Semisynthetische Kollagenmembranen zur Regeneration und ... · und Struktur. Zudem ist das Risiko...
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Semisynthetische Kollagenmembranen zur Rekonstruktion und Regeneration der Augenoberfläche Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Corinna Petsch aus Nürnberg
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Semisynthetische Kollagenmembranen zur Rekonstruktion und Regeneration der Augenoberfläche
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von Corinna Petsch aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 17.12.2014 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms Gutachter: Prof. Dr. Andreas Feigenspan
PD Dr. Björn O. Bachmann
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................... 1
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................................... 3
1 EINLEITUNG ............................................................................................................................ 5
1.1 ANATOMIE DES AUGES ............................................................................................................. 6 1.1.1 DIE CORNEA ................................................................................................................................... 7 1.1.1.1 Aufbau und Struktur der Cornea ............................................................................................. 7 1.1.1.2 Regeneration des Corneaepithels ......................................................................................... 10 1.1.1.2.1 Eigenschaften und Besonderheiten von Stammzellen ....................................................... 10 1.1.1.2.2 Stammzellen der Hornhaut – Funktion des Limbus und Migration der Stammzellen ........ 11 1.1.1.2.3 Funktionsverlust des Limbus und Therapiestrategien ........................................................ 12 1.1.2 DAS KANINCHENAUGE ................................................................................................................... 14 1.2 ERKRANKUNGEN DER AUGENOBERFLÄCHE UND DEREN THERAPIE ....................................................... 15 1.2.1 ENTSTEHUNG VON HORNHAUTULZERATIONEN................................................................................... 16 1.2.2 OPERATIVE THERAPIEMÖGLICHKEITEN .............................................................................................. 16 1.2.3 DIE AMNIONMEMBRANTRANSPLANTATION ...................................................................................... 17 1.3 TISSUE ENGINEERING – ALTERNATIVE MATERIALIEN ZUR AMNIONMEMBRAN ........................................ 21 1.3.1 ANFORDERUNGEN AN ALTERNATIVE MATERIALIEN ............................................................................. 22 1.3.2 FIBRIN, SEIDE, KERATIN ODER KOLLAGEN? ........................................................................................ 22 1.4 DIE KOLLAGENMEMBRAN ......................................................................................................... 23 1.4.1 ZUSAMMENSETZUNG DER KOLLAGENMEMBRAN ................................................................................ 23 1.4.1.1 Modifikationen der ursprünglichen Kollagenmembran ....................................................... 23 1.4.1.1.1 Crosslinking mit UV-Licht und Riboflavin ............................................................................ 24 1.4.1.1.2 Reduzierung des kurzkettigen Kollagens ............................................................................ 24 1.4.1.1.3 Zugabe von Antibiotika ....................................................................................................... 25 1.4.2 KLINISCHE ANWENDUNGEN ............................................................................................................ 25 1.4.2.1 Wundversorgung mit Kollagen ............................................................................................. 25 1.4.2.2 Anwendungen in der Ophthalmologie ................................................................................. 26 1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT ......................................................................................................... 26
2 MATERIAL UND METHODE .................................................................................................... 28
2.1 MATERIAL ............................................................................................................................ 28 2.1.1 KOLLAGENMEMBRANEN ................................................................................................................. 28 2.1.2 AMNIONMEMBRAN ....................................................................................................................... 29 2.1.3 ZELLKULTUR.................................................................................................................................. 29 2.1.3.1 Zellen ...................................................................................................................................... 29 2.1.3.2 Gewebe .................................................................................................................................. 29 2.1.3.3 Zellkulturmedien und Zusätze ............................................................................................... 30 2.1.4 TIERMODELL ................................................................................................................................. 31 2.1.4.1 Versuchstiere ......................................................................................................................... 31 2.1.4.2 Tierhaltung ............................................................................................................................ 31 2.1.4.3 Operations- und Nahtmaterial.............................................................................................. 32 2.1.4.4 Narkosemittel und Medikamente ......................................................................................... 33 2.1.5 ANTIKÖRPER ................................................................................................................................. 34 2.1.6 CHEMIKALIEN, LÖSUNGEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN ................................................................. 34
2.1.7 GERÄTE........................................................................................................................................ 36 2.1.8 SOFTWARE ................................................................................................................................... 38 2.2 METHODEN .......................................................................................................................... 38 2.2.1 IN-VITRO-ZELLKULTUR MIT MUNDSCHLEIMHAUT- UND LIMBUSSTAMMZELLEN ....................................... 38 2.2.1.1 Gewinnung epithelialer Stammzellen ................................................................................... 38 2.2.1.1.1 Epitheliale Stammzellen der Mundschleimhautzellen (Oral mucosa) ................................ 38 2.2.1.1.2 Limbusstammzellen............................................................................................................. 39 2.2.1.2 Klonierung auf 3T3-Feederzellen und Aussaat auf die Kollagenmembranen ..................... 40 2.2.1.3 Verwendete Medien .............................................................................................................. 41 2.2.2 PRÄPARATION DER AMNIONMEMBRAN ............................................................................................ 42 2.2.3 IN-VIVO-VERSUCHE AM TIERMODELL ............................................................................................... 42 2.2.3.1 Narkoseverfahren .................................................................................................................. 42 2.2.3.2 Intrastromale Implantation .................................................................................................. 43 2.2.3.3 Oberflächliche Implantation ................................................................................................. 44 2.2.3.4 Entnahme, Präparation und Fixierung der Hornhäute ........................................................ 45 2.2.4 HISTOLOGIE UND IMMUNFLUORESZENZ-FÄRBUNGEN ......................................................................... 45 2.2.4.1 Licht- und Elektronenmikroskopie ........................................................................................ 45 2.2.4.2 Immunfluoreszenz-Färbungen .............................................................................................. 46 2.2.5 PHYSIKALISCHE UND BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN DER KOLLAGENMEMBRAN .................................... 46 2.2.5.1 Quellung................................................................................................................................. 46 2.2.5.2 Druckstabilität ....................................................................................................................... 47 2.2.5.3 Kollagenaseassay .................................................................................................................. 48 2.2.6 KLINISCHE ANWENDUNGSBEOBACHTUNG AM PATIENTEN ................................................................... 48
3 ERGEBNISSE .......................................................................................................................... 50
3.1 HERGESTELLTE UND UNTERSUCHTE VARIANTEN ............................................................................. 50 3.2 IN-VITRO-ZELLKULTURVERSUCHE ................................................................................................ 50 3.2.1 KULTIVIERUNG VON STAMMZELLEN DER MUNDSCHLEIMHAUT ............................................................. 50 3.2.1.1 Kultivierung von Stammzellen oraler Mukosa auf unterschiedlichen Varianten der Biomembran aus equinem Kollagen Typ I ........................................................................................... 53 3.2.1.2 Immunhistologische Auswertung des Mundschleimhautepithels ....................................... 55 3.2.2 KULTIVIERUNG DER LIMBUSSTAMMZELLEN ........................................................................................ 57 3.2.3 KULTIVIERUNG VON EPITHELZELLEN AUF WEITEREN VARIANTEN ........................................................... 59 3.3 IN-VIVO-VERSUCHE AM TIERMODELL .......................................................................................... 61 3.3.1 INTRASTROMALE IMPLANTATION INS STROMA .................................................................................. 61 3.3.1.1 Klinischer Verlauf ................................................................................................................... 62 3.3.1.2 Histologische Querschnitte ................................................................................................... 63 3.3.1.3 Elektronenmikroskopische Untersuchungen ........................................................................ 64 3.3.2 OBERFLÄCHLICHE IMPLANTATION NACH LAMELLÄRER KERATEKTOMIE .................................................. 65 3.3.2.1 Klinischer Verlauf ................................................................................................................... 66 3.3.2.2 Histologische Querschnitte ................................................................................................... 68 3.3.2.3 Elektronenmikroskopische Untersuchungen ........................................................................ 69 3.4 MATERIALEIGENSCHAFTEN DER KOLLAGENMEMBRANVARIANTEN....................................................... 70 3.4.1 DRUCKSTABILITÄT ......................................................................................................................... 71 3.4.2 QUELLUNG ................................................................................................................................... 71 3.4.3 ABBAUGESCHWINDIGKEITEN IM KOLLAGENASEASSAY ......................................................................... 72 3.5 KLINISCHE ANWENDUNGSBEOBACHTUNG ..................................................................................... 73 3.5.1 PATIENT 01 .................................................................................................................................. 73 3.5.2 PATIENT 02 .................................................................................................................................. 74 3.5.3 PATIENT 03 .................................................................................................................................. 75 3.5.4 PATIENT 04 .................................................................................................................................. 77
3.5.5 PATIENT 05 .................................................................................................................................. 80
4 DISKUSSION .......................................................................................................................... 82
4.1 BIOKOMPATIBILITÄT DER KOLLAGENMEMBRANEN .......................................................................... 82 4.2 AUSWIRKUNGEN DES CROSSLINKINGS MIT RIBOFLAVIN UND UV-LICHT ............................................... 83 4.2.1 ERHÖHUNG DER STABILITÄT UND REDUZIERUNG DER ABBAUGESCHWINDIGKEIT ..................................... 83 4.2.2 EINFLUSS DES RIBOFLAVINS AUF DIE KULTIVIERTEN EPITHELZELLEN ....................................................... 84 4.3 KLINISCHE ANWENDUNG AM AUGE ............................................................................................ 86 4.4 VERGLEICH MIT ANDEREN BIOMATERIALIEN .................................................................................. 87 4.5 KOLLAGENMEMBRANEN ALS ALTERNATIVE ZUR AMNIONMEMBRAN ................................................... 88 4.6 OPTIMIERTE KULTIVIERUNG DER LIMBUSSTAMMZELLEN ................................................................... 90 4.7 AUSBLICK ............................................................................................................................. 91
ABBILDUNGSVERZEICHNIS .......................................................................................................... 93
TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................................................... 95
LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................. 96
ANHANG ................................................................................................................................... 102
VERÖFFENTLICHUNGEN ............................................................................................................. 105
POSTERPRÄSENTATIONEN ......................................................................................................... 105
LEBENSLAUF .............................................................................................................................. 106
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ................................................................................................... 108
Zusammenfassung
1
Zusammenfassung Corneale Ulzerationen und Vernarbungen gehören zu den häufigsten Gründen von Sehverlust
weltweit und stellen eine Herausforderung bei der Behandlung dar. Zu den gängigsten
operativen Therapien zählen die Hornhaut- und die Amnionmembrantransplantation. Die
Behandlung mit der Amnionmembran ist inzwischen gut etabliert, allerdings bestehen
Einschränkungen bei ihrer Verfügbarkeit und eine qualitative Variabilität in Bezug auf Dicke
und Struktur. Zudem ist das Risiko der Keimübertragung vorhanden, und sowohl der Transport
als auch die Lagerung sind nicht standardisiert. Derzeit werden in Deutschland jährlich ca.
2.300 Amnionmembrantransplantationen durchgeführt, der Bedarf an alternativen
Materialien zur Deckung von Hornhautoberflächendefekten ist dementsprechend hoch.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Biomembranen aus equinem Kollagen Typ I der
Firma Resorba Medical GmbH untersucht. Kollagen Typ I ist der Hauptbestandteil der
menschlichen Hornhaut und wird bereits in unterschiedlichen medizinischen Disziplinen
klinisch angewendet (Orthopädie, Kieferchirurgie, Neurochirurgie).
Ziel des Versuchsvorhabens war die experimentelle und die klinische Erprobung
unterschiedlicher semisynthetischer Biomembranen auf Kollagenbasis zur Behandlung von
Defekten der Augenoberfläche.
Dafür wurden die Eigenschaften und das Verhalten der verschiedenen
Kollagenmembranvarianten – physikalische und enzymatische Stabilität, Quellung und
Biokompatibilität mit epithelialen Stammzellen und in der Kaninchenhornhaut – untersucht.
In der anschließenden Beobachtungsstudie wurde die ursprüngliche, unbehandelte
Biomembran bei Patienten mit unter konservativer Therapie nichtheilenden
Hornhautulzerationen angewendet und der postoperative Verlauf kontrolliert.
Die Untersuchungen zeigten, dass die getesteten Kollagenmembranen als Kulturunterlage für
epitheliale Stammzellen (Mundschleimhaut- und Limbusstammzellen) die Bildung einer
mehrschichtigen Epithelschicht ermöglichten. Eine verbesserte enzymatische und
physikalische Stabilität konnte durch UV-Licht / Riboflavin-Crosslinking erreicht werden, ein
Verfahren, bei dem durch Bildung freier Radikale die Ausbildung kovalenter Bindungen
zwischen einzelnen Kollagenfibrillen herbeigeführt wird. Diese modifizierten
Kollagenmembranen erwiesen sich ebenfalls als geeignet für die Kultivierung von epithelialen
Stammzellen.
Zusammenfassung
2
In-vivo-Untersuchungen in der Kaninchenhornhaut zeigten nach Einbringen in das
Hornhautstroma die Immigration von Keratozyten in die Kollagenmembran, die Produktion
von neuem körpereigenem Kollagen und einen gleichmäßigen Epithelschluss über den
Kollagenmembranen. Klinisch konnte ebenfalls eine gute Verträglichkeit des Materials und
eine Unterstützung der Heilung festgestellt werden.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass Membranen aus equinem Kollagen Typ I als
Wachstumsunterlage für epitheliale Stammzellen geeignet sind und eine gute
Biokompatibilität in-vivo aufweisen. Durch quervernetzende Maßnahmen kann der Erhalt an
der Augenoberfläche verlängert werden, was in Abhängigkeit von der zugrundeliegenden
Hornhauterkrankung ein durchaus gewünschter und auf die Heilung sich positiv auswirkender
Effekt sein könnte. Die Verwendung als Implantat zur Defektdeckung nicht heilender
Ulzeration könnte durch weitere Anwendungen an der Augenoberfläche, wie die Verwendung
als Träger für kultivierte epitheliale Stammzellen bei der Behandlung der
Limbusstammzellinsuffizienz, ergänzt werden. Weitere mögliche Modifikationen, wie
strukturgebende Oberflächenbehandlungen oder das Einbringen von bioaktiven Substanzen
zur Verbesserung von Zellproliferation, -migration und -adhäsion, könnten Membranen aus
equinem Kollagen Typ I zu einer Alternative zur Amnionmembran werden lassen.
Abkürzungsverzeichnis
3
Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AM Amnionmembran AMT Amnionmembrantransplantation Aqua bidest. Aqua bidestillata (bidestilliertes Wasser) bzw. beziehungsweise ca. circa Chigh quervernetzte Kollagenmembranvariante mit hohem
Riboflavinanteil Clow quervernetzte Kollagenmembranvariante mit niedrigem
Riboflavinanteil cm Zentimeter cm2 Quadratzentimeter Cnon nicht-quervernetzte Kollagenmembranvariante °C Grad Celsius DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium dpt. Dioptrie Ham`s F12 Flüssigmedium mit Nährstoffen E Epithel EM Elektronenmikroskop et al. et alteri (und andere) Fa. Firma FCS Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum) g Gramm ggf. gegebenenfalls HCGS human corneal growth supplement (cornealer
Wachstumszusatz) HE Hämalaun-Eosin hEGF human epidermal growth factor (epidermaler
Wachstumsfaktor) H2O Wasser i. m. intramuskulär i. v. intravenös J Joule K3/76 Cytokeratin 3/Cytokeration 76 K4 Cytokeratin 4 K15 Cytokeratin 15 KM Kollagenmembran LM Lichtmikroskop LSZ Limbusstammzellen LSZI Limbusstammzellinsuffizienz mg Milligramm µg Mikrogramm min Minute
Abkürzungsverzeichnis
4
ml Milliliter mm Millimeter µm Mikrometer NaCl Natriumchlorid ng Nanogramm NZW New Zealand white rabbits OCT optimal cutting temperature compound OP Operation(en) PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung) PFA Paraformaldehyd PMC postmitotic cells (postmitotische Zellen) p/p-Wert Signifikanzwert, Wahrscheinlichkeit rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur S Stroma sek Sekunde sog. sogenannt Tab. Tabelle TAC transient amplifying cells (transient amplifizierende Zellen) TDC terminally differentiated cells (ausdifferenzierte Zellen) u. a. unter anderem v. a. vor allem z. B. zum Beispiel λ Wellenlänge % Prozent
Einleitung
5
1 Einleitung Das Sehen ist neben dem Hören die wichtigste Informationsaufnahme für den Menschen und
der erste Schritt bei der Verarbeitung von visuellen Reizen. Sowohl in unserer natürlichen als
auch in der vom Menschen geschaffenen Umwelt sind wir stark auf die visuelle Wahrnehmung
angewiesen, sodass eine Verschlechterung des Sehens oder gar eine Erblindung zur starken
Einschränkung der Lebensqualität führen. Zu den häufigsten Ursachen von Sehverminderung
und Erblindung gehören Erkrankungen der Augenoberfläche (Whitcher et al., 2002). Diese
können zur Trübung der Hornhaut und im schlimmsten Fall zu persistierenden
Hornhautepitheldefekten mit Ulzerationen führen, welche die Betroffenen aufgrund der
daraus resultierenden verminderten Sehleistung und der Schmerzen stark einschränken.
Eine Therapie dieser Defekte gestaltet sich schwierig. Operativ wird meist eine
Amnionmembran- oder eine komplette Hornhauttransplantation angewendet. Allerdings ist
die Amnionmembran nicht uneingeschränkt verwendbar, da es sich um biologisches Material
handelt und somit sowohl die Gefahr der Keimübertragung besteht als auch die Verfügbarkeit
und die Lagerung eingeschränkt sind. Spenderhornhäute unterliegen denselben
Einschränkungen wie die Amnionmembran. Außerdem führen Hornhauttransplantationen in
stark entzündeten Augen häufig zum Verlust des Transplantats. Der Bedarf an neuen
Materialen zur Behandlung von Hornhautdefekten ohne gravierende Nebenwirkungen ist
folglich hoch.
In dieser Arbeit wurde eine neue, semisynthetische Kollagenmembran zur Rekonstruktion und
Regeneration der Augenoberfläche untersucht. Hierbei wurden verschiedene modifizierte
Varianten der Kollagenmembran in der Zellkultur und am Tiermodell getestet und mit dem
bestehenden System der Amnionmembran verglichen. Abschließend wurde mit einer
ausgewählten Variante der Kollagenmembran eine klinische Anwendungsbeobachtung an
Patienten durchgeführt. Die Methoden und Ergebnisse werden im Folgenden beschrieben.
Einleitung
6
1.1 Anatomie des Auges
Der Augapfel liegt in der Augenhöhle und wird von Muskeln und Fettpolstern gehalten. Die
äußerste Schicht des Auges, die Lederhaut (Sclera), besteht aus festem Bindegewebe, dient
dem Schutz und sorgt für Stabilität. Im vorderen Bereich des Auges wird die Sclera von der
durchsichtigen Hornhaut (Cornea) abgelöst. Letztere ermöglicht den Lichteinfall ins Innere.
Die Hülle des Augapfels wird zusätzlich ergänzt durch die gefäßreiche Aderhaut (Choroidea)
und die Netzhaut (Retina) am Augenhintergrund. In der Retina befinden sich zahlreiche
lichtempfindliche Photorezeptoren und Nervenzellen. Die Reaktionen der Photorezeptoren
auf Lichtreize werden zunächst von den verschiedenen Neuronen verarbeitet und schließlich
über die Ganglienzellen an den Sehnerv und an das Gehirn weitergeleitet. Die Versorgung der
Retina mit Nährstoffen wird durch die Aderhaut gewährleistet.
Im Inneren des Auges befinden sich die Regenbogenhaut (Iris) mit der größenverstellbaren
Pupille, der Ziliarkörper, die Linse und der Glaskörper. Die klare Linse sitzt direkt hinter der
Pupille und verfügt über keinerlei Blutgefäße oder Nerven. Zwischen der Linse und der
Hornhaut befinden sich die vordere und die hintere Augenkammer. Beide Kammern sind mit
Kammerwasser gefüllt, welches ständig vom Ziliarkörperepithel produziert wird und die
Versorgung der Linse und der Hornhaut mit Nährstoffen sicherstellt. Das Augeninnere hinter
der Linse wird vom Glaskörper ausgefüllt. Dessen gallertartige Konsistenz erhält zum einen die
Form des Augapfels aufrecht und sorgt zum anderen für einen gleichbleibenden Druck auf die
Netzhaut, die Aderhaut und die Lederhaut.
Die Linse ist über die Zonulafasern am Ziliarkörper befestigt, und mithilfe dieser Aufhängung
kann die Brechkraft geändert werden. Sobald der Zug der Zonulafasern durch die Kontraktion
des Ziliarmuskels nachlässt, wölbt die Linse sich stärker, wodurch ihre Brechkraft erhöht wird.
Direkt vor der Linse reguliert die Iris den Lichteinfall ins Innere des Auges. Sie ist durch die
transparente Hornhaut sichtbar und stellt eine Verlängerung der Aderhaut da. Das Weiten
und Zusammenziehen der Iris steuert die Lichtintensität, die auf die photosensitive Retina
trifft. Der auftreffende Lichtreiz wird von den zwei Photorezeptortypen in der Retina
wahrgenommen, verarbeitet und über den Sehnerv in den visuellen Cortex zur Bilddarstellung
weitergeleitet (Campbell, 2009, Grehn, 2008).
Einleitung
7
1.1.1 Die Cornea
Die Cornea ist der vordere Teil der äußeren Augenhaut und hauptverantwortlich für scharfes
Sehen. Häufig wird sie auch als das „Fenster zur Welt“ bezeichnet, da sie den Einfall des Lichts
und somit auch das Sehen ermöglicht. Neben ihrer Transparenz ist die hohe Brechkraft
entscheidend für eine scharfe Abbildung der Umgebung. Verantwortlich hierfür ist zum einen
der Unterschied zwischen den Brechungsindizes der Luft (1,0) und der Hornhaut (1,33) als
auch die Wölbung der Cornea. Dadurch entsteht eine Brechkraft von 43 Dioptrien. Die
Kombination von Transparenz, gleichmäßiger Oberfläche und Brechungskraft ist
Voraussetzung für die scharfe Abbildung der Umwelt auf der Retina (Grehn, 2008). Der Aufbau
und die Funktion der Cornea werden im Folgenden beschrieben.
1.1.1.1 Aufbau und Struktur der Cornea
Die Cornea ist im Zentrum 500 µm dick und nimmt in die Peripherie hin auf 700 µm zu. Ihr
Durchmesser beträgt ca. 10–13 mm. Der Aufbau der Cornea ist anhand eines Querschnitts in
Abb. 1 dargestellt.
Einleitung
8
Abbildung 1: Aufbau der Cornea Die transparente Cornea begrenzt das Auge an der Vorderseite. Sie besteht aus fünf Schichten: dem Epithel, der Bowman-Lamelle, dem Stroma, der Descemet-Membran und dem Endothel.
Die Hornhaut setzt sich aus insgesamt fünf Schichten zusammen: dem Epithel, der Bowman-
Lamelle, dem Stroma, der Descemet-Membran und dem Endothel.
Die äußerste Schicht besteht aus einem mehrschichtigen, nichtverhornten Epithel und ist etwa
40–60 µm dick. Dieses Epithel dient als Schutzschicht der Hornhaut und verhindert das
Eindringen von Bakterien und Fremdstoffen. Außerdem stellt sie die Versorgung des Auges
mit Sauerstoff und Nährstoffen sicher. Die Funktion als Schutzschild wird durch die
vorhandenen Nerven zusätzlich unterstützt. Die Innervation der Hornhaut ist ausgesprochen
sensibel und essentiell für die Aufrechterhaltung der Funktion. So macht sie auf Verletzungen
aufmerksam und unterstützt die gleichmäßige Benetzung der Oberfläche mit
Tränenflüssigkeit, indem sie den Lidschlag auslöst. Bei einer verminderten Sensibilität wird das
Aufreißen des Tränenfilms und somit die mangelhafte Befeuchtung des Auges nicht oder zu
spät bemerkt. Die dadurch entstehenden Läsionen des Epithels können zum Eindringen von
Bakterien führen.
Die Regeneration des Epithels erfolgt konstant von der Peripherie zum Zentrum.
Abgestorbene Zellen werden an der Oberfläche abgeschilfert und durch die Tränenflüssigkeit
entfernt. Für die vollständige Funktion des Epithels ist eine stabile Befestigung der
Einleitung
9
Epithelzellen am Stroma erforderlich. Diese Verankerung erfolgt über die basale Zellschicht.
Sie sorgt außerdem für die notwendige Stabilität gegen mechanische Reize.
Die Befestigung des Epithels wird von einer kollagenen Bindegewebsschicht geleistet: der
Bowman-Lamelle. Diese gehört bereits zum Stroma und besteht größtenteils aus Kollagen,
welches sich mit Proteoglykanen zu Fibrillen verbindet und eine stabile Schicht bildet.
Das corneale Stroma stellt mit 400–500 µm die dickste Schicht der Hornhaut dar. Es besteht
vorwiegend aus Kollagenfasern des Typs I (90%) und III (10%) und Keratozyten. Keratozyten
befinden sich normalerweise vereinzelt im Stroma, können sich aber im Fall einer Verletzung
vermehren. Hierfür werden sie in Fibroblasten umgewandelt und sind in der Lage, Kollagene
und Proteoglykane zu produzieren, welche dann die Wunde verschließen. Um die Transparenz
aufrecht zu erhalten, verfügen das Stroma, wie auch alle anderen Schichten der Cornea, über
keinerlei Blutgefäße. Entscheidend für die Transparenz ist außerdem eine exakte Anordnung
der Kollagenfibrillen. Kollagenpeptide lagern sich zu Fibrillen zusammen, die sich in der
Hornhaut parallel verlaufend in Lamellen anordnen. Diese Lamellen wiederum sind
schichtweise übereinander gelagert, wobei die jeweilige Laufrichtung der Kollagenfibrillen
sich von Lamelle zu Lamelle mit einem Winkel von ca. 90° dreht. Dadurch entsteht ein
regelmäßiges Gitter, welches sich nicht nur durch hohe Transparenz, sondern auch durch
Stabilität auszeichnet. Nach Verletzungen kann diese Anordnung bei der Heilung häufig nicht
mehr hergestellt werden, sodass es zur Narbenbildung kommt, welche zu einer Trübung und
somit zur Beeinträchtigung des Sehens führt.
Direkt an die Unterseite des Stromas grenzt die Descemet-Membran. Sie ist aus elastischen
Fasern aufgebaut und äußerst widerstandsfähig. Neben ihrer Funktion als Schutzschicht für
das Endothel gegen Infektionen oder mechanische Verletzungen verhindert sie ein Aufquellen
des Stromas durch Kammerwasser.
Den Abschluss der Cornea zum Augeninneren bildet eine einschichtige Zellschicht: das
Endothel. Die Endothelzellen sind hexagonal und regelmäßig angeordnet. Zellteilungen finden
nur in den ersten Lebensmonaten statt, mit steigendem Alter nimmt die Dichte der Zellen von
ca. 3500 Zellen/mm2 auf 2500 Zellen/mm2 ab. Abgestorbene Zellen werden durch
Formveränderungen ausgeglichen, sodass die Descemet-Membran konstant mit Zellen
bedeckt ist. Diese vollständige Abdeckung der Descemet-Membran ist wichtig für die
Aufrechterhaltung der Funktion der Zellen. Sie regulieren den Austausch von
Einleitung
10
Stoffwechselprodukten zwischen Kammerwasser und Stroma und sind aktiv am Stoffwechsel
beteiligt. Ihre Hauptfunktion ist allerdings das Abpumpen von eingedrungenem
Kammerwasser aus dem Hornhautstroma. Hierbei wird das Wasser aus dem Stroma durch
aktiven Ionentransport abgepumpt. Fällt die Pumpfunktion des Endothels aus, z. B. aufgrund
einer Verletzung oder zu geringer Zelldichte (ab 700 Zellen/mm2), bilden sich
Wassereinlagerungen im Stroma. Dieses Wasser führt dann zur Quellung des Stromas und
somit zur Trübung (Forrester, 2008; Grehn, 2008).
1.1.1.2 Regeneration des Corneaepithels
Wie schon im vorangegangen Kapitel beschrieben, sind für eine klare und transparente Cornea
zahlreiche Faktoren entscheidend. Neben der Anordnung der Kollagenfasern und der präzisen
Abstimmung der Hydration durch ein intaktes Endothel ist vor allem ein funktionsfähiges
Epithel essentiell (Benedek, 1971; Maurice, 1957). Der Mechanismus der Zellerneuerung und
die verantwortlichen Stammzellen der Epithelzellen werden in den folgenden Abschnitten
dargestellt.
1.1.1.2.1 Eigenschaften und Besonderheiten von Stammzellen
Stammzellen sind unspezialisierte Zellen, die sich unter geeigneten Bedingungen unbegrenzt
vermehren bzw. sich zu einem oder mehreren Zelltypen differenzieren können. Man
unterscheidet hierbei zwischen pluripotenten Stammzellen, welche unterschiedliche Zellen
eines Gewebes bilden und monopotenten Stammzellen, die nur zu einer Zellart
ausdifferenzieren. Letztere erhalten ihre eigene Population aufrecht und ersetzen gleichzeitig
abgestorbene, ausdifferenzierte Zellen. Um dieser Aufgabe gerecht zu werden, verfügen sie
über ein hohes Proliferationspotential. Allerdings teilen sie sich im gesunden Gewebe eher
selten, um Replikationsfehler in der DNA gering zu halten. Eine verstärkte Teilungsrate wird z.
B. durch Verletzungen ausgelöst (Campbell, 2009).
Um den Stammzellcharakter zu erhalten und eine vorzeitige Differenzierung zu verhindern,
befinden sich die Stammzellen in einer bestimmten, von äußeren Einflüssen geschützten
Einleitung
11
Umgebung. Diese sog Stammzellnische ist auf die Bedürfnisse der Stammzellen abgestimmt
und verhindert deren Differenzierung (Schofield, 1983). In ihr liegen die Stammzellen zum
einen geschützt, werden aber auch gleichzeitig mit Nährstoffen und Informationen versorgt
(Kruse, 1994).
Die Teilung und Vermehrung der Limbusstammzellen unterscheidet sich von der Zellteilung
anderer Körperzellen. Um ihre Stammzelleigenschaften nicht zu verlieren, müssen die
Stammzellen bei der Teilung einerseits differenzierte Zellen bilden, andererseits aber auch
sich selbst erhalten. Durch eine asymmetrische Zellteilung wird genau diese Aufspaltung
gewährleistet. Dabei entstehen aus einer Stammzelle zwei unterschiedliche Tochterzellen.
Während die eine Zelle die Stammzelleigenschaften behält, reift die andere über verschiedene
Vorläuferzellen zur ausdifferenzierten Zelle heran. Die Differenzierung dieser Tochterzelle zu
einer bestimmten Zellart wird hierbei sowohl durch Veränderungen der Umgebung als auch
durch zelleigene Mechanismen (Proteine, chronologische Faktoren) beeinflusst (Campbell,
2009; Watt and Hogan, 2000).
1.1.1.2.2 Stammzellen der Hornhaut – Funktion des Limbus und Migration der Stammzellen
Die Stammzellen des cornealen Epithels befinden sich geschützt zwischen den Vogt`schen
Palisaden am Limbus (Abb. 2A). Im Gegensatz zur restlichen Hornhaut ist dieser Bereich stark
vaskularisiert, um die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Wachstumsfaktoren zu
gewährleisten (Zieske, 1994). Außerdem sind die umgebenden Zellen teilweise pigmentiert,
sodass die Stammzellen zusätzlich vor Sonnenlicht geschützt sind (Dua et al., 2005).
Bei der asymmetrischen Teilung der Stammzellen entstehen Vorläuferzellen, die sogenannten
„transient amplifying cells“ (TACs), welche, im Fall einer Verletzung bzw. während der
normalen Zellerneuerung, zentripetal zum Zentrum der Hornhaut wandern und
währenddessen ausdifferenzieren. Charakteristisch für diese Vorläuferzellen ist ein geringer
Grad der Differenzierung bei gleichzeitig hoher Proliferationsfähigkeit. Diese gewährleistet
weitere Teilungen während der Migration über die Cornea zu postmitotischen Zellen (post-
mitotic cells (PMCs)) welche schließlich zu spezialisierten Zellen (terminally differentiated cells
(TDCs)) ausdifferenzieren (Kruse, 1994) (Abb. 2B)
Einleitung
12
Abbildung 2: Regeneration des cornealen Epithels (A) Die Stammzellen (SC) für das Hornhautepithel befinden sich am Rand der Cornea zwischen den Vogt`schen Palisaden (Pfeile). (B) Nach der asymmetrischen Teilung wandern die Vorläuferzellen (transient amplifying cells (TACs)) zentripetal zum Zentrum der Cornea und differenzieren währenddessen zu Epithelzellen (terminally differentiated cells (TDCs)) aus (A: modifiziert nach (Oie and Nishida, 2013)).
1.1.1.2.3 Funktionsverlust des Limbus und Therapiestrategien
Wie in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben, dient der Limbus als Stammzellnische
für das Hornhautepithel. Daneben hat er allerdings noch eine weitere Aufgabe. Er stellt eine
Barriere zum Bindehautepithel dar und verhindert das Eindringen von Zellen aus anderen
Zellpopulationen (Lavker et al., 2004).
Mechanische, chemische oder thermische Verletzungen, operative Eingriffe, immunologische
Erkrankungen oder Infektionen sind einige Gründe, die zum Funktionsverlust der limbalen
Stammzellen führen können. Dieser Funktionsverlust verhindert nicht nur die Regeneration
des Hornhautepithels, sondern hebt auch die Barrierefunktion des Limbus auf. Ohne diese
Barriere zwischen Cornea und Conjunctiva (Bindehaut) wird die transparente Hornhaut in
Ermangelung an Epithelzellen von Bindehautzellen überwachsen (Shapiro et al., 1981). Diese
Zellen bilden eine undurchsichtige, von Blutgefäßen durchzogene Schicht und verhindern so
eine klare Sicht.
Einleitung
13
Diese Konjunktivalisierung verursacht häufig zusätzlich eine chronische Entzündung des
Stromas und einen Abbau der Basalmembran mit daraus resultierenden Vernarbungen und
persistierenden Hornautulzerationen. Neben dem verminderten Sehvermögen leiden die
Patienten unter erhöhter Lichtempfindlichkeit und starken Schmerzen.
Hornhauttransplantationen als Therapie führen bei dieser Patientengruppe zu keiner
Verbesserung des Krankheitsbilds, da hierbei nur die klare Hornhaut und keine Stammzellen
übertragen werden. Ohne die Stammzellen kann kein gesundes Hornhautepithel erhalten
werden, sodass ein erhöhtes Risiko der Abstoßung und erneute Vaskularisierung besteht.
(Gruterich and Tseng, 2002)
Alternative, mehr Erfolg versprechende Therapieansätze sind die Transplantation von
gesundem Limbusgewebe (Kenyon and Tseng, 1989; Tsai and Tseng, 1994). In leichteren Fällen
reicht manchmal auch die Entfernung des konjunktivalisierten Hornhautepithels (superfizielle
Keratektomie), sodass gesunde Epithelzellen über das freigelegte Stroma wachsen können.
Bei der Transplantation von Limbusgewebe und Limbusstammzellen kann entweder auf das,
falls vorhandene, gesunde Auge zurückgegriffen werden (Autograft) oder auf Spendergewebe
von Verwandten oder Verstorbenen (Allograft). Für die autologe Transplantation wird
gesundes Limbusgewebe am Partnerauge des Empfängers entnommen und in das
freipräparierte erkrankte Areal überführt. Vorteil ist hierbei, dass es aufgrund des
Eigengewebes nicht zu einer immunologischen Abstoßungsreaktion kommt. Die allogene
Transplantation erfolgt nach demselben Muster. Beide Verfahren bergen allerdings das Risiko,
im Spenderauge selbst eine Limbusstammzellinsuffizienz aufgrund der Gewebeentnahme
auszulösen. Außerdem besteht immer die Gefahr von Infektionen und Vernarbung der
Spenderhornhaut. Bei der allogenen Transplantation ist außerdem noch eine
Immunsuppression notwendig.
Eine weitere Möglichkeit stellt die Transplantation von ex vivo kultivierten Stammzellen auf
Trägermaterialien mit anschließender Transplantation dar (Tsai et al., 2000). Neben limbalen
Stammzellen werden auch Mundschleimhautstammzellen erfolgreich zur Rekonstruktion der
Augenoberfläche in der klinischen Ophthalmologie angewendet (Madhira et al., 2008;
Nakamura et al., 2004). Sie sind im Gegensatz zu limbalen Zellen besser verfügbar und bergen
nicht das Risiko, eine Limbusstammzellinsuffizienz zu induzieren.
Einleitung
14
Als Träger für die Stammzellen sind verschiedene Materialien wie die Amnionmembran oder
Biomaterialien aus Fibrin oder Kollagen geeignet. Auf die verschiedenen Materialien wird in
Kapitel 1.2 näher eingegangen.
1.1.2 Das Kaninchenauge
Tierversuche sind in der heutigen Forschung noch immer unersetzlich. Mithilfe von
Untersuchungen an Zellkulturen können zwar bereits wichtige und gute Ergebnisse erzielt
werden, eine Aussage über die Auswirkungen auf den gesamten Organismus kann damit aber
leider (noch) nicht gewonnen werden. Die Kommunikation zwischen Zellen im natürlichen
Gewebeverband bzw. das Zusammenspiel vieler einzelner Reaktionen im Organismus lassen
sich nur mit Zellkulturen nicht ausreichend untersuchen und wiedergeben. Die Anwendung
der Kollagenmembranen im Tiermodell war somit unerlässlich, insbesondere im Hinblick auf
die klinische Anwendungsbeobachtung, um zuverlässige Aussagen über das Verhalten und die
Auswirkungen des Materials in der Hornhaut zu treffen.
Im Gegensatz zu den Augen der gängigen Tiermodelle Maus und Ratte, ist das Auge des
Kaninchens in Form und Größe dem menschlichen Auge sehr ähnlich. Die Größe erleichtert
außerdem die operativen Tätigkeiten und ermöglicht eine bessere Übersicht über das
Operationsfeld. Im Vergleich zum Schwein, welches ebenfalls häufig in der Ophthalmologie
verwendet wird, ist zudem die Handhabung von Kaninchen verhältnismäßig leicht. Auch die
Durchführung der Narkose ist einfach und ohne zusätzliche Beatmung und Überwachung
möglich. Außerdem ist das Kaninchen als Tiermodell in der Ophthalmologie etabliert und gut
beschrieben, sodass die Interpretation der Ergebnisse erleichtert wird.
Insgesamt ist das Kaninchenauge dem menschlichen Auge morphologisch und physiologisch
sehr ähnlich, größere Unterschiede finden sich vor allem im hinteren Augenabschnitt bei der
Vaskularisation der Retina. Im vorderen Teil des Auges variieren lediglich die
Größenverhältnisse leicht. So weist die Hornhaut eine etwas geringere Dicke (300–400 µm)
auf als die menschliche (500 µm zentral, 700 µm peripher), der Aufbau und das
Dickenverhältnis der einzelnen Schichten ist allerdings gleich (Davis, 1929; Gelatt, 2007).
Einleitung
15
Trotz der Gemeinsamkeiten sollte nicht außer Acht gelassen werden, dass es sich beim
Kaninchen um eine andere Spezies handelt und man somit bei der Übertragbarkeit der in-vivo-
Ergebnisse auf das menschliche Auge Vorsicht walten lassen muss. Bei Hund, Schwein und
Kaninchen konnten z. B. deutliche Interspeziesvariationen bei Untersuchungen am Auge
nachgewiesen werden (Gilman, 1982). Bei Behandlungen an der Augenoberfläche, wie sie im
Rahmen dieser Arbeit auch erfolgten, ist deshalb auf folgende Besonderheiten des
Kaninchenauges zu achten: das Kaninchen verfügt über ein drittes Augenlid, welches aus
Bindehaut und Knorpel besteht und dadurch eine erhöhte Festigkeit aufweist. Es kann zum
Schutz zusätzlich über die Hornhaut gezogen werden (Simoens, 2004) und so eine Reibung auf
einem Transplantat verursachen. Außerdem unterscheidet sich die Zusammensetzung des
Tränenfilms von der des menschlichen, was zu einem reduzierten Blinzelreflex beim
Kaninchen führt (Swanston, 1985). Des Weiteren ist zu beachten, dass bei einer
Traumatisierung des Auges eine stärkere Gewebs- und Immunreaktion als beim Menschen zu
erwarten ist (Klein and Bito, 1983). Dieser Umstand stellt allerdings bei unseren
Untersuchungen einen Vorteil dar, da so eine sensiblere Beurteilung der Biokompatibilität der
transplantierten Kollagenmembranen möglich ist.
Abschließend lässt sich noch anmerken, dass sich die Ergebnisse eines Tierversuchs, trotz aller
Gemeinsamkeiten, nie vollständig auf den Menschen übertragen lassen und die Interpretation
sehr sorgfältig und genau erfolgen muss.
1.2 Erkrankungen der Augenoberfläche und deren Therapie
Erkrankungen der Augenoberfläche können verschiedene Gründe haben. So können sowohl
mechanische Ursachen als auch verschiedene Krankheitserreger zu einer Störung des
empfindlichen Gleichgewichts der Hornhautoberfläche führen.
Einleitung
16
1.2.1 Entstehung von Hornhautulzerationen
Das Hornhautepithel bildet die oberste Schicht der Cornea und schützt das Auge vor
Krankheitserregern. Eine Schädigung des Epithels kann schwerwiegende Folgen für die
Hornhaut und infolge dessen auch für ihre Transparenz haben.
Mechanische Verletzungen, Verätzungen, Entzündungen bakteriellen, viralen oder
mykotischen Ursprungs, die Austrocknung des Auges oder trophische Ursachen können zu
einer Entzündung der gesamten Hornhaut führen. Ohne den Schutz des Epithels wird das
Stroma durch Kollagenasen im Tränenfilm angegriffen und es kommt zum Abbau und Zerfall
des Gewebes (siehe Abb. 3). Diese Ulzerationen können im Verlauf der Erkrankung immer
tiefer ins Gewebe fortschreiten, zur Perforation der Hornhaut führen und einen Verlust des
Auges zur Folge haben. Außerdem wird die Lebensqualität der Betroffenen aufgrund des
Sehverlusts und der Schmerzen stark eingeschränkt.
Abbildung 3: Persistierende Hornhautulzeration Chronische Entzündungen der Lider und der Bindehaut verursachten eine therapieresistente Ulzeration im Zentrum der Cornea.
Therapiert werden diese krankhaften Veränderungen meist zunächst konservativ mit den
entsprechenden Augentropfen. Die Therapie muss dabei gründlich erfolgen, um
Sekundärinfektionen und ein Fortschreiten der Ulzeration zu verhindern (Grehn, 2008).
1.2.2 Operative Therapiemöglichkeiten
Zur Behandlung von fortgeschrittenen Ulzerationen bleibt meist nur eine
Hornhauttransplantation (Keratoplastik). Hierbei wird das ulzerierte Gewebe entfernt und
Einleitung
17
durch eine Spenderhornhaut ersetzt. Bei weniger schwer ausgeprägten Erkrankungen kann
häufig eine Amnionmembrantransplantation den Krankheitsprozess aufhalten und eine
Heilung der Augenoberfläche herbeiführen. Die Methodik der
Amnionmembrantransplantation wird im folgenden Abschnitt genauer erläutert.
1.2.3 Die Amnionmembrantransplantation
Die Fruchtblase, in der der Fötus umgeben von Fruchtwasser liegt, ist aus verschiedenen,
miteinander verbundenen Schichten aufgebaut (siehe Abb. 4). Die innerste, dem Fötus
zugewandte, gefäßfreie Schicht wird als Amnionmembran, die äußere als Chorion bezeichnet.
Zur Embryoseite hin entwickelt sich eine Epithelschicht, die kindlichen Ursprungs ist
(Benninghoff, 2014).
Einleitung
18
Abbildung 4: Die Amnionmembran Die Amnionmembran kleidet die Fruchtblase vollständig aus und ist mit fötalem Epithel bedeckt (modifiziert nach (Benninghoff, 2014)).
Eine therapeutische Anwendung der Amnionmembran wurde zunächst zur oberflächlichen
Wundbehandlung an der Haut beschrieben (Davis, 1910). Die Therapie von Epitheldefekten
mit Amnionmembran im Auge wurde erstmals von Kim und Tseng 1995 (Kim and Tseng, 1995)
genauer untersucht. In den Jahren darauf wurden die Methoden zur Standardisierung der
Nabel-schnur
Amnion-membran
Plazenta
Chorion
Einleitung
19
Präparation weiterentwickelt, sodass sich die Therapie mit der Amnionmembran weltweit
durchsetzte.
Zur Regeneration der Augenoberfläche kann die Amnionmembran je nach Krankheitsbild auf
verschiedene Art und Weise angewandt werden. So kann sie als Transplantat (graft) in den
Hornhautdefekt eingesetzt werden oder als Verband (patch) über die Hornhaut gespannt
werden (siehe Abb. 5) (Kruse et al., 1999; Lee and Tseng, 1997).
Abbildung 5: Anwendung der Amnionmembran bei Oberflächendefekten der Cornea Die Amnionmembran kann sowohl als Verband über der gesamten Hornhaut, als auch, z. B. bei tieferen Ulzerationen, als mehrlagiges Transplantat angewendet werden.
Nach der Transplantation wird die Amnionmembran im Lauf der Zeit abgebaut und durch
körpereigenes Kollagen und Gewebe ersetzt. Die Abbaugeschwindigkeit kann hierbei stark
variieren und ist abhängig von der Membran, der Disposition des Patienten und der
ursprünglichen Erkrankung (Kruse et al., 2000).
Die häufige und erfolgreiche Anwendung der Amnionmembran ist vor allem in ihrer
biologischen Wirksamkeit begründet. Auch ohne eine spezielle Vorbehandlung verfügt die
Membran über zahlreiche Eigenschaften, die die Heilung des umliegenden Gewebes positiv
beeinflussen (Tseng et al., 2004).
So wirkt die Amnionmembran antiinflammatorisch und führt zur Reduktion von
Entzündungen. Zum einen geht dies zurück auf den mechanischen Schutz gegen das
Eindringen von Leukozyten in die Wunde und gegen das Abtragen von neugebildetem Epithel
durch die Reibung beim Lidschlag (Azuara-Blanco et al., 1999). Zum anderen unterdrückt die
Amnionembran die Bildung von entzündungsfördernden Signalstoffen und enthält selbst
antientzündliche Zytokine (Hao et al., 2000; Solomon et al., 2001).
Einleitung
20
Neben der antiinflammatorischen Wirkung wurden außerdem noch antiangiogene,
antimikrobielle und antifibrotische Eigenschaften bei der Amnionmembran beschrieben (Dua
et al., 2004; Gomes et al., 2005; Tseng et al., 2004) . Diese Eigenschaften werden auf das
Vorkommen von antiangiogenen Faktoren zurückgeführt, wie Pigment Epithelium Derived
Factor (PEDF) (Shao et al., 2004) und Thrombospondin-1 (Ma et al., 2006), die Unterdrückung
der Myofibroblastenbildung (Choi and Tseng, 2001) und die enge Bindung der Membran an
die Wundoberfläche (Talmi et al., 1991).
Außerdem wurde das Vorhandensein verschiedener Wachstumsfaktoren wie z. B. EGF
(Epidermal Growth Factor), NGF (Nerve Growth Factor), KGF (Keratinocyte Growth Factor)
und TGF-β (Transforming Growth Factor) bestätigt (Koizumi et al., 2000).
Eine weitere positive Eigenschaft der Amnionmembran ist ihre immunmodulatorische
Wirkung. So können nach einer Amnionmembrantransplantation keine bzw. kaum
Abstoßungsreaktionen gegen das körperfremde Gewebe beobachtet werden (Ueta et al.,
2002).
Da es sich bei der Amnionmembran um menschliches Gewebe handelt, ist ihre Verwendung
allerdings auch mit einigen profunden Nachteilen verbunden. Einschränkungen bestehen z. B.
bei ihrer Verfügbarkeit, da potentielle Spender genau festgelegten Standards unterworfen
sind. Das Material muss auf alle gängigen Infektionskrankheiten (HIV, Hepatitis u.a.) negativ
getestet sein und kann nur nach einer Kaiserschnittgeburt gewonnen werden, da es bei einer
natürlichen Geburt zu Kontaminationen im Geburtskanal kommt.
Außerdem besteht eine große qualitative Variabilität in Bezug auf Dicke und Struktur der
Amnionmembran sowohl zwischen den Spendern als auch innerhalb einer Amnionmembran.
Ein weiteres Problem stellt der Umgang mit der Amnionmembran bis zur Verwendung dar. So
müssen zum einen die biologischen Eigenschaften der Membran bewahrt werden, zum
anderen müssen Kontaminationen verhindert werden. Zudem sind weder die Gewinnung
noch der Transport und die Lagerung standardisiert, sodass auch die unterschiedliche
Handhabung einen Einfluss auf die Eigenschaften der Amnionmembran haben kann.
Die Therapie mit der Amnionmembran verfolgt in erster Linie die Wundheilung der Hornhaut.
Ist die Entzündung durch die Amnionmembrantransplantation abgeklungen und ein
geschlossenes Epithel entstanden, kann im Anschluss im reizfreien Auge eine Keratoplastik
durchgeführt werden. Die Vorteile einer Keratoplastik nach der Amnionmembran liegen
Einleitung
21
hierbei auf der Hand. So wird bei einem gesunden Epithel zum einen eine schnellere Heilung
als bei einem erkrankten eintreten, zum anderen ist die Prognose des Hornhauttransplantats
bezüglich einer Abstoßungsreaktion besser und die Behandlung verspricht dadurch eher einen
dauerhaften Erfolg (Seitz, 2007).
Neben den operativen Anwendungen kann die Amnionmembran auch als
Wachstumsunterlage für Epithelzellen verwendet werden (Pellegrini et al., 1997). Ziel ist es
hierbei, eine vollständige Hornhautepithelschicht mit möglichst vielen Stammzellen zu
züchten und diese anschließend mit der Wachstumsunterlage ins erkrankte Auge zu
transplantieren. Die gesunden Stammzellen des Transplantats sollen die geschädigten
Stammzellen ersetzen und eine dauerhafte, gesunde Epithelialisierung ermöglichen.
Die Ergebnisse der dieser ex-vivo-Transplantationen waren vielversprechend, allerdings zeigte
sich schnell, dass für eine erfolgreiche Kultivierung der Limbusstammzellen zahlreiche
Faktoren (u. a. Zusammensetzung des Mediums, Kultivierungsbedingungen, Gewinnung der
Zellen) ausschlaggebend sind. Eine einheitliche Methode zur Kultivierung von
Limbusstammzellen und zur Behandlung von Limbusstammzellinsuffizienz ist bis heute noch
nicht etabliert worden.
1.3 Tissue Engineering – alternative Materialien zur Amnionmembran
Da sich die Amnionmembran sowohl in der klinischen Anwendung als auch in der Zellkultur
bewährt hat, haben das Interesse daran und ihre Verwendung stetig zugenommen (Tseng et
al., 2004). Allerdings rückten damit auch ihre Nachteile weiter in den Fokus. Gleichzeitig
entwickelte sich auch das Tissue engineering weiter und neue, risikoärmere und
standardisierte Materialen konnten hergestellt werden. Unter Tissue engineering versteht
man die künstliche Herstellung biologischen Gewebes, welches krankes Gewebe im Patienten
ersetzt oder regeneriert und dessen Funktion übernehmen kann, also biologisch aktiv ist.
Beim Tissue engineering werden zunächst Zellen entnommen und im Labor (in vitro) vermehrt.
Die Kultivierung kann entweder als Zellrasen oder auf einem dreidimensionalen Gerüst,
welches der Form des späteren Organs entspricht, erfolgen. Anschließend erfolgt eine
Retransplantation mit dem Ziel, die Gewebefunktion zu erhalten oder wiederherzustellen.
Vorteile beim Tissue engineering sind Sterilität, keine immunologischen Abwehrreaktionen
Einleitung
22
und keine Wartezeit auf Spendermaterial. Wichtig für die Funktion des neuen Gewebes und
des gesamten Organismus ist hierbei, dass das Biomaterial den Empfänger nicht schädigt,
sondern unterstützt, und biologische Aktivität aufweist. Es muss in das umgebende Gewebe
integriert und von den zellulären Strukturen akzeptiert werden (Williams, 2008).
1.3.1 Anforderungen an alternative Materialien
Die Ansprüche an ein künstlich entwickeltes Material sind aufgrund der Funktion der Cornea
als „Fenster zur Welt“ und ihrer essentiellen Rolle bei der Sinneswahrnehmung, entsprechend
hoch.
So wird eine gefäß- und entzündungsfreie Integration in das corneale Stroma sowie die
Adhäsion und Migration von cornealen Epithelzellen vorausgesetzt. Außerdem sollte das
Material, wie die Amnionmembran, abbaubar sein und durch körpereigenes Gewebe ersetzt
werden. Weitere Anforderungen wie Sterilität, einfache Handhabung (v. a. beim Transpor und
der, Lagerung) und Standardisierung sind im Labor leicht zu erfüllen.
1.3.2 Fibrin, Seide, Keratin oder Kollagen?
Im Lauf der letzten Jahre wurden zahlreiche verschiedene Materialien als
Wachstumsunterlage für corneale Epithelzellen und als mögliche Alternativen zur
Amnionmembran untersucht. So wurden verschiedene biologische Polymere (behandelt und
unbehandelt) wie Kollagen (Levis et al., 2013; Schiff et al., 1992), Seide (Lawrence et al., 2009)
oder Keratin (Reichl et al., 2011), aber auch synthetische Materialien (Tan et al., 2013)
entwickelt und erprobt. Als besonders gut verträglich und vielseitig einsetzbar zeigte sich
dabei Kollagen.
Das ubiquitäre Vorkommen im menschlichen Körper und die Fähigkeit, zu verschiedenen
Formen verarbeitet werden zu können, machen das Kollagen zu einem vielversprechenden
Kandidaten für gut verträgliches Biomaterial.
Einleitung
23
1.4 Die Kollagenmembran
Kollagen ist ein Strukturprotein der extrazellulären Matrix und Bestandteil des Bindegewebes
(Haut, Knorpel, Sehnen etc.). Die Primärstruktur besteht aus einer α-helikalen Peptidkette,
jeweils drei Ketten lagern sich zu einer Tripelhelix, dem Tropokollagen, zusammen. Durch
weitere Zusammenlagerungen werden Fibrillen und Kollagenfasern gebildet. Das Material
weist eine hohe Zugfestigkeit auf und ist kaum dehnbar. Insgesamt werden im menschlichen
Körper 29 verschiedene Typen von Kollagen gebildet. Das Kollagen der Cornea (Typ I und III)
gehört zu den fibrillären Kollagenen und ermöglicht so die Bildung der transparenten
Hornhaut (Campbell, 2009).
1.4.1 Zusammensetzung der Kollagenmembran
Das Material für die Kollagenmembranen dieser Arbeit wurde aus kollagenreichem
Pferdegewebe wie Sehnen und Knorpel gewonnen. Dieses wurde physikalisch, chemisch und
biochemisch gereinigt, in Form gegossen, getrocknet und sterilisiert.
1.4.1.1 Modifikationen der ursprünglichen Kollagenmembran
Die Anwendung von Kollagen am Auge wurde schon früh untersucht. Dabei wurde das
Kollagen als natürlicher Verband (Palmer and McDonald, 1995), als antibiotisches Pflaster
(Callegan et al., 1994) oder zur Reduzierung von cornealem Stromaabau bei Entzündungen
(Schiff et al., 1992) verwendet. Allerdings zeigte sich, dass die Kollagenmembranen meist in
zu kurzer Zeit abgebaut wurden, um in vollem Umfang zu wirken. Bei Hornhautulzerationen
mit stärkeren Entzündungen ist eine langsamere Abbaugeschwindigkeit des implantierten
Materials notwendig, damit sich das Epithel vor einem vollständigen Abbau schließen kann.
Um die Stabilität zu erhöhen und somit auch die Haltbarkeit zu verlängern, wurden in der
Vergangenheit verschiedene Methoden entwickelt. So wurden komprimierte
Einleitung
24
Kollagenmembranen mit kultivierten cornealen Fibroblasten entwickelt. Diese Membranen
sind als Wachstumsunterlage in vitro gut geeignet, wurden bisher allerdings noch nicht in vivo
untersucht und erfordern eine zusätzliche Vorbehandlung (Levis et al., 2013; Mi et al., 2010).
In anderen Studien werden chemisch zusätzliche Quervernetzungen zwischen den
Kollagenfasern erzeugt, welche die Membranen stabilisieren (Duan and Sheardown, 2006; Liu
et al., 2009). Im Folgenden werden die Modifikationen der in dieser Arbeit verwendeten
Kollagenmembranen erklärt.
1.4.1.1.1 Crosslinking mit UV-Licht und Riboflavin
Die Stabilität der Kollagenmembranen für diese Arbeit sollte durch die Zugabe von Riboflavin
und die Bestrahlung mit UV-Licht erhöht werden. Obwohl diese Methode des Crosslinkings in
der Ophthalmologie gut etabliert ist, wurde sie bisher noch nicht für Kollagenmembranen,
welche im Auge angewendet werden sollen, eingesetzt. Beim Crosslinking mit Riboflavin und
UV-Licht entstehen O2-Radikale, welche mit den Aminosäuren des Kollagens wechselwirken,
sodass neue kovalente Bindungen an inter- oder intramolekular aktiven Stellen entstehen
(Sporl et al., 2008). Durch diese neuen Verbindungen wird die Stabilität um den Faktor 4,5
erhöht und außerdem die Schwellungskapazität reduziert (Ehlers and Hjortdal, 2008;
Wollensak et al., 2007; Wollensak et al., 2003). In der Ophthalmologie wird diese Methode
häufig angewendet, um Festigkeit der Cornea und somit eine Verformung (z. B. bei
Keratokonus) zu verlangsamen (Wollensak, 2006).
1.4.1.1.2 Reduzierung des kurzkettigen Kollagens
Eine andere Methode, mit der in dieser Arbeit ebenfalls versucht wurde, die Stabilität der
Kollagenmembranen zu erhöhen und somit die Abbaugeschwindigkeit zu verlangsamen, war
die Reduzierung des kurzkettigen Kollagens. Bei der Herstellung der Kollagenmembranen
bilden sich Kollagenfibrillen und -fasern unterschiedlicher Länge. Durch eine Änderung des
Herstellungsprozesses sollte nun der Anteil des kurzkettigen Kollagens minimiert und mit Hilfe
Einleitung
25
der längeren Strukturen eine engere Verknüpfung der Kollagenfibrillen entstehen. Zusätzlich
wurden diese Varianten ebenfalls teilweise mit Riboflavin und UV-Licht quervernetzt.
1.4.1.1.3 Zugabe von Antibiotika
Aufgrund der ständigen Benetzung mit Tränenflüssigkeit und der damit einhergehenden
Verdünnung des Antibiotikums gestaltet sich dessen Anwendung am Auge schwierig und muss
häufig wiederholt werden. Es erscheint vielversprechend, ein gut verträgliches Material,
welches über einen längeren Zeitraum kontinuierlich Antibiotikum abgibt, in der Cornea und
somit direkt in der Entzündung zu positionieren. Um diesen Ansatz zu untersuchen, wurden
Kollagenmembranen mit zugesetztem Antibiotikum (Gentamicin) ebenfalls in die Arbeit mit
einbezogen.
1.4.2 Klinische Anwendungen
1.4.2.1 Wundversorgung mit Kollagen
Die Möglichkeit, Kollagen in vielen verschiedenen Formen und Varianten herzustellen, und
dessen gute Verträglichkeit haben dazu geführt, dass das Material heute in vielen
medizinischen Bereichen verwendet wird.
So wurde Kollagen bereits erfolgreich bei der Wundversorgung von Verbrennungen bzw.
entzündlichen Defekten der Haut (Frieß, 2007) und im Mundraum (Rastogi et al., 2009)
angewendet. Des Weiteren wurde das Material in weiteren klinischen Disziplinen wie z. B. in
der Zahnmedizin (Valentini, 2004) und der Orthopädie mit sehr guten Ergebnissen eingesetzt
(Bartlett et al., 2005).
Einleitung
26
1.4.2.2 Anwendungen in der Ophthalmologie
Wie bereits zuvor erwähnt, wurde die Anwendung von Kollagen am Auge schon früher
untersucht. Allerdings wurden bislang noch keine biosynthetischen Kollagenmembranen als
Stromaersatz bei Hornhautulzerationen verwendet.
Bisher wurde die Anwendung quervernetzter Kollagenmembranen als Stromaersatz zur
optischen Rehabilitation und nicht zur Förderung der Wundheilung klinisch untersucht. In
einer Studie wurden Membranen aus rekombinantem Kollagen Typ II im Rahmen einer
lamellären Keratoplastik eingesetzt (Fagerholm et al., 2010; Lagali, 2011). Dabei konnten zwar
eine gute Verträglichkeit, aber auch Probleme bei der Epithelialisierung und nur sehr geringe
Anzeichen für einen Umbau der implantierten Membranen beobachtet werden.
Nicht nur im vorderen Augenabschnitt wird die Verwendung von Kollagenmembranen
diskutiert, sondern auch im Bereich des Augenhintergrundes. So wurden an der Technischen
Hochschule in Aachen Untersuchungen mit Kollagenmembranen an der Retina durchgeführt.
Hierfür wurde sowohl eine Kultivierung der retinalen Pigmentepithelzellen als auch die
Transplantation in den Augenhintergrund von Kaninchenaugen durchgeführt. Bei den
Versuchen konnte sowohl ein gutes Zellwachstum als auch eine entzündungsfreie Integration
ins lebende Gewebe gezeigt werden. (Thumann et al., 2009). Für diese Experimente wurde
mit der in dieser Arbeit ebenfalls verwendeten Kollagenmembran von Resorba Medical GmbH
gearbeitet.
1.5 Zielsetzung der Arbeit
In dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten einer Biomembran aus equinem Kollagen Typ
I auf ihre Eignung als mögliche Alternative zur Amnionmembran für die Behandlung von
Hornhautulzerationen untersucht.
Vorteile biosynthetischer Kollagenmembranen gegenüber der Amnionmembran sind ihre
Sterilität, die Standardisierung, ihre Haltbarkeit und Verfügbarkeit. Eine vollständige
Transparenz, wie sie auch bei der Amnionmembran nicht vorhanden ist, wurde nicht als
notwendig angesehen, da die Kollagenmembran wie die Amnionmembran in erster Linie den
Einleitung
27
Heilungsprozess unterstützen soll und so ggf. anschließend die optische Rehabilitation durch
eine Keratoplastik ermöglicht.
Dreizehn verschiedene Varianten, quervernetzt und unbehandelt, wurden zunächst in vitro
auf Zelltoxizität und ihre Eignung als Wachstumsunterlage untersucht. Dabei wurden
insbesondere die Entwicklung des Epithels und dessen Bindung an die Kollagenmembranen
sowie die Differenzierung, Proliferation und der Stammzellanteil der Zellen untersucht. Die
geeignetsten Varianten wurden anschließend mit zwei verschiedenen Methoden im
Tiermodell angewendet. Hierbei wurde das Augenmerk vor allem auf mögliche Entzündungs-
und Vaskularisationsreize gelegt. Bei guter Verträglichkeit sollte außerdem noch eine klinische
Beobachtungsstudie mit den Kollagenmembranen am Patienten durchgeführt werden.
Zusätzlich wurden die mechanischen und physikalischen Eigenschaften der verschiedenen
Kollagenmembranvarianten eingehend untersucht.
In der Diskussion werden abschließend die unterschiedlichen Eigenschaften der
verschiedenen Varianten der Kollagenmembran erläutert und näher auf ihre Eignung zur
Therapie von Hornhautulzerationen eingegangen. Des Weiteren werden die Ergebnisse mit
aktuellen Forschungsergebnissen verglichen und Möglichkeiten zur Verbesserung und
Weiterentwicklung der Kollagenmembran diskutiert.
Material und Methoden
28
2 Material und Methode
2.1 Material
2.1.1 Kollagenmembranen
Die Kollagenmembranen wurden von der Firma Resorba Medical GmbH (Nürnberg)
hergestellt und zur Verfügung gestellt. Die Membranen hatten zum Lieferzeitpunkt einen
Durchmesser von 16 mm und waren 25 µm dick.
Neben der ursprünglichen, unbehandelten Kollagenmembran wurden noch weitere, mit
Riboflavin (in zwei Konzentrationen: 12,5 µg/cm2 und 25 µg/cm2) und UV-Licht (365 nm)
quervernetzte Varianten von Resorba hergestellt (siehe Abb. 6). Die Bestrahlungsintensität
des UV-Lichts blieb mit 5 J/cm2 jeweils konstant.
Abbildung 6: Quervernetzte Varianten der Kollagenmembran Für die Untersuchungen wurden eine unbehandelte Kollagenmembran (links) und zwei quervernetzte Varianten hergestellt. Durch die Zugabe des Riboflavins verfärbten sich die Kollagenmembranen gelblich. Die Intensität war dabei abhängig von der zugegebenen Menge (Mitte: 12,5 µg/cm2; rechts: 25 µg/cm2).
Außerdem wurde noch ein alternatives Herstellungsverfahren angewendet, bei dem der
Anteil an langkettigem Kollagen erhöht wird (Herstellungsverfahren 2). Mit diesem Verfahren
sollte die Stabilität der Kollagenmembranen zusätzlich erhöht werden. Auch diese Varianten
wurden teilweise quervernetzt.
Zusätzlich wurden noch Kollagenmembranen mit Antibiotikum (4 mg Gentamicinsulfat ≙
2,20–2,86 mg Gentamicin) entwickelt. Abhängig von der Antibiotikumskonzentration variierte
Material und Methoden
29
bei diesen Membranen die Dicke zwischen 15 µm und 30 µm. Die Kollagenmembranen
wurden doppeltsterilisiert geliefert und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert.
2.1.2 Amnionmembran
Die Amnionmembranen wurden freundlicherweise von der Universitätsfrauenklinik Erlangen
zur Verfügung gestellt. Alle Amnionmembranen wurden nach Kaiserschnittgeburten
gewonnen, waren serologisch unauffällig, und die Spenderinnen hatte zuvor ihre schriftliche
Einwilligung für die wissenschaftliche Verwendung gegeben.
2.1.3 Zellkultur
2.1.3.1 Zellen
Für die Zellkulturversuche wurde folgende Zelllinie verwendet:
Bezeichnung Herkunft Bezugsquelle
Swiss Albino 3T3-Feederzellen murin ATCC, Manassas, VA, USA
2.1.3.2 Gewebe
Für die Gewinnung der Stammzellen wurden, nach Einverständniserklärung der Spender bzw.
deren Angehörigen, folgende Gewebe verwendet:
Bezeichnung Herkunft Bezugsquelle
Mundschleimhaut (Oral mucosa) human freiwillige Spender,
Universitätsklinikum
Erlangen
Material und Methoden
30
Corneoskleralringe human Spenderhornhäute,
Universitätsklinikum
Erlangen
Bulbi human Spenderaugen,
Universitätsklinikum
Erlangen
2.1.3.3 Zellkulturmedien und Zusätze
Im Folgenden sind alle verwendeten Zellkulturmedien und Zusätze sowie deren jeweilige
Herstellern aufgelistet.
Name Hersteller
3,3′,5-Triiodo-L-thyronin Natriumsalz 0,2 mM Sigma-Aldrich, S. Louis,
MO, USA
Adenin 18,5 mM Sigma-Aldrich
Calciumchlorid Carl Roth GmbH&Co.KG,
Karlsruhe
Choleratoxin 10 µM Sigma-Aldrich
Dulbecco's Modified Eagle Medium HyClone, Thermo Fisher
Scientific, Waltham, MA,
USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium GlutaMAX™ Gibco, life technologies,
Carlsbad, CA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4,5g/l Glucose) PAN-Biotech GmbH,
Aidenbach
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 Gibco, life technologies;
PAN-Biotech GmbH
Foetal bovine serum (FBS) Gibco, life technologies;
PAN-Biotech GmbH
Material und Methoden
31
Ham's F12, mit 1.00 mM L-Glutamin HyClone, Thermo Fisher
Scientific
HCGS (human corneal growth supplement) Invitrogen, life
technologies,
Human epidermal growth factor 10 µg/ml Gibco, life technologies
Hydrocortison 5 mg/ml Sigma-Aldrich
Insulin 10 mg/ml Sigma-Aldrich
L-Glutamin 200 mM PAN-Biotech GmbH
MCDB151 Biowest SAS, Nuaillé,
France
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B-Mix Gibco, life technologies
PAN-Biotech GmbH
Transferrin 5 mg/ml Sigma-Aldrich
2.1.4 Tiermodell
2.1.4.1 Versuchstiere
Für die in-vivo-Versuche wurden weibliche New Zealand white rabbits verwendet. Die Tiere
wurden von Charles River Laboratories aus der Niederlassung in Kißlegg, Deutschland,
bezogen. Das Anfangsgewicht der Tiere betrug 1,8–2,0 kg.
2.1.4.2 Tierhaltung
Die Tiere wurden gemäß den Richtlinien der „Association for Research in Vision and
Ophthalmology“ (ARVO), Rockville, USA, für die Verwendung von Versuchstieren in der
visuellen Forschung und Ophthalmologie gehalten. Die Haltung der Kaninchen erfolgte bei
konstanter Raumtemperatur (20°C) mit einem Tag- und Nachtrhythmus von 12 Stunden Länge
und Futter und Wasser ad libidum im Franz-Penzoldt-Zentrum (Präklinisches Tierzentrum) der
Material und Methoden
32
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg. Die operative Nachsorge wurde von den
Tierpflegern bzw. der beteiligten Doktorandin durchgeführt.
2.1.4.3 Operations- und Nahtmaterial
Zur Durchführung der Tierversuche wurden folgende Materialien benötigt:
Name Hersteller
6-0 Fäden, Seide, Seraflex Serag Wiessner, Naila
10-0 Fäden, Nylon, Ethilon Ethicon, Endo-Surgery,
Somerville, NJ, USA
ES-Kompressen, unsteril, 7,5 x 7,5 cm Paul Hartmann AG,
Heidenheim
Graefe-Messer, 12 cm F. S. T. GmbH, Heidelberg
Introcan®Safety-W, 22G, PUR, Sicherheitsvenen-
verweilkanüle B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
MicrolanceTM 3, 21G,Kanülen BD, Franklin Lakes, NJ, USA
Lidsperrer n. Murdock Geuder AG, Heidelberg
Nadelhalter n. Barraquer, 10,5 cm gebogen Geuder AG
OP-Tücher, steril, 45 x 75 cm Mölnlycke Health Care
GmbH, Wien, Österreich
Phako-Messer, 45° Winkel, 2,5 mm Mani-Messer, Ruck
Ophthalmologische
Systeme GmbH, Eschweiler
Pinzette „Bonn“, 11084-07 F. S. T. GmbH
Pinzette „Bonn”, 11083-07 F. S. T. GmbH
Spritze, 5 ml, Discardit II BD
Trepan, 4 mm AcuPunch®, Acuderm,
Ft. Lauderdale, FL, USA
Material und Methoden
33
Vannas Scissors Cohan F. S. T. GmbH
Verbandskontaktlinse, Geaflex70 Wöhlk-Contact-Linsen
GmbH, Schönkirchen
Xstar® Tunnel-Messer, 55° Winkel, 2,5 mm Beaver-Visitec Internat.,
Sydney, Australien
2.1.4.4 Narkosemittel und Medikamente
Folgende Narkosemittel und Medikamente waren zur tiergerechten Operation und
Versorgung der Tiere notwendig:
Name Hersteller
Conjuncain® EDO Bausch&Lomb GmbH,
Berlin
Corneregel® Bausch&Lomb GmbH
Floxal® EDO Bausch&Lomb GmbH
Fluorescein Haag-Streit Holding-AG,
Köniz, Schweiz
Jodlösung Apotheke,
Universitätsklinik Erlangen
Ketanest®S 25 mg/ml Pfizer Pharma GmbH,
Berlin
Narcoren® 16g/100ml Merial GmbH,
Hallbergmoos
Natriumchlorid 0,9% B. Braun Melsungen AG
Rompun® 2% Bayer AG, Leverkusen
Material und Methoden
34
2.1.5 Antikörper
Mit folgenden Antikörpern wurden die Immunfluoreszenz-Färbungen der
Kollagenmembranen und der kultivierten Stammzellen durchgeführt:
Name Hersteller
Alexa 488 Invitrogen,life technologies
Cytokeratin 4 Abcam, Cambridge, UK
Cytokeratin 3/76 Chemicon, Merck, Billerica,
MA, USA
Cytokeratin 15 Abcam
DAPI (4’,6’-Diamidin-2-phenylindol) Sigma-Aldrich
E-Cadherin BD
Integrinα6 Millipore, Merck
Ki67 LabVision, Thermo
Scientific, Waltham, MA,
USA
p63 Abcam
2.1.6 Chemikalien, Lösungen und Verbrauchsmaterialien
Weitere verwendete Chemikalien, Lösungen und Verbrauchsmaterialen sind im Folgenden
aufgelistet:
Name Hersteller
6-Well-Platten Costar 3516 Corning Inc, Corning,
NY, USA
Aceton Carl Roth, Karlsruhe
Bacillol® AF Bode Chemie, Hamburg
BSA (Bovine serum Albumin) Carl Roth
Material und Methoden
35
Casytone Roche, Basel, Schweiz
Dako fluorescent mounting medium Dako Deutschland,
Hamburg
Deckgläschen Carl Roth
Dispase II Roche
DMSO (Dimethylsulfoxid) Carl Roth
Einbettschälchen Cryomold®Biopsy Sakura, Science services,
München
Einmalhandschuhe „purple Nitrile“ Kimberley-Clarke
Professional, KIMTECH
SCIENCE, Koblenz
Eukitt ™ Mounting medium Electron microscopy
sciences, Hatfield
Grossbritanien
Falcons 50 ml BD
Fettstift Dako Pen Dako Deutschland
Fluoreszenz 6-Well-Platten Nunc Maxisorp,
eBioscience, Frankfurt
Glutaraldehyd 1% Carl Roth
Hanks`-Salzlösung Biochrom, Merck, Billerica,
USA
Incidur Spray Ecolab GmbH, Wien
Inserts 6-Well-Platten Costar 3452 Corning Inc
Kaliumchlorid (KCl) 2,7 mM Carl Roth
Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) 2 mM Carl Roth
Kollagenase von Clostridium difficile Sigma-Aldrich
Magnesiumchlorid (MgCl) Sigma-Aldrich
Mitomycin C Apotheke,
Universitätsklinik Erlangen
Natriumchlorid (NaCl) 137 mM Carl Roth
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat (NaH2PO42H2O) 10 mM Carl Roth
Material und Methoden
36
Objekträger Superfrost®Plus Thermo scientific
O. C. T. Cell Path Ltd., Newtown,
Großbritannien
Osmiumtetroxid 2% Carl Roth
Paraformaldehyd 4% Carl Roth
Petrischalen 35 x 10 mm Falcon, BD
Rasierklingen TED Pella Inc, Redding,
CA, USA
Skalpell, Feather, Nr 10 + 11 pfm medical AG, Köln
Tierfutter V233 Fa. Ssniff, Soest
Trypsin-EDTA 0,05%/0,25% PAN-Biotech GmbH
Urinbecher 100 ml Sarstedt, Nürnbrecht-
Rommelsdorf
Versene Solution Gibco, life technologies
2.1.7 Geräte
Folgende Geräte standen für die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche zur Verfügung:
Name Hersteller
Autoklav 2540 EL Tuttnauer, Biomedis®,
Gießen
Brutschrank BBD 6220 Heraeus Instruments,
Hanau
Elektronenmikroskop EM 906E Carl Zeiss, Oberkochen
Fluoroskan AscentFL Thermo scientific
Fluoreszenzlampe U-RFL-T Olympus, Münster
Gefrierschrank Liebherr, Bulle, Schweiz
Gefrierschrank -80°C MDF-U54V Sanyo, München
Kamera ColorView I CCD Olympus
Material und Methoden
37
Kamera E-330 Olympus
Kamera F-View II CCD Olympus
Kryostat CM1950 Leica Biosystems, Wetzlar
Kühlschrank Liebherr
Micrometer Messuhr Mitutoyo, Kawasaki, Japan
Mikroreaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg
Mikroskop BX51 Olympus
Mikroskop Novex Euromex, Arnhem,
Niederlande
Mikroskop SMZ 745T Nikon GmbH, Düsseldorf
Mikroskop SZX7 Olympus
Mikroskop TS100 Nikon GmbH
Multiskan Spectrum Thermo scientific
pH-Meter pH720 inoLab®, WTW series,
Weilheim
Pipetten 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000 µl Eppendorf
Schüttler Polymax 1040 Heidolph Instruments,
Schwabach
Sterilbank Herasafe Thermo scientific
Stickstoff-Tank Cryomed Thermo scientific
Ultraschallbad Elmasonic One Elma Hans Schmidbauer
GmbH&Co.KG, Singen
UV-Crosslinker Bio-link 365 Vilber Lourmat,
Eberhardzell
Waage TE 612 Sartorius AG, Göttingen
Wasserbad Sw22 Julabo GmbH, Seelbach
Zellzähler CASY® Roche Innovatis AG,
Reutlingen
Zentrifuge 5804 Eppendorf
Zug- und Druckprüfmaschine Zwicki-Line Z2.5 Zwick Roell, Ulm
Material und Methoden
38
2.1.8 Software
Für die Auswertung der durchgeführten Versuche wurden folgende Software verwendet:
Name Hersteller
AscentTM 2.6 Thermo scientific
cell^F Olympus
GraphPad Prism 4 GraphPad Software, San
Diego, CA, USA
SPSS statistics standard IBM, Ehningen
SkanItRE MSS 2.2 Thermo scientific
2.2 Methoden
2.2.1 In-vitro-Zellkultur mit Mundschleimhaut- und Limbusstammzellen
2.2.1.1 Gewinnung epithelialer Stammzellen
Alle Gewebespenden erfolgten mit schriftlichem Einverständnis der Spender bzw. deren
Angehörigen.
2.2.1.1.1 Epitheliale Stammzellen der Mundschleimhautzellen (Oral mucosa)
Die Mundschleimhaut-Biopsate wurden von vier Patienten, die sich einer dentalen Operation
unterzogen hatten, gewonnen. Die Proben wurden dreimal mit Hanks`Salzlösung und PSA für
3–5 min gewaschen. Anschließend wurden die Proben mit dem Epithel nach unten für 5
Stunden bei 4 °C in Dispase II inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Epithel abgezogen und
für 8 min in 0,05% Trypsin/EDTA-Lösung gelegt. Die Reaktion wurde mit DMEM-Medium
abgestoppt und die Zellen vorsichtig mit Pinzetten abgekratzt. Die Zellsuspension wurde
Material und Methoden
39
anschließend für 5 min bei 11000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das
Pellet wieder in Medium gelöst und die Zellen bis zur Verwendung bei -80 °C eingefroren.
2.2.1.1.2 Limbusstammzellen
Die Limbusstammzellen wurden von Corneoskleralringen (siehe Abb. 7) gewonnen, die nach
einer Keratoplastik übriggeblieben waren. Zusätzlich wurden Stammzellen auch von ganzen
Bulbi entnommen, welche nicht für Hornhauttransplantationen geeignet waren und durch die
Einwilligung der Angehörigen für die Forschung freigegeben worden waren.
Abbildung 7: Corneoskleralring Die Limbusstammzellen für die Versuche in der Zellkultur wurden von Corneoskleralringen und ganzen Bulbi gewonnen.
Für die Gewinnung von Limbusstammzellen von ganzen Bulbi wurde im posterioren,
interferioren, temporalen und nasalen Limbusbereich Gewebe (ca. 2 mm2) exzidiert. Die
Corneoskleralringe wurden vollständig verwendet und zunächst geviertelt. Das Gewebe
wurde vorsichtig gereinigt und bei 37 °C für 1,5 Stunden in Dispase II inkubiert. Danach wurden
die Proben in eine neue Petrischale überführt und mit Medium feucht gehalten. Mithilfe von
Pinzetten wurden die Zellen anschließend vorsichtig abgekratzt und in 0,25% Trypsin
überführt. Dort wurden sie für 10 min inkubiert. Um die Zellen besser aus dem Zellverband
lösen zu können, wurden sie außerdem in regelmäßigen Abständen auf- und abpipettiert. Die
Reaktion wurde mit Medium abgestoppt und die Zellsuspension für 10 min bei 1000 rpm
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Medium gelöst. Die Zellen
wurden anschließend sofort weiterverwendet.
Material und Methoden
40
2.2.1.2 Klonierung auf 3T3-Feederzellen und Aussaat auf die Kollagenmembranen
Für die Kultivierung auf den Kollagenmembranen wurden die Zellen im Wasserbad aufgetaut
bzw. direkt nach der Isolierung weiterverarbeitet und zunächst auf murinen 3T3-Feederzellen
kloniert. Ziel ist hierbei, möglichst viele Stammzellen zu erhalten und sie gleichzeitig durch die
Klonierung zu vermehren. Die 3T3-Feederzellen wurden mit Mitomycin C behandelt, um eine
weitere Proliferation zu verhindern. Mitomycin ist ein Antibiotikum, welches in die DNA
interkaliert und so die DNA-Synthese hemmt.
Die behandelten 3T3-Feederzellen wurden anschließend in 6-Well-Platten ausgesät (2x105
Zellen/Well). Nach dem Festsetzen der 3T3-Feederzellen wurden die Mundschleimhautzellen
auf die Feederzellschicht getropft. Während der nächsten zwei Wochen bildeten die
Stammzellen der ausgesäten Mundschleimhaut deutliche, gegen die 3T3-Feederzellen
abgegrenzte Klone (siehe Abb. 8).
Abbildung 8: Klonierte Limbusstammzellen zwischen 3T3-Feederzellen (A) Nach einer Woche konnten die ersten Klone der Stammzellen festgestellt werden. (B) Während der weiteren Kultivierung wuchsen die Klone stetig und verdrängten dabei die 3T3-Feederzellen (K: Stammzellklone; F: 3T3-Feederzellen).
Die Klone wurden danach durch Trypsinierung abgelöst und auf den unterschiedlichen
Varianten der Kollagenmembranen ausgesät. Hierfür wurden die Kollagenmembranen in
Inserts in 6-Well-Platten gelegt und angefeuchtet. Die Klone (5x105–1x106 Zellen/Folie)
wurden dann vorsichtig auf die Kollagenmembranen getropft. Das Medium wurde im
weiteren Verlauf täglich gewechselt.
A B
F
K K
F
Material und Methoden
41
Nach 9–12 Tagen wurden die Kollagenmembranen mit den Epithelschichten geviertelt, fixiert
und für die histologischen, elektronenmikroskopischen und immunhistochemischen
Auswertungen weiterverarbeitet.
2.2.1.3 Verwendete Medien
Die Mundschleimhautzellen wurden mit einem Dulbecco’s modified Eagle’s Medium und
Ham’s F12 Medium mit fötalem Kälberserum (FBS), human corneal growth supplement
(HCGS; Zusatz mit 0,18 µg/ml Hydrocortison, 5 µg/ml Insulin, 5 µg/ml Transferrin, 1 ng/ml EGF,
0,2% Rinder-Hypophysenextrakt), L-Glutamin, humanem epidermal growth factor (EGF),
Antibiotikum (PSA) und Calciumchlorid kultiviert (Mengenangaben siehe Anhang).
Im Gegensatz dazu wurden die Limbusstammzellen zur Optimierung der Kultivierung mit
verschiedenen, für die Kultivierung von limbalen Stammzellen gebräuchlichen Medien
inkubiert (Mengenangaben siehe Anhang).
Die Unterschiede sind im Folgenden tabellarisch dargestellt:
Kulturmedium MCDB151 DMEM/F12-1 DMEM/F12-2
Glucose 1081 mg/L 3151 mg/L 7651 mg/L
Riboflavin 0,376 µg/ml 0,22 µg/ml 0,619 µg/ml
fötales Kälberserum (FCS) 10% 10% 10%
Rinderhypophsenextrakt (BPE) 0,2% 0,2% x
Insulin 5µg/ml 5µg/ml 5µg/ml
Hydrocortison 0,18µg/ml 0,18µg/ml 0,4µg/ml
Transferrin 5µg/ml 5µg/ml 5µg/ml
Human epidermal growth factor (hEGF) 1ng/ml 1ng/ml 10ng/ml
Penicillin-Streptomycin-A (PSA) 1x 1x 1x
Adenin x 0,18mM x
Choleratoxin x 0,1nM x Tabelle 1: Unterschiede zwischen den Medien zur Kultivierung der Limbusstammzellen Die Medien DMEM/F-12-1 und MCDB151 enthielten im Gegensatz zu DMEM/F-12-2 mit Rinderhypophysenextrakt einen weiteren tierischen Bestandteil. Gleichzeitig war der Glukosegehalt bei DMEM/F12-2 deutlich erhöht.
Material und Methoden
42
2.2.2 Präparation der Amnionmembran
Direkt nach der Geburt wurde die Amnionmembran von der Plazenta abgetrennt. Der
Transport und die weitere Präparation erfolgten unter sterilen Bedingungen. Während der
gesamten Zeit wurde die Membran stetig mit Kochsalzlösung befeuchtet, um ein Austrocknen
zu verhindern. Im Labor wurde die Membran mehrfach mit NaCl-Lösung gespült und vom
Chorion getrennt. Das Chorion wurde verworfen und die Amnionmembran in ca. 3x6 cm große
Stücke geschnitten. Diese Stücke wurden nochmals gespült und auf einer Trägermembran
befestigt. Die befestigte Amnionmembran wurde dann in einem Falcon mit DMEM-Medium
und Glycerin bei -20 °C gelagert.
Für die in-vivo-Anwendungen wurde epithelialisierte Amnionmembran verwendet. Hierfür
wurden die Membranen ca. 15 min vor dem Eingriff bei Raumtemperatur aufgetaut.
2.2.3 In-vivo-Versuche am Tiermodell
Alle Versuche am Tiermodell wurden gemäß des deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt
und von der Regierung Mittelfranken genehmigt (Versuchsvorhaben: „Rekonstruktion der
Hornhaut mittels biokompatibler Materialien = Biomaterialien in der Hornhaut“,
Aktenzeichen: 54-2532.1.1/09).
2.2.3.1 Narkoseverfahren
Für die operativen Eingriffe und die anschließende Photodokumentation wurden die Tiere
unter Beibehaltung der Spontanatmung narkotisiert.
Zur Narkose wurde den Tieren eine Mischung aus Ketanest® S (Esketaminhydrochlorid, 25
mg/kg Körpergewicht) und 2% Rompun® (Xylazinhydrochlorid, 5 mg/kg Körpergewicht)
intramuskulär in den Oberschenkel gespritzt.
Material und Methoden
43
Das zu behandelnde Auge wurde durch die Gabe von Conjuncain® Augentropfen lokal
betäubt. Außerdem wurde das Auge unmittelbar vor dem Eingriff mit einer Jodlösung gespült,
um das Infektionsrisiko zu minimieren.
2.2.3.2 Intrastromale Implantation
Um die Verträglichkeit der Kollagenmembranen in vivo zu untersuchen, wurden die
Kollagenmembranen zunächst in das Stroma der Kaninchenhornhäute implantiert. Hierfür
wurde das Hornhautepithel eines Auges mit einem Trepan (5 mm) vorsichtig markiert. Am
Rand der Markierung wurde anschließend ein kleiner Schnitt gesetzt. Durch diesen Einschnitt
wurde dann ein Graefe-Messer in das Stroma eingeführt und durch vorsichtige Bewegungen
eine Tasche innerhalb der Markierung geformt. Mit einem zweiten Trepan (4 mm) wurde als
nächstes die Kollagenmembran ausgestanzt, befeuchtet und über den Einschnitt in die
Stromatasche eingeführt und flächig ausgebreitet (siehe Abb. 9). Abschließend wurden die
Augen mit Floxal® Augensalbe versorgt.
Abbildung 9: Intrastromale Implantation Die Kollagenmembranen wurden über einen kleinen Einschnitt in der Cornea in eine Stromatasche eingeführt (KM: Kollagenmembran; E: Epithel; S: Stroma).
Neben den Varianten der Kollagenmembran wurde, als Vergleich, auch die Amnionmembran
ins Stroma eingesetzt. Bis zur Entnahme nach vier, zwölf und 24 Wochen wurden die Augen
regelmäßig kontrolliert und photodokumentiert.
KM
E
S
Material und Methoden
44
2.2.3.3 Oberflächliche Implantation
Im zweiten Ansatz wurden die Kollagenmembranen auf die Cornea genäht, um das corneale
Epithelwachstum zu untersuchen. Zunächst wurde eine zirkuläre, zentrale Keratektomie
durchgeführt. Dafür wurde als erstes das corneale Epithel mit einem 4 mm Trepan markiert
und anschließend mit einem Hockeymesser entfernt. Danach wurden die obersten
Stromaschichten mit Pinzetten und einer Rasierklinge ebenfalls entfernt. Aus den
Kollagenmembranen und der Amnionmembran wurden dann Scheiben (ø 4 mm) ausgestanzt,
im Wundbett platziert und mit acht Fäden fixiert (siehe Abb. 10).
Abbildung 10: Oberflächliche Implantation (A+B) Nach dem Entfernen des Epithels und einer dünnen Stromaschicht wurden die Kollagenmembranen mithilfe von Fäden im Wundbett fixiert. (C) Diese konnten nach der vollständigen Epithelialisierung entfernt werden (KM: Kollagenmembran, S: Stroma, E:Epithel).
Zum Schutz wurde eine weiche Verbandskontaktlinse auf das Auge gelegt. Außerdem wurden
noch antibiotische Augentropfen (Floxal®) verabreicht. Abschließend wurden die Augenlieder
mit zwei bis drei Nähten verschlossen. Die Nähte wurden während des
Beobachtungszeitraums täglich kontrolliert und wenn nötig erneuert. Die vollständige
Entfernung der Nähte erfolgte nach 14 Tagen. Des Weiteren wurden täglich zweimal
antibiotische Augentropfen verabreicht.
Während des postoperativen Beobachtungszeitraums wurden die Augen photodokumentiert
und der Epithelschluss mit Fluoresceinfärbungen kontrolliert. Der Farbstoff Fluorescein ist
nicht toxisch, lagert sich an nicht epithelialisierten Bereichen der Cornea an und wird auch in
der klinischen Routine verwendet. Dadurch können Ulzerationen leicht identifiziert und das
Epithelwachstum gut kontrolliert werden.
4 mm
S E KM
C B A
Material und Methoden
45
2.2.3.4 Entnahme, Präparation und Fixierung der Hornhäute
Am Ende der Beobachtungszeiträume wurden die Tiere tierschutzgerecht durch die
intravenöse Injektion von Pentobarbital (Narcoren®) vom tierärztlichen Leiter des Franz-
Penzoldt-Zentrums getötet.
Direkt nach dem Tod der Tiere wurden die Augen entnommen, mit PBS gespült und über Nacht
bei 4 °C in 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach der Fixation wurde die Cornea aus dem Augapfel
präpariert und durch die implantierte Kollagenmembran halbiert. Eine Hälfte wurde
anschließend für die histologische, die andere Hälfte für die elektronenmikroskopische
Auswertung weiterverarbeitet.
2.2.4 Histologie und Immunfluoreszenz-Färbungen
2.2.4.1 Licht- und Elektronenmikroskopie
Für die histologischen Untersuchungen mit dem Lichtmikroskop wurden die
Kollagenmembranen mit den kultivierten Epithelzellen und die präparierten
Kaninchenhornhäute in 4% gepuffertem Paraformaldehyd fixiert, dehydriert und in Paraffin
eingebettet. Die Paraffinschnitte wurde anschließend mit Hämatoxylin-Eosin gemäß den
Standard-Protokollen (siehe Anhang) gefärbt.
Zur Beurteilung des Zellwachstums auf den Kollagenmembranen wurden die Anzahl der
Zellschichten und deren Qualität mithilfe eines Punktesystems bewertet, um Unterschiede im
Bewuchs festzustellen und so auf die Eignung der unterschiedlichen Varianten als
Wachstumsunterlage zu schließen. Folgende Punkte wurden vergeben: 0 = keine oder
vereinzelte Zellen; 1 = 1–2 Zellschichten; 2 = 2–3 Zellschichten; 3 = 3–4 Zellschichten. Es wurde
der Mittelwert von je fünf Proben verglichen und mit dem Mann-Whitney-U-Test auf
Signifikanz überprüft. Das Signifikanz-Level lag bei p<0.05.
Für die elektronenmikroskopische Auswertung wurden die Kollagenmembranen mit den
kultivierten Epithelzellen und die präparierten Kaninchenhornhäute in einer Lösung aus 4%
Paraformaldehyd und 1% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer fixiert. Danach folgte eine
Material und Methoden
46
zweite Fixierung in 2% gepuffertem Osmiumtetroxid und die Dehydrierung über eine
aufsteigende Ethanolreihe. Abschließend wurden die Proben in Epoxidharz eigebettet.
Semidünnschnitte wurden angefertigt und mit Toluidinblau, Ultradünnschnitte mit Uranyl-
Citrat-Bleiacetat gefärbt und mit dem Transmissionselektronenmikroskop ausgewertet.
2.2.4.2 Immunfluoreszenz-Färbungen
Für die Immunfluoreszenz-Untersuchungen wurden die Kollagenmembranen mit den
kultivierten Epithelzellen in Präparationsschälchen mit O.C.T.-Medium gelegt und im auf -20
°C abgekühlten Gefrierschrank eingefroren. Für die Färbungen wurden 5 µm dicke Schnitte
am Kryotom angefertigt.
Die kultivierten Zellen wurden mit Markern für Differenzierung, Adhäsion, Proliferation und
mögliche Stammzellen gefärbt (Protokoll siehe Anhang).
2.2.5 Physikalische und biochemische Eigenschaften der Kollagenmembran
Um die physikalischen und biochemischen Eigenschaften der verschiedenen Varianten der
Kollagenmembran zu bestimmen, wurden sowohl das Quellungsverhalten als auch die
mechanische und biochemische Stabilität untersucht.
2.2.5.1 Quellung
Die Quellung wurde durch den Dickenvergleich der getrockneten und der feuchten
Kollagenmembran ermittelt. Hierfür wurden die Membranen bei Raumtemperatur für 10 min
in 50 ml Wasser inkubiert. Danach wurden die Dicken der Varianten mit einer Micrometer-
Messuhr bestimmt. Jede Messung wurde viermal durchgeführt und anschließend der
Mittelwert errechnet.
Material und Methoden
47
2.2.5.2 Druckstabilität
Da aufgrund der Quervernetzung mit Riboflavin und UV-Licht unter anderem eine Erhöhung
der Stabilität erwartet wurde, wurde die mechanische Stabilität der verschiedenen Varianten
mithilfe einer Zug- und Druckprüfmaschine (siehe Abb. 11) überprüft. Die angefeuchteten
Kollagenmembranen wurden hierfür in einem Rahmen mit einem Durchmesser von 20,5 mm
fixiert und mit einem Stempel in Form einer Halbkugel (Durchmesser 9,5 mm) über eine
definierte Distanz belastet, bis das Material zerriss. Die Halbkugel verhinderte hierbei das
vorzeitige Einreißen der Kollagenmembranen durch scharfe Kanten.
Abbildung 11: Zug- und Druckprüfmaschine Um die Stabilität der Kollagenmembranen zu untersuchen, wurden die Membranen in eine Rahmenvorrichtung gespannt und mit einem abgerundeten Stempel belastet. Die maximal aufgewendete Kraft wurde als Maß für die Stabilität genommen.
Die maximal mögliche Kraft bis zum Zerreißen der Kollagenmembran wurde als Maß für die
Stabilität genommen. Die Messungen wurden jeweils dreimal wiederholt und der Mittelwert
ermittelt.
Material und Methoden
48
2.2.5.3 Kollagenaseassay
Die biochemikalische Stabilität der verschiedenen Kollagenmembranen wurde mithilfe eines
Kollagenaseassays ermittelt. Dafür wurde die Kollagenase von Clostridium difficile in
Sörensen-Phosphatpuffer (pH=7,0) mit Magnesiumchlorid aufgelöst und mit den
Kollagenmembranen inkubiert. Die Inkubation erfolgte im Schüttelwasserbad (70 rpm) bei 37
°C in 20 ml Erlenmeyerkolben für 140 min. Im Verlauf wurde die Membranintegrität in 10-
Minuten-Intervallen visuell beurteilt (siehe Tab. 2) und mit einem Kontrollansatz ohne
Kollagenase verglichen. Die Messung wurde zweimal wiederholt.
Punkte Degradation
0 Vollständige Degradation
1 Reste erkennbar
2
Verschiedene Stadien der Degradation
3
4
5
6
7 Leichte Zeichen einer Degradation
8 Kollagenmembran vollständig
Tabelle 2: Bewertungssystem der Membranintegrität während des Kollagenaseassays Das Voranschreiten des Abbaus der Kollagenmembranen wurde optisch untersucht und mithilfe eines Punktesystems bewertet.
2.2.6 Klinische Anwendungsbeobachtung am Patienten
Nach erfolgreichem Abschluss der Tierversuche wurde die klinische Anwendung am Patienten
untersucht. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Erlangen-Nürnberg
genehmigt (Antrag 75_12B) und gemäß den gesetzlichen Vorgaben durchgeführt. Alle
behandelten Patienten wurden zudem ausführlich aufgeklärt und erklärten ihr Einverständnis
schriftlich.
Material und Methoden
49
Bei der im Rahmen der klinischen Anwendungsbeobachtung verwendeten Kollagenmembran
handelte es sich um eine nicht quervernetzte, CE-zertifizierte Variante, die mit der in den
Zellkulturen und Tierversuchen verwendeten Kollagenmembran Cnon vergleichbar ist. Für die
Behandlung mit der Kollagenmembran wurden Patienten mit persistierenden
Hornhautulzerationen unterschiedlicher Ätiologie ausgewählt. Die Entscheidung zur
operativen Therapie erfolgte, nachdem konservative Maßnahmen keine Besserung des
Hornhautbefundes erbracht hatten. Mit den Patienten wurde zunächst die Möglichkeit einer
Amnionmembrantransplantation besprochen, bevor auf die alternative Behandlung mit einer
Membran aus equinem Kollagen Typ I im Rahmen der Studie verwiesen wurde.
Die Kollagenmembran wurde während der Operation in die Ulzeration eingenäht, ggf.
mehrschichtig, und zusätzlich als Verband großflächig über die gesamte Hornhaut gelegt und
ebenfalls mit Fäden fixiert (10-0 Nylon Einzelknüpfnähte). Anschließend wurden lokal
antibiotische Augentropfen verabreicht sowie eine Verbandskontaktlinse eingesetzt. Die
postoperative Therapie richtete sich nach der zugrundeliegenden Hornhauterkrankung. Die
Dicke der Kollagenmembran betrug bei der Anwendung am Patienten 28 µm.
Im Verlauf wurden der Verbleib der Kollagenmembran, der Epithelschluss und eventuelle
Entzündungsreaktionen und Vaskularisationen der Hornhaut kontrolliert. Postoperative
Kontrollen bestanden während der ersten vier Tage täglich, dann nach einer Woche, nach zwei
Wochen und nach vier Wochen. Bei den Patienten, bei denen es zu einer schnellen
Degradation der Membran kam und der Epitheldefekt weiterhin bestand, wurde eine
Amnionmembrantransplantation durchgeführt.
Ergebnisse
50
3 Ergebnisse
3.1 Hergestellte und untersuchte Varianten
Zur Erprobung des Materials wurden insgesamt 13 Varianten mit unterschiedlichen
Modifizierungen hergestellt (siehe Tab. 3).
Kollagenmembran
Herstellungsprozess (1: Standardprozess; 2: Reduzierung des
kurzkettigen Kollagens)
Riboflavin Konzentration
(µg/cm2)
UV-Bestrahlung
(J/cm2)
Antibiotikum Gentamicin
(mg/cm2)
Dicke (µm)
KM1/Cnon 1 x x 25
KM2 1 x 5 25
KM3 1 12,5 x 25
KM4 1 25 x 25
KM5/Clow 1 12,5 5 25
KM6/Chigh 1 25 5 25
KM7 2 12,5 x 25
KM8 2 25 x 25
KM9 2 12,5 5 25
KM10 2 25 5 25
ABlow 1 x x 0,68 15
ABmedium 1 x x 0,9 20
ABhigh 1 x x 1,25 30 Tabelle 3: Übersicht aller hergestellten und untersuchten Kollagenmembranen Insgesamt wurden 13 verschiedene Varianten hergestellt in vitro und in vivo und untersucht.
3.2 In-vitro-Zellkulturversuche
Die Kultivierung von Epithelzellen sollte Aussagen über die Verträglichkeit und mögliche
Zelltoxizität aufgrund der Modifikationen ermöglichen.
3.2.1 Kultivierung von Stammzellen der Mundschleimhaut
Die klonierten Epithelzellen wurden zunächst auf den quervernetzten und unbehandelten
Kollagenmembranen beider Herstellungsprozesse KM1–KM10 kultiviert und histologisch
Ergebnisse
51
ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass alle Varianten der Kollagenmembran die Adhäsion und
Proliferation der Mundschleimhaut unterstützten und teilweise mehrlagige Zellschichten
ausbildeten (siehe Abb. 12). Die Zugabe von Riboflavin hatte keinen zytotoxischen Effekt und
beeinflusste das Zellwachstum nicht negativ.
Ergebnisse
52
Abbildung 12: Kultivierung der Mundschleimhautzellen auf den Varianten der Kollagenmembran
Auf den Kollagenmembranen KM1–KM10 bildeten sich regelmäßige, mehrlagige Epithelschichten aus. Für keine Variante konnten zytotoxische Eigenschaften nachgewiesen werden (E: Epithel; KM: Kollagenmembran; HE-Färbung).
200 µm
KM7
KM6 KM5
KM4 KM3
KM2 KM1
KM10 KM9
KM8
E KM
Ergebnisse
53
3.2.1.1 Kultivierung von Stammzellen oraler Mukosa auf unterschiedlichen Varianten der
Biomembran aus equinem Kollagen Typ I
Da grundsätzlich alle Varianten für die Kultivierung von Mundschleimhautzellen geeignet
erschienen, wurden sechs Kollagenmembranen (KM1, KM4, KM7, KM8, KM9, KM10) für einen
ausführlicheren Vergleich der Epithelschichten ausgewählt und genauer untersucht. Hierbei
wurden die Kollagenmembranen sowohl bezüglich ihrer Eigenschaften (quervernetzt,
Herstellungsprozess) als auch nach den ersten Ergebnissen in vitro ausgewählt. Die
unbehandelte Kollagenmembran diente dabei als Vergleich.
Es zeigte sich, dass die Epithelschichten auf den quervernetzten Varianten mit Riboflavin
mehrschichtiger und regelmäßiger ausgebildet waren (siehe Tab. 4). Diese Beobachtung
konnte statistisch allerdings nicht bestätigt werden (p=0.075). Unterschiede, die auf das
alternative Herstellungsverfahren (Methode 2) zurückgeführt werden können, waren nicht zu
erkennen.
Kollagen-membran
Herstellungs-methode
Riboflavin-konzentration UV-Dosis
Kultivierungs-zeitraum
Qualität des Bewuchses
KM5/Clow 1 12,5 µg/cm2 5 J/cm2 8 Tage 2,6
KM9 2 12,5 µg/cm2 5 J/cm2 8 Tage 2,4
KM4 1 25 µg/cm2 xx 8 Tage 2,2
KM6/Chigh 1 25 µg/cm2 5 J/cm2 8 Tage 2
KM10 2 25 µg/cm2 5 J/cm2 8 Tage 2
KM1/Cnon 1 x xx 8 Tage 1,6 Tabelle 4: Statistische Auswertung des Epithels auf verschiedenen Varianten der Kollagenmembran Für die Auswertung wurde die Qualität des Epithels von je sechs Kollagenmembranen einer Variante verglichen und der Mittelwert berechnet.
Für die weiteren Untersuchungen wurden zwei quervernetzte Varianten mit gutem
Epithelwachstum, KM5 und KM6, ausgewählt und mit der unbehandelten Kollagenmembran
verglichen. Beide Varianten wurden, wie die unbehandelte Kollagenmembran KM1, mit dem
Standardverfahren hergestellt und mit unterschiedlichen Mengen an Riboflavin quervernetzt.
Zur besseren Unterscheidung werden die Kollagenmembranen im Folgenden mit Cnon (KM1),
Clow (KM5) und Chigh (KM6) bezeichnet. Im direkten Vergleich der drei Varianten konnten
deutliche Unterschiede bezüglich des Epithels festgestellt werden. So war die Epithelschicht
auf der unbehandelten Kollagenmembran Cnon häufig einschichtig und stellenweise
Ergebnisse
54
unvollständig. Auf Chigh und Clow entwickelte sich im Gegensatz dazu ein drei- bis
vierschichtiges, regelmäßiges Mundschleimhautepithel (siehe Abb. 13).
Abbildung 13: Unterschiede zwischen dem Mundschleimhautepithel auf quervernetzten und unbehandelten Varianten der Kollagenmembran Die Epithelschichte der Mundschleimhautzellen unterschied sich zwischen den verschiedenen Varianten der Kollagenmembran bezüglich der Anzahl der Schichten und der Regelmäßigkeit. Im Gegensatz zu Cnon war das Epithel auf den quervernetzten Varianten Clow und Chigh gleichmäßiger und aus bis zu vier Schichten aufgebaut (E: Epithel; KM: Kollagenmembran; HE-Färbung).
Mit dem Elektronenmikroskop konnten außerdem für alle Varianten typische ultrastrukturelle
Zeichen der epithelialen Differenzierung wie Desmosomen und zytoplasmatische Filamente
dargestellt werden. Für die Bindung an der Oberfläche der Kollagenmembranen wurden
Hemidesmosomen ausgebildet (siehe Abb. 14).
Abbildung 14: Elektronenmikroskopische Darstellung der Epithelschicht und ihre Bindung an die Kollagenmembranen Mithilfe des Elektronenmikroskops konnten Desmosomen (Stern) als interzelluläre Adhäsionsstrukturen und Hemidemosomen (Pfeile) als Adhäsionsstrukturen zwischen den basalen Epithelzellen und der Kollagenmembranen dargestellt werden (E: Epithel; KM: Kollagenmembran).
Cnon Clow Chigh
E
KM
Cnon Clow Chigh
E
KM
0,5µm
50µm
Ergebnisse
55
3.2.1.2 Immunhistologische Auswertung des Mundschleimhautepithels
Die Immunfluoreszenz-Färbungen der Mundschleimhautzellen auf den drei Varianten der
Kollagenmembran (Cnon, Clow and Chigh) zeigten keine Unterschiede bei der Expression des Zell-
Zell-Adhäsionsmarkers E-Cadherin und des Hemidesmosomenmarkers Integrin α6.
Desmosomen konnten in allen Zellschichten, Hemidesmosomen, wie bereits
elektronenmikroskopisch gezeigt, in den basalen Zellschichten dargestellt werden.
Unterschiede waren dafür bei der Differenzierung zu erkennen. Der Differenzierungsmarker
K4 wurde zwar auch in den oberen Zellschichten der quervernetzten Kollagenmembranen Clow
und Chigh exprimiert, war allerdings bei Zellen, die auf Cnon kultiviert wurden, stärker
ausgeprägt.
Die Expression der möglichen Stammzellmarker p63 und K15 war bei allen Membranvarianten
hauptsächlich in den basalen Zellen lokalisiert, aber auch hier waren Unterschiede zu
erkennen. Während p63 in Zellen auf allen Varianten, wenn auch in geringerer Zahl bei Cnon,
zu sehen war, wurde K15 nur auf den quervernetzten Varianten exprimiert (siehe Abb. 15).
Ergebnisse
56
Abbildung 15: Immunfluoreszenz-Färbungen der kultivierten Mundschleimhautzellen auf drei Varianten der Kollagenmembran Die Expression der putativen Stammzellmarker p63 und K15 war bei allen Kollagenmembranen in den basalen Zellen lokalisiert. Während p63 in den Zellen, die auf Cnon kultiviert wurden, in geringerer Zahl exprimiert wurde, konnten K15 positive Zellen nur auf Clow und Chigh nachgewiesen werden. Der Differenzierungsmarker K4 konnte in den oberen Zellschichten gezeigt werden und wurde in den Zellen auf Cnon stärker exprimiert. Integrin α6 positive Zellen (Hemidesmosomen) konnten ebenfalls in den basalen Zellschichten dargestellt werden. Der Zell-Zell-Adhäsionsmarker E-Cadherin konnte in allen Zellschichten nachgewiesen werden (blau: Zellkern; Negativkontrollen sekundärer Antikörper siehe Anhang).
p63
K15
K4
Integrin α6
E-Cadherin
40µM
Cnon
Cnon
Cnon
Cnon
Cnon
Clow
Clow
Clow
Clow
Clow
Chigh
Chigh
Chigh
Chigh
Chigh
Ergebnisse
57
3.2.2 Kultivierung der Limbusstammzellen
Im Hinblick auf die Therapie einer Limbusstammzellinsuffizienz wurde auch die Eignung der
drei Kollagenmembranen Cnon, Clow und Chigh als Wachstumsunterlage für limbale Epithelzellen
untersucht.
Hierfür wurden zunächst die Kultivierungsbedingungen optimiert und drei verschiedene, für
die Kultivierung von Limbusstammzellen typische Medien getestet. Dabei konnten
Unterschiede zwischen den Kultivierungsmedien festgestellt werden. Eine mehrlagige
Epithelschicht bildete sich nur bei der Kultivierung mit DMEM/F12-2-Medium aus.
Limbusstammzellen, die mit MCDB151 oder DMEM/F12-1-Medien kultiviert wurden,
entwickelten häufiger ein einschichtiges, teilweise unregelmäßiges Epithel (siehe Tab. 5).
Kulturmedium
Cnon Nicht quervernetzte Kollagenmembran
Clow Quervernetzte
Kollagenmembran mit 12,5µg/cm2 Riboflavin
Chigh Quervernetzte
Kollagenmembran mit 25µg/cm2 Riboflavin
MCDB151 Einschichtige
Zellschicht Vereinzelte Zellen Einschichtige Zellschicht
DMEM/F12-1 Ein- bis zweischichtige
Zellschicht Einschichtige Zellschicht
Ein- bis zweischichtige Zellschicht
DMEM/F12-2 Mehrschichtige
Zellschicht
Mehrschichtige Zellschicht
Mehrschichtige Zellschicht
Tabelle 5: Unterschiedliche Ausbildung der Mehrschichtigkeit von Limbusstammzellen nach Kultivierung mit verschiedenen Medien Bei der Kultivierung mit DMEM/F12-2 wurde die beste Ausbildung eines mehrschichtigen Limbusepithels beobachtet.
Aufgrund dieser Ergebnisse wurden die Zellen für die weiteren Versuche mit DMEM/F-12-2-
Medium kultiviert.
Beim histologischen Vergleich der verschiedenen Varianten der Kollagenmembran als
Kulturunterlage zeigten sich, im Gegensatz zu den Ergebnissen bei der Kultivierung von
Mundschleimhautepithel, keine Unterschiede. Auf allen Varianten wurde ein mehrschichtiges
Epithel ausgebildet (siehe Abb. 16A). Alle kultivierten Zellen zeigten im Elektronenmikroskop
außerdem typische Strukturen wie Desmosomen und zytoplasmatische Filamente. Auch die
Ergebnisse
58
Verankerung der Epithelschicht konnte durch die Darstellung von Hemidesmosomen bestätigt
werden (siehe Abb. 16B).
Abbildung 16: Limbusepithelschicht auf den Kollagenmembranvarianten Cnon, Clow und Chigh nach der Kultivierung mit DMEM/F12-2 (A) Auf allen Varianten der Kollagenmembran bildete sich ein mehrschichtiges Epithel aus. (B) Elektronenmikroskopisch konnten außerdem die für die Verankerung der Epithelzellen wichtigen Hemidesmosomen (Pfeile) dargestellt werden (E: Epithel, KM: Kollagenmembran; A: HE-Färbung).
Bei den Immunfluoreszenz-Färbungen konnten keine Unterschiede zwischen den
verschiedenen Membranvarianten bezüglich der Zell-Zell-Adhäsion (E-Cadherin) und der Zell-
Membran-Adhäsion (Integrin α6) dargestellt werden (siehe Abb. 17). Beide Marker wurden
auf jeder Kollagenmembran in der gesamten Epithelschicht (E-Cadherin) bzw. in den basalen
Zellen (Integrin α6) exprimiert. Auch der mögliche Stammzellmarker p63 konnte in den
Epithelschichten aller Kollagenmembranen nachgewiesen werden. Ein Unterschied konnte für
den Proliferationsmarker Ki-67 festgestellt werden. Dieser wurde nur in Epithelzellen
exprimiert, die auf Chigh kultiviert wurden.
Cnon
Cnon Clow
Clow Chigh
Chigh
A
B
KM
E
KM
E
0,5µM
50µm
Ergebnisse
59
Abbildung 17: Immunfluoreszenz-Färbungen von Limbusepithelzellen kultiviert auf drei Varianten (Cnon, Clow und Chigh) der Kollagenmembran Die Färbungen zeigten den Zell-Zell-Adhäsionsmarker E-Cadherin in allen Zellschichten. Der putative Stammzellmarker p63 konnte vor allem in der basalen Zellschicht nachgewiesen werden. Hemidesmosomen (Integrin α6) waren ebenfalls in den basalen Zellschichten auf allen Varianten der Kollagenmembran zu sehen. Der Proliferationsmarker Ki67 (Pfeile) wurde nur in den Epithelzellen exprimiert, die auf der quervernetzten Variante mit hohem Riboflavingehalt kultiviert wurden (blau: Zellkern, grün: Antikörper; Negativkontrollen der sekundären Antikörper siehe Anhang).
3.2.3 Kultivierung von Epithelzellen auf weiteren Varianten
Die Kultivierung der Mundschleimhautzellen auf den Varianten der Kollagenmembran mit
langkettigem Kollagen zeigte keine Unterschiede zu den Varianten, die gemäß der
Standardprozedur hergestellt wurden. Auf beiden Arten konnte eine regelmäßige
Epithelbildung beobachtet werden (siehe Abb. 12).
Elektronenmikroskopisch konnten nur geringe Unterschiede festgestellt werden zwischen der
Zusammensetzung der Kollagenmembranen, die mit dem Standardprozess und denen, die mit
dem alternativen Herstellungsprozess produziert wurden. Bei beiden Varianten konnte
Integrin α6
E-Cadherin
p63
Ki67
Cnon
Cnon
Cnon
Cnon Clow
Clow
Clow
Clow
Chigh
Chigh
Chigh
Chigh
100µm
Ergebnisse
60
ungefähr die gleiche Menge an Kollagenfasern zwischen amorphem Kollagen nachgewiesen
werden (siehe Abb. 18). Inwiefern aber tatsächlich eine Reduzierung des kurzkettigen
Kollagens stattgefunden hatte, konnte nicht festgestellt werden.
Abbildung 18: Vergleich der elektronenmikroskopischen Struktur der verschiedenen Varianten der Kollagenmembran Im Querschnitt zeigte sich ein geringer Unterschied zwischen den Kollagenmembranen, die mit dem Standardverfahren (Cnon) und denen, die mit dem alternativen Herstellungsprozess (KM10) produziert wurden. So konnten etwas mehr Kollagenfasern in den Kollagenmembranen festgestellt werden, die mit dem zweiten Verfahren hergestellt wurden (KM10), eine Aussage über die Menge an langkettigem Kollagen konnte allerdings nicht getroffen werden.
Die Zugabe von Antibiotikum führte zu einer deutlichen Verschlechterung der
Membraneigenschaften. Dabei konnte von keinen Zellen, weder von Mundschleimhaut- noch
von Limbusstammzellen ein gleichmäßiges Epithel ausgebildet werden (siehe Abb. 19).
Unabhängig vom Antibiotikumsgehalt und der Dicke der Kollagenmembranen adhärierten und
proliferierten nur wenige Zellen.
Cnon KM10 2,5µm
Ergebnisse
61
Abbildung 19: Vergleich des Epithelwachstums auf Kollagenmembranen mit Antibiotikum (A) Die Kultivierung von Mundschleimhaut- und (B) Limbusstammzellen auf Kollagenmembranen mit unterschiedlicher Menge Antibiotikum führte nicht zur Ausbildung eines mehrschichtigen Epithels. Es konnten nur vereinzelte Zellen (Pfeile) bzw. eine dünnes, unregelmäßiges Epithel (Sterne) nachgewiesen werden. Gleichzeitig veränderten sich die physikalischen Eigenschaften der Kollagenmembranen. Die Quellung nahm zu, und die Kollagenmembranen bekamen eine schwammige Konsistenz, welche die Adhäsion der Zellen erschwert.
Zudem zeigten die Kollagenmembranen mit Antibiotikum ein deutlich anderes physikalisches
Verhalten. Im Gegensatz zu den anderen Varianten quollen die Kollagenmembranen stark auf
und bekamen eine schwammige, teilweise unzusammenhängende Konsistenz. Dies führte
dazu, dass sich die dünnste Kollagenmembran während der Kultivierung der Zellen teilweise
vollständig auflöste und nur vereinzelte Kollagenfasern zurück blieben.
3.3 In-vivo-Versuche am Tiermodell
Die zwei verschiedenen Anwendungen der Kollagenmembranen in vivo sollten Aufschluss
über die Verträglichkeit im lebenden Organismus, einen möglichen Entzündungs- bzw.
Vaskularisierungsreiz und Unterschiede bezüglich des Abbaus geben.
3.3.1 Intrastromale Implantation ins Stroma
Die intrastromale Implantation wurde mit fünf Varianten der Kollagenmembran (Cnon, Clow,
Chigh, KM9, KM10) und, zum Vergleich, mit der Amnionmembran durchgeführt.
200 µm ABlow
ABlow ABmedium
ABmedium
ABhigh
ABhigh
A
B
OM
Lim
bu
s
Ergebnisse
62
3.3.1.1 Klinischer Verlauf
Insgesamt war die Verträglichkeit aller Kollagenmembranen sehr gut. Es ergaben sich sowohl
bei allen Varianten der Kollagenmembran als auch bei der Amnionmembran keinerlei
Anzeichen für Entzündungen oder Gefäßneubildungen während des Beobachtungszeitraums
von sechs Monaten. Unterschiede wurden allerdings bezüglich der Abbaugeschwindigkeit
festgestellt.
Bereits vier Wochen nach der Implantation zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen
der unbehandelten und den quervernetzten Membranvarianten (siehe Abb. 20A). Während
das Erscheinungsbild aller quervernetzten Varianten nahezu unverändert war, konnten
sowohl bei der unbehandelten Kollagenmembran als auch bei der Amnionmembran deutliche
Zeichen des Abbaus erkannt werden.
Nach weiteren zwei Monaten wurden auch bei den quervernetzten Kollagenmembranen
Zeichen der Degradation sichtbar, die jedoch über die folgenden Monate nicht deutlich
voranschritt. Im Gegensatz dazu waren die unbehandelte Kollagenmembran und die
Amnionmembran zu diesem Zeitpunkt klinisch kaum noch zu erkennen (siehe Abb. 20B).
Ergebnisse
63
Abbildung 20: Klinischer Verlauf der intrastromalen Implantation (A) Vier Wochen nach der intrastromalen Implantation der Membranen zeigten nur die Amnionmembran AM und die unbehandelte Kollagenmembran Cnon deutliche Anzeichen für einen Abbau. (B) Im Verlauf der nächsten fünf Monate konnte auch bei den quervernetzten Kollagenmembranen ein Abbau beobachtet werden, allerdings signifikant geringer als bei der Amnionmembran und bei Cnon. Diese waren nach 24 Wochen klinisch kaum noch sichtbar.
3.3.1.2 Histologische Querschnitte
Da zwischen den quervernetzten Kollagenmembranen bei der in-vivo-Implantation und in
vitro keine Unterschiede feststellbar waren, wurden für die weiteren in-vivo-Versuche die
Varianten Clow und Chigh ausgewählt.
Von den ausgewählten Varianten wurden am Ende des Beobachtungszeitraums histologische
Querschnitte angefertigt, um die Positionierung der Membranen im Stroma zu bestätigen und
deren Abbau zu kontrollieren.
Ergebnisse
64
Dabei konnten Residuen aller Membranen, auch derer, die klinisch nicht mehr sichtbar waren,
im Stroma nachgewiesen werden (siehe Abb. 21). Sechs Monate nach der Implantation
konnten die quervernetzten Kollagenmembranen deutlich vom umgebenden Stroma
abgegrenzt werden und waren von aktiven Keratozyten umgeben. Von unbehandelten
Kollagenmembranen und der Amnionmembran waren jeweils noch Reste zu erkennen. Im
Unterschied zu den quervernetzten Varianten waren bei Cnon und der Amnionmembran die
Keratozyten allerdings bereits in die Membranen eingewandert.
Abbildung 21: Histologische Querschnitte der Kaninchenhornhäute nach intrastromaler Implantation Sechs Wochen nach der intrastromalen Implantation konnten noch alle Membranen bzw. Reste davon nachgewiesen werden. In der unbehandelten Kollagenmembran Cnon und der Amnionmembran AM konnten außerdem das Einwandern von Keratozyten (Pfeile) beobachtet werden. Im Gegensatz dazu befanden sich die Keratozyten bei den quervernetzten Varianten Clow und Chigh noch an der Oberfläche der Kollagenmembranen (E: Epithel; S: Stroma; KM: Kollagenmembran; HE-Färbung).
3.3.1.3 Elektronenmikroskopische Untersuchungen
Die Invasion der Keratozyten nach sechs Monaten in die unbehandelte Kollagenmembran Cnon
konnte auch auf elektronenmikroskopischer Ebene bestätigt werden (siehe Abb. 22). Die
eingewanderten Keratozyten hatten außerdem die Neubildung von körpereigenen
Kollagenfibrillen unterstützt. Da die neugebildeten Kollagenfibrillen nur einen Durchmesser
Cnon Clow
Chigh AM
E
S
KM
200µm
Ergebnisse
65
von ca. 30 µm hatten, konnten sie gut von den dickeren Kollagenfibrillen der Membran (ca.
160–250 µm) unterschieden werden.
Bei den quervernetzten Kollagenmembranen spiegelte sich der geringe Abbau auch
elektronenmikroskopisch wieder. Im Gegensatz zu den anderen Membranen befanden sich
die Keratozyten nach sechs Monaten nur an der Grenzfläche von Clow und Chigh zum
umgebenden Hornhautstroma. Eine Neubildung von Kollagenfibrillen innerhalb dieser
Kollagenmembranen konnte nicht nachgewiesen werden.
Abbildung 22: Elektronenmikroskopische Aufnahmen intrastromal implantierter Membranen Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigen immigrierte Keratozyten (Sterne) in der unbehandelten Kollagenmembran Cnon und die damit verbundene Neubildung von körpereigenen Kollagenfibrillen (Pfeile) zwischen den größeren Kollagenfibrillen der Kollagenmembran. Bei den quervernetzten Kollagenmembranen Clow und Chigh befinden sich die Keratozyten noch an der Grenzfläche der Membranen zum umgebenden Hornhautstroma (S: Stroma; KM: Kollagenmembran).
3.3.2 Oberflächliche Implantation nach lamellärer Keratektomie
Da nach intrastromaler Implantation kein wesentlicher Unterschied zwischen der niedrig und
der hoch quervernetzten Variante erkennbar war, beschränkten wir uns für die oberflächliche
Implantation auf die Kollagenmembranen Cnon und die quervernetzte Variante Chigh. Zum
Vergleich wurden zusätzlich Amnionmembrantransplantationen durchgeführt. Die
Implantation war technisch ohne Probleme durchführbar. Die Membranen ließen sich mit
KM
S
S
KM
Ergebnisse
66
einem Trepan gut auf die benötigte Größe in Form und Durchmesser anpassen, und die Anlage
der Nähte erfolgte problemlos. Hierbei musste lediglich die Fadenspannung im Vergleich mit
der Amnionmembran etwas geringer angelegt werden, da sonst die Gefahr des
Fadendurchzugs bestand.
3.3.2.1 Klinischer Verlauf
Zwei Tage nach der Implantation waren alle Membranen klinisch deutlich sichtbar (siehe Abb.
23A). Die Anfärbung mit Fluorescein zeigte bereits eine beginnende, aber noch unvollständige
Epithelialisierung sowohl auf allen Kollagenmembranen als auch auf der Amnionmembran.
Klinische Abbauanzeichen konnten weder für die Kollagenmembranen noch für die
Amnionmembran zu diesem Zeitpunkt beobachtet werden.
Die Epithelialisierung war nach einer Woche weiter fortgeschritten (siehe Abb. 23B). Das
Epithel über der Amnionmembran war zu diesem Zeitpunkt fast komplett geschlossen.
Klinisch waren deutliche Unterschiede bezüglich der Degradation zu erkennen. Während die
Struktur von Chigh und von der Amnionmembran noch deutlich erkennbar war, zeigte Cnon
deutliche Zeichen des Abbaus vor allem in Bereichen, die nicht mit Epithel bedeckt waren.
Nach 14 Tagen war die Kollagenmembran Chigh noch gut zu erkennen, und die Anfärbung mit
Fluorescein zeigte eine vollständige, intakte Epithelschicht auf der Membran (siehe Abb. 23C).
Allerdings waren zu diesem Zeitpunkt ebenfalls Zeichen des Abbaus sichtbar. Im Gegensatz
dazu war die unbehandelte Membran weitgehend degradiert. Klinisch waren lediglich
vereinzelte Reste erkennbar. Die transplantierte Amnionmembran war komplett
epithelialisiert, zeigte klinisch aber auch deutliche Degradationszeichen.
Nach Ablauf des dreiwöchigen Beobachtungszeitraums waren sowohl Chigh als auch die
Amnionmembran klinisch ebenfalls nicht mehr sichtbar. Entzündungen oder
Vaskularisationen der Kollagenmembranen konnten, wie auch nach intrastromaler
Anwendung, in keinem Fall beobachtet werden.
Ergebnisse
67
Abbildung 23: Klinischer Verlauf nach oberflächlicher Implantation (A) Zwei Tage nach der oberflächlichen Implantation konnte eine beginnende Epithelialisierung an den Randbereichen aller verwendeten Membranen beobachtet werden. (B) Im Laufe der ersten Woche schritt die Epithelialisierung auf allen Membranen weiter voran. Im Gegensatz zur quervernetzten Kollagenmembran Chigh und der Amnionmembran AM konnten bei der unbehandelten Kollagenmembran Cnon gleichzeitig erste klinische Anzeichen für einen Abbau beobachtet werden. (C) Zwei Wochen nach dem Eingriff war das Epithel auf den Hornhäuten, die mit der Amnionmembran behandelt worden waren, vollständig geschlossen. Cnon war zu diesem Zeitpunkt weitgehend abgebaut. Das Epithel auf Chigh war nahezu vollständig geschlossen, und die Membran zeigten erste Anzeichen einer Degradation.
Ergebnisse
68
3.3.2.2 Histologische Querschnitte
Von allen Membranen wurden zu den verschiedenen Zeitpunkten histologische Querschnitte
der Hornhäute durch das Implantat angefertigt.
Bereits zwei Tage nach dem Eingriff konnte auf den Kollagenmembranen Cnon und Chigh ein
mehrschichtiges Epithel nachgewiesen werden (siehe Abb. 24A). Bei einem Vergleich der
beiden Membranen zeigte sich allerdings, dass das Epithel auf der quervernetzten
Kollagenmembran mehrschichtiger und regelmäßiger ausgebildet war als das Epithel auf der
unbehandelten Kollagenmembran. Auf der Amnionmembran konnte zu diesem Zeitpunkt
ebenfalls stellenweise Epithel gezeigt werden.
Nach Ablauf der ersten Woche war das Epithel auf der quervernetzten Kollagenmembran Chigh
weiterhin gut sichtbar und deutlich abgegrenzt (siehe Abb. 24B). Auch auf Cnon war das Epithel
ebenfalls geschlossen, allerdings konnte bereits eine Auflockerung der Kollagenfasern und ein
Eindringen von Keratozyten beobachtet werden. Die Amnionmembran war zu diesem
Zeitpunkt auch mit Epithel bedeckt, eine Invasion der Keratozyten konnte hier ebenfalls
beobachtet werden.
Zwei Wochen nach der Transplantation war Chigh immer noch gut vom Stroma abzugrenzen,
allerdings hatte auch hier der Abbau begonnen und eine Auflockerung der Kollagenmembran
war histologisch zu erkennen. (siehe Abb. 24C). Die unbehandelte Kollagenmembran Cnon war
zu diesem Zeitpunkt bereits fast vollständig abgebaut, sodass nur noch vereinzelte Reste
nachgewiesen werden konnten. Die Amnionmembran war ebenfalls noch sichtbar und
epithelialisiert, allerdings teilweise verdickt.
Die Degradation der Kollagenmembran Chigh schritt in der nächsten Woche weiter voran,
sodass nach drei Wochen nur noch die Amnionmembran mikroskopisch dargestellt werden
konnte.
Ergebnisse
69
Abbildung 24: Histologische Querschnitte der Kaninchenhornhäute nach oberflächlicher Implantation (A) Histologische Querschnitte der implantierten quervernetzten Kollagenmembran Chigh zeigten nach zwei Tagen ein mehrschichtiges corneales Epithel. Die unbehandelte Kollagenmembran Cnon war ebenfalls mit Epithelzellen bedeckt, allerdings war diese Zellschicht unregelmäßiger und dünner. (B) Eine Woche nach der Implantation konnte eine Auflockerung der Kollagenstruktur und die Migration von Keratozyten zwischen die Kollagenfasern bei Cnon beobachtet werden. Die Kollagenstruktur von Chigh war weiterhin kompakt und wies keine Anzeichen für einen Abbau auf. (C) Eine Auflockerung der Kollagenstruktur und ein beginnender Abbau konnte erst zwei Wochen nach dem Einsetzen der quervernetzten Kollagenmembran Chigh gezeigt werden.
3.3.2.3 Elektronenmikroskopische Untersuchungen
Zusätzlich zu den mikroskopischen Untersuchungen wurden die Hornhäute nach Implantation
der Membranen zu unterschiedlichen postoperativen Zeitpunkten mit dem
Elektronenmikroskop untersucht.
Dabei konnten die Epithelschicht und die dichte Struktur der beiden Kollagenmembranen Cnon
und Chigh dargestellt werden (siehe Abb. 25A). Außerdem konnten bei höherer Vergrößerung
bereits nach zwei Tagen Hemisdemosomen zwischen dem Epithel und beiden Varianten der
Kollagenmembran gefunden werden.
Der beginnende Abbau der unbehandelten Kollagenmembran Cnon eine Woche nach der
Implantation konnte auch elektronenmikroskopisch bestätigt werden (siehe Abb. 25B). Im
Gegensatz zu Chigh, welche eine intakte, dicht gepackte Kollagenstruktur aufwies, war bei Cnon
bereits eine Auflockerung der Kollagenfibrillen zu erkennen.
Ergebnisse
70
Diese Auflockerung konnte eine Woche später auch bei Chigh beobachtet werden. Die
Untersuchungen zeigten, dass die Kollagenfibrillen der oberen, dem Epithel zugewandten
Seite begannen aufzulockern (siehe Abb. 25C). Die Kollagenfibrillen im unteren, an das Stroma
angrenzenden Bereich waren zu diesem Zeitpunkt noch dicht gepackt. Von Cnon konnten nur
noch vereinzelte Reste und Kollagenfibrillen nachgewiesen werden.
Abbildung 25: Elektronenmikroskopische Aufnahmen der oberflächlich angewandten Kollagenmembranen Cnon und Chigh (A+B) Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen zwei Tage nach der Implantation zeigten corneales Epithel, welches über Hemidesmosomen (Pfeile) an beiden Varianten der Kollagenmembran fest angeheftet war. (C) Der Abbau der unbehandelten Kollagenmembran Cnon konnte auch auf ultrastruktureller Ebene beobachtet werden. Eine Woche nach der Implantation war die Auflockerung der kompakten Struktur der Kollagenmembran deutlich zu erkennen. (D) Bei der quervernetzten Variante Chigh war eine Auflockerung der oberen, dem Epithel zugewandten Schicht der Kollagenmembran nach zwei Wochen feststellbar (E: Epithel; KM: Kollagenmembran).
3.4 Materialeigenschaften der Kollagenmembranvarianten
Neben den biologischen Eigenschaften wurden auch die mechanischen und physikalischen
Eigenschaften der verschiedenen Kollagenmembranen untersucht. Die Untersuchungen
wurden an den, für die in-vitro- und in-vivo-Versuche ausgewählten Kollagenmembranen Cnon,
Clow und Chigh durchgeführt.
2 TAGE
1 WOCHE 2 WOCHEN
Ergebnisse
71
3.4.1 Druckstabilität
Im Vergleich zeigten die quervernetzten Membranen Clow and Chigh eine höhere mechanische
Stabilität als die unbehandelte Variante Cnon. Während Cnon bereits bei 12 N und 8 mm
Dehnung riss, hielten die quervernetzten Membranen deutlich länger stand. Allerdings zeigten
sich auch zwischen diesen Unterschiede. So zerriss Clow bei 23 N, Chigh bei 33 N (siehe Abb. 26).
Abbildung 26: Druckstabilität der verschiedenen Kollagenmembranvarianten Die quervernetzten Kollagenmembranen Clow und Chigh (grüne und blaue Kurve) wiesen im Vergleich zur unbehandelten Kollagenmembran Cnon (rote Kurve) eine größere Druckstabilität auf.
3.4.2 Quellung
Im trockenen Zustand war die Dicke der unbehandelten Variante Cnon (24 µm ± 1,3 µm) und
die der quervernetzten Kollagenmembran mit dem geringen Riboflavingehalt Clow (19 µm ±
0,6 µm) nahezu gleich. Quervernetzte Kollagenmembranen mit einem hohen Riboflavingehalt
(Chigh) waren geringfügig dicker (37 µm ± 0,6 µm).
Ergebnisse
72
Die Inkubation in Wasser verursachte, wie erwartet, bei den quervernetzten Varianten eine
geringere Schwellung als bei der unbehandelten Kollagenmembran. So betrug die
Dickenzunahme von Clow 15 µm ± 8 µm und von Chigh 16 µm ± 14 µm, von Cnon hingegen 24 µm
± 9 µm (siehe Abb. 27).
Abbildung 27: Quellung der Kollagenmembranen Der Dickenvergleich der Kollagenmembranen im trockenen und feuchten Zustand zeigte eine reduzierte Quellung der quervernetzten Kollagenmembranen Chigh und Clow im Vergleich zur unbehandelten Kollagenmembran Cnon.
3.4.3 Abbaugeschwindigkeiten im Kollagenaseassay
Die Abbaugeschwindigkeit der verschiedenen Varianten der Kollagenmembran unterschied
sich im Kollagenaseverdau deutlich. Die unbehandelte Kollagenmembran Cnon wurde sehr viel
schneller abgebaut als die quervernetzten Varianten. Erste Anzeichen für einen
enzymatischen Abbau konnten bei Cnon bereits 30 min nach Inkubationsbeginn erkannt
werden. Nach insgesamt 70 min waren die unbehandelten Kollagenmembranen vollständig
abgebaut. Im Gegensatz dazu begann der Abbau der quervernetzten Varianten nach 40 min
und setzte sich verlangsamt über 80 min fort. Selbst 130 min nach Inkubationsbeginn waren
noch Reste der Kollagenmembranen zu erkennen. Im Vergleich wurde Clow zu Beginn etwas
langsamer abgebaut, erreichte aber nach 130 min denselben Auflösungszustand wie Chigh
(siehe Abb. 28).
Ergebnisse
73
Abbildung 28: Enzymatischer Abbau der Kollagenmembranvarianten Im Vergleich zu der nicht quervernetzten Kollagenmembran Cnon (rote Kurve) wurden die quervernetzten Varianten Clow und Chigh (grüne und blaue Kurve) verzögert abgebaut.
3.5 Klinische Anwendungsbeobachtung
Für die klinische Anwendungsbeobachtung wurde die unbehandelte Kollagenmembran Cnon
ausgewählt. Insgesamt konnten fünf Patienten eingeschlossen werden. Der klinische Verlauf
bei jedem einzelnen Patienten wird im Folgenden dargestellt.
3.5.1 Patient 01
Patient 01 wurde mit einer neurothrophen, teilweise verkalkten Hornhautulzeration im
rechten Auge in der Sprechstunde des Universitätsklinikums Erlangen vorstellig. Die
Ulzeration befand sich am nasalen Rand der Cornea und betrug ca. 4,5 x 5,0 mm (siehe Abb.
29A). Lokal pflegende Augentropfen hatten zu keiner Befundbesserung beigetragen. Auch
unter stationärer Kontrolle konnte im klinischen Verlauf unter konservativer Therapie keine
Verkleinerung des Hornhautdefektes herbeigeführt werden.
Ergebnisse
74
Operativ wurde nach mechanischer Lösung von Verkalkungen die Kollagenmembran einlagig
in die Ulzeration implantiert und eingenäht (10-0 Nylon). Zusätzlich wurde eine
Verbandskontaktlinse eingesetzt. Die postoperative Therapie wurde analog zur präoperativen
Therapie unter Zugabe von antibiotischen (Ofloxacin) Augentropfen fortgesetzt.
Während die Kollagenmembran am ersten Tag noch vollständig vorhanden war, konnten am
zweiten Tag erste Anzeichen für einen Abbau an den Rändern der Membran festgestellt
werden (siehe Abb. 29B). Die Degradation schritt im Verlauf der nächsten 24 Stunden schnell
voran, sodass an Tag 3 nur noch Reste innerhalb des Ulkusbetts erkennbar und die
Kollagenmembran nahezu vollständig aufgelöst war (siehe Abb. 29C).
Da zu diesem Zeitpunkt kein Epithelschluss erfolgt war, wurde eine
Amnionmembrantransplantation durchgeführt.
Abbildung 29: Klinischer Verlauf nach Anwendung der unbehandelten Kollagenmembran Cnon bei Patient 01 (A) Im rechten Auge des Patienten befand sich eine 4,5 x 5,0 mm große Ulzeration. (B) nach der Implantation der unbehandelten Kollagenmembran Cnon konnten am zweiten Tag erste klinische Anzeichen für einen Abbau beobachtet werden. Die gelbliche Färbung wurde durch die eingesetzte Verbandskontaktlinse verursacht und hat keinen Einfluss auf die Heilung. (C) Drei Tage nach dem Einsetzen der Kollagenmembran waren nur noch Reste der Kollagenmembran vorhanden, das Epithel war zu diesem Zeitpunkt nicht geschlossen.
3.5.2 Patient 02
Bei Patient 02 wurde 2008 eine lamelläre Keratoplastik am linken Auge durchgeführt.
Aufgrund einer neurotrophen Keratopathie bei rezidivierenden Herpeskeratitiden hatte sich
am oberen Rand des Transplantats eine 1,5 mm x 3,0 mm große Ulzeration gebildet (siehe
Abb. 30A). Unter konservativer Therapie konnte im klinischen Verlauf kein wesentlicher
Epithelschluss nach fünf Tagen erreicht werden. Aus diesem Grund erfolgte die operative
Therapie durch Implantation einer Kollagenmembran.
Ergebnisse
75
Zunächst wurde eine Kollagenmembran in die Ulzeration eingesetzt. Zusätzlich wurde bei
diesem Patienten eine zweite Kollagenmembran als Patch über die gesamte Hornhaut
vernäht. Am Ende der Operation wurde eine Verbandskontaktlinse eingesetzt.
Der Patch war bereits am ersten Tag vollständig abgebaut (siehe Abb. 30B). Die in den Defekt
eingesetzte Membran war klinisch jedoch weiterhin gut erkennbar. Innerhalb der nächsten 24
Stunden wurde auch sie komplett abgebaut (siehe Abb. 30C). Da bei diesem Patienten das
Epithel nicht vollständig geschlossen war, wurde im weiteren Verlauf eine
Amnionmembrantransplantation durchgeführt.
Abbildung 30: Klinischer Verlauf nach Anwendung der unbehandelten Kollagenmembran Cnon bei Patient 02 (A) Mithilfe der Fluoresceinfärbung konnte die Ulzeration von Patient 02 am Rand des Hornhauttransplantats dargestellt werden. (B+C) Innerhalb von zwei Tagen wurde die Kollagenmembran Cnon vollständig abgebaut. Da das Epithel weiterhin nicht geschlossen war, wurde eine Amnionmembrantransplantation durchgeführt.
3.5.3 Patient 03
Ebenfalls mit einem neurotrophen Hornhautulkus mit leukozytärem Infiltrat stellte sich
Patient 03 in der Augenklinik vor. Das 4,6 x 4,8 mm große Ulkus befand sich im rechten Auge
am temporalen Rand der Hornhaut (siehe Abb. 31A). Da keine Besserung des Befunds unter
konservativer Therapie über sieben Tage erreicht werden konnte, erfolgte auch in diesem Fall
eine operative Versorgung mit der Kollagenmembran. Hierbei wurde eine Kollagenmembran
in die Ulzeration eingenäht (Graft) und eine zweite als zusätzlicher Schutz (Patch) großflächig
darüber vernäht (jeweils mit 10-0 Nylon). Abschließend wurde eine Verbandskontaktlinse
eingesetzt.
Am dritten Tag war der Patch bereits vollständig abgebaut, während der Graft lediglich am
Rand kleinere Anzeichen des Abbaus aufwies (siehe Abb. 31B). Im Verlauf der nächsten zwei
Tage wurde auch diese Kollagenmembran weitestgehend abgebaut (siehe Abb. 31C), sodass
Ergebnisse
76
an Tag 6 nur noch wenige Reste innerhalb des Ulkusbetts zu erkennen waren (siehe Abb. 31D).
Die Fluoresceinfärbung zu diesem Zeitpunkt zeigte nur noch eine kleine Färbung im Bereich
der Fäden. Es waren keine vermehrte Entzündung oder Neovaskularisation erkennbar
Abbildung 31: Klinischer Verlauf nach Anwendung der unbehandelten Kollagenmembran Cnon bei Patient 03 (A) Die Ulzeration des Patienten 03 (Markierung) wurde mit zwei Lagen (Graft und Patch) der Kollagenmembran Cnon versorgt. (B) Die äußere Verbandsmembran war nach drei Tagen bis auf wenige Reste abgebaut. (C) Im Verlauf der nächsten zwei Tage wurde auch die untere, in die Ulzeration eingesetzte Kollagenmembran degradiert. (D) Am sechsten Tag waren nur noch Reste des Grafts erkennbar und das Epithel geschlossen. Die geringe Fluoresceinfärbung trat aufgrund kleinerer Läsionen auf, die beim Entfernen der Fäden entstanden.
Fluorescein
Ergebnisse
77
Bei Wiedervorstellung vier Wochen nach dem Eingriff waren keine Reste der Folie mehr
sichtbar und die Hornhaut war deutlich aufgeklart. Das Epithel war geschlossen und der
Patient beschwerdefrei (siehe Abb. 32).
Abbildung 32: Klinischer Befund präoperativ und vier Wochen nach der Implantation einer Kollagenmembran Bei Wiedervorstellung vier Wochen nach der Implantation einer Kollagenmembran war das Epithel vollständig geschlossen und die Hornhaut deutlich aufgeklart. Entzündungen oder Neovaskularisationen waren nicht aufgetreten.
3.5.4 Patient 04
Patient 04 hatte bei Vorstellung in der Augenklinik eine 3,7 x 1,8 mm große
Hornhautulzeration mit persistierenden Epitheldefekten im linken Auge (siehe Abb. 33A).
Ursache hierfür war eine chronische Entzündung der Augenlider und der Bindehaut
(Blepharokonjunktivitis) aufgrund einer Hauterkrankung (Rosacea). Der beständige
Entzündungsreiz verhinderte eine Heilung des Epithels und hatte eine Ulzeration zur Folge.
Auch unter antiinflammatorischer und pflegender Therapie sowie mehrmaligen
Amnionmembrantransplantationen konnte über einen Zeitraum von drei Jahren keine
deutliche Befundbesserung erreicht werden.
Die Kollagenmembran wurde bei diesem Patienten ebenfalls mehrlagig angewendet. Dabei
wurde die innerste Kollagenmembran direkt in die Ulzeration eingesetzt und mit einer
zweiten, größeren Membran fixiert. Die unterste Kollagenmembran wurde aufgrund der
Defektgröße und -form nicht vernäht. Über die gesamte Hornhaut wurde anschließend noch
eine dritte Kollagenmembran (Patch) genäht (10-0 Nylon). Abschließend erfolgte die Einlage
einer Verbandskontaktlinse.
Ergebnisse
78
Weder an Tag 1 noch an Tag 2 waren klinische Anzeichen für einen Abbau der
Kollagenmembranen erkennbar (siehe Abb. 33B). Am dritten Tag hingegen war die oberste
Verbandsmembran nahezu komplett abgebaut und nur noch vereinzelte Reste an den Fäden
zu sehen (siehe Abb. 33C). Erste Abbauanzeichen waren zu diesem Zeitpunkt auch an den
Nähten der mittleren Kollagenmembran zu erkennen. Im Verlauf der nächsten drei Tage
wurde auch diese Kollagenmembran vollständig abgebaut, sodass nur von der untersten
Schicht noch Reste vorhanden waren (siehe Abb. 33D). Am siebten Tag konnte klinisch keine
weitere Degradation der Kollagenmembran beobachtet werden. Die Fluoresceinfärbung
zeigte auch bei diesem Patienten ein vollständig geschlossenes Epithel ohne Hinweis auf
membranbedingte Entzündungen bzw. Neovaskularisationen.
Ergebnisse
79
Abbildung 33: Klinischer Verlauf nach Anwendung der unbehandelten Kollagenmembran Cnon bei Patient 04 (A) Die Fluoresceinfärbung im linken Auge des Patienten zeigte einen Epitheldefekt im Zentrum der Hornhaut. (B) Die Anwendung der Kollagenmembran erfolgte in diesem Fall dreilagig, wobei die innerste Lage aufgrund der Defektgröße nicht vernäht wurde. Zwei Tage nach dem Eingriff waren noch alle Lagen vollständig vorhanden (C) Die oberste Kollagenlage war am dritten Tag abgebaut, die mittlere Lage zeigte erste Anzeichen für einen Abbau am dritten Tag. (D) Nach sieben Tagen waren die oberen zwei Lagen der Kollagenmembran vollständig abgebaut, während von der inneren Schicht noch Reste zu erkennen waren. Mithilfe der Fluoresceinfärbung konnte der Schluss des Epithels bestätigt werden.
Die Wiedervorstellung erfolgte vier Wochen nach dem Eingriff. Zu diesem Zeitpunkt waren
das Epithel geschlossen und die krankheitsbedingten Entzündungen abgeklungen (siehe Abb.
34).
Ergebnisse
80
Abbildung 34: Klinischer Befund bei Wiedervorstellung vier Wochen nach der Implantation einer Kollagenmembran Vier Wochen nach der Implantation war das Epithel vollständig geschlossen und keine weiteren Entzündungen aufgetreten. Reste der als Graft implantierten Kollagenmembran waren weiterhin sichtbar.
3.5.5 Patient 05
Mit einer 3,0 x 2,5 mm großen, persistierenden Ulzeration im rechten Auge, wurde Patient 05
in der Sprechstunde der Augenklinik vorstellig (siehe Abb. 35A). Grund für die Erkrankung war
eine bakterielle Superinfektion durch Moraxella lacunata. Diese war bereits durch die Cornea
ins Augeninnere vorgedrungen und hatte eine Eiteransammlung in der Vorderkammer
(Hypopyon) zur Folge. Nach der Gabe von Antibiotikum über zwei Wochen war die Infektion
abgeklungen, da aber ein Epithelschluss nicht erreicht werden konnte wurde die Implantation
der Kollagenmembran durchgeführt.
Die Kollagenmembran wurde als Graft mehrlagig in den Ulkusbereich eingepasst und
eingenäht. Eine die Hornhaut überspannende Kollagenmembran wurde als Patch aufgenäht.
Abschließend wurde eine Verbandskontaktlinse eingesetzt (siehe Abb. 35B). Im Verlauf der
ersten zwei Tage blieben die Kollagenmembranen morphologisch stabil, lediglich die äußerste
Ergebnisse
81
Kollagenmembran erschien dünner. Bei der nächsten Kontrolle acht Tage nach dem Eingriff
waren die Kollagenmembranen fast vollständig abgebaut. Nur noch minimale Reste waren
erkennbar (siehe Abb. 35C).
Abbildung 35: Klinischer Verlauf nach Anwendung der unbehandelten Kollagenmembran Cnon bei Patient 05 (A) Im rechten Auge des Patienten war aufgrund einer bakteriellen Infektion eine Hornhautulzeration entstanden. (B) Die Kollagenmembran wurde zweilagig angewendet: als graft in der Ulzertion und als patch darüber. (C) Drei Tage nach dem Eingriff, waren beide Membranen noch deutlich sichtbar. (D) Der Abbau schritt in den nächsten Tagen voran, sodass am achten postoperativen Tag nur noch minimale Anteile der Kollagenmembranen zu erkennen waren. Ein vollständiger Epithelschluss hatte zu diesem Zeitpunkt noch nicht stattgefunden.
Zu diesem Zeitpunkt hatte sich die Ulzeration zwar bereits verkleinert, ein kompletter
Epithelschluss konnte allerdings nicht beobachtet werden. Zur Verbesserung des
Krankheitsbildes wurde eine Amnionmembrantransplantation durchgeführt.
Diskussion
82
4 Diskussion
4.1 Biokompatibilität der Kollagenmembranen
Bei der Anwendung in vivo wurden mit den verschiedenen Methoden, intrastromal und
oberflächlich, unterschiedliche, für die klinische Anwendung unerlässliche Aspekte
untersucht. So sollte die intrastromale Implantation der Kollagenmembranen in erster Linie
über Entzündungen, Neovaskularisationen und immunologische Abstoßungsreaktionen
Aufschluss geben. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten allerdings für keine der
Varianten negative und unerwünschte Reaktionen auf das Material. Ganz im Gegenteil: Die
Kollagenmembranen wurden vollständig integriert und förderten im Fall der unbehandelten
Kollagenmembran Cnon sogar die Neubildung von körpereigenem Kollagen. So konnte eine
Umstrukturierung der Kollagenmembran durch Abbau auf der einen Seite und die Neubildung
von Kollagen auf der anderen Seite beobachtet werden. Auch im Fall der oberflächlichen
Anwendung, welche vor allem die Eignung der Kollagenmembranen als Wachstumsunterlage
für ein stabiles Epithel und die Abbaugeschwindigkeit überprüfen sollte, konnten keine
Irritationen des umliegenden Gewebes festgestellt werden. Die Kollagenmembranen wurden
von cornealem Epithel überwachsen und unterstützen somit die Heilung der Wunde. Die Zeit
bis zur vollständigen Reepithelialisierung nach der oberflächlichen Keratektomie und der
Transplantation war hierbei auch vergleichbar mit der Abheilungszeit nach einer
oberflächlichen Keratektomie ohne Transplantation (Williams et al., 2007).
Die Biokompatibilität aller getesteten Kollagenmembranen erwies sich damit als sehr gut und
bestätigte frühere Untersuchungen bezüglich der Verträglichkeit im Augenhintergrund
(Thumann et al., 2009). Auch hier konnten keine Entzündungen und Abstoßungsreaktionen
beobachtet werden.
Das Verhalten der Kollagenmembranen in vivo deckt sich so auch mit den Anforderungen, die
an Materialen, welche im Rahmen des Tissue engineering geschaffen werden, gestellt werden.
So schädigen die Kollagenmembranen das Gewebe nicht, sondern unterstützen es in seiner
Funktion (Neubildung der Kollagenfasern) und werden von den zellulären Strukturen
akzeptiert (Ausbildung eines stabilen Epithels).
Diskussion
83
4.2 Auswirkungen des Crosslinkings mit Riboflavin und UV-Licht
Die chemische Behandlung von Kollagenmembranen mit dem Ziel, ihre Festigkeit und
Stabilität zu erhöhen, wurde bereits früher untersucht. Dabei fand das in dieser Arbeit
beschriebene Crosslinking mit Riboflavin und UV-Licht allerdings noch keine Verwendung,
obwohl diese Methode in der Augenheilkunde bereits weit verbreitet ist.
Bei der Auswertung der Ergebnisse zeigte sich, dass die Modifizierung der Kollagenmembran
durch Crosslinking mit Riboflavin und UV-Licht nicht nur die erwarteten Auswirkungen auf die
Stabilität der Kollagenmembran hatten, sondern auch das Wachstum der Epithelzellen positiv
beeinflussten.
4.2.1 Erhöhung der Stabilität und Reduzierung der Abbaugeschwindigkeit
Es ist bereits bekannt, dass Kollagen mit zunehmender Anzahl an Quervernetzungen
widerstandsfähiger gegenüber Proteolyse und Degradation wird (Banga and Balo, 1965).
Diese Aussage konnte auch für die hier untersuchte Kollagenmembran bestätigt werden.
So bewirkte die Ausbildung neuer Quervernetzungen innerhalb der Kollagenmembranen eine
Verbesserung der Stabilität und eine erhöhte Resistenz gegen den Abbau von Kollagenasen.
Sowohl im Kollagenaseassay als auch bei der Anwendung im Tiermodell verzögerte sich der
Abbau der Kollagenfasern, sodass die quervernetzten Kollagenmembranen bei der
oberflächlichen Implantation eine Woche länger nachgewiesen werden konnten als die
unbehandelten Kollagenmembranen. Die Zeitspanne des Abbaus vergrößerte sich bei der
intrastromalen Anwendung zwischen den Kollagenmembranen noch weiter. Und auch die
Untersuchungen bezüglich Druckstabilität und Quellung bestätigten die Veränderungen des
Materials.
Bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigte sich außerdem, dass die
Auflockerung der Kollagenfasern bei der oberflächlichen Implantation an der dem Epithel
zugewandten Seite begann. Diese Beobachtung deckt sich mit den Ergebnissen der
intrastromalen Anwendung, bei der ein deutlich verzögerter Abbau festgestellt wurde. Der
Abbau der Kollagenmembranen scheint also bei der oberflächlichen Anwendung mehr von
Diskussion
84
den Epithelzellen als von den Keratozyten auszugehen. Allerdings wird der Abbau der
oberflächlich transplantierten Kollagenmembran zusätzlich auch durch die Tränenflüssigkeit
und die darin enthaltenen Kollagenasen beschleunigt.
Während die unterschiedliche Abbaugeschwindigkeit intrastromal keine direkten
Auswirkungen hatte, zeigte sich bei der oberflächlichen Implantation ein Vorteil der erhöhten
Stabilität. Durch die längere Stabilität und somit durch die höhere Festigkeit der Oberfläche
hatte das Epithel mehr Zeit, um über die Kollagenmembran zu wachsen und eine stabile
Zellschicht zu entwickeln.
4.2.2 Einfluss des Riboflavins auf die kultivierten Epithelzellen
Zusätzlich zu den Auswirkungen auf die physikalischen Eigenschaften der quervernetzten
Kollagenmembranen beeinflusste das Crosslinking auch das Wachstum der Epitehelzellen
positiv. Riboflavin (Vitamin B2) spielt für eine Vielzahl von Stoffwechselreaktionen eine
wichtige Rolle. Es ist ein zentraler Bestandteil der Kofaktoren Flavinmononukleotid (FMN) und
Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), welche als Koenzyme für ein breites Spektrum zellulärer
Prozesse (z.B. Energie-, Fettsäure-, Kohlenhydrat- und Proteinstoffwechsel) fungieren
(Powers, 2003). Aufgrund seiner Bedeutung für essentielle zelluläre Prozesse ist es auch ein
gebräuchlicher Bestandteil von Zellkulturmedien. Wir vermuten nun, dass die Medien von
Kulturen mit quervernetzten Kollagenmembranen, vor allem zu Beginn, eine höhere
Riboflavinkonzentration aufweisen aufgrund der Auswaschung des Riboflavins aus den
Kollagenmembranen. Dieser Auswaschungseffekt wird bereits bei der Anwendung von
Kollagenmembranen mit Antibiotikum genutzt, um eine kontinuierliche Abgabe des
Antibiotikums an die Umgebung zu ermöglichen. So konnte bei der Inkubation der
quervernetzten Kollagenmembranen in PBS eine gelbliche Verfärbung festgestellt werden,
deren Intensität von der zugegebenen Riboflavinmenge abhängig war.
Somit könnte die erhöhte Riboflavinkonzentration eine mögliche Erklärung für das bessere
und gleichmäßigere Wachstum sein, welches sowohl in der Zellkultur als auch bei der
oberflächlichen Anwendung der Kollagenmembranen im Tiermodell auffiel. Obwohl die
beobachtete Verbesserung des Epithelwachstums durch zusätzliches Riboflavin statistisch
Diskussion
85
nicht bestätigt werden konnte, vermuten wir einen Zusammenhang zwischen der erhöhten
Riboflavinkonzentration und dem besseren Epithelwachstum. Diese Vermutung gründet auch
auf die unterschiedlichen Ergebnisse der Immunfluoreszenz-Färbungen.
So könnte die unterschiedliche Expression der möglichen Stammzellmarker p63 und K15 und
des Differenzierungsmarkers K4 bei den Immunfluoreszenz-Färbungen der Mundschleimhaut
auch auf die erhöhte Riboflavinkonzentration der quervernetzten Kollagenmembran
zurückgeführt werden. P63 ist ein Transkriptionsfaktor und wird im Zellkern exprimiert. Er
wird vor allem in der basalen Zellschicht von mehrschichtigem Epithel nachgewiesen und
scheint essentiell für die Entwicklung und Differenzierung des Epithels zu sein (Schlotzer-
Schrehardt and Kruse, 2005). So verfügen p63-knockout-Mäuse über keine mehrschichtigen
Plattenepithelien (Yang et al., 1999).
Ergebnisse verschiedener Studien deuten allerdings darauf hin, dass p63 nicht nur ein Marker
für Stammzellen, sondern auch für junge, hoch proliferative Vorläuferzellen (TACs) ist (Chee
et al., 2006; Dua et al., 2003; Kim et al., 2004; Schlotzer-Schrehardt and Kruse, 2005). Dies ließ
sich aus dem Expressionsgradienten vom Limbus über die Peripherie bis zum Zentrum der
Cornea folgern. Während p63 im Limbus noch sehr stark exprimiert wird, nimmt es über die
Peripherie immer weiter ab und ist im Zentrum nur noch vereinzelt zu finden, entsprechend
zur Verteilung der Vorläuferzellen (Pellegrini et al., 2001). Der positive Nachweis von p63 zeigt
demzufolge den Zelltyp an und lässt auf ein hohes Proliferationspotential und eine geringe
Differenzierung schließen.
Im Gegensatz dazu scheint K15, ein Intermediärfilament und Bestandteil des Zytoskeletts,
spezifischer für Stammzellen zu sein. K15 wurde erstmals als Stammzellmarker für
Haarfollikelzellen (Lyle et al., 1998), später auch für andere Gewebe wie die
Mundschleimhaut, beschrieben (Kose et al., 2007). Allerdings ist die Identifizierung von
limbalen Stammzellen schwierig, da zum jetzigen Zeitpunkt kein eindeutiger Marker
identifiziert werden konnte. Für den Nachweis von Stammzellen wird daher immer auf eine
Kombination mehrerer Marker bzw. den Ausschluss bestimmter Marker zurückgegriffen.
Bei den Versuchen dieser Arbeit waren im Vergleich mehr Zellen auf den quervernetzten
Kollagenmembranen für p63 und K15 positiv. Zur selben Zeit waren weniger Epithelzellen auf
Chigh und Clow positiv für den Differenzierungsmarker K4. Die Kombination der beiden Marker
legt die Vermutung nahe, dass die Zellen auf den quervernetzten Kollagenmembranen
Diskussion
86
weniger stark differenziert waren und somit noch eine größere Anzahl an Stammzellen bzw.
hoch proliferativen TACs vorhanden war.
Ein ähnlicher Effekt konnte auch für die Limbusstammzellen beobachtet werden. In diesem
Fall konnte der Proliferationsmarker Ki-67 nur in Epithelzellen, welche auf Chigh kultiviert
wurden, nachgewiesen werden. Ki-67 ist eng mit der Zellproliferation assoziiert und auf der
Oberfläche der Chromosomen lokalisiert. Aufgrund seiner Aktivität während der aktiven
Phasen der Zellteilung gilt Ki-67 als Proliferationsmarker (Scholzen and Gerdes, 2000). Es wird
außerdem vermutet, dass Ki-67 an der frühen rRNA-Synthese beteiligt ist (Bullwinkel et al.,
2006). Allerdings ist anzumerken, dass das Vorhandensein von Ki-67 negativen Zellen nicht
zwingend bedeutet, dass diese Zellen nicht mehr teilungsfähig sind. Diese ruhenden Zellen
können zu einem späteren Zeitpunkt auch wieder proliferieren (Scholzen and Gerdes, 2000).
Eine geringe Differenzierung der Epithelzellen mit gleichzeitig hohem Proliferationspotential
würde bei der Anwendung am Auge einen Vorteil bedeuten. Ob das Riboflavin tatsächlich den
Erhalt der Stammzelleigenschaften unterstützt und die Differenzierung verzögert, ist
allerdings zum jetzigen Zeitpunkt noch Spekulation, da über die Auswirkungen von Riboflavin
in Zellkulturmedien auf das Schicksal von epithelialen Stammzellen noch zu wenig bekannt ist.
4.3 Klinische Anwendung am Auge
Bei der klinischen Anwendung der unbehandelten Kollagenmembran Cnon konnten
verschiedene Ergebnisse festgestellt werden. So konnte bei drei Patienten (Patient 01, 02 und
05) keine Verbesserung der Erkrankung durch das Aufbringen der Kollagenmembran erreicht
werden. Bei den anderen beiden (Patient 03 und 04) hingegen war die Anwendung
erfolgreich.
Als Ursache für die gescheiterte Anwendung kommen verschiedene Gründe infrage. So wurde
bei Patient 01 nur eine Schicht der Kollagenmembran verwendet, welche vor der endgültigen
Heilung bereits wieder abgebaut worden war. Bei Patient 02 und 05 wurde zwar eine zweite
Kollagenschicht angewendet, aber dafür waren die Augen dieser Patienten sehr stark
entzündet. Dadurch wurde die Kollagenmembran massiv von Entzündungsfaktoren und
Diskussion
87
Kollagenasen angegriffen. In diesem Fall hätte eventuell die Anwendung der quervernetzten
und somit stabileren Kollagenmembran eher zum Erfolg geführt.
Insgesamt zeigte sich aber, dass die unbehandelte Kollagenmembran durchaus für eine
klinische Anwendung geeignet ist und die Heilung einer cornealen Ulzeration unterstützt. So
konnte in zwei Fällen ein Epithelwachstum und eine Verbesserung des Krankheitsbilds ohne
Entzündungs- oder Abstoßungsreaktionen erreicht werden. Allerdings sollte diese Variante
eher bei leichteren Grunderkrankungen ohne starke bakterielle oder virale Entzündungen
angewendet werden, um einen vorzeitigen Abbau zu verhindern und ein gutes Ergebnis zu
erzielen.
4.4 Vergleich mit anderen Biomaterialien
Das klassische Ziel des Tissue engineerings von cornealem Gewebe ist es, ein Material zu
entwickeln, welches das getrübte Stroma entweder teilweise oder eventuell sogar vollständig
ersetzt. In diesem Zusammenhang muss der stromale Ersatz sehr stabil und transparent sein.
So zeigte sich bei einigen Untersuchungen zwar gute Verträglichkeit, gleichzeitig aber wurde
die Invasion von Keratozyten und somit auch eine Umgestaltung des Transplantats verhindert
(Duncan et al., 2010; Dunn et al., 1967; Fagerholm et al., 2009; Gil et al., 2010).
Außerdem wurden in anderen Studien bereits zahlreiche alternative biologische Materialien
wie Seide, Keratin oder PGA/PAA (Lawrence et al., 2009; Lawrence et al., 2012; Reichl et al.,
2011; Tan et al., 2013) getestet. Da die Ergebnisse allerdings sehr unterschiedlich ausfielen
und bis jetzt noch keine klinischen Studien durchgeführt wurden, konnte sich keines der
Materialien gegen die Amnionmembran durchsetzen und im klinischen Alltag etabliert
werden.
Insgesamt scheint Kollagen derzeit am geeignetsten zu sein, auch wenn gerade bezüglich der
quervernetzten Kollagenmembranen ebenfalls noch nicht viele klinische Ergebnisse vorliegen.
Einige der entwickelten Kollagenmembranen müssen vor der eigentlichen Anwendung mit
Keratozyten vorkultiviert werden bzw. durchlaufen verschiedene präoperative
Behandlungsschritte. So wurden z. B. verschiedene Versuche mit abbaubaren
Kollagengerüsten durchgeführt. In diese wurden fibroblastische Zellen gesät, welche die
Diskussion
88
Gerüste in stroma-ähnliche Strukturen umwandeln, sodass die Empfänger-Fibroblasten
leichter in das Material einwandern können (Ruberti and Zieske, 2008).
Klinische Untersuchungen an Patienten wurden bisher erst für eine, als Stromaersatz
entwickelte, quervernetzte Kollagenmembran durchgeführt. Bei der Studie wurden die
Membranen aus rekombinantem, humanem Typ III Kollagen nach lamellären Keratoplastiken
eingesetzt. Während der Abheilung zeigten sich stellenweise Epithelialisierungsprobleme und
nur geringe Anzeichen für einen Abbau oder eine Umgestaltung des Materials (Fagerholm et
al., 2009; Fagerholm et al., 2010; Lagali, 2011).
Im Gegensatz zu den Arbeiten an bisher klinisch untersuchten Materialien, welche vor allem
einen dauerhaften Ersatz des Stromas zum Ziel hatten, war das Ziel dieser Arbeit, ein Material
zu entwickeln, dass in seinen Eigenschaften der Amnionmembran gleicht, die
Epithelialisierung unterstützt und abgebaut bzw. in die Wunde integriert wird. Das Material
soll an der Augenoberfläche angewendet werden und die Ausbildung einer vollständigen
Epithelschicht unterstützen. Optische Klarheit wurde dabei, wie auch bei der
Amnionmembran, nicht als entscheidendes Kriterium angesehen.
Bei Entzündungen der Augenoberfläche verhindert die veränderte Struktur des Stromas eine
stabile Bindung, Proliferation und Migration des Epithels. Eine gesunde und intakte
Epithelschicht ist allerdings wiederum Vorraussetzung für das Abklingen der Entzündung
während des Heilungsprozesses. Somit sollte mithilfe der Kollagenmembran zunächst eine
Epithel ausgebildet werden und die Entzündung abklingen. Anschließend können dann
weitere operative Eingriffe, wie eine Hornhauttransplantation, vorgenommen werden, um die
Sehfähigkeit wiederherzustellen. Im entzündeten Auge würde ein solcher Eingriff mit hoher
Wahrscheinlichkeit zu Abstoßungsreaktionen und zum Verlust des Transplantats führen.
4.5 Kollagenmembranen als Alternative zur Amnionmembran
Die Intention der in-vivo-Versuche dieser Arbeit war es, vor allem die Eignung der
Kollagenmembranen als möglichen Ersatz für die Amnionmembran zu untersuchen. Die
Kollagenmembranen sollten sich bei der Anwendung wie die Amnionmembran verhalten, die
Heilung unterstützen und langfristig abgebaut werden.
Diskussion
89
Bei den Versuchen zeigte sich, dass besonders die quervernetzte Kollagenmembran Chigh
aufgrund des verzögerten Abbaus den Eigenschaften der Amnionmembran glich. So können
teilweise noch nach Jahren Reste der Amnionmembran im Stroma histologisch nachgewiesen
werden (Kruse et al., 1999).
Einer der wesentlichen Unterschiede zur Amnionmembran sind die Wachstumsfaktoren. Im
Gegensatz zur Kollagenmembran enthält die Amnionmembran zahlreiche
Wachstumsfaktoren, welche die Heilung der Augenoberfläche positiv beeinflussen (Koizumi
et al., 2000; Tseng et al., 2004). In ihrer jetzigen Form beinhaltet die Kollagenmembran
keinerlei Wachstumsfaktoren, die Ergebnisse im Tiermodell und in der klinischen Anwendung
waren allerdings trotzdem vergleichbar mit dem „Goldstandard“ Amnionmembran. Aufgrund
dieser Tatsache stellt sich natürlich die Frage nach den Wachstumsfaktoren und ihrem
tatsächlichen Einfluss auf die Heilung.
Während das Vorhandensein verschiedener Wachstumsfaktoren in der Amnionmembran (z.
B. NGF, EGF oder TGF-β) bestätigt wurde, ist der tatsächliche Effekt dieser Faktoren immer
noch nicht geklärt (Koizumi et al., 2000). Auch sind die Auswirkungen der Kryokonservierung
auf die Wachstumsfaktoren und deren Wirksamkeit noch nicht vollständig aufgeklärt. Zudem
ist über die Konzentrationen aufgrund der inter- und intraindividuellen Variationen der
Amnionmembran nur wenig bekannt. Aus diesen Gründen sind die Länge der Wirkung und die
abgegebene Menge der Wachstumsfaktoren nur schwer vorhersagbar und ihre Wirkung somit
nicht bestätigt.
Insgesamt ist festzuhalten, dass die untersuchten Kollagenmembranen standardisierte und
physiologisch abbaubare Biomembranen darstellen, welche im Gegensatz zur
Amnionmembran oder anderen Biomembranen gut verfügbar und leicht zu handhaben sind.
Sie können bei Raumtemperatur gelagert werden, bergen kein Infektionsrisiko und müssen
präoperativ nicht behandelt werden. Keine der untersuchten Varianten zeigte zelltoxische
Eigenschaften in vitro oder verursachte starke Entzündungen in vivo. Alle Kollagenmembranen
unterstützten, sowohl im Tierversuch als auch bei der klinischen Anwendung die
Epithelialisierung der Augenoberfläche und stellten ein Gerüst für die stromalen Keratozyten
dar. Corneale Ulzerationen mit starken Entzündungen oder zusätzlichen augenoberflächlichen
Erkrankungen wie dem Trockenen Auge oder einer Limbusstammzellinsuffizienz erfordern
möglicherweise eine längere Verweildauer des Materials und die Verwendung einer
Diskussion
90
Membran, die gegenüber enzymatischem Abbau stabiler ist. In diesem Fall wäre, nach
unseren Ergebnissen, die Anwendung der quervernetzen Kollagenmembran eine gute
Alternative zur Amnionmembran. Allerdings zeigte sich auch die unbehandelte
Kollagenmembran in der klinischen Anwendung als geeignet. Die Entscheidung für eine der
Varianten sollte daher im Hinblick auf die Erkrankung erfolgen.
4.6 Optimierte Kultivierung der Limbusstammzellen
Die erfolgreiche Kultivierung limbaler Epithelzellen und der gleichzeitige Erhalt ihrer
Stammzelleigenschaften ist, neben der geeigneten Wachstumsunterlage, eine wichtige
Voraussetzung zur Behandlung von Limbusstammzellinsuffizienz mit ex-vivo-Transplantaten.
Aber gerade bei der Kultivierung gibt es viele Variablen wie die Gewinnung der Zellen, die
Kulturbedingungen und die Medienzusammensetzung, die beachtet werden müssen und die
die Eigenschaften der Zellen beeinflussen können (Blazejewska et al., 2009; Grueterich et al.,
2003; Koizumi et al., 2002; Pellegrini et al., 1999; Tsai et al., 2000)
In dieser Arbeit untersuchten wir limbale Epithelzellen, welche auf verschiedenen Varianten
einer Kollagenmembran mit verschiedenen, für die Kultivierung epithaler Zellen geeigneten
Medien kultiviert wurden. Das DMEM/F12-2-Medium zeigte sich dabei als besonders
geeignet.
Die gute Entwicklung der Epithelzellen bei der Kultivierung mit DMEM/F-12-2 wird vermutlich
durch den hohen Glukose- und Glutamingehalt des Mediums verursacht. Sowohl Glukose als
auch Glutamin spielen eine wichtige Rolle für den Energiestoffwechsel der Zellen und sind
essentiel für die zelluläre Energiegewinnung (Rehberg et al., 2013; Reitzer et al., 1979). Die
Amnionsäure Glutamin kann in vitro außerdem als alternative Energiequelle für schnell
teilende Zellarten genutzt werden (Baggetto, 1992; Cruz et al., 1999; Fitzpatrick et al., 1993).
Neben der erhöhten Konzentration dieser beiden Energielieferanten beeinflusste
möglicherweise auch die erhöhte Konzentration des Wachstumsfaktors EGF die Entwicklung
des Epithels positiv. Darüber hinaus war dem Medium Choleratoxin zugesetzt, welches
ebenfalls die Proliferation unterstützt (Green, 1978), gleichzeitig aber die Differenzierung
hemmt (Sun and Green, 1976). Das Zusammenspiel dieser verschiedenen Faktoren
Diskussion
91
begünstigte vermutlich das Wachstum der Epithelzellen und die Bildung eines
mehrschichtigen Epithels.
4.7 Ausblick
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Kollagen ein Material mit vielseitigen
Anwendungsmöglichkeiten ist. Für die hier verwendeten Kollagenmembranen bestehend aus
Pferdekollagen Typ I zeigte sich ein mögliches Einsatzgebiet im Bereich der Augenoberfläche.
Alle getesteten Kollagenmembranen und ihre Varianten scheinen für die Verwendung an der
Augenoberfläche geeignet. Außerdem lassen unsere Ergebnisse aus den in-vitro-Versuchen
eine mögliche Verwendung als Wachstumsunterlage für die ex-vivo-Expansion von
Limbusstammzellen mit anschließender Transplantation zur Behandlung von
Limbusstammzellinsuffizienz vermuten. Um diese Vermutungen zu bestätigen, sind allerdings
weitere Untersuchungen am Tiermodell mit präkultivierten Limbusstammzellen notwendig.
Neben der Verwendung im vorderen Augenabschnitt erfolgte experimentell auch die
erfolgreiche Anwendung des Materials am Augenhintergrund . Hierbei wurden retinale
Pigmentepithelzellen auf den Kollagenmembranen kultiviert und unter die Retina
transplantiert (Thumann et al., 2009). Dabei konnte ebenfalls eine gute Verträglichkeit und
ein gradueller Abbau des Materials beobachtet werden.
Ein weiteres mögliches Anwendungsgebiet wäre die Innenseite der Cornea, an der die
Kollagenmembran als Ersatz für die Descemet-Membran bei Erkrankungen des
Hornhautendothels eingesetzt werden könnte. Im Moment wird in diesem Fall die Descemet-
Membran inklusive gesundem Hornhautendothel von Spenderhornhäuten verwendet, welche
schwierig zu präparieren sind und nur eingeschränkt zur Verfügung stehen. Die Kultivierung
von Hornhautendothel auf Kollagenmembranen und eine anschließende Transplantation
könnten helfen, die schwierige Situation eines Spendermangels zu verbessern.
Unabhängig von den genannten Anwendungsgebieten sind auch weitere Modifikationen der
Kollagenmembran selber möglich. So zeigten Untersuchungen, dass strukturierte Oberflächen
das Migrationsverhalten von Epithelzellen beeinflussen und die Ausrichtung und das
Wachstum der Zellen in bestimmte Richtungen fördern (Lawrence et al., 2012). Außerdem
Diskussion
92
kann mithilfe der Strukturierungen die Stammzellnische nachempfunden werden, sodass die
Zellen länger ihren Stammzellcharakter beibehalten (Levis et al., 2013).
Zusätzlich wäre auch die Zugabe von Antibiotika oder aber auch von Proteinen oder Peptiden,
die die Adhäsion und Proliferation von Hornhautepithelzellen oder Keratozyten fördern,
denkbar. Außerdem ist die klinische Anwendung der quervernetzten Variante der
Kollagenmembran ein Aspekt, der bereits in naher Zukunft evtl. auch klinisch weiterverfolgt
werden könnte.
Abschließend ist festzuhalten, dass Kollagen für die Anwendung am Auge sehr gut geeignet ist
und dass neben der Vielzahl an Anwendungsmöglichkeiten in und an der Cornea auch die
Kollagenmembranen an sich stetig weiterentwickelt und an neuen Erkenntnissen aus der
Forschung angepasst werden können.
Abbildungsverzeichnis
93
Abbildungsverzeichnis ABBILDUNG 1: AUFBAU DER CORNEA........................................................................................ 8 ABBILDUNG 2: REGENERATION DES CORNEALEN EPITHELS .................................................... 12 ABBILDUNG 3: PERSISTIERENDE HORNHAUTULZERATION ...................................................... 16 ABBILDUNG 4: DIE AMNIONMEMBRAN ................................................................................... 18 ABBILDUNG 5: ANWENDUNG DER AMNIONMEMBRAN BEI OBERFLÄCHENDEFEKTEN DER
CORNEA ............................................................................................................................ 19 ABBILDUNG 6: QUERVERNETZTE VARIANTEN DER KOLLAGENMEMBRAN ............................. 28 ABBILDUNG 7: CORNEOSKLERALRING ..................................................................................... 39 ABBILDUNG 8: KLONIERTE LIMBUSSTAMMZELLEN ZWISCHEN 3T3-FEEDERZELLEN ............... 40 ABBILDUNG 9: INTRASTROMALE IMPLANTATION ................................................................... 43 ABBILDUNG 10: OBERFLÄCHLICHE IMPLANTATION ................................................................ 44 ABBILDUNG 11: ZUG- UND DRUCKPRÜFMASCHINE ................................................................ 47 ABBILDUNG 12: KULTIVIERUNG DER MUNDSCHLEIMHAUTZELLEN AUF DEN VARIANTEN DER
KOLLAGENMEMBRAN ...................................................................................................... 52 ABBILDUNG 13: UNTERSCHIEDE ZWISCHEN DEM MUNDSCHLEIMHAUTEPITHEL AUF
QUERVERNETZTEN UND UNBEHANDELTEN VARIANTEN DER KOLLAGENMEMBRAN ..... 54 ABBILDUNG 14: ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE DARSTELLUNG DER EPITHELSCHICHT UND
IHRE BINDUNG AN DIE KOLLAGENMEMBRANEN ............................................................ 54 ABBILDUNG 15: IMMUNFLUORESZENZ-FÄRBUNGEN DER KULTIVIERTEN
MUNDSCHLEIMHAUTZELLEN AUF DREI VARIANTEN DER KOLLAGENMEMBRAN ........... 56 ABBILDUNG 16: LIMBUSEPITHELSCHICHT AUF DEN KOLLAGENMEMBRANVARIANTEN CNON,
CLOW UND CHIGH NACH DER KULTIVIERUNG MIT DMEM/F12-2 ........................................ 58 ABBILDUNG 17: IMMUNFLUORESZENZ-FÄRBUNGEN VON LIMBUSEPITHELZELLEN KULTIVIERT
AUF DREI VARIANTEN (CNON, CLOW UND CHIGH) DER KOLLAGENMEMBRAN...................... 59 ABBILDUNG 18: VERGLEICH DER ELEKTRONENMIKROSKOPISCHEN STRUKTUR DER
VERSCHIEDENEN VARIANTEN DER KOLLAGENMEMBRAN ............................................... 60 ABBILDUNG 19: VERGLEICH DES EPITHELWACHSTUMS AUF KOLLAGENMEMBRANEN MIT
ANTIBIOTIKUM ................................................................................................................. 61 ABBILDUNG 20: KLINISCHER VERLAUF DER INTRASTROMALEN IMPLANTATION ................... 63 ABBILDUNG 21: HISTOLOGISCHE QUERSCHNITTE DER KANINCHENHORNHÄUTE NACH
INTRASTROMALER IMPLANTATION ................................................................................. 64 ABBILDUNG 22: ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN INTRASTROMAL
IMPLANTIERTER MEMBRANEN ........................................................................................ 65 ABBILDUNG 23: KLINISCHER VERLAUF NACH OBERFLÄCHLICHER IMPLANTATION ................ 67 ABBILDUNG 24: HISTOLOGISCHE QUERSCHNITTE DER KANINCHENHORNHÄUTE NACH
OBERFLÄCHLICHER IMPLANTATION ................................................................................. 69 ABBILDUNG 25: ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN DER OBERFLÄCHLICH
ANGEWANDTEN KOLLAGENMEMBRANEN CNON UND CHIGH ............................................. 70 ABBILDUNG 26: DRUCKSTABILITÄT DER VERSCHIEDENEN KOLLAGENMEMBRANVARIANTEN
.......................................................................................................................................... 71 ABBILDUNG 27: QUELLUNG DER KOLLAGENMEMBRANEN ..................................................... 72 ABBILDUNG 28: ENZYMATISCHER ABBAU DER KOLLAGENMEMBRANVARIANTEN ................ 73
Abbildungsverzeichnis
94
ABBILDUNG 29: KLINISCHER VERLAUF NACH ANWENDUNG DER UNBEHANDELTEN KOLLAGENMEMBRAN CNON BEI PATIENT 01 .................................................................... 74
ABBILDUNG 30: KLINISCHER VERLAUF NACH ANWENDUNG DER UNBEHANDELTEN KOLLAGENMEMBRAN CNON BEI PATIENT 02 .................................................................... 75
ABBILDUNG 31: KLINISCHER VERLAUF NACH ANWENDUNG DER UNBEHANDELTEN KOLLAGENMEMBRAN CNON BEI PATIENT 03 .................................................................... 76
ABBILDUNG 32: KLINISCHER BEFUND PRÄOPERATIV UND VIER WOCHEN NACH DER IMPLANTATION EINER KOLLAGENMEMBRAN ................................................................. 77
ABBILDUNG 33: KLINISCHER VERLAUF NACH ANWENDUNG DER UNBEHANDELTEN KOLLAGENMEMBRAN CNON BEI PATIENT 04 .................................................................... 79
ABBILDUNG 34: KLINISCHER BEFUND BEI WIEDERVORSTELLUNG VIER WOCHEN NACH DER IMPLANTATION EINER KOLLAGENMEMBRAN ................................................................. 80
ABBILDUNG 35: KLINISCHER VERLAUF NACH ANWENDUNG DER UNBEHANDELTEN KOLLAGENMEMBRAN CNON BEI PATIENT 05 .................................................................... 81
Tabellenverzeichnis
95
Tabellenverzeichnis
TABELLE 1: UNTERSCHIEDE ZWISCHEN DEN MEDIEN ZUR KULTIVIERUNG DER
LIMBUSSTAMMZELLEN..................................................................................................... 41 TABELLE 2: BEWERTUNGSSYSTEM DER MEMBRANINTEGRITÄT WÄHREND DES
KOLLAGENASEASSAYS ...................................................................................................... 48 TABELLE 3: ÜBERSICHT ALLER HERGESTELLTEN UND UNTERSUCHTEN
KOLLAGENMEMBRANEN .................................................................................................. 50 TABELLE 4: STATISTISCHE AUSWERTUNG DES EPITHELS AUF VERSCHIEDENEN VARIANTEN
DER KOLLAGENMEMBRAN ............................................................................................... 53 TABELLE 5: UNTERSCHIEDLICHE AUSBILDUNG DER MEHRSCHICHTIGKEIT VON
LIMBUSSTAMMZELLEN NACH KULTIVIERUNG MIT VERSCHIEDENEN MEDIEN. .............. 57
Literaturverzeichnis
96
Literaturverzeichnis
Azuara-Blanco, A., Pillai, C.T., Dua, H.S. Amniotic membrane transplantation for ocular
surface reconstruction. Br J Ophthalmol. 1999;83(4):399-402. Epub 1999/08/06. Baggetto, L.G. Deviant energetic metabolism of glycolytic cancer cells. Biochimie.
1992;74(11):959-974. Epub 1992/11/01. Banga, I., Balo, J. Correlation between crosslinkages, steric structure and digestibility of
collagen. Biochem Z. 1965;342(3):330-336. Epub 1965/08/06. Bartlett, W., Gooding, C.R., Carrington, R.W., Skinner, J.A., Briggs, T.W., Bentley, G.
Autologous chondrocyte implantation at the knee using a bilayer collagen membrane with bone graft. A preliminary report. J Bone Joint Surg Br. 2005;87(3):330-332. Epub 2005/03/19.
Benedek, G.B. Theory of transparency of the eye. Appl Opt. 1971;10(3):459-473. Epub 1971/03/01.
Benninghoff, A. Taschenbuch Anatomie. München: Elsevier GmbH, Urban & Fischer; 2014. Blazejewska, E.A., Schlotzer-Schrehardt, U., Zenkel, M., et al. Corneal limbal
microenvironment can induce transdifferentiation of hair follicle stem cells into corneal epithelial-like cells. Stem Cells. 2009;27(3):642-652. Epub 2008/12/17.
Bullwinkel, J., Baron-Luhr, B., Ludemann, A., Wohlenberg, C., Gerdes, J., Scholzen, T. Ki-67 protein is associated with ribosomal RNA transcription in quiescent and proliferating cells. J Cell Physiol. 2006;206(3):624-635. Epub 2005/10/06.
Callegan, M.C., Engel, L.S., Clinch, T.E., Hill, J.M., Kaufman, H.E., O'Callaghan, R.J. Efficacy of tobramycin drops applied to collagen shields for experimental staphylococcal keratitis. Curr Eye Res. 1994;13(12):875-878. Epub 1994/12/01.
Campbell, N.A., Reece, R. Biologie. Pearson Education Deutschland GMBH; 2009. Chee, K.Y., Kicic, A., Wiffen, S.J. Limbal stem cells: the search for a marker. Clin Experiment
Ophthalmol. 2006;34(1):64-73. Epub 2006/02/03. Choi, T.H., Tseng, S.C. In vivo and in vitro demonstration of epithelial cell-induced
myofibroblast differentiation of keratocytes and an inhibitory effect by amniotic membrane. Cornea. 2001;20(2):197-204. Epub 2001/03/15.
Cruz, H.J., Ferreira, A.S., Freitas, C.M., Moreira, J.L., Carrondo, M.J. Metabolic responses to different glucose and glutamine levels in baby hamster kidney cell culture. Appl Microbiol Biotechnol. 1999;51(5):579-585. Epub 1999/07/03.
Davis, F.A. The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit. Trans Am Ophthalmol Soc. 1929;27:400 402-441. Epub 1929/01/01.
Davis, J. Skin transplantation with a review of 550 cases at the Johns Hopkins Hospital. Johns Hopkins Med J. 1910;15:307.
Dua, H.S., Gomes, J.A., King, A.J., Maharajan, V.S. The amniotic membrane in ophthalmology. Surv Ophthalmol. 2004;49(1):51-77. Epub 2004/01/09.
Dua, H.S., Joseph, A., Shanmuganathan, V.A., Jones, R.E. Stem cell differentiation and the effects of deficiency. Eye (Lond). 2003;17(8):877-885. Epub 2003/11/25.
Dua, H.S., Shanmuganathan, V.A., Powell-Richards, A.O., Tighe, P.J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. Br J Ophthalmol. 2005;89(5):529-532. Epub 2005/04/19.
Literaturverzeichnis
97
Duan, X., Sheardown, H. Dendrimer crosslinked collagen as a corneal tissue engineering scaffold: mechanical properties and corneal epithelial cell interactions. Biomaterials. 2006;27(26):4608-4617. Epub 2006/05/23.
Duncan, T.J., Tanaka, Y., Shi, D., Kubota, A., Quantock, A.J., Nishida, K. Flow-manipulated, crosslinked collagen gels for use as corneal equivalents. Biomaterials. 2010;31(34):8996-9005. Epub 2010/09/11.
Dunn, M.W., Nishihara, T., Stenzel, K.H., Branwood, A.W., Rubin, A.L. Collagen-derived membrane: corneal implantation. Science. 1967;157(3794):1329-1330. Epub 1967/09/15.
Ehlers, N., Hjortdal, J. Riboflavin-ultraviolet light induced cross-linking in endothelial decompensation. Acta Ophthalmol. 2008;86(5):549-551. Epub 2008/06/10.
Fagerholm, P., Lagali, N.S., Carlsson, D.J., Merrett, K., Griffith, M. Corneal regeneration following implantation of a biomimetic tissue-engineered substitute. Clin Transl Sci. 2009;2(2):162-164. Epub 2010/05/07.
Fagerholm, P., Lagali, N.S., Merrett, K., et al. A biosynthetic alternative to human donor tissue for inducing corneal regeneration: 24-month follow-up of a phase 1 clinical study. Sci Transl Med. 2010;2(46):46ra61. Epub 2010/08/27.
Fitzpatrick, L., Jenkins, H.A., Butler, M. Glucose and glutamine metabolism of a murine B-lymphocyte hybridoma grown in batch culture. Appl Biochem Biotechnol. 1993;43(2):93-116. Epub 1993/11/01.
Forrester, J.V.D., A. D.; McMenamin, P. G.; Roberts, F. The eye: basic science in practice: Saunders Elsevier; 2008.
Frieß, W., Metzmacher I. and Wild T. Die Bedeutung von Kollagen und Kollagenasen in der Wundheilung. Wild, T.a.J.A., editor: SpringerWienNewYork; 2007. 89-97 p.
Gelatt, K. Veterinary Ophthalmology. 4. edition ed: Wiley-Blackwell; 2007. Gil, E.S., Mandal, B.B., Park, S.H., Marchant, J.K., Omenetto, F.G., Kaplan, D.L. Helicoidal
multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 2010;31(34):8953-8963. Epub 2010/08/31.
Gilman, M. Skin and eye testing in animals. In: Wallace Hayes, A., editor. Principles and methodes of toxicology: Raven Press; 1982. p. 209-222.
Gomes, J.A., Romano, A., Santos, M.S., Dua, H.S. Amniotic membrane use in ophthalmology. Curr Opin Ophthalmol. 2005;16(4):233-240. Epub 2005/07/08.
Green, H. Cyclic AMP in relation to proliferation of the epidermal cell: a new view. Cell. 1978;15(3):801-811. Epub 1978/11/01.
Grehn, F. Augenheilkunde. Heidelberg: Springer Medizin Verlag; 2008. Grueterich, M., Espana, E.M., Tseng, S.C. Modulation of keratin and connexin expression in
limbal epithelium expanded on denuded amniotic membrane with and without a 3T3 fibroblast feeder layer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44(10):4230-4236. Epub 2003/09/26.
Gruterich, M., Tseng, S.C. [Surgical approaches for limbal stem cell deficiency]. Klin Monbl Augenheilkd. 2002;219(5):333-339. Epub 2002/07/03. Strategien zur Behandlung der Limbusstammzellinsuffizienz.
Hao, Y., Ma, D.H., Hwang, D.G., Kim, W.S., Zhang, F. Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea. 2000;19(3):348-352. Epub 2000/06/01.
Kenyon, K.R., Tseng, S.C. Limbal autograft transplantation for ocular surface disorders. Ophthalmology. 1989;96(5):709-722; discussion 722-703. Epub 1989/05/01.
Literaturverzeichnis
98
Kim, H.S., Jun Song, X., de Paiva, C.S., Chen, Z., Pflugfelder, S.C., Li, D.Q. Phenotypic characterization of human corneal epithelial cells expanded ex vivo from limbal explant and single cell cultures. Exp Eye Res. 2004;79(1):41-49. Epub 2004/06/09.
Kim, J.C., Tseng, S.C. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas. Cornea. 1995;14(5):473-484. Epub 1995/09/01.
Klein, E.M., Bito, L.Z. Species variations in the pathophysiologic responses of vertebrate eyes to a chemical irritant, nitrogen mustard. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1983;24(2):184-191. Epub 1983/02/01.
Koizumi, N., Cooper, L.J., Fullwood, N.J., et al. An evaluation of cultivated corneal limbal epithelial cells, using cell-suspension culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002;43(7):2114-2121. Epub 2002/07/02.
Koizumi, N.J., Inatomi, T.J., Sotozono, C.J., Fullwood, N.J., Quantock, A.J., Kinoshita, S. Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. Curr Eye Res. 2000;20(3):173-177. Epub 2000/03/01.
Kose, O., Lalli, A., Kutulola, A.O., Odell, E.W., Waseem, A. Changes in the expression of stem cell markers in oral lichen planus and hyperkeratotic lesions. J Oral Sci. 2007;49(2):133-139. Epub 2007/07/20.
Kruse, F.E. Stem cells and corneal epithelial regeneration. Eye (Lond). 1994;8 ( Pt 2):170-183. Epub 1994/01/01.
Kruse, F.E., Joussen, A.M., Rohrschneider, K., et al. Cryopreserved human amniotic membrane for ocular surface reconstruction. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2000;238(1):68-75. Epub 2000/02/09.
Kruse, F.E., Rohrschneider, K., Volcker, H.E. Multilayer amniotic membrane transplantation for reconstruction of deep corneal ulcers. Ophthalmology. 1999;106(8):1504-1510; discussion 1511. Epub 1999/08/12.
Lagali, N. biointegration of implanted human donor vs biosynthetic tissue in patient corneas: a comparative three-year in-vivo study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011;52(E-Abstract 350).
Lagali, N.F., P.; Griffith, M. Biointegration of implanted human donor vs biosynthetic tissue in patient corneas: a comparative three-year in-vivo study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011;52.
Lavker, R.M., Tseng, S.C., Sun, T.T. Corneal epithelial stem cells at the limbus: looking at some old problems from a new angle. Exp Eye Res. 2004;78(3):433-446. Epub 2004/04/27.
Lawrence, B.D., Marchant, J.K., Pindrus, M.A., Omenetto, F.G., Kaplan, D.L. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 2009;30(7):1299-1308. Epub 2008/12/09.
Lawrence, B.D., Pan, Z., Liu, A., Kaplan, D.L., Rosenblatt, M.I. Human corneal limbal epithelial cell response to varying silk film geometric topography in vitro. Acta Biomater. 2012;8(10):3732-3743. Epub 2012/06/19.
Lawrence, B.D., Pan, Z., Weber, M.D., Kaplan, D.L., Rosenblatt, M.I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J Vis Exp. 2012(62). Epub 2012/05/09.
Lee, S.H., Tseng, S.C. Amniotic membrane transplantation for persistent epithelial defects with ulceration. Am J Ophthalmol. 1997;123(3):303-312. Epub 1997/03/01.
Literaturverzeichnis
99
Levis, H.J., Massie, I., Dziasko, M.A., Kaasi, A., Daniels, J.T. Rapid tissue engineering of biomimetic human corneal limbal crypts with 3D niche architecture. Biomaterials. 2013;34(35):8860-8868. Epub 2013/08/24.
Levis, H.J., Menzel-Severing, J., Drake, R.A., Daniels, J.T. Plastic compressed collagen constructs for ocular cell culture and transplantation: a new and improved technique of confined fluid loss. Curr Eye Res. 2013;38(1):41-52. Epub 2012/09/29.
Liu, W., Deng, C., McLaughlin, C.R., et al. Collagen-phosphorylcholine interpenetrating network hydrogels as corneal substitutes. Biomaterials. 2009;30(8):1551-1559. Epub 2008/12/23.
Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D.E., Albelda, S., Cotsarelis, G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J Cell Sci. 1998;111 ( Pt 21):3179-3188. Epub 1998/10/09.
Ma, D.H., Chen, J.K., Zhang, F., Lin, K.Y., Yao, J.Y., Yu, J.S. Regulation of corneal angiogenesis in limbal stem cell deficiency. Prog Retin Eye Res. 2006;25(6):563-590. Epub 2006/11/03.
Madhira, S.L., Vemuganti, G., Bhaduri, A., Gaddipati, S., Sangwan, V.S., Ghanekar, Y. Culture and characterization of oral mucosal epithelial cells on human amniotic membrane for ocular surface reconstruction. Mol Vis. 2008;14:189-196. Epub 2008/03/13.
Maurice, D.M. The structure and transparency of the cornea. J Physiol. 1957;136(2):263-286. Epub 1957/04/30.
Mi, S., Chen, B., Wright, B., Connon, C.J. Plastic compression of a collagen gel forms a much improved scaffold for ocular surface tissue engineering over conventional collagen gels. J Biomed Mater Res A. 2010;95(2):447-453. Epub 2010/07/22.
Nakamura, T., Inatomi, T., Sotozono, C., Amemiya, T., Kanamura, N., Kinoshita, S. Transplantation of cultivated autologous oral mucosal epithelial cells in patients with severe ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 2004;88(10):1280-1284. Epub 2004/09/21.
Oie, Y., Nishida, K. Regenerative medicine for the cornea. Biomed Res Int. 2013;2013:428247. Epub 2014/01/08.
Palmer, R.M., McDonald, M.B. A corneal lens/shield system to promote postoperative corneal epithelial healing. J Cataract Refract Surg. 1995;21(2):125-126. Epub 1995/03/01.
Pellegrini, G., Dellambra, E., Golisano, O., et al. p63 identifies keratinocyte stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(6):3156-3161. Epub 2001/03/15.
Pellegrini, G., Golisano, O., Paterna, P., et al. Location and clonal analysis of stem cells and their differentiated progeny in the human ocular surface. J Cell Biol. 1999;145(4):769-782. Epub 1999/05/20.
Pellegrini, G., Traverso, C.E., Franzi, A.T., Zingirian, M., Cancedda, R., De Luca, M. Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium. Lancet. 1997;349(9057):990-993. Epub 1997/04/05.
Powers, H.J. Riboflavin (vitamin B-2) and health. Am J Clin Nutr. 2003;77(6):1352-1360. Epub 2003/06/07.
Rastogi, S., Modi, M., Sathian, B. The efficacy of collagen membrane as a biodegradable wound dressing material for surgical defects of oral mucosa: a prospective study. J Oral Maxillofac Surg. 2009;67(8):1600-1606. Epub 2009/07/21.
Literaturverzeichnis
100
Rehberg, M., Rath, A., Ritter, J.B., Genzel, Y., Reichl, U. Changes in intracellular metabolite pools during growth of adherent MDCK cells in two different media. Appl Microbiol Biotechnol. 2013. Epub 2013/10/31.
Reichl, S., Borrelli, M., Geerling, G. Keratin films for ocular surface reconstruction. Biomaterials. 2011;32(13):3375-3386. Epub 2011/02/15.
Reitzer, L.J., Wice, B.M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 1979;254(8):2669-2676. Epub 1979/04/25.
Ruberti, J.W., Zieske, J.D. Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization. Prog Retin Eye Res. 2008;27(5):549-577. Epub 2008/09/09.
Schiff, W.M., Speaker, M.G., McCormick, S.A. The collagen shield as a collagenase inhibitor and clinical indicator of collagenase activity on the ocular surface. CLAO J. 1992;18(1):59-63. Epub 1992/01/01.
Schlotzer-Schrehardt, U., Kruse, F.E. Identification and characterization of limbal stem cells. Exp Eye Res. 2005;81(3):247-264. Epub 2005/07/30.
Schofield, R. The stem cell system. Biomed Pharmacother. 1983;37(8):375-380. Epub 1983/01/01.
Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 2000;182(3):311-322. Epub 2000/02/01.
Seitz, B. [Amniotic membrane transplantation. An indispensable therapy option for persistent corneal epithelial defects]. Ophthalmologe. 2007;104(12):1075-1079. Epub 2007/11/22. Amnionmembrantransplantation. Eine unverzichtbare Therapieoption bei persistierenden kornealen Epitheldefekten.
Shao, C., Sima, J., Zhang, S.X., et al. Suppression of corneal neovascularization by PEDF release from human amniotic membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004;45(6):1758-1762. Epub 2004/05/27.
Shapiro, M.S., Friend, J., Thoft, R.A. Corneal re-epithelialization from the conjunctiva. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1981;21(1 Pt 1):135-142. Epub 1981/07/01.
Simoens, P. Sehorgan, Organum visus. In: Salomon, F.-V., Geyer, H., Gille, U., editor. Anatomie für die Tiermedizin. Stuttgart: Enke; 2004. p. 578-611.
Solomon, A., Rosenblatt, M., Monroy, D., Ji, Z., Pflugfelder, S.C., Tseng, S.C. Suppression of interleukin 1alpha and interleukin 1beta in human limbal epithelial cells cultured on the amniotic membrane stromal matrix. Br J Ophthalmol. 2001;85(4):444-449. Epub 2001/03/27.
Sporl, E., Raiskup-Wolf, F., Pillunat, L.E. [Biophysical principles of collagen cross-linking]. Klin Monbl Augenheilkd. 2008;225(2):131-137. Epub 2008/02/23. Biophysikalische Grundlagen der Kollagenvernetzung.
Sun, T.T., Green, H. Differentiation of the epidermal keratinocyte in cell culture: formation of the cornified envelope. Cell. 1976;9(4 Pt 1):511-521. Epub 1976/12/01.
Swanston, D.W. Assessment of the validity of animal techniques in eye-irritation testing. Food Chem Toxicol. 1985;23(2):169-173. Epub 1985/02/01.
Talmi, Y.P., Sigler, L., Inge, E., Finkelstein, Y., Zohar, Y. Antibacterial properties of human amniotic membranes. Placenta. 1991;12(3):285-288. Epub 1991/05/01.
Tan, X.W., Hartman, L., Tan, K.P., et al. In vivo biocompatibility of two PEG/PAA interpenetrating polymer networks as corneal inlays following deep stromal pocket implantation. J Mater Sci Mater Med. 2013;24(4):967-977. Epub 2013/01/29.
Literaturverzeichnis
101
Thumann, G., Viethen, A., Gaebler, A., et al. The in vitro and in vivo behaviour of retinal pigment epithelial cells cultured on ultrathin collagen membranes. Biomaterials. 2009;30(3):287-294. Epub 2008/10/22.
Tsai, R.J., Li, L., Chen, J. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells(1). Am J Ophthalmol. 2000;130(4):543. Epub 2000/10/12.
Tsai, R.J., Tseng, S.C. Human allograft limbal transplantation for corneal surface reconstruction. Cornea. 1994;13(5):389-400. Epub 1994/09/01.
Tseng, S.C., Espana, E.M., Kawakita, T., et al. How does amniotic membrane work? Ocul Surf. 2004;2(3):177-187. Epub 2007/01/12.
Ueta, M., Kweon, M.N., Sano, Y., et al. Immunosuppressive properties of human amniotic membrane for mixed lymphocyte reaction. Clin Exp Immunol. 2002;129(3):464-470. Epub 2002/08/29.
Valentini, P. Collagen membrane and open healing: a predictable therapeutic option? Dental News. 2004;XI(III). Watt, F.M., Hogan, B.L. Out of Eden: stem cells and their niches. Science.
2000;287(5457):1427-1430. Epub 2000/02/26. Whitcher, J.P., Srinivasan, M., Upadhyay, M.P. Prevention of corneal ulceration in the
developing world. Int Ophthalmol Clin. 2002;42(1):71-77. Epub 2002/08/23. Williams, D.F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 2008;29(20):2941-2953.
Epub 2008/04/29. Williams, K.K., Shepard, A.R., Rice, R.L., McCartney, M.D., Wax, M.B., Hiddemen, J.W.
Corneal wound healing in New Zealand White Rabbits following anterior keratectomy and treatment with moxifloxacin ophthalmic solution 0.5% or gatifloxacin ophthalmic solution 0.3%. J Ocul Pharmacol Ther. 2007;23(6):517-525. Epub 2007/11/16.
Wollensak, G. Crosslinking treatment of progressive keratoconus: new hope. Curr Opin Ophthalmol. 2006;17(4):356-360. Epub 2006/08/11.
Wollensak, G., Aurich, H., Pham, D.T., Wirbelauer, C. Hydration behavior of porcine cornea crosslinked with riboflavin and ultraviolet A. J Cataract Refract Surg. 2007;33(3):516-521. Epub 2007/02/27.
Wollensak, G., Spoerl, E., Seiler, T. Stress-strain measurements of human and porcine corneas after riboflavin-ultraviolet-A-induced cross-linking. J Cataract Refract Surg. 2003;29(9):1780-1785. Epub 2003/10/03.
Yang, A., Schweitzer, R., Sun, D., et al. p63 is essential for regenerative proliferation in limb, craniofacial and epithelial development. Nature. 1999;398(6729):714-718. Epub 1999/05/05.
Zieske, J.D. Perpetuation of stem cells in the eye. Eye (Lond). 1994;8 ( Pt 2):163-169. Epub 1994/01/01.
Anhang
102
Anhang
Hämatoxylin-Eosin-Färbung Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Vorgang Zeitraum Reagenzien
Färbung 4 min Hämalaun
spülen 2 x 10 sek Aqua bidest.
Färbung 10 sek Eosin
spülen 2 x 10 sek Aqua bidest.
Aufsteigende Alkoholreihe mit je 2 Küvetten
Dehydrierung
2 x kurz 70% Isopropanol
2 x kurz 96% Isopropanol
2 x 2 min 100% Isopropanol
2 x 5 min Xylol
Eindeckelung -- Eukitt™ Mounting Medium
Immunfluoreszenz-Färbung
Vorgang Zeitraum Temperatur Reagenzien
Fixierung 10 min. 4 °C 70% Methanol/Aceton
spülen 3 x 5 min. RT PBS
Permeabilisierung 5 min. 4 °C 0,5% Triton-X-100/PBS
spülen 5 min. RT PBS
Blockierung 30 min. RT Bovines serum albumin/PBS
Antikörper-Markierung
2 Stunden/über Nacht.
RT/4 °C Primäre Antikörper
spülen 3 x 5 min. RT PBS
Fluoreszenzfärbung 45 min. RT Sekundäre Antikörper
spülen 3 x 5 min. RT PBS
Kernfärbung 10 min. RT DAPI
spülen 3 x 5 min. RT PBS
Eindeckelung -- RT Dako fluorescent mounting Medium
Anhang
103
Zellkulturmedien
MCDB 151
Reagenzien Hersteller Endkonzentration 50ml
MCDB 151 Biowest 50 ml
HCGS Invitrogen 1% 500 µl
FBS PAN 10% 5 ml
Gentamycin Gibco 50 µg/ml 250 µl
EGF Invitrogen 5 ng/ml 2,5 µl
DMEM/F12-1
Reagenzien Hersteller Endkonzentration 50ml
DMEM/Ham´s F12 PAN 50 ml
HCGS Invitrogen 1% 500 µl
FBS PAN 10% 5 ml
Gentamycin Gibco 50 µg/ml 250 µl
EGF Invitrogen 5 ng/ml 2,5 µl
PSA PAN 1% 500 µl
DMEM/F12-2
Reagenzien Hersteller Endkonzentration 50ml
DMEM/Ham´s F12 Invitrogen 22,5 ml
DMEM Glutamax Invitrogen 22,5 ml
FBS Gibco 10% 5 ml
Adenin Sigma 0,18 mM 500 µl
Choleratoxin Sigma 0,1 nm 50 µl
Hydrocortison Sigma 0,4 µg/ml 50 µl
Insulin Sigma 5 µg/ml 25 µl
T3-Transferrin Sigma 5 µg/ml 500 µl
PSA Sigma 1% 500 µl
EGF Invitrogen 10 ng/ml 50 µl
Orale Mucosa
Reagenzien Hersteller Endkonzentration 50ml
DMEM HyClone 32,5 ml
Ham`s F 12 HyClone 10,8 ml
HCGS Invitrogen 1% 500 µl
FBS PAN 10% 5 ml
L-Glutamin PAN 0,4 mM 850 µl
EGF Invitrogen 5 ng/ml 2,5 µl
Ca²Cl Roth 0,4 mM 40 µl
PSA PAN 1% 500 µl
Anhang
104
Negativkontrollen der Immunfluoreszenz-Färbungen Mundschleimhaut
Limbusstammzellen
Veröffentlichungen
105
Veröffentlichungen
Publikationen aus Inhalten der vorliegenden Arbeit: Novel collagen membranes for the reconstruction of the corneal surface. Petsch, C., Schlotzer-Schrehardt, U., Meyer-Blazejewska, E., et al. Tissue Eng Part A. 2014. Epub 2014/03/14. Publikationen im Rahmen der wissenschaftlichen Tätigkeit: Haploinsufficiency of ARID1B, a member of the SWI/SNF-a chromatin-remodeling complex, is a frequent cause of intellectual disability. Hoyer, J., Ekici, A.B., Endele, S., et al. Am J Hum Genet. 2012;90(3):565-572. Epub 2012/03/13.
Posterpräsentationen
Optimized culturing conditions for limbal epithelial cells cultivated on semi-synthetic collagen matrices. Association for research in vision and ophthalmology (ARVO), 2013, Seattle, Washington, USA. Optimierung der Kulturbedingungen von Limbusepithelzellen auf semisynthetischen Kollagenmembranen. Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (DOG), 2013, Berlin. Cross-linked variants of a novel semi-synthetic collagen substitute for the reconstruction of the surface. Association for research in vision and ophthalmology (ARVO), 2012, Ft. Lauderdale Florida, ARVO International Travel Grant. Neue, semi-synthetische Kollagenmembranen zur Wiederherstellung der Augenoberfläche. Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (DOG), 2012, Berlin.
Lebenslauf
106
Lebenslauf
Persönliche Daten Corinna Petsch Lederhosenstr. 11 91341 Röttenbach Tel.: 09195-9244254 E-Mail: [email protected] Geburtsdatum und -ort: 17.01.1985 in Nürnberg
Promotion Jan. 2011–Jun.2014 Promotion an der Augenklinik der Friedrich-Alexander-
Universität Erlangen-Nürnberg Thema: „Semisynthetische Kollagenmembranen zur Rekonstruktion und Regeneration der Augenoberfläche“
Studium Dez. 2009–Sep. 2010 Masterabschlussarbeit am Institut für Humangenetik in
Erlangen Thema: „Systematische Mutationsanalyse einer
interstitiellen 2,3 Mb Mikrodeletion auf Chr. 6q25 als Ursache für mentale Retardierung“
2008–2010 Master-Biologiestudium an der Friedrich-Alexander-Universität in Erlangen Studiengang: Molekular- und Zellbiologie Abschlussnote: 1,5
Mai 2008 Bachelorabschlussarbeit am Lehrstuhl für Tierphysiologie in
Erlangen Thema: „Die wildtypische und die Bassoon-mutante
Mäuse-Retina: Ein Vergleich auf zellulärer und synaptischer Ebene“
2005–2008 Bachelor-Biologiestudium an der Friedrich-Alexander-
Universität in Erlangen Abschlussnote: 2,8
Schulausbildung 1991–2005 Grundschule, Abitur am Marie-Therese-Gymnasium in
Erlangen Abschlussnote: 2,3
Praktikum/Seminare Okt. 2008 vierwöchiges Praktikum im Labor für
Fortpflanzungsmedizin der Frauenklinik in Erlangen Nov. 2010 einwöchiges Praktikum in der Samenbank Erlangen Jan. 2011 einwöchiges Seminar „Einführung in die Versuchstierkunde
und Tierexperimentelle Techniken“ (FELASA-B-Kurs)
Anhang
107
Sprachkenntnisse Englisch – sehr gut
Französisch – gut
EDV-Kenntnisse MS Office, Photoshop, Corel-Draw, SeqMan, Sequencing Analysis
Sonstiges Sep. 2007–Jun. 2014 Nebenjob als Kassiererin und Aushilfe im Drogeriemarkt dm
Eidesstaatliche Erklärung
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Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel und Quellen angefertigt habe. Ich habe weder diese Dissertation an einer anderen Stelle zur Promotion eingereicht noch bisher erfolglose Promotionsversuche unternommen. Corinna Petsch
