Stressreaktion des Pankreas Hat die Hämoxygenase-1 (HSP32 ... · Pankreatitis anhand spezifischer...

Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik II-Großhadern

der Ludwig-Maximilians-Universität München

Direktor: Prof. Dr. med. B. Göke

Stressreaktion des Pankreas

Hat die Hämoxygenase-1 (HSP32) eine protektive Wirkung auf die akute

experimentelle Pankreatitis?

Dissertation

zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin

an der Medizinischen Fakultät der

Ludwig-Maximilians-Universität zu München

vorgelegt von

Tobias Gebhardt

aus

Wiesbaden

München 2007

Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät

der Universität München

Berichterstatter: Prof. Dr. A. Wagner

Mitberichterstatter: Prof. Dr. T. Hoffmann Prof. Dr. R. Gärtner

Mitbetreuung durch den promovierten Mitarbeiter: PD Dr. med. C. Schäfer

Dekan: Prof. Dr. med. D. Reinhardt

Tag der mündlichen Prüfung: 19.04.2007

Meinen Eltern Gisela und Dieter,

welche mir gemeinsam mein Studium ermöglicht haben,

in Liebe und Dankbarkeit gewidmet.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis IV Tabellenverzeichnis VI

1. Gegenstand und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 1 2. Einleitung und Grundlagen 4

2.1. Anatomie und Physiologie des Pankreas..................................................... 4 2.1.1. Allgemeine Anatomie ........................................................................ 4 2.1.2. Allgemeine Physiologie..................................................................... 5 2.1.3. Exokrines Pankreas und dessen funktionelle Anatomie ................... 5 2.1.4. Physiologie des exokrinen Pankreas ................................................ 6

2.2. Ätiologie und Pathogenese der akuten Pankreatitis .................................... 9 2.2.1. Ätiologie ............................................................................................ 9 2.2.2. Pathophysiologische Modelle und Pathogenese der Pankreatitis .. 10 2.2.3. Pathophysiologische Vorgänge in der Frühphase .......................... 12

2.2.3.1. Sekretorische Blockade ..................................................... 13 2.2.3.2. Frühzeitige intrazelluläre Trypsinaktivierung...................... 13 2.2.3.3. Immunologische Reaktion im Rahmen der akuten

Pankreatitis ........................................................................ 17 2.3. Oxidativer Stress und zellulärer Schutz ..................................................... 18 2.4. Hitzeschockproteine................................................................................... 19

2.4.1. Expression und Aufgabe von Hitzeschockproteinen....................... 19 2.4.2. Hitzeschockproteingruppen............................................................. 20 2.4.3. Genetische Regulation der HSP-Synthese..................................... 22 2.4.4. Induktion von Hitzeschockproteinen im Pankreas .......................... 22

2.5. Hämoxygenase-1 (HO-1/HSP32)............................................................... 23 2.5.1. Charakterisierung der Hämoxygenase............................................ 23 2.5.2. Formen und Funktionen der Hämoxygenase.................................. 24 2.5.3. Struktur der Porphyrine und Einfluß von synthetischen

Metalloporphyrinen wie Kobalt-Protoporphyrin (CoPP) .................. 26 2.5.4. Die Hämoxygenase als ein protektives Protein............................... 28

3. Ergebnisse 31 3.1. Proteinexpression und Regulation von Hitzeschock-Proteinen im

Pankreas......................................................................................... 31 3.1.1. Nachweis verschiedener HSPs im Pankreashomogenat nativ und

nach Hyperthermie-Präkonditionierung........................................... 31 3.1.2. CoPP induziert die HSP32-Expression im Pankreas ...................... 35 3.1.3. Auswirkungen von Caerulein und Caerulein-induzierter

Pankreatitis auf die HSP-Expression .............................................. 41

Inhaltsverzeichnis

II

3.2. Biochemische Messungen und statistische Analysen................................ 45 3.2.1. Einfluss der Präkonditionierung auf die Trypsinaktivität in

Pankreashomogenaten................................................................... 47 3.2.1.1. Validierung der Trypsinbestimmung................................... 47 3.2.1.2. Bestimmung von Trypsin in Pankreashomogenaten.......... 49

3.2.2. Einfluss der Präkonditionierung auf die Sekretion von Lipase und Amylase .......................................................................................... 50

3.2.3. Ödembildung und relativer Wassergehalt ....................................... 53 3.3. Histologische und makroskopische Morphologie ....................................... 54

4. Diskussion 61 5. Zusammenfassung 71 6. Methoden 72

6.1. Präkonditionierungen ................................................................................. 72 6.1.1. Präkonditionierung durch Hyperthermie.......................................... 72 6.1.2. Präkonditionierung durch CoPP...................................................... 72

6.2. Organentnahme des Pankreas zur Analyse der Proteinexpression .......... 73 6.3. Induktion einer akuten experimentellen Pankreatitis.................................. 74 6.4. Pankreasödem ........................................................................................... 75 6.5. Enzymaktivitätsmessungen........................................................................ 75

6.5.1. Enzymaktivitätsmessung von Amylase........................................... 75 6.5.2. Enzymaktivitätsmessung von Lipase .............................................. 76 6.5.3. Bestimmung von Trypsin in Pankreashomogenaten....................... 78

6.6. Western-Blotting zum Proteinnachweis ..................................................... 80 6.6.1. Erstellung von Zellproben ............................................................... 80 6.6.2. Quantitative Proteinbestimmung..................................................... 81 6.6.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese........................................... 81 6.6.4. Transfer der Proteine auf Nitrozellulose.......................................... 82 6.6.5. Immunchemischer Nachweis von Proteinen................................... 83 6.6.6. Immunchemischer Nachweis von unterschiedlichen Proteinen

auf gleicher Nitrozellulosemembran (Stripping) .............................. 83 6.7. Histologische Untersuchungen .................................................................. 84

6.7.1. Hämatoxylin/Eosin-Färbung............................................................ 84 6.8. Statistische Auswertungen......................................................................... 84

7. Materialien 86 7.1. Chemikalien und Reagenzien .................................................................... 86

7.1.1. Narkose (Hyperthermie).................................................................. 86 7.1.2. Caeruleinpankreatitis ...................................................................... 86 7.1.3. Protein-Bestimmung ....................................................................... 86 7.1.4. Hämatoxylin/Eosin-Färbung (Histologie)......................................... 86

Inhaltsverzeichnis

III

7.1.5. Amylase-Bestimmung ..................................................................... 87 7.1.6. Lipase-Bestimmung ........................................................................ 87 7.1.7. Trypsin-Bestimmung ....................................................................... 87 7.1.8. SDS-Probenaufbereitung................................................................ 88 7.1.9. Western-Blotting ............................................................................. 91

7.2. Technische Geräte und Materialien ........................................................... 94 7.2.1. Technische Geräte.......................................................................... 94 7.2.2. Materialien ...................................................................................... 95

7.3. Versuchstiere ............................................................................................. 95 8. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 96 9. Literaturverzeichnis 99 10. Danksagung 121 11. Lebenslauf 122

Abbildungsverzeichnis

IV

Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Anatomische Verhältnisse des Pankreas ............................................. 4 Abb. 2 Azinuszelle mit Schaltstücken und Ausführungsgang .......................... 6 Abb. 3 Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Azinuszelle ...................... 7 Abb. 4 Pathophysiologische Phänomene in der Frühphase der akuten

Pankreatitis ......................................................................................... 13 Abb. 5 a/b Physiologische Schutzmechanismen vor Selbstverdauung und

Störungen bei hereditärer Pankreatitis ............................................... 14 Abb. 6 Immunantwort im Rahmen einer akuten Pankreatitis ......................... 17 Abb. 7 Katalytische Reaktion der Hämoxygenase ......................................... 24 Abb. 8 Nomenklatur der Porphyrine ............................................................... 27 Abb. 9 Cobalt (III) Protoporphyrin IX chloride [C34H32CoN4O4Cl] ................... 28 Abb. 10 Darstellung der Spezifität der Antikörper und der Einfluss von

Hyperthermie auf die Expression von HSP32 und HSP70 im Pankreas und der Leber ..................................................................... 32

Abb. 11 Einfluss von Hyperthermie auf die Expression von HSP25/27 im Pankreas und der Leber ..................................................................... 34

Abb. 12 Einfluss der Präkonditionierung mit CoPP auf die Induktion von HSP32 im Vergleich mit HSP70 ......................................................... 35

Abb. 13 Dosisabhängige Induktion von HSP32 durch CoPP- Präkonditionierung (Dose response) .................................................. 37

Abb. 14 a/b Einfluss von Hyperthermie und CoPP im Vergleich auf HSP25/27 und 32 im Pankreas............................................................................ 38

Abb. 15 Die Induktion von HSP25 nach CoPP-Präkonditionierung mit steigender Dosis ................................................................................. 40

Abb. 16 Auswirkung von Caerulein, Hyperthermie und CoPP auf das Expressionsmuster von HSP32 und HSP70 im Vergleich .................. 42

Abb. 17 Western Analyse mit Anti-HSP32 und die Auswirkungen von Trägerlösungen auf die HSP32-Expression ....................................... 44

Abb. 18 Messung der Zunahme der Fluoreszenz bei definierten Standard-Trypsinkonzentrationen ...................................................................... 48

Abb. 19 Kalibriergerade aus den ermittelten Steigungen der Standardkonzentrationen.................................................................... 48

Abb. 20 Trypsinaktivität im Pankreasgewebe .................................................. 49 Abb. 21 Aktivität der Lipase im Serum der Versuchstiere ................................ 51 Abb. 22 Aktivität der Amylase im Serum der Versuchstiere............................. 52 Abb. 23 Relativer Wassergehalt des Pankreas (Feuchtgewicht) ..................... 53 Abb. 24 Darstellung des OP-Situs eines Tieres ohne CoPP-Präkonditionierung

nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis ............................. 55 Abb. 25 Darstellung des OP-Situs eines Tieres ohne CoPP-Präkonditionierung

nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis ............................. 56

Abbildungsverzeichnis

V

Abb. 26 Darstellung des OP-Situs eines durch CoPP-Präkonditionierung vorbehandelten Tieres nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis ......................................................................................... 57

Abb. 27 Darstellung des OP-Situs eines durch CoPP-Präkonditionierung vorbehandelten Tieres nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis ......................................................................................... 58

Abb. 28 Darstellung von nativem Pankreasgewebe eines Versuchstieres ...... 59 Abb. 29 Darstellung von Pankreasgewebe eines Versuchstieres 6h nach

Caerulein-induzierter Pankreatitis....................................................... 59 Abb. 30 Darstellung von Pankreasgewebe eines Versuchstieres 6h nach

Caerulein-induzierter Pankreatitis und 24h nach CoPP-Präkonditionierung.............................................................................. 60

Abb. 31 Reaktion des Lipase-Farbtests ........................................................... 77 Abb. 32 Berechnung der Lipaseaktivität .......................................................... 77 Abb. 33 Fluorimetrische Umsetzung des Substrats durch Trypsin .................. 79

Tabellenverzeichnis

VI

Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Häufigste Faktoren und Ursachen als Auslöser einer Pankreatitis....... 9 Tabelle 2 Die bekanntesten und wichtigsten Gruppen der Hitzeschock-

Proteine .............................................................................................. 21 Tabelle 3 Übersicht über die Isoformen der Hämoxygenase ............................. 26 Tabelle 4 Verdünnungen der verwendeten Antikörper zum

immunochemischen Nachweis der HSPs ........................................... 31 Tabelle 5 Vorbehandlungen der Versuchstiere in einzelnen

Versuchsgruppen................................................................................ 45 Tabelle 6 Verwendete Reagenzien in einzelnen Versuchsgruppen ................... 73 Tabelle 7 Reagenzien des enzymatischen Farbtests (nach Roche) .................. 76 Tabelle 8 Darstellung der eingesetzten Standardtrypsinkonzentrationen .......... 80 Tabelle 9 Darstellung der Zusammensetzung der Sammel- und Trenngele ...... 82

Kapitel 1 Gegenstand und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

1

1. Gegenstand und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

Die akute Pankreatitis ist in den Industrieländern eine relativ häufig vorkommende

Erkrankung des Pankreas mit einer Inzidenz von 20 bis 100 Fällen pro 100.000

Menschen jährlich.

Das Ursachenspektrum ist breit gefächert (s. Abschnitt 2.2.1.) und der

Krankheitsverlauf in mehr als ¾ der Fälle mild und selbstlimitierend. In etwa 20 bis

30% der Fälle kommt es zu einem schweren Verlauf mit systemischen

Komplikationen, die nicht selten zu einem letalen Ausgang führen [Nam und Murthy

2003]. Das Verständnis der Pathophysiologie der Pankreatitis hat durch neuere

Forschungsergebnisse der letzten Jahre bedeutend zugenommen. Es wurden zwar

in den letzten Jahren Konzepte etabliert, wie z.B. die sekretorische Blockade, die

frühzeitige intrazelluläre Trypsinaktivierung oder andere pathologische Vorgänge (s.

Abschnitt 2.2.3.), dennoch gibt es bislang keine Möglichkeit, den Verlauf einer

Pankreatitis vorherzusagen und es steht auch keine kausale Therapie zur

Verfügung. Im Vordergrund der Therapie stehen daher rein symptomatische

Ansätze wie Schmerz- und Volumentherapie, sowie die Therapie von

Komplikationen.

Die Arbeitsgruppe Pankreas der Medizinischen Klinik II des Klinikums Großhadern

erforscht die Stressreaktion des Pankreas, mit dem Ziel, durch die

Charakterisierung der Stressreaktion des Pankreas weiterführende Erkenntnisse

zum Verständnis der Pathophysiologie der Pankreatitis und damit Ansatzpunkte für

eine adäquate Therapie zu erarbeiten.

Es können offensichtlich mehrere Hitzeschockproteine (HSPs) im Pankreas durch

Präkonditionierung mit verschiedenen Methoden induziert werden, so dass sich die

Frage nach der Bedeutung individueller HSPs in diesem Organ stellt. Es finden sich

in der Literatur zumindest zahlreiche Hinweise dafür, dass verschiedene

Hitzeschockproteine in anderen Systemen protektive Wirkung zeigen, wobei der

genaue Mechanismus immer noch nicht gut verstanden ist.

Durch die eingehende Untersuchung der Stressreaktion konnte bereits gezeigt

werden, dass Hitzeschockproteine, wie z.B. HSP27 oder HSP70, im Tiermodell

gegenüber einer akuten Pankreatitis protektiv wirken [Kubisch et al. 2004, Schäfer


2

et al. 2005] und dass verschiedene Präkonditionierungen, wie zum Beispiel die

Hyperthermie-Präkonditionierung und auch die akute Pankreatitis selbst (s.

Abschnitt 2.4.4.), zur Expression von Hitzeschockproteinen, wie zum Beispiel

HSP70, im Pankreas führen [Wagner et al. 1996].

Die Expression wird durch Stress in großen Mengen induziert und die

Überexpression führt zu erhöhter Widerstandsfähigkeit gegenüber Hitze oder

anderen Stressfaktoren in einer Reihe von Zellinien [Kubisch et al. 2004]. HSP27 ist

offensichtlich an der Regulation des Zytoskeletts, insbesondere des Aktins, beteiligt,

indem die Überexpression zu einer Stabilisierung der Aktin-Mikrofilamente führt

[Schäfer et al. 1999, Kubisch et al. 2004].

Neben der Untersuchung von HSP27 und HSP70, die nicht Bestandteil der

vorliegenden Arbeit sind, steht besonders HSP32 (Hämoxygenase-1) [Ewing und

Maines 1991] und dessen Bedeutung im Rahmen der akuten Pankreatitis im

Vordergrund. Dies gilt nicht zuletzt deshalb, weil dieses Hitzeschockprotein relativ

gut definierte und biochemisch beeinflussbare Funktionen hat, so dass die selektive

Hemmung und Aktivierung dieses HSPs Aussagen bezüglich seiner Bedeutung für

die Stressreaktion bei der Pankreatitis zulassen. Auch ist der Einfluss auf die akute

Pankreatitis anhand spezifischer Parameter, wie Enzymaktivitäten (Amylase,

Lipase, Trypsin) oder morphologische Veränderungen (Histologie, Ödembildung),

gut im Verlauf zu dokumentieren und soll in dieser Arbeit untersucht werden.

Im Pankreas wird HSP32/HO-1 in der Spätphase durch Caerulein induziert [Fu et al.

1997, Sato et al. 1997]. Es existieren allerdings keine Daten zur Induktion in der

Frühphase der akuten Pankreatitis oder zur Induktion durch Hyperthermie. Durch

zuletzt genannte Methode lassen sich Vergleiche zu anderen HSPs, wie z.B. HSP27

oder HSP70, welche in unserer Arbeitsgruppe eingehender Untersucht wurden,

ziehen [Kubisch et al. 2004, Ploessl et al. 2005, Schäfer et al. 2005].

Untersuchungen über mögliche protektive Effekte der HO-1 im Pankreas liegen

ebenfalls nicht vor. Da die HO-1 zur Anhäufung antioxidativ wirkender Metabolite

wie Biliverdin und Bilirubin führt [Elbirt und Bonkovsky 1999], erscheint eine wichtige

Rolle der HO-1 für die Stressreaktion bei der akuten Pankreatitis zumindest

aufgrund theoretischer Erwägungen durchaus plausibel, da oxidativer Stress bei der

Entstehung der akuten Pankreatitis sehr wahrscheinlich eine wichtige Rolle spielt

[Schulz et al. 1999]. Sauerstoffradikale können mit einer Vielzahl von zellulären


3

Molekülen wie Lipiden und Proteinen interagieren und zu Funktionsbeeinträchtigung

führen. Nachdem oxidativer Stress sehr wahrscheinlich einen wichtigen

Pathomechanismus bei der Entstehung der akuten Pankreatitis, zumindest im

Tiermodell darstellt, ist die Funktion der HO-1, Zellen vor oxidativem Stress zu

schützen, folglich sehr interessant (s. Abschnitt 2.3.).

Darüber hinaus lässt sich die HO-1, im Unterschied zu anderen

Hitzeschockproteinen, biochemisch mit verschiedenen Porphyrinen entweder

hemmen (Zink-Protoporphyrin, Zinn-Protoporphyrin) oder aktivieren (Kobalt-

Protoporphyrin) (s. Abschnitt 2.5.3.) und ist dadurch gut regulierbar [Amersi et al.

1999]. Diese Induktionsmöglichkeit stellt sich im Gegenzug bei anderen HSPs (z.B.

HSP70) nicht dar, so dass sich hier eine sehr spezifische Darstellung der

Auswirkungen und der Effekte auf die akute Pankreatitis, sowie der

pharmakologischen Induktionsmöglichkeit bietet, welche im Weiteren dargestellt

werden soll.

Kapitel 2 Einleitung und Grundlagen

4

2. Einleitung und Grundlagen 2.1. Anatomie und Physiologie des Pankreas

2.1.1. Allgemeine Anatomie

Die Bauchspeicheldrüse (Pankreas) als zentrales Organ für die Verdauung und die

Regulation des Blutzuckers ist eine exokrine und endokrine Drüse und liegt

retroperitoneal in Höhe des zweiten Lendenwirbels hinter dem Magen. Sie gliedert

sich in Kopf (Caput), Körper (Korpus) und Schwanz (Cauda). Der Kopf liegt im

oberen Anteil des Duodenum, dem duodenalen C, das dünnere Ende mit dem

Pankreasschwanz im Bereich des Milzhilus. Ihr Gewicht ist etwa 70 g bis 90 g, sie

ist knapp 15 bis 20 cm lang, aber nur etwa 3 cm dick.

Abb. 1 Anatomische Verhältnisse des Pankreas

In der Bauchspeicheldrüse befinden sich kleine Drüsenläppchen, die das

Pankreassekret produzieren. Die Drüsenläppchen geben das Sekret in feine Gänge

ab, die sich zur Mitte der Bauchspeicheldrüse hin in einen großen

Hauptausführungsgang, den Ductus pancreaticus, vereinen. Dieser Pankreasgang

mündet zu 80% mit dem Ausführungsgang der Gallenblase in die Papilla vateri

(Papilla duodeni major) des Duodenums und ist von einer zarten Kapsel aus

kollagenem Bindegewebe umgeben. Die Blutversorgung erfolgt durch zahlreiche

kleinere Äste der Arteria mesenterica superior und des Truncus Coeliacus

(A. splenica, A. gastroduodenalis).


5

2.1.2. Allgemeine Physiologie

Das Pankreas ist ein zentrales Organ für die Verdauung und die Regulation des

Blutzuckers und lässt sich funktional in zwei Einheiten unterteilen: den exokrinen

Teil, dessen funktionelle Untereinheit die Azinuszellen sind und den endokrinen Teil,

der inselartig in den exokrinen Teil eingelagert ist und deshalb auch als Inselorgan

bezeichnet wird. Der endokrine Teil ist essentiell an der Regulation des Blutzuckers

beteiligt. In verschiedenen Zelltypen werden dafür Hormone gebildet und in die

Blutbahn abgegeben. A-Zellen produzieren Glucagon, das bei niedriger

Blutzuckerkonzentration ausgeschüttet wird und einen Abbau von Glycogen zu

Glucose in der Leber und damit eine Erhöhung des Blutzuckers bewirkt. Der

Gegenspieler dazu ist das Insulin, das bei hohen Blutzuckerkonzentrationen

ausgeschüttet wird und eine Aufnahme von Glucose aus dem Blut in die Zellen

bewirkt. Dabei ist für die vorliegende Arbeit der endokrine Anteil des Pankreas nicht

von Bedeutung.

Das exokrine Pankreas ist zuständig für die Synthese von Verdauungsenzymen und

für die Sekretion des Verdauungssaftes in das Duodenum. Dieser Saft setzt sich

aus einer Vielzahl an Eiweiß, Kohlenhydrat und Lipid abbauenden Enzymen sowie

Bicarbonat, das für die Neutralisation des sauren Magensafts zuständig ist,

zusammen.

2.1.3. Exokrines Pankreas und dessen funktionelle Anatomie

Das exokrine Pankreas des Menschen ist eine seröse, lobulär gegliederte Drüse.

Diese Lappen wiederum sind aus kleineren Lobuli zusammengesetzt, die mehrere

Gangverzweigungen enthalten, an deren Enden sich beerenförmige

Drüsenendstücke, die so genannten Azinuszellen, angliedern. Diese stellen die

morphologische und funktionelle Grundeinheit dar (s. Abb. 2).

Die pyramidenförmige Azinuszelle ist ungefähr 12-15 µm hoch und begrenzt mit

ihrer durch Mikrovilli besetzten apikalen Membran das Azinuslumen. Die

hauptsächlich apikal körnige Struktur ist bedingt durch die azidophilen

Zymogengranula. Deren Menge ist vom Funktionszustand der Zelle abhängig.

Die Azini sind dicht nebeneinander gepackt, das azinäre Lumen variiert im

Durchmesser in Abhängigkeit der Sekretionsphase. Im Interstitium der

benachbarten Azini befinden sich Fibrozyten, zwischen denen eingebettet die

Aufzweigungen der Blutgefäße und der Nerven verlaufen. Diese enden mit ihren


6

Synapsen an der basalen Plasmamembran der azinären Zelle, wobei sie von deren

Basallamina umhüllt werden. Jeder Azinus ist über das Schaltstück mit den

intralobulären und den in Bindegewebssepten verlaufenden interlobulären Gängen

verbunden. Die Schaltstücke sind relativ lang und münden direkt in die

Ausführungsgänge (s. Abb. 2).

Abb. 2 Azinuszelle mit Schaltstücken und Ausführungsgang

Die Ausführungsgänge bestehen aus einem allmählich an Höhe zunehmenden

prismatischen Epithel. Sie beginnen bereits intralobulär, die großen interlobulären

Gänge besitzen in der breiten bindegewebigen Hülle kleine, in die

Ausführungsgänge mündende, mukoide Drüsen. Die multiplen Ausführungsgänge

führen schließlich in den Hauptausführungsgang, den Ductus pancreaticus, der in

der Pars descendens des Duodenums auf der Papilla duodeni major mündet. Ein

sehr variabler akzessorischer Ductus pancreaticus accessorius mündet in den

Hauptgang oder selbständig in das Duodenum [Bockman et al. 1983, Ingbar 1993].

2.1.4. Physiologie des exokrinen Pankreas

Die Hauptfunktion des exokrinen Pankreas und der pankreatischen Azinuszellen ist

die Synthese, Speicherung und Sekretion von Verdauungs- und anderen Enzymen.

Das Pankreas des Menschen bildet täglich ca. 1,0 l bis 1,5 l blutisotones Sekret.


7

Das Sekret hat einen pH von 8,0 bis 8,4 und enthält Wasser, Elektrolyte wie Natrium

und Kalium, Anionen (Hydrogencarbonat, bis zu 125 mmol/l) und Enzyme, wie

Peptidasen (Trypsin (Trypsinogen), Chymotrypsin (Chymotrypsinogen), Carboxy-

peptidase), Lipasen (Lipase, Phospholipasen, Cholinesterase), Ribonukleasen und

α-Amylase.

Die Verdauungs- bzw. Proenzyme werden im Endoplasmatischen Retikulum

synthetisiert und von dort zum Golgi-Apparat transportiert. Die intrazelluläre

Speicherung der Enzyme erfolgt in so genannten Zymogengranula, die

membranumgebene Speicherorganellen darstellen. Hormone wie Cholezystokinin

oder Sekretin und der Neurotransmitter Acetylcholin bewirken eine Fusion der

Zymogengranulamembran mit der apikalen Plasmamembran der Azinuszelle,

wodurch es schließlich zur Exozytose der Enzyme in die Lumina der Azini kommt,

gleichzeitig findet eine intensive Neusynthese statt [Williams 1995, Williams et al.

1997].

Abb. 3 Elektronenmikroskopische Aufnahme einer Azinuszelle

Aufnahme einer Azinuszelle mit deutlich erkennbaren fusionierten Granula

Die Sekretion der Verdauungsenzyme erfolgt nach Stimulation von spezifischen

Rezeptoren, die an der basolateralen Membran der Azinuszelle lokalisiert sind und


8

durch Hormone wie z.B. Acetylcholin oder CCK stimuliert werden. Für die Induktion

der experimentellen Pankreatitis bei Tieren wird häufig das CCK-Analogon

Caerulein verwendet. Beim Menschen werden die CCK-Effekte überwiegend über

neuronale Einflüsse vermittelt. Es gibt Hinweise darauf, dass beim Menschen ein

erheblicher Anteil der CCK-Rezeptoren nicht auf Azinuszellen, sondern auf

präsynaptischen cholinergen Neuronen lokalisiert ist [Adler et al. 1991, Niederau et

al. 1994].

Üblicherweise unterteilt man die exokrine Pankreassekretion in eine interdigestive

(basale) und in eine digestive (prandiale bzw. postprandiale) Phase. Die

interdigestive Sekretion findet man bei Nahrungskarenz bzw. dann, wenn die

aufgenommene Nahrung bereits vom Magen verdaut und von Jejunum und Ileum

resorbiert worden ist. Sie ist charakterisiert durch zyklische Aktivitätsschwankungen,

assoziiert mit dem Rhythmus der interdigestiven Motilität des oberen

Gastrointestinaltraktes. Die digestive Phase setzt schon vor der eigentlichen

Nahrungsaufnahme ein, nämlich bereits bei Vorstellung, Geruch und Anblick von

Speisen. Bei unmittelbarem Kontakt des Magens und des Dünndarms mit der

Nahrung bzw. mit dem Chymus wird sie verstärkt. Sie ist gekennzeichnet durch die

Ausschüttung großer Mengen an Wasser, Hydrogencarbonat und

Pankreasenzymen [Singer 1983].

Die Kontrolle über die Sekretion des exokrinen Pankreas unterliegt also neuralen,

hormonalen und auch parakrinen Mediatoren [Solomon 1987]. Unter

physiologischen Bedingungen existiert folglich im Gesamtorganismus eine Vielzahl

an stimulatorischen und inhibitorischen Regulationsmechanismen der

Pankreasfunktion. Diese bestimmen im Zusammenspiel die sekretorische Leistung

des exokrinen Pankreas insgesamt [Singer 1983]. Das normale exokrine Pankreas

zeigt folglich nicht eine konstitutive, sondern eine regulierte Sekretion, bei der die

Sekretionsprodukte in Abhängigkeit von extrazellulären Einflüssen synthetisiert und

nach Modifikation innerhalb der intrazellulären Kompartimente in die

Zymogengranula verpackt und exozytotisch freigesetzt werden [Palade 1975]. Über

transmembranöse und intrazelluläre Signalvermittlung erfolgt so eine Adaptation der

exokrinen Pankreasfunktion an die kurzfristigen, aber auch langfristigen

Veränderungen der Umweltbedingungen, wie beispielsweise die Zusammensetzung

der Nahrung [Morisset und Webster 1972, Webster et al. 1972, Kotler und Levine

1979].


9

2.2. Ätiologie und Pathogenese der akuten Pankreatitis

2.2.1. Ätiologie

Der Begriff „akute Pankreatitis“ beschreibt eine Vielzahl unterschiedlicher

Entzündungsformen des exokrinen Pankreas, die sich hinsichtlich Klinik,

Morphologie und Ätiologie unterscheiden, wobei viele pathogenetische Faktoren, die

den Verlauf dieser Erkrankung beeinflussen, zum größten Teil noch unbekannt sind.

Tabelle 1 Häufigste Faktoren und Ursachen als Auslöser einer Pankreatitis

Metabolisch Alkohol

Medikamente (z.B. Thiazide, Diuretika)

Hypertriglizidämie / Hyperlipoproteinämie

Hyperkalzämie

Genetische Ursachen

Mechanisch Gallensteine

Iatrogen (z.B. ERCP)

Trauma

Pankreastumor / Papillentumor

Kongenitale Anomalien

Sphinkter oddi Dysfunktion

Vaskulär Schock

Embolien

Polyarteriitis nodosa

Infektiös Mumps

Coxackie virus

M. Pneumoniae

Parasiten

Gifte

Hereditäre Formen (sind meistens häufiger Ursache einer chronischen Pankreatitis)

Trypsinogen-Gen

SPINK 1

CFTR

Wie andere Organe auch, reagiert das Pankreas dabei recht einförmig auf eine

ganze Reihe unterschiedlicher schädlicher Einflüsse und Noxen. Das klinische Bild

der akuten Pankreatitis variiert von einer milden Verlaufsform mit interstitiellen

Ödemen und „restitutio ad integrum“, bis hin zur schweren Verlaufsform mit


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Multiorganversagen und Sepsis, was sich besonders in der schweren

nekrotisierenden oder hämorrhagischen Form der Erkrankung manifestiert.

Die akute Pankreatitis weist keine einheitliche Ätiologie auf, sondern kann durch

unterschiedliche Noxen ausgelöst werden (s. Tab. 1). Häufigste Ursachen der

akuten Pankreatitis sind Gallengangssteine (obstruktive Störungen) und

Alkoholabusus. Seltenere Ursachen sind unter anderem Medikamente, Toxine,

ERCP (iatrogene Ursache) und Tumore. Bei der chronischen Pankreatitis ist

Alkoholabusus die häufigste Ursache. Zusätzlich gibt es auch genetische Ursachen,

die die Präsdisposition für eine chronische Pankreatitis erhöhen können [Nam und

Murthy 2003].

2.2.2. Pathophysiologische Modelle und Pathogenese der Pankreatitis

In experimentellen Modellen der Erkrankung gibt es zahlreiche Faktoren, welche

eine Pankreatitis auslösen können, einbegriffen biliäre Obstruktion, die direkte

toxische Schädigung durch Ethanol und andere Toxine (wie z.B. Pharmaka), die

ischämische Schädigung, die Schädigung durch freie Radikale, Hypertrigliceridämie,

Hypercalcämie, eine Permeabilitätszunahme des Pankreasganges und

Hyperstimulation der Drüse sowie genetische Ursachen.

Die klassische Hypothese besagt, dass die biliäre Pankreatitis durch die Passage

eines Gallensteins durch das terminale bilio-pankreatische Gangsystem verursacht

werden kann, wobei gelegentlich eine Inkarzeration im ampullären Bereich auftritt.

Dieses Konzept basiert auf Opie's „Obstruktionstheorie“ von 1901 [Opie 1901].

Diese Theorie basierte auf dem bei zwei an Pankreatitis verstorbenen Patienten

erhobenen, autoptischen Nachweis von Gallensteinen, welche die Papilla major

verschlossen. Allerdings findet sich ein gemeinsamer Ausführungsgang von

Pankreas- und Gallenwegen, welcher lang genug wäre, einen Gallereflux im Falle

einer steinbedingten Okklusion der Papille zu erlauben, nur bei weniger als 20% der

Bevölkerung.

Weitere obstruktive Ursachen sind z.B. Trauma oder Tumor, welche mit einer

intraduktalen Druckerhöhung und einem duktalen Permeabilitätsanstieg

einhergehen können. Durch die Abflussbehinderung des Pankreassekretes im

Ductus pankreaticus ist die Ausschleusung der Pankreasproenzyme aus der


11

Azinuszelle gestört. Die Folge ist eine intrapankreatische Aktivierung dieser Enzyme

und somit Autodigestion des Organs [Steer 1997].

Hauptvertreter der direkten toxischen Schädigung, ist die akute Alkoholpankreatitis

[Apte und Wilson 2003]. Ursprung der alkoholinduzierten Pankreatitis ist die

Azinuszelle. Schon lange ist bekannt, dass Alkohol in Pankreasazinuszellen ganz

ähnlich wie in Hepatozyten metabolisiert werden kann [Clemente et al. 1977]. Es

gibt Hinweise, dass Alkoholmetabolite, zum Beispiel durch oxidativen Stress, zur

Schädigung von Azinuszellen bis zu Nekrosen führen können. Dies wiederum führt

zur Freisetzung von Chemokinen (z.B. Mob-1) und Zytokinen (z.B. TNF-α) durch die

Azinuszellen [Grady et al. 1997, Gukovskaya et al. 1997, Brady et al. 1999, Han et

al. 2000] (s. Abschnitt 2.2.3.3.). Oxidativem Stress sind auch unterschiedliche

Effekte auf die Pankreassekretion, die Pankreasgangpermeabilität und den Druck

im Pankreasgang zugeschrieben worden. Die Daten hierzu sind allerdings

widersprüchlich.

Aufgrund des aktuellen Kenntnisstandes scheint also ein direkter toxischer Effekt

von Alkohol und seinen Metaboliten bei entsprechend (genetisch oder durch

Cofaktoren) disponierten Patienten eine pathologische Sequenz auszulösen. Diese

beginnt mit der Azinuszellschädigung bis zur Nekrose und mündet in der

Freisetzung entzündlicher Mediatoren mit Stimulation des Immunsystems und

Rekrutierung von Makrophagen und Lymphozyten, in akuten rezidivierenden

Entzündungen sowie der Aktivierung von pankreatischen Sternzellen und

konsekutiver Fibrose. Neben genetischen Faktoren spielt zum Beispiel Rauchen

eine Rolle und scheint das Risiko für die Entstehung alkoholischer Pankreatitiden

und für die Fibrose sowie Verkalkungen des Pankreas zu erhöhen [Hartwig et al.

2000].

Offensichtlich müssen zum Alkohol noch weitere, entweder äußere oder auch

interne (genetische) Faktoren hinzukommen, da nur ein kleiner Teil der Alkoholiker

Pankreatitiden entwickelt [Dreiling und Koller 1985, Steinberg und Tenner 1994]. Die

bislang bekannten genetischen Ursachen der chronischen Pankreatitiden scheinen

bei Alkoholikern nicht wesentlich häufiger aufzutreten, so dass wesentliche

Polymorphismen möglicherweise noch nicht gefunden wurden.

Mehrere genetische Ursachen für die Entstehung einer chronischen Pankreatitis

wurden in den letzten Jahren beschrieben. Whitcomb et al. zeigten, dass


12

Mutationen im kationischen Trypsinogengen (PRSS1) für die hereditäre Pankreatitis

(s. Abschnitt 2.2.3.2.) verantwortlich sein können [Whitcomb et al. 1996 und 1999].

Mutationen im pankreatischen sekretorischen Trypsin Inhibitor (SPINK1) [Witt et al.

2000] oder dem „cystic fibrosis transmembrane conductance regulator“ (CFTR)

[Cohn et al. 1998] können offensichtlich die Prädisposition für die Entstehung einer

chronischen Pankreatitis erhöhen.

2.2.3. Pathophysiologische Vorgänge in der Frühphase

Abhängig vom auslösenden Faktor entwickelt sich die pathogenetische Sequenz der

akuten Pankreatitis entweder aus der direkten Azinuszellschädigung, wie dies vor

allem bei metabolischen Ursachen zu erwarten ist oder über vorzeitige Aktivierung

von Enzymen und deren Übertritt in den interstitiellen Bereich des

Pankreasgewebes. Über eine dieser beiden Sequenzen mündet das

Krankheitsgeschehen in die gemeinsame Endstrecke der pathomorphologischen

Schädigung. Möglicherweise kommt es bei verschiedenen Faktoren sogar von

Anfang an zu einer Überlagerung der intraduktalen Gangpermeabilitätsstörung und

direkten Azinuszellschädigung.

Um die pathophysiologischen Vorgänge genauer zu beschreiben, wurden in den

letzten Jahren konkrete praxisrelevante Konzepte entwickelt und es hat sich ein

Konzept der Pathophysiologie etabliert, welches erlaubt, für die Frühphase der

akuten Pankreatitis drei entscheidende Phänomene (s. Abb. 4) zu definieren [Steer

1997, Grendell 1997]. Es wurde publiziert, dass es zu Beginn einer akuten

Pankreatitis zur sekretorischen Blockade [Saluja et al. 1999] (s. Abschnitt 2.2.3.1.),

zur frühzeitigen intrazellulären Trypsinaktivierung [Saluja et al. 1997, Hofbauer et al.

1998, Saluja et al. 1999] (s. Abschnitt 2.2.3.2.) und letztlich durch die Bildung

proinflammatorischer Mediatoren zu einer immunologischen Antwort auf die

pathopysiologischen Vorgänge kommt [Grady et al. 1997, Brady et al. 1999] (s.

Abschnitt 2.2.3.3.).


13

Abb. 4 Pathophysiologische Phänomene in der Frühphase der akuten Pankreatitis

2.2.3.1. Sekretorische Blockade

Die sekretorische Blockade zu Beginn der Entstehung einer akuten Pankreatitis ist

ein bereits seit längerem bekanntes Phänomen. Man versteht darunter, dass die

Sekretionsantwort nach Stimulation mit bestimmten Sekretagoga, wie

Cholezystokinin (CCK), biphasisch verläuft. Nach Erreichen der maximal

sekretorisch wirksamen Dosis kommt es bei Hyperstimulation zu einer Hemmung

der Sekretion von Verdauungsenzymen. Die Synthese der Verdauungsenzyme in

der Azinuszelle erfolgt aber weiterhin, so dass die neu synthetisierten Enzyme in der

Drüse akkumulieren [Steer 1997]. Als Ursache für die sekretorische Blockade wird

diskutiert, dass es infolge der Pankreatitis zu einer Zerstörung des Aktinzytoskeletts

an der basolateralen Zellmembran der Azinuszelle kommt und damit der Transport

der Verdauungsenzyme aus der Zelle heraus unterbrochen ist [Schäfer und

Williams 2000, Kubisch et al 2004].

2.2.3.2. Frühzeitige intrazelluläre Trypsinaktivierung

Ein weiteres wichtiges Ereignis ist die frühzeitige, intrazelluläre (intraazinäre)

Aktivierung von Verdauungsenzymen, insbesondere von Trypsinogen zum

proteolytischen Enzym Trypsin. Dieses Konzept wird schon lange diskutiert, da es

bei der Pankreatitis zu einem Selbstverdau des Pankreas kommen kann.

Physiologischerweise erfolgt die Aktivierung der Verdauungsenzyme überwiegend

nach Erreichen des Duodenums. Trypsinogen wird von der Enterokinase des

Dünndarmepithels durch Abspaltung eines Peptides zu Trypsin aktiviert. Trypsin

aktiviert dann die übrigen Proenzyme (proteolytische Kaskade).


14

Das Pankreas besitzt normalerweise ausreichende Schutzmechanismen gegen eine

mögliche Selbstverdauung durch Verdauungsenzyme. Zum einen werden die

meisten Enzyme in Form von inaktiven Pro-Enzymen (Zymogene) synthetisiert und

in Zymogengranula gespeichert und zum anderen wird die Selbstverdauung des

Pankreas durch kleinere Mengen intraazinär aktivierten Trypsins

physiologischerweise durch verschiedene protektive Mechanismen verhindert (s.

Abb. 5 a/b).

Abb. 5 a/b Physiologische Schutzmechanismen vor Selbstverdauung und Störungen bei hereditärer Pankreatitis

a) Modell der intrazellulären Mechanismen gegen frühzeitige Trypsinaktivierung. Dazu gehören neben einem sauren pH-Wert in den Zymogengranula, der Serinproteaseninhibitor Typ KAZAL I (SPINK1), der reversibel bis zu 20% des Trypsins blockieren kann, welches durch vorzeitige Aktivierung von Trypsinogen anfällt und die Autolyse durch Trypsin verhindert. Des Weiteren gibt es trypsinaktivierte trypsinähnliche Enzyme, wie Mesotrypsin, die Trypsinogen degradieren, sowie unspezifische Antiproteasen im Pankreasparenchym wie α-1-Antitrypsin oder α-2-Makroglobulin [Lerch und Gorelick 2000].


15

b) Mutationen im Trypsinogengen bewirken einen verminderten Abbau durch Mesotrypsin bzw. Mutationen im SPINK-Gen können die trypsinhemmende Aktivität reduzieren.

Durch die Klonierung des Gendefektes der hereditären Pankreatitis konnte gezeigt

werden, dass eine vermehrte Aktivierbarkeit des Trypsinogens (frühzeitige

Trypsinaktivierung) offensichtlich rezidivierende Schübe akuter Pankreatitiden

verursachen kann [Whitcomb et al. 1996, Teich et al. 1998]. Die hereditäre

Pankreatitis ist eine seltene Erkrankung mit autosomal dominantem Erbgang. Bei

betroffenen Patienten kommt es bereits im Kindesalter zu rezidivierenden

Pankreatitisschüben mit Entwicklung einer chronischen Pankreatitis. Mindestens

zwei Mutationen im Gen des kationischen Trypsinogens sind inzwischen bei

Familien mit hereditärer Pankreatitis beschrieben. Man vermutet, dass eine Mutation

(Arg117His) zum Verlust einer putativen Schnittstelle im Trypsin führt, so dass

frühzeitig intrazellulär aktiviertes Trypsin nicht mehr durch Proteasen abgebaut

werden kann und somit die Aktivierung weiterer Verdauungsenzyme bereits

intrazellulär möglich wird [Whitcomb et al. 1996, Grendell 1997]. Die zweite Mutation

(Asp21Iso) führt dagegen möglicherweise zu einer verstärkten Aktivität des Trypsins

in saurem Milieu, was eine gesteigerte Aktivität in den Zymogengranula ebenfalls


16

erklären könnte [Teich et al. 1998, Keim et al. 1999]. Diese Arbeiten zeigen, dass

Trypsinmutationen ausreichend für die Entstehung einer chronischen Pankreatitis

sein können. Auch wurde eine Mutation (N34S) im Gen des Trypsinhemmers

SPINK1 (Serin Protease Inhibitor Typ KAZAL I) bei familiär gehäuften

Pankreatitisfällen und bei Kindern mit idiopathischer chronischer Pankreatitis

gefunden, aber auch in 2% der Kontrollpersonen, so dass gefolgert wird, dass diese

Mutation eher krankheitsmodifizierend als -verursachend ist [Witt et al. 2000 und

2002, Threadgold et al. 2002, Keim 2002, Whitcomb 2002].

Weitere Arbeiten an isolierten Azinuszellen und im in vivo Modell der akuten

Pankreatitis haben gezeigt, dass der zellpermeable Cathepsin B Hemmstoff E-

64d/CA-074Me die durch Caerulein induzierte Aktivierung von Trypsin komplett

hemmen kann [Saluja et al. 1997, Teich et al. 1998, Keim et al. 1999]. Inzwischen

gibt es auch Daten von Experimenten mit Cathepsin B -/- knock-out Mäusen, welche

zeigen, dass die Caerulein-induzierte, intrazelluläre Trypsinaktivierung bei diesen

Mäusen um bis zu 90% reduziert ist. Allerdings wird die Pankreatitis nur lokal

abgeschwächt, aber nicht verhindert. Die systemischen Auswirkungen z.B. auf die

Lunge sind dagegen nicht verändert [Halangk et al. 2000].

Wie es allerdings zur intrazellulären Trypsinaktivierung kommt, ist noch unklar. Eine

Hypothese besagt, dass es, möglicherweise im Zusammenhang mit der Störung der

Sekretion, zu einer Fusion von Lysosomen und Zymogengranula kommt

(„Kolokalisationshypothese“). Die lysosomale Protease Cathepsin B soll

Trypsinogen durch proteolytische Spaltung zum Trypsin aktivieren und so die

gesamte proteolytische Kaskade in Gang setzen [Steer et al. 1987, Niederau und

Grendell 1988]. Die „Kolokalisationshypothese“ ist allerdings nicht uniform

akzeptiert. So konnte elektronenmikroskopisch mittels Immunogold-Markierung

gezeigt werden, dass Cathepsin B und Verdauungsenzyme auch in gesundem

Pankreasgewebe bereits teilweise in den gleichen Organellen vorkommen [Willemer

et al. 1990]. Kolokalisation lysosomaler und sekretorischer Verdauungsenzyme

wurde außerdem nach Stimulation mit Bombesin, welches keine Pankreatitis

auslöst, beschrieben [Grady et al. 1996]. Bombesin führt auch zu einer

Trypsinaktivierung in einem zu Caerulein vergleichbaren Ausmaß. Des Weiteren

haben Trypsin- bzw. Proteasehemmstoffe den klinischen Verlauf der akuten

Pankreatitis nicht günstig beeinflussen können [Buchler et al. 1993].


17

2.2.3.3. Immunologische Reaktion im Rahmen der akuten Pankreatitis

Neben der lokalen Schädigung des Pankreas mit sekretorischer Blockade und

wahrscheinlich frühzeitiger intrazellulärer Aktivierung von Verdauungsenzymen, ist

inzwischen auch klar, dass der Schweregrad der akuten Pankreatitis ganz

entscheidend von einer, im Rahmen der Pankreatitis ablaufenden, immunologischen

Reaktion abhängt.

Abb. 6 Immunantwort im Rahmen einer akuten Pankreatitis

So ist schon länger bekannt, dass es im Verlauf der akuten Pankreatitis zur

systemischen Aktivierung von Makrophagen und Lymphozyten kommt, welche nicht

nur im Pankreas sondern auch in anderen Organen, wie zum Beispiel der Lunge,

eine entzündliche Reaktion in Gang setzen [Norman et al. 1995]. Entsprechend sind

auch die Serumspiegel diverser entzündlich aktiver Zytokine, wie TNF-α [Hughes et

al. 1996], weiterer Zytokine [Brady et al. 1999] und auch von Chemokinen [Grady et

al. 1997], Interleukin 1β (IL-1β) [Fink und Norman 1997], IL-6 [Gross et al. 1993]

oder Platelet activating factor (PAF) [Zhou et al. 1993] bei der akuten Pankreatitis

erhöht, die die Schädigung abhängig von den ihnen entgegengesetzten

Abwehrstrategien des Pankreasgewebes in unterschiedlicher Ausprägung ablaufen

lassen.

Zunächst galt die Herkunft dieser Zytokine von Makrophagen als gesichert, bis klar

geworden ist, dass die Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse nicht nur selbst auf


18

Zytokine reagieren, sondern diese im Rahmen der Stressantwort bei der

Pankreatitis auch selbst synthetisieren kann [Gukovskaya et al. 1997].

Azinuszellen können aber nicht nur Zytokine synthetisieren und freisetzen, sondern

auch chemotaktisch wirksame Chemokine als Stressantwort produzieren [Luster

1998]. Somit ist die Bauchspeicheldrüse aktiv an der entzündlichen Reaktion im

Rahmen der Pankreatitis durch Chemokin vermittelte Anreicherung des

Pankreasgewebes mit weißen Blutzellen, sowie deren Aktivierung durch Zytokine

beteiligt.

2.3. Oxidativer Stress und zellulärer Schutz In normalen biologischen Prozessen werden in Zellen mit ihren Kompartimenten

laufend freie Radikale gebildet. Unter oxidativem Stress, worunter man die

Imbalance zwischen dem ansteigendem Gehalt an Pro-Oxidantien (z.B. reaktive

Sauerstoff-Zwischenstufen; reactive oxygen intermediates; ROI) und dem folglich

abnehmenden Gehalt an antioxidativen Schutzfaktoren (Proteinen) versteht, wird

die Formation dieser Radikale enorm gesteigert. Ein Absinken des Gehaltes an

Antioxidantien wie z.B. Glutathion, Ascorbinsäure oder a-Tocopherol (Vitamin E) hat

die vermehrte Bildung reaktiver Sauerstoffzwischenstufen [Halliwell und Gutteridge

1990] zur Folge.

Diese Sauerstoff-Intermediate können sich wegen ihrer hohen Reagibilität potentiell

toxisch verhalten. Die Imbalance durch zu hohe O• Produktion und abnehmenden

Schutzfaktoren erzeugt als Folge einen unkontrollierten oxidativen Stress mit

zellschädigenden Effekten wie z.B. Lipidperoxidation [Rice-Evans und Burdon 1993]

und dadurch Membranbeschädigungen [Ferrali et al. 1992], DNA-Strangbrüche

[Ames 1989] sowie Proteinveränderungen [Neuzil et al. 1993] und spielt bei der

Entstehung der akuten Pankreatitis sehr wahrscheinlich eine wichtige Rolle [Rau et

al. 2000]. Sauerstoffradikale können mit einer Vielzahl von zellulären Molekülen wie

Lipiden und Proteinen interagieren und zu Funktionsbeeinträchtigung führen

[Nonaka et al. 1990]. Freie Sauerstoffradikale können außerdem durch Hemmung

des Energiestoffwechsels zur ATP-Depletion bei akuter experimenteller Pankreatitis

führen [Luthen et al. 1995].

Um dem oxidativen Stress entgegenzusteuern, haben Zellen und Gewebe eine

Vielzahl von antioxidativ wirkenden Mechanismen entwickelt, die bei eventueller

Anreicherung von reaktiven Sauerstoffzwischenstufen, oder bei zellulären


19

Reperaturvorgängen aktiviert werden. Dazu zählen intrazelluläre Antioxidantien wie

die Katalase, welche Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff konvertiert, die

Superoxid-Dismutase (SOD), welche Superoxidanionen zu Wasserstoffperoxid

konvertiert, a-Tocopherol (Vitamin E), Ascorbinsäure und Glutathion (GSH). Auch

HSP32/HO-1 hat vermutlich antioxidative Eigenschaften.

Rau et al. konnten in experimentellen Modellen zeigen, dass die Antioxidantien wie

Glutathion und antioxidativ wirkende Enzyme wie Katalase und Superoxid-

Dismutase (SOD) einen positiven Effekt auf den Schweregrad der Pankreatitis

haben können [Rau et al. 2000]. Allerdings genügt oxidativer Stress allein nicht, um

eine akute Pankreatitis auszulösen [Fu et al. 1997, Rau et al. 2000].

2.4. Hitzeschockproteine

2.4.1. Expression und Aufgabe von Hitzeschockproteinen

Hitzschock-Gene (heat shock protein, HSP) ist die Bezeichnung für eine Klasse von

entsprechenden Genen und ihrer Proteine welche in allen bisher untersuchten

Spezies sehr stark konserviert sind. Die bedeutende Klasse von Stressproteinen

wurde zuerst 1962 von Ritossa in der Speicheldrüse der Fruchtfliegenlarve

Drosophila Melanogaster entdeckt [Ritossa 1962]. Es wurde festgestellt, dass die

Erhöhung der Zelltemperatur von 25°C auf 30°C eine Anhäufung von Formationen

an speziellen Regionen auf polytenen (übergroßen) Chromosomen der Larve

induziert. Diese Formationen reflektieren Transkriptionsaktivitäten von speziellen

Genen, welche eine Gruppe von Proteinen codieren, die Aufgrund ihrer gesteigerten

Genexpression nach Hitzeeinwirkung als Hitzeschockproteine (HSP) bezeichnet

wurden [Tissieres et al. 1974, Lindquist und Craig 1988].

Obwohl die HSPs ursprünglich anhand der Induktion durch gesteigerte

Temperaturen benannt wurden und die ausgeprägte Thermotoleranz der Zellen die

wichtigste und bekannteste Auswirkung der Hitzeschock-Proteine darstellt [Landry

et al. 1989], kann die Expression dieser Proteine aber auch durch nahezu jede

andere Art von Stress induziert werden, wie beispielsweise mechanischer Stress,

oxidativer Stress, toxisch-metabolischer Stress etc. [Morimoto et al. 1992]. Diese

Proteine werden deshalb auch als Stressproteine bezeichnet.

Zusätzlich zu ihrer Funktion als Teil der akuten, zellulären Antwort auf Stress, führt

die gesteigerte Expression von HSPs auch zu einer gesteigerten Toleranz


20

gegenüber nachfolgenden Stressereignissen. Es wurde später auch demonstriert,

dass thermischer Stress, welcher die Synthese von HSP induzieren kann, Schutz

vor nachfolgendem nichtthermischem Stress verleiht [Currie 1987, Bellmann et al.

1995].

HSPs sind aber nicht nur für die (pathophysiologische) Stressreaktion wichtig,

sondern erfüllen auch in normalem Zellstoffwechsel zahlreiche physiologische

Funktionen [Morimoto et al. 1992, Pockley 2001]. Eine häufig beobachtete Funktion

von Hitzeschockproteinen ist ihre Wechselwirkung mit anderen Proteinen. HSPs

können diese Proteine in eine korrekte Konformation (Ordnung der Proteinfaltung)

überführen. Zum Beispiel wirken HSP60 und HSP70 zusammen, um entstehenden

Peptiden bei der Translation die Einnahme ihrer korrekten Tertiärstruktur zu

ermöglichen. Wegen dieser Begleitfunktion, die auch unter physiologischen

Bedingungen wahrgenommen werden [Minowada und Welch 1995], sind sie auch

als Begleitproteine (chaperone proteins) oder „Chaperone“ bezeichnet worden.

2.4.2. Hitzeschockproteingruppen

Hitzeschockproteine umfassen eine ganze Reihe verschiedener Familien (s. Tab.

2), welche strukturell nicht miteinander verwandt sind. Die Bezeichnung und

Klassifizierung rührt vom apparenten Molekulargewicht der jeweiligen Proteine her,

(z.B. HSP32 ist ein 32 kDa Protein), also unter anderem HSP90, HSP70, HSP60,

HSP32 oder HSP25/27 [Hartl et al. 1996, Rakonczay et al. 2003].

Die Familienmitglieder besitzen funktionelle Homologien in verschiedenen

Kompartimenten der Zelle. Während es eine große Ähnlichkeit zwischen gleichen

HSP in verschiedenen Organismen gibt, z.B. teilen sich Escherichia coli DnaJ und

das humane HSP70 ungefähr 50% Sequenzgleichheit [Caplan et al. 1993], gibt es

offensichtlich keine Sequenzhomologie zwischen verschiedenen Familien (z.B.

zwischen HSP60 und HSP70).


21

Tabelle 2 Die bekanntesten und wichtigsten Gruppen der Hitzeschock-Proteine

Familie Proteine Lokalisation in der Zelle

Funktionen

kleine HSPs

Ubiquitin Zytosol / Nukleus

Beteiligt am nicht-lysosomalen Proteinabbau

HSP10 Mitochondrien Co-Chaperon von HSP60

αB-Crystallin

Zytosol Verbunden mit zytoskelettalen Elementen (Stabilisierung)

HSP27 Zytosol / Nukleus

Stabilisierung der Microfilamente, Regulation des Actin-Zytoskeletts

HSP32 Zytosol Hämoxygenase-1, Hämkatabolismus, Antioxidative Eigenschaften

HSP40 HSP40 Zytosol / Nukleus

Co-Chaperon von HSP70

HSP60 HSP60 Mitochondrien Gebunden an teilweise gefaltete Polypeptide (assistiert korrekte Faltung), in pankreatischen Zymogen Granula

HSP70 HSP72 (HSP70)

Zytosol / Nukleus

Durch starken Stress (Hyperthermie) induzierbar

HSP73 (HSC70)

Zytosol / Nukleus

Konstitutiv exprimiert

GRP75 Mitochondrien Beteiligt an der Translokation von Vorläuferproteinen durch die mitochondriale Membran

GRP78 Endoplasmati-sches Retikulum

Spielt eine Rolle bei der Zusammensetzung sekretorischer Proteine

HSP90 HSP90α Zytosol Wichtige Rolle in der Steroid-Rezeptor Funktion

HSP90β Zytosol Wichtige Rolle in der Steroid-Rezeptor Funktion

GRP94 Endoplasmati-sches Retikulum

Calcium-bindendes Chaperon

HSP100 HSP100 Zytosol / Nukleus

Beteiligt an der Auflösung von Aggregaten und der Erleichterung der Proteolyse, Thermotoleranz

Das GRP (Glucose regulated protein) ist nicht speziell durch Hitzeschock induziert, sondern durch Glucosemangel.


22

2.4.3. Genetische Regulation der HSP-Synthese

Die Regulation der Expression der Hitzeschock-Gene erfolgt größtenteils auf

Transkriptionsebene durch Bindung eines Hitzeschock-Transskriptionsfaktors (heat

shock factor; HSF) an eine DNA-Sequenz im Promoterbereich (heat shock response

element; HSRE) [Leppä und Sistonen 1997, Cotto und Morimoto 1999].

Nach wie vor ist die Signaltransduktion, welche der Induktion von HSP zugrunde

liegt, nur teilweise erforscht. Der HSF, welcher die Transkription reguliert und

konstitutiv exprimiert wird, liegt in ungestressten Zellen in monomerer und inaktiver

Form vorliegt und muss zu seiner Aktivierung phosphoryliert werden. Drei

Mononomere müssen sich zu einem Trimer zusammenfügen und es muss eine

Translokation aus dem Zytosol in den Zellkern erfolgen [Baler et al. 1993].

Sehr wahrscheinlich besteht eine negative Feedback-Regulation zwischen HSP und

dem HSF. HSP bindet HSF, stabilisiert somit seine monomere Form und hemmt so

seine transkriptionelle Aktivität. Wenn durch Stress die Akkumulation denaturierter

Proteine steigt, bindet das HSP mit höherer Affinität an diese Proteine, um ihre

Aggregation zu verhindern und die Rückfaltung in den nativen Zustand zu

unterstützen. Somit steht weniger HSP zur Hemmung der HSF-Aktivität zur

Verfügung, was zu einer Derepression der HSP-Transkription führt [Nieto-Sotelo et

al. 1990].

2.4.4. Induktion von Hitzeschockproteinen im Pankreas

Die HSP der großen zytoprotektiven Familien werden im Pankreas konstitutiv

exprimiert oder induziert [Schäfer und Williams 2000].

Es wurde bereits vor einigen Jahren mittels metabolischer Markierung azinärer

Proteine mit 35S-Methionin gezeigt, dass auch Azini auf eine Erhöhung der

Umgebungstemperatur (Hyperthermie) mit der Expression ganz bestimmter

Proteine reagieren [Wagner et al. 1996, Strowski et al. 1997]. Insbesondere fand

sich eine starke Hochregulation von HSP70 Isoformen (HSP72). Die Quantität von

HSP72 war nach 3-6h signifikant angestiegen und blieb 12-24h erhöht. Daneben

wurden aber auch Proteine von 92, 59, 58 und 30 kDa gefunden, welche ebenfalls

verstärkt nach Hyperthermie exprimiert wurden. Auch wurde in vorausgehenden

Versuchen HSP60 schwach induziert. Dieses Phänomen ließ sich in gleicher Weise

nach Ganzkörperhyperthermie (die Körperkerntemperatur der Versuchstiere wurde

auf 42°C für 20 min erhöht) im Pankreas in vivo zeigen [Tashiro et al. 2002].


23

Ferner konnte gezeigt werden, dass die Präkonditionierung durch Hyperthermie zu

einer Protektion bei einer experimentellen Pankreatitis und damit zur Abschwächung

des Schweregrades derselben führt, was nicht nur für das Modell der

Caeruleinpankreatitis gilt [Frossard 1999, Grise et al. 2000, Weber H et al. 2000].

Als möglicher Mechanismus der Protektion durch HSP wird eine Reduzierung der

frühzeitigen intrazellulären Trypsinaktivierung (s. Abschnitt 2.2.3.2.) nach Caerulein

Hyperstimulation diskutiert [Frossard et al. 2002, Bhagat et al. 2002].

HSPs werden auch bei Pankreatitis ohne Präkonditionierung im Pankreas

hochreguliert [Weber CK et al. 1995, Bhagat et al. 2002]. So wurde die Expression

von HSP32 nach Induktion einer akuten Pankreatitis durch Caerulein beschrieben.

Es wurde gezeigt, dass die Caerulein induzierte akute Pankreatitis mit einem

signifikanten Ansteigen der Expression von HSP32/HO-1 im Pankreasgewebe,

beginnend etwa 12-24h nach den ersten Zeichen eines intestinalem

Pankreasödems. Es konnte zwar nicht ausgeschlossen werden, dass infiltrierende

Phagozyten in das Pankreasgewebe zur ansteigenden Expression beigetragen

haben, aber es ist wahrscheinlicher, dass das ansteigende HO-1 in vivo den

Pankreaszellen zuzuordnen ist [Sato et al. 1997]. Für die Frühphase der akuten

Pankreatitis ließen sich in der aktuellen Literatur bisher keine Daten finden.

Der zeitliche Ablauf dieser selektiven Induktion im Pankreasgewebe in vivo könnte

die Antwort auf und Anpassung an die Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen (s.

Abschnitt 2.3.) in den frühen Stadien der akuten Pankreatitis widerspiegeln

[Schoenberg et al. 1995].

2.5. Hämoxygenase-1 (HO-1/HSP32)

2.5.1. Charakterisierung der Hämoxygenase

Die Hämoxygenase (HO) gehört zu den Monooxygenasen. Sie katalysiert den

ersten Schritt des Abbaus von Häm zu Gallepigmenten. Das bekannteste Beispiel

dafür ist der Hämoglobinabbau aus Erythrozyten, der hauptsächlich in Milz und der

Leber stattfindet. Die biochemischen Grundlagen dieser Abbauvorgänge wurden in

den vergangenen 20 Jahren weitgehend geklärt [Maines 1988 und 1992].

Von großer Bedeutung in der Regulation biologischer Systeme ist dabei die

Degradation des Häm zu Biliverdin (s. Abb. 7) unter Freisetzung von Eisen und der


24

Bildung von Kohlenmonoxid [CO]. Das Biliverdin wird anschließend durch die

Biliverdin-Reduktase (ein zytosolisches Enzym) zu Bilirubin konvertiert.

Abb. 7 Katalytische Reaktion der Hämoxygenase

Schematische Darstellung des Abbaus der Hämgruppe: Das Enzym katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt beim oxidativen Abbau des Häm zu Biliverdin und äquimolaren Mengen an Kohlenstoffmonoxid (CO) und Eisen. Diese Reaktion spielt eine wichtige Rolle bei der Wiedergewinnung des Eisens aus dem Hämoglobin alternder Erythrozyten und beim Abbau anderer Hämproteine. Das lineare Tetrapyrrol Biliverdin wird im Folgenden sofort durch die Biliverdin-Reduktase zu Bilirubin reduziert [Choi und Alam 1996].

Dem Bilirubin wird eine Bedeutung als physiologisch wirksame antioxidative

Substanz zugeschrieben [Stocker et al. 1987 und 1990]. Sowohl durch die

Mediatorfunktion von CO als auch durch das antioxidative Potential von Bilirubin

könnte Hämoxygenase im Pankreas daher unter physiologischen und

pathophysiologischen Bedingungen eine Rolle spielen. Daten aus der Literatur

zeigen, dass die HO-1 durch Exposition mit verschiedenen Formen von oxidativem

Stress induziert wird und dass dieses Enzym zellulären Schaden verhindern, sowie

gegen oxidativen Stress schützen kann [Stocker 1990] (s. Abschnitt 2.5.4.).

2.5.2. Formen und Funktionen der Hämoxygenase

Die Hämoxygenase Typ1 (HO-1) ist die induzierbare, ubiquitär im Organismus

vorkommende Isoform und hat ein Molekulargewicht von 32 kDa [Maines et al.

1986], während das später entdeckte Isoenzym mit Hauptvorkommen in Gehirn und

Hoden als Hämoxygenase Typ2 (HO-2) mit 36 kDa bezeichnet wurde. Nach

Klonierung und Sequenzierung dieser beiden Isoformen wurde durch Homologie-


25

Screening eine dritte Enzymvariante (HO-3) mit 33 kDa entdeckt, deren

biochemische Charakterisierung bislang noch aussteht [McCoubrey et al. 1997].

Die Gene für HO-1 [Shibahara et al. 1989] und HO-2 [McCoubrey und Maines 1994,

McCoubrey et al. 1995] sind auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert, dennoch

weisen sie grundsätzlich eine ähnliche Struktur und Homologie in der

Aminosäurensequenz von 40% auf. Durch ein sehr langes Intron sind jedoch die

HO-2 Gene nahezu doppelt so groß wie das HO-1 Gen.

HO-1 ist durch eine Vielzahl von strukturell nicht verwandten, pharmakologischen

und chemischen Agenzien, sowie durch Variation des Zellzustandes, wie z.B.

Hitzeschock und anderen Formen von zellulärem Stress (Stickstoffmonoxid) in

zahlreichen Zelltypen induzierbar. In vielen Geweben und Zellkulturen steigt die HO-

1 mRNA Expression durch die Behandlung mit dem natürlichen Substrat Häm sowie

mit verschiedenen Metallen und Xenobiotika (Fremdstoffen), endokrinen Faktoren

und synthetischen Metalloporphyrinen und Metallprotoporphyrinen [Alam et al.

1994]. Darunter sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS oder reactive oxygen

intermediates, ROI), Endotoxine, Cytokine wie TNF-α, UV-Licht, Natriumarsenit,

Hyperoxie und Glutathionmangel von besonderer Bedeutung [Keyse und Tyrrell

1989]. Die Induzierbarkeit des HO-1/HSP32-Gens dient höchstwahrscheinlich als

Schutz der Zellen gegen Stress, insbesondere oxidativen Stress wie z.B. Hitzschock

und Entzündungen [Choi und Alam 1996, Otterbein und Choi 2000].

HO-2 ist hauptsächlich im zentralen Nervensystem (Gehirn), Leber, Milz,

Gefäßsystem und Reproduktionsorganen (z.B. Hoden) exprimiert und scheint nicht

induzierbar zu sein [McCoubrey und Maines 1994, McCoubrey et al. 1997]. Studien

an HO-2 knock-out Mäusen weisen darauf hin, dass CO, durch HO-2 produziert, als

Signalmolekül wirken und somit eine Aufgabe in der Signaltransduktion haben kann

[Zakhary et al. 1997].

Die HO-3 wird ebenfalls konstitutiv exprimiert, wobei die katalytische Aktivität sehr

niedrig ist. HO-3 wirkt möglicherweise hauptsächlich als Häm-bindendes Protein

[McCoubrey et al. 1997, Elbirt und Bonkovski 1999].


26

Tabelle 3 Übersicht über die Isoformen der Hämoxygenase

HO-1 (HSP32)

HO-2 HO-3

Chromosom 22q12 16p13.3 ?

Gen Ratte: 6830 bp Mensch: ~ 14.000 bp 5 Exons, 4 Introns Heat shock elements Bindungsstellen für Transskriptionsfaktoren

Ratte: 12563 bp 5 Exons, 4 Introns Glucocortikoid-response element (GRE)

?

Protein Ratte: 289 AS, MW 33.005 Mensch: 288 AS, MW 32.818

Ratte: 315 AS, MW 35.762 Mensch: 315 AS, MW 36.033 ca. 40% Homologie mit HO-1

Ratte: MW ~ 33.000 ca. 90% Homologie mit HO-2

Vorkommen Induzierbar Leber, Milz, Pankreas

Konstitutiv ZNS (Gehirn), Hoden, Leber, Milz

Konstitutiv Gehirn, Hoden, Leber, Milz, Thymus, Niere, Prostata, Herz

Regulation Aktivierung durch: Häm, Hitze Neurotoxische Metalle (Cadmium) Viren, Bakterientoxine Stress: physiologisch und pathologisch Normales Vorkommen: Zellwachstum und Entwicklung

Keine Stimuli oder Regulatoren bekannt (Glukokortikoide nur während der Entwicklung)

Regulation nicht bekannt Nur schwache Hämkatalyse

2.5.3. Struktur der Porphyrine und Einfluß von synthetischen Metalloporphyrinen wie Kobalt-Protoporphyrin (CoPP)

Metallporphyrine, in welchen das zentrale Eisenatom z.B. gegen Zinn2+- (Sn),

Zink2+- (Zn), Chrom2+- oder Mangan2+- Ionen ausgetauscht wurde, wirken als

potente kompetetive Inhibitoren der Hämoxygenase [Rosenberg et al. 1989].


27

Im Gegensatz dazu induziert Kobalt-Protoporphyrin (CoPP) in vivo die

Hämoxygenase. Es ist also prinzipiell von der Beschaffenheit des zentralen

Metallatoms abhängig, ob ein Metalloporphyrin hemmende oder induzierende

Eigenschaften in vivo besitzt [Kappas und Drummond 1986].

Die HO-1 Aktivität lässt sich also mit Metalloporphyrinen positiv (CoPP) und negativ

(SnPP, ZnPP) regulieren.

Abb. 8 Nomenklatur der Porphyrine

Die vier Pyrrolringe werden mit A, B, C und D bezeichnet. Die Nummerierung und Zu-ordnung der Positionen der Porphyrinsubstituenten folgt den Richtlinien der „International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry“ (IUPAC/IUB). Wie rechts in der Abbildung ersichtlich, werden die Ringatome des Tetrapyrrolsystems, die C- und N-Atome, von 1 bis 24 durchnummeriert. Synthetisiert wird die Hämgruppe aus den Grundstoffen Succinyl-CoA (einem Zwischen-produkt des Citratzyklus) und Glycin. Der die Geschwindigkeit bestimmende Schritt dieser Synthese (das „Schrittmacherenzym“) bildet die δ-Aminolävulinat-Synthetase (ALAS).

Während anorganisches Zinn (Sn) und Sn-Protoporphyrin Vertreter metallischer

Sorten repräsentieren, deren Effekte auf die Häm-Degradation eher supprimierend

waren, bildet anorganisches Kobalt (Co) oder Co-Protoporphyrin (CoPP) (s. Abb. 9)

ein Musterbeispiel der Elemente, dessen biologische Aktivitäten, im Gegensatz

dazu, sehr gute Protoporphyrin-Chelatbildner sind. Anorganisches Kobalt in einer

Einzeldosis induziert die Hämoxygenase in der Leber, üblicherweise mit einem Peak

nach 16h und einem Absinken nach 48-72h. Dies ist mit einem gleichzeitigem

Sinken und transienter Verminderung des Cytochrom P-450 Levels assoziiert,

gefolgt von einem überschießendem „rebound“ Anstieg der δ-ALS-Synthaseaktivität


28

über hochnormale Werte, bevor sich die gesamte Reaktion wieder normalisiert

[Maines und Kappas 1974, 1975].

Abb. 9 Cobalt (III) Protoporphyrin IX chloride [C34H32CoN4O4Cl]

Dagegen verursacht eine einzelne äquimolare Dosis von Co-Protoporphyrin eine im

Maß wesentlich größere Induktion der Hämoxygenase in der Leber. Diese „Antwort“

persistiert auch für eine längere Zeitspanne, nämlich etwa für 3-5 Wochen, in den

behandelten Tieren. Co-Protoporphyrine sind hierbei ein starker und lang wirkender

Induktor der Hämoxygenase. Ein ausgeprägtes Absinken der δ-ALS-

Synthaseaktivität begleitet diese Reaktion. Als Konsequenz dieser anhaltenden

dualen Aktionen auf Hämsynthese und Degradation, erfolgt eine tiefe Abnahme des

Cytochrome P-450 Levels [Drummond und Kappas 1982].

2.5.4. Die Hämoxygenase als ein protektives Protein

Die HO-1/HSP32 ist ein Hitzeschock-Protein und damit ein Stressprotein, dass unter

anderem durch oxidative Schädigungen der Zelle induziert wird [Keyse und Tyrrell

1989, Nascimento et al. 1993, Schulz et al. 1999]. Von physiologischer Relevanz

sind das Biliverdin und das Bilirubin, die in vitro in der Lage sind, mit hoher Effizienz

Peroxyl-Radikale einzufangen [Stocker et al. 1987, Dennery et al. 1995]. Durch die

Bildung von Biliverdin entsteht ein starkes Antioxidans, welches freie

Sauerstoffradikale einfangen kann, wobei das Bilirubin Superoxid-Anionen

neutralisieren kann und somit viele Substrate vor Peroxidation bei der Anwesenheit

von Wasserstoffperoxid oder organischen Hydroperoxiden schützt. Dies ist


29

wahrscheinlich für die protektive Wirkung der HO-1 wichtig. Die antioxidativen

Eigenschaften des Bilirubins wurden durch verschiedene Studien belegt. So konnte

an isolierten Rattenherzen ein kardioprotektiver Effekt, sowohl durch Stimulation der

HO-1, als auch durch exogenes Bilirubin im Ischämie-Reperfusions-Modell gezeigt

werden [Clark et al. 2000]. Dennery stellte im Tiermodell einen protektiven Effekt

erhöhter Plasmaspiegel an unkonjugiertem Bilirubin gegen Hyperoxie vermittelte

oxidative Schädigung fest [Dennery et al. 1995]. In HO-1 defizienten knock-out

Mäusen zeigte sich entsprechend, dass die Anfälligkeit von Hepatozyten und

Fibroblasten gegenüber oxidativem Stress deutlich erhöht war. Kultivierte

Fibroblasten dieser Mäuse produzierten hohe Spiegel an freien Sauerstoffradikalen

und zeigten starke Cytotoxizität durch Prooxidanzien. Die Gabe von Endotoxin

verursachte in den knock-out Mäusen im Vergleich zu den Kontrolltieren vermehrte

Leberzellnekrose durch oxidative Schädigung und eine höhere Mortalität durch

endotoxischen Schock. Darüber hinaus entwickelten die Mäuse eine Eisenmangel-

Anämie mit Eisenablagerung in Leber und Niere, die zur chronischen Entzündung

der Organe führte [Vile et al. 1994, Poss und Tonegawa 1997].

Die HO-1 Expression lässt sich durch Veränderungen des intrazellulären Gehaltes

des Antioxidanten Gluthation beeinflussen. Ein Zusammenhang zwischen dem

antioxidativen Glutathion-Gehalt (GSH) und der Hämoxygenase-Induktion konnte in

kultivierten Fibroblasten von Ratten [Ketterer et al. 1988] festgestellt werden. Bei

einer Zellexposition durch Streßagentien wie z.B. Häm oder Wasserstoffperoxid

erfolgt eine Verminderung des zellulären GSH-Gehaltes. Diese Verminderung des

Antioxidanten wird durch eine Inhibierung der HO-1-Aktivität noch erhöht. Lautier

zeigte unter Verwendung des Glutathion-Inhibitorstoffes D,L-Buthionin-S,R-sulfoxin

ein komplettes Aufbrauchen des intrazellulären GSH-Gehaltes und einen daraus

resultierenden Anstieg der HO-1 [Lautier et al. 1992]. In Tieren, welche mit hohen

Konzentrationen von Caerulein behandelt wurden, fiel der gesamte pankreatische

Gluthation-Gehalt während der Frühphase der akuten ödematösen Pankreatitis ab

[Luthen et al. 1994]. Daraus kann man schließen, dass ein Abfall des intrazellulären

GSH, verursacht durch reaktive oxygene Radikale, einen Weg repräsentiert, die

Expression von HO-1 im Rahmen einer akuten Pankreatitis zu steigern.

Unter hypoxischen Bedingungen wird die HO-1 ebenfalls induziert, wobei der

molekulare Mechanismus dieser Induktion noch nicht bekannt ist. Als Grundlage

des Regulationsweges wird die Zellschädigung durch den Mangel an Sauerstoff


30

angenommen und die dadurch verbundene Ausschüttung von freien Radikalen. Die

durch die Radikale erzeugte Veränderung des Zellzustandes bewirkt eine

Anschaltung des zellulären Schutzsystemes und damit die Anschaltung der HO-1.

Kapitel 3 Ergebnisse

31

3. Ergebnisse 3.1. Proteinexpression und Regulation von Hitzeschock-

Proteinen im Pankreas Es konnte durch vorangegangene eingehende Untersuchungen der Stressreaktion

bereits aufgezeigt werden, dass Hitzeschockproteine im Tiermodell gegen eine

Pankreatitis protektiv wirken (s. Abschnitt 2.4.). Während HSP25/27 und HSP70 von

der Arbeitsgruppe Pankreas der Medizinischen Klinik II im Klinikum Großhadern

bereits eingehend untersucht wurden, stand für diese Arbeit besonders die

Expression von HSP32 im Pankreas, sowie dessen Bedeutung für die akute

Pankreatitis im Vordergrund.

3.1.1. Nachweis verschiedener HSPs im Pankreashomogenat nativ und nach Hyperthermie-Präkonditionierung

Zur genauen Beschreibung und Analyse des Expressionsmusters pankreatischer

Hitzeschockproteine im Pankreasgewebe, wie auch zum Nachweis der Spezifität

der verwendeten Antikörper wurden die SDS-Gel Elektrophorese und die Western

Analyse, wie in Methoden 6.6. beschrieben, durchgeführt. Zum immunochemischen

Nachweis der verschieden Hitzeschockproteine wurden spezifische primäre

Antikörper verwendet.

Tabelle 4 Verdünnungen der verwendeten Antikörper zum immunochemischen Nachweis der HSPs

Antikörper Verdünnung

Anti-HSP25 1:2000

Anti-HSP32 1:5000

Anti-HSP60 1:6000

Anti-HSP70 1:1000

Sekundäre Antikörper 1:10000

Die primären Antikörper wurden analog den in der Tabelle 4 angegebenen

Verdünnungen eingesetzt und nach dem Waschvorgang mit den jeweils

dazugehörigen sekundären, mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelten,


32

Immunglobulin G Antikörpern inkubiert. Diese Bindung wurde mit dem ECL-System

(s. Materialien 7.1.9.) erfasst und auf Film dargestellt.

Zunächst wurden die Expression und die Regulation der Expression von

Hitzeschockproteinen in verschiedenen Organen, wie Pankreas, Leber und Herz

untersucht und vergleichend dargestellt. Zur Regulation wurde zum einen die

Hyperthermie-Präkonditionierung (s. Abschnitt 2.4.4. und Methoden 6.1.1.) und zum

anderen die Präkonditionierung mit CoPP (s. Abschnitt 2.5.3. und Methoden 6.1.2.)

eingesetzt. Es wird in den Abbildungen jeweils als interner Standard und zur

Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper rekombinantes Protein der

jeweiligen Hitzeschockproteine mit aufgetragen (weiße Pfeile). In einigen

Abbildungen wird auch ein Protein-Standard-Marker für die jeweiligen

Molekulargewichte als Referenzmarkierung mit definierten Molekulargewichten auf

der linken Seite der Abbildung angegeben (schwarze Pfeile).

Abb. 10 Darstellung der Spezifität der Antikörper und der Einfluss von Hyperthermie auf die Expression von HSP32 und HSP70 im Pankreas und der Leber

Jeweils 20 µg Protein aus Herz (Bahn 4), Pankreas (Bahn 5 und 6, 8 und 9) und Leber (Bahn 3 und 7) von unbehandelten Kontrolltieren (NK) (Bahn 3 und 4), von Kontrolltieren (NK Pankreas), welche mit den Trägersubstanzen des CoPP bzw. Caerulein, [NaOH] (Bahn 8) und [NaCl] (Bahn 9) behandelt wurden, oder Tieren die mit Hyperthermie (HT) vorbe-handelt wurden (Bahn 5 bis 7), wurden pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulose-membran übertragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1, 25 ng) oder


33

Pankreasgewebe mit Hyperthermie präkonditionierter Tiere (Pos. Kontr. HSP70, Bahn 2, 25 ng) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Die Membran wurde zunächst mit einem spez. Anti-HSP32 Antikörper (oberes Panel) in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. Anschließend wurden die Antikörper durch Stripping (Herunterwaschen) entfernt und die Membran dann mit einem spez. HSP70 Antikörper in einer Konzentration von 1.1000 markiert (unteres Panel), die Konzentration des sekundären Ak war auch hier wieder 1:10000 (Erläuterungen siehe Text).

In Abbildung 10 ist gezeigt, dass die Hyperthermie-Vorbehandlung keinen Einfluss

auf die Expression von HSP32 im Pankreas hat.

Im oberen Panel der Western-Analyse mit Anti-HSP32 von Leber und Pankreas der

Ratte zeigt sich weder nativ (Negativkontrolle), noch nach Präkonditionierung durch

Hyperthermie, eine HSP32-Expression im Pankreas. Im Unterschied dazu kann in

der Leber eine geringe vorhandene konstitutive Expression, mit geringfügiger

zusätzlicher Induktion durch Hyperthermie-Präkonditionierung nicht ausgeschlossen

werden (vgl. Bahn 3 mit Bahn 7 im oberen Panel, sowie mit Abb. 12).

Im unteren Panel wurde nach „Strippen“ (s. Methoden 6.6.6.) dieselbe Membran mit

einem spezifischen Anti-HSP70 Antikörper markiert. Hierbei zeigt sich eine

Induktion der Expression von HSP70 durch Hyperthermie-Vorbehandlung. Die mit

rekombinantem HSP32 beladene Positivkontrolle ergibt dagegen kein Signal, so

dass durch diese Abbildung auch die Spezifität und Sensitivität der Antikörper

nachgewiesen werden kann.

In der im Folgenden gezeigten Abbildung 11 konnte, ergänzend zur zuvor gezeigten

Abbildung 10, mittels eines Anti-HSP25/27 Antikörpers die Expression von

HSP25/27 im Pankreas charakterisiert werden. Bei sehr schwacher konstitutiver

Expression konnte eine Hochregulation im Pankreas durch die Hyperthermie-

Präkonditionierung beobachtet und damit Ergebnisse der Literatur nachvollzogen

werden [Schäfer et al. 1999, Tashiro et al. 2002].


34

Abb. 11 Einfluss von Hyperthermie auf die Expression von HSP25/27 im Pankreas und der Leber

Jeweils 20 µg Protein von Tieren die mit Hyperthermie vorbehandelt wurden, wurden pro Bahn aufgetragen (Pankreas Bahn 3 bis 6; Leber Bahn 7 und 8), die Proteine per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran über-tragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden rekombinantes HSP25 (Pos. Kontr. HSP25, Bahn 1). Als Negativkontrolle (NK) dienten Pankreas-Proben unbehandelter Kontrolltiere (Bahn 2). Gezeigt ist eine Auswahl aus 5 voneinander unabhängigen Experimenten. Die Membran wurde mit einem spezifischen Anti-HSP25 Antikörper in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären Antikörpers 1:10000 (Erläuterungen siehe Text).

HSP60 gehört zu den Hitzeschockproteinen, das schon in größerem Ausmaß

konstitutiv im Pankreas vorliegt [Wagner et al. 1996]. Deshalb wurde in weiteren

Versuchen auch der Einfluss von Hyperthermie-Präkonditionierung auf die

Proteinexpression von HSP60 untersucht. Es zeigte sich, dass HSP60 eher in der

Leber verstärkt exprimiert wird, wogegen durch eine Hyperthermie sich die

Expression von HSP60 im Pankreas nicht mehr sichtbar steigern lässt. Die

Präkonditionierung durch Hyperthermie scheint im Pankreas also nur eine geringe

Rolle bei der Induktion von HSP60 zu spielen (Daten nicht gezeigt).

HSP90 ist ein Hitzeschockprotein welches in vielen Geweben konstitutiv vorliegt

[Tashiro et al. 2002]. Im Pankreas dagegen ließ sich in unseren Versuchen keine

genuine Expression feststellen. Durch thermalen Stress war in unserem Versuch


35

nur eine schwache Expression im Pankreasgewebe feststellbar (Daten nicht

gezeigt).

3.1.2. CoPP induziert die HSP32-Expression im Pankreas

Als nächster Schritt wurden Metalloporphyrine als Werkzeuge eingesetzt (s.

Abschnitt 2.5.3.) und Versuchstiere mit CoPP in verschiedenen Konzentrationen (s.

Tab. 5 unter 3.2.) behandelt. Der Versuchsaufbau erfolgte in Anlehnung an die

Arbeiten von Amersi et al., in denen die Metalloporphyrine, zur Hochregulierung von

HO-1 zur Protektion der Rattenleber bei Ischämie und Reperfusionsschädigung,

verwendet wurden [Amersi et al. 1999].

Abb. 12 Einfluss der Präkonditionierung mit CoPP auf die Induktion von HSP32 im Vergleich mit HSP70

Jeweils 20 µg Protein aus Herz, Pankreas (Pankr.) und Leber (Bahn 3 bis 5) von unbe-handelten Kontrolltieren (NK) oder Tieren die mit 5 mg CoPP i.p. vorbehandelt wurden (CoPP, Bahn 6 bis 8), wurden pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran über-tragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1) oder Pankreasgewebe mit Hyperthermie präkonditionierter Tiere (Pos. Kontr. HSP70, Bahn 2) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Zusätzlich wurde noch eine Negativkontrolle (NK NaOH Pankr., Bahn 9) verwendet. Die Membran wurde zunächst mit einem spez. Anti-HSP32 Antikörper (oberes Panel) in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. Anschließend wurden die Antikörper durch Stripping (Herunterwaschen) entfernt und die


36

Membran dann mit einem spez. HSP70 Antikörper markiert (unteres Panel) (Erläuterungen siehe Text).

In Abbildung 12 ist der Effekt der CoPP-Präkonditionierung auf die HSP32-

Expression dargestellt. Im oberen Panel der Western Analyse mit spezifischen Anti-

HSP32/HO-1 Antikörpern zeigt sich, dass HO-1 im nativen Pankreas (NK Pankr.)

und im nativen Herz (NK Herz) konstitutiv nicht nachweisbar exprimiert wird,

wogegen in der Leber (NK Leber), wie schon in Abbildung 10 gezeigt, eine geringe

Expression nachweisbar scheint.

24 Stunden nach intraperitonealer Applikation von 5 mg CoPP/kg Körpergewicht

zeigt sich eine deutliche Expression von HSP32 in Herz, Pankreas und der Leber,

wobei die stärkste Induktion im Pankreas zu finden ist (Bahn 7). Dass der Träger

bzw. das Lösungsmittel [NaOH], in welchem CoPP zur Applikation gelöst wird,

keinen Einfluss auf die HSP32 Expression hat, lässt sich in Bahn 9 nachvollziehen.

Hier wurden die Versuchstiere nur mit einer dem CoPP-Träger aquivalenten Menge

an [NaOH] vorbehandelt. Es lässt sich dabei keine Induktion durch den Trägerstoff

nachweisen (vgl. auch Abb.17).

Im unteren Panel zeigt sich nach dem Strippen und Markierung derselben Membran

(s. Methoden 6.6.6.) mit einem spezifischen Anti-HSP70 Antikörper vergleichend

keine konstitutive Expression von HSP70 und keine Induktion der Expression nach

Präkonditionierung mit CoPP. Auch hier nimmt wiederum das Lösungsmittel von

CoPP, [NaOH], keinen Einfluss auf die Proteinexpression (Bahn 9).


37

Abb. 13 Dosisabhängige Induktion von HSP32 durch CoPP-Präkonditionierung (Dose response)

Jeweils 20 µg Protein aus Pankreashomogenat von Tieren, welche mit CoPP 5 mg (Bahn 3), 10 mg (Bahn 4 und 5) und 20 mg (Bahn 6 und 7) i.p. vorbehandelt wurden, wurden pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurde rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1, 25 ng) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Die Membranen wurde zunächst mit einem spezifischen Anti-HSP32 Antikörper in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000 (Erläuterungen siehe Text).

In der oben gezeigten Abbildung 13 ist die dosisabhängige Induktion der

Proteinexpression (Dose response) von HSP32 nach CoPP-Präkonditionierung

dargestellt. In der Western Analyse mit spezifischen Anti-HSP32/HO-1 Antikörper

24h nach i.p. Applikation von 5, 10 oder 20 mg CoPP ist eine dosisabhängig

zunehmende Expression von HSP32 im Pankreas demonstriert.

Im Weiteren soll ergänzend noch der vergleichende Einfluss von CoPP auf

HSP25/27 untersucht werden. Hierbei auch im direkten Vergleich zwischen beiden

vorbeschriebenen Präkonditionierungen. Für die Bestimmung eines Expressions-

musters wurden die Versuchstiere einer Hyperthermie- bzw. CoPP-

Präkonditionierung unterzogen und 24h später die HSP-Expression in Pankreas-

homogenaten untersucht.


38

Abb. 14 a/b Einfluss von Hyperthermie und CoPP im Vergleich auf HSP25/27 und 32 im Pankreas

Jeweils 20 µg Protein von Tieren, die mit 5 mg CoPP i.p. vorbehandelt wurden (CoPP, Bahn 3 bis 6), wurden pro Bahn aufgetragen, die Proteine per SDS/Page aufgetrennt und an-schließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurden rekombinantes HSP25 (Pos. Kontr. HSP25, Bahn 2, 20 ng) oder Pankreasgewebe mit Hyperthermie prä-konditionierter Tiere (Bahn 7 und 8, 25 ng) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Zusätzlich wurde noch eine Negativkontrolle (NK Pankr., Bahn 9) verwendet. Die Membran wurde zunächst mit einem spezifischen Anti-HSP25 Antikörper (Abb. 14 a) in


39

einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. Anschließend wurden die Antikörper durch Stripping (Herunterwaschen) entfernt und die Membran dann mit einem spezifischen HSP32 Antikörper markiert (Abb. 14 b). Das schwache Signal in Bahn 6 scheint durch die Auftragung weniger Protein bedingt zu sein und ist wohl hier eher als Auftragungsfehler zu werten bzw. resultiert aus einer stärkeren Verdünnung. Auf der jeweils linken Seite der Abbildungen wurden die Molekulargewichte durch einen Protein-Standard-Marker (schwarze Pfeile), die mitgelaufenen Positivkontrollen jeweils mit weißen Pfeilen auf der rechten Seite markiert. Als Positivkontrollen (die beiden linken Bahnen) diente rekombinantes Protein, als Negativkontrolle (äußerst rechte Bahn) diente unbehandeltes natives Pankreasgewebe.

In Abbildung 14 a sieht man das Expressionsmuster von HSP25/27 in den

Pankreasproben, sowohl 24h nach CoPP-Präkonditionierung, als auch 24h nach

Hyperthermiebehandlung (vgl. Abbildung 11). Im Unterschied zur Induktion durch

Hyperthermie, lässt sich kein eindeutiger Nachweis einer CoPP induzierten HSP25-

Expression erbringen. Die Expression bei den mit CoPP behandelten Tieren dürfte

vielmehr der konstitutiven HSP25-Expression im Pankreas entsprechen [Schäfer et

al. 1999]. Dies gilt analog auch für Abbildung 15, in der eine Expression von HSP25

durch CoPP-Präkonditionierung auch mit steigenden CoPP-Dosen nicht belegt

werden kann.

In Abbildung 14 b zeigt sich nach dem erneuten Waschen, Entfernen des

spezifischen HSP25 Antikörpers (Strippen) und erneuter Markierung derselben

Membran mit einem spezifischen Anti-HSP32 Antikörper, wiederum keine

Expression bzw. Hochregulierung von HSP32/HO-1 nach Hyperthermiebehandlung,

aber erneut eine Expression nach CoPP-Vorbehandlung. Dabei stellt sich in Bahn 6

ein schwächeres Expressionssignal dar. Wegen des geringen Expressionssignals

im Western auch von HSP25 in Abbildung 14 a in dieser Probe, muss hier von einer

geringeren Proteinmenge vorab ausgegangen werden.


40

Abb. 15 Die Induktion von HSP25 nach CoPP-Präkonditionierung mit steigender Dosis

Jeweils 20 µg Protein aus Pankreashomogenat von Tieren, die mit 5 mg (Bahn 1 bis 3), 10 mg (Bahn 4 bis 6) und 20 mg (Bahn 7 und 8) CoPP i.p. vorbehandelt wurden (CoPP, Bahn 1 bis 3), wurden pro Bahn aufgetragen, die Proteine per SDS/Page aufgetrennt und an-schließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Membran wurde zunächst mit einem spezifischen Anti-HSP25 Antikörper in einer Kon-zentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. das schwächere Signal ist am ehesten durch eine geringere aufgetragene Proteinmenge zu begründen.

Da in Abbildung 14 a eine HSP25 Expression in allen Bahnen zu sehen ist, ist in

Abbildung 15 noch einmal das Expressionsmuster mit unterschiedlichen Mengen

CoPP (Dose response) mit spezifischen Anti-HSP25 Antikörper nach Applikation

von CoPP i.p. in einer Auswahl aus 10 voneinander unabhängigen Experimenten

gezeigt. Nach Gabe von 5, 10 oder 20 mg CoPP stellt sich hier keine signifikante

Hochregulierung von HSP25 im Pankreas dar, die unterschiedlichen Intensitäten in

Bahn 3, 6 und 7 sind wohl eher auf verschiedene Experimente und Schwankungen

in den aufgetragenen Proteinmengen zurückzuführen. Dies zeigt, dass HSP25

genuin im Pankreas vorkommt, aber nicht auf die CoPP-Präkonditionierung

anspricht, also pharmakologisch durch CoPP nicht beeinflussbar ist.

Da sich zeigen lässt, dass sich HSP70 durch CoPP-Präkonditionierung nicht

beeinflussen lässt, wurde nun auch das in Verbindung mit HSP70 oft auftretende

HSP60 untersucht. Es wurde die HSP60-Expression auf unterschiedliche CoPP-

Mengen (5, 10 und 20 mg/kg KG) 24h nach i.p. Applikation beurteilt und auch hier


41

konnte keine spezifische Reaktion bzw. dosisabhängige Expression

(Hochregulierung) 24h nach CoPP-Präkonditionierung nachweisbar gezeigt werden

(Daten nicht gezeigt).

3.1.3. Auswirkungen von Caerulein und Caerulein-induzierter Pankreatitis auf die HSP-Expression

Die Induktion einer experimentellen akuten Pankreatitis erfolgte in Anlehnung an die

Vorarbeiten von Sato und Fu [Sato et al. 1997, Fu et al. 1997] und analog der

Arbeiten aus unserer Arbeitsgruppe [Kubisch et al. 2004, Schäfer et al. 2005]

standardmäßig durch Verwendung von Caerulein (pGlu-Gln-Asp-Tyr(SO3H)-Thr-

Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2) (s. Methoden 6.3.). Dabei handelt es sich um ein

Decapeptid und Cholezystokinin (CCK) Analogon, das sich von diesem nur durch

zwei zusätzliche Aminosäuren unterscheidet, die sich im Anschluss an das für die

biologische Aktivität zwingend notwendige Heptapeptid befinden. Die Wirkungen

von Caerulein und CCK auf das Pankreas sind annähernd identisch [Lampel und

Kern 1977].

Nachdem in den vorangegangenen Western-Analysen der Nachweis der

spezifischen pharmakologischen Induktion von HSP32 durch CoPP und HSP70

durch Hyperthermie vergleichend dargestellt und erbracht wurde, soll nun der

Einfluss von Caerulein bzw. der akuten Pankreatitis auf verschiedene

Expressionsmuster gezeigt werden. Interessant ist dabei, dass vorhergehende

Studien nach 12h bzw. 24h eine Induktion von HO-1 durch Caerulein beschreiben

[Fu et al. 1997, Sato et al. 1997]. In dieser Arbeit wird dagegen die Frühphase nach

6h untersucht und dargestellt.


42

Abb. 16 Auswirkung von Caerulein, Hyperthermie und CoPP auf das Expressionsmuster von HSP32 und HSP70 im Vergleich

Jeweils 20 µg Protein aus Pankreashomogenat von unbehandelten Kontrolltieren (Bahn 2 und 3) als Negativkontrolle (NK), von Tieren, welche mit Caerulein 50 µg/kg KG (Bahn 4 und 5), Hyperthermie (Bahn 6 und 7) oder Tieren die mit CoPP 5 mg (Bahn 8) und 10 mg (Bahn 9) i.p. vorbehandelt wurden, pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran über-tragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurde rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Die Membran wurde zunächst mit einem spez. Anti-HSP32 Antikörper (oben) in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären AK 1:10000. Anschließend wurden die Antikörper durch Stripping (Herunterwaschen) entfernt und die Membran dann mit einem spez. HSP70 Antikörper in der Konzentration 1:1000 markiert (unten) (Erläuterungen siehe Text).

In Abbildung 16 wird zuerst die Wirkung von Caerulein auf die HSP32- und HSP70-

Expression im Pankreas ohne Präkonditionierung, wie noch einmal vergleichend,

der Einfluss der verschiedenen Vorbehandlungen mit Hyperthermie und CoPP,

dargestellt. Es sind zum einen Kontrolltiere ohne Vorbehandlung abgebildet (Bahn 2

und 3), wie auch Tiere nach Induktion einer akuten experimentellen Pankreatitis

durch 5-malige stündliche Applikation von Caerulein ohne Vorbehandlung (Bahn 4

und 5), sowie entweder jeweils 24h nach der Präkonditionierung mit Hyperthermie

bzw. mit CoPP (Bahnen 6 bis 9).


43

Das Expressionsmuster in der Western Analyse in Abbildung 16 im oberen Panel

mit Anti-HSP32 zeigt für Caerulein in der Frühphase nach 6h keinen messbaren

Einfluss auf die Expression von HSP32 im Pankreas. Weder im unbehandelten

Pankreasgewebe (NK), noch 6h nach induzierter Pankreatitis durch Caerulein (Cae)

oder 24h nach Präkonditionierung durch Hyperthermie (HT), zeigt sich eine HSP32-

Expression im Pankreas. CoPP-Präkonditionierung führt dagegen nach 24h

dosisabhängig zu einer starken HSP32-Induktion, dieses auch wie zuvor schon

beschrieben mit einer Dose response. Die Banden in der NK Bahn entsprechen

nicht dem Molekulargewicht der Positivkontrolle bzw. resultieren aus der

Überbelichtung und sind somit als unspezifisch anzusehen.

Der Einfluss von Hyperthermie ist, dargestellt im unteren Panel, wie schon vorher

gezeigt und so erwartet, nur auf HSP70 gegeben. Die unterschiedliche Ausprägung

der HSP70 Induktion bei den beiden Proben ist durch Schwankungen im Ausmaß

der durch Hyperthermie vermittelten Induktion der HSP70-Proteinexpression

einerseits und durch Schwankungen der aufgetragenen Proteinmenge zu erklären.

Eine Induktion von HO-1 durch Caerulein, wie in vorhergehenden Studien nach 12h

bzw. 24h beschrieben, lässt sich hierbei nach 6h also nicht nachweisen und scheint

wohl in der Frühphase der akuten Pankreatitis durch Caerulein noch nicht messbar,

was den Daten in der Literatur entspricht [Fu et al. 1997, Sato et al. 1997].

Abbildung 17 zeigt abschießend zwei repräsentative Western Analysen von Tieren,

jeweils während einer akuten, durch Caerulein induzierten Pankreatitis und nach

Präkonditionierung mit CoPP bzw. den Trägerlösungen [NaOH] und [NaCl].


44

Abb. 17 Western Analyse mit Anti-HSP32 und die Auswirkungen von Trägerlösungen auf die HSP32-Expression

Jeweils 20 µg Protein aus Pankreashomogenat von Tieren, welche mit Caerulein 50 µg/kg KG und mit CoPP 5 mg i.p. vorbehandelt wurden (Bahnen 3 bis 6 oben und Bahn 6 und 7 unten), von Tieren, welche mit Caerulein 50 µg/kg KG und mit [NaCl] (Bahn 7 und 8 oben und Bahn 3 unten), sowie [NaOH] (Bahn 4 und 5 unten), jeweils in äquimolarer Konzen-tration zu den Trägersubstanzen, pro Bahn aufgetragen. Die Proteine wurden per SDS/Page aufgetrennt und anschließend per Western-Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Als interner Standard und zur Prüfung der Spezifität der verwendeten Antikörper wurde rekombinantes HSP32 (Pos. Kontr. HSP32, Bahn 1, 25 ng) als Positivkontrolle ebenfalls aufgetragen. Gezeigt ist eine Auswahl aus 10 voneinander unabhängigen Experimenten. Die Membranen wurde zunächst mit einem spezifischen Anti-HSP32 Antikörper in einer Konzentration von 1:5000 markiert, Konzentration des sekundären Antikörpers war 1:10000 (Erläuterungen siehe Text).

In den beiden Panels wird gezeigt, dass eine experimentelle akute Pankreatitis,

durch supramaximale Gabe von Caerulein ausgelöst, nach 6h noch keine

nachweisbare Hochregulierung der HSP32-Expression bedingt, wogegen die 24h

zuvor mit CoPP vorbehandelten (präkonditionierten) Tiere eine deutliche HSP32-

Expression zeigen. Es ist dargestellt, dass die Trägerlösungen [NaOH] oder [NaCl],

welche zur Lösung von CoPP oder Caerulein benötigt werden, sowie der Vorgang

der Injektion als „mechanischer Stress“ hierbei die HSP32-Induktion allein nicht

beeinflussen. Nun soll im folgenden Abschnitt die Qualität der Induktion und die


45

Auswirkung auf spezifische Parameter des Pankreas und der Pankreatitis evaluiert

werden.

3.2. Biochemische Messungen und statistische Analysen Nachdem gezeigt werden konnte, dass eine gezielte pharmakologische Induktion

von HSP32/HO-1 mit CoPP möglich ist und dass die Präkonditionierung mit

Metalloprotoporphyrinen im Besonderen die Expression von HSP32, aber nicht die

anderer HSPs beeinflusst, wurde nun der pharmakologische Einfluss der

HSP32/HO-1 auf die spezifischen biochemischen Parameter des Pankreas, sowie

die Auswirkungen auf den Verlauf der durch Caerulein induzierten Pankreatitis

untersucht und im folgenden Abschnitt dargestellt.

Um die Wirkung einer Präkonditionierung mit CoPP auf die akute Pankreatitis und

den Effekt der Überexpression von HSP32/HO-1 auf die Schwere der akuten

Pankreatitis vergleichend zu untersuchen und genauer zu charakterisieren, wurden

verschiedene pankreasspezifische biochemische Parameter, wie die

Konzentrationen der Enzyme Amylase und Lipase im Blutserum der Versuchstiere,

sowie Trypsin im Pankreasgewebe und der relative Flüssigkeitsgehalt im Pankreas

selbst im Verlauf des Versuches erhoben und in den folgenden Abbildungen

vergleichend dargestellt. Die Versuchstiere wurden, wie in Tabelle 5 beschrieben,

unterschiedlich vorbehandelt.

Tabelle 5 Vorbehandlungen der Versuchstiere in einzelnen Versuchsgruppen

Kontrollgruppe 1 0,9% NaCl Ø Ø

Kontrollgruppe 2 0,9% NaCl 5 mg/kg CoPP Ø

Versuchsgruppe 1 Ø 5 mg/kg CoPP 50 µg/kg Caerulein



Versuchsgruppe 4 0,9% NaCl Ø 50 µg/kg Caerulein

Die Kontrollgruppen erhielten 24h vor der Parameterbestimmung eine

Vorbehandlung entweder mit 0,9% [NaCl] oder mit CoPP, bzw. beidem, da [NaCl]

hier als Verdünnungsmedium von [CoPP/NaOH] verwendet wurde, bzw. der

Injektionsvorgang im Sinne des mechanischen Stresses als Einflussmöglichkeit

ausgeschlossen werden musste. Eine akute experimentelle Pankreatitis durch


46

Caerulein wurde in diesen Gruppen nicht induziert, um für die Auswertung

Nativdaten zu erhalten.

Die Tiere der Versuchsgruppen wurden dementsprechend jeweils 24h vor

Versuchsbeginn mit 5, 10 oder 20 mg/kg KG CoPP i.p. oder ebenfalls einer

äquivalenten Menge an 0,9% [NaCl] i.p. präkonditioniert bzw. behandelt (s.

Methoden 6.1.2.). Die Versuchsgruppen bekamen im Unterschied zur

Kontrollgruppe jedoch am Versuchstag stündliche intraperitoneale Injektionen,

welche die supramaximale Konzentration an Caerulein von 50 μg/kg KG enthielten

(s. Methoden 6.3.), welche zu einer gesteigerten Trypsinaktivität, zu einer

steigenden Lipase- und Amylaseaktivität im Serum, sowie zu einem steigenden

Wassergehalt (Ödembildung) im Pankreasgewebe führten.

Da die Induktion einer Pankreatitis dosisabhängig ist, wurde durch unsere

Arbeitsgruppe zunächst die genaue Menge an Caerulein ermittelt, die nötig ist, um

eine experimentelle akute Pankreatitis zu induzieren und damit sowohl auf

biochemischer, wie auch auf histologischer Ebene charakteristische Veränderungen

hervorzuheben. Zuerst wurde eine Dosis von 10 µg/kg KG Caerulein verwandt, bei

welcher es aber lediglich zu einer geringfügigen Veränderung der biochemischen

Parameter kam, histologische Veränderungen konnten dabei kaum beobachtet

werden (nicht gezeigt). Deshalb wurde die Caeruleindosis auf 50 µg/kg KG oder 100

µg/kg KG erhöht. Hierbei zeigten sich die erwarteten biochemischen und

histologischen Veränderungen aller Parameter. Es stellte sich heraus, dass sich bei

der Dosis von 50 µg/kg KG die pankreasspezifischen Parameter (Trypsin, Lipase,

Amylase, relativer Wassergehalt (Ödembildung) und histologische Veränderungen)

signifikant verändern und die weitere Steigerung der Caeruleinmenge zwar zu etwas

stärkeren Veränderungen der pankreatitisspezifischen Parameter führte, aber kein

weiterer statistisch signifikanter Unterschied zu beobachten war (im Vgl. mit 50

µg/kg KG). Deshalb wurden alle weiteren Experimente mit der Gabe eines Bolus

von 50 µg/kg KG durchgeführt, um eine akute Pankreatitis auszulösen (s. Methoden

6.3.).

In den Abschnitten 3.2.1.2., 3.2.2. und 3.2.3. sind die unterschiedlichen

Auswirkungen auf die oben genannten biochemischen Parameter nach Induktion

einer akuten Pankreatitis in der Frühphase sowie die Beeinflussung durch eine

zuvor erfolgte CoPP-Präkonditionierung graphisch dargestellt (s. Methoden 6.8.).


47

3.2.1. Einfluss der Präkonditionierung auf die Trypsinaktivität in Pankreashomogenaten

Der intrazellulären Trypsinaktivierung in der Frühphase der akuten Pankreatitis

kommt eine zentrale Bedeutung zu. Dieses beschreibt die frühzeitige intrazelluläre

Aktivierung von Verdauungsenzymen, insbesondere die von Trypsinogen zu

Trypsin, das in der Lage ist, die proteolytische Kaskade in Gang zu setzen. Dieses

Phänomen scheint eine zentrale Rolle zu spielen für die Pathogenese der akuten

Pankreatitis (s. Abschnitt 2.2.3.2.).

Als Parameter zur Beurteilung der Pankreatitis ist daher die Messung intrazellulär

aktivierten Trypsins zwingend erforderlich, sowohl bei in vivo (experimentelle

Pankreatitis) als auch bei in vitro Modellen (Azini) des exokrinen Pankreas. Für den

Einfluss einer CoPP-Präkonditionierung und des dadurch gebildeten HSP32 auf die

frühzeitige intrazelluläre Trypsinaktivierung lagen bislang in vivo im Modell der

akuten experimentellen Caerulein-induzierten Pankreatitis keine Daten vor.

3.2.1.1. Validierung der Trypsinbestimmung

Die Methodik zur Trypsinbestimmung und die Messung der Aktivität wurden in

unserer Arbeitsgruppe in Anlehnung an die Methode von Kawabata et al. etabliert

[Kawabata et al. 1988]. Dabei handelte es sich um eine Fluoreszenzmessung, bei

der das Substrat Boc-Gln-Ala-Arg-AMC•HCl durch Trypsin, nicht aber durch

Trypsinogen gespalten wird, wodurch die fluoreszierende Verbindung 7-Amino-4-

methylcoumarin (AMC) entsteht. Die Durchführung der Fluoreszenzmessung

erfolgte analog der Beschreibung im Kapitel Methoden 6.5.3..

Vor jeder Messung von Pankreasproben wurden Standardkonzentrationen von

Trypsin vermessen, um eine Standardkurve (Steigung gegen Trypsinkonzentration)

zu erstellen, damit die Konzentration an Trypsin in den zu vermessenden Proben

berechnet werden konnte. Hierfür wurden Standards mit definierten, vorbestimmten

Trypsinkonzentrationen (z.B. 0,1 ng/ml; 0,3 ng/ml; 0,5 ng/ml; 0,75 ng/ml) hergestellt

und vermessen (s. Methoden 6.5.3.).

Aus den erhaltenen Geraden der vermessenen, verschieden konzentrierten

Standards, wurden die jeweiligen Steigungen ermittelt (s. Abb. 18).


48

Abb. 18 Messung der Zunahme der Fluoreszenz bei definierten Standard-Trypsinkonzentrationen

Beispiel einer Messung der Zunahme der Fluoreszenz über die Zeit, abhängig von unterschiedlichen Trypsinkonzentrationen.

Abb. 19 Kalibriergerade aus den ermittelten Steigungen der Standardkonzentrationen

Darstellung einer Kalibriergerade, die sich ergibt, wenn die Steigungen der einzelnen Intensitätsgeraden gegen die jeweils entsprechende Trypsinkonzentration aufgetragen werden (vgl. Abb.18).

Die berechneten Geradensteigungen wurden dann gegen die dazugehörigen

Trypsinkonzentrationen in ng/ml in einem Koordinatensystem aufgetragen

(s. Abb. 19). Zur Berechnung des Trypsingehaltes der Pankreasproben, wurden die


49

ermittelten Steigungen aus den vermessenen Proben jeweils in die

Geradengleichung der Kalibriergeraden y = mx eingesetzt, wobei m der Steigung

der Kalibriergeraden entspricht. Indem man für x die Geradensteigung der

jeweiligen Probe einsetzt, erhält man folglich als y die Konzentration an Trypsin in

der zu bestimmenden Probe. Bei Proben, die für die Vermessung verdünnt wurden,

musste anschließend der jeweilige Verdünnungsfaktor mit in das Ergebnis

eingerechnet werden, um die tatsächliche Trypsinkonzentration in der Probe zu

erhalten.

3.2.1.2. Bestimmung von Trypsin in Pankreashomogenaten

In Abbildung 20, ist graphisch die pankreatische Trypsinaktivität dargestellt. Sechs

Stunden nach Versuchsbeginn erkennt man einen deutlichen Anstieg der Aktivität

der Versuchsgruppen gegenüber den Kontrollgruppen (vgl. mittleren Balken mit

Balken 1 und 2 oben), was die Ausprägung der induzierten akuten Pankreatitis

beschreibt. Dabei besteht ein signifikanter Unterschied zwischen den

Versuchstieren mit und ohne Präkonditionierung (p < 0,01), wobei der größte Effekt

hier bei der Präkonditionierung mit 5 mg/kg CoPP zu sehen ist (vgl. hierzu mittleren

Balken mit den Balken 4 und 5 unten).

Abb. 20 Trypsinaktivität im Pankreasgewebe

Die Ergebnisse sind bei Mehrfachbestimmungen als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt; die Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe ist unter (n) angegeben. Balkenbezeichnung 1-5 von oben nach unten.


50

Bei der Trypsinbestimmung (s. Abb. 20) nach Induktion einer Caeruleinpankreatitis

lässt sich für die nicht CoPP-präkonditionierten Versuchstiere (Anzahl n = 17,

Balken 3), ein Mittelwert von 845,65 fmol/mg Protein bei einer Standardabweichung

von 266,32 und einer SEM von 64,59 angeben.

Die Werte von mit CoPP vorbehandelten Versuchstieren ergaben nach Induktion

einer Caeruleinpankreatitis bei 5 mg/kg CoPP (Balken 4) einen Mittelwert von

234,40 fmol/mg mit einer Standardabweichung von 161,09 und einer SEM von

53,70 und für 10 mg/kg CoPP (Balken 5) einen Mittelwert von 328,18 fmol/mg mit

einer Standardabweichung von 150,60 und einer SEM von 50,20. In beiden

Versuchsgruppen betrug die Anzahl der Versuchstiere n = 9.

Die Caerulein-induzierte Trypsinaktivität in Pankreashomogenaten war in beiden

CoPP-Versuchsgruppen (Balken 4 oder 5) signifikant niedriger (p < 0,001) im

Vergleich mit der Gruppe, welche nur mit [NaCl] vorbehandelt wurde (Balken 3).

Vergleicht man dabei beide CoPP-Gruppen untereinander, zeigt sich kein

signifikanter Unterschied (p = 0,220).

3.2.2. Einfluss der Präkonditionierung auf die Sekretion von Lipase und Amylase

Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Präkonditionierung mit

Metalloprotoporphyrinen im besonderen die Expression von HSP32 und damit die

Trypsinaktivität im Pankreashomogenat beeinflusst, wurde untersucht, inwiefern

sich die Lipase- und Amylasesekretion, sowie die jeweilige Enzymaktiviät im

Blutserum nach Induktion einer akuten Pankreatitis in der Frühphase, durch eine

zuvor erfolgte CoPP-Präkonditionierung, beeinflussen lassen.


51

Abb. 21 Aktivität der Lipase im Serum der Versuchstiere


Bei der Lipasebestimmung (s. Abb. 21) nach Induktion einer Caeruleinpankreatitis

lässt sich für die nicht mit CoPP präkonditionierten Versuchstiere (Balken 3) ein

Mittelwert von 668,88 U/l bei einer Standardabweichung von 327,21 und einer SEM

von 79,36 angeben. Die Werte der mit CoPP vorbehandelten Versuchstieren

ergaben nach Induktion einer Caeruleinpankreatitis bei 5 mg/kg CoPP (Balken 4)

einen Mittelwert von 268,66 U/l mit einer Standardabweichung von 131,48 und einer

SEM von 43,83 und für 10 mg/kg CoPP (Balken 5) einen Mittelwert von 163,88 mit

einer Standardabweichung von 116,23 und einer SEM von 38,74. In beiden


Dabei ergibt sich für den Vergleich der nur mit [NaCl] vorbehandelten Tiere mit 5

mg/kg CoPP (Balken 3 mit 4) ein statistisch signifikanter Unterschied von p = 0,002.

Der Caerulein-induzierte Anstieg der Lipaseaktivität war in beiden CoPP

Versuchsgruppen signifikant geringer als im Vergleich mit der Versuchsgruppe mit

NaCl Vorbehandlung (p < 0,001). Der Vergleich der Gruppen 5 mit 10 mg/kg KG

CoPP (Balken 4 mit 5) zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied.


52

Abb. 22 Aktivität der Amylase im Serum der Versuchstiere


Bei der Amylasebestimmung (s. Abb. 22) nach Induktion einer Caeruleinpankreatitis

lässt sich für die nicht mit CoPP präkonditionierten Versuchstiere (Balken 3) ein

Mittelwert von 483,18 U/l bei einer Standardabweichung von 122,62 und einer SEM

von 29,74 angeben.

Die Werte der mit CoPP vorbehandelten Versuchstieren ergaben nach Induktion


452,89 U/l mit einer Standardabweichung von 164,00 und einer SEM von 54,67 und

für 10 mg/kg CoPP (Balken 5) einen Mittelwert von 423,22 U/l mit einer

Standardabweichung von 151,44 und einer SEM von 50,48. In beiden


Im Unterschied zu den Effekten von Caerulein auf die Trypsinaktivierung und die

Serumlipase-Werte zeigte die CoPP-Vorbehandlung keinen Effekt auf die Caerulein-

induzierte Amylase-Erhöhung (p = 0,599 für 5 mg/kg und p = 0,285 für 10 mg/kg).

Auch der direkte Vergleich beider CoPP-präkonditionierten Gruppen untereinander

(Balken 4 mit 5) zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,695).

Die Aktivität von Lipase (s. Abb. 21) und Amylase (s. Abb. 22) im Serum ist im

Vergleich zu den Kontrollgruppen deutlich um ein vielfaches erhöht (vgl. jeweils


53

Balken 3 mit Balken 1 und 2), was in den durchgeführten Versuchen die Qualität der

Ausprägung der akuten Pankreatitis nach 6h sehr gut beschreibt. Die eigentliche

Verabreichung bzw. manuelle Injektion des Caerulein bzw. [NaCl / NaOH] scheint

als traumatische Ursache hierbei keinen Einfluss zu nehmen (siehe jeweilis Balken

1 und 2).

3.2.3. Ödembildung und relativer Wassergehalt

In Abbildung 23 (vgl. mittleren Balken mit Balken 1 und 2) kann man die deutliche

Zunahme des Feuchtgewichts 6 Stunden nach einer durch Caerulein induzierten

akuten Pankreatitis bei den Versuchsgruppen erkennen. Dieses entspricht der

Entstehung eines Pankreasödems im Rahmen der frühen Entzündungsreaktion. Es

wurde das Verhältnis von Feucht- zu Trockengewicht (nach 48h) dargestellt, der

Flüssigkeitsgehalt als prozentualer Anteil am Pankreasgewebe angegeben.

Auch hier fand sich ein signifikanter Unterschied zur CoPP-Vorbehandlung (vgl.

mittleren Balken mit Balken 4 und 5). Der größte Effekt zeigt sich, wie bei der

Trypsinaktivität (s. Abb. 20), wiederum bei 5 mg/kg KG CoPP (Balken 4), hier stellte

sich die geringste Ödembildung dar.

Abb. 23 Relativer Wassergehalt des Pankreas (Feuchtgewicht)

Die Ergebnisse sind als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt; die Anzahl der Versuchstiere pro Gruppe ist unter (n) angegeben. Balkenbezeichnung 1-5 von oben nach unten.


54

Diese Daten passen auch sehr gut zu den makroskopischen und mikroskopischen

Bildern in denen sich dieser Effekt sehr gut nachvollziehen lässt (s. Abschnitt 3.3.).

Bei der Bestimmung des relativen Wassergehaltes (RWC) nach Induktion einer

Caeruleinpankreatitis lässt sich für die nicht mit CoPP präkonditionierten

Versuchstiere (Anzahl n = 17, Balken 3) ein Mittelwert von 89,59% bei einer

Standardabweichung von 1,76% und einer SEM von 0,47 angeben.

Die Werte der mit CoPP vorbehandelten Versuchstiere ergaben nach Induktion


77,00% mit einer Standardabweichung von 5,91% und einer SEM von 1,97 und für

10 mg/kg CoPP (Balken 5) einen Mittelwert von 86,23% mit einer

Standardabweichung von 2,41% und einer SEM von 0,8. In beiden


Im direkten Vergleich je einer CoPP-Versuchsgruppe (Balken 4 oder 5) mit der

Gruppe, welche nur mit [NaCl] vorbehandelt wurde (Balken 3), ließ sich jeweils ein

signifikanter Unterschied von p < 0,001 beobachten. Der Vergleich beider CoPP-

Gruppen untereinander (Balken 4 mit 5) zeigt in diesem Fall einen deutlichen

stärkeren Effekt nach Vorbehandlung mit 5 mg/kg Copp im Vergleich zu 10 mg

CoPP (p < 0,001).

Bei der Präkonditionierung der Gruppe der Versuchstiere mit 10 mg/kg CoPP fällt im

Vergleich mit der Gruppe, welche mit 5 mg/kg CoPP vorbehandelt wurden, eine

sehr starke Zunahme des Feuchtgewichtes auf. Somit scheint der protektive Effekt

der höheren CoPP-Dosierung geringer zu sein. Bei den biochemischen Messungen

ließ sich dies nicht so beobachten (s. Abbildungen 20 bis 22). Möglicherweise

werden die protektiven Effekte der CoPP-Präkonditionierung durch toxische Effekte

der höheren Dosierung zum Teil aufgehoben [Dennery 2000].

3.3. Histologische und makroskopische Morphologie In den morphologischen Analysen wurde die Auswirkung einer Caerulein-

induzierten Pankreatitis im Vergleich zur CoPP-Präkonditionierung in der Frühphase

dokumentiert. Hierbei konnte schon, wie in den oben genannten biochemischen

Messungen angedeutet, eine deutliche Reduktion der histologischen Parameter, wie

z.B. die Ödemgröße, im Vergleich zu Tieren die keine CoPP-Präkonditionierung

erhalten haben, beobachtet werden.


55

Die morphologischen und histologischen Veränderungen nach einer akuten

Pankreatitis wurden in Pankreasgewebe beschrieben, welches während Präparation

und Resektion, sowie im Rahmen von Autopsien gewonnen wurde (s. Methoden

6.2.). Es zeigten sich hierbei in den milden akuten Formen, dass größtenteils die

Veränderungen im Pankreasödem lagen, während schwere Pankreatitiden sich

durch Nekrose, Hämorrhagie, Abszeß und Flüssigkeitsansammlungen

auszeichneten. In dieser Arbeit wurde das Bild einer akuten Pankreatitis in der

Frühphase (6h) dargestellt.

Abb. 24 Darstellung des OP-Situs eines Tieres ohne CoPP-Präkonditionierung nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis

Dargestellt ist ein abdomineller Situs ohne CoPP-Präkonditionierung (24h nach [NaCl] i.p.) und 6h nach Caerulein-Gabe. Die weißen Pfeile bezeichnen das stark ödematös veränderte Pankreasgewebe.

Auf den Abbildungen 24 bis 27 ist jeweils ein geöffnetes Abdomen während eines

Versuches bei den Versuchstieren (Ratten) dargestellt. Die Organe sind zur

besseren Orientierung beschriftet, die weißen Pfeile bezeichnen in den jeweiligen

Bildern das Pankreasorgan.


56

Die Tiere auf den Abbildungen 24 und 25 wurden jeweils 24 Stunden vor Induktion

einer akuten experimentellen Pankreatitis mit einer dem CoPP äquivalenten Menge

an Trägerlösung [NaCl / NaOH], die Tiere auf den Abbildungen 26 und 27 mit 5

mg/kg KG CoPP (s. Methoden 6.1.2.) vorbehandelt. Zur Induktion der akuten

Pankreatitis bekamen die Versuchstiere am Versuchstag stündlich (insgesamt 5-

mal) eine intraperitoneale Injektion, welche die supramaximale Konzentration an

Caerulein von 50 μg/kg KG enthielt (s. Methoden 6.3.).

Abb. 25 Darstellung des OP-Situs eines Tieres ohne CoPP-Präkonditionierung nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis

Dargestellt ist ein abdomineller Situs ohne CoPP-Präkonditionierung (24h nach [NaCl] i.p.) und 6h nach Caerulein Gabe. Die weißen Pfeile bezeichnen das stark ödematös veränderte Pankreasgewebe.

Im direkten Vergleich der jeweiligen OP-Situs kann man makroskopisch deutlich die

verstärkte Ödembildung bei den Tieren ohne CoPP-Vorbehandlungen sehen (weiße

Pfeile auf Abb. 24 und 25). Es ist eine stärkere Flüssigkeitsansammlung im

Abdomen feststellbar und das Pankreas wirkt größer in seiner Substanz und

ödematös aufgequollen.


57

Im Gegensatz dazu erscheint die Ödembildung im Pankreas nach der CoPP-

Vorbehandlung in den Abbildungen 26 und 27, trotz gleicher Behandlung mit

Injektionen derselben Konzentration an Caerulein, makroskopisch nur sehr gering

ausgebildet bzw. nicht vorhanden. Es zeigt sich also hier, was das makroskopische

Bild betrifft, eine gewisse Protektion gegenüber einer durch Caerulein induzierten

Pankreatitis.

Abb. 26 Darstellung eines OP-Situs eines durch CoPP-Präkonditionierung vorbehandelten Tieres nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis

Dargestellt ist ein abdomineller Situs 24h nach intraperitonealer CoPP-Präkonditionierung mit 5 mg/kg CoPP und 6h nach Caerulein Gabe. Die weißen Pfeile bezeichnen hierbei, im Vergleich zu den nicht präkonditionierten Tieren (vgl. Abb. 24 und 25), gering verändertes Pankreasgewebe.


58

Abb. 27 Darstellung eines OP-Situs eines durch CoPP-Präkonditionierung vorbehandelten Tieres nach Induktion einer experimentellen Pankreatitis

Dargestellt ist ein abdomineller Situs 24h nach intraperitonealer CoPP-Präkonditionierung mit 5 mg/kg CoPP und 6h nach Caerulein Gabe. Die weißen Pfeile bezeichnen hierbei, im Vergleich zu den nicht präkonditionierten Tieren (vgl. Abb. 24 und 25), nur gering verändertes Pankreasgewebe.

Das mikroskopische Bild in den Abbildungen 28 bis 30 bestätigt die makroskopische

Aussage. Auch hier kann man durch die Präkonditionierung eine Verminderung des

histologischen Schweregrades im Rahmen der Gewebsveränderungen in der

Frühphase der Caerulein-induzierten Pankreatitis erkennen. Im Vergleich des

nativen Pankreasgewebes mit den Pankreatitisbildern (vgl. Abb. 28 mit Abb. 29 und

30) stellt sich eine deutlichere Gewebsveränderung bei den Tieren ohne

Präkonditionierung dar. Die größten Unterschiede zeigen sich dabei am deutlichsten

in der Ausprägung des Gewebeödems. Größere Zellschäden lassen sich hierbei in

der Frühphase nur vereinzelt ausmachen.


59

Abb. 28 Darstellung von nativem Pankreasgewebe eines Versuchstieres

Abb. 29 Darstellung von Pankreasgewebe eines Versuchstieres 6h nach Caerulein-induzierter Pankreatitis


60

Abb. 30 Darstellung von Pankreasgewebe eines Versuchstieres 6h nach Caerulein-induzierter Pankreatitis und 24h nach CoPP-Präkonditionierung

Kapitel 4 Diskussion

61

4. Diskussion Die Untersuchung der Stressreaktion der Bauchspeicheldrüse bildet die Grundlage

der vorliegenden Arbeit, mit dem Ziel die Mechanismen, die zur Entstehung einer

akuten Pankreatitis führen, noch besser zu verstehen. Zu den typischen Ursachen,

die zu einer akuten Pankreatitis führen, wie z.B. Alkoholabusus, eingeklemmte

Gallensteine oder die Einnahme bestimmter Medikamente, kann eine Pankreatitis

auch iatrogen ausgelöst werden, wie z.B. nach einer ERCP oder nach

extrakorporalem Kreislauf in der Herzchirurgie. Dadurch, dass eine Pankreatitis

einen sehr schweren und mitunter lebensbedrohlichen Verlauf nehmen kann, wäre

demnach eine klinische anwendbare Form der Präkonditionierung und damit der

induzierbaren Protektion von größtem Nutzen. Präkonditionierung als Möglichkeit

einer Organschädigung vorzubeugen, sowie das Ausmaß der Schädigung zu

reduzieren, eignet sich dabei selten zur Protektion von spontan erworbenen bzw.

auftretenden Erkrankungen. Hingegen ist sie eine durchaus sinnvolle Methode, um

z.B. iatrogen verursachte Schädigungen, wie z.B. bei der durch die ERCP

induzierten Pankreatitis, zu minimieren [Raeburn et al. 2001, Cleveland et al. 2001].

In vorangegangen Studien konnte bereits belegt werden, dass eine

Präkonditionierung oder Prästimulation durch geeignete Stressoren, wie z.B. die

Hyperthermie, geeignet ist, eine akute Pankreatitis, zumindest im Tiermodell, zu

verhindern oder wenigstens deutlich abzuschwächen. Es wurde dabei von

verschiedenen Arbeitsgruppen der Beweis erbracht, dass diese Methode in

Verbindung mit der Induktion und Expression von Hitzschock- oder Stressproteinen

steht und im Pankreas Schutz vor einer akuten Pankreatitis bietet [Wagner et al.

1996, Bhagat et al. 2000 und 2002, Frossard et al. 2002]. Die Induktion von

Hitzeschockproteinen, besonders von HSP70 und HSP32, aber auch HSP27, ist an

vielen verschiedenen Organsystemen in unterschiedlichen Studien über die

Regulations- und Schutzmechanismen an in vivo sowie in vitro Modellen untersucht

worden und nach Präkonditionierung auch protektiv wirksam [Elbirt et al. 1999,

Immenschuh und Ramadori 2000, Otterbein und Choi 2000]. Im Pankreas sind

insbesondere HSP70 und HSP27 bezüglich Ihrer protektiven Wirkung untersucht

und beschrieben worden [Wagner et al. 1996, Bhagat et al. 2000 und 2002,

Frossard et al. 2002, Kubisch et al. 2004].

Die Induktion durch einen Stressreiz wie Ischämie oder Hyperthermie ist dabei einer

der wichtigen Mechanismen bei der Präkonditionierung [Redaelli et al. 2001,


62

Frossard et al. 2002, Jaeschke 2003]. Auch bei der Ischämie-Reperfusions-

Schädigung (IRS) am Herzen konnte eine Hyperthermie-Präkonditionierung die

Infarktgröße deutlich verringern [Donnelly et al. 1992, Plumier und Currie 1996] und

besaß im Rahmen von Ischämien im Bereich des ZNS ein protektives Potential

[Franklin et al. 2005]. Dieses Verfahren der Hyperthermie-Präkonditionierung ist

jedoch klinisch schlecht einsetzbar.

In dieser Arbeit wurde die Induktion und Regulation der HSP32/HO-1, einem

Vertreter der intrazellulären Stress- bzw. Hitzeschockproteine, unter experimentellen

Stressbedingungen, wie der durch Caerulein induzierten, akuten Pankreatitis,

untersucht. HO-1 ist, wie auch schon in Abschnitt 2.5. beschrieben, durch Häm, wie

auch eine Vielzahl anderer Substanzen, wie Schwermetalle, Endotoxine,

Hitzeschock, Zytokine oder Prostaglanine induzierbar [Choi und Alam 1996]. Neben

der Rolle der Hämdegradation, kann eine Überexpression von HO-1 eine defensive

Rolle gegen oxidativen Stress unter Entzündungs- oder Irritationsbedingungen

spielen [Nath et al. 1992, Vogt et al.1995 und 1996] und hat sich in verschiedenen

Zelltypen als protektiv gegen oxidativen Stress erwiesen [Wong und Wispe 1997].

Am Herzen ist dieser protektive Effekt bislang am besten beschrieben. So ist der

myokardiale Schaden nach IRS bei transgenen Mäusen, die menschliches HO-1-

Gen erhalten haben, verringert. Die Induktion des Enzyms durch exogenes Häm

reduziert die Infarktgröße [Yet et al. 2002].

Um einen begründeten Effekt nun einem einzelnen HSP, wie HSP32/HO-1

zuzuschreiben, kann man dieses entweder durch Überexpression, wie in dieser

Arbeit durchgeführt, oder durch Hemmung [Amersi et al. 1999] beeinflussen. Die

HO-1 lässt sich im Unterschied zu anderen Hitzeschockproteinen, biochemisch mit

verschiedenen Porphyrinen entweder hemmen (Zink-Protoporphyrin (ZnPP), Zinn-

Protoporphyrin (SnPP)) [Labbe et al. 1999], oder wie in Abschnitt 2.5.3. dargestellt,

durch Kobalt-Protoporphyrin (CoPP) aktivieren. So konnte zum Beispiel in

Vorarbeiten gezeigt werden, dass die IRS (Ischämie-Reperfusions-Schäden) von

transplantierten Lebern im Modell von übergewichtigen Zucker Ratten (genetically

fat Zucker rats) durch Induktion der HO-1 mit Kobalt-Protoporphyrin reduziert und

durch Hemmung der HO-1 mit Zink-Protoporphyrin verstärkt werden kann [Lee et al.

1996, Amersi et al. 1999]. In diesen Studien wurde dabei eine konstitutive HO-1

Expression in Leberzellen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu konnte in unserem

Versuchsaufbau keine konstitutive HSP32-Expression im Pankreasgewebe


63

nachgewiesen werden (s. Abb. 12). Auch andere Studien zeigen keine bzw. nur

eine sehr geringe konstitutive Expression im Pankreasgewebe [Sato et al. 1997, Fu

et al. 1997]. Deshalb lag der Fokus der vorliegenden Arbeit entsprechend auf der

Induktion und Expression von HSP32/HO-1 mit CoPP und nicht auf der Suppression

mit SnPP oder ZnPP.

Es wurden dazu Möglichkeiten der pharmakologischen Induktion des HSP32/HO-1

untersucht und angewandt. Kobalt gehört, wie in der Literatur beschrieben, zu den

potenten Induktoren der HO-1 [Maines 1988]. In dieser Arbeit wurde untersucht,

inwiefern HSP32/HO-1 im Pankreas exprimiert wird und durch Kobalt-

Protoporphyrin (CoPP) induzierbar ist. CoPP induzierte dabei den Anstieg der HO-1

Proteinexpression im Pankreasgewebe analog anderer Studien, in denen bei in vivo

Experimenten mit Mäusen, durch CoPP-Injektion, ein Anstieg der HO-1

Proteinexpression nach 24h in der Milz, der Leber und der Niere nachgewiesen

werden konnte [Woo et al. 1998, Amersi et al. 1999]. Eine Therorie besagt, dass

CoPP über die Verschiebung des oxidativen Gleichgewichtes durch Reduktion der

intrazellulären GSH Konzentration mit konsekutivem Anstieg der freien

Peroxidkonzentration die HO-1 mRNA Expression induziert [Dennery 2000].

In den durchgeführten Versuchen zeigte sich 24 Stunden nach intraperitonealer

Gabe von 5 mg CoPP eine deutliche Proteinexpression unter anderem in Pankreas,

Leber und Herz (s. Abb. 12). Die Induktion und Expression konnte im weiteren

Verlauf dosisabhängig gesteigert werden, mit maximaler Expression bei ca. 20

mg/kg CoPP i.p. (s. Abb. 13), so dass man von einer Dosisabhängigkeit (Dose

Response) sprechen kann. Einen ähnlichen Effekt konnte auch Sato et al [Sato et

al. 1997] in Pankreas βTC3-Zellen nachweisen, indem er diese mit verschiedenen

Stressoren wie CdCl2, Diethylmaleat (DEM) oder H2O2, welches Sauerstoffradikale

freisetzt, in steigender Konzentration inkubierte und eine Zeit- sowie dosisabhängige

Steigerung der HO-1-Expression darstellte.

Die Auswirkungen auf die Parameter der experimentellen Pankreatitis zeigten in

dieser Arbeit allerdings eher eine biphasische Antwort mit maximalen Effekten bei 5

mg und geringerer Reduktion des Schweregrades bei höheren Dosierungen (vgl.

Abb. 20 bis 22 in Abschnitt 3.2.). Das Lösungsmittel von CoPP [NaOH], hatte dabei,

wie auch [NaCl] als Lösungsmittel von Caerulein, keinen Einfluss auf die HSP32-

Expression. Genauso wenig beeinflusste die mechanische Injektion als

traumatische Ursache die Proteinexpression.


64

Im Unterschied zur Hyperthermie-Präkonditionierung stellte sich heraus, dass die

Präkonditionierung mit CoPP spezifisch zur Induktion von HSP32/HO-1 führt und in

den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen (s. Abschnitt 3.1.2.) keinen Einfluss

auf die Expression von HSP70, HSP25/27 und HSP60 im Pankreasgewebe hat. Die

Präkonditionierung mit CoPP erlaubt also in dem in dieser Arbeit angewandten

Modell, isoliert die Effekte der Expression von HSP32 auf die Pankreatitis zu

beobachten, da eine spezifische pharmakologische Regulation möglich ist. Auch

zeigen die gewonnenen Daten, dass die in den Versuchen verwendeten Antikörper

sensitiv und spezifisch sind.

Vergleicht man dagegen die vorher beschriebene Methode der Hyperthermie-

Präkonditionierung als etablierte experimentelle Methode [Wagner et al 1996], mit

der Induktion und Expression von HSP32 im Pankreas, zeigt sich zwar ein

deutlicher Effekt auf die Expression anderer Hitzschockproteine wie HSP70, HSP60,

HSP 90 und HSP25/27 einzeln oder in Kombination, nicht jedoch auf HSP32 im

Pankreas. Es zeigte sich dagegen eine Hyperthermie-induzierte Induktion der

HSP32-Expression in der Leber (s. Abb. 10). Passend zu diesen Daten wurde eine

Hyperthermie-induzierte Expression von HSP32 in Leber und Niere auch von

anderen Arbeitsgruppen gefunden. In diesen Organen wird die Hämoxygenase-1

(HSP32) durch Hyperthermie in den Mechanismus der Präkonditionierung mit

einbezogen und induziert [Amersi et al. 1999, Redaelli et al. 2001 und 2002].

Es zeigt sich also, dass die Hyperthermie-Präkonditionierung mehrere HSPs

hochregulieren kann und die Untersuchung des Effektes einzelner HSPs

problematisch ist, da die Effekte der verschiedenen induzierten HSPs nicht oder nur

schwer getrennt werden können.

HSP32/HO-1 kann neben CoPP auch durch andere Agenzien, wie durch oxidativen

Stress [Applegate et al. 1991, Tyrrell und Basu-Modak 1994] sowie z.B. durch

Caerulein i.p. im Pankreasgewebe induziert werden [Fu et al. 1997]. Es wurde in

vorangegangenen Studien gezeigt, dass Caerulein auf mRNA Ebene die Expression

von HSP32/HO-1 mRNA im Pankreas rasch und koordiniert hochreguliert, dabei

konnte aber zuerst der Anstieg von TNF-α und die Infiltration von Makrophagen

nachgewiesen werden [Norman et al. 1995]. Das Ausmaß der Proteinbildung stieg

in in vivo Experimenten mit Mäusen in der Frühphase der akuten, Caerulein-

induzierten Pankreatitis (bis 6h) nur sehr gering an [Fu et al. 1997] und führte erst 7-

12h nach Caeruleininjektion auch auf Proteinebene zur deutlich nachweisbaren


65

Expression von HSP32 im Pankreas. Passend zu unseren Beobachtungen haben

Sato et al. ergänzend festgestellt, dass HSP32 nur in sehr niedrigen Basisspiegeln

im Pankreas in vivo und in Azinuszellen in vitro exprimiert wird [Sato et al. 1997].

Die Caerulein-induzierte akute Pankreatitis war hier mit einem signifikanten

Ansteigen der Expression von pankreatischem HSP32 erst 12-24 Stunden nach den

ersten Zeichen von intestinalem Ödem im Pankreas der Versuchstiere (Ratten)

verbunden. Der zeitliche Verlauf dieser selektiven Induktion von HO-1 im Pankreas

in vivo spiegelt wahrscheinlich eine anlagebedingte Reaktion (Antwort) auf die

Bildung von reaktiven oxidativen Radikalen in der Frühphase der akuten

Pankreatitis wider [Schoenberg et al. 1992 und 1995, Luthen et al. 1995].

In dieser Arbeit wurden auf dieser oben genannten Grundlage die Effekte von

Caerulein in einem experimentellen Versuchsaufbau auf die HSP32-Expression

untersucht. Hier zeigte sich, dass in diesem System Caerulein innerhalb von 6h

(Frühphase) nicht zu einer nachweisbaren Proteinexpression von HSP32/HO-1 im

Pankreas führt (s. Abb. 16 und 17). Somit ist das gewählte System der

pharmakologischen Präkonditionierung mit CoPP in dieser Arbeit gut geeignet, für

die individuelle Analyse der Effekte der Induktion von HSP32/HO-1 auf den Verlauf

der Caerulein induzierten Pankreatitis. Dies ist im Unterschied zur Hyperthermie-

Präkonditionierung von Vorteil, da durch diese mehrere Hitzeschockproteinklassen

(z.B. HSP70, HSP25/27 und HSP60) induziert werden können [Redaelli et al. 2001

und 2002, Jaeschke 2003]. Auch ist in der hier gewählten Methode durch die

Caeruleingabe alleine noch keine Expression von HSP32/HO-1 nachweisbar, da die

Tiere vor Beginn der ausschließlich durch Caerulein-induzierten Proteinexpression

getötet werden.

Wie in der Einleitung schon erläutert, stellt die intrazelluläre Aktivierung von Trypsin

ein zentrales Phänomen für die pathophysiologischen Vorgänge in der Frühphase

der akuten Pankreatitis dar. Verschiedene Studien der letzten Jahre konnten zeigen,

dass die Entstehung und Entwicklung einer akuten Pankreatitis ihren Anfang in der

Azinuszelle nimmt und die frühzeitige und intrazellulär stattfindende Aktivierung von

Verdauungsenzymen dabei eine entscheidende Rolle spielt [Saluja et al. 1999,

Whitcomb et al. 1999, Bhagat et al. 2000]. Die Unterbindung dieser schädlichen

Aktivierung von Trypsin in der Azinuszelle spielt vermutlich eine entscheidende

Rolle für die Abschwächung des Schweregrades des Verlaufs der akuten

experimentellen Pankreatitis und dürfte auch eine entscheidende Rolle für die


66

Protektion des Pankreas in diesem Zusammenhang spielen [Leach et al. 1991,

Saluja et al. 1999, Whitcomb et al. 1999]. Auf diesem Hintergrund wurde in dieser

Arbeit untersucht, ob der protektive Effekt auf die akute Pankreatitis durch eine

vorangegangene CoPP-Präkonditionierung und die damit verbundene Expression

von HSP32/HO-1 in einer Änderung dieser initial in der Zelle ablaufenden

schädlichen Trypsinogenaktivierung liegt [Witt et al. 2001]. Dafür wurde ein Modell

gewählt, mit dem es möglich war, die intrazelluläre Aktivität von Trypsin und die

Sekretion darzustellen und zu quantifizieren (s. Abschnitt 3.2.1. und Methoden

6.5.3).

Betrachtet man die Auswirkung der CoPP-Präkonditionierung auf die

Trypsinaktivierung in dieser Arbeit (s. Abb. 20), so zeigt sich eine direkte Inhibierung

der frühzeitigen und intrazellulären Aktivierung von Trypsin nach Gabe

supramaximaler Caerulein-Konzentrationen, mit ähnlichen Phänomenen, wie denen

der in der Literatur beschriebenen Versuchen mit HSP27 [Schäfer et al. 2000,

Kubisch et al 2004]. Auch Bhagat et al. konnten zeigen, dass eine Protektion in

Zusammenhang mit einer Reduktion der Trypsinogenaktivierung steht [Bhagat et al.

2000]. Im Prankreashomogenat, welches von präkonditionierten Tieren gewonnen

wurde, konnte eine schwächere Aktivierung des intrazellulären Trypsins beobachtet

werden, als dies bei den Zellen der Fall war, welche von Ratten isoliert wurden, die

nicht zuvor präkonditioniert waren. Zusammen mit der ebenfalls in dieser Arbeit

beobachteten starken Expression von HSP32 kann dies als Indiz dafür gewertet

werden, dass der Mechanismus der Protektion gegen die Entstehung einer

Pankreatitis in der verringerten Aktivierung des intrazellulären Trypsins zu sehen ist.

Der Mechanismus durch den HSP32 dabei in die Caerulein-induzierte intrazelluläre

Trypsinaktivierung eingreift, bleibt dabei allerdings weiter unklar. Viele

Arbeitsgruppen nehmen an, dass der Prozess der intrazellulären Trypsinaktivierung

durch eine Colokalisation von Trypsinogen und anderen Zymogenen mit

lysosomalen Hydrolasen insbesondere Cathepsin B in instabilen intrazellulären

Organellen hervorgerufen wird [Gorelick et al. 1992, Saluja et al. 1997].

Experimente an Cathepsin B -/- knock-out Mäusen zeigten, dass die Caerulein

induzierte, intrazelluläre Trypsinaktivierung bei diesen Mäusen um bis zu 90%

reduziert gegenüber Wildtypmäusen, aber nicht gänzlich verschwunden ist [Saluja

et al. 1997].


67

Im Folgenden wurden dann in weiteren experimentellen Gruppen die Entwicklung

typischer Pankreatitisparameter, wie die Amylase und Lipase im Serum untersucht.

Dabei wurden unbehandelte Kontrolltiere, mit Tieren, welche lediglich 5-malig

Caerulein i.p. erhielten und Tieren die 24h vor Caeruleingabe mit 5 oder 10 mg/kg

CoPP i.p. prästimuliert worden waren, verglichen. Hier zeigte sich bei den

spezifischen Pankreasenzymen nach Induktion einer Pankreatitis ein deutlicher

Anstieg der Enzymaktivität, wobei sich für die Präkonditionierung bezüglich der

biochemischen Parameter der Pankreatitis eine Verringerung des Schweregrades

der Caerulein-induzierten Pankreatitis dokumentieren lässt. Dies gilt insbesondere

für die Verringerung der intrapankreatischen Serum-Lipase. Auch Kubisch et al.

konnten mit einer Caerulein-induzierten Pankreatitis einen deutlichen Lipase- und

Amylaseanstieg nachweisen [Kubisch et al. 2004].

Die Aktivität von Lipase (s. Abb. 21) und Amylase (s. Abb. 22) im Serum ist im

Vergleich zu den Kontrollgruppen deutlich um ein vielfaches erhöht, was in den

durchgeführten Versuchen die Qualität der Ausprägung der akuten Pankreatitis in

der Frühphase sehr gut beschreibt. Auch lässt sich anhand der gemessenen

Parameter die Auswirkung einer Präkonditionierung der Versuchstiere darstellen.

Man kann hierbei den Einfluss und die teilweise deutliche Reduktion der

Pankreatitisparameter im Vergleich zu Tieren, die keine CoPP-Präkonditionierung

erhalten haben, beobachten. Damit zeigt sich, dass die Präkonditionierung mit

CoPP auch hier eine Milderung der akuten Pankreatitis bewirken kann. Im Vergleich

der für die Pankreatitis spezifischen Parameter zwischen der Kontrollgruppe und der

Versuchsgruppe zeigt sich eine deutliche Reduktion des Parameters Lipase (p <

0,01) mit dem Unterschied zur Amylase, deren Serumspiegel nach wie vor sehr

hoch waren und sich nicht signifikant veränderten (p > 0,05), wobei jeweils der

größere Effekt bei beiden Enzyme durch die Präkonditionierung mit 10 mg/kg CoPP

zu verzeichnen ist. Dabei stellt sich hier deutlich eine fehlende Korrelation zwischen

Schweregrad und Enzymwerten dar. Diese fehlende Korrelation zwischen der Höhe

der Serum-Amylase und -Lipase findet sich analog auch im klinischen Alltag bei

Patienten mit akuter Pankreatitis. Im Unterschied zur Präkonditionierung mit CoPP

zeigt sich nach Induktion von HSP27 eine deutliche Reduktion der Aktivität beider

Enzyme [Schäfer und Williams 2000, Kubisch et al. 2004].

Eine Steigerung der CoPP-Dosis führte zwar zu einer stärkeren HSP32-Expression

(Dose response), was aber im Falle der Enzymaktivität die Wirkung jedoch nur für


68

die Lipaseaktivität verstärken konnte. Die eigentliche Verabreichung bzw. manuelle

Injektion als traumatisches Ereignis, scheint auch hier, wie zuvor im Rahmen der

Proteinexpression schon beschrieben, keinen Einfluss auf die gemessen Parameter

zu haben.

Unter den etablierten experimentellen Bedingungen wurde ebenfalls untersucht,

inwiefern die Präkonditionierung mit CoPP zu einer morphologischen Beeinflussung

während einer Pankreatitis führt. Es zeigte sich im direkten Vergleich der jeweiligen

präparierten Situs makroskopisch und mikroskopisch deutlich bei den nicht

präkonditionierten Tieren eine verstärkte Gewebeödembildung im Pankreas (s. Abb.

24 bis 27), was für eine stärker ausgeprägte Pankreatitis in der Frühphase sprechen

könnte. Dieses lässt sich auch durch die graphische Darstellung des relativen

Wassergehaltes bekräftigen (s. Abb. 23). Die präkonditionierten Tiere zeigten

sowohl makroskopisch, als auch wiederum in der graphischen Darstellung einen

reduzierten Wassergehalt. Der stärkste Effekt zeigte sich hier bei 5 mg/kg CoPP,

ließ sich aber nicht durch steigende CoPP-Gabe verstärken. Es gibt also Anzeichen

einer der HO-1 zugerechneten Protektion (protektive Effekte), welche aber nicht mit

steigender Expression korreliert, d.h. es gibt hier wohl ein Induktionsoptimum, wobei

bei weiterer Steigerung höchstwahrscheinlich toxische Effekte von CoPP zum

Tragen kommen. Auch wurden von Dennery zelltoxische Effekte durch eine starke

Induktion mit CoPP beschrieben [Dennery 2000].

Der genaue Mechanismus der Protektion durch HSP32 im Pankreas ist bis jetzt

nicht eindeutig geklärt. HSP32 kann die Kernbindung von proinflammatorischen

Transkriptionsfaktoren reduzieren [Uchinami et al. 2002] und die antioxidative

Kapazität der Zellen steigern [Bauer und Bauer 2002]. Beide Effekte können

dadurch eine mildere inflammatorische Antwort bewirken [Arai et al. 2001].

Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Kohlenstoffmonoxid (CO), ein

Nebenprodukt der HO-1 Aktivität, die p38 MAP-Kinase als Schlüsselmechanismus

der CO-vermittelten Protektion gegen eine IRS aktiviert [Amersi et al. 2002, Katori et

al. 2002]. Auch antagonisiert HO-1 durch das als Radikalfänger wirksame Biliverdin

und Bilirubin sowohl den von freien Radikalen hervorgerufenen Zellschaden, als

auch die Leukozytenadhäsionen [Hayashi et al. 1999].

Noch ist nicht eindeutig geklärt, ob die durch Präkonditionierung hervorgerufene

Protektion wirklich durch HSPs vermittelt wird, da die Präkonditionierung auch noch

andere Effekte haben kann, an denen HSPs nicht beteiligt sind. Sie könnten mit der


69

Protektion assoziiert sein, ohne diese zu vermitteln [Bhagat et al. 2002]. Ebenso

kann Stress, welcher die HSP-Expression induziert, auch nicht-HSP-spezifische

Effekte haben, bzw. mehrere HSPs induzieren und somit eine Kombination von

diesen darstellen [Schäfer et al. 2005]. Aufgrund des jedoch engen zeitlichen

Verhältnisses zwischen der Induktion und beobachteter Protektion, ist anzunehmen,

dass die HSPs eine zentrale Rolle für die protektive Wirkung der Präkonditionierung

spielen. Es wurde von Kubisch et al. mit Hilfe der Generierung einer transgenen

Mauslinie, die HSP27 im Pankreas überexprimiert, gezeigt, dass eine einzelnes

HSP Schutz vor Caerulein-induzierter Pankreatitis bilden kann. Diese

Überexpression führt zu erhöhter Widerstandsfähigkeit gegenüber Hitze oder

anderen Stressfaktoren in einer Reihe von Zelllinien [Schäfer et al. 1999, Schäfer

und Williams 2000, Kubisch et al. 2004]. HSP27 stellt ein Phosphoprotein dar und

spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation und Stabilisierung des Zytoskeletts,

insbesondere des F-Aktins, wobei eine HSP27 Überexpression zu einer

Stabilisierung der Aktin-Mikrofilamente [Schäfer et al. 1999, Kubisch et al. 2004] und

zu einer Verbesserung der Proteinfaltung in der Zelle führt [Ethridge et al. 2000].

Damit wird eine vermehrte Toleranz des Zytoskeletts gegenüber Stress erreicht, da

hohe Dosierungen von CCK oder Caerulein zu negativen Veränderungen des

Aktinzytoskellets führen und damit zu einer Unterbindung der Exozytose von

Zymogengranula aus den Azinuszellen in die Pankreasgänge. Die Überexpression

von HSP27 bewirkt dabei eine Stabilisierung der Aktin-Mikrofilamente und inhibiert

damit die negativen Folgen von unphysiologisch hohen Konzentrationen von

Caerulein.

Weitere Studien haben bewiesen, dass eine Inhibition, bzw. Blockierung von HSPs

auch zum Auslöschen der Protektion führen kann und somit die Voraussetzung der

durch HSP vermittelten „Stresstoleranz“ eine verstärkte Aktivität oder Expression ist

[Bhagat et al. 2002, Frossard et al. 2002]. Bhagat et al. untersuchten den

protektiven Effekt von HSP70 bei der Caerulein-induzierten Pankreatitis mit Hilfe

von Antisense- und Sense-Oligonukleotiden. Dabei konnten sie einen

Zusammenhang zwischen HSP70 und der Reduktion des Schweregrades der

akuten experimentellen Pankreatitis aufzeigen. Es zeigten ihre Untersuchungen,

dass die Gabe von Antisense-Oligonukleotiden vor der Hyperthermiebehandlung die

Expression von HSP70 verhinderte. Die Folge der fehlenden HSP70-Expression

war, dass trotz Hyperthermiebehandlung kein protektiver Effekt auf die akute

experimentelle Pankreatitis zu sehen war [Bhagat et al. 2002].


70

Es gilt also, dass der verstärkte Einfluss der HSPs auf die Zelle zu einer

verbesserten Dissaggregation von stressbedingt denaturierten Proteinen und zu

einer vermehrten Stabilisierung, bzw. Reparatur von zellulären Strukturen, wie

Mikrofilamenten und Zentromeren, sowie von zellulären Prozessen, wie

Transkription, Splicing und Translation während eines zweiten Stresses führt [De

Maio 1999]. HSPs reduzieren außerdem die Bindung von proinflammatorischen

Transkriptionsfaktoren im Zellkern und erhöhen die antioxidative Kapazität der

Zellen [Jaeschke 2003].

Insgesamt ist die durchgeführte Prästimulation mit CoPP eine weitere Methode zur

Protektion durch Hitzschockproteine ähnlich der zuvor schon beschriebenen

Hyperthermiebehandlung [Wagner et al. 1996, Frossard et al. 1999 und 2002,

Bhagat et al. 2000 und 2002]. Nach einer Hyperthermiebehandlung konnten sowohl

im Pankreasgewebe, als auch in den Azinuszellen eine Reihe von HSPs

nachgewiesen werden, wobei im Gegensatz zu HSP32 der Effekt der Hyperthermie

auf die Expression von HSP70 besonders ausgeprägt ist. Da HSP70 unter normalen

Bedingungen nicht exprimiert wird und erst durch ein einwirkendes Stressereignis

gebildet wird, könnte man HSP70 den hauptsächlichen protektiven Effekt

zuzuschreiben, wobei HSP70, im Gegensatz z.B. zu HSP25/27, HSP32 oder

HSP60 im Pankreas das einzig nur unter Stressbedingungen exprimierte HSP zu

sein scheint [Wagner et al. 1996]. Das zytoprotektive Potential von HSP32 und

HSP70 wird durch die Hochregulation eines weiteren Hitzeschockproteins

(HSP25/27) unterstützt [Schäfer et al. 1999]. Ähnlich wie bei anderen

Hitzeschockproteinen, wird die Expression des schon genuin (konstitutiv)

vorliegenden HSP25/27 durch Stress und Hyperthermie reguliert und durch letztere

stark exprimiert. Somit könnte ein Synergismus von HSP70 und HSP27 für das

zytoprotektive Potential vorliegen [Schäfer et al. 1999, Schäfer und Williams 2000,

Kubisch et al. 2004] und somit scheint neben HSP32 und HSP70 auch HSP27 ein

protektives Potential gegenüber Stressereignissen im Rahmen der akuten

Pankreatitis aufzuweisen.

Kapitel 5 Zusammenfassung

71

5. Zusammenfassung Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass der Überexpression des

„Stressproteins“ und Antioxidans HSP32/HO-1 im Pankreasgewebe, während einer

akuten Pankreatitis, wohl eine Bedeutung als protektives Agens bei der

experimentellen akuten Pankreatitis zuzukommen scheint. Es wurde auf dem

Hintergrund der in der Einleitung beschrieben Mechanismen gezeigt, dass dieses

Enzymsystem eine protektive Rolle in Pankreaszellen durch eine pharmakologische

Prästimulation, d.h. Aktivierung vor Einsetzen der Schädigung, spielen kann. Das

Ausmaß der HO-1 Induktion durch oxidativen Stress und die weite Streuung des

Enzyms in verschiedenen Geweben, verbunden mit den biologischen Aktiviäten der

katalytischen Beiprodukte, CO, Eisen und Bilirubin, legen nahe, dass die HO-1

Induktion ein Teil der generellen Antwort auf oxidativen Stress ist und dass dieses

Enzym eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase

spielt.

Das antioxidative Potential von HO-1 mildert den Zellschaden und erhöht die

Widerstandsfähigkeit gegen oxidative Beschädigung. Es zeigt sich aus den

gewonnenen Beobachtungen, dass eine CoPP-Präkonditionierung ein potentes

Präkonditionierungsmodell, auch wegen der spezifisch pharmakologisch kontrollier-

baren Induktion, für die akute experimentelle Pankreatitis darstellt und dass es

durchaus einen Zusammenhang zwischen diesem und der dadurch hervor-

gerufenen verstärkten Expression von Hitzeschockproteinen und der Protektion des

Pankreas gibt.

Kapitel 6 Methoden

72

6. Methoden 6.1. Präkonditionierungen

6.1.1. Präkonditionierung durch Hyperthermie

Für die Hyperthermiebehandlung wurden die Versuchstiere narkotisiert. Für die

Einleitung der Anästhesie wurden die Sprague-Dawley Ratten in einem Glas-

Exsikkator mit 4% Isofluran (Forene®) in Sauerstoff über einen Isofluran Vaporisator

narkotisiert. Die eigentliche Narkose erfolgte unter Einsatz von Xylazin (Rompun®

2%) in einer Dosierung von 3 mg/kg Körpergewicht und Ketaminhydrochlorid

(Ketavet® 10%) in einer Dosierung von 40 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung

des Narkotikums erfolgte intraperitoneal [Ploessl et al. 2004].

Die Tiere wurden anschließend in eine Heizdecke eingepackt und auf 42ºC

Körpertemperatur erwärmt. Die Kontrolle der Körpertemperatur erfolgte über ein

rektal appliziertes Digitalthermometer.

Im Abstand von etwa fünf Minuten erfolgte die intraperitoneale Verabreichung von 1

ml isotonischer Kochsalzsalzlösung über einen Butterfly, um das Dehydrieren der

Tiere zu vermeiden.

Die Ratten wurden nach erreichen der Körpertemperatur von 42ºC für 20 min

konstant bei dieser Körpertemperatur gehalten.

24 Stunden nach der Hyperthermiebehandlung erfolgte die Entnahme des Pankreas

wie nachfolgend unter Methoden 6.2. beschrieben [Wagner et al. 1996].

6.1.2. Präkonditionierung durch CoPP

Für die Anästhesie wurden die Ratten in einem Glasexsikkator mit 4% Isofluran in

Sauerstoff über einen Isofluran Vaporisator betäubt.

Die Metalloporphyrine wurden in Anlehnung an die Arbeiten von Amersi et al. und

Sato K et al. zur intraperitonealen Injektion gelöst und aliquotiert [Amersi et al. 1999,

Sato K et al. 2001].

Das in 0,2 M [NaOH] aliquotierte Metalloporphyrin (5 mg/ml) wurde lichtgeschützt

bei -80°C gelagert und zur intraperitonealen Gabe aufgetaut und mit 0,9% [NaCl]

auf 1 mg/ml bzw. 2,5 mg/ml verdünnt. Die intraperitoneale Gabe des

Cobaltprotoporphyrins beziehungsweise des Trägergemisches [NaOH/NaCl] in einer

Kapitel 6 Methoden

73

Kontrollgruppe, erfolgte 24 Stunden vor der Induktion einer akuten experimentiellen

Pankreatitis (s. Methoden 6.3.) und der darauf folgenden Pankreas- und

Serumentnahme (s. Methoden 6.2.). Die Bolusinjektion erfolgte mit verschiedenen

Mengenzusammensetzungen. Für die Kontrollgruppen bestand die

Injektionszusammensetzung nur aus der Verdünnung des CoPP [NaCl], bzw. dem

Trägergemisch [NaOH], um den jeweiligen Einfluss desselben zu dokumentieren.

CoPP selbst wurde in aufsteigenden Konzentrationen, alle im rechten oberen

Quadranten des Bauches, injiziert. Genauere Einzelheiten sind in Tabelle 6

zusammengefasst.

Tabelle 6 Verwendete Reagenzien in einzelnen Versuchsgruppen

Versuchstiere 0,9% NaCl NaOH CoPP

Kontrollgruppe 1 Ø Ø Ø

Kontrollgruppe 2 mg/kg KG Ø Ø

Kontrollgruppe 3 mg/kg KG 0,2 M Ø

Versuchsgruppe 1 mg/kg KG 0,2 M 5 mg/kg KG



6.2. Organentnahme des Pankreas zur Analyse der Proteinexpression

Für die Probengewinnung wurden männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem

Körpergewicht von 150-250 g verwendet und in einem Glas-Exsikkator mit Isofluran

für 1,5 min betäubt und anschließend durch Dekapitation getötet und ausgeblutet.

Das Blut wurde für die Enzymassay´s (s. Methoden 6.5.1. und 6.5.2.) aufgefangen

und gekühlt (4°C) bei 14000 rpm 15 min zentrifugiert. Das Blutserum wurde

abpipettiert und auf Eis gelagert, das Pelett verworfen. Anschließend erfolgte ein

Bauchschnitt, der Bauchraum wurde geöffnet und das Pankreas dargestellt. Es

folgte ein Foto des Organs in situ, die zügige Entnahme des Pankreas und das

Überführen in eine Schale mit gekühlter, physiologischer Kochsalzlösung 0,9%

[NaCl]. Nach erneutem Fotografieren erfolgten die Entfernung von Fettgewebe und

Lymphknoten, das Zerteilen in mehrere Stücke für verschiedene Proben, sowie die

Entnahme von anderen Organen (Leber, Niere, Herz).

Kapitel 6 Methoden

74

6.3. Induktion einer akuten experimentellen Pankreatitis Zur Induktion einer experimentellen akuten Pankreatitis wurden die Tiere über Nacht

nüchtern gelassen. Die Versuchstiere bekamen am Versuchstag stündlich eine

intraperitoneale Injektion, welche die supramaximale Konzentration an Caerulein

von 50 μg/kg KG enthielt. Caerulein, ein Decapeptid und Cholezystokinin Analogon,

verursacht bei supraphysiologischen Konzentrationen eine akute Pankreatitis in

Ratten [Lampel und Kern 1977]. Über einen Zeitraum von 5 Stunden wurde

stündlich ein Bolus nach Kurznarkose (4% Isofluran (Forene®) und Sauerstoff) in

das linke untere Abdomen injiziert, um eine sekretagog induzierte Pankreatitis

auszulösen.

Für die Herstellung einer Caerulein-Stock-Lösung von 1 mg/ml wurde lyophilisiertes

Caerulein in der entsprechenden Menge 0,9% [NaCl] gelöst, in Portionen aufgeteilt

und bei -20°C aufbewahrt. Für die Injektion wurde eine entsprechende Menge an

Caerulein mit einer Konzentration 50 µg/ml durch Verdünnung mit 0,9% [NaCl]

hergestellt.

In der Versuchsgruppe erfolgte die Gabe von Caerulein 24 Stunden nach der CoPP-

Präkonditionierung. In jeder Versuchsgruppe wurden bei Kontrolltieren als

Negativkontrolle eine vergleichbare isotonische Kochsalzlösung verwendet und i.p.

injiziert.

Eine Stunde nach der letzten erfolgten Caerulein- bzw. 0,9% [NaCl]-Injektion

wurden die Tiere durch Dekapitation getötet und dabei das Blut aufgefangen und bei

4°C und 14000 rpm für 15 min zentrifugiert. Das Serum wurde zur Bestimmung

pankreasspezifischer Enzyme verwendet.

Die Pankreata wurden entnommen (s. Methoden 6.2.) und es folgte eine

Gewichtbestimmung des Organs und die Bestimmung des Pankreasödems (s.

Methoden 6.4.).

Das Pankreas wurde in physiologischer Kochsalzlösung auf Eis in mehrere Stücke

geteilt, zum Teil sofort in flüssigem Stickstoff [N2] schockgefroren und bis zu ihrer

Weiterverwendung bei -80°C aufbewahrt oder sofort zur Probenerstellung

verwendet.

Es folgte eine Fixation in Formalin für histologische Schnitte, eine Aufnahme in 500

µl Homo-Puffer (s. Materialien 7.1.8.) für die SDS-Probenaufbereitung und eine

Kapitel 6 Methoden

75

Aufnahme von 0,05 g Gewebe in 1000 µl MOPS-Puffer (s. Materialien 7.1.7.) zur

Trypsinbestimmung.

6.4. Pankreasödem Für die Bestimmung des Pankreasödems wurde ein Stück Pankreasgewebe kurz

auf Filterpapier zum Abtrocknen gelegt, in ein zuvor ausgewogenes Reaktionsgefäß

gegeben, gewogen und anschließend bei 90˚C für 48h bis zur Gewichtskonstanz

getrocknet. Danach erfolgt erneut die Bestimmung des Gewichts. Aus der

resultierenden Abnahme des Gewichts wurde der prozentuale Anteil des

Feuchtgewichts am Gesamtgewicht bestimmt.

6.5. Enzymaktivitätsmessungen

6.5.1. Enzymaktivitätsmessung von Amylase

Die α-Amylaseaktivität im Blutserum der Versuchstiere wurde mit dem Phadebas®

Amylase Test nach Herstellerangaben [Arbeitsanweisung, Phadebas Amylase Test,

1994, Pharmacia AB, Uppsala, Schweden] gemessen. Dieser ist ein Verfahren, das

sich zur schnellen und einfachen Aktivitätsbestimmung in einer Serumprobe eignet.

Er basiert auf der Verwendung von Stärke als Substrat, an die kovalent blaue

Farbstoffmoleküle gebunden sind. Das Substrat selbst ist aufgrund seiner

Quervernetzung in Wasser schwer löslich. Die Amylase spaltet das Substrat in

kleinere, in Wasser lösliche Fragmente. Die Konzentration an farbigen Fragmenten

und somit die Absorption der überstehenden Lösung, welche im Photometer durch

Extinktionsmessung bei 620 nm bestimmt wurde, steht in direktem Zusammenhang

mit der Amylaseaktivität, welche so, ausgehend von einer Kalibrierungsreihe,

abgeschätzt werden kann.

Zur Durchführung wurde eine Phadebas®-Tablette in 14 ml Amylase-Puffer unter

ständigem Rühren gelöst. Zu 10 µl einer Serumprobe der Versuchstiere bzw. 10 µl

Aqua dest. als Nullabgleichprobe, werden 1020 µl oben genannter Reagenz

gegeben, mit dem Vortex-Mixer gemischt und danach bei 37°C inkubiert.

Nach 10 min Inkubation wird die Reaktion durch die Zugabe von 300 µl Stopplösung

0,5 M [NaOH] (4°C) gestoppt. Jedes Tube wird mit 4 ml Aqua dest. verdünnt und

erneut im Vortex-Mixer gemischt.

Kapitel 6 Methoden

76

Nach der Zentrifugation für 5 min bei 4000 rpm werden 1000 µl des Überstands in

eine Küvette vorsichtig abpipettiert und die Absorption am UV-Spektrometer bei

einer Wellenlänge von 620 nm gegen den Nullabgleich (Blindwert) gemessen. Die

Aktivität bzw. die Aktivitätskonzentration kann aus der vorgegebenen Kalibrierkurve

abgelesen werden [Arbeitsanweisung, Phadebas Amylase Test, 1994].

6.5.2. Enzymaktivitätsmessung von Lipase

Die Messung der Lipasekonzentration (Aktivität) erfolgt mit dem Lipase-Kit (LIP) der

Firma Roche Diagnostics nach Herstellerangaben. Das Lipase Kit beruht auf einem

enzymatischen in vitro Test zur quantitativen Bestimmung von Lipase im Blutserum

der in vivo Versuche.

Lipasen sind Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von 47000 Dalton. Sie sind

definiert als Triglycerid-Hydrolasen, die die Spaltung von Triglyceriden zu

Diglyceriden mit nachfolgender Bildung von Monoglyceriden und Fettsäuren

katalysieren. Die Pankreaslipase gehört neben der α-Amylase seit langem zu den

differentialdiagnostisch wertvollsten klinisch-chemischen Parametern bei

Pankreaserkrankungen.

Tabelle 7 Reagenzien des enzymatischen Farbtests (nach Roche)

Reagenz 1 Puffer Colipase Cholat

Reagenz 2 Puffer Farbsubstrat Cholat

Lipasefarbsubstrat: 1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure-(6-methylresorufin)-ester)

Die Methode nach Roche beruht auf der Spaltung eines mit Gallensäuren

emulgierten spezifischen Lipasefarbsubstrats, dem 1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-

glutarsäure-(6-methyl-resorufin)-ester. Mit der eingesetzten Kombination aus

Gallensäuren und Colipase wird das Pankreasenzym spezifisch erfasst. Bei

Abwesenheit von Colipase wird praktisch keine Lipaseaktivität nachgewiesen. Die

Colipase aktiviert nur die Pankreaslipase, nicht andere im Serum vorkommende

lipolytische Enzyme. Durch den hohen Anteil an Cholaten ist sichergestellt, dass im

Serum vorkommende Esterasen aufgrund der hohen Grenzflächenladung nicht mit

dem Farbsubstrat reagieren können. Das Testprinzip beruht auf einem

enzymatischen Farbtest.

Kapitel 6 Methoden

77

Abb. 31 Reaktion des Lipase-Farbtests

Abb. 32 Berechnung der Lipaseaktivität

Kapitel 6 Methoden

78

Die Serumproben der Versuchstiere wurden nach Entnahme bei 14000 rpm bei 4°C

für 10 min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Zu 1 ml Reagenz 1 wird 10 µl

dieser Probe hinzugegeben und dann für 5 min bei 37°C gewärmt. Durch Zugabe

von 600 µl der Reagenz 2 wird die Reaktion gestartet und nach 1 min mit der

Messung begonnen.

Das Lipasefarbsubstrat wird unter katalytischer Einwirkung von Lipase in alkalischer

Lösung zu 1,2-O-Dilauryl-rac-glycerin und einem instabilen Zwischenprodukt, dem

Glutarsäure-(6-methylresorufin)-ester, gespalten. Dieser zerfällt in alkalischer

Lösung spontan in Glutarsäure und dem Farbstoff Methylresorufin (s. Abb. 31). Die

Farbintensität des gebildeten roten Farbstoffs, welcher sich direkt proportional der

Lipaseaktivität verhält, wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 570 nm in

einem Zeitraum von 90 Sekunden gemessen.

6.5.3. Bestimmung von Trypsin in Pankreashomogenaten

Die Bestimmung der Trypsinaktivität erfolgte aus frischem Pankreasgewebe der

Versuchstiere, welches nach Entnahme homogenisiert wurde. Zur Bestimmung

wurde 0,05 g Pankreasgewebe in 1 ml eiskaltem (4°C) MOPS-Puffer aufgenommen

und mit einem Handhomogenisator mechanisch zerkleinert, um das Gewebe zu

schonen. Die Gewebetrümmer wurden bei 4°C mit 3000 rpm für 5 min

abzentrifugiert und der Überstand sofort für die Vermessung (Trypsin-Assay)

verwendet.

Die Messung der Aktivität erfolgte fluorimetrisch mit einem Luminesescenz

Spectrometer (Perkin Elmer) mit Hilfe des Substrates [Boc-Glu-Ala-Arg-MCA•HCl]

nach der Methode von Kawabata et al. [Kawabata et al. 1988, Hofbauer et al. 1998,

Saluja et al. 1999].

Kapitel 6 Methoden

79

Abb. 33 Fluorimetrische Umsetzung des Substrats durch Trypsin

Die Messung beruht auf einer Umsetzung des Substrates mit Trypsin, wobei das

oben genannte Substrat durch Trypsin, nicht aber durch Trypsinogen, gespalten

wird und wodurch eine fluoreszierende Verbindung entsteht. Die Messung erfolgte

bei einer Anregungswellenlänge von 380 nm, die Lichtemission wurde bei einer

Emissionswellenlänge von 440 nm in Quarzküvetten, sowie der Anstieg der

Intensität der Fluoreszenz über die Zeit wurde alle 10 Sekunden nachfolgend über

einen Zeitraum von 300 s fluorimetrisch gemessen. Aus der Differenz der

Fluoreszenz zwischen zwei Messpunkten wurde dann die Steigung nach der

Geradengleichung ermittelt. Die Steigung entspricht dabei dem Quotienten aus dem

jeweiligen vertikalen (Zeitachse) und dem horizontalen Abstand (Delta F) zweier

beliebiger Punkte der Geraden und ist ein Maß für die Änderung entlang der

Regressionsgeraden. Die Gleichung, nach der die Steigung einer

Regressionsgeraden berechnet wird, lautet wie folgt:

Die Trypsinaktivität wurde aus der Steigung der Standardkurve errechnet (s.

Abschnitt 3.2.1.1., Abb. 18 und 19), welche vor der Vermessung der Proben mit

definierten Trypsinkonzentrationen (Standardkonzentrationen) erstellt wurde (s. Tab.

8).

Kapitel 6 Methoden

80

Tabelle 8 Darstellung der eingesetzten Standardtrypsinkonzentrationen

Kalibrierkonzentration 0,1 ng/ml 0,3 ng/ml 0,5 ng/ml 0,75 ng/ml

Menge der Verdünnung 10 µl 30 µl 50 µl 7,5 µl

Verdünnung 10 ng/ml 10 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml

Trypsin wurde als Stockreagenz auf 10 mg/ml aliquotiert. Die Verdünnungen wurden mit TAB-Puffer (s. Materialien 7.1.7.) wie folgt erstellt:

1:100 Verdünnungen 100 μg/ml ► 1 μg/ml

1:10 Verdünnungen 100 ng/ml ►10 ng/ml

Das Substrat wurde in DMSO in einer Konzentration von 10 mM gelöst und die

Aliquots bei -20°C aufbewahrt. Für die Messung wurden 20 μM Substrat pro

Einzelmessung lichtgeschützt eingesetzt.

Zur Vermessung der Kalibriergeraden wurden 900 µl TAB mit 100 µl Substrat und

der entsprechenden Menge an Verdünnung angesetzt und vermessen.

Zur Vermessung der Proben wurden 700 µl TAB mit 100 µl Substrat und 200 µl

Probe angesetzt. Bei zu hoher Intensität der Probe wurde diese entsprechend mit

TAB für die Vermessung verdünnt und anschließend der Verdünnungsfaktor

hinterher mit in das Ergebnis eingerechnet, um die tatsächliche

Trypsinkonzentration in der Probe zu erhalten.

Der Proteingehalt wurde mit einem Protein-Assay (s. Materialien 7.1.3.) bestimmt

und die Trypsinaktivität in femtomol pro Milligramm Protein angegeben.

6.6. Western-Blotting zum Proteinnachweis

6.6.1. Erstellung von Zellproben

Zur Erstellung der Proben für das Western-Blotting wurde eine Gewebeprobe in 500

µl gekühltem Homopuffer mit pH 7,4 (s. Materialien 7.1.8.) und Proteaseinhibitor

aufgenommen und bei 4°C mit einem Polytron (Homogenisator) zerkleinert und

aufgeschlossen. Das Homogenisat wurde daraufhin mit einer Kühlzentrifuge bei

4°C, 14000 rpm für 10 min zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Dieser

Schritt wurde zweimal wiederholt, wobei das Pellet jeweils verworfen wurde.

Anschließend erfolgte die Proteinquantifizierung aus dem klaren Überstand mit dem

Bradford Protein Assay.

Kapitel 6 Methoden

81

Die Proben für die Proteinelektrophorese wurden mit SDS-Puffer (Laemmli-Puffer)

angefärbt und mit Homogenisatpuffer auf eine Proteinendkonzentration von 2 mg/ml

aliquotiert.

6.6.2. Quantitative Proteinbestimmung

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte photometrisch mit dem Bradford

Protein Assay [Bradford 1976, BioRad Protein Determination, Laboratory Manual

1979].

Sie beinhaltet die Zugabe von einem Dye-Reagenz zur Proteinlösung und

anschließender Messung bei 595 nm in einem Spektralphotometer. Die

Farbveränderungen entstehen als Antwort auf verschiedene Proteinkonzentrationen

und der Vergleich mit einer Standardkurve liefert eine relative Messung der

Proteinkonzentration.

Das Prinzip der Quantifizierung beruht auf einer bathochromen Verschiebung des

Absorptionsmaximums durch Bindung des Farbstoffs Coomassie Brillant Blau an

Proteine im sauren Milieu. Die Kalibriergerade wurde mit definierten BSA Standards

(0,2-0,8 mg/ml) angefertigt. Die Verdünnung des Reagenz und die Durchführung

erfolgten nach den Angaben des Herstellers.

Vor der Proteinelektrophorese wurden die Proteinproben denaturiert und negativ

geladen durch Zugabe von Laemmli-Puffer und anschließendem Kochen der

Proben für 5 Minuten (s. Methoden 6.6.3.).

6.6.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Proteinauftrennung erfolgte mittels denaturierter SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (s. Materialien 7.1.9.) nach der Methode von

Laemmli [Laemmli 1970]. Bei dieser Methode werden Proteine in Laemmli-Puffer

(SDS-Puffer) durch Erhitzen und Kochen für 5 min bei 95°C denaturiert und

anschließend in einem elektrischen Feld anhand ihres Molekulargewichtes

aufgetrennt. Das geschieht durch Anlagerung des negativ geladenen Detergens

SDS an die hydrophoben Regionen dieser Proteine. Dadurch erhalten die Proteine

eine stark negative Ladung, die ihre Eigenladung überlagert, so dass ihre

Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld nur von ihrem Molekulargewicht,

also der Größe, abhängig ist. Das Molekulargewicht lässt sich nach der Auftrennung

Kapitel 6 Methoden

82

mit einem Protein-Standard-Marker ermitteln (Prestained SDS-PAGE Standards,

Low Range, BioRad, München).

Die elektrophoretische Trennung erfolgte in 10%-SDS-Trenngelen, die mit

Sammelgelen überschichtet wurde (s. Tab. 9).

Das Trenngel wurde so in die Gelkammern eingefüllt, dass noch etwa 3 cm bis zur

oberen Glaskante frei blieben. Zur Ausbildung einer ebenen Oberfläche wurde die

Lösung sofort mit 0,1% SDS oder Methanol überschichtet. Nach Polymerisation

wurde das SDS vorsichtig abgeschüttet, das Trenngel mit dem Sammelgel bis zur

oberen Glaskante überschichtet und ein Gelkamm eingesetzt.

Tabelle 9 Darstellung der Zusammensetzung der Sammel- und Trenngele

Bestandteile Trenngel Sammelgel

Trenngelpuffer 4,0 ml (pH 8,8) Ø

Sammelgelpuffer Ø 2,5 ml (pH 6,8)

Aqua dest. 6,7 ml 5,9 ml

30% Polyacrylamid 5,3 ml 1,6 ml

10% APS 25,0 µl 60 µl

TEMED 12,5 µl 20 µl

Nach der Polymerisation des Sammelgels wurde der Gelkamm entfernt und die

Gelkammern sowie die Apparatur mit Laufpuffer (1x) aus SDS-Laufpuffer-

Stammlösung (10x) gefüllt. Danach wurden 10 µl (20 µg) der in Laemmli-Puffer

(SDS-Puffer) gelösten Proben sowie ein Protein-Standard-Marker in die

entsprechenden Taschen des Sammelgels pipettiert. Die Gele wurden in die

Elektrophoresekammer platziert und die Auftrennung der Proteine erfolgte für 75

min bei 150 V.

6.6.4. Transfer der Proteine auf Nitrozellulose

Anschließend wurden die im Gel befindlichen, nun immobilisierten Proteine mittels

Blotting-Technik in einer Blot-Kammer, welche Transferpuffer (1x) aus Transfer-

Puffer-Stammlösung (10x) (Blotting-Puffer) enthält, auf eine Nitrozellulosemembran

übertragen. Dabei wandern die negativ geladenen Proteine in einem elektrischen

Feld von der Kathode zur Anode und damit aus dem Gel auf die Membran. Die

Kapitel 6 Methoden

83

Temperatur während des Transfers wurde bei 4°C gehalten. Der Transfer erfolgte

bei 300 mA (80-130 V) für 60 min.

6.6.5. Immunchemischer Nachweis von Proteinen

Nach dem Transfer der Proteine wurde die Nitrozellulosemembran in Blocklösung

auf dem Kreisschüttler für 60 min und 30 U/min bei Raumtemperatur geblockt, um

unspezifische Bindungsstellen abzusättigen und anschließend mehrfach mit TBS-T

gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit dem primären Antikörper in TBS-

T und 2% Top-Block bzw. Non-Fat Dry Milk inkubiert. Die Bindung des Antikörpers

an die Proteine erfolgte über Nacht bei 4°C auf einem Überkopfrotator. Am

nächsten Tag wurde die Membran zur Entfernung ungebundener Antikörper für 30

min bei Pufferwechsel in Waschlösung gewaschen. Anschließend erfolgte die

Inkubation mit dem gegen den Primärantikörper gerichteten und Meerrettich-

Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörper für 60 min bei Raumtemperatur. Es

schloss sich wiederum ein Waschschritt für jeweils 10 min in Waschlösung mit

dreifachem Pufferwechsel an. Danach erfolgte die ECL-Detektion (Amersham) nach

Angaben des Herstellers.

Das Prinzip der „verstärkten Chemilumineszenz Reaktion“ beruht auf einer

Lichtemission, welche anhand der Schwärzung von Röntgenfilmen semiquantitativ

ausgewertet werden kann. Zur ECL-Detektion wurden je 0,5 ml der Luminol

enthaltenen zwei ECL-Lösungen vermischt, auf die Proteinseite der Nitrozellulose

gegeben und für 1 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Membran wurde dann über verschiedene Zeiträume in einer Dunkelkammer auf

Röntgenfilme gelegt, welche anschließend entwickelt wurden.

Die korrekte Lage der erwarteten Signale auf den Röntgenfilmen wurde einerseits

durch Vergleich mit dem Protein-Standard-Marker auf der Membran und

andererseits durch das Mitlaufen einer Positivkontrolle, welche zur Überprüfung der

korrekten Höhe der Signale verwendet wurde, festgestellt.

6.6.6. Immunchemischer Nachweis von unterschiedlichen Proteinen auf gleicher Nitrozellulosemembran (Stripping)

Um auf einer Membran verschiedene HSPs bei gleichem Laufmuster mit

unterschiedlichen Antikörpern zum direkten Vergleich nachzuweisen, wurde das

„Membran-Stripping“ angewandt. Die jeweilige Membran wurde, nach der

Kapitel 6 Methoden

84

Übertragung der Signale des ersten primären Antikörpers auf Röntgenfilme, im auf

50°C erwärmten Stripping-Puffer (s. Materialien 7.1.9.) für 30 min bei leichter

Bewegung im Überkopfrotator gewaschen. So konnten die primären Antikörper

schonend entfernt werden, ohne die Proteine bzw. das Proteinverteilungsmuster

aus der Membran zu lösen. Danach erfolgte das zweimalige Waschen in TBST-

Puffer für jeweils 10 min und das erneute Blocken in Blocklösung auf dem

Kreisschüttler für 30 min und 30 U/min bei Raumtemperatur, um unspezifische

Bindungsstellen erneut abzusättigen und anschließend mehrfach mit TBS-T

gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit dem neuen primären Antikörper

in TBS-T und 2% Top-Block bzw. Non-Fat Dry Milk inkubiert. Die weiteren Schritte

erfolgten dann wie oben beschrieben.

6.7. Histologische Untersuchungen

6.7.1. Hämatoxylin/Eosin-Färbung

Histologische Schnitte des Pankreas wurden am Institut für Pathologie des

Universitätsklinikums Großhadern in München unter Anleitung von Prof. Dr. med. J.

Diebold angefertigt und mit Hämatoxylin/Eosin gefärbt. Die formalinfixierten

Gewebeproben wurden in einem Einbettautomaten über Nacht in Paraffin

eingebettet. Aus den Paraffinblöcken wurden 2 μm dicke Schnitte angefertigt und in

einem Färbeautomat mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt.

Die Schnitte wurden maschinell von einem Eindeckautomat mit Deckgläschen

versehen.

6.8. Statistische Auswertungen Die statistische Auswertung erfolgt mit Sigma Stat, Version 2.03 (SYSTAT Software

Inc., Chicago, IL), die graphischen Auswertungen und Abbildungen wurden mit

Sigma Plot, Version 7.0 durchgeführt.

Die Ergebnisse werden jeweils mit den Mittelwerten und den zugehörigen

Standardabweichungen standard error of means (SEM) dargestellt, sowie die Größe

der Versuchsgruppen jeweils auf der x-Achse neben den Graphen angegeben. Die

einzelnen Proben aus einem Experiment werden jeweils z.B. doppelt oder dreifach

gemessen und daraus ein Mittelwert (mean) gebildet. Bei mehreren Experimenten

werden dann die jeweils ermittelten Mittelwerte wiederum verwendet, um die

Standardabweichung zu ermitteln.

Kapitel 6 Methoden

85

Die Signifikanz der Ergebnisse wird mit dem one sample t-test oder dem student´s t-

test. Dabei wird p < 0,05 und p < 0,01 als statistisch signifikant betrachtet.

Kapitel 7 Materialien

86

7. Materialien 7.1. Chemikalien und Reagenzien

7.1.1. Narkose (Hyperthermie)

Isofluran, Forene® Abott, Wiesbaden

Ketaminhydrochlorid, Ketavet® (100 mg/ml)

Pharmacia & Upjohn, Erlangen

Xylazin, Rompun® 2% BayerVital, Leverkusen

7.1.2. Caeruleinpankreatitis

Caerulein (MW 1352.4) Sigma Aldrich, München

Cobalt(III)-Protoporphyrin IX Chlorid (MW 654.61)

Frontier Scientific, Lancashire, UK

Isotone Kochsalzlösung 0,9% [NaCl] Braun, Melsungen

Natriumhydroxid [NaOH] (MW 40.0) Sigma Aldrich, München

CoPP Lösung (Stock-Lösung)

CoPP gelöst in 0,2 M [NaOH] mit einer Konzentration von 5 mg/ml

pH-Titration auf pH 7,4

Zur Präkonditionierung: Verdünnt in isotoner Kochsalzlösung 0,9% [NaCl] auf 1 mg/ml

7.1.3. Protein-Bestimmung

Serum Albumin, bovines (BSA) Fluka, Biochemie, Buchs, Schweiz

Bradford Protein Assay (Dye Concentrate)

BioRad Laboratories, Hercules, CA

7.1.4. Hämatoxylin/Eosin-Färbung (Histologie)

Paraformaldehyd Merck Biosciences, Darmstadt


87

PBS gepuffertes Formalin

Paraformaldehyd 4% in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (s. Materialien 7.1.8.)

ph-Titration auf pH 7,4

7.1.5. Amylase-Bestimmung

Natriumchlorid [NaCl] (MW 58.44) Sigma Aldrich, München

Natriumdihydrogenphosphat [NaH2PO4] (MW 119.98)

Fluka, Biochemie, Buchs, Schweiz

Natriumhydroxid [NaOH] (MW 40.0) Sigma Aldrich, München

Phadebas® Amylase Assay Phadebas Pharmacia, Uppsala, Schweden

Amylase Puffer

[NaCl] 0,05 M

[NaH2PO4] 0,02 M

mit Aqua dest. ad 500 ml


Stopp-Lösung

[NaOH] 0,5 M

mit Aqua dest ad 250 ml

7.1.6. Lipase-Bestimmung

(LIP) Lipase Farb Assay Roche Diagnostics, Mannheim

7.1.7. Trypsin-Bestimmung

Calciumchlorid [CaCl2] (MW 110.98) Sigma Aldrich, München

Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt


88

Sucrose (MW 342.3) Sigma Aldrich, München

Magnesiumsulfat [MgSO4•7H2O] (MW 246.4)

Sigma Aldrich, München

MOPS [C7H15NO4S] (MW 209.3) Sigma Aldrich, München


Serum Albumin, bovines (BSA) Fluka Biochemie, Buchs, Schweiz

Substrat [Boc-Glu-Ala-Arg-MCA•HCl] Bachem, Heidelberg

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Trizma®-Base [C4H11NO3] (MW 121,1)


Trypsin (8.300 U/mg) Sigma Aldrich, München

MOPS-Homogenisatpuffer

Sucrose 250 mM

MOPS 5 mM

[MgSO4] 1 mM



Trypsin-Assay-Puffer (TAB-Puffer)

TrisBase 50 mM

[NaCl] 150 mM

[CaCl2] 1 mM

BSA 0,1 mg/ml



7.1.8. SDS-Probenaufbereitung

Benzamidin [C7H8N2•HCl] (MW 156.6) Sigma Aldrich, München


89

β-Mercaptoethanol [C2H6OS] (MW 78.1) Sigma Aldrich, München

Brij 35, 30% Lösung Sigma Diagnostics, St.Louis, USA

Bromphenolblau Sigma Aldrich, München

DTT (D2-Dithiothreitol) (MW 154.2) Sigma Aldrich, München

EGTA [C14H24N2O10] (MW 380.2) Sigma Aldrich, München

Glycerol [C3H8O3] (MW 92.1) Sigma Aldrich, München

β-Glycerophosphat [C3H7PO6] (MW 172.1) Sigma Aldrich, München

Kaliumchlorid [KCl] (MW 74.6) Sigma Aldrich, München

Kaliumhydrogenphosphat [KH2PO4] (MW 136.1)



Natriumdodecylsulfat (SDS) BioRad Laboratories, Hercules, CA

Natriumhydrogenphosphat [Na2HPO4] (MW 142.0)


Natriumfluorid [NaF] (MW 42.0) Sigma Aldrich, München

Natriumorthovanadate [Na3VO4] (MW 183.9) Sigma Aldrich, München

Proteinase Inhibitor Cocktail Set Calbiochem, La Jolla, CA

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Trizma®-Base (MW 121.1) Trizma®-HCl (MW 157.6)


Proteinase Inhibitor Cocktail Set

AEBSF 4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonylfluorid

500 µM

Aprotinin 150 nM

E-64, Protease Inhibitor 1 µM

EDTA, Dinatrium 0,5 mM

Leupeptin, Hemisulfat 1 µM


90

Homogenisatpuffer (Homo-Puffer)

Glycerophosphat 50 mM

Benzamidin 2 mM

Brij 35, 30% Lösung 0.03%

Glycerol 5%

EGTA 1 mM

[Na3VO4] 2 mM

[NaF] 1 mM

DTT 1 mM

β-Mercaptoethanol 0,1%

mit PBS pH 7,4 ad 50 ml

Vor Gebrauch: Proteinase Inhibitor Cocktail Set (100 µl / 10 ml) hinzugeben

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

[NaCl] 0,14 M

[KCl] 2,7 mM

[Na2HPO4•7H2O] 10 mM

[KH2PO4] 1,8 mM



Laemmli-Puffer (SDS-Puffer)

TrisHCl 0,2 M (pH 6,8)

Glycerol 40%

SDS 8%

β-Mercaptoethanol 10%

Bromphenolblau 0,2%


91

7.1.9. Western-Blotting

10% Ammoniumperoxidsulfat (APS) Sigma Aldrich, München

30% Acrylamid / Bisacrylamid Solution BioRad Laboratories, Hercules, CA

β-Mercaptoethanol [C2H6OS] (MW 78.1) Sigma Aldrich, München

Blotting grade Blocker (Non-Fat dry milk) Sigma Aldrich, München

Bromphenolblau Sigma Aldrich, München

DTT (D2-Dithiothreitol) (MW 154.3) Sigma Aldrich, München

ECL®-Western Blotting Detection System Amersham Biosciences, UK

Glycin [C2H5NO2] (MW 75.1) Sigma Aldrich, München

Glycerol [C3H8O3] (MW 92.1) Sigma Aldrich, München

Kaliumchlorid [KCl] (MW 74.56) Sigma Aldrich, München

Methanol [CH3OH] Merck Biosciences, Darmstadt


Prestained SDS-PAGE Standards BioMol, München

Protein-Standard-Marker BioRad Laboratories, Hercules, CA

Natriumdodecylsulfat (SDS) BioRad Laboratories, Hercules, CA

N,N,N´,N´–Tetramethylethylendiamin TEMED

BioRad Laboratories, Hercules, CA

Salzsäure [HCl] Merck Biosciences, Darmstadt

Top-Block Fluka Biochemie, Buchs, Schweiz

Trizma®-Base (MW 121.1) Trizma®-HCl (MW 157.6)


Polyoxyethylene-Sorbitan Monolaurate Tween® 20 (MW 216.6)


Trenngelpuffer

TrisBase 1,5 M

SDS 0,014 M

mit Aqua dest ad 250 ml


92


Sammelgelpuffer

TrisBase 0,5 M

SDS 0,014 M



SDS-Laufpuffer-Stammlösung

TrisBase 25 mM

Glycin 0,2 M

SDS 10 mM


Transfer-Puffer-Stammlösung (Blotting-Puffer)

TrisBase 25 mM

Glycin 0,2 M

SDS 30 mM

Methanol 5 M


Tris-gepufferte Kochsalzlösung (Tris buffered saline, TBS) + Tween (TBS-T)

TrisBase 25 mM

[NaCl] 150 mM

[KCl] 2,5 mM

Tween® 20 0,25%




93

Blocklösung

TBS-T

Non-Fat Dry Milk / Top Block 5%

Waschlösung

TBS-T

Non-Fat Dry Milk / Top Block 2%

Strippingpuffer

β-Mercaptoethanol 100 mM

SDS 20 mM

ad 100ml TrisHCl

62,5 mM


Antikörper und Proteine

Anti-HSP25 [SPA-801]

monoklonaler Kaninchen IgG-Antikörper

StressGen Biotech, Victoria, CA

Anti-Hämoxygenase-1(Anti-HSP32) [OSA-150] polyklonaler Kaninchen IgG-Antikörper


Anti-Hämoxygenase-1(Anti-HSP32) [OSA-111] monoklonaler Maus IgG-Antikörper


Anti-HSP60 [SPA-806] monoklonaler Maus IgG-Antikörper


Anti-HSP70 [SPA-810] monoklonaler Maus IgG-Antikörper


Anti-Kaninchen (Meerrettich-Peroxidase gekoppelter Antikörper) monoklonaler Esel IgG-Antikörper

Amersham Biosciences,Freiburg

Anti-Maus (Meerrettich-Peroxidase gekoppelter Antikörper) monoklonaler Ziege IgG-Antikörper

Amersham Biosciences,Freiburg


94

Recombinantes [von Ratten] [SPP-730] HSP32 (Hämoxygenase-1)


7.2. Technische Geräte und Materialien

7.2.1. Technische Geräte

Analysenwaage (Sartorius research) Sartorius, Göttingen,

Reagenzwasser System (Aqua dest.) Millipore, Molsheim, Frankreich

Blot-Kammer Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA

Elektrophorese-Apparatur Amersham Biosciences, UK

Hamiltonspritze Hamilton Company, Rena, Nevada, USA

Homogenisator Schütt Labortechnik, Göttingen

Inkubator GFL 1083 GFL, Burgwedel

Isofluran Vaporator 19.3 Dräger, Lübeck

Kühlzentrifüge 541712 Eppendorf, Hamburg

Luminesescenz Spectrometer LS50B Perkin Elmer Instruments, Rodgau

Magnetrührer RTC basic IKA Werke, Staufen

MiniSpin-Zentrifuge Eppendorf, Hamburg,

Minigelapparatur Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA

ph-Meter InoLab pH Level 1 WTW, Weilheim

Pipetten Eppendorf, Hamburg

Polytron Homogenisator Kinematica AG, Littau/Luzern, Schweiz

Power Supply (Elektrophorese) Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK

Schüttelblock Heidolph, Kelheim

Spektralphotometer Ultrospec 3100 pro Amersham Pharmacia Biotech Buckinghamshire, UK

Überkopfrotator Rocky 3D Fröbel Labortechnik, Lindau

Vortex Mixer 2020 neo Lab

Zentrifuge EBA 12R Hettich Zentrifugen, Bern, Schweiz


95

7.2.2. Materialien

Einmal-Küvetten, UV Sarstedt, Nümbrecht,

Eppendorf-Röhrchen Eppendorf, Hamburg

Film (Hyperfilm®) Amersham Pharmacia Biotech, UK

Gel-Blotting Papier Schleicher & Schuell Bioscience, Dassel

Halbmikro-Fluoreszenz-Küvetten Hellma, Mülheim

Nitrozellulosemembran Protran® Schleicher & Schuell Bioscience, Dassel

Petrischalen Becton Dickinson Labware, Le Pont De Claix, Frankreich

Quarzglas SUPRASIL® Hellma, Mülheim,

Tubes (Falcon®) Becton Dickinson Labware, Le Pont De Claix, Frankreich

7.3. Versuchstiere Für die Präparation des Pankreas, die Präkonditionierungen, sowie die

Hyperthermie- und Caeruleinversuche wurden männliche Sprague-Dawley Ratten

(Charles River Wiga, Sulzfeld, D) mit einem Körpergewicht von 150-250 g

verwendet.

Die Tiere wurden in vollklimatisierten Ställen mit einem konstanten 12h Licht-

Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Futter (Ssniff Soest, Deutschland)

und entsprechend den Bedingungen des Tierschutzgesetzes gehalten. Vor der

Durchführung von Experimenten wurden die Tiere über Nacht nüchtern gehalten mit

freiem Zugang zu Wasser.

Die Tierversuche waren von der zuständigen Behörde genehmigt (AZ: 211-2531-

34/2001).

Kapitel 8 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

96

8. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. Abbildung(en)

Ag Antigen

Ak Antikörper

APS Ammoniumperoxidsulfat

ARDS adult respiratory distress syndrome

bp Basenpaare

BPA Bradford Protein Assay

BSA Rinder Serum Albumin

°C Grad Celsius

CCK Cholezystokinin

CO Kohlenmonoxid

CoPP Kobalt (Co)-Protoporphyrin

d Tag(e)

DIC Disseminierte intravasale Gerinnung

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiothreitol

ECL Enhanced chemiluminescence

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz

ERCP Endoskopische retrograde Cholangiopankreatographie

f femto

g Gramm

h Stunde(n)

HO Hämoxygenase

HRP Horseradish Peroxidase (Meerrettich-Peroxidase)

HSRE heat shock response element

HSF heat shock factor (Hitzeschockfaktor)


97

HSP Hitzeschockprotein; Synonym: Stressprotein

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

i.p. intraperitoneal

IRS Ischämie-Reperfusions-Schaden

kDa Kilodalton

kg Kilogramm

KG Körpergewicht

µg Mikrogramm

µm Mikrometer

M Molar [mol/l]

min Minute

ml Mililiter

MOPS 3-(N-Morpholino) propansulfonic acid

MW Molekulargewicht

n Anzahl der verwendeten Versuchstiere/Versuchseinheit

NK Negativ Kontrolle

PAGE Polyacrylamid Gel Elektrophorese

PBS Phosphat gepufferte Kochsalzlösung

Pos.Kontr. Positiv Kontrolle (Western Blotting)

s Sekunde

s. siehe

SDS Natriumdodecylsulfat (Sodium dodecyl sulphate)

SEM standard error of means (Standardabweichung)

Sn Zinn

spez. spezifisch(en)

Tab. Tabelle

TAB Trypsin Assay Buffer

TBS Tris buffered saline


98

TEMED Tetramethylethylendiamin

TNF Tumor-Nekrose-Faktor

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

rpm rounds per minute

pH negativer dekadischer Logarithmus der Konzentration von Hydroniumionen [H3O+]

RT Raumtemperatur

U Unit, Enzymspezifische Angabe

U/min Umdrehungen pro Minute

UV Strahlung im ultravioletten Bereich

V Volt

Vgl. / vgl. Vergleich / vergleiche

Zn Zink

Kapitel 9 Literaturverzeichnis

99

9. Literaturverzeichnis Adler G, Beglinger C, Braun U, Reinshagen M, Koop I, Schafmayer A, Rovati L,

Arnold R

Interaction of the cholinergic system and cholecystokinin in the regulation of

endogenous and exogenous stimulation of pancreatic secretion in humans.

Gastroenterology. 1991 Feb; 100(2): 537-543

Alam J, Cai J, Smith A

Isolation and characterization of the mouse heme oxygenase-1 gene. Distal 5'

sequences are required for induction by heme or heavy metals.

J Biol Chem. 1994 Jan; 269(2): 1001-1009

Alam J

Multiple elements within the 5' distal enhancer of the mouse heme oxygenase-1

gene mediate induction by heavy metals.

J Biol Chem. 1994 Oct; 269(40): 25049-25056

Amersi F, Buelow R, Kato H, Ke B, Coito AJ, Shen XD, Zhao D, Zaky J Melinek J,

Lassman CR, Kolls JK, Alam J, Ritter T, Volk HD, Farmer DG, Ghobrial RM, Busuttil

RW, Kupiec-Weglinski JW

Up regulation of heme oxygenase-1 protects genetically fat Zucker rat livers from

ischemia/reperfusion injury.

J Clin Invest. 1999 Dec; 104(11): 1631-1639

Amersi F, Shen XD, Anselmo D, Melinek J, Iyer S, Southard DJ, Katori M, Volk HD,

Busuttil RW, Buelow R, Kupiec-Weglinski JW

Ex vivo exposure to carbon monoxide prevents hepatic ischemia/reperfusion injury

through p38 MAP kinase pathway.

Hepatology. 2002 Apr; 35(4):815-823

Ames BN

Endogenous DNA damage as related to cancer and aging.

Mutat Res. 1989 Sep; 214(1): 41-46

Applegate LA, Luscher P, Tyrrell RM

Induction of heme oxygenase: a general response to oxidant stress in cultured

mammalian cells.

Cancer Res. 1991 Feb; 51(3): 974-978


100

Apte MV, Wilson JS

Alcohol-induced pancreatic injury.

Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2003 Aug; 17(4): 593-612

Arai M, Thurman RG, Lemasters JJ

Ischemic preconditioning of rat livers against cold storage-reperfusion injury: role of

nonparenchymal cells and the phenomenon of heterologous preconditioning.

Liver Transpl. 2001 Apr; 7(4): 292-299

Baler R, Dahl G, Voellmy R

Activation of human heat shock genes is accompanied by oligomerization,

modification, and rapid translocation of heat shock transcription factor HSF1.

Mol Cell Biol. 1993 Apr; 13(4): 2486-2496

Bauer M, Bauer I

Heme oxygenase-1: redox regulation and role in the hepatic response to oxidative

stress.

Antioxid Redox Signal. 2002 Oct; 4(5): 749-758

Bellmann K, Wenz A, Radons J, Burkart V, Kleemann R, Kolb H

Heat shock induces resistance in rat pancreatic islet cells against nitric oxide,

oxygen radicals and streptozotocin toxicity in vitro.

J Clin Invest. 1995 Jun; 95(6): 2840-2845

Bhagat L, Singh VP, Hietaranta AJ, Agrawal S, Steer ML, Saluja AK

Heat shock protein 70 prevents secretagogue-induced cell injury in the pancreas by

preventing intracellular trypsinogen activation.

J Clin Invest. 2000 Jul; 106(1): 81-89

Bhagat L, Singh VP, Song AM, van Acker GJ, Agrawal S, Steer ML, Saluja AK

Thermal stress-induced HSP70 mediates protection against intrapancreatic

trypsinogen activation and acute pancreatitis in rats.

Gastroenterology. 2002 Jan; 122(1): 156-165

Bockman DE, Boydston WR, Parsa I

Architecture of human pancreas: Implications for early changes in pancreatic

disease.

Gastroenterology. 1983 Jul; 85(1): 55-61


101

Bradford MM A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein

utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May; 72: 248-254

Brady M, Christmas S, Sutton R, Neoptolemos J, Slavin J

Cytokines and acute pancreatitis.

Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol. 1999 Jul; 13(2): 265-289

Buchler M, Malfertheiner P, Uhl W, Scholmerich J, Stockmann F, Adler G, Gaus W,

Rolle K, Beger HG

Gabexate mesilate in human acute pancreatitis. German Pancreatitis Study Group.

Gastroenterology. 1993 Apr; 104(4): 1165-1170

Caplan AJ, Cyr DM, Douglas MG

Eukaryotic homologues of Escherichia coli DnaJ: A diverse protein family that

functions with hsp70 stress proteins.

Mol Biol Cell. 1993 Jun; 4(6): 555-563

Choi AM, Alam J

Heme oxygenase-1: function, regulation, and implication of a novel stress-inducible

protein in oxidant-induced lung injury.

Am J Respir Cell Mol Biol. 1996 Jul; 15(1): 9-19

Clark JE, Foresti R, Sarathchandra P, Kaur H, Green CJ, Motterlini R

Heme oxygenase-1-derived bilirubin ameliorates postischemic myocardial

dysfunction.

Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000 Feb; 278(2): H 643-651

Clark JE, Foresti R, Green CJ, Motterlini R

Dynamics of haem oxygenase-1 expression and bilirubin production in cellular

protection against oxidative stress.

Biochem J. 2000 Jun; 348 Pt 3: 615-619

Clemente F, Durand S, Laval J, Thouvenot JP, Ribet A

Ethanol metabolism by rat pancreas. Presence and level modifications of ethanol

oxidizing systems.

Gastroenterol Clin Biol. 1977; 1(1): 39-48


102

Cleveland JC, Raeburn C, Harken AH

Clinical applications of ischemic preconditioning: from head to toe.

Surgery. 2001 Jun; 129(6): 664-647

Cohn JA, Friedman KJ, Noone PG, Knowles MR, Silverman LM, Jowell PS

Relation between mutations of the cystic fibrosis gene and idiopathic pancreatitis.

N Engl J Med. 1998 Sep; 339(10): 653-658

Cotto JJ, Morimoto RI

Stress-induced activation of the heat-shock response: cell and molecular biology of

heat-shock factors.

Biochem Soc Symp. 1999; 64: 105-118

Currie RW Effects of ischemia and perfusion temperature on the synthesis of stress-induced

(heat shock) proteins in isolated and perfused rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 1987 Aug; 19(8): 795-808

De Maio A Heat shock proteins: facts, thoughts, and dreams. Shock. 1999 Jan; 11(1): 1-12

Dennery PA, McDonagh AF, Spitz DR, Rodgers PA, Stevenson DK

Hyperbilirubinemia results in reduced oxidative injury in neonatal Gunn rats exposed

to hyperoxia.

Free Radic Biol Med. 1995 Oct; 19(4): 395-404

Dennery PA Regulation and role of heme oxygenase in oxidative injury. Curr Top Cell Regul. 2000; 36: 181-199

Donnelly TJ, Sievers RE, Vissern FL, Welch WJ, Wolfe CL

Heat shock protein induction in rat hearts. A role for improved myocardial salvage

after ischemia and reperfusion?

Circulation. 1992 Feb; 85(2): 769-778

Dreiling DA, Koller M

The natural history of alcoholic pancreatitis: update 1985.

Mt Sinai J Med. 1985 May; 52(5): 340-342


103

Drummond GS, Kappas A

The cytochrome P-450-depleted animal: an experimental model for in vivo studies in

chemical biology.

Proc Natl Acad Sci USA. 1982 Apr; 79(7): 2384-2388

Elbirt KK, Bonkovsky HL

Heme oxygenase: recent advances in understanding its regulation and role.

Proc Assoc Am Physicians. 1999 Sep; 111(5): 438-447

Ethridge RT, Ehlers RA, Hellmich MR, Rajaraman S, Evers BM

Acute pancreatitis results in induction of heat shock proteins 70 and 27 and heat

shock factor-1.

Pancreas. 2000 Oct; 21(3): 248-256

Ewing JF, Maines MD

Rapid induction of heme oxygenase 1 mRNA and protein by hyperthermia in rat

brain: Heme oxygenase 2 is not a heat shock protein.

Proc Natl Acad Sci USA. 1991 Jun; 88(12): 5364-5368

Ferrali M, Signorini C, Ciccoli L, Comporti M

Iron release and membrane damage in erythrocytes exposed to oxidizing agents,

phenylhydrazine, divicine and isouramil.

Biochem J. 1992 Jul; 285 (Pt 1): 295-301

Fink GW, Norman JG

Specific changes in the pancreatic expression of the interleukin 1 family of genes

during experimental acute pancreatitis.

Cytokine. 1997 Dec; 9(12): 1023-1027

Franklin TB, Krueger-Naug AM, Clarke DB, Arrigo AP, Currie RW

The role of heat shock proteins Hsp70 and Hsp27 in cellular protection of the central

nervous system.

Int J Hyperthermia. 2005 Aug; 21(5): 379-392

Frossard JL Heat shock protein 70 (HSP70) prolongs survival in rats exposed to hyperthermia. Eur J Clin Invest. 1999 Jun; 29(6): 561-562


104

Frossard JL, Bhagat L, Lee HS, Hietaranta AJ, Singh VP, Song AM, Steer ML,

Saluja AK

Both thermal and non-thermal stress protects against caerulein induced pancreatitis

and prevent trypsinogen activation in the pancreas.

Gut. 2002 Jan; 50(1): 78-83

Fu K, Sarras MP Jr, De Lisle RC, Andrews GK

Expression of oxidative stress-responsive genes and cytokine genes during

caerulein-induced acute pancreatitis.

Am J Physiol. 1997 Sep; 273 (3 Pt 1): G 696-705

Gorelick FS, Modlin IM, Leach SD, Carangelo R, Katz M

Intracellular proteolysis of pancreatic zymogens.

Yale J Biol Med. 1992 Sep-Oct; 65(5): 407-420; discussion 437-440

Grady T, Dabrowski A, Williams JA, Logsdon CD

Stress-activated protein kinase activation is the earliest direct correlate to the

induction of secretagogue-induced pancreatitis in rats.

Biochem Biophys Res Commun. 1996 Oct; 227(1): 1-7

Grady T, Liang P, Ernst SA, Logsdon CD

Chemokine gene expression in rat pancreatic acinar cells is an early event

associated with acute pancreatitis.

Gastroenterology. 1997; 113(6): 1966-1975

Grendell JH Acute pancreatitis. Curr.Opin.Gastroenterol. 13, 1997: 381-385

Grise K, Kim F, McFadden D

Hyperthermia induces heat-shock protein expression, reduces pancreatic injury, and

improves survival in necrotizing pancreatitis.

Pancreas. 2000 Aug; 21(2):120-125

Gross V, Leser HG, Heinisch A, Scholmerich J

Inflammatory mediators and cytokines-new aspects of the pathophysiology and

assessment of severity of acute pancreatitis?

Hepatogastroenterology. 1993 Dec; 40(6): 522-530


105

Gukovskaya AS, Gukovsky I, Zaninovic V, Song M, Sandoval D, Gukovsky S,

Pandol SJ

Pancreatic acinar cells produce, release, and respond to tumor necrosis factor-

alpha. Role in regulating cell death and pancreatitis.

J Clin Invest. 1997; 100(7): 1853-1862

Halangk W, Lerch MM, Brandt-Nedelev B, Roth W, Ruthenbuerger M, Reinheckel

T, Domschke W, Lippert H, Peters C, Deussing J

Role of cathepsin B in intracellular trypsinogen activation and the onset of acute

pancreatitis.

J Clin Invest. 2000 Sep; 106(6): 773-781

Halliwell B, Gutteridge JM

The antioxidants of human extracellular fluids.

Arch Biochem Biophys. 1990; 280(1): 1-8

Han B, Klonowski-Stumpe H, Luthen R, Schreiber R, Haussinger D, Niederau C

Menadione-induced oxidative stress inhibits cholecystokinin-stimulated secretion of

pancreatic acini by cell dehydration.

Pancreas. 2000 Aug; 21(2): 191-202

Hartl FU Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature. 1996 Jun; 381(6583): 571-579

Hartwig W, Werner J, Ryschich E, Mayer H, Schmidt J, Gebhard MM, Herfarth C,

Klar E

Cigarette smoke enhances ethanol-induced pancreatic injury.

Pancreas. 2000 Oct; 21(3): 272-278

Hayashi S, Takamiya R, Yamaguchi T, Matsumoto K, Tojo SJ, Tamatani T, Kitajima

M, Makino N, Ishimura Y, Suematsu M

Induction of heme oxygenase-1 suppresses venular leukocyte adhesion elicited by

oxidative stress: role of bilirubin generated by the enzyme.

Circ Res. 1999 Oct; 85(8): 663-671


106

Hofbauer B, Saluja AK, Lerch MM, Bhagat L, Bhatia M, Lee HS, Frossard JL, Adler

G, Steer ML.

Intra-acinar cell activation of trypsinogen during caerulein-induced pancreatitis in

rats.

Am J Physiol. 1998 Aug; 275(2 Pt 1): G 352-362

Hughes CB, Grewal HP, Gaber LW, Kotb M, El-din AB, Mann L, Gaber AO

Anti-TNFalpha therapy improves survival and ameliorates the pathophysiologic

sequelae in acute pancreatitis in the rat.

Am J Surg. 1996 Feb; 171(2): 274-280

Immenschuh S, Ramadori G

Gene regulation of heme oxygenase-1 as a therapeutic target.

Biochem Pharmacol. 2000 Oct; 60(8): 1121-1128

Ingbar DF Extracellular matrix as a regulator of epithelial polarity, cell growth and tissue

pattern. In: Go VLW, Dimagno EP, Gardner JD, Lebenthal E, Reber HA, Scheele GA

(editors) The Pancreas: Biology, Pathobiology and Disease. New York, Raven press, 1993:

351-367

Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2003 Jan; 284(1): G 15-26

Katori M, Buelow R, Ke B, Ma J, Coito AJ, Iyer S, Southard D, Busuttil RW, Kupiec-

Weglinski JW

Heme oxygenase-1 overexpression protects rat hearts from cold

ischemia/reperfusion injury via an antiapoptotic pathway.

Transplantation. 2002 Jan; 73(2): 287-292

Kappas A, Drummond GS

Control of heme metabolism with synthetic metalloporphyrins.

J Clin Invest. 1986 Feb; 77(2): 335-339


107

Kawabata S, Miura T, Morita T, Kato H, Fujikawa K, Iwanaga S, Takada K, Kimura

T, Sakakibara S

Highly sensitive peptide-4-methylcoumaryl-7-amide substrates for blood-clotting

proteases and trypsin.

Eur J Biochem. 1988 Feb; 172(1): 17-25

Keim V, Hoffmeister A, Kurth T, Niels T, Mössner J

Trypsinogen variant N21I in hereditary pancreatitis is characterized by a higher

stability in acidic environment but not by increased resistance to autolysis.

Gastroenterology. 1999; 116: A 1137

Keim V Genetic risk factors in pancreatic diseases-significance for general practice Med Klin (Munich). 2002 May; 97(5): 278-284

Ketterer B Protective role of glutathione and glutathione transferases in mutagenesis and

carcinogenesis. Mutat Res. 1988 Dec; 202(2): 343-361

Ketterer B, Meyer DJ, Tan KH

The role of glutathione transferase in the detoxication and repair of lipid and DNA

hydroperoxides.

Basic Life Sci. 1988; 49: 669-674

Keyse SM, Tyrrell RM

Heme oxygenase is the major 32 kDa stress protein induced in human skin

fibroblasts by UVA radiation, hydrogen peroxide, and sodium arsenite.

Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Jan; 86(1): 99-103

Kotler DP, Levine GM

Reversible gastric and pancreatic hypo secretion after long-term total parenteral

nutrition.

New England J Med. 1979 Feb; 300(5): 241-242


108

Kubisch C, Dimagno MJ, Tietz AB, Welsh MJ, Ernst SA, Brandt-Nedelev B, Diebold

J, Wagner AC, Göke B, Williams JA, Schaefer C

Overexpression of heat shock protein Hsp27 protects against cerulein-induced

pancreatitis.

Gastroenterology. 2004 Jul; 127(1): 275-286

Labbe RF, Vreman HJ, Stevenson DK

Zinc protoporphyrin: A metabolite with a mission.

Clin Chem. 1999 Dec; 45(12): 2060-2072

Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage

T4. Nature. 1970 Aug; 227(5259): 680-685

Lampel M, Kern HF

Acute interstitial pancreatitis in the rat induced by excessive doses of a pancreatic

secretagogue.

Virchows Arch A Pathol Anat Histol. 1977 Mar; 373(2): 97-117

Landry J, Chretien P, Lambert H, Hickey E, Weber LA

Heat shock resistance conferred by expression of the human HSP27 gene in rodent

cells.

J Cell Biol. 1989 Jul; 109(1): 7-15

Lautier D, Luscher P, Tyrrell RM

Endogenous glutathione levels modulate both constitutive and UVA

radiation/hydrogen peroxide inducible expression of the human heme oxygenase

gene.

Carcinogenesis. 1992 Feb; 13(2): 227-232

Leach SD, Modlin IM, Scheele GA, Gorelick FS

Intracellular activation of digestive zymogens in rat pancreatic acini. Stimulation by

high doses of cholecystokinin.

J Clin Invest. 1991 Jan; 87(1): 362-366


109

Lee PJ, Alam J, Wiegand GW, Choi AM

Overexpression of heme oxygenase-1 in human pulmonary epithelial cells results in

cell growth arrest and increased resistance to hyperoxia.

Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Sep; 93(19): 10393-10398

Leppä S, Sistonen L

Heat shock response-pathophysiological implications.

Ann Med. 1997 Feb; 29(1): 73-78

Lerch MM, Gorelick FS

Early trypsinogen activation in acute pancreatitis.

Med Clin North Am. 2000 May; 84(3): 549-563

Lindquist S, Craig EA

The heat-shock proteins.

Annu Rev Genet. 1988; 22: 631-677

Luster AD Chemokines-chemotactic cytokines that mediate inflammation. N Engl J Med. 1998 Feb; 338(7): 436-445

Luthen RE, Neuschwander-Tetri BA, Niederau C, Ferrell LD, Grendell JH

The effect of L-buthionine-[S,R]-sulfoximine on the pancreas in mice. A model of

weakening glutathione-based defence mechanisms.

Int J Pancreatol. 1994 Aug; 16(1): 31-36

Luthen RE, Niederau C, Grendell JH

Intrapancreatic zymogen activation and levels of ATP and glutathione during

caerulein pancreatitis in rats.

Am J Physiol. 1995 Apr; 268(4 Pt 1): G 592-604

Maines MD, Kappas A

Cobalt induction of hepatic heme oxygenase; with evidence that cytochrome P-450

is not essential for this enzyme activity.

Proc Natl Acad Sci USA. 1974 Nov; 71(11): 4293-4297


110

Maines MD, Kappas A

Cobalt stimulation of heme degradation in the liver. Dissociation of microsomal

oxidation of heme from cytochrome P-450.

J Biol Chem. 1975 Jun; 250(11): 4171-4171

Maines MD, Trakshel GM, Kutty RK

Characterization of two constitutive forms of rat liver microsomal heme oxygenase.

Only one molecular species of the enzyme is inducible.

J Biol Chem. 1986 Jan; 261(1): 411-419

Maines MD Heme oxygenase: function, multiplicity, regulatory mechanisms, and clinical

applications. FASEB J. 1988 Jul; 2(10): 2557-2568

Maines MD Heme Oxygenase and Heme Degrading Systems. In Heme Oxygenase: Clinical

Applications and Functions. ed. Maines, MD pp. 63-108. Boca Raton: CRC Press. 1992

McCoubrey WK, Maines MD

The structure, organization and differential expression of the gene encoding rat

heme oxygenase-2.

Gene. 1994 Feb; 139(2): 155-161

McCoubrey WK, Eke B, Maines MD

Multiple transcripts encoding heme oxygenase-2 in rat testis: developmental and

cell-specific regulation of transcripts and protein.

Biol Reprod. 1995 Dec; 53(6): 1330-1338

McCoubrey WK, Huang TJ, Maines MD

Heme oxygenase-2 is a hemoprotein and binds heme through heme regulatory

motifs that are not involved in heme catalysis.

J Biol Chem. 1997 May; 272(19): 12568-12574

McCoubrey WK, Huang TJ, Maines MD

Isolation and characterization of a cDNA from the rat brain that encodes

hemoprotein heme oxygenase-3.

Eur J Biochem. 1997 Jul; 247(2): 725-732


111

Minowada G, Welch WJ

Clinical implications of the stress response.

J Clin Invest. 1995 Jan; 95(1): 3-12

Morimoto RI, Sarge KD, Abravaya K

Transcriptional regulation of heat shock genes. A paradigm for inducible genomic

responses.

J Biol Chem. 1992 Nov; 267(31): 21987-21990

Morisset JA, Webster PD

Effects of fasting and feeding on protein synthesis by the rat pancreas.

J Clin Invest. 1972 Jan; 51(1): 1-8

Nam JH, Murthy S

Acute pancreatitis-the current status in management.

Expert Opin Pharmacother. 2003 Feb; 4(2): 235-241

Nascimento AL, Luscher P, Tyrrell RM

Ultraviolet A (320-380 nm) radiation causes an alteration in the binding of a specific

protein/protein complex to a short region of the promoter of the human heme

oxygenase 1 gene.

Nucleic Acids Res. 1993 Mar; 21(5): 1103-1109

Nath KA, Balla G, Vercellotti GM, Balla J, Jacob HS, Levitt MD, Rosenberg ME

Induction of heme oxygenase is a rapid, protective response in rhabdomyolysis in

the rat.

J Clin Invest. 1992 Jul; 90(1): 267-270

Neuzil J, Gebicki JM, Stocker R

Radical-induced chain oxidation of proteins and its inhibition by chain-breaking

antioxidants.

Biochem J. 1993 Aug; 293 (Pt 3): 601-606

Neuzil J, Stocker R

Bilirubin attenuates radical-mediated damage to serum albumin.

FEBS Lett. 1993 Oct; 331(3): 281-284


112

Niederau C, Grendell JH

Intracellular vacuoles in experimental acute pancreatitis in rats and mice are an

acidified compartment.

J Clin Invest. 1988; 81(1): 229-236

Niederau C, Lüthen R, Heintges T

Effects of CCK on pancreatic function and morphology.

Ann NY Acad Sci. 1994 Mar; 713: 180-198

Nieto-Sotelo J, Wiederrecht G, Okuda A, Parker CS

The yeast heat shock transcription factor contains a transcriptional activation

domain whose activity is repressed under nonshock conditions.

Cell. 1990 Aug; 62(4): 807-817

Nonaka A, Manabe T, Kyogoku T, Tamura K, Tobe T

Changes in lipid peroxide and oxygen radical scavengers in cerulein-induced acute

pancreatitis. Imbalance between the offence and defence systems.

Digestion. 1990; 47(3): 130-137

Norman JG, Fink GW, Franz MG

Acute pancreatitis induces intrapancreatic tumor necrosis factor gene expression.

Arch Surg. 1995 Sep; 130(9): 966-970

Otterbein LE, Choi AM

Heme oxygenase: colours of defence against cellular stress.

Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 Dec; 279(6): L1029-1037

Opie EL The etiology of acute hemorrhagic pancreatitis. John Hopkins Hosp.Bull. 12, 1901: 182-188

Opie EL The relation of cholelithiasis to disease of the pancreas and to fat necrosis. John Hopkins Hosp.Bull. 12, 1901: 19-21

Palade G Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science. 1975 Aug; 189(4200): 347-358


113

Ploessl I, Gallmeier E, Schaefer C, Bilzer M, Bittmann I, Goke B, Wagner ACC

ANP preconditioning does not increase protection against experimental pancreatitis,

observed after general anaesthesia and jugular vein catheterization.

Pancreas. 2004 Mar; 28(2): 166-173

Plumier JC, Currie RW

Heat shock-induced myocardial protection against ischemic injury: a role for Hsp70?

Cell Stress Chaperones. 1996 Apr; 1(1): 13-17

Pockley AG Heat shock proteins in health and disease: therapeutic targets or therapeutic

agents? Expert Rev Mol Med. 2001 Sep; 2001: 1-21

Poss KD, Tonegawa S

Reduced stress defense in heme oxygenase 1-deficient cells.

Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Sep; 94(20): 10925-10930

Raeburn CD, Cleveland JC Jr, Zimmerman MA, Harken AH

Organ preconditioning.

Arch Surg. 2001 Nov; 136(11): 1263-1266

Rakonczay Z Jr, Takacs T, Boros I, Lonovics J

Heat shock proteins and the pancreas.

J Cell Physiol. 2003 Jun; 195(3): 383-391

Rau B, Poch B, Gansauge F, Bauer A, Nussler AK, Nevalainen T, Schoenberg MH,

Beger HG

Pathophysiologic role of oxygen free radicals in acute pancreatitis: initiating event or

mediator of tissue damage?

Ann Surg. 2000 Mar; 231(3): 352-360

Redaelli CA, Wagner M, Kulli C, Tian YH, Kubulus D, Mazzucchelli L, Wagner AC,

Schilling MK

Hyperthermia-induced HSP expression correlates with improved rat renal isograft

viability and survival in kidneys harvested from non-heart-beating donors.

Transpl Int. 2001 Dec; 14(6): 351-360


114

Redaelli CA, Tian YH, Schaffner T, Ledermann M, Baer HU, Dufour JF

Extended preservation of rat liver graft by induction of heme oxygenase-1.

Hepatology. 2002 May; 35(5): 1082-1092

Rice-Evans C, Burdon R

Free radical-lipid interactions and their pathological consequences.

Prog Lipid Res. 1993; 32(1): 71-110

Ritossa FA A new puffing pattern inducted by temperature shock in DNP in Drosophila. 1962 Experimentia. 18: 571-573

Rosenberg DW, Drummond GS, Kappas A

The in vitro and in vivo inhibition of intestinal heme oxygenase by tin-protoporphyrin.

Pharmacology. 1989; 39(4): 224-229

Saluja AK, Donovan EA, Yamanaka K, Yamaguchi Y, Hofbauer B, Steer ML

Cerulein-induced in vitro activation of trypsinogen in rat pancreatic acini is mediated

by cathepsin B.

Gastroenterology. 1997; 113(1): 304-310

Saluja AK, Bhagat L, Lee HS, Bhatia M, Frossard JL, Steer ML

Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic

acini.

Am J Physiol. 1999; 276(4 Pt 1): G 835-842

Sato H, Siow RC, Bartlett S, Taketani S, Ishii T, Bannai S, Mann GE

Expression of stress proteins heme oxygenase-1 and -2 in acute pancreatitis and

pancreatic islet betaTC3 and acinar AR42J cells.

FEBS Lett. 1997 Mar; 405(2): 219-223

Sato K, Balla J, Otterbein L, Smith RN, Brouard S, Lin Y, Csizmadia E, Sevigny J,

Robson SC, Vercellotti G, Choi AM, Bach FH, Soares MP

Carbon monoxide generated by heme oxygenase-1 suppresses the rejection of

mouse-to-rat cardiac transplants.

J Immunol. 2001 Mar; 166(6): 4185-4194


115

Schäfer C, Clapp P, Welsh MJ, Benndorf R, Williams JA

HSP27 expression regulates CCK-induced changes of the actin cytoskeleton in

CHO-CCK-A cells.

Am J Physiol. 1999 Dec; 277(6 Pt 1): C 1032-1043

Schäfer C, Williams JA

Stress kinases and heat shock proteins in the pancreas: possible roles in normal

function and disease.

J Gastroenterol. 2000; 35(1): 1-9

Schäfer C, Tietz AB, Göke B

Pathophysiology of acute experimental pancreatitis: lessons from genetically

engineered animal models and new molecular approaches.

Digestion. 2005 May; 71(3): 162-172

Schoenberg MH, Buchler M, Beger HG

The role of oxygen radicals in experimental acute pancreatitis.

Free Radic Biol Med. 1992; 12(6): 515-522

Schoenberg MH, Birk D, Beger HG

Oxidative stress in acute and chronic pancreatitis.

Am J Clin Nutr. 1995 Dec; 62(6 Suppl): 1306 S-1314 S

Schulz HU, Niederau C, Klonowski-Stumpe H, Halangk W, Luthen R, Lippert H

Oxidative stress in acute pancreatitis.

Hepatogastroenterology. 1999 Sep-Oct; 46(29): 2736-2750

Shibahara S, Sato M, Muller RM, Yoshida T

Structural organization of the human heme oxygenase gene and the function of its

promoter.

Eur J Biochem. 1989 Feb; 179(3): 557-563

Singer MV Latency of pancreatic fluid secretory response to intestinal stimulants in the dog. J Physiol. 1983 Jun; 339: 75-85


116

Solomon TE Control of exocrine pancreatic secretion. In Johnson LR (editor): Physiology of the gastrointestinal tract

New York, Raven press, 1987

Steer ML, Meldolesi J

The cell biology of experimental pancreatitis.

New Engl J Med. 1987; 316(3): 144-150

Steer ML Pathogenesis of acute pancreatitis. Digestion. 1997; 58 Suppl 1: 46-49

Steinberg W, Tenner S

Acute Pancreatitis.

New England Journal of Medicine. 1994 Apr; 330(17): 1198-1210

Stocker R, Glazer AN, Ames BN

Antioxidant activity of albumin-bound bilirubin.

Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Aug; 84(16): 5918-5922

Stocker R Induction of heme oxygenase as a defence against oxidative stress. Free Radic Res Commun. 1990; 9(2): 101-112

Stocker R, McDonagh AF, Glazer AN, Ames BN

Antioxidant activities of bile pigments: biliverdin and bilirubin.

Methods Enzymol. 1990; 186: 301-309

Strowski MZ, Sparmann G, Weber H, Fiedler F, Printz H, Jonas L, Göke B, Wagner

AC

Caerulein pancreatitis increases mRNA but reduces protein levels of rat pancreatic

heat shock proteins.

Am J Physiol. 1997 Oct; 273(4 Pt 1): G 937-945

Tashiro M, Ernst SA, Edwards J, Williams JA

Hyperthermia induces multiple pancreatic heat shock proteins and protects against

subsequent arginine-induced acute pancreatitis in rats.

Digestion. 2002; 65(2): 118-126


117

Teich N, Mossner J, Keim V

Mutations of the cationic trypsinogen in hereditary pancreatitis.

Hum Mutat. 1998; 12(1): 39-43

Threadgold J, Greenhalf W, Ellis I, Howes N, Lerch MM, Simon P, Jansen J,

Charnley R, Laugier R, Frulloni L, Olah A, Delhaye M, Ihse I, Schaffalitzky de

Muckadell OB, Andren-Sandberg A, Imrie CW, Martinek J, Gress TM, Mountford R,

Whitcomb D, Neoptolemos JP.

The N34S mutation of SPINK1 (PSTI) is associated with a familial pattern of

idiopathic chronic pancreatitis but does not cause the disease.

Gut. 2002 May; 50(5): 675-681

Tissieres A, Mitchell HK, Tracy UM

Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: Relation to

chromosome puffs.

J Mol Biol. 1974 Apr; 85(3): 389-398

Tyrrell RM, Basu-Modak S

Transient enhancement of heme oxygenase 1 mRNA accumulation: a marker of

oxidative stress to eukaryotic cells.


Uchinami H, Yamamoto Y, Kume M, Yonezawa K, Ishikawa Y, Taura K, Nakajima

A, Hata K, Yamaoka Y

Effect of heat shock preconditioning on NF-kappaB/I-kappaB pathway during I/R

injury of the rat liver.

Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002 Jun; 282(6): G 962-971

Vile GF, Basu-Modak S, Waltner C, Tyrrell RM

Heme oxygenase 1 mediates an adaptive response to oxidative stress in human

skin fibroblasts.

Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Mar; 91(7): 2607-2610

Vogt BA, Alam J, Croatt AJ, Vercellotti GM, Nath KA

Acquired resistance to acute oxidative stress. Possible role of heme oxygenase and

ferritin.

Lab Invest. 1995 Apr; 72(4): 474-483


118

Vogt BA, Shanley TP, Croatt A, Alam J, Johnson KJ, Nath KA

Glomerular inflammation induces resistance to tubular injury in the rat. A novel form

of acquired, heme oxygenase-dependent resistance to renal injury.

J Clin Invest. 1996 Nov; 98(9): 2139-2145

Wagner AC, Weber H, Jonas L, Nizze H, Strowski M, Fiedler F, Printz H, Steffen H,

Göke B

Hyperthermia induces heat shock protein expression and protection against

cerulein-induced pancreatitis in rats.

Gastroenterology. 1996 Nov; 111(5): 1333-1342

Weber CK, Gress T, Muller-Pillasch F, Lerch MM, Weidenbach H, Adler G

Supramaximal secretagogue stimulation enhances heat shock protein expression in

the rat pancreas.

Pancreas. 1995 May; 10(4): 360-367

Weber H, Wagner AC, Jonas L, Merkord J, Hofken T, Nizze H, Leitzmann P, Göke

B, Schuff-Werner P

Heat shock response is associated with protection against acute interstitial

pancreatitis in rats.

Dig Dis Sci. 2000 Nov; 45(11): 2252-2264

Webster PD, Singh M, Tucker PC, Black O

Effects of fasting and feeding on the pancreas.

Gastroenterology. 1972 Apr; 62(4): 600-605

Whitcomb DC, Gorry MC, Preston RA, Furey W, Sossenheimer MJ, Ulrich CD,

Martin SP, Gates LK Jr, Amann ST, Toskes PP, Liddle R, McGrath K, Uomo G, Post

JC, Ehrlich GD

Hereditary pancreatitis is caused by a mutation in the cationic trypsinogen gene.

Nat Genet. 1996; 14(2): 141-145

Whitcomb DC Hereditary pancreatitis: new insights into acute and chronic pancreatitis. Gut. 1999 Sep; 45(3): 317-322

Whitcomb DC How to think about SPINK and pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2002 May; 97(5): 1085-1088


119

Willemer S, Bialek R, Adler G

Localization of lysosomal and digestive enzymes in cytoplasmic vacuoles in

caerulein-pancreatitis.

Histochemistry. 1990; 94(2): 161-170

Williams JA Signal transduction and intracellular signaling in pancreatic acinar cells. Current opinion in Gastroenterology. 1995; 11: 397-401

Williams JA, Groblewski GE, Ohnishi H, Yule DI

Stimulus-secretion coupling of pancreatic digestive enzyme secretion.

Digestion. 1997; 58 Suppl 1: 42-45

Witt H, Luck W, Hennies HC, Classen M, Kage A, Lass U, Landt O, Becker M

Mutations in the gene encoding the serine protease inhibitor, Kazal type 1 are

associated with chronic pancreatitis.

Nat Genet. 2000 Jun; 25(2): 213-216

Witt H, Simon P, Lerch MM

Genetic aspects of chronic pancreatitis

Dtsch Med Wochenschr. 2001 Sep;126(36): 988-993

Witt H The SPINK in chronic pancreatitis: similar finds, different minds. Gut. 2002 May; 50(5): 590-591

Wong HR, Wispe JR

The stress response and the lung.

Am J Physiol. 1997 Jul; 273(1Pt1): L 1-9

Woo J, Iyer S, Cornejo MC, Mori N, Gao L, Sipos I, Maines M, Buelow R

Stress protein-induced immunosuppression: inhibition of cellular immune effector

functions following overexpression of haem oxygenase (HSP 32).

Transpl Immunol. 1998 Jun; 6(2): 84-93

Yet SF, Melo LG, Layne MD, Perrella MA

Heme oxygenase 1 in regulation of inflammation and oxidative damage.



120

Zakhary R, Poss KD, Jaffrey SR, Ferris CD, Tonegawa S, Snyder SH

Targeted gene deletion of heme oxygenase 2 reveals neural role for carbon

monoxide.

Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Dec; 94(26): 14848-14853

Zhou W, Levine BA, Olson MS

Platelet-activating factor: a mediator of pancreatic inflammation during cerulein

hyperstimulation.

Am J Pathol. 1993 May; 142(5): 1504-1512

Kapitel 10 Danksagung

121

10. Danksagung Ich möchte Herrn Prof. Dr. med. Andreas Wagner herzlich danken für die

interessante und herausfordernde Aufgabenstellung, die jederzeit gewährte

freundliche Unterstützung und die hervorragenden Möglichkeiten des

selbstständigen wissenschaftlichen Arbeitens, sowie der sehr guten Betreuung der

Arbeit. Seine kritische Auseinandersetzung mit meiner Arbeit, wie auch die

motivierenden Diskussionen und Gespräche waren mir eine große Hilfe und haben

den Fortgang der Arbeit entscheidend beeinflusst.

Mein Dank gilt Herrn PD Dr. med. Claus Schäfer, der mich in meiner Arbeit sehr

unterstützt und immer ein offenes Ohr für Anliegen aller Art hatte. Seine zahlreichen

Anregungen und Tipps haben mir bei der Fertigstellung dieser Arbeit sehr geholfen.

Bei Frau Dr. Irmgard Plössl und Frau Dr. med. Constanze Kubisch möchte ich mich

für die Einarbeitung und die Einweisung in experimentelle Techniken im Labor, die

hervorragende Zusammenarbeit und die anregenden Diskussionen, die freundliche

und geduldige Unterstützung herzlich bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit

wesentlich mit beigetragen haben. Ein weiterer Dank gilt Frau Claudia Jäger für ihre

Hilfsbereitschaft beim experimentellen Arbeiten.

Mein Dank gilt allen Kollegen des Arbeitskreises für ihre Hilfsbereitschaft und für

das überaus angenehme Klima im Labor, Herrn Prof. Dr. med. Joachim Diebold für

die Hilfe bei der Anfertigung histologischer Präparate und der Deutschen

Forschungsgesellschaft für die finanzielle Unterstützung der Arbeit.

Des Weiteren möchte ich mich bei Sebastian Fiedler und Tobias Brandt für Ihre

Unterstützung bei technischen und graphischen Problemen, sowie all meinen

Freunden für ihre Hilfe, Aufmunterung und Unterstützung, nicht nur während der

Doktorarbeit, bedanken.

Danken möchte ich ganz besonders auch meiner Familie, vor allem meinen Eltern,

für die anhaltende Unterstützung, die mir das Medizinstudium und diese

Doktorarbeit erst ermöglicht haben und auf deren Rückhalt ich jederzeit bauen

konnte.

Kapitel 11 Lebenslauf

122

11. Lebenslauf Zur Person

Tobias Gebhardt

geboren am 09.08.1974 in Wiesbaden

ledig

Schulausbildung

1980-1984 Grundschule in Homburg/Saar

1984-1985 Gymnasium Vaterstetten bei München

1985-1992 Gymnasium Oberalster, Hamburg

1992-1994 Gymnasium Adolfinum, Bückeburg, Niedersachsen Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Wehrdienst

1994-1996 Wehrdienst im Gebirgsjägerbataillon 233 in Mittenwald, Bayern Ausbildung im Sanitätsdienst und in der Bergrettung

1996 Erfolgreicher Abschluss an der Offizierschule des Heeres in Hannover

Universitäre Ausbildung

1997-2004 Studium der Humanmedizin an der LMU, München

Aug. 2000 Ärztliche Vorprüfung an der LMU

Aug. 2001 Erstes Staatsexamen an der LMU

Sep. 2003 Zweites Staatsexamen an der LMU

Nov. 2004 Drittes Staatsexamen an der LMU

Ärztliche Prüfung (Gesamtnote 2,33) und Approbation als Arzt

Beruflicher Werdegang

seit Feb. 2005 Assistenzarzt in der Allgemein- und Viszeralchirurgie, Akademisches Lehrkrankenhaus der LMU, Klinikum München-Neuperlach

Stressreaktion des Pankreas Hat die Hämoxygenase-1 (HSP32 ... · Pankreatitis anhand spezifischer...

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