520 WISSENSCHAFT · SPECIAL: LABORAUTOMATION

BIOspektrum | 05.13 | 19. Jahrgang

STEPHAN HÜTTEL, JENNIFER HERRMANN, ROLF MÜLLER

ABTEILUNG MIKROBIELLE NATURSTOFFE, HELMHOLTZ-INSTITUT FÜR

PHARMAZEUTISCHE FORSCHUNG SAARLAND (HIPS), HELMHOLTZ-ZENTRUM FÜR

INFEKTIONSFORSCHUNG (HZI), SAARBRÜCKEN

Natural products from myxobacteria continue to be invaluable sources fornovel bioactive leads. Although screening for such compounds from themost abundant representatives has already been achieved, myxobacteriastill bear an enormous potential, as novel species and even novel generaand families are continuously discovered. State-of-the-art analytical toolswithin a comprehensive discovery pipeline greatly facilitate the identifica-tion of potential lead structures from these organisms.

DOI: 10.1007/s12268-013-0350-9© Springer-Verlag 2013

Myxobakterien alsNaturstoffproduzentenó Myxobakterien sind ubiquitär vorkom-mende Mikroorganismen, die sich als Multi-produzenten von Naturstoffen auszeichnen[1]. Das Vorhandensein einer Vielzahl vonSekundärstoff-Biosynthesegenclustern bis-lang unbekannter Funktion in den Genomen

dieser Bakterien zeigt das bislang nur un -zureichend erforschte genetische Potenzialzur Naturstoffbildung auf [2]. Viele der bio-logisch aktiven Substanzen aus Myxobakte-rien weisen zudem neue Wirkmechanismenauf [3].

Trotz aller Vorteile sind mit der Produktionvon Wirkstoffen aus Myxobakterien häufig

auch Probleme assoziiert, wie beispielsweiselangsames und pelletiertes Wachstum undoftmals niedrige Produktivität. Dies wiede-rum macht die sorgfältige Planung und Orga-nisation aller experimentellen Abläufe beider Naturstoffisolierung aus diesen Produ-zenten erforderlich.

Aktuelle EntwicklungenDie ursprünglich am HZI (Helmholtz-Zentrumfür Infektionsforschung; ehemals Gesellschaftfür Biotechnologische Forschung, GBF) begon-nene Stammsammlung von Myxobakterienin unseren Laboren umfasst mittlerweilemehr als 9.000 Isolate, wobei neue Stämmederzeit hauptsächlich aus Lebensräumengewonnen werden, die maximale Biodiver-sität aufweisen [4, 5].

Bei der systematischen Wirkstofffindungaus diesen Bodenbakterien sind standardi-sierte Methoden für die Anzucht, die Her-stellung von Rohextrakten und für nachfol-gende Analysen von immenser Bedeutung.Ausschlaggebend für die effiziente Isolierungneuer Naturstoffe ist darüber hinaus dieschnelle und umfassende Charakterisierungder bereits bekannten Sekundärmetabolitenaus neuen Stämmen. Sowohl analytischeDaten als auch Aktivitätsdaten von über100 Substanzklassen aus Myxobakterien sindmittlerweile in unserer internen Datenbank(Myxobase) hinterlegt.

Anknüpfend an die bisherigen Erfolge inder myxobakteriellen Wirkstoffforschung wur-de im Jahr 2008 ein Programm initiiert, dasder Charakterisierung neuer Antiinfektivaaus Myxobakterien gewidmet ist. Dieses Pro-gramm umfasste zunächst die Definition einesBasissets von phylogenetisch möglichst unter-schiedlichen Isolaten, die kontinuierlich reak-tiviert und analysiert werden.

Identifizierung neuer biologischaktiver SekundärmetabolitenWenn in den Rohextrakten vielversprechen-de biologische Aktivitäten detektiert werden,die nicht durch die Präsenz bekannter Sekun-därmetaboliten erklärt werden können, sowird der myxobakterielle Stamm weiter bear-

Naturstoffforschung

Schätze aus dem Boden: innovativeProzesse zur Wirkstofffindung

˚ Abb. 1: Genereller Ablauf der bioaktivitätsgeleiteten Isolierung von Naturstoffen aus Myxobak-terien. Die aus Produktionskulturen erhaltenen Rohextrakte werden sowohl hinsichtlich ihrer bio-logischen Aktivität als auch ihrer chemischen Zusammensetzung analysiert. Die Ergebnisse bei-der Analysen werden in einer Datenbank (Myxobase) hinterlegt und für die anschließende Derepli-kation verwendet (graue Box). Stämme, die potenziell neue Naturstoffe mit biologischer Aktivitätproduzieren, werden in weiterführenden Studien bearbeitet.

beitet (Abb. 1). Die Identifizierung bereitsbekannter Naturstoffe in den Substanzge-mischen erfolgt durch Abgleichen analyti-scher Daten mit unserer Datenbank. Eineautomatisierte chromatografische Auftren-nung (LC/hR-MS) des Substanzgemischesmit simultaner Fraktionierung in 96- oder384-Lochplatten gekoppelt an biologischeAssays erlaubt dann die rasche Identifizie-rung potenziell neuer Moleküle mit biolo-gischer Aktivität.

Für die Testung von Fraktionen habensich zwei Methoden als besonders emp-findlich und materialsparend herausgestellt(Abb. 2): Bei der antimikrobiellen Testungwird die ATP-Konzentration in den Test-wells gemessen, wodurch eine quantitativeAuswertung der Zellviabilität ermöglichtwird. Vorfraktionierte Extrakte werdenaußerdem in high-content screening-Analy-sen (automatisierte Fluoreszenzmikrosko-pie gekoppelt an Bildanalyseverfahren)untersucht. Somit können nicht nurschwach ausgeprägte Effekte in Zellliniendetektiert werden, sondern es ist ebenfallsmöglich, mehrere und unterschiedlichezytostatische/-toxische Effekte eindeutigvoneinander zu trennen.

Umfangreiche Bearbeitungausgewählter ProduzentenEin neues Isolat der Gattung Chondromy-ces fiel im Primärscreening aufgrund einerstarken zytostatischen Wirkung desRohextrakts auf. Obwohl der Stamm diebereits bekannten Aktin-stabilisierendenChondramide [6, 7] produziert, solltennachfolgende Analysen dazu dienen, daskomplette biosynthetische Potenzial desStamms genauer zu untersuchen. Dabeierlaubt der Einsatz kleiner Bioreaktorenein Monitoring des Prozesses und eineAufzeichnung einer Vielzahl sensorischerDaten. Durch die Automatisierung vonInkubationsschritten oder Medienwech-seln können Kleinkultivierungen reali-siert werden, die keine permanentemanuelle Kontrolle erfordern. Für dieAutomatisierung dieser Schritte werdenin Abhängigkeit vom Organismus unter-schiedliche Parameter gemessen und zurDefinition der Stellgrößen im Prozess ver-wendet [8].

Durch die Teilautomatisierung solcherProzesse können mit geringem personel-lem Aufwand direkt miteinander ver-gleichbare Kultivierungen durchgeführtwerden, die zum Ziel haben, den Einfluss

verschiedener physikalischer Parameterauf die Produktion von Sekundärstoffen zuuntersuchen. Rohextrakte aus diesen Kul-tivierungen werden für die softwareunter-stützte Quantifizierung von Produktivi-tätsunterschieden, biologische Aktivitäts-tests und die aktivitätsgeleitete Identifi-zierung neuer Naturstoffe verwendet. ImFalle des oben erwähnten Chondromyces-Isolats wurden high-content screening-Ana-lysen begleitend zu mehreren Fraktionie-rungsschritten durchgeführt. Waren dieanfänglich produzierten Naturstoffmengenfür eine Aufarbeitung nicht ausreichend,so wurden die gespeicherten Prozessdatenverwendet, um durch eine Vergrößerungdes Kulturvolumens ausreichende Mengenunter günstigeren Kultivierungsbedingun-gen zu produzieren (Abb. 3, [8, 9]). Letz-tendlich konnten so zahlreiche neue Chon-dramid-Derivate isoliert werden, die zumTeil verbesserte Wirkungsspektren im Ver-gleich zu den ursprünglich beschriebenenNaturstoffen aufweisen [9].

Welche Rolle spielenAutomatisierungskonzepte?Automatisierung spielt mittlerweile in allenBereichen der Laborarbeit eine wichtigeRolle. Insbesondere eine Auswertung gro-ßer Datenmengen ist manuell meist nichtdurchführbar. Durch Programmierung undAnwendung entsprechender Auswertungs-Algorithmen wird eine zeitsparende Ana-lyse von Daten ermöglicht, die beispiels-weise aus der hochauflösenden Massen-spektrometrie oder auch aus der mikro-skopischen Analytik von Extrakt- oder Rein-substanzwirkungen hervorgehen.

Ein weiterer Aspekt ist die Teilautomati-sierung von Produktionsprozessen. Diesesehr aufwendigen Experimente benötigenin der Regel spezifische Anpassungen, dievom untersuchten Mikroorganismus abhän-gen. Dies bedeutet, dass kein allgemein-gültiges übergeordnetes Konzept für eineAutomatisierung angewendet werden kann,sondern stammspezifische Parameter ver-wendet werden müssen. Die Software- undHardware-unterstützte Kontrolle solcherProzesse schafft die Möglichkeit, viele Teil-schritte zu automatisieren, die mittels einerstarren, vorkonfigurierten Regelung nichtkontrollierbar wären. Durch den EinsatzHersteller-unabhängiger, übergeordneterSteuersoftware können verschiedensteInformationen für Kontroll- und Automati-sierungsprozesse verwendet werden.

BIOspektrum | 05.13 | 19. Jahrgang

Dadurch können heute Untersuchungendurchgeführt und Prozesse entwickelt wer-den, die bis vor wenigen Jahren kaum reali-sierbar waren.

Zusammenfassend ist festzustellen, dassdie moderne Naturstoffforschung ein inter-disziplinäres Zusammenspiel aus den Gebie-ten der Mikrobiologie, der Molekularbiologie,der analytischen Chemie und der Bioverfah-renstechnik einsetzen und weiterentwickeln

muss, um weiterhin einen signifikanten Bei-trag für die Identifizierung und Entwicklungneuer Wirkstoffe leisten zu können.

DanksagungWir bedanken uns bei allen Mitgliedern derArbeitsgruppen Mikrobielle Wirkstoffe(MWIS, HZI) und Mikrobielle Naturstoffe(MINS, HIPS) für ihr Engagement und ihreUnterstützung. ó

Literatur[1] Wenzel SC, Müller R (2009) The biosynthetic potential ofmyxobacteria and their impact on drug discovery.Curr Opin Drug Discov Dev 12:220–230[2] Wenzel SC, Müller R (2009) The impact of genomics onthe exploitation of the myxobacterial secondary metabolome.Nat Prod Rep 26:1385–1407[3] Weissman KJ, Müller R (2010) Myxobacterial secondarymetabolites: bioactivities and modes-of-action.Nat Prod Rep 27:1276–1295[4] Müller R, Wink J (2013) Future potential for anti-infecti-ves from bacteria – how to exploit biodiversity and genomicpotential. Int J Med Microbiol (im Druck)[5] Garcia RO, Krug D, Müller R (2009) Chapter 3.Discovering natural products from myxobacteria with empha-sis on rare producer strains in combination with improvedanalytical methods. Methods Enzymol 458:59–91[6] Sasse F, Kunze B, Gronewold TM et al. (1998) The chon-dramides: cytostatic agents from myxobacteria acting on theactin cytoskeleton. J Natl Cancer Inst 90:1559–1563[7] Kunze B, Jansen R, Sasse F et al. (1995) ChondramidesA-D, new antifungal and cytostatic depsipeptides fromChondromyces crocatus (Myxobacteria). Production, physico-chemical and biological properties. J Antibiot 48:1262–1266[8] Hüttel S, Müller R (2012) Methods to optimize myxobact-erial fermentations using off-gas analysis.Microb Cell Fact 11:59[9] Herrmann J, Hüttel S, Müller R (2013) Discovery of newchondramides with improved bioactivity in extracts ofChondromyces sp. ChemBioChem (im Druck)

Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Rolf MüllerHelmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung SaarlandHelmholtz-Zentrum für InfektionsforschungAbteilung Mikrobielle NaturstoffeCampus, Geb. C2.3Universität des SaarlandesD-66123 SaarbrückenTel.: 0681-302-70200Fax: 0681-302-70202rolf.mueller@helmholtz-hzi.dewww.helmholtz-hzi.de/HIPS

˚ Abb. 3: Prozesskontrolle und -optimierung für die Produktion neu entdeckter Substanzen ausMyxobakterien. Wird ein Stamm für die weitere Bearbeitung ausgewählt, so erfolgt die Anzucht inkleinen Bioreaktoren. Dabei können prozessrelevante Daten erfasst und später für eine etwaigeNachproduktion von biologisch aktiven Zielsubstanzen genutzt werden.

˚ Abb. 2: Biologische Testsysteme zur Charakterisierung von vorfraktionierten Extrakten. A, Anti-mikrobielle Effekte werden im 384-Format erfasst und mittels einer Lumineszenzmessung quanti-fiziert. Die Rohextrakte werden hierfür fraktioniert, automatisiert in 384-Lochplatten gesammeltund anschließend getrocknet. Der entsprechende Testorganismus in Nährmedium wird mittelseines Dispensers in die Platten gegeben und über Nacht kultiviert. Anschließend erfolgt die Zell -lyse und die Quantifizierung von ATP (Luziferase-Reaktion). B, Unterschiedliche zytostatischeEffekte in Fraktionen können mithilfe automatisierter Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert undeindeutig zugeordnet werden. Die Rohextrakte werden ebenfalls fraktioniert und in 96-Lochplat-ten mit optischem Boden gesammelt. Zellen (z. B. humane U-2 OS[Osteosarkom]-Zellen) könnendirekt in diesen Platten kultiviert werden. Nach der Immunfluoreszenzfärbung oder Fluoreszenz-markierung von Organellen mittels spezifischer Farbstoffe werden die Effekte, die durch einzelneFraktionen induziert werden, mittels automatisierter Fluoreszenzmikroskopie erfasst undanschließend quantifiziert.

A

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AUTORENStephan Hüttel2004–2008 Biotechnologies-tudium an der HochschuleEsslingen. 2008–2013 Promo-tion am Institut für Pharma-zeutische Biotechnologie ander Universität des Saarlan-des.

Jennifer Herrmann2001–2007 Chemiestudiuman der TU Kaiserslautern.2008–2012 Promotion am In-stitut für PharmazeutischeBiotechnologie an der Univer-sität des Saarlandes. Seit2013 Postdoc am Helmholtz-Institut für PharmazeutischeForschung Saarland, Saarbrü-cken.

Rolf Müller1986–1990 Pharmaziestu-dium an der Universität Bonn,dort 1994 Promotion. 1996–1997 Postdoc in Seattle, WA,USA. 1998–2003 Juniorgrup-penleiter an der Gesellschaftfür Biotechnologische For-schung (GBF), Braunschweig.Seit 2003 Professor für Phar-mazeutische Biotechnologiean der Universität des Saar-landes und seit 2009 Grün-dungsdirektor des Helmholtz-Instituts für PharmazeutischeForschung Saarland.