Restriktion und Gentechnik - · PDF fileEinteilung 1.) Restriktion - Restriktionsenzyme -...

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  • Restriktion und Gentechnik

  • Einteilung

    1.) Restriktion- Restriktionsenzyme

    - Southern Blotting

    2.)Gentechnik- sticky ends

    - blunt ends

  • Restriktion

    Grundwerkzeuge der Gentechnik- Restriktionsenzymanalyse

    - Blottingtechniken

    - DNA-Sequenzierung

    - Polymerasenkettenreaktion (PCR)

  • Restriktionsenzyme

    - Restriktionsenzyme = Restriktionsendonucleasen

    - przise molekulare Skalpelle

    sie schneiden die DNA-Doppelhelix an spezifischen Stellen

  • Nutzen von Restriktionsenzymen

    - Chromosomenstruckturanalyse

    - Sequenzierung von DNA-Moleklen

    - Isolierung von Genen

    - Erzeugung neuer DNA-Molekle

    (anschlieende Klonierung)

  • Wo findet man Restriktionsenzyme?

    - Sie sind in vielen Prokaryonten vorhanden

    - Ihre Aufgabe ist das spalten fremder DNA

    (eigene DNA ist durch Methylierung der Erkennungsstellen geschtzt)

  • Funktionsweise von Restriktionsenzymen

    - Erkennen spezifischer Sequenzen aus 4 bis 8 bp

    - Spaltung der Phosphodiesterbindung bei jedem Strang

    - Sequenzen sind hufig Palindrome

    (Madam, Im Adam)

  • Trennung von Restriktionsfragmenten

    Trennung durch Gelelektrophorese

    - Laufstrecke ist umgkehrt proportional zum log der Basenpaare

    - Trennung hnlicher DNA-Molekle

    - Polyacrylamidgele (bis 1000bp), Agarosegele

  • Fingerprint eines DNA-Molekls

    Durch die Nutzung mehrerer Restriktionsenzyme knnen ganze Chromosomen in kleine Fragmente gespalten werden und anschlieend kartiert werden

  • Sichtbar machen von Banden

    - Autoradiographie bei radioaktiv markierter DNA

    - Anfrben des Gels mit Ethidiumbromid

    (DNA fluoresziert orange)

  • Southern Blotting

    - DNA Blotting

    - Methode, um ein bestimmtes Fragment unter vielen aufzuspren

    - analoges Verfahren mit RNA-Moleklen nennt sich Northern Blotting

  • Southern Blotting 2

    - Restriktionsfragmente mittels Gelelektrophorese trennen

    - denaturieren der DNA zu Einzelstrngen

    - berfhren auf Nitrocellulosemembran

    - mittels 32P-markierter Sonde komplementre Sequenzen hybridisieren

    - gesuchtes Fragment ist autoradiographisch sichtbar

  • RFLP-Analyse

    Restriktionsfragmentlngen-Polymorphismus

    - Vererbung ausgewhlter Genen kann verfolgt werden

    - Mutationen an Restriktionsstellen verndern die Lnge der Restriktionsfragmente

    -Nachweis von Erbkrankheiten (Sichelzellanmie, cystische Fibrose)

  • Gentechnik

    - Herstellung neuer Kombinationen nicht verwandter Gene im Labor

    - dauerhafte Vernderung der genetischen Ausstattung eines Wirtes

  • Klonieren

    - Bedeutet: in hoher Anzahl vervielfltigen

    -Einbringen von Genen in passende Zellen, wo sie vom DNA-Syntheseapparat des Wirtes repliziert werden

  • Neue DNA-Molekle im Labor

    - Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden

    - Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden

    - DNA-Molekl mit komplementren Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA-Ligase verknpfen

  • Vektoren

    - Vektoren haben die Eigenschaft sich in einem passenden Wirt autonom zu replizieren.

    - Besonders geeignet sind Plasmide und der Bakteriophage

  • Neue DNA-Molekle im Labor

    - Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden

    - Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden

    - DNA-Molekl mit komplementren Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA-Ligase verknpfen

  • DNA-FragmentVektor

  • Kohsive Enden (sticky ends)

    - Durch versetzte Schnittstellen entstehen zueinander komplementre Einzelstrnge mit spezifischer Affinitt zueinander

    - Man erhlt die gleichen kohsiven Enden durch Verwendung gleicher Restriktionsenzyme bei Vektor und DNA-Fragment

  • DNA-FragmentVektor

  • Glatte Enden (blunt ends)

    - Auf diese Weise lassen sich an nahezu jedes

    DNA-Molekl kohsive Enden anfgen

    - Einen DNA-Linker (chemische synthetisiertes Verbindungsstck) kovalent mit den Enden des DNA-Fragmentes verknpfen

    - kohsive Enden durch Einsatz geeigneter Restriktionsenzyme