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Spezielle Methoden der Lichtmikroskopie

Prof. Dr. M. Sernetz,Dr. C. Giese, Dr. U. Hauptmann, D. Hild, Dr. M. Müller

Institut für Biochemie und EndokrinologieFachbereich Veterinärmedizin

Justus-Liebig-Universität Gießen

Gießen, 2. Auflage 2000

INHALTSVERZEICHNIS:

1 EINLEITUNG .............................................................................................................................. 1

2 AUFBAU UND ELEMENTE DES STRAHLENGANGS..................................................................... 42.1 KONJUGIERTE EBENEN.................................................................................................................. 42.2 ABBILDUNGSTHEORIE.................................................................................................................... 52.3 AUSRÜSTUNG DER ARBEITSPLÄTZE.................................................................................................. 62.4 AUFGABEN UND EXPERIMENTE ZUR IDENTIFIZIERUNG DER BILD- UND APERTUREBENEN .................................. 62.5 APERTUR UND ÖFFNUNGSVERHÄLTNIS .............................................................................................. 72.6 EXPERIMENTE UND DISKUSSION ZUR WIRKUNG VON APERTUREN............................................................. 8

3 EXPERIMENTE ZUR BEUGUNG EINES LASERSTRAHLS AN GITTERN........................................10

4 EXPERIMENTE ZUM VERGLEICH DES BEUGUNGSBILDES UND DES ZWISCHENBILDES ...........114.1 AUSRÜSTUNG UND EINSTELLUNG DER MIKROSKOPE ...........................................................................114.2 EXPERIMENTE............................................................................................................................124.3 DIE BEOBACHTUNG DER APERTUREBENEN.........................................................................................124.4 TYPEN DER VERGRÖßERUNG.........................................................................................................13

5 EINGRIFFE IN DIE APERTUREBENE ..........................................................................................155.1 HELLFELD-MIKROSKOPIE ..............................................................................................................155.2 DUNKELFELD-MIKROSKOPIE ..........................................................................................................165.3 RHEINBERG-BELEUCHTUNG ...........................................................................................................175.4 SCHLIERENMIKROSKOPIE...............................................................................................................185.5 ABSORPTIONSGITTER UND PHASENGITTER ........................................................................................195.6 PHASENKONTRAST.....................................................................................................................19

6 SELBSTLEUCHTER UND NICHTSELBSTLEUCHTER...................................................................23

7 FLUORESZENZMIKROSKOPIE, MIKROSKOPFLUOROMETRIE...................................................247.1 FLUOROMETRIE ..........................................................................................................................247.2 EXPERIMENTE............................................................................................................................277.3 BIOLOGISCHE ANWENDUNGEN DER FLUORESZENZMIKROSKOPIE.............................................................297.4 DURCHFLUß-IMPULS-CYTOMETRIE ..................................................................................................307.5 KONFOKALE LASER SCANNING MIKROSKOPIE ...................................................................................31

8 INTERFERENZMIKROSKOPIE, MIKROSKOPINTERFEROMETRIE................................................338.1 INTERFEROMETRIE, GANGUNTERSCHIEDE, PHASENOBJEKTE..................................................................338.2 BAUPRINZIPIEN VERSCHIEDENER INTERFERENZMIKROSKOPE ...................................................................348.3 INTERFERENZMIKROSKOPE ............................................................................................................378.4 EXPERIMENTE ZUR INTERFERENZMIKROSKOPIE....................................................................................38

9 POLARISATIONSMIKROSKOPIE...............................................................................................409.1 GRUNDEXPERIMENTE: OVERHEAD-PROJEKTOR MIT GEKREUZTEN POLFOLIEN.............................................409.2 DOPPELBRECHUNG......................................................................................................................409.3 GANGUNTERSCHIED, AUSLÖSCHUNG UND INTERFERENZFARBE..............................................................429.4 POL-MIKROSKOPIE DOPPELBRECHENDER OBJEKTE..............................................................................47

10 STEREOMIKROSKOPIE, STEREODARSTELLUNGEN................................................................4810.1 GRUNDLAGEN RÄUMLICHEN SEHENS..............................................................................................4810.2 STEREOMIKROSKOPE, STEREOLUPEN.............................................................................................4810.3 STEREODARSTELLUNG, STEREOPHOTOGRAPHIE...............................................................................4810.4 EXPERIMENTE...........................................................................................................................5210.5 BEISPIELE ZUR STEREODARSTELLUNG............................................................................................53

11 RELIEFUMKEHR UND RÄUMLICHE WAHRNEHMUNG...............................................................57

12 DIGITALE BILDERFASSUNG ...................................................................................................62

1. Einleitung

1

1 EINLEITUNG

Das Mikroskop und mikroskopische Untersuchungsmethoden gehören zum Handwerkzeug und zur Routine invielen Gebieten der medizinischen, biologischen, chemischen, mineralogischen und materialanalytischen Fächer.Die Ausbildung bleibt jedoch leider meist beschränkt auf eine grobe Kenntnis des geometrischen Strahlengangsund der technischen Bauteile, übliche Erwartung an das Instrument sind nur Vergrößerung, Schärfe und Kontrast.Damit werden die Möglichkeiten mikroskopischer Analyse aber nicht nur nicht ausgeschöpft, sondernInformation wird schlichtweg vergeben und ungewollt zusätzlich mit meist massiven Fehlern überladen.

Ziel des Kurses ist es,

1. spezielle Methoden der Lichtmikroskopie nicht nur zur qualitativen Darstellung mikroskopischer Objekte,sondern vielmehr als analytische Verfahren zur Charakterisierung von Eigenschaften des Objekts zu nutzen.

2. das Mikroskop als empfindliches Meßinstrument für quantitative Aufgaben nutzen zu lernen.

3. die unterschiedlichen Darstellungsarten mikroskopischer Verfahren aus einer gemeinsamen, wellenoptischenTheorie der Abbildung abzuleiten.

4. die charakteristische, unterschiedliche Qualität der Abbildung bei allen Verfahren als gewollte Unähnlichkeitzum Objekt verstehen zu lernen und experimentell durch bewußten Eingriff in die Beugungsbildebene zuerzeugen.

5. die Eigenschaften folgender lichtmikroskopischer Verfahren am Beispiel jeweils geeigneter Objektekennenzulernen: Hellfeld-, Dunkelfeld-, Phasenkontrastmikroskopie, Fluoreszenz-, Interferenz- und Polari-sationsmikroskopie, Streulicht- und Fluoreszenzimpulsanalyse und automatische Bildanalyse und Stereo-mikroskopie.

6. Verständnis für die Qualität mikroskopischer Instrumentation, für Handhabung und Beurteilung einesMikroskops zu entwickeln, um das jeweils geeignete Verfahren für die Analyse eines Objektes wählen zukönnen.

Allg. Literatur:

1. Michel: Die Grundzüge der Theorie des Mikroskops, WVG Stuttgart 1964, 3. neubearbeitete und erweiterteAuflage 1981

2. M. Françon: Einführung in die neueren Methoden der Lichtmikroskopie, G. Braun-Verlag, Karlsruhe 19673. H. Naumann, G. Schröder: Bauelemente der Optik, Carl Hanser Verlag, München, Wien 19924. Young: Optics and Lasers, including Fibers and integrated Optics, Springer 19845. G. Müller, M. Raith: Methoden der Dünnschliffmikroskopie, Clausthaler tektonische Hefte 14, E. Pitter Verlag

19816. Determann, F. Lepusch: Das Mikroskop und seine Anwendung, Firmenschrift Leitz-Wetzlar 512-69c7. Gerlach: Das Lichtmikroskop, G. Thieme, Sttgt. 19768. Piller, H.: Microscope Photometry, Springer 19779. Schade, K.H.: Lichtmikroskopie, Technologie und Anwendungen, Reihe: Die Bibliothek der Technik, Bd. 82,

Verlag Moderne Technik 199310. Schröder, G.: Technische Fotografie, Vogel-Verlag, Würzburg 198111. Mütze, K., Foitzik, L., Krug, W. Schreiber, G.: ABC der Optik, Edition Leipzig, Verlag Werner Dausien,

Hanau/Main 1961

(weitere spezielle Literatur bei den einzelnen Kapiteln)

1. Einleitung

2

Am Beispiel von Gelkugeln, wie man sie für die Gelchromatographie, Ligandbindung oder Enzym-immobilisierungverwendet, werden die unterschiedliche Information und Qualität der Abbildung eines Objekts mittelsverschiedener mikroskopischer Verfahren, dargestellt (Abb. 1.1 - 1.12).

Raster-Elektronenmikroskopie

Abb. 1.1: Darstellung der Struktur der Oberfläche des trockenen Gels

Interferenzmikroskopie

Abb. 1.2: Durchlicht-Interferenzkontrast-Darstellung einer homogenen, gequollenen Gelkugel

Abb. 1.3: Interferenzstreifen-Verfahren zur Bestimmung des Quellungsgrades des Gels

Abb. 1.4: Interferenzstreifen-Verfahren: Messung eines Diffusionsprozesses im Gel (Albumin in Sephadex)

Abb. 1.5: Interferenzstreifen-Verfahren: Nachweis eines radialen Dichtegradienten der Gelmatrix (Eupergit C)

Polarisationsmikroskopie

Abb. 1.6: Spannungsdoppelbrechung bei Vorliegen eines radialen Dichtegradienten der Gelmatrix; gekreuztePolare und Kompensatorplättchen Rot I

Abb. 1.7: Spannungsdoppelbrechung bei Vorliegen eines radialen Dichtegradienten der Gelmatrix (Alginat);gekreuzte Polare, Auslöschungskreuz und Isochromaten bei orthoskopischer (!) Betrachtung

Abb. 1.8: wie Abb. 1.7, gekreuzte Polare und Kompensator Rot I

Abb. 1.9: wie Abb. 1.8, Darstellung im zirkularpolarisierten Licht mittels λ/4-Hilfsplättchen

Fluoreszenzmikroskopie

Abb. 1.10: Primärfluoreszenz der Polymermatrix bei UV-Anregung (Eupergit C)

Abb. 1.11: Nachweis der Bindung einer RITC-markierten, immobilisierten Proteins (Eupergit C)

Abb. 1.12: Umsatzmessung eines fluorogenen Substrats (Fluorescein-di-acetat) durch immobilisierte Esterase(Sephadexgel) im Fließgleichgewicht

1. Einleitung

3

2. Aufbau und Elemente des Strahlengangs

4

2 AUFBAU UND ELEMENTE DES STRAHLENGANGS

Es ist sinnvoll, sich zunächst von den bekannten bautechnischen Begriffen (wie Stativ, Tisch, Kondensor,Binocular etc.) zu lösen und unabhängig von der Bauform das Mikroskop als eine Anordnung von Linsen-systemen entlang einer optischen Bank (Achse) zu verstehen, mit denen zwei Serien von untereinanderkonjugierten Ebenen A (Aperturebenen oder Pupillenebenen) und O (Objektebenen oder Bildebenen) alternierendmehrfach abgebildet werden.

Das Auge ist Bestandteil dieses optischen Systems.

2.1 Konjugierte Ebenen

O Objektebene

O' Zwischenbildebene

O , F Leuchtfeldebene

O'' sekundäre Bildebene

Bildebenen

Lichtquelle L, A

Apertur des Kondensors A

Apertur des Objektivs A'

Apertur- oder Bauelemente

Netzhaut des Auges

Okular

Objektiv

Kondensor

Stativ

PupillenebenenObjekt- oder

Tisch x, y, z

Iris des AugesEintrittspupille des Auges

Austrittspupille des Mikroskops

-

-

O Objektebene

O' Zwischenbild

O , F Leuchtfeld

Netzhaut

Bildebenen

Lichtquelle L, A

Apertur des Kondensors A

Apertur des Objektivs A'

Aperturebenen Linsen

Augenlinse

Frontlinse des Okulars

Feldlinse des Okulars (Tubuslinse)

Objektiv

Kondensor

Kollimator

Eintrittspupille des AugesAustrittspupille des Mikroskops

-

-

Abb. 2.1: Strahlengang in den Apertur- und Bildebenen

Die Darstellung der Abbildung in den Bildebenen (rechts) ergibt sich aus dem Strahlengang der Aperturen (links)allein durch "Halbierung" der Linsen.

Das Wesentliche für Qualität und Charakter der mikroskopischen Abbildung in O' spielt sich zwischen denAperturebenen A und A' ab; alles andere sind nur wiederholende Elemente. Der Strahlengang ist symmetrisch zur


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Objektebene und läßt sich beliebig falten und spiegeln. Die Eigenschaften aller zu besprechenden Verfahren sindaus dem Verständnis der Vorgänge zwischen A und A' ableitbar. Alle vorgesehenen Experimente dienen zurDarstellung der Modifikation der Bildqualität durch gezielten Eingriff in die Aperturebene A'.

O

A'

A

0 1-2 2-1 0 0-1 1 0-1 1

Abb. 2.2: Entstehung des primären Beugungsbildes der Lichtquelle durch Gitter in der Objektebene

2.2 Abbildungstheorie

1. Kondensor und Objektiv erzeugen in der Aperturebene A' (hintere Brennebene des Objektivs) ein Bild derLichtquelle L aus der Aperturebene A des Kondensors. Bei punktförmiger Lichtquelle L entsteht einpunktförmiges Bild (Maximum 0. Ordnung). (Die Lichtquelle L ist ihrerseits bereits aus A- nach A abgebildetworden, Köhlersche Beleuchtung, s.u.).

2. Jedes mikroskopische Objekt in der Objektebene O beeinflußt dieses Bild der Lichtquelle durch Beugung.Wesentliche Wirkung ist die Beugung des Lichts an der "Gitterstruktur" des Objekts.

3. In der hinteren Brennebene des Objektivs entsteht somit das durch Beugung am Objekt modifizierte Bild derLichtquelle mit dem Maximum 0. Ordnung und den Maxima höherer Ordnung. (Das Beugungsbild des Objektsist das primäre Interferenzbild.)

4. Die Beugungsmaxima höherer Ordnung enthalten wegen der Wechselwirkung mit dem Objekt alle Informationüber das Objekt, das Maximum 0. Ordnung enthält keine Information über das Objekt (ungebeugtes Licht).

5. Das Licht der Beugungsmaxima ist interferenzfähig, da es kohärent ist, d.h. von gleichen Punkten derLichtquelle stammt. Durch Interferenz des Lichtes der Beugungsmaxima aller Ordnungen entsteht in derZwischenbildebene O' das Bild des Objektes als sekundäres Interferenzbild.

6. Das Aussehen (die Ähnlichkeit) des Bildes in der Zwischenbildebene O' ist allein bestimmt durch den Anteilder zur Rekonstruktion zugelassenen Beugungsmaxima des primären Interferenzbildes in derBeugungsbildebene A' .

7. Theoretisch liefert die Beteiligung aller Beugungsmaxima über den vollen Raumwinkel 4π (360°) absoluteÄhnlichkeit zum Objekt. Effektiv ist der Bildinhalt (Ähnlichkeit, Qualität, Auflösung) bestimmt durch dieBeugungsmaxima im technisch erreichbaren Öffnungswinkel (Apertur) des Systems (< 2π, < 180°).

8. Die teilweise (gewollte oder ungewollte) Ausklammerung von Beugungsmaxima bestimmt den Grad derUnähnlichkeit des Bildes.

Thema des praktischen Teils ist die Erarbeitung der Eigenschaften der Abbildung durch gezielte Eingriffe in dasBeugungsbild und durch Manipulation und Selektion eben dieser Beugungsmaxima.


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2.3 Ausrüstung der Arbeitsplätze

A. Mikroskope

• Binokulartubus mit Okular (Kpl 8 x , 10 x oder 12,5 x) und Hilfsmikroskop (Phako)

• Objektivrevolver mit Diffraktionstrichter und Objektiv 6 x oder 10 x

• Leuchtfeldblende (Irisblende) im Stativfuß (vgl. Abb. , S. 11)

• Es wird zunächst kein Kondensor benutzt! Die ausgegebenen Kondensoren dienen vorab nur zur Demonstra-tion der Lage der Aperturebene.

• Lichtquelle im Stativfuß mit Regeltrafo

B. Zubehörkasten für Experimente

• Blendenschieber, Lochblenden, Spaltblenden, Irisblenden

• Rot-, Grün- und Blaufilter, Polarisationsfolien, doppelbrechende Folien

• halbierte Tischtennisbälle als Projektionskuppeln

• Objektträger mit Mattglasfläche, Transparentpapier

• Fluoreszenzglas

• Präparierbesteck Schere, Pinzetten

• Objektträger, Deckgläser, doppelt klebender Tesa-Film zur Herstellung von Deckglaskammern

C. Präparate und Ausrüstung für Beugungsexperimente:

• He-Cd-Laser, Rot λ 650 nm

• Diffraktionsplatte Zeiss

• Präzisions-Nylonsiebe (Nylonstrumpf)

• Erythrozytensuspension (ø ≈ 6 µm)

• Latexsuspension (ø ≈ 0,5 µm)

• Objektträger mit Deckglaskammern (Tesafilm-Stege)

2.4 Aufgaben und Experimente zur Identifizierung der Bild- und Aperturebenen

1. Kontrolle der Teile der Ausrüstung (nach jedem Praktikumstermin wieder ordnungsgemäß zusammenstellen)

2. Identifizierung der Lage der Bildebenen

3. Identifizierung der Lage der Aperturebenen

4. Demonstration des Lichtkegels in der Austrittspupille des Mikroskops mittels Mattscheibe oder Transpa-rentpapier. Lage der Austrittspupille bei normalen und Brillenträger-Okularen.

5. Das Auge ist Bestandteil des Mikroskops. Beim Mikroskopieren wird die Pupille des Auges (Eintrittspupillemit Iris als Aperturblende) auf der optischen Achse des Mikroskops soweit vorgeschoben, bis sie mit derAustrittspupille des Mikroskops zusammenfällt. (Beobachten des Lichtflecks der Austrittspupille auf der Irisdes Auges beim Annähern an das Okular).

6. Demonstration der Zwischenbildebene im Tubus nach Abnahme des Okulars mittels Mattscheibe oderTransparentpapier (Präparat Tesafilm). Lage der Zwischenbildebene und ihre Begrenzung im Okular(Meßokulare mit Skalen, Fadenkreuz etc.). Meßokulare besitzen eine auf die Skalen in der Zwischenbildebenefokussierbare Frontlinse.

7. Projektion eines Objektmikrometers auf die Skala eines Meßokulars zur Eichung der tatsächlichen Ver-größerung.

8. Demonstration des Lichtkegels in der Objektebene mittels Mattglas, durch Aufsetzen eines Fluoreszenzglasesauf den Kondensor oder mittels matter Projektionshalbkugel (halbierter Tischtennisball)

a) Wirkung der Leuchtfeldblende: Veränderung des Leuchtfeldes bei Erhalt des Winkels der Apertur.Die Leuchtfeldblende bestimmt das Feld, in dem das Objekt ausgeleuchtet wird.

b) Wirkung der Aperturblende: Veränderung des Aperturwinkels bei Erhalt des Leuchtfelddurchmessers. DieAperturblende bestimmt den Öffnungswinkel, unter dem Licht das Objekt passiert.


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2.5 Apertur und Öffnungsverhältnis0 1

r a αm

αl

nl

nm

A'

O

Abb. 2.3: Apertur

Die Sinus der Öffnungswinkel αL und αm verhalten sich wie die Brechungsindices nL und nm der Medien

sinsin

αα

L

m

L

m

nn

A= =

Die Apertur A ist der Sinus des halben Öffnungswinkels αL des Lichtkegels, der vom optischen System in einemMedium mit dem Brechungsindex nL = 1,0 (Luft) aufgenommen werden kann

sinαL A=

Die numerische Apertur (n.A.) ist der Sinus des halben Öffnungswinkels αm des Lichtkegels in einem Medium mitdem Brechungsindex nm

n A nm m L. . sin sin= = ⋅α α

Die numerische Apertur ist damit der um den Brechungsindex des Mediums nm gewichtete Sinus desÖffnungswinkels αL in Luft.

Im Objektiv entspricht die Apertur dem größten verfügbaren Radius der Öffnung in der Aperturebene A', mit demBeugungsmaxima des Objekts (primäres Interferenzbild) zur Rekonstruktion des sekundären Interferenzbildes inder Zwischenbildebene O' genutzt werden können.

2.5.1 Kennzahlen und Kennzeichnung von Objektiven und Kondensoren

M n.A.

T DKorr. , z.B. Plan 16 x 0,3

160 0,17

M: Maßstabszahl; T: Tubuslänge (mm); D: Deckglasdicke (mm); n.A.: numerische Apertur

1. Numerische Apertur n.A., wichtigste Kennzahl, bestimmt das Auflösungsvermögen und ist damit Voraus-setzung, bis zu welcher Maßstabszahl eine Vergrößerung sinnvoll ist.

2. Korrekturtyp, Korrektion von Farb- und Verzeichnungsfehlern des Linsensystems.

3. Maßstabszahl, Vergrößerung

4. Tubuslänge in mm (160 Zeiss, 170 Leitz, ICS ∞)

5. Bedingungen für DeckgläserD : mit Deckglas,0,17 : mit Deckglasdicke 0,17 mm : ohne Deckglas

Bei Kondensoren ist die Apertur neben der Frontlinse eingraviertschwarz-weiße Gravuren: normale Objektive u. Kondensorenrote Gravuren: spannungsfrei, geeignet für Polarisationsmikroskopie


8

In der Photographie und bei Teleskopen wird anstelle der Apertur das Öffnungsverhältnis f/2 definiert:

Öffnungsverhältnis fra

/ 2 =

Das reziproke Verhältnis ist die Blendenzahl Bar

=

also fB

ra L2

1= = = tanα

Daraus ergibt sich die Beziehung zur Apertur A:

Ara

n L= ⋅ ⋅ cos α

Der Kehrwert des Öffnungsverhältnisses heißt Blendenzahl. Die Blendenzahlen werden in geometrischer Reihemit 2 abgestuft (Faktor 2 der Beleuchtungsstärke), vgl. 2.6, 6

Aufgabe: Welcher Öffnungswinkel wird von einem Öl-Immersions-Objektiv (-Kondensor) der Apertur 1.4aufgenommen?

2.5.2 Von der Apertur abhängige Größen

1. Auflösungsvermögen d [µm] = λ [µm] ⋅ A-1; d ist der kleinste auflösbare Abstand zweier Objektpunkte.

2. Aufgenommener Lichtstrom Φ

Φ = I ⋅ π ⋅ A2

Die Beleuchtungsstärke ist proportional dem Quadrat der Apertur, wichtig besonders für die Photometrie,Fluorometrie (s.u.) und Mikrophotographie. Sie ist unabhängig vom Leuchtfeld. I: Intensität der Lichtquelle.

3. Schärfentiefe oder Abbildungstiefe T (Abb. ) ist der Entfernungsbereich amin - amax , in dem bei gegebenerBlendenzahl a/r die Abbildung eines Objektpunktes mit einem maximalen Durchmesser d des Zerstreu-ungskreises noch toleriert wird

Tar

d A= ⋅ ∝ −1

a: Einstellungsentfernung; r: Radius der Aperturblende (Öffnung); a/r: Blendenzahl; r/a: Öffnungsverhältnis;

d: tolerierter Durchmesser des Zerstreuungskreises (Abb. 2.4)

2.6 Experimente und Diskussion zur Wirkung von Aperturen

1. Demonstration der Apertur eines Objektivs an dem Blickwinkel zur Achse des Objektivs, unter dem die vonhinten beleuchtete Frontlinse hell erscheint (Apertometer).

2. Demonstration der Aperturöffnung von Objektiven mit variabler Aperturblende.

3. Demonstration der Aperturöffnung von Kondensoren mit variabler Aperturblende.

4. Demonstration extremer Schärfentiefe bei Blick durch eine sehr kleine Lochblende (kleine Apertur), die dichtvor die Augenpupille gehalten wird. Demgegenüber geringste Schärfentiefe bei den extrem hohen Aperturen(hohen Öffnungsverhältnissen) mikroskopischer Objektive (Abb. )

5. Bedeutung der Abstimmung der Aperturen von Kondensor und Objektiv (AK ≥ Aobj), Entsprechung vonKondensoren und Objektiven.

6. Bedeutung der DIN-Normzahlreihen für die Abstufung von Blendenzahlen, Öffnungsverhältnis, Objektiv-vergrößerungen, Okularen, Belichtungszeiten, Filmempfindlichkeiten.

7. Unterschiede und Bedeutung der Beleuchtungsarten

a) Köhlersche Beleuchtung: Abbildung der Lichtquelle in die Aperturebene, homogene Leuchtdichte-verteilung (Ausleuchtung) in der Leuchtfeldebene und damit in allen Bild- und Objektebenen.

b) Kritische Beleuchtung: Abbildung der Lichtquelle in die Objektebene, inhomogene Ausleuchtung, üblichbei Photometern und Fluorometern, bei denen die Lichtquelle in die Küvette abgebildet wird. (Kritik s. aberKap. 7.1 Fluorometrie)


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8. Schärfentiefe bei ausgedehnten Objekten als Funktion der Apertur (Abb. 2.4)

Abb. dient gleichzeitig zur Demonstration der Scheimpflug-Technik: Abbildung mit geneigter Objekt- undBildebene zur Entzerrung z.B. in der Photogrammetrie oder in der Ophthalmologie zur Darstellung vonAugenschnitten.

Scheimpflug-Bedingung: Objekt-, Objektiv- und Bildebene schneiden sich in einer Geraden.

Tiefe des Objektes Tiefe des Bildes

d

A

O B

OS

BS

Abb. 2.4: Schärfentiefebereich und ScheimpflugbedingungA: Apertur; d: Durchmesser des Zerstreuungskreises (s. 2.5.2)O,B: Objekt- und Bildebene im Normalfall;OS,BS: Objekt- und Bildebene bei Scheimpflugtechnik

3. Experimente zur Beugung eines Laserstrahls an Gittern

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3 EXPERIMENTE ZUR BEUGUNG EINES LASERSTRAHLS AN GITTERN

Helium-Cadmium-Laser (Liconix 4110V),

1. Projektion der Beugungsbilder von Testgittern der Diffraktionsplatte bzw. der Nylonnetze gegen die Deckeoder ein Blatt Papier

a) Demonstration der Maxima 0. und höherer Ordnung und ihrer Ausdehnung im Raum.

b) Richtung und Abstand der Beugungsmaxima als Funktion der Gitterkonstanten.

c) Das Beugungsbild ist invariant gegen Translation, nicht jedoch gegen Drehung des Gitters.

d) Demonstration des extremen Beugungswinkels (90°) bei Auflage des Testgitters auf die Laseröffnung.

2. Monodisperse Partikelsuspensionen (Latexpartikel, Erythrozyten, Sephadex-Siebungen) erzeugenBeugungsringe (Maxima 1. und höherer Ordnung), deren Radius dem Durchmesser der Partikel(Gitterkonstante) umgekehrt proportional ist (Halometrie)

3. Darstellung von Beugungsringen (Halos) beim Einstrahlen des Lasers in eine monodisperse Latexdispersion

4. Punktförmige Lichtquelle durch ein Nylonnetz betrachten (Straßenlaterne durch einen Regenschirm)

4. Experimente zum Vergleich des Beugungsbildes und des Zwischenbildes

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4 EXPERIMENTE ZUM VERGLEICH DES BEUGUNGSBILDES UND DESZWISCHENBILDES

Ausgangspunkt: Das Aussehen des Bildes (Informations-Inhalt) ist völlig bestimmt durch den Inhalt der zurRekonstruktion zugelassenen Teile des Beugungsbildes(Beugungsmaxima) in der Aperturebene (s. Kap. 2.2).

Die folgenden Experimente dienen zum Vergleich des primären Interferenzbildes (Beugungsbild) in derAperturebene und des sekundären Interferenzbildes (Objektbild) in der Zwischenbildebene

4.1 Ausrüstung und Einstellung der Mikroskope

Okular Hilfslupe Okular Hilfslupe

Tubus

TubusBino-

Diffraktions-trichter

Objektiv

AObj

AKond

Kondensor

exptl. AObj

Leuchtfeld-blende

LF LF = AKond

Lichtquelle

Kollimator

a) b)

Abb. 4.1: Anordung zur simultanen Beobachtung von Bild- und Aperturebenen mit der Möglichkeit zumexperimentellen Eingriff in die Aperturebene Aobj des Objektivs mittels "Diffraktionstrichter".a) Lage der Aperturebenen im normalen Strahlengang des Mikroskops mit Kondensorb) Verlagerung der Aperturebenen ohne Kondensor und bei insgesamt schwach

vergrößerndem Objektiv. Die Leuchtfeldblende wird mit ihrer variablen Irisblende zur stellvertretenden , punktförmigen Lichtquelle ("Apertur des Kondensors"). Dadurch verschiebt sich gleichzeitig die Aperturebene des Objektivs an dessen oberen Rand und wird im Diffraktionstrichter experimentell zugänglich.


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Zur gleichzeitigen Darstellung des Beugungsbildes und der Zwischenbildebene wird in den Binokulartubus je einOkular und ein Hilfsmikroskop eingesetzt. Mit dem Okular sieht man in die Bildebenen O, mit dem Hilfsmikroskop(fokussierbar) in die Aperturebenen.

Ein schwaches Objektiv (6,3 x) wird über einen "Diffraktionstrichter" an den Objektivrevolver geschraubt. DerKondensor wird weggelassen. Die Aperturebene des Objektivs liegt jetzt in der Höhe der Öffnung des Trichters.

Die Irisblende im Stativfuß (eigentlich Leuchtfeldblende) dient jetzt als "Aperturblende" zur Erzeugung einerpunktförmigen Lichtquelle. Deren Bild wird in der Aperturebene des Objektivs beobachtet, die jetzt an das obereEnde des Objektivs in den Diffraktionstrichter verschoben ist. Es können auch Loch- und Spaltblenden beigeöffneter Irisblende eingelegt werden. (Abb. 4.1)

4.2 Experimente

1. Ein Testgitter (orthogonal, hexagonal) oder Testnetz mit einem Okular scharf einstellen. PunktförmigeLichtquelle = kleinste Öffnung der Irisblende im Stativfuß. Im Hilfsmikroskop das Beugungsbild beobachtenund als Funktion der Gitterkonstanten beschreiben (Lage, Richtung, Intensität, Farbe, Abstand derBeugungsmaxima) und mit der Qualität des Bildes vergleichen. Verschieben und Drehen des Objektes.

2. In den Diffraktionstrichter wird mit dem Blendenschieber eine kleine Lochblende eingeführt, die außer demMaximum 0. Ordnung alle Maxima erster und höherer Ordnung abblendet. Ergebnis, Auflösung?

3. Spaltblende einlegen und drehen. Nur in Spaltrichtung werden Beugungsmaxima zugelassen: Richtungs-abhängige Apertur. Auch als Lichtquelle eine Spaltblende benutzen. Ergebnis bei verschiedener Lage derRichtung der im Trichter und im Stativ drehbaren Spalte relativ zur Lage des Gitters beschreiben? (parallel,senkrecht und diagonal (!) zum orthogonalen Gitter)

4. Einlegen einer Lochblende (Iris-blende), die nur das 0. und 1. Maximum zuläßt. Bildqualität (Auflösung) beiBeobachtung durch Rot-, Grün- und Blaufilter.

5. Einstellen einer Erythrozytensuspension (ø ≈ 6 µm) oder Sephadex-Siebung (ø ≈ 80 µm) in Deckglaskammer.Beobachten des Beugungsringes 1. Ordnung (Halo) innerhalb der Aperturöffnung. Die Partikeln werdenaufgelöst. (vgl. Experimente Kap. 3, 2. : Halometrie)

6. Einstellen einer Latexdispersion (ø < 0,5 µm). Der Beugungsring 1. Ordnung liegt außerhalb derAperturöffnung, die Partikeln werden nicht mehr aufgelöst.

Folgerungen

1. Das Maximum 0. Ordnung (weiß, sehr intensiv) enthält keine Information über das Objekt

2. Zur Auflösung der Struktur muß mindestens das Maximum 1. Ordnung zugelassen werden.

3. Richtungsabhängig unterschiedliche Aperturen verfälschen das Bild durch richtungsabhängig unterschied-liche Auflösung.

4. Je feiner die Gitterstruktur, desto größer der Abstand des Maximums 1. Ordnung.

5. Je kürzer die Wellenlänge, desto kleiner der Abstand des Maximums 1. Ordnung, d.h. bei konstanter Aperturwerden mit blauem Licht feinere Strukturen aufgelöst als mit rotem (UV-Mikroskopie bis 5000 x).

6. Vergrößerung ohne Auflösung ist sinnlos. Bei gleicher Vergrößerung ist die höhere Apertur ausschlaggebendfür die Qualität der Abbildung.

7. Die Zahl der Beugungsmaxima, die in der Objektivöffnung erscheinen und daher zur Erzeugung desZwischenbildes benutzt werden können, hängt ab

a) von der Apertur des Objektivs

b) von der Wellenlänge des Lichts

c) von der Gitterkonstanten des Objekts

4.3 Die Beobachtung der Aperturebenen

Die Beobachtung der Aperturebenen ist möglich mittels:

1. Blick in den offenen Tubus

2. Hilfsmikroskop anstelle Okular (s. Abb. 4.1)

3. Klein'sche Lupe als Okularaufsatz

4. Amici-Bertrand-Linse. Im Tubus von Mikroskopen einschwenkbar und fokussierbar eingebaut (z.B. Optovar-Zeiss, Pol- u. Phasenkontrastmikroskope)


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Die Aperturebenen werden beobachtet bei

1. Zentrieren der Lichtquelle zur homogenen Ausleuchtung des Leuchtfeldes

2. Zentrieren der Kondensorapertur und Objektivapertur. Die Achse des Objektivs ist normalerweise dieBezugsachse im Mikroskop, auf die die anderen Elemente zentriert werden. (Ausnahme Polarisations-Objektive, s. Kap. 9)

3. Zentrieren bei Phasenkontrastmikroskopie

4. Konoskopie bei der Polarisationsmikroskopie

5. Zentrieren der Lichtquelle bei der Fluoreszenzmikroskopie

6. Justieren der Photomultiplier bei der Photometrie (Lichtmessung erfolgt in Aperturebenen!)

7. Beugungsbildanalyse, Frequenzfilterung

4.4 Typen der Vergrößerung

4.4.1 Objektiv

A

a

f1

a 1

A 1

A: Objekt, Objektebene; A1: Bild, Bildebene;f1: vordere Brennebene des Objektivs; a: Objektabstand; a1: Bildabstand

Maßstabszahl:

MAA

aa

mit f A f= = > < <1

11 11 2

Linsengesetz:

1 1 11a a f+ =

4.4.2 Okular, Funktion einer Lupe

Das Auge ist Bestandteil des Mikroskops; wegen seiner Zoom-Eigenschaften ist es notwendig, eine Bezugs-sehweite zu definieren (250 mm). In Bezugssehweite sieht man das Objekt a) noch scharf und b) unter demgrößten, noch ohne Hilfsmittel möglichen Sehwinkel α2 (Auflösungsvermögen des Auges αmin ≈ 1' = 1/60°). DasOkular wirkt als Lupe, es erzeugt ein virtuelles Bild des Objekts im Abstand ∞. Das Auge zieht es auf 250 mmheran.


14

∞

A

f

α2

α1

A

Bezugssehweite 250 mm

f

Anordnung:

a) Gegenstand in f des Okulars (Zwischenbildebene)

b) Augenlinse in f des Okulars (Austrittspupille des Mikroskops)

VAf A f

mmmmOk = = ⋅ =

tantan

αα

2

1

250 250 .

Damit ergibt sich eine Beziehung zwischen der Okularvergrößerung Vok und der Okularbrennweite fOk .

z.B: VOk = 8 x , fOk = 31 mm

4.4.3 Gesamtvergrößerung

Vges = MObj · VOk

Bei gleicher Gesamtvergrößerung Vges hängt die Qualität der Abbildung auf der Netzhaut bzw. dem Filmausschließlich von der Qualität des Zwischenbildes, d.h. der Auflösung und damit der Apertur des Objektivs ab.Das Okular als Lupe liefert nur eine Nachvergrößerung dessen, was das Zwischenbild an Information enthält.Daher sind die Vergrößerungsfaktoren von Objektiv MObj und Okular VOk nicht beliebig austauschbar. Ein zu hochvergrößerndes Okular liefert nur noch eine Totvergrößerung (vgl. Kap. 10.2).

5. Eingriffe in die Aperturebene

15

5 EINGRIFFE IN DIE APERTUREBENE

Die "Qualität" des Zwischenbildes, das ist der Grad der Ähnlichkeit oder Unähnlichkeit mit dem Objekt, hängt abvon Eingriffen in das Beugungsbild in der Aperturebene. Die Zulassung der Beugungsmaxima oder die Art ihrerBeeinflussung modifizieren die Rekonstruktion des Bildes.

Bisher wurde bei gegebenen Gittereigenschaften des Objekts nur die Art des Beugungsbildes, des primärenInterferenzbildes, abgeleitet. Jetzt wird zusätzlich durch gezielte Eingriffe in das Beugungsbild die Rekonstruktiondes sekundären Interferenzbildes beeinflußt und damit die Qualität des Zwischenbildes modifiziert.

5.1 Hellfeld-Mikroskopie

Zulassung aller Beugungsmaxima einschließlich des Maximums 0. Ordnung

Die Beugungsmaxima 1. und höherer Ordnung enthalten alle Information über das Objekt. Ihre Interferenzrekonstruiert die Struktur des Objekts im Zwischenbild. Die Grenz-Auflösung des feinsten Objektdetails wird vondem Maximum 1. Ordnung erreicht, das gerade noch in die Apertur fällt.

Das Maximum 0. Ordnung enthält keine Information über das Objekt, es liefert nur die Helligkeit des Feldes. Da esgegenüber den Maxima höherer Ordnung sehr intensiv ist, "ertrinkt" die Struktur im Untergrund (Hellfeld).

Bei durchsichtigen ("glasklaren") Objekten wird Struktur nur an Grenzen mit Brechzahlunterschieden erkannt. Beibrechzahlgleicher Einbettung wird das Objekt (Kontur) unsichtbar.

Zur Darstellung von Strukturunterschieden zusätzlich durch Helligkeitskontrast wird daher Absorption durchEigenfärbung oder Färbeverfahren notwendig. (Die Namen vieler Zellen, Organellen und biologischer Strukturensind von Farben abgeleitet: Erythro-zyten, Eosino-phile, Azuro-phile Granula, baso-phile Leuko-cyten, Chloro-plasten.)

Die Helligkeit des Bildes (Untergrund) ist nur über die Lampe (Trafo) zu steuern, niemals über die Aperturblendeoder durch Senken des Kondensors - wie fälschlich häufig geübt -, da dann natürlich Auflösung verloren geht.

5.1.1 Experimente zur Hellfeldmikroskopie und zur Bedeutung von Aperturen und Brechzahlen

6. Frequenzfilterung, Weichzeichnen: Ein Nylonnetz unmittelbar vor das Auge halten (Aperturebene !), in derPhotographie unmittelbar vor das Objektiv. Es werden Beugungsmaxima bestimmter Grobstrukturenherausgefiltert. Weichzeichnen von gerasterten Bildern in der Zeitung oder auf dem Fernsehschirm durch dieAugenwimpern.

7. Sephadex-Kugel-Suspension in Wasser und Glycerin unter einer Deckglaskammer betrachten (Kontrast,Konturen, Auflösung?)

8. Quarzglasfäden in einer Deckglaskammer in Wasser (n = 1,33), Glycerin (n = 1,46) und Immersionsöl (n = 1,52)immergieren (Kontrast, Konturen, Auflösung?)

9. Zellsuspension in einer Deckglaskammer in isotonischem Puffer und in einem albuminhaltigen Medium oderSerum betrachten (Kontrast, Konturen, Auflösung?)

10. Beobachtung der Becke'schen Linie an den Präparaten (Quarzglasfäden, Tesafilm, Zellsuspension)

a b c d e f

abcdef

n1

n2

n1> n

2

Abb. 5.1: Entstehung der Becke'schen Linie


16

An der Grenze zweier Medien mit unterschiedlicher Brechzahl (n1 > n2, Abb. 5.1) ergibt sich eine Asymmetrieder Lichtbrechung, die sich an dieser Kante als helle Linie (Becke-Linie) zeigt. Ihre Lage verschiebt sich beimUnscharfstellen gegenüber der Brechzahlgrenze.

"3H-Regel": Bei Erhöhung des Abstandes Objekt - Objektiv wandert die helle Linie in das Medium mithöherem Brechungsindex.

Nutzanwendung:

a) Definition der Scharfeinstellung einer Kontur

b) Bestimmung des Vorzeichens der Brechzahldifferenz ±∆ n zwischen Objekt und Einbettungsmedium.

6. Beobachtung des "Kontrasts" an den Präparaten (Quarzglasfäden, Tesafilm, Zellsuspension) bei unter-schiedlicher Einbettung (Luft, Wasser, Glycerin, Öl). Die Glasfäden wirken wie Zylinderlinsen unter-schiedlicher Brechkraft bei unterschiedlicher Einbettung.

Grenzen, Konturen eines Objekts stellen sich nur dar aufgrund von Brechzahlunterschieden ∆ n.

∆ n groß: grober Kontrast, geringe Auflösung der Grenze

∆ n klein: feiner Kontrast, hohe Auflösung

∆ n = 0: die Grenze wird unsichtbar.

Nutzanwendung: Erhöhung der Auflösung und Feinzeichnung eines Objekts durch annähernd"brechzahlgleiche" Einbettung.

n

n 1,46Glas

Quarz

==

=

152

0

,

nccm

n

n 1,46

n 1,332

n 1,000

Oel

Glycerin

Wasser

Luft

==

==

152,

c0: Lichtgeschwindigkeit im Vakuum; cm: Lichtgeschwindigkeit im Material

Brechzahl nLsg einer Lösung

nLsg = nLM + α cS

nLM: Brechzahl des Lösungsmittels; cS: Konzentration des gelösten Stoffes (s = solutum); α: spezifischesBrechzahlinkrement (∆ n/∆ cS)

Herstellung von Stufenreihen von Lösungen oder kontinuierliche Brechzahlgradienten z.B. durch GemischeGlycerin - Wasser, Zuckerlösungen, Salzlösungen. Bei Zellen "brechzahlgleiche" Einbettung nur mitmakromolekularen Lösungen (Albumin, PEG) wegen Isotonie!

6. Refraktometrie mittels Abbe-Refraktometer (Wasser, Albuminlösung, Glycerin, Zuckerlösung)

7. Immersionsrefraktometrie

Makromolekulare Stoffe (Proteine, Stärke, Zellulose, PEG) haben molekulargewichtsunabhängige, etwa gleicheBrechzahlinkremente. (z.B. Albumin α = 0.017 /%). Durch Einbetten biologischer Präparate (Zellen,Gewebeschnitte) in geeignete Immersionslösungen steigender Brechungszahlen über die "brechzahlgleiche"Einbettung hinaus ergibt sich die Möglichkeit nicht nur zur Brechzahlbestimmung des Objektes, sondern auchzur Bestimmung der sog. "Trockenmassekonzentration" cS [%] bzw. des Wassergehalts (100 - cS) mit Hilfe desmittleren Brechzahlinkrements α aus

n = n + cLsg LM Sα ⇒ cn - n

S

Lsg LM=α

5.2 Dunkelfeld-Mikroskopie

Zulassung aller Beugungsmaxima außer dem Maximum 0. Ordnung

Ausrüstung: zentrale Punktblenden für Blendenschieber

6. Die Beugungsmaxima 1. und höherer Ordnung enthalten alle Information über das Objekt. Das Maximum 0.Ordnung enthält keine Information, sondern liefert nur Hintergrund-Helligkeit. Blendet man daher dasMaximum 0. Ordnung durch eine zentrale Punktblende aus, so zeigt das sekundäre Interferenzbild(Zwischenbild) die Struktur des Objekts aus den Maxima höherer Ordnung über dunklem Untergrund(zentrales Dunkelfeld).


17

7. Dezentriert man die punktförmige Lichtquelle, (z.B. Spaltblende exzentrisch abdecken) und blendet dasMaximum 0. Ordnung in der Aperturebene seinerseits durch die dezentrierte Punktblende ab, so erhält manaus den Beugungsmaxima nur einer Seite eine schiefe azimutale Dunkelfeldbeleuchtung (schiefes Dunkelfeld).

8. Erzeugt man durch Rotation der dezentrierten punktförmigen Lichtquelle (Abb. 5.6, b) um die optische Achseeine ringförmige Lichtquelle (Ringblende) so entsteht ein ringförmiges Maximum 0. Ordnung.

Gelangt dieses ringförmige Maximum 0. Ordnung noch ins Objektiv, wird aber von der Aperturblendeausgeblendet, so erhält man das normale Dunkelfeld.

Tritt das Maximum 0. Ordnung nicht mehr in das Objektiv ein. d.h. hat der beleuchtende Ring eine höhereApertur als das Objektiv, so tritt nur gebeugtes Licht in das Objektiv (Ultradunkelfeld)

Der Vorteil des ringförmigen gegenüber dem zentralen Dunkelfeld liegt a) in der höheren Intensität und b) in derhöheren Auflösung des Dunkelfeldes, da einseitig, aber rotationssymmetrisch doppelt so viele Beugungsmaximain die Apertur fallen.

Die hohen Aperturen werden durch spezielle Immersions-Dunkelfeld-Kondensoren (Abb. 5.2) erzeugt. Für denaus dem Lichtring mit dem Dunkelfeldkondensor erzeugten Lichtkegel werden innere und äußere Grenzapertur (A i,Aa) unterschieden. Der Lichtstrom Φ ist dem Quadrat ihrer Differenz proportional ( ø ∝ (∆A)2, vgl. 2.5.2).

Ai

Aa

Abb. 5.2: Ultradunkelfeld-Kondensor,innere und äußere Grenzaperturen A i , Aa (z.B. D 1,20-1,40)

Experiment:

Demonstration der Grenzaperturen bei Dunkelfeldkondensoren mittels Projektionshalbkugel (Tischtennisball)

Erzeugen einer ringförmigen Lichtquelle durch Einlegen einer Scheibe (Münze, Pfennig) auf die Glasplatte dergeöffneten Aperturblende des Kondensors. Dies ergibt zusammen mit einem schwach vergrößernden Objektiveine einfache Dunkelfeldanordnung.

5.3 Rheinberg-Beleuchtung

Blendet man gegenüber dem zentralen Dunkelfeld das Maximum 0. Ordnung nicht völlig durch eine Punktblendeaus, sondern benutzt eine transparente farbige Punktblende, so erhält man aus den Beugungsmaxima 1. undhöherer Ordnung das Bild des Objekts wie beim Dunkelfeld im Weißlicht, aber auf einem Untergrund in der Farbedes Filters (zentrale Rheinberg-Beleuchtung, s. 5.1.1, 6). Mit weiteren ringförmigen Farbfiltern für die Maximahöherer Ordnung ergeben sich eine Vielzahl von Farbkombinationen der Struktur gegenüber dem Untergrund.


18

Daraus folgt die allgemeine Aussage:

Das Maximum der 0. Ordnung bestimmt den Eindruck des Untergrundes. Die Farbe, die man bei etwa punkt-förmiger Lichtquelle im Zentrum der Aperturebene sieht, liefert die Farbe des Feldes (Untergrund) in der Bildebene(wichtig auch in der Polarisationsmikroskopie bei der Konoskopie und Orthoskopie, s. Kap. 9.4).

spezielle Literatur:

1. M. Abramowitz: Rheinberg illumination, International Laboratory 76-80 (Oct. 1983)2. M. Abramowitz: Amateur scientist column, Sci. Amer. 125-130 (Apr. 1968)

5.4 Schlierenmikroskopie

Eine Spielart der Dunkelfeldmethode ist die Toepler'sche Schlierenmethode.

Wählt man bei punktförmiger Lichtquelle die zentrale Punktblende gerade so groß oder nur etwas kleiner als dasMaximum 0. Ordnung, dann wirkt der Rand der Punktblende wie eine Schneidenkante zwischen direktem und angroßflächigen Brechzahl-Inhomogenitäten des Objekts, d.h. unter kleinem Winkel gebeugtem Licht. DieseInhomogenitäten werden dann als Schlieren unterschiedlichen Grauwertes in der Bildebene dargestellt.

Beachte: Beugungsmaxima grober, d.h. großflächiger Struktur liegen nahe der Achse (Schlierenmethode),Beugungsmaxima feinster Strukturen liegen fern der Achse (Dunkelfeld bei hoher Apertur).

Foucault'sche Schneidenmethode

In der Optik dient die Foucault'sche Schneidenmethode als ein sehr einfaches und exaktes Verfahren zur Prüfungvon Linsen oder Hohlspiegeln auf korrekten Schliff, Brechzahl-Homogenität und Fehler der Oberfläche (Abb. 5.3).

Punktförmige Lichtquelle in 2 f Entfernung, Auge "im Brennpunkt" sieht die homogen leuchtende Fläche derLinse (des Hohlspiegels). Eine auf der optischen Achse verschiebbare Schneide unmittelbar vor dem Augedunkelt Gebiete mit abweichendem Brennpunkt (Inhomogenität, Fehler) ab.

Schneide

2 f2 f

Abb. 5.3: Foucault'sche Schneidenmethode zur Prüfung von Linsen und Hohlspiegeln

Spiegel

Spiegelungen im Mikroskop erfolgen an Prismenflächen oder an Oberflächenspiegeln. Plan- und Hohlspiegel sindihrerseits Präzisionsflächen mit Silberverspiegelung und Oberflächenvergütung. Im Gegensatz zu Linsen besitzenSpiegel keine Farbdispersion: konstanter Brennpunkt für alle Wellenlängen (z.B. Spiegelteleskope). Das ersteVerfahren zur Herstellung von Silberspiegeln wurde im übrigen von Justus Liebig entwickelt und zurFabrikationsreife gebracht (Liebig'scher Silberspiegel, 1863).


19

5.5 Absorptionsgitter und Phasengitter

Bisher haben wir die Beugung ausschließlich an Objekten besprochen, die als Absorptionsgitter wirken,bestehend aus undurchlässigen, absorbierenden Stegen und durchlässigen Zwischenräumen (Abb. 5.4). DieAmplitude des Lichts wird dabei im Maße der Absorption durch die Stege (Schichtdicken d, Extinktions-koeffizienten ε) geschwächt und liefert damit Grauwerte (Kontrast).

Demgegenüber sind bei Phasengittern sowohl Stege als auch Zwischenräume völlig transparent, d.h. sie absor-bieren nicht. Das Beugungsbild entsteht sowohl aus den Gittereigenschaften der Stege als auch der Zwischen-räume. Beide Anteile erzeugen jedoch Unterschiede in der Lage der Wellenfronten. Durch unterschiedlicheLaufzeiten entstehen Phasendifferenzen δ zwischen "Stegen" und "Zwischenräumen", und zwar entweder beigleicher Schichtdicke d in Medien unterschiedlicher Brechzahl n1 und n2 oder bei wechselnder Schichtdicke d1

und d2 in einem Medium mit Brechungsindex n (Abb. 5.5). Das am Phasengitter gebeugte Licht entspricht inPhasenlage und Amplitude der Differenz zwischen den beiden Wellenzügen. Im Unterschied zu Absorptions-gittern ist bei dünnen Phasengittern das gebeugte Licht (Beugungsmaxima 1. und höherer Ordnung) gegenüberdem ungebeugten Licht (Maximum 0. Ordnung) um eine Phasendifferenz (90° ± δ) verschoben. Die sekundäreInterferenz aller Beugungsmaxima in der Zwischenbildebene mit der gegebenen Phasendifferenz liefert wieder dasdurchsichtige, d.h. kontrastarme Bild des Phasenobjekts im Hellfeld.

5.6 Phasenkontrast

Zulassung aller Beugungsmaxima mit Phasenverschiebung des Maximums 0. Ordnung

Bei Phasengittern mit Phasendifferenz ±δ weist das gebeugte Licht (Beugungsmaxima 1. und höherer Ordnung)gegenüber dem ungebeugten Licht eine Phasendifferenz von (90° ± δ) auf (Abb. 5.5, b.). Verschiebt man diePhasendifferenz des Maximums 0. Ordnung ihrerseits um weitere 90° (Abb. 5.5, c.), indem man (als bewußtenEingriff in die Aperturebene) eine entsprechende Phasenplatte in die Position des Maximums 0. Ordnung bringt,so subtrahieren sich die Amplituden von gebeugtem und jetzt phasengleich verschobenem ungebeugten Licht.Es resultiert daraus eine Lichtwelle mit einer Amplitude, die im Maß der vom Objekt vorgegebenenPhasendifferenz δ geschwächt ist und daher einen Grauwert als Kontrast gegenüber dem Umfeld liefert.

Durch die Verschiebung der Phase des Maximums 0. Ordnung wird das Beugungsbild eines Phasenobjekts in daseines Absorptionsobjekts überführt und die Rekonstruktion der sekundären Interferenzerscheinung in derZwischenbildebene liefert ein "Absorptionsbild" des Phasenobjekts. Phasenunterschiede δ im Objekt werden alsKontrast im Zwischenbild wiedergegeben (Phasenkontrast).

Da die Intensität des Lichtes 0. Ordnung sehr groß ist gegenüber der des gebeugten Lichts, wäre dieKontraständerung allein aus der phasenschiebenden Wirkung des Phasenplättchens zu gering gegenüber derHintergrundhelligkeit. Das Phasenplättchen wird daher zusätzlich so ausgelegt, daß es 80 % des ungebeugtenLichts absorbiert und damit den Kontrast gegenüber der Hintergrundhelligkeit durch die Anpassung derIntensitäten stärker ausgeprägt.

ε1 ε 2

Abb. 5.4: Absorptionsgitter


20

n1

n2

d1

d2

d = const

n = const

+ 90°

δδ

Abb. 5.5: Phasengitter; Entstehung des Phasenkontrasts

5.6.1 Experimente zum Phasenkontrast

a) Mikroskope ausgerüstet wie bisher: Diffraktionstrichter, schwaches Objektiv, kein Kondensor, Spalt- oderRingblenden in der Leuchtfeldebene (hier = Aperturebene), Phasenplättchen oder Phasenring im Blendenschieberdes Diffraktionstrichters.

1. Zentraler Phasenkontrast (Bratuschew) (Abb. 5.6, a)

Experiment: Punktförmige Lichtquelle, punktförmige, zentrale Phasenplatte im Blendenschieber, mit HilfsmikroskopLichtquelle und Phasenplatte zentrieren

Objekt Phasengitter (Diffraktionsplatte)

Sepharose-Suspension, Glasfäden mit entsprechend angepaßter geringer Brechzahldifferenz gegenüber demImmersionsmittel in Deckglaskammer.

2. Schiefer Phasenkontrast

Dezentrieren der punktförmigen Lichtquelle und der Phasenplatte, entsprechend dem schiefen Dunkelfeld (vgl.5.1.1, 7). Azimutaler Phasenkontrast kann als Fehler bei dezentriertem Strahlengang auftreten.

3. Zernicke Phasenkontrast (Abb. 5.6, b)

Erzeugt man durch Rotation der dezentrierten punktförmigen Lichtquelle eine ringförmige Lichtquelle (Ringblendewie 5.2.3.), so entsteht ein ringförmiges Maximum 0. Ordnung. Wird dieses Maximum durch eine entsprechendgroße ringförmige Phasenplatte in der Aperturebene des Objektivs abgedeckt, so erhält man den Phasenkontrastnach dem Zernicke-Verfahren (Zeiss) (5.6.2).

Experiment: Ringförmige Lichtquelle (Ringblende), Phasenring im Blendenschieber, Objekte wie oben


21

A'

O

A

-2. -1. 0.-1. 0. +1.

a) b)

Abb. 5.6: Lage des Maximums 0. Ordnung und der Beugungsmaxima 1. und höherer Ordnung in derAperturebene des Objektivs beia) zentraler, punktförmiger undb) ringförmiger Lichtquellesowie Lage der punktförmigen (a) bzw. ringförmigen (b) Blenden, Phasenplatten oder Farbfilter beiDunkelfeld-, Schlieren- und Phasenkontrastmikroskopie sowie bei Rheinberg-Beleuchtung.

b) Mikroskope mit Phasenkontrastobjektiven und -Kondensoren ausgerüstet

4. Zernicke Phasenkontrast

Ausrüstung der Zeiss- und Leitz-Mikroskope mit Kondensorrevolver mit Ringblenden

Phasenkontrastobjektive, demonstrieren der Phasenringe

Justieren der Ringblenden des Kondensors zum Phasenring des Objektivs mittels Hilfsmikroskop

Präparate: Zwiebelhäutchen in Wasser immergiert, Blütenhaare von Tradescantia, Beobachtung von Cytoplasma-Strömung, Tesafilm, Sepharose-Suspension.

5. Heine-Phasenkontrastkondensor (Leitz) am Leitz-Mikroskop

Beim Heine-Kondensor erzeugt ein in der Höhe verstellbarer Lichtring ein ringförmiges Maximum 0. Ordnung mitvariablem Durchmesser in der Aperturebene des Phasenkontrastobjektivs. Fällt das Maximum 0. Ordnung in denPhasenring, erhält man Phasenkontrast, ist es größer oder kleiner als der Phasenring, erhält man Hellfeld, ist esgrößer als die Apertur erhält man Dunkelfeld. Beim Übergang zum Dunkelfeld kann man auch den Effekt derSchlierenoptik erzeugen (vgl. 5.4).

6. Zernicke Phasenkontrast im umgekehrten Mikroskop

Diavert-Mikroskop (Leitz) zur Beobachtung von Zellen in Monolayerkultur. Bei der Beobachtung der Zellen istauf den Unterschied in der Güte der Phasendarstellung für die sehr dünnen , ausgespreizten Zellen der Monolayerzu achten und demgegenüber auf die Phasenhalos bei abgekugelten, dicken Zellen.


22

A

O

A'

ZB

Abb. 5.7: Strahlengang im umgekehrten MikroskopPhasenkontrastkondensor und -objektive mit großem Arbeitsabstand z.B. für Zellkulturflaschen(vgl. Kap. 7: zusätzliche Ausrüstung für Auflicht-Fluoreszenz)

Literatur:

P. Bracker, M. Grave, D. Terglane, R. Winter: LC-Grafik-Display in der Aperturebene des Mikroskops zurManipulation des Strahlengangs. Wettbewerb Jugend-Forscht 2000, Gymnasium Ochtrup, FB Physik

6. Selbstleuchter und Nichtselbstleuchter

23

6 SELBSTLEUCHTER UND NICHTSELBSTLEUCHTER

Auflösung zweier Punkte

Die Ausdehnung von Objekteinzelheiten ist nicht mehr groß gegenüber der Wellenlänge des Lichts, so daß beider Abbildung diese nicht mehr vernachlässigt werden kann. Die Abbildung ist nicht mehr geometrisch-optisch,sondern wellenoptisch als Interferenzerscheinung zu untersuchen.

Selbstleuchter

Die von verschiedenen Punkten 1 und 2 eines Selbstleuchters herkommenden Wellenzüge sind inkohärent,interferieren nicht. In der zugehörigen Bildebene bestehen beide Amplituden nebeneinander, ohne sich irgendwiezu verstärken oder zu schwächen. Daher sind in der Bildebene bei der Abbildung eines ausgedehnten,selbstleuchtenden Objekts einfach die Beleuchtungsstärken E aus den einzelnen Elementen der Beugungsfigur zusummieren. Die Beleuchtungsstärken E sind dem Quadrat der Amplituden R proportional

E R Rink = +12

22

Nichtselbstleuchter

Werden nichtselbstleuchtende Objekte durch eine punktförmige Lichtquelle aus hinreichend großer Entfernungbeleuchtet, dann werden sie von einer ebenen Wellenfront senkrecht getroffen. Von jedem Punkt des Objektsgehen dann nach dem Huygen'schen Prinzip elementare, untereinander kohärente, phasengleiche Kugelwellenaus. Die Rekonstruktion des Bildes aus den Beugungsbildern der einzelnen Objektpunkte setzt jetzt die Inter-ferenzfähigkeit der Wellenzüge voraus. Interferenz heißt Summieren der Amplituden R, erst danach ist dieresultierende Beleuchtungsstärke E aus dem Quadrat der Amplitudenfunktion zu bilden

( )E R Rkoh = +1 2

2

Auflösung und Apertur

In einem kritischen Bereich sind die Verteilungen der Beleuchtungsstärken für gleichen Objektabstand (Punkte 1und 2) bei Selbstleuchtern und Nichtselbstleuchtern sehr verschieden. Während bei Selbstleuchtern das Bildnoch zwei Maxima auflöst, ist es bei beleuchteten Objekten, also bei Nichtselbstleuchtern, nur noch ein breitesMaximum, und die Punkte sind nicht mehr aufgelöst. Als erkennbare Auflösung gilt eine Einsenkung derBeleuchtungsstärke auf 80 % zwischen zwei Maxima. Beim Selbstleuchter ergibt sich daraus ein Grenzauf-lösungsvermögen von

dAink

Obj

= 12

λ

Beim Nichtselbstleuchter wird bei diesem Abstand nichts mehr aufgelöst, vielmehr ist das Bild der Punkte zueinem breiten Maximum verschmolzen. Die Grenzauflösung liegt bei etwa

dAkoh

Obj

=λ

Daher ist die Auflösung bei Selbstleuchtern (z.B. Fluoreszenz) etwa zweimal höher als bei Nichtselbstleuchternunter den Bedingungen punktförmiger Lichtquelle, d.h. geringer Beleuchtungsapertur. Ist allerdings dieBeleuchtungsapertur (des Kondensors) so groß wie die Apertur des Objektivs, dann entspricht das Bild desNichtselbstleuchters hinsichtlich der Auflösung dem eines Selbstleuchters

E Ekoh ink=

Konsequenz:

Die mit einem Objektiv zu erreichende Auflösung wird beim Nichtselbstleuchter nur bei optimaler Nutzung derApertur des Kondensors ausgeschöpft (Cave! Häufig wird der Fehler gemacht, zur Erhöhung von Kontrast denKondensor abzusenken oder zur Regulierung der Helligkeit die Aperturblende zuzuziehen).

Bei schräger Beleuchtung, d.h. unter hohem Aperturwinkel des Kondensors können doppelt sovieleBeugungsmaxima einer Seite von der Apertur des Objektivs aufgenommen werden als bei gerader Beleuchtung.Daher erreicht man mit hoher Apertur bei Hellfeldbeleuchtung dieselbe Grenzauflösung wie bei Dunkelfeld-beleuchtung, nämlich

dAObj

= 12

λ

7. Fluoreszenzmikroskopie, Mikroskopfluorometrie

24

7 FLUORESZENZMIKROSKOPIE, MIKROSKOPFLUOROMETRIE


1. Th. Förster: Fluoreszenz organischer Verbindungen, Vandenhoek & Ruprecht, Göttingen 19512. M. Zander: Fluorimetrie, Springer, Berlin 19813. J.S. Ploem, H.J. Taube: Introduction to Fluorescence Microscopy, Oxford University Press 19874. G. Guilbault: Fluorescence, Marcel Dekker, New York 19675. H. Piller: Microscope Photometry, Springer, Berlin 19776. G. Wick, S. Baudner, F. Herzog: Immunfluoreszenz, Med. Verlagsgesellschaft, Marburg 19767. W. Storch: Immunfluoreszenzfibel, VEB G. Fischer, Jena 19798. A. Thaer, M. Sernetz (eds.): Fluorescence Techniques in Cell Biology, Springer, N.Y. 1973

Firmenbroschüren, z.B.:

1. K.F. Koch: Fluoreszenzmikroskopie, E. Leitz, Wetzlar 1972

ergänzende Literatur:

1. Farb- und Filterglas für Wissenschaft und Technik, Jenaer Glaswerk Schott & Gen., Mainz 19622. H. Zollinger: Color Chemistry, VCH Weinheim 1987

7.1 Fluorometrie

Bestimmte Moleküle können durch Absorption von Lichtenergie in einen angeregten Zustand übergehen, ausdem sie wieder in den Grundzustand zurückfallen unter Abgabe (Emission) längerwelliger, d.h. energieärmererLichtstrahlung. Dieses Phänomen bezeichnet man als Fluoreszenz. Das Fluoreszenzverhalten wird durchAnregungs- (Exzitations-) und Emissionsspektren der Substanz charakterisiert (Abb. , a).

Die Fluoreszenzintensität IF ist bei gegebener Anregungsenergie I0 eine Funktion der absorbierten Energie IA undder Quantenausbeute Φ

I IF A= ⋅ Φ

Die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Konzentration läßt sich aus dem Lambert-Beer'schen Gesetz ableiten

( )

I I I

I I e

I I e

A T

Tcd

Acd

= −

= ⋅

= ⋅ −

−

−

0

0

0 1

ε

ε

Daraus ergibt sich für die Messung der Fluoreszenzintensität IF bis zum Sättigungsbereich das Perrin'sche Gesetz(Abb. , b):

( )I I eFcd= ⋅ ⋅ − −

0 1Φ ε

Zusätzlich muß für praktische Anwendungen ein Faktor k eingeführt werden, der die Güte, d.h. den Wirkungsgraddes optischen Strahlengangs durch Justierung, Zentrieren, Aperturen, Filterung berücksichtigt.

( )I I k eFcd= ⋅ ⋅ ⋅ − −

0 1Φ ε

Bei hohen Konzentrationen geht die Fluoreszenz in Sättigung, bei niedrigen Werten des Exponenten ergibt sichdie Vereinfachung

± ⋅ ⋅ << → ≈ ± ⋅ ⋅−ε εεc d e c dcd1 1

d.h. bei niedrigen Konzentrationen oder Schichtdicken (Mikroskopie!) ist die Fluoreszenzintensität derKonzentration proportional

I I k c dF = ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅0 Φ ε

Die Intensität der Fluoreszenz IF ist über die Intensität der Lichtquelle I0 und über die Optimierung der Justierungdes Strahlengangs steuerbar. Fluorometrie verlangt daher aber auch immer Eichung mittels Fluoreszenzstandards(Uranylgläser, Uranyl- oder Europiumglasfäden oder Lösungen von z.B. Chinin-Sulfat, Fluorescein u.a.).

Gegenüber der Absorptionsphotometrie ist Fluorometrie wesentlich empfindlicher. Das Meßsignal nimmt mit derKonzentration (Masse), der Apertur und der Anregungsenergie der Lichtquelle über dem Untergrund Null(Dunkel) zu, während in der Absorptionsphotometrie mit zunehmender Konzentration die relative Schwächungdes Signals I/I0 gemessen wird.


25

IF

ε ·c·d << 1

cλ

excitation emissionI

Abb. 7.1: a) Fluoreszenzspektren,b) Fluoreszenzintensität als Funktion der Konzentration c und der Schichtdicke d

7.1.1 Entsprechungen zwischen Makrofluorometern und Fluoreszenzmikroskopen

In Abhängigkeit vom Winkel zwischen der Richtung der Anregung und dem Meßstrahlengang gibt es dreitypische Meßanordnungen in der Makrofluorometrie mit dazu entsprechenden Verfahren in der Mikroskop-Fluorometrie.

Küvette

1.

3.

2.

SF

SFSF

AF

SF SF

AF

AF

1. 2.1. 2.2. 3.

DT

Abb. 7.2: Vergleich der Strahlengänge von Makro- und Mikrofluorometern


26

1. Messung in der Vorwärtsrichtung. Spektrale Trennung von Anregungsstrahlung (AF) und Emissions-strahlung ausschließlich durch Sperrfilter (SF). Dies entspricht in der Mikroskopie der Hellfeld-Durchlicht-anregung (ältestes Verfahren) (Abb. 7.2, 1.).

2. Messung unter 90° zur Anregungsrichtung mit spektraler Trennung von Anregungs- und Emissions-strahlung, in der Mikroskopie entsprechend

a) Dunkelfeld-Durchlicht-Anregung mit hochaperturigem Ultra-Dunkelfeldkondensor (Abb. 7.2, 2.1.)

b) Dunkelfeld-Auflicht-Anregung mit ringförmigem Auflichtkondensor (Abb. 7.2, 2.2.)

Die effektive Anregungsapertur beschränkt sich jedoch auf die Differenz zwischen äußerer und innererGrenzapertur (s. Kap. 5.2) des Dunkelfeldkondensors. Das Verfahren erfordert denselben Aufwand anJustierung wie die Dunkelfeld-Mikroskopie.

3. Messung in der Rückwärtsrichtung, d.h. von der Frontfläche der Küvette (= beste Voraussetzung für dieErfüllung der Meßbedingungen nach dem Perrin'schen Gesetz). Die spektrale Trennung erfolgt in der Auflicht-Mikroskopie durch dichromatische Teiler DT. Das Objektiv ist gleichzeitig Kondensor, d.h. Nutzung der vollenApertur, kein Problem der Justierung. Kombinierbar mit Durchlicht-Mikroskopie, insbesonderePhasenkontrast, besonders beim umgekehrten Mikroskop (Abb. 5.7 sowie Exp. 7.2, 3)

7.1.2 Unterschiede zwischen Makrofluorometern und Fluoreszenzmikroskopen

1. Bei Makrofluorometern wird üblicherweise die Lichtquelle, bzw. die entsprechende Spaltposition derMonochromatoren im Anregungsstrahlengang und die Frontfläche des Photomultipliers im Emissions-strahlengang in die Küvette abgebildet: sogenannte kritische Beleuchtung bei sehr geringen Aperturen, führtzu inhomogener Ausleuchtung , daher ist eine exakte Zentrierung beider Strahlengänge notwendig.

Beim Fluoreszenzmikroskop bzw. Mikroskopfluorometer liegt dagegen Köhler'sche Beleuchtung vor, d.h.Abbildung der Lichtquelle in die Aperturebenen, nicht in die Objektebene.

Vorteil: Homogene Leuchtdichteverteilung der Anregungsstrahlung in der Objektebene (Objekt = Küvette). Dasgleiche gilt für den Meßstrahlengang, auch die Frontfläche des Photomultipliers befindet sich in einerAperturebene. Dadurch wird die Fluoreszenzmessung unabhängig von der Position des Objekts imGesichtsfeld der Objektebene.

2. Beim Makrofluorometer sind die Querschnitte der Strahlengänge kleiner als die der Küvette. Wegen derkritischen Beleuchtung und damit inhomogenen Ausleuchtung erhält man in erster Hinsicht ein konzen-trationsproportionales Meßsignal (IF ∝ c).

Beim Mikroskopfluorometer ist der Querschnitt des Strahlengangs (Leuchtfeldblende, Meßfeldblende) größer alsder des Objekts (Küvette). Man erhält durch integrale Messung über dem ganzen Objekt daher primär ein derMasse m proportionales Meßsignal IF ∝ m/V, aus dem bei bekanntem Volumen V des Objektes dann auch aufdie Konzentration c geschlossen werden kann.

3. Wegen der im Vergleich zu Makrofluorometer-Küvetten (d = 1 cm) geringen Schichtdicke mikroskopischerObjekte (d ≈ 1 µm) reicht der proportionale Bereich der Fluorometrie in Mikroskopen zu höheren Konzen-trationen. Die Fluoreszenzmessung erfolgt bei den höchstmöglichen Aperturen (IF ≈ A2). Die Nachweis grenzeliegt bei beiden Verfahren bei etwa 10-18 Mol eines Fluorochroms guter Quantenausbeute (z.B. Fluorescein).


27

7.2 Experimente

1. Demonstration der Eigenschaften von dichromatischen Teilerspiegeln, Komplementärfarben in Reflexion undDurchlicht, Anregungs- und Sperrfilter und ihre Kombination.

λ

D Anregungsfilter AF (band pass), z.B. UG-, BG-Filtergläser

λ

D dichromatische Spiegel DT, Kantenfilter,Lage des Halbwertes im Bereich 410-580 nm

λ

D Sperrfilter SF (Hochpass) z.B. GG-, RG-Filtergläser,Neutrale Teilerspiegel, Rotunterdrückungsgläser (Tiefpass)

λ

I Excitations- und Emissionsspektren

Abb. 7.3: Spektrale Filterung und Trennung bei der Fluoreszenzmikroskopie

1. Demonstration der Elemente des Auflicht-Strahlengangs für die Anregung (z.B. Auflichtkondensor RS-Zeissmit Schieber für unterschiedliche Filterkombinationen AF, DT, SF. Demonstration der Apertur- undLeuchtfeldblenden im Auflichtstrahlengang)

2. Demonstration der Elemente des Meßstrahlengangs, Sperrfilter, Apertur- und Bildebenen, Position desPhotomultipliers oder eines Belichtungsmessers in einer Aperturebene (Austrittspupille des Mikroskops),Position der Filmebene einer Kamera in einer Bildebene, Bedeutung der Größe der Meßblende im Verhältnis zurLeuchtfeldblende.

3. Justierung der Lichtquelle (x,y,z) im Lampenhaus (Wendel oder Lichtbogen von Hg- oder Xe-Lampe) und ihresSpiegelbildes (x',y',z') über einen Hohlspiegel für eine möglichst gleichmäßige Ausleuchtung der Aperturebene(Cave: Filter!) und damit für eine homogene Anregung (Leuchtdichteverteilung) in der Objektebene (Abb. 7.4).


28

yx z

y'

x'

z'

b)a)

Abb. 7.4: a) Justierung der Lichtquelle im Lampenhausb) Bild und Spiegelbild der Lampenwendel in der Aperturebene

1. Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop (Zeiss-Universal)

Ausrüstung mit 3RS-Auflichtkondensor, HB= 100 W oder XB0 150 W

Objektive 25/0,65, 100/1,32 Öl

Das Objektiv ist auch Kondensor, Anregungs- und Meßstrahlengang haben gleiche Apertur und konstanteZentrierung mit gemeinsamer Fokussierung der Anregungs- und Emissionsebene (Objektebene). SpektraleSelektion erfolgt über dichromatische Teilerspiegel zusammen mit Anregungs- und Sperrfiltern. HöchsteAusbeute durch Nutzung der vollen Apertur. Beliebige Kombination mit Durchlichtverfahren (z.B. Hellfeld,Phasenkontrast s.u., Interferenz) möglich.

Filterkombination für Grün-Fluoreszenz: BG 12, BG 38, TS 70, GG 580

Filterkombination für Rot-Fluoreszenz: IF 546, T 580, RG 600

Präparate:

a) Uranylglasfaser als Eichstandard (Blau-Anregung, Grün-Fluoreszenz), eingebettet in Immersionsöl,Deckglaskammer

b) Europiumglasfaser (Grün-Anregung, Rot-Fluoreszenz)

c) Sepharose 4B Kugeln, fluoreszenzmarkiert, keilförmige Deckglaskammern

d) Mikropartikeln, fluoreszenzmarkiert, Durchmesser ≈ 1 µm, Partikeln als Suspension in Deckglaskammer

e) Glaskapillaren, eingebettet in Immersionsöl, Deckglaskammer, gefüllt mit Fluorescein-Lösung definierterKonzentration.

Fasern unter Deckglas in Immersionsöl einbetten. Zunächst im Durchlicht einstellen. Prüfen des Einflussesvon Apertur-, Leuchtfeld- und Meßblenden auf das Meßsignal.

2. Mikroskop-Fluorometer, Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop mit Photometeraufsatz, variable Leuchtfeld- undMeßblende, Präparate wie oben.

3. Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie am umgekehrten Mikroskop (Leitz-Diavert) in Kombination mit Durchlicht-Phasenkontrast (vgl. Kap. 5.6, Abb. 5.7)

Beobachtung der Fluoreszenz von Zellen in Monolayer-Kultur.

Präparate:

a) Monolayer-Kultur, Hela-Tumorzellen oder L-Zellen (Fibroblasten). Da das Nährmedium allgemeinPhenolphthalein als pH-Indikator enthält, fluoreszieren die Zellen bei Blauanregung rot.

b) Monolayer-Kultur, mit phenolphthalein-freiem Medium gewaschen. DNA- und Protein-Fluoreszenz-färbungen z.B. mit Acridin-Orange, Ethidiumbromid, Fluorescamin, Fluoresceinisothiocyanat (FITC),Rhodaminisothiocyanat (RITC), ANS- und Dansyl-Fluoreszenz.


29

c) Monolayer-Kultur, gewaschen, Zusatz des fluorogenen Substrats Fluoresceindiacetat (FDA), 50 µl10-4 mol/l Stammlösung in Aceton. Intrazelluläre enzymatische Hydrolyse (unspezifische Esterasen E) desfarblosen Substrats FDA zu dem fluoreszierenden Produkt Fluorescein F. Fluorogene Substrate erlaubendie Umsatzbestimmung von zellulären enzymatischen Reaktionen und von Membran-permeabilitäten.

FDA FDA F F a iE

i a → → →

farblos Grün-Fluoreszenz

7.3 Biologische Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie

1. Selektive Anfärbung von Zellen zur Diagnose und automatischen Differenzierung, DNA-Färbungen, Protein-Färbungen

2. Massenbestimmung in Zellen, z.B. Kern-DNA, Zellprotein, Kern-Plasma-Relation, saure Mucopolysaccharide,Catecholamine, Ploidiegrad (Biologischer Standard: Spermien DNA)

3. Immunfluoreszenz: Fluoreszenzmarkierung von Antikörpern, z.B. mit RITC und FITC zur Bestimmung derAntigeneigenschaften von Zellen, selektive Erkennung, Fluidität der Zellmembran (Capping), Cytoskelett

4. Chromosomenanalyse und Chromosomen-Mapping (Banden) mit Quinacrine-mustards

5. Primärfluoreszenz von Zellprotein und DNA im Ultraviolett (UV-Fluorometrie erfordert Quarzoptik)

6. Bindungsparameter der Wechselwirkung Zelle - Ligand (Pharmaka) durch mikrofluorometrische Titration undBestimmung der Invasion und Elimination (Pharmakokinetik) von Fluorochromen in Zellen

7. Lokalisierung von Enzymaktivitäten in Zellen durch fluorometrische Varianten histochemischer Reaktionen

8. Umsatzbestimmung zellulärer enzymatischer Reaktionen mittels fluorogener Substrate (s.o.)

9. In der Biotechnologie Entwicklung fluorometrischer Meßsonden für Bioreaktoren zur Bestimmung des"Pegels" des natürlichen fluorogenen Substrats NADH in Zellen und seiner Änderung z.B. nach Zugabe vonSubstraten der Glycolyse

10. Fluoreszenzpolarisation zur Bestimmung makromolekularer Bindung, Membranbindung und -orientierung,Viskosität


30

7.4 Durchfluß-Impuls-Cytometrie

Ausgehend von der Auflichtmikroskopfluorometrie (Abb. 7.2, 3) wurden mit der Durchflußimpulscytometrie völligneue Verfahren zur schnellen, automatischen und dispersiven fluorometrischen und streulichtanalytischenCharakterisierung von Zellen in Suspension entwickelt.

Mit der klassischen Mikroskopfluorometrie (Abb. 7.2) werden mit Objektiven höchster Apertur Zellen auf einemObjektträgerpräparat individuell untersucht. Demgegenüber verzichtet man bei der Impulscytometrie auf dievisuelle Kontrolle einzelner Zellen, vielmehr wird eine fluoreszenzgefärbte Zellsuspension in einer Kapillare imDurchfluß durch die Objektebene des Objekivs geführt. Jede Zelle liefert beim Durchgang durch denAnregungsfokus sowohl einen kurzen Fluoreszenzimpuls als auch ein Streulichtsignal, die simultan überentsprechende dichromatische Teiler und Sperrfilter an Photomultiplier geleitet werden (Abb. 7.5). Mit schnellenImpulshöhenanalysatoren werden die Impulse zu Histogrammen der Impulshöhenverteilungen verarbeitet.

Ersetzt man die konventionelle Lichtquelle durch einen Laser zur Fluoreszenzanregung in der Durchflußkapillare,so verbleibt vom ursprünglichen Strahlengang des Auflichtmikroskops nur das Objektiv zur Aufnahme vonLichtimpulsen mit hoher Apertur.

Die Zellsuspension wird vor dem Eintritt in die Meßkapillare von einem partikelfreien Flüssigkeitsstrom umhüllt(sog. Mantelstromverfahren) und dadurch zu einem feinen Flüssigkeitsfaden auseinander gezogen(hydrodynamisch fokussiert), so daß die Zellen einzeln hintereinander im Zentrum der Kapillare durch denAnregungs- und Meßfokus des Systems laufen. Die Zählraten liegen im Bereich von 103/s. Die mehrparametrigeImpulshöhenanalyse mittels Durchflußcytometrie dient heute zur schnellen und automatischen Charakterisierungvon Zellpopulationen in der Medizin und Biologie.

Laser

PM I

PM II

PM III IHA

DT

DT

SF

Zell-suspension

Hüll-strom

N

N

I1

I2

Abb. 7.5: Impulscytometrie, Mantelstromverfahren mit Laseranregung und dreiparametriger Impuls-höhenanalyse (IHA)


31

7.5 Konfokale Laser Scanning Mikroskopie

Prinzip:

Die Beleuchtung und Fluoreszenzanregung mittels eines Lasers als Lichtquelle entspricht der eines Auflicht-Fluoreszenzmikroskops (Anregungsfilter AF, dichromatischer Teilerspiegel DT, Sperrfilter SF). In einerSchnittbildebene z (Fokusebene O des Mikroskops) wird in x- und y-Richtung durch eine Schwingspiegel-anordnung Punkt für Punkt des Objekts abgetastet (scanning) und auf eine Punktblende (pinhole) in derZwischenbildebene O' abgebildet. Der Detektor in der dahinter liegenden Aperturebene A' (Austrittspupille) mißtdie von jedem Bildpunkt (x, y, z) stammende Lichtintensität I (Fluoreszenz oder Streulicht). Mit dem Datensatz (x,y, z, I) wird im Rechner die räumliche Struktur des Objekts rekonstruiert und nach beliebigen Verfahren derdigitalen Bildverarbeitung ausgewertet.

Optische Elemente des Strahlengangs (Abb. 7.6):

Variable Punktblende (pinhole) in der Zwischenbildebene O',

digitale x-y-Bildabtastung und z-Fokussierung: konfokales Raumfilter,

Detektor in der Austrittspupille des Mikroskops, Aperturebene A ',

Laser mit Aufweitungsoptik,

Strahlenteiler, dichromatischer Teilerspiegel DT

Anregungsfilter AF, Sperrfilter SF

x-y-Scanner, galvanische Schwingspiegel

Objektiv (= Kondensor)

Objekt, Dicke d >> Schärfentiefe δ,

Objektebene O, Fokusebene, Schnittbildebene z

Betriebsarten:

Auflicht-Fluoreszenz und -Reflexion mit Detektor I, Laser (Ar 365 nm, 488 nm),

kombinierbar mit konventionellem Durchlicht, z.B. Hellfeld oder Phasenkontrast

Durchlicht-Streulicht mit einem weiteren Detektor II, Laser (HeNe 543 nm, 633 nm)

Anwendungen:

Oberflächenrelief im Auflicht, Dickenbestimmungen im Durchlicht,

optische Schnitte (Auflösung < 50 nm), mikroskopische Tomographie bei allerdings begrenzter nutzbarerGesamtdicke d in z-Richtung,

5D-Datensätze, digitale Bildverarbeitung, 3D-Rekonstruktion, Stereodarstellung,

digitale Filterung, Profildarstellungen, Zeitserien I(t)

räumlich hoch auflösende Darstellung von Zellen in Fluoreszenz, z.B. mittels Fluoreszenz-Immun-Markierung


32

Abb. 7.6: Strahlengang und Baugruppen eines konfokalen Laser Scanning Mikroskops (LSM)

8. Interferenzmikroskopie, Mikroskopinterferometrie

33

8 INTERFERENZMIKROSKOPIE, MIKROSKOPINTERFEROMETRIE


1. W. Krug, J. Rienitz, G. Schulz: Interferenzmikroskopie, Akademie-Verlag, Berlin 19612. W.H. Steel: Interferometry, 2nd ed., Cambridge Studies in Modern Optics 1, Cambridge University Press,

Cambridge 1987

8.1 Interferometrie, Gangunterschiede, Phasenobjekte

Interferenzmikroskopie macht wie Phasenkontrastmikroskopie Phasenstrukturen durch Kontrast sichtbar.

b)a)

Abb. 8.1: Interferenz kugelförmiger (a) und ebener (b) Wellenfronten und zugehörige Inter-ferenzstreifenbilder

Durch Strahlenteilung oder Spiegelung des Lichtes einer punktförmigen Lichtquelle werden zwei Strahlengänge(Meß- und Vergleichsstrahlengang) bzw. zwei kohärente und damit interferenzfähige Wellenfrontsysteme zweier(reelle u. virtuelle) Lichtquellen erzeugt.

Bei kugelförmiger Ausbreitung der Wellenfronten (d.h. ohne weitere Linsensysteme) ergibt deren Interferenzeinen hyperbelförmig gekrümmten Verlauf von Interferenzlinien gleicher Phasendifferenz (Abb. 8.1, a).

Durch ein Linsensystem (Abb. 8.1, b) als Kondensor werden die kugelförmigen in plane Wellenfronten umgewan-delt; deren Interferenz ergibt geradlinige, parallele Interferenzstreifen gleicher Phasendifferenz 1 λ.

Ein phasenschiebendes Objekt im Meßstrahlengang eines Interferometers beeinflußt die optische Weglänge desdurchgehendes Lichtes gegenüber dem Vergleichsstrahlengang. Aus der Interferenz von kohärenten, um einenGangunterschied Γ versetzten Wellenfronten zwischen Meß- und Vergleichsstrahlengang entstehen Intensitäts-änderungen (Kontrast), durch die das Phasenobjekt sichtbar wird. Das interferenzmikroskopische Bild gibtObjektdetails unabhängig von Größe und Gestalt phasendifferenzgetreu wieder, im Gegensatz zur Phasen-kontrastmikroskopie (5.6.), die nur Gangunterschiede objektgetreu durch Kontrast wiedergibt, die klein sindgegenüber der Wellenlänge (Γ << λ), und damit nur die Phasenfeinstruktur des Präparats darstellt.

Interferenzmikroskope eignen sich daher besonders als empfindliche Meßinstrumente für Gangunterschiede(Mikroskopinterferometer). Der für eine bestimmte Wellenlänge λ zu messende Gangunterschied Γ [µm] istproportional der Dicke d [µm] des Objekts und der Brechzahldifferenz ∆n zwischen Objekt (n0) und Ein-bettungsmedium (nm)

( )Γ[ ] = d[ ] n - n0 mµ µm m ⋅


34

Der erzeugte Gangunterschied Γ kann aus der Versetzung der Interferenzlinien in Vielfachen k oder Bruchteilender benutzten Wellenlänge abgelesen werden

Γ[ ] = k [ ]µ λ µm m⋅

Bei gegebener Dicke d und bekanntem Brechungsindex nm des Mediums läßt sich der unbekannte Brechungs-index n0 des Objekts berechnen, oder bei bekanntem Brechungsindex n0 die Dicke des Objekts. Die Brechungs-indices stehen über das Brechzahlinkrement α mit der Konzentration c in Beziehung (vgl. 5.1.1, 6)

( )n - n0 m = ⋅α c

so daß z.B. bei Einbettung von Zellen in wäßrigen Lösungen die sog. Trockenmasse-Konzentration c oder ihrKomplement, der Wassergehalt (1 - c) berechnet werden können. Bei porösen Materialien (z.B. Gele, Sepha-rosekugeln) läßt sich der Anteil der Gelmatrix und das gesamte Porenvolumen, sowie bei Immersion mit Lösungenunterschiedlich großer Testmoleküle auch die Porenvolumenverteilung bestimmen (analog zur Gelfiltration).

Das Brechzahlinkrement α hat für Proteine etwa den Wert α ≈ 0,017 % bei Angabe der Konzentration in Prozent.

Ist bei einem Objekt auch die Dicke d unbekannt, so läßt sie sich durch Doppel-Einbettung in zwei Immer-sionsmedien mit nm1 und nm2 bestimmen

( )Γ1 = d n - n0 m1⋅

( )Γ2 = d n - n0 m2⋅

8.2 Bauprinzipien verschiedener Interferenzmikroskope

Hinsichtlich der Auftrennung zwischen Objekt- und Vergleichsstrahlengang im Interferometer unterscheidet man:

1. Laterale Trennung

a) Völlig getrennte Strahlengänge

Mach-Zehnder Interferometer, Durchlicht, Doppelmikroskop, Leitz (Abb. 8.2, 1 u. 2)

Michelson-Linnik Interferometer, Auflicht, Doppelmikroskop, Leitz (Abb. 8.2, 6)

b) Totale Bildaufspaltung innerhalb eines Mikroskops mit polarisationsoptischen Mitteln

Jamin-Lebedeff-Interferenzmikroskop, Zeiss (Abb. 8.2, 3)

c) Differentielle Bildaufspaltung mit polarisationsoptischen Mitteln

Nomarski-differentieller Interferenzkontrast (Abb. 8.2, 4)

2. Axiale Trennung

Beyer-Schöppe, Interphako, Zeiss-Jena (Abb. 8.2, 5)


35

1.

K1

K2

K3

2.

Mach-Zehnder - Interferometer Leitz Mach-Zehnder - Interferenzmikroskop

oe

eo

3. 4.

Jamin-Lebedeff Zeiss - Interferenzmikroskop Nomarski Differentieller Interferenz Kontrast

Abb. 8.2: Bauweisen von Interferenzmikroskopen


36

Abb. 8.2, Fortsetzung

A

A'

5. 6.

Beyer-Schöppe Interphako Zeiss-Jena Michelson-LinnikAuflicht-Interferenzmikroskop

1. 2.

rot

rot

blau

gelb

blau

gelb

Γ

∆ Γ

3.

Abb. 8.3: Darstellung einer Kugel und einer Platte1. im Interferenzstreifen, 2. im Interferenzkontrast und 3. im Differentiellen Interferenzkontrast


37

8.3 Interferenzmikroskope

8.3.1 Zweistrahl-Interferenzmikroskop nach Horn (Leitz) (Abb. 8.2, 2)

Es basiert auf einem Mach-Zehnder-Interferometer (Abb. 8.2, 1), dessen getrennte Meß- und Vergleichs-strahlengänge (seitlicher Abstand ca. 6 cm) zwei untereinander abgeglichene Mikroskope (Kondensor- undObjektivpaare) enthalten. Die Trennung und Wiedervereinigung der Strahlengänge erfolgt über zwei Prismen-blöcke.

Vier paarweise angeordnete Kippkompensatoren (K1, K2 planparallele Platten) erzeugen eine variable Versetzung(x,y) zweier virtueller, kohärenter Lichtquellen (Aperturblende). Die Interferenz ihrer Wellenfronten liefert beimonochromatischem Licht der Wellenlänge λ ein System paralleler Interferenzstreifen, deren Abstand geradeeinem Gangunterschied von 1 λ entspricht. Bei Weißlicht ergeben sich ein unbunter, weißer Interferenzstreifen 0.Ordnung und daneben spiegelbildlich wegen der Dispersion farbige und in der Intensität rasch abnehmendeStreifen höherer Ordnung.

Ein Phasenobjekt im Meßstrahlengang erzeugt einen Gangunterschied Γ und damit eine Versetzung der Inter-ferenzstreifen um diesen Betrag.

Durch einen weiteren Keilkompensator K3 läßt sich die relative Lage der Interferenzstreifen bei konstantemAbstand kontinuierlich seitlich verschieben. Die Phasenlage und der Gangunterschied können mit einerAuflösung von ca. 1/100 λ gemessen werden.

Das Interferenzmikroskop erlaubt zwei Arten der Darstellung der Gangunterschiede von Phasenobjekten.

1. Interferenzstreifen-Verfahren (Abb. 8.3, 1)

Bei zwei durch die spiegelbildliche Kippung der Kompensatoren K1 erzeugten virtuellen Lichtquellen erscheintdas Objekt im Interferenzstreifenfeld. Über dem Objekt sind die Interferenzstreifen um den jeweiligenGangunterschied seitlich versetzt. Bei Erhöhung des Kippwinkels verengt sich das Streifenbild. Verringert man dieKippwinkel, so nähern sich die Lichtquellenbilder (sichtbar in der Aperturebene, s. Experimente) und dieInterferenzstreifen laufen auseinander.

2. Interferenzkontrast-Verfahren (Abb. 8.3, 2)

Verringert man die Kippwinkel so weit, daß die Lichtquellenbilder und damit die von ihnen ausgehendenWellenfronten ineinanderfallen, so werden die Interferenzstreifen auf unendliche Breite auseinandergezogen. DerUntergrund wird homogen und das Objekt erscheint darüber im Kontrast (bei Weißlicht in der Interferenz-Farbe)seines Gangunterschiedes gegenüber dem Untergrund. Mit dem Interferenzkontrast-Verfahren lassen sichgeringste Gangunterschiede (≈ 1/200 λ ) durch Farbunterschiede darstellen, wobei die Qualität der Farbdifferenzmit Hilfe des Keilkompensators frei wählbar ist. (zum Vergleich: im Phasenkonstrast werden dieseGangunterschiede nur durch Grauwerte dargestellt)

8.3.2 Auflicht-Interferenzmikroskop nach Linnik (Leitz) (Abb. 8.3, 6)

Es basiert auf der Kombination eines Michelson-Interferometers mit einem Auflichtmikroskop. Ein Prismenblocktrennt Meß- und Vergleichsstrahlengang und vereinigt sie wieder nach Reflexion an der Objektoberfläche undeiner planen Referenzspiegelfläche. Beide Strahlengänge enthalten je abgeglichene Objektive, die gleichzeitigauch Kondensoren sind. Der Abstand der Referenzfläche läßt sich an Feintrieben in die Objektebene fokussierenund ihre Ausrichtung auf einer Kugelkalotte kippen.

Interferenz entsteht zwischen den an Objekt und Referenzfläche reflektierten Wellenfronten. Je nach Neigung derReferenzfläche läßt sich die Oberflächenstruktur hier ebenfalls in Interferenzstreifen oder im Interferenzkontrastdarstellen.

8.3.3 Durchlicht-Interferenzmikroskop nach Jamin-Lebedeff (Zeiss) (Abb. 8.3, 3)

Beim Jamin-Lebedeff-Verfahren erfolgt die Trennung und Wiedervereinigung von Meß- und Vergleichs-strahlengang des Interferometers innerhalb des Bildfeldes eines Mikroskops (innerhalb eines Objektivs undKondensors) und zwar mit polarisationsoptischen Mitteln. Das durch einen Polarisator linear polarisierte Lichtwird in einem unter 45° dazu orientierten doppelbrechenden Kristall in einen ordentlichen (o) und außer-ordentlichen (e) Strahl getrennt. Die Wiedervereinigung kann mit einem entsprechend geschnittenen Kristallerfolgen, nachdem vorher durch eine λ/2-Platte die Schwingungsrichtungen um 90° gedreht und damit dieEigenschaften von o und e gegenüber dem zweiten Kristall vertauscht wurden.


38

Gemessen wird der Gangunterschied des Objektes gegen eine objektfreie Stelle des Präparates im Interferenz-kontrast. Es tritt zusätzlich ein seitlich und axial verschobenes (unscharfes) Doppelbild auf.

8.3.4 Differentieller Interferenzkontrast nach Nomarski (Abb. 8.3, 4)

Beim differentiellen Interferenzkontrast nach Nomarski wird die seitliche Bildauftrennung (gegenüber dem Jamin-Lebedeff-Verfahren) soweit verringert, daß sie unter die Auflösungsgrenze des Auges fällt. Es interferieren nunzwei nur "differentiell" gegeneinander versetzte Wellenfronten (Abb. , 3) zu einem Kontrast derPhasenstrukturänderungen (Gradienten). Die notwendige schwache (differentielle) Bildaufspaltung undWiedervereinigung wird ebenfalls polarisationsoptisch mittels Wollaston-Prismen erreicht.

Der Effekt tritt in Richtung der Bildversetzung auf, die im Gesichtsfeld in NW-SO-Richtung orientiert ist. Positiveund negative Differenzen der Phasengradienten an den entgegengesetzten Rändern und Flanken des Objektswerden durch gleiche Grauwerte gegenüber dem Untergrund (Weiß der 0. Ordnung) wiedergegeben. Fügt manjedoch zusätzlich ein doppelbrechendes Plättchen Rot I. Ordnung (551 nm, s.u. Polarisationsmikroskopie) ein, d.h.verschiebt man die Lage des Untergrunds in ein Maximum 1. Ordnung, so erscheinen gegenüber dem rotenUntergrund positive Phasendifferenzen blau (Farbe höherer Ordnung) und negative Differenzen orange (Farbeniederer Ordnung). Der differentielle Interferenzkontrast erzeugt damit den Eindruck eines plastischen Kontrastesmit scheinbar einseitiger, azimutaler Beleuchtung (Abb. , 3)

8.3.5 Durchlicht-Interferenzverfahren Interphako nach Beyer (Abb. 8.3, 5)

Das Interphako-Verfahren beruht auf einem Mach-Zehnder-Interferometer, das einem normalen Mikroskopnachgeschaltet ist. In dem Vergleichs-Strahlengang des Interferometers befindet sich eine Ringblende A', auf dieeine ebensolche Ringblende A im Kondensor wie beim Phasenkontrast abgebildet wird. Der Vergleichs-Strahlengang des Interferometers erhält somit nur ungebeugtes Licht (Maximum 0. Ordnung), das keineInformation über das Objekt enthält, sondern nur die ebene Wellenfront des kohärenten, homogenen Unter-grundes (U). Der Meß-Strahlengang enthält die vollständige Information H über das Objekt (alle Maxima 1. undhöherer Ordnung) und damit die durch das Objekt modulierten Wellenfronten. Die Trennung der Strahlengängeerfolgt also erst hinter dem Objektiv in axialer Richtung. Beide Anteile ergeben aus der Interferenz der ebenenReferenzwellenfronten mit den durch das Objekt modulierten Wellenfronten das Interferenzbild desPhasenobjekts. Die Kompensatoren entsprechen denen des Mach-Zehnder-Interferometers und ermöglichendaher Interferenzstreifen- und Interferenzkontrast-Darstellung.

Ersetzt man die Ringblende A' durch einen Phasenring, so erhält man zusätzlich auch Phasenkontrast-Darstellung(Inter-Phako). Das Interphako-Verfahren eignet sich als Interferenz- und Phasenkontrast-Zusatz zu gewöhnlichenDurchlichtmikroskopen.

8.4 Experimente zur Interferenzmikroskopie

8.4.1 Zweistrahl-Interferenzmikroskop Leitz

Objektivpaar 20 x

1. Identifizieren der Elemente des Mikroskops:

Objektivpaar, Kondensorpaar, Kippkompensatoren, Keilkompensator, Prismenblock, Aperturblende,Leuchtfeldblende

2. Einstellen der Interferenzstreifen in Weißlicht

Justieren der Leuchtfeldblendenbilder am Kondensor des Vergleichsstrahlengangs

Funktion der Kippkompensatoren prüfen: Lage, Richtung und Abstand der Interferenzstreifen variieren

Funktion des Keilkompensators prüfen: seitliche Verschiebung der Interferenzstreifen

3. Darstellung der Aperturblendenbilder (virtuelle Lichtquellen) mit Hilfsmikroskop

Vergleich der Lage der Aperturblendenbilder mit den Interferenzstreifen, Funktion der Kompensatoren

4. Messung in monochromatischem Licht

Filterschieber auf 436 nm, 546 nm, 588 nm Interferenzfilter

5. Untersuchung im Interferenzkontrast mit Weißlicht

mit Kippkompensatoren auf Streifenbreite ∞ einstellen, mit Keilkompensator kontinuierlich die Phasenlage ändern


39

6. Präparate:

Jeweils zwei Deckglaskammern auf einem Objektträger herstellen, dann für den Meß- und VergleichsstrahlengangObjektträger halbieren (Diamant)

Einstellen eines Präparates jeweils mit Vergleichspräparat (leer)

Sephadexkugelsuspension (Abb. )

Bestimmung des Gangunterschiedes

Glimmerspaltblättchen, Darstellung in Interferenzstreifen und Interferenzkontrast

Quarzfasern, Quarzkapillaren in Deckglaskammer einbetten in Luft, Wasser, Glycerin, Immersionsöl. Vergleich derQualität der Abbildung mit und ohne Interferenzstrahlengang (Durchlicht-Hellfeld-Mikroskopie)

Zellen aus Harnsediment in Deckglaskammer

Zellen aus Zungenabstrich, Metaphase-Zellen suchen und Chromosomen im Interferenzkontrast darstellen

8.4.2 Auflichtinterferenzmikroskop Leitz

Objektivpaar 20 x

1. Identifizieren der Elemente des Mikroskops

Michelson-Prismenblock, Auflichtstrahlengang mit Aperturblende und Meß- und Vergleichsobjektiv

Justieren der Objektoberfläche und Justierung der Referenzfläche (demonstrieren lassen!)

Lichtquelle mit Lichtleiter, die Frontfläche des Lichtleiters liegt in der Aperturebene des Auflichtstrahlengangs,mit Hilfsmikroskop betrachten, Interferenzfilter 546 nm (grün) und Weißlichtinterferenz

2. Präparate:

Rauhigkeitsuntersuchung einer Metalloberfläche, z.B. Pfennig, mit Wasser oder Öl benetzte Oberfläche,Aufdampfschichten, Glimmer-Spaltstufen, Struktur einer Compact-Disc, eines Beugungsgitters

Präparate einstellen und im Interferenzstreifen und Interferenzkontrast untersuchen

Vergleich der Qualität der Abbildung mit und ohne Interferenzstrahlengang (Auflicht-Reflexions-Mikroskopie)

8.4.3 Jamin-Lebedeff-Verfahren (Zeiss), ad libitum demonstrieren lassen

Objektiv 10 x und Kondensor 10x

Präparat Zellsuspension

8.4.4 Nomarski-Differentieller Interferenzkontrast

Identifizieren der optischen Elemente

Kondensorrevolver, Interferenzkontrastschieber

Plättchen Rot I. Ordnung

Präparate: Sephadexkugel-Suspension, Zellen in Deckglaskammer

8.4.5 Bestimmung der Brechzahl von Einbettungsmedien am Abbe- und Präzisionsrefraktometer

9. Polarisationsmikroskopie

40

9 POLARISATIONSMIKROSKOPIE


1. E. Buchwald:Einführung in die Kristalloptik, Sammlung Göschen, Bd. 619/619a, W. de Gruyter, Berlin 19632. W, Bruhns, P. Ramdohr: Kristallographie, Sammlung Göschen, Bd. 210, W. de Gruyter, Berlin 19543. G. Müller, M. Raith: Methoden der Dünnschliffmikroskopie, Clausthaler tektonische Hefte 14, E. Pilger Verlag,

Clausthal-Zellerfeld 19814. L. Föppl, E. Mönch: Praktische Spannungsoptik, Springer, Berlin 19725. W.J. Patzelt: Polarisationsmikroskopie, E. Leitz, Firmenschrift 550-51, 19746. O. Leeder, H.J. Blankenburg: Polarisationsmikroskopie, VEB Deutscher Verlag, Leipzig 19897. vgl. auch Kapitel Polarisation in: Bukatsch - Kratz - Probeck - Schwankeier: So interessant ist Chemie; Aulis-

Verlag, Deubner 19878. vgl. auch Kristalloptik, Kurs I u. II, FB 16 Geowissenschaften

9.1 Grundexperimente: Overhead-Projektor mit gekreuzten Polfolien

Polarisationsfolien sind hergestellt aus gereckten und angefärbten Kunststofffolien. Sie sind wie anisotropeKristalle doppelbrechend, lassen Licht mit bestimmter Lage der Schwingungsebene mit einem hohen Trans-missionsgrad τPol durch, dazu senkrecht schwingendes Licht aber nur mit dem geringen Transmissionsgrad τSperr .Damit ergibt sich für auftreffendes unpolarisiertes Licht der Transmissionsgrad τ

ττ τ τ

= Pol Sperr Pol+

≈2 2

Mit τ-Werten 20% < τ < 40% erhält man hinter dem Polfilter nahezu vollständig linear polarisiertes Licht mit demPolarisationsgrad P

PPol Sperr

Pol Sperr

=τ ττ τ

−+

Wegen des beschränkten Transmissionsgrades sehen Polfilter gegenüber doppelbrechenden Kristallen grau aus(wie Neutralfilter). Polfolien sind wärmeempfindlich.

a) Quarzkristall, Drehen um 360°, viermal Aufhellung in Diagonalrichtung, gerade Auslöschung

b) doppelbrechender Kalkspat-Kristall, schiefe Auslöschung

c) Glimmer-Spaltplatten (Muskovit) verschiedener Dicke, mit verschiedenen Interferenzfarben

d) Kunststoff-Folien, Interferenzfarben in Abhängigkeit von der Anzahl Folienschichten

e) dicke Plexiglasplatte, eingespannt in Schraubzwinge, Spannungsdoppelbrechung

f) Quarzkeil 1. - 3. Ordnung, Interferenzfarben als Funktion der Dicke

g) Ca-Alginatkugeln (aus 2 % Na-Alginat in 5 % CaCl2-Lösung getropft), Auslöschungskreuz

9.2 Doppelbrechung

Anisotrope Materialien zeigen zwischen gekreuzten Polarisatoren das Phänomen der Doppelbrechung. Es kannmittels Polarisationsmikroskopie zur Analyse des Aufbaus und der inneren Ordnung transparenter anisotroper,anorganischer wie biologischer und polymerer Strukturen dienen.

In isotropen Materialien (Gase, Flüssigkeiten, spannungsfreie Gläser, kubische Kristalle) ist die Ausbreitungs-geschwindigkeit v des Lichts (Wellenlänge λ) in allen Richtungen gleich. Sie besitzen damit richtungs-unabhängige, konstante Brechungsindices n(λ) = c/v.

In anisotropen Materialien sind die Ausbreitungsgeschwindigkeiten v des Lichtes und damit die Brechungs-indices n richtungsabhängig. In doppelbrechendem Material sind außerdem für jede Richtung je zwei senkrechtzueinander stehende Schwingungsebenen für linear polarisiertes Licht vorgegeben. Beim Durchgang durch dasMaterial entstehen in verschiedenen Richtungen Laufzeitunterschiede für zwei zueinander senkrecht schwin-gende, linear polarisierte Lichtwellen mit den Brechungsindices n γ' und nα'. Daraus resultieren Gangunterschiede

( )Γ = d n - n' '⋅ γ α

als Produkt aus der Schichtdicke d und der Doppelbrechung (n γ' - na') in der jeweiligen Richtung. Der Betragdieses Gangunterschiedes Γ kann bei monochromatischem Licht als Grauwert bzw. bei Weißlicht als


41

charakteristische Interferenzfarbe IF sichtbar gemacht werden, wenn man mittels eines Analysators nur die jeweilsin dessen Durchlaßebene liegenden Vektoren der beiden im Material senkrecht zueinander schwingendenpolarisierten Wellen zur Interferenz bringt.

Die unterschiedliche Ausbreitung des Lichtes in anisotropem Material läßt sich auf zwei Arten räumlich darstellen

a) mittels der Lichtgeschwindigkeiten v als zweischalige Konstruktionsfläche der Strahlengeschwindigkeiten(Strahlenfläche), oder

b) mittels der Indikatrix als einschalige Konstruktionsfläche aus den Brechungsindices n und den Schwin-gungsebenen des polarisierten Lichtes für alle Richtungen.

1. Strahlengeschwindigkeitsfläche

Man trägt den Betrag der Lichtgeschwindigkeit in allen Richtungen auf. Für isotrope Materialien ist dieStrahlenfläche eine Kugel, für anisotrope Materialien besteht sie aus zwei Flächen, nämlich einer Kugel für denordentlichen Strahl o (no) und einem Ellipsoid für den außerordentlichen Strahl e (ne). Das Ellipsoid ist beipositiver Doppelbrechung (∆n > 0, ve < vo) der Kugel einbeschrieben und bei negativer Doppelbrechung (∆n < 0,ve > vo) der Kugel umbeschrieben

v v0 ve v0ve

isotrop anisotrop∆n = 0 ∆n < 0 ∆n > 0

2. Indikatrix

Man erhält die Indikatrix als einschalige Konstruktionsfläche, indem man für alle Ausbreitungsrichtungen in derenNormalebenen für die zueinander senkrecht stehenden Schwingungsebenen des linear polarisierten Lichtes diebeiden zugehörigen Brechungsindices n γ' und nα' aufträgt.

n

ne

no

ne

no

Kugelisotrop

2-achsiges Ellipsoid, Rotationsellipsoid, geometrische Achsen n0 , ne

anisotrop∆n = 0 ∆n < 0 ∆n > 0

nα

nβ

nγ


42

3-achsiges Ellipsoid,geometrische Achsen n γ > nβ > nα

Aufgabe polarisationsmikroskopischer Untersuchungen ist es, die Art und Lage der Indikatrix und die Werte ihrerAchsen (Doppelbrechung) im Material zu bestimmen.

9.3 Gangunterschied, Auslöschung und Interferenzfarbe

Polarisator

Analysator

doppelbrechenderKristall

Abb. 9.1: a) Auslöschung in Polar-Richtung b) Aufhellung in Diagonalrichtung

1. Auslöschung

Stehen die beiden Schwingungsrichtungen im doppelbrechenden Material parallel und senkrecht zu denSchwingungs- und Durchlaßrichtungen der beiden gekreuzten Polare (Polarisator, Analysator), so wird die vomPolarisator vorgegebene und im doppelbrechenden Material allein durchgelassene Ebene vom Analysatorgelöscht (viermal bei Drehung des Präparates um 360°). Soweit die Orientierung einer sichtbaren Vorzugsrichtung(Kristallkante) mit der Richtung der Löschungen übereinstimmt, spricht man von gerader Auslöschung (wirteligeKristalle z.B. Quarz), sonst von schiefer Auslöschung.

2. Aufhellung in Diagonalstellung

Stehen die beiden Schwingungsrichtungen in doppelbrechendem Material diagonal zur Durchlaßrichtung desPolarisators, so werden von dem in dessen Durchlaßrichtung schwingenden, linear polarisierten Licht jeweils nurdie in die beiden Schwingungsebenen des Materials fallenden Vektoren durchgelassen. Aufgrund derunterschiedlichen Geschwindigkeiten (vo, ve bzw. no, ne) entsteht zwischen den beiden senkrecht zueinanderpolarisierten Wellenzügen beim Durchlaufen der Schichtdicke d ein Gangunterschied Γ. Von diesen beidenphasenverschobenen Wellenzügen wird beim Auftreffen auf den Analysator wiederum jeweils nur der Vektor indessen Durchlaßrichtung durchgelassen. Diese beiden Vektoren schwingen nun phasenverschoben in derselbenEbene, nämlich der Durchlaßrichtung des Analysators, und sind daher interferenzfähig. Die Interferenz resultiertbei Beobachtung in Weißlicht in Interferenzfarben und bei monochromatischem Licht in Grauwerten inAbhängigkeit vom erzielten Gangunterschied Γ(λ) = d · ∆n. Bei einem Gangunterschied von 1 λ bzw. ganzzahligerVielfachen von λ annullieren sich die entgegengesetzt schwingenden Wellenzüge und löschen sich aus.


43

Quarzkeil

λ1 λ2 λ3

551

rot

grün

blau

551

450

650

551

Rot I1100Rot II

1650Rot II

nm

nm

nm

I

d

I

Abb. 9.2: Gangunterschiede, wellenlängenabhängige Auslöschung an einem Quarzkeil und Interferenzfarbenbei Weißlicht

3. Interferenzfarben

Die Entstehung und Qualität der Interferenzfarben doppelbrechender Materialien läßt sich an einem Präparat mitstetig zunehmender Schichtdicke d erklären (Quarzkeil in Diagonalstellung, s. Abb. 9.1, a + f).

Für eine bestimmte Wellenlänge (z.B. grün 551 nm) treten über dem Keil dunkle Banden über den Schichtdickenauf, in denen der Gangunterschied ganze Vielfache der Wellenlänge erreicht. Für Licht verschiedener Wellenlängesind die Abstände der Banden der Wellenlänge proportional. Aus ihrer Überlagerung im Weißlicht, hierstellvertretend mit drei Hauptfarben blau (450 nm), grün (551 nm) und rot (650 nm) demonstriert, ergeben sich sehrcharakteristische Farben, deren Qualität direkt zur Abschätzung des Wertes der Doppelbrechung bei bekannterSchichtdicke dient (Levy-Michel-Farbtafeln).


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GangunterschiedΓ [nm]

Interferenzfarbe und Ordnung "Restspektrum", vgl. Abb. 9.2

0 schwarz

bis 250 Weiß 0. Ordnung alle drei Farbkomponenten blau, grün, rot nehmen etwagleichmäßig zu: weiß

bis 300 gelb

450 orange ohne blau 450 nm

551 Rot I. Ordnung ohne grün 550 nm

600 violett

650 blau ohne rot 650 nm

750 grün

850 gelb

1000 orange ohne blau (2 x 450 nm)

1100 Rot II. Ordnung ohne grün (2 x 550 nm)

1130 violett

1150 blau

1300 grün ohne rot (2 x 650 nm)

bis 1350 grün ohne blau (3 x 450 nm)

1650 Rot III. Ordnung ohne grün (3 x 550 nm)

... blasser werdende

↓ Fleischfarben

>> Weiß höherer Ordnung

Bei höheren Ordnungen überwiegen rot-grüne und fleischfarbene Töne, die zunehmend ausblassen und in Weißhöherer Ordnung übergehen. Daher sind dicke doppelbrechende Kristalle in Diagonalstellung unbunt weißhöherer Ordnung (vgl. 9.1, a) und b)). Demgegenüber zeigen dünne Platten mit geringer Doppelbrechung (z.B.Kunststoff-Folien) Weiß der 0. Ordnung.

Vgl. Interferenzfarben-Tabelle (Lévy-Karte) im Anhang

Exp. 9.1, d) : Herstellen eines treppenförmigen Keils aus steigender Anzahl Kunststoff-Folien auf einemObjektträger unter Deckglas. Zur Beobachtung der Interferenzfarben in Abhängigkeit von der Schichtdicke istdabei auf folgendes zu achten:

a) bei gleicher Ausrichtung der Folienlagen addieren sich die Gangunterschiede: steigende Interferenzfarben zuhöheren Ordnungen

b) bei um 90° gedrehter Ausrichtung der Folien subtrahieren sich die Gangunterschiede: niedrigere Inter-ferenzfarben (vgl. unten: Kompensatoren, Kompensator Rot I)


45

Demonstration der Interferenzfigur eines doppelbrechenden Materials (Glimmerplatte, Kunststoff-Folie)

Analysator

Polarisator

ϕ

d

Abb. 9.3: Gangunterschied Γ eines doppelbrechenden Materials in Abhängigkeit vonDicke d und Durchstrahlungsrichtung ϕ

Durchstrahlt man zwischen gekreuzten Polaren eine doppelbrechende Platte der Dicke d unter großemÖffnungswinkel ϕ (Apertur), so ergeben sich je nach Art und Lage der Indikatrix im Material und der effektivenSchichtdicke in allen Beobachtungsrichtungen unterschiedliche Gangunterschiede Γϕ

( )Γϕ γ α ϕϕ= ⋅ −

dn n

cos ' '

mit den zugehörigen Interferenzfarben. Daraus resultiert über dem Raumwinkel eine für die jeweilige Indikatrixcharakteristische Interferenzfigur, die man direkt subjektiv betrachten (Expt. 1, Abb. 9.4) oder auf einen Schirmprojizieren kann (s. Expt. 2, Abb. 9.5).

Bei einem zweiachsigen Ellipsoid (Rotationsellipsoid) gibt es eine Richtung, in der beide senkrecht zueinanderpolarisierten Wellenzüge gleiche Geschwindigkeit haben. In dieser Achse der Indikatrix mit kreisförmigemQuerschnitt no tritt keine Doppelbrechung auf (optisch einachsig).

Bei allgemeinen, dreiachsigen Ellipsoiden gibt es zwei Richtungen senkrecht zu den beiden Kreisschnitten desEllipsoids, in denen keine Doppelbrechung eintritt (optisch zweiachsig). Die Lage dieser beiden Kreisschnitte desEllipsoids erhält man, wenn man in der Ebene nα II nγ soweit geht, bis der Vektor den Wert nß als Radius desKreisschnittes erreicht.

Expt. 1: Subjektive Betrachtung der Interferenzfigur einer doppelbrechenden Platte (Abb. 9.4). Man betrachte einedoppelbrechende Platte (Glimmer, Kunststoff-Folie) zwischen einer unmittelbar vor das Auge gehaltenen Polfolie(Analysator) und einer dahinter gekreuzt angeordneten großen Polfolie (Polarisator) gegen eine helle Fläche(Himmel). Um einen möglichst großen Raumwinkel zu überblicken, ist auch die Platte möglichst nahe ans Auge zubringen und gegebenenfalls zu kippen. Man sieht im überblickbaren Gesichtswinkel (Apertur) die Interferenzfigurder Indikatrix des Materials.


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Analysator

Polarisator

Abb. 9.4: Subjektive Betrachtung der Interferenzfigur einer doppel-brechenden Platte

Expt. 2: Projektion der Interferenzfigur einer doppelbrechenden Platte am Mikroskop mit hochaperturigemKondensor und mit Projektionshalbkugel (Abb. )

Man durchstrahlt eine doppelbrechende Platte (Glimmer, Kunststoffplatte auf Objektträger) mit einem Kondensormit möglichst hoher Apertur (0,9 < n.A. < 1,4, Ölimmersion, Ausrüstung des Mikroskopstativs mit Drehtisch, ohneObjektive, Polarisator).

Unmittelbar über dem Präparat wird in eine Fassung, die drehbar im Diffraktionstrichter des Objektivrevolversaufgehängt ist, eine Polfolie als Analysator gelegt. Darüber wird als Projektionsfläche eine matte Halbkugel(Tennisball) gestülpt. Auf dieser Projektionsfläche erscheint die mit der Apertur des Kondensors erreichbareInterferenzfigur des Materials.

a) Polare in gekreuzte Stellung bringen

b) Präparat zwischen den gekreuzten Polaren drehen

spezielleLiteratur:

O. Medenbach, H. Weinreich, K. Medenbach: Die Demonstration der Interferenzfigur von Kristallen mit derProjektionshalbkugel nach Quirke, Leitz-Mitt. f. Wiss. u. Technik 7 (1), 12-14 (1977)

Projektions-halbkugel

Analysator

Präparat

Kondensor

Polarisator

Abb. 9.5: Projektion der Interferenzfigur eines doppelbrechendenMaterials mittels Projektionshalbkugel


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4. Interpretation der Interferenzfigur

a) Die Durchstoßpunkte der Richtungen, in denen keine Doppelbrechung auftritt, sind dunkel (Richtungen deroptischen Achsen des Materials).

Indikatrix 2-achsiges Ellipsoid, Rotationsellipsoid mit einem Kreisschnitt und daher einer optischen Achse(optisch 1-achsiges Material)

Indikatrix 3-achsiges Ellipsoid mit zwei Kreisschnitten und daher zwei optischen Achsen in der Ebene nγ/nα, diemiteinander den Achsenwinkel 2V bilden (optisch zweiachsiges Material).

Beim Drehen des Objekts dreht sich die Interferenzfigur mit viermaliger Auslöschung.

b) In den Richtungen, in denen die Schwingungsebenen im Kristall mit denen der Polare übereinstimmen, liegenebenfalls dunkle Bereiche vor: "Achsenkreuz" bei optisch einachsigem bzw. "Auslöschungshyperbeln" beioptisch zweiachsigem Material. Die Scheitel der Hyperbeln liegen in den Durchstoßpunkten der beidenoptischen Achsen. Die Richtungen der Hyperbel-Äste bleiben beim Drehen des Objekts erhalten.

c) Betrachtet man die Interferenzfigur im monochromatischen Licht, so erkennt man den Verlauf der OrdnungenΓ = k · λ in Abhängigkeit von der Wellenlänge λ (blau-, grün-, rot-Filter oder Interferenzverlaufsfilter für diekontinuierliche Änderung der Wellenlänge).

d) Der Betrag der Doppelbrechung in senkrechter Richtung (Mikroskopachse) ergibt die Interferenzfarbe desObjekts, mit der man es bei orthoskopischer Betrachtung sieht (vgl. Overhead-Projektion).

9.4 Pol-Mikroskopie doppelbrechender Objekte

Orthoskopie: Betrachtung der Interferenzfarben eines doppelbrechenden Objekts in der Objekt-/Bildebene desMikroskops.

Konoskopie: Betrachtung der Interferenzfigur eines doppelbrechenden Objekts (Glimmerkristall) in derAperturebene des Pol-Mikroskops mittels Hilfsmikroskop oder Bertrand-Linse bei Beleuchtung mit Pol-Kondensor (Apertur 1,4; Öl-Immersion) und Pol-Objektiv (40 x) höchster Apertur.

Mikroskope ausgerüstet mit Drehtisch (zentrieren üben) und hochaperturigem Kondensor, Objektive mittlererVergrößerung

Polarisatorfolie auf die Leuchtfeldblende legen, Analysatorfolie in den Einschub des Diffraktionstrichters legen

Binokulartubus mit einem Okular für Orthoskopie und einer Einstellupe für Konoskopie

Präparate (Orthoskopie):

a) isotrope Kristalle: Kochsalzkristalle auf Objektträger, aus Salzlösung kristallisiert

b) anisotrope Kristalle: Zucker, Ammoniumsulfat auf Objektträger, aus der Lösung kristallisiert

c) Ascorbinsäure-Sphärite auf Objektträger, aus der Lösung kristallisiert (Beobachtung des Auslöschungs-kreuzes der Sphärite bei orthoskopischer Betrachtung!)

d) Deckglaskammer mit Harnsediment (Kristalle)

e) doppeltklebendes Tesaband (Deckglaskammer)

f) Stärkekörner, Ca-Alginat-Kugeln, Eupergit A-Kugeln, Libellenlarvenauge (Auslöschungskreuz)

Sphärite: kreisförmige (kugelförmige) Kristallisation um ein Zentrum. "Auslöschungskreuz" für alle Kristallite, diein Richtung der Polare liegen. Die Ausrichtung des Kreuzes bleibt beim Drehen des Objekts bestehen.

Alginatkugeln: radiärsymmetrische Abflachung der Indikatrix (aufgrund innerer Spannung und Schichtung)Räumliche Änderung der Indikatrix und ihrer Lage, Zentrum isotrop

Stärkekörner: ebenso wie Alginatkugeln, jedoch nur bis Weiß 0. Ordnung

Libellenlarvenauge: Die kuppelförmige Chitinhülle ergibt orthoskopisch ein Auslöschungskreuz wie bei Späriten(Weiß 0. Ordnung)

Schalen von Süßwasserschnecken (Posthornschnecke): phasenreiner Aragonit (CaCO3)

10. Stereomikroskopie, Stereodarstellungen

48

10 STEREOMIKROSKOPIE, STEREODARSTELLUNGEN

10.1 Grundlagen räumlichen Sehens

Die Raumempfindung beim Sehen beruht darauf, daß ein räumliches Objekt aufgrund des Augenabstandes (Basis) mitbeiden Augen simultan unter einem bestimmten Konvergenzwinkel und damit unterschiedlicher Perspektive bzw.Parallaxe gegen den Hintergrund gesehen wird. Die auf der Netzhaut beider Augen entstehenden unterschiedlichenBilder werden dann im Gehirn zu einem Raumeindruck verarbeitet. Für die Wahrnehmung eines räumlichen Eindruckswirken dabei zwei optische Komponenten des beidäugigen Sehens zusammen, nämliche die Akkomodation (derAugenlinsen) und die Konvergenz (der Augenachsen) (Abb. ).

Akkomodation ist die Fähigkeit der Augenlinse, durch Verändern der Brechkraft auf einen Entfernungsbereich von etwa250 mm bis ∞ scharf zu stellen. Konvergenz ist die Fähigkeit, den Sichtwinkel 2α beider Augen frei zwischen 0°, d.h.paralleler Ausrichtung bei unendlicher Entfernung des Objekts, und etwa 15° bei einem Objektabstand von 250 mm(normaler Leseabstand) zu variieren. Bei einem mittleren Augenabstand von 64 mm und der konventionellen Sehweite 250mm ist tg α = 32/250 = 0,128; α = 7,3°. Die noch weitere, willentliche Konvergenz der Achsen wird als Schielen bezeichnet.Die beiden physiologischen Fähigkeiten Akkomo dation und Konvergenz, sind üblicherweise - aber nicht notwendig (s.u.10.3) - unbewußt gekoppelt, d.h. also das Sehen verbindet automatisch z.B. bei Fernsicht Akkomodation ∞ mitKonvergenz 0° und bei Nahsicht Akkomodation 250 mm mit Konvergenz 15°.

Je größer bei gegebener Basis der Objektabstand, desto kleiner wird der Konvergenzwinkel und desto geringer derräumliche Eindruck. Aber auch bei einem entfernten Objekt kann ein großer räumlicher Eindruck künstlich erzeugtwerden, wenn es von einer entsprechend großen Basis (z.B. Scherenfernrohr) stereoskopisch gesehen wird (Abb. ).Durch geeignete Veränderung der Basislänge für den erwünschten Konvergenzwinkel oder auch durch Kippen desObjekts um den Konvergenzwinkel ist stereoskopische Darstellung räumlicher Objekte vom mikroskopischen bisastronomischen Skalenbereich möglich (s.u. Beispiele, 10.6).

10.2 Stereomikroskope, Stereolupen

Stereomikroskope (Greenough-Typ) besitzen zwei getrennte, gegeneinander um etwa 15° geneigte Tuben mit je einemObjektiv und Okular. Zwischen Objektiv und Okular sind wie bei einem Fernglas zwei bildaufrichtende Porro-Prismeneingebaut, um beide Bilder seiten- und höhenrichtig zu sehen.

Normalerweise sind bei Mikroskopen wegen der gewünschten hohen Aperturen der Objektive die Schärfentiefebereichesehr gering (vgl. Abb. ). Bei Stereomikroskopen ist man aber wegen der notwendigen Schärfentiefe auf schwachvergrößernde Objektive beschränkt. Die Erzeugung eines deutlichen stereoskopischen Effekts ist daher bei räumlichausgedehnten Objekten nur innerhalb der Schärfentiefe des Objektivs möglich. Da Stereomikroskope prinzipiell aufschwache Primärvergrößerungen beschränkt sind, ist auch von einer extremen Nachvergrößerung (Okulare bis 25 x) desZwischenbildes natürlich kein Gewinn an Auflösung zu erwarten (vgl. Kap. 4.2, 4.4.3).

Auch mit einem einfachen, monokularen Mikroskop lassen sich bei Lupenvergrößerung mit schwachen ObjektivenStereoaufnahmen durch Kippen des Objekts oder durch seitliches Verschieben (Basis) herstellen.

10.3 Stereodarstellung, Stereophotographie

Meist wird vermutet, daß die Betrachtung von Stereobildern und der Gewinn eines räumlichen Eindrucks von derAnwendung besonderer optischer Hilfsmittel abhängig sei, wie von der Verwendung von Spiegelstereoskopen, von Rot-grün-Brillen bei sog. Anaglyphenbildern oder von Polarisationsbrillen bei polarisierten Bildern. Ziel der hiervorgesehenen Experimente ist es dagegen zu zeigen, daß Stereobilder auch ohne jegliche Hilfsmittel und ganz einfachstereoskopisch erfaßt werden können (Abb. ). Dafür aber ist es wichtig zu wissen, daß sich die beiden Komponenten desräumlichen Sehens (10.1), nämlich die physiologischen Fähigkeiten der Akkomodation und Konvergenz bewußt undleicht, evtl. mit einiger Übung entkoppeln lassen (s. Experimente).


49

b)a)

64 mm 64 mm

250 mm "Leseabstand"

2 α

15°

∞

Abb. 10.1: Akkomodation und Konvergenza) Objekt in unendlichem Abstand: Akkomodation ∞, Konvergenz 0°b) Objekt in konventioneller Sehweite 250mm: Akkomodation 250 mm, Konvergenz 15°


50

b)a)

L R

Objekttiefe

Parallaxe

Augen-

basis

basis

Kamera-

Abb. 10.2: a) Räumliches Sehen eines ausgedehnten Objekts, Objekttiefe innerhalb Schärfentiefeb) Stereoaufnahmen mit einer Kamera durch Wahl einer geeigneten Basis oder durch

Kippen des Objekts


51

a) b)

64 mm

250 mm≈

64 mm

RL RL

R L

Projektions-"basis"

Projektions-abstand

"Rekonstruktion" desräumlichen Objekts

Abb. 10.3: Betrachtung von Stereobildern und Stereoprojektion ohne optische Hilfsmittel, aber mit Entkopplungvon Konvergenz und Akkomodationa) Stereobetrachtung seitenrichtig montierter Stereobilder mit parallelen Augenachsen, Konver-

genz 0°, Bildabstand und Akkomodation ≈ 250 mm, größte mögliche Bildbreite 64 mmb) Stereobetrachtung über Kreuz montierter oder projizierter Stereobilder, Konvergenz 15°,

Akkomodation je nach Projektionsabstand variabel, Bilddurchmesser beliebig


52

Für die direkte Betrachtung von Stereobildern gibt es zwei Möglichkeiten (Abb. 10.3):

a) mit seitenrichtig montierten Stereobildern , und

b) mit über Kreuz montierten Stereobildern.

1. Stereobetrachtung seitenrichtig montierter Stereobilder mit parallel gerichteten Augenachsen, also Konvergenz 0°.Die Breite der Bilder ist dabei wegen des Augenabstandes auf maximal 64 mm beschränkt. Der Betrachtungsabstandsei die konventionelle Sehweite 250 mm. Die "Kunst" besteht darin, bei Konvergenz 0° die Augenlinsen auf 250 mmLeseabstand zu akkomodieren, so daß beide Bilder zu einem scharf gesehenen räumlichen Bild verschmelzen. DiesesVerfahren ist verbreitet, z.B. in der wissenschaftlichen Literatur für die räumliche Darstellung chemischer Formeln,obwohl es neben seiner Beschränkung in der Größe und im Bildabstand auch aus physiologischen Gründengegenüber dem folgenden schwieriger ist.

2. Stereobetrachtung seitenvertauscht montierter oder projizierter Stereobilder mit konvergierenden Augenachsen, alsoüber Kreuz. Man sieht "über Kreuz" mit dem gewohnten Konvergenzwinkel (z.B ≤ 15°), die Akkomodation ist je nachBetrachtungsabstand variabel. Bildgröße, Projektionsabstand und Basis sind dabei in einem weiten Bereich praktischbeliebig (z.B. Hörsaal). Die Bilder verschmelzen leicht zu einem großen, scharfen, räumlichen Bild. Daher wird dieseBetrachtungsart, die allgemein weniger bekannt ist, gegenüber dem vorigen Verfahren sowohl aus physiologischenGründen als auch wegen ihrer sehr viel weiteren Anwendungsmöglichkeiten zur Einübung empfohlen.

3. Betrachtung seitenrichtig montierter Stereobilder über Kreuz. Betrachtet man seitenrichtig montierte Stereobilder überKreuz, so entsteht ein negativer räumlicher Eindruck. Vorn und Hinten im Objekt haben sich umgekehrt und wegender Vertauschung der Abstände erscheint auch das Objekt perspektivisch verzerrt und verfremdet.

10.4 Experimente

1. Betrachten eines Objekts im Stereomikroskop, Wechsel der Vergrößerung, Zoom-Wirkung

2. Herstellen von Stereoaufnahmen mit einer Kamera durch Verschieben des Objekts, Verschieben der Kamera oderKippen des Objekts.

3. "Daumensprung" als Richtungsmaß, Parallaxe

4. Künstliche Räumlichkeit beim Betrachten einer regelmäßigen Struktur "über Kreuz", z.B., Heizkörper, Ziegeldach,Zaun,

5. Projektion (Overhead-Folie, Dia-Paare, Stereophotos) oder Monitordarstellung von Stereobildern. Beispiele s. 0.

6. Stereomikroskopie mit polarisationsoptischen Mitteln

Mit einem normalen Mikroskop läßt sich auf relativ einfache Weise mittels Polfolien eine stereomikroskopischeDarstellung erzielen (Abb. 10.4):

Man erzeugt in der Aperturebene des Kondensors zwei spaltförmige Lichtquellen, indem man mit einem breiten Steg dieMitte der Aperturblende abdeckt. Auf diese Lichtquellen legt man ihrerseits je eine Polfolie mit gekreuztenDurchlaßrichtungen.

Dadurch wird das Objekt aus zwei Richtungen stereoskopisch beleuchtet und in der Aperturebene des Objektivsentstehen zwei Beugungsbilder mit unterschiedlicher Polarisation. Mit Hilfe von Polfolien in gekreuzter Position, inoder nahe der Zwischenbildebene, können dann wiederum zwei stereoskopisch unterschiedliche Bilder des Objektsbetrachtet werden:

a) mit geradem Monokulartubus und Kamera: Aufnahme zweier stereoskopischer Bilder durch Drehen der Polfolie

b)mit Binokulartubus: beide Okulare werden mit einer Polfolie versehen und diese gekreuzt ausgerichtet, so daß jedesAuge nur einen der beiden Strahlengänge sieht.

Einschränkungen: Die Spiegelungen an den Prismen des Binokulartubus reduzieren zum Teil wieder die Polarisation.Wegen der geringen und auch gerichteten Apertur bleibt die Anwendung auf gering vergrößernde Objektive und derEffekt auf große Strukturen innerhalb des Schärfentiefenbereichs beschränkt.


53

O'

A

O

A'

Abb. 10.4: Stereomikroskopie mittels Polarisation

10.5 Beispiele zur Stereodarstellung

(Reihenfolge nach Objektgröße bzw. Basislänge)

Anwendung/Beispiel Basis Bemerkung Abb. aus:Referenz

1. Chemische Formel nm Simulation [[1]]

2. Fibrinnetzwerk nm Elektronenmikroskopie, Kippen desObjekts

[[2]]

3. Broccoli Romanesco cm Drehen des Objekts, fraktale Struktur

4. Plazenta-Gefäße cm 3D-Datensatz (Rekonstruktion),fraktale Struktur

[[3]]

5. Im Park Kenrokuen in Kanazawa, Japan m 1 Schritt

6. Wolken 11 km über Novosibirsk km Aufnahme aus dem Flugzeug(4 s · 900 km/h = 1 km)

7. Entdeckung des Kometen Shoemaker-Levy 9 1 d Parallaxe der Kometenbewegung gegenden Fixsternhimmel

[[4]]

[1] Goldberg, J., Huang, H., Kwon, Y., Greengard, P., Nairn, A.C. und Kuriyan, J.; Nature 376: 745-53 (1995)[2] Baradet, T.C., Haselgrove, J.C. und Weisel, J.W.; Biophys J 68/4: 1551-1560 (1995)[3] Eibenstein, M.; Dissertation Gießen (1995[4] Levy, D.H., Shoemaker, E.M. und Shoemaker, C.S.; Sci Am: 69-75 (Aug. 1995)


54

1.

2.


55

3.

4.


56

5.

6.

7.

11. Reliefumkehr und räumliche Wahrnehmung

57

11 RELIEFUMKEHR UND RÄUMLICHE WAHRNEHMUNG

Aus der 2D-Abbildung einer 3D-Struktur rekonstruiert unser Gehirn aufgrund „gewisser Erfahrung“ einenräumlichen Eindruck des Objekts. Solange keine besonderen Erkennungsmerkmale überwiegen, wird derplastische Eindruck besonders von der uns gewohnten Einfallsrichtung des Lichtes „von oben“ diktiert. Lichtund Schatten werden für einen 3D-Eindruck, das Relief, so assoziiert, als ob das Objekt von oben her beleuchtetsei. Wechselt aber die Beleuchtungsrichtung oder die Betrachtungsrichtung um 180°, so gewinnt man denEindruck einer Reliefumkehr: positives wird negatives Relief. Das Gehirn läßt sich dadurch in derStrukturwahrnehmung - auch bei bekannten Objekten - sehr leicht täuschen, besonders eindrucksvoll aber, wenndie zu beschreibenden Strukturen und Maßstäbe unbekannt sind.

3 Beispiele:

1. Abb. 11.1: Spur im Sand, Eindruck einer Pfote. Vertieft oder erhaben?

2. Abb. 11.2: Gebirgslandschaft auf dem Mars. Was sind Berge, was sind Täler?

3. Abb. 11.3: Der Südpol des Mondes. Landschaft mit Kratern oder Buckeln?

Diese „Aufnahme“ ist in zweifacher Hinsicht ein unmögliches Bild:

a) Der Südpol wird von dem Satelliten auf einer polaren Umlaufbahn nie so gesehen, da das Gebietvon der Sonne jeweils nur aus einer einzigen Richtung seitlich beleuchtet wird. Das Bild isttatsächlich ein Kompositum aus Umläufen über einen ganzen Monat hinweg. Die radialeBeleuchtungsrichtung wandert dabei einmal um die Polachse des Mondes.

b) Wegen der wechselnden Beleuchtungsrichtung innerhalb des Bildes bedeutet dies aber, daß manin diesem Bild simultan gegenüberliegende Gebiete mit positivem Relief (Krater) und negativemRelief (Buckel) sehen muß, gleichgültig in welche Richtung man auch immer das Bild drehen mag.


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Abb. 11.1: Spur im Sand, Eindruck einer Pfote. Vertieft oder erhaben?


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Abb. 11.2: Gebirgslandschaft auf dem Mars. Was sind Berge, was sind Täler?


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11.3: Der Südpol des Mondes. Landschaft mit Kratern oder Buckeln?


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12. Digitale Bilderfassung

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12 DIGITALE BILDERFASSUNG

Zur digitalen Darstellung von mikroskopischen Bildern auf einem Computerbildschirm arbeiten wir mit einerdigitalen Kamera (Typ CCD der Marke Spindler & Hoyer) und der zugehörigen Videokarte und Software der FirmaFAST Multimedia AG.

Die Systemvoraussetzungen zur Installation sind ein IBM-AT oder kompatibler Rechner mit mindestens 386 SXProzessor und einem 16 Bit-Slot. Mindestens 4 MB Hauptspeicher sind empfohlen, wobei gerade für dieKompression grosser Bilder 8 MB Hauptspeicher empfehlenswert sind.

Die Videokamera wird auf den Phototubus des Mikroskops aufgesetzt und arbeitet mit der Videokarte zusammen,ist somit ein Echtzeit Video-Digitizer und unabhängig von der Grafikkarte. Die Screen Machine ist in der Lage, liveVideo in einem beliebigen Ausschnitt in frei wählbarer Position und Größe darzustellen, und ermöglicht ebensoeine Steuerung von Ton.

Die Darstellung der digitalisierten Bilder erfolgt in True Color (= 24 Bit Farbtiefe ≅ 16,7 Mio Farben). Das LiveVideo ist in True Color bei einer VGA-Auflösung von 1024 x 768 im non-interlaced und bis 1280 x 1024 iminterlaced Modus und voller PAL-Zeilenzahl integriert.

Mit der Screen Machine können nicht nur einzelne Bilder festgehalten werden, sondern kompletteVideosequenzen aufgenommen und gespeichert werden. Auch eine weitere grafische Aufarbeitung derAufnahmen ist möglich.

Eine weitere interessante Nutzungsmöglichkeit ist die digitale Auswertung solcher Aufnahmen, zum Beispiel dieErmittlung der Zellzahl mit Hilfe einer grafischen Auswertungssoftware. Als Beispiel sei hier das UTHSCASAImage Tool erwähnt, eine Software, die für Windows 95 und Windows NT entwickelt wurde. NähereInformationen zu diesem Programm und FTP sites sind unter folgender Internetadresse zu finden:

http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html

Abb. 12.1: Exemplarische Bildschirmansicht aus dem Bildanalyseprogramm Image Tool

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