[REVIEW] PRODUKSI PROTEIN HBsAg MENGGUNAKAN …

JSTFI

Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology

Vol.VI, No.1, Januari 2017

37

[REVIEW] PRODUKSI PROTEIN HBsAg MENGGUNAKAN SISTEM EKSPRESI

Pichia pastoris UNTUK PENGEMBANGAN VAKSIN HEPATITIS B

Patricia Gita Naully

Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Jenderal Achmad Yani Cimahi

_________________________________________________________________________

Abstrak

Hepatitis B adalah peradangan hati yang disebabkan oleh Virus Hepatitis B (VHB). Penyakit ini

sudah menjadi masalah dunia. Pengobatan penyakit hepatitis B tergolong mahal dan tidak selalu

tersedia di negara berkembang. Oleh sebab itu, penyakit ini perlu dicegah menggunakan vaksin

hepatitis B yang mengandung protein permukaan VHB (HBsAg). Vaksin tersebut sudah lama

ditemukan, namun hingga saat ini berbagai penelitian masih dilakukan untuk menemukan

sistem ekspresi yang paling efisien dalam memproduksi protein HBsAg. Sistem ekspresi Pichia

pastoris memiliki banyak keunggulan jika dibandingkan dengan sistem ekspresi yang lain. P.

pastoris menyediakan banyak pilihan promoter yang kuat dan dapat diregulasi. Sudah banyak

strain dan vektor ekspresi yang dikembangkan untuk mempermudah proses produksi protein

rekombinan di P. pastoris. Selain itu, beberapa hasil penelitian membuktikan bahwa P. pastoris

mampu memproduksi protein HBsAg dengan struktur protein yang sesuai. Sistem ekspresi P.

pastoris pun mudah dimanipulasi sehingga tersedia berbagai macam cara untuk meningkatkan

produksi protein HBsAg. Oleh karena itu, sistem ekspresi P. pastoris dapat dijadikan alternatif

untuk memproduksi protein HBsAg.

Kata Kunci: HBsAg, Ekspresi, Pichia pastoris, Vaksin, Hepatitis B

Abstract

Hepatitis is an inflammation of the liver that is caused by hepatitis B virus (HBV) infection.This

disease has become a worldwide problem. Treatment for hepatitis B is relatively expensive and

not always available in developing countries. Therefore, this disease needs to be prevented

using a vaccine containing hepatitis B surface antigen (HBsAg). Such vaccine has long been

found, but the most suitable expression system to produce HBsAg protein is still being

developed. Pichia pastoris is one choice of expression system which has several advantages,

compared to other expression systems. P. pastoris provides many strong promotors that can be

regulated. Numerous strains and expression vectors have been developed to simplify the process

of recombinant proteins production using P. pastoris. In addition, some studies show that P.

pastoris is capable of producing HBsAg protein with an appropriate protein structure. P.

pastoris expression system is capable to be manipulated in various ways to increase the

production of HbsAg protein. It can be concluded that the P. pastoris expression system can be

used as an alternative to producing protein of HBsAg.

Key words: HBsAg, Expression, Pichia pastoris, Vaccine, Hepatitis B

________________________________________________________________________

JSTFI



36

PENDAHULUAN

Penyakit hepatitis B adalah

peradangan hati yang disebabkan oleh

Virus Hepatitis B (VHB). Penyakit tersebut

telah tersebar luas di dunia. Sebanyak 2

miliar manusia diperkirakan telah terinfeksi

oleh virus tersebut, 350 juta diantaranya

telah berkembang menjadi infeksi kronis

yang menghasilkan 600.000 kematian

setiap tahunnya (WHO, 2012). Data

statistik menunjukkan bahwa penyakit

hepatitis B masuk ke dalam 10 besar

penyakit yang menyebabkan kematian,

bahkan 80% kanker hati di dunia

disebabkan oleh penyakit hepatitis B

(WHO, 2009). VHB dapat ditularkan

melalui pemaparan mukosa terhadap darah

atau cairan tubuh lain yang terinfeksi

termasuk cairan semen dan vaginal. Infeksi

VHB kronis dapat menyebabkan kematian

prematur yang disebabkan penyakit terkait

VHB seperti sirosis hati, dan kanker

hepatoseluler (Hilman et al., 2002).

Hepatitis B dapat diobati dengan

pemberian interferon dan senyawa antiviral,

namun pengobatan tersebut membutuhkan

biaya besar dan tidak selalu tersedia di

negara berkembang. Selain itu, lamanya

waktu pengobatan dapat menyebabkan

virus menjadi resisten terhadap berbagai

obat yang digunakan (Shu et al., 1987).

Oleh sebab itu, penyakit hepatitis B perlu

dicegah dengan pemberian vaksin (WHO,

2012). Vaksin hepatitis B mengandung

protein permukaan VHB (HBsAg). HBsAg

adalah subpartikel yang disekresikan oleh

sel inang selama proses infeksi

berlangsung. Adanya HBsAg yang

berbentuk Virus Like Particle (VLP) di

dalam darah dapat menginduksi

pembentukan antibodi untuk mengeliminasi

VHB (Lunsdorf et al., 2011).

Vaksin hepatitis B sudah ditemukan

sejak tahun 1981 (Moticka, 2015). Sampai

saat ini, vaksin tersebut sudah mengalami

banyak perkembangan terkait dengan cara

produksi protein HBsAg. Oleh karena itu,

artikel ini bertujuan untuk mengulas tiga

poin bahasan yang meliputi perkembangan

vaksin hepatitis B, sistem ekspresi P.

pastoris, dan ekspresi gen pengkode protein

HBsAg pada P. pastoris.

Perkembangan Vaksin Hepatitis B

Vaksin hepatitis B pertama kali

diproduksi dengan cara mengisolasi HBsAg

dari plasma darah karier VHB. Cara ini

hanya bertahan selama sepuluh tahun

karena memiliki banyak kelemahan, yaitu

adanya potensi kontaminasi, keterbatasan

plasma karier VHB, dibutuhkan prosedur

purifikasi serta inaktivasi agar vaksin yang

dihasikan terbebas dari virus dan agen lain

yang mungkin terdapat di dalam plasma

(Lunsdorf et al., 2011). Hal tersebut

menyebabkan biaya produksi HBsAg cukup

tinggi sehingga harga plasma derived

vaccine kurang terjangkau terutama untuk

negara berkembang yang pada umumnya

memiliki tingkat prevalensi tinggi terhadap

penyebaran VHB (Steephen, 1988).

JSTFI



37

Selanjutnya HBsAg diproduksi

dengan cara yang lebih aman, yaitu dengan

teknologi DNA rekombinan. Cara ini masih

bertahan sampai sekarang walaupun terjadi

beberapa kali perubahan sistem ekspresi.

Sistem ekspresi yang pertama kali

digunakan untuk memproduksi HBsAg

rekombinan adalah sel eukariot. Ekspresi

HBsAg di sel China Hamster Ovary (CHO)

telah berhasil dilakukan, namun jumlah

HBsAg yang diproduksi sangat sedikit.

Selain itu, CHO membutuhkan perlakuan

yang cukup rumit sehingga tidak efektif

digunakan dalam skala industri (Porro et

al., 2005; Liu et al., 2009).

Oleh karena itu pemilihan sistem

ekspresi beralih ke bakteri Escherichia coli.

Sistem ekspresi E. coli menawarkan sistem

yang sederhana dan mudah dimanipulasi,

namun ternyata tidak berdampak positif

pada produksi HBsAg. Penelitian yang

dilakukan oleh Fujisawa et al (1983)

menunjukkan bahwa E. coli yang membawa

gen pengkode HBsAg mengalami inhibisi

pertumbuhan dan memproduksi antigen

dengan level yang sangat rendah. Hasil

deteksi secara langsung menggunakan

immunoassay menunjukkan bahwa HBsAg

yang diproduksi berinteraksi lemah dengan

anti-HBsAg. Hal ini terjadi karena HBsAg

yang diproduksi E.coli tidak mengalami

glikosilasi (Mackay et al, 1981).

Mikroorganisme prokariot seperti E.coli

tidak menyediakan proses modifikasi

protein paska translasi seperti yang terjadi

pada sel eukariot.

Untuk mengatasi permasalahan ini,

industri mulai menggunakan sistem

ekspresi Saccharomyces cerevisiae.

Ekspresi protein HBsAg di S. cerevisiae

telah berhasil dilakukan, namun masih

terdapat beberapa kekurangan. Tingkat

ekspresi HBsAg di S. cerevisiae cukup

rendah (Balamurugan et al., 2007) dan

HBsAg yang diproduksi mengalami

hiperglikosilasi sehingga menyebabkan

perbedaan imunogenisitas (Grinna &

Tschopp, 1989). Selain itu, dalam penelitian

Yang et al (2000), dibuktikan bahwa

plasmid yang digunakan pada sistem

ekspresi S. cerevisiae tidak cukup stabil

sehingga sulit untuk memperoleh kultur

dengan densitas yang besar dan

membutuhkan biaya yang mahal dalam

proses produksi skala besar.

Sistem Ekspresi Pichia pastoris

Sistem ekspresi P. pastoris dapat

digunakan sebagai alternatif untuk

menghasilkan protein rekombinan. P.

pastoris memiliki beberapa keunggulan,

yaitu tingkat ekspresi protein tinggi dengan

media pertumbuhan yang relatif murah

(Balamurugan et al., 2007), mudah untuk

diskalakembangkan (Cereghino & Cregg,

2000), mampu melakukan modifikasi

protein paska translasi (Vassileva et al.,

2001;), dan menyediakan promotor yang

sangat kuat sehingga memiliki tingkat

ekspresi tinggi baik secara ekstraseluler

maupun intraseluler (Awan, 2008). Protein

rekombinan yang diproduksi oleh P.

JSTFI



38

pastoris tidak mengalami hiperglikosilasi

seperti pada S. cerevisiae. P. pastoris hanya

menambahkan sekitar 8-14 residu manosa

per sisi rantai sedangkan S. cerevisiae

menambahkan 50-150 redisu manosa

(Balamurugan et al., 2007).

1. Karakteristik Umum Pichia pastoris

P. pastoris adalah ragi metilotropik

yang dapat menggunakan metanol sebagai

sumber karbon tunggal. Metabolisme

metanol pada P. pastoris diawali dengan

proses oksidasi metanol oleh enzim alcohol

oksidase (AOX) menjadi formaldehid dan

hidrogen peroksida. Menurut Yurimoto et

al (2011), metabolisme metanol diregulasi

melalui dua cara yaitu represi dan aktivasi

gen spesifik metanol. Proses represi terjadi

ketika P. pastoris tumbuh pada medium

yang mengandung glukosa dan mengalami

aktivasi ketika tumbuh pada medium yang

mengandung metanol.

Berdasarkan kemampuan

menggunakan metanol dan keberadaan gen

AOX1 dan AOX2 pada kromosom, fenotip

P. pastoris terbagi menjadi tiga, yaitu

methanol utilization plus (Mut+), methanol

utilization slow (Muts), dan methanol

utilization minus (Mut-) (Cereghino &

Cregg, 2000). P. pastoris Mut+ dapat

tumbuh dengan laju tinggi pada medium

yang mengandung metanol karena masih

memiliki gen AOX1 dan AOX2. P. pastoris

Mut-

tidak memiliki kedua gen AOX

sehingga tidak dapat tumbuh pada medium

yang mengandung metanol. P. pastoris

Muts masih memiliki salah satu gen AOX

sehingga laju pertumbuhan pada medium

yang mengandung metanol lebih rendah

dibandingkan dengan kelompok Mut+.

2. Strain dan Promoter

P. pastoris memiliki beberapa jenis

strain seperti pada tabel 1. Setiap strain

memiliki karakteristik yang berbeda. Strain

P. pastoris yang umum digunakan untuk

produksi protein rekombinan adalah GS115

dan KM71. Kedua strain ini telah

mengalami mutasi pada gen histidinol

dehidrogenase (his4) yang bertanggung

jawab untuk mensintesis asam amino

histidin (Balamurugan et al., 2007).

Strain Mutasi Fenotip Referensi

GS115 Delesi gen his4 Mut+ dan His

- Balamurugan et

al., 2007

KM71 Delesi gen AOX1 dan hi4 Muts dan His

- Romanos, 1995

X-33 Tidak ada Mut+ dan His

+ Araya et al., 2012

MC100-3 Delesai gen AOX1 dan

AOX2

Mut- Cereghino &

Cregg, 2000

SMD1163, SMD

1165, SMD 1168

Delesi gen pep4 Defisiensi protease Higgins & Cregg,

1998

Tabel 1. Daftar Strain P. pastoris

JSTFI



39

P. pastoris memiliki beberapa

promoter pada sistem ekspresinya seperti

terangkum dalam tabel 2. Promoter AOX1

yang kuat, dapat diregulasi dan diinduksi

oleh metanol. Promoter GAP memiliki

tingkat ekspresi yang tinggi pada medium

yang mengandung gliserol, glukosa, dan

metanol, namun promoter ini tidak dapat

direpresi (Jahic, 2006). Promoter FLD1

dapat diinduksi dengan metanol atau

metilamin pada medium yang mengandung

glukosa (Higgins & Cregg, 1998). Promoter

PEX8 dapat induksi metanol, namun tingkat

ekspresinya rendah pada medium yang

mengandung glukosa (Cereghino & Cregg,

2000). Promoter YPT1 memiliki tingkat

ekspresi rendah pada medium glukosa,

metanol, atau manitol (Balamurugan et al.,

2007).

3. Vektor Ekspresi dan Strategi

Integrasi

Vektor ekspresi yang umum

digunakan untuk P. pastoris (tabel 3)

adalah vektor yang mengandung urutan

nukleotida AOX1 di ujung 3’, urutan

promotor AOX1 di ujung 5’ dan gen

penanda HIS4 (Li et al., 2007). Sampai saat

ini belum ada vektor episomal stabil yang

berhasil dikembangkan untuk P. pastoris.

Oleh karena itu, DNA sisipan biasanya

diintegrasikan pada kromosom P. pastoris

untuk mendapatkan sistem ekspresi yang

stabil. DNA sisipan dapat diintegrasikan ke

dalam kromosom P. pastoris dengan dua

strategi, yaitu rekombinasi homolog pada

satu sisi (single crossover) dan rekombinasi

homolog pada dua sisi (double crossover

atau disebut juga gene transplacement)

(Burdychova et al., 2002).

Strategi integrasi pertama adalah

single crossover dimana integrasi hanya

akan terjadi pada salah satu ujung 3’ urutan

Promoter Induser Referensi

AOX1 Metanol Awan, 2008

GAP Gliserol, Glukosa, Metanol Jahic, 2006

FLD1 Metanol dan Metilamin Higgins & Cregg, 1998

PEX8 Metanol Cereghino & Cregg, 2000

YPT1 Gliserol, Metanol, Manitol Balamurugan et al., 2007

Nama Plasmid Keunggulan Referensi

pPICZ A, B, C Resisten zeocin Higgins & Cregg, 1998

pPIC9K

dan pPIC3.5K

Multi kaset, Resisten ampisilin dan

kanamisin

Romanos, 1995

pAO815 Multi kaset, Resisten ampisilin Cereghino & Cregg, 2000

Tabel 3. Daftar Vektor dalam Sistem Ekspresi P. pastoris

Tabel 2. Daftar Promoter pada Sistem Ekspresi P. pastoris

JSTFI



40

nukleotida AOX atau pada gen penanda

HIS4 (Balamurugan et al., 2007). Strategi

ini diawali dengan memasukkan DNA

sisipan ke dalam mutan auksotrof (mutan

his4). Fragmen DNA akan menstimulasi

terjadinya rekombinasi homolog pada satu

sisi (single crossover) dengan frekuensi

tinggi (50-80% transforman His+) (Li et al.,

2007). Rekombinasi homolog pada strategi

ini tidak terjadi pada lokasi yang spesifik

sehingga dapat menyebabkan terjadinya

rekombinasi berulang. Peristiwa tersebut

mengakibatkan adanya perbedaan jumlah

salinan gen target pada vektor ekspresi

dengan jumlah salinan gen target yang

terintegrasi pada kromosom (Burdychova et

al., 2002). Walaupun melalui strategi ini

integran multi salinan mudah didapatkan,

banyak integran yang hanya mengandung

sisi homolog tetapi tidak mengandung

keseluruhan kaset ekspresi (promoter, gen

sisipan, dan terminator) sehingga tidak

menghasilkan protein target. Hanya 5-30%

integran yang memiliki fenotip Muts.

Fenotip P. pastoris yang paling baik

digunakan dalam produksi protein

rekombinan adalah Muts karena P. pastoris

tersebut dapat menghasilkan jumlah protein

lebih tinggi dibandingkan dengan sel yang

berfenotip Mut+. Selain itu, sel yang

berfenotip Muts membutuhkan jumlah

metanol yang lebih sedikit dibandingkan

Mut+ sehingga berguna untuk produksi

dalam skala industri (Li et al., 2007).

Strategi yang kedua adalah gene

transplacement. Pada strategi ini, vektor

ekspresi P. pastoris direstriksi sehingga

menghasilkan fragmen DNA yang

mengandung kaset ekspresi dan gen

penanda (HIS4) yang diapit dengan urutan

AOX1 pada ujung 5’ dan 3’ (Li et al.,

2007). Hal ini dapat menstimulasi

terjadinya gene transplacement pada urutan

nukleotida AOX1. Gen AOX1 akan

terdelesi dan digantikan oleh kaset ekspresi

dan gen penanda. Metode ini akan

menghasilkan 10-20% integran yang

bersifat histidin fototrofik (His+). Karena

adanya gangguan terhadap gen AOX1,

integran ini hanya bergantung pada gen

AOX2 yang ditranskripsikan secara lemah

untuk tumbuh pada metanol dan memiliki

fenotip Muts (Romanos, 1995).

4. Penggunaan Metanol sebagai Induser

Penggunaan metanol dengan

konsentrasi tinggi pada tahap induksi tidak

dianjurkan karena dapat menyebabkan

akumulasi produk beracun seperti

formaldehida dan hidrogen peroksida yang

dapat membahayakan kelangsungan hidup

sel dan produktivitas. Beberapa penelitian

melaporkan bahwa metanol dengan

konsentrasi di atas 2% dapat menghambat

pertumbuhan. Oleh karena itu, konsentrasi

metanol yang direkomendasikan adalah 0.4-

0.6% (Higgins & Cregg, 1998).

Ekspresi Gen Pengkode HbsAg Pada

Pichia pastoris

Beberapa penelitian membuktikan

bahwa P. pastoris dapat memproduksi

protein HBsAg. HBsAg tersebut tidak

JSTFI



41

mengalami hiperglikosilasi dan memiliki

struktur protein yang sesuai (Romanos,

1995; Higgins & Cregg, 1998;

Balamurugan et al., 2007). P. pastoris dapat

memproduksi HBsAg dalam jumlah banyak

tanpa membutuhkan waktu yang lama dan

biaya produksi yang tinggi. Gurammkonda

et al, (2009) membuktikan bahwa P.

pastoris mampu memproduksi protein

HBsAg sebanyak 6-7 g/L hanya dalam

waktu 90-160 jam.

Ekspresi gen pengkode HBsAg

diawali dengan pemilihan strain dan

promoter yang sesuai. Strain yang paling

sering digunakan oleh para peneliti dan

terbukti berhasil memproduksi HBsAg

adalah GS115 sedangkan promoter yang

paling kuat dan dapat diregulasi adalah

promoter AOX (Ottone et al., 2007; Liu et

al., 2009; Vassileva et al., 2001; Lunsdof et

al., 2011; Giri-Rachman et al., 2015).

GS115 memiliki fenotip Mut+ namun

proses integrasi gen pengkode HBsAg pada

kromosomnya mengakibatkan P. pastoris

GS115 berubah menjadi Muts. Gen AOX1

pada GS115 digantikan oleh gen pengkode

HBsAg. Dengan menggunakan strain

GS115, peneliti dapat memproduksi HBsAg

dengan cara menginduksi promoter AOX1

dan mendapatkan jumlah biomassa yang

banyak karena P. pastoris GS115 masih

memiliki gen AOX2 yang bertanggung

jawab dalam proses metabolisme metanol.

Pemilihan vektor ekspresi

tergantung pada strain P. pastoris, jenis

seleksi yang dinginkan, dan jumlah salinan

gen yang akan diinsersikan. Jika

menggunakan strain GS115 maka vektor

ekspresi yang dipilih harus mengandung

gen his4 untuk sistem seleksi. Vektor

ekspresi yang mengandung gen his4 dan

sering digunakan dalam penelitian adalah

plasmid pAO815 (Vassileva et al., 2001;

Giri-Rachman et al., 2015) dan pPIC3.5K

(Ottone et al., 2007; Liu et al., 2009).

Kedua plasmid ini dapat digunakan untuk

mengonstruksi multi salinan kaset ekspresi

gen HBsAg. Plasmid pPIC3.5K

menyediakan sistem seleksi yang lebih

banyak dari pAO815, yaitu ampisilin dan

kanamisin (Romanos, 1995).

Ekspresi gen sHBsAg pada P.

pastoris GS115 dapat ditingkatkan dengan

beberapa cara, salah satunya dengan

meningkatkan jumlah salinan kaset ekspresi

yang diintegrasikan di dalam kromosom.

Giri-Rachman et al (2015), berhasil

meningkatkan produksi HBsAg dengan cara

mengintegrasikan empat salinan kaset

ekspresi gen pengkode HBsAg. Bahkan

sebelumnya Vassileva et al (2001), berhasil

mengintegrasi delapan salinan kaset

ekspresi gen pengkode HBsAg pada

kromosom P. pastoris GS115. Pada kedua

penelitian tersebut dibuktikan bahwa

jumlah protein HBsAg yang diproduksi

semakin tinggi seiring meningkatkan

jumlah salinan kaset ekspresi yang

diintegrasikan.

Strategi integrasi yang

direkomendasikan untuk mengekspresikan

multi kaset ekspresi gen HBsAg adalah

JSTFI



42

gene transplacement. Metode tersebut

memungkinkan beberapa salinan gen

terintegrasi pada lokus yang sama sehingga

terjadi pengulangan gen pada kromosom

secara berurutan. Tetapi menurut Wang et

al (1996), metode integrasi gene

transplacement dapat menyebabkan

rekombinasi eksisional sehingga gen asing

dapat terlepas dari kromosom (looped out).

Ketidakstabilan integrasi gen pada

kromosom P. pastoris akibat rekombinasi

eksisional dapat meningkat karena adanya

metanol dalam medium (Zhu et al., 2009).

Di sisi lain, Giri-Rachman et al (2015)

membuktikan bahwa integrasi empat

salinan kaset ekspresi gen pengkode

HBsAg masih bersifat stabil sampai 100

generasi. Hasil penelitian Naully (2015)

juga membuktikan bahwa kestabilan

integrasi multi kaset ekspresi gen HBsAg

pada kromosom P. pastoris bukan hanya

dipengaruhi oleh strategi integrasi dan

keberadaan metanol, namun dipengaruhi

pula oleh jumlah salinan kaset ekspresi gen

pengkode HBsAg, konsentrasi metanol, dan

volume kultur yang digunakan. Tingginya

jumlah salinan kaset ekspresi gen pengkode

HBsAg harus diimbangi dengan rendahnya

konsentrasi metanol dan volume kultur.

Selain dengan meningkatkan

salinan gen, produksi HBsAg pada P.

pastoris dapat ditingkatkan dengan

menggunakan metanol sebagai induser

dengan konsentrasi yang optimum.

Konsentrasi metanol optimum pada setiap

produksi protein rekombinan dapat

berbeda-beda. Untuk produksi beberapa

protein rekombinan, konsentrasi metanol

yang tinggi justru dapat berdampak negatif

bagi P. pastoris (Murray et al., 1989;

Jimenez et al., 1997). Untuk produksi

HBsAg, Naully (2014) dan Giri-Rachman

et al (2015) membuktikan bahwa metanol

dengan konsentrasi 2% justru berdampak

positif bagi tingkat ekspresi HBsAg dan

pertumbuhan P. pastoris. Penelitian

tersebut juga membuktikan bahwa semakin

lama waktu induksi semakin banyak pula

protein HBsAg yang dihasilkan.

Banyak para peneliti

mempertanyakan imunoreaktivitas HBsAg

yang diproduksi oleh P. pastoris. HBsAg

yang digunakan sebagai vaksin hepatitis B

harus berbentuk virus like particle (VLP)

agar bersifat imunoreaktif. Dalam

penelitian Lunsdorf et al (2011),

keberadaan dan lokasi HBsAg selama

produksi diamati dengan mikroskop

elektron dan pelabelan immunogold.

Terdapat perbedaan antara sel P. pastoris

yang tumbuh pada medium gliserol dan sel

yang telah terpapar metanol. Sel yang telah

terpapar metanol membentuk peroksisom

berisi enzim yang berguna dalam jalur

metabolisme metanol dan irregular cloud-

shape area. Penelitian lebih lanjut

menunjukkan bahwa irregular cloud-shape

area tersusun dari lamela berlapis. Hasil

pelabelan immunogold menunjukkan

bahwa HBsAg diproduksi di dalam lamela

berlapis. Ekspresi HBsAg pada P. pastoris

menyebabkan terjadinya translokasi protein

JSTFI



43

ke retikulum endoplasma dan membentuk

perpanjangan retikulum endoplasma.

Perpanjangan retikulum endoplasma ini

yang membentuk lamela berlapis.

Protein HBsAg asli memiliki sinyal

sekresi N-terminal yang mengarahkan

protein pada sel mamalia bertranslokasi ke

retikulum endoplasma tanpa pembelahan

sekuen N-terminal. Sinyal sekresi ini

dikenali juga oleh P. pastoris sehingga

HBsAg mengalami translokasi ke lumen

retikulum endoplasma tetapi tidak diproses

di jalur sekretori (Lunsdorf et al., 2011).

Pada sel mamalia, partikel HBsAg atau

VLP diproses melalui jalur sekretori dan

disekresikan ke lingkungan eksternal. Pada

sel mamalia, VLP terbentuk di retikulum

endoplasma namun prosesnya berlangsung

lambat. Ada beberapa faktor pada mamalia

yang menyebabkan terjadinya disfungsi

jalur sekretori yang mengakibatkan

gagalnya perakitan VLP. Oleh karena itu,

tetap lebih baik mengekspresikan HBsAg di

P. pastoris karena dapat memproduksi

protein HBsAg dengan cepat walaupun

tidak membetuk VLP. VLP dapat dibentuk

secara in vitro melalui proses hilir seperti

purifikasi dan penggabungan lisat dengan

detergen.

SIMPULAN

P. pastoris adalah ragi metilotropik

yang menawarkan sistem ekspresi dengan

banyak keunggulan. P. pastoris sudah

terbukti dapat memproduksi protein HBsAg

dengan struktur protein yang benar. Jumlah

HBsAg yang diproduksi oleh P. pastoris

dapat ditingkatkan dengan cara

menggunakan promoter AOX,

meningkatkan jumlah salinan gen HBsAg

yang diintegrasikan pada kromosom, dan

menggunakan metanol sebagai induser

dengan konsentrasi yang optimum.

DAFTAR PUSTAKA

Awan, A.R. 2008. Expression study of Pre-

S2 REgion of hepatitis B virus in

Pichia pastoris. University of

Punjab. Lahore. P 98-99.

Araya, G.J.M., Feijoo, S.l., Rosa, D.S.F.,

Veiga, C.P., Villa, T.G. 2012.

“Construction of new Pichia

pastoris X-33 strains for production

of lycopene and b-carotene”. Appl

Microbiol Biotechnol. 93(6): 2483-

2492.

Balamurugan, V., Reddy, G.R.,

Suryanarayana, V.V. S. 2007.

“Pichia pastoris: a notable

heterologous expression system for

the production of foreign proteins

vaccines”. Indiana Journal of

Biotechnology. 6:175-186.

Burdychova, R., Ruzicka, V. Bartos, M.

2002. “PCR-based method for

identification of integration events

in the Pichia pastoris genome”.

Biotechniques. 33: 1214-1218.

Cereghino, J.M. dan Cregg, J.M. 2000.

“Heterologous protein expression

in the methylotrophic yeast Pichia

JSTFI



44

pastoris”. FEMS Microbiology

Review. 24: 45-66.

Fujisawa, Y., Ito, Y., Sasada, R., Ono, Y.,

Igarashi, K., Marumoto, R.,

Kikuchi, M., Sugino, Y. 1983.

“Direct expression of hepatitis B

surface antigen gene in E.coli”.

Nucleic Acids Res. 11(11): 3581-

3591.

Giri-Rachman, E.A., Utami, I.W.,

Kusumawardani, S., Retnoningrum,

D.S., Natalia, D., Nurfitriani,

Nadia, G., Naully, P.G., Nurainy,

N. 2015. “Construction, expression

and characterization of multi

cassettes encoding indonesian small

hepatitis B surface antigen (s-

HBsAg) in methylotropic yeast

Pichia pastoris”. Biotechnology. 14

(5): 225-232.

Grinna, I.S dan Tschopp, J.F. 1989. “Size

distribution and general structural

features of N-linked

oligosaccharides from the

methylotrophic yeast Pichia

pastoris”. Yeast. 5: 107- 115.

Gurramkonda, C., Adnan, A., Gabel, T.,

Lunsdorf, H., Ross, A., Nemani, S.

K., Swaminathan, S., Khanna, N.,

Rinas, U. 2009. “Simple high-cell

density fed-batch technique for

high-level recombinant protein

production with Pichia pastoris:

application to intracellular

production of hepatitis b surface

antigen”. Microbial Cell Factories.

8:13.

Higgins, D.R dan Cregg, J. M. 1998. Pichia

Protocols. Humana Press Inc.

New Jersey. P78-80.

Hilman, K., Djajadiredja, S.H., Prasetya, E.,

Meilianau. 2002. “Penatalaksanaan

Hepatitis B Kronik”. Jurnal

Kedokteran Maranatha. 1(2): 1-8.

Jahic, M. 2006. “Process technology for

production and recovery of

heterologous proteins with Pichia

pastoris”. Biotechnol. Prog. 22 (6):

1465-1473.

Jiménez, E.R., Sánchez, K., Roca, H.,

Delgado, J.M. 1997.”Different

methanol feeding strategies to

recombinant Pichia pastoris

cultures producing high level of

dextranase”. Biotechnol Tech.

11:461-466.

Li, P., Anumanthan, A., Gao, X.G.,

Illangovan, K.K., Suzara, V.V.,

Duzgunes, N., Renugopalakrishnan,

V. 2007. “Expression of

recombinant protein in Pichia

pastoris”. Applied Biochemistry

and Biotechnology. 142: 105-124.

Liu, R., Lin, Q., Sun, Y., Lu, X., Qiu, Y.,

Li, Y. 2009. “Expression,

purification, and characterization of

hepatitis B virus surface antigens

(HBsAg) in yeast Pichia pastoris”.

Apply Biochemistry Biotechnology.

158: 432-444.

JSTFI



45

Lunsdorf, H., Gurramkonda, C., Adnan, A.,

Khanna, N., Rinas, U. 2011.

“Virus-like Particle production with

yeast: ultrastructural and

immunocytochemical insights into

Pichia pastoris producing high

level of the hepatitis B surface

antigen”. Microbial Cell Factories.

10:48.

Mackay, P., Lees, J., Murray, K. 1981.

“The conversion of hepatitis B core

anitigen synthesised in E. coli into

e antigen”. Journal of Medical

Virology. 8: 237-243.

Moticka, E. 2015. A Historical Perspective

On Evidence-Based Immunology.

1st Ed. Elsevier. New York. P 59.

Murray, W.D., Duff, S.J.B., Lanthier, P.H.

1989. “Induction and stability of

alcohol oxidase in the

methylotrophic yeast Pichia

pastoris”. Appl Microbiol

Biotechnol. 32:95-100.

Naully, P.G. 2014. “Pengaruh Konsentrasi

Metanol Terhadap Pertumbuhan

dan Ekspresi Empat Salinan Kaset

Ekspresi Gen sHBsAg pada Pichia

pastoris GS115”. Skripsi. Program

Studi Mikrobiologi. Institut

Teknologi Bandung. P 30-35.

Naully, P.G. 2015. “Uji Stabilitas dan

Penentuan Jumlah Salinan Kaset

Ekspresi Gen sHBsAg yang

Terintegrasi pada Kromosom

Pichia pastoris GS115. Tesis.

Program Studi Bioteknologi.

Institut Teknologi Bandung. P 38-

43.

Ottone, S., Nguyen, X., Bazin, J., Berard,

C., Jimenez, S., Letourneur, O.

2007. “Expression of hepatitis B

surface antigen major subtypes in

Pichia pastoris and purification for

in vitro diagnosis”. Protein

Expression and Purification. 56:

177-188.

Porro, D., Sauer, M., Branduardi, P.,

Mattanovich, D. 2005. “Review :

recombinant protein production in

yeast”. Molecular Biotechnology.

31: 245-259.

Romanos, M. 1995. “Advances in the Use

of Pichia pastoris for high-level

gene expression”. Current Opinion

in Biotechnology. 6: 527-533.

Shu, L., Toujzian, N., Nan, D., Kushner, N.,

Strong, A.J., Zeping, W. 1987.

“Selective synthesis and secretion

of particles composed of the

hepatitis B virus midle surface

protein directed by a recombinant

vaccina virus : induction of

antibodies to Pre-S and S epitopes”.

American Society for Microbiology.

61: 1286-1290.

Steephen, J. 1988. “Recombinant versus

plasma-derived hepatitis B vaccines

: issues of safety, immunogenicity

and cost effectiveness”. Vaccine. 6:

299-303.

Vassileva, A., Chugh, D.A., Swaminathan,

S., dan Khanna, N. 2001. “Effect of

JSTFI



46

copy number on the expression

levels of hepatitis B surface antigen

in the methylotrophic yeast Pichia

pastoris. Prot Expres Purif. 21: 71-

80.

Wang, X., Wang, Z., Da Silva, N. A. 1996.

“G418 selection and stability of

cloned genes integrated at

chromosomal delta sequences of

Saccharomyces cerevisiae”.

Biotechnol Bioeng. 49:45–51.

WHO. 2012. “Hepatitis B”. World Health

Organization. 204: 1-5.

WHO. 2009. “Hepatitis B vaccine”. Weekly

Epidemiological Record. 84: 405-

420.

Yang, J.Y., Hui, J.Y., Li, G.D., Wang, Y.,

Yuan, H.Y. 2000.”Expression of

the recombinant hepatitis B virus

surface antigen carrying preS

epitopes in Pichia pastoris” Sheng

Wu Hua Hseueh Yu Sheng Wu Wu

Li Xue Pao. 32: 139- 144.

Yurimoto, H., Oku, M., Sakai, Y. 2011.

“Yeast methylotrophy: metabolism,

gene regulation and peroxisome

homeostasis”. International

Journal of Microbiology. 2011:1-8.

Zhu, T., Guo, M., Sun, C., Qian, J., Zhuang,

Y., Chu, J., Zhang, S. 2009. “A

systematical investigation on the

genetic stability of multi-copy

Pichia pastoris strains”. Biotechnol

Lett. 31:679-684.

[REVIEW] PRODUKSI PROTEIN HBsAg MENGGUNAKAN …

Documents

Transcript of [REVIEW] PRODUKSI PROTEIN HBsAg MENGGUNAKAN …