Schnelle Diagnostik durch molekularbiologische und...

10.10.2017 ECMM-Symposium | Priv. Doz. Dr. med. Axel Hamprecht | Institut für medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene

Schnelle Diagnostik durch molekularbiologische und massenspektrometrische Verfahren

10.10.2017 2 ECMM-Symposium Köln | Axel Hamprecht | Institut für medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene

Institut für medizinische Mikrobiologie, Immunologie u. Hygiene 300 000 Proben/Jahr, davon › 123 000 MRSA-Screenings › 40 000 Varia-Proben › 30 000 Blutkulturen › 19 000 Urinkulturen › 29 000 molekularbiologische Proben → 72 000 Proben auf Pilze


Inhalt

Anzucht und Identifizierung von Pilzen Massenspektrometrie Molekularbiologische Nachweismethoden


Nachweisverfahren für Pilze

Kultur (Spezialmedien)

› Tage bis Wochen

› Voraussetzung zur Resistenztestung Serologische Verfahren (Antikörper/Antigen)

› Tage

› nur für wenige Organismen Molekularbiologische Verfahren

› 1-2 Tage


Kultur und Identifizierung

Probe Kultur

Wachstum › Hefen: 1-3d › SP: 1-28d

Resistenz- testung

Identifiz. Spezies

› früher ≥1d › heute i.d.R.

gleicher Tag

C. albicans


Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization — Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS)


Massenspektrometrie

Bernhard et al., J. Clin. Microbiol. 2014, 52(12):4163

Extraktion

AS on target

Schmierpräp.


Evaluierung von MALDI-ToF Systemen zur Identifizierung von Hefen

Vergleich von Biotyper (3.0) und VitekMS (2.0) 210 klin. Hefeisolate aus primär sterilen Materialien d. UK Köln und UK Frankfurt/Main (Blutkulturen und Liquores) 178 Candida spp., 32 non-Candida spp.


Ergebnisse d. Identifizierung

Biotyper ID VitekMS ID

Falsche ID Falsche ID

202 (96.2%)

8 (3.8%)

0 (0%) 202

(96.2%) 3

(1.4%) 5

(2.4%)


Geschwindigkeit d. Messungen

Hamprecht et al., Med Microbiol Immunol. 2014 Apr;203(2):93-9.


Identifizierung von Schimmelpilzen mittels MALDI-ToF

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MALDI-TOF und Schimmelpilze

Ranque et al, Mycoses. 2014 Mar; 57(3):135-40

Ranque et al., Vergleich von konventioneller ID und MALDI-TOF ID von Schimmelpilzen mit eigener Datenbank


Wachstum › Hefen: 1-3d › SP: 1-28d

Resistenz- testung

Identifiz. Spezies

› früher ≥1d › heute i.d.R.

gleicher Tag

C. albicans

Kultur

Probe Kultur

Anti- mykotika

kein Wachstum

nicht/schwer anzüchtbare

Erreger


Molekularbiologische Nachweisverfahren

Probe DNA-Isolierung conventional PCR Real-time PCR

Genus/ Spezies


Real time PCR

Zyklen

Fluo

resz

enz


Welche PCR anfordern?

Panels Erreger bei Aplasie/Immunsuppression (BAL) › PCR Aspergillus spp., Mucorales, Pneumocystis jiroveci › PCR Toxoplasma gondii › Aspergillus-Ag (BAL) › Mikroskopie mit optischen Aufhellern › large volume culture

→ Kombination von PCR/Antigennachweis und Kultur


PCR für Pilze am IMMIH

01.10.2016 – 30.09.2017

Positiv

Aspergillus-PCR 402 47 (11,7%)

Mucorales-PCR 405 11 (2,7%)

Pneumocystis-PCR

551 29 (5,3%)

Candida-PCR (Biopsien)

25 1 (4%)

panfungale PCR (Biopsien)

54 11 (20,4%)


Fazit Massenspektrometrie/Molekularbiologie

Nachweis von Pilzen schwierig; abhängig von richtiger Indikationsstellung/Probennahme MALDI-TOF MS erhebliche Beschleunigung d. Identifikation von Pilzen, v.a. für Hefen Schimmelpilze: weitere Verbesserung d. Datenbanken notwendig Molekularbiologische Methoden erlauben schnellen Nachweis von Pilz-DNA, häufig auch bei antimykotisch vorbehandelten Patienten Multiplex-PCR für wichtigsten Erreger von Mykosen Erhebliche Beschleunigung d. Diagnostik und Therapie


Danksagung IMMIH Jacqueline Kleffmann Tanja Oestreicher Ahmad Saleh Gunhilde Schröder Yvonne Stelzer Janine Vollmann Astrid Zimmer

Frieder Fuchs Ellen Piepenbrock

Dr. Jörg Gielen Prof. Martin Krönke PD Dr. Georg Plum Prof. Harald Seifert

Alle Kollegen/innen d. UK Köln Infektiologie Intensivmedizin

Kooperationspartnern O.Bader/UK Göttingen D. Buchheidt/UK Mannheim F. Dromer/Institut Pasteur

S. Göttig/UK Frankfurt M. Koeppel/LMU München O. Kurzai/UK Würzburg/NRZ C. Lass-Flörl/UK Innsbruck

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!

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