Ziele und Fragenstellungen Zielsetzung

Die vorliegende Arbeit setzt sich zum Ziel, eine Methode zu finden, mit der

möglichst schnell und primär auch mit hoher Sensitivität sowie Spezifität

eine Penicillinase-Produktion bei S. aureus nachgewiesen werden kann..

Als Referenzmethode wird eine genotypische Methode, die blaZ-PCR

gewählt. Folgende Methoden werden dafür herangezogen:

1) Penicillin-Disk (10 Units) mit Interpretation gemäss CLSI (≥ 29 mm=S,

< 28 mm=R) und Beurteilung des Hemmhofrandcharakters

2) Penicillin-Disk (1 Unit) mit Interpretation gemäss EUCAST (≥ 26

mm=S, < 26 mm=R) und Beurteilung des Hemmhofrandcharakters

3) Nitrocefin-Test (Cefinase®)

4) Flüssig-Cefinase

5) Cloverleaf-Test

Desweiteren ist das Ziel die Gegenüberstellung der CLSI- und der

EUCAST-Richtlinien in Bezug auf das Vorgehen zur Detektion der

Penicillinase beim S. aureus.

Fragenstellung

1. Welcher dieser evaluierten Methoden ist für die Bestimmung der

Penicillinase die sensitivste, spezifischste und schnellste bezogen auf

die Referenzmethode PCR?

2. Welche der beiden obengenannten Richtlinien begünstigt die

Detektion der Penicillinase beim S. aureus?

Zusammenfassung Heute bilden in der Schweiz über 80% der Staphylococcus aureus-Stämme (S. aureus) eine Penicillinase. Diese ist verantwortlich für die Resistenz gegenüber Penicillin.

Das kodierende Gen für die Penicillinase heisst blaZ. Penicillin gilt als Mittel der Wahl gegen Penicillin-sensible S. aureus-Isolate ohne Penicillinase-Produktion. Eine sichere

Unterscheidung zwischen Penicillin-sensiblen und -resistenten S. aureus-Isolaten ist daher von grosser klinischer Bedeutung. Deshalb gilt es, eine zuverlässige

diagnostische Methode für die Detektion einer Penicillinase zu finden.

In dieser Arbeit wurden verschiedene phänotypische Methoden (Nitrocefin-Disk Test, Flüssig-Cefinase, Cloverleaf-Test und Agardiffusionstest inkl. Hofrandcharakter nach

CLSI- und nach EUCAST-Richtlinien) mit der Referenzmethode blaZ-PCR verglichen. Es handelt sich dabei um eine retrospektive Untersuchung mit 98 S. aureus-Isolate

aus der Stammsammlung des IFIK Bern, die Initial als "nicht Penicillinase-produzierend" berichtet wurden. Von diesen 98 Stämmen wiesen nur 4 das blaZ-Gen auf und

zwei der vier positiven Stämme wurden in keiner der ausgetesteten phänotyischen Methoden positiv.

Der Nitrocefin-Disk Test, die Flüssig-Cefinase und der Agardiffusionstest (nach CLSI) erzielten eine Sensitivität von 0%. Der Hofrandcharakter nach CLSI wies eine

Sensitivität von 25% auf. Über Nacht erzielte die Flüssig-Cefinase eine verbesserte Sensitivität von 50%. Der Agardiffusionstest inkl. Hofrandcharakter (nach EUCAST) und

der Cloverleaf-Test zeigten eine Sensitivität von 50%. Die Spezifität fiel bei allen Methoden zu 100% bzw. beim Hofrandcharakter (nach EUCAST) zu 98.88% aus.

Der Cloverleaf-Test und der Agardiffusionstest (nach EUCAST) könnten unter gewissen Umständen routinemässig eingesetzt werden.

Diskussion Verglichen mit der Referenzmethode blaZ-PCR stellen sich in dieser Arbeit der Agardiffusionstest nach EUCAST mit dem Penicillin-Disk von 1 Unit (inkl. Bewertung des

Hemmhofrandcharakters) und der Cloverleaf-Test als relativ sensitive und spezifische phänotypische Methoden heraus. Beide Methoden sind unkompliziert in der Durchführung

und können mit etwas Übung sicher abgelesen werden. Als einziger Nachteil ist die Bebrütungsdauer von ca. 16 Stunden zu bemängeln.

Der Nitrocefin-Disk Test und die Flüssig-Cefinase sind obschon der Schnelligkeit für die Routine weniger geeignet, da diese Methoden einige falsch negative Resultate

erzielten.Das Fazit welches bezüglich der CSLI- und der EUCAST-Richtlinien gemacht werden kann, befürwortet das Arbeiten mit den EUCAST-Richtlinien, weil dadurch die

Detektion der Penicilinase begünstigt wird. Die Bedeutsamkeit eine möglichst schnelle, sensitive und spezifische Methode zur Detektion einer Penicillinase in S. aureus zu

finden, konnte trotz der geringen Anzahl an blaZ-positiven S. aureus-Isolaten (N=4) gezeigt werden.

Das Resultat ist aufgrund der wenigen blaZ-positiven S. aureus Isolaten statistisch nicht relevant. Dennoch ist die Dringlichkeit der Thematik erkennbar und gewisse Tendenzen

können erkannt werden.

Material, Methodik, Vorgehen Die 98 S. aureus-Patientenisolate werden mit 4 verschieden Methoden auf

die Penicillinase geprüft. Das Prinzip des Nitrocefin-Disk Tests und der

Flüssig-Cefinase beruht auf einem Farbumschlag. Ist die Penicilinase

vorhanden wird eine Säure freigesetzt und es erscheint die Farbe Rot. Der

Cloverleaf-Test zeigt bei Vorhandensein der Penicillinase ein

Kleeblattmuster. Beim Agardiffusions-Test wird mit einem Penicillin-Disk 1

und 10 Units gearbeitet. Es wird der Hemmhofdurchmesser wie auch der

Hemmhofrandcharakter beurteilt. Die Auswertung erfolgt beim Penicillin-

Disk 10 Units nach CLSI und beim Penicillin-Disk nach EUCAST.

Für den Nachweis, ob das gesuchte Gen blaZ in den S. aureus-Stämmen

ist, wird das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) genutzt. Die

phänotypische Expression des Gens, kann jedoch nicht garantiert werden.

Einleitung

S. aureus ist ein gram-positives, fakultativ anaerobes, rundlich bis ovales

Bakterium. Das Bakterium kommt weltweit vor und kann sowohl Mensch

wie auch Tier besiedeln. Etwa 20-50% der humanen Bevölkerung sind

Träger des S. aureus. Die Übertragung des Keimes geschieht

hauptsächlich durch Schmierinfektionen. Vor allem in Spitälern kann sich

der Keim durch Pflegepersonal oder Ärzte unbemerkt auf Patienten

übertragen. Dies führt zu den sogenannten nosokomialen Infektionen. (Nagel, 2015.)

Beta-Laktam-Antibiotika zählen zu den wichtigsten Antibiotika-Klassen. Zu

den Beta-Laktam-Antibiotika zählt auch die Substanzklasse Penicilline. Es

wirkt bakterizid, indem es in die Zellwandbiosynthese eingreift und so eine

Quervernetzung der Transpeptidase verhindert. Die Bakterien haben

jedoch im Laufe der Zeit verschiedene Resistenzmechanismen entwickelt,

um sich gegen Antibiotika zu schützen. Dazu gehören auch die Enzyme β-

Laktamasen. Durch diese Enzyme verliert das Antibiotikum seine Wirkung.

Penicillinasen gehören einer Untergruppe der β-Laktamasen. Sie werden

durch die Abgabe der Penicilline in S. aureus hervorgerufen. Das Gen, auf

welchem die Penicillinase codiert heisst blaZ. Kann bei S. aureus eine

Penicillinasebildung ausgeschlossen werden, ist Penicillin die Therapie

der Wahl. Deshalb ist eine sichere Unterscheidung zwischen Penicillin-

sensiblen und –resistenten S. aureus-Isolaten von grosser Bedeutung. (Lenga S., 2010)

Es gibt zwei wichtige Richtlinien, nach welchem ein Mikrobiologielabor eine

Resistenzprüfung durchführen kann. Dies ist CLSI und EUCAST.

Ergebnisse/ Resultate Von den 98 untersuchten Stämmen zeigten vier ein Vorhandensein des

blaZ-Gens. Daraus folgt, dass von den total 98 S.aureus-Stämmen (100%),

vier (3.92) blaZ-Gen Träger sind. In der Tabelle sind die Sensitivität sowie

die Spezifität der phänotypischen Methoden, berechnet anhand der

Referenzmethode blaZ-PCR.

Phänotypische

Methode Sensitivität

Richtig

positive

N=4

Spezifität

Nitrocefin-Disk Test 0% 0 100%

Flüssig-Cefinase nach 1

Std. 0%

0 100%

Flüssig-Cefinase über

Nacht 50% 2 100%

Cloverleaf-Test 50% 2 100%

Hemmhofdurchmesser

mit

Penicillin-Disk 10Units

0% 0 100%

Hemmhofdurchmesser

mit

Penicillin-Disk 1Unit

50% 2 100%

Hofrandcharakter mit

Penicillin-Disk 10Units 25% 1 100%

Hofrandcharakter mit

Penicillin-Disk 1Unit 50% 2 98.88%

Nitrocefin-Disk Test Flüssig-Cefinase

Cloverleaf-Test Agardiffusions-

Test

Referenzmethode

PCR

(Eigene Abbildungen)

Natascha Wymann BMA 12-15, 11.09.2015 IFIK Bakteriologie Bern Quellen: Nagel, G. [Stand 22.03.2015] Staphylococcus aureus, http://www.onmeda.de/krankheitserreger/staphylococcus_aureus.html

Lenga S,. 2010,: S.10-12l Dissertation. http://www-brs.ub.ruhr-uni-bochum.de/netahtml/HSS/Diss/LengaSarahMagdalena/diss.pdf