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  • Klinische Chemie Enzyme

    Die Enzymdiagnostik dient der Lokalisation und Verlaufskontrolle von Erkrankungen und macht ca. 50% der Untersuchungen in der klinischen

    Chemie aus.

    Abb. 1: Enzyme pattern caused by acute virus hepatitis.

    Kenntnisse & Wissen Phase 1b: Sie knnen Enzyme unterteilen in plasmaspezifische -, Exkretions- und

    Zellenzyme. Sie kennen die Grundlagen der Enzyme (Verknpfung & Vorwissen aus

    Chemie und Biochemie). Sie wissen ber die Enzymkinetik Bescheid, kennen und verstehen die

    Methoden zur Messung der Enzymaktivitt. Sie knnen Enzymresultate interpretieren. Bei optisch-enzymatischen UV-Tests wissen Sie, ob es sich um eine

    Extinktionszu- oder Extinktionsabnahme handelt.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 1

  • Klinische Chemie Enzyme

    Inhaltsverzeichnis:

    1. Wirkungsweise von Enzymen 5 1.1. Energiediagramm einer biochemischen Reaktion .... 5 1.2. Mechanismus der Enzymkatalyse .. 6 2. Aktives Zentrum ... 6 3. Spezifitt ..... 7 4. Nomeklatur von Enzymen (Klassifikation) ........ 7 5. Messung eines Enzyms ... 9 5.1. Direkte Bestimmung der Enzymkonzentration ...... 9 5.2. Bestimmung der Enzymaktivitt im Serum ....... 10 6. Bestimmung der Enzymaktivitt ..... 11 7. Reaktionsbedingungen fr die Enzymmessung .. 13 7.1. Temperaturabhngigkeit .......... 13 7.2. pH-Wert .......... 13 7.3. Konzentration und Art des Substrates ....... 13 7.4. Coenzyme .......... 14 7.5. Art und Konzentration des Puffers ............ 15 7.6. Effektoren ................................ 15 8. Optimierte Standardmethoden ..... 15 9. Enzymaktivittsmessung im Farbtest (kinetische Messung) .. 16 10. Enzymaktivittsmessung im optisch-enzymatischen UV-Test ... 17 10.1.Enzymaktivittsmessung im gekoppelten optisch-enzymatischen UV-Test ... 19 11. Enzymatische Substratbestimmung (Enzymatischer Test) .. 21 11.1.Endpunkt-Methode .... 21 11.2.Kinetische Methode ...... 21 Isoenzyme ... 22 12. ALAT .... 23 13. ASAT .... 26 14. AP ..... 28 15. GGT ...... 30 16. CHE .. 31 17. GLDH ... 33 18. LDH ...... 35 19. Lipase ...... 38 20. -Amylase ...... 40 21. CK ..... 42

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 2

  • Klinische Chemie Enzyme

    Einleitung: Enzyme (frher Fermente genannt) sind Biokatalysatoren, die chemische Reaktionen im Krper berhaupt erst ermglichen und diese dann auch beschleunigen. Die Gesamtheit der chemischen Umsetzungen im Organismus ist nur mglich durch die Wirkung einer Vielzahl von Enzymen. Der Zellstoffwechsel ist strikte auf Enzyme angewiesen! Chemisch gesehen sind Enzyme Proteine oder Proteide (setzen sich aus einem Protein- und einem Nicht-Protein-Anteil zusammen). Die im Blut bestimmbaren und fr medizinische Fragestellungen relevanten Enzyme knnen unterteilt werden in:

    Plasmaspezifische Enzyme: Sie haben ihren physiologischen Wirkungsort im Plasma, z.B. Cholinesterase.

    Sezernierte Enzyme (Exkretionsenzyme): Sie sind exokriner Herkunft, d.h. sie werden von exokrinen Drsen normalerweise nur in geringen Mengen in das Blut abgegeben. Bei einer Schdigung der Herkunftsorgane bzw. bei Obstruktion der Ausfhrungsgnge erfolgt ein vermehrter bertritt ins Blut, z.B. -Amylase (P-Amylase und S-Amylase) und Lipase.

    Zellenzyme: Sie sind intrazellulrer Herkunft und gelangen bei mehr oder weniger schweren Organschden (also Zellschdigung) in das Blut, z.B. Transaminasen (ALAT, ASAT) und LDH.

    Jede Zelle synthetisiert in ihrem RER die zelleigenen Proteine, darunter auch die Enzyme, die sie fr ihre Funktionen braucht. Jede ausdifferenzierte Zelle hat ein ganz spezifisches "Paket" unterschiedlicher Enzyme, das auf ihre Funktionen angepasst ist. Damit hat auch jedes Organ eine ganz bestimmte Palette verschiedener Enzyme, also ein spezifisches, einzigartiges Enzymmuster. Diese Organspezifitt der Enzyme wird in der Medizin zu diagnostischen Zwecken ausgenutzt: Werden Zellen eines Organs zerstrt, so gelangen ihre Enzyme vermehrt (selten auch vermindert, z.B. CHE) ins Blut durch ihre Erfassung (Art, Konzentration und Mengenverhltnis der gemessenen Enzyme) kann auf das geschdigte Organ geschlossen werden: (siehe auch Titelbild).

    Enzym (Abkrzung) Mgliche Ursache einer Vermehrung des Enzyms im Blut

    Alanin-Aminotransferase (ALT, ALAT) [frher Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT)]

    Schdigungen der Leber

    Aspartat-Aminotransferase (AST, ASAT) [frher Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT)]

    Schdigungen der Leber und des Muskels

    Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) Krankheiten der Leber und der Gallenwege

    Alkalische Phosphatase (AP, ALP) Krankheiten der Leber, der Gallenwege und des Knochens

    Lipase Schdigungen der Bauchspeicheldrse (z.B. Pankreatitis)

    Kreatinphosphokinase (CK) Muskelschden, (Herzmuskelschden)

    Kreatinphosphokinase MB-Typ (CK-MB) Herzmuskelschden (z.B. Infarkt)

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 3

    http://www.med4you.at/laborbefunde/lbef2/lbef_ast_alt.htmhttp://www.med4you.at/laborbefunde/lbef2/lbef_ast_alt.htmhttp://www.med4you.at/laborbefunde/lbef2/lbef_ggt.htmhttp://www.med4you.at/laborbefunde/lbef2/lbef_alkalische_phosphatase.htmhttp://www.med4you.at/laborbefunde/lbef_lipase.htmhttp://www.med4you.at/laborbefunde/lbef2/lbef_ck.htmhttp://www.med4you.at/laborbefunde/lbef2/lbef_ckmb.htm

  • Klinische Chemie Enzyme

    In den Zellen sind die einzelnen Zellenzyme unterschiedlich lokalisiert (Zellmembran, Zytoplasma, Mitochondrien) damit kann auf die Schwere und das Ausmass der Organ-/Zellschdigung gedeutet werden: Sind nur die Zellmembranenzyme vom Referenzbereich abweichend, so ist die Organ-/Zellschdigung noch nicht stark ausgeprgt; sind jedoch noch Enzyme aus Zellkompartimenten (z.B. aus den Mitochondrien) in ihrem Wert auffllig, so ist die Schdigung schon gravierender. Enzymbestimmungen im Blut sind daher hufig Teil einer Laboruntersuchung. Selten bestimmt man Enzyme in anderen Proben (Harn: Amylase, Stuhl: Chymotrypsin oder Elastase). Enzyme werden in der Labormedizin jedoch auch als Hilfsmittel bei der Bestimmung anderer Parameter (z.B. Glucose, Harnsure) in sogenannten enzymatischen Tests eingesetzt (siehe spter). Auch Antigen-Antikrper Reaktionen kann man durch Kopplung mit einer enzymatischen Farbreaktion sichtbar machen (z.B. ELISA).

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 4

  • Klinische Chemie Enzyme

    A. GRUNDLAGEN ENZYME Siehe auch Chemie & Biochemie

    1. Wirkungsweise von Enzymen: Die Stoffe, die von einem Enzym umgesetzt werden, bezeichnet man als Substrate. Diese Substrate gehen mit Hilfe von Enzymen in ein Produkt ber; ohne Enzyme wrden diese biochemischen Reaktionen im Organismus nicht oder nur mit einer nicht messbar kleinen Geschwindigkeit ablaufen. Hier kommen die Enzyme zum Einsatz: die Reaktionen werden mit Hilfe der Enzyme ermglicht und laufen viel schneller ab. Einfach dargestellt: Enzym (E) Substrat (S) Produkt (P)

    Abb. 2: Jedes Enzym, das die Reaktion S P katalysiert, katalysiert auch die Reaktion P S.

    1.1. Energiediagramm einer biochemischen Reaktion: In untenstehender Abbildung wird das Substrat A in das Produkt B umgewandelt. Um diese Reaktion zu ermglichen muss Energie aufgebracht werden, um einen angeregten, energiereichen bergangszustand zu erreichen: die Aktivierungsenergie. Mit Hilfe eines Enzyms wird diese Aktivierungsenergie herabgesetzt (Chemie-Skript S. 71) , in dem sich das Enzym an das Substrat bindet es wird weniger Energie fr die Reaktion bentigt und die Reaktion luft viel schneller ab. Enzyme werden als Katalysatoren nur in kleinen Mengen bentigt und verlassen die Reaktion unverndert; sie knnen in weiteren Reaktionen agieren.

    Abb. 3: Energiediagramm einer biochemischen Reaktion

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 5

  • Klinische Chemie Enzyme

    1.2. Mechanismus der Enzymkatalyse: Betrachten wir den Ablauf der Enzymkatalyse etwas detaillierter, dann ergibt sich folgender Reaktionsablauf:

    Abb. 4: Das freie Enzym E (1.) bindet nacheinander die Substrate A und B (2., 3.) Enzyme knnen ein Substrat oder mehrere Substrate katalysieren zu einem Zwischenprodukt, dem Enzym-Substrat-Komplex (3. E-A-B-Komplex). ber kurzlebige bergangskomplexe (4., 5.), dem sogenannten Enzym-Produkt-Komplex (E-C-D-Komplex), findet die Umwandlung der Substrate in die Produkte statt: Das aktive Zentrum des Enzyms macht, dass nur die Substrate A und B ins Enzym passen und dass diese Substrate in die Produkte C und D (6.) zerfallen. Das Enzym geht unverndert aus der Reaktion heraus und kann weitere Reaktionen katalysieren. Bei Reaktionen von zwei Substraten sorgt das Enzym auch fr die richtige rumliche Anordnung der Reaktionspartner und erhht dadurch die Trefferquote. Durch solche Mechanismen wird die Reaktion so erleichtert, dass die Reaktionsgeschwindigkeit um mehr als das 1010 -fache gesteigert werden kann.

    2. Aktives Zentrum: Jedes Enzym besitzt ein aktives Zentrum, welches ein kleines Areal auf dem Enzym ist. Es ist der Ort im Enzym, an welchem die Substratbindung und die Umsetzung vom Substrat ins Produkt mit Herabsetzen der Aktivierungsenergie stattfindet.

    Abb. 5: Man bezeichnet die Stelle, in die das Substrat (blau) wie ein Schlssel ins Schloss passt, als aktives Zentrum des Enzyms (rot). Hier findet die enzymkatalysierte Reaktion statt.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 6

  • Klinische Chemie Enzyme

    3. Spezifitt:

    Enzyme wirken ausserordentlich spezifisch. Sie besitzen meist eine sehr ausgeprgte Substratspezifitt (ein Enzym reagiert meist nur mit einem bestimmten Substrat, z.B. das Enzym Urease spaltet nur Harnstoff). In der Regel werden selbst dem eigentlichen Substrat sehr hnliche Substanzen nicht umgesetzt. Jedoch: Manche Enzyme reagieren zwar mit verschiedenen Stoffen, aber dann meist mit einer ganz bestimmten chemischen Gruppe oder Verbindungsart, die in diesen verschiedenen Stoffen in gleicher Weise vorkommt (z.B. Abbau von exogenen Substanzen wie Medikamente). Doch noch grsser ist ihre Wirkungsspezifitt/Reaktionsspezifitt: Von den vielen mglichen Reaktionen, die ein Stoffwechselzwischenprodukt eingehen kann, wird nur eine bestimmte Reaktion katalysiert.

    4. Nomeklatur von Enzymen (Klassifikation): Viele Enzyme werden durch Anfgen der Nachsilbe "-ase" an den Namen ihrer Substrate oder an die Bezeichnung, die ihre Aktivitt beschreibt, benannt. Dieser systematische Name eines Enzyms besteht aus:

    Name des umgesetzten Substrates Art der katalysierten Reaktion (den 6 Hauptklassen zu entnehmen)

    Beispiel: Das Enzym Creatinkinase kommt vor allem in den Muskelzellen vor und ist fr die Energiebereitstellung der Zellen wichtig. Wie das Enzym zu seinem Namen kommt: Das umgesetzte Substrat ist das Creatin. Das Enzym bertrgt das Phosphat von ATP auf das Substrat (Creatin) und daraus ergibt sich ein Produkt (Creatinphosphat) dieses Vorgehen wird von den Kinasen durchgefhrt Creatinkinase.

    Creatinkinase Creatin + ATP Creatinphosphat + ADP

    Andere Enzyme, wie Pepsin oder Trypsin (Verdauungsenzyme) tragen Namen, die nichts mit ihren Substraten oder Reaktionen zu tun haben. Manchmal hat ein und dasselbe Enzym 2 oder mehr Namen, oder 2 verschiedene Enzyme werden identisch benannt. Wegen diesen Mehrdeutigkeiten und der stndig wachsenden Zahl neu entdeckter Enzyme wurden internationale Richtlinien zur Benennung und Klassifizierung von Enzymen eingefhrt: Jedem Enzym werden eine 4-stellige Klassifizierungsnummer/Code-Nr. (EC-Nr., Bildung siehe unten) und ein systematischer Name (Bildung siehe oben) zugewiesen, wodurch die katalysierte Reaktion identifiziert werden kann, d.h. nicht das Enzym selbst, sondern die Reaktion, die es katalysiert, wird kategorisiert. Die Code-Nr. (EC-Nr.: Enzyme-Commission-Number) wird gebildet aus:

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 7

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    1. Zahl: Sie gibt eine der 6 Hauptklassen an und bezieht sich auf die katalysierte Reaktion (Anmerkung: Die untenstehende Tabelle mssen Sie nur verstehen):

    Nr.

    Klasse: Katalysierte Reaktion:

    Beispiel:

    1

    Oxidore-duktasen

    Elektronentransfer (Hydrid-Ionen oder H-Atome)

    Oxidasen Reduktasen Peroxidasen Dehydrogenasen (Dehydrogenasen

    verwenden Cosubstrate wie NAD+ oder NADP+ als Wasserstoffakzeptor)

    2

    Transferasen

    Gruppentransfer-Reaktion: bertragen funktionelle Gruppe auf Substrat

    Aminotransferasen (ALAT) Kinasen (bertragung von Phosphat von ATP

    auf andere Stoffe, z.B. CK)

    3

    Hydrolasen

    Hydrolyse-Reaktionen: bertragung funktioneller Gruppen auf Wasser

    Esterasen (Cholinesterase) Lipasen Glykosidasen Peptidasen Phosphatasen (ALP)

    4

    Lyasen

    Addition von Gruppen (H2O, NH3, CO2) an Doppelbindungen oder Bildung von Doppelbindungen durch Entfernung von Gruppen

    Decarboxylasen Aldolasen (Fruktose-1,6-biphosphat-Aldolase)

    5

    Isomerasen

    Transfer von Gruppen innerhalb eines Molekls

    Racemasen Epimerasen Mutasen

    6

    Ligasen

    Katalysieren die Bindung zwischen zwei Substraten mit gleichzeitiger Spaltung energiereicher Verbindungen (Aufbau von Bindungen unter Verbrauch energiereicher Phosphate, z.B. ATP)

    T4-DAN-Ligase

    2. Zahl: Weitere Unterteilung der Hauptklassen in Unterklassen, je nach chemischer Bindung.

    3. Zahl: Unter-Unterklassen 4. Zahl: Seriennummer in der Unter-Unterklasse

    Als Beispiel soll die Benennung des Enzyms Creatinkinase (CK) erlutert werden, das die folgende Reaktion katalysiert:

    CK (Enzym)

    Creatin (Substrat) + ATP Creatinphosphat (Produkt) + ADP Edukte Produkte

    CK hat die System-Nr. (EC): 2.7.3.2. Dies bedeutet: 1. Zahl: Hauptklasse 2 = Transferase 2. Zahl: Unterklasse 7 = Phosphotransferase 3. Zahl: Unter-Unterklasse 3 = H2N als Akzeptor 4. Zahl: Seriennummer in der Unter-Unterklasse 2.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 8

  • Klinische Chemie Enzyme

    B. ENZYMKINETIK

    5. Messung eines Enzyms: Es gibt zwei prinzipiell unterschiedliche Methoden, um Enzyme im Blut nachzuweisen:

    5.1. Direkte Bestimmung der Enzymkonzentration: Man kann ein Enzym im Serum mit Spezialmethoden direkt nachweisen und seine Konzentration bestimmen im Laboralltag sagt man: Man misst die Masse des Enzyms. Das funktioniert, indem man spezielle Antikrper gegen das Enzym herstellt. Eine solche Bestimmungsmethode wird in den meisten Labors zur Bestimmung des Herz-Enzyms CK-MB (da misst man also die CK-MB-Masse) eingesetzt. Im Allgemeinen ist der direkte Enzymnachweis aber zu aufwndig, auch weil Enzyme im Serum nur in sehr geringer

    Konzentration vorhanden sind und die Reagenzien teuer sind. Es kommen jedoch immer mehr Reagenzien auf den Markt, mit welchen die direkte Bestimmung der Enzymkonzentration bestimmt werden kann. Auf diese Bestimmungsmethode wird hier nicht nher eingegangen, da es sich um immunologische Bestimmungen handelt, welche turbidimetrisch gemessen werden und Sie schon in anderen Zusammenhngen kennen gelernt haben bzw. werden (siehe Labortechnik, Turbitimer).

    Abb. 6: Die Darstellung symbolisiert ein Enzymmolekl im Blut. Die Enzyme liegen im Blut nur in sehr geringer Konzentration vor. Eine direkte Bestimmung, also eine Bestimmung des Enzyms selbst, ist mglich aber oft schwierig.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 9

  • Klinische Chemie Enzyme

    5.2. Bestimmung der Enzymaktivitt im Serum: Ein einziges Enzym-Molekl ist in der Lage, in einer Minute Zig-Tausende Substrat-Molekle umzuwandeln. Das macht man sich zunutze, um Enzyme nachzuweisen: Man bietet dem Enzym im Reagenz ein geeignetes Substrat an, lsst das Enzym eine Zeit lang arbeiten und misst dann die Zig-Tausend entstandenen Produkt-Molekle. Das ist meist leichter als das Enzym direkt nachzuweisen. Statt zu messen, wie viel Produkt entstanden ist, kann man natrlich auch messen, wie viel

    Substrat verschwunden ist (siehe unten). Bei dieser Bestimmungsmethode muss man sich zwar bewusst sein, dass man so nicht die Menge des Enzyms, sondern seine Aktivitt im Blut bestimmt das ist aber kein grosses Problem. Unter geeigneten Bedingungen (siehe spter) ist die Enzymaktivitt zur Enzymmenge proportional.

    Abb. 7: 1. Schritt: Man setzt dem Serum Substrat zu (weisse Kugeln). Unter geeigneten Bedingungen (optimaler pH-Wert, richtige Temperatur usw.) wird das Enzym damit beginnen, das Substrat umzusetzen - und zwar sehr grosse Mengen.

    Abb. 8: 2. Schritt: Nach genau definierten Zeitabstnden (siehe nchster Abschnitt) misst man fotometrisch bei der spezifischen Absorptionswellenlnge wie viele Substratmolekle umgesetzt sind, also wie viele orange Kugeln (=Produkt) entstanden sind. Alternativ kann man auch die Abnahme des Substrates (der weissen Kugeln) messen. Das Ergebnis ist die Anzahl der durch die Enzyme umgewandelten Molekle pro Zeiteinheit, also anders ausgedrckt: die Reaktionsgeschwindigkeit oder die Enzymaktivitt. Auch in der Enzymkinetik gilt das Lambert-Beer'sche Gesetz.

    Abb. 9: Je mehr Enzym im Serum, desto mehr Substrat wird umgesetzt. Waren zwei Enzyme im Serum, ist die Reaktionsgeschwindigkeit doppelt so hoch und es werden doppelt so viele orange Kugeln produziert. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist also proportional zur Enzymkonzentration.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 10

  • Klinische Chemie Enzyme

    6. Bestimmung der Enzymaktivitt: Bei den meisten Enzymbestimmungen wird also nicht die Enzymkonzentration (oder Masse) gemessen, sondern die Enzymaktivitt. Die Enzymaktivitt entspricht der Geschwindigkeit, mit der die katalysierte Reaktion abluft. Das bedeutet, dass wir bei der Messung anders vorgehen mssen als bei der blichen Konzentrationsmessung. Wie oben erwhnt, kann entweder das Substrat oder das Produkt gemessen werden: die Enzymaktivitt kann gleichermassen ber die Geschwindigkeit des Verschwinden des Substrates oder ber die Geschwindigkeit des Entstehen des Produktes pro Zeiteinheit bestimmt werden:

    Fotometrisch wird die Extinktion der Substratabnahme oder die Extinktion der Produktzunahme nach mehreren Zeitabschnitten gemessen und zwar nicht nur 1x am Schluss, sondern in genau definierten Zeitabschnitten: Z.B wird bei der CK-Bestimmung (Handmethode von Axonlab!) die Extinktion der Produktzunahme nach 2 Min., dann wieder 1, 2, 3, 4, und 5 Min. spter gemessen. Anschliessend wird die Differenz der einzelnen Extinktionsmessungen ausgerechnet: Whrend den einzelnen Minuten muss das Enzym immer gleich viel Substrat katalysiert haben, d.h. das Enzym muss gleichmssig gearbeitet haben. Die Differenz von einem Extinktionspunkt zum nchsten muss also immer gleich sein, d.h. die Zunahme bzw. Abnahme muss gleichmssig ablaufen. Diese Differenz nennt man E/Min. (Delta Extinktion pro Minute). Aus den mehreren ausgerechneten E/Min.Resultaten wird der Mittelwert ermittelt, welcher mit einem entsprechenden Faktor (wird durch die Kalibration ermittelt) multipliziert wird. Jetzt erhalten wir die Enzymaktivitt in U/l fr das entsprechende Enzym: Die Enzymeinheit (U) ist diejenige Enzymmenge, die 1 mol Substrat pro Minute unter definierten Standardbedingungen umsetzt - und genau das wird bei diesem Vorgehen gemessen. Sind die einzelnen E/Min. nicht gleich gross, ergibt sich beim Aufzeichnen und Verbinden der Messpunkte (Extinktion gegen Zeit) keine Gerade d.h. die Messung lief nicht linear ab, die Reaktionsbedingungen waren nicht optimal bzw. haben sich whrend der Messung verndert die Messung muss wiederholt werden.

    Substrat nimmt ab

    0

    2

    4

    6

    8

    10

    12

    14

    16

    18

    0 1 2 3 4

    Zeit

    Subs

    trat

    Produkt nimmt zu

    0

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    9

    0 1 2 3

    Zeit

    Prod

    ukt

    4

    Abb. 10 & 11: Auf die Enzymaktivitt kann aus der Substratabnahme pro Zeiteinheit oder aus der Produktzunahme pro Zeiteinheit geschlossen werden.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 11

  • Klinische Chemie Enzyme

    Falls sich die Gerade gegen Ende krmmt, lief die Reaktion ebenfalls nicht linear ab, denn auch hier gilt das Lambert-Beersche Gesetz. Die Probe muss verdnnt werden, da das zugefgte Substrat im Reagenz aufgrund einer grossen Enzymkonzentration zu schnell verbraucht wurde.

    Abb. 12: E/Min. entspricht der Differenz zwischen zwei Messpunkten und muss mglichst

    gleich sein: Im Beispiel ist E/Min. 0,08 (Produktzunahme wird gemessen).

    Wir messen also die Aktivitt und nicht die Menge des Enzyms.

    Enzymeinheit: Die Enzymaktivitt (also das Resultat) wird in internationalen Einheiten (Unit=U) angegeben: 1 U bezeichnet diejenige Enzymaktivitt, die den Umsatz von 1 mol Substrat pro Minute unter Standardbedingungen (pH, Temperatur usw.) katalysiert. Aus dem Substratumsatz pro Zeitintervall ergibt sich also die Reaktionsgeschwindigkeit.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 12

  • Klinische Chemie Enzyme

    7. Reaktionsbedingungen fr die Enzymmessung: Die Messung der katalytischen Enzymkonzentration/der Enzymaktivitt hngt im Gegensatz zu einfachen Konzentrationsbestimmungen von Stoffen wie etwa Albumin stark von den Messbedingungen ab, insbesondere von der Temperatur, dem pH-Wert, der Konzentration und der Art des Substrates, von Cofaktoren, der Art und Konzentration des Puffers und dem Einfluss von Effektoren. Daher mssen die Reaktionsbedingungen fr die Messung von Enzymaktivitten verbindlich festgelegt werden, um vergleichbare Bedingungen zu schaffen nur so knnen reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Anmerkung: Das Einhalten der Reaktionsbedingungen muss vor allem strikte bei Handmethoden eingehalten werden dies wird heute jedoch nur noch vereinzelt gemacht. Die heutigen Vollautomaten sowie Reagenzien gewhren, dass die Reaktionsbedingungen konstant gehalten werden. 7.1. Temperaturabhngigkeit: Sie ist von Enzym zu Enzym unterschiedlich. Eine Temperaturerhhung um 10C ergibt in etwa eine Verdoppelung der Reaktionsgeschwindigkeit (RGT-Regel = Reaktionsgeschwindigkeit-Temperatur-Regel). Heute ist die Messtemperatur moderner Analysengerte und die Temperatur fr die Befundmitteilung von Enzymaktivitten einheitlich 37C. brigens drfen wir die Temperatur zur Reaktionsbeschleunigung bei einer enzymkatalysierten Reaktion nicht beliebig erhhen (oft schon nicht ber 40C), da durch das Erhitzen die Raumstruktur der Enzyme zerstrt wird. Obwohl bei der Denaturierung der chemische Aufbau in Form der Aminosuresequenz erhalten bleibt, geht die katalytische Aktivitt durch Strukturnderung des aktiven Zentrums verloren die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt. 7.2. pH-Wert: Jedes Enzym besitzt einen optimalen pH-Bereich, in welchem die enzymkatalysierte Reaktion am optimalsten abluft. Dieser Bereich ist meistens relativ eng, wobei das eigentliche Maximum aber oft doch so breit ist, dass kleine pH-Abweichungen unter 0,2 pH-Einheiten kaum Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit haben. Durch extreme pH-Werte jedoch kann es zur irreversiblen Denaturierung von Proteinen kommen. 7.3. Konzentration und Art des Substrates: Bei Bestimmungen von Enzymaktivitten muss stets in Gegenwart eines Substratberschusses (d.h. bei Substratsttigung) bzw. beim Substratoptimum gearbeitet werden. Nur so ist Gewhr geboten, dass der gemessene Umsatz durch die zu bestimmende Enzymkonzentration und nicht durch das Substratangebot limitiert wird. Denn whrend der gesamten Reaktionszeit muss jedes Enzymmolekl ein Substratmolekl binden und umsetzen knnen nur so kann die ganze Enzymaktivitt erfasst werden.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 13

  • Klinische Chemie Enzyme

    Vorsicht: Bei zu hoher Substratkonzentration kann das Enzym gehemmt werden: Substrathemmung. Als Erklrung dient die Vorstellung, dass sich die Substratmolekle in diesem Fall gegenseitig bei der Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms behindern: Zu viele Substratmolekle sind vorhanden und versperren so den Eingang zum aktiven Zentrum.

    Abb. 13: Substrathemmung der Enzymkatalyse

    Auch die Art des Substrates hat einen Einfluss: Je besser das zugefgte Substrat zum aktiven Zentrum des Enzyms in der Probe passt (je hher also die Affinitt ist), desto schneller liegen Enzym-Substrat-Komplexe vor. Also werden Substrate mit hoher Affinitt daher schon bei relativ niedriger Substratkonzentration rasch umgesetzt.

    Wenn das Enzym grosse Affinitt zum Substrat besitzt, so ist eine kleinere Substratkonzentration ntig, da die Enzym-Substrat-Komplexe schnell vorliegen.

    Wenn das Enzym eine geringe Affinitt zum Substrat besitzt, so ist eine grssere Substratkonzentration ntig, da es lnger dauert bis die Enzym-Substrat-Komplexe vorliegen.

    7.4. Coenzyme: Coenzyme (auch Cosubstrate genannt) werden bei katalytischen Reaktionen fr die Aktivitt von Enzymen oft gebraucht: Das Enzym bindet sich an das Coenzym, um dann aktiv zu werden. Coenzyme (z.B. NAD+) binden reversibel und nicht kovalent an das Apoenzym (Enzym-Molekl) und bildet zusammen mit ihm das Holoenzym (Apoenzym + Coenzym = Holoenzym). Das Coenzym wird dabei verndert, das Apoenzym geht unverndert aus der katalysierten Reaktion hervor. Coenzyme leiten sich von Vitaminvorstufen ab: z.B. hat das Coenzym Pyridoxalphosphat das Vitamin B6 (Pyridoxin) als Baustein. Liegt ein Vitamin B6-Mangel vor, so liegt auch ein Mangel des Coenzyms Pyridoxalphosphat vor die Enzyme, welche das Pyridoxalphosphat als Coenzym bentigen, knnen die Reaktion nicht katalysieren. Ein Vitaminmangel kann also verschiedene Stoffwechselvorgnge beeintrchtigen und unspezifische Symptome bewirken. (Vitamine sind lebensotwendige hochwirksame Stoffe, die der Mensch in geringen Mengen mit der Nahrung aufnehmen muss, da sie nicht im Krper hergestellt werden knnen. Sie gehren sehr unterschiedlichen chemischen Stoffklassen an.)

    Coenzyme & ihre Vitaminbausteine: NAD+ (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid) Vitamin B3 NADP+ (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat) Vitamin B3 Pyridoxalphosphat Vitamin B6

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 14

  • Klinische Chemie Enzyme

    7.5. Art und Konzentration des Puffers: Nicht nur der pH-Wert des Puffers, sondern auch seine chemische Natur beeinflusst die katalytische Aktivitt. Z.B. ist die Aktivitt der Alkalischen Phosphatase bei gleichem pH und Substrat in Diethanolamin-Puffer 2- bis 4-mal hher als in 2-Amino-2-methylpropanol-Puffer. 7.6. Effektoren: Effektoren (Ionen, kleine Molekle, Proteine) sind Aktivatoren (positive Effektoren) oder Inhibitoren (Hemmstoffe, negative Effektoren). Aktivatoren erhhen und Inhibitoren vermindern die katalytische Aktivitt von Enzymen. Effektoren kommen z.B. auch in Antikoagulantien und Reagenzien vor:

    ATP und NADH sind Inhibitoren gewisser Enzyme des Glucoseabbaus (siehe Biochemie).

    ADP und AMP sind Aktivatoren gewisser Enzyme des Glucoseabbaus (siehe Biochemie).

    Fluorid (Antikoagulant in Fluoridrhrchen) hemmt die glykolytischen Enzyme. Tartrat (Reagenzienzusatz) hemmt die saure Prostata-Phosphatase der

    Prostata, Thrombozyten, Monozyten. Kalziumionen (aus dem Probenmaterial) hemmen die Creatinkinase. N-Acetylcystein (NAC) reaktiviert die Creatinkinase, die infolge Oxidation ihrer

    beiden Sulfhydrylgruppen inaktiviert wurde.

    8. Optimierte Standardmethoden: Aus den zuvor genannten Grnden erscheint es verstndlich, dass die Vergleichbarkeit von Enzymaktivittsbestimmungen oft eingeschrnkt ist und erst erreicht werden kann, wenn in sog. optimierten Methoden all diese Einflussgrssen (pH-Wert, Substratkonzentration, Effektoren usw.) durch genaue Festlegung der Durchfhrungsbedingungen weitgehend ausgeschaltet werden. International sind die Bedingungen fr die Messung von Enzymreaktionen nicht einheitlich, so dass eine Vielzahl sog. optimierter Testverfahren von der IFCC (Internationale Fachstelle fr klinische Chemie) eingefhrt wurde: Optimierte Tests sind Tests, welche standardisierte Bedingungen (pH-Wert, Substratkonzentration, Effektoren usw.) erfllen. Durch optimierte Standardmethoden werden vergleichbare Resultate erzielt (z.B. knnen so im Labor die gleichen Referenzwerte wie in der Reagenzpackung erreicht werden). In den Packungsbeilegern werden optimierte Tests folgendermassen bezeichnet: " nach den Empfehlungen der International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) modifiziert." In einem Labor sollten optimierte Standardmethoden den anderen Methoden vorgezogen werden (gilt nicht nur bei der Bestimmung der Enzymaktivitt sondern fr alle Tests).

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 15

  • Klinische Chemie Enzyme

    C. METHODEN ZUR MESSUNG DER ENZYMAKTIVITTEN

    Die Messung von Enzymaktivitten wird mit sog. Enzymtests erfasst: In einem Enzymtest wird die Aktivitt eines Enzyms gemessen. Die Messung erfolgt hier immer kinetisch, d.h. die Extinktionszu- oder Extinktionsabnahme wird kontinuierlich oder in genau definierten Zeitabstnden ber eine bestimmte Zeit gemessen. Oft reicht es nicht, nur ein Substrat zuzufhren man muss zwei oder mehrere Stoffe hinzugeben. Die Enzymaktivitt kann in zwei verschiedenen Verfahren erfolgen:

    mit einem Farbtest (kinetische Messung) oder mit dem sogenannten optisch-enzymatischen (kinetischen) UV-Test

    (einfach oder gekoppelt).

    9. Enzymaktivittsmessung im Farbtest (kinetische Messung): Wie auf den vorherigen Seiten schon erwhnt, ist es zur Ermittlung der Enzymaktivitt entscheidend zu wissen, wie viel Substrat pro Zeiteinheit umgesetzt wurde - man kann die Produktzunahme oder aber auch die Substratabnahme im Fotometer messen. Bei der Bestimmung der Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) wird die Produktzunahme gemessen: Bietet man diesem Enzym zwei bestimmte Substrate an, dann entsteht als Produkt ein Farbstoff, den man im Fotometer messen kann.

    Abb. 14: Kinetischer Farbtest (am Beispiel der Aktivittsmessung der GGT): Die zwei Substrate sind im Testansatz (im Reagenz) im berschuss enthalten. Unter Wirkung der GGT aus dem Serum entstehen die zwei untenstehenden Produkte. Die Farbnderung auf Zeit des 5-Amino-2-nitrobenzoat kann man im Fotometer bei 405 nm messen und ist proportional zur Enzymaktivitt.

    Glycylglycin

    Man beobachtet bei der Enzymaktivittsmessung im Farbtest also den Verlauf der Zu- oder Abnahme der Farbintensitt auf Zeit, welche der Enzymaktivitt proportional ist.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 16

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    10. Enzymaktivittsmessung im optisch-enzymatischen (kinetischen) UV-Test:

    Im Vergleich zum obgenannten Farbtest wird hier nicht im Farbbereich gemessen, sondern im UV-Bereich. Grund dafr ist, dass wir NADH oder NADPH messen mssen (da die anderen Produkte oder Edukte nicht messbar sind), welche bei der Reaktion entstanden sind und welche ihr Absorptionsmaximum im UV-Bereich haben.

    NADH + H+ NAD+ (NADH ist die reduzierte Coenzymform von NAD+) NADPH + H+ NADP+ (NADPH ist die reduzierte Coenzymform NADP+)

    Wir schauen uns als Beispiel das Bestimmungsverfahren des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH) an:

    a. Messreaktion: LDH L-Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

    Bei einem optisch-enzymatischen UV-Test wird bei einer entsprechenden Testreaktion die Oxidation von reduziertem Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), gemessen. Fotometrisch kann immer nur das NADH im UV-Bereich bei 340 nm (auch mglich bei 334 nm, 365 nm) gemessen werden Grund: Wrde man im Absorptionsmaximum bei 260 nm messen, so wre dies ungnstig, weil sowohl NAD+ als auch NADH ihr Absorptionsmaximum bei 260 nm haben.

    Da NADH im Gegensatz zu NAD zwischen 300 und 370 nm stark absorbiert, kann anhand der

    Extinktionsnderung (Abnahme bei Oxidation von NADH, Zunahme bei Reduktion von NAD) bei einer Wellenlnge von 340 oder 366 nm der Ablauf der Reaktion verfolgt werden. Die Extinktion des NAD+ ist bei dieser Wellenlnge fast gleich null.

    Abb. 16: Absorptionsspektrum von NADH (NADPH) und NAD (NADP). NADH bzw. NADPH haben bei 340 nm ein zustzliches Absorptionsmaximum.

    Abb. 15: Die Lactatdehydrogenase katalysiert die Oxidation von L-Lactat (Substrat) zu Pyruvat (Produkt) unter gleichzeitiger Reduktion von NAD+ (Coenzym) zu NADH. Die Geschwindigkeit der Bildung von NADH ist direkt proportional zur LDH-Aktivitt.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 17

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    Die Extinktionsnderung ist der Enzymaktivitt proportional. NADH bzw. NAD kann direkt an der vom Enzym katalysierten Reaktion beteiligt sein. Analoges gilt fr Nikotinamid-adenin-dinukleotidphosphat (NAD(P)) bzw. die reduzierte Verbindung NAD(P)H. Luft die Reaktion von NADH zu NAD+ ab, so handelt es sich um eine Extinktionsabnahme. Wenn die Reaktion von NAD+ zu NADH abluft, so handelt es sich immer um eine Extinktionszunahme:

    a. Messreaktion: LDH L-Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

    Abb. 17: LDH: Luft die Reaktion von NAD+ (Eduktabnahme) nach NADH (Produktzunahme) ab, so handelt es sich um eine Extinktionszunahme.

    a. Messreaktion: ASAT L-Aspartat + 2-Oxoglutarat Oxalacetat + L-Glutamat b. Indikatorreaktion: MDH Oxalacetat + NADH + H+ L-Malat + NAD+

    Abb. 18: ASAT: Die Reaktion luft von NADH (Eduktabnahme) nach NAD+ (Produktzunahme) ab, so handelt es sich um eine Extinktionsabnahme.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 18

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    10.1. Enzymaktivittsmessung im gekoppelten optisch-enzymatischen (kinetischen) UV-Test:

    Auch die Aktivitt von Enzymen, welche nicht NAD+- oder NADP+ -abhngig sind, kann mit Hilfe des optischen Tests bestimmt werden. Es gibt eine Vielzahl von Enzymen, bei denen keines der in der Messreaktion auftretenden Substrate, Cosubstrate und Produkte photometrisch erfasst werden kann; denn diese Enzyme sind nicht NAD+- oder NADP+ -abhngig. Bei ihnen muss die eigentliche enzymatisch-katalysierte Reaktion mit einer NAD+- oder NADP+ -abhngigen Indikatorreaktion gekoppelt werden. Man spricht dann von einem gekoppelten optisch-enzymatischen Test. Meistens ist die Indikatorreaktion der eigentlichen Messreaktion nachgeschaltet, indem eines der Produkte der Messreaktion in der Indikatorreaktion weiterreagiert: Die Messreaktion wird von dem zu untersuchenden Enzym aus der Probe katalysiert. In der Indikatorreaktion reagiert eines der dabei gebildeten Produkte zu einem photometrisch sichtbaren Folgeprodukt weiter. Einfach dargestellt:

    Abb. 19: Gekoppelter optisch-enzymatischer UV-Test

    Beispiel fr einen gekoppelten optischen Test mit Mess- und Indikatorreaktion ist die Bestimmung der Transaminase Alanin-Aminotransferase ALAT (GPT): a. Messreaktion: ALAT L-Alanin + 2-Oxoglutarat L-Glutamat + Pyruvat b. Indikatorreaktion: LD Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+ Beispiel fr einen gekoppelten optischen Test mit Hilfs-, Indikator- und Messreaktion ist die Bestimmung der Creatinkinase (CK): a. Messreaktion: CK Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP b. Hilfsreaktion: Hexokinase ATP + Glucose Glucose-6-P + ADP c. Indikatorreaktion: Glucose-6-P- Dehydrogenase Gluc-6-P + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 19

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    a. Messreaktion: Erster Schritt im Ablauf einer chemischen Reaktion, wobei das zu messende Enzym hier reagiert und Produkte entstehen. b. Hilfsreaktion: Ein oder mehrere Schritte nach der Messreaktion, um die Produkte aus der Messreaktion soweit umzuwandeln, dass dessen Konzentration in der Indikatorreaktion gemessen werden kann. Hier kommen sogenannte "Hilfsenzyme" zum Einsatz: D.h. dem Reagenz zugesetzte Enzyme, die den Umsatz der Edukte in der Hilfsreaktion (=Produkte aus der Messreaktion) katalysieren. c. Indikatorreaktion: Letzter Schritt im Testablauf, in welchem die Edukte zu Produkte reagieren.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 20

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    D. ENZYMATISCHE TESTS

    11. Enzymatische Substratbestimmung (Enzymatischer Test): Enzyme sind nicht nur unter diagnostischen Gesichtspunkten interessant, sondern auch wichtige Hilfsmittel zur Bestimmung von Substratkonzentrationen, da sie sehr spezifisch sind. Substrat (Protein, Lipid, Glucose usw.), das gemessen werden soll, wird mit Hilfe von Enzymen umgesetzt, so dass die Extinktionsnderung als Mass fr die Substratkonzentration fotometrisch erfasst werden kann = Enzymatischer Test. Als Beispiel die Bestimmung der Harnsure mittels einem Enzym: Fr die Harnsure gibt es ein ideales Enzym, das ist die Uricase. Die Uricase baut Harnsure ab. Gibt man Uricase zum Serum dazu, wird die Harnsure abgebaut. Irgendwann ist die ganze Harnsure abgebaut und die Extinktion ndert sich nicht mehr. Da die Harnsure bei 290 nm Licht absorbiert, kann man den Abbau im Fotometer beobachten. Die Messung der Harnsurekonzentration kann auf zwei verschiedene Mglichkeiten ablaufen: 11.1. Endpunkt-Methode: Dabei lsst man die Reaktion wie oben beschrieben ablaufen. Man misst die Extinktion zwei Mal: Einmal den Ausgangwert vor Zugabe des Enzyms und nach Erreichen des Endwertes. Die Differenz zwischen Ausgangswert und Endwert (multipliziert mit dem entsprechenden Faktor) entspricht der Harnsurekonzentration. 11.2. Kinetische Methode: Diese hat folgende Grundlage: Unter geeigneten Bedingungen ist die Geschwindigkeit, mit der das Substrat (z.B. Harnsure) abgebaut wird, proportional zur Menge vorhandenen Substrats. Man kann damit aus der Geschwindigkeit des Abbaus auf die Substratkonzentration schliessen.

    Man misst hier die Extinktion zweimal whrend die Reaktion luft, also whrend des Abfalls der Substratkonzentration. Mittels geeigneter mathematischer Formeln lsst sich aus der Differenz der beiden gemessenen Extinktionen und der verstrichenen Zeit die Ausgangskonzentration berechnen. (Anmerkung: Vollautomaten messen nicht nur 2x, sondern viel fters, was zu genaueren Resultaten fhrt.)

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 21

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    E. ISOENZYME Enzyme mit gleicher Substratspezifitt und enzymatischer Wirkung (d.h. sie katalysieren die gleichen Reaktionen), aber mit unterschiedlicher Proteinstruktur, bezeichnet man als Isoenzyme. Bei Isoenzymen handelt es sich zum Beispiel um mitochondriale und zytoplasmatische Formen des gleichen Enzyms (z.B. ASAT) oder um Enzymvarianten, die gewebespezifisch vorkommen (z.B. Knochen-ALP und plazentre-ALP) oder auch um Enzymvarianten, die rassenspezifische Unterschiede zeigen. Beispiele:

    Das Enzym LDH (LD) hat 5 Isoenzyme (LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4, LDH-5). Die LDH setzt sich aus zwei verschiedenen genetisch determinierten Untereinheiten A und B zusammen. Das Enzym besteht jeweils aus 4 Untereinheiten, so dass fnf Kombinationen mglich sind. Alle fnf Formen katalysieren dieselbe Reaktion, sind also Isoenzyme.

    Das Enzym CK hat 3 Isoenzyme: CK-MM, CK-MB, CK-BB. Die relativen Mengen der verschiedenen Isoenzyme sind je nach Organ unterschiedlich. Die blichen Enzymtestverfahren erfassen alle Isoenzymformen eines Enzyms gemeinsam. Die Quantifizierung von Isoenzymen gewinnt zunehmende diagnostische Bedeutung und ist mittels verschiedener Methoden mglich. Die am hufigsten anzutreffenden sind:

    Immunologische Bestimmungsverfahren: Die Bestimmung erfolgt mit

    hochspezifischen monoklonalen Antikrpern (z.B. CK-MB-Masse). Elektrophoretische Trennverfahren (siehe klinische Chemie, Proteine):

    Aufgrund der unterschiedlichen Proteinstruktur der Isoenzyme zeigen sie charakteristische elektrophoretische Wandereigenschaften; jedes Isoenzym weist eine eigene Bande auf. Dieses Verfahren wird fr die Isoenzymbestimmung nur selten durchgefhrt.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 22

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    F. ENZYME IM EINZELNEN Auf den folgenden Seiten finden Sie eine Zusammenstellung der einzelnen Enzyme, welche im Labor am hufigsten bestimmt werden. Die Referenzbereiche, Probenmaterialien sowie die Pranalytik muss den Packungsbeileger entnommen werden es wird hier nicht nher darauf eingegangen.

    12. Alanin-Aminotransferase ALAT/ALT bzw. GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase):

    Der Name Transaminase beschreibt die physiologische Funktion des Enzyms Alanin-Aminotransferase (ALAT, frher GPT): Es ermglicht den Transfer von stickstoffhaltigen Gruppen von einer AS auf eine andere. 12.1. Vorkommen: Die ALAT/GPT ist ein in vielen Geweben vorkommendes Zellenzym. Es ist im Zytoplasma lokalisiert, so dass es bereits bei geringgradigen Strungen der Membranpermeabilitt zu einem Anstieg der ALAT im Blut kommt. Die ALAT kommt in grosser Konzentration vor allem in der Leber vor und besitzt somit grosse diagnostische Bedeutung als Leitenzym fr die Erkennung, Differenzierung und Verlaufsbeurteilung von Erkrankungen der Leber und Gallenwege. In kleiner Konzentration kommt die ALAT auch in Skelettmuskel, Herz, Niere, Pankreas und Erythrozyten vor, d.h. auch bei diesen Organerkrankungen kann die ALAT im Blut erhht sein jedoch nur leicht! Parallele Bestimmungen von ALAT und ASAT werden zur Unterscheidung zwischen Leber- und Herz-/Muskelschden durchgefhrt: Als spezifisches Leberenzym ist ALAT nur bei hepatobiliren Erkrankungen signifikant erhht. Erhhte ASAT-Werte aber knnen sowohl mit Erkrankungen der Herz- und Skelettmuskulatur als auch des Leberparenchyms zusammenhngen. In diesem Zusammenhang werden in einigen Spitlern der sogenannte De-Ritis-Quotient (ASAT/ALAT-Quotient) ausgerechnet, um solche Einschrnkungen zu machen (siehe spter). ALAT ist jedoch bei Lebererkrankungen das spezifischere Enzym als ASAT; ausserdem hlt die Erhhung der ALAT-Aktivitt lnger an als die der ASAT-Aktivitt.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der ALAT:

    Leber und Gallenwege:

    bei Lebererkrankungen , z.B.: Hepatitis, Zirrhose, toxische Leberschden durch z.B. Alkohol, Lebertumor usw.

    bei Gallenwegerkrankungen , z.B.: Cholestase Geringfgig erhhte Werte der ALAT knnen auch durch hufigen Alkoholgenuss und die Einnahme bestimmter Medikamente bedingt sein.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 23

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    12.2. Bestimmungsverfahren: Die Alanin-Aminotransferase katalysiert die bertragung der Aminogruppe von L-Alanin auf 2-Oxoglutarat unter Bildung von Glutamat und Pyruvat. In der nachgeschalteten Indikatorreaktion wird das Pyruvat mit Hilfe von NADH zu Lactat reduziert; diese Reaktion wird durch die Lactatdehydrogenase (LDH) katalysiert. Gemessen wird die Absorptionsabnahme (bei 340 nm, 334 nm oder 365 nm) in der Indikatorreaktion aufgrund des NADH-Verbrauchs (die Abnahme der NADH-Konzentration ist der Enzymaktivitt proportional). Es handelt sich dabei um einen gekoppelten, optisch-enzymatisch UV-Test, mittels kinetischer Messung: a. Messreaktion: ALAT L-Alanin + 2-Oxoglutarat L-Glutamat + Pyruvat b. Indikatorreaktion: LDH Pyruvat + NADH + H+ L-Lactat + NAD+

    Bei der ALAT-Bestimmung (wie bei ASAT) knnen folgende Strungen auftreten, welchen folgendermassen entgegengewirkt wird :

    Vor dem Start der spezifischen Messreaktion mit 2-Oxoglutarat wird das Coenzym der Transaminasen (Pyridoxalphosphat) dem Reaktionsansatz zugefgt, um etwa in der Probe vorhandene inaktive Apo-ALAT (Enzym ohne gebundenes Pyridoxalphosphat = PLP; ungebunden, weil in der Probe zu wenig des Coenzyms PLP vorhanden ist und so das Enzym ALAT nicht aktiviert werden kann) durch Bildung des Holoenzyms (Apo-ALAT + Pyridoxalphosphat) zu aktivieren. Dieser Zusatz von Pyridoxalphosphat vermeidet falsch niedrige Werte in Proben von Patienten mit Myokardinfarkt, Lebererkrankungen, Intensivpatienten und Patienten mit Vitamin-B6-Mangel, die zu wenig endogenes Pyridoxalphosphat enthalten. Das Pyridoxalphosphat muss dem Reagenz zustzlich beigefgt und separat bestellt werden aus Kostengrnden gibt es Labors, welche kein Pyridoxalphosphat zugeben und den Ansatz ohne Pyridoxalphosphat durchfhren. Die Referenzwerte variieren dann einwenig. Wird dem Reagenz kein Pyridoxalphosphat zugefgt, so kann die Serumaminotransferaseaktivitt bei obigen Patienten falsch vermindert sein.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 24

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    Lactatdehydrogenase (LDH/LD) wird zugegeben, um whrend der Vorinkubationszeit das in der Probe vorhandene Pyruvat zu reduzieren, damit es nicht durch Reaktion des endogenen Pyruvats konkurrierend zur Indikatorreaktion zu einem unspezifischen NADH-Verbrauch kommt. Endogenes Pyruvat kommt z.B. vermehrt bei Diabetikern vor: Durch Strungen im Glukosestoffwechsel fllt bei ihnen viel Pyruvat an, welches in der Reaktion auch NADH verbraucht und so zu falsch erhhten Resultaten fhren kann.

    Abb. 20: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der ALAT mit Pyridoxalphosphat.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 25

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    13. Aspartat-Aminotransferase ASAT/AST bzw. GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transaminase):

    Der Name Transaminase beschreibt die physiologische Funktion des Enzyms Aspartat-Aminotransferase (ASAT, frher GOT): Es ermglicht den Transfer von stickstoffhalten Gruppen von einer AS auf eine andere. 13.1. Vorkommen: Die ASAT/GOT ist ein in vielen Geweben vorkommendes Zellenzym, das sowohl zytosolisch (zu 1/3) gelst als auch an mitochondriale Strukturen (zu 2/3) gebunden vorliegt. Die ASAT kommt daher erst dann strker ins Blut, wenn Zellen vollstndig zerstrt sind. ASAT kommt in Leber, Herz, Skelettmuskel, Gehirn, Niere, Pankreas, Lunge und Erythrozyten vor. Diagnostische Bedeutung besitzt die ASAT fr die Erkennung, Differenzierung und Verlaufsbeurteilung von Erkrankungen der Leber und Gallenwege, sowie darber hinaus bei der Differenzialdiagnose von Erkrankungen der Skelett- und Herzmuskulatur, beim Lungeninfarkt und der hmolytischen Anmie. Geringfgig erhhte Werte der ASAT knnen auch durch hufigen Alkoholgenuss und die Einnahme bestimmter Medikamente bedingt sein. Parallele Bestimmungen von ALAT und ASAT werden zur Unterscheidung zwischen Leber- und Herz-/Muskelschden durchgefhrt: Als spezifisches Leberenzym ist ALAT nur bei hepatobiliren Erkrankungen signifikant erhht. Erhhte ASAT-Werte aber knnen sowohl mit Erkrankungen der Herz- und Skelettmuskulatur als auch des Leberparenchyms zusammenhngen. Ist die ASAT stark erhht (gleich hoch wie ALAT oder hher), so weist dies auf mitochondriale Schdigung und somit auf eine starke Zellschdigung hin.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der ASAT:

    Leber und Gallenwege:

    bei Lebererkrankungen , z.B.: Hepatitis, Zirrhose, toxische Leberschden durch z.B. Alkohol, Lebertumor usw.

    bei Gallenwegerkrankungen , z.B.: Cholestase

    Skelettmuskel: bei z.B.: Muskeldystrophie, Krampfanflle, Entzndungen, schwere krperliche Anstrengung

    Herz: Herzinfarkt (keine Organspezifitt!) Lunge: Lungeninfarkt Blut: hmolytische Anmie

    13.2. Bestimmungsverfahren: Die Aspartat-Aminotransferase katalysiert die bertragung der Aminogruppe von L-Aspartat auf 2-Oxoglutarat unter Bildung von L-Glutamat und Oxalacetat. In der nachgeschalteten Indikatorreaktion wird das Oxalacetat mit Hilfe von NADH zu L-Malat reduziert; diese Reaktion wird durch die Malatdehydrogenase (MDH) katalysiert. Gemessen wird die Absorptionsabnahme (bei 340 nm, 334 nm oder 365 nm) in der Indikatorreaktion aufgrund des NADH-Verbrauchs (die Abnahme der NADH-Konzentration ist der Enzymaktivitt proportional). Es handelt sich hierbei um einen gekoppelten, optisch-enzymatischen UV-Test, mitels kinetischer Messung:

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 26

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    a. Messreaktion: ASAT L-Aspartat + 2-Oxoglutarat Oxalacetat + L-Glutamat b. Indikatorreaktion: MDH Oxalacetat + NADH + H+ L-Malat + NAD+ Bei der ASAT-Bestimmung (wie bei ALAT) knnen folgende Strungen auftreten, welchen folgendermassen entgegengewirkt wird :

    Vor dem Start der spezifischen Reaktion wird das Coenzym der Transaminasen (Pyridoxalphosphat) dem Reaktionsansatz zugefgt, um etwa in der Probe vorhandene inaktive Apo-ASAT (Enzym ohne gebundenes Pyridoxalphosphat = PLP; ungebunden, weil in der Probe zu wenig des Coenzyms PLP vorhanden ist und so das Enzym ASAT nicht aktiviert werden kann) durch Bildung des Holoenzyms (Apo-ASAT + Pyridoxalphosphat) zu aktivieren. Dieser Zusatz von Pyridoxalphosphat vermeidet falsch niedrige Werte in Proben von Patienten mit Myokardinfarkt, Lebererkrankungen, Intensivpatienten und Vitamin-B6-Mangel, die zu wenig endogenes Pyridoxalphosphat enthalten. Das Pyridoxalphosphat muss dem Reagenz zustzlich beigefgt und separat bestellt werden aus Kostengrnden gibt es Labors, welche kein Pyridoxalphosphat zugeben und den Ansatz ohne Pyridoxalphosphat durchfhren. Die Referenzwerte variieren dann einwenig. Wird dem Reagenz kein Pyridoxalphosphat zugefgt, so kann die Serumaminotransferaseaktivitt bei Patienten mit Vitamin-B6-Mangel vermindert sein.

    Lactatdehydrogenase (LDH/LD) wird zugegeben, um whrend der Vorinkubationszeit das in der Probe vorhandene Pyruvat zu reduzieren, damit es nicht durch Reaktion des endogenen Pyruvats konkurrierend zur Indikatorreaktion zu einem unspezifischen NADH-Verbrauch kommt. Endogenes Pyruvat kommt z.B. vermehrt bei Diabetikern vor: Durch Strungen im Glukosestoffwechsel fllt bei ihnen viel Pyruvat an, welches in der Reaktion auch NADH verbraucht und so zu falsch erhhten Resultaten fhren kann.

    Abb. 21: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der ASAT mit Pyridoxalphosphat. .

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 27

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    14. Alkalische Phosphatase

    ALP/AP: Unter der Bezeichnung Alkalische Phosphatase (ALP/AP) wird eine Gruppe von Enzymen zusammengefasst, die Phosphatester spalten und am besten bei einem pH > 7.0, also im alkalischen Milieu wirken. 14.1. Vorkommen: Die alkalischen Phosphatasen im Blut kommen vorwiegend aus dem Knochen (zu ca. 50%) und der Leber (zu ca. 50%), vor allem das Gallengansgewebe besitzt sehr viel AP-Aktivitt. Bei einem Viertel der Menschen stammen ca. 10% aus dem Dnndarm. Bei Schwangeren kommt ein Teil der alkalischen Phosphatase aus der Plazenta. Alkalische Phosphatasen sind membranstndige Zellenzyme. Von ihnen existieren verschiedene Isoenzyme, welche aus verschiedenen Geweben stammen und auch so benannt werden:

    Leber-AP Knochen-AP Dnndarm-AP (auch intestinale-AP) Plazenta-AP

    Diese AP-Isoenzyme knnen mit speziellen Tests einzeln gemessen werden. Je nach Methode lassen sich noch einige andere Untergruppen unterscheiden. Wenn man aber von der Alkalischen Phosphatase spricht, so ist damit die Gesamtaktivitt aller im Blut befindlichen Alkalischen Phosphatasen gemeint genauer msste man dies "Gesamt-AP" nennen. Meist reicht die Bestimmung der Gesamt-AP aus, fr spezielle Fragestellungen oder Situationen muss man einzelne AP-Isoenzyme bestimmen. Das kann eine unklare Gesamt-AP Erhhung sein, bei der man wissen mchte, ob sie von der Leber oder vom Knochen verursacht wurde. Oder man mchte die Knochen-AP bei bekannter Lebererkrankung abschtzen. Auch wenn man den Verlauf der AP bei einer Erkrankung kontrollieren mchte gelingt dies exakter durch Bestimmung des interessierenden AP-Isoenzyms. Die Konzentration der Alkalischen Phosphatase im Blut wird meist bei Verdacht auf Leber-, Gallenwegs- oder Knochenkrankheiten bestimmt, sowie zur Beobachtung des Verlaufs dieser Erkrankungen. Bei Verschlssen der Gallenwege findet man die hchsten Werte, bei Erkrankungen der Leber findet man weniger starke Erhhungen. Auch Erkrankungen der Knochen knnen Ursache einer Erhhung sein. Bei Kindern und in der Schwangerschaft findet man auch normalerweise hhere AP-Spiegel.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der ALP:

    Leber und Gallenwege:

    bei Lebererkrankungen , z.B.: Hepatitis, Lebertumor und metastasen usw.

    bei Gallenwegerkrankungen , z.B.: Cholestase Knochen:

    bei Knochenerkrankungen als Folge gesteigerter osteoblastischer Aktivitt, z.B.: Morbus Paget (entzndliche Knochendystrophie), Osteomalazie (generalisierte Knochenerweichung), Knochentumoren und metastasen

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 28

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    14.2. Bestimmungsverfahren: Die Alkalische Phosphatase katalysiert in Gegenwart von Magnesiumionen die Hydrolyse des farblosen p-Nitrophenylphosphat zu Phosphat und p-Nitrophenol, welches im alkalischen Bereich eine gelbe Farbe aufweist, deren Farbintensitt bei ca. 405 nm bestimmt wird. Die Geschwindigkeit der Bildung von p-Nitrophenol und somit deren Farbintensitt ist direkt proportional zur ALP-Aktivitt. Gemessen wird die Gesamt-ALP. Es handelt sich demnach um einen kinetischen Farbtest (Enzymtest): a. Messreaktion: ALP p-Nitrophenylphosphat + H2O p-Nitrophenol + Phosphat Abb. 22: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der ALP.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 29

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    15. Gamma-Glutamyltransferase y-GT/GGT:

    Die -GT hilft Glutamyl-Reste von einem Stoff (z.B. von Glutathion) auf einen anderen (z.B. eine AS) zu bertragen, also zu transferieren. 15.1. Vorkommen: Die Gamma-Glutamyltransferase (-GT) findet sich gebunden an die Zellmembran (Zellenzym). Sie kommt in sehr vielen Organen vor. Die -GT, die man im Blut messen kann, stammt aber praktisch nur aus der Leber und in der Leber sind es vor allem die Zellen, die die kleinen Gallengnge auskleiden (also Gallengansgewebe), auf denen man besonders viel GGT-Aktivitt findet. Die GGT im Blut ist also ein sehr empfindlicher Anzeiger und somit ein Leitenzym fr Erkrankungen der Leber und Gallenwege.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der ASAT:

    Leber und Gallenwege:

    bei Lebererkrankungen , z.B.: Hepatitis, toxische Leberschden durch z.B. Alkohol, Leberzirrhose, Fettleber, Lebertumor und metastasen usw.

    bei Gallenwegerkrankungen , z.B.: Cholestase

    Zusammen mit anderen Enzymen wie ALAT, ASAT, AP und Cholinesterase ist die -GT ein wertvoller Test zur Differentialdiagnose bei Lebererkrankungen. 15.2. Bestimmungsverfahren: Die Gamma-Glutamyltransferase katalysiert die bertragung der L--Glutamylgruppe von L- -Glutamyl-3-carboxy-4-nitranilid (Glucana) auf Glycylglycin. Dabei bilden sich L- -Glutamyl-Glycylglycin und 5-Amino-2-nitrobenzoat. Gemessen wird das gelbe Reaktionsprodukt 5-Amino-2-nitrobenzoat bei ca. 405 nm. Die Geschwindigkeit der Bildung von 5-Amino-2-nitrobenzoat ist direkt proportional zur -GT-Aktivitt. Es handelt sich hierbei um einen kinetischen Farbtest (Enzymtest):

    a. Messreaktion: L- -Glutamyl-3-carboxy-4-nitranilid + Glycylglycin -GT L--Glutamyl-Glycylglycin + 5-Amino-2-nitrobenzoat

    Abb. 23: Reaktionsablauf bei der

    Bestimmung der Gamma-GT.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 30

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    16. Cholinesterase CHE:

    Die Cholinesterasen (CHE) sind eine Gruppe von Enzymen, die bevorzugt Ester des Cholins oder des Thiocholins spalten. Es wird auch der Name Pseudo-Cholinesterase verwendet. 16.1. Vorkommen: Im Krper kommen verschiedene Cholinesterasen vor. Im klinischen Gebrauch versteht man darunter aber nur die im Blut vorkommende Cholinesterase (genauer die Acylcholin-Acylhydrolase, die auch als Pseudo-Cholinesterase, unspezifische Cholinesterase, Cholinesterase II, Benzoyl-Cholinesterase oder S-Typ-Cholinesterase bezeichnet wird). Die CHE werden in der Leber synthetisiert und ins Plasma exportiert CHE sind plasmaspezifische Enzyme. Die Serumaktivitt ist von der Funktion und der Anzahl der Leberparenchymzellen abhngig. Deshalb ist die CHE-Aktivitt eine Messgrsse der globalen Leberfunktion und somit ein Leitenzym fr die Leber. Es fhren jedoch nur schwere Leberschden, die mit einer erheblichen Reduzierung der Proteinsynthese der einzelnen Parenchymzelle einhergehen oder die auf einer starken Verminderung der Parenchymzellmasse beruhen, zu einem Absinken des CHE-Wertes unter den unteren Referenzbereichswert.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der Cholinesterase im Blut: Leber:

    bei z.B.: Leberzirrhose, chron. Hepatitis, Lebertumoren, -metastasen

    Insektizidvergiftung Muskelrelaxansunvertrglichkeit

    Die Cholinesterase wird also zur Erkennung von Leberschden oder Vergiftungen mit bestimmten Schdlingsbekmpfungsmitteln bestimmt. Muskelrelaxantien, die regelmssig bei operativen Eingriffen neben den Ansthetika eingesetzt werden, mssen durch die CHE wieder inaktiviert werden. Bei Menschen mit verminderter Cholinesteraseaktivitt wirken manche bei der Narkose eingesetze Medikamente viel strker. Um dies zu erkennen und die Dosierung der entsprechenden Medikamente anzupassen, wird die Cholinesterase auch vor Operationen gemessen. 16.2. Bestimmungsverfahren: Eine IFCC-Standardmethode ist nicht verfgbar. In gngigen Methoden hydrolisiert die Cholinesterase das Butyrylthiocholin unter Freisetzung von Buttersure und Thiocholin. Thiocholin reduziert in der Indikatorreaktion gelbes Kaliumhexacyanoferrat (III) zu farblosem Kaliumhexacyanoferrat (II). Nach Reaktionsstart mit Butyrylthiocholin wird die Absorptionsabnahme bei 405 nm gemessen.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 31

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    a. Messreaktion: CHE Butyrylthiocholin + H20 Buttersure + Thiocholin b. Indikatorreaktion: 2 Thiocholin + 2OH- + 2[Fe(CN)6]3- Dithiobis(cholin) + H2O + 2[Fe(CN)6]4-

    Bedeutung der CHE-Messung im properativen Screening:

    Succinyldicholin und hnliche Muskelrelaxantien werden bei grsseren Eingriffen gemeinsam mit den eigentlichen Narkotika eingesetzt. Succinyldicholin macht wie Insektizide die Erregungsbertragung durch Acetylcholin unmglich. Abgebaut wird Succinyldicholin im Blutplasma durch die CHE. Genetisch bedingt haben einige Patienten abnormale CHE-Enzyme, die das verabreichte Succinyldicholin wesentlich langsamer hydrolysieren. Die betroffenen Patienten wrden deshalb bei der blichen Narkosefhrung verlngert beatmungspflichtig sein, verbunden mit den entsprechenden Risiken. Im properativen Screening fallen diese Patienten durch eine niedrige Serum-CHE auf und der Ansthesist kann sich auf diese Besonderheit einstellen.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 32

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    17. Glutamat-Dehydrogenase GD/GLDH:

    Ihren Namen hat die Glutamatdehydrogenase von ihrer Wirkung im Stoffwechsel: Sie hilft Glutamat unter Abspaltung von Wasserstoff letztlich in Oxoglutarat umzuwandeln. 17.1. Vorkommen: Die GLDH ist ein Zellenzym, das nur in den Mitochondrien dafr aber in allen Geweben vorkommt. Die Aktivitt ist in der Leber 10-fach hher als in anderen Geweben, deshalb sind erhhte Aktivitten im Serum ausschliesslich leberbeding Leitenzym. Man bestimmt die GLDH praktisch nur gemeinsam mit anderen Leberenzymen, wie der ASAT und der ALAT und beurteilt die GLDH-Werte im Vergleich zu den ASAT- und ALAT-Werten. Whrend die ASAT und ALAT teilweise oder ganz aus der Zellflssigkeit der Leberzelle stammen, kommt die GLDH nur aus den Mitochondrien der Zelle. Das hat folgende wichtige Bedeutung: ASAT und ALAT werden schon bei leichteren Leberschden erhht sein, whrend die GLDH im Blut erst ansteigt, wenn die Leberzelle ganz zu Grunde gehen. Erhhungen der GLDH bedeuten also einen schweren Leberschaden. Besonders hohe Werte entstehen bei Vergiftungen. Man muss die GLDH im Vergleich mit anderen Leberenzymen (ASAT, ALAT) beurteilen.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der GD: Leber und Gallenwege:

    z.B. bei: Hepatitis, Lebertumor, Lebermetastasen, pltzlicher Blutunterversorgung mit Sauerstoffmangel der Leber (entsteht durch Versagen des rechten Herzteils, Verstopfung der Lebervenen oder Leberarterie) usw.

    bei Pilzvergiftung bei Galle-Stauung: Gallensteine, Tumor,

    Verengungen usw. 17.2. Bestimmungsverfahren: Die Glutamat-Dehydrogenase katalysiert die reduktive Aminierung von 2-Oxoglutarat zu L-Glutamat unter gleichzeitiger Oxidation von NADH. Gemessen wird die Absorptionsabnahme (NADH) bei 340 nm oder 334 nm. Gestartet wird die Messreaktion durch Zugabe von 2-Oxoglutarat. Streinflsse durch die Lactatdehydrogenase (NADH-Verbrauch) werden durch den Zusatz von Oxamat im Reagenz 1 vermindert. Es handelt sich um einen optisch-enzymatischen UV-Test, mittels kinetischer Messung:

    GD 2-Oxoglutarat + NH4+ + NADH L-Glutamat + NAD+ + H2O

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 33

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    Abb. 24: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der

    GD.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 34

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    18. Lactatdehydrogenase LDH/LD:

    Lactat-Dehydrogenase (LDH/LD) ist ein Enzym, das aus fnf Isoenzymen besteht. Das Enzym ermglicht eine chemische Reaktion, bei der aus dem Laktat (Milchsure) unter Abgabe eines Wasserstoffs (Hydrogenium) das Pyruvat wird. 18.1. Vorkommen: Die Lactatdehydrogenase ist ein zytosolisches (im Zytoplasma lokalisiert) Zellenzym und kommt in jeder Zelle vor besonders hohe Konzentratonen findet man in der Leber, dem Herzen, dem (Skelett)muskel, der Niere und den Ec. Wegen ihrer universellen Verteilung fhrt jede Zellmembranschdigung und jeder vermehrte Zelluntergang zu einer Aktivittserhhung der LD im Plasma. Es gengen schon geringe Lsionen, damit die relativ kleinen LD-Molekle in die Blutbahn gelangen. Da die LDH im Ec in ca. 160-fach hherer Konzentration vorliegt als im Plasma, darf hmolytisches Untersuchungsmaterial keinesfalls verwendet werden! Von diagnostischer Bedeutung der LDH ist vor allem der Nachweis einer Gewebsschdigung bzw. einer Hmolyse. Wegen der fehlenden Spezifitt von LDH ist fr eine Differentialdiagnose die Bestimmung der LDH-Isoenzyme oder anderer Enzyme wie ALP oder ALAT und ASAT notwendig.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der LDH (gesamt):

    Erhhte Isoenzyme: Hmolysen:

    bei Malaria bei Thalassmie, Kugelzell-,

    Sichelzellanmie bei Vitamin B12- und/oder

    Folsuremangel

    LD-1,2

    Lunge:

    bei Lungenkrankheiten , z.B.: Lungenembolie, Lungeninfarkt, Bronchialkarzinom

    LD-3

    Herz: Herzinfarkt LD-1, 2

    Muskel: bei Muskelerkrankungen, aber auch extremer krperlicher Anstrengung

    LD-5 Leber- und Gallenwege:

    bei Lebererkrankungen , z.B.: Virushepatitis, Leberkarzinom, Vergiftungen (z.B. Knollenbltterpilz), pltzliche Durchblutungsstrungen der Leber (z.B. wegen Herzversagen)

    LD-5

    Niere: bei Nierenerkrankungen LD-1, 2 Neoplasmen (Tumoren): Variabel LD-1 bis LD-5 Die LD-Molekle sind jeweils aus vier Untereinheiten aufgebaut, wobei es zwei Typen von Untereinheiten gibt. Der H-Typ (Herz) und der M-Typ (Muskel) leiten sich von zwei unterschiedlichen Genloci ab. Der H-Typ herrscht in Geweben mit hohem Sauerstoffverbrauch vor, der M-Typ in Geweben mit starker glykolytischer Aktivitt, d.h. hoher Lactatproduktion. Durch Kombination ergeben sich 5 Isoenzyme:

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 35

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    Typ:

    Zusammensetzung:

    Vorkommen: Prozent der Gesamtaktivitt:LD-1 HHHH Herz, Niere, Ec 20% LD-2 HHHM Herz, Niere, Ec 35% LD-3 HHMM Lunge, Pankreas, Milz 20% LD-4 HMMM Skelettmuskel, Leber 12,5% LD-5 MMMM Skelettmuskel, Leber 12,5% Zur Differenzierung des LD-Isoenzymmusters ist die elektrophoretische Trennung geeignet. Die Trennung und Quantifizierung der LD-Isoenzyme hat jedoch keine grosse diagnostische Bedeutung mehr.

    Abb. 25: Verteilung der LDH-Isoenzyme (LDH1-LDH5) in

    menschlichen Organen.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 36

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    -HBDH (-Hydroxybutyratdehydrogenase): Hydroxybutyratdehydrogenase umfasst begrifflich die beiden Isoenzyme 1 und 2 der

    Laktatdehydrogenase. HBDH bleibt nach einem Myokardinfarkt bis zu 20 Tage lang erhht und ist somit prinzipiell fr die Sptdiagnose eines Myokardinfarktes geeignet. Bei einer akuten hmolytischen Anmie kommt es bei nahezu 100% der Patienten zu einem HBDH-Anstieg. Man hat auch versucht aus dem Verhltnis Gesamt-LDH zu HBDH (also dem LDH/HBDH-Quotient)Rckschlsse auf die Ursache einer LDH Erhhung zu ziehen:

    Bei Lebererkrankungen findet man hhere LDH/HBDH-Quotienten als im normalen Blut. Das kommt daher, dass die Erhhung der LDH durch LDH-5 verursacht wird, die man mit der HBDH-Messung nicht erfasst.

    Bei Herzmuskelschden oder beim Zerfall roter Blutkrperchen findet man niedrigere LDH/HBDH-Quotienten als im normalen Blut. In diesem Fall ist die Erhhung der LDH durch LDH-1 und LDH-2 bedingt, die man mit der HBDH-Messung sehr wohl erfasst.

    Diese Untersuchung wird heute nur noch selten in den Labors durchgefhrt, weil es inzwischen verlsslichere Laborwerte fr die entsprechenden Erkrankungen gibt.

    18.2. Bestimmungsverfahren: Gemessen wird die Gesamt-LDH. Die Lactatdehydrogenase katalysiert die Oxidation von L-Lactat zu Pyruvat unter gleichzeitiger Reduktion von NAD+ zu NADH; die Absorptionszunahme von NADH wird bei 340 nm, 365 nm oder 334 nm gemessen. Die Reaktion wird mit NAD+ gestartet. Die Geschwindigkeit der Bildung von NADH ist direkt proportional zur LDH-Aktivitt und wird fotometrisch gemessen. Es handelt sich hierbei um einen optisch-enzymatischen UV-Test, mittels kinetischer Messung: a. Messreaktion: LDH L-Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+ Prinzipiell kann die LDH zwar auch unter Einsatz von Pyruvat und NADH als Substrate, d.h. in umgekehrter Reaktionsrichtung, gemessen werden, allerdings

    stren hierbei endogene -Ketosuren (2-Oxoglutarat) aus der Probe.

    Abb. 26: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der LDH.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 37

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    19. Lipase

    LIPA: Die Lipase spaltet von Triglyceriden mit langkettigen Fettsureestern bevorzugt eine der beiden endstndigen Fettsuren ab. Durch die Colipase ist die Lipase in der Dnndarmflssigkeit vor der Wirkung der Gallensure geschtzt. 19.1. Vorkommen: Die Lipase ist ein Verdauungsenzym, welches in der Bauchspeicheldrse gebildet, bei Bedarf in den Dnndarm abgegeben wird. Im Zusammenwirken mit den Gallensuren und einem Coenzym (die Colipase) vermag die Lipase die Fette der Nahrung in Glycerin und Fettsuren aufzuspalten. Normalerweise gelangen nur Spuren von Lipase ins Blut. Ausserhalb der Bauchspeicheldrse werden geringe Lipasemengen noch in den Speicheldrsen, der Magen und Darmschleimhaut produziert. Auch im Leber-, im Fettgewebe und in den Lc kann man Lipaseaktivitten nachweisen. Die Lipase ist ein Exkretionsenzym. Wie die Amylase wird auch die Lipase in den Nieren glomerulr filtriert. Die Lipase wird jedoch von den Tubuluszellen nahezu vollstndig rckresorbiert und zu Aminosuren abgebaut. Die Lipase erscheint daher so gut wie nicht im Harn lediglich bei starken Proteinverlusten (Nephrotisches Syndrom) kann es im Harn nachweisbar sein. Die Lipase besitzt ebenso wie die Pankreas-Amylase absolute Organspezifitt fr das Pankreas Leitenzym. Messtechnisch hat die P-Amylase Vorteile.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der Lipase im Blut: Pankreas: Bei Pankreaserkrankungen , z.B.: akute und

    chronische Pankreatitis, Pankreasgangverschluss Niere: Niereninsuffizienz

    19.2. Bestimmungsverfahren: Fr die Bestimmung der Lipase sind verschiedene Techniken mglich. In der Schule fhren wir von der Firma Axonlab einen kinetischen Farbtest (Enzymtest) durch: Ein synthetisch hergestelltes Lipasesubstrat (1,2-o-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsure-(6-methylresorufin)-ester) wird in einer Mikroemulsion spezifisch der Spaltung durch Lipase, unter Zusatz von Colipase und Gallensure, zugefhrt. Die Kombination von Colipase und Gallensure stellt die spezifische Erfassung von Pankreaslipase sicher, ohne dass lipolytische Enzyme oder Esterasen reagieren. Der entstehende Methylresorufinester zerfllt spontan zu Methylresorufin. Die Geschwindigkeit der Bildung von Methylresorufin ist direkt proportional zur Lipaseaktivitt und wird fotometrisch gemessen.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 38

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    a. Messreaktion: 1,2-o-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsure-(6-methylresorufin)-ester Lipase/Colipase 1,2-o-Dilauryl-rac-glycerin + Glutarsure-(6-methylresorufin)-ester b. Indikatorreaktion: Spontaner Zerfall Glutarsure-(6-methylresorufin)-ester Glutarsure + Methylresorufin

    Abb. 27: Reaktionsablauf bei

    der Lipasebestimmung.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 39

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    20. alpha-Amylasen

    -Amylasen: -Amylasen sind hydrolytische Enzyme, die glykosidische Bindungen spalten. Im Serum knnen bis zu 4, im Speichel bis zu 8 Isoamylasen auftreten. 20.1. Vorkommen: Die Amylase ist ein Verdauungsenzym. Sie spaltet lange Kohlenhydratketten wie pflanzliche Strke (Amylose und Amylopektin, Vorkommen z.B. im Mehl) und Glykogen (=tierische Strke, Vorkommen in Leber und Muskel) in die kleineren Disaccharide. -Amylasen werden vor allem in den Speicheldrsen (Speichel-Amylase, S-Amylase Leitenzym) und im Pankreas (Pankreas-Amylase, P-Amylase Leitenzym) gebildet. Von den Speicheldrsen wird die Amylase in die Mundhhle abgegeben, wo mit der Verdauung der Kohlenhydrate begonnen wird. Das Pankreas gibt die Amylase normalerweise fast vollstndig in den Darmtrakt ab, wo die Verdauung weiter geht. Nur geringe Spuren gehen ins Blut ber. -Amylasen sind somit Exkretionsenzyme. Geringere Mengen an -Amylasen findet man auch in Leber, Samenflssigkeit, Hoden, Eierstcken, Eileiter, Muskulatur, Fettgewebe sowie in Lungengewebe. Die Amylase ist ein kleines Molekl (MG 40'000 bis 50'000) und wird als einziges Serumenzym im Harn ausgeschieden. Sie wird fast vollstndig glomerulr filtriert und zu etwa 50% tubulr rckresorbiert. Die Bestimmung der -Amylase im Blut und Urin wird hauptschlich durchgefhrt, um Pankreaserkrankungen zu diagnostizieren und die Entwicklung von Komplikationen aufzuzeigen. Bei akuter Pankreatitis steigt die Amylaseaktivitt im Blut innerhalb weniger Stunden nach Beginn der Bauchschmerzen an, erreicht nach ca. 12 Stunden ein Maximum und fllt sptestens nach 5 Tagen wieder auf Werte innerhalb des Referenzbereichs. Die Spezifitt der -Amylase fr Pankreaserkrankungen ist nicht sehr hoch, da erhhte Werte auch bei verschiedenen nicht-pankreatischen Erkrankungen z.B. bei Parotitis und Niereninsuffizienz gemessen werden. Deshalb wird zur Besttigung einer akuten Pankreatitis die zustzlichen Bestimmungen von P-Amylase und Lipase empfohlen. Da die Amylase im Blut ber die Nieren eliminiert und im Urin ausgeschieden wird, spiegelt sich ein Anstieg der Amylaseaktivitt im Serum durch einen Anstieg der Amylaseaktivitt im Urin wider.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der -Amylase im Blut: Pankreas: bei Pankreaserkrankungen , z.B.: akute und

    chronische Pankreatitis, Pankreasgangverschluss Abdomen: bei Abdomenerkrankungen , z.B.: chronisch

    entzndliche Darmerkrankungen, Extrauterinschwangerschaft

    Niere: Niereninsuffizienz Speicheldrsen: Parotitis

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 40

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    20.2. Bestimmungsverfahren: Das Substrat 4,6-Ethyliden-(Glucose7)-p-nitrophenyl-(Glucose1)--D-maltoheptaosid (EPS-G7) wird von -Amylasen in verschiedene Bruchstcke zerlegt. Diese werden in einem zweiten Schritt von -Glucosidase (Hilfsenzym aus dem Reagenz) unter Bildung von Glucose und p-Nitrophenol hydrolisiert. Die Geschwindigkeit der Bildung von PNP ist direkt proportional zur Gesamtamylaseaktivitt und wird bei 405 nm fotometrisch gemessen. Es handelt sich hierbei um einen enzymatischen Farbtest (kinetische Messung):

    -Amylase 5 EPS-G7 + 5 H2O 2 Ethyliden-G5 + 2 G2-PNP 2 Ethyliden-G4 + 2 G3-PNP Ethyliden-G3 + G4-PNP -Glucosidase 2 G2-PNP + 2 G3-PNP + G4-PNP + 14 H2O 5 PNP + 14 G G Glucose; PNP p-Nitrophenol

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 41

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    21. Gesamt-Creatinkinase CK:

    Creatinkinase (CK) ist ein Enzym, das aus Isoenzymen besteht. Ihre physiologische Bedeutung liegt in der ATP-Regeneration aus Creatinphosphat: Die Creatinkinase koppelt Phosphate an Kreatin. Das Enzym ist fr die Energiegewinnung der Muskelzellen wichtig. 21.1. Vorkommen der Gesamt-CK und der Isoenzyme: Die Creatinkinase kommt in jeder Krperzelle als Zellenzym vor. Besonders grosse Mengen der CK finden sich in den Muskelzellen. Die zwei Untereinheiten M (muscle) und B (brain) bilden daher folgende CK-Isoenzyme:

    CK-MM (vorwiegend in der Skelettmuskulatur) CK-BB (ausschliesslich im Gehirn) CK-MB (vorwiegend im Myokard)

    Ausserdem gibt es noch eine mitochondriale CK (CK-MiMi). CK liegt im Serum immer als CK-MM, CK-MB und CK-BB vor. Verteilung der CK-Isoenzyme im menschlichen Gewebe:

    Gewebe: Isoenzymverteilung: CK-MM: CK-MB: CK-BB:

    Skelettmuskel: 96-100% 1-3% 0-1% Herz: 71-96% 4-27% 0-2% Niere: 70-100% 0% 6-30% Lunge: 27-72% 0-4% 18-69% Leber: 50% 0% 50% Pankreas: 21-29% 5-9% 66-73% Magen: 3% 2-6% 91-95% Grosshirn: 0% 0% 100% Beim Gesunden stammt die CK-Aktivitt im Blut fast ausschliesslich aus der Skelettmuskulatur. Diagnostische Bedeutung besitzt die Creatinkinase bei Erkrankungen der Skelett- und Herzmuskulatur. Frher wurde die CK als Leitenzym fr Muskelerkrankungen ernannt heute sagt die CK jedoch nicht mehr viel Spezifisches aus; es gibt bessere Marker: Bei einem Myokardinfarkt wird zustzlich noch das Troponin, Myoglobin und die CK-MB Masse bestimmt, welche viel spezifischer sind als die Gesamt-CK.

    Organ: Erkrankung und Verhalten der CK: Herzmuskulatur:

    Bei Herzmuskelerkrankungen , z.B.: Myokardinfarkt, Myokarditis

    Skelettmuskulatur:

    Bei Skelettmuskelerkrankungen , z.B.: Muskeldystrophie, multiples Trauma (Verletzungen), Intramuskulre Injektionen, krperliche Belastung

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 42

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    21.2. Bestimmungsverfahren: Die Gesamt-Creatinkinase katalysiert die bertragung der Phosphatgruppe von Creatinphosphat auf Adenosin-5-diphosphat (ADP) in Anwesenheit von Mg2+-Ionen und Imidazolpuffer. Dabei entstehen Creatin und Adenosin-5-triphosphat (ATP). In einer Hilfsreaktion wird mit dem in der Messreaktion gebildeten ATP Glucose phosphoryliert. Diese Reaktion katalysiert die Hexokinase. Das entstehende D-Glucose-6-Phosphat wird dann in der Indikatorreaktion mit NADP+ oxidiert. Dieser Schritt wird durch die Glucose-6-phosphatdehydrogenase katalysiert. Die Aktivittsbestimmung erfolgt durch Registrierung der Absorptionszunahme des gebildeten NADPH bei 340 nm, 365 nm oder 344 nm. Die Geschwindigkeit der Bildung von NADPH ist der CK-Aktivitt direkt proportional. Vor dem spezifischen Start der Messreaktion mit Creatinphosphat reagiert in der Vorinkubationszeit bereits das in der Probe vorhandene ATP (mit Hilfe von pipettierter Hexokinase, Glucose und Glucose-6-P-Dehydrogenase) in der Hilfs- und Indikatorreaktion unter NADPH-Bildung. EDTA ist im Reagenz enthalten: EDTA bindet das Kalzium und die Fe3+-Ionen zu Komplexen, damit eine Hemmung der CK durch Kalzium und Fe3+-Ionen vermieden wird (Kalzium und Fe3+-Ionen sind fr CK Inhibitoren). Es handelt sich hierbei um einen gekoppelten, optisch-enzymatischen UV-Test, mittels kinetischer Messung: a. Messreaktion: CK Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP b. Hilfsreaktion: Hexokinase ATP + D-Glucose D-Glucose-6-P + ADP c. Indikatorreaktion: Glucose-6-P- Dehydrogenase D-Gluc-6-P + NADP+ D-Gluconat-6-P + NADPH + H+

    Abb. 28: Reaktionsablauf bei der Bestimmung der

    Gesamt-CK.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 43

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    G. ZIELSETZUNG DER ENZYM-DIAGNOSTIK &

    ORGANSPEZIFISCHE ENZYMDIAGNOSTIK IM BERBLICK

    Die Enzymdiagnostik dient wie schon zu Beginn erwhnt der Lokalisation und Verlaufskontrolle von Erkrankungen. Zum nheren Verstndnis mssen wir uns mit den Mechanismen der Freisetzung, der biologischen Halbwertszeit und Einflussgrssen sowie der Organspezifitt von Enzymen befassen. Daraus lassen sich Strategien fr die Abklrung von organspezifischen Erkrankungen ableiten.

    22. Grundlagen der Enzymdiagnostik: 22.1. Zellulre Freisetzung von Enzymen: Alle im Blut und anderen Krperflssigkeiten messbaren Enzyme sind Proteine und daher zellulren Ursprungs, da die Proteinbiosynthese nur in den Zellen mglich ist. Daher knnen Enzyme ausser in Krperflssigkeiten im Speziallabor auch in Gewebeproben bestimmt werden. Nur durch Sekretion oder aufgrund einer Zellschdigung knnen Enzyme aus den Zellen, in denen ihre Biosynthese erfolgt, in das Blut gelangen. Im Plasma des Gesunden sind fr die meisten Enzyme nur niedrige Aktivitten messbar, die Folge kleinster physiologischer Membrandurchlssigkeiten aller lebenden Zellen sind. Daneben hat der natrliche Zellumsatz und der geringgradige bertritt von Enzymen aus Sekretionsflssigkeiten in das Blut Bedeutung fr diese niedrige Enzymaktivitt im Blutplasma. Bei vielen Erkrankungen findet man dagegen aufgrund von Zellschdigungen oder einer verstrkten Sekretion ein mehr oder weniger organspezifisches Enzymmuster im Blutplasma erhht. Einige wenige Enzyme werden andererseits gezielt in das Blut abgegeben und entfalten dort ihre biologische Wirkung sie werden deshalb auch als plasmaspezifische Enzyme bezeichnet. Hierher gehren z.B. die Cholinesterase (CHE) und die Gerinnungsfaktoren mit enzymatischer Aktivitt. Ihre Aktivitten bzw. Konzentrationen im Blutplasma sind dementsprechend beim Gesunden hoch, im Krankheitsfall dagegen vermindert.

    Abb. 29: Physiologische und pathologische Freisetzung von plasmaspezifischen Enzymen.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 44

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    22.2. Allgemeine Bedeutung von endogenen und exogenen Einflussgrssen: Wichtige Einflussgrssen sind diagnostische und therapeutische Massnahmen, Ernhrung, Alkoholgenuss, krperliche Belastung, Schwangerschaft sowie Krperlage und Stauungstechnik bei der Blutentnahme. Wesentliche Strfaktoren (exogene Einflussgrssen) sind Hmolyse, sowie das Vorkommen bestimmter Medikamente. 22.3. Leitenzyme und Isoenzyme: Einen besonderen Beitrag zur Organlokalisation einer Erkrankung knnen die sogenannten Leitenzyme leisten. Diese kommen in einem bestimmten Gewebe ausschliesslich oder im interessierenden Gewebe in besonders hoher Konzentration vor. Die Erhhung eines Leitenzyms im Plasma oder Serum weist daher auf das geschdigte Herkunftsgewebe hin. Die absolute Hhe der gemessenen katalytischen Enzymkonzentration korreliert in der Regel gut mit dem Ausmass der Gewebeschdigung.

    Zusammenstellung wichtiger Leitenzyme: Leber: GLDH, ALAT, -GT, CHE Pankreas: P-Amylase, Lipase

    Die Quantifizierung von Isoenzymen ist von diagnostischem Interesse, weil die Bestimmung eines spezifischen Isoenzyms hufig eine eindeutigere Organlokalisation erlaubt als die Bestimmung der Gesamtenzymaktivitt. So zeigt die Bestimmung der Pankreas-Amylase gegenber der -Amylasebestimmung nur Pankreasschdigungen an, d.h. die P-Amylase ist ein Leitenzym. Durch Messung der CK-MB-Masse knnen wir gegenber der Bestimmung der Gesamt-CK zuverlssiger auf Herzmuskelschden untersuchen. Von besonderer Bedeutung ist dabei die methodische Entwicklung besonders sensitiver und spezifischer immunologischer Verfahren, die die direkte Messung der Enzymkonzentration (Masse) im Bereich weniger Mikrogramm pro Liter erlauben. 22.4. Intrazellulre Enzymlokalisation: Die diagnostisch im Blut untersuchten Enzyme finden sich in den Ursprungszellen mit unterschiedlicher Verteilung in den einzelnen Zellkompartimenten. Dies kann fr die Abschtzung des Schweregrades der Zellschdigung genutzt werden, indem die Relation von Enzymen mit mitochondrialer Lokalisation zu solchen mit zytoplasmatischer Lokalisation in der Ursprungszelle untersucht wird. Bei leichteren Schden werden fast nur Enzyme des Zytoplasmas freigesetzt, am Beispiel der Leberzelle die ALAT. Bei Zellschdigung, die zur Nekrose fhren, gehen auch mitochondriale Enzyme, am Beispiel der Leber die GD, vermehrt ins Blut ber. Allgemein betrachtet werden Membranenzyme, besonders solche, die nur aussen mit der Membran assoziiert sind, am leichtesten freigesetzt, whrend Enzyme aus den Mitochondrien, dem Zytoskelett oder kontraktilen Apparat der Zelle und aus dem Zellkern, erst bei schwerster Zellschdigung freigesetzt werden.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 45

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    22.5. Bedeutung der Halbwertszeit: Enzyme, die aufgrund eines Gewebeschadens verstrkt ins Blutplasma gelangt sind, haben dort nur eine bestimmte Lebenszeit, die durch die Halbwertszeit charakterisiert werden kann. Die Halbwertszeit ist die Zeitspanne, in der die ursprnglich erhhte Enzymaktivitt auf eine Restaktivitt in halber Hhe gesunken ist. Ein Rckgang der feststellbaren Enzymaktivitt entsprechend der Halbwertszeit lsst sich erst beobachten, wenn es zu keiner weiteren ber das physiologische Mass hinausgehenden Sekretion oder Zellfreisetzung mehr kommt.

    Plasma-Halbwertszeiten von diagnostisch wichtigen Enzymen:

    ALP: 3 7 Tage ASAT: 12 22 h ALAT: 37 57 h GD: 16 18 h -GT: 3 4 Tage

    Abb. 30: Verteilung von Enzymen auf verschiedene Zellkompartimente (TnI,

    TnT = Troponine).

    Bei akuten Organerkrankungen kann das Krankheitsstadium aus der Relation von Enzymen mit kurzer zu solchen mit langer Halbwertszeit abgeleitet werden. So spricht z.B. bei einer akuten Hepatitis die Abnahme des Quotienten ASAT/ALAT, entsprechend dem raschen Verschwinden der ASAT, die die krzere Halbwertszeit aufweist, fr ein Abklingen der Erkrankung. Die Erkrankung muss in diesem Fall am Abklingen sein, da die Halbwertszeit sich auf die Verminderung der messbaren Enzymaktivitt erst dann auswirkt, wenn das untersuchte Enzym nicht mehr weiter in pathologischem Ausmass aus dem erkrankten Gewebe freigesetzt wird.

    Medi; Bildungsgang med. Labor G. Doubt 46

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    23. Organspezifische Enzymdiagnostik: 23.1. Erkrankungen der Zellen des Blutes: Enzymdefekte der Ec sind hufig und knnen Glykolyseenzyme, Enzyme des Pentosephosphatzyklus und des Glutathionstoffwechsels betreffen. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasemangel: Er wird X-chromosomal vererbt und ist mit weltweit 100 Millionen Defektgentrgern der hufigste definierte Gendefekt berhaupt. Im Laufe des Eryhtrozytenlebens nimmt bei den betroffenen Personen die Aktivitt des Enzyms durch Vernderung des pH-Optimums und der Temperaturstabilitt rasch ab. Retikulozyten dagegen enthalten bei den betroffenen Personen noch normale Enzymaktivitten. Eine durch die Enzymopathie bedingte akute Hmolyse wird hufig erst durch zustzliche exogene Stoffwechselbelastungen der Ec ausgelst. Zu diesen exogenen Auslsern gehren Infektionen, Azidosen, der Genuss von Saubohnen (Favismus) und die Einnahme bestimmter Medikamente (Sulfonamide). Zum Nachweis werden Ec isoliert, gewaschen und hmolysiert. Im Hmolysat wird die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivitt bestimmt. Bei einer hmolytischen Anmie aufgrund des Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenasemangels sind erniedrigte Aktivitten zu erwarten. Nicht selten lsst sich jedoch trotz des Enzymdefekts eine nahezu normale Erythrozytenaktivitt beobachten. Dies kann auf eine Retikulozytenvermehrung zurckgefhrt werden. Daher sollte zur Vermeidung von Fehlinterpretationen parallel zur Enzymbestimmung immer eine Retikulozytenzhlung erfolgen. Zustzlich muss darauf geachtet werden, dass die Untersuchung nicht unmittelbar nach der Gabe von Erythrozytenkonzentrat durchgefhrt wird