Restriktion und Gentechnik

Einteilung

1.) Restriktion- Restriktionsenzyme

- Southern Blotting

2.)Gentechnik- sticky ends

- blunt ends

Restriktion

Grundwerkzeuge der Gentechnik- Restriktionsenzymanalyse

- Blottingtechniken

- DNA-Sequenzierung

- Polymerasenkettenreaktion (PCR)

Restriktionsenzyme

- Restriktionsenzyme = Restriktionsendonucleasen

- przise molekulare Skalpelle

sie schneiden die DNA-Doppelhelix an spezifischen Stellen

Nutzen von Restriktionsenzymen

- Chromosomenstruckturanalyse

- Sequenzierung von DNA-Moleklen

- Isolierung von Genen

- Erzeugung neuer DNA-Molekle

(anschlieende Klonierung)

Wo findet man Restriktionsenzyme?

- Sie sind in vielen Prokaryonten vorhanden

- Ihre Aufgabe ist das spalten fremder DNA

(eigene DNA ist durch Methylierung der Erkennungsstellen geschtzt)

Funktionsweise von Restriktionsenzymen

- Erkennen spezifischer Sequenzen aus 4 bis 8 bp

- Spaltung der Phosphodiesterbindung bei jedem Strang

- Sequenzen sind hufig Palindrome

(Madam, Im Adam)

Trennung von Restriktionsfragmenten

Trennung durch Gelelektrophorese

- Laufstrecke ist umgkehrt proportional zum log der Basenpaare

- Trennung hnlicher DNA-Molekle

- Polyacrylamidgele (bis 1000bp), Agarosegele

Fingerprint eines DNA-Molekls

Durch die Nutzung mehrerer Restriktionsenzyme knnen ganze Chromosomen in kleine Fragmente gespalten werden und anschlieend kartiert werden

Sichtbar machen von Banden

- Autoradiographie bei radioaktiv markierter DNA

- Anfrben des Gels mit Ethidiumbromid

(DNA fluoresziert orange)

Southern Blotting

- DNA Blotting

- Methode, um ein bestimmtes Fragment unter vielen aufzuspren

- analoges Verfahren mit RNA-Moleklen nennt sich Northern Blotting

Southern Blotting 2

- Restriktionsfragmente mittels Gelelektrophorese trennen

- denaturieren der DNA zu Einzelstrngen

- berfhren auf Nitrocellulosemembran

- mittels 32P-markierter Sonde komplementre Sequenzen hybridisieren

- gesuchtes Fragment ist autoradiographisch sichtbar

RFLP-Analyse

Restriktionsfragmentlngen-Polymorphismus

- Vererbung ausgewhlter Genen kann verfolgt werden

- Mutationen an Restriktionsstellen verndern die Lnge der Restriktionsfragmente

-Nachweis von Erbkrankheiten (Sichelzellanmie, cystische Fibrose)

Gentechnik

- Herstellung neuer Kombinationen nicht verwandter Gene im Labor

- dauerhafte Vernderung der genetischen Ausstattung eines Wirtes

Klonieren

- Bedeutet: in hoher Anzahl vervielfltigen

-Einbringen von Genen in passende Zellen, wo sie vom DNA-Syntheseapparat des Wirtes repliziert werden

Neue DNA-Molekle im Labor

- Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden

- Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden

- DNA-Molekl mit komplementren Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA-Ligase verknpfen

Vektoren

- Vektoren haben die Eigenschaft sich in einem passenden Wirt autonom zu replizieren.

- Besonders geeignet sind Plasmide und der Bakteriophage

Neue DNA-Molekle im Labor

- Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden

- Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden

- DNA-Molekl mit komplementren Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA-Ligase verknpfen

DNA-FragmentVektor

Kohsive Enden (sticky ends)

- Durch versetzte Schnittstellen entstehen zueinander komplementre Einzelstrnge mit spezifischer Affinitt zueinander

- Man erhlt die gleichen kohsiven Enden durch Verwendung gleicher Restriktionsenzyme bei Vektor und DNA-Fragment

DNA-FragmentVektor

Glatte Enden (blunt ends)

- Auf diese Weise lassen sich an nahezu jedes

DNA-Molekl kohsive Enden anfgen

- Einen DNA-Linker (chemische synthetisiertes Verbindungsstck) kovalent mit den Enden des DNA-Fragmentes verknpfen

- kohsive Enden durch Einsatz geeigneter Restriktionsenzyme