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Rekombinante Allergene

Assoc.Prof.Dr. Birgit Linhart

Abteilung für Immunpathologie

Institut für Pathophysiologie

und Allergieforschung

Medizinische Universität Wien

8. WIENER KOMPONENTENSCHULE

2.-3. September 2016 in Wien

DEFINITIONEN:

Allergenquelle – Allergenextrakt - Allergen

Allergen

Mast-

zelle

Allergenquelle

Gemische aus allergenen

und nicht allergenen

Bestandteilen

Allergenextrakt

Molekül, das die

Krankheitssymptome

auslöst

Was sind standardisierte Allergenextrakte ?

Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich Institut, 1996

Was sind standardisierte Allergenextrakte ?

Nachweis von IgE-bindenden Proteinen in Maisextrakten


‚Standardisierte‘ Allergenextrakte enthalten

unterschiedliche Konzentrationen von

Haupt- und Nebenallergenen


Analyse von 9 Haselnuß-Extrakten




Nachweis des LTP-Gehalts in 9 Haselnuss - Hauttestlösungen

(A-I) mittels Immunoblot:

14

68

21

30

46

14

68

21

30

46

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 IgE

Timothygrass




Company 1

14

68

21

30

46

14

68

21

30

46

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 IgE

Company 4

14

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21

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46

14

68

21

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2 4 6 8 10 12 14 16 IgE

Company 5

14

68

21

30

46

68

21

30

46

2 4 6 8 10 12 14 16 IgE

1= preimmune Phl p 1

2= a-Phl p 1

3= preimmune-Phl p 2

4= a-Phl p 2

5= Preimmune Phl p 4

6= a-Phl p 4


8= a-Phl p 5


10= a-Phl p 6


12= a-Phl p 12


14= a-Phl p 13


16= a-Phl p 7

IgE= Graspollen-allergischer Patient

Lieschgras Extrakt

Focke M. et al,

Clin.Exp.Allergy 2008

14

68

21

30

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14

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 IgE

Timothygrass




Company 1

14

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14

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21

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 IgE

Company 4

14

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14

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2 4 6 8 10 12 14 16 IgE

Company 5

14

68

21

30

46

68

21

30

46

2 4 6 8 10 12 14 16 IgE


2= a-Phl p 1


4= a-Phl p 2


6= a-Phl p 4


8= a-Phl p 5


10= a-Phl p 6


12= a-Phl p 12


14= a-Phl p 13


16= a-Phl p 7

IgE= Graspollen-allergischer Patient

Lieschgras Extrakt

Focke M. et al,

Clin.Exp.Allergy 2008

Phl p 1

Wichtige Allergene sind oft nur in

geringen Mengen enthalten

Biological activity of recombinant Der p 2, Der p 5 and Der

p 7 allergens of the house-dust mite Dermatophagoides

pteronyssinus.

Lynch et al., Int-Arch-Allergy-Immunol. 1997

Recombinant spiked allergen extract

Lundberg et al., Allergy. 2001

‚Standardisierte‘ Allergenextrakte

enthalten beträchtliche Mengen

an Endotoxinen

Endotoxin content of standardized allergen

vaccines.

Trivedi et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 2003

Allergenextrakte können mit Allergenen aus

anderen Allergenquellen kontaminiert sein

Beispiel:

False-positive skin prick test responses to commercially

available dog dander extracts caused by contamination

with house dust mite (Dermatophagoides

pteronyssinus) allergens.

van der Veen MJ, Mulder M, Wittemann AM, van Ree R, Aalberse

R, Jansen HM, van der Zee JS. J. Allergy Clin Immunol. 98, 1028-

1034, 1996.

Herstellung rekombinanter Allergene

Herstellung rekombinanter Allergene

DNA

PROTEIN /

ALLERGEN RNA

cDNA Bank

Bakteriophage

ausplatieren

jeder Plaque steht

für 1 Protein

die Proteine werden auf

Nitrozellulose übertragen

Serum IgE von

allergischen Patienten

Detektion von

gebundenem IgE

Bakterienrasen

IgE IMMUNOSCREENING

cDNA Bank

Bakteriophage

ausplatieren

jeder Plaque steht

für 1 Protein

die Proteine werden auf

Nitrozellulose übertragen

Serum IgE von

allergischen Patienten

Detektion von

gebundenem IgE

Bakterienrasen

IgE IMMUNOSCREENING

Isolation der

DNA, die für das

Allergen kodiert

DNA Sequenz-

analyse

Expression des

rekombinanten

Allergens

Produktion von rekombinanten Allergenen:

Prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme

1. Bakterien: Escherichia coli

2. Hefe: Pichia pastoris

3. Pflanzen: Tabak

4. Insektenzellen

Produktion von rekombinanten Allergenen:

Prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme

1. Bakterien: Escherichia coli

2. Hefe: Pichia pastoris

3. Pflanzen: Tabak

4. Insektenzellen

Proteine werden

nicht glykosyliert!

Proteine werden

glykosyliert!

Welche Bedeutung haben Karbohydrate ?

MUXF3 CCD (Bromelain),

eine prototypische N-Glykan Struktur

Cross-reactive Carbohydrate Determinants

(CCDs)

Karbohydrate sind IgE-bindende Strukturen

Studies of the carbohydrate moieties of the timothy grass

pollen allergen Phl p 1

Petersen et al., Electrophoresis 1995

Post-translational modifications influence IgE reactivity to

the major allergen Phl p 1 of timothy grass pollen

Petersen et al., Clin Exp Allergy 1998

Hapten

Cross-reactive Carbohydrate Determinants

(CCDs)

Phl p 1 Lieschgraspollen



Lyc e 2 Tomate

Hev b 4 Latex

Lol p 11 Weidelgraspollen

Api g 5 Sellerie

Ole e 1 Olivenpollen

Cor a 11 Haselnuss

Ara h 1 Erdnuss

Cyn d 1 Bermudagraspollen

Art v 1 Beifußpollen

Api m 1 Bienengift

Api m 2 Bienengift

Ves v 2 Wespengift

Karbohydrate sind IgE-bindende Strukturen,

jedoch mit geringer biologischer Relevanz

?

Karbohydrate sind IgE-bindende Strukturen,

jedoch mit geringer biologischer Relevanz

Poor biologic activity of cross-reactive IgE directed to carbohydrate

determinants of glycoproteins.

van-der-Veen et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1997

Carbohydrate epitopes and their relevance for the diagnosis and treatment

of allergic diseases.

van-Ree et al., Int-Arch-Allergy-Immunol. 2002

Specific IgE to cross-reactive carbohydrate determinants strongly affect

the in vitro diagnosis of allergic diseases.

Mari et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1999

IgE to cross-reactive carbohydrate determinants: analysis of the

distribution and appraisal of the in vivo and in vitro diagnosis.

Mari et al., Int-Arch-Allergy-Immunol. 2002

?

IgE-Reaktivität gegen Karbohydrat-Epitope

kann zu falsch positiven Testresultaten führen

Recombinant allergen-based IgE testing to distinguish

bee and wasp allergy

Mittermann I., et.al. J Allergy Clin Immunol 2010

IgE-Reaktivität gegen Karbohydrat-Epitope

kann zu falsch positiven Testresultaten führen

Charakterisierung rekombinanter Allergene

Analyse der Reinheit von

rekombinanten Allergenen

SDS-PAGE

M

14 -

21 -

30 -

45 -

66 -

97 -

Massenspektrometrie

Analyse der Reinheit von

rekombinanten Allergenen

Zirkulardichroismus (CD): eine einfache Technik,

um die strukturelle Integrität von Proteinen festzustellen

Temperature scan

-40000

-20000

0

20000

40000

60000

80000

185 195 205 215 225 235 245 255

Wavelength (nm)

Mo

lecu

lar

Ellip

ticit

y

25°C

35°C

45°C

55°C

65°C

75°C

85°C

95°C

Tropomyosin

Die dreidimensionale Struktur der rekombinanten

Allergene ist für ihre allergene Wirkung von Bedeutung

Die Strukturaufklärung von Allergenen erfolgt mittels

NMR-Spektroskopie und Röntgenstrukturanalyse

Birchpollen-Profilin Acanthamoeba-Profilin

Vergleich der IgE-Reaktivität von

natürlichen und rekombinanten Allergenen

Recombinant allergens for immunoblot diagnosis of tree-pollen

allergy

Valenta et al., J Allergy Clin Immunol 1991

Gereinigte natürliche Allergene sind

oft Gemische aus mehreren Isoformen

Humane IgE- und T-Zell-Reaktivität der Bet v 1

Isoformen a, e, b, d und l

T cell

reactivity

(rel. %)

IgE binding

(rel. %)

Skin prick test

wheal areas

(mm2)

nBet v 1 100 100 ND

rBet v 1a 41 100 70

rBet v 1e 67 83 50

rBet v 1l 87 3 10

rBet v 1d 100 5 7

rBet v 1b 92 60 19

IgE antibodies to recombinant pollen allergens

(Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, and Bet v 2) account for a

high percentage of grass pollen-specific IgE

Niederberger et al., J Allergy Clin Immunol 1998

Recombinant birch pollen allergens (rBet v 1 and

rBet v 2) contain mostof the IgE epitopes present in

birch, alder, hornbeam, hazel, and oak pollen: A

quantitative IgE inhibition study with sera from

different populations

Niederberger et al., J Allergy Clin Immunol 1998

Vergleich der IgE-Reaktivität von

natürlichen und rekombinanten Allergenen

Zelluläre Allergen-Stimulationstests:

Histamin-Freisetzungstest

Eine in vitro - Methode zur Messung der

biologischen Aktivität von rekombinanten Allergenen

Induction of specific histamine release from basophils with purified natural and

recombinant birch pollen allergens. Valenta et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1993

Die Stimulierung von spezifischen T-Zellen

ist kein charakteristisches Merkmal für Typ I Allergien !

Peptide specificity and HLA restriction do not dictate lymphokine

production by allergen-specific T-lymphocyte clones.

van-Neerven et al., Immunology. 1994

Nonallergic individuals recognize the same T cell epitopes of Bet

v 1, the major birch pollen allergen, as atopic patients.

Ebner et al., J-Immunol. 1995


Der Lymphozyten-Transformationstest


Der Basophilen-Aktivierungstest

misst die CD63 und CD203c Expression auf

basophilen Granulozyten

Messung der CD203c Expression

auf basophilen Granulozyten

Recombinant allergens promote expression of CD203c

on basophils in sensitized individuals.

Hauswirth et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 2002

Evaluation von rekombinanten Allergenen

in vivo mittels Provokationstests

Pricktest und intradermaler Hauttest

mit rekombinanten Allergenen

In vivo allergenic activity of a hypoallergenic mutant of the major

fish allergen Cyp c 1 evaluated by means of skin testing.

Douladiris et al., J Allergy Clin Immunol. 2015

Diagnostic value of recombinant Aspergillus fumigatus allergen

I/a for skin testing and serology.

Moser et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1994

Type I skin reactivity to native and recombinant phospholipase A2

from honeybee venom is similar.

Muller et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1995

Serological and skin-test diagnosis of birch pollen allergy with

recombinant Bet v I, the major birch pollen allergen.

Menz et al., Clin-Exp-Allergy. 1996

Skin testing with recombinant allergens rBet v 1 and birch

profilin, rBet v 2: diagnostic value for birch pollen and associated

allergies.

Pauli et al., J-Allergy-Clin-Immunol. 1996

Nasale Provokation mit rekombinanten Allergenen

Skin test results but not serology reflect

immediate type respiratory sensitivity: a study

performed with recombinant allergen

molecules.

Niederberger et al., J-Invest-Dermatol. 2001

1988-89 First cloning of allergen-encoding cDNAs

1991-92 IgE-based diagnosis with recombinant allergens

1992-96 Development of animal models based on recombinant allergens

1989-92 DNA and amino acid sequence similarities – the basis for the

‘one for all’ concept

1993-97 Construction and characterization of recombinant hypoallergens

for allergy vaccination

1994-96 First studies using recombinant allergens for provocation testing

in allergic patients

1996 First population studies using recombinant allergens

1999 Monitoring the course of SIT using recombinant allergens

1999-2000 Evaluation of recombinant hypoallergens in patients by

provocation testing

2002 The concept of marker allergens for the identification of

cross-sensitizations and for selection of patients for SIT

2002 Microarrayed recombinant allergens for diagnosis

2001-05 First immunotherapy trial with recombinant hypoallergens

2005 First immunotherapy trial with recombinant allergens

2008 Comparison of extract-, purified allergen-, and recombinant

allergen-based SIT

2009 Phase III studies with recombinant hypoallergens completed

2010 First SLIT studies with recombinant allergens

REKOMBINANTE ALLERGENE IN DER ALLERGIEDIAGNOSTIK UND -BEHANDLUNG

2008 Recombinant allergens as reference materials for allergenic

products

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !

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