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Abbildung 74: Struktur der NC1-Domäne von menschlichem Placenta-Collagen IV. DieAbbildung zeigt ein NC1-Hexamer. Die Struktur wurde auf der Grundlage einer adhoc-Präparation von Bromderivaten und MAD-Phasierung an der K-Kante von Brom gelöst.(Quelle: Than et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 6607)

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Max-Planck-GesellschaftArbeitsgruppen für StrukturelleMolekularbiologieLeiter: H.-D. Bartunik, E. Mandelkow (Sprecher), A. Yonath

Die Max-Planck-Arbeitsgruppen beschäftigen sichmit den Beziehungen zwischen der Struktur undder Funktion von biologischen Makromolekülen.Thematische Schwerpunkte sind

– die Enzyme und ihr katalytischer Mechanismus,

– das Zytoskelett und seine Rolle in Zellbewegungund Alzheimer-Krankheit,

– das Ribosom und seine Funktion in der Protein-biosynthese.

Die Proben werden mit biochemischen Methodenisoliert oder mit molekularbiologischen Methodensynthetisiert. Die wesentliche Methode der Struk-turuntersuchung ist die Röntgenbeugung von Pro-teinkristallen, Fasern oder Lösungen; daneben wer-den weitere biophysikalische Analyseverfahren wieSpektroskopie, Elektronenmikroskopie, Bildverar-beitung und andere eingesetzt. Schwerpunkte me-thodischer und instrumenteller Entwicklungen sindneue Kristallisationsverfahren, Einsatz von elektro-nischen Detektoren, Laue-Methoden und eine Mess-strecke für die Proteinkristallographie.

Forschungsschwerpunkte

Proteindynamik

Die MPG-Arbeitsgruppe für Proteindynamik unter-sucht Struktur-Funktionsbeziehungen von Proteinen.Sie setzt dabei Methoden der Proteinkristallographiebei ultrahoher Auflösung, der Kryokristallographiesowie der zeitaufgelösten Röntgenbeugung ein. Einweiterer Schwerpunkt ist die Entwicklung von Me-thoden anomaler Phasenlösung und ihre Anwendungauf de-novo-Bestimmungen von Proteinstrukturen. DieGruppe betreibt eine Messstation an der Wiggler-Beamline BW6 an DORIS.

Ein Schwerpunkt der wissenschaftlichen Arbeiten lagbeiderweiterenEntwicklungvonVerfahrenexperimen-teller Phasierung. Mit Hilfe anomaler Streuung bei einerRöntgenwellenlänge (SAD-Methode) bezw. bei mehre-ren Wellenlängen (MAD) wurde eine Reihe neuer Pro-teinstrukturen aufgeklärt. Ein wichtiges Beispiel stelltdie Struktur der nichtkollagenen (NC1) Domäne vonKollagen IV aus menschlicher Plazenta dar. Adhoc-Derivatisierung mit Natriumbromid und der Einsatzanomaler Streuung an der Br-K-Kante löste das Pro-blem der Nichtisomorphie von Kristallen, das eine Be-stimmung der Struktur trotz langjähriger Bemühungenbisher verhindert hatte. Die Struktur (Abb. 74) ist insbe-sondere von Bedeutung für die Untersuchung bestimm-ter Krankheiten auf molekularer Ebene; dazu gehörendie Goodpasture- und Alport-Syndrome.

Ein weiterer Schwerpunkt lag bei der Entwicklung vonVerfahren und Techniken zur Automatisierung der Beu-gungsmessungenund ihrer Auswertung. Damit wurdenwesentliche Voraussetzungen für die Lösung von Pro-teinstrukturen in HT (,,High Throughput“) Verfahrenund damit für Anwendungen in der Strukturgenomikan der Beamline BW6 geschaffen. Weitere Schritte derEntwicklung zielen insbesondere auf eine Automatisie-rung der Beurteilung der Kristallqualität, der Bestim-mung der Kristallklasse sowie der Wahl der Messstrate-gie für HT-Strukturlösung mit SAD/MAD-Phasierung;diese Schritte bedürfen bisher der Intervention durcherfahrene Proteinkristallographen.

Alle Röntgenbeugungsmessungen wurden an derBeamline BW6 an DORIS durchgeführt, die von MPGund GBF gemeinsam betrieben wird.

Zytoskelett

Die MPG-Arbeitsgruppe ,,Zytoskelett“ befasst sich mitder Stukturbestimmung von Proteinen des Zytoske-

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Abbildung 75: Die Zusammenstellung verschiedenerStrukturenvon KinesinundverwandtenMotorproteinen in einheitlicher Orientierung verdeutlicht die Unterschiede in den variablenBereichen an der Oberfläche der Motordomäne. Besonders hervorgehoben sind die Schalter-Regionen (,,Switch-Regionen“, Sw1 und Sw2) mit den sich anschließenden Helizes, die inLänge und Ausrichtung relativ zum Kern der Motordomäne variieren.

letts mit Hilfe der Synchrotronstrahlung, insbeson-dere mit der Untersuchung des Struktur-Funktions-Zusammenhangs von Mikrotubuli und den damit asso-ziierten Proteinen. Mikrotubuli sind Proteinfasern, diezusammen mit anderen Komponenten des Zytoskelettsfür die äußere Gestalt der Zellen und für die innereräumliche Organisation der subzellulären Bestandteileverantwortlich sind. Mikrotubuli sind dabei keineswegsstatisch und unveränderlich, wie der Ausdruck ,,Zy-toskelett“ vermuten lässt, sie besitzen vielmehr einehohe Dynamik und können sich daher rasch an die sichändernden Erfordernisse anpassen. Die Steuerung derMikrotubuli-Dynamik geschieht durch den Einfuss an-derer Proteine, die mit den Mikrotubuli direkt (MAPs –Mikrotubuli-Assoziierte Proteine) oder indirekt inter-

agieren. Andererseits dienen Mikrotubuli als Schienenfür intrazelluläre Transportvorgänge und nehmen da-durch selbst Einfluss auf die innere Dynamik der Zellen.Prominente Beispiele für solche Prozesse, bei denenMikrotubuli eine wichtige Rolle spielen, sind die Tren-nung der Tochterchromatiden bei der Zellteilung unddie Bildung von Zellfortsätzen (Axone, Dendriten) beider Differenzierung von Nervenzellen.

Aktive Elemente beim Mikrotubuli-basierten Transportsind die Motorproteine aus der Familie der Kinesine.Das so genannte ,,konventionelle Kinesin“, der Haupt-vertreter der Kinesine, besteht aus zwei schweren undzwei leichten Peptidketten. Jede der beiden schwerenKetten hat eine etwa 350 Aminosäuren umfassende

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globuläre ,,Motordomäne“. Diese Motordomänen bin-den an die Oberfläche der Mikrotubuli und wandelnchemische Energie in Form energiereicher Moleküle(ATP – Adenosintriphosphat) in gerichtete Bewegungum. In der MPG-Arbeitsgruppe ,,Zytoskelett“ wurdevor einiger Zeit die Struktur der Motordomäne ausRattenkinesin in monomerer und dimerer Form be-stimmt. Mittlerweile sind etwa 15 Röntgenstrukturenvon Motordomänen verschiedener Kinesine bekannt,unter anderem von menschlichem Kinesin sowie vonnicht-konventionellen Kinesinen aus verschiedenen Or-ganismen. Durch den Vergleich dieser Strukturen konn-ten Einblicke in die Funktionsweise der molekularenMotoren gewonnen werden.

Aufschlussreich ist dabei die Struktur des schnel-len Pilzkinesins NcKin (Neurospora crassa Kinesin),die zuletzt in der Arbeitsgruppe ,,Zytoskelett“ gelöstwurde. Kleine strukturelle Änderungen in der ATP-Bindungstasche, hervorgerufen durch die Hydrolysevon ATP, werden durch ein Netzwerk von Salzbrückenverstärkt und auf eine Region übertragen, die fürdie Bindung an die Mikrotubuli-Oberfläche wichtigist (,,Switch2-Region“, Abb. 75). Dadurch wird dieFestigkeit der Bindung zwischen Motordomäne undMikrotubuli-Oberfläche im Takt der ATP-Hydrolysemoduliert. Gleichzeitig führt die Verschiebung der,,Switch2-Region“ zu einer Konformationsänderung ineiner benachbarten Region, die mit der zweiten Motor-domäne in Kontakt steht und damit für die Kommunika-tion zwischen den beiden Motordomänen verantwort-lich ist. Dies erklärt die Koordinierung der Aktivitätenbeider Motordomänen, was für eine ,,reibungsfreie“ Be-wegung des zusammengesetzten Kinesin-Motors uner-lässlich ist. Der geschwindigkeitsbestimmende Schrittist der Ersatz der Spaltprodukte des ATP durch fri-sches ATP. Im Vergleich mit den anderen Kinesinenhat das schnelle Pilzkinesin eine ATP-Bindungstasche,die weiter geöffnet ist, so dass der Austausch von ADPund ATP schneller erfolgen kann.

Die Funktion der MAPs besteht nach üblichem Ver-ständnis hauptsächlich in einer stabilisierenden bzw.regulativen Wirkung auf das Mikrotubuli-Gerüst derZelle. In der Arbeitsgruppe ,,Zytoskelett“ konnte nach-gewiesen werden, dass das Tau-Protein, das zur Gruppeder MAPs zählt, nicht nur die Mikrotubuli stabili-siert, sondern auch direkt Einfluss auf den Mikrotubuli-basierten Transport von Vesikeln und anderen Zellorga-

nellen nimmt, indem es die Wechselwirkung zwischenKinesinen und Mikrotubuli reguliert. Dies wurde durchdie Beobachtung der Bewegung einzelner Kinesin-Moleküle mit Hilfe der TIRF-Mikroskopie (,,Total In-ternal Reflection Fluorescence“) bestätigt. Dabei stelltesich heraus, dass Tau hauptsächlich die Annäherungdes Motorproteins an die Mikrotubuli behindert, wäh-rend der eigentliche Bewegungsablauf nach erfolgtemKontakt durch die Anwesenheit von Tau-Molekülenauf der Oberfläche der Mikrotubuli kaum beeinträchtigtwird.

Eine Fehlfunktion des Tau-Proteins kann weitreichendeFolgen für die strukturelle Integrität und den Metabo-lismus der Zelle haben. Bei einigen neuronalen Er-krankungen (FTDP-17, Alzheimer-Krankheit) kommtes aus bisher ungeklärten Gründen zur Aggregationvon Tau-Protein zu unlöslichen Fasern und letztlichzum Absterben von Nervenzellen. Um die Ursachendieser pathologischen Aggregation von Tau-Proteinzu klären, wurden in der Arbeitsgruppe ,,Zytoske-lett“ strukturelle Untersuchungen an Tau-Protein inLösung und an künstlichen Tau-Fasern durchgeführt.Verglichen mit der langsamen Aggregation des Tau-Proteins bei der Alzheimerkrankheit neigen bestimmteTau-Mutanten der frontotemporalen Demenz beson-ders stark zur Fibrillenbildung. Unter verschiedenen,teilweise einander ausschließenden Bedingungen (Zu-gabe von Polyanionen oder Fettsäuren, oxidierendeoder reduzierende Bedingungen) erfolgt die Aggrega-tion so schnell, dass sie sich in vitro verfolgen lässt.Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass dieAggregation von Tau unabhängig von den experimen-tellen Bedingungen nach einem einheitlichen Struktur-prinzip erfolgt. Die beobachteten Unterschiede lassensich auf die unterschiedliche Kinetik der Teilreaktio-nen (Aktivierung, Nukleation, Polymerisation) zurück-führen. Das Tau-Protein enthält ein Hexapeptid-Motiv,welches von einer ungeordneten Struktur in eine β-Faltblatt-Struktur übergehen kann. Die Umwandlunggeschieht zunächst spontan in einem langsamen Pro-zess. Durch den Kontakt mit bereits umgewandeltenTau-Molekülen wird die Umwandlung beschleunigt.Dabei bilden sich lange Fasern mit einer β-Faltblatt-ähnlichen Struktur.

Für die Suche nach aggregationshemmenden Substan-zen für den therapeutischen Einsatz ist es wichtig, einadäquates in vitro-Modell der Tau-Aggregation zur Ver-

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fügung zu stellen und ein schnelles, effektives Verfah-ren zu entwickeln, das es erlaubt, den Einfluss che-mischer Verbindungen und anderer Faktoren auf dieFaserbildung zu bestimmen. Dazu wurde eine syste-matische Untersuchung von Tryptophan-Mutanten desTau-Proteins durchgeführt, in der gezeigt wurde, dasssichdiePackungderTau-MolekülebeiderFaserbildungmit Hilfe der Tryptophan-Fluoreszenz charakterisierenlässt, ohne die Aggregation selbst zu behindern. Da-mit erscheint die Fluoreszenzanalyse von Tryptophan-Mutanten des Tau-Proteins geeignet für die Suchenach potentiellen Wirkstoffen in groß angelegten Test-reihen.

Struktur der Ribosomen

Ribosomen decodieren die Baupläne der Erbsubstanzin jeder Zelle und setzen diese in die Synthese vonProteinen um. Sie bestehen aus zwei Untereinheiten,die jeweils verschiedene Funktionen im Rahmen derProtein-Biosynthese erfüllen. Die kleine Untereinheit(30S in Prokaryonten) ist für die Übersetzung des ge-netischen Codes verantwortlich. Die große Unterein-heit (50S) fügt die einzelnen Aminosäuren zu einerPeptidkette, dem neu zu bildenden Protein,zusammen.

Aufgrund der zentralen Rolle des Ribosoms in derProtein-Biosynthese ist es zugleich das primäre Tar-get der meisten Antibiotika. Da aber der Großteil derAntibiotika heutzutage in der Nahrungsmittelindus-trie und nicht zur Behandlung bakterieller Infektio-nen eingesetzt wird, kommt es in immer größeremund schnellerem Rahmen zu Antibiotika-Resistenzen,während die Neuentwicklung von Medikamenten da-mit kaum Schritt halten kann. Mit der Strukturaufklä-rung bakterieller Ribosomen bzw. deren Untereinhei-ten und Komplexen mit Antibiotika ist den Forschernnun ein Mittel in die Hand gegeben, die vielfältigenWechselwirkungen detailliert zu verstehen und somitein gezieltes, kostengünstiges, deutlich beschleunig-tes und vereinfachtes Medikamentendesign voranzu-treiben.

Im Jahr 2002 wurden weitere Ribosomen-Antibiotika-Komplexe auf kristallographischem Wege analysiert.Azalide und Ketolide sind Antibiotika der neuestenGeneration, die durch chemische Modifikation der

Makrolide gewonnen wurden. Makrolide wie Erythro-mycin, Roxithromycin und Clarythromycin blockie-ren den Tunneleingang der ribosomalen 50S Unterein-heit, durch den die naszierende Proteinkette geführtwird. Der Durchlass wird auf ein Drittel geschmä-lert, die Protein-Biosynthese stoppt nach wenigenZyklen, sobald die Proteinkette das Antibiotikum er-reicht hat.

Das Ketolid ABT-773 und das Azalid Azithromy-cin wurden im Micromolarbereich mit der 50S ri-bosomalen Untereinheit von Deinococcus radiodur-ans co-kristallisiert, die gezüchteten Kristalle wurdenschockgefroren und Synchrotronstrahlung ausgesetzt.Die gewonnenen kristallographischen Daten erlaubtenRückschlüsse auf die spezifische Wirkungsweise.

Die Bindestelle des ABT-773 ist im Vergleich zu denMakroliden innerhalb des Tunneleingangs der 50S ri-bosomalen Untereinheit leicht verschoben, obwohl sichreaktive Molekülanteile perfekt mit denen von Roxi-thromycin überlagern lassen. Die Verschiebung führtzu vermehrten Kontakten mit verschiedenen Domä-nen der ribosomalen RNA, die zum Teil mutations-unabhängig sind, was die Aktivität gegen bestimmteMakrolid-resistente Phänotypen erklärt.

Azithromycin ist eines der wenigen Antibiotika, dieim Spätstadium von Aids eingesetzt werden können.Aus der Elektronendichte des Azithromycin-Ribosom-Komplexes gingen überraschenderweise zwei Bin-destellen innerhalb des ribosomalen Tunnels hervor(Abb. 76). Das zweite Azithromycin-Molekül bindetnicht nur an die ribosomale RNA, sondern auch anzwei ribosomale Proteine, die die Makrolid-Resistenzzur Folge haben.

Des Weiteren wurden kristallographische Untersuchun-gen zur Dynamik der Protein-Biosynthese, speziell derPeptid-Bindung und der Translokation, durchgeführt.Im Laufe des Elongationszyklus passiert jede Transfer-RNA (tRNA), die die einzelnen Aminosäuren an dasRibosomliefert, drei (A→P→E)ribosomaleBindestel-len, abhängig von der Konformation des Ribosoms. Imprätranslokalen Zustand befinden sich je eine tRNAin A- und P-Bindestelle, während im posttransloka-len Stadium die P- und E-Stelle besetzt ist. Die kor-rekte Lagerung der Aminosäure-beladenen tRNA inder A-Stelle stimuliert den Flip des CCA-Endes der

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Abbildung 76: Der erste strukturelle Nachweis für eine zweite Bindestelle eines Makro-lid Antibiotikums am Ribosom. Links: Elektronendichte für zwei an die ribosomale 50SUntereinheit von Deinococcus radiodurans gebundene Azithromycin Moleküle. Mitte: Che-mische Darstellung von Azithromycin. Rechts: Die zwei Moleküle blockieren den – in dieserDarstellung aufgeschnittenen – Tunnel.

A-Stellen-tRNA in die Position des 3’-Endes der P-Stellen-tRNA bei nahezu gleichzeitiger Peptidbindung.Diese Bewegung resultiert in einem naszierenden Pep-tid, das in den Eingang des Tunnels zeigt und derTranslokation der entladenen P-Stellen-tRNA in dieE-Stelle.

Kristallstrukturen ribosomaler Komplexe, bestehendaus der 50S ribosomalen Untereinheit von Deinococ-cus radiodurans mit verschiedenen Substratanalogen,die den tRNA-Akzeptorstamm und das CCA-3’-Ende

der A-Stellen-tRNA imitieren, und dem AntibiotikumSparsomycin wurden in molekularer Auflösung ana-lysiert. Es gelang nicht nur, den Bindungsmodus derSubstratanaloge und des Inhibitors aufzuklären, son-dern auch dynamische Elemente innerhalb des Pepti-dyltransferasezentrums zu definieren. Innerhalb diesesZentrums konnte eine 180 Grad Rotationsachse gefun-den werden, woraus sich der Vorschlag einer allgemei-nen Ribosomenmaschinerie für die Peptidbindung, dieTranslokation und das Anwachsen der naszierendenPeptidkette ergab.

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