membran verteilt und für 5 min inkubiert. Die Nitrocellulose-Membran wurde nun in Folie eingeschlagen und zusammen mit einem Röntgenfilm in einer Röntgenfilmkassette für 30 s bis 5 min bei RT inkubiert. Tropix DEA-Lösung: 0.9 % (v/v) Diethanolamin (DEA) pH 10.0; 0.1 % (v/v) 1 M Magnesiumchlorid-Lösung;

Tropix Nitroblock-Lösung: Nitroblock 1:20 verdünnt in DEA-Lösung;

6. Reinigung von Proteinen 6.1. Konzentrieren, Entsalzen und Umpuffern von Proteinlösungen Ein wichtiger Schritt zwischen jeder Reinigungsstufe war die Konzentrierung und das Entsalzen der Proteinlösung. Dafür wurden je nach Menge an Proteinlösung unterschiedlicher Verfahren verwendet. Entsalzung über Sephadex G-25 (PD-10 Säulen) Zur Entsalzung von Proteinlöungen nach vorausgegangener Ammoniumsulfatfällung wurden vorgepackte Sephadex G-25 (PD-10 Säulen) benutzt. Die mit fünf Gelbettvolumen Puffer equilibrierte Säule wurde mit 2.5 ml Proteinlösung beladen und anschließend die umgepufferte Proteinfraktion in 2 ml des Probenpuffers eluiert. Von der eingesetzten Proteinmenge konnten 80 % Protein auf diese Weise wiedergewonnen werden.

III.Methoden 45

Einengen mit Einwegkonzentratoren Verschiedene Firmen bieten Konzentratoren an, mit denen Lösungen von Makromolekülen eingeengt werden können. Diese unterscheiden sich einerseits in der Ausschlussgröße der verwendeten Membranen, andererseits im Fassungsvermögen an zu konzentrierender Lösung. Bei allen verwendeten Systemen (Millipore, Eschborn) wurde der nötige Druck durch Zentrifugation erzeugt. Centricon® Plus

20 Zentrifugen-Filtereinheiten

Centricon® Zentrifugen-Filtereinheiten

Microcon® Zentrifugen-Filtereinheiten

Ausschlußgröße: 10 kDa 10 kDa 10 kDa Membrantyp: PL-10 Ultracel YM Ultracel YM Maximales Probenvolumen:

19 ml 2 ml 500 µl

6.2. Gewinnung zellfreier Enzympräparationen aus pflanzlichen

Zellsuspensionskulturen und differenziertem Pflanzengewebe Sieben Tage alte Zellsuspensionskulturen wurden über eine Porzellannutsche mit eingelegtem Nylonnetz (50 µm Maschenweite) mittels Vakuumfiltration vom Medium getrennt. Die in der Nutsche verbleibenden Zellen wurden kurz mit destilliertem Wasser gespült, erneut abgesaugt und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Tiefgefrorenes Zellmaterial wurde in einer Reibschale unter ständiger Kühlung pulverisiert. Anschließend wurde das pulverisierte Zellmaterial in der doppelten Menge Aufschlusspuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 7.5, 20 mM Mercaptoethanol) aufgenommen. Die auf diese Weise aufgebrochenen Zellen wurden so lange auf Eis gerührt, bis eine homogene Suspension entstand. Überstieg die Menge der aufzuschließenden Zellen ein Gewicht von 500 g, so wurden sie in einem Waring Blender aufgeschlossen. Die Zellwandbestandteile wurden durch vierlagigen Mull abgepresst und die Lösung anschließend im GSA Rotor bei 4 °C (12.000 x g, 20 min) zentrifugiert. Differenziertes Gewebe 4-8 Wochen alter Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser unter ständiger Kühlung pulverisiert. Tiefgefrorenes Gewebe wurde in der vierfachen Menge Aufschlusspuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 7.5, 20 mM

III.Methoden 46

Mercaptoethanol) aufgenommen. Der Rohextrakt wurde gewonnen, indem die Gewebesuspension durch Filtration über einen Faltenfilter geklärt wurde. Die Menge an Zellmasse, Pufferart und –volumen für die Gewinnung zellfreier Enzympräparationen aus pflanzlichen Zellsuspensionskulturen und aus differenziertem Pflanzengewebe variierten geringfügig und sind im jeweiligen Ergebnisteil spezifiziert. 6.3. Protein-Überexpression der rekombinanten MeJA-Esterase Kulturbedingungen der Protein-Überexpression Die Expressionsbedingungen der rekombinanten MeJA-Esterase wurden zunächst hinsichtlich Temperatur und Expressionsdauer optimiert. Alle Versuche wurden in LB-Nährmedium (100 µg/ml Ampicillin, 50 µg/ml Kanamycin) vorgenommen. Ein Teil einer Übernachtkultur wurde 1:10 mit Medium verdünnt und diese über Nacht bei 20 °C im Schüttler inkubiert, bis die Bakterienkultur eine OD600 von 0.6-0.9 zeigte. Mit 0.25 mM IPTG (Isopropylthiogalactosid) wurden Bakterienkulturen induziert und für weitere 24 h bei 20 °C im Schüttler inkubiert. Aufschluss bakterieller Zellen Bakterienzellen, die einen Expressionsvektor enthielten, wurden in Selektionsmedium mit dem entsprechenden Antibiotikum bis zu einer späten log-Phase kultiviert und anschließend bei 4.000 x g (10 min) zentrifugiert. Nach Waschen des Niederschlages mit Aufschlusspuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH; 1 mM EDTA) und erneuter Zentrifugation wurde der Niederschlag im gleichen Puffer resuspendiert, jedoch nur in einem Zehntel des Ausgangsvolumens. Die Zellen wurden unter Eiskühlung in Portionen (25 ml im Falcon-Röhrchen) mittels Ultraschall für 6 x 10 sec mit 30 sec Unterbrechung aufgebrochen (Pulse/sec, Stufe 4, 50 % Duty Cycle). Die Probe wurde ständig im Eisbad gekühlt, denn Erwärmung, übermäßiger Lufteintrag und mechanische Belastung der Probe hätte zum Funktionsverlust des Proteins führen können. Nach Abtrennung von Zellwandfragmenten (Zentrifugation 15.000 x g, 20 min, 4 °C) konnte der Überstand für Enzymtests weiter verwendet werden.

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6.4. Chromatographische Aufreinigung von Proteinen Die Auftrennung von Proteingemischen erfolgte mittels säulenchromatographischer Methoden in gekühlten Schränken bei 4 ºC. Alle verwendeten Chromatographiesäulen wurden mit der HPLC-Anlage „Äkta Purifier“ (Amersham Biosciences) betrieben. Vor jedem Lauf erfolgte ein Spülen der Chromatographiesäulen mit drei Gelbettvolumina des Startpuffers. Die Wahl der maximalen Druckbelastung und der damit erreichten Flussrate richtete sich nach den Angaben des Herstellers für die eingesetzten Chromatographiematerialen oder Chromatographiesäulen. Der Verlauf der Proteintrennung wurde durch kontinuierliche Messung der UV-Absorption bei 280 nm kontrolliert und zusammen mit Fraktionswechsel und Gradienten (Größenausschluss-Chromatographie ausgenommen) in einem Chromatogramm aufgezeichnet. Die Auswertung der Proteinauftrennung erfolgte durch Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität in den einzelnen Fraktionen. Für eine längerfristige Lagerung wurden alle Chromatographiematerialen oder Chromatographiesäulen mit 20 % Ethanol equilibriert und bei 4 ºC aufbewahrt. 6.4.1. Anionenaustausch-Chromatographie Das Trennprinzip eines Anionenaustauschers beruht auf der Bindung negativ geladener Proteine an die positiv geladenen Gruppen der quartären Amine, welche an die Matrix gebunden sind. Ist der isoelektrische Punkt der gelösten Proteine saurer als der verwendeten Puffer, liegen sie als Anionen vor und können an die positiv geladene Säulenmatrix gebunden werden. Durch Anionen starker Säuren wie z. B. Cl- werden die Proteine wieder aus der Bindung verdrängt und von der Säule eluiert. Anionenaustausch-Chromatographie an Q-Sepharose „Fast Flow“ Material Q-Sepharose „Fast Flow“ ist ein starker Anionenaustauscher, dessen Matrix aus kugelförmigen Agarose-Einheiten besteht. Säulencharakteristika: Säulen-Maße (Innendurchmesser [cm] x Höhe [cm]): 2.6 x 20 Gelbettvolumen [ml]: 55 Mittlere Partikelgröße [µm]: 45-165 Proteinbindungskapazität [mg Protein/ml Gel]: 120

III.Methoden 48

Maximale Druckbelastung [MPa]: 0.5 Zum Packen der Säule wurde eine XK 26/20-Säule (Amersham Biosciences), 2.6 cm Innendurchmesser, mit dem vorgequollenen und mit Startpuffer equilibrierten Gel gefüllt. Das Packen erfolgte mit einer Flussrate von 5 ml/min bis zu einer Gelbetthöhe von 10 cm (entsprechend einem Säulenvolumen von ca. 55 ml). Nachfolgend wurde der Säulenadapter direkt auf das Gel aufgebracht und justiert. Puffer zur Auftrennung der nativen bzw. rekombinanten MeJA-Esterase: Startpuffer: Elutionspuffer: 50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH;

50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH; 1 M KCl;

Die Unterschiede in der Auftrennung der nativen bzw. rekombinanten MeJA-Esterase wurden im Ergebnisteil beschrieben. Start- und Elutionspuffer waren in beiden Fällen identisch. Anionenaustausch-Chromatographie an einer „Bio-Scale Q2“ Chromatographiesäule Bio-Scale Q2 ist ein starker Anionenaustauscher, der als fertig gepackte Chromatographiesäule erworben werden kann. Säulencharakteristika: Säulen-Maße ( Innendurchmesser [cm] x Höhe [cm): 0.7 x 5.2 Gelbettvolumen [ml]: 2 Mittlere Partikelgröße [µm]: 10 ± 2.7 Proteinbindungskapazität [mg Protein/ml Gel]: 20 Maximale Druckbelastung [MPa]: 5.0 Puffer zur Auftrennung der nativen MeJA-Esterase: Startpuffer: Elutionspuffer: 50 mM Tricin-Puffer, pH 8.0; 20 mM EtSH;

50 mM Tricin-Puffer, pH 8.0; 20 mM EtSH; 1 M KCl;

III.Methoden 49

Anionenaustausch-Chromatographie an einer „Mono Q HR 5/5“ Chromatographiesäule Zur hochauflösenden Anionenaustausch-Chromatographie wurde eine fertig gepackte Mono Q HR 5/5 Chromatographie-Säule benutzt. Hierbei handelt es sich um einen stark basischen Anionenaustauscher, dessen geladene, quartäre Tetraalkylammoniumgruppen sich an hydrophilen, gleichmäßig kugelförmigen Harzpartikeln („MonoBeads“) befinden. Säulencharakteristika: Säulen-Maße (Innendurchmesser [cm] x Höhe [cm]): 0.5 x 5 Gelbettvolumen [ml]: 1 Mittlere Partikelgröße [µm]: 10 Proteinbindungskapazität [mg Protein/ml Gel]: 20 - 50 Maximale Druckbelastung [MPa]: 5 Puffer zur Auftrennung der nativen MeJA-Esterase: Startpuffer: Elutionspuffer: 50 mM KPi-Puffer, pH 5.5; 20 mM EtSH;

50 mM KPi-Puffer, pH 5.5; 20 mM EtSH; 1 M KCl;

Puffer zur Auftrennung der rekombinanten MeJA-Esterase: Startpuffer: Elutionspuffer: 50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH;

50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH; 1 M KCl;

6.4.2. Hydroxyapatit-Chromatographie an einer Bio-Scale CHT5

Chromatographiesäule Proteine werden von einer kristallinen Hydroxyapatit-Matrix, einer unlöslichen Form von Calcium-Phosphat mit der empirischen Formel Ca5(PO4)3OH, adsorbiert. Das Trennprinzip beruht darauf, dass sowohl Amino- als auch Carboxygruppen mit der Oberfläche der nicht-porösen Hydroxyapatitkristalle interagieren. Säulencharakteristika: Säulen-Maße (Innendurchmesser [cm] x Höhe [cm]): 1.0 x 6.4

III.Methoden 50

Gelbettvolumen [ml]: 5 Partikelgröße [µm]: 10 ± 3.0 Proteinbindungskapazität [mg Protein/ml Gel]: 50 Maximale Druckbelastung [MPa]: 5.0 Puffer zur Auftrennung der nativen MeJA-Esterase: Startpuffer: Elutionspuffer: 20 mM KPi-Puffer, pH 6.8; 20 mM EtSH; 0.3 mM CaCl2;

500 mM KPi-Puffer, pH 6.8; 20 mM EtSH;

6.4.3. Größenausschluss-Chromatographie Eine Größenausschluss-Chromatographie basiert auf einer chemisch inerten Matrix mit Poren definierter Größe. Größere Moleküle können nicht durch die kleinen Öffnungen der Gelmatrix diffundieren. Sie verbleiben in den Zwischenräumen der Säulenmatrix und werden rasch eluiert. Kleinere Moleküle dringen dagegen in die Poren des Gels ein und werden länger im Säulenmaterial zurückgehalten. Mit einer Größenausschluss-Chromatographie werden die Proteine ihrer Größe entsprechend aufgetrennt. Größenausschluss-Chromatographie an einer „HiLoad 16/60 Superdex 200“ Chromatographiesäule Das Material der Superdex 200 Chromatographiesäule wird durch Dextran-Ketten gebildet, die kovalent an eine stark quervernetzte Agarose-Matrix gebunden sind. Säulencharakteristika: Säulen-Maße (Innendurchmesser [cm] x Höhe [cm]): 1.6 x 60 Gelbettvolumen [ml]: 120 Mittlere Partikelgröße [µm]: 34 Maximale Druckbelastung [MPa]: 0.3 Optimaler Trennbereich [Mr globuläre Proteine]: 1 x 104 – 6 x 105

Puffer zur Auftrennung der nativen MeJA-Esterase: Elutionspuffer: 50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH; 0.15 M NaCl;

III.Methoden 51

Größenausschluss-Chromatographie an einer „Sephacryl S-100 HR 26/60“ Chromatographiesäule Sephacryl Material formt eine hydrophile Matrix und setzt sich zusammen aus quervernetztem Allyl-Dextran das an N,N´-Methylen-Bisacrylamid kovalent bindet. Säulencharakteristika: Säulen-Maße (Innendurchmesser [cm] x Höhe [cm]): 2.6 x 60 Gelbettvolumen [ml]: 320 Partikelgröße [µm]: 47 Maximale Druckbelastung [MPa]: 0.3 Optimaler Trennbereich [Mr globuläre Proteine]: 5 x 103 – 2.5 x 105

Puffer zur Auftrennung der rekombinanten MeJA-Esterase: Elutionspuffer: 50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH; 0.15 M NaCl; 6.4.4. Affinitätschromatographische Reinigung an immobilisierten

Metallionen (BD Talon™-Material) Bei der Affinitätschromatographie an immobilisierten Metallionen (IMAC) dient als Trennparameter die unterschiedliche Affinität von Proteinen zu chelatgebundenen Metallionen. Die Bindungsstärke hängt von der Anzahl und räumlichen Anordnung bestimmter Aminosäuren (z.B. Histidin) ab. Im Falle des in der vorliegenden Arbeit verwendeten BD Talon™ Affinitätsmaterials werden Cobalt-Ionen über einen vierzähnigen Chelator komplexiert. Die Elution der gebundenen Proteine kann über Erniedrigung des pH-Wertes oder über kompetitive Verdrängung mittels Substanzen mit Aminfunktionen erfolgen. Charakteristika des Affinitätsmaterials: Gebundenes Metallion: Cobalt Gelmatrix: Sepharose CL-6B Gelbettvolumen [ml]: 500 µl Partikelgröße [µm]: 45 - 165 Proteinbindungskapazität [mg Protein/ml Gel]: 5-10

III.Methoden 52

Puffer zur Auftrennung der rekombinanten MeJA-Esterase: Waschpuffer: Elutionspuffer: 50 mM NaPi-Puffer, pH 7.0; 300 mM NaCl; 10 % Glycerin;

50 mM NaPi-Puffer, pH 7.0; 300 mM NaCl; 150 mM Imidazol; 10 % Glycerin;

Regeneration des Affinitätsmaterials: 20 mM MES-Puffer pH 5.0; 100 mM NaCl;

Zur Regeneration wurde gebrauchtes Affinitätsmaterial mit zehn SV Regenerationspuffer und zehn SV Waschpuffer gespült und konnte wieder verwendet werden. 6.4.5. Isoelektrische Fokussierung an einer Mono P HR 5/5 Chromatographie-

Säule Die isoelektische Fokussierung ist ein Verfahren, bei dem Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt werden. Die Elution der Proteine erfolgte mit einem pH-Gradienten. Dabei wird ein spezieller Anionenaustauscher (Mono P HR 5/20) mit Puffer bei einem pH-Wert equilibriert, bei dem das gewünschte Enzym negativ geladen ist und somit an den Anionenaustauscher bindet. Durch Elution mit einem ampholythaltigen Puffer (Polybuffer 74) bildet sich ein pH-Gradient aus, der langsam durch die Säule wandert. Das Enzym eluiert von der Säule, wenn der pH-Wert soweit abgesenkt wurde, dass das Enzym formal ungeladen ist und deshalb vom Anionenaustauscher abgelöst werden kann. Säulencharakteristika: Säulen-Maße (Innendurchmesser [cm] x Höhe [cm]): 0.5 x 20 Gelbettvolumen [ml]: 4 Partikelgröße [µm]: 10 Proteinbindungskapazität [mg Protein/ml Gel]: 5-10 Maximale Druckbelastung [MPa]: 5.0 Vor erneuter Inbetriebnahme der Säule musste zuerst 1 ml 5 M NaOH, anschließend 1 ml 1 M Natriumacetat aufgegeben werden, bevor mit Startpuffer equilibriert werden konnte.

III.Methoden 53

Puffer zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes der nativen MeJA-Esterase: Startpuffer: Elutionspuffer: 25 mM Bis-Tris-Puffer, pH 6.3; (eingestellt mit HCl);

10 % Polybuffer 74, pH 4.0; (eingestellt mit HCl);

7. Mikrosequenzierung von Proteinen 7.1. Sequenzierung von Peptidfragmenten Die Bestimmung der Primärstruktur von tryptischen Peptiden isolierter Proteine erfolgte nach ECKERSKORN et al. (1990), und wurde in den Labors von Prof. Dr. Lottspeich, MPI für Biochemie, Martinsried durchgeführt. Proteinverdau mittels Trypsin in der Gelmatrix Mittels SDS-PAGE wurden 25–50 µg gereinigtes Protein aufgetrennt und die gewünschte Proteinbande nach Anfärben mit Coomassie Brilliant Blue aus dem Gel herausgeschnitten. Der Gelstreifen wurde gründlich unter Schwenken mit Wasser gewaschen, in Würfel von ca. 2 x 2 mm Größe geschnitten und anschließend im Vakuumkonzentrator getrocknet. Der tryptische Verdau erfolgte in situ unter Verwendung von hochreinem Trypsin in Tris-HCl, pH 8.5 bei 37 ºC für 5 h. Die vorangegangene Trocknung der Gelstücke gewährleistete eine gleichmäßige Verteilung der Trypsinlösung. Nach der Reaktion wurden die entstandenen Peptide durch mehrmalige Behandlung der Gelstücke mit 75 % Acetonitril und 50 % Trifluoressigsäure eluiert. Die Peptidlösung wurde anschließend in der Vakuumzentrifuge konzentriert und das Acetonitril vollständig abgezogen. Aufreinigung der Peptidfragmente und automatische Sequenzierung Die Acetonitril-freie Peptidlösung wurde mittels HPLC in die einzelnen Peptide aufgetrennt. Hierbei kam eine micro-HPLC-Anlage der Fa. Merck mit einer reversed-phase Säule MicroCart 150-1 mm RP 18 zum Einsatz. Die Elution der Peptide erfolgte mittels eines Gradienten von 0 bis 60 % Acetonitril in 0.1 % Trifluoressigsäure. Das Eluat wurde bei 260 nm detektiert und in einzelnen Fraktionen aufgefangen. Fraktionen, die eindeutig homogene Peptide in ausreichender Menge enthielten, wurden auf Glasfaserfilter aufgetragen und

III.Methoden 54

anschließend automatisch sequenziert. Dies erfolgte durch Edman-Abbau in einem Procise 492 A Gasphasensequenziergerät (Applied Biosystems, Weiterstadt) mit nachgeschalteter HPLC-Analyse der entstandenen Phenylthiohydantoin-Aminosäuren. Alle Arbeiten wurden in den Labors von Prof. Lottspeich am MPI für Biochemie, Martinsried durchgeführt. 7.2. N-terminale Sequenzierung von Proteinen Die Bestimmung des Amino-Terminus der MeJA-Esterase wurde im Labor von Prof. Dr. Hoppe, Lehrstuhl für Physiologische Chemie II, Universität Würzburg durchgeführt. Proteintransfer auf eine PVDF-Membran Zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz wurde das Protein aus einem ungefärbten 12 %igen SDS-Polyacrylamidgel auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Proteinübertragung erfolgte durch Elektrotransfer mit Hilfe einer Tank-Blot-Apparatur. Die PVDF-Membran wurde auf Gelgröße zugeschnitten, 2 min in Methanol und weitere 10 min in CAPS-Puffer equilibriert. Zwölf Filterpapierstücke (Whatman-3MM-Chromatographie-Papier) und zwei Schwämme wurden in CAPS-Puffer eingelegt. Das Gel wurde 5 min in CAPS-Puffer gewaschen und die Blotkammer mit CAPS-Puffer gefüllt. Auf einen Schwamm wurden sechs Lagen Filterpapier, das Gel, die PVDF-Membran, sechs Lagen Filterpapier sowie der zweite Schwamm gestapelt und zwischen den Halteplatten in die Blot-Kammer eingesetzt. Der Proteintransfer erfolgte für 1 h bei 250 mA und für weitere 30 min bei 350 mA. Die zu analysierenden Proteine wurden mittels Coomassie Brilliant Blue R250 gefärbt, die Proteinbande in einer möglichst kleinen Fläche ausgeschnitten und nachfolgend wieder entfärbt. Diese Probe wurde für die Sequenzierung verwendet. CAPS-Puffer: 0.1 M CAPS-Puffer pH 11.0; 10 % (v/v) Methanol;

Färbelösung: 0.1 % Coomassie Brilliant Blue R 250; 50 % (v/v) Methanol; 7.5 % Eisessig;

Entfärber: 50 % (v/v) Methanol; 7.5 % Eisessig;

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Proteinsequenzierung Die aminoterminale Sequenzierung des auf eine PVDF-Membran transferierten Proteins (III.5.6.1.) wurde von Frau Dr. Vivienne Hoppe, Lehrstuhl für Physiologische Chemie II, Universität Würzburg an einem Gasphasensequenzer Modell 476 A (Applied Biosystems, Weiterstadt) durchgeführt. 8. Molekularbiologische Methoden 8.1. Nukleinsäuregehaltsbestimmung Die Konzentration von Nukleinsäuren wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt. Eine Absorption von 1.0 entspricht dabei den folgenden Konzentrationen: Doppelsträngige DNA: 50 µg/µl; Einzelsträngige DNA: 33 µg/µl; RNA: 40 µg/µl; 8.2. Präparation von Nucleinsäuren 8.2.1. RNA-Präparation nach der Lithiumchlorid-Methode Die Isolierung von Gesamt-RNA erfolgte nach der Methode von AUSUBEL et al. (1994), die auf einer selektiven RNA-Fällung aus Nucleinsäuregemischen durch Lithiumchlorid beruht. Endogene Ribonucleasen (RNasen) wurden durch SDS im Aufschlusspuffer inhibiert, durchgehend sterile Bedingungen verhinderten die Kontamination mit exogenen RNasen. Für den Aufschluss wurden Tomaten-Zellsuspensionskulturen mit flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem vorgekühlten Mörser pulverisiert. Aufgeschlossene Zellen (5 g) wurde erst mit 15 ml Extraktionspuffer (TLE-Puffer mit 1 % SDS) und anschließend mit 5 ml TLE-equilibriertem Phenol vermischt. Nach einer Homogenisierungszeit von 10 sec mit dem Ultraturrax wurden 5 ml Chloroform zugegeben und abermals homogenisiert. Zur vollständigen Zell-Lysis wurde die Mischung 20 min im 50 ºC warmen Wasserbad inkubiert und zur Abtrennung der Zelltrümmer anschließend 15 min (8.000 x g) zentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde abgezogen, in ein neues Zentrifugengefäß überführt und so oft mit TLE-gesättigtem Phenol und Chloroform (je 5 ml) extrahiert,

III.Methoden 56

bis an der Grenzfläche kein Protein mehr ausfiel. Als abschließender Schritt wurde mit 10 ml Chloroform extrahiert. Die abgetrennte wässrige Phase wurde nun mit einem Drittel ihres Volumens (ca. 5 ml) 8 M LiCl versetzt. Die Fällung der RNA erfolgte bei 4 ºC über Nacht. Durch Zentrifugation (20 min, 30.000 x g, 4 ºC) bildete sich ein glasiger Niederschlag, der mit 1 ml 2 M LiCl-Lösung gewaschen und erneut zentrifugiert wurde (5 min, 8.000 x g, 4 ºC). Der Niederschlag wurde vorsichtig in 600 µl sterilem Wasser gelöst, in ein Reaktionsgefäß überführt und abermals mit 200 µl 8 M LiCl-Lösung versetzt. Nach zweistündiger Inkubation bei 4 ºC wurde die RNA abzentrifugiert (20 min, 15.000 x g, 4 ºC), der Niederschlag mit 2 M LiCl-Lösung gewaschen (Zentrifugation 5 min, 15.000 x g, 4 ºC) und anschließend in 200 ml sterilem Wasser gelöst. Als letzter Reinigungsschritt wurde eine Ethanolfällung durch Zugabe von 20 µl 3 M Natriumacetat-Lösung und 550 µl Ethanol durchgeführt (Fällung bei –80 ºC, 1 h). Die nach Zentrifugation bei 15.000 x g, 15 min, 4 ºC erhaltene RNA wurde in 100 µl sterilem Wasser gelöst und der Gehalt nach III.8.1. bestimmt. 8.2.2. RNA-Präparation mit der Trizol-Methode Für den Aufschluss wurden Tomaten-Zellsuspensionskulturen mit flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem vorgekühlten Mörser pulverisiert. In einem vorgekühlten Reaktionsgefäß wurden 100 mg des gefrorenen Zellgewebes mit 1 ml TRIzol Reagenz versetzt, sofort für 30 sec auf dem Vortex kräftig durchmischt und für 5 min bei RT inkubiert. Die Suspension wurde mit 200 µl Chloroform versetzt und für 15 sec ausgeschüttelt. Es folgte eine Inkubation bei RT für 3 min und ein Zentrifugationsschritt (12.000 x g, 15 min, 4 ºC), um wässrige und organische Phase voneinander zu trennen. Die RNA enthaltende obere, wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, nochmals mit Chloroform extrahiert und zentrifugiert (12.000 x g, 15 min, 4 ºC). Die RNA wurde aus der oberen, wässrigen Phase mit 0.5 VT Isopropanol für 10 min bei RT gefällt und anschließend zentrifugiert (12.000 x g, 15 min, 4 ºC). Das Präzipitat wurde mit 75 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 µl DEPC-Wasser aufgenommen. 8.2.3. RNA-Präparation mit dem Qiagen-Kit RNeasy Plant Mini Für die Isolierung von Gesamt-RNA aus Tomatengewebe wurde der RNeasy Plant Mini Kit eingesetzt. Die Methode beruht auf der spezifischen Bindung der RNA an die Oberfläche von Silicagel unter Hochsalzbedingungen. Die verwendeten Zellproben

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wurden mit flüssigem Stickstoff gefroren und in einem vorgekühlten Mörser pulverisiert. Anschließend erfolgte die Lyse unter denaturierenden Bedingungen durch einen Guanidin-Isothiocyanat-haltigen Puffer, um vorhandene RNasen zu inaktivieren. Als Lyse-Puffer wurde Puffer RLC verwendet, da hierdurch pflanzliche Sekundärstoffe und Polysaccharide effektiv entfernt wurden und die RNA Isolierung nicht störten. Nachfolgend wurden die Proben auf eine Silicagel-Säule gegeben. Nach zweimaligem Waschen wurde die RNA mit 20 bis 40 µL DEPC-behandeltem Wasser eluiert und bei – 80 ºC bis zur weiteren Verwendung gelagert. Alle Arbeitsschritte erfolgten entsprechend dem Protokoll des Herstellers. 8.2.4. Präparation genomischer DNA aus Pflanzenzellen Die Isolierung genomischer DNA aus Pflanzenzellen erfolgte nach der Methode von ROGERS et al. (1985). Denaturierungs-Puffer: 1 % Sarcosyl; 0.022 M Tris-HCl (pH 7.8); 0.8 % CTAB (N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid); 0.14 M Mannitol; 0.8 M NaCl; (Zugabe von 14 µl EtSH pro 10 ml Denaturierungspuffer kurz vor dem Gebrauch des Puffers) Tomatensuspensions-Zellkulturen (2 g) oder Tomatenblätter (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) wurden mit flüssigem Stickstoff gefroren und in einem vorgekühlten Mörser pulverisiert. Denaturierungs-Puffers (10 ml) wurde auf 65 ºC vorgewärmt und das gefrorene Gewebe schnell zugegeben. Das Rohlysat wurde durch vorsichtiges Schwenken gemischt, mit 10 ml Chloroform versetzt und unter zeitweisem Belüften für 10 min bei 65 ºC im Wasserbad inkubiert. Nach dem Abkühlen auf RT wurden 10 ml Phenol zugegeben, für weitere 5 min durch vorsichtiges Schwenken extrahiert und die Phasen durch Zentrifugation bei 3.000 x g getrennt. Die obere, wässrige Phase wurde mit einem Volumenteil (VT) Isopropanol versetzt und die an der Grenzfläche ausfallende genomische DNA auf einem Glasstab aufgewickelt. Nach einem Waschschritt mit 70 %igem Ethanol wurde die genomische DNA bei RT getrocknet, in 400 µl TE-Puffer (pH 8.0) aufgenommen und durch kurzzeitiges Erhitzen auf 45 ºC in Lösung gebracht. Anschließend erfolgte eine

III.Methoden 58

Inkubation mit RNase A (Endkonzentration 100 µg/ml) für 30 min bei RT. Die genomische DNA wurde nochmals mit Chloroform extrahiert und durch Ammoniumacetat (Endkonzentration 2 M) und zwei VT Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und abschließend in 400 µl TE-Puffer (pH 8.0) aufgenommen. Die Konzentration der genomischen DNA wurde bei 260 nm bestimmt. Die Verunreinigung mit Protein wurde über das Verhältnis von A260 nm/A280 nm bestimmt und lag bei allen Proben > 1.6. Genomische DNA (1 µg) wurde auf ein 0.8 % Agarose/TAE-Gel geladen, um die Größe zu bestimmen und das Fehlen von RNA nachzuweisen. Die Bande der genomischen DNA sollte in einer diskreten Bande auf dem Gel zu sehen sein. Um die Verdaubarkeit der genomischen DNA nachzuweisen wurde 1 µg mit HindIII verdaut und auf einem 0.8 %igen Agarosegel aufgetrennt. War die genomische DNA komplett verdaut, so war keine konkrete Bande mehr auf dem Gel sichtbar. 8.2.5. Präparation von Plasmid-DNA Die Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse aus Flüssigkulturen (BIRNBOIM und DOLY, 1979). Mini-Präparation von Plasmid-DNA Eine Übernachtkultur von E. coli TOP 10 F mit dem zu isolierenden rekombinanten Plasmid wurde in 3 ml LB-Medium mit dem geeigneten Antibiotikum bei 37 ºC und 300 Upm in einem Schüttelinkubator angezogen. Eine Bakterienkultur (1.5 ml) für die Gewinnung von „high-copy“ Plasmiden oder 2 x 1.5 ml einer Bakterienkultur für die Gewinnung von „low-copy“ Plasmiden wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (1 min, 12.000 x g, RT). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 100 µl Resuspendierungs-Puffer aufgenommen. Die Bakterienzellen wurden durch Zugabe von 200 µl frisch angesetztem Lyse-Puffer und vorsichtigen Schwenken innerhalb von 5 min aufgeschlossen. Diese Suspension wurde zur Ausfällung von genomischer DNA, Proteinen und Kaliumdodecylsulfat mit 150 µl 3 M Kaliumacetat (pH 4.8) versetzt, wiederholt geschwenkt und 5 min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation (15 min, 12.000 x g, 4 ºC) wurden die Nucleinsäuren aus dem Überstand mit zwei Volumenteile Ethanol für 10 min bei RT gefällt und anschließend zentrifugiert (15 min, 12.000 x g, 4 ºC). Das Präzipitat wurde mit Ethanol 70 % (v/v) gewaschen, für 10 min bei 37 ºC getrocknet und in 20 µl Wasser aufgenommen.

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Puffer I (ResuspendierungsPuffer): Puffer II (Lyse-Puffer): 25 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.2 M NaOH; 10 mM EDTA; 1 % SDS; 50 mM Glucose; RNase (20 µg/ml) Puffer III (Neutralisations-Puffer): 3 M Kaliumacetat, pH 5,5; Midi-Präparation von Plasmid-DNA Für die Präparation größerer Mengen an Plasmid-DNA wurde eine Übernachtkultur von E. coli TOP 10 F, in 50 ml LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum angezogen. Zur Gewinnung hochreiner Plasmid-DNA wurde der „QIAfilter™ Plasmid Midi Kit“ von Qiagen nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Plasmid Mini- und Plasmid Midi-Systeme unterscheiden sich nur in dem maximal aufzuschließenden Kulturvolumen (3 ml bzw. 50 ml bakterielle Suspensionskultur), das durch die Bindungskapazität der Reinigungssäulen vorgegeben wird. Für Mengen bis 20 µg Plasmid-DNA wurden Mini-Präparationen durchgeführt, für Mengen bis 100 µg Plasmid-DNA wurde das Midi-System verwendet. 8.2.6. Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Unter UV-Licht wurde das DNA-Fragment enthaltende Agarosegelstück mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit“ entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Die Partikel des „QIAquick Gel Extraction Kit“ adsorbierten effektiv Nukleinsäuren aus Lösungen mit hoher Salzkonzentration und einem pH-Wert ≤ 7.5. Verunreinigungen wie Agarose, Proteine, Salz oder Ethidiumbromid wurden in zwei Waschschritten entfernt. Die gereinigte DNA wurde anschließend mit Wasser eluiert. 8.3. Agarosegele Agarosegel zur elektrophoretischen Auftrennung von DNA Mit Hilfe der Flachbett-Gelelektrophorese wurden DNA-Fragmente nach ihrer Größe aufgetrennt, um diese auf Qualität oder Menge zu überprüfen. In Abhängigkeit der zu erwartenden Größe der Nucleinsäuren wurden 0.7-1.2 %ige Agarose-Gele verwendet. Die Agarose wurde in einer Mikrowelle mit 1 x TAE-Puffer kurz

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aufgekocht und nach Abkühlen auf ca. 60-70 ºC in eine Gelform gegossen. Zur Sichtbarmachung der DNA wurde dem Gel vor dem Gießen in die Gelform 0.2 µg/µl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml Wasser) zugegeben. Die DNA wurde mit 0.2 Volumenteile DNA-Probenpuffer (10 x DNA-Probenpuffer: 0.25 % (w/v) Bromphenolblau; 0.25 % (w/v) Xylencyanol; 60 % (v/v) Glycerin; 150 mM Tris-HCl pH 7.6) versetzt und auf das nichtdenaturierende Agarosegel aufgetragen. Die elektrophoretische Auftrennung der DNA erfolgte bei 1.5 bis 6 V/cm mit 1 x TAE als Laufpuffer. Unter Bestrahlung mit UV-Licht (312 nm) konnte die Auftrennung der DNA dokumentiert werden. Denaturierende Agarosegel zur elektrophoretischen Auftrennung von RNA Zur elektrophoretischen Auftrennung von RNA-Fragmenten wurden denaturierende Agarosegele verwendet. Vor der elektrophoretischen Auftrennung der RNA mussten alle Geräte, die mit der Probe in Berührung kamen, von RNase-Kontamination befreit werden. Dies erfolgte durch Einlegen der Geräte in 3 %ige H2O2-Lösung über Nacht. Alle Puffer wurden mit DEPC-behandeltem Wasser angesetzt. Für die Herstellung des denaturierenden Agarosegels wurden 1.2 % (w/v) Agarose in 1 x FA-Puffer durch Erhitzen in der Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlen der Lösung auf ca. 50–60 ºC wurde Formaldehyd zugegeben (1.8 % (v/v) Endkonzentration). Jeweils 10-20 µg RNA wurden mit 0.25 VT 5 x RNA-Probenpuffer versetzt, 15 min bei 65 ºC erhitzt, 5 min auf Eis inkubiert und auf ein denaturierendes Agarosegel aufgetragen. Die RNA wurde 1.5 h bei 6 V/cm mit FA-Laufpuffer elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Dokumentation wurden die Agarosegele unter Bestrahlung mit UV-Licht (312 nm) fotografiert. FA-Laufpuffer: 10 % (v/v) 10 x FA-Puffer; 2 % (v/v) Formaldehyd;

5 x RNA-Probenpuffer: 40 % (v/v) 10 x FA-Puffer; 30.8 % (v/v) Formamid; 20 % (v/v) Glycerin; 7.2 % (v/v) Formaldehyd; 0.8 % (v/v) EDTA; 0.16 % (v/v) Bromphenolblau-Lösung; 0.001 % (v/v) Ethidiumbromid-Lösung

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8.4. Transfertechniken Um spezifische DNA- oder RNA-Moleküle durch Hybridisierung mit DNA-Sonden nachweisen zu können, müssen die Nukleinsäuren, nachdem sie in Gelen der Größe nach aufgetrennt worden sind, auf geeignete Trägermatrix übertragen und fixiert werden. Northern-Transfer Analysen mittels Northern-Transfer (Northern-„Blot“) dienen dazu die Expression eines bestimmten Genes in verschiedenen Zelllinien oder Geweben auf der Ebene der Transkription qualitativ oder quantitativ zu bestimmen. Vor dem Transfer wurde das denaturierende Agarose-Gel mehrmals mit 25 mM NaPi-Puffer (pH 6.5) gespült, um Formaldehyd zu entfernen. Transfer von RNA auf eine Nylonmembran erfolgte aus denaturierenden Agarose-Gelen (III.8.3.2.) mit 25 mM NaPi-Puffer mittels Kapillarblot. Hierzu wurde der zu „blottende“ Gelteil luftblasenfrei auf zwei Schichten Whatman®Papier gelegt, die mit 25 mM NaPi-Puffer getränkt waren. Das Papier stand mit einem Pufferreservoir in Verbindung, welches 25 mM NaPi-Puffer enthielt. Auf das Gel wurde zuerst eine Nylonmembran und dann drei Schichten Whatman®Papier gelegt. Den Abschluss bildete eine 10 cm hohe Schicht aus saugfähigem Papier. Alle Bestandteile des „Blots“ waren exakt auf Gelgröße zugeschnitten und wurden mit einem Gewicht von 500 g beschwert. Nach 16–18 h Transferzeit wurde die RNA durch zweistündiges Trocknen bei 80 ºC an der Membran fixiert. Southern-Transfer Dieses Verfahren kann zur Untersuchung von Restriktionsfragmenten genomischer DNA verwendet werden. Beim Southern-„Blotting“ wird DNA auf eine Nylonmembran übertragen. 10 µg genomische DNA (III.8.2.4.) wurden für 24 h mit Restriktionsenzymen gespalten. Die Ansätze hatten folgende Zusammensetzung: Genomische DNA: 20 µg; Restriktionsenzym: 2 µl (50 U/µl); 10 x Reaktionspuffer: 5 µl; dH2O: ad 50 µl Endvolumen;

III.Methoden 62

Für die Hydrolyse der genomischen DNA wurden dem Reaktionsgemisch zunächst 50 U des jeweiligen Restriktionsenzyms und nach Inkubation über 10 h bei 37 ºC nochmals 50 U des entsprechenden Enzyms zugesetzt. Am nächsten Tag konnten die Ansätze mit einem 0.7 %igen Agarose-Gel (III.8.3.1.) aufgetrennt werden. Zur Denaturierung wurde das Gel zuerst 15 min in 0.25 M HCl und DNA zweimal für 30 min zur Neutralisation in einer Lösung mit 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5) und 1 mM EDTA geschwenkt. Der Kapillarblot war identisch mit dem „RNA-Blot“ (III.8.4.1.), wurde allerdings mit einem Gewicht von 1000 g beschwert. Nach 16 – 18 h Transferzeit wurde die DNA durch zweistündiges Backen bei 80 ºC im Trockenschrank fixiert. 8.5. Hybridisierung von Nucleinsäuren Das Prinzip der Hybridisierung beruht auf der Paarung von einzelsträngigen, homologen Nucleinsäurebereichen und dient zur Detektion von Transkripten. Dazu wird ein DNA-Fragment eines schon bekannten Genes bzw. einer bekannten cDNA, dessen homologe Sequenz in Gesamt-RNA bzw. –DNA detektiert werden soll, markiert. Markierung von DNA-Fragmenten mit Digoxigenin DNA-Fragmente wurden mit Digoxygenin-11-Desoxyuridintriphosphat (DIG-11-dUTP) durch „Random Primed Labeling“ markiert. Die Methode beruht auf der Anlagerung einer Mischung von Hexanucleotiden an denaturierte DNA und Neusynthese des Komplementärstranges durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I unter Einbau DIG-markierter dUTPs. Dazu diente der „PCR DIG Probe Synthesis Kit“. Die Markierung von DNA-Fragmenten mit Digoxigenin erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Markierung von DNA-Fragmenten mit DIG-11-dUTP dient zum Sichtbarmachen der hybridisierenden Nukleinsäurebereiche durch die Bindung von Fab-Fragment am Digoxygenin. Das Fab-Fragment eines Anti-Digoxygenin-Antikörpers ist mit dem Enzym Alkalische Phosphatase (AP) assoziiert. Alkalische Phosphatase setzt das Substrat CDP-Star um, das zu Chemilumineszenz führt (III.5.6.2.). Hybridisierung mit DIG-11-dUTP-markierter DNA Zur Detektion auf Nylonmembran fixierter DNA oder RNA (III 8.4.) wurde eine Hybridisierung mit DIG-11-dUTP-markierter DNA durchgeführt. Die Herstellung dieser Sonden wurde unter III.8.5.1. beschrieben. Die zu hybridisierende Membran

III.Methoden 63

wurde in eine Schott-Hybridisierungsflasche gegeben und mit 10 ml Prähybridisierungslösung für 2 h bei 42 ºC im Hybridisierungsofen vorhybridisiert. Im Anschluss wurde die vorher denaturierte (5 min, 95 ºC) und auf Eis abgekühlte Hybridisierprobe zugegeben und bei gleicher Temperatur über Nacht für 16 h hybridisiert. Am nächsten Tag wurde die Membran dreimal mit Waschlösung 1 für 15 min bei RT auf einem Köttermann-Schüttler gewaschen. Für den nächsten Waschschritt wurde die Membran in die Schott-Hybridisierungsflasche überführt und dreimal mit schon vortemperierter Waschlösung 2 für 15 min bei 62 ºC im Hybridisierungsofen gewaschen. Durch die beiden Waschschritte wurden nicht gebundene, mit DIG-11-dUTP markierte DNA-Fragmente von der Membran entfernt. Anschließend wurde die Membran für 5 min in DIG-Wasch-Puffer equilibriert und für 1 h bei RT mit DIG-Blockierungs-Lösung im Hybridisierungsofen blockiert. Vor der Zugabe des Antikörpers (DIG-AP) wurde dieser kurz auf dem Vortex durchmischt und für 3 min bei 10.000 x g zentrifugiert. 1 µl des Antikörpers wurden in die DIG-Blockierungs-Lösung pipettiert und mit der Membran im Hybridisierungsofen bei RT für 30 min inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch zweimaliges Waschen (15 min bei RT) mit DIG-Wasch-Puffer auf dem Köttermann-Schüttler entfernt. Zur Detektion wurde die Membran für 5 min in DIG-Detektions-Puffer (Substratpuffer) equilibriert, auf eine Haushaltsfolie gelegt und eine 1:1.000 Mischung aus CDP-Star (Substratlösung) und DIG-Detektions-Puffer auf die Oberseite der Membran pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 5 min wurde die beidseitig mit Haushaltsfolie bedeckte Membran auf einem Röntgenfilm je nach Signalintensität für einen geeigneten Zeitraum exponiert. Prähybridisierungs,- Hybridisierungslösung: DIG Easy Hyb Puffer; Waschlösung I (geringe Stringenz): 2 x SSC-Puffer; 0.1 % (w/v) SDS-Lösung;

Waschlösung II (hohe Stringenz): 0.5 x SSC-Puffer; 0.1 % (w/v) SDS-Lösung;

DIG-Wasch-Puffer: 100 mM Maleinsäure, pH 7.5; 150 mM NaCl; 0.3 % (w/v) Tween;

DIG-Blockierungs-Lösung: 100 mM Maleinsäure, pH 7.5; 150 mM NaCl; 10 % (w/v) Blocking Reagent;

DIG-Detektions-Puffer: 100 mM Tris-HCl, pH 9.5; 100 mM NaCl;

III.Methoden 64

8.6. Herstellung und Transformation kompetenter Zellen Herstellung kompetenter Zellen Zur Transformation von Bakterien mit Plasmiden wurden kompetente Zellen mit einer Transformationseffizienz von 106–107 Kolonien/µg Plasmid benötigt. Die Herstellung dieser Zellen erfolgte nach der Rubidiumchlorid-Methode (TANG et al., 1994). Je eine Kolonie der benötigten Bakterien wurde von Agarplatten in 3 ml SOB-Medium angeimpft und unter entsprechender Antibiotika-Selektion über Nacht bei 37 ºC inkubiert. Am folgenden Tag wurden 100 ml SOB-Medium mit 1 ml der frischen Übernacht-Kultur inokuliert. Die Bakterien wurden bei erneuter Inkubation bei 37 ºC bis zu einer OD600 von 0.6 wachsen gelassen (ca. 2-4 h), danach in 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und für 15 min auf Eis gestellt. Anschließend wurden sie für 10 min zentrifugiert (3.000 x g, 4 ºC). Der Überstand wurde verworfen, jedes Pellet in 15 ml eiskaltem TfB1-Puffer resuspendiert und für 30 min auf Eis gestellt. Von diesem Zeitpunkt an durfte die Bakteriensuspension nicht über 4 ºC erwärmt werden und nur sehr vorsichtig resuspendiert werden. Nach abermaliger Zentrifugation (3.000 x g, 4 ºC) erfolgte die Aufnahme der Bakterienzellen in 4 ml TfB2-Puffer. Schließlich wurden die Zellen zu je 50 µl pro Reaktionsgefäß aliquotiert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Lagerung der kompetenten Zellen erfolgte bei –80 ºC. Transformation von kompetenten E. coli Transformation ist ein Vorgang, bei dem die Zelle DNA aus der Umgebung aufnimmt und in das Genom einbaut. Unmittelbar vor der Transformation wurden die kompetenten Zellen (III.8.6.2.) auf Eis aufgetaut. 10 µl Ligationsansatz (III.8.9.2.) wurde zu 100 µl Zellsuspension pipettiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Die Aufnahme der Plasmide erfolgte durch einen Hitzeschock bei 42 ºC für 50 sec. Die Lösungen wurden danach für 2 min auf Eis abgekühlt, mit 500 µl LB-Medium versetzt und für 1 h bei 37 ºC auf dem Thermomixer bei 450 rpm inkubiert. Ein Aliquot des Ansatzes wurde auf einer LB-Platte unter entsprechender Antibiotikum-Selektion ausplattiert. Die Kultivierung erfolgte über Nacht bei 37 ºC, bis am nächsten Tag die Transformanten sichtbar wurden.

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8.7. Polymerasekettenreaktion (PCR) Die Polymerasekettenreaktion wurde von K.B. MULLIS entwickelt (SAIKI et al.,1985; MULLIS und FALOONA, 1987). Diese Methode beruht auf der exponentiellen Vermehrung definierter DNA-Abschnitte unter Verwendung von mehr oder weniger spezifischen, komplementären Oligonucleotidprimern und thermostabilen DNA-Polymerasen. Das Verfahren besteht aus drei sich zyklisch wiederholenden Einzelschritten, Hitzedenaturierung der DNA bei 95 ºC, Anlagerung der Primer bei 40-65 ºC (Annealing) und DNA-Neusynthese bei 72 ºC. Jedes DNA-Fragment kann durch dieses Verfahren beliebig amplifiziert werden. Allgemeiner PCR-Reaktionsansatz: DNA: 10 – 100 ng; Oligodesoxynucleotid: 10 – 100 pmol; dNTP-Mix: 2 nmol; 10 x PCR-Reaktionspuffer: 2.0 µl; Taq- oder Pfu-DNA-Polymerase: 1-2 U; dH2O: ad 20 µl; Allgemeiner PCR-Reaktionszyklus: Denaturierung: 30 sec 95 °C Annealing: 30 sec – 1 min 40 – 60 °C Polymerisation: 30 sec – 5 min 72 °C Die DNA wurde zunächst 5 min bei 95 ºC denaturiert und nach Ablauf von 30 Reaktionszyklen 5 min bei 72 ºC inkubiert. Dabei fand eine vollständige DNA-Polymerisation statt. Eine Abkühlung auf 4 ºC beendete anschließend die PCR. Von den komerziell erhältlichen thermostabilen DNA-Polymerasen wurden je nach erforderlicher Genauigkeit der PCR entweder die Taq- (Thermus aquaticus) oder die Pfu- (Pyrococcus furiosus) DNA-Polymerase eingesetzt. Letztere verfügt im Gegensatz zur Taq-Polymerase über eine 3´-,5´- Exonuklease-Aktivität zur Korrektur falsch eingebauter Nucleotide. Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze, das Reaktionsvolumen und Temperaturprofil variierte und wurde bei den jeweiligen Experimenten angegeben. Die gewonnenen Lösungen konnten direkt mit Probenpuffer versetzt werden und über ein Agarose-Gel getrennt werden.

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8.8. PCR als Reihentest auf positive Transformanten Zum Test auf positive Transformanten wurde mit Primern ein Reihentest in Form einer PCR durchgeführt. Hierfür wurden Bakterienkolonien von einer Kulturplatte mittels einer Pipettenspitze in 20 µl destilliertes Wasser überführt und als Matrize für die PCR verwendet. Der Reaktionsansatz für die PCR wurde wie folgt auf Eis pipettiert: Bakteriensuspension: 10 µl; Primer for (10 pmol): 0.2 µl; Primer rev (10 pmol): 0.2 µl; 2.5 mM dNTP-Mix: 1.6 µl; 25 mM MgCl2: 1.6 µl; 10 x PCR Reaktionspuffer: 2 µl; dH2O: 4.2 µl; Taq-Polymerase: 0.2 µl; Genaue Angaben über die verwendeten Primer in den entsprechenden Reaktionsansätzen ist dem Ergebnisteil zu entnehmen. Folgendes Temperaturprofil wurde für die PCR verwendet: Denaturierung 3 min 94 °C 1 x Denaturierung 1 min 94 °C Anlagerung der Primer 45 sec 50 °C 30 x Polymerisation 45 sec 72 °C Polymerisation 5 min 72 °C 1 x 8.9. Enzymatische Modifikationen von Nucleinsäuren 8.9.1. Restriktionsanalyse Bakterielle Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die in einem doppelsträngigen DNA-Molekül meist palindrome Sequenzen aus vier bis acht Basenpaaren erkennen und diese spezifisch zwischen zwei Basen hydrolysieren. Mit ihrer Hilfe können definierte Fragmente aus DNA-Molekülen ausgeschnitten und mit bestimmten Enden versehen werden. Restriktionsenzyme werden im analytischen Bereich zur Identifizierung von DNA-Molekülen und auf präparativer Ebene zur Gewinnung spezifischer DNA-Fragmente verwendet.

III.Methoden 67

Der Standard-Restriktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung: DNA: 1-10 µg; Restriktionsenzyme: 1 U/µg DNA; 10 x Reaktionspuffer: 2 µl; dH2O: ad 20 µl Endvolumen; Ein Unit (1 U) ist definitionsgemäß diejenige Enzymmenge, die 1µg doppelsträngige DNA innerhalb von 1 h spaltet. Die Inkubation der Enzymansätze erfolgte im Temperaturoptimum (meist 37 ºC) der jeweiligen Enzyme über 2-3 h in Abhängigkeit von der eingesetzten DNA-Menge 8.9.2. Ligation Die T4-DNA-Ligase katalysiert in doppelsträngigen DNA-Molekülen die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten 5´-Phosphat- und 3´-Hydroxyenden. Der Standard-Ligationsansatz hatte folgende Zusammensetzung: Linearisierte Vektor-DNA: 10 – 20 ng; Zu ligierendes DNA-Fragment (Insert-DNA): x ng; 10 x DNA-Ligase-Puffer: 1 µl; T4-DNA-Ligase: 1 U; dH2O: ad 10 µl Endvolumen; Die Ansätze wurden 16 °C über Nacht ligiert. Die erhaltenen Plasmide wurden anschließend in kompetente Zellen transformiert (III.8.6.2.). Die genaue Zusammensetzung des jeweiligen Ligationsansatzes ist dem Ergebnisteil zu entnehmen. 8.9.3. Dephosphorylierung Um das Rezirkularisieren eines linearisierten Plasmids oder eine Multimerisisierung eines DNA-Fragments über kompatible Enden bei Ligationsreaktionen zu verhindern, wurden die 5´-Phosphatenden der DNA mit Hilfe der Alkalischen Phosphatase (AP) entfernt (SAMBROOK et al., 1989). Miteinander kompatibel sind stumpfe DNA-Enden und kohäsive Enden, deren einzelsträngige Überhänge zueinander komplementär

III.Methoden 68

sind. Der Dephosphorylierungsansatz wurde mit einem zinkhaltigen Reaktionspuffer durchgeführt und pro Picomol 5´-Phosphatenden wurden eine Einheit Enzym zugesetzt. Die Dephosphorylierung erfolgte für eine Stunde bei 37 ºC. Durch Inkubation für 15 min bei 65 ºC wurde das Enzym inaktiviert. Musste das dephosphorylierte DNA-Fragment außerdem noch aus einem Reaktionsansatz gereinigt werden, so kann die Abtrennung aller störenden Komponenten in einem Schritt durch Elution nach Agarosegel-Elektrophorese erfolgen. Bei der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Alkalischen Phosphatase handelt es sich um die sogenannte „Shrimp“ alkalische Phosphatase aus dem Organismus Pandalus borealis. 8.9.4. Reverse Transkription (RT) Die Reverse Transkription wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen durchgeführt. Zum einen wurde eine M-MLV (Moloney-Mäuseleukämievirus) Reverse Transkriptase verwendet, zum anderen ein RT-PCR Kit®. Die M-MLV Reverse Transkriptase besitzt im Gegensatz zu anderen kommerziell erhältlichen reversen Transkriptasen keine DNA-Endonukleaseaktivität und nur sehr geringe RNase H-Aktivität. Neben der gewünschten DNA-Synthese findet deshalb gleichzeitig ein mehr oder wenig starker Abbau der RNA-Matrize statt. Als Ausgangsmaterial wurde neben Gesamt-RNA auch mRNA verwendet, deren Sekundärstrukturen zuvor durch Erhitzen aufgelöst wurden. Dazu wurden die Ansätze ohne Reverse Transkriptase für 5 min bei 65 °C inkubiert und dann innerhalb von 10 min auf 37 °C abgekühlt. Nach Zugabe des Enzyms erfolgte bei 37 °C über 60 min die Transkription des jeweiligen RNA-Moleküls. Um die Reverse Transkriptase zu denaturieren, wurden die Ansätze nach Beendigung der Reaktion 5 min auf 95 °C erhitzt und anschließend bei -80 °C gelagert. Die genaue Zusammensetzung der Reaktionsansätze ist dem Ergebnisteil zu entnehmen. Die Reverse Transkription unter Verwendung des RT-PCR Kit® erfolgte nach den Angaben des Herstellers (siehe hierzu auch die Produktbeschreibung des Herstellers). Die in dem Kit verwendete M-MLV Reverse Transkriptase stellt eine RNA-abhängige DNA-Polymerase dar. Mit Hilfe eines geeigneten Primers (poly-dT Oligonucleotidprimer) synthetisierte die M-MLV Reverse Transkriptase, ausgehend von einzelsträngiger RNA, das komplementäre DNA-Fragment. Dieser Vorgang wird als Erststrang-Synthese bezeichnet. Die erhaltene Erststrang-cDNA wurde DNA als Matrize (Template) in den Polymerasekettenreaktionen verwendet.

III.Methoden 69

8.10. Amplifizierung von 5´-Enden (5´-RACE) oder 3´-Enden (3´-RACE) von cDNA-Fragmenten

Mit der Methode der RACE- (engl.: Rapid Amplification of cDNA Ends) PCR ist es möglich, die noch unbekannten 5´-Enden (5´-RACE) oder 3´-Enden (3´-RACE) von cDNA-Fragmenten zu identifizieren. Die gesamte Länge der cDNA eines unbekannten Gens kann so amplifiziert, isoliert und kloniert werden. Hierzu wurde der „SMART™ RACE cDNA Amplification Kit“ der Fa. BD Biosciences Clontech (Heidelberg) verwendet. Die Reaktionen wurden nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Bei den in der hier vorliegenden Arbeit verwendeten Reagenziensätzen wurden in zwei voneinander unabhängigen Reaktionen sowohl an das 5´- als auch an das 3´- Ende Adapter fusioniert. Dadurch konnte der 5´- Bereich bzw. 3´- Bereich des Gens amplifiziert werden. Die Erststrang-Synthese der cDNA wurde aus Gesamt-RNA durchgeführt, die nach der LiCl-Methode (III.8.2.1.) gereinigt wurde. 9. Sequenzierung von DNA Die Sequenzierung von DNA führte Frau Susanne Michel im Rahmen des SFB 567 „Mechanismen der interspezifischen Aktion von Organismen“ durch. Zur Ermittlung der Sequenzen wurde die Kettenabbruchmethode, auch als Sanger-Coulson-Methode bekannt, verwendet. Dabei kam der LI-COR DNA-Sequencer 4200 (LI-COR Biosciences, Bad Homburg) unter Verwendung des „Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP“ (Amersham Biosciences, Freiburg) zum Einsatz. Die Sequenzierungen wurden mittels Software des Herstellers LI-COR (Base Imagir 4.0) ausgewertet. Zum Vergleich der ermittelten DNA-Sequenzen mit bereits bekannten wurde der BLAST-Algorithmus (ALTSCHUL et al., 1990) vom NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/-BLAST/) verwendet. 10. Computeranalysen und Datenbankvergleiche Für statistische Berechnungen wurde das Programm Microcal Origin, Version 3.5 von Microcal Software (Northampton, USA) verwendet. DNA- und Proteinsequenzvergleiche wurden mit den verfügbaren Sequenzen in der SwissProt und EMBL Datenbank unter Verwendung der Sequenzanalyse Programme BLAST und FASTA durchgeführt. Entwürfe von Primern für die RACE-PCR und Vektorkarten wurde mit dem Computerprogramm Vector NTI Suite von Invitrogen (Karlsruhe) erstellt.

IV. Ergebnisse 70

IV. Ergebnisse 1. Reinigung der Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase, MJE) Der Biosyntheseweg von Jasmonsäure wurde in wesentlichen Teilen von VICK und ZIMMERMAN (1978, 1984) in den Jahren von 1978 bis 1984 aufgeklärt. Sie konnten ausgehend von α-Linolensäure alle Zwischenstufen der Jasmonat-Synthese bis auf das chemisch instabile Allenoxid identifizieren. HAMBERG und BRASH (1987) gelang der Nachweis des Allenoxids als Intermediat der Jasmonat-Kaskade. Die an der Bildung der Jasmonsäure (JA) beteiligten Enzyme sind, abgesehen von den Lipasen, die α-Linolensäure bereitstellen und den Enzymen, welche die drei Runden β-Oxidation katalysieren, soweit bekannt. Jasmonsäure ist nicht die Endstufe des Biosyntheseweges, sondern es können weitere metabolische Schritte, wie Hydroxylierung, Glucosylierung, Konjugation mit Aminosäuren und Veresterung erfolgen. Inwieweit diese Schritte eine Bedeutung bei der Inaktivierung von Jasmonsäure haben ist noch weitgehend unbekannt. Für Methyljasmonat ist hingegen eine Rolle als Signalstoff nachgewiesen (CHEONG und CHOI, 2003). SEO et al. (SEO et al., 2001) konnten das Enzym rekombinant überexprimieren, das die Bildung von Methyljasmonat (MeJA) und S-Adenosylhomocystein durch Übertragung einer Methylgruppe von S-Adenosylmethionin auf Jasmonsäure katalysiert. Für die Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT) konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression der JMT in Arabidopsis thaliana eine dreifache Erhöhung des Methyljasmonat-Spiegels zur Folge hatte. Desweiteren wiesen die Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegenüber dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea auf, obwohl die JA-Konzentrationen nicht höher waren als im Wildtyp. Diese Experimente werfen die Frage nach der möglichen Signalfunktion von MeJA auf. Unklar bis zum jetzigen Zeitpunkt ist, ob MeJA oder JA oder beide Verbindungen primär biologisch aktiv sind, da beide Verbindungen rasch durch die JMT und eine noch unbekannte Esterase ineinander umgewandelt werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit sollte es nun sein, das Enzym, im nachfolgenden als Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase, MJE) bezeichnet, das MeJA zu JA hydrolysiert aus einer pflanzlichen Zellsuspensionskultur zu reinigen. Ausgehend von der Aminosäuresequenz der nativen MeJA-Esterase sollte das zugehörige Gen identifiziert werden und zur Klonierung der MeJA-Esterase verwendet werden. Hierdurch sollte eine Protein-Überexpression der MeJA-Esterase möglich werden, um eine biochemische Charakterisierung durchführen zu können.

IV. Ergebnisse 71

1.1. Synthese von racemischem [Methyl-3H]Methyljasmonat ([Methyl-3H]MeJA)

[Methyl-3H]Methyljasmonat ([Methyl-3H]MeJA) wurde als Substrat für den spezifischen und empfindlichen Nachweis der Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase) synthetisiert. Hierfür wurde Jasmonsäure (JA) mittels [Methyl-3H]Methyljodid zu Methyljasmonat (MeJA) umgesetzt (vgl. III.1.1.). Um während der Reaktion den quantitativen Umsatz von [Methyl-3H]Methyljodid zu gewährleisten und die radioaktive Ausgangssubstanz sparsam einsetzen zu können, wurde Jasmonsäure (JA) im Überschuß zugesetzt. Da eine anfängliche Ausbeute von 19.9 % niedrig erschien, wurde die Synthesevorschrift (vgl. III.1.1.) variiert (siehe Tab. IV.1.). Komponenten Ansatz 1 Ansatz 2 Ansatz 3 Ansatz 4 Jasmonsäure [µg] 500 500 500 500 [Methyl-3H]Methyljodid [mCi] 1 1 1 1 K2CO3 [mg] 1 1 - 1 AgNO3 [mg] - 1 2 - Ethylacetat [µl] 100 100 100 - Tetrahydrofuran [µl] - - - 100 Ausbeute [%] 19.9 17.8 0 18.7 Tab IV.1.: Variation der Synthesevorschrift für [Methyl-3H]Methyljasmonat, zur Steigerung der Ausbeute. Ansätze

1-4 unterschieden sich in ihrer Zusammensetzung an K2CO3, AgNO3, Ethylacetat und Tetrahydrofuran,

während die Mengen an Jasmonsäure und [Methyl-3H]Methyljodid konstant gehalten wurden.

Dabei zeigte sich, dass eine Variation der Synthesevorschrift (Ansätze 2-3) keine Erhöhung der Ausbeute brachte. Nachdem die Durchführung der Synthese erfolgreich war, musste anschließend die im Reaktionsansatz enthaltene Jasmonsäure entfernt werden, damit sie keinen hemmenden Einfluß auf die Enzymaktivität haben konnte. Ziel war es [Methyl-3H]MeJA in chemisch reiner Form vorliegen zu haben. Dies erfolgte durch Aufreinigung des Reaktionsansatzes über Aminopropyl-Festphasenextraktion (NH2-SPE) wie unter III.2.2.1. beschrieben. Da ein Ester von einer organischen Säure abgetrennt werden sollte, wurde als Extraktionsmechanismus das starke Anionenaustausch-Prinzip verwendet. Das Silicagel in der Säule trug dabei kovalent gebundene Aminopropylreste. Die Auftrennung von MeJA und JA wurde dadurch möglich, dass zwischen MeJA als Methylester und den Aminopropylgruppen keine Ionenpaare ausgebildet wurden.

IV. Ergebnisse 72

MeJA wurde von der Säule eluiert, während JA durch die Ausbildung von Ionenpaaren zwischen der Säure- und der Aminopropylgruppe zurückgehalten wurde. JA ließ sich als freie organische Säure durch ein 2 %iges Diethylether/Essigsäure-Gemisch (2:98, v/v) von den Aminopropylgruppen verdrängen. Die NH2-SPE-Säulen konnten nicht sofort wieder verwendet werden, sondern mussten wie unter III.2.2.1. beschrieben regeneriert werden. Die Elution des [Methyl-3H]MeJA von der NH2-SPE-Säule erfolgte durch 1 ml Diethylether, der in fünf 200 µl Fraktionen in HPLC-Vials aufgefangen wurde. Das Eluat (200 µl Diethylether) wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen bis der Diethylether abgedampft war. Da MeJA flüchtig ist, wurden die Proben danach sofort in 100 µl Methanol aufgenommen. Die Verluste an [Methyl-3H]MeJA betrugen 10 %. Um die radiochemische Reinheit und Identität Produktes zu prüfen, wurde [Methyl-3H]MeJA in den Fraktionen mit einem Dünnschicht-Scanner analysiert. Der Tritium-markierten Probe wurde vor der dünnschichtchromatographischen Auftrennung [2-14C]JA und Methyl-[2-14C]JA zugesetzt. Anhand des Rf-Wertes von Methyl-[2-14C]JA wurde [Methyl-3H]MeJA identifiziert. Die Radioaktivitätsverteilung von [Methyl-3H]MeJA auf der DC-Platte ermöglichte es eine Aussage über die Reinheit der synthetisierten Verbindung zu machen. Abbildung IV.1. zeigt die radiochemische Reinheit des [Methyl-3H]MeJA. Abb IV.1.: Radio-Dünnschichtchromatogramm zum Nachweis der Identität und Reinheit des synthetisierten

[Methyl-3H]Methyljasmonats. Methyl-[2-14C]JA (Rf-Wert=0.53) und [2-14C]JA (Rf-Wert=0.27) wurden

dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Anhand des übereinstimmenden Rf-Wertes mit Methyl-[2-14C]JA (Rf-Wert=0.39) wurde [Methyl-3H]MeJA (Rf-Wert=0.53) identifiziert. Die

Radioaktivitätsverteilung auf dem Dünnschichtchromatogramm ermöglichte es, eine Aussage über die

radiochemische Reinheit zu machen.

IV. Ergebnisse 73

Methyl-[2-14C]JA wurde als Referenzsubstanz zur Detektion von [Methyl-3H]MeJA verwendet. Methyl-[2-14C]JA (Rf-Wert=0.53) zeigte gleiches Laufverhalten und übereinstimmende Rf-Werte mit [Methyl-3H]MeJA (Rf-Wert=0.53). [Methyl-3H]MeJA konnte als alleiniges Produkt der Synthese identifiziert werden. Der Anteil an Radioaktivität in der Peakfläche wurde in Beziehung zu der Gesamtaktivität auf der DC-Platte gesetzt. Dabei stellte sich heraus, dass [Methyl-3H]MeJA über 80 % der Gesamtaktivität ausmachte. Verunreinigungen < 20 %, die über die gesamte Laufstrecke streuten, wurden detektiert, konnten jedoch nicht näher spezifiziert werden. Für die spätere Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität wurde kein [Methyl-3H]MeJA eingesetzt dessen Grad an Verunreinigungen 15 % überstieg. 1.2. Entwicklung von Methoden zur Messung der Methyljasmonat-

Esterase(MeJA-Esterase) Aktivität Vorraussetzung für den erfolgreichen Nachweis, die Reinigung und Charakterisierung einer unbekannten Enzymaktivität ist die Verfügbarkeit von präzisen, reproduzierbaren und genügend empfindlichen Testmethoden. Bisher gab es keine experimentellen Hinweise für eine Hydrolyse von Methyljasmonat zu Jasmonsäure, so dass erst ein geeignetes Testsystem zum Nachweis der Enzymaktivität entwickelt wurde. 1.2.1. Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit Methyl-[2-14C]jasmonat

(Methyl-[2-14C]JA) Der direkte Weg zur Bestimmung einer Enzymaktivität ist die unmittelbare Erfassung des interessierenden Reaktionsproduktes. MeJA, an C-2 mit [14C] markiert, wurde für den direkten Nachweis des entstehenden Produktes als Substrat eingesetzt.

IV. Ergebnisse 74

Abb. IV.2.: Prinzip des Testsystems zur Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit Methyl-[2-14C]JA. Methyl-[2-

14C]JA sollte durch die MeJA-Esterase in [2-14C]JA und Methanol gespalten werden. Die Menge an

gebildeter [2-14C]JA konnte mit einem Radio-Dünnschichtscanner quantifiziert werden.

Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität der MeJA-Esterase wurde folgender Testansatz verwendet:

Stocklösung Probenvolumen 73 µCi Methyl-[2-14C]JA (0.77 µCi/µmol) 3 µl 1 M KPi-Puffer, pH 7.5 50 µl Enzymprobe (0.05-2.0 µg/µl Protein) 10-50 µl H2O ad 200 µl Gesamtvolumen 200 µl

Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 37 ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 µl Eisessig und 400 µl Ethylacetat beendet. Das Reaktionsgemisch wurde für 10 min im Überkopfschüttler durchmischt und für 1 min (10.000 x g, RT) zum Trennen der Phasen zentrifugiert. Die organische Phase (300 µl) wurde abgenommen und in einer Vakuumzentrifuge zur Trockne eingeengt. Der Rückstand, der nicht umgesetztes Substrat sowie gebildete Produkte enthielt, wurde in 30 µl Methanol aufgenommen. Ein Aliquot des Testansatzes wurde auf eine DC-Platte aufgetragen. Eine dünnschichtchromatographische Auftrennung der radioaktiv markierten Jasmonate erfolgte zusammen mit unmarkierten Referenzsubstanzen (vgl. III.2.1.) Die Detektion der Referenzsubstanzen erfolgte in einer Iodkammer (vgl.III.2.1.), während die radioaktiv markierten Verbindungen mit einem Radio-Dünnschichtscanner (vgl. III.4.) nachgewiesen wurden (Abb. IV.3.). Die untenstehende Abb. IV.3. zeigt den Umsatz von Methyl-[2-14C]JA zu [2-14C]JA durch die MeJA-Esterase in einem Ethylacetatextrakt von Lycopersicon esculentum-Zellen.

IV. Ergebnisse 75

Abb. IV.3.: Radio-Dünnschichtchromatogramm des Ethylacetatextraktes der L. esculentum-Zellen nach

30minütiger Inkubation mit Methyl-[2-14C]JA: Die Peaks zeigen die Radioaktivitätsverteilung von

Substrat und Produkt der MeJA-Esterase. Anhand der Rf-Werte von unmarkiertem JA und MeJA

ließ sich [2-14C]JA als Reaktionsprodukt der MeJA-Esterase mittels Radio-

Dünnschichtchromatogramm bestimmen.

Das entwickelte Testsystem für den gleichzeitigen Nachweis von Methyl-[2-14C]JA neben [2-14C]JA wurde alleine für den qualitativen Nachweis und die Identifizierung des Reaktionsproduktes verwendet. Hauptproblem bei dem Testsystem war die starke Flüchtigkeit von Methyl-[2-14C]JA. Während der Probenaufarbeitung ging Methyl-[2-14C]JA leicht verloren und machte die Quantifizierung des Umsatzes problematisch. Darüberhinaus war der zeitliche Aufwand zu groß, um den Test routinemäßig nach säulenchromatographischer Auftrennung der Proteine für eine größere Anzahl von Proben einzusetzen.

IV. Ergebnisse 76

1.2.2. Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit [Methyl-3H]Methyljasmonat ([Methyl-3H]MeJA)

Nachdem der Nachweis erbracht werden konnte, dass eine Enzympräparation von Lycopersicon esculentum in der Lage war Methyl-[2-14C]JA zu [2-14C]JA umzusetzen, galt es nun einen schnelleren Test zu entwickeln. Denn die MeJA-Esterase sollte säulenchromatographisch aufgetrennt werden und hierzu mußte ein großes Kollektiv an Proben getestet werden. In einer Synthese gelang die radioaktive Markierung von JA (vgl. III.2.1.) durch Methylierung mit [Methyl-3H]Methyljodid. Das synthetisierte [Methyl-3H]MeJA konnte in einem schnelleren Testsystem eingesetzt werden als Methyl-[2-14C]JA (vgl. IV.1.2.1.). Die MeJA-Esterase katalysierte die Bildung von JA und [Methyl-3H]MeOH. Letzteres konnte leicht von JA und MeJA abgetrennt und mittels Szintillationszähler (vgl. III.4.) bestimmt werden. Hierzu wurde der Inkubationsansatz auf eine endcapped Octadecyl-(C18 ec)-Festphasenextraktionsäule aufgegeben (vgl. III.2.2.2.). Mit einem Methanol/Wasser-Gemisch (1:9, v/v) konnte [Methyl-3H]MeOH selektiv eluiert werden, während die Jasmonate von dem Octadecyl-(C18 ec)-Festphasenmaterial zurückgehalten wurden (vgl. III.2.2.2.).

Abb. IV.4.: Prinzip des Testsystems zur Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit [Methyl-3H]Methyljasmonat.

[Methyl-3H]Methyljasmonat sollte durch die MeJA-Esterase in Jasmonsäure und [Methyl-3H]Methanol

gespalten werden. Die Menge an gebildetem [Methyl-3H]Methanol wurde nach Abtrennung aus dem

Reaktionsansatz über Festphasenextraktion im Szintillationszähler quantifiziert. Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität der MeJA-Esterase wurde folgender Testansatz verwendet:

Stocklösung Probenvolumen 1 mM MeJA 5 µl 110 µCi [Methyl-3H]MeJA (9.09 µCi/mmol) 2 µl Enzymprobe (0.05-2.0 µg/µl Protein) 23 µl Gesamtvolumen 30 µl

IV. Ergebnisse 77

In Kontrollansätzen wurde die Enzymprobe durch hitzedenaturiertes (100 ºC) Protein ersetzt. Die Inkubationszeit für den Enzymtest lag je nach Proteinkonzentration zwischen 5 und 60 min. Gestoppt wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 µl Eisessig zum Enzymtest. Zur Vorbereitung für die Festphasenextraktion wurden dem Enzymansatz 100 µl eines Methanol/Wasser-Gemisches (3:7, v/v) zugesetzt. Als Festphasenextraktionsmaterial wurde C18 ec-Material ausgewählt (vgl. III.2.2.2.). C18 ec-SPE-Säulen wurden vor der Aufgabe der Probe mit Methanol und anschließend mit einem Methanol/Wasser-Gemisch (1:9, v/v) equilibriert. Der gesamte Enzymansatz wurde auf die Säule aufgegeben. [Methyl-3H]Methanol wechselwirkte nicht mit dem C18 ec-Material und wurde mit Methanol/Wasser-Gemisch (1:9, v/v) von der Säule eluiert. Die Lipide MeJA und JA wurden aufgrund von Van-der-Waals-Wechselwirkungen vom Säulenmaterial reteniert. JA konnte mit einem Methanol/Wasser-Gemisch (1:1, v/v) eluiert werden, während das lipophilere MeJA erst mit reinem Methanol vom C18 ec-Material eluiert wurde. [Methyl-3H]Methanol wurde direkt in Szintillationsgläschen mit Szintillationscocktail aufgefangen und die Radioaktivität mittels Szintillationsmessung bestimmt (vgl. III.4.). Wegen der während der Synthese entstandenen Verunreinigungen konnte auch in Ansätzen ohne Enzymaktivität Radioaktivität detektiert werden. Die Radioaktivität in Kontrollansätzen mit denaturiertem Protein wurde bei der Auswertung der Messdaten berücksichtigt. Der Vorteil des Testverfahrens mit [Methyl-3H]MeJA gegenüber der dünnschichtchromatographischen Auftrennung von Methyl-[2-14C]JA neben [2-14C]JA lag in der Schnelligkeit der Analyse in Verbindung mit ausreichender Empfindlichkeit. Alle nachfolgenden Bestimmungen der spezifischen Enzymaktivität wurden mit diesem Standardenzymtest durchgeführt, soweit es in den entsprechenden Ergebnisteilen nicht anders vermerkt wurde. 1.2.3. Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit p-Nitrophenylacetat Zum Nachweis von unspezifischer, hydrolytischer Enzymaktivität wurde das chromogene Substrat p-Nitrophenylacetat eingesetzt. p-Nitrophenylacetat wird durch viele Esterasen rasch zu p-Nitrophenol und Essigsäure hydrolysiert. Die Produktbildung von p-Nitrophenol kann photometrisch bei 405 nm nachgewiesen werden.

IV. Ergebnisse 78

Abb. IV.5.: Gezeigt wird das Prinzip des Testsystems zur Bestimmung der unspezifischer Esteraseaktivität mittels

p-Nitrophenylacetat. Das chromogene Substrat p-Nitrophenylacetat wurde im Enzymtest zu p-

Nitrophenol und Essigsäure umgesetzt. Gebildetes p-Nitrophenol konnte photometrisch bei 405 nm

vermessen werden. Zur Bestimmung unspezifischer Esteraseaktivität wurde folgender Testansatz verwendet:

Stocklösung Probenvolumen 10 mM Nitrophenylacetat 10 µl 1 M KPi-Puffer pH 7.5 20 µl Enzymprobe (0.05-2.0 µg/µl Protein) 10-50 µl H2O ad 100 µl Gesamtvolumen 100 µl

Entsprechend dem Reinigungsgrad und der Konzentration der Enzympräparation wurden die Testansätze für 1–15 min bei RT in Mikrotiterplatten inkubiert. Kontrollansätze wurden mit Wasser statt mit Enzymlösung versehen. Eine Gelbfärbung in einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatte zeigte unspezifische Esteraseaktivität an. Während der Proteinreinigung wurde die Freisetzung von Nitrophenol als qualitativer Schnelltest eingesetzt, wenn es galt die Esteraseaktivität in fraktioniert aufgefangenen Säuleneluaten zu lokalisieren und einzugrenzen. Dadurch konnte die Zahl der Fraktionen die mit [Methyl-3H]MeJA im Standardtest untersucht wurden, minimiert werden und die radioaktiv markierte Substanz sparsam eingesetzt werden.

IV. Ergebnisse 79

1.3. MeJA-Esterase Aktivität in verschiedenen Zellsuspensionskulturen Verschiedene Zellsuspensionskulturen wurden getestet, um eine Aussage über eine Verbreitung der MeJA-Esterase in höheren Pflanzen machen zu können. Darüber hinaus war es für die Proteinreinigung wichtig eine geeignete Quelle für die Gewinnung des Enzyms zu finden. Dazu wurden je 5 g tiefgefrorenes Gewebe von 7 Tage alte Kulturen in 10 ml 50 mM KPi-Puffer (pH 7.5, 20 mM EtSH) aufgeschlossen (vgl. III.6.2.1.). Zum einen wurde der gewonnene Rohextrakt selbst zur Bestimmung der Enzymaktivität eingesetzt. Zum anderen wurde in einem weiteren Schritt ein Aliquot des Rohextraktes auf eine Gelfiltrationssäule (PD-10 Säule) aufgetragen (vgl. III.6.1.1.), um störende niedermolekulare Substanzen abzutrennen. Durch diesen ersten Anreicherungsschritt sollte sich die Enzymaktivität erhöhen und sich besser detektieren lassen. Die Erfassung der Enzymaktivität erfolgte in beiden Fällen im Standardtest (vgl. IV.1.2.2.).

Abb. IV.6.: Spezifische Enzymaktivität der MeJA-Esterase (Enzymaktivität/ mg Gesamtprotein) in

verschiedenen pflanzlichen Zellsuspensionskulturen. Getestet wurden sowohl Rohextrakte als

auch über PD-10 Säulen angereicherte Extrakte.

IV. Ergebnisse 80

Die Enzymaktivität der MeJA-Esterase fand sich in den Rohextrakten und PD-10 Eluaten aller untersuchten Kulturen wieder. Die spezifische Aktivität der einzelnen Kulturen lag für die Rohextrakte zwischen 0.23 pkat/mg (Thalictrum tuberosum) und 3.44 pkat/mg (Papaver somniferum), während sie für die Eluate der Gelfiltrationssäule zwischen 0.21 pkat/mg (Thalictrum tuberosum) und 5.67 pkat/mg (Petroselinum crispum) lag. Bis auf die Kulturen von Thalictrum tuberosum, Gypsophila arabia, Galium molugo und Nicotiana tabacum war die Enzymaktivität wie erwartet nach der Anreicherung über die PD-10 Säule erhöht gegenüber dem Rohextrakt. Eine der zuvor auf spezifische Aktivität getesteten Zellsuspensionskulturen sollte für die anschließende Proteinreinigung ausgewählt werden. Eine Arabidopsis-Zellkultur wäre als Ausgangsmaterial für die Proteinreinigung besonders geeignet gewesen, da eine spätere Klonierung der MeJA-Esterase aufgrund des bekannten Genoms von Arabidopsis leichter hätte durchgeführt werden können. Da eine Arabidopsis-Zellkultur nicht zur Verfügung stande, wurde Lycopersicon esculentum ausgewählt. Die spezifische Enzymaktivität in Rohextrakten von L. esculentum Zellkulturen war mit 1.77 pkat/mg nicht die höchste der Testreihe. Jedoch ist die Sequenzierung des Tomatengenoms als Modellpflanze für Fruchtentwicklung weit fortgeschritten (MOORE et al., 2002) und könnte die Klonierung der MeJA-Esterase vereinfachen. Bei dem Tomaten-Genomprojekt handelt es sich nicht um eine Bestimmung der Totalsequenz des Genoms, sondern um eine Sequenzierung der sogenannten ESTs („Expressed Sequence Tags“) (RAFALSKI et al., 1998). Bei ESTs handelt es sich um sehr kurze cDNA-Abschnitte, wovon nach dem Stand vom April 2003 155317 ESTs bekannt sind (www.tigr.org/tdb.tgi.lgi/release_notes.html). Mit Hilfe von ESTs kann jedes einzelne Gen im Genom identifiziert werden. Darüber hinaus ermöglichen sie die Kartierung von Genen auf Chromosomen (Bestimmung ihrer Position auf dem Chromosom) sowie die Isolierung vollständiger cDNA-Klone (VAN DER HOEVEN et al., 2002). Nach erfolgter Reinigung der MeJA-Esterase und Sequenzierung von Peptidfragmenten könnte mittels Datenbanksuche wie z. B. im „TIGR tomato gene index“ (www.tigr.org/tdb.tgi.lgi) der cDNA-Klon für die MeJA-Esterase herausgesucht werden. Die Klonierung (vgl. IV.2.) würde hierdurch stark vereinfacht werden und es wäre somit möglich direkt für 5´-und 3´-Ende des Gens spezifische Primer zu entwickeln und nicht den Weg über die Erzeugung degenerierter Primer gehen zu müssen.

IV. Ergebnisse 81

1.4. Kinetische Untersuchungen zur MeJA-Esterase Aktivität in Lycopersicon esculentum-Zellkulturen

Nachdem L. esculentum als Zellkultur für die Proteinreinigung ausgewählt worden war, galt es nun den richtigen Zeitpunkt der Ernte festzulegen, da der Enzymgehalt sich möglicherweise mit der Entwicklung und dem Alter der Kultur ändert. Um die Enzymaktivität der MeJA-Esterase über einen Zeitraum von neun Tagen in L. esculentum-Zellkultur zu verfolgen, wurden neun 1-Liter Erlenmeyerkolben mit genau gleichen Mengen Gewebe inokuliert. Über einen Zeitraum von neun Tagen wurde täglich ein Kolben entnommen und das Zellmaterial durch Vakuumfiltration vom Medium getrennt. Nach der Gewinnung des Rohextraktes (vgl. III.6.2.1.) wurde die gewonnene Enzympräparation im Standard-Enzymtest (vgl. IV.1.2.2.) vermessen. Desweiteren wurde der Verlauf der Frischgewicht- und Trockengewichtzunahme registriert. Die Bestimmung des Trockengewichtes erfolgte aus einem Aliquot der geernteten Zellen, das mehrere Tage bei 50 °C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wurde. Abb IV.7. zeigt die Enzymaktivität der MeJA-Esterase aus L. esculentum über eine Kultivierungsdauer von neun Tagen.

Abb. IV.7.: Enzymaktivität der MeJA-Esterase aus L. esculentum über eine Kultivierungsdauer von neun

Tagen. Die höchste MeJA-Esterase Aktivtät wurde am 8. Tag nach der Subkultivierung

gefunden, so dass die Zellkultur für die nachfolgende Reinigung am 8. Tag geerntet wurde.

IV. Ergebnisse 82

Die höchste MeJA-Esterase Aktivität (bezogen auf das Trockengewicht) lag innerhalb der Wachstumsphase der Zellkultur am 8. Tag. Für die nachfolgende Reinigung der MeJA-Esterase wurden die Zellkulturen somit am 8.Tag nach der Subkultivierung geerntet. 1.5. Reinigung der MeJA-Esterase 1.5.1. Herstellung eines Rohextraktes und fraktionierte Ammoniumsulfat-

fällung Die Gewinnung des Enzymrohextraktes erfolgte nach 8-tägiger Kultivierungsdauer aus L. esculentum-Zellkulturen wie unter III.6.2.1. beschrieben. Zellkulturmaterial (500 g) wurden mit 1000 ml Aufschlusspuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH; 10 mM Ascorbinsäure; 1.5 % PVPP) versetzt und unter Rühren aufgetaut. Danach wurde der Zellbrei durch 4-lagigen Mull gepresst, und das Filtrat 20 min bei 12.000 x g abzentrifugiert. Der anfänglich klare, olivgrüne Rohextrakt verfärbte sich zunehmend dunkelbraun und trübte ein, falls er nicht zügig weiterverarbeitet wurde. Durch den mechanischen Aufschluss des Gewebes wurden bei der Herstellung des Rohextraktes vermutlich Phenoloxidasen freigesetzt. Phenoloxidasen können in intakten Pflanzenzellen cytosolisch oder membrangebunden vorliegen. Durch die Zerstörung der Pflanzenzellen wurde die Kompartimentierung innerhalb der Pflanzenzelle aufgehoben, so dass Phenoloxidasen mit ihren Substraten, den Catecholen, in Kontakt kommen konnten. Hierdurch können farblose Catechole zu gelb gefärbten ortho-Quinonen umgesetzt (GERDEMANN et al., 2002) werden. Ortho-Quinone wiederum können unter dem Einfluss von Luftsauerstoff zu braunschwarz gefärbten Melaninen polymerisieren oder mit Amino- und SH-Gruppen von Proteinen reagieren (WANG und MELLENTHIN, 1973). Letztere Reaktion könnte zur Inaktivierung des gesuchten Proteins führen und sollte deshalb unterbunden werden. Hierzu sollten die Reaktionsprodukte aus dem Rohextrakt entfernt werden. Um Phenole zu entfernen, wurde der Rohextrakt auf eine XAD-4-Säule aufgetragen. XAD-4-Material ist ein Adsorbens für phenolische Strukturen (KU und LEE, 2000). Proteine werden von dem hydrophoben Material nicht gebunden. Allerdings gelang es nicht die Polyphenole mittels XAD-4-Material zu entfernen und der Rohextrakt blieb weiterhin braun gefärbt. Eine weitere Möglichkeit den Rohextrakt zu klären bestand darin, PVPP und Ascorbinsäure zu zusetzen (WANG und MELLENTHIN, 1974). PVPP bindet Polyphenole, während Ascorbinsäure antioxidative Wirkung besitzt. Sowohl PVPP

IV. Ergebnisse 83

als auch Ascorbinsäure konnten die Oxidation der Polyphenole durch Phenoloxidasen nicht vollständig hemmen. Normalerweise werden dem Rohextrakt zu Beginn einer Proteinreinigung Proteinaseinhibitoren zugesetzt. Im Falle der MeJA-Esterase unterblieb dieser Zusatz, da hierdurch die MeJA-Esterase gehemmt wurde, wie nachfolgende Versuche mit Inhibitoren zeigten. Viele Esterasen werden beispielsweise durch Serinproteinaseinhibitoren irreversibel gehemmt. Serinproteasen binden dabei kovalent an Aminosäuren der katalytischen Triade und beeinflussen die katalytische Aktivität der Enzyme. Eine Bestimmung der spezifischen Aktivität der MeJA-Esterase während der Proteinreinigung wäre dann nicht mehr möglich gewesen. Die Herstellung des Rohextraktes erfolgte wie unter III.6.2. beschrieben. Aus 500 g aufgeschlossenem Zellkulturmaterial von L. esculentum wurden ca. 1500 ml Rohextrakt mit einer durchschnittlichen Proteinkonzentration von 1.67 mg/ml gewonnen. Die spezifische Aktivität betrug 1.77 pkat/mg, woraus sich eine Gesamtaktivität von 4430 pkat ergab. Im nächsten Aufreinigungsschritt wurde der eisgekühlte Rohextrakt zur Aufkonzentrierung des löslichen Proteins und zur Abtrennung molekularer Störsubstanzen einer Ammoniumsulfatfällung unterzogen. Dabei wurde das pulverisierte Salz dem Rohextrakt bis zur 30 %igen Sättigungskonzentration portionsweise unter Rühren zugegeben. Nach 10 min wurde ausgefälltes Protein bei 12.000 x g abzentrifugiert. Das Pellet konnte verworfen werden, denn es enthielt keine MeJA-Esterase Aktivität. Der Überstand dieses Zentrifugationsschrittes wurde einer weiteren Ammoniumsulfatfällung (30-70 %) unterzogen, und nach weiteren 20 min Rühren wurde das ausgefällte Protein für 20 min bei 12.000 x g zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets wurden vollständig vom Überstand befreit und in einem minimalen Volumen an 50 mM KPi-Puffer (pH 7.5, 20 mM EtSH) resuspendiert. Zur Abtrennung niedermolekularer Bestandteile und zur Entfernung des Ammoniumsulfats wurde die Proteinlösung auf mehrere Gelfiltrationssäulen (PD-10 Säulen) (vgl. III.6.1.1.) aufgetragen, so dass das Volumen der Lösung 90 ml betrug (entsprechend 8.8 mg Protein pro ml). Mit der fraktionierten Ammoniumsulfatfällung wurde eine Anreicherung der spezifischen Aktivität des gesuchten Enzyms um den Faktor 2.1 gegenüber dem Rohextrakt erzielt.

IV. Ergebnisse 84

1.5.2. Ionenaustausch-Chromatographie an Q-Sepharose „Fast Flow“ (2.6 cm x 20 cm)

Eine überwiegende Anzahl von Proteinen besitzt bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8 eine negative Gesamtladung und lässt sich unter diesen Bedingungen an Anionenaustauschermaterial adsorbieren (MURRAY, 1990). Der erste Reinigungsschritt der Polyneuridinaldehydesterase, einer pflanzlichen Esterase erfolgte ebenfalls über einen Anionenaustauscher (Dogru et al., 2000). Deshalb wurde als erster säulenchromatographischer Reinigungsschritt eine Trennung an einem Anionenaustauscher durchgeführt. Hierfür erwies sich Q-Sepharose „Fast Flow“ als geeignetes Material. Ionenaustauscher haben darüberhinaus den Vorteil, dass sich die zu Beginn eines Reinigungsverfahrens anfallenden Proteinmengen aufgrund hoher Bindungskapazität des Materials und hoher Flussraten ohne Probleme bearbeiten lassen. Die Proteinlösung (1500 ml) wurde bei einer Flussrate von 5 ml/min aufgetragen (Säulen-Maße 2.6 cm x 20 cm), nicht gebundenes Protein anschließend mit Startpuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH) ausgewaschen. Die Auftrennung gebundener Proteine erfolgte mit einem linearen KCl-Gradienten (0-1 M) in Startpuffer. Proben wurden in 10 ml Fraktionen gesammelt. Jede Fraktion wurde mit dem radioaktiven Standardtest (vgl. IV.1.2.2.) und mit Nitrophenylacetat (vgl. IV.1.2.3), das photometrisch bei 405 nm vermessen wurde, auf Aktivität überprüft. MeJA-Esterase Aktivität fiel für beide getesteten Substrate in einem Proteinpeak an und war in den Fraktionen zwischen 0 mM und 500 mM KCl detektierbar, wobei das Maximum bei 350 mM lag. Vereinigte Fraktionen hatten ein Volumen von 24 ml mit einer spezifischen MeJA-Esterase Aktivität von 8.39 pkat/mg bei 255 mg Gesamtprotein. Hier lag die Ausbeute bei 48.3 % gegenüber dem Rohextrakt, der Anreicherungsfaktor lag bei 4.7. Alle aktiven Fraktionen wurden vereinigt, mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 20 kDa (Centricon® Plus 20 Zentrifugen-Filtereinheiten) eingeengt und gegen den Startpuffer für die folgende Gelfiltrationssäule umgepuffert.

IV. Ergebnisse 85

Abb. IV.8.: Auftrennung eines konzentrierten Proteinextraktes (70 %ige Sättigung mit Ammoniumsulfat) aus L.

esculentum Zellsuspensionskultur (Volumen: 90 ml, Proteinmenge: 8.8 mg/ml) an Q-Sepharose

„Fast Flow“ Chromatographiematerial. Säulenabmessungen: 2.6 x 6 cm. Flussrate: 5 ml/min.

Elution: KCl-Gradient von 0-1 M in Startpuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH). Die

Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität erfolgte mit dem Standardtest (vgl. IV.1.1.2.). Der Balken

kennzeichnet den Bereich der Fraktionen, die vereinigt, mittels Filtration durch Membranen mit einer

Ausschlussgrenze von 20 kDa eingeengt und für die weitere Reinigung verwendet wurden.

1.5.3. Größenausschluss-Chromatographie an HiLoad Superdex 200 (1.6 cm x

60 cm) Größenausschluss-Chromatographie erlaubt eine Trennung der Proteine nach ihrer Größe. Da in der Regel keine direkten Wechselwirkungen zwischen Gelmaterial und Proteinen auftreten, können hohe Ausbeuten an aktivem Protein wiedergewonnen werden. Die Probe wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min, bei einem maximal aufzutragenden Probenvolumen von 5 ml aufgegeben (Säulen-Maße 1.6 cm x 60 cm). Die Elution der Proteine erfolgte isokratisch durch 50 mM KPi-Puffer, pH 7.5 mit 150 mM NaCl. Nach einstündigem Vorlauf, der keine MeJA-Aktivität enthielt, wurde die Probe in 5 ml Fraktionen gesammelt. Die MeJA-Esterase Aktivität erschien in den Fraktionen zwischen 165 ml und 200 ml. Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte

IV. Ergebnisse 86

mit dem Standardtest (vgl. IV.1.2.2.) und mit Nitrophenylacetat (vgl. IV.1.2.3.) und fiel in einer Fraktion an. Das Volumen der Fraktionen mit Esteraseaktivität, die vereinigt wurden, betrug 35 ml (3.5 mg/ml Protein). Anschließend wurden die Fraktionen mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 20 kDa (vgl. III.6.1.2., Centricon® Plus 20 Zentrifugen-Filtereinheiten) eingeengt und auf den nächsten Startpuffer umgepuffert. Sie enthielten 123 mg Protein mit einer spezifischen Enzymaktivität von 10.91 pkat/mg. Dies entsprach einer Ausbeute von 30.3 % bei einem Anreicherungsfaktor von 6.

Abb. IV.9.: Elutionsprofil der Größenausschluss-Chromatographie an HiLoad Superdex 200 nach vorheriger

Chromatographie an Q-Sepharose „Fast Flow“ Material. Aufgegebene Proteinlösung: 24 ml

vorgereinigter MeJA-Esterase (2140 pkat/255 mg Protein) wurden mittels Filtration durch

Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 20 kDa auf ein Volumen von 5 ml eingeengt und auf

die Säule aufgetragen. Säulenabmessungen: 1.6 x 60 cm. Flussrate: 1 ml/min. Elution: isokratisch

mit 150 mM NaCl in Startpuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 7.5; 20 mM EtSH). Die Bestimmung der

MeJA-Esterase Aktivität erfolgte mit dem Standardtest (vgl. IV.1.1.2.). Der Balken kennzeichnet den

Bereich der Fraktionen, die vereinigt und für die weitere Reinigung verwendet wurden.

IV. Ergebnisse 87

1.5.4. Hydroxyapatit-Chromatographie an Bio-Scale CHT5 (1.0 x 6.4 cm) Bei der Chromatographie an Hydroxyapatit handelte es sich im Gegensatz zu den bisher verwendeten Proteinreinigungsmethoden um eine rein empirische Methode, da schwer Vorhersagen getroffen werden konnten, ob das zu reinigende Protein an das Säulenmaterial bindet. Das Trennprinzip beruht darauf, dass sowohl Amino- als auch Carboxygruppen mit der Oberfläche der nicht-porösen Hydroxyapatitkristalle interagieren. Die Säule wurde mit drei Gelbettvolumina Startpuffer (20 mM KPi-Puffer, pH 6.8; 20 mM EtSH; 0.3 mM CaCl2) equilibriert und die Probe über einen 5 ml Injektionsloop mit 1 ml/min aufgegeben (Säulen-Maße 1.0 x 6.4 cm). Ungebundene Proteine wurden mit Startpuffer von der Säule gewaschen. Nach dem Auswaschen ungebundener Proteine von der Säule wurden gebundene Proteine durch einen linearen Gradienten (0-500 mM) mit Elutionspuffer (500 mM KPi-Puffer, pH 6.8; 20 mM EtSH) in 2 ml Fraktionen gesammelt. Alle Fraktionen wurden auf spezifische Aktivität im Standardtest (vgl. IV.1.1.2.), sowie auf hydrolytische Aktivität gegen Nitrophenylacetat getestet. Die MeJA-Esterase Aktivität für beide getesteten Substrate fiel in einer Fraktion an. Das Aktivitätsmaximum wurde bei einer Phosphatkonzentration von 200 mM eluiert. Die vereinigten Fraktionen mit Esteraseaktivität, die zwischen 0 M und 300 mM KPi-Puffer eluierten, hatten ein Volumen von 16 ml bei einer Gesamtproteinmenge von 1.41 mg. Durch diesen Reinigungsschritt erhöhte sich die spezifische MeJA-Esterase Aktivität auf 44.04 pkat/mg bei einer Ausbeute von 22.4 % und einem Anreicherungsfaktor von 25. Die vereinigten aktiven Fraktionen wurden eingeengt und mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 20 kDa (vgl. III.6.2.1, Centricon® Plus 20 Zentrifugen-Filtereinheiten) gegen Tricin/NaOH-Puffer (pH 8.0, 20 mM EtSH) umgepuffert.

IV. Ergebnisse 88

Abb. IV.10.: Elutionsprofil der Hydroxyapatit-Chromatographie an Bio-Scale CHT5 nach Größenausschluss-

Chromatographie an HiLoad Superdex 200. Aufgegebene Proteinlösung: 35 ml vorgereinigte MeJA-

Esterase (1341 pkat/123 mg Protein) wurde mittels Filtration durch Membranen mit einer

Ausschlussgrenze von 20 kDa auf ein Volumen von 5 ml eingeengt und auf die Säule aufgetragen.

Säulenabmessungen: 1.0 x 6.4 cm. Flussrate: 1 ml/min. Elution: KPi -Gradient von 0-500 mM (pH

6.8; 20 mM EtSH). Die Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität erfolgte mit dem Standardtest (vgl.

IV.1.1.2.). Der Balken kennzeichnet den Bereich, der vereinigt und für die weitere Reinigung

verwendet wurde.

1.5.5. Ionenaustausch-Chromatographie an Bio-Scale Q2 (0.7 x 5.2 cm) Das Säulenmaterial der Bio-Scale Q2 Chromatographiesäule besteht aus sphärischen Partikeln, die aus hochporösem, polymerem Macro-Prep® MP 10 Material gebildet werden. Macro Prep® MP 10 Material ist ein starker Anionenaustauscher und zeichnet sich aufgrund seiner Hydrophilie durch eine extrem geringe unspezifische Bindung von Proteinen aus. Zur weiteren Aufreinigung der nativen MeJA-Esterase wurde die Proteinlösung über einen 2 ml Injektionsloop auf eine mit fünf Gelbettvolumina Startpuffer (50 mM Tricin/NaOH-Puffer, pH 8.0; 1 M KCl, 20 mM EtSH) equilibrierte Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min aufgegeben (Säulen-Maße 0.7 x 5.2). Ungebundene Proteine wurden mit Startpuffer

IV. Ergebnisse 89

ausgewaschen und der Säulendurchfluss zur späteren Analyse jeweils in 1 ml Fraktionen aufgefangen. Die Elution gebundener Proteine erfolgte durch einen linearen Salzgradienten innerhalb von zehn Säulenvolumina von 0–1 M KCl in Startpuffer. Alle Fraktionen wurden auf spezifische Aktivität im Standardtest (vgl. IV.1.2.2.), sowie auf hydrolytische Aktivität gegen Nitrophenylacetat (vgl. IV.1.2.3.) getestet. Die MeJA-Esterase Aktivität für beide getesteten Substrate fiel in einem Proteinpeak an. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und die spezifische Aktivität der eingeengten Fraktionen betrug in einem Volumen von 7 ml 365 pkat/mg. Der Anreicherungsfaktor bei diesem Schritt betrug 207, die Fremdproteinabtrennung 10 % bei einer Ausbeute von 18.16 %. Zur Vorbereitung der Probe für die nächste Säule wurde mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa (vgl. III.6.2.1, Centricon® Zentrifugen-Filtereinheiten) gegen KPi-Puffer (pH 5.5, 20 mM EtSH) umgepuffert.

Abb. IV.11.: Elutionsprofil der Ionenaustausch-Chromatographie an Bio-Scale Q2 nach Hydroxyapatit-

Chromatographie an Bio-Scale CHT5. Aufgegebene Proteinlösung: 16 ml vorgereinigter MeJA-

Esterase (992.7 pkat/ 22.5 mg Protein) wurden mittels Filtration durch Membranen mit einer

Ausschlussgrenze von 10 kDa auf ein Volumen von 2 ml eingeengt und auf die Säule

aufgetragen. Säulenabmessungen: 0.7 x 5.2 cm. Flussrate: 1 ml/min. Elution: KCl-Gradient 0-1

M in Startpuffer (50 mM Tricin/NaOH-Puffer, pH 8.0; 20 mM EtSH). Die Bestimmung der MeJA-

Esterase Aktivität erfolgte mit dem Standardtest (vgl. IV.1.1.2.). Der Balken kennzeichnet den

Bereich, der vereinigt und für die weitere Reinigung verwendet wurde.

IV. Ergebnisse 90

1.5.6. Ionenaustausch-Chromatographie an Mono-Q HR 5/5 (0.5 cm x 5.0 cm) Mono Q HR 5/5 ist ein starker Anionenaustauscher bestehend aus Harzpartikeln mit einem sehr einheitlichen Größenbereich (10 µm). Diese Materialbeschaffenheit verbessert die Auftrennschärfe während der Elution. An Harzpartikeln sind quartäre Aminogruppen gebunden, woran Proteine mit negativer Gesamtladung binden können. Durch stärker geladene Anionen wie z. B. Chlorid können sie wieder aus dieser Bindung verdrängt und von der Säule eluiert werden. Vor jedem Lauf wurde die Säule mit fünf Gelbettvolumina Startpuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 5.5; 20 mM EtSH) equilibriert. Die auf den Startpuffer umgepufferte Probe wurde über das Injektionsventil (1 ml Injektionsloop) mit einer Flussrate von 0.5 ml/min auf die Säule aufgegeben (Säulen-Maße 0.5 cm x 5.0 cm). Eluiert wurden die gebundenen Proteine mit einem linearen KCl-Gradienten von 0 – 1 M in Startpuffer über 30 Säulenvolumina. Die Aktivität und der Proteingehalt wurde in jeder Fraktion bestimmt (vgl. IV.1.2.2.), sowie auf hydrolytische Aktivität mit Nitrophenylacetat (vgl. IV.1.2.3.) getestet. Die Elution der MeJA-Esterase Aktivität erfolgte zwischen 300 mM und 400 mM KCl in Startpuffer in einem Gesamtvolumen von 4 ml, das insgesamt noch 72 µg Protein enthielt. Aus der spezifischen Aktivität von 1357.1 pkat/mg errechnete sich, bezogen auf das Eluat der Bio-Scale Q2 Chromatographiesäule, ein Anreicherungsfaktor von 767 mit einer Ausbeute von 2.2 %. Die Proteinlösung wurde mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa (Microcon® Zentrifugen-Filtereinheiten) auf 1 ml eingeengt und gegen Tricin/NaOH-Puffer (pH 8.0, 20 mM EtSH) umgepuffert.

IV. Ergebnisse 91

Abb. IV.12.: Elutionsprofil der Ionenaustausch-Chromatographie an Mono Q HR 5/5 nach Ionenaustausch-

Chromatographie an Bio-Scale Q2. Aufgegebene Proteinlösung: 7 ml vorgereinigter MeJA-

Esterase (804.3 pkat; 2.2 mg Protein) wurden mittels Filtration durch Membranen mit einer

Ausschlussgrenze von 10 kDa auf ein Volumen von 1 ml eingeengt und auf die Säule

aufgetragen. Säulenabmessungen: 0.5 x 5.0 cm. Flussrate: 1 ml/min. Elution: KCl-Gradient von 0-

1 M in Startpuffer (50 mM KPi-Puffer, pH 5.5; 20 mM EtSH). Die Bestimmung der MeJA-Esterase

Aktivität erfolgte mit dem Standardtest (vgl. IV.1.1.2.). Der Balken kennzeichnet den Bereich der

Fraktionen, die vereinigt und für die weitere Reinigung verwendet wurden.

1.5.7. Zusammenfassende Übersicht der Reinigung der MeJA-Esterase Aus Zellsuspensionskulturen von L. esculentum konnte nach Extraktherstellung, Ammoniumsulfatfällung (30-70 %) und fünf säulenchromatographischen Schritten die MeJA-Esterase 1357-fach angereichert werden. Ausgehend vom Rohextrakt betrug die Gesamtaktivitätsausbeute 2.2 % (vgl. Tab. IV.2.).

IV. Ergebnisse 92

Ungewöhnlich während der Reinigung der MeJA-Esterase war die Verwendung von drei Anionenaustauschern, da die chromatographische Trennung auf dem gleichen Prinzip beruhte. Aufgrund abnehmender Partikelgrößen und unterschiedlichen Struktur der Materialien konnte ausgehend vom Q-Sepharose Material, über die Q2 Bio-Scale Chromatographisäule und Mono Q HR 5/5 Chromatographisäule dennoch eine Abtrennung von Fremdprotein und Aufreinigung der MeJA-Esterase erzielt werden. Eine geringere Partikelgröße erreichte eine wesentlich höhere Trennleistung. Die Proteinkapazität hingegen, d.h. die Menge an Protein, die durch das Säulenmaterial gebunden werden konnte, nahm ab. Ein zusätzlicher Parameter der während der Proteinreinigung variiert werden konnte, war der pH-Wert des verwendeten Puffersystems. Da der isolelektrische Punkt der MeJA-Esterase bei 4.7 lag, wurde sie umso später von einem Anionenaustauscher eluiert, je höher der pH-Wert des Puffers lag, bzw. umso früher, je niedriger der pH-Wert des Puffers gewählt wurde. Die Elution der MeJA-Esterase Aktivität erfolgte deshalb bei der Auftrennung über die Q2 Bio-Scale Chromatographisäule mit Tricin/NaOH-Puffer pH 8.0, so dass durch Erhöhung des pH-Wertes die Salzkonzentration zur Elution des Proteins bei 500 mM lag. Bei der Auftrennung der Proteine an der Mono Q HR 5/5 Chromatographiesäule wurde hingegen ein KPi-Puffer mit pH 5.5 gewählt. Die Elution der MeJA-Esterase Aktivität erfolgte hierdurch schon bei 200-300 mM KCl sehr früh im Vergleich zur Q2 Bio-Scale Chromatographisäule. Aufgrund der unterschiedlichen Partikelgröße des Chromatographiematerials und der Änderung des pH-Wertes konnte eine Anreicherung der MeJA-Esterase erzielt werden, obwohl drei Anionenaustauscher im Reinigungsschema verwendet wurden. Reinigungsschritt Gesamt-

protein [mg]

Gesamt-aktivität [pkat]

Spezifische Aktivität [pkat/mg]

Ausbeute [%]

Anreicherung [x-fach]

Rohextrakt 2503 4430 1.77 100 1 Ammoniumsulfat-fällung

794 2985 3.76 67.4 2.1

Q-Sepharose 255 2140 8.39 48.3 4.7 HiLoad Superdex 200

123 1341 10.91 30.3 6

Bio-Scale CHT5 22.5 992.7 44.04 22.4 25 Bio-Scale Q2 2.2 804.3 365.6 18.2 207 Mono Q HR 5/5 0.072 89.2 1357.1 2.2 767 Tab. IV.2.: Anreicherung der MeJA-Esterase Aktivität aus 500 g Zellgewebe (Frischgewicht) von L. esculentum

Zellsuspensionskultur.

IV. Ergebnisse 93

Mit einer zunehmenden Zahl an Reinigungsschritten war eine deutliche Konzentrierung von Proteinen mit mittlerem Molekulargewicht erkennbar (vgl. Abb. 16). Auffallend bei dem Reinigungsverfahren war eine Protein-Doppelbande (25 kDa und 28 kDa), die sich anreichern ließ und im letzten Schritt nach der Mono Q HR 5/5 chromatographisch nicht weiter aufgetrennt werden konnte. Eine gelelektrophoretische Auftrennung einzelner Fraktionen nach der Mono Q HR 5/5 Chromatographiesäule erbrachte keinen Hinweis darauf, bei welcher der beiden Proteinbanden es sich um die MeJA-Esterase handelte (Abb. IV.13.B.). Die MeJA-Esterase Aktivität korrelierte in allen analysierten Fraktionen (B14 bis B10) mit der 25 kDa und 28 kDa Proteinbande der SDS-PAGE (Abb. IV.13.A. und Abb. IV.13.B.). Eine Zuordnung der MeJA-Esterase Aktivität zu der 25 kDa oder 28 kDa Proteinbande war nicht möglich.

Abb. IV.13.: Korrelation zwischen MeJA-Esterase Aktivität und der 25 kDa Bande sowie der 28 kDa Bande in

einer SDS-PAGE. Die MeJA-Esterase Aktivität korrelierte in allen analysierten Fraktionen (B14 bis

B10) mit der 25 kDa und 28 kDa Bande der SDS-PAGE. Somit konnte keine Zuordnung der MeJA-

Esterase Aktivität zu einer der beiden Proteinbanden erfolgen.

A) Ausschnitt aus dem Elutionsprofil der Ionenaustausch-Chromatographie an Mono Q HR 5/5

(Abb. IV.12.). Gezeigt werden die Fraktionen (B14-B10) mit MeJA-Esterase Aktivität.

B) Auftrennung der einzelnen Fraktionen (B14-B10) nach Ionenaustausch-Chromatographie an

Mono Q HR 5/5 in einer 12.5 %igen SDS-PAGE

IV. Ergebnisse 94

Um Klarheit darüber zu bekommen, ob eine der angereicherten Proteinbanden die gesuchte MeJA-Esterase repräsentierte, wurden im weiteren Verlauf der Untersuchungen sowohl das apparente Molekulargewicht des Enzyms bestimmt als auch eine Sequenzierung von Peptidfragmenten durchgeführt. 1.6. Bestimmung des Molekulargewichts Zur Molekulargewichtsbestimmung der MeJA-Esterase standen zwei verschiedene Methoden zur Verfügung: die Gelfiltration an kalibrierten Säulen und die SDS-Gelelektrophorese. Die Bestimmung des Molekulargewichts mittels beider Methoden sollte Auskunft darüber geben, ob sich das Protein aus ein oder mehreren Untereinheiten zusammensetzte. Darüberhinaus sollte geklärt werden ob die Proteinbande bei 25 kDa oder bei 28 kDa der MeJA-Esterase Aktivität zuzuordnen war. 1.6.1. Gelfiltration Die zur Gelfiltration verwendete Sephacryl S-100 HR 26/60 Chromatographiesäule (vgl. III.6.4.3.2) wurde mit Proteinen bekannten Molekulargewichts durch die Bestimmung ihrer Elutionsvolumina kalibriert, so dass aus der erstellten Kalibriergeraden und dem Elutionsvolumen der gereinigten MeJA-Esterase (150 ml) das Molekulargewicht ermittelt und mit dem durch SDS-Gelelektrophorese erhaltenen, verglichen werden konnte. Dazu wurde die Sephacryl S-100 HR 26/60 Chromatographiesäule mit 50 mM KPi-Puffer (pH 7.5 mit 150 mM NaCl) equilibriert. Bei einer Flußrate von 0.5 ml/min erfolgte die Kalibrierung der Säule mit fünf Proteinen von bekanntem Molekulargewicht (Transferrin 80 kDa, Rinderserumalbumin 67 kDa, Ovalbumin 43 kDa, Chymotrypsinogen 25 kDa, Ribonuklease A 13.7 kDa). Die Kalibriergerade wurde aus den Elutionsvolumina der Standardproteine und den entsprechenden Molekulargewichten erstellt. Das Totvolumen der Säule wurde mit Dextran (2000 kDa) bestimmt. Aus den Elutionsvolumina der bekannten Proteine sowie Ausschluss- und Bettvolumen wurde der Kav-Wert (Verteilungskoeffizient) nach folgender Formel berechnet werden. Ve = Elutionsvolumen des Proteins Kav = Ve - Vo / Vt – Vo Vo = Totvolumen der Säule (Dextran 2000 kDa) Vt = Bettvolumen (24 ml)

IV. Ergebnisse 95

Mit Hilfe einer Kalibriergeraden wurden logarithmierte molekulare Massen der Standards gegen die jeweiligen Kav-Werte aufgetragen. Hierfür wurden 150 pkat angereicherte MeJA-Esterase über die Sephacryl S-100 HR 26/60 Chromatographiesäule aufgetrennt. Aus dem Elutionsvolumen der MeJA-Esterase Aktivität von 150 ml wurde über die Kalibriergerade ein Molekulargewicht von 26 kDa (unter Annahme einer globulären Struktur des Proteins) bestimmt. Abb. IV.14.: Bestimmung des Molekulargewichtes der MeJA-Esterase mittels Gelfiltration. Die Kalibriergerade

wurde mit folgenden Proteinen bekannten Molekulargewichts kalilbriert: Transferrin (80 kDa),

Rinderserumalbumin (69 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Chymotrypsinogen (25 kDa), Ribonuklease A

(13.7 kDa). Der Pfeil zeigt das aus dem Elutionsvolumen der MeJA-Esterase-Fraktion ermittelte

Molekulargewicht von 26 kDa an

1.6.2. SDS-Gelelektrophorese Für die Molekulargewichtsbestimmung unter denaturierenden Bedingungen wurden 5 µg des gereinigten Proteins über SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt. Aus der Laufstrecke des jeweiligen Proteins und der des Bromphenolblaumarkers wurde der Rf-Wert wie folgt berechnet: Rf-Wert = Laufstrecke des Proteins/ Laufstrecke des Bromphenolblau Markers Eine graphische Auftragung des logarithmierten Molekulargewichts gegen den entsprechenden Rf-Wert lieferte die Kalibriergerade. An dieser Stelle sollen die Ergebnisse der nachfolgenden Sequenzierung vorweg genommen werden, denn die

IV. Ergebnisse 96

25 kDa Bande wurde als Hitzeschockprotein identifiziert. Die Größe der MeJA-Esterase wurde mit 28 kDa graphisch bestimmt. In Abb. IV.15. ist die Molekulargewichtsbestimmung der MeJA-Esterase durch SDS-Gelelektrophorese dargestellt. Abb. IV.15.: Molekulargewichtsbestimmung der MeJA-Esterase (5 µg Protein) nach Auftrennung in einem 12.5

%igem Polyacrylamidgel. Als Eichproteine wurden Trypsin-Inhibitor (21.5 kDa), Carboanhydrase (30

kDa), Ovalbumin (43 kDa), Rinderserumalbumin (69 kDa) und Phosphorylase b (97.4 kDa)

verwendet. Der Pfeil zeigt das ermittelte Molekulargewicht der MeJA-Esterase von 28 kDa an.

Unter denaturierenden Bedingungen wurde für die MeJA-Esterase ein Molekulargewicht von 28 kDa bestimmt (vgl. Abb. IV.15.). Hieraus ließ sich im Vergleich zum nativen Molekulargewicht von 26 kDa schließen, dass die MeJA-Esterase als monomeres Protein vorlag. Eine Zuordnung der MeJA-Esterase Aktivität zu einer der beiden Proteinbanden von 25 kDa bzw. 28 kDa über die Molekulargewichtsbestimmung gelang jedoch nicht. Hierüber sollte die nachfolgende Proteinsequenzierung Aufschluss geben.

IV. Ergebnisse 97

1.7. Bestimmung interner und N-terminaler Aminosäuresequenzen 1.7.1. Bestimmung interner Aminosäuresequenzen Sequenzbestimmungen für interne Aminosäuresequenzen wurden bei Prof. Lottspeich am Max-Planck-Institut für Biochemie in München durchgeführt. Eine ausreichende Proteinmenge (50 µg) für die partielle Sequenzierung wurde erhalten, indem 3 kg L. esculentum Zellkulturen aufgereingt wurden. Für eine Bestimmung der Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase, mußte das Protein zuerst in Peptidfragmente zerlegt werden. Die Fragmentierung wurde mit dem Enzym Endoproteinase LysC durchgeführt, welches in einem Proteinstrang C-terminal von Lysin eine Spaltung vornimmt. Mittels Endoproteinase LysC werden in der Regel Peptide mit einer durchschnittlichen Fragmentlänge von 16 Aminosäuren erhalten, während mit dem häufig verwendeten Enzym Trypsin (spaltet hinter Arginin und Lysin) nur Peptide mit einer durchschnittlichen Fragmentlänge von 9 Aminosäuren erhalten werden. Längere Peptide sind zur Klonierung eines Enzyms von Vorteil, da dementsprechend auch längere Oligonucleotide abgeleitet werden können (vgl. IV. 2.2.1.). Der Verdau wurde direkt im Gel durchgeführt. Die beiden interessierenden Banden bei 25 kDa und 28 kDa wurden mit einem Skalpell ausgeschnitten und konnten auf diese Weise von benachbarten Proteinen abgetrennt werden. Peptide, die nach dem Verdau im Gel vorlagen, wurden entsprechend Standardmethoden eluiert, mittels HPLC getrennt und fraktioniert (ECKERSKORN und LOTTSPEICH, 1990; ECKERSKORN und LOTTSPEICH, 1993). Bei drei Peptiden der 28 kDa Bande war die Sequenzierung erfolgreich, es wurden Sequenzen mit Längen zwischen 11 und 14 Aminosäuren erhalten. Das Ergebnis der Sequenzierung der Proteinbande bei 28 kDa zeigt Tab. IV.3a.:

Peptidsignal 28 kDa Bande

Aminosäuresequenz

18 a Val-Val-Thr-Ile-Leu-Arg-Ser-Glu-Gly-His-Lys

18 b Tyr-Gly-Ser-Val-His-Arg-Val-Tyr-Val-Val-Cys-Asp-Lys

23 Val-Ser-Val-Leu-Asp-Met-Ala-Ala-Ser-Gly-Ile-Asn-Pro-Lys

Tab. IV.3a.: Ergebnisse der Sequenzierung einzelner Peptidfraktionen nach Verdau der Proteinbanden bei 28

kDa mit Endoproteinase LysC.

Bei einem Peptid der 25 kDa Bande war die Sequenzierung erfolgreich, es wurde eine Sequenz mit einer Länge von 10 Aminosäuren erhalten.

IV. Ergebnisse 98

Das Ergebnis der Sequenzierung der Proteinbande bei 25 kDa zeigt Tab. IV.3b.:

Peptidsignal 25 kDa Bande

Aminosäuresequenz

1 Gly-Arg-Leu-Ser-Lys-Glu-Glu-Ile-Glu-Lys

Tab. IV.3b.: Ergebnisse der Sequenzierung einzelner Peptidfraktionen nach Verdau der Proteinbande bei 25

kDa mit Endoproteinase LysC.

1.7.2. Bestimmung einer N-terminalen Aminosäuresequenz Die Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz wurde im Labor von Prof. Dr. Hoppe am Lehrstuhl für Physiologische Chemie II an der Universität Würzburg durchgeführt. Die Bestimmung der N-terminalen Sequenz wurde nur für die Proteinbande mit 28 kDa durchgeführt. Hierfür wurde eine angereicherte Proteinfraktion über SDS-PAGE (vgl. III.5.2.) getrennt und auf eine PVDF-Membran geblottet (vgl. III.5.6.1.). Der Membranbereich mit dem gewünschten Protein konnte anschließend einem Edman-Abbau unterworfen werden. Die Ergebnisse der Sequenzierung des Amino-Terminus der Proteinbande bei 28 kDa zeigt Tab. IV.4.:

Peptidsignal 28 kDa Bande

Aminosäuresequenz

N-Terminus Lys-Gly-Asp-Lys-Asn-His-Phe-Val-Leu-(X)-His

Tab. IV.4.: Ergebnis der Sequenzierung des Amino-Terminus. Aminosäuren die nicht bestimmt werden konnten

sind durch ein x markiert.

Ungewöhnlich bei der Sequenz des Amino-Terminus war, dass die Aminosäuresequenz nicht wie üblich mit einem Methionin begann. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass während der Enzymreinigung Aminosäuren am Amino-Terminus abgespalten wurden, da ohne Zusatz von Proteinaseinhibitoren aufgereinigt wurde. Nach der Sequenzierung wurde versucht, die gewonnenen Aminosäuresequenzen durch eine Datenbankrecherche (vgl. III.10.) einer Enzymklasse zuzuordnen und Ähnlichkeiten zu bekannten Enzymen aufzudecken.

IV. Ergebnisse 99

1.8. Datenbankrecherche Damit die steigende Anzahl von sequenzierten Genen, sowie die daraus resultierenden Proteine erfasst werden können, und die Ergebnisse leichter zugänglich sind, existieren eine Vielzahl von Datenbanken. In Kombination mit leistungsstarken Suchprogrammen bieten sie die Möglichkeit, Gensequenzen abzurufen oder aber neue Gen- und Proteinabschnitte mit den bisher bekannten Strukturen zu vergleichen. Die Entscheidung, wie ähnlich zwei Sequenzen sind und ob eine beobachtete Ähnlichkeit wahrscheinlicher auf einen gemeinsamen Vorläufer zurückgeführt werden kann als auf den Zufall, setzt einen paarweisen Vergleich einzelner Positionen zweier Sequenzen voraus, das sogenannte „Alignment“ (engl. Ausrichtung, paarweise Zuordnung). Im Falle von Peptidsequenzen kann sehr schnell geprüft werden, ob die aufgefundenen Aminosäuresequenzen mit bereits bekannten Proteinen identisch sind, oder ob Homologien zu bestimmten Enzymfamilien bestehen. Unter Identität versteht man die Zahl von Sequenzpositionen die bei paarweiser Zuordnung (Alignment) identisch sind. Sie wird meist in Prozent der Alignment-Länge angegeben. Die Quantifizierung der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen setzt dagegen die Definition einer Ähnlichkeitsmetrik voraus, eines Maßes dafür, als wie ähnlich man beispielsweise Valin zu Threonin oder Leucin annehmen möchte. Homologie bedeutet dagegen evolutionäre Verwandtschaft. Zwei homologe Proteine haben sich aus einer gemeinsamen Vorläufersequenz entwickelt. Der Begriff hat nicht unbedingt etwas mit Identität oder Ähnlichkeit zu tun, abgesehen davon, dass homologe Sequenzen meist ähnlicher sind (oder in einem Alignment mehr identische Positionen besitzen) als nicht-homologe Sequenzen. Die erhaltenen Aminosäuresequenzen wurden mit verschiedenen Datenbanken analysiert. Sequenzvergleiche wurden in der SwissProt und EMBL Datenbank unter Verwendung der Sequenzanalyse Programme BLAST und FASTA (vgl. III.10.) vorgenommen. Nachfolgende Tabellen (IV.5a-d) zeigen auszugsweise hohe Homologien zu fünf bis September 2003 bekannter pflanzlicher Hydrolasen. Die unten aufgeführten Hydrolasen wurden entsprechend ihrer höchsten Ähnlichkeit zur MeJA-Esterase ausgewählt. Mehrere putative Proteine aus A. thaliana besaßen ebenfalls große Ähnlichkeiten zu den Peptidsequenzen der MeJA-Esterase. Sequenzvergleiche wurden jedoch nur mit bereits charakterisierten Proteinen durchgeführt. Da keine 100 %ige Übereinstimmung zu einem Protein aus den Datenbanken bestand, konnte davon ausgegangen werden, dass es sich um eine neue Esterase handelte. Die Tabellen IV.5a.-d. zeigen die Ergebnisse der Sequenzvergleiche aller Peptide der 28 kDa Bande. Die jeweiligen Enzyme und ihre Stammpflanzen sind wie folgt abgekürzt:

IV. Ergebnisse 100

MJE Methyljasmonat-Esterase LE Lycopersicon esculentum PNAE Polyneuridinaldehydesterase RS Rauvolfia serpentina EIE Ethylen-induzierte Esterase CS Citrus sinensis HNLME Hydroxynitrillyase ME Manihot esculenta HNLHB Hydroxynitrillyase HB Hevea brasiliensis PIR 7B Pseudomonas-induziertes Protein OS Oryza sativa Die für die Enzyme angegebenen Nummern geben den Zugriffsschlüssel (Accession-Number) der Datenbank-Einträge wieder: PNAE Polyneuridinaldehydesterase Q9SE93 EIE Ethylen-induzierte Esterase Q94G63 HNLME Hydroxynitrillyase M. esculenta P52705 HNLHB Hydroxynitrillyase H. brasiliensis U40402 PIR 7B Pseudomonas-induziertes Protein Q942Y9 Ergebnis der Sequenzvergleiche: Tab. IV.5a.: Sequenz mit Ähnlichkeit und Homologie zum N-Terminus

Enzym Herkunft Aminosäuresequenz Identische AS (%) MJE LE KGDK--NHFVLxH -

PNAE RS 1 MHSAANAKQQKHFVLVH 17 60 EIE CS 1 MEEVVGMEEKHFVLVH 16 50 HNL ME 1 MVT---A---HFVLIH 7 50 HNL HB 1 M---AFA----HFVLIH 7 50

PIR 7B OS 1 MEGSSSSSKHFILVH 15 40 Tab. IV.5b.: Sequenz mit Ähnlichkeit und Homologie zu Peptid 18 a:

Enzym Herkunft Aminosäuresequenz Identische AS (%) MJE LE VVTILRSEGHK -

PNAE RS 29 LKPLLESAGHK 39 46 EIE CS 28 LKARLVAGGHR 38 27 HNL ME 21 LKPALERAGHK 31 36 HNL HB 21 LKPLLEALGHK 31 36

PIR 7B OS 27 VVTMLRSEGHR 37 82

IV. Ergebnisse 101

Tab. IV.5c.: Sequenz mit Ähnlichkeit und Homologie zu Peptid 18 b:

Enzym Herkunft Aminosäuresequenz Identische AS (%) MJE LE VSVLDMAASGINPK -

PNAE RS 40 VTAVDLSAAGINPR 53 43 EIE CS 39 VTAVDLAASGINMK 52 64 HNL ME 32 VTALDMAASGIDPR 45 71 HNL HB 32 VTALDLAASGVDPR 45 57

PIR 7B OS 38 VTALDLAASGVHPA 51 57 Tab. IV.5d.: Sequenz mit Ähnlichkeit und Homologie zu Peptid 23:

Enzym Herkunft Aminosäuresequenz Identische AS (%) MJE LE YGSVHRVYVVCDK -

PNAE RS 203 YGSVKRAYIFCNE 215 54 EIE CS 204 YGSVKRVYLVCEE 216 69 HNL ME 194 YGSIKKVYIWTDQ 206 46 HNL HB 193 YGSIKKIYVWTDQ 205 46

PIR 7B OS 154 YGSVKRVCLMAME 166 46 Tab.IV. 5a. - 5d.: Ausschnitte aus dem Datenbankvergleich der Peptidsequenzen Amino-Terminus, 18a, 18b und

23 der 28 kDa Bande. Angegeben sind jeweils die Enzyme, aus denen übereinstimmende

Sequenzen stammen, die Quelle der Enzyme und die Anzahl identischer Aminosäuren in

Prozent. Die Zahlen vor und nach den Aminosäuresequenzen geben die Lage der Peptide

innerhalb der Proteine an. Aminosäuren der Peptidausschnitte, die identisch zur MeJA-

Esterase waren, wurden hervorgehoben.

Für alle Peptide gab es homologe Bereiche in den Sequenzen der in den Tabellen IV.5a-d aufgeführten Hydrolasen. Diese hohen Homologien bestätigten, dass es sich bei dem analysierten Protein der 28 kDa Bande tatsächlich um eine Esterase handelte. Die Peptidsequenz der 25 kDa Bande hingegen konnte als Hitzeschockprotein (HSP 70) aus L. esculentum identifiziert werden. HSP 70 ist ein abundantes Protein, das vermutlich nur zufällig mit der MeJA-Esterase gemeinsam gereinigt wurde. Nachdem die Ergebnisse der Proteinsequenzierung die Reinigung der nativen MeJA-Esterase aus L. esculentum bestätigt hatten, konnten anhand der Peptidsequenzen Oligonucleotide für die weitere molekularbiologische Bearbeitung abgeleitet werden.

IV. Ergebnisse 102

1.9. Darstellung der Homogenität Die Reinheit des isolierten Proteins wurde nach jedem Reinigungsschritt durch eine denaturierende Gelelektrophorese in einem 12.5 %igen SDS-Gel (vgl. III.5.2.) mit anschließender Silberfärbung überprüft. Abb. IV.16. zeigt die Reinheit der Präparationen nach den chromatographischen Reinigungsschritten. Abb. IV.16.: SDS-Gelelektrophorese der einzelnen Schritte im Reinigungsgang der MeJA-Esterase Aktivität.

1. Molekulargewichtsgrößenstandard (75 kDa, 50 kDa, 37 kDa, 25 kDa und 15 kDa)

2. Rohextrakt nach Zellaufschluss

3. Ammoniumsulfatfällung (30-70 %Sättigung)

4. Q-Sepharose Fast Flow

5. HiLoad Superdex 200

6. Bio-Scale CHT5

7. Bio-Scale Q2

8. Mono Q HR 5/5

Der Pfeil verweist auf die Proteinbande der MeJA-Esterase (MJE)

Die Spur des Mono Q Eluates wies eine prominente Hauptbande und eine weitere Nebenbande zwischen den Markerproteinen von 25 kDa bis 37 kDa auf. Durch Vergleich der Rf-Werte der Eichproteine mit dem Rf-Wert der Hauptbande konnte ein Molekulargewicht von 28 kDa für die MeJA-Esterase bestimmt werden (vgl. IV.1.6.2.)

IV. Ergebnisse 103

2. Klonierung der MeJA-Esterase 2.1. Strategie zum Klonieren der MeJA-Esterase Die Sequenzierung der Peptidfragmente der aus L. esculentum gereinigten MeJA-Esterase ermöglichte nun eine weitergehende molekularbiologische Untersuchung. Hierbei sollte das für die MeJA-Esterase korrespondierende Gen identifiziert, kloniert und überexprimiert werden. Eine gewebsspezifische Expression sollte über Northern-Hybridisierung nachgewiesen werden. Da die Sequenzierung des Tomatengenoms schon weit fortgeschritten ist (www.tigr.org/tdb.tgi.lgi/release notes.html), wurden die Nucleinsäuresequenzen der sequenzierten Peptide (vgl IV.1.7.1./IV.1.7.2.) mit bekannten exprimierten Sequenzen (EST´s, Expressed Sequence Tags) aus Datenbanken (TIGR Gene Index) verglichen. EST´s sind spezifische DNA-Segmente auf Chromosomen, die durch die Sequenz von zwei Primern festgelegt werden. Aus Datenbanken sind solche Informationen schnell verfügbar und können zur Klonierung von Genen verwendet werden. Jedoch ließen Datenbankrecherchen keine Identifizierung von EST´s zu, die den Nucleinsäuresequenzen der sequenzierten Peptide entsprachen. Deshalb wurden zur Klonierung der MeJA-Esterase aus den Aminosäuresequenzen der Peptide 18a, 18b, 23 und des Amino-Terminus, die nach Sequenzierung erhalten wurden (vgl IV.1.7.1./IV.1.7.2.), degenerierte Primer abgeleitet. Degenerierte Primer sind ein Gemisch aus Einzelmolekülen, die sich an bestimmten Stellen in ihrer Sequenz unterscheiden. Sie werden verwendet, wenn man die Aminosäuresequenz des Proteins, nicht aber die Basensequenz des Gens kennt. Über den Aminosäurecode lassen sich Rückschlüsse auf die Basensequenz ziehen. Mittels degenerierter Primer, die von den Peptiden 18a, 18b, 23 und dem Amino-Terminus abgeleitet wurden, sollte die Klonierung eines internen Gen-Fragmentes der MeJA-Esterase möglich sein. Ausgehend von neu gewonnenen und spezifischen DNA-Sequenzinformationen des internen Gen-Fragmentes sollte mittels RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends – Amplifizierung von cDNA-Enden) 5´-und 3´-Ende des Volllänge-Klons gewonnen werden.

IV. Ergebnisse 104

2.2. Klonierung eines internen cDNA-Fragmentes der MeJA-Esterase 2.2.1. Entwurf degenerierter Primer zur Klonierung der MeJA-Esterase Anhand einer N-terminalen und drei internen Aminosäuresequenzen der MeJA-Esterase wurden Primer abgeleitet. Da der genetische Code degeneriert ist, d.h. in der Regel mehrere Basentripletts für eine Aminosäure codieren, können von einer Peptidsequenz nur sogenannte degenerierte Primer abgeleitet werden. Dies bedeutet, dass an einigen Stellen des Oligonucleotides unterschiedliche Basen auftreten können und das Triplett trotzdem für dieselbe Aminosäure codiert. Anhand dieser Informationen müssten entweder alle möglichen Oligonucleotide einzeln oder als Mischung aller möglichen Basenkombinationen synthetisiert werden. Die Oligonucleotid-Sonde sollte mit den Basen Guanin und Cytosin enden, um eine feste Bindung mit der DNA-Sequenz einzugehen. Bei der Auswahl der Primer musste zusätzlich darauf geachtet werden, dass nicht zu hoch konservierte Bereiche der Proteine ausgewählt wurden. Hohe Homologien hätten sonst dazu führen können, dass die Primer nicht ausschließlich an die DNA-Sequenz der MeJA-Esterase gebunden hätten, sondern zusätzlich homologe Enzyme kloniert worden wären. Die Oligonucleotide MJE for1, MJE rev2 und MJE N1 wurden in einem ersten Versuch in einer RT-PCR zur Klonierung des internen Fragmentes eingesetzt. Hierbei wurden Inosin-haltige Primer verwendet, die an homologe Sequenzen der MeJA-Esterase binden sollten und ein Fragment von etwa 500 bp ergeben sollten. Desoxyinosin wurde an den Positionen des Primers verwendet, für die eine vierfache Degeneration des genetischen Codes für die jeweilige Aminosäure bestand. Dieses Nucleotid ist in der Lage, mit allen vier natürlichen Nucleotiden eine Basenpaarung einzugehen (KWOK et al., 1994). Abb. IV.17 zeigt die Peptidsequenzen, die von den Peptidsequenzen abgeleiteten Sequenzen der Oligonucleotide und die tatsächlich in der anschließenden PCR verwendeten degenerierten Primer. Peptidsequenz 18 a und 18 b (vgl. IV.1.7.1.)

H K V S V L D M A A Oligonucleotid zur Peptidsequenz 18 a und 18 b CAC AAA GTN TCN GTN CTN GAC ATG GCN GC T G AGC TAA T T G

IV. Ergebnisse 105

Degenerierter Primer MJE for1

CAY AAR GTI WSI GTI YTI GAY ATG GCN GC Peptidsequenz N-Terminus (vgl. IV.1.7.2.)

K G D K N H F V L

Oligonucleotid zur Peptidsequenz N-Terminus AAA GGN GAY AAA AAC CAC TTC GT G G T T T Degenerierter Primer MJE for1

AAR GGN GAY AAR AAY CAY TTY GT Peptidsequenz 23 (vgl. IV.1.7.1.)

Y G S V H R V Y V V C D K Oligonucleotid zur Peptidsequenz 23 TAC GGN TCN GTN CAC CGN GTN TAC GTN GTN TGC GAC AAA T AGC T ACA T T T G T G

Degenerierter Primer MJE rev 2

TT RTC RCA IAC IAC RTA IAC ICK RTG NAC

Abb. IV. 17.: Aminosäuresequenzen und die davon abgeleiteten Nucleinsäuresequenzen. Die für die

Primersynthese herangezogenen Aminosäuren sowie die möglichen Nucleotid-Tripletts, welche

für die Aminosäuren codieren können, sind aufgeführt. Die Pfeile geben die Leserichtung an,

das heißt, ob Primer für den Matrizenstrang oder komplementären Strang der cDNA konzipiert

wurden. In den Kästen unter den Aminosäure-/Nucleinsäure-Sequenzen sind die zur

Primersynthese verwendeten Sequenzen abgebildet. Nucleotidsequenzen sind immer in 5´→

3´-Richtung aufgeführt. Bei allen drei Primern wurde bei einer vierfachen Degeneration des

genetischen Codes anstelle der entsprechenden Basen Inosin (gekennzeichnet mit I)

verwendet.

Von den Peptidsequenzen 18a und 18b (VVTILRSEGHK VSVLDMAASGINPK, vgl. IV. 17.) wurden nur kursiv gedruckte Bereiche zum Entwurf eines Primers verwendet,

IV. Ergebnisse 106

da sehr streng homologe Bereiche durch den Primer erfasst worden wären und dies vermieden werden sollte. Denn eine hohe Spezifität der Primer wurde gewünscht. Peptidsequenz 23 und Peptidsequenz des Amino-Terminus wurden in voller Länge für die Herstellung der Primer verwendet. Mit Hilfe der drei in Abb. IV.17. dargestellten Primer sollten in einer RT-PCR MeJA-Esterase spezifische DNA-Fragmente amplifiziert werden. RT-PCR ist eine Kombination aus reverser Transkription (vgl. III.8.9.4.) und anschließender Polymerasekettenreaktion (vgl. III.8.7.). Zur Isolierung der verwendeten mRNA wurde die Lithiumchlorid-Methode (III.8.2.1.) angewendet. Der Reaktionsansatz für die RT-PCR setzte sich wie folgt zusammen: Template RNA (1 µg/µl) 2 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 1 µl Primer MJErev2 (40 pmol) 1 µl Primer MJEfor 1 und MJE N1 (40 pmol) 1 µl 2 mM dNTP-Mix 1 µl 10 x PCR Reaktionspuffer 10 µl dH2O 31 µl Enzym-Mix RT-PCR Kit 2 µl Folgendes Temperaturprofil wurde für die RT-PCR verwendet: Reverse Transkription 30 min 50 °C 1 x Inaktivierung 15 min 95 °C 1 x Denaturierung 30 sec 94 °C Anlagerung der Primer 1 min 40 °C 5 x Polymerisation 1 min 72 °C Denaturierung 30 sec 94 °C Anlagerung der Primer 1 min 45 °C 30 x Polymerisation 1 min 72 °C Polymerisation 10 min 72 °C 1 x Nach Ablauf des vollständigen Temperaturprogrammes konnten amplifizierte DNA-Fragmente mit einem 1 %igen Agarosegel (vgl. III.8.3.1.) analysiert werden. Im Agarosegel waren mehrere Banden zu sehen, allerdings nicht die gesuchte Bande im Bereich von ca. 500 bp. Deshalb wurde versucht, mittels Variation der Primer MJE for1 (neuer Primer: MJE for31) und MJE rev2 (neuer Primer: MJE rev4) bzw. Einsatz eines neuen Primers (MJE for4) eine 500 bp Bande wieder unter Verwendung des

IV. Ergebnisse 107

RT-PCR Kit (vgl. III.8.9.4.) generieren zu können. Für den Entwurf der neuen Primer MJE for4 wurde keine bekannten Peptidsequenzen herangezogen, sondern die Ähnlichkeit der Hydrolasen (Homologie-Klonierung) untereinander ausgenutzt (DOGRU et al. 2000). Bei der Klonierung mittels Homologie werden Genabschnitte einer Spezies amplifiziert, deren genaue Sequenz nur aus anderen Arten bekannt ist. Man identifziert dann über Homologievergleiche die variablen Stellen und synthetisiert anschließend degenerierte Primer, die alle Nucleotidvariationen enthalten. Mit diesen versucht man, den entsprechenden Abschnitt aus der jeweiligen Sequenz zu amplifizieren. Im Fall der MeJA-Esterase wurden zur Synthese des degenerierten Primers MJE for 4 homologe Peptidsequenzen aus der Polyneuridinaldehydesterase (R. serpentina), der Ethylen-induzierte Esterase (Citrus sinensis), der Hydroxynitrillyase (Manihot esculenta) und des Pseudomonas induzierten Proteins (Pir7B, Oryza sativa) herangezogen (DOGRU et al. 2000). Abb. IV.18. zeigt die Peptidsequenzen, die von den Peptidsequenzen abgeleiteten Sequenzen der Oligonucleotide und die tatsächlich in der anschließenden PCR verwendeten degenerierten Primer.

Peptidsequenz 18 b (vgl. IV.1.7.1.)

VSVL D M A A S G I N P K

Oligonucleotid zur Peptidsequenz 18 b GAC ATG GCN GCN TCN GGN ATA AAC CC T AG C T T Degenerierter Primer MJE for 31

GAY ATG GCN GCN WSN GGN ATH AAY CC

Homologe Peptidsequenz (DOGRU et al. 2000)

E D(E) L(Y) E L A K M

Oligonucleotid zur homologen Peptidsequenz GAA GAC CTA GAA CTA GCA AAA ATG G T C G C C G (A) G G G (G) T T TTA TTA

IV. Ergebnisse 108

G G (TAC) T Degenerierter Primer MJE for 4

GAR GAN YWN GAR YTN GCN AAR ATG

Peptidsequenz 23 (vgl. IV.1.7.1.)

Y G S V H R V Y V V C D K

Oligonucleotid zur Peptidsequenz 23 TAC GGN TCN GTN CAC CGN GTN TAC GTN GTN TGC GAC AAA

T AGC T AGA T T G G Degenerierter Primer MJE rev 4

YTT RTC RCA NAC NAC RTA NAC NCK RTG NAC NSW NCC RTA

Abb. IV. 18.: Aminosäuresequenzen und die davon abgeleiteten Nucleinsäuresequenzen. Die für die

Primersynthese herangezogenen Aminosäuren sowie die möglichen Nucleotid-Tripletts, welche

für die Aminosäuren codieren können, sind aufgeführt. Die Pfeile geben die Leserichtung an,

das heißt, ob Primer für den Matrizenstrang oder komplementären Strang der cDNA konzipiert

wurden. In den Kästen unter den Aminosäure-/Nucleinsäure-Sequenzen sind die zur

Primersynthese verwendeten Sequenzen abgebildet. Amplifizierte DNA-Fragmente wurden wiederum mit einem 1 %igen Agarosegel (vgl. III.8.3.1.) analysiert. Abb. IV.19. zeigt das Ergebnis einer Reaktion mit Gesamt-RNA aus L. esculentum nach RT-PCR. Wie erwartet war ein 500 bp Fragment entstanden (Abb. IV.19.), das zur Kontrolle aus dem Gel eluiert (vgl. III.8.2.6.) und erneut in einer PCR-Reaktion als Matrize verwendet wurde. Mit demselben Primer-Paar wie in der RT-PCR sollte aus dem 500 bp Fragment zur Kontrolle eine einzelne Bande bei ca. 500 bp reamplifiziert werden. Das Ergebnis dieser Reaktion ist in Abb. IV.19. (Spur 2 und 3) zu sehen und zeigte erneut eine entsprechende Bande.

IV. Ergebnisse 109

Abb.IV.19.: PCR-Produkte nach einer RT-PCR Reaktion mit den Primern MJE for31, MJE for 4 und MJE rev4

aus Gesamt-RNA von L. esculentum Zellsuspensionskulturen. Spur M: Größenstandard, Spur 1:

RT-PCR mit den Primern MJE rev 4 und MJE for 31, Spur 2: RT-PCR mit den Primern MJE rev 4

und MJE for 4, Spur 3: Reamplifzierung der 500 bp Bande aus Spur 2 mit den Primern MJE rev 4

und MJE for 31. Es entstand mit den Primern MJE rev 4 und MJE for 31 das erwartete 500 bp

Fragment, während die Primer MJE rev 4 und MJE for 4 kein Produkt bildeten. Eine

Reamplifizierung des 500 bp Fragments aus Spur 1 erzeugte ebenfalls wieder ein 500 bp Fragment.

2.2.2. Auswahl eines geeigneten Klonierungsvektors und Subklonierung der

PCR-Fragmente Das DNA-Fragment aus Abb. IV.19. musste nun aus dem Gel eluiert (vgl. III.8.2.6.) und in einen Vektor kloniert werden. Zur Subklonierung der PCR-Produkte war das pGEM-T Vektor-System geeignet, das in E. coli in hoher Kopienzahl vorkommt. Der pGEM-T Vektor besitzt eine Multiklonierungsstelle mit Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme. An beiden Enden dieser Multiklonierungsstelle sind 3´-Thymidin-Überhänge vorhanden. Diese 3´-Thymidin-Überhänge sind kompatibel zu den 3´-Adenin-Überhängen von PCR-Produkten, die durch die Taq-Polymerase angehängt werden. Die Effizienz der Ligation der PCR-Fragmente in das Plasmid ist sehr hoch. Eine Ampicillinresistenz ermöglicht die Selektion transformierter Klone. Die Multiklonierungsstelle wird darüber hinaus von Sequenzen flankiert, die eine Bindung von Standardprimern (vgl. II.6.) und eine direkte Sequenzierung des klonierten DNA-Fragmentes ermöglichen. Nach der Elution des PCR-Produktes aus dem Gel (vgl. III.8.2.6.) wurde das maximal mögliche Volumen des Eluats (7 µl) für die Ligation wie unter III.8.9.2. beschrieben in 10 ng des pGEM-T Vektors eingesetzt. Am folgenden Morgen wurde der gesamte Ligationsansatz zur Transformation (vgl. III.8.6.2.) kompetenter E. coli Top 10 F verwendet, und transformierte Bakterien anschließend auf LB-Platten unter Ampicillin-Selektion (vgl. II.3.) angezogen. Zum

IV. Ergebnisse 110

Test auf positive Transformanten wurde mit den Primern SP6ht und T7ht (vgl. II.6.) ein Reihentest in Form einer PCR (vgl. III.8.8.) durchgeführt. Hierfür wurden 20 Bakterienkolonien mit einer Pipettenspitze in 20 µl destilliertes Wasser überführt und als Matrize in einer PCR eingesetzt. Es zeigte sich nach Analyse der PCR-Produkte mit einem 1 %igen Agarosegel, dass alle getesteten Klone ein Insert der erforderlichen Größe von 660 bp enthielten. Die Differenz zu den 500 bp des internen Fragmentes ergab sich dadurch, dass sich die Primer T7ht und Sp6ht (vgl. II.6.) nicht direkt an der Klonierungsstelle, sondern erst neben der Multiklonierungsstelle anlagerten, wodurch die PCR-Fragmente etwa 160 bp größer als das Insert waren. Alle getesteten Klone enthielten ein Insert der erforderlichen Größe, weshalb auf einen Restriktionsverdau zur Verifizierung des Ergebnisses verzichtet wurde. Von zwei positiven E. coli Kolonien wurden Flüssigkulturen angezogen und eine abschließende Charakterisierung des durch Polymerase-Kettenreaktion erzeugten 500 bp cDNA-Fragmentes erfolgte über Sequenzierung (vgl. III.9.). 2.2.3. Sequenzierung des internen cDNA-Fragmentes Eine Überprüfung der Sequenz der durch die Polymerase-Kettenreaktion erzeugten DNA-Fragmente erfolgte durch Sequenzierung (vgl. III.9.). Da es sich bei dem erzeugten DNA-Fragment um ein Stück aus einer cDNA handelte, müsste in einem der drei möglichen Leseraster ein offener Leserahmen auftreten. Die daraus ableitbare Aminosäuresequenz sollte einerseits an den äußeren Enden die zur Oligonucleotid-Synthese herangezogenen Sequenzen aufweisen und anderseits hohe Homologie zu den unter IV.1.8. aufgeführten Hydrolasen besitzen. Standardprimer T7ht und SP6ht (vgl. II.6.) wurden zur Sequenzierung des internen cDNA-Fragmentes eingesetzt. Die Sequenzierreaktion wurde analog III.9. durchgeführt, die gelelektrophoretische Trennung und Detektion gemäß III.8.3.1. Folgende Sequenz in Abb. IV.19 wurde ermittelt. DNA-Bereiche, die zum Vektor gehören wurden nicht berücksichtigt. 1 GACATGGCTGCCTCTGGAATTAATCCAAAACATGTTGATGATCTCAATTCA

D M A A S G I N P K H V D D L N S 52 ATGGCTGATTACAATGAACCATTAATGGAATTTATGAATTCTTTGCCACAA

M A D Y N E P L M E F M N S L P Q

103 CTAGAAAGAGTTGTTTTAGTGGGACATAGCATGGGTGGCATCAACATATCT

IV. Ergebnisse 111

L E R V V L V G H S M G G I N I S 154 CTTGCCATGGAAAAGTTCCCTCAAAAAATTGTTGTGGCTGTGTTTGTGACA

L A M E K F P Q K I V V A V F V T 205 GCTTTCATGCCTGGTCCTGACCTCAATCTTGTAGCCCTTGGCCAGCAGTAT

A F M P G P D L N L V A L G Q Q Y

256 AATCAACAAGTGGAATCACATATGGATACTGAATTTGTTTACAACAACGGA

N Q Q V E S H M D T E F V Y N N G 307 CAGGATAAAGCCCCCACCTCTCTCGTGTTAGGCCCTGAAGTCTTAGCAACC

Q D K A P T S L V L G P E V L A T 358 AACTTTTATCAACTGTCCCCTCCTGAGGACTTAACTCTTGCAACATATTTG

N F Y Q L S P P E D L T L A T Y L

409 GTGAGACCCGTACCATTGTTCGATGAGTCAATCCTATTGGCAAATACTACA

V R P V P L F D E S I L L A N T T

460 CTTTCAAAAGAGAAATATGGTAGTGTTCATCGTGTTTATGTTGTATGTGACAAA

L S K E K Y G S V H R V Y V V C D K Abb. IV.20.: Ergebnisse der Sequenzierungsreaktion der in pGEM-T eingebauten cDNA. Die daraus abgeleitete

Aminosäuresequenz ist im Einbuchstaben-Code unter der jeweiligen Nucleotidsequenz angegeben.

Peptidsequenzen, die nach der Mikrosequenzierung (vgl. IV.171/IV.1.7.2.) erhalten wurden, sind

unterstrichen.

Aus der oben abgebildeten Aminosäuresequenz wurde ersichtlich, dass durch die RT-PCR tatsächlich das interne cDNA-Fragment der MeJA-Esterase mit einer exakten Größe von 513 bp amplifiziert wurde. Anschließend galt es durch eine RACE-PCR das gesamte cDNA-Fragment zu isolieren.

IV. Ergebnisse 112

2.3. RACE – Isolierung der Volllänge-cDNA und Sequenzanalyse 2.3.1. Prinzip der RACE Dem erhaltenen cDNA-Fragment fehlte sowohl das 5´- als auch das 3´-Ende zur vollständigen cDNA-Sequenz. Um die 5´-und 3´-Enden zu isolieren wurde das „RACE“-System (Rapid Amplification of cDNA Ends – Amplifizierung von cDNA-Enden) verwendet, das eine oft problematische Adapterligation unnötig macht. Der SMART RACE cDNA Amplification Kit arbeitet nach dem Prinzip einer RT-PCR, wobei das SMART II™ Oligonucleotid (Switching Mechanism At 5´end of RNA Transcript) in der Erststrangsynthese an das dC-reiche Ende der cDNA bindet und auf diese Weise als verlängerte Matrize für die Reverse Transkriptase fungiert. Der generelle Ablauf dieses Verfahrens ist in Abb. IV.21. dargestellt. Abb. IV.21.: Schematische Darstellung des Verlaufs von 5´-und 3´-RACE. Die mRNA ist orange, die cDNA blau

gekennzeichnet. Die SMART-Sequenz entspricht dem grauen Balken. Der an diesen Bereich

bindende Primer ist grün und grau gefärbt.

IV. Ergebnisse 113

2.3.2. Erststrangsynthese Die Durchführung der “RACE”-PCR erfolgte nach den Angaben des Herstellers (vgl. III.8.10.). Getrennt für die spätere Amplifizierung der cDNA-Enden wurden ausgehend von 1 µg Poly(A)+-RNA die komplementäre 5´-cDNA bzw. 3´-cDNA synthetisiert. Der Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

5´-RACE cDNA 3´-RACE cDNA 1 µl RNA 1 µl RNA 1 µl 5´-CDS Primer (10 µM) 1 µl 3´-CDS Primer (10 µM) 1 µl SMART II Oligonucleotid (10µM) 2 µl dH2O 2 µl dH2O

SMART II Oligonucleotid: 5´-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3´ 5´-CDS Primer: 5´-(T)25N-1N-3´ 3´-CDS Primer: 5´-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC/T30N-1N-3´ (N = A, C, G, T; N-1 = A, G, C) Zu beiden Reaktionsansätzen wurden nach 3 min Inkubationszeit bei 70 ºC und Abkühlen auf Eis folgende Komponenenten hinzugegeben:

2 µl 5 x Erststrangpuffer 1 µl DTT (20 mM) 1 µl dNTP Mix (10mM) 1 ml Power Script Reverse Transkriptase (200 U/µl)

Beide Reaktionsansätze wurden für weitere 1.5 h zur Synthese der Erststrang-cDNA bei 42 ºC inkubiert. Nach Beendigung der Reaktionszeit wurden beide Ansätze mit 90 µl Tricin-EDTA-Puffer verdünnt und für 7 min auf 72 ºC erhitzt, um die Reaktion zu beenden. 2.3.3. Entwicklung der Primer und Vortest für die 5´- und 3´-RACE-PCR Ausgehend von der Sequenz des internen cDNA-Fragmentes wurden Primer für die 5´- und 3´-„RACE“-PCR entwickelt. Die Primer sollten in der Mitte des Sequenzstückes liegen, damit zu den 5´- und 3´-Enden hin amplifiziert werden konnte. Aus einer konservierten Region sollten sie hingegen nicht abgeleitet werden, da sonst die Gefahr bestand auch ähnliche Gene zu klonieren. Zusätzlich war ein in

IV. Ergebnisse 114

der Mitte überlappender Bereich von etwa 100 bp wichtig, um beide Fragmente nach der Amplifikation des 5´- und 3´-Endes zu einer Sequenz zusammenfügen zu können. Beide RACE-Primer sind in Abb. 22. mit den homologen Aminosäuren dargestellt, von denen sie abgeleitet wurden. Peptidsequenz für RACE for (vgl. IV.2.2.3.)

V T A F M P G

Spezifischer Primer RACE for

GTG ACA GCT TTC ATG CCT GG

Peptidsequenz für RACE for (vgl.IV.2.2.3.)

V Y N N G Q D

Spezifischer Primer RACE rev

ATC CTG TCC GTT GTT GTA AAC

Abb. IV.22.: Aminosäuresequenzen und die davon abgeleiteten Nucleinsäuresequenzen. In den Kästen unter

der Aminosäure-Sequenz sind die zur Primersynthese verwendeten Nucleinsäuresequenzen

abgebildet.

Da nur eine begrenzte Anzahl an Reaktionen für 5´- und 3´-RACE-PCR zur Verfügung standen, wurden die entwickelten Primer erst in einem Vortest überprüft. Hierbei wurde die spezifische Bindung der Primer an die Matrize getestet und die optimale Temperatur für die PCR ermittelt. Als Matrize wurde ein Plasmid des internen cDNA-Fragmentes eingesetzt (vgl. IV.2.2.3.). Durch die PCR mit den Primern RACE for und RACE rev sollte ein Fragment mit einer Größe von 114 bp amplifiziert werden. Die Reaktionsansätze für den Vortest der 5´- und 3´-RACE-PCR setzten sich wie folgt zusammen: Plasmid (1 ng/µl) 2 µl Primer RACE for (100 pmol) 1 µl Primer RACE rev (100 pmol) 1 µl 25 mM MgCl2 1 µl 2 mM dNTP-Mix 2 µl 10 x PCR Reaktionspuffer 2 µl

IV. Ergebnisse 115

dH2O 10 µl Taq-Polymerase (1 U/µll) 1 µl Folgendes Temperaturprofil wurde für den Vortest der RACE-PCR verwendet: Denaturierung 5 min 94 °C 1 x Denaturierung 1 min 94 °C Anlagerung der Primer 1 min 55 – 70 °C

(Gradient) 30 x

Polymerisation 1.5 min 72 °C Polymerisation 5 min 72 °C 1 x Um die optimale Temperatur für die Anlagerung der Primer an die Matrize herauszufinden, wurde ein Temperaturgradient gefahren. Hierbei durchliefen zwölf Reaktionsansätze parallel im Thermocycler oben stehendes Temperaturprofil. Der Unterschied in den Reaktionszyklen bestand darin, dass für jeden der zwölf Reaktionsansätze während der Anlagerung der Primer eine andere Temperatur gewählt wurde. Der Temperaturgradient durchlief somit einen Bereich von 55–70 °C. Nach Ablauf des PCR-Programmes wurden die amplifizierten DNA-Fragmente mit einem 2.5 %igen Agarosegel nach III.8.3.1. analysiert. Abb.IV.23. zeigt das Ergebnis des Vortest der RACE-PCR. Abb. IV.23. zeigt das Ergebnis des Vortest der RACE-PCR. Als Matrize wurde das Plasmid des internen cDNA-

Fragmentes verwendet (vgl.IV.2.2.3.) Die PCR-Produkte des Temperaturgradienten von 55 – 70 °C

wurden mit den Primern RACE for und RACE rev erzeugt. Spur M: Größenstandard, Spur 1-12:

Generierung eines 114 bp Fragment im Temperaturgradient von 55 – 70 °C. Da in den Spuren 1-12

das erwartete 114 bp Fragment entstanden war, konnte gezeigt werden, dass sich die Primer

spezifisch an die Matrize anlagerten. Die optimale Temperatur für die Anlagerung der Primer in der

PCR-Reaktion lag bei einer Temperatur von 70 °C.

IV. Ergebnisse 116

Aus Abb. IV.23. lässt sich erkennen, dass die PCR-Reaktion für das gesamte Temperaturintervall von 55-70 °C erfolgreich durchgeführt wurde. Der Reaktionsansatz, in dem als Kontrolle nur die beiden Primer eingesetzt wurden, zeigte kein PCR-Produkt (nicht abgebildet). Es war deshalb nicht zu befürchten, dass die Primer auch ohne Matrize amplifiziert wurden. Der Temperaturgradient ließ erkennen, dass eine Bindung der Primer an die Matrize umso spezifischer war, umso höher die Temperatur für die Anlagerung der Primer gewählt wurde. Zwischen 55 °C und 60 °C waren im Agarosegel zusätzlich schwache Banden mit einer Größe abweichend vom erwarteten 114 bp Fragment zu sehen. Um nun in der RACE-PCR zur Amplifikation des 5´- und 3´-Endes ein hochspezifisches Produkt zu erhalten wurde als Temperatur zur Anlagerung der Primer 68 °C und 70 °C gewählt. 2.3.4. Amplifizierung der cDNA-Enden (Zweitstrangsynthese) Die Amplifizierung von 3´-cDNA-Enden setzte eine Erststrangsynthese mit einem OligodTAdapterprimer voraus. Die Verwendung von genspezifischen Primern in Kombination mit zueinander komplementären Adapterprimern in aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen ermöglichte dann die selektive Amplifizierung von cDNA-Enden des entsprechenden Zieltranskriptes. Zur Zweitstrangsynthese wurden folgende Komponenten zu einem PCR-Ansatz gemischt: 5´- RACE 3´-RACE 5´-RACE-cDNA 2.5 µl 3´-RACE-cDNA 2.5 µl Universal Primer Mix (UPM) (10 x) 5 µl 5 µl Primer RACE rev 1 µl Primer RACE for 1 µl 10 x PCR-Reaktionspuffer 5 µl 5 µl 10 mM dNTP Mix 1 µl 1 µl dH2O 34.5 µl 34.5 µl 50 x Advantage 2 Polymerase Mix 1 µl 1 µl UPM: 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3´ 5´-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3´ Dabei wurde die vom Hersteller empfohlene „touch down“-PCR angewandt. In einem Gradienten wurden 2 Stufen abfallender Temperatur (70°C und 68°C) für die Hybridisierung der Oligonucleotide mit der zu amplifizierenden DNA verwendet.

IV. Ergebnisse 117

Folgendes Temperaturprofil wurde für die 5´- und 3´-RACE verwendet: Denaturierung 30 sec 94 °C 5x 3 min 72 °C Denaturierung 30 sec 94 °C Anlagerung der Primer 30 sec 70 °C 5 x Polymerisation 3 min 72 °C Denaturierung 30 sec 94 °C Anlagerung der Primer 30 sec 68 °C 25 x Polymerisation 3 min 72 °C Nach Ablauf des PCR-Programmes wurden die PCR-Produkte mit einem 1 %igen Agarosegel nach III.8.3.1. analysiert. Abb. IV.24. zeigt das Ergebnis der 5´- und 3´-RACE. Abb. IV.24.: Amplifizierung der 5´- und 3´-cDNA-Enden mittels RACE-PCR. Spur 1: Marker, Spur 2: 3´-RACE

(etwa 650 bp, erwartete Größe etwa 480 bp), Spur 3: 5´-RACE (etwa 550 bp, erwartete Größe etwa

430 bp). Die aufgetrennten Fragmente weichen aufgrund der nicht bekannten Größe untranslatierter

cDNA-Bereiche von der Größe der tatsächlich erwarteten Fragmente (vgl. Abb. IV. 24) ab.

Nachdem Datenbankvergleiche der Peptidsequenzen (vgl. IV.1.7.1./IV.1.7.2.) der MeJA-Esterase hohe Homologien zu anderen Hydrolasen aufzeigten und alle Hydrolasen ähnliche Längen der Nucleotidsequenzen (etwa 750 bp–850 bp) hatten, wurde davon ausgegangen, dass die Nucleotidsequenz der MeJA-Esterase etwa 800 bp beträgt. Das PCR-Produkt der 3´-RACE sollte eine Größe von etwa 480 bp haben während das PCR-Produkt der 5´-RACE etwa 430 bp groß sein sollte. Die abweichenden Größen von etwa 650 bp für das 3´-RACE-Produkt und etwa 550 bp

für das 5´-RACE-Produkt sind auf untranslatierte cDNA-Bereiche zurückzuführen, deren Größe unbekannt ist. In Abb. IV.25. ist schematisch die Lage der einzelnen

IV. Ergebnisse 118

cDNA-Fragmente, die erwartete Größe der klonierten 5´- und 3´-RACE cDNA-Fragmente und die während der Klonierung verwendeten Primer angegeben.

Abb. IV.25.: Schematische Darstellung der klonierten MeJA-Esterase Fragmente. Angegeben sind die

verwendeten Primer und die erwartete Größe der Fragmente, sowie die relative Lage der

Fragmente zueinander.

2.3.5. Subklonierung und Sequenzierung der 5´- und 3´-RACE cDNA-Fragmente Nach Vergleich von Abb. IV.25. mit den erwarteten Größen der klonierten 5´- und 3´-RACE cDNA-Fragmente, konnte davon ausgegangen werden, dass die richtigen Produkte amplifiziert wurden. Außerdem sollte es sich um spezifische PCR-Produkte handeln, da auf dem Agarosegel keine weiteren Banden zu sehen waren. Deshalb wurden die DNA-Fragmente nach III.8.2.6. aus dem Agarosegel eluiert und das maximal mögliche Eluat (7 µl) zur Ligation (vgl. III.8.9.2.) in den Klonierungsvektor pGEM-T eingesetzt. Der gesamte Ligationsansatz wurde zur Transformation kompetenter E. coli Top 10 F (vgl. III.8.6.1.) verwendet und transformierte Bakterien (vgl. III.8.6.2.) auf Agarplatten unter Ampicillin-Selektion angezogen (vgl. II.3.). Zum Test auf positive Transformanten wurde mit den Primern SP6ht und T7ht (vgl. II.6.) ein Reihentest in Form einer PCR (vgl. III.8.8) durchgeführt. Hierfür wurden jeweils 12 Bakterienkolonien der 5´- und 3´-RACE mittels einer Pipettenspitze in 20 µl destilliertes Wasser überführt und als Matrize in einer PCR verwendet. Da mehr als die Hälfte aller Klone im Reihentest positiv waren, wurden positiv getestete Klone sequenziert. Allerdings war es nicht möglich die Banden des Sequenziergeles

IV. Ergebnisse 119

auszuwerten. Die Banden, die mit den Primern T7ht und SP6ht erhalten wurden, waren zu schwach für eine Detektion mit dem Auswerteprogramm. Deshalb wurden die 5´- und 3´-RACE cDNA-Fragmente in den Klonierungsvektor pDrive eingeführt. Der Vektor pDrive unterscheidet sich vom Vektor pGEM-T insofern, als dass zur Sequenzierung (vgl. III.9.) andere Primer (Primer M13 forward und M13 universal (vgl. II.6.) verwendet werden konnten. Bis zur Sequenzierung wurde bei Ligation, Transformation und Reihentest ebenso wie mit dem Klonierungsvektor pGEM-T verfahren. Unter Verwendung der Primer M13 forward und M13 universal (vgl. II.6.) war die Sequenzierung (vgl. III.9.) erfolgreich. 3. Übersicht über die Klonierung der MeJA-Esterase In Abb. IV.26. ist die Klonierung der Volllänge-cDNA der MeJA-Esterase schematisch zusammengefaßt. Abb. IV.26.: Übersicht über die Klonierung der Volllänge cDNA der MeJA-Esterase (MJE).

IV. Ergebnisse 120

4. Nucleotid- und Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase Die vollständige Nucleotidsequenz der MeJA-Esterase umfasste einen offenen Leserahmen von 786 bp. Die davon abgeleitete Aminosäuresequenz codierte ein offenes Leseraster für ein Protein von 262 Aminosäuren. Abb. IV.24 zeigt die vollständige cDNA der MeJA-Esterase. 1 ATGGAAAAGGGTGATAAAAATCACTTTGTACTAGTTCATGGAGCTTGTCAT M E K G D K N H F V L V H G A C H 51 GGTGCATGGTGTTGGTACAAAGTTGTGACAATTCTAAGAAGTGAAGGACAC G A W C W Y K V V T I L R S E G H 101 AAAGTTAGTGTTCTTGACATGGCTGCCTCTGGAATTAATCCAAAACATGTT K V S V L D M A A S G I N P K H V 151 GATGATCTCAATTCAATGGCTGATTACAATGAACCATTAATGGAATTTATG D D L N S M A D Y N E P L M E F M 201 AATTCTTTGCCACAACTAGAAAGAGTTGTTTTAGTGGGACATAGCATGGGT N S L P Q L E R V V L V G H S M G 251 GGCATCAACATATCTCTTGCCATGGAAAAGTTCCCTCAAAAAATTGTTGTG

G I N I S L A M E K F P Q K I V V 301 GCTGTGTTTGTGACAGCTTTCATGCCTGGTCCTGACCTCAATCTTGTAGCC

A V F V T A F M P G P D L N L V A 351 CTTGGCCAGCAGTATAATCAACAAGTGGAATCACATATGGATACTGAATTT

L G Q Q Y N Q Q V E S H M D T E F 401 GTTTACAACAACGGACAGGATAAAGCCCCCACCTCTCTCGTGTTAGGCCCT V Y N N G Q D K A P T S L V L G P 451 GAAGTCTTAGCAACCAACTTTTATCAACTGTCCCCTCCTGAGGACTTAACT E V L A T N F Y Q L S P P E D L T 501 CTTGCAACATATTTGGTGAGACCCGTACCATTGTTCGATGAGTCAATCCTA L A T Y L V R P V P L F D E S I L 551 TTGGCAAATACTACACTTTCAAAAGAGAAATATGGTAGTGTTCATCGTGTT

L A N T T L S K E K Y G S V H R V 601 TATGTTGTATGTGACAAGGACAATGTGCTCAAGGAACAACAATTCCAAAAG Y V V C D K D N V L K E Q Q F Q K 651 TGGTTGATTAACAATAATCCACCAGATGAGGTCCAGATAATTCACAATGCA W L I N N N P P D E V Q I I H N A 701 GACCATATGGTCATGTTCTCTAAACCTAGGGATCTTTCTTCTTGTCTTGTT D H M V M F S K P R D L S S C L V

IV. Ergebnisse 121

751 ATGATTTCGCAAAAATATTATTGA M I S Q K Y Y X Abb. IV.27.: Nucleotidsequenz (cDNA Klon MJE1) der MeJA-Esterase mit einer Gesamtlänge von 786 bp. Es

besteht ein durchgehendes Leseraster, das für ein Protein aus 262 Aminosäuren codiert. Die Zahlen

links geben die Nucleotid-Position an.

Die aus der isolierten cDNA der MeJA-Esterase abgeleitete Aminosäuresequenz enthielt alle ermittelten Aminosäuresequenzen der durch Proteaseverdau erhaltenen Peptide. Mit der erhaltenen kompletten cDNA- und Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase konnten Datenbankvergleiche mit dem Programm FASTA (vgl. III.10.) durchgeführt werden. Auch hier wurden, wie unter IV. 1.8. bereits beschrieben hohe Homologien zu Esterasen und Hydroxynitrillyasen aufgefunden. Tab. IV. 6 gibt die Übereinstimmung von Aminosäuresequenzen verschiedener Hydrolasen mit der MeJA-Esterase-Sequenz an. Zu weiteren zehn putativen Proteinen aus A. thaliana war die Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase zwischen 43 % und 47 % identisch. Ein Homologievergleich wurde hingegen nur mit schon charakterisierten Proteinen durchgeführt. Hydrolase Pflanzenspezies Identität Ethylen-induzierte Esterase Citrus sinensis 47 % Polyneuridinaldehydesterase Rauvolfia serpentina 44 % Pseudomonas-induziertes Protein Oryza sativa 43 % Hydroxynitrillyase Hevea brasiliensis 36 % Hydroxynitrillyase Manihot esculenta 33 %

Tab. IV. 6.: Übereinstimmung der Aminosäuresequenz verschiedener Hydrolasen mit der MeJA-Esterase-

Sequenz.

5. Experimente zur Untersuchung des MeJA-Esterasegens Zur Abschätzung der Kopienzahl der zum Protein der MeJA-Esterase korrespondierenden Gene wurde eine Southern-„Blot“ Analyse durchgeführt. Dazu wurde zunächst aus einer vier Tage alten L. esculentum Zellsuspensionskultur nach III.8.2.4. genomische DNA isoliert und davon 20 µg, wie unter III.8.9.1. beschrieben, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten. Am nächsten Tag konnte die hydrolysierte DNA in einem 0.8 %igen Agarosegel (vgl. III.8.3.1.) aufgetrennt werden. Die genomische DNA wurde anschließend auf eine Nylonmembran transferiert. Die exakte Durchführung des Kapillarblots wurde in III.8.4.2.

IV. Ergebnisse 122

beschrieben. Zur Hybridisierung des Southern-„Blots“ wurde der nach III.8.5.1. vollständig mit DIG-11-dUTP markierte Leserahmen des MeJA-Esterase cDNA-Klons verwendet. Abb. IV.26. zeigt den Southern-„Blot“ des MeJA-Esterase cDNA-Klons nach Hybridisierung bei 68 ºC. Abb. IV.28.: Nachweis der Kopienzahl des MeJA-Esterasegens im Genom vom L. esculentum. Genomische

DNA (20 µg) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespalten. Für die

Hybridisierung wurde als Sonde das 786 bp große Volllänge-Fragment verwendet. Spur M:

Größenstandard, Spur 1: Unverdaute cDNA, Spur 2: Restriktionsverdau mit EcoRI, Spur 3:

Restriktionsverdau mit HindIII. Die cDNA-Sequenz der MeJA-Esterase wies eine Erkennungsstelle

für EcoRI und keine Erkennungsstelle für HindIII auf. Somit wurden beim Verdau mit EcoRI zwei

Banden erwartet, während beim Verdau mit HindIII eine Bande im Southern Blot zu sehen sein

sollte. Die verdaute genomische DNA hingegen hybridisierte mit sieben Fragmentem im Fall des

Verdaus mit EcoRI und mit vier Fragmentem bei der mit HindIII verdauten Probe.

Die cDNA-Sequenz der MeJA-Esterase aus L. esculentum enthielt für die Restriktionsendonuklease HindIII keine Erkennungsstellen. Mit EcoRI konnte die cDNA-Sequenz jedoch einmal an Position 204 (vgl. IV.3.) geschnitten werden, so dass im Southern Blot mindestens zwei Banden zu sehen sein sollten. Die verdaute genomische DNA hingegen hybridisierte mit sieben Fragmenten im Fall des Verdaus mit EcoRI und mit vier Fragmentem bei der mit HindIII verdauten Probe (vgl. Abb. IV.28.).

IV. Ergebnisse 123

6. Klonierung eines Expressionskonstruktes der MeJA-Esterase Als Grundlage für eine biochemische Charakterisierung der MeJA-Esterase wurde die cDNA-Sequenz in einen Vektor der pQE-Serie (Qiagen) kloniert. Das nach der Expression erhaltene Protein sollte über Metallaffinitätschromatographie gereinigt und biochemisch charakterisiert werden. IV. 6.1. Entwurf spezifischer Primer zur Klonierung eines Expressions-

konstruktes der MeJA-Esterase Da vor dem Start- und nach dem Stopcodon der cDNA-Sequenz keine Erkennungsstellen für passende Restriktionsenzyme vorhanden waren, wurde der Bereich der cDNA-Sequenz, der für die MeJA-Esterase codierte (cDNA-Klons MJE1, vgl. IV.3.) mit Hilfe der PCR amplifiziert. Die für die Amplifikation nötigen Oligonucleotidprimer waren zum N- bzw. C-Terminus des MeJA-Esterasegens homolog und wurden so konstruiert, dass sie unmittelbar vor und nach der codierenden Sequenz eine SpHI (GCATGC) bzw. BamHI- (GGATCC) Schnittstelle enthielten. In Tabelle IV.7. sind die entsprechenden Primer abgebildet.

Primer Nucleotidsequenz full MJEfor MQ 5´- GCATGCAGGGTGATAAAAATCACTTTGTA-3´

full MJE rev 5´- AAGGATCCATAATATTTTTGCGAAATC-3´ Tab. IV.7.: Zusammenstellung der Oligonucleotidprimer zur Amplifikation des Leserahmens des cDNA-Klons

der MeJA-Esterase

Die Konstruktion der genspezifischen Primer erfolgte mit Hilfe der Vector NTI 4.0 Deluxe Software (vgl. III.9.). Denn es hatte sich gezeigt, dass der Primer full MJEfor MEK, der zuerst ohne zu Hilfenahme eines Computerprogrammes entworfen wurde, nicht zur Amplifizierung der cDNA der MeJA-Esterase geeignet war. Nach einer RT-PCR unter Verwendung des Primers full MJEfor MEK konnte kein PCR-Produkt identifiziert werden. Deshalb wurde der Anfang des Primers full MJEfor MEK abgewandelt und Primer full MJEfor MQ hergestellt. In Tabelle IV.8. sind die entsprechenden Primer und ihre Nucleotidsequenzen bzw. abgeleiteten Aminosäuresequenzen dargestellt.

IV. Ergebnisse 124

Primer Nucleotidsequenz/ Aminosäuresequenz

full MJEfor MEK

AAGCATGGAAAAGGGTGATAAAAATC

M E K G D K N

full MJEfor MQ

GCATGCAGGGTGATAAAAATCACTTTGTA M Q G D K N H F

Tab. IV.8.: Gegenüberstellung der Primer full MJEfor MEK und full MJEfor MQ, die zur Amplifizierung der cDNA

der MeJA-Esterase hergestellt wurden. Hervorgehoben wurden Bereiche der Nucleotid- und

Aminosäuresequenz, die verändert wurden, um anschließend in einer RT-PCR eine Bindung der

Primer an die Matrize zu testen.

Mittels einer RT-PCR (vgl. III.8.9.4.) wurde die Bindung der Primer an die Matrize getestet und in einem 1 %igen Agarosegel (vgl. III.8.3.1.) aufgetrennt (vgl. Abb. IV.29.). Abb. IV.29.: PCR-Produkt nach einer RT-PCR mit dem abgewandelten Primer full MJEfor MQ und Primer full

MJErev. Spur M: Größenstandard, Spur 1: erwartetes 786 bp Fragment. Primer full MJEfor MQ und

Primer full MJErev erzeugten das gesuchte 786 bp Fragment, während mit Primer full MJEfor MEK

und Primer full MJErev kein Produkt amplifiziert werden konnte (nicht abgebildet).

6.2. Amplifizierung der Volllänge cDNA und Subklonierung Gesamt-RNA, die nach der Lithiumchlorid-Methode (vgl. III.8.2.1.) gereinigt worden war, wurde zur Synthese der komplementären Erststrang-cDNA mit dem Primer full MJE rev in einer Reversen Transkription (vgl. III.8.9.4.) eingesetzt.

IV. Ergebnisse 125

Der Reaktionsansatz setzte sich wie folgt zusammen: Gesamt-RNA (10 µg) 5 µl Primer full MJErev (10 pmol) 1 µl 2.5 mM dNTP-Mix 2 µl 5 x Reaktionspuffer 2 µl dH2O 9 µl M-MLV-RT 1 µl Eine anschließende PCR-Reaktion erfolgte mit 1 µl DNA-Matrize und den Primern full MJEfor MQ und full MJErev. Der Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung: Erststrang-cDNA-Lösung 5 µl Primer full MJEfor MQ (10 pmol) 3 µl Primer full MJErev (10 pmol) 3 µl 2.5 mM dNTP-Mix 1 µl 10 x Reaktionspuffer 5 µl dH2O 32.2 µl Taq-Polymerase 0.5 µl Pfu-Polymerase 0.3 µl Folgendes Temperaturprofil wurde für die PCR verwendet: Denaturierung 1 min 95 °C 1 x Denaturierung 10 sec 95 °C Anlagerung der Primer 20 sec 50 °C 30 x Polymerisation 3 min 72 °C Polymerisation 5 min 72 °C 1 x Nach Beendigung des PCR-Programmes wurden nochmals 0.5 µl Taq-Polymerase zum Reaktionsansatz hinzugefügt und für weitere 10 min bei 72 °C inkubiert. Die amplifizierten PCR-Produkte konnten mit einem 1 %igen Agarosegel nach III. 8.3.1. analysiert werden.

IV. Ergebnisse 126

Abb. IV.30.: A) PCR-Produkt nach einer RT-PCR mit Primer full MJEfor MQ und Primer full MJErev. Spur M:

Größenstandard, Spur 1: erwartetes 786 bp Fragment. Das amplifzierte PCR-Produkt entsprach mit

einer Größe von 786 bp dem MeJA-Esterase Volllänge-Klon und wurde zur Subklonierung in den

Vektor pDrive verwendet. B) Restriktionsanalyse des 786 bp Fragments im Vektor pDrive mit BamHI und SpHI zur

Identifizierung positiver Klone nach Subklonierung. Spur M: Größenstandard, Spur 1: PCR-

Fragment mit einer Größe von etwa 800 bp (erwartet: 786 bp) nach Restriktionsverdau des Vektors

pDrive mit BamHI und SpHI. Zu beachten ist, dass das Fragment bereits für die Ligation

ausgeschnitten worden war. Der Pfeil gibt die Lage der erwarteten Bande von 786 bp wieder.

Die Auftrennung im Agarosegel zeigte ein PCR-Produkt mit etwa 800 bp, das in der Größe dem erwarteten MeJA-Esterase Klon mit 786 bp entsprach (vgl. Abb. IV.30.A.). Zur Subklonierung wurde das PCR-Fragment nach III.8.3.1. aus dem Gel eluiert und anschließend 1 µg der cDNA über Nacht bei 15 °C in 10 ng des Vektors pDrive ligiert (vgl. III.8.9.2.). Am nächsten Tag wurde der gesamte Ligationsansatz zur Transformation (vgl. III.8.6.2.) kompetenter E. coli Top 10 F (vgl. III.8.6.1.) verwendet, und transformierte Bakterien anschließend auf LB-Platten unter Ampicillin-Selektion angezogen (vgl. II.3.). Zur Verifizierung der klonierten cDNA wurde zuerst ein Restriktionsverdau (vgl. III.8.9.1.) mit BamHI und SpHI durchgeführt. Da durch die beiden Primer full MJEfor MQ und full MJErev entsprechende Schnittstellen am 5´- und 3´-Ende der Sequenz eingeführt worden waren, sollten sich auf diese Weise positive Klone identifizieren lassen. Abb. IV.30.B. zeigt das mittels Restriktionsverdau erhaltene Bandenmuster. Wie erwartet hatte der geöffnete Vektor pDrive eine Größe von 3.85 kb und das ausgeschnittene Fragment eine Größe von 786 bp. Der Leserahmen des durch Restriktionsverdau verifizierten Klones W65 wurde mittels Sequenzierung (vgl. III.9.) kontrolliert und die erhaltene Sequenz abschließend bestätigt. Die Nucleotidsequenz entsprach der des Klons MJE1 (vgl. IV.3.) mit Ausnahme des abgewandelten 5´-Endes, das durch die Sequenz des Primers full MJEfor MQ (Tab. IV.7.) ersetzt wurde.

IV. Ergebnisse 127

6.3. Konstruktion des Expressionsvektors Als Expressionsvektor wurde pQE70 (3431 bp) ausgewählt. Der Vektor besitzt den T5-Promotor PN25 (GENTZ und BUJARD, 1985), zwei lac-Operatorserkennungs-sequenzen und eine synthetische ribosomale Bindungsstelle, die auf hohe Expressionsraten in E. coli optimiert ist. Die Multiklonierungsstelle, bestehend aus den Restriktionsschnittstellen für SpHI, BamHI und BglII, ermöglicht die Ligation von cDNA-Fragmenten in den Vektor unter Beibehaltung des Leserahmens und führt zu einer C-terminalen Fusion des rekombinanten Proteins mit sechs Histidinen. Die Sequenz ATG der SpHI Restriktionssequenz dient als Startcodon für den offenen Leserahmen der MeJA-Esterase. Das auf den Leserahmen verkürzte Konstrukt der MeJA-Esterase (vgl. IV.5.2.) sollte über die Restriktionsschnittstellen BamHI und SpHI in den ebenfalls mit BamHI und SpHI verdauten 3.43 kb großen Epressionsvektor pQE70 eingeführt werden. Da zur Subklonierung aufgrund der zuvor aufgetretenen Sequenzierungsprobleme allerdings der Vektor pDrive ausgewählt worden war, umfasste die Vorbereitung des MeJA-Esterase Konstruktes für die Ligation in pQE70 zwei Schritte. Denn der Vektor pDrive besaß in seiner Multiklonierungsstelle zusätzlich zu den BamHI und SpHI Restriktionsstellen des MeJA-Esterase Konstruktes eigene BamHI und SpHI Restriktionsstellen (vgl.Abb. 31). Deshalb musste während des Restriktionverdaus mit BamHI und SpHI ausgeschlossen werden, dass sich der Leserahmen der MeJA-Esterase verschob. Dieser Fall hätte eintreten können, wenn die Restriktionsenzyme den Vektor an nicht allen möglichen Schnittstellen verdaut worden wären. Abb. IV.31.: Vektorkarte des Vektors pDrive (4646 bp) mit 786 bp Fragment, das für die MeJA-Esterase codiert.

Hervorgehoben sind die doppelten Restriktionsstellen für BamHI und SpHI, wodurch die

Vorbereitung des MeJA-Esterase Konstruktes für die Ligation in den Vektor pQE70 einen

Restriktionsverdau in zwei Schritten erforderte.

IV. Ergebnisse 128

Die für die MeJA-Esterase codierende DNA-Sequenz wurde aus dem Vektor pDrive ausgeschnitten und in den Expressionsvektor pQE70 ligiert, indem der Restriktionsverdau mit den Enzymen BamHI und SpHI in zwei Schritten durchgeführt wurde. In einem ersten Restriktionsverdau (vgl. III.8.9.1.), wurde der Klon MJEW65 mit dem Restriktionsenzym BamHI geöffnet, in einem 1%igen Agarosegel (vgl. III.8.3.1.) aufgetrennt und aus dem Gel nach III.8.2.6. eluiert. Das ausgeschnittene cDNA-Fragment MJEW65 musste hierauf über eine Alkalische Phosphatase dephosphoryliert (vgl. III.8.9.3.) werden, um in den Vektor pQE70 ligiert werden zu können. Die Ligation (vgl. III.8.9.2.) erfolgte über Nacht. Am nächsten Tag wurde der gesamte Ligationsansatz in kompetente E. coli-Zellen transformiert (vgl. III.8.6.2.) Nach Inkubation bei Raumtemperatur wurden 50 verschiedene Bakterienkolonien entnommen und im Reihentest mittels PCR (vgl. III.8.8.) unter Verwendung der Primer full MJEfor MQ und full MJErev auf das gewünschte cDNA-Fragment MJEW65 überprüft. 13 Bakterienkolonien erwiesen sich im Reihentest als positiv. Hiervon wurden 6 Klone über Nacht für eine Minipräparation (vgl. III.8.2.5.1.) angezogen. Nach Isolierung der Plasmide wurde die Orientierung des cDNA-Fragmentes MJEW65 im Vektor pQE70 über einen Restriktionsverdau (vgl. III.8.9.1.) mit EcoRI überprüft. Die Orientierung des Fragmentes MJEW65 im Vektor pQE70 wurde als richtig erachtet, wenn im Restriktionsverdau auf dem Agarosegel eine Vektorbande mit etwa 4.43 kb und eine cDNA-Bande mit etwa 100 bp zu sehen war. Ein falscher Einbau des Fragmentes MJEW65 im Vektor pQE70 sollte auf dem Agarosegel eine Vektor-Bande mit etwa 4.0 kb und cDNA-Bande mit etwa 600 bp erkennen lassen. Möglich wurde eine Überprüfung der Orientierung des cDNA-Fragmentes MJEW65 im Vektor pQE70 durch drei EcoRI Schnittstellen, die unsymmetrisch über Vektor und Konstrukt verteilt waren. Abb. IV.32. zeigt das Ergebnis des Restriktionsverdaus mit EcoRI.

IV. Ergebnisse 129

Abb. IV.32.: Restriktionsanalyse des Vektors pQE70 in den das Fragment MJEW65 ligiert wurde (pQE70-

MJEW65 Konstrukt), nachdem es aus dem Vektor pDrive über BamH ausgeschnitten worden

war. Die Restriktionsanalyse wurde mit EcoRI durchgeführt und sollte die Orientierung des

Fragmentes MJEW65 im Vektor pQE70 überprüfen. Spur M1: 100 bp Größenstandard, Spur 1-6:

Restriktionsverdau des pQE70-MJEW65 Konstruktes mit EcoRI (verschiedende Klone), Spur 1:

Klon 5, Spur 2: Klon 9, Spur 3: Klon 10, Spur 4: Klon 11, Spur 5: Klon 13, Spur 6: Klon 17, Spur

M2: 100 bp Größenstandard. Wie erwartet war eine Vektorbande mit 4.43 kb und eine cDNA-

Bande mit etwa 100 bp zusehen (siehe Pfeil in der Graphik). Alle Klone bis auf Klon 13 (Spur 5)

zeigten die richtige Orientierung im Vektor pQE 70.

Die Überprüfung der Orientierung des Fragmentes MJEW65 im Vektor pQE70 ergab, dass alle Klone bis auf Klon 13 (Spur 5) die richtige Lage im Vektor zeigten. Klon 13 wurde wahrscheinlich unvollständig verdaut. Alle positiven Klone (5, 9, 10, 11 und 17, vgl. Abb. IV.32, Spur 1,2,3,4 und 6) wurden zur Isolierung des Plasmides durch Minipräparation (vgl. III.8.2.5.1.) über Nacht unter Standardbedingungen angezogen. Isoliertes Plasmid wurde nun in einem zweiten Schritt einem Restriktionsverdau (vgl. III.8.9.1.) mit SpHI unterzogen. Hierdurch wurde der etwa 4.23 kb große Vektor linearisiert. Ein Fragment mit einer Größe von etwa 50 bp, das durch die beiden SpHI Schnittstellen generiert wurde, konnte aus dem Vektor herausgeschnitten werden. Abb. IV.33. zeigt das Ergebnis des Restriktionsverdaus nach Auftrennung in einem 1 %igen Agarosegel (vgl. III.8.3.1.).

IV. Ergebnisse 130

Abb. IV.33.: Restriktionsanalyse des Vektors pQE70 in den das Fragment MJEW65 ligiert wurde mit SpHI. Spur

M1: 100 bp Größenstandard, Spur 1-5: Restriktionsverdau des pQE70-MJEW65 Konstruktes mit

SpHI, Spur M2: 1 kb Größenstandard. In allen Spuren war wie erwartet eine Vektorbande mit 4.2 kb

(markiert durch weißen Pfeil oben) und eine cDNA-Bande mit etwa 50 bp (markiert durch weißen

Pfeil unten) zu sehen. Allerdings wurden Klon 9 (Spur 2) und 11 (Spur 4) unvollständig verdaut. Die

Restriktionsanalyse bestätigte die Linearisierung des Vektors und Entfernung der zweifachen SpHI-

Schnittstelle. Zu beachten ist, dass das Fragment (4.2 kb) bereits für die Ligation ausgeschnitten

worden war.

Aus Abb. IV.33. ist zu erkennen, dass das 50 bp Fragment bei allen Klonen herausgeschnitten werden konnte, jedoch nur bei den Klonen 5 (Spur 1), 10 (Spur 3) und 17 (Spur 5) ein vollständiger Verdau und damit eine Linearisierung des Vektors stattgefunden hatte. Im Folgenden wurde nur noch mit Klon Nr. 5 (Spur 1) weiter gearbeitet. 50 ng des linearisierten Vektors wurden in einer Ligation nach III.8.9.2. eingesetzt. Das Ligationsprodukt wurde anschließend in kompetente E. coli Top 10 transformiert (vgl. III.8.6.2.). Nach Inkubation unter Standardbedingungen wurden 2 verschiedene Kolonien entnommen, Plasmide mittels Minipräparation (vgl. III.8.2.5.1.) isoliert und in einer Restriktionsanalyse untersucht. Die Restriktionsanalyse wurde zum einen mit dem Restriktionsenzym BamHI, zum anderen in einem Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen BamHI und SpHI durchgeführt. Erhaltenen Fragmente wurden über ein 1 %iges Agarosegel (vgl. III.8.3.1.) analysiert. Wie erwartet wurde das Plasmid des Klon Nr. 5 durch den Restriktionsverdau mit BamHI linearisiert, während durch den Restriktionsverdau mit BamHI und SpHI das 786 bp Fragment herausgeschnitten wurde, das für die MeJA-Esterase codierte.

IV. Ergebnisse 131

7. Übersicht über die Konstruktion des Expressionsvektors Abb. IV.34. : Konstruktion des Expressionsvektors für die MeJA-Esterase. Die codierende cDNA-Sequenz

wurde aus dem Vektor pDrive ausgeschnitten und in den Expressionsvektor pQE70 ligiert, indem

der Restriktionsverdau mit den Enzymen BamHI und SpHI in zwei Schritten durchgeführt wurde.

IV. Ergebnisse 132

8. Protein-Überexpression und chromatographische Reinigung der MeJA-Esterase

8.1. Protein-Überexpression Nachdem die Klonierung der MeJA-Esterase in den Expressionsvektor pQE70 erfolgreich abgeschlossen worden war, sollten sich Überexpression und Reinigung des Proteins aus Escherichia coli anschließen. Obgleich per definitionem Überexpression die erhöhte Expressionsrate- bzw. Transkriptionsrate eines Genes bedeutet, soll im Folgenden der Begriff Überexpression erweitert und generell die vermehrte Bildung eines bestimmten Proteins in transformierten E. coli über die natürliche Konzentration hinaus im Vergleich zu Wildtyp E. coli verwendet werden. Zur Protein-Überexpression der MeJA-Esterase wurde 1 ng des rekombinanten Vektors (vgl. IV.5.3.) in den Expressionsstamm E. coli M15 (vgl. II.2.) transformiert (vgl. III.8.6.2.) und auf Ampicillin und Kanamycin (vgl. II.3.) selektioniert. Die Genexpression im pQE70 Vektor ist durch den Lac-Repressor reprimierbar. Zu diesem Zwecke wurde die Expression unter Verwendung des Plasmides pREP4 durchgeführt. Das Plasmid pREP4 (3740 bp) ist mit seinem Replikationsursprung P15A (MILLER, 1992) kompatibel zu ColE-Plasmiden der pQE-Reihe und kann so in Kombination mit pQE-Vektoren in E. coli repliziert werden. Es exprimiert den durch das lacI-Gen (FARABOUGH, 1978) codierten Lac-Repressor. Deshalb wurde pREP4 als „Helferplasmid“ in Kombination mit pQE70 verwendet, um durch die lac-Repressorproduktion eine Regulation der Expression von in pQE70-Vektor erhaltenen Gene zu ermöglichen. In einem Reihentest wurde versucht sowohl Expressionstemperatur und – dauer als auch IPTG-Konzentration für die erhaltenen Transformanten zu optimieren. Hierfür wurden 3 ml Kulturen der Bakterienkolonien unter Ampicillin und Kanamycin Selektion (vgl. II.3) angezogen. Aus jeder Kultur wurden die in 1 ml enthaltenen Bakterien durch Zentrifugation bei 7000 x g pelletiert. Das Pellet wurde direkt mit 100 µl SDS-PAGE Probenpuffer (vgl. III.5.2.) versetzt und für 10 min bei 100 °C gekocht. Ein Aliquot der jeweiligen Probe wurde in einem 12.5 %igen SDS-Gel (vgl. III.5.2.) analysiert. Dabei wurden IPTG-Konzentration von 100 µM, 250 µM, 500 µM und 1000 µM bei Temperaturen von 20 °C, 25 °C, 30 °C und 37 °C zu den Bakterienkulturen zugesetzt. Jeweils nach 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h und 24 h erfolgte die Probennahme. Allerdings konnte keine prominente Bande auf dem SDS-Gel mit einer ungefähren Größe von 28 kDa identifiziert werden. Deshalb wurden Bakterienkulturen mit einem Volumen zwischen 500 ml und 5000 ml, wie im Methodenteil unter III.6.3.1. beschrieben, angezogen und die rekombinante MeJA-Esterase anschließend säulenchromatographisch angereichert.

IV. Ergebnisse 133

8.2. Reinigung der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase Als Reinigungsstrategie für die rekombinant exprimierte MeJA-Esterase war ein zweistufiges Reinigungsschema vorgesehen. In einem ersten Schritt sollten grobe Verunreinigungen über Anionenaustausch-Chromatographie entfernt werden. Als zweiter Schritt sollte eine Metallaffinitäts-Chromatographie durchgeführt werden. Dabei sollte das Fusionsprotein aus MeJA-Esterase und C-terminalem Hexahistidin-Rest durch die Histidin-Markierung spezifisch mit einer Nickel-Matrix komplexiert werden. Der Komplex sollte durch Imidazol als Kompetitor aufgehoben werden und das Protein von der Matrix eluieren. Vortests zeigten jedoch, dass über das Nickel-Affinitätsmaterial keine ausreichende Anreicherung der rekombinanten MeJA-Esterase erzielt werden konnte. Deshalb orientierte sich das folgende Reinigungsschema an der säulenchromatographischen Auftrennung der nativen MeJA-Esterase. 8.2.1. Ionenaustausch-Chromatographie an Q-Sepharose „Fast Flow“ (2.6 cm x

20 cm) Zur chromatographischen Aufreinigung der rekombinanten MeJA-Esterase wurden 5 l Bakterienkultur wie unter III.6.3.2. beschrieben aufgeschlossen. Hierdurch wurde das Gesamtvolumen auf 500 ml reduziert und konnte zeitsparend auf die mit Startpuffer (50 mM KPi, pH 7.5; 20 mM EtSH) equilibrierte Chromatographisäule (Säulen-Maße 2.6 cm x 20 cm) mit einer Flussrate von 5 ml/min aufgetragen werden. Fraktioniert aufgefangen wurden die Proben in Volumina von 10 ml. MeJA-Esterase Aktivität, die mittels radioaktivem Standardtest (vgl. IV.1.2.2.) bestimmt wurde, war in den Fraktionen zwischen 0 mM und 800 mM KCl detektierbar. Die vereinigten Fraktionen hatten ein Volumen von 80 ml mit einer spezifischen MeJA-Esterase Aktivität von 1.64 pkat/mg bei 2044 mg Gesamtprotein. Hier lag die Ausbeute bei 27.7 % gegenüber dem Rohextrakt. Der Anreicherungsfaktor lag bei 1.13. 8.2.2. Größenausschluss-Chromatographie an Sephacryl S-100 HR 26/60 (2.6

cm x 60 cm) Die nach der Ionenaustausch-Chromatographie mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 20 kDa (Centricon® Plus 20 Zentrifugen-Filtereinheiten) eingeengte und umgepufferte Proteinlösung, wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min auf die mit Startpuffer (50 mM KPi, pH 7.5; 150 mM NaCl)

IV. Ergebnisse 134

equilibrierte Chromatographiesäule (Säulen-Maße 2.6 cm x 60 cm) aufgetragen. Die Elution der Proteine erfolgte isokratisch mit Startpuffer. Nach 30minütigem Vorlauf wurden die Eluate in 5 ml Fraktionen gesammelt. Die MeJA-Esterase Aktivität erschien in den Fraktionen zwischen 220 ml und 270 ml und wurde im Standardtest (vgl. III.1.2.2.) bestimmt. Das Volumen der Fraktionen mit Esteraseaktivität, die vereinigt wurden, betrug 50 ml. Anschließend wurden die Fraktionen mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 20 kDa (Centricon® Plus 20 Zentrifugen-Filtereinheiten) eingeengt und auf den nächsten Startpuffer umgepuffert. Sie enthielten 67.5 mg Protein mit einer spezifischen Enzymaktivität von 9.67 pkat/mg. Dies entsprach einer Ausbeute von 19.4 % bei einem Anreicherungsfaktor von 5.9. 8.2.3. Ionenaustausch-Chromatographie an Mono Q HR 5/5 (0.5 cm x 5.0 cm) Im Anschluss an die Gelfiltration wurde die verbleibende Proteinlösung mit einer Flussrate von 1 ml/min auf die mit Startpuffer (50 mM KPi, pH 7.5; 20 mM EtSH) equilibrierte Chromatographie-Säule (Säulen-Maße 0.5 cm x 5.0 cm) aufgetragen. Zur Entfernung gebundener Proteine wurde zunächst mit Startpuffer gewaschen, danach mit KCl zunehmender Molarität (0-1 M) eluiert. MeJA-Esterase Aktivität wurde im Standardtest (vgl. III.1.2.2.) bestimmt. Ein Maximum an Aktivität ließ sich zwischen 0 und 200 mM KCl erkennen. Fraktionen mit Esteraseaktivität wurden vereinigt, mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa (Microcon Zentrifugen-Filtereinheiten) eingeengt und auf den nächsten Startpuffer umgepuffert. In diesem Reinigungsschritt konnten 1.9 mg Protein (spezifischen Enzymaktivität: 54.4 pkat/mg) mit einer Ausbeute von 3.0 % bei einem Anreicherungsfaktor von 33.2 gewonnen werden. 8.2.4. Affinitäts-Chromatographie an Talon™-Material Im letzten Schritt der Proteinreinigung wurde der Hexa-Histidinrest, der an die MeJA-Esterase fusioniert war für eine affinitätschromatographische Trennung ausgenutzt. Nachdem sich in einem Vortest (vgl. IV.6.1.) gezeigt hatte, dass die Komplexierung des Hexahestidin-Restes der MeJA-Esterase an Nickel nicht funktionierte, wurde die Verwendung von Cobalt als Metallion für die Affinitäts-Chromatographie getestet. Hierzu wurde Talon™-Material der Firma BD Biosciences (vgl. III.6.4.4.) verwendet. Dieses Affinitätsmaterial zeichnet sich durch einen vierzähnigen Chelator aus, der das Cobaltion komplexiert. Hierdurch kommt es zu keinem Verlust an Metallionen

IV. Ergebnisse 135

während der Reinigung (BD Talon™ User Manual 2003). Ein weiterer Vorteil gegenüber herkömmlichen Nickel-Matrices besteht in der geringeren Bindung von Fremdproteinen und den milderen Elutionsbedingungen, unter denen das Fusionsprotein von der Cobalt-Matrix eluiert werden kann (KASHER et al., 1993). Um das Affinitätsmaterial zu equilibrieren, wurden 500 µl des resuspendierten Gels in ein Reaktionsgefäß pipettiert und für 2 min bei 700 x g pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen, verworfen und das verbleibende Affinitätsmaterial dreimal mit Waschpuffer (1 ml) im Reaktionsgefäß gewaschen. In Waschpuffer umgepufferte Proteinlösung wurde zum Affinitätsmaterial pipettiert und für mindestens eine halbe Stunde bei 4 ºC im Überkopfschüttler bewegt, um die Bindung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Anschließend wurde die Probe für 5 min (700 x g, 4 ºC) zentrifugiert und der Überstand, der ungebundenes Protein enthielt, vorsichtig abgenommen. In einem weiteren Waschschritt wurde das Affinitätsmaterial mit 20 Gelbettvolumina Waschpuffer in ein Falcon-Röhrchen überführt und im Eisbad auf einem Schüttler für 10 min geschwenkt. Die Probe wurde für 5 min (700 x g, 4 ºC) zentrifugiert und die überstehende Waschlösung abgenommen. Der Waschschritt wurde ein zweites Mal wiederholt. Zur Elution des gebundenen Proteins wurde das Affinitätsmaterial in ein Amchro-Plastiksäulchen mit fünf SV Waschpuffer überführt und das Protein mit fünf SV Elutionspuffer vom Säulenmaterial verdrängt. Nachdem das Proteineluat mittels Filtration durch Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa (Microcon Zentrifugen-Filtereinheiten) eingeengt worden war, konnte eine spezifische Aktivität von 464.3 pkat/mg (52 µg Gesamtprotein) bei einer Ausbeute von 0.8 % und 283-facher Anreicherung bestimmt werden.

8.2.5. Darstellung der Homogenität und Western-Blot der rekombinanten MeJA-Esterase

Dokumentiert wurde die Protein-Überexpression und Aufreinigung durch SDS-PAGE (vgl. III.5.2.) und Western-Blot (vgl. III.5.6.). Jeweils 5 µg Protein wurden in einer SDS-PAGE und in einem Western-Blot analysiert. Die MeJA-Esterase konnte nach der Affinitäts-Chromatographie als einzelne Proteinbande in einer SDS-PAGE (vgl. III.5.2.) mit einem Molekulargewicht von 28 kDa identifiziert und als homogen angesehen werden (Abb IV. 35.A.). Der Nachweis, dass es sich bei der Bande von 28 kDa um ein Fusionsprotein aus MeJA-Esterase und Hexahistidin-Rest handelte, wurde durch einen Western-Blot bestätigt. Der Proteintransfer wurde wie unter III. 5.6.1. beschrieben durchgeführt. Zur Detektion des Hexahistidin-Restes wurde der

IV. Ergebnisse 136

Nachweis mittels Chemilumineszenz (vgl. III.5.6.2.) durchgeführt. Abb. IV. 35.B. zeigt das Ergebnis des Western-Blots.

Abb. 35.: A) Elektrophoretische Auftrennung von 5 µg Protein nach Reinigung über Talon™-Affinitätsmaterial in

einem 12.5 %igem SDS-Gel (vgl. III.5.2.) nach Silberfärbung (vgl. III.5.3.2.). Spur M: Protein

Größenstandard (75 kDa, 50 kDa, 37 kDa, 25 kDa und 15 kDa), Spur 1: Eluat nach Reinigung über

Talon™-Affinitätsmaterial. Zu erkennen ist eine prominente Proteinbande bei 28 kDa, was der Größe

der MeJA-Esterase entsprach. Ein Pfeil kennzeichnet die Lage der MeJA-Esterase.

B) Nachweis des Hexahistidin-Restes der rekombinanten MeJA-Esterase mittels Western-Transfer

(vgl. III.5.6.) Spur M: Proteingrößenstandard, Spur 1: Eluat nach Reinigung über Talon™-

Affinitätsmaterial, Spur 2: Wildtyp E. coli. als Kontrolle. Die Detektion erfolgte mittels

Chemilumineszenz. Spur 1 ließ wie erwartet ein Signal der Größe erkennen, das dem Fusionsprotein

aus Hexahistidin-Rest und MeJA-Esterase entsprach. Ein Pfeil kennzeichnet die Lage der MeJA-

Esterase.

8.2.6. Zusammenfassende Übersicht über die Reinigung der rekombinant

exprimierten MeJA-Esterase Nach drei säulenchromatographischen Schritten an zwei Anionenaustauschern und einer Gelfiltrationssäule konnte die heterolog exprimierte MeJA-Esterase nach Auftrennung über Affinitätschromatographie zur Homogenität gereinigt werden. Das rekombinante Protein verhielt sich wie die native MeJA-Esterase. Eine ausreichende Anreicherung der rekombinanten MeJA-Esterase konnte ebenfalls mittels Anionenaustauscher- und Größenausschlusschromatographie erzielt werden. Eine

IV. Ergebnisse 137

Verwendung der Hydroxyapatit-Chromatographiesäule wie bei der nativen MeJA-Esterase war nicht notwendig. Die Gesamtaktivitätsausbeute betrug 0.8 % bei einem Anreicherungsfaktor von 283 im Vergleich zum Kulturüberstand und einer spezifischen Aktivität von 464.3 pkat/mg Protein. Die Homogenität des Enzyms konnte nach elektrophoretischer Auftrennung von 5 µg Protein in einer 12.5 %igen SDS-PAGE (vgl. III.5.2.) mit anschließender Silberfärbung (vgl. III.5.3.2.) eindeutig gezeigt werden. Abb. IV.32.A. zeigt die Anreicherung der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase. In Tab. IV.9. ist die gesamte Reinigung der MeJA-Esterase im Überblick dargestellt. Für alle Reinigungsschritte wurde mit Tritium markiertes Methyljasmonat (Standardtest nach VI. 1.2.2.) als Substrat verwendet. Reinigungsschritt Gesamt-

protein [mg]

Gesamt-aktivität [pkat]

Spezifische Aktivität

[pkat/mg]

Ausbeute [%]

Anreicherung[x-fach]

Rohextrakt 2044 3352 1.64 100 1 Q-Sepharose 712 1317 1.85 27.7 1.13 Sephacryl HR 26/60 67.5 652.7 9.67 19.4 5.89 Mono Q HR 5/5 1.9 100.6 54.39 3.0 33.16 Talon™-Material 0.052 24.1 464.3 0.8 283.11 Tab. VI.9.: Zusammenfassung der einzelnen Schritte zur Anreicherung der rekombinanten MeJA-Esterase aus

E. coli Zellen.

9. Identifizierung des Reaktionsproduktes der nativen und

rekombinant exprimierten MeJA-Esterase Ein Nachweis der Enzymfunktion der MeJA-Esterase gelang durch Identifizierung des durch Hydrolyse von MeJA gebildeten Produktes. Der Nachweis des Produktes erfolgte nach gaschromatographischer Auftrennung im Massenspektrometer im Modus der positiven chemischen Ionisation (vgl. III.3.). 9.1. Identifizierung des Reaktionsproduktes von MeJA nach Inkubation

mit der nativen MeJA-Esterase Das Hydrolyseprodukt der MeJA-Esterase (767-fach angereichert) wurde nachgewiesen, indem Methyljasmonat (12.5 mM) als Substrat in einem 50 µl

IV. Ergebnisse 138

Reaktionsansatz eingesetzt wurde. Der Enzymansatz wurde für 30 min bei 37 ºC inkubiert und durch die Zugabe von 1 M HCl (10 µl) gestoppt. Zur Extraktion der Ester und freien Säuren wurde der Enzymansatz mit 300 µl Diethylether ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und eventuell gebildete Jasmonsäure durch Ethylierung mit Diazoethan wie unter III.1.5. beschrieben in den entsprechenden Ethylester überführt. Die Derivatisierung freier Säure war notwendig, da sie ansonsten nicht flüchtig genug gewesen wäre, um eine Auftrennung über den Gaschromatographen durchführen zu können. Der Reaktionsansatz wurde vorsichtig unter einem Stickstoffstrom bis auf 50 µl eingeengt und konnte nach gaschromatographischer Auftrennung im Massenspektrometer (vgl. III.3.) vermessen werden. Messungen wurden im Modus der positiven chemischen Ionisation (Isobutan) durchgeführt. Bei dieser Ionisationstechnik werden Moleküle protoniert. Dadurch erhöht sich die Molekülmasse um eine Masseneinheit. In Abb.IV.36. sind die Chromatogramme von m/z: 225 (MeJA: [M+H]+ = 225) und m/z: 239 (EtJA: [M+H]+ = 239) gezeigt. Abb. IV.36.: GC-MS-Chromatogramme des Enzmansatzes mit MeJA und Derivatisierung mit Diazoethan. In

der Ionenspur mit m/z = 225 (A) wird nicht umgesetztes MeJA detektiert. In der Ionenspur mit m/z

= 239 (B) konnte Ethyljasmonsäure anhand der Retentionszeit und der Masse identifziert werden.

IV. Ergebnisse 139

Anhand von Retentionszeit und Masse konnte Jasmonsäure damit zweifelsfrei spektrometrisch als das von der MeJA-Esterase gebildete Hydrolyseprodukt identifiziert werden. 9.2. Identifizierung des Reaktionsproduktes von MeJA nach Inkubation

mit der rekombinanten MeJA-Esterase Im Reaktionsansatz wurde Methyljasmonat (12.5 mM) zusammen mit 283-fach angereicherter MeJA-Esterase in einem Gesamtvolumen von 50 µl eingesetzt. Nach Inkubation des Reaktionsansatzes wurden Probenaufarbeitung und Ethylierung freier Säuren im Vergleich zu VI. 9.1. modifiziert. Hierzu wurden 1000 µl Pipettenspitzen mit einem kleinen Wattepfropf verschlossen und 5 mg C18 ec-Material eingewogen. C18 ec-Material wurde mit 200 µl Methanol gewaschen und mit Methanol/Wasser (1:9, v/v) equilibriert. Der Enzymansatz wurde aufgegeben, das Eluat und eine Waschfraktion (200 µl Wasser, mit dem nachgewaschen wurde), verworfen. Pufferbestandteile und Salze befanden sich in der Waschfraktion. Proteine wurden irreversibel an die Säule gebunden und durch das C18 ec-Material zurückgehalten, während methylierte- und freie Säuren mit 100 µl Methanol eluiert wurden. Die in dem methanolischen Extrakt enthaltenen freie Säuren wurde wie unter III. 1.5. beschrieben in einen Ethylester überführt. Dadurch gewann Jasmonsäure als Ethylester die notwendige Flüchtigkeit, um gaschromatographisch aufgetrennt werden zu können. Die zusätzliche Aufreinigung des Enzymansatzes über C18 ec-Material sollte die Gaschromatographiesäule schonen. Jasmonsäure konnte (als Ethylester) eindeutig als Produkt der Umsetzung von MeJA mit der MeJA-Esterase nachgewiesen werden.

IV. Ergebnisse 140

10. Vergleichende Charakterisierung der rekombinant exprimierten und der nativen MeJA-Esterase

10.1 Biochemische Charakterisierung der nativen MeJA-Esterase 10.1.1. pH-Optimum Die Enzymaktivität ist abhängig vom pH-Wert der umgebenden Lösung. Denn einerseits können sich mit dem pH-Wert der Dissoziationsgrad der Aminosäuren des Enzyms und andererseits das Protonierungsmuster der Substrate ändern. Durch beides kann die Reaktivität des Enzyms stark beeinflußt werden. Die pH-Abhängigkeit der MeJA-Esterase ist in Abb. IV. 37. dargestellt und wurde im Bereich von pH 4.0 bis 10.0 bestimmt. Es wurde dazu im Standardtest jeweils 3.0 pkat (6 µg Protein) und 500 mM der in Abb. IV. 37. angeführten Puffer eingesetzt. Vor Inkubation der MeJA-Esterase mit Substrat im entsprechenden Puffer wurde der pH-Wert der Ansätze mit einer Glaselektrode gemessen. Eine maximale Umsatzrate zeigte die MeJA-Esterase im basischen Bereich bei einem pH-Wert von 9.0. Bei pH 5.5 und pH 10.0 waren noch 50 % der bei pH 9.0 ursprünglichen Aktivität vorhanden. Da die MeJA-Esterase sehr stabil war, wurde auch die Bestimmung des Temperaturoptimums und der Substratspezifität bei diesem pH-Wert durchgeführt. Abb. IV. 37.: pH-Abhängigkeit der MeJA-Esterase-katalysierten Enzymreaktion, gemessen im Standardtest in

verschiedenen gepufferten (jeweils 500 mM) Ansätzen mit je 3.0 pkat Enzymaktivität.

IV. Ergebnisse 141

10.1.2. Temperaturoptimum Mit steigender Temperatur laufen chemische Reaktionen schneller ab. Dies gilt auch für die Gleichgewichtseinstellungen, die durch Enzyme katalysiert werden. Allerdings kann bei Erhöhung der Temperatur die Konformation verändert werden, was zu Erniedrigung der Umsatzgeschwindigkeit und bei starker Temperaturerhöhung zur irreversiblen Denaturierung führen kann. Um das für jedes Enzym charakteristische Temperaturoptimum zu ermitteln, muss die Temperatur bestimmt werden, bei der eine optimale enzymatische Umsatzrate erzielt werden kann. Die Temperaturabhängigkeit der von der MeJA-Esterase katalysierten Reaktion ist in Abbildung IV. 38. dargestellt. Die Ansätze wurden unter Standardbedingungen mit jeweils 3.0 pkat (6 µg Protein) bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Das Temperaturoptimum lag für die Aktivität der MeJA-Esterase bei 40 °C. Erst eine Temperaturerhöhung auf 60 °C hatte eine 50 %ige Aktivitätseinbuße zur Folge und bei 70 °C wurde das Enzym vollständig inaktiviert. Abb. IV. 38.: Temperaturabhängigkeit der MeJA-Esterase-katalysierten Enzymreaktion, gemessen im

Standardtest. Die Ansätze (3 pkat MeJA-Esterase, 50 mM Tricin/NaOH-Puffer, pH 8.0) wurden

für 60 min bei verschiedenen Temperaturen inkubiert.

10.1.3. Isoelektrischer Punkt Am isoelektrischen Punkt, dem pH-Wert, bei dem sich positive und negative Ladungen innerhalb eines Proteins ausgleichen, sind Moleküle nach außen hin ungeladen. Diese Eigenschaften nützt man bei der Bestimmung dieses Parameters durch Chromatofokussierung aus. Eine detaillierte Beschreibung der

IV. Ergebnisse 142

Chromatofokussierung ist unter III. 6.4.5. zu finden. Vorgereinigtes Enzyms (10 pkat/100 µg Protein) wurde in einem Volumen von 200 µl auf die Säule aufgegeben (Säulen-Maße 0.5 cm x 20.0.cm). Die Flussrate während des Laufs betrug 0.7 ml/min, das Eluat wurde in 1 ml Fraktionen aufgefangen. Ausgehend von 25 mM Bis-Tris/HCl-Puffer pH 6.3 erfolgte die Einstellung des pH-Gradienten über 10 % Polybuffer 74 (pH 4.0). Über eine in der HPLC-Anlage integrierte pH-Elektrode wurde der pH-Wert der jeweiligen Fraktion bestimmt und im Chromatogramm aufgezeichnet. Um die Aktivität des Proteins nicht zu beeinträchtigen, wurde 500 mM KPi-Puffer (pH 7.5) in die Reaktionsgefäße vorgelegt. Hierdurch wurde während der Fraktionierung des Enzyms der pH-Wert in den physiologischen Bereich angehoben. Die Enzymaktivität wurde im Standardtest bestimmt und Fraktionen mit der höchsten Enzymaktivität eluierten bei einem pH-Wert von 4.7 (vgl. Abb. IV.39).

Abb. IV. 39.: Bestimmung des isoelektrischen Punktes der MeJA-Esterase durch Chromatofokussierung an

einer Mono P HR 5/20. Säulenabmessungen: 0.5 x 20 cm. Flussrate: 0.7 ml/min. Elution: pH-

Gradient, ausgehend von 25 mM Bis-Tris/HCl-Puffer pH 6.3 wurde der pH-Wert durch 10 %

Polybuffer auf pH 4.0 abgesenkt. Die Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität erfolgte im

Standardtest. MeJA-Esterase Aktivität ist mit einem schwarzen Balken im Chromatogramm

gekennzeichnet. Der isoelektrische Punkt der MeJA-Esterase lag bei pH 4.7 und ist im

Chromatogramm mit einem Punkt markiert.

IV. Ergebnisse 143

10.1.4. Hemmung der MeJA-Esterase durch Proteaseinhibitoren Um die Auswirkungen möglicher Hemmstoffe von Hydrolasen auf die MeJA-Esterase quantitativ zu erfassen, wurde die MeJA-Esterase Aktivität in An- und Abwesenheit der zu untersuchenden Verbindung im Standardtest (vgl. IV.1.2.2.) gemessen. Getestet wurden die Proteaseinhibitoren N-Ethylmaleimid (Inhibitor von Thiolproteasen), Iodacetamid (Inhibitor von Thiolproteasen), Bestatin (Inhibitor von Metallproteasen, Aminopeptidasen), Pepstatin (Inhibitor von Carboxyproteasen), Leupeptin (Inhibitor von Cysteinproteasen) und Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, Inhibitor von Serin-Proteasen). Hierzu wurden 5 pkat native MeJA-Esterase mit den entsprechenden Konzentrationen der Hemmstoffe für 30 min inkubiert und im Standardtest (vgl. IV.1.2.2.) vermessen. Wurden die Hemmstoffe in Ethanol gelöst, so wurde die MeJA-Esterase als Kontrolle ebenfalls mit der gleichen Ethanol-Verdünnung versetzt. Im Standardtest eingesetzte Konzentrationen der Hemmstoffe und dabei gemessene Enzymaktivitäten der MeJA-Esterase sind Tab. IV. 10. zu entnehmen.

Hemmstoff Konzentration (mM)

Enzymaktivität (%)

Phenylmethansulfonyl- Fluorid (PMSF)

5 1

0.500

0 20.7 50

Leupetin 0.100 100 Pepstatin 0.001 100 Bestatin 0.065 100 Iodacetamid 10

5 100 100

N-Ethylmaleimid 10 5 1

100 100 100

Tab. IV.10.: Hemmung der MeJA-Esterase Aktivität durch verschiedene Protease-Inhibitoren. Die Messung

erfolgte im Standardtest (vgl. IV.1.2.2.) mit 5 pkat MeJA-Esterase.

Keine Hemmung der MeJA-Esterase Aktivität wurde bei einer Inkubation des Enzyms mit N-Ethylmaleimid (10 mM, Thiolprotease-Inhibitor) und Iodacetamid (10 mM, Thiolprotease-Inhibitore) sowie nach Zugabe von Bestatin (65 µM, Metallprotease-Inhibitor), Pepstatin (1 µM, Carboxyprotease-Inhibitor) und Leupeptin (100 µM, Cysteinprotease-Inhibitor) beobachtet. PMSF, ein irreversibler Inhibitor von Serin-

IV. Ergebnisse 144

Proteasen, konnte hingegen in einer Konzentration von 0.5 mM die MeJA-Esterase Aktivität um 50 % vermindern und führte in einer Konzentration von 5 mM zu einer vollständigen Hemmung der MeJA-Esterase. Bei PMSF handelt es sich um einen hochspezifischen Inhibitor von Serin-Hydrolasen. Die Hemmung der MeJA-Esterase durch PMSF liefert einen starken Hinweis darauf, dass es sich bei der MeJA-Esterase um eine Hydrolase mit einer katalytischen Triade mit einem reaktiven Serinrest handelt. 10.1.5. Analyse der Proteinmasse der nativen MeJA-Esterase mittels ESI-TOF

MS (Electrospray Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) Der Begriff Electrospray beschreibt die Dispersion einer Flüssigkeit in sehr viele kleine geladene Tröpfchen mit Hilfe eines elektrostatischen Feldes. Der Electrospray-Prozess bewirkt eine definierte Ionisation und komplette Desolvatisierung von in Lösung versprühten Analytmolekülen. Die molekulare Masse der MeJA-Esterase wurde von Herrn Dr. Axel Parbel in den Labors von Amersham Biosciences, Freiburg bestimmt. Für die Messung wurden 10 pkat MeJA-Esterase (100 µg Protein) eingesetzt. Zur Probenvorbereitung wurde die Proteinlösung über eine Micra RP18 Trap Column (Amersham Biosciences, Freiburg) entsalzt und aufkonzentriert. Die Massenanalyse wurde an einem Ettan™ LC-MS System (Amersham Biosciences, Freiburg) durchgeführt. M+-Spektren wurden mit dem Software Paket MagTrans erstellt. Die Masse der MeJA-Esterase betrug 28547.714 Da (± 237.339 Da). Dieses Ergebnis stimmte überein mit der Bestimmung des Molekulargewichtes aus SDS-Gelelektrophorese (vgl. IV.1.6.2) und Größenausschluss-Chromatographie (vgl. IV.1.6.1). 10.2. Vergleichende Substratspezifität der nativen und der rekombinant

exprimierten MeJA-Esterase 10.2.1. Substratspezifität der nativen MeJA-Esterase Zur Bestimmung der Substratspezifität wurde die relative hydrolytische Aktivität der MeJA-Esterase in Gegenwart unterschiedlicher Ester und Amide gemessen. Die Bestimmung der Substratspezifität konnte nicht im Standardtest (vgl. III.1.2.2.) durchgeführt werden, da hierfür radioaktiv markierte Substrate benötigt worden wären. Somit musste ein geeigneter Test entwickelt werden, der es erlaubte mehrere Substrate mit derselben Methode zu vermessen, um einen direkten Vergleich der

IV. Ergebnisse 145

Substrate zu ermöglichen. Deshalb bot es sich aufgrund der Flüchtigkeit der Verbindungen an, die Bestimmung nach gaschromatographischer Trennung über Massenspektrometrie durchzuführen (vgl. III.3.). Vermessen wurden die einzelnen Substrate (12.5 mM) wie unter IV.9.1. (Identifizierung des Reaktionsproduktes der nativen MeJA-Esterase) beschrieben. Die im Enzymtest eingesetzten Methylester wurden in unterschiedlichem Maße zu freien Säuren hydrolysiert. Da die Säuren schwer flüchtig sind und nicht zusammen mit den Methylestern erfasst werden konnten, wurden die freien Säuren zu Ethylestern derivatisiert (vgl. III.1.5.). Peakflächen der [M+H+] Ionen von Methylester (Substrat) und Ethylester (Produkt) wurden integriert und aus ihrem Verhältnis konnte der Enzymumsatz bestimmt werden. Die Umsatzraten der Substrate wurden auf den Umsatz von Methyljasmonat bezogen (100 %-Wert). Tab. IV.11. fasst die Ergebnisse der Untersuchung zusammen.

Substrat Relative Aktivität (Mittelwert ± S.D.)

(±) Jasmonsäuremethylester (MeJA) 100.0 ± 1.0 Indol-3-essigsäuremethylester 95.9 ± 1.7 Linolensäuremethylester 71.7 ± 12.6 p-Nitrophenylacetat 65.3 ± 11.6 (±) Abscissinsäuremethylester 32.4 ± 6.6 Linolsäuremethylester 12.4 ± 2.7 Zimtsäuremethylester 4.5 ± 0.6 Benzoesäuremethylester 3.3 ± 2.7 Salicylsäuremethylester 2.9 ± 0.8 L-Leucin-p-nitroanilid 0

Tab. IV. 11.: Zusammenstellung der chemischen Verbindungen, die als Substrate für die MeJA-Esterase

getestet wurden. Substrate und Produkte wurden mit Diethylether extrahiert und mit Diazoethan

derivatisiert. Der Diethyletherextrakt wurde im GC-MS im Modus der positiven chemischen

Ionisation vermessen. Die Enzymaktivität der MeJA-Esterase wurde aus dem Verhältnis der

Peakflächen der [M+H+] Ionen von Methylester (Substrat) und Ethylester (Produkt) durch

Integration berechnet. Die chromogenen Substrate p-Nitrophenylacetat und L-Leucin-p-nitroanilid

wurden photometrisch vermessen. Die Umsatzraten der Substrate wurden auf den Umsatz von

Methyljasmonat bezogen (100 %-Wert). Alle Messungen wurden in Dreifachbestimmung

durchgeführt.

Die MeJA-Esterase hydrolysierte nicht alleine Methyljasmonat, sondern akzeptierte auch weitere Substrate. Die Methylester der Pflanzenhormone Indol-3-essigsäure

IV. Ergebnisse 146

und (±) Abscissinsäure, die Methylester der Linol- und Linolensäure und das chromogene Substrat p-Nitrophenylacetat wurden als Substrate akzeptiert. Zimtsäure,- Benzoesäure- und Salicylsäuremethylester wurden hingegen kaum hydrolysiert. Die Hydrolyse von Amiden wie z. B. L-Leucin-p-nitroanilid wurde nicht durch die MeJA-Esterase katalysiert. 10.2.2. Substratspezifität der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase Zur Bestimmung der Substratspezifität der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase wurden die beiden in der Pflanze relevanten flüchtigen Hormone Methylsalicylat und Methyljasmonat getestet. Desweiteren wurde der Umsatz der beiden chromogenen Substrate p-Nitrophenylacetat und L-Leucin-p-nitroanilid vermessen. Die Bestimmung des Substratumsatzes erfolgte ebenso wie bei der Bestimmung der Substratspezifität der nativen MeJA-Esterase nach gaschromatographischer Auftrennung mittels Massenspektrometrie (vgl. III.3.). Der Reaktionsansatz wurde vor der Messung im GC-MS derivatisiert, wie unter IV.9.1. (Identifizierung des Reaktionsproduktes der rekombinanten MeJA-Esterase) beschrieben. Tab. IV.12. zeigt die Ergebnisse der Untersuchungen zur Substratspezifität.

Substrat Relative Aktivität (Mittelwert ± S.D.)

(±) Jasmonsäuremethylester (MeJA) 100.0 ± 1.0 Salicylsäuremethylester 37.1 ± 1.3 p-Nitrophenylacetat 72.8 ± 1.6 L-Leucin-p-nitroanilid 0

Tab. IV.12.: Zusammenstellung der Verbindungen, die als Substrate für die rekombinante MeJA-Esterase

getestet wurden. Substrat und Produkte wurden mit Diethylether extrahiert und mit Diazoethan

derivatisiert. Anteile des Diethyletherextraktes wurden im GC-MS im Modus der positiven

chemischen Ionisation vermessen. Die Enzymaktivität der MeJA-Esterase wurde aus dem

Verhältnis der Peakflächen der [M+H+] Ionen von Methylester (Substrat) und Ethylester (Produkt)

durch Integration berechnet. Die chromogenen Substrate p-Nitrophenylacetat und L-Leucin-p-

nitroanilid wurden photometrisch vermessen. Die Umsatzraten der Substrate wurden auf den

Umsatz von Methyljasmonat bezogen (100 %-Wert). Alle Messungen wurden in

Dreifachbestimmung durchgeführt.

Im Gegensatz zur nativen MeJA-Esterase hydrolysierte die rekombinante MeJA-Esterase den Methylester der Salicylsäure in höherem Maße. Die relative Aktivität

IV. Ergebnisse 147

der nativen MeJA-Esterase bei der Hydrolyse von Salicylsäuremethylester betrug 2.9 ± 0.8 %. 10.3. Vergleichende enzymologische Charakterisierung der nativen

und der rekombinant exprimierten MeJA-Esterase Um die Affinität von Methyljasmonat zur MeJA-Esterase untersuchen zu können, wurde sowohl für natives als auch für rekombinantes Enzym der KM-Wert bestimmt. Einen Zusammenhang zwischen Substratmenge und Anfangsgeschwindigkeit einer Enzym-katalysierten Reaktion hatten MICHAELIS und MENTEN (1913) mathematisch in der Michaelis-Menten-Gleichung ausgedrückt. Gleichgewichtskonstante (KM) und Maximalgeschwindigkeit der Katalyse (vmax) lassen sich aus der Michaelis-Menten-Gleichung rechnerisch oder graphisch ermitteln. Dazu wurden im Standardtest unterschiedliche Konzentrationen des radioaktiv markierten Substrates eingesetzt und die Umsetzung mittels Szintillationszähler quantifiziert. Der KM-Wert wurde durch Auftragung der Messwerte nach MICHAELIS und MENTEN (1913) und durch doppelt reziproke Auftragung der Messwerte nach LINEWEAVER und BURK (1934) für native (Abb. IV.40.) und rekombinante MeJA-Esterase bestimmt (Abb. IV.41.). Abb. IV.40.: Die Daten für die native MeJA-Esterase wurden nach MICHAELIS und MENTEN (1913) aufgetragen.

KM-Wert und vmax wurden nach doppelt reziproker Auftragung der Messwerte nach LINEWEAVER und

BURK (1934) berechnet.

IV. Ergebnisse 148

Abb. IV.41.: Die Daten für die rekombinante MeJA-Esterase wurden nach MICHAELIS und MENTEN (1913)

aufgetragen. KM-Wert und vmax wurden nach doppelt reziproker Auftragung der Messwerte nach

LINEWEAVER und BURK (1934) berechnet.

Die Ermittlung des KM-Wertes erfolgte durch doppelt reziproke Auftragung der Messwerte nach LINEWEAVER und BURK (1934). Tab. IV.13. fasst die Daten für native und rekombinante MeJA-Esterase zusammen. Native MeJA-

Esterase Rekombinante MeJA-

Esterase KM-Wert nach Lineweaver und Burk [µM] 14.7 ± 0.8 24.3 ± 2.3 vmax nach Lineweaver und Burk [nkat/mg] 7.9 ± 0.4 3.9 ± 0.1 Tab. IV.13.: Übersicht über Kinetik-Daten für native und rekombinante MeJA-Esterase. Die Ermittlung der KM-

Werte erfolgte durch doppelt reziproke Auftragung der Messwerte nach LINEWEAVER und BURK

(1934). Alle Werte wurden in Dreifachbestimmung ermittelt. Die Daten, welche für KM-Wert und vmax der nativen und rekombinanten MeJA-Esterase nach Lineweaver und Burk bestimmt wurden, stimmten innerhalb der Messgenauigkeit überein.

IV. Ergebnisse 149

11. Untersuchungen zur mRNA-Expression und Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität

11.1. Gewebsspezifische Expression der MeJA-Esterase Zur Charakterisierung der MeJA-Esterase wurde die gewebsspezifische Expression der mRNA untersucht. RNA wurde aus Geweben verschiedener Organe isoliert und über Northern-Hybridisierung analysiert (vgl. III. 8.4.1.). Von zehn jeweils vier Monate alten Tomatenpflanzen (L. esculentum cv. Moneymaker) wurden 2 g Blätter, Blüten, Stängel und Wurzeln gesammelt und mit flüssigem Stickstoff schockgefroren. Tiefgefrorenes Gewebe wurde unter ständiger Kühlung mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser fein pulverisiert und 100 mg davon für die RNA-Isolierung eingesetzt. Isoliert wurde Gesamt-RNA mit dem Qiagen-Kit „RNeasy Plant Mini“ nach Vorschrift des Herstellers (vgl. IV.8.2.3.). Isolierungsversuche mit der Trizol-Methode ergaben keine ausreichende Ausbeute bzw. die Gesamt-RNA aus Blüten degradierte zu schnell, um für einen Northern Blot eingesetzt werden zu können. Gesamt-RNA (je 30 µg) wurden nach III.8.3.2. in einem 1.2 %igen denaturierenden Agarosegel aufgetrennt und auf eine Hybond® N Nylonmembran transferiert. Der genaue Aufbau des Kapillarblots ist detailliert unter III.8.4.1. beschrieben. Zur Analyse auf Nylonmembran fixierter RNA wurde eine Hybridisierung mit einer DIG-11-dUTP markierten (vgl. III.8.5.1.) Volllänge-Sonde durchgeführt. Abb. IV.42. zeigt die gewebsspezifische Expression von MeJA-Esterase mRNA. Abb. IV.42.: Gewebsspezifische Expression von MeJA-Esterase mRNA. Hybridisierung von RNA aus Wurzel,

Blatt, Stängel und Blüte mit genspezifischer Sonde. Jeweils 30 µg Gesamt-RNA wurden mit einer

DIG-11-dUTP Volllänge-Sonde bei 42 ºC hybridisiert.

Wie aus Abb. IV.42. hervorgeht konnte in allen Geweben ein Hybridisierungssignal detektiert werden. In Blüte und Wurzel konnte die höchste Transkriptakkumulation nachgewiesen werden, während die MeJA-Esterase in Stängel und Blatt im Vergleich zu Blüte und Wurzel nur schwach exprimiert war.

IV. Ergebnisse 150

11.2. Spezifische Aktivität der MeJA-Esterase in verschiedenen Geweben von L. esculentum cv. Moneymaker

Um die Daten der Expression mit der tatsächlichen MeJA-Esterase Aktivtät vergleichen zu können, wurde zusätzlich zum Northern Blot eine Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität in Blüte, Blatt, Stängel und Wurzel durchgeführt. Hierfür wurden jeweils 0.5 g des unter III.6.2. gewonnenen tiefgefrorenen Pflanzengewebes in 2 ml KPi-Puffer (50 mM, pH 7.5, 20 mM EtSH) aufgenommen und wie unter III.6.1. beschrieben aufgeschlossen. Die Zellsuspension wurde auf Eis gerührt bis eine homogene Suspension entstand und zur Abtrennung von Zellwandbestandteilen durch vierlagigen Mull abgepresst. Der so gewonnene Rohextrakt wurde zur Bestimmung der spezifischen Aktivität im Standardtest (vgl. IV.1.2.2.) eingesetzt. Abb. IV. 43 zeigt die Aktivitätsverteilung der MeJA-Esterase in verschiedenen Geweben. Abb. IV.43.: Aktivität (pkat) der MeJA-Esterase pro Gesamtprotein (mg) in verschiedenen pflanzlichen

Geweben von L. esculentum cv. Moneymaker.

MeJA-Esterase Aktivität konnte in allen Geweben nachgewiesen werden. Aus Abb. IV.43 ist zu ersehen, dass die spezifische Aktivität der MeJA-Esterase in Wurzel (1.95 ± 0.14 pkat/mg) und Blüte (1.27 ± 0.08 pkat/mg) am höchsten war. Im Vergleich zu Blatt (0.21 ± 0.66 pkat/mg) und Stängel (0.28 ± 0.02 pkat/mg) war die spezifische Aktivität in Wurzel und Blüte fünf- bis neunfach erhöht.

IV. Ergebnisse 151

11.3. MeJA-Esterase Expression nach Zugabe von Methyljasmonat, Methylsalicylat und Chitosan zu Zellsuspensionskulturen von L. esculentum

Es sollte untersucht werden, ob das MeJA-Esterase Gen nach Zugabe von Methyljasmonat, Methylsalicylat und Chitosan zu Zellsuspensionskulturen von L. esculentum durch Induktion der entsprechenden mRNA vermehrt gebildet wird. Hierzu wurde ein mit Digoxigenin markiertes Oligonucleotid synthetisiert (vgl. III.8.5.1.), um die Veränderung der mRNA in Northern Blot Analysen (vgl. III.8.4.1.) zu überprüfen. Dazu wurden zunächst sechs 250 ml Erlenmeyerkolben einer L. esculentum Zellkultur (150 ml Zellkultursuspension) für vier Tage kultiviert. Um die Auswirkungen der beiden Phytohormone Methyljasmonat und Methylsalicylat, sowie von Chitosan (pilzlicher Elicitor) auf die pflanzliche Zellkultur zu verfolgen, wurden von den sechs Erlenmeyerkolben jeweils drei mit Methyljasmonat (50 µM), Methylsalicylat (50 µM) oder Chitosan (0.1 %) versetzt, während die restlichen drei Erlenmeyerkolben als Kontrolle dienten. Diese Kontrollen wurden mit 1.5 ml Methanol/Wasser (2:8, v/v) versetzt, da Methyljasmonat und Methylsalicylat darin gelöst wurden. Chitosan konnte der Zellkultur als Pulver zugesetzt werden. Der gesamte Versuch wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt. Um den zeitlichen Verlauf der Expressionsänderung verfolgen zu können, entnahm man den Erlenmeyerkolben unmittelbar nach der Applikation der Chemikalien (0 h) sowie nach 20 min, 40 min, 60 min, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h und 24 h jeweils ein Aliquot (20 ml) der Zellsuspensionskultur. Durch Vakuumfiltration wurden die Zellsuspensionskulturen vom Medium getrennt, in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und in einem vorgekühlten Mörser pulverisiert. Zur Isolierung der Gesamt-RNA wurden 200 mg tiefgefrorenes Gewebe nach der Trizol-Methode (vgl. III.8.2.2.) aufgeschlossen. Je 20 µg Gesamt-RNA wurden anschließend nach III.8.3.2. in einem 1.2 %igen denaturierenden Agarosegel aufgetrennt und nach III.8.4.1. auf eine Hybond® N Nylonmembran transferiert. Die Änderung der Expression wurde durch Hybridisierung mit einer nach III.8.5.1. hergestellten, DIGdUTP markierten Volllänge-cDNA-Sonde der MeJA-Esterase kontrolliert. Abb. IV.44. zeigt die über 24 h isolierte Gesamt-RNA der MeJA-Esterase, die nach Elicitierung mit Methyljasmonat, Methylsalicylat und Chitosan in Northern-Blots analysiert wurde. Um die RNA-Proben untereinander vergleichen zu können, wurde die gleichmäßige Beladung des Northern-Blot anhand der rRNA kontrolliert.

IV. Ergebnisse 152

Abb. IV.44.: Ergebnis der Northern-Hybridisierung mit einer DIGdUTP markierten Volllänge cDNA-Sonde der

MeJA-Esterase. Der Northern-Blot wurde mit 20 µg Gesamt-RNA hergestellt. Gesamt-RNA wurde

aus Zellkulturen von L. esculentum isoliert, die zuvor mit Methyljasmonat (50 µM, Abb. IV.44A.),

Methylsalicylat (50 µM, Abb. IV.44B.) und Chitosan (0.1 %, Abb. IV.44C.) behandelt worden

waren. Unmittelbar nach der Elicitierung (0 h) bzw. nach 0.3-, 0.6-, 1-, 2-, 3-, 4-, 8- und 24-

stündiger Inkubation mit den entsprechenden Substanzen wurden Proben aus den Zellkulturen

entnommen und Gesamt-RNA isoliert. Die gleichmäßige Beladung der Proben wurde mittels

rRNA überprüft.

Wie aus den 0 h Werten der Abb. IV.44 A.-C. hervorgeht, wurde die MeJA-Esterase konstitutiv exprimiert. Nach Zugabe des Elicitors Methyljasmonat sank der RNA-Gehalt in den Zellen ab. Erst nach 4 h stieg die Genexpression wieder an und erreichte nach 8 h den Ausgangswert. Der Elicitor Chitosan führte ebenfalls zu einer verminderten Transkription des MeJA-Esterasegens. Allerdings erfolgte die Abnahme des MeJA-Esterase Transkriptes nach 4-8 h. Im Vergleich zur Elicitierung mit Methyljasmonat also um 2-4 h später. Methylsalicylat hatte keinen Effekt auf die Expression der MeJA-Esterase. Die Northern-Blot Experimente zeigten somit, dass eine Elicitierung von L. esculentum Zellkulturen mit MeJA und Chitosan zu einer Repression der Transkription führte, während die Elicitierung mit Methylsalicylat keinen Einfluß auf die Transkription des MeJA-Esterasegens hatte.

V. Diskussion

153

V. Diskussion

1. Reinigung, Klonierung und Überexpression der MeJA-Esterase In den letzten 25 Jahren ist die Biosynthese der Jasmonate fast lückenlos aufgeklärt worden. Alle Intermediate des Biosyntheseweges konnten isoliert werden. Darüber hinaus wurden fast alle beteiligten Enzyme gereinigt und kloniert (VICK und ZIMMERMANN 1979, 1984; BRASH et al., 1988; HAMBERG, 1988). Die Bereitstellung der α-Linolensäure als Ausgangssubstrat der Jasmonsäure-Bildung ist dagegen noch nicht vollständig aufgeklärt worden. Inzwischen gibt es jedoch erste Hinweise auf Lipasen, die hierfür in Frage kommen könnten (ISHIGURO et al. 2001, NARVÁEZ-VÁSQUEZ et al., 1999). Vollkommene Unklarheit besteht darüber, welche Enzyme die drei Runden ß-Oxidation katalysieren und zur Bildung von Jasmonsäure (JA) führen. JA kann im Cytosol zu MeJA (SEO et al., 2001) und einer Reihe von Konjugaten umgewandelt werden (SEMBDNER und PARTHIER, 1993; KRUMM et al., 1995; MATSUURA und YOSHIHARA, 2003). Die Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT), welche die Bildung von Methyljasmonat (MeJA) katalysiert, konnte kürzlich durch SEO et al. (2001) identifiziert werden. Eine Esterase, welche MeJA zu JA hydrolysiert ist bislang noch nicht identifiziert worden. Sowohl JA als auch MeJA können in vivo durch die Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT) und eine unbekannte Esterase ineinander überführt werden. Beide Verbindungen werden als zelluläre Regulatoren von Entwicklungsprozessen und Mechanismen der Pflanze zur Abwehr von Pathogenen und Schädlingen diskutiert (WEBER, 2002). Bei der Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT) handelt es sich vermutlich um ein Schlüsselenzym JA-vermittelter Antworten (CHEONG und CHOI, 2003). Die Bedeutung einer MeJA-hydrolysierenden Esterase für die JA-Signaltransduktion ist noch unklar. Schon vor einigen Jahren wurde von unserer Arbeitsgruppe die Beobachtung gemacht, dass exogen zugeführtes MeJA innerhalb von Minuten von einer Reihe von pflanzlichen Zellkulturen aufgenommen und zu JA hydrolysiert werden kann. Ausgehend von diesen Befunden sollte das entsprechende Enzym, welches die Hydrolyse von MeJA zu JA katalysiert und nachfolgend als Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase) bezeichnet wird, gereinigt, kloniert und überexprimiert werden. Diese Arbeiten bildeten die Grundlage für eine Aufklärung funktioneller Aspekte in der Zukunft.

V. Diskussion

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1.1. Reinigung und Identifizierung der MeJA-Esterase Zur Identifizierung und Charakterisierung eines unbekannten Enzyms ist es notwendig, dieses bis zur Homogenität zu reinigen. Nach Etablierung radioaktiver Enzymassays zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der MeJA-Esterase Aktivität mit Methyl-[2-14C]jasmonat und [Methyl-3H]Methyljasmonat konnte gezeigt werden, dass 18 untersuchte pflanzliche Zellkulturen MeJA hydrolysieren konnten. Eine Arabidopsis-Zellkultur wäre als Ausgangsmaterial für die Reinigung besonders geeignet gewesen, da spätere Klonierungsarbeiten aufgrund des bekannten Genoms von Arabidopsis leichter hätten durchgeführt werden können. Eine Arabidopsis-Zellkultur stand jedoch zu Beginn der Arbeiten noch nicht zur Verfügung. Neben Arabidopsis ist bislang nur das Genom von Reis vollständig sequenziert worden. Die Sequenzierung weiterer Pflanzen, darunter hauptsächlich Nutzpflanzen wie z. B. Mais, Kartoffel, Weizen, Gerste, Roggen, Soja, Baumwolle und Tomate sind derzeit in Bearbeitung (http://www.tigr.org/tdb/tgi/plant.shtml). Da eine Tomaten-Zellsuspensionskultur zur Verfügung stand, wurde diese aufgrund der zahlreichen Sequenzinformationen von Tomate, die in Datenbanken verfügbar sind, zur Reinigung der MeJA-Esterase ausgewählt. Da das Tomaten-Genom allerdings noch nicht vollständig sequenziert ist und die klonierte MeJA-Esterase nicht darin enthalten war, konnten hieraus leider keine Informationen für die Klonierung abgeleitet werden. Dennoch ist Tomate wegen ihrer Bedeutung als Nutzpflanze ein gut untersuchter Organismus. Wichtige Daten zum Jasmonsäure-Signaltransduktionsweg, vor allem bei Verwundung und der Pathogenabwehr (RYAN und PEARCE, 2003; RYAN, 2000) wurden durch Arbeiten an Tomate gesammelt. In intakten Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) konnte eine MeJA-Esterase Aktivität in allen Pflanzenteilen nachgewiesen werden. Die Isolierung des Enzyms erfolgte aus heterotrophen Lycopersicon esculentum Zellsuspensionskulturen, da es sich um eine sehr gut wachsende Zellkultur handelte und keine Abtrennung von störendem Chlorophyll erfolgen musste. Die MeJA-Esterase wurde über einen 6-stufigen Reinigungsprozeß isoliert und konnte bis zur fast apparenten Homogenität gereinigt werden. An eine 70 %ige Ammoniumsulfatfällung schlossen sich sechs säulenchromatographische Reinigungsschritte an. Das Protein wurde 767-fach angereichert und die Ausbeute betrug 2.2 %. Innerhalb der Messgenauigkeit konnte die MeJA-Esterase Aktivität einer prominenten Proteinbande zugeordnet werden, welche zumindest das quantitativ wichtigste Enzym für die Hydrolyse von MeJA in Tomaten-Zellkulturen darstellt. Während der chromatographischen Reinigungsschritte fiel die MeJA-Esterase Aktivität stets in einem Proteinpeak an. Aktive Fraktionen mit MeJA-Esterase Aktivität wurden für den jeweils folgenden Reinigungsschritt verwendet. Die

V. Diskussion

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Enzymreinigung ergab keine Anhaltspunkte dafür, dass eine weitere MeJA-Esterase in Tomaten-Zellsuspensionskulturen vorkommt. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass weitere MeJA-Esterasen existieren, die im Rahmen der Messgenauigkeit nicht nachgewiesen werden konnten. Sicher kann jedoch davon ausgegangen werden, dass die gereinigte MeJA-Esterase das quantitiativ bedeutendste Enzym mit MeJA-Esterase Aktivität in Tomaten-Zellsuspensionskulturen darstellt. Die gereinigte MeJA-Esterase und ein als geringe Verunreinigung vorhandenes Protein wurden mittels klassischer Edman-Sequenzierung untersucht. Dabei wurden N-terminale Aminosäuresequenz und interne Aminosäuresequenzen beider Proteine bestimmt. Die erhaltenen Aminosäuresequenzen wurden mit verschiedenen Datenbanken (SwissProt und EMBL Datenbank) analysiert. Anhand der Datenbankrecherchen mittels Aminosäuresequenzen ließ sich die putative Esterase als ein bisher unbekanntes Protein der Superfamilie der „α/β-Fold“-Hydrolasen zuordnen. Bei der Verunreinigung handelte es sich um ein Hitzeschockprotein (Hsp70) aus L. esculentum. Hitzeschockproteine sind ubiquitär verbreitet, an einer Vielzahl von Proteinfaltungsprozessen beteiligt (ZHANG und GLASER, 2002) und werden häufig als Verunreinigungen in angereinigten Proteinproben gefunden. 1.2. Klonierung der MeJA-Esterase Nach Reinigung und Sequenzierung der MeJA-Esterase erfolgte die Klonierung des entsprechenden Gens. Eine Klonierung codierender DNA-Sequenzen aus Eukaryoten kann auf unterschiedliche Art und Weise durchgeführt werden. Ein bewährtes Verfahren ist das Erstellen einer Genbibliothek. Mit einer geeigneten Sonde kann die Genbibliothek anschließend durchmustert werden und das gesuchte Gen identifiziert werden. Da die Erstellung einer Genbibliothek jedoch zeitintensiv ist, wurde für die Klonierung der MeJA-Esterase die sogenannte RACE-Methode („Rapid Amplification of cDNA Ends“) ausgewählt. Für die RACE-Methode sind Sequenzinformationen des zu isolierenden Gens nötig, die im Fall der MeJA-Esterase zur Verfügung standen. Es konnte eine cDNA-Sequenz kloniert werden, deren offener Leserahmen für ein aus 262 Aminosäuren bestehendes Protein codierte. Datenbankvergleiche der kompletten, von der cDNA-Basenabfolge abgeleiteten Aminosäuresequenz und der sequenzierten Spaltpeptide machten deutlich, dass es sich bei dem gereinigten und klonierten Enzym wie erwartet um eine Esterase handelte. Die Homologie zu anderen Enzymen soll in einem späteren Abschnitt (vgl. V.3.) diskutiert werden.

V. Diskussion

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Nachteilig an der Klonierung mittels der RACE-Methode ist, dass möglicherweise Isoenzyme unentdeckt bleiben, die bei der Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek ebenfalls hätten identifiziert und kloniert werden können. Mittels einer Southern-Blot Analyse wurde die Kopienanzahl der zur MeJA-Esterase korrespondierenden Gene ermittelt. Die Auswertung des Southern-Blot ergab, dass mindestens zwei bis sieben DNA-Abschnitte mit der Volllänge-Sonde der MeJA-Esterase hybridisierten. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die MeJA-Esterase zu einer Genfamilie gehört. Für eine Hydroxynitrillyase aus Manihot esculenta, die hohe Homologie zur MeJA-Esterase aufweist, konnten ebenfalls mehrere Genkopien nachgewiesen werden (HUGHES et al., 1998). Unklar bleibt, ob es im Falle der MeJA-Esterase mehrere homologe Gene gibt, oder ob eine Hybridisierung der Volllänge-Sonde mit Pseudogenen erfolgte. Pseudogene stellen Genkopien dar, die ein funktionelles Protein in voller Länge codieren, aber nicht exprimieren und durch Mutation aus aktiven Vorläufergenen hervorgegangen sind. Es können auch mehrere Signale nach Hybridisierung mit der MeJA-Esterase Volllänge Sonde auftreten, wenn das Gen Introns besitzt, die von Restriktionsenzymen hätten geschnitten werden können, wie es beispielsweise bei einer Hydroxynitrillyase aus Hevea brasiliensis vermutet wird (HASSLACHER et al., 1996). Während der Reinigung der MeJA-Esterase gab es jedoch keine Hinweise darauf, dass Isoenzyme existieren. 1.3 Heterologe Expression und Reinigung der rekombinanten MeJA-Esterase Das Gen der MeJA-Esterase wurde in E. coli heterolog exprimiert. Hierdurch konnte der Beweis erbracht werden, dass die klonierte cDNA tatsächlich für das Gen der MeJA-Esterase codierte. Nachdem die komplette cDNA der MeJA-Esterase in den Expressionsvektor pQE70 kloniert und in E. coli M15 exprimiert wurde, konnten Klone isoliert werden, die MeJA-Esterase Aktivität zeigten. Es wurden vergleichende Aktivitätstests mit Proteinextrakten aus dem E. coli M15 Wirtsstamm mit und ohne Expressionsvektor durchgeführt. Diese Aktivitätstests zeigten, dass die Hydrolyse des Methyljasmonats weder durch bakterieneigene Enzyme noch durch Enzyme katalysiert wurden, die durch den leeren Expressionsvektor codiert wurden. Das Produkt der MeJA-Hydrolyse (Jasmonsäure) wurde über GC-MS-Messungen identifiziert. Um nachfolgend eine biochemische Charakterisierung der rekombinanten MeJA-Esterase durchzuführen, sollten größere Mengen des überexprimierten Proteins gereinigt werden. Allerdings wurde die MeJA-Esterase nur schwach exprimiert und die Expression konnte nicht induziert werden. Die Induktion einer Expression rekombinanter Proteine schlägt oftmals fehl und bedarf häufig einer Optimierung der Kultivierungs-Bedingungen. Um dennoch ausreichend Mengen der

V. Diskussion

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rekombinanten MeJA-Esterase isolieren zu können, wurden große Ansätze (5 l) mit transgenen Bakterien durchgeführt. Die rekombinante MeJA-Esterase wurde anschließend über drei säulenchromatographische und einen affinitätschromatographischen Schritt gereinigt. Dabei wurde die rekombinante MeJA-Esterase 283-fach bei einer Ausbeute von 0.8 % angereichert. Weshalb die MeJA-Esterase nur so schwach exprimiert wurde, ist unklar. Bei der Klonierung und Expression der Polyneuridinaldehydesterase führte die Verwendung des Expressionsvektors pQE70 und Bakterienstammes E. coli M15 nach nur einem Reinigungsschritt über Nickel-Affinitätsmaterial zu einer 900-fachen Anreicherung mit einer Ausbeute von 1 % (DOGRU et al., 2000). Um zu überprüfen, ob der Hexahistidin-Rest am N-Terminus der MeJA-Esterase korrekt translatiert worden war, wurde ein Western-Blot durchgeführt. Im Western-Blot konnte eindeutig eine Bande in der entsprechenden Größe der MeJA-Esterase zugeordnet werden. Es wurden also Histidine am C-Terminus der MeJA-Esterase translatiert. Allerdings lässt sich keine Aussage darüber machen, ob wirklich alle sechs Histidine vorhanden sind. Da Organismen wie E. coli und Tomate unterschiedliche Codons für bestimmte Aminosäuren verwenden, könnte ein Grund für die schwache Expression der MeJA-Esterase am Codonbedarf für die Translation des Tomatengens liegen (GRANTHAM et al., 1980; FRANCESCA et al., 2000). Besonders auffallend sind die Unterschiede in der Codonnutzung für die Aminosäure Arginin. Während von allen in E. coli vorkommenden Arginin-Codons nur 0.2 % für AGA bzw. 0.12 % für AGG stehen, treten diese Codons bei L. esculentum fast siebenmal häufiger auf (1.4 % für AGA bzw 0.78 % für AGG). Ähnliches gilt für die Codons der Aminosäuren Leucin (CTA) und Isoleucin (ATA) (WADA et al., 1990). Da in den ersten 30 Aminosäuren der MeJA-Esterase sowohl Leucin (CTA) als auch Arginin (AGA) vorkommen, könnte hierdurch ein Abbruch der Translation der MeJA-Esterase erklärt werden. Eine Möglichkeit, das Problem der unterschiedlichen Codonnutzung zu umgehen, hätte darin bestanden, gezielt modifizierte Bakterienstämme zu verwenden, die zusätzliche codierende Plasmide für seltene tRNAs enthalten. Eine zweite Möglichkeit bestünde darin, die entsprechenden Nucleotide des MeJA-Esterasegens gezielt über Mutagenese auszutauschen.

V. Diskussion

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2. Biochemische Charakterisierung der MeJA-Esterase 2.1 Substratspezifität und Reaktionskinetik Enzyme können sehr in ihrer Substratspezifität variieren. Manche zeigen eine fast absolute Spezifität für ein bestimmtes Substrat und reagieren nicht einmal mit nahe verwandten Molekülen, wie dies z. B. bei pflanzlichen Enzymen des Sekundärstoffwechsels häufig der Fall ist (CHOU und KUTCHAN, 1998). Andere Enzyme, beispielsweise Cytochrome, akkzeptieren eine ganze Klasse von Molekülen mit gemeinsamen Strukturmerkmalen. Die Substratspezifität von Esterasen kann ebenfalls sehr stark variieren. So weist die Polyneuridinaldehydesterase aus Rauvolfia serpentina eine außergewöhnlich enge Substratspezifität auf. Von 18 getesteten Substraten, darunter verschiedene Alkaloidmethylester und künstliche Substrate wie z. B. Naphtylacetat, wurde einzig und alleine die Spaltung von Polyneuridinaldehyd zu Vellosimin katalysiert (DOGRU et al., 2000). Andere pflanzliche Esterasen hingegen sind weit weniger spezifisch und akkzeptieren ein breites Spektrum an Substraten. Die geringe Substratspezifität von Esterasen die an der Hydrolyse von Menthylacetat (CROTEAU und HOOPER, 1978), dem Pyrethroid-Insektizid Cyfluthrin (PREISS et al., 1988), Cardenoliden (KANDZIA et al., 1998) und Geranylacetat (DUBEY et al., 2003) beteiligt sind, konnte gezeigt werden. Im Rahmen der Untersuchungen zur Substratspezifität der MeJA-Esterase wurden neben Methyljasmonat verschiedene Methylester von Phytohormonen (Indol-3-essigsäuremethylester, (±) Abscissinsäuremethylester und Salicylsäuremethylester), Fettsäuremethylester (Linolsäuremethylester und Linolensäuremethylester) sowie aromatische Methylester (Zimtsäuremethylester und Benzoesäuremethylester) getestet. Bei der MeJA-Esterase handelt es sich um kein spezifisches Enzym, das nur Methyljasmonat spaltet. Neben Methyljasmonat wurden auch die Methylester der Indol-3-essigsäure, der Abscissinsäure und der Linolensäure gespalten. Linolsäure- und aromatische Methylester wurden dagegen nur mit einer relativ geringen Aktivität (2–5 % der MeJA-Esterase Aktivität bei millimolaren Substratkonzentrationen) umgesetzt. Im Gegensatz zur MeJA-Esterase ist die Jasmonsäurecarboxyl-Methyltransferase (JMT) aus A. thaliana, welche die Methylierung von Jasmonsäure katalysiert, hochspezifisch. Sie akzeptiert neben Jasmonsäure einzig und alleine Dihydrojasmonsäure als weiteres Substrat. Die relative Aktivität liegt bei nur 18 % im Vergleich zur Methylierung von Jasmonsäure. Linolensäure, 12-Oxo-Phytodiensäure, Salicylsäure, Benzoesäure und Zimtsäure werden nicht als Substrate akzeptiert (SEO et al., 2001). Während die Substratspezifitäten von JMT und MeJA-Esterase sehr unterschiedlich sind, so lassen sich die Michaelis-Menten-Konstante (KM-Wert) sehr gut vergleichen. Der KM-Wert (14.7 µM ± 0.8 µM) der nativen MeJA-Esterase zeigt

V. Diskussion

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die Fähigkeit des Enzyms auch bei niedrigen intrazellulären Konzentrationen an MeJA effektiv zu arbeiten und bewegt sich in demselben Bereich wie der KM-Wert (38.5 µM) der JMT (SEO et al., 2001). 2.2. Bestimmung der apparenten molekularen Masse der MeJA-Esterase Das Molekulargewicht der nativen MeJA-Esterase wurde mit unterschiedlichen Methoden bestimmt. Sie sollten Aufschluss über die Größe des Proteins geben und die Frage klären, ob das Protein aus mehreren Untereinheiten besteht. Durch Gelfiltration konnte ein Molekulargewicht des nativen Proteins von 26 kDa bestimmt werden, das mit dem mittels SDS-PAGE bestimmten Molekulargewicht von 28 kDa übereinstimmte. Eine Analyse der MeJA-Esterase mittels ESI-TOF Massenspektroskopie ergab ein Molekulargewicht von 28547.714 ± 237.339 Da. Das berechnete Molekulargewicht betrug 29526.96 Da und wurde mittels „Compute pI/MW“ der Proteindatenbank Expasy (www.expasy.ch) ermittelt. Die Sequenzierung der aus Tomate gereinigten MeJA-Esterase hatte gezeigt, dass Proteasen Aminosäuren am N-Terminus des Enzyms abgespalten hatten. Eine Hemmung der Proteasen mittels Proteaseinhibitoren konnte während der Proteinaufreinigung nicht durchgeführt werden, da nicht nur die katalytische Aktivität der Proteasen sondern auch der MeJA-Esterase gehemmt worden wäre. Bei der Bestimmung des Molekulargewichtes mittels nativer Gelfiltration, SDS-PAGE und ESI-TOF Massenspektroskopie wurde somit ein Proteingemisch der MeJA-Esterase mit unterschiedlichen Längen der Aminosäuresequenzen vermessen. Hierdurch lässt sich die Differenz von etwa 1 kDa zwischen experimentell ermitteltem und berechnetem Molekulargewicht erklären. Das Molekulargewicht der rekombinanten MeJA-Esterase wurde nur mittels SDS-PAGE ermittelt und stimmte mit dem Molekulargewicht der nativen MeJA-Esterase erwartungsgemäß überein. Vergleicht man das Molekulargewicht der MeJA-Esterase mit Literaturwerten nahverwandter Esterasen, wie z. B. der Polyneuridinaldehydesterase aus Rauvolfia serpentina (DOGRU et al., 2000) und der Ethylen-induzierten Esterase aus Citrus sinensis, so bewegen sich die Molekulargewichte dieser Esterasen ebenfalls zwischen 28 und 32 kDa. Allerdings unterscheiden sich die Enzyme in ihren Untereinheiten. Für Pir7b, ein hydrolytisches Enzym aus Oryza sativa konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass es sich um ein Monomer handelt (WÄSPI et al. 1998). Anfänglich vermutete man auch bei der α-Hydroxynitrillyase aus Hevea brasiliensis eine monomere Struktur. In Puffer-Lösungen mit geringer Salzkonzentration formt sich hingegen ein aktives Homodimer aus Monomeren (HASSLACHER et al., 1996). Eine anfänglich vermutete monomere Struktur der Polyneuridinaldehydesterase (DOGRU et al., 2000) konnte

V. Diskussion

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widerlegt werden. Mittels Gelfiltration bei neutralem pH-Wert konnte ein Homodimer nachgewiesen werden. Disulfidbrücken scheinen nicht an der Dimerisierung beteiligt zu sein, da β-Mercaptoethanol keinen Effekt auf das Homodimer hatte. Sequenzvergleiche zwischen α-Hydroxynitrillyase aus H. brasiliensis und Polyneuridinaldehydesterase aus R. serpentina lassen vermuten, dass die Monomere über eine hydrophobe Kontaktstelle miteinander wechselwirken und Dimere ausbilden (MATTERN-DOGRU et al., 2002). Aus M. esculenta ist eine α-Hydroxynitrillyase bekannt die sogar Homotrimere oder Homotetramere ausbilden kann (HICKEL et al., 1996). Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von MeJA-Esterase, α-Hydroxynitrillyase aus H. brasiliensis und Polyneuridinaldehydesterase aus R. serpentina macht deutlich, dass die MeJA-Esterase über konservierte hydrophobe Bereiche verfügt, die an der Ausbildung von Dimeren beteiligt sein könnten (Abb. V.1.). Inwieweit die experimentell ermittelten Daten für die MeJA-Esterase mit den tatsächlichen Verhältnissen in vivo übereinstimmen und ob es sich tatsächlich um ein Monomer handelt, ist deshalb fraglich. Die Hochsalzbedingungen während der chromatographischen Reinigungsschritte könnten leicht dazu führen, dass hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den beiden Monomeren aufgehoben werden. Deshalb müsste der Einfluss der Salzkonzentration auf die Quartärstruktur der MeJA-Esterase untersucht werden. Beispielsweise könnte die Bestimmung des Molekulargewichtes der nativen MeJA-Esterase mittels Gelfiltration mit Puffern unterschiedlicher Salzkonzentration durchgeführt werden. MJE ----MEKGDKNHFVLVHGACHGAWCWYKVVTILRSEGHKVSVLDMAASGINPKHVDDLNS PNAE MHSAANAKQQKHFVLVHGGCLGAWIWYKLKPLLESAGHKVTAVDLSAAGINPRRLDEIHT HNL-HB -------MAFAHFVLIHTICHGAWIWHKLKPLLEALGHKVTALDLAASGVDPRQIEEIGS MJE MADYNEPLMEFMNSLPQLERVVLVGHSMGGINISLAMEKFPQKIVVAVFVTAFMPGPDLN PNAE FRDYSEPLMEVMASIPPDEKVVLLGHSFGGMSLGLAMETYPEKISVAVFMSAMMPDPNHS HNL-HB FDEYSEPLLTFLEALPPGEKVILVGESCGGLNIAIAADKYCEKIAAAVFHNSVLPDTEHC MJE LVALGQQYNQQV--ESH--MDTEFVYNNG-QDKAPTSLVLGPEVLATNFYQLSPPEDLTL PNAE LTYPFEKYNEKC--PADMMLDSQFSTYGN-PENPGMSMILGPQFMALKMFQNCSVEDLEL HNL-HB PSYVVDKLMEVF--PD--WKDTTYFTYTK-DGKEITGLKLGFTLLRENLYTLCGPEEYEL MJE ATYLVRPVPLFD-ESILLANTTLSKEKYGSVHRVYVVCDKDNVLKEQQFQKWLINNNPPD PNAE AKMLTRPGSLFFQ--DLAKAKKFSTERYGSVKRAYIFCNEDKSFP-VEFQKWFVESVGAD HNL-HB AKMLTRKGSLFQN--ILAKRPFFTKEGYGSIKKIYVWTDQDEIFL-PEFQLWQIENYKPD MJE EVQIIHNADHMVMFSKPRDLSSCLVMISQKYY PNAE KVKEIKEADHMGMLSQPREVCKCLLDISDS-- HNL-HB KVYKVEGGDHKLQLTKTKEIAEILQEVADTYN

Abb. V.1.: Aminosäuresequenzvergleich („Multiple Sequence Alignment“) der MeJA-Esterase (MJE) aus L.

esculentum, Polyneuridinaldehydesterase (PNAE) aus R. serpentina und α-Hydroxynitrillyase (HNL-

HB) aus H. brasiliensis. Grau unterlegte Aminosäuresequenzen markieren apolare Bereiche, die

vermutlich für eine Dimerisierung der Enzyme verantwortlich sind (MATTERN-DOGRU et al., 2002).

V. Diskussion

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3. Datenbankvergleiche („Multiple Sequence Alignment“) Datenbankvergleiche sollten einen Aufschluss über die Identität des klonierten Gens liefern. Anhand von Homologievergleichen wurde der evolutionäre Verwandtschaftsgrad zu anderen Enzymen bestimmt und mit den 262 Aminosäuren des codierenden Leserahmens ein Datenbankvergleich durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die MeJA-Esterase eine 33 – 47 %ige Homologie zu verschiedenen pflanzlichen Esterasen, α-Hydroxynitrillyasen und zu dem Protein Pir 7b, das an der Pathogenabwehr in Oryza sativa beteiligt ist, aufwies (WÄSPI et al., 1998) (Abb. V.2.). Die Proteine, welche miteinander verglichen wurden, wurden wie folgt abgekürzt: MJE Methyljasmonat-Esterase Lycopersicon esculentum PNAE Polyneuridinaldehydesterase Rauvolfia serpentina EIE Ethylen-induzierte Esterase Citrus sinensis HNLME α-Hydroxynitrillyase Manihot esculenta HNLHB α-Hydroxynitrillyase Hevea brasiliensis PIR 7B Pseudomonas-induziertes Protein Oryza sativa MJE ----MEKGDKNHFVLVHGACHGAWCWYKVVTILRSEGHKVSVLDMAASGINPKHVDDLNS EIE -MEEVVGMEEKHFVLVHGVNHGAWCWYKLKARLVAGGHRVTAVDLAASGINMKRIEDVHT PNAE MHSAANAKQQKHFVLVHGGCLGAWIWYKLKPLLESAGHKVTAVDLSAAGINPRRLDEIHT PIR7B -----MEDGGKHFVFVHGLGHGAWCWYRVVAALRAAGHRATALDMAAAGAHPARADEVGS HNLME -------MAVVDFVLIHTICHGAWIWYKLKPVLEAAGHKVTALDLAASGVDPRQIEQINS HNLHB -------MAFAHFVLIHTICHGAWIWHKLKPLLEALGHKVTALDLAASGVDPRQIEEIGS MJE MADYNEPLMEFMNSLPQLERVVLVGHSMGGINISLAMEKFPQKIVVAVFVTAFMPGPDLN EIE FHAYSEPLMEVLASLPAEEKVILVGHSLGGVTLALAGDKFPHKISVAVFVTAFMPDTTHR PNAE FRDYSEPLMEVMASIPPDEKVVLLGHSFGGMSLGLAMETYPEKISVAVFMSAMMPDPNHS PIR7B LEEYSRPLLDAVAAAAPGERLVLVGHSLGGLSLALAMERFPDKVAAAVFLAACMPAAGKH HNLME FDEYSEPLLTFMESLPQGEKVILVGESCGGLNIAIAADKYPEKIAAAVFQNSLLPDTKHK HNLHB FDEYSEPLLTFLEALPPGEKVILVGESCGGLNIAIAADKYCEKIAAAVFHNSVLPDTEHC MJE LVALGQQYNQQV--ESH--MDTEFVYNNG-QDKAPTSLVLGPEVLATNFYQLSPPEDLTL EIE PSFVLEQYSEKMGKEDDSWLDTQFSQCDA-SNPSHISMLFGREFLTIKIYQLCPPEDLEL PNAE LTYPFEKYNEKC--PADMMLDSQFSTYGN-PENPGMSMILGPQFMALKMFQNCSVEDLEL PIR7B MGITLEEFMRRI--KPDFFMDSKTIVLNT-NQEPRTAVLLGPKLLAEKLYNRSPPEDLTL HNLME PSYVVDKLMEVF--PD--WKDTEYFEFSNSNGETITGMVLGLKLMRENLYTICPPEDYEL HNLHB PSYVVDKLMEVF--PD--WKDTTYFTYTK-DGKEITGLKLGFTLLRENLYTLCGPEEYEL MJE ATYLVRPVPLFD-ESILLANTTLSKEKYGSVHRVYVVCDKDNVLKEQQFQKWLINNNPPD EIE AKMLVRPGSMFID--NLSKESKFSDEGYGSVKRVYLVCEEDIGLP-KQFQHWMIQNYPVN PNAE AKMLTRPGSLFFQ--DLAKAKKFSTERYGSVKRAYIFCNEDKSFP-VEFQKWFVESVGAD PIR7B ATMLVRPGTNYIDDPIMKDETLLTEGNYGSVKRVFLVAMDDASSD-EEMQRWTIDLSPGV HNLME AKMLTRRGSLFQS--ILAQREKFTEKGYGSIKKIYVWTGDDKIFL-PEFQLWQIENYKPD HNLHB AKMLTRKGSLFQN--ILAKRPFFTKEGYGSIKKIYVWTDQDEIFL-PEFQLWQIENYKPD

V. Diskussion

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MJE EVQIIHNADHMVMFSKPRDLSSCLVMISQKYY EIE EVMEIKGGDHMAMLSDPQKLCDCLSQISLKYA PNAE KVKEIKEADHMGMLSQPREVCKCLLDISDS-- PIR7B EVEELAGADHMAMCSKPRELCDLLLRIAAKYD HNLME LVFRVMGGDHKLQLTKTNEIAGILQKVADIYA HNLHB KVYKVEGGDHKLQLTKTKEIAEILQEVADTYN

Abb. V.2.: Aminosäuresequenzvergleich („Multiple Sequence Alignment“) der MeJA-Esterase mit fünf Proteinen

der Familie der „α/β-Fold“-Hydrolasen. Rot unterlegt sind identische Aminosäuren. Türkis unterlegt

sind Aminosäuren, die in mindestens vier von fünf Sequenzen identisch sind. Gelb unterlegt sind

Aminosäuren, die in mindestens drei von fünf Sequenzen identisch sind. Grün unterlegt sind die für

eine katalytische Funktion wichtigen Aminosäuren. Eine hochkonservierte Signatur, die allen Lipasen

gemeinsam ist, ist mit einem schwarzen Rahmen versehen.

Mehrere putative Proteine aus A. thaliana zeigten ebenfalls hohe Homologie zur MeJA-Esterase. Da sie allerdings nicht charakterisiert sind und ihre Funktion unbekannt ist, wurde ein Homologievergleich nur mit bereits charakterisierten Proteinen durchgeführt. Eine Recherche mit dem Programm Prosite der Datenbank Expasy ergab, dass es sich bei der MeJA-Esterase vermutlich um ein cytosolisches Protein handelt. Es konnten keine Sequenzen ermittelt werden, die als Sezernierungssignale dienen könnten. Diese Vermutung beruht allerdings auf einer Untersuchung der Primärstruktur des Proteins. Da aber mittlerweile schon Ausnahmen von den Strukturregeln für sekretorische Proteine gefunden wurden und mehrere Transportmechanismen in das Endoplasmatische Retikulum diskutiert werden (ZHENG und GIERASCH, 1996), kann diese Frage nur durch eine Lokalisation des Enzyms in vivo geklärt werden. Für die Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT), welche die Methylierung von JA katalysiert, konnten ebenfalls keine Signalsequenzen für eine subzelluläre Lokalisation nachgewiesen werden (SEO et al., 2001). 3.1. Die „α/β-Fold“-Hydrolase-Superfamilie Alle Proteine die hohe Homologie zur MeJA-Esterase zeigten, gehören zur extrem divergenten Superfamilie der „α/β-Fold“-Hydrolasen (NARDINI und DIJKSTRA, 1999). Die Vermutung, dass die MeJA-Esterase ebenfalls dieser Familie angehört, konnte bestätigt werden. Allen Enzymen der „α/β-Fold“-Hydrolase-Superfamilie ist eine hochkonservierte Anordnung der katalytischen Triade, bestehend aus einem Nukleophil (Ser, Cys oder Asp), einer Säure (Asp oder Glu) sowie einem Histidinrest, gemeinsam. Sequenzvergleiche ergaben, dass die Aminosäuren der katalytischen Triade, die in den homologen Proteinen hochkonserviert waren, ebenfalls bei der MeJA-Esterase wieder gefunden werden konnten. Serin (Pos. 83), Asparaginsäure

V. Diskussion

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(Pos. 211) und Histidin (Pos. 240) bilden vermutlich das katalytische Zentrum der MeJA-Esterase. Eine Recherche mit dem Programm Prosite der Datenbank Expasy zeigte in der Umgebung des Nukleophils Serin (Pos. 83) eine flankierende hochkonservierte Signatur an, die allen Lipasen gemeinsam ist (FALQUET et al., 2002). Die Signatur mit der Aminosäurenabfolge V-LVGHS-GG konnte auch bei der MeJA-Esterase gefunden werden. Innerhalb der Superfamilie der „α/β-Fold“-Hydrolasen weisen die Enzyme eine geringe Sequenzübereinstimmung zueinander auf. „α/β-Fold“-Hydrolasen Proteine lassen sich in viele verschiedene Familien aufgliedern, darunter Lipasen, Phospholipasen, Prolinoligopeptidasen, Carboxylesterasen, Haloalkandehalo-genasen, Semialdehydhydrolasen, Haloalkanperoxidasen, Epoxidhydrolasen, Serincarboxypeptidasen, Cholesterolesterasen und Acetylcholinesterase (HEIKINHEIMO et al., 1999). In einer eigenen Datenbank (ESTHER/ www.ensam.inra.fr/cholinesterase) werden alle erhältlichen Informationen über „α/β-Fold“-Hydrolase Proteine gesammelt und bereitgestellt (COUSIN et al., 1997). Die Topologie der „α/β-Fold“-Hydrolase Proteine zeichnet sich durch eine stark verdrillte, 8-11 strängige, meist parallele β-Faltblattanordnung aus, die an beiden Seiten von α-Helices flankiert wird (Abb.V.3.). Die hochkonservierte Topologie trotz geringer Sequenz-Homologie lässt vermuten, dass die Proteine mittels divergenter Entwicklung aus einem gemeinsamen Vorfahren entstanden sind (OLLIS et al., 1992). Abb. V.3.: Schema der Sekundärstruktur, die allen „α/β-Fold“-Hydrolasen gemeinsam ist. α-Helices und β-

Faltblattstrukturen sind mittels Zylinder und Pfeilen dargestellt. Schwarze Punkte markieren die Lage

der katalytischen Triade (NARDINI und DIJKSTRA, 1999; modifiziert).

V. Diskussion

164

3.2. Katalytische Triade der MeJA-Esterase Ein Verständnis der Proteinfunktion auf molekularer Ebene kann auf verschiedene Weise gewonnen werden. Röntgenkristallographische Methoden gewähren Einblicke in die dreidimensionale Struktur von Proteinen, liefern ein Strukturmodell mit den Positionen einzelner Atome und sind ein Instrument zur Aufklärung des katalytischen Mechanismus eines Enzyms. Bisher konnten Röntgenstrukturanalysen nur für die α-Hydroxynitrillyase aus H. brasiliensis durchgeführt werden (ZUEGG et al., 1999; GRUBER et al., 1999). Für α-Hydroxynitrillyasen wurde in Analogie zu Serin-Hydrolasen (WHARTON, 1998) ein Katalyse-Mechanismus unter Ausbildung eines Hemiacetals (oder Hemiketals) über eine kovalente Bindung an Serin (Pos. 80) postuliert (WAGNER et al., 1996). Röntgenstrukturanalysen lassen eine Säure/Basen-katalysierten Mechanismus vermuten (WAJANT und PFIZENMAIER, 1996). Aufgrund der näheren Verwandtschaft zur MeJA-Esterase sollen die Versuche zur Aufklärung der katalytischen Triade der rekombinanten Polyneuridinaldehydesterase aus R. serpentina näher beleuchtet werden. Der Austausch einzelner Basen mittels gerichteter Mutagenese bietet eine Möglichkeit Aminosäuren zu substitutieren. Eine schrittweise Substitution sämtlicher Aminosäuren durch Alanin oder Glycin ermöglicht die Identifizierung „essentieller“ funktioneller Aminosäuren, die eine katalytischen Triade ausbilden. Im Falle der Polyneuridinaldehydesterase wurden zuerst mit Inhibitorstudien potentielle Aminosäuren für spätere Mutagenesesstudien designiert. Keine Hemmung konnte mit Pefabloc SC (AEBSF) (MINTZ, 1993), einem selektiven Serin-modifizierende Agens und E-64 (UMEZAWA und AOYAGI, 1983), einem selektiven Cystein-Inhibitor erzielt werden. Mittels Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, 1.0 mM), einem Serin-Proteaseinhibitor (GOLD, 1965) wurde die Polyneuridinaldehydesterase zu 12-20 % inhibiert. Ein vollständiger Verlust der katalytischen Aktivität konnte durch DEPC, das Histidin-Reste modifiziert (MILES, 1977) und durch Hg+2-Ionen erreicht werden. Interessanterweise wurde die MeJA-Esterase bei einer Konzentration von 5 mM PMSF vollständig gehemmt. In Gegenwart von 1 mM PMSF ging die katalytische Aktivität der nativen MeJA-Esterase auf 20 % der Ausgangsaktivität zurück, was mit den Daten der Polyneuridinaldehydesterase übereinstimmt. Bei PMSF handelt es sich um einen hochspezifischen Inhibitor von Serin-Hydrolasen. Die Hemmung der MeJA-Esterase durch PMSF liefert einen Hinweis darauf, dass die MeJA-Esterase eine katalytische Triade mit einem reaktiven Serin-Rest besitzt. Leupeptin, Bestatin, Pepstatin, NEM und Iodacetamid (Thiol-, Metall- und Carboxyprotease-Inhibitoren) übten keine hemmende Wirkung auf die MeJA-Esterase aus. Um definitive Aussagen über die an der katalytischen Triade beteiligten Aminosäuren machen zu können, sind Mutagenesestudien notwendig. MATTERN-DOGRU et al. (2002) konnten mittels Mutagenesestudien, die Aminosäuren identifizieren, welche die katalytische Triade

V. Diskussion

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der Polyneuridinaldehydesterase bilden. Die Aminosäuren Serin, Asparaginsäure und Histidin können ebenfalls an den entsprechenden Stellen in der Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase wieder gefunden werden. Der experimentelle Nachweis, dass es sich tatsächlich um die Aminosäuren der katalytischen Triade handelt, muss jedoch erst über Mutagenesestudien erbracht werden. 4. Funktion pflanzlicher Esterasen Pflanzliche Esterasen sind mit Ausnahme der Pectinmethylesterasen wenig intensiv erforscht (MICHELI, 2001). Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind nur wenige pflanzliche Esterasen gereinigt und kloniert worden. Ihre Rolle im pflanzlichen Stoffwechsel ist daher noch vollständig unbekannt. Von den Enzymen die hohe Homologie zur MeJA-Esterase aufweisen, ist die Polyneuridinaldehydesterase aus R. serpentina am besten charakterisiert. (DOGRU et al., 2000, MATTERN-DOGRU et al., 2002). Es handelt sich hierbei um ein hochspezifisches Enzym des Alkaloidstoffwechsels, das die Bildung von 16-epi-Vellosimin aus Polyneuridinaldehyd katalysiert. Alkaloide sind an der chemischen Verteidigung von Pflanzen beteiligt und können durch mechanische Verwundung oder Herbivore induziert werden (KUTCHAN, 1995; YAHIA et al., 1998). Ebenfalls an der Abwehr von Fraßfeinden sind α-Hydroxynitrillyasen beteiligt (HICKEL et al., 1996), die strukturelle Ähnlichkeit zu der MeJA-Esterase aufweisen. α-Hydroxynitrillyasen werden erst bei einer Zerstörung des Gewebes durch Herbivore mit ihrem Substrat in Kontakt gebracht. Sie katalysieren dabei die Spaltung von Cyanhydrinen zu Blausäure und zum entsprechenden Aldehyd oder Keton. Es handelt sich um eine reversible Reaktion, deren umgekehrter Weg zur industriellen Darstellung optisch reiner Cyanhydrine genutzt wird (GRIENGL et al., 1997). Chirale Cyanhydrine wiederum sind wertvolle Verbindungen für die Produktion von Arzneimitteln wie z. B. β-Blocker, Antibiotika und ACE-Hemmern (HICKEL et al., 1996). Die Ethylen-induzierte Esterase aus C. sinensis (ZHONG et al., 2001) und das Protein Pir7b aus O. sativa (WÄSPI et al., 1998) sind vermutlich ebenfalls an der Defensivantwort von Pflanzen beteiligt, da sie induziert werden können. Ihre genaue Funktion ist bislang unbekannt, da noch keine Klarheit darüber besteht, welche Reaktionen durch die beiden Enzyme katalysiert werden. Beiden gemeinsam ist die katalytische Aktivität gegenüber nicht natürlich vorkommenden Naphtolestern. Da Methyljasmonat an der Signalantwort auf biotische und abiotische Stressstimuli beteiligt ist, wurde die Regulation des Enzyms in Gegenwart verschiedener Stressstimuli untersucht. Hierfür wurden Tomaten-Zellsuspensionskulturen mit Chitosan (pilzliche Zellwandfragmente), Methylsalicylat oder Methyljasmonat behandelt und anschließend einer Genexpressionsanalyse unterzogen. Die MeJA-

V. Diskussion

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Esterase wurde konstitutiv exprimiert und die Gabe von Methylsalicylat führte zu keiner Änderung der Genexpression. Mit Methyljasmonat konnte eine verminderte Genexpression nach 2 h - 4 h festgestellt werden, die nach 8 h wieder auf die Ausgangswerte anstieg. Nach Gabe von Chitosan trat nach 8 h eine verminderte Genexpression auf, die allerdings nicht so stark vermindert war wie nach Methyljasmonat-Gabe. Nach 24 h erreichte die Genexpression wieder die Ausgangswerte. Trotz verminderter transienter Expression der MeJA-Esterase nach Gabe von Chitosan und Methyljasmonat, bleibt weiterhin unklar, ob hierdurch auch die Menge an aktiver MeJA-Esterase beeinflusst wird. Vorstellbar sind verschiedene Szenarien:

1. Eine verminderte Genexpression der MeJA-Esterase wirkt sich zunächst nicht aus, da die MeJA-Esterase konstitutiv vorhanden und nur langsam abgebaut wird. Erst eine langfristige Suppression der Genexpression wirkt sich auf Enzymmenge und Aktivität aus.

2. Eine verminderte Genexpression der MeJA-Esterase führt zum schnellen Abfall der MeJA-Esterase Proteinmenge und Aktivität, da die MeJA-Esterase einem hohen Turnover unterliegt und schnell abgebaut wird.

Weitere Versuche wären notwendig, um zu klären, ob eine verminderte Genexpression nach MeJA und Chitosan-Gabe tatsächlich zu einer verminderten Enzymaktivität und zu einem Anstieg an MeJA in der Zelle führt. Flüchtiges MeJA könnte dann über die Gasphase verbreitet werden und als lokales Frühwarnsystem in einem Gewebeverband fungieren. 5. Signaltransduktion in der Wundreaktion Bereits Anfang der siebziger Jahre entdeckte die Arbeitsgruppe von C. Ryan, dass Tomaten- und Kartoffelpflanzen nach Befall durch Kartoffelkäfer mit einer de novo Synthese von Proteinaseinhibitoren reagieren (GREEN und RYAN, 1972). Die Proteinaseinhibitoren hemmen Verdauungsenzyme des Fraßfeindes, so dass es in der Folge bei dem Insekt zu Mangelerscheinungen kommt, die Wachstum und Entwicklung verzögern. Bei der Akkumulation von Proteinaseinhibitoren handelt es sich um einen induzierbaren Abwehrmechanismus, der die Resistenz gegenüber Insekten erhöht. Interessanterweise ist diese Wundantwort nicht auf verwundete Pflanzenteile begrenzt, sondern eine systemische Reaktion. GREEN und RYAN stellten daher die Hypothese auf, dass ein mobiler Faktor existiert, der am Ort der Verwundung gebildet wird und die Expression der Abwehrgene auch in unverwundeten Pflanzenteilen auslöst. Nach diesem zunächst hypothetischen Faktor

V. Diskussion

167

wurde jahrelang intensiv gesucht und die Arbeiten gipfelten 1991 in der Entdeckung des Oligopeptids Systemin (PEARCE et al., 1991). Es konnte gezeigt werden, dass Systemin zur Ausprägung der systemischen Wundreaktion in Pflanzen unentbehrlich ist (MCGURL et al. 1992). Bis vor kurzem wurde vermutet, dass Systemin als Langstreckensignal die Wundantwort zwischen unverwundeten und verwundeten Blättern vermittelt (RYAN, 2000). Die Bedeutung von Systemin für die systemische Wundantwort wurde mit Propfexperimenten untersucht (LI et al., 2002; LEE und HOWE, 2003). Hierfür wurde eine Mutante (spr1), die nach Systemingabe keine Proteinaseinhibitoren (PIN) akkumulierte, verwendet. Diese Mutante wurde daher als systemin-insensitiv bezeichnet. Verwundete spr1-Pflanzen zeigten eine normale PIN-Produktion an der Verwundungsstelle, jedoch eine stark verminderte in systemischen Blättern. Dieses Experiment ist vereinbar mit der Hypothese, wonach Systemin das Langstreckensignal darstellt. Pfropfte man Wildtyp-Sprosse auf spr1 Wurzelstöcke und verwundete die Blätter des Wurzelstocks, so beobachtete man eine lokale, jedoch keine systemische PIN-Akkumulation. Pfropfte man spr1-Sprosse auf Wildtyp-Wurzelstöcke, beobachtete man eine lokale und systemische Akkumulation von PIN. Daraus wurde geschlossen, dass die systemische Erkennung eine wichtige Rolle bei der lokalen Wundantwort, nicht aber in systemischen Blättern spielt. Somit kann Systemin als Langstreckensignal ausgeschlossen werden. Mittels weiterer Pfropfexperimente mit den Mutanten spr2 und jai1 wurde versucht die Identität des Langstreckensignals aufzuklären. Die spr2-Mutante zeigt einen Defekt in der Jasmonat-Biosynthese und kann darüber hinaus nach Verwundung kein Langstreckensignal mehr bilden. Die Mutante ist jedoch befähigt, Langstreckensignale zu erkennen. Dies bedeutet, dass für die Erkennung des Langstreckensignals in distalen Geweben keine JA-Biosynthese notwendig ist. Für das Pfropfexperiment wurden auf einen spr2-Wurzelstock Wildtyp-Pflanzen aufgepfropft und spr2-Blätter verwundet. Dabei zeigte sich, dass die verwundeten Blätter, nicht aber die Wildtyp-Blätter PIN´s bilden konnten. Somit können spr2-Blätter weder Jasmonate noch das Langstreckensignal bilden. Jasmonate sind daher entweder selber Langstreckensignale oder essentiell für die Bildung eines Langstreckensignals. In einem weiteren Experiment wurde die jai-Mutante auf Wildtyp-Wurzelstöcke aufgepropft. Die jai-Mutante ist JA-insensitiv, d.h. sie bildet nach JA-Applikation keine PIN´s. Nach Verwundung des Wildtyp-Wurzelstockes wurden in distalen jai-Blättern keine PIN´s gebildet. Dies bedeutet, dass die Jasmonat-Erkennung funktionell verknüpft ist mit der Erkennung des Langstreckensignals. Die einfachste Erklärung für die Propfexperimente mit den Mutanten spr2 und jai1 ist, dass Jasmonate oder eine Jasmonat-ähnliche Verbindung das unbekannte Langstreckensignal darstellen. Mögliche Kandidaten hierfür sind OPDA, JA oder MeJA. Systemin hingegen übt

V. Diskussion

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vermutlich eine Funktion in der Nähe der Verwundungsstelle aus. Möglicherweise leitet Systemin das JA-vermittelte Signal an unverwundete Blätter weiter (STRATMANN, 2003). RYAN und MOURA (2002) formulierten eine ähnliche Hypothese und vermuten, dass Systemin und JA oder MeJA über ein positives Feedback ein Langstreckensignal propagieren. Ungeklärt bleibt weiterhin, ob Systemin als parakrines Signal wirken kann und im Phloem in vivo transportiert werden kann. Sollte es sich bei Systemin um ein interzelluläres Signal handelt, so bleibt weiterhin unklar, ob ein Transport von Systemin auf das verwundete Blatt begrenzt ist. Für JA, JA-Vorstufen und JA-Metabolite wie beispielsweise MeJA sind weitere Untersuchungen notwendig, ob es sich wirklich um mobile Signale handelt. Abb. V.4.: Modell des Wundsignaltransduktionsweges in Tomate. Infolge der Verwundung wird Systemin aus

seiner Vorstufe Prosystemin freigesetzt. Systemin vermittelt seine Wirkung über einen Weg, der in der

spr1-Mutante Defekt ist. Die Mutante spr2 weist einen Defekt in der Jasmonsäure-Biosynthese auf.

Eine Expression von Abwehrgenen in verwundeten und unverwundeten Blätten als Jasmonsäure-

vermittelte Antwort benötigt JAI1. Möglicherweise kann Jasmonsäure über den Octadecanoidweg als

Antwort auf Systemin produziert werden und in distale unverwundete Blätter transloziert werden.

Darüberhinaus kann Jasmonsäure über einen positiven Feedback (+) eine Expression von Genen

induzieren, die für Prosystemin und Enzyme des Octadecanoidweges codieren. Hierdurch kann ein

Langstreckensignal amplifiziert werden, dessen Identität bislang ungeklärt ist (STRATMANN, 2003;

modifiziert).

V. Diskussion

169

6. Biologische Aktivität von Methyljasmonat Die Untersuchung 12-Oxo-Phytodiensäure (OPDA) bzw. JA/MeJA defizienter Mutanten zeigte, dass Jasmonate sowohl für die Abwehr bestimmter Mikroorganismen, z.B. Alternaria brassicicola, und Herbivore, als auch für die Entwicklung fertiler Blüten essentiell sind (Übersicht s. (BERGER, 2002)). Für die Reproduktion ist JA/MeJA, nicht aber OPDA, wichtig. Dagegen spielen sowohl OPDA als auch JA/MeJA eine Rolle bei der Pathogenabwehr (MCCONN und BROWSE, 1996; STINTZI et al., 2001). Die exakte Bedeutung der einzelnen Jasmonsäurederivate, insbesondere von MeJA, für zelluläre Reaktionen ist dagegen noch unklar. Die intrazellulären JA- und MeJA-Konzentrationen können durch Überexpression von Enzymen der Jasmonatbiosynthese moduliert werden. So führte die Überexpression der plastidären Flachs Allenoxid-Synthase in Kartoffelpflanzen zu einem 6 – 12 fachen Anstieg der JA Konzentrationen, ohne dass jedoch JA-responsive Gene aktiviert wurden. Dies bedeutet, dass zumindest in Kartoffelpflanzen die Jasmonsäurekonzentrationen nicht mit der Aktivierung JA-responsiver Gene korreliert (HARMS et al., 1995). In Arabidopsis konnte eine Überproduktion von MeJA durch Überexpression der Jasmonsäure-Carboxylmethyltransferase (JMT) erreicht werden.Transgene Pflanzen zeigten eine konstitutive Aktivierung von Abwehrgenen und wiesen eine erhöhte Resistenz gegenüber dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea auf. Trotz vermehrter MeJA-Bildung waren die JA-Konzentrationen nicht höher als im Wildtyp (SEO et al., 2001). Diese Experimente lassen eine Signalfunktion für MeJA vermuten. Besitzt MeJA neben JA auch alleine eine Signalfunktion, so ist unklar wie die Koordination der Bildung und Hydrolyse von MeJA durch die JMT und durch die MeJA-Esterase erfolgt. Datenbankrecherchen lassen sowohl auf eine cytosolische Lokalisation der MeJA-Esterase als auch der JMT schliessen. Wenn sowohl JMT als auch MeJA-Esterase im Cytosol lokalisiert sind, sollten die Bildung von MeJA und die MeJA-Esterase räumlich oder zeitlich voneinander getrennt sein, damit in der Zelle gebildetes MeJA nicht sofort zu JA hydrolysiert wird. Möglicherweise bindet gebildetes MeJA an ein Bindeprotein und wird hierdurch einer Spaltung durch die MeJA-Esterase entzogen. Der MeJA-Bindeproteinkomplex könnte eine Transportform darstellen und beispielsweise eine Abgabe von MeJA und somit Weiterleitung eines Signals an benachbarte Zellen ermöglichen. Sollte es sich bei MeJA um einen interzellulären Signalstoff handeln, so kann eine Zelle möglicherweise zwischen endogen gebildetem und exogen zugeführtem MeJA unterscheiden. In Tieren ist eine ähnliche Situation bekannt. Eine Stimulation von Neutrophilen führt innerhalb von Minuten zur Synthese von Leukotrienen, welche in den Extrazellulärraum abgegeben werden und als auto- oder parakrines Signal

V. Diskussion

170

wirken können. Darüberhinaus sind Neutrophile in der Lage, Leukotriene für den intrazellulären Katabolismus aufzunehmen und hierdurch die Signalwirkung einzuschränken oder zu terminieren. Untersuchungen an Gerstenblättern, die mit osmotischem Stress behandelt wurden, zeigten, dass JA und MeJA sowie 12-Oxo-PDA und 12-Oxo-PDA-Methylester simultan induziert wurden. Dabei betrugen die Konzentrationen der Methylester in verschiedenen Geweben stets 1/10 der Konzentrationen der jeweiligen Säuren. Dieses Verhältnis konnte auch nicht durch die exogene Zugabe von deuterierter JA oder MeJA verändert werden, so dass vermutet wurde, dass ein Gleichgewicht zwischen MeJA und JA d.h. zwischen Veresterung und Hydrolyse existiert (HAUSE et al., 2000; KRAMELL et al., 2000). Das Verhältnis von MeJA zu JA ist in unterschiedlichen Spezies verschieden. In Arabidopsis beträgt das Verhältnis von MeJA zu JA etwa 0.7 (SEO et al., 2001). Vorstellbar ist auch, dass MeJA eine Speicherform von JA darstellt und die MeJA-Esterase erst aktiviert werden muss, um JA freizusetzen. Möglicherweise hat die MeJA-Esterase die Aufgabe, exogenes MeJA in die nicht-flüchtige, intrazelluläre JA zu überführen. Durch diesen Mechanismus könnte JA in der Form von MeJA aus dem Extrazellularmilieu rekrutiert werden und Abwehrgene induzieren, bevor die Zelle beispielsweise durch Pathogene angegriffen wird. In aktivierten Zellen, die selbst hohe Mengen an JA biosynthetisieren und transient akkumulieren, könnte dagegen ein Teil der JA in MeJA überführt und als parakrines oder systemisches Signal abgegeben werden. Von diesem Mechanismus könnte die Pflanze auch dann profitieren, wenn MeJA genauso wie JA als primärer Signalstoff fungieren würde. 7. Ausblick Jasmonate spielen in der pflanzlichen Entwicklung und Pathogenabwehr eine wichtige Rolle, wobei die Mechanismen der Signalweiterleitung weitgehend unbekannt sind. Neue gentechnische Methoden erlauben einen Eingriff an regulatorischen Stellen. Mutanten können eine Unterbrechung in Biosynthese- und Signaltransduktionswegen aufweisen und damit wirkungsvolle Werkzeuge zur Aufklärung von Stoffwechselwegen darstellen. Eine Möglichkeit die Funktion von Genen zu analysieren, besteht darin, Gene in Zellen oder ganzen Organismen mittels dsRNA-Interferenz (RNAi) auszuschalten. Anschließend lässt sich beobachten, wie sich diese Veränderungen oder gar der komplette Verlust der Genexpression auf den Phänotyp auswirkt. Erst durch das Ausschalten der MeJA-Esterase mittels RNAi-Technik könnte gezeigt werden, dass es sich tatsächlich um ein einziges Enzym handelt, welches MeJA zu JA hydrolysieren kann. Wird

V. Diskussion

171

isotopenmarkiertes Methyljasmonat an MeJA-Esterase „Knock-down“ Pflanzen appliziert, so sollte aufgrund mangelnder Expression der MeJA-Esterase die Bildung von isotopenmarkiertem JA vollkommen unterbunden oder stark eingeschränkt werden. Darüber hinaus bestünde mittels RNAi-Technik die Möglichkeit, die Frage zu beantworten, ob es sich bei MeJA um einen eigenen Signalstoff handelt. Hierzu müsste die MeJA-Esterase ausgeschaltet werden und die Genexpression nach exogener Gabe von MeJA untersucht werden. Kann exogen appliziertes MeJA weiterhin Gene induzieren, obwohl keine Hydrolyse zu JA mehr möglich ist, so bedeutet dies, dass MeJA ein eigener Signalstoff ist. Werden hingegen durch MeJA-Applikation keine Gene angeschaltet, so handelt es sich möglicherweise um eine inaktive Speicher- oder Transportform von JA. Denkbar wäre auch dass durch MeJA sowohl Gene angeschaltet werden, die durch JA induziert werden als auch Gene angeschaltet werden, die ein von JA verschiedenes Wirkspektrum haben. Vermutlich weisen MeJA-Esterase defiziente Pflanzen erhöhte MeJA-Spiegel auf, da MeJA nicht mehr zu JA hydrolysiert werden kann. Eine Überexpression der JMT führte ebenfalls zu erhöhten MeJA Spiegeln und zu einer konstitutiven Aktivierung von Abwehrgenen. Sollten JMT und MeJA-Esterase gegenläufig reguliert sein, so sollte ein Ausschalten der MeJA-Esterase ebenfalls konstitutiv Abwehrgene aktivieren. MeJA-defiziente Pflanzen, die möglicherweise durch Ausschalten der JMT oder Überexpression der MeJA-Esterase erhalten werden, könnten einen Hinweis darauf geben, ob MeJA als Signalstoff fungieren kann. Denn Verwundung induziert sowohl in verwundeten Arabidopsis-Blättern als auch systemisch (unverwundete Blätter) das Enzym JMT. Die Expression der JMT kann aber auch durch exogenes MeJA induziert werden (SEO et al., 2001). Um die Regulation der JMT und MeJA-Esterase näher zu charakterisieren, müsste die Expression der beiden Enzyme bei Verwundung in den verletzten und den distalen, unverletzten Blättern in Arabidopsis untersucht werden. Diese Experimente könnten zeigen, ob JMT und MeJA-Esterase gegenläufig reguliert werden und Hinweise auf Unterschiede in der Expression der Enzyme in lokalen und distalen Geweben geben. Untersuchungen zur Ausschaltung als auch zur Überexpression des MeJA-Esterasegens würden darüberhinaus weitere grundlegende Einsichten in die Signaltransduktion eines wichtigen Signalstoffes der Wundantwort und Pathogenabwehr gewähren.

VI. Zusammenfassung 172

VI. Zusammenfassung 1. Aus Lycopersicon esculentum Zellsuspensionskulturen konnte ein bisher

unbekanntes Enzym isoliert und beschrieben werden, das die Hydrolyse von Methyljasmonat (MeJA) zu Jasmonsäure (JA) katalysiert. Das Enzym wurde als Methyljasmonat-Esterase (MeJA-Esterase) bezeichnet. Mittels Methyl-[2-14C]JA und [Methyl-3H]MeJA wurden qualitative und quantitative Enzymtestsysteme etabliert, welche die Reinigung und Charakterisierung des Enzyms erlaubten.

2. Methyljasmonat-Esterase Aktivität konnte in 18 taxonomisch unterschiedlichen

Zellsuspensionskulturen höherer Pflanzen sowie in differenziertem Gewebe (Blüte, Wurzel, Stengel und Blatt) von Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker nachgewiesen werden. Lycopersicon esculentum Zellsuspensionskulturen wurden als geeignetes Material zur Gewinnung und Reinigung der MeJA-Esterase ausgewählt. Die spezifische Aktivität des Rohextraktes betrug 1.77 pkat/mg.

3. In einem 6-stufigen Reinigungsverfahren wurde das native Enzym mit einer

Ausbeute von 2.2 % bis zur Homogenität 767-fach angereichert. 4. Die native MeJA-Esterase kommt nativ als monomeres 26 kDa großes Protein

vor. Unter denaturierenden Bedingungen konnte ein Molekulargewicht von 28 kDa bestimmt werden. Eine Analyse mittels ESI-TOF-Massenspektrometrie ergab ein Molekulargewicht von 28547 Da. Die native MeJA-Esterase hatte ein basisches pH-Optimum von 9.0. Optimale katalytische Aktivität zeigte die MeJA-Esterase bei einer Reaktionstemperatur von 40 °C. Der isoelektrische Punkt lag bei pH 4.7.

5. Eine vollständige und irreversible Hemmung der MeJA-Esterase konnte durch 5

mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), einem Serinprotease-Inhibitor erzielt werden. Dieses Ergebnis lieferte einen Hinweis darauf, dass die MeJA-Esterase eine katalytische Triade mit einem reaktiven Serin-Rest besitzt. N-Methylmaleimid, Iodacetamid, Bestatin, Pepstatin und Leupeptin konnten die MeJA-Esterase nicht inhibieren.

6. Nach der Reinigung der MeJA-Esterase wurde das Protein partiell mit der

Endoproteinase LysC verdaut. Mittels Sequenzierung der Spaltpeptide und N-terminaler Sequenzierung der MeJA-Esterase konnte von vier Peptiden die Sequenz bestimmt werden. Ein Datenbankvergleich (SwissProt und EMBL) dieser

VI. Zusammenfassung 173

Peptide mit bekannten Sequenzen zeigte eine hohe Homologie (bis zu 80 %) zu verschiedenen Esterasen und α-Hydroxynitrillyasen. Die Peptide konnten somit eindeutig als Bestandteile einer Esterase identifiziert werden.

7. Zur Identifizierung des MeJA-Esterase Gens wurden aus den Peptidsequenzen

degenerierte Primer abgeleitet und zur weiteren Klonierung verwendet. Über eine Reverse Transkription mit anschließender PCR wurde ein internes cDNA-Fragment (513 bp) amplifiziert. Mittels RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) konnten das 5´-und 3´-Ende der MeJA-Esterase cDNA ermittelt werden. Die Nucleotidsequenz umfasste einen offenen Leserahmen von 786 bp. Die davon abgeleitete Aminosäuresequenz codierte ein offenes Leseraster für ein Protein von 262 Aminosäuren.

8. Datenbankvergleiche der vollständigen Aminosäuresequenz zeigten Homologien

von 33 – 47 % zu Esterasen und α-Hydroxynitrillyasen. Die Aminosäuren der katalytischen Triade, die in den homologen Proteinen hochkonserviert waren, konnten bei der MeJA-Esterase als Serin-83, Asparaginsäure-211 und Histidin-240 ermittelt werden. Diese drei Aminosäuren bilden vermutlich das katalytische Zentrum der MeJA-Esterase. Darüber hinaus konnte eine hochkonservierte Signatur, die allen Lipasen gemeinsam ist in der Aminosäuresequenz der MeJA-Esterase identifziert werden. Diese Ergebnisse erlauben eine Einordnung der MeJA-Esterase in die Superfamilie der „α/β-Fold“-Hydrolasen. Untersuchungen der Primärstruktur der MeJA-Esterase legten den Schluss nahe, dass es sich um ein cytosolisches Enzym handelt.

9. Eine Southern-Blot Analyse mit genomischer DNA aus L. esculentum wurde zur Abschätzung der Kopienzahl der zum Protein der MeJA-Esterase korresporendierenden Gene durchgeführt. Dabei wurden zwei bis sieben DNA-Abschnitte ermittelt, die mit der Volllänge-Sonde der MeJA-Esterase hybridisierten. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass die MeJA-Esterase zu einer Genfamilie gehört. Unklar bleibt jedoch, ob es sich um mehrere homologe Gene handelt, oder ob eine Hybridisierung der Volllänge-Sonde mit Pseudogenen erfolgte.

10. Die heterologe Expression der MeJA-Esterase cDNA wurde erfolgreich

durchgeführt. Hierdurch wurde der Beweis erbracht werden, dass die klonierte cDNA tatsächlich für das Gen der MeJA-Esterase codierte. Nach Klonierung der cDNA in den pQE70-Expressionsvektor und Transformation in kompetente E. coli

VI. Zusammenfassung 174

(M15) konnte im Proteinrohextrakt eine spezifische Enzymaktivität von 1.64 pkat/mg detektiert werden.

11. In einem 4-stufigen Reinigungsverfahren wurde das heterolog exprimierte Enzym

mit einer Ausbeute von 0.8 % bis zur Homogenität 283-fach angereichert. 12. Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten, dass native und heterolog

exprimierte MeJA-Esterase Methyljasmonat zu Jasmonsäure hydrolysierten. In beiden Fällen handelte es sich jedoch um kein hochspezifisches Enzym. Für die native MeJA-Esterase konnte ein KM-Wert von 14.7 ± 0.8 µM und für die heterolog exprimierte MeJA-Esterase ein KM-Wert von 24.3 ± 2.3 µM ermittelt werden.

13. Eine gewebsspezifische Expression der MeJA-Esterase konnte in Gewebe

(Stängel, Blatt, Blüte und Wurzel) von L. esculentum (cv. Moneymaker) mittels Northern-Hybridisierung gezeigt werden. In Blüten und Wurzeln konnten die meisten Transkripte nachgewiesen werden, während die MeJA-Esterase in Stängel und Blatt im Vergleich zu Blüte und Wurzel nur schwach exprimiert war.

14. Die Regulation der MeJA-Esterase wurde in Gegenwart verschiedener

Stressstimuli (Methyljasmonat, Methylsalicylat und Chitosan) untersucht. Die MeJA-Esterase wird offensichtlich konstitutiv exprimiert. Durch Zugabe von Methyljasmonat und Chitosan nahmen die Transkripte der MeJA-Esterase transient ab. Methylsalicylat hatte keinen Einfluss auf die Genexpression.

VI. Summary 175

VI. Summary 1. From cell suspension cultures of Lycopersicon esculentum a so far unknown

enzyme was purified, catalyzing the cleavage of methyl jasmonate to jasmonic acid. The isolated enzyme was termed as methyl jasmonate esterase (MeJA esterase). Qualitative and quantitative enzyme assays using methyl-[2-14C]jasmonic acid and [methyl-3H]methyl jasmonate as substrates were established for purification and characterization of the enzyme.

2. Screening of 18 suspension plant cell cultures of taxonomically distant species

revealed that MeJA-Esterase activity occurs in all plant species so far analyzed. MeJA esterase activity was also found in flowers, roots, stems and leaves of L. esculentum (cv. Moneymaker). Cultured cells of L. esculentum were selected as plant source for enzyme purification. Specific activity of the crude extract was 1.77 pkat/mg.

3. MeJA esterase was purified in a six-step purification scheme. The enzyme was

purified 767-fold to give a homogenous protein with a yield of 2.2 %. 4. The native enzyme exhibited a Mr of 26 kDa (gel-filtration chromatography) which

was similar to the Mr determined by SDS-PAGE (Mr of 28 kDa) and ESI-TOF MS analysis (Mr of 28547 kDa). MeJA esterase revealed a pH optimum of pH 9.0 and a temperature optimum of 40 °C. Chromatofocussing of MeJA esterase gave an isoelectric point (pI) of 4.7.

5. Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), a serine protease inhibitor, led to

irreversible and complete inhibition of MeJA esterase at a concentration of 5 mM. This result suggests that the enzyme has a catalytic triade with an active serine residue. N-Methylmaleimide, iodacetamide, bestatin, leupeptin and pepstatin did not inactivate the enzyme.

6. Proteolysis of the purified and pure enzyme with endoproteinase LysC and

subsequently sequencing revealed three peptide fragments. N-Terminal sequencing yielded an additional peptide fragment. Sequence alignment of these fragments showed high homologies (up to 80 %) to certain esterases and hydroxynitrile lyases. MeJA esterase peptides could be identified as components of an esterase.

VI. Summary 176

7. For the identification of the MeJA esterase gene degenerated primers were designed on the basis of the partial amino acid sequences obtained from the purified MeJA esterase. Degenerated primers were used for cloning. Reverse transcription followed by PCR amplified an internal cDNA fragment (513 bp). Full-length cDNA of MeJA esterase was amplified using RACE (Rapid amplification of cDNA ends). Sequencing and annealing of the 5´- and the 3´-sequence revealed an open reading frame of 789 bp encoding a 262 amino acid protein.

8. Sequence analysis and alignment with known proteins from Genbank showed

high overall-homology of 33 – 47 % to esterases and hydroxynitrile lyases. Since all the aligned proteins belong to the extremely divergent family of α/β-hydrolase fold proteins it could be assumed that MeJA esterase is a member of this protein family. MeJA esterase shows the highly conserved amino acid residues forming the catalytic triad – nucleophile, acid and a histidine – represented by serine-83, aspartic acid-211 and histidine-240. Additionally a higly conserved lipase motive could be identified in the MeJA esterase amino acid sequence. Analysis of the primary structure of the enzyme makes a cytosolic location probably.

9. Southern blot analysis of genomic cDNA from cell suspension cultures of L.

esculentum was carried out to estimate gene copies of MeJA esterase. MeJA esterase coding sequence hybridized with two to seven cDNA fragments. It might be possible that MeJA esterase belongs to a gene family. It remains still unclear if there are several homologous genes or pseudogenes hybridized with the MeJA esterase sequence.

10. To get unequivocal evidence of the identity of cloned sequence, MeJA esterase

cDNA was successfully subcloned into a bacterial vector (pQE70) for heterologous expression. Crude extracts of E. coli M15 cells harbouring the pQE-MeJA esterase plasmid showed MeJA esterase activity (1.64 pkat/mg) while wild type M15 cells did not show any MeJA esterase activity.

11. A four step purification protocol was employed to purify the enzyme to

homogeneity (283-fold) with a yield of 0.8 % 12. Analysis of substrate specifity showed that native and heterologously expressed

MeJA esterase cleaved methyl jasmonate to jasmonic acid. However MeJA esterase is not a highly specific enzyme. Enzyme kinetics of native MeJA esterase revealed a KM value of 14.7 ± 0.8 µM while heterologous expressed MeJA esterase revealed a KM value of 24.3 ± 2.3 µM.

VI. Summary 177

13. Northern blot analysis was used to determine MeJA esterase expression in

different plant organs. MeJA esterase transcripts were present in all tomato plant tissues. High levels of MeJA esterase mRNA could be found in roots and flowers while low to moderate amounts where present in leafs and stems of tomato plants.

14. In order to evaluate if transcripts levels could be regulated by external stimuli, cell

suspension cultures were treated with methyl jasmonate, methyl salicylate or chitosan and time courses of mRNA levels were monitored. Methyl jasmonate and chitosan induced a transient decrease of transcript levels that returned to basal levels 24 h after treatment. No changes in mRNA levels were observed after methyl salicylate treatment

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Danksagung

Mein herzlichster Dank gilt Herrn Prof. Dr. Martin J. Müller für die Überlassung dieses interessanten und vielseitigen Themas. Sein großes Interesse am Fortgang der Arbeit, seine fortwährende Unterstützung und die Bereitstellung hervorragender Arbeitsbedingungen trugen wesentlich zum Gelingen der Arbeit bei. Seine ansteckende Begeisterung und seine Motivation waren mir stets Inspiration und Ansporn, sein mir entgegen gebrachtes Vertrauen bedeutete einen wichtigen Rückhalt. Besonders danken möchte ich ihm für die Faszination am wissenschaftlichen Arbeiten, die er in mir wecken konnte. Frau Dr. Martina Rüffer (Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, Ludwig-Maximilians-Universität München) danke ich dafür, dass sie mich in die Geheimnisse der Proteinreinigung eingeweiht und hiermit die Grundlagen für die erfolgreiche Reinigung eines Proteins gelegt hat.

Herrn Dr. Axel Parbel (Amersham Biosciences) möchte ich meinen herzlichen Dank aussprechen für die Aufnahme der ESI-TOF MS Spektren. Bedanken möchte ich mich auch für die Freundlichkeit und Geduld bei der Beantwortung vieler proteinchemischer Fragen. Herrn Prof. Dr. Riederer gilt mein Dank für die Möglichkeit radioaktive Messungen am Lehrstuhl für Botanik II durchführen zu können.

Für die Proteinsequenzierung möchte ich mich recht herzlich bei Prof. Dr. F. Lottspeich (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried) bedanken.

Für viele wertvolle Anregungen in den Bereichen Analytik und Molekularbiologie sowie die Freundschaft und stete Hilfsbereitschaft möchte ich Frau Dr. R. Imbusch, Frau Dr. I. Thoma, Frau Dr. Ch. Löffler, Frau Dr. G. Gresser, Herrn M. Krischke, Herrn R. Pröls, Herrn Dr. M. Hoffmann, Frau K. Glenz, Herrn Dr. H. Warzecha und Frau Dr. F. Siefritz danken.

Den Praktikanten Frau H. Stöcklein und Herrn S. Müller, sowie den studentischen Hilfskräften Frau S. Lux, Herrn P. Maisel und Herrn Ch. Brandt danke ich für die hervorragende Zusammenarbeit und das große Engagement während ihrer Tätigkeit.

Frau B. Dierich und B. Stephan gebührt mein Dank für die tatkräftige und kompetente Unterstützung bei der Pflege der Zellkulturen. Bei den Institutsgärtnern möchte ich mich für die Aufzucht und Kultivierung der Pflanzen bedanken. Frau S. Michel danke ich für die Durchführung der Sequenzierarbeiten. Mein herzlicher Dank gilt Frau F. Reisberg und Frau E. Wirth für die netten und aufmunternden Gespräche abseits des

Laboralltags. Allen nicht namentlich genannten Kolleginnen und Kollegen des Lehrstuhls und Institutes gilt mein Dank für die hilfsbereite und freundschaftliche Zusammenarbeit während meiner Labortätigkeit.

Den Sonderforschungsbereichen 369 in München und 567 in Würzburg danke ich für die finanzielle Unterstützung.

Der größte Dank gebührt meiner Familie und meinem Bruder Thorsten, die mir durch ihre Geborgenheit und Unterstützung die Durchführung dieser Arbeit erst ermöglichten. Eva Molenda, Saskia Held, Miriam Pfad und Maria Oberhofer möchte ich für Ihre innige und langjährige Freundschaft meinen Dank aussprechen. Guido Reinsfelder bin ich zutiefst verbunden für seine Freundschaft und den Beitrag, den er zu meiner persönlichen Weiterentwicklung geleistet hat.

Meinem neu gewonnen Mentor und Freund Prof. Dr. Karl-Heinz Brodbeck möchte ich für die Entdeckung meiner Achtsamkeit und der Belebung meiner Kreativität danken, die gerade während dem Schreiben der Arbeit wertvolles geleistet haben.

Ganz herzlich möchte ich mich bei meinen Freunden bedanken, die mir zu jeder Zeit den notwendigen Halt gegeben haben, oftmals Rücksicht auf mich nehmen mussten und immer für mich da waren. Ein herzliches Danke an Euch alle: Eva & Martin, Saskia & Werner, Mirchen & Andi, Margot & Raffael, Maria, Guido, Claudi, Uschi & Guido, Sandra & Mike, Winnie, Dietmar, Tom & Vita, Rainer, Julia & Mike, Charly, Pamela, Christian, Michi, Wolfgang, Holger, Moni & Olli, Andrea & Michi, Annette & Gregor, Dirk, Bella Elke, Roland, Daniel, Marcus, Wolfram, Nadine, Martin, Elmar, Stefan & Chrissy, Nico, Mirco, Phillip, Matthias, Felix & Gabi, Michel, Monique & Klaus, Helga & Armin, Wolfgang, Eva & Christian, Wolfgang, Andrea & Stefan, meiner Apothekenfamilie Tini, Korbi, Gerli & Roman, den Bergwachtkamerad(inn)en Susi, Christiane, Robert, Peter, Stefan, Martin (BGL) und Greg.

Wenn nicht überhaupt mal eine klare

Linie zum verstehen besser sein könnte als nirgendwo anders als hier.

Guido Reinsfelder 2003

Lebenslauf Persönliche Angaben Name:

Geburtsdatum:

Geburtsort:

Staatsangehörigkeit:

Familienstand

Christiane Stuhlfelder

28.11.1972

Rosenheim

deutsch

ledig

Schulausbildung 1979 – 1983 Grundschule Sengenthal

1983 – 1992 Ostendorfer Gymnasium, Neumarkt i. d. Opf.

Hochschulstudium 1992 – 1994 Biologiestudium an der Universität Regensburg

1994 – 1998 Pharmaziestudium an der Universität Regensburg Praktische Ausbildung Nov. 1999 – Apr. 1999 Elvira Apotheke in München Mai 1999 – Okt. 1999 SmithKline Beecham GmbH & Co KG Bühl Approbation 21.12.1999 Promotionsstudium Feb. 2000 – Aug. 2000 Wissenschaftliche Mitarbeiterin im Arbeitskreis von

Privatdozent Dr. Martin J. Müller am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie der Ludwig-Maximilians-Universität München

seit Sept. 2000 Wissenschaftliche Mitarbeiterin im Arbeitskreis von Prof.

Dr. Martin J. Müller am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie an der Julius-Maximilians Universität Würzburg

Teile der vorliegenden Arbeit fanden Eingang in folgende Veröffentlichungen: STUHLFELDER, C., LOTTSPEICH, F. and MUELLER, M.J. (2002) Purification and partial

amino acid sequences of an esterase from tomato. Phytochemistry 60, 233-240

STUHLFELDER, C., MUELLER, M.J. and WARZECHA, H. (2003) Cloning, expression and

characterization of methyl jasmonate esterase from tomato. Manuskript, eingereicht bei Planta

Posterpräsentation: STUHLFELDER, C. and MUELLER, M.J. (2002) Purification and characterization of

methyl jasmonate esterase. DPhG Doktorandentagung in Frankfurt/Main, 2002

Ehrenwörtliche Versicherung

Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Dissertation

selbständig angefertigt und keine als die angegebenen Quellen und

Hilfsmittel verwendet habe.

Diese Arbeit hat weder in gleicher noch in ähnlicher Form bereits in

einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen.

Ich habe bisher noch keinen akademischen Grad erworben oder zu

erwerben versucht.

Würzburg, den

Christiane Stuhlfelder