Relevanz von Virusvarianten für Diagnostik, Therapie und Krankheitsverlauf am Beispiel der

Hepatitis B

Thomas Bock, PhDRobert Koch-Institut, BerlinFG15, Molekulare Epidemiologie viraler Erreger

Fortbildung für den Öffentlichen GesundheitsdienstBerlin, 24. – 26. März 2010

Bock & Zentgraf 1995

Hepatitis-Viren: Hepatitis A Virus (HAV, Picornaviren)Hepatitis B Virus (HBV, Hepadnaviren)Hepatitis C Virus (HCV, Flaviviren, Hepaciviren)Hepatitis D Virus (HDV, Viroid)Hepatitis E Virus (HEV, Caliciviren)Hepatitis G Virus (GBV-C, Flaviviren)TT-Virus (Circoviren)SENV-D/H-Virus (Circoviren)NonA-nonG Viren

Andere Virusinfektionen mit Folge Hepatitis:

Humanes Cytomegalie Virus (HCMV, HHV5, Beta-Herpesvirus)Herpes simplex Virus (HSV1, [HSV2], Alpha-Herpesvirus)Epstein Barr Virus (EBV, HHV4, Gamma-Herpesvirus)Gelbfieber Virus (Yellow fever virus, YFV, Flaviviren)

Virus Hepatitis

Bock & Zentgraf 1995

http://www.clinical-

virology.org/gallery/cvn_em_01.html

Quelle: http://www.hepb.de/cps/rde/xchg/bms_hepb/hs.xsl/home_hepatitis-b_kampagne.html

WHO und Robert Koch-Institut, Berlin (Epidem. Bulletin 2009, 20:189-202)

• ca. 2 Milliarden von derzeit ca. 6,5 Milliarden Menschen aktuell mit HBV infiziert

• > 420 Millionen Menschen = 5%-7% der Weltbevölkerung chronisch HBV infiziert

• > 1 Million/Jahr Todesfälle (HBV-induzierten Leberzirrhose [57% aller Fälle], hepatozellulären Karzinom (HCC) [53% aller HCC]

• In Europa sind zwischen <0,1% (Nordeuropa) und 8% (Ost- und Südeuropa) der Bevölkerung chronisch mit HBV infiziert

• In der Bundesrepublik Deutschland wurden im Jahre 2008 1.850 akuter HBV-Neuerkrankungen an das RKI gemeldet, wobei etwa 5% Virusträger bleiben

Epidemiologie der Hepatitis B Virus Infektion

Hepatitis B Virus Verbreitung

Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/09/HBV_prevalence_2005.png

Pressefoto zum Start der Kampagne Hepatitis B 2009Welt-Hepatitis Tag 19.05.2009

Bock & Zentgraf 1995100 nm

Infektiöse HBV-Virionen

Nicht-infektiöse filamentöse und globuläre HBV-Partikel

(HBsAg)

1012 virale Kopien/ml Serum(1013 HBsAg* Partikel/ml Serum)

Hepatitis B Virus Partikel im Serum

• umhülltes ~40 nm DNA-Virus; ~20 nm Kapsid

• Hepadnavirus, Pararetrovirus

• pdDNA, ca. 3200 bp

• 4 überlappende Leserahmen (ORF)

• preC/Core, preS/surface, RT-Polymerase, X-Protein

• Promotoren: pg/Core, S and X-Promotor; Enh 1 und Enh 2

• 8 Genotypen

• strikt hepatotroph

Hepatitis B Virus

fila

men

teo

us

globular

Infectious virion„Dane-particel“(approx. 42 nm)

Not-infectiousHBsAg-particel(apprx. 20 nm)

CapsidHBcAg

HBVDNA genome

LHBs

MHBs

SHBs

SHBs

SHBs

Hepatitis B Virus Genom

HBV Virion

Surface Genes

X-GenC

apsidgen

Polymerase

HBV Genom

nach Kann & Gerlich, 1998, modifiziert

Interaktion

Virion

Nucleus

Hepatozyte

Translation

EnkapsidierungReverse

Transkription

pgRNApgRNADNA (-)

cccDNA Amplifikation

Transkription

mRNAmRNA

pgRNApgRNA

AAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAcccDNAcccDNA

cccDNA Formation

rcDNA

Entry

Polymerase

DNA (+)

(+) StrangSynthese

Virion Sekretion

ER

HBeAgHBsAg

Rezeptor ?

ER

virale ProteineSekretion

Hepatitis B Virus Lebenszyklus

Adapted from: Ganem D, et al. N Engl J Med 2004

HBV Minichromosom (Bock et al 2001)

• parenteral

(Blut/-produkte)

(Dialyse)

kontaminierte Instrumente

kontaminierte Spritzen

• sexuell

• perinatal

Übertragungswege des Hepatitis B Virus

Quelle: www.endowsec.com/pated/gifs/elv0010.gif

Quelle: CDC Sentinel Counties Study of Viral Hepatitis

Heterosexuelle(Promiskuität)

(41%)

Homosexuelle (9%)

familiärer Kontakt (2%)Heilberufe (1%)

Unbekannt (31%)

Drogen-abhängige

(15%)

Risikogruppen der Hepatitis B Virus-Infektion

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

Altersgruppen

Altersspezifische Inzidenz der Hepatitis B, Jilg; Dt. Ärzteblatt 1996

gem

eld

ete

Erk

ran

kun

gen

/100

.000

< 5 5 - 15 15 - 25 25 - 45 45 – 65 >65

3,9% 6,7% 25,9% 41,8% 15,3% 6,4%

Alterspezifische Verteilung von HBV Infektionen

Klinischer Verlauf der Hepatitis B Virus Infektion

akut(35%)

Chronische Hepatitis(5-10%)

Primäres Leberkarzinom

fulminant(<1%)

inapparent(65%)

„Gesunde“ HBsAg-Träger

Zirrhose

HBV Infektion

(10%)

Ausheilung

chronisch persistent(70%)

chronisch aktiv(30%)

(90%-95%)

?(>50%)

(10%)

tuepedia.de/index.php/Ludwig_Uhland

7,8% keine Risikofaktoren

0,4 % Steroid Missbrauch

0,4 % M. Wilson

0,7% Hämochromatose

15,7 % andere Leberzirrhose

3,0 % Hep B und C und Alkohol

6,3 % Hep. B und Alkohol

3,7% Hep. C und Alkohol

23,1 % Alkohol Missbrauch

7,1 %Hepatitis B und C18,7 % Hepatitis B

13,1 % Hepatitis C

Inzidenz des hepatozellulären Karzinoms in Hannover1995-1998 / n= 268

Kubicka et al, Liver 2000; 20(4):312-8

Akute Hepatitis B: Diagnostik

Serologie:

- HBsAg, anti-HBc (total und IgM)

- HBeAg, (anti-HBe)

Weitere Methoden:

- HBV-DNA (quantitaiv)

- Transaminasen

HBe/HBs Sero-conversion

Ganem & Prince, 2004

Chronische Hepatitis B: Diagnostik

• Zusätzlich zur Akut-Diagnostik:- Sonographie der Leber- zusätzliche biochemische Marker (Albumin, ChE, Quick, AFP)- Ausschluss anderer Infektionen (HIV, HDV, HCV)- Leberhistologie

Ganem & Prince, 2004

keine HBe/HBs Sero-conversion

Diagnostik der HBV Infektion

HBsAg positiv

HBeAg, HBV-DNA

(hoch-replikativ) (niedrig-replikativ)+ -

anti-HDV

>105 IE/ml <105 IE/ml

Chen CJ et al. EASL 2005

kumulative Inzidenz des HCC abhängig der “baseline” HBV DNA (n=3851)

P<0.01

HBV Viruslast und HCC-Risko

HBV-Core-spezifische Quantitative Real Time

Taqman PCR

HBV qPCRAmplification Plot

Standard Kurve

Kommerziell z.B.:COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV Test

Weltweite HBV-Genotyp Verteilung

A

A(e)

A

B(j)

B(a)

C

C

D

D

E

F

F

G

G

H

A(a)

A(a)

H

D

F

Adapted from Hamilton and Gross

• Interferon alpha: Genotyp A und B sprechen relativ gut an

Genotyp D und C sprechen nur moderat an

• Lamivudine: Resistenzrate höher bei A als in D

kein Unterschied zwischen B und C

• Adefovir: keine Genotyp-spezifischen Unterschiede

• andere Nukleoside: bislang nicht bestimmt

HBV Genotypen und Suszeptibilität zuantiviralen Substanzen

Variable preS/S-region zur HBV Genotypisierung

Methoden zur HBV Genotyp Bestimmung

Therapie der chronischen Hepatitis B Virus Infektion

• (PEG)-Interferon-αααα• Nucleoside Analoga (Lamivudine, Entecavir, Telbivudine)

• Nucleotide Analoga (Adefovir dipivoxil, Tenofovir)

• Hepatitis B Hyperimmunoglobulin (HBIG)

Prophylaxis des Hepatozellulären Karzinoms

Wirkung Antiviraler SubstanzenInhibition der Reversen Transkription

Inhibitoren der viralen Polymerase

durch Nucleos(t)idanaloga:

• Herpesvirus Polymerase:

Aciclovir, Ganciclovir

Inhibitoren der Reversen Transcriptase:

• HIV: AZT (Zidovudine)

• HBV Polymerase:

Lamivudin (ZeffixTM)

Adefovir (HepseraTM)

Entecavir (BaracludeTM)

Telbivudine (SebivoTM)

Tenofovir (Viread®)

Selektion von Therapie-resistenten Mutationen

Adapted from: Ganem D, et al. N Engl J Med 2004

Schema der Nucleos(t)idanalog-Wirkung

wt HBV Polymerase-Funktion Nucleotidanalog-Wirkung auf die HBV Polymerase Funktion führt zu Kettenabbruch

Kettenabbruch

modifiziert nach: Richman, Nature 2001, 410:995-1001

http://www.mcld.co.uk/hiv/images/lamivudine.gif

Hepatitis B: Problem der antiviralen Resistenz

• Nur ein virales Target - die HBV Polymerase

• Nur eine Substanzklasse (Nucleos(t)id-Analoga)

• Antivirale Substanzen:

– Lamivudine / Telbivudine (L-NUCLEOSID)

– Adefovir / Tenofovir (ACYCLISCHES PHOSPHONAT)

– Entecavir (CYCLOPENTEN RING GRUPPE)

Selektion von Hepatitis B Virus VariantenMutanten und Genotypen

Bock & Zentgraf 1995

Virale Faktoren:• HBV ist ein hoch replizierendes Virus (1012 IE/ml)

• Die virale Polymerase (Reverse Transcriptase) besitzt keine “proofing

reading” Aktivität

• 1 - 5 x10-5 Substitutionen/Position/Jahr (S/P/Y)

= >107 Fehler/Tag/Patient

• 104 fach höher im Vgl. zum humanen Genom

• Lange Halbwertszeit der cccDNA (6-10 d)

• Lange Halbwertszeit der infizierten Hepatozyte (>30d)

Wirt Faktoren:• Selektionsdruck des Immunsystems

• Selektionsdruck einer antiviralen Therapie

• Andere selektive Einflüsse

Einfluss von HBV Mutanten auf die Virus Replikation

Mutationen im HBV Genom führen zur:

• Modulation der HBV Replikation

• Beeinflussen die Wirtszell-Suszeptibilität

• Maskieren gegen das Immunsystem

• oder haben keinen Einfluss

Klinische Relevanz von HBV Mutanten

Mutationen im HBV Genom können assoziiert sein mit:

• schweren Leberentzündungen• fulminanter Hepatitis • Leberzirrhose • HCC (Leberzellkarzinom)• Resistenz gegen eine antivirale Therapie

preC C

TP spacer RT RNaseH

S X

BCPSP1 SP2S-Promoters

Enh I Enh IIXP

preS1preS2

A1762T/G1764AHBeAg neg.

G1896A/C1858TpreC-Stopp (HBeAg neg.)

Schwere Leberentzündung, Resistenz

P120T/D144A/G145R„a“ Determinante

„Escape“ Mutanten

M204V/I (YMDD)Lamivudine Resistenz

L180MLamivudine

Resistenz

K130M/V131Iüberlappt mit

A1762/G1764A

N236TAdefovirResistenz

A181VAdefovirResistenz

Stopp Codontrunkiertes X-Protein

HCC Assoziation

Polymerase ORF

Core/HBS/X ORF

3221

/0

3221

/0

1000

2000

3000

HBV Genom

Häufige Mutationen im HBV Genom

antivirale Resistenz

Fung SK & Lok ASF. Antivir Ther 2004; 9:1013–1026.Locarnini S, et al. Antivir Ther 2004; 9:679–693.

Behandlungsstart

Therapie-resistente Varianten

Therapie-suszeptibles Virus

Natürlich vorkommende Virusvarianten

� Mangelnde Suppression- Inadäquate Potenz des Medikaments- Inadäquate Medikamentenkonzentration- Inadäquate Einnahme (non compliance)- Prä-existierende HBV Resistenzmutanten

Time

HB

V R

eplik

atio

n

Mangelnde Suppression der viralen Replikation fördert die Selektion von resistenten Viren

50% T-C

10% T-C

Nachweis von Hepatitis B Virus Quasi-Spezies (YMDD vs YIDD)

50% YMDD/YIDD

10% YIDD

T

T/G

G

Definition der Therapie-Resistenz

• Genotypische Resistenz: Mutationen im HBV Genom welche

sich aufgrund der antiviralen Therapie entwickeln

• Virologischer Durchbruch: Rückfall der HBV Serum DNA

Spiegel während der antiviralen Therapie

• Klinischer Durchbruch: Virologischer Durchbruch mit erhöhten

ALT Spiegelen oder verschlechterter Histologie

• Phänotypische Resistenz: Verringerte Suszeptibilität (in vitro)

der antiviralen Therapie assoziiert mit genotypischer Resistenz

• Kreuzresistenz: Virusmutanten, die durch eine Substanz

selektioniert werden und auch mit einer Resistenz gegen eine

andere Substanz einhergehen

Cornberg, Wedemeyer et al., Z. Gastroenterologie 2007; 45:525-57

Definition der Therapie-ResistenzLeitlinien der „Arbeitsgemeinschaft Wissenschaftlicher

Medizinischer Fachgesellschaften“Cornberg, Wedemeyer et al., Z. Gastroenterologie 2007; 45:525-57

� Klinisch ausreichendes Ansprechen: nach 6 Monaten

antiviraler Therapie ist die Viruslast unter < 200 HBV-IE/ml

gesunken

� Primär virologisches non/bad-response: nach 3 Monaten

antiviraler Therapie kein Abfall der Viruslast um mindestens

>1 log

� Sekundäre Resistenz: nach initialem Ansprechen auf eine

antivirale Behandlung konsekutiver Anstieg der Viruslast um

mehr als >1 log über dem Detektionslimit

Res

iste

nz

(%)

70%

0

20

40

60

80

Jahr 1 Jahre 2 Jahre 3 Jahre 4

Lamivudin1

Adefovir2

29%

Telbivudine4

18%

Jahre 5

Entwicklung einer antiviralen Resistenz unterNukleos(t)id-Analog Behandlung

Entecavir<1% nach 1 Jahr bei

unbehandelten Pat.

20% nach 2 Jahren3 bei Lam-vorbehandelen Pat.

1Lai et al. Clin Infect Dis. 2003;36:687-96 2Hadziyannis et al. Gastroenterology 2006;131:1743–1751, 3Sherman et al. Hepatology 20084Lai et al. AASLD 20065Heathcote et al. AASLD 2007, Marcellin et al. AASLD 2007

Tenofovir5

0% after 72 Wochen

YMDD

rtM204

Fragment1

23

4

HBV Polymerase

Schema PCR/Sequenzierungsmethode zur Mutationsanalysevon Hepatitis B Virus Resistenzmutationen

1 1032 nt

Molekulargenetische Analyse der HBV Polymerase von HBV-infizierten Patienten bei Adefovir Behandlung

YMDD rtN236TrtA181V

A

B C D E

BF/G Polymorphe Bereiche

rtT184GETV

rtA194TTDF?

rtS202IETV

rtM250VETV

rtM204V/ILAM/LdT/ETV

rtL180MLAM/ETV

rtC256SLAM

0

10

20

30

40

50

60

7 21

38

53

80

10

6

11

5

12

0

12

4

12

7

12

9

13

1

13

5

14

5

15

3

16

3

17

3

18

1

18

7

20

7

21

5

22

1

23

1

23

8

25

3

25

7

26

0

26

6

26

8

27

1

29

0

33

6

Häufigkeitsverteilung von HBV Polymerase-Mutationenunter Adefovir Therapie

aa Substitutionen

An

zah

l Pat

ien

ten

n=276 Patienten

Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A

Terminal Protein Spacer RNaseH

75 91 163

189

200

210

230

241

247

257

37 47

A B C D EF

1 344

1 153

Reverse Transcriptase

1 179/1 169 G

0

50

100

150

200

250

I16T

L91I

S106T

L115V

L122F

N124H

H126R

D131N

L180M

A181V

I187L

rtV19

1IM20

4IM20

4VL21

7RV23

3IN23

6TN24

8HC25

6W

260L

E263D

I266R

Q267M

/H

n=276 aa Substitution

nu

mb

er o

f p

atie

nts

FG A B C D E

Polymorphe Bereiche

Polymorphe Bereiche der HBV RT-Domäne

Qi et al. 2004 AASLD

Polymorphe Stellen (>1% Sequenz Variation) in der HBV RT-Domäne

59 (17%) der 344 HBV-RT Reste zeigen >1% Sequenzvariation bei HBeAg+ Patienten

Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

control 1 µM 10 µM 20 µM

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

control 1µM ADV 5µM ADV 10µM ADV0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

control 1 µM ADV 10 µM ADV 20 µM ADV

rtN236T

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

control 1 µM ADV 10 µM ADV 20 µM ADV

rtV233I

Wildtyp

rtN248H

Suszeptibilität von HBV Polymerase Mutanten gegenüber Adefovir Dipivoxil in funktionellen phänotypischen Assays

EC50=3 µM

EC50= >20 µM

EC50= 12 µMEC50= 16 µM

Bock et al. Hepatology 2007; 46:658A

Yang H. et al. Hepatology 2003;38:705A; Lai CL et al Hepatology 2003;38:262A

V173L L180M A181V/S A184G S202I M204I M204V N236T M250V

LAMLamivudine

ETV*Entecavir

LdTTelbivudine

FTCEmtricitabine

ADVAdefovir

YMDD

Kreuzresistenz bei HBV Therapeutika

* ETV Resistenz

benötigt YVDD

Mutation

TdFtenofovir

Terminal Protein Spacer RNaseH

75 91 163

189

200

210

230

241

247

257

37 47

A B C D EF

1 344

1 153

Reverse Transcriptase

1 179/1 169 G

Selektion kompensatorischer Mutationen unter sequentieller antiviraler Behandlung

Selektion kompensatorischer Mutationen unter antiviraler Behandlung: Patienten

Patient 1

Patient 3

Patient 2

preC CpreS1preS2 S

X

polymeraseTP spacer RNaseHRT

B-domainC-domainpre

CA

TG

=1

EcoR

11407

3221

S-ORFP-ORF

NH2 -

NH2 -

- COOH

B-domain C-domain

catalytic site

145

476

472

149

118

528 5

52

HBV wt adw 2

560TGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTC

NQYGTMQNLHDSCSRQLYVSLMLLYKTYGWKLHLYSHPIVLGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAICSVVRRAFPHCLAFSYMDDVVLGAK- COOHa-determinant

1921 T

476N

1996 G

145R

2076 L

528M

2148 M

552V

2150 M

552I

sG145R

sP120T

L180M (W171W)

M204V (I195M)

M204I (I195T)

sG145R/M552I

sP120T/M204I

L180M/M204V

sG145R/L528M/M204V

sP120T/L180M/M204V

R

R

R

T

T

T

M

M

MM

V

V

VV

III

Muster von HBV Polymerase Mutanten

120

pHBV1.2

HBIg

FCV

LAM

HBIgP120T

LamL180M

LamM204V

HBIgG145R

Sensitivität von Polymerase Mutantengegenüber Lamivudine

- Keine Sensitivität- erhöhte Replikation

unter LAM Behandlung

con

tro

l

wt

pH

BV

1.2

P12

0T

M20

4V

L18

0M/M

204V

G14

5R/L

180M

/M20

4V

P12

0T/L

180M

/M20

4V

HB

V M

arke

r

- + - + - + - + - + - + - +

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

HBV Progeny DNA

1.0 µM Lamivudine

3.2 kb

Bock et al. Gastroenterology 2002

+ Lam + Lam + Lam

0

50

100

150

200

250

cont

rol

wt-HBV

wt-HBV

+ Lam

P120T

/L18

0M/M

204V

P120T

/L18

0M/M

204V

+ L

amG14

5R/L

180M/M

204V

P120T

/L18

0M/M

204V

+ L

am

Rational für eine De Novo Kombinations-Therapie

Drug A

Drug B

Wildtyp

Drug B ResistenzMutante

Drug A ResistenzMutante

→→ KombinationKombination vonvon TherapeutikaTherapeutika ohneohne KreuzresistenzKreuzresistenz

wt

Geringes Risiko zurGeringes Risiko zurSelektionSelektion vonvon MDRMDR

Clavel et al NEJM 2004;350:1023-35 ; Zoulim Antiviral Res 2004;64: 1-15

Wege zur Resistenzvermeidung

Maximieren der antiviralen Aktivität

– Wahl von Präparaten mit hoher antiviraler Potenz

– Vorgegebene Dosierung einhalten

– Leichte Einnahme, hohe Resorption (Nahrungsunabhängig)

– Für maximale Therapie-Adhärenz sorgen (Compliance)

Maximieren der Resistenzbarriere

– Vermeidung sequentieller Monotherapie

– Auswahl von Nukleos(t)idanaloga mit einer hohen Resistenz-

barriere

– Kombination komplementärer Resistenzprofile

Cornberg et al. Upgrade der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011, Z Gastroenterol 2007;45:1-50

Resistenz: Zusammenfassung der Leitlinie 2007

• Die neuen Leitlinien unterstreichen die Wichtigkeit der

Resistenzvermeidung und adäquatem Resistenzmanagement

- Bei >1 Mio Kop/ml Einsatz hochpotenter Substanzen

- HBV-DNA Monitoring alle 3 Monate, Intensivierung der Therapie bei

unvollständigem Ansprechen nach 6-12 Monaten

- Rasche Intervention nach sekundärem Therapieversagen (>1 log

Viruslastanstieg)

- Vermeidung sequenzieller Monotherapie

- „Add-on“ Therapie mit komplementärem Resistenzprofil

Cornberg et al. Upgrade der Leitlinie, AWMF-Register-Nr.: 021/011, Z Gastroenterol 2007;45:1-50

Robert Koch-Institut, FG15:Dr. Marina HöhneDr. Sabine DiedrichDr. Meike ChevillotteDr. Sandra NiendorfDr. Andreas Mas MarquesFr. Tina DittmannFr. Daniela GuttFr. Roswitha LorenzFr. Ute ObstFr. Christin KellnerFr. Kathrin StanossekFr. Jenny ThieleFr. Sonja Zimmermann

Royal Melbourne Hospital, AustraliaProf. Dr. Joseph TorresiProf. Dr. Stephen Locarnini

University of TübingenDeptartment of Molecular PathologyProf. Dr. Reinhard KandolfDr. Bernd KöberleinDr. Anja DüchtingDr. Stefanie SimonovicDipl. Biol. Agnes BryniokDipl. Biol. Friedericke Uttacand. med. Christine Walkercand. med. Martin Wolfcand. med. Christian WollboldtRosa MamatoHeike Kaiser

German Cancer Research Center, DKFZ, HeidelbergProf. Dr. Hanswalter ZentgrafProf. Dr. Frank Rösl

Duke University, Durham, USAProf. Dr. Hans Tillmann

Tran Hung Dao Hospital, Hanoi, Viet NamProf. Dr. Nguyen T. BinhDr. Song Le HuuDr. Nguyen Toan

Acknowledgments

Albert Schweitzer Hospital, Lambarene, GabonProf. Dr. Peter Kremsner

Medical School of HannoverProf. Dr. Heiner WedemeyerProf. Dr. Michael Manns

Charitè UniversitätsmedizinBerlin, Bemjamin Franklin, VirchowProf. Dr. Thomas BergProf. Dr. Carsten Tschöpe

www.a-birken.de/welt.gif