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Restriktion und Gentechnik

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Restriktion und Gentechnik

Einteilung

1.) Restriktion- Restriktionsenzyme

- Southern Blotting

2.)Gentechnik- sticky ends

- blunt ends

Restriktion

Grundwerkzeuge der Gentechnik- Restriktionsenzymanalyse

- Blottingtechniken

- DNA-Sequenzierung

- Polymerasenkettenreaktion (PCR)

Restriktionsenzyme

- Restriktionsenzyme = Restriktionsendonucleasen

- präzise molekulare „Skalpelle“

sie schneiden die DNA-Doppelhelix an spezifischen Stellen

Nutzen von Restriktionsenzymen

- Chromosomenstruckturanalyse

- Sequenzierung von DNA-Molekülen

- Isolierung von Genen

- Erzeugung neuer DNA-Moleküle

(anschließende Klonierung)

Wo findet man Restriktionsenzyme?

- Sie sind in vielen Prokaryonten vorhanden

- Ihre Aufgabe ist das spalten fremder DNA

(eigene DNA ist durch Methylierung der Erkennungsstellen geschützt)

Funktionsweise von Restriktionsenzymen

- Erkennen spezifischer Sequenzen aus 4 bis 8 bp

- Spaltung der Phosphodiesterbindung bei jedem Strang

- Sequenzen sind häufig Palindrome

(Madam, I‘m Adam)

Trennung von Restriktionsfragmenten

Trennung durch Gelelektrophorese

- Laufstrecke ist umgkehrt proportional zum log der Basenpaare

- Trennung ähnlicher DNA-Moleküle

- Polyacrylamidgele (bis 1000bp), Agarosegele

Fingerprint eines DNA-Moleküls

Durch die Nutzung mehrerer Restriktionsenzyme können ganze Chromosomen in kleine Fragmente gespalten werden und anschließend kartiert werden

Sichtbar machen von Banden

- Autoradiographie bei radioaktiv markierter DNA

- Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid

(DNA fluoresziert orange)

Southern Blotting

- DNA Blotting

- Methode, um ein bestimmtes Fragment unter vielen aufzuspüren

- analoges Verfahren mit RNA-Molekülen nennt sich Northern Blotting

Southern Blotting 2

- Restriktionsfragmente mittels Gelelektrophorese trennen

- denaturieren der DNA zu Einzelsträngen

- überführen auf Nitrocellulosemembran

- mittels 32P-markierter Sonde komplementäre Sequenzen hybridisieren

- gesuchtes Fragment ist autoradiographisch sichtbar

RFLP-Analyse

Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus

- Vererbung ausgewählter Genen kann verfolgt werden

- Mutationen an Restriktionsstellen verändern die Länge der Restriktionsfragmente

-Nachweis von Erbkrankheiten (Sichelzellanämie, cystische Fibrose)

Gentechnik

- Herstellung neuer Kombinationen nicht verwandter Gene im Labor

- dauerhafte Veränderung der genetischen Ausstattung eines Wirtes

Klonieren

- Bedeutet: in hoher Anzahl vervielfältigen

-Einbringen von Genen in passende Zellen, wo sie vom DNA-Syntheseapparat des Wirtes repliziert werden

Neue DNA-Moleküle im Labor

- Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden

- Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden

- DNA-Molekül mit komplementären Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA-Ligase verknüpfen

Vektoren

- Vektoren haben die Eigenschaft sich in einem passenden Wirt autonom zu replizieren.

- Besonders geeignet sind Plasmide und der Bakteriophage λ

Neue DNA-Moleküle im Labor

- Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden

- Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden

- DNA-Molekül mit komplementären Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA-Ligase verknüpfen

DNA-FragmentVektor

Kohäsive Enden (sticky ends)

- Durch versetzte Schnittstellen entstehen zueinander komplementäre Einzelstränge mit spezifischer Affinität zueinander

- Man erhält die gleichen kohäsiven Enden durch Verwendung gleicher Restriktionsenzyme bei Vektor und DNA-Fragment

DNA-FragmentVektor

Glatte Enden (blunt ends)

- Auf diese Weise lassen sich an nahezu jedes

DNA-Molekül kohäsive Enden anfügen

- Einen DNA-Linker (chemische synthetisiertes Verbindungsstück) kovalent mit den Enden des DNA-Fragmentes verknüpfen

- kohäsive Enden durch Einsatz geeigneter Restriktionsenzyme