RELAÇÃO ENTRE MARCADORES FISIOLÓGICOS DO DIABETES …...Palazzo do Serviço de genética Médica...

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Camila Schreiner Pereira

RELAÇÃO ENTRE MARCADORES FISIOLÓGICOS DO DIABETES (DANO NO

DNA, GLICEMIA E HEMOGLOBINA GLICOSILADA), NÍVEIS SÉRICOS DE

MINERAIS E QUALIDADE DA DIETA EM PACIENTES PRÉ-DIABÉTICOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Promoção da Saúde da Universidade de Santa Cruz do Sul - UNISC, como requisito parcial para à obtenção do título de Mestre em Promoção da Saúde. Orientador: Dra. Silvia Isabel Rech Franke

Co-orientador: Dr. Daniel Prá

Santa Cruz do Sul

2012

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P436r Pereira, Camila Schreiner Relação entre marcadores fisiológicos do diabetes (dano no

DNA, glicemia e hemoglobina glicosilada), níveis séricos de

minerais e qualidade da dieta em pacientes pré-diabéticos / Camila

Schreiner Pereira. – 2012.

79 f. : il. ; 30 cm.

Dissertação (Mestrado em Promoção da Saúde) – Universidade

de Santa Cruz do Sul, 2012.

Orientação: Profª. Drª. Silvia Isabel Rech Franke.

Co-orientação: Prof. Dr. Daniel Prá.

1. Diabetes mellitus. 2. Dieta para diabéticos. 3. Diabetes

mellitus – Fatores de risco. 4. Avaliação nutricional. I. Franke,

Silvia Isabel Rech, orient. II. Prá, Daniel. III. Título.

CDD: 616.462

Bibliotecária responsável Fabiana Lorenzon Prates - CRB 10/1406

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Essa dissertação foi apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Promoção da Saúde da Universidade de Santa Cruz do Sul - UNISC, como requisito parcial para

à obtenção do título de Mestre em Promoção da Saúde.

Banca examinadora

Dra. Silvia Isabel Rech Franke

Professor Orientador – UNISC

Dr. Jorge André Horta

Professor examinador – UNISC

Dra. Juliana da Silva

Professor examinador – ULBRA

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AGRADECIMENTOS

Agradeço em especial à professora Dra. Silvia Isabel Rech Franke, exemplo de

sabedoria e dedicação profissional, por sempre lutar e acreditar que é possível. Obrigada pelas

diversas horas de aprendizagem e compreensão. Ao professor Dr. Daniel Prá pelos

ensinamentos, empenho e imenso apoio na construção deste trabalho, à colega Cynthia

Caetano pela parceria em toda nossa caminhada de ―mestrandas‖, ao professor Dr. Jorge

André Horta pela colaboração e participação constante. À colega nutricionista Ligia Beatriz

da Costa e futuras colegas de profissão Morgana Tonett e Nathamy Stoeckel que fizeram parte

do processo de coletas de dados, e à estudante do curso de nutrição Patrícia Molz que esteve

presente com extrema dedicação em diversos momentos.

Também à Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Promoção da Saúde Dra.

Miria Suzana Burgos pela dedicação e exigência. Aos colaboradores professores Dra.

Hildergard H. Pohl e Dr. Valeriano Corbellini, Dr Sharbel Weidner Maluf e Roberta Passos

Palazzo do Serviço de genética Médica do HCPA, Dra. Carla Eliete Iochims dos Santos e Dr.

Johnny Ferraz Dias Laboratório de Implantação Iônica do Instituto de Física da Universidade

Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

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DEDICATÓRIA

Ao meu pai, exemplo de força e dedicação, base da minha essência.

À minha mãe, pelo carinho constante e compreensão nos momentos de ausência.

À minha irmã, meu exemplo de profissionalismo.

Aos professores e colegas que souberam ensinar e guiar a direção correta para a realização

desse desafio.

Àqueles que nos inspiram a querer continuar.

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LISTA DE TABELAS DO ARTIGO

Tabela 01 Características clínicas dos indivíduos. Masculino (M). Feminino (F). 59

Tabela 02 Média de glicose e desvio padrão (DP) em quartis. Médias e DP de A1C,

circunferência de cintura (CC), índice de massa corporal (IMC) e percentual de

gordura encontradas respectivamente conforme a divisão em quartis por

glicose.

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Tabela 03 Média e desvio padrão (DP) de A1C em quartis. Média e DP de glicose de

jejum, circunferência de cintura (CC), índice de massa corporal (IMC) e

percentual de gordura encontradas respectivamente conforme a divisão em

quartis por A1C.

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LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO

Figura 01 Comparação entre o Índice de Massa Corporal (IMC) (a,b), percentual de

gordura corporal (c,d) e circunferência de cintura (e,f) de acordo com os quartis

de glicose e hemoglobina glicosilada (A1C), respectivamente.

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Figura 02 Correlação entre a circunferência da cintura e glicemia (a) e hemoglobina

glicosilada (A1C) (b).

63

Figura 03 Ensaio cometa. Comparação entre o índice de dano (a,b) e a frequência de dano

(c,d) de acordo com os quartis de glicose e hemoglobina glicosilada (A1C),

respectivamente.

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Figura 04 CBMN. Comparação entre a frequência de micronúcleos (a,b), pontes

nucleoplásmicas (c,d) e brotos nucleares (e,f) de acordo com os quartis de

glicose e hemoglobina glicosilada (A1C), respectivamente.

65

Figura 05 CBMN. Comparação entre a frequência de células necróticas (a,b), células

apoptóticas (c,d) e o total de células com alterações celulares e nucleares (NA)

(e,f) de acordo com os quartis de glicose e hemoglobina glicosilada (A1C),

respectivamente.

66

Figura 06 CBMN. Correlação entre a frequência de células necróticas e a glicemia (a) e

hemoglobina glicosilada (A1C) (b).

67

Figura 07 CBMN e ensaio cometa. Correlação entre o índice de dano (ID) e a frequência

de dano (FD) e a frequência de brotos nucleares (a, b), células necróticas (c,d).

r e p: coeficiente e nível de significância, respectivamente.

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A1C Hemoglobina Glicosilada

DM2 Diabetes Mellitus tipo 2

DRI Dietary Reference Intake

CBMN Ensaio de citoma de micronúcleos em células binucleadas

CC Circunferência de Cintura

EROS Espécies Reativas de Oxigênio

FD Fraquencia de Dano

HSC Hospital Santa Cruz

ID Índice de Dano

IMC Índice de Massa Corporal

MN Micronúcleo

NA Frequência total de alterações nucleares e celulares

NBUD Botões nucleares

NDCN Núcleos não detectáveis

NPB Pontes nucleoplasmáticas

NO Oxido Nítrico

PIXE Particle Induced X-Ray Emission

RD Registro diário

R24h Registro 24h

RCQ Relação Cintura Quadril

SIS Serviço Integrado de Saúde

SPSS Statistical Package for Social Science

TOTG Teste Oral de Tolerância à Glicose

VET Valor Energético Total

UBS Unidade Básica de Saúde

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APRESENTAÇÃO

Esta dissertação de mestrado, consoante Regimento do Programa de Pós-Graduação

em Promoção da Saúde da Universidade de Santa Cruz do Sul, é composta por cinco partes:

projeto de pesquisa, relatório do trabalho de campo, artigo, nota para divulgação da pesquisa

na imprensa e anexos.

O projeto de pesquisa foi defendido em novembro de 2010, perante banca composta

pelos professores Silvia Isabel Rech Franke, Daniel Prá, Jorge André Horta, com a presença

dos demais professores e alunos do Programa de Pós-Graduação em Promoção da Saúde e

aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da UNISC. Esta dissertação, que consta de um

artigo, intitulado ―Dano de DNA e citotoxicidade em indivíduos com risco para progressão de

diabetes‖, foi submetida à pré-defesa no mês de fevereiro de 2012, mediante banca interna do

Programa. A dissertação foi defendida, mediante banca constituída dentro das exigências da

CAPES e normas regimentais do PPGPS, no mês de março de 2012.

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SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS

DEDICATÓRIA

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES

APRESENTAÇÃO

CAPÍTULO I

PROJETO DE PESQUISA............................................................................................... 11

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................

13

2 MARCO TEÓRICO.......................................................................................................... 16

3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 23

4 MÉTODO.......................................................................................................................... 25

5 CRONOGRAMA.............................................................................................................. 31

6 ORÇAMENTO.................................................................................................................. 31

REFERÊNCIAS........................................................................................... ........................ 32

CAPÍTULO II

RELATÓRIO DO TRABALHO DE CAMPO................................................................ 37

CAPÍTULO III

ARTIGO............................................................................................................................. . 40

CAPÍTULO IV

NOTA À IMPRENSA......................................................................................................... 69

ANEXOS............................................................................................................................. 71

ANEXO A – Aprovação Comitê de Ética e Pesquisa........................................................... 72

ANEXO B – Termo de Consentimento Livre Esclarecido................................................... 73

ANEXO C – Divulgação da pesquisa em jornal impresso................................................... 74

ANEXO D – Instruções para autores – Anais da Academia Brasileira de Ciências............ 75

ANEXO E – Perspectivas .................................................................................................. 79

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CAPITULO I

PROJETO DE PESQUISA

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UNIVERSIDADE DE SANTA CRUZ DO SUL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROMOÇÃO DA SAÚDE

MESTRADO EM PROMOÇÃO DA SAÚDE

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO PROMOÇÃO DA SAÚDE





Projeto de dissertação apresentado ao Programa de

Pós-Graduação em Promoção da Saúde –

Mestrado, Universidade de Santa Cruz do Sul.

Orientador: Drª Silvia Isabel Rech Franke

Co-orientador: Dr. Daniel Prá

Santa Cruz do Sul

2012

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1 INTRODUÇÃO

Dados estatísticos do Ministério da Saúde mostram que o diabetes já afeta cerca de

246 milhões de pessoas em todo o mundo. A estimativa é de que, até 2025, esse número

aumente para 380 milhões. No Brasil, a ocorrência média de diabetes na população adulta

(acima de 18 anos) é de 5,2%, o que representa 6.399.187 de pessoas que confirmaram ser

portadoras da doença. A prevalência aumenta com a idade: o diabetes atinge 18,6% da

população com idade superior a 65 anos (BRASIL, 2007).

A incidência de DM2 é crescente em nosso meio, e resulta da interação entre

predisposição genética e fatores de risco ambientais e comportamentais. Ainda que a base

genética do DM2 não tenha sido identificada, há uma forte tendência de que os fatores de

risco modificáveis, como a obesidade e o sedentarismo sejam os determinantes não genéticos

dessa enfermidade (LELLAN, 2007).

Diabetes caracteriza-se por hiperglicemia crônica com distúrbios de carboidratos,

gordura e metabolismo de proteínas, resultantes de defeitos na secreção e ação da insulina. No

DM2, os resultados de glicose sanguínea sobem a partir de uma combinação de predisposição

genética, dieta não saudável, inatividade física, e o aumento de peso com distribuição central,

resultando em processos fisiopatológicos complexos. Tradicionalmente, o diagnóstico de

diabetes é baseado em sintomas, devido à hiperglicemia, mas durante as últimas décadas,

muita ênfase está sendo colocada sobre a necessidade de identificar o diabetes, e outras

formas de anormalidades da glicose, em indivíduos assintomáticos. A zona entre a parte

superior limite de glicemia em jejum normal (110 mg/dL) e do limite inferior da glicemia em

jejum de diabetes (125 mg/dL) foi adotada pela OMS e deve ser considerado um fator de risco

para diabetes. (OMS, 1999; OMS, 2005)

A glicose elevada leva à perda da função das células do pâncreas que pode resultar em

intolerância à glicose e, finalmente, um estado irreversível de diabetes. Sabe-se que a perda

pancreática resulta da excessiva produção de insulina (exaustão células β) e/ou da toxicidade

das células β pela hiperglicemia (WILLET, MANSON e LIU, 2002).

Um aumento na concentração de glicose no sangue provoca aumento do estresse

oxidativo que contribui para o desenvolvimento e a progressão das complicações associadas

ao diabetes (PAZDRO & BURGESS, 2010). O estresse oxidativo é definido como um

acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs) que causam danos à estrutura das

biomoléculas de DNA, lipídios, carboidratos e proteínas, além de outros componentes

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celulares. Estudos comprovam que o estresse oxidativo está relacionado com o

envelhecimento, atividade física intensa, apoptose, câncer, DM e arteriosclerose (NUNES,

OLIVEIRA e MORAES, 2006). Por outro lado, estes compostos, também podem ter efeitos

considerados positivos sobre o sistema imunitário e desempenham funções metabólicas

essenciais para a homeostase celular (CRUZAT et al., 2007). Estudos mostram que além do

aumento na formação de EROs, os sistemas fisiológicos de defesa antioxidante estão

depletados no paciente com DM2. Por essa razão, vários pesquisadores têm usado modelos de

animais diabéticos, pacientes diabéticos e cultura de células vasculares para avaliar o efeito de

antioxidantes clássicos na prevenção e no tratamento das complicações do DM (ROCHA et

al., 2006)

Embora bem estabelecido os efeitos deletérios da hiperglicemia crônica, ou seja, a

toxicidade da glicose, dados bioquímicos precisos e mecanismos moleculares responsáveis

pelo aumento de glicose induzida pela toxicidade continuam a ser investigados (GIACCARI,

SORICE e MUSCOGIURI, 2009)

Conforme Guerrero-Romero & Rodríguez-Morán (2005), um número crescente de

trabalhos sobre o possível papel benéfico de minerais e suplementos antioxidantes no

tratamento da diabetes, tem contribuído para o debate sobre o seu valor para atingir o controle

metabólico e evitar complicações crônicas em pacientes diabéticos. A elevada atividade

antioxidante sugere o fornecimento de benefícios potenciais para a saúde (PSALTOPOULOU

et al., 2010).

Diversos trabalhos vêm demonstrando o envolvimento de minerais no metabolismo da

glicose e resistência à insulina, ressaltando a importância da avaliação e determinação destes

nutrientes no individuo pré-diabético (LIMA et al., 2004; MARREIRO et al., 2004;

ROUSSEL, 2009).

A origem mais frequente das deficiências de micronutrientes está na dieta inadequada,

reforçando a importância dos prestadores de cuidados de saúde investir esforços em

aconselhamento nutricional, a fim de alcançar o controle metabólico dos pacientes. Um

estudo (PSALTOPOULOU et al., 2010) sugere a implementação da modificação dietética, nas

estratégias de saúde pública, a fim de melhorar o controle da glicemia em indivíduos e

impedir o desenvolvimento de diabetes.

Embora se saiba que a dieta possa reduzir o risco de doenças crônicas e reduzir as

complicações associadas à doença (SCHRODER, 2007), pouco é sabido acerca das doses

ideais de micronutrientes individualmente com vistas a prevenir as co-morbidades associadas.

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O conceito de que as recomendações nutricionais devem ser desenvolvidas para situações

fisiológicas particulares com vistas a otimizar o metabolismo (AMES, 2003).

Diante do exposto pergunta-se: qual a associação entre marcadores fisiológicos do

diabetes (dano no DNA, glicemia e hemoglobina glicosilada), níveis séricos de minerais e a

qualidade da dieta em pacientes pré-diabéticos?

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2 MARCO TEÓRICO

2.1 Pré diabetes

O diabetes caracteriza-se pelo estado de hiperglicemia crônica com distúrbios do

metabolismo dos carboidratos, lipídios e proteínas, decorrente da falta de insulina ou da

incapacidade da insulina de exercer adequadamente seus efeitos. Pode ocorrer a existência de

hiperglicemia de grau suficiente para causar alterações funcionais ou patológicas por um

longo período antes que o diagnóstico de DM2 seja estabelecido. Antes do surgimento de

hiperglicemia mantida, acompanhada do quadro clínico clássico do DM2, a síndrome

diabética passa por um estágio de distúrbio do metabolismo da glicose, caracterizado por

valores glicêmicos situados entre a normalidade e a faixa diabética (OMS, 1999). Conforme

Meigs (2010) os meios para prevenção de diabetes são a mudança no estilo de vida através da

manutenção de um peso saudável e atividade física regular.

A primeira manifestação da diabetes é a hiperglicemia, podendo surgir a partir de vá-

rias causas. Conforme a American Diabetes Association (ADA, 1997) níveis de glicose no

sangue mais elevados do que o normal, mas ainda não diabético são definidos como níveis de

glicemia de jejum ≥110 mg/dL e

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mas sim ao fato de que um resultado dentro dos valores propostos não exclui a doença. Sendo

assim, a utilização da A1C no rastreio ou no diagnóstico do diabetes seria uma opção diag-

nóstica com especificidade, porém, sem sensibilidade (NGSP, 2008).

O termo pré-diabetes é utilizado para descrever a condição em que os níveis de glicose

no sangue estão mais elevados do que o normal, mas ainda não caracterizada como diabetes,

antes usualmente descrita como tolerância à glicose diminuída ou glicemia de jejum alterada

(NARAYAN et al, 2002).

Segundo a Sociedade Brasileira de Diabetes (SBD, 2000) os fatores de risco para dia-

betes são: Idade ≥ 45 anos, história familiar de diabetes, sobrepeso ou obesidade - Índice de

Massa Corporal (IMC) ≥ 25 kg/m2, sedentarismo, HDL-c baixo ou triglicérides elevados,

hipertensão arterial sistêmica (HAS), doença coronariana, diabetes gestacional prévio, ma-

crossomia ou história de abortos de repetição ou mortalidade perinatal, uso de fármacos hi-

perglicemiante (corticosteróides, tiazídicos, beta-bloqueadores). O diagnóstico precoce de

diabetes pode ser indicado para: indivíduos com idade igual ou superior a 45 anos (a cada três

a cinco anos), utilizando a glicose plasmática de jejum. Rastreamento mais frequente (um a

três anos) ou mais precoce (antes dos 45 anos), ou então realizar o rastreamento com Teste de

Tolerancia à Glicose (TTG) com 75 g de glicose quando: a. Há evidência de dois ou mais

fatores da síndrome metabólica, (excesso de peso, HDL-c baixo, triglicerídeos elevados, hi-

pertensão e doença cardiovascular); b. Além da idade 45 anos, há presença adicional de dois

ou mais fatores de risco; c. diabetes gestacional prévio. Rastreamento anual ou mais freqüente

nas seguintes condições: a. Glicemia de jejum alterada ou tolerância à glicose diminuída; b.

Presença de complicações compatíveis com diabetes; c. Hipertensão; d. Doença coronariana.

2.2 Estresse oxidativo

A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), entre outras espécies reativas, é

parte integrante do metabolismo humano e observada em diversas condições fisiológicas.

EROs têm importante função biológica, como na fagocitose, fenômeno em que essas espécies

são produzidas para eliminar o agente agressor. No entanto, quando sua produção é exacerba-

da, o organismo dispõe de um eficiente sistema antioxidante que consegue controlar e restabe-

lecer o equilíbrio. O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio entre o sistema pró e antioxi-

dante (SCHAFER e BUETTNER, 2001). A geração de EROs pode ser neutralizada pelos sis-

temas antioxidantes enzimático (a superóxido dismutase, que catalisa a dismutação do ânion

radical superóxido, a peróxido de hidrogênio e O2, a catalase, e a glutationa peroxidase) e não

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enzimático (glutationa, principal composto antioxidante intracelular, tocoferóis, ascorbato,

ácido úrico e β-caroteno, além de proteínas de transporte de metais de transição, como a trans-

ferrina (transporte do ferro) e ceruloplasmina - transporte do cobre e oxidação do ferro para

ser captado pela transferrina, entre outros) (AMES et al, 1993; HALLIWELL, 2001; VAS-

CONCELOS et al., 2007; URSO & CLARKSON, 2003).

Existem evidencias crescentes de que o estresse oxidativo desempenha papel

fundamental em várias situações clínicas, envolvendo falhas no desenvolvimento de doenças

degenerativas (AMES, 1989; WISEMAN & HALLIWELL, 1996; WELLS et al., 2005).

A modificação oxidativa de proteínas por estresse oxidativo está associada à etiologia

e à progressão de diversas doenças e disfunções fisiológicas, por corrupção da estrutura ou

atividade das proteínas (STADTMAN & BERLETT, 1997) e pelo desacoplamento da

regulação gênica (CERDA & WEITZMAN, 1997). O acúmulo de proteínas danificadas e a

alteração do perfil de expressão gênica diminuem a eficiência homeostática, levando ao

acúmulo de alterações em outros componentes celulares (STOCKER & KEANEY, 2004). Os

lipídios são altamente suscetíveis à oxidação, especialmente nas insaturações, que quando

alteradas levam a efeitos de alteração em cadeia associados a disfunções em membranas, entre

outros efeitos (LOPACZYNSKI & ZEISEL, 2001). No DNA, as lesões na molécula se

constituem etapa inicial da carcinogênese e estão associadas ao envelhecimento e defeitos de

desenvolvimento (HALLIWELL & GUTERRIDGE, 2000) por dois mecanismos: a) alteração

na estrutura molecular do DNA (WANG et al., 1998). b) alterações epigenéticas que

modulam a expressão gênica (CERDA & WEITZMAN, 1997). Quanto às alterações nas

bases mediadas por estresse oxidativo, estima-se a ocorrência de cerca de 10.000 bases do

DNA por dia em situação de ritmo metabólico mediano. Em outras situações de exercício de

alta intensidade, estresse e exposição à xenobióticos (ex. tabagismo) podem ocorrer aumentos

significativos na quantidade de bases alteradas, muito embora os organismos possam se

adaptar devido ao aumento nas defesas antioxidantes e na atividade de sistema de reparo do

DNA (LOFT & POULSEN, 1996).

No diabetes, devido ao excesso de glicose e desequilibrio no metabolismo de ácidos

graxos, ocorre aumento no estresse oxidativo na mitocôndria, bem como ativação de rotas

metabólicas de sinalização inflamatória, que causam agravos progressivos ao organismo,

resultando nas complicações da doença. A perturbação no metabolismo de lipídios gera

autoxidação de gliceraldeído, que gera peróxido de hidrogênio e acetoaldeídos, numa situação

de dano oxidativo crônico, que pode ser aumentada pela presença de metais de transição livre.

O aumento do estresse oxidativo tem sido proposto como um dos maiores gatilhos de

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hiperglicemia nas complicações diabética; assim como a hiperglicemia no organismo

estimula a produção de EROs por varias causas. Estas causas incluem: fosforilação oxidativa,

auto-oxidação glicose, oxidação NAD(P)H, lipoxigenase, monoxigenase P450, e síntese de

óxido nítrico (NO) (VALKO et al., 2007), a formação de produtos de glicação (ex.: A1C) e

acúmulo de sorbitol, bem como ativação da proteína C quinase e de uma cascata de ativação,

envolvendo entre outros fatores de crescimento endotolial, endotelina 1 e o fator nuclear

kappa B (NF-kB). Essa resposta está associada no processo de envelhecimento e resulta em

quebras no DNA de carbonilas e proteínas (ROBERTSON e HARMON, 2006; DENNERY,

2006).

2.3 Diabetes e Dieta

A importância da prevenção de DM2 é destaque pelo aumento substancial mundial na

prevalência de diabetes nos últimos anos. A predisposição genética parece desempenhar um

papel importante na ocorrência de diabetes tipo 2. Contudo, dado que as reservas genéticas da

população mudam muito lentamente ao longo do tempo, a atual epidemia provavelmente se

reflete de mudanças no estilo de vida levando à diabetes. Mudanças no estilo de vida

caracterizada por aumento da ingestão calórica e redução da atividade física parece ter

promovido em conjunto com sobrepeso e obesidade, que são fatores de risco para a diabetes

(ADA, 2008).

Segundo a American Diabetes Association ADA (2002) as recomendações

nutricionais foram sendo modificadas a partir de novos conhecimentos. Entre os indivíduos

com alto risco de desenvolver diabetes tipo 2, programas estruturados que enfatizam as

mudanças de estilo de vida que incluem perda de peso moderada (7% do peso corporal) e

atividade física regular (150 min / semana), com estratégias alimentares, incluindo a redução

de calorias e uma menor ingestão de gordura na dieta, pode reduzir o risco de desenvolver

diabetes e, portanto, recomendado (ADA, 2008).

Evidências epidemiológicas do papel da qualidade dos carboidratos no

desenvolvimento e prevenção do diabetes ainda são inconsistentes. Embora resultados de

alguns estudos indiquem uma possível associação entre dieta com elevados teores de índice

glicêmico e pobre em fibras de cereais e maior risco para diabetes, há indícios de que esta

relação seja mediada também pelos baixos teores de magnésio deste padrão de consumo

alimentar, sugerindo a relevância de se considerar os alimentos e padrões alimentares como

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um todo em investigações sobre fatores determinantes de doenças crônicas (SARTORELLI,

D. S. e CARDOSO, M. A., 2006).

Estudos sugerem que uma dieta rica em cereais integrais e vegetais, fontes naturais de

magnésio e fibras, e pobre em cereais refinados e sacarose, possam exercer um papel protetor

para o diabetes. Dieta alimentar com fontes alimentares em fibras e baixo índice glicêmico

consumidas por indivíduos com susceptibilidade genética, peso corporal e resistência à

insulina, podem influenciar a resposta metabólica individual, fato que pode explicar em parte

os controversos resultados dos estudos epidemiológicos disponíveis, enfatizando a

necessidade de maior número de estudos prospectivos para a elucidação das relações entre o

consumo alimentar e risco para diabetes, ferramenta fundamental no planejamento de medidas

de prevenção. Ensaios clínicos aleatorizados para a prevenção primária do diabetes 2 apontam

que orientações nutricionais enfocando a qualidade dos carboidratos e lipídeos da dieta, como

o estímulo ao consumo de cereais integrais, frutas, verduras, legumes, azeite de oliva e peixes,

em detrimento do consumo de carnes e cereais refinados associadas ao incentivo da prática de

atividades físicas podem produzir um importante impacto na prevenção do diabetes tipo 2 em

indivíduos portadores de fatores de risco (SARTORELLI, D. S. e CARDOSO, M. A., 2006).

Evidências experimentais têm sugerido que deficiências em muitos dos elementos

traço, incluindo zinco, cromo, magnésio, cobre, e manganês, assim como deficiência de

vitamina B-6 pode levar à intolerância à glicose (MOORADIAN A. D, e MORLEY J. E.,

1987). Alguns micronutrientes têm potente atividade antioxidante (CHEHADE, J. M.;

SHEIKH-ALI, M; e MOORADIAN, A. D, 2009). Nutrientes com propriedade antioxidante

incluem carotenóides, vitaminas C e E, selênio, e algumas das vitaminas do complexo B,

nomeadamente, piridoxina, ácido fólico e cianocobalamina (SCOTT JA e KING GL, 2004).

Não se sabe se a ingestão de vitaminas antioxidantes poderia atrasar ou talvez reverter os

danos oxidativos em pessoas com diabetes, mas deve-se orientar sobre a importância da

ingestão diária das necessidades de vitaminas e minerais através de fontes alimentares

(CHEHADE, J. M.; SHEIKH-ALI, M; e MOORADIAN, A. D, 2009).

Alterações de excreção e distribuição de zinco em animais diabéticos têm

demonstrado uma estreita associação entre o aparecimento de diabetes e alterações no

metabolismo do zinco. Torna-se necessário um maior número de investigações para esclarecer

não só o seu papel na fisiologia da insulina e do metabolismo da glicose, mas também se a

suplementação com zinco pode contribuir para evitar, pelo menos algumas das complicações

de DM2 ou mesmo evitar seu aparecimento (SALGUEIRO et. al., 2001). O zinco pode ser

considerado como uma possível nova molécula para a prevenção de diabetes e terapia,

http://spectrum.diabetesjournals.org/search?author1=Joe+M.+Chehade&sortspec=date&submit=Submithttp://spectrum.diabetesjournals.org/search?author1=Mae+Sheikh-Ali&sortspec=date&submit=Submithttp://spectrum.diabetesjournals.org/search?author1=Arshag+D.+Mooradian&sortspec=date&submit=Submithttp://spectrum.diabetesjournals.org/search?author1=Joe+M.+Chehade&sortspec=date&submit=Submithttp://spectrum.diabetesjournals.org/search?author1=Mae+Sheikh-Ali&sortspec=date&submit=Submithttp://spectrum.diabetesjournals.org/search?author1=Arshag+D.+Mooradian&sortspec=date&submit=Submit

21

especialmente para pacientes DM2 (JANSEN, J.; KARGES, W.; LOTHAR RINK, 2009).

Quanto ao cobre a associação da deficiência com o diabetes mellitus parece aumentar

a demanda de cobre pelo organismo, para compensação do estresse oxidativo, por meio das

enzimas antioxidantes dependentes deste nutriente. Na maioria dos estudos com pacientes

diabéticos, o nível de cobre circulante mostra-se aumentado, mas isto não implica em um

estado nutricional adequado de cobre. Este distúrbio pode ser proveniente de alterações na

absorção e circulação de cobre, podendo levar a um aumento de peroxidação lipídica,

contribuindo assim para o surgimento ou agravamento das complicações vasculares do

diabetes. (PEDROSA, L. de F. C.; e COZZOLINO, S. M. F., 1999).

A deficiência de cromo parece provocar quadros de intolerância à glicose, assim como

sua maior disponibilidade aumenta a sensibilidade à insulina e diminui a concentração de

lipoproteínas de baixa densidade na circulação, favorecendo o controle do diabetes tipo 2.

(GOMES, M. R.; ROGERO, M. M. e TIRAPEGUI, J., 2005). A manutenção de um estado

ideal de cromo é importante contra a síndrome metabólica, o risco diabetes e doenças

cardiovasculares, portanto deve ser investigado quando em pacientes com síndrome

metabólica, obesos, com resistência à insulina e DM2. (ROUSSEL, A. M., 2009)

2.4 Diabetes e Avaliação Nutricional

A obesidade, principalmente a visceral, resulta em alterações fisiopatológicas como

menor extração de insulina pelo fígado, aumento da produção hepática de glicose e

diminuição da captação de glicose pelo tecido muscular (DENINO, W.F., et al.2001), podendo

resultar em diferentes graus de intolerância à glicose e, nos indivíduos com DM2, irão

influenciar o controle glicêmico, refletido por maiores níveis de hemoglobina glicosilada

(HbA1c) (PASCOT A, et al. 2000). É amplamente aceito que o excesso de peso,

tradicionalmente definido pelo IMC (obtido pela divisão do peso do indivíduo em quilos pela

altura em metros quadrados) elevado, é um importante fator de risco para uma série de

doenças crônicas e lesões cardiovasculares, incluindo doença cardiovascular e diabetes tipo II.

(CHOURAKI ET AL 2008)

Vasques e colaboradores (2009) avaliaram o comportamento de indicadores

antropométricos de obesidade em relação à Resistência à Insulina (RI) (índice HOMA), e

pontos de corte com melhor eficácia em relação à RI. A amostra foi constituída por 138

homens adultos com idade entre 20 a 59 anos, não diabéticos, para o IMC, o melhor ponto de

corte identificado foi o valor de 24,8 kg/m², bem próximo ao valor de 25,0 kg/m² considerado

22

como diagnóstico de excesso de peso corporal pela Organização Mundial da Saúde (OMS,

2000). No entanto, este índice não teve o melhor desempenho para predizer RI, quando

comparado a circunferência abdominal e circunferência da cintura (CC). O IMC representa

um indicador do estado nutricional bastante utilizado na prática clínica, podendo ser utilizado,

em associação às circunferências abdominal e de cintura para associação ao risco de diabetes.

Em um estudo caso-controle (DELOUMEAUX J, NININ E, FOUCAN L, 2004)

incluindo 309 pacientes portadores de DM2 e 309 controles normo-glicêmicos, com idade

entre 20-86 anos, foram documentadas associações significativas entre CC, RCQ e diabetes

tipo 2, enquanto que o IMC não foi significativamente associado com diabetes em ambos os

sexos. Hofso, et al. (2009) avaliaram características antropométricas e diabetes tipo 2 em

indivíduos extremamente obesos (IMC>40) e não encontraram relação significativa entre o

IMC e o diabetes tipo 2, podendo indicar que o aumento dos níveis de IMC acima de 40

kg/m2, não necessariamente traduz em maior risco de desenvolver diabetes tipo 2.

Uma revisão recente na literatura (HUXLEY R, et al, 2010) com objetivo de avaliar

variáveis antropométricas em relação às doenças cardiovasculares e associação com diferentes

grupos étnicos, mostrou resultados conflitantes; para o diabetes, houveram alguns indícios

indicando que medidas de obesidade central, foram mais fortemente associados com risco de

desenvolver quando comparado ao IMC. Conforme revisão realizada por Qiao e Nyamdorj

(2009), o IMC, CC e RCQ foram associados à incidência e prevalência do DM2, de forma

independente. Porém os resultados mostraram-se controversos sobre quais destes indicadores

de obesidade estão mais fortemente relacionados ao DM2.

Em estudo longitudinal, Tuomilehto J et al (2001) realizaram uma intervenção, com

grupo controle, durante o acompanhamento de três anos, incluíram 522 indivíduos de meia-

idade, com sobrepeso e tolerância diminuída à glicose. Cada sujeito no grupo de intervenção

recebeu orientação individualizada destinadas a redução de peso, ingestão total de gordura, e

ingestão de gordura saturada, aumento da fibra e atividade física. Uma mudança significativa

no peso foi observada no grupo de intervenção em comparação ao grupo controle, bem como

a redução de 58% na incidência de casos de DM (P

23

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar a relação entre marcadores fisiológicos do diabetes (dano no DNA, glicemia e

hemoglobina glicosilada), níveis séricos de minerais e qualidade da dieta em pacientes pré-

diabéticos.

3.2 Objetivos específicos

Verificar a associação entre estresse oxidativo e alterações nos marcadores fisiológicos

do diabetes em indivíduos pré-diabéticos.

Verificar a associação entre níveis séricos de minerais e alterações nos marcadores

fisiológicos do diabetes em indivíduos pré-diabéticos.

Verificar a associação entre o consumo de carboidratos, fibras e antioxidantes e

alterações nos marcadores fisiológicos do diabetes em indivíduos pré-diabéticos.

Verificar a associação entre o Índice de Massa Corporal (IMC) e alterações nos

marcadores fisiológicos do diabetes em indivíduos pré-diabéticos.

Verificar a associação entre a circunferência abdominal e alterações nos marcadores

fisiológicos do diabetes em indivíduos pré-diabéticos.

24

4 METODO

4.1 Delineamento metodológico

Este é um estudo transversal, onde a exposição à causa está presente ao efeito no

mesmo momento ou intervalo de tempo analisado. Este tipo de estudo é aplicado às investiga-

ções dos efeitos por causas que são permanentes, ou por fatores dependentes de características

permanentes dos indivíduos, sobre determinada doença (CAMPANA, et al, 2001). De deline-

amento analítico, que configuram-se como as investigações que tem como objetivo analisar

determinados fenômenos, define seus pressupostos, identificar suas estruturas ou esclarecer

possíveis relações com outras variáveis (GAYA, 2008). Do tipo quantitativo, onde serão quan-

tificados componentes da alimentação, correlacionando com danos oxidativos, níveis séricos

de minerais e glicemia nos indivíduos.

4.2 Sujeitos, local da pesquisa e amostra

Serão convidados a participar indivíduos pré-diabéticos que consultarem na rede

básica de saúde de Santa Cruz do Sul, encaminhados através das Unidades Básicas de Saúde

(UBS) para o ambulatório de Pesquisa Clínica vinculado à Área Acadêmica da UNISC e

Hospital Santa Cruz. Estima-se avaliar em torno de 110 indivíduos de idade entre 20 e 59

anos, em uma amostragem de natureza probabilística não intencional. O tamanho da amostra

(n) foi calculado a partir do efeito das variáveis (VET, RCQ, IMC, % de gordura, dano no

DNA, micronúcleos, glicemia, variáveis da dieta – fibras, carboidratos, vitamina C, fenólicos

totais, e variáveis do sangue – cromo, zinco, cobre e magnésio) sobre o risco de desenvolver

DM. Considerando a correlação múltipla destas sobre a A1C, com coeficiente de correlação

(r=0,5), baseado em outros estudos, nível de significância da correlação com poder estatístico

de 80% e erro amostral previsto (p=0,05).

4.2.1 Critérios de inclusão

Os critérios para a inclusão do encaminhamento para participar do projeto são:

indivíduos entre 20-59 anos de ambos os sexos, portadores de glicemia de jejum acima ou

igual a 100 mg/dL, com função renal preservada (creatinina inferior a 1,5 mg/dL, que não

25

façam uso de fármacos hipoglicemiantes orais ou insulina e aceitem participar (assinatura do

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido) (ANEXO 1).

4.2.2 Critérios de exclusão

Não participarão da amostra indivíduos que não tiverem alterações nos exames de

glicose, que utilizarem medicamentos para controle de DM e que não assinarem o termo de

consentimento livre e esclarecido.

4.3 Hipóteses e Variáveis

4.3.1 Definição das variáveis

VET, RCQ, IMC, % de gordura, dano no DNA, micronúcleos, glicemia, variáveis da

dieta – fibras, carboidratos, vitamina C, fenólicos totais, e variáveis do sangue – cromo, zinco,

cobre e magnésio.

4.3.2 Hipótese 1

Pacientes com alterações nos marcadores fisiológicos do diabetes (dano no DNA,

glicemia e hemoglobina glicosilada) têm níveis séricos baixos de minerais relacionados ao

diabetes.

4.3.3 Hipótese 2


glicemia e hemoglobina glicosilada) possuem ingestão de carboidratos acima do

recomendado, e de fibras alimentares e antioxidantes abaixo.

4.3.4 Hipótese 3


glicemia e hemoglobina glicosilada) possuem circunferência abdominal aumentada.

26

4.4 Procedimentos metodológicos

Este estudo será desenvolvido observando as seguintes etapas:

Etapa 1: Serão convidados a realizar atendimento no Ambulatório do Hospital Santa

Cruz, pacientes com alteração de glicemia, interessados em receber atendimento e orientação

nutricional, bem como participar do projeto de pesquisa. O encaminhamento será realizado

através da rede básica de saúde de Santa Cruz do Sul.

Etapa 2: No Ambulatório do Hospital Santa Cruz os sujeitos receberão orientações e

esclarecimentos em relação à pesquisa. Pacientes que aceitarem participar receberão o termo

de consentimento livre e esclarecido para assinatura. Serão realizadas as seguintes coletas:

entrevista através de questionário com dados pessoais e gerais sobre saúde, aplicação do

recordatório alimentar 24h e orientação do preenchimento do segundo recordatório alimentar

24h (fim de semana). Encaminhamento ao Serviço Integrado de Saúde (SIS) – UNISC para

coleta dos demais questionários e exames.

Etapa 3: No Serviço Integrado de Saúde (SIS) – UNISC será realizada coleta de

sangue para avaliação de glicemia, hemoglobina glicosilada, dano de DNA e minerais,

aplicação do terceiro recordatório alimentar e avaliação antropométrica.

Etapa 4: Orientações e acompanhamento nutricional dos indivíduos no Serviço

Integrado de Saúde (SIS) – UNISC ou Ambulatório do Hospital Santa Cruz.

4.5 Técnicas e instrumentos de coleta

4.5.1 Avaliação da dieta

O consumo alimentar será obtido por meio de inquérito recordatório 24 h (R24h) e

registro diário (RD), de acordo com Fisberg et al (2005). Durante a coleta de dados, os

indivíduos serão submetidos a entrevistas por entrevistador treinado. A dieta habitual será

mensurada pela média do consumo de macronutrientes e micronutrientes em dias alternados,

um dia através do R24h no momento da avaliação e dois dias por RD, sendo um destes de

final de semana.

Cada registro será processado no Programa DietWin® para cálculo da média de

ingestão dos nutrientes. Para avaliar a adequação da ingestão os valores apresentados serão

comparados com valores de referência dos critérios das Dietary Reference Intake (DRI).

27

4.5.2 Coleta de sangue

As amostras de sangue serão coletadas em três momentos: a) durante o rastreamento

da glicemia do sujeito, b) após triagem nas UBS, c) na consulta no HSC para inclusão na

pesquisa e no SIS. As coletas de amostras de sangue serão realizadas no início da manhã por

um Laboratório de Análises Clínicas de Santa Cruz do Sul (Laboratório Horta), o sangue só

será coletado em indivíduos em jejum de 12 horas, com restrição de atividade física moderada

ou vigorosa neste período. Em todos os casos, as amostras serão mantidas a 4ºC no escuro e

transportadas ao laboratório de Nutrição Experimental da Unisc para o ensaio Cometa e para

o preparo do sangue para determinação de minerais. Será utilizado para o ensaio cometa

anticoagulante heparina. EDTA será utilizado para o hemograma, glicose e hemoglobina

glicosilada, determinações feitas no Laboratório Horta e para a técnica Particle Induced X-ray

Emission (PIXE) para determinação de minerais o sangue será liofilizado e analisado no

Laboratório de Implantação Iônica do Instituto de Física da UFRGS. O sangue coletado será

utilizado especificadamente para os propósitos da pesquisa e não terá qualquer outra

finalidade. O material para coletas e armazenamento do sangue será descartado conforme

rotina de descarte de materiais biológicos dos locais envolvidos: HSC, Laboratório Horta, SIS

– UNISC, Laboratório de Implantação Iônica do Instituto de Física da UFRGS.

4.5.3 Avaliação do dano de DNA: Ensaio Cometa

O ensaio cometa alcalino será realizado conforme protocolo padrão do grupo Franke et

al. (2005); Maluf et al. (2009). Cem células por indivíduo, selecionadas aleatoriamente, serão

analisadas (50 por lâmina, 2 lâminas por indivíduo) em microscópio convencional com

magnificação de 200X. O dano será visualmente determinado pela classificação das células

(morfologia em forma de ―cometa‖) em cinco classes de migração de DNA, de dano 0 (sem

dano, morfologia circular apenas ―cabeça‖ e nenhuma ―cauda‖) até dano 4 (dano máximo,

―cauda‖ pronunciadamente maior do que a ―cabeça‖). O índice de dano (ID) será obtido pela

soma de células individuais classificadas, variando de 0 (nenhum dano: 100 células x 0) para

400 (dano de máximo: 100 células x 4). A Freqüência de Dano (FD), em porcentagem (%)

será calculada pela relação entre o número de células com dano (classificadas de 1-4) e o total

de células da amostra. Células com núcleos não detectáveis (NDCN) (cabeça e cauda

separadas) não serão consideradas.

28

5.4.4 Avaliação do dano de DNA: Ensaio de micronúcleos em células binucleadas

(CBMN)

No tempo 500 µL de sangue total serão adicionados a 4,5 mL de meio cultura RPMI

1640 sem L-Glutamine (Sigma), 1mM de piruvato de sódio (Sigma) e 200µg/mL de

fitohemglutina (Cultilab) em frasco de cultura de 30 mL estéril. O sangue, será incubado a

37ºC por 44 horas em estufa contendo 5% CO2. Em seguida, 500 µL de citocalasina (6,0

µg/mL em DMSO estéril) serão adicionados e as células serão removidas do frasco de cultura

e dispostas delicadamente sobre 1,8 mL de Ficcol (Amersham) em tubos côniccos estéreis de

15 mL. Os tubos serão, então, ceentrifugados por 400 g por 30 minutos a 18-20ºC, para

separar os leucócitos dos demais componentes do sangue. A camada de leucócitos será

removida do tubo cômico e misturada na HBSS a temperatura ambiente. Posteriormente, esta

suspensão celular será centrifugada por 180 g por 10 minutos à temperatura ambiente. Ao

final da centrifugação o pellet será ressuspenso em 300 µL de meio de cultura. As células,

misturadas com 5% DMSO para evitar grumos, serão então adicionadas às lâminas e estas

fixadas por imersão em metanol: ácido acético (3:1) e coradas com azul de metileno segundo

Giemsa.

As lâminas serão codificadas para análise, que será executada por um único analisador

para cada grupo de indivíduos, utilizando os critérios e métodos (Fenech, 2000). As células

binucleadas (BNC; 1000 células) serão analisadas quanto à presença de micronúcleos (MN),

botões nucleares – buds (NBUD) e pontes nucleoplasmáticas (NPB). O número de células

mononucleadas binucleadas, multinucleadas, apoptóticas e necróticas será determinado pela

análise de 500 células.

4.5.5 Avaliação de Minerais: Técnica PIXE

Esta técnica tem uma capacidade multi-elementar, isto é, todos os elementos com

número atômico acima de 11 podem ser detectados simultaneamente em uma única medição

no mesmo alvo. A análise é relativamente rápida, não-destrutiva e preserva as amostras

originais, permitindo medidas extras caso seja necessário. A preparação da amostra, na sua

forma sólida (para uma variedade de amostras) não requer qualquer tratamento sofisticado ou

tratamento químico, reduzindo drasticamente qualquer chance de contaminação. Atualmente,

PIXE é amplamente utilizado para caracterizar uma variedade de materiais, incluindo

amostras biológicas, geológicas e ambientais (FRANKE et al., 2006; PRÁ et al., 2008).

29

4.5.6 Análise antropométrica

Serão consideradas as medidas de peso corpóreo e altura, utilizando-se balança

antropométrica. A partir da verificação do peso e da altura, será cálculado o Índice de Massa

Corporal (IMC; kg/m2), mediante divisão do peso corpóreo (kg) pela estatura (m2). Para

classificação do IMC será utilizado o critério proposto pela Organização Mundial da Saúde

(OMS, 1995), que estabelece os seguintes limites de corte e seus respectivos diagnósticos

nutricionais: Eutrofia de 18,5 a 24,9kg/m2; Sobrepeso de 25,0 a 29,9 kg/m2; Obesidade grau I

de 30,0 a 34,9kg/m2; Obesidade grau II de 35 a 39,9kg/m2; Obesidade grau III ≥40,0kg/m2.

Para verificação da circunferência abdominal será utilizada fita métrica inelástica, sendo a

medida realizada no ponto médio entre a crista ilíaca e o rebordo costal inferior.

Para a estimativa do Percentual de Gordura será utilizado Jackson e Pollock, equação

de Siri e classificação de Pollock e Wilmore (1993).

4.6 Análise estatística

Os dados serão tabulados e avaliados no programa DietWin® para cálculo do consumo

de nutrientes e nos programas Excel e Statistical Package for Social Science (SPSS) v. 18.0

para análises estatísticas. As variáveis serão comparadas utilizando-se o teste t de Student ou o

teste U de Mann-Whitney ou por análise de variância (ANOVA) ou teste de Kruskall-Wallis

quando for necessário. Para variáveis categóricas será empregado teste qui-quadrado ou

outros testes para comparação de proporções. A análise de correlação (Pearson ou Spearman)

será utilizada para buscar associações das variáveis. Todos os dados serão testados para

homocedasticidade e normalidade, uma transformação logarítimica será empregada. O nível

de significância será de P

30

5 CRONOGRAMA

ETAPAS/MESES A S O N D J F M A M J J A S O N D

Submissão/aprovação

do projeto

X X

Submissão ao Comitê

de Ética e Pesquisa

X X

Coleta de dados X X X X X

Análise estatística e

discussão dos

resultados

X X X X X X

Defesa em banca X

Encaminhamento de

artigo

X

31

6 ORÇAMENTO

Itens a serem financiados Valor Total

(R$)

(R$)Fonte

viabilizadora

Custeio

Análises bioquímicas (glicemia, hemoglobina

glicada)

1.100,00 Pesquisador

Material para coleta de sangue e uso geral no

laboratório (seringas e agulhas, reagentes de uso

geral, microtubos, lâminas e lamínulas)

1.000,00 *FAPERGS

Material para o ensaio cometa (agarose de baixo

ponto de fusão, ácido tungstosilícico, nitrato de

prata, etc.)

1.300,00 *FAPERGS

Deslocamento Santa Cruz do Sul – Porto Alegre

para a realização do ensaio de PIXE pelo Instituto

de Física da UFRGS (parceria)

200,00 **CAPES

Material de escritório (folha para impressão,

pendrives)

100,00 Pesquisador

Custeio (Total) 3.700,00

* Verba do Edital Auxílio a Recém Doutores-FAPERGS (Prof. Daniel Prá R$

9.500,00) - R$ 2.300,00 destinados aos experimentos descritos

**Verba do edital da rede Nanobiotec-CAPES (Prof. Daniel Prá R$ 36.000,00).

Destinados ao projeto R$ 100,00 aos experimentos descritos

Órgão financiador: EDITAL FAPERGS n.003/2009 (Auxílio Recém Doutor Daniel

Prá: Título do projeto ―Efeitos in vitro de compostos antioxidantes sobre marcadores

fisiológicos do diabetes mellitus: uma estratégia para ampliar a compreensão sobre a

fisiopatologia e melhorar o manejo da doença‖. Recursos da CAPES virão relativos ao projeto

"microfeixes de ions em biomateriais", no âmbito da rede Nanobiotec (processo

23038.019101/2009-79)

32

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37

CAPÍTULO II

RELATÓRIO DO TRABALHO DE CAMPO

38

RELATO DE CAMPO

Este foi um estudo transversal quantitativo no qual foram convidados a participar indi-

víduos com características iniciais de pré-diabetes que consultaram na rede básica de saúde de

Santa Cruz do Sul, Ambulatório de Pesquisa Clínica vinculado à Área Acadêmica da UNISC,

e Clínicas particulares. A divulgação do projeto teve início em dezembro de 2010, quando o

mesmo foi enviado à Coordenação das Unidades Básicas de Saúde (UBS) e aprovado para

busca dos pacientes. A partir desse momento, foram realizadas três reuniões com os médicos

das Estratégias de Saúde da Família (ESFs) e contatados, via visita e telefone, todos os en-

fermeiros responsáveis pelas UBS. Elaborou-se material de divulgação que também foi distri-

buído nestes locais e em diversas clínicas e locais ligados à rede de saúde do município. Po-

rém, houve poucos encaminhamentos. Um grande número de pacientes chegou até a coleta

por meio de indicações de médicos e nutricionistas particulares, bem como convênios de saú-

de.

Foram avaliados 62 indivíduos com idades entre 20 e 59 anos conforme os critérios de

inclusão - indivíduos entre 20-59 anos de ambos os sexos, portadores de glicemia de jejum

acima ou igual a 100mg/dL que não fizessem uso de fármacos hipoglicemiantes orais ou insu-

lina e que aceitassem participar da pesquisa mediante assinatura do Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido.

Este estudo foi desenvolvido observando-se as seguintes etapas:

Etapa 1: Por indicações de clínicas, de nutricionistas de um convênio de saúde e

algumas do setor público, os nomes e dados dos pacientes foram informados aos responsáveis

pelo projeto. Após informações prévias realizadas nos locais de indicação, os indivíduos

foram convidados a participar da pesquisa via telefone. Os agendamentos das coletas

iniciaram em março de 2011 e os procedimentos foram realizados nas terças-feiras pela

manhã, devido ao fluxo dos procedimentos bioquímicos, no Serviço Integrado de Saúde (SIS)

– UNISC.

Etapa 2: No local das coletas os pacientes receberam orientações e esclarecimentos em

relação à pesquisa. Pacientes que aceitaram participar assinaram o termo de consentimento

livre e esclarecido. Foram realizadas os seguintes procedimentos: a) entrevista por

questionário que incluía dados pessoais e gerais sobre saúde; b) aplicação do recordatório

alimentar 24h e orientação do preenchimento do segundo recordatório alimentar 24h (fim de

semana); c) coleta de sangue para avaliação de glicemia, hemoglobina glicosilada, dano de

39

DNA e determinação de minerais. O material bioquímico foi encaminhado aos laboratórios

responsáveis de acordo com os protocolos descritos no projeto.

Etapa 4: Orientações e acompanhamento nutricional dos indivíduos no Serviço

Integrado de Saúde (SIS) – UNISC ou consultório nutricional particular.

40

CAPÍTULO III

ARTIGO

41

Dano de DNA e citotoxicidade em indivíduos com risco para progressão de diabetes

Danos de DNA em pré-diabetes

Camila Schreiner1,2

, Patrícia Molz2, Morgana Tonet

2, Nathamy Schenkel

2, Thiago Brites

3,

Sharbel Weidner Maluf3, Daniel Prá

1, Silvia Isabel Rech Franke

1,2*

1 PPG em Promoção da Saúde, Universidade de Santa Cruz do Sul (UNISC), Santa Cruz do

Sul, RS, Brasil.

2 Curso de Nutrição, Universidade de Santa Cruz do Sul (UNISC), Santa Cruz do Sul, RS,

Brasil.

3 Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), Porto Alegre,

RS, Brasil.

* Corresponding author: Dra Silvia Isabel Rech Franke. PPG em Promoção da Saúde.

Universidade de Santa Cruz do Sul – UNISC. Av. Independência, 2293 - Prédio 42, sala 4206.

CEP: 96815-900 Santa Cruz do Sul - RS / Brasil

42

RESUMO

No pré-diabetes há hiperglicemia leve e estresse oxidativo, porém desconhece-se a citotoxici-

dade associada. Portanto, avaliou-se a relação entre alterações glicêmicas, danos de DNA e

citotoxicidade em pré-diabéticos. A glicemia de jejum e hemoglobina glicosilada foram avali-

ados e utilizados como critérios de inclusão. Variáveis antropométricas também foram avalia-

das. O ensaio cometa e ensaio de citoma de micronúcleos em células binucleadas foram utili-

zados para avaliar genotoxicidade e citotoxicidade. Os indivíduos foram agrupados em quartis

conforme glicemia e hemoglobina glicosilada para comparação às demais variáveis. A circun-

ferência de cintura associou-se à hiperglicemia. No terceiro quartil de glicemia houve aumen-

to na frequência de danos ao DNA avaliados pelo cometa (p

43

Introdução

O risco para progressão de diabetes é caracterizado quando a concentração de glicose

sanguínea está elevada em relação aos valores normais, porém ainda não elevada o suficiente

para diagnóstico de diabetes. Neste momento, o quadro pode ser nomeado como pré-diabetes

(ADA 2011).

Exames como glicemia de jejum e teste oral de tolerância à glicose (TOTG) são

utilizados para caracterizar fator de risco para diabetes (ADA 2011). Estudos prospectivos

vêm utilizando a concentração de hemoglobina glicosilada (A1C) para prever a progressão de

diabetes e demonstrando uma forte e contínua associação entre A1C e diabetes subsequente

(Zhang et al. 2010; Selvin et al. 2010). Atualmente os critérios propostos para maior risco de

pré-diabetes são: a) glicemia de jejum entre 100 e 125 mg/dL (5,6–6,9 mmol/L); ou b) TOTG

- teste de glicemia após ingestão oral de 75 g de glicose entre 140– 199 mg/L (7,8–11,0

mmol/L); ou c) A1C entre 5,7–6,4% (ADA 2011).

A obesidade, principalmente o acúmulo de gordura visceral, resulta em alterações

fisiopatológicas como menor extração de insulina pelo fígado, aumento da produção hepática

de glicose e diminuição da captação de glicose pelo tecido muscular (Denino et al, 2001). Tais

alterações podem influenciar no controle glicêmico e nos níveis A1C (Pascot et al, 2000),

sendo portanto um importante componente de várias desordens metabólicas incluindo

tolerância diminuída à glicose, dislipidemia e hipertensão, correlacionados com doença

cardiovascular aterosclerótica (Nakatsuji, 2010, ADA, 2011). Evidências vêm demonstrando

que o desenvolvimento do diabetes é também caracterizado pelo aumento do estresse

oxidativo e que parece contribuir para o desenvolvimento de complicações metabólicas e

cardiovasculares (Hopps et al. 2009). O estresse oxidativo é definido como o acúmulo de

espécies reativas de oxigênio (EROs) que causam danos à estrutura das biomoléculas de

44

DNA, lipídios, carboidratos e proteínas, além de outros componentes celulares. A produção

de EROs e de outras espécies reativas, é parte integrante do metabolismo humano e observada

em diversas condições fisiológicas. O aumento do estresse oxidativo tem sido proposto como

um dos maiores gatilhos de hiperglicemia nas complicações do diabetes; assim como a

hiperglicemia no organismo estimula a produção de EROs. Na hiperglicemia ocorre a auto-

oxidação da glicose, a glicação não enzimática de proteínas e a estimulação da via poliol (que

converte glicose em sorbitol e sorbitol em frutose), tais alterações metabólicos podem induzir

ao aumento de radicais livres de oxigênio e consequentemente a uma variedade de lesões no

DNA, incluindo bases oxidadas e quebras de cadeia de DNA. Sendo assim, o estresse

oxidativo é um processo deletério que pode ser um importante mediador dos danos nas

estruturas celulares na etiologia e progressão de diabetes (Shigenaga e Ames 1991; Maritim et

al. 2003; Valko et al. 2007).

Dentre os marcadores genéticos de dano no DNA podemos incluir o ensaio cometa e

ensaio de citoma de micronúcleos em células binucleadas (CBMN). O ensaio cometa é um

método simples, sensível, rápido e eficaz para a detecção de danos no DNA e pode ser

utilizado para estimar danos no DNA ao nível da célula individual através de rupturas de

filamentos, sítios de reparação, ligações cruzadas e sítios alcalinos gerados a partir de estresse

oxidativo (Tice et al. 2000). O CBMN é o marcador mais frequentemente utilizado em

linfócitos humanos para avaliar genotoxicidade e citotoxicidade in vitro e in vivo (Fenech e

Morley 1985; Fenech 2007), fornecendo informações sobre a ruptura cromossômica,

rearranjos cromossômicas, amplificação do gene e a morte celular - apoptose e necrose

(Fenech 2007). O ensaio cometa, ao contrário do CBMN, não necessita de células em

proliferação para sua aplicação, podendo ser utilizado qualquer tipo de célula. Contudo o tipo

de dano observado no ensaio cometa é possivelmente reversível (Tice et al. 2000).

45

Esse estudo avaliou a relação entre glicemia de jejum, A1C, danos de DNA e

citotoxicidade em indivíduos com risco para progressão de diabetes (pré-diabéticos).

46

Materiais e Métodos

Seleção da amostra

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade de Santa Cruz do Sul (UNISC) (processo 2687/10). Foram encaminhados ao

Serviço Integrado de Saúde (SIS) da UNISC, no período de março de 2010 a outubro de 2011,

indivíduos (n=60) com idades entre 20 e 59 anos com critério de risco para progressão de

diabetes, segundo exame prévio de glicemia de jejum a partir de 100 mg/dL, que não faziam

uso de fármacos hipoglicemiantes ou insulina e aceitaram participar da pesquisa (assinatura

do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido). Permaneceram no estudo indivíduos com

pelo menos um dos critérios de pré-diabetes estabelecidos pela ADA (2011), conforme os

resultados de glicemia e A1C encontrados nesse estudo. Não foram excluídos aqueles que

apresentaram valores superiores ao estabelecido para pré-diabetes, devido ao não diagnóstico

clínico e tratamento de diabetes nesses pacientes.

Os participantes do estudo foram selecionados da comunidade através da divulgação

no Ambulatório de Pesquisa Clínica (vinculado à Área Acadêmica da UNISC) do Hospital

Santa Cruz (HSC), nas Unidades Básicas de Saúde (UBS), clínicas e convênios particulares.

O tamanho da amostra foi calculado a partir do efeito das variáveis (glicemia de jejum,

A1C, dano de DNA) sobre o risco de desenvolver diabetes. Considerando a correlação

múltipla destas sobre a A1C, com coeficiente de correlação (r=0,5), baseado em outros

estudos, nível de significância da correlação com poder estatístico de 80% e erro amostral

previsto (p=0,05).

47

Caracterização clínica e bioquímica

Foram coletadas amostras sanguíneas no início da manhã (jejum de 12h) para

determinação de glicemia de jejum, A1C e dano de DNA, em um Laboratório de Análises

Clínicas de Santa Cruz do Sul. Em todos os casos, as amostras foram mantidas a 4ºC no

escuro e transportadas ao laboratório de Nutrição Experimental da Unisc para o ensaio

cometa. Para os procedimentos de CBMN as amostras foram encaminhadas ao Laboratório de

Citogenética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Foi utilizado para o ensaio cometa e

CBMN anticoagulante heparina. EDTA foi utilizado para avaliação da glicemia de jejum e

A1C.

O Índice de Massa Corporal (IMC; Kg/m2) foi calculado através das medidas de peso

corpóreo e altura, coletados por balança antropométrica. Para verificação da circunferência de

cintura (CC) foi utilizada fita métrica inelástica, para a estimativa do percentual de gordura foi

utilizado equação de Siri e classificação de Pollock e Wilmore (1993).

Dano de DNA: ensaio cometa

O ensaio cometa alcalino foi realizado conforme protocolo padrão (Prá et al. 2011).

Foram analisadas cem células por indivíduo, selecionadas aleatoriamente (50 por lâmina, 2

lâminas por indivíduo) em microscópio convencional com magnificação de 200X. O dano foi

visualmente determinado pela classificação das células (morfologia em forma de ―cometa‖)

em cinco classes de migração de DNA, de dano 0 (sem dano, morfologia circular apenas

―cabeça‖ e nenhuma ―cauda‖) até dano 4 (dano máximo, ―cauda‖ pronunciadamente maior do

que a ―cabeça‖). O índice de dano (ID) obtido pela soma de células individuais classificadas,

variando de 0 (nenhum dano: 100 células x 0) para 400 (dano de máximo: 100 células x 4). A

Frequência de Dano (FD), em porcentagem (%) calculada pela relação entre o número de

48

células com dano (classificadas de 1-4) e o total de células da amostra. Células com núcleos

não detectáveis (NDCN) (cabeça e cauda separadas) não foram consideradas.

Dano de DNA: CBMN

O teste de micronúcleos em células binucleadas foi realizado de acordo com o método

descrito por Fenech e Morley (1985) e adaptado por Maluf (2004). As amostras de sangue

(0,5 mL) foram colocadas em cultura contendo 5 mL de RPMI 1640 suplementado com 20%

de soro bovino fetal e 0,2% de fitohemaglutinina. Os frascos de cultura foram encubados em

estufa a 37ºC por 44 horas. Após esse período, foram adicionados 4,5 g/mL de citocalasina B

as suspensões celulares, que foram encubadas por mais 28 horas. Posteriormente, as

suspensões celulares foram tratadas com agente hipotônico (KCl), fixadas em solução 3:1 de

metanol e ácido acético e, então, pingadas sobre lâminas de microscopia (pelo menos 2 por

indivíduo). As lâminas foram coradas com Giemsa. Foram analisadas 500 células por

indivíduo quanto à frequência de células apoptóticas e necróticas, bem como para obtenção do

índice de proliferação celular (IPC). O IPC foi calculado pela razão entre o número de células

que sofreram divisão (binucleadas e tetranucleadas) e o número de células que não sofreram

divisão (mononucleadas). Foram analisados 2000 linfócitos binucleados por indivíduo para

avaliação da frequência de micronúcleos (MN), brotos nucleares (NBUD), pontes

nucleoplasmáticas (NPB), células apoptóticas, células necróticas. A soma de dessas

frequências deu origem ao total de alterações celulares e nucleares (N.A) por 2000 células.

49

Análise estatística

Os dados foram analisados no programa Statistical Package for Social Science (SPSS)

(versão 18.0) e as figuras foram plotadas no programa Graphpad Prism versão 5.0 (Graphpad

Inc, San Diego, CA). Os indivíduos foram divididos em quatro grupos, de acordo com os

quartis de glicose e A1C para comparação das variáveis entre os grupos. As variáveis foram

comparadas por análise de variância (ANOVA), seguido de teste de Tukey e correlações de

Pearson foram utilizadas para buscar a relação dos dados clínicos e bioquímicos (glicemia e

A1C) e o dano de DNA (ensaio cometa e CBMN). Foram considerados os valores de p

inferiores 0,05 como significativos.

50

Resultados

Marcadores de pré-diabetes e de obesidade

As características clínicas do grupo de estudo estão apresentadas na tabela 1. Dos 60

participantes, 38 foram do sexo feminino e a maioria dos indivíduos foi de meia-idade. Houve

correlação significativa entre a glicose sanguínea e A1C (r=0,660; p

51

de células necróticas no quarto quartil em relação ao primeiro (Fig.5 a).

Não houve significância estatística na comparação de A1C e danos de DNA. No

entanto, conforme demonstrado na figura 5 (b,d,f) ocorreu o aumento na morte celular

(apoptose e necrose) e na frequência total de alterações nucleares e celulares (N.A) no último

quartil (A1C média 6,7 ± 0,24%) segundo o CBMN. Observou-se correlação entre necrose e

A1C (r=0,042, p=0,005) (Fig.6 b), e entre o ID e a FD e a frequência de brotos nucleares e

células necróticas (Fig.7 a,b,c,d).

Discussão

Esse estudo avaliou a relação entre glicemia de jejum e A1C, danos de DNA (ensaio

cometa e CBMN), citotoxicidade combinada com genotoxicidade (CBMN) e caracterização

antropométrica em indivíduos com risco para progressão ao diabetes (pré-diabéticos), sem o

uso de medicações para controle de glicemia.

Está bem consolidado que a obesidade, a inatividade fisica e a má alimentação são

fatores de risco para o desenvolvimento de doenças crônicas não transmissíves (ADA, 2011).

Apesar de opiniões controversas sobre qual medida de obesidade está mais fortemente

associada ao risco de desenvolver diabetes, estudos vêm mostrando que métodos de

classificação de acúmulo de gordura visceral estão mais associados ao diabetes quando

comparados aos métodos de classificação de peso corporal (Qiao e Nyamdorj 2010). No

presente estudo o indicador de adiposidade central (CC) se sobressaiu em relação aos

marcadores gerais de obesidade (IMC e percentual de gordura) quando comparados à

glicemia de jejum e A1C, reforçando a associação da gordura visceral ao risco de desenvolver

diabetes.

Em relação aos biomarcadores de danos de DNA, a glicemia de jejum demonstrou

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