Synthese von Arylamin-modifizierten 2’-dG...

Synthese von Arylamin-modifizierten 2’-dG-Phosphoramiditen und deren Einbau in

Oligonucleotide

Dissertation Zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades

von

Nicolas Böge

aus

Hamburg

vorgelegt dem Department Chemie der Universität Hamburg

Hamburg, im Januar 2008

1. Gutachter: Prof. Dr. C. Meier

2. Gutachter: Prof. Dr. J. Thiem

Datum der Disputation: 14.3.2008

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde im Arbeitskreis von Prof. Dr. Chris Meier am Institut für

Organische Chemie der Universität Hamburg in der Zeit von April 2005 bis Januar

2008 angefertigt.

Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. C. Meier für die Überlassung des interessanten

Themas, sowie für die Freiheiten bei der Bearbeitung. Ferner danke ich ihm für die

gute Betreuung während der Arbeit, für zahlreiche Diskussionen, Anregungen und

Hilfestellungen.

Allen ehemaligen und aktiven Mitgliedern des Arbeitskreises gilt mein Dank für ihre

Hilfsbereitschaft. Einen ganz besonderen Dank möchte ich Herrn Dipl.-Chem.

Nicolas Gisch für die gemeinsamen Jahre im Labor 518, die hervorragende

Zusammenarbeit, das exzellente Arbeitsklima und die stete Hilfsbereitschaft in allen

Lagen aussprechen. Für die thematische Zusammenarbeit danke ich weiterhin Frau

Dipl.-Chem. Maike Jacobsen, Frau Dipl.-Chem. Zita Szombati und Frau Sarah

Krüger.

Einen besonderen Dank gilt den zahlreichen Praktikantinnen und Praktikanten,

welche im Rahmen ihres Studiums experimentelle Arbeiten für mich durchführten.

Hervorzuheben sind dabei meine ehemaligen Schwerpunktpraktikanten, Frau Dipl.-

Chem. Zita Szombati, Frau Sarah Krüger, Frau Saskia Wolf, Frau Nathalie Lunau

und Herr Marcus Schröder.

Herrn Dr. V. Sinnwell, Herrn Dr. E.T.K. Haupt und ihren Mitarbeitern möchte ich für

die Messung zahlreicher NMR-Spektren danken.

Frau A. Meiners, Frau C. Christ und Herrn M. Preuße spreche ich meinen Dank für

die zahlreichen Messungen der FAB-, ESI- und EI-Massenspektren aus.

Herrn Prof. Andreas Marx und Frau Dipl.-Chem. Francesca di Pasquale, Universität

Konstanz danke ich für die Durchführung der Primer-Verlängerungs-Tests, sowie für

die Aufnahme von ESI-Massenspektren.

Einen weiteren Dank gilt meinen Kooperationspartnern am DESY, Hamburg. Allen

voran Herrn Dr. Markus Perbandt für die Unterstützung bei den

Kristallisationsversuchen der Oligonucleotide.

Herrn Dipl.-Chem. Nicolas Gisch und Herrn Dipl.-Chem. Bastian Reichardt danke ich

weiterhin für die kritische Durchsicht dieser Arbeit.

Meiner Mutter möchte ich für die finanzielle Unterstützung während meines Studiums

danken. Ebenso möchte ich ihr wie auch meinen Freunden, besonders Jenny

Matthiesen, für die moralische Unterstützung während der gesamten Zeit danken.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1. Einleitung 1 2. Kenntnisstand 5 2.1 Metabolismus der aromatischen Amine 5

2.1.1 Phase I 5

2.1.2 Phase II (Bildung der ultimalen Carcinogene) 6

2.2 Reaktion ultimaler Carcinogene mit der DNA 8

2.3 Mechanismus der Adduktbildung in vivo 10

2.4 Nachweis der Carcinogenität 11

2.4.1 Ames-Test 11

2.4.2 32P-Postlabeling-Methode 12

2.5 Darstellung von Arylamin-Addukten am 2‘-Desoxyguanosin 13

2.5.1 Darstellung von C8-Arylamin-Addukten 13

2.5.2 Darstellung von N2-Arylamin-Addukten 17

2.5.3 Darstellung von O6-Arylamin-Addukten 19

2.5.4 Darstellung von C8-N-Acetyl-Arylamin-Addukten 20

2.6 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide und

deren Eigenschaften 21

2.7 Reparatur und Struktur C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 22

3. Aufgabenstellung 24 4. Resultate und Diskussion 26

4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-

Bausteine 26

4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-

Bausteine 41

4.2.1 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels

Azokupplung 42

4.2.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution 45

4.2.3 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels

Palladium-katalysierter Kreuzkupplung 50

Inhaltsverzeichnis

4.3 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-

Bausteine 72

4.3.1 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-

Bausteine mittels Mitsunobu-Reaktion 73

4.3.2 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotid-

Bausteine mittels einer Substitutions-Reaktion 78

4.4 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 94

4.4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 100

4.4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide 104

4.5 Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte) 109

4.6 Messung des circularen Dichroismus 116

4.7 Restriktionsabbau mittels EcoRI 121

4.8 Primer-Verlängerungs-Untersuchungen 127

4.9 Erste Versuche zur Kristallisation von Oligonucleotiden 136

5. Zusammenfassung 141 6. Summary 146

7. Ausblick 149

8. Experimentalteil 152 8.1 Allgemeines 152

8.1.1 Lösungsmittel und Reagenzien 152

8.1.2 Chromatographie und Geräte 154

8.1.2.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 154

8.1.2.2 Präparative Säulenchromatographie 154

8.1.2.3 Zirkulare präparative Dünnschichtchromatographie 155

8.1.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 155

8.1.2.5 Kernresonanzspektroskopie (NMR) 156

8.1.2.6 Massenspektrometrie (MS) 156

8.1.2.7 Schmelzpunktbestimmung 157

8.1.2.8 Infrarot-Spektrometer 157

8.1.2.9 Polarimeter 157

8.1.2.10 Zentrifuge 157

8.1.2.11 UV-Spektrometer 157

8.1.2.12 Thermomixer 157

8.1.2.13 Speed-Vac-Probenkonzentrator 157

Inhaltsverzeichnis

8.1.2.14 DNA-Synthesizer 158

8.1.2.15 CD-Spektrometer 158

8.2 Oligonucleotide 158

8.2.1 Synthese von Oligonucleotiden 158

8.2.2 Entschützung und Trägerabspaltung 158

8.2.3 Reinigung der Oligonucleotide 159

8.3 Analytik der Oligonucleotide 159

8.3.1 Bestimmung der Optischen Dichte (OD260) 159

8.3.2 Präparation der Oligonucleotide für das ESI-MS 160

8.3.3 Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm-Wert) 160

8.3.4 Messung des circularen Dichroismus 160

8.3.5 Enzymatischer Abbau der Oligonucleotide mittels des

EcoRI Restriktionsenzym 160

8.4. Allgemeine Arbeitsvorschriften 161

8.5 Synthesen 167

8.6 Oligonucleotide 273

9. Gefahrstoffe 281 10. Literatur 286

11. Anhang 301

12. Persönliches 312


Abkürzungen und Symbole

AAV Allgemeine Arbeitsvorschrift

Abb. Abbildung

Ac Acetyl

AG Abgangsgruppe

Äq. Äquivalente

ber. berechnet

BINAP 2,2´-Bis(diphenylphosphino)-1,1´-binaphthyl

Bn Benzyl

BOP Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-

hexafluorophosphat

Bz Benzoyl

CD circularer Dichroismus

cod cyclooctadienyl

CPE Cyanophenylethyl

CPG controlled pore glass

δ chemische Verschiebung

d Dublett

dA 2’-Desoxyadenosin

dba dibenzylidenaceton

DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en

DC Dünnschichtchromatographie

DCM Dichlormethan

dC 2’-Desoxycytosin

DCI 4,5-Dicyanoimidazol

dG 2’-Desoxyguanosin

DIAD Diisopropylazodicarboxylat

DIPEA Diisopropylethylamin (Hünigs Base)

DLS Dynamische Lichtstreuung

DMAP 4-(Dimethylamino)-pyridin

1,2-DME 1,2-Dimethoxyethan

DMF N,N-Dimethylformamid

DMSO-d6 Dimethylsulfoxid (sechsfach deuteriert)


DMTr 4,4’-Dimethoxytriphenylmethyl

DNA Desoxyribonucleinsäure

dT 2’-Desoxythymidin

DTE Dithioerithrol

DTT Dithiothreithol

ε molarer Extinktionskoeffizient

EcoRI Escherichia Coli

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EI Elektronenionisation

ESI Elektronensprayionisation

FAB fast atom bombardment

FG funktionelle Grupppe

Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

Form Formamidin

gef. gefunden

h Stunde

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure

HPLC High Performance Liquid Chromatographie

iBu iso-Butyryl

IQ 2-Amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinolin

IR Infrarot

J skalare Kern-Kern-Kopplungskonstante

λ Wellenlänge

K Kelvin

Kap. Kapitel

LM Lösungsmittel

m Multiplett

M Molar

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

MHz Megahertz

MPD 2-Methyl-2,4-pentanediol

MS Massenspektrometrie

NBS N-Bromsuccinimid

NER nucleotide excision repair


nm Nanometer

NMR Nuclear Magnetic Resonance

NOE Nuclear Overhauser Effect

NOESY Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy

p page

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PPh3 Triphenylphosphin

ppm parts per million

PhthNOH N-Hydroxyphthalimid

rac racemisch

Rf Retentionsfaktor

RP reversed phase

Rt Raumtemperatur

s Singulett

S. Seite

s. siehe

Sdp Siedepunkt

sec Sekunden

sept Septett

SG Schutzgruppe

Smp Schmelzpunkt

t Triplett

TBAF Tetrabutylammoniumfluorid

TBDMS tert-Butyldimethylsilyl

TEAA Triethylammoniumacetat

Tf Triflat

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

Tm Schmelzpunkt eines DNA-Duplexes

TMSN3 Trimethylsilylazid

tR Retentionszeit

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

UV Ultraviolett

XANTPHOS 9,9-Dimethyl-4,5-bis(diphenylphosphino)xanthene


z.B. zum Beispiel

Einleitung

1. Einleitung

Der menschliche Körper besteht aus vielen verschiedenen Zelltypen. Normalerweise

wachsen bzw. teilen sich die Zellen, wenn dies für den Körper notwendig ist. Diese

Regeneration der Zellen läuft geregelt ab und dient der Gesunderhaltung des

Körpers.

Erfolgen Zellteilungen, obwohl keine neuen Zellen benötigt werden, kommt es zu

einer übermäßigen Gewebeneubildung. Der Überschuss an Gewebe bildet eine

Geschwulst, welche man Tumor nennt. Dieser kann gutartig oder bösartig sein.

Bösartiges (malignes) Gewebe bezeichnet man als Krebsgewebe. Bei Krebszellen

ist das Gleichgewicht von Wachstum, Teilung und Zerstörung (Apoptose) im

Zellverband außer Kraft gesetzt. Regulierende Signale werden nicht erkannt oder

nicht ausgeführt, da meistens der dafür benötigte genetische Code einer Mutation

unterliegt und damit defekt ist. Die Krebszellen teilen sich im Vergleich zu gesunden

Zellen unkontrolliert. Sie können in das benachbarte gesunde Gewebe eindringen

(infiltrierendes Wachstum) oder es zerstören (destruierendes Wachstum). Als

krebserregend werden daher vor allem Einflüsse bezeichnet, die das Erbgut

verändern.

Die Nomenklatur der malignen Tumore unterscheidet zum Einen nach dem

Ursprungsgewebe und zum Anderen nach dem Tumortyp. Hier werden epitheliale

Tumore, die sich aus Ektoderm- und Entodermgewebe gebildet haben, als

Karzinome bezeichnet, während mesenchymale Tumore, die aus dem Mesoderm

entstehen, als Sarkome bezeichnet werden.[1]

Prinzipiell kann jedes Gewebe einen Tumor entwickeln. Die drei häufigsten Tumor-

erkrankungen sind jedoch das Prostata-Karzinom, das Mamma-Karzinom, sowie das

Bronchial-Karzinom. Das Bronchial-Karzinom weist zudem die höchste Todesrate

aller Tumorerkrankungen auf. Dies begründet sich vor allem in der Tatsache, dass

das Karzinom relativ spät diagnostiziert wird, so dass ein Großteil des umgebenden

Gewebes schon geschädigt ist und sich meist schon Metastasen gebildet haben.[2]

Metastasen entstehen, wenn sich Tumorzellen aus dem Tumor lösen und sich über

das Lymphsystem und den Blutstrom verbreiten. Binden sie schließlich an

Endothelzellen, so kann die Zelle von dort in das umliegende Gewebe eindringen

und einen Tochtertumor bilden (s. Abb. 1, S. 2).

1

http://de.wikipedia.org/wiki/Krebserregend

Einleitung

Abb. 1 Skizze des Mechanismus der Metastasierung[3]

Die direkte Folgeerscheinung des Tumorwachstums ist der Verlust von spezifischen

Zell- und Gewebefunktionen, die daraus resultiert, dass der Tumor in das gesunde

Gewebe hineinwächst und so die ihn umgebenden Zellstrukturen schädigt. Zudem

gibt es eine weitere Folgeerscheinung, die sogenannte Tumoranämie, bei der unter

anderem die Anzahl und die Lebensdauer der Erythrozyten herabgesenkt sind.

Zusätzlich kommt es zu Schädigungen der Blutgefäße und damit verbunden zu

Blutungen, wodurch die Erythrozytenkonzentration weiter sinkt. Eine direkte

Konsequenz der Anämie ist somit eine Schwächung des Patienten, wodurch die

Überlebenschance weiter abnimmt.[1, 4-6]

In den meisten Ländern der Welt ist Krebs heute nach Herz- und

Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Todesursache. [7] So stieg die Anzahl der

durch Krebs ausgelösten Todesfälle in den letzten Jahren auf ein Viertel. Nach

Schätzungen der American Cancer Society lag die Zahl der Krebs-Neuerkrankungen

beispielsweise innerhalb der USA im Jahre 2007 bei 1.44 Millionen Patienten. Im

gleichen Jahr sind schätzungsweise 560.000 Personen an den Folgen von Krebs

gestorben. Dabei handelt es sich um 23.1% der in den USA registrierten

Todesfälle.[2] Diese Daten lassen sich auf nahezu jedes andere westliche

Industrieland übertragen.

Neben der Neigung an Krebs zu erkranken, welche bekanntermaßen u.a. bei Brust-

und Darmkrebs vererbt werden kann, können Neuerkrankungen von ionisierender

Strahlung (so starb Marie Curie 1934 an durch radioaktiver Strahlung verursachter

Leukämie), infektiösem biologischem Material und genetischen Determinanten

herrühren. Als Hauptursache bei der Induktion von Krebs scheinen jedoch

Chemikalien zu fungieren.[8]

2

Einleitung

Die ersten Befunde über den Zusammenhang zwischen bestimmten Chemikalien

und Krebs stammen aus dem Jahr 1761.[9] So berichtete J. Hill von einem erhöhten

Auftreten von Krebs in Nasenschleimhäuten nach langjährigem Gebrauch von

Schnupftabak. Berichte über aromatische Amine, die Gegenstand dieser Arbeit sind,

als krebsauslösende Substanzen, wurden von L. Rehn im Jahr 1895 veröffentlicht.[10]

Er beobachtete eine Zunahme von Harnblasenkarzinomen bei Arbeitern, die in der

Produktion von Magenta (Fuchsin) beschäftigt waren. Rehn prägte daraufhin den

Begriff „Anilin-Krebs“, da Anilin 1 (s. Abb. 2) die Ausgangsverbindung der Synthese

darstellt. Diese Bezeichnung stellte sich jedoch später als falsch heraus. Vielmehr

waren es die Nebenprodukte der Anilinherstellung, wie z. B. 4-Aminobiphenyl 2, die

krebserzeugend waren (s. Abb. 3, S. 4).

NH2 NH2 NH2 NH2

O

1 5 6 7

NH2

NH2NH2

2 3 4 Abb. 2 carcinogene aromatische Amine

Außer polycyclischen Aminen wie z.B. 2-Aminofluoren 3 oder 2-Naphthylamin 4 sind

für die Carcinogenese auch die monocyclischen Amine von Bedeutung, wenngleich

sie im Allgemeinen eine geringere Carcinogenität aufweisen. Verbindungen dieser

Art, wie z. B. Anilin 1, 4-Toluidin 5, 4-Anisidin 6 oder 4-Ethylanilin 7, werden daher als

Grenzcarcinogene bezeichnet. Bei Substanzen dieser Klasse kommt die Fähigkeit

der Tumorindikation nur dann zum Ausdruck, wenn eine hohe Dosierung vorliegt, die

Substanz über einen langen Zeitraum verabreicht oder aber ein Comutagen

zugegeben wird.

3

Einleitung

Aromatische Amine sind in den Industrieländern ubiquitäre Umweltgifte. Sie werden

seit Beginn des 19. Jahrhunderts vor allem zur Synthese von Azo-Farbstoffen,

Pharmaka, Pestiziden oder auch Polyurethanen benötigt. Auch waren aromatische

Amine bis ins 20. Jahrhundert aufgrund mangelndem Risikobewusstseins im

Straßenteer enthalten.

Monocyclische, aromatische Amine wurden unter anderem im Tabakrauch

nachgewiesen, vor allem das 4-Aminobiphenyl 2 und zahlreiche Methyl-, Dimethyl-,

und Ethylderivate des Anilin 1.

Weiterhin können sie jedoch auch als Abbauprodukte, z. B. durch Reduktion von

polycyclischen Nitroaromaten aus Dieselgasen und synthetischen Treibstoffen

entstehen. Ebenso konnten verschiedene heterocyclische, aromatische Amine, wie

z.B. 2-Amino-3-methyl-imidazo[4,5-f]quinolin (IQ) 33 (s. S. 15), in gekochtem Fisch

oder Fleisch nachgewiesen werden, wo sie durch Pyrolyse von Aminosäuren wie

Tryptophan entstehen können. [11,12]

4

Kenntnisstand

2. Kenntnisstand

2.1 Metabolismus der aromatischen Amine

Obwohl das carcinogene Potential bei den genannten Verbindungen bisweilen sehr

unterschiedlich ist, bleibt deren Wirkungsweise immer gleich.

Gelangen aromatische Amine in den Körper, so setzt ein Detoxifizierungsprozess

ein, der die Wasserlöslichkeit körperfremder Stoffe zum Ziel hat, um diese

ausscheiden zu können. Allerdings können die aromatischen Amine auch durch

enzymatische Reaktionen zu elektrophilen Aminierungsreagenzien (sogenannte

ultimale Carcinogene) umgewandelt werden (s. Abb. 4, S. 7).

Bei diesen Prozessen unterscheidet man zwei Phasen. In Phase I findet eine

Oxidation statt, während es sich bei der Reaktion in Phase II meistens um eine

Veresterung handelt.

2.1.1 Phase I

Aus Arbeiten von J. W. Cramer, J. A. Miller und E. C. Miller wurde bekannt, dass

diesem ersten Schritt, der Oxidation aromatischer Amine, eine Schlüsselrolle für

deren Carcinogenität zukommt.[13]

Das aromatische Amin 8 (bzw. die N-acetylierte Form) kann relativ unspezifisch

durch verschiedene Enzymsysteme am Ring oder am Stickstoff oxidiert werden. So

kann es einerseits durch eine Cytochrom-P450-vermittelte Aktivierung in der Leber

zum Hydroxylamin 9 oxidiert werden. Quantenmechanische Rechnungen legen dabei

einen Ein-Elektronen-Mechanismus für diesen initialisierenden Schritt des

Metabolismus aromatischer Amine nahe. Dabei kann der Mechanismus sowohl über

das Aminium-Kation 10 als auch über das Aminyl-Radikal 11 laufen (s. Abb. 3, S.

6).[14]

5

Kenntnisstand

HN

8

NH

10

N

11

NH

N

- e

- H

- H

Enz-OHN

9

R

R R

R R R

OH

R = H, Ac

Abb. 3 Postulierter Ein-Elektronen-Mechanismus der N-Oxidation aromatischer Amine

Andererseits kann das Arylamin 8 durch die cytosolische N-Acetyltransferase in das

ausscheidbare Acetanilid 12 überführt werden.[15] Nach neueren Erkenntnissen wird

auch die N-Glucuronidierung als Entgiftungsreaktion genutzt, wobei der

Glucuronsäureester 13 gebildet wird, der aufgrund seiner Stabilität als Transportform

gilt und ausgeschieden werden kann.

Das Hydroxylamin 9 kann über das Blut in die Nieren transportiert und über den Urin

ausgeschieden werden. Im Blut allerdings kann das Hydroxylamin 9 teilweise durch

Hämoglobin, unter Methämoglobinbildung, zum Nitrosoderivat 14 oxidiert werden und

spontan mit Glutathion (GSH) oder SH-Gruppen des Hämoglobins abreagieren.[9]

2.1.2 Phase II (Bildung der ultimalen Carcinogene)

In der Harnblase kann es allerdings zu weiteren Reaktionen kommen. Das

Hydroxylamin 9 kann hier wegen des geringen pH-Wertes protoniert werden und

liefert unter Wasserabspaltung das hochreaktive Nitreniumion 15, welches kovalent

an DNA oder andere Biomoleküle binden kann.

Neben diesem nicht-enzymatischen Aktivierungsschritt gibt es je nach Spezies und

Organ eine Reihe von enzymatisch katalysierten Wegen. So kann das Hydroxylamin

9 beispielsweise durch die Sulfotransferase in den Sulfatester 16 (ein ultimales

Carcinogen) überführt werden, welcher dann durch Abspaltung der Sulfatgruppe

ebenfalls das Nitreniumion 15 bildet.[16,17]

Ein weiterer Weg, der das Nitreniumion 15 liefert, erfolgt durch Acetylierung des

Hydroxylamins 9 durch die N-Acetyltransferase in der Harnblase. Hierbei entsteht

6

Kenntnisstand

zunächst das N-Acyloxyarylamin 17 (ultimales Carcinogen), das dann ebenfalls nicht-

enzymatisch unter Acetatabspaltung zerfällt und das Nitreniumion 15 bildet.[18,19]

N-AcetyltransferaseNH

O

P450

NOH

RN

Gluc

HbFe

N OGSHHämoglobin

NOH

RN

GlucAusscheidung

Leber

Blut

Harn-blase

Sulfo-transferase

nicht-enzymatisch

N-Acetyl-transferase

NR

OSO3N

RN

R

OAc

DNA-Addukt

NH

8

9

12

13

14

1516 17

11 R

R

R = H, Ac

Abb. 4 Metabolismus aromatischer Amine in der Entstehung von Harnblasenkrebs (Giftungsreaktionen sind rot,

Entgiftungsreaktionen schwarz dargestellt)

7

Kenntnisstand

2.2 Reaktion ultimaler Carcinogene mit der DNA

Das durch Metabolisierung erhaltene elektrophile Nitreniumion 15 ist in der Lage sich

an die nucleophilen Stellen der DNA anzulagern und sogenannte DNA-Addukte zu

bilden.

Chemisch betrachtet ist der Begriff des „DNA-Addukts“ missverständlich, da es sich

bei der Reaktion zwischen Carcinogen und Nucleobase nicht um eine

Additionsreaktion, sondern um eine Substitutionsreaktion handelt. Da der Begriff in

der biochemischen Terminologie jedoch gebräuchlich ist und auch in der Literatur

Verwendung findet, soll er auch hier angewandt werden.

Viele Untersuchungen in den letzten Jahren haben sich mit der Identifizierung dieser

„Addukte“ beschäftigt. Dabei hat sich gezeigt, dass sowohl in vitro, als auch in vivo

die Anzahl, als auch die Menge der mit den DNA-Basen gebildeten Produkte je nach

Carcinogen verschieden sein können.

Neben der Bildung von Addukten an der N4-Position des 2’-Desoxycytosin, an der

C8- sowie N6-Position des 2’-Desoxyadenosin wurden eine Reihe von Addukten am

2’-Desoxyguanosin gefunden, welche Thema dieser Arbeit sind (s. Abb. 5, S. 9).[20]

Neben den Addukten in C8-Position 18 (ca. 80% aller gefundenen Addukte) wurden

von Hatcher und Swaminathan, sowie von Kadlubar die in geringerem Maße

vorkommenden Addukte in N2- und in O6-Position nachgewiesen und identifiziert.

Diese Nachweise wurden dabei mit Hilfe der 32P-Postlabeling-Methode, sowie

massenspektrometrischen und NMR-spektroskopischen Untersuchungen mit

4-Aminobiphenyl 2 bzw. 2-Naphthylamin 4 durchgeführt.[21-26]

Eine Quantifizierung gelang dabei für das C8-Addukt des 4-Aminobiphenyl in

humanen Pankreaszellen durch Vouros im Jahre 2005. Er konnte dabei die

durchschnittliche Anzahl an gebildeten Addukten (60 pro 108 Nucleobasen) bei

starken Rauchern mittels Kapillar-Flüssigchromatographie-Mikroelektronenspray

Massenspektrometrie bestimmen.[27] Aussagen über die Quantifizierung in anderen

Organen oder Zelltypen sind bislang nicht bekannt.

8

Kenntnisstand

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

NH

Aryl NH

N

N

O

NHN

O

OH

HNAryl

NH

N

N

O

NN

O

OH

NAryl

C8-dG ~ 80 % 18

N2-dG ~ 5 % 19

N2-dG < 5 % 20

HO HO HO

HO

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HNAryl

O6-dG ~1 % 21

NH

N

N

O

NH

N

O

OH

N2-dG < 1 % 22

HONH2

HO

N

N

N

O

NH2N

O

OH

O6-dG < 0.1 % 23

NH2

Abb. 5 Addukte des 2’-Desoxyguanosin und deren relative Häufigkeit

Durch diese Addukte kann die Struktur der DNA soweit verändert werden, dass es

bei der Transkription zu Mutationen und in Folge dessen zu Zellen kommt. Dies kann

zum Absterben der Zelle (Apoptose) oder im ungünstigsten Fall zur Entwicklung

einer Tumorzelle führen.[9] Allerdings führen diese DNA-Modifikationen nur dann zu

Replikationsfehlern, sollten die zelleigenen Reparaturmechanismen die Veränderung

nicht rechtzeitig erkennen und beheben, sowie die Zelle nicht mehr in der Lage sein

ein Signal zu ihrer eigenen Zerstörung abzugeben.

In Tierversuchen konnte unter Zuhilfenahme von 32P-Postlabeling-Experimenten

gezeigt werden, dass die unterschiedlichen DNA-Addukte der verschiedenen

aromatischen Amine unterschiedlich schnell repariert werden.[28] So sind zum

Beispiel N2-Addukte in vivo persistenter verglichen mit den

entsprechenden C8-Addukten. Grund hierfür ist die unterschiedliche Konformation

der DNA, die durch die verschiedenen Addukte entstehen kann. Welche

Konformation vorliegt und damit maßgeblich die Struktur beeinflusst, hängt vom

aromatischen System des Addukts ab. Während einige Aromaten sich in die Helix

der DNA einfügen und keine merkliche konformative Änderung hervorrufen,

begünstigen andere in unterschiedlichem Maße die Umwandlung von der

9

Kenntnisstand

B-Konformation zur „stacked“ S-Konformation (z. B. C8-modifizierte Oligonucleotide

des 2-Aminofluoren 6), welches eine Denaturierung der DNA zur Folge hat.[29]

2.3 Mechanismus der Adduktbildung in vivo

Der Mechanismus der am häufigsten auftretenden DNA-Addukt-Gruppe, dem dG-C8-

Addukten, ist bislang noch nicht vollständig geklärt. Allerdings gilt es als erwiesen,

dass intermediär ein Arylnitreniumion 15 gebildet wird. Die Beobachtung, dass die

Reaktion vorwiegend am Guanin stattfindet, kann mit Hilfe des Redoxpotentials der

Base erklärt werden, da dieses deutlich kleiner als das der anderen DNA-

Heterocyclen ist und somit die notwendige Elektronenabgabe erst möglich macht.

Aufgrund der Tatsache, dass die C8-Position nicht die nukleophilste Stelle der Base

ist und mit Alkylierungsreagenzien (z.B. Methyliodid) eine bevorzugte Reaktion an

der N7-Position nachgewiesen werden konnte, schlugen F. P. Guengerich et al.

einen Mechanismus vor, der diesen Umstand mit einbezieht.[30,31]

Zu ähnlichen Ergebnissen kamen drei Jahre später auch M. Novak und S. A.

Kennedy.[32] Die durch den elektrophilen Angriff des Arylnitreniumion 15 erzeugte

positive Ladung ist demnach über die N7-, C8- und N9-Positionen delokalisiert. Nach

Deprotonierung an der C8-Position liegt dann ein Ylid vor, welches in einer der

Stevens-Umlagerung ähnlichen Reaktion das in vivo beobachtete C8-Addukt liefert,

wobei seine Aromatizität zurückgebildet wird (s. Abb. 6).

HN

N N

N

O

H2NR

H

Aryl NH

15

N

N

R

H

NAryl

H

H N

N

R

NAryl

H

N

N

R

HN Aryl

R=OH

OHO

Abb. 6 Postulierter Mechanismus der C8-Adduktbildung

10

Kenntnisstand

2.4 Nachweis der Carcinogenität

Der Nachweis, ob eine Substanz carcinogen oder mutagen ist, lässt sich am

zuverlässigsten in Tierversuchen an Säugetieren klären. Da diese jedoch nicht nur

sehr umstritten, sondern auch teuer sind, existieren auch mehrere alternative

Methoden, von denen zwei an dieser Stelle kurz erläutert werden sollen.

2.4.1 Ames-Test

Der gegenwärtig wichtigste Test zur Untersuchung von Mutagenität einer Verbindung

ist der nach seinem Entwickler B. N. Ames benannte Ames-Test.[33,34] Als

Testobjekte werden hier mutierte Bakterienstämme von Salmonella typhimurium

verwendet. Diese Stämme besitzen das Merkmal der Histidinauxotrophie; eine

Mutation in den Genen für die Enzyme der Histidinbiosynthese, welche dafür sorgt,

dass diese Bakterien, im Gegensatz zum Wildtyp, nicht zur Synthese des Histidin

befähigt sind und deshalb in histidinfreien Kulturen nicht wachsen können. Diese

Mutation kann allerdings durch eine weitere Mutation (z. B. durch chemische

Substanzen) rückgängig gemacht werden. Durch diese Reversion entsteht eine

Zelle, die nun wiederum eine funktionelle Basensequenz besitzt und in der Lage ist,

Histidin zu synthetisieren.

Es ist möglich, eine Selektion dieser Revertanten vorzunehmen, ihre quantitative

Häufigkeit zu bestimmen und mit der Mutagenität der chemischen Substanz in

Korrelation zu setzen. In Tabelle 1, S. 12 sind die ermittelten Werte für die in dieser

Arbeit verwendeten Arylamine dargestellt. Hierbei scheint in den verwendeten

Zellsystemen (TA 100; aus Salmonella typhimurium) ein Zusammenhang zwischen

der Mutagenität (log Rev; je größer der Wert, desto mutagener die Substanz) und der

Polarität der aromatischen Amine (log P; je größer der Wert, desto lipophiler bzw.

unpolarer die Substanz) zu bestehen.[35]

11

Kenntnisstand

Arylamin log Rev/nmol log P

Anilin 1 - 2.61 0.90 4-Methoxyanilin 6 - 1.95 0.95 4-Methylanilin 5 - 1.77 1.39

3,5-Dimethylanilin 24 - 1.31 1.91 4-Aminobiphenyl 2 0.29 2.86 2-Aminofluoren 3 0.91 3.14

Tabelle 1 Korrelation von Polarität und Mutagenität der verwendeten Arylamine[35]

Routinemäßig werden heute fünf verschiedene Bakterienstämme eingesetzt. Da

diese Stämme zum Teil verschiedene Arten von Mutationen (z. B. Leseraster- oder

Basenpaarmutationen) besitzen, kann mit ihrer Hilfe nicht nur das mutagene

Potential einer Substanz, sondern auch Anhaltspunkte für eine Klassifizierung des

Wirkmechanismus erfolgen. So gibt es erste Anzeichen für eine Basendeletion

welche durch die Modifikationen aromatischer Amine ausgelöst werden könnten. Da

die meisten genotoxischen Stoffe (wie z. B. die aromatischen Amine) allerdings nicht

direkt, sondern erst nach Aktivierung zu reaktiven Metaboliten mit der DNA

reagieren, muss diese im Säugetierorganismus stattfindende Metabolisierung im

Ames-Test simuliert werden. Hierzu kann ein aus Säugetierleber gewonnenes

Aktivierungssystem (S9-Mix) verwendet werden.[36]

2.4.2 32P-Postlabeling-Methode

Eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von DNA-Addukten ist das 32P-

Postlabeling. Bei dem von K. Randerath et al.[37] eingeführten Verfahren wird

zunächst DNA mit der zu testenden Substanz inkubiert, wobei ebenfalls ein

Aktivierungssystem hinzugegeben werden kann. Nach Aufarbeitung wird die DNA

enzymatisch zu 3’-Nucleosidmonophosphaten abgebaut. Diese werden dann durch

Reaktion mit γ-[32P]-Adenosintriphosphaten am C5’ phosphoryliert. Durch

mehrdimensionale Dünnschichtchromatographie können die Addukte von den

unveränderten 3’,5’-Nucleosiddiphosphaten abgetrennt und radiographisch

untersucht werden. Voraussetzung ist jedoch das die Addukte bekannt und

strukturell charakterisiert sind, um eine eindeutige Zuordnung vornehmen zu können.

12

Kenntnisstand

2.5 Darstellung von Arylamin-Addukten am 2’-Desoxyguanosin

2.5.1 Darstellung von C8-Arylamin-Addukten

Bei der Synthese der modifizierten C8-Addukte können grundsätzlich drei Methoden

angewendet werden.

Bei der 1989 von der Arbeitsgruppe Boche erstmals durchgeführten elektrophilen Arylaminierung werden zunächst Hydroxylamine gebildet, welche dann in das

elektrophile Nitreniumion umgewandelt werden können. Der Nachteil dieser Methode

sind jedoch die sehr geringen Ausbeuten, wie z.B. bei der Reaktion des

Arylhydroxylaminesters 25 mit 2’-Desoxyguanosin zum entsprechenden C8-Addukt

26 mit 2.5% (Abb. 7).[38]

HN

O

O

R

25

CHCl3/EtOH/H2O (3 : 7 : 4)dG, Et3N, 24 h, 37 °C

2.5%

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

NH

26 Abb. 7 Beispielreaktion zur elektrophilen Arylaminierung nach Boche et al 38]

Durch die von E. Kriek und E. Müller bereits 1967 durchgeführte Synthese eines

C8-Adduktes mittels nukleophiler Arylaminierung des geschützten Ribosederivates

27 wurde jedoch mit 23% eine bessere Ausbeute erzielt, als es über die elektrophile

Arylaminierung bisher möglich war (Abb. 8).[39]

NH

N

N

O

NH2N

O

OAcOAc

AcO

Br

NH2

NH

N

N

O

NH2N

O

OAcOAc

AcO

NH

iPrOH

20 h, 150 °C

27 3 28

23%

Abb. 8 Beispielreaktion zur nukleophilen Arylaminierung nach Kriek und Müller

13

Kenntnisstand

Diese Methode ist jedoch nur auf Ribosen anwendbar, da die harschen

Reaktionsbedingungen (150 °C) eine Depurinierung des 2’-Desoxynucleotids zur

Folge hatten.

Die Strategie der Palladium-katalysierten C-N-Bindungskupplung wurde erstmals

von T. Migita et al. im Jahre 1983 veröffentlicht.[40] Diese Reaktion wurde von S. L.

Buchwald et al. und J. F. Hartwig et al. weiterentwickelt und beide veröffentlichten

schließlich 1995 die nach ihnen benannte Buchwald-Hartwig-Kupplung (s. Abb.

9).[41,42]

BrR

NR1R2RPdCl2[P(o-Tol)3]

tBuONa, Toluol,100 °C

29 30

HNR1R2

Abb. 9 Buchwald-Hartwig-Kupplung

Die ersten Reaktionen dieser Art mit Nucleosiden wurden von M. K. Lakshman et al.

durchgeführt. Ihm gelang es u. a. die N6-Aryl-Addukte des 2’-Desoxyadenosin zu

synthetisieren.[43]

Eine Anwendung der Buchwald-Hartwig-Kupplung zur Darstellung C8-Arylamin

modifizierter 2’-Desoxyguanosin-Derivate und deren anschließende Überführung in

die entsprechenden Phosphoramidite gelang S. Gräsl in ihrer Dissertation im

Arbeitskreis von C. Meier.[44] Ihr gelang es unter Verwendung von Silylethern als

Schutzgruppe der beiden Hydroxyfunktionen, sowie der Verwendung der Isobutyryl-

Schutzgruppe, einer Standardschutzgruppe für die Oligonucleotidsynthese für die

exocyclische Aminofunktion, mehrere dG-C8-Addukte (mit Ausbeuten von 65-75%)

darzustellen und diese dann in die entsprechenden Phosphoramidite zu überführen.

Bei der angewandten Buchwald-Hartwig-Kupplung war eine Schützung der O6–

Funktion der Base elementar für eine erfolgreiche Einführung der Arylamin-

Modifikation. Als Schutzgruppe etablierte S. Gräsl die Benzylschutzgruppe, da sie

nach der Kupplungsreaktion unter milden Bedingungen wieder abgespalten werden

konnte (s. Abb. 10, S. 15).

14

Kenntnisstand

N

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br O

K3PO4, rac-BINAP, Pd2(dba)3,1,2-Dimethoxyethan

50 h, 80 °C

N

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

NH

O

NH2

31

5

32 75%

Abb. 10 Synthese des dG-C8-Adduktes des 4-Toluidin 5

Nachteil der verwendeten iso-Butyryl-Schutzgruppe ist jedoch die langwierige,

vollständige Abspaltung, die in konzentrierter Ammoniaklösung bei 55 °C erst nach

mindestens 8 Stunden zu beobachten war. Des Weiteren war die Synthesesequenz

nicht universell anwendbar, so scheiterte z.B. die Überführung des C8-2-

Aminofluorenyl-modifizierten 2’-Desoxyguanosin-Derivates in das entsprechende

Phosphoramidit. Dennoch konnte S. Gräsl den Einbau der modifizierten

Phosphoramidite in Oligonucleotide in ihrer Dissertation zeigen.

Während der Durchführung der vorliegenden Arbeit veröffentlichten Rizzo et al. eine

Modifizierung der Syntheseroute zur Herstellung der C8-Addukte von

heteroaromatischen Aminen, wie 2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinolin (IQ) 33.[45]

Hierbei gelang es ihnen nach kompletter Entschützung des Adduktes mit Formamidin

als Schutzgruppe für die exocyclische Aminofunktion eine sehr labile Gruppe

einzuführen (s. Abb. 11).

N

N

N

OBn

NH2N

O

O

O

Br

Si

SiO

34

N

N

N

OBn

NN

O

O

DMTrO

HN

35

NN

N

PO N(iPr)2NC

1.) Pd2(dba)3, BINAP2.) H2, Pd/C3.) TBAF4.) Me2NCH(OMe)2

5.) DMTr-Cl6.) NC(CH2)2OP[N(iPr)2]2

NMe2

N NN NH2

33

Abb. 11 Synthesesequenz zur Herstellung des C8-modifizierten

Phosphoramidits 35 des IQ 33 nach Rizzo[45]

15

Kenntnisstand

Probleme traten jedoch im Weiteren auf, da die entsprechenden Phosphoramidite,

welche als Grundbaustein zur Oligonucleotidsynthese dienen, in den standardmäßig

verwendeten Lösungsmitteln nicht löslich waren und deshalb eine präparativ

schwierige Oligonucleotidsynthese zur Folge hatten. Ebenfalls konnte nicht gezeigt

werden, ob diese Syntheseroute auch auf einfache aromatische Amine anwendbar

ist.

Einen anderen Weg zur Darstellung C8-Arylamin-modifizierter 2’-Desoxyguanosin-

Derivate mittels der Buchwald-Hartwig-Kupplung beschritt Takamura-Enya. Nach der

Überführung von geschütztem 2’-Desoxyguanosin 36 in das entsprechende C8-

Amino-Derivat 37 folgte eine Buchwald-Hartwig-Reaktion mit polycyclischen

Arylbromiden (s. Abb. 12).[46,47]

N

N

N

OBn

NH

N

O

OAc

AcODMTr

BrN

N

N

OBn

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSODMTr

H2N

1) TMSN3, TBAF, CH3CN2) NaBH4, MeOH/THF

3) NaOMe4) TBDMSCl, Imidazol, DMF

N

N

N

OBn

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSODMTr

HN

36 37

39

Pd2(dba)3,XANTPHOS,KO-t-Bu

Br

38

Ausbeute: 75%

Abb.12 Synthesesequenz nach Takamura-Enya[46,47]

Zwar gelang bei diesem Syntheseweg auch die Kupplung mit polycyclischen

Arylaminen, jedoch konnte keine Verkürzung der Syntheseschritte oder eine

deutliche Steigerung der Syntheseausbeuten erreicht werden.

16

Kenntnisstand

2.5.2 Darstellung von N2-Arylamin-Addukten

F. De Riccardis, R. R. Bonala und F. Johnson widmeten sich der Synthese von N2-

Alkyl-substituierten-2’-dG-Derivaten. Der Schlüssel für diese erfolgreiche Synthese

war auch hier die Palladium-katalysierte Buchwald-Hartwig-Kupplung zwischen

einem TBDMS-geschützten 2´-dG 40 und einem o-Nitroaryltriflat oder –bromid 41 in

Anwesenheit von racemischem BINAP und einer stöchiometrischen Menge einer

milden Base, z.B. Cäsiumcarbonat (s. Abb. 13).[48]

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

+R

O2N

R= OTf, Br

N

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

O2N

N

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

H2NN

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

HNAc

40

41

42

43 44

Abb. 13 Synthese der N2-Aryl-2´-dG-Derivate[48]

Bei der Umsetzung mit dem geschützten 2´-dG-Derivat 40 konnte unabhängig von

den verwendeten aromatischen Donoren stets eine Ausbeute von > 86% beobachtet

werden. Die Produkte 42 konnten jeweils durch Flash-Chromatographie leicht

gereinigt werden. Eine anschließende Reduktion der Nitro-Funktion lieferte die

N2-Alkyl-substituierten-2’-dG-Addukte 43, welche auch in die entsprechenden

N-acetylierten Formen 44 überführt werden konnten. Die anschließende Entfernung

der TBDMS-Schutzgruppen erfolgte mit TBAF in THF, jedoch wurde von keiner

17

Kenntnisstand

Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite und deren Einbau in

Oligonucleotide berichtet.

Neuere Versuche von G. Boche et al. zeigten die Darstellung von N-2´-dG-4-

aminobiphenyl-3´-phosphaten, welche synthetisiert und vollständig durch 1H-NMR

und Massenspektrometrie charakterisiert wurden, um als Standard für die 32P-Postlabeling-Methode zu dienen. Allerdings erfolgte auch hier keine Synthese

der entsprechenden Phosphoramidite (s. Abb. 14).[49]

NH

N

N

O

NH2N

O

O

TBDMSO

PO OO

45

1. DEAD, PPh3, Allylalkohol, THF, Rt, 1 h2. tBuONO, Rt, 5 min3. Tf2O, Et3N, DMAP, Rt, 0.5 h

N

N

N

O

ON

O

O

TBDMSO

PO OO

46

SCF3

O

O

1. DMF, Rt, 3 h2. (Et2NH2)2CO3, Pd(PPh3)4, CHCl3, Rt, 0.5 h3. TBAF, THF, Rt, 1 h4. Pd/C, H2, MeOH, Rt, 1 h

NH

N

N

O

NH

N

O

O

HO

PO OO 48

HN

10%

9%

HN NH2

47

Abb. 14 Synthese von N-2´-dG-4-aminobiphenyl-3´-phosphat 47 nach der Vorschrift von G. Boche [49]

Ausgehend von einem bereits 5´-TBDMS-geschützten 2´-dG-phosphat 45 erfolgte

zuerst mit Hilfe einer Mitsunobu-artigen Reaktion die Allylschützung in O6-Position

und die anschließende Umsetzung zum Triflat-Derivat 46. An dieser Stelle erfolgte

die Umsetzung mit 4-Hydrazinobiphenyl.

Nach Entschützung der Phosphatgruppe, Entfernung der TBDMS-Gruppen mit Hilfe

von TBAF und der Entschützung der O6-Position mittels Hydrogenolyse konnte das

N-2´-dG-4-aminobiphenyl-3´-phosphat 48 erhalten werden. Auch hier wurde

wiederum nicht über die Überführung in die entsprechenden Phosphoramidite

18

Kenntnisstand

berichtet, so dass bislang keine Methode zur Darstellung von N2-Addukten und deren

Phosphoramidite bekannt ist.

2.5.3 Darstellung von O6-Arylamin-Addukten

Im Jahr 1978 gelangen F. F. Kadlubar, J. A. Miller und E. C. Miller neben dem

Nachweis auch erste Erfolge in der Synthese von O6-Arylamin-Addukten.[22]

Damals fanden sie heraus, dass N-Hydroxy-1-naphthylamin 49 mit Nucleinsäuren bei

einem pH-Wert von 5 unter Bildung von kovalent gebundenen Derivaten reagierte.

Es konnten dabei jedoch keine Aussagen über die Art der Bindung noch die

Ausbeute gemacht werden. Erst die nach Zugabe des Hydroxylamin 49

durchgeführte enzymatische Hydrolyse der DNA führte unter sauren Bedingungen zu

zwei O6-Arylamin-Addukten (neben den bereist zuvor identifizierten C8 und N2-

Addukten), dem N-dG-O6-1-naphthylamin 50 als Hauptprodukt (s. Abb. 15) und dem

2-dG-O6-1-naphthylamin 51. Beide Produkte konnten mittels HPLC getrennt und

mittels NMR-Spektroskopie eindeutig charakterisiert werden.[22]

HNOH

1) DNA

pH 5, 37 °C, 6 h

2) DNase, Phosphatase, Phosphodiesterase

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

NH

49 50

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

51

NH2

Abb. 15 Reaktion von N-Hydroxyl-1-naphtylamin mit DNA[22]

In Anbetracht der Selektivität des Hydroxylamins gegenüber Makromolekülen und

der Tatsache, dass die Geschwindigkeit dieser Reaktion von der Konzentration der

DNA und des N-Hydoxylarylamins abhängig ist, konnte ein Reaktionsmechanismus

postuliert werden, welcher die Bildung eines 1-Naphthyl-Nitrenium-Ions als

Schlüsselschritt der Reaktion beinhaltet und welcher durch Solvolyse-Reaktionen mit

H218O bestätigt werden konnte. Diese Erkenntnisse wurden in der Folgezeit

19

Kenntnisstand

allerdings nicht weiter verfolgt, um zu einer geeigneten Syntheseroute zur

Darstellung O6-Arylamin-modifizierten 2’dG-Phosphoramiditen zu gelangen.

2.5.4 Darstellung von C8-N-Acetyl-Arylamin-Addukten

Neben den Arylaminen haben auch die entsprechenden N-Acetyl-Derivate eine

große Bedeutung für die chemische Carcinogenese. Die ersten erfolgreichen

Synthesen dieser Addukte wurden von Zhou und Romano beschrieben. Mittels

elektrophiler Arylaminierung konnten sie das C8-Addukt des N-Acetyl-2-

aminofluorens darstellen. Problematisch war jedoch die geringe Ausbeute der

Kupplung (ca. 2.5 %). [50,51] Die bislang einzige effektive Synthese solcher Addukte

wurde 2002 von Schärer beschrieben (s. Abb. 16).[52,53]

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

N

N

N

OBn

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSODMTr

Br4 Stufen

N

N

N

OBn

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSODMTr

HNArylKreuz-

kupplungNH

N

N

O

NHiPr-PAcN

O

O

DMTrO

NAryl

O

PO N

NC

7 Stufen

52 53

54 55Gesamtausbeute: 6%

Abb. 16 Darstellung C8-N-Acetyl-Arylamin-modifizierter 2’-dG-Phosphoramidite nach Schärer[52,53]

Ausgehend vom 2’-Desoxyguanosin 52 wurde zunächst in vier Stufen ein

geschützter, bromierter Baustein 53 synthetisiert, welcher anschließend mit dem

Arylamin mittels der schon beschriebenen Buchwald-Hartwig-Reaktion zum

20

Kenntnisstand

entsprechenden Addukt 54 gekuppelt werden konnte. Nach anschließender

Acetylierung und Abspaltung der Schutzgruppen (O6-Benzyl, NH2-DMTr und OH-

TBDMS) konnte das geschützte Phosphoramidit 55 über insgesamt 12 Stufen mit

einer Gesamtausbeute von 6% hergestellt werden.

Die Synthese solcher N-acetylierten C8-Addukte ohne die Verwendung einer

Kreuzkupplungsreaktion und der damit verbundenen aufwändigen

Schutzgruppenstrategie bzw. die direkte Kupplung von Acetaniliden sind bislang

nicht bekannt.

2.6 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide und deren Eigenschaften

Die ersten synthetisierten C8-modifizierten Oligonucleotidbausteine und deren

Einbau wurden von Zhou und Romano beschrieben. Ihnen gelang es, mittels

elektrophiler Arylaminierung die Phosphoramidite der dG-C8-Addukte des

2-Aminofluorens 3 und des N-Acetyl-2-aminofluorens darzustellen und

einzubauen.[50,51] Probleme waren neben der geringen Ausbeute der Kupplung, die

Verwendung der Fmoc-Funktion (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) als Schutzgruppe für

die exocyclische Aminofunktion, da die entsprechenden unmodifizierten

Phosphoramidite nicht kommerziell erhältlich sind.

Nach der erfolgreichen Synthese C8-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite konnte

S. Gräsl in ihren Arbeiten auch deren Einbau in verschiedene Oligonucleotide

zeigen. Ihr gelang es, neben drei Grenzcarcinogen-C8-modifizierten 2’-dG-

Phosphoramiditen, auch das C8-Biphenyl-modifizierte 2’-dG-Phosphoramidit

einzubauen. Nach anschließender Reinigung mittels HPLC konnte sie erste

Untersuchungen hinsichtlich der Eigenschaften solcher modifizierten Oligonucleotide

durchführen. Es konnte beobachtet werden, dass die Modifikation eine Verringerung

des Schmelzpunktes (Tm-Wert) zur Folge hatte, jedoch keinerlei Einfluss auf die

Konformation des Doppelstranges zu haben schien. Auch in ersten biologischen

Untersuchen, Primer-Verlängerungs-Untersuchungen, konnte kein Unterschied in

den Eigenschaften zwischen den Grenzcarcinogen- und dem Biphenyl-modifizierten

Oligonucleotiden festgestellt werden.[44]

Während der Durchführung dieser Arbeit gelang Rizzo der Einbau des C8-IQ-

modifizierten 2’-dG-Phosphoramidits. Er untersuchte die Eigenschaften eines

21

Kenntnisstand

solchen modifizierten Oligonucleotids im Vergleich zu einem 2’-dG-C8-N-Acetyl-2-

aminofluorenyl-modifizierten Oligonucleotids (Sequenz: 5'-d(CTCGGCGCCATC) 56)

und konnte zeigen, dass der Einfluss auf den Tm-Wert im Fall des 2’-dG-C8-IQ-

modifizierten Doppelstranges geringer ist. Jedoch konnte er keine konformativen

Unterschiede beider modifizierter Oligonucleotide feststellen.[45] In Folgearbeiten

berichtet Rizzo von dem Einbau eines N2-IQ-2’-dG-modifizierten Phosphoramidites

des Typs 22 (s. Abb. 6, S. 9). Vergleichende Polymerase-Experimente zu dem 2’-dG-

C8-IQ-modifizierten Oligonucleotiden wurden beschrieben und legten nahe, dass der

Effekt bei der Replikation IQ-modifizierter Oligonucleotide (abhängig von der

Sequenz) sowie von der Art (C8 oder N2) der Modifikation sei.[54,55] Hierbei scheinen

die C8-Addukte zu einer Basendeletion zu führen, während die N2-Addukte zu einem

Abbruch der Replikation führen. Ähnliche Untersuchungen, allerdings nur mit 2’-dG-

C8-N-Acetyl-2-aminofluorenyl-modifizierten Oligonucleotiden, wurden 2005 von

Romano durchgeführt.[56] Auch hier war eine Zwei-Basen-Deletion zu beobachten.

Da weitere Untersuchungen, insbesondere im Hinblick auf die Ursachen der

unterschiedlichen Carcinogenität mono- und polycyclischer aromatischen Amine

nicht bekannt sind, ist es das Bestreben dieser Arbeit, zu weiteren Erkenntnissen auf

diesem Gebiet zu gelangen.

2.7 Reparatur und Struktur C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide

Die bisherigen Untersuchungen zur Reparatur der DNA-Schäden, welche durch

aromatische Amine verursacht werden, legen nahe, dass die Struktur eine

entscheidende Rolle spielt. So scheinen Addukte aromatischer Amine schlechte

Substrate für die NER (nucleotide excision repair) zu sein, die eine Struktur

aufweisen, in der der aromatische Ring in der major oder minor groove liegt (z.B. bei

2-Aminofluoren 6). Andererseits sind Addukte, bei denen das aromatische System

innerhalb der DNA liegt, gute Substrate.[57] Detaillierte Versuche zur Reparatur von

Benzo[α]pyren- und Benzo[α]phenanthren-Addukten ließen erkennen, dass bei der

Reparatur verschiedene Parameter wie z.B. die Störung der Basenpaarung, die

Entwindung, die Krümmung und die Flexibilität der DNA eine Rolle zu spielen

scheinen.[58-60] Experimentelle Untersuchungen zur Reparatur von Addukten, welche

durch aromatische Amine gebildet werden, sind bislang nur für polycyclische

22

Kenntnisstand

Arylamine wie 4-Aminobiphenyl 5 und 2-Aminofluoren 6, sowie deren N-acetylierte

Formen bekannt. Diese legen nahe, dass eine mögliche syn-Konformation der

modifizierten Guanin-Base (Drehung der glycosidischen Bindung um 180°) die

Fähigkeit der DNA-Polymerase über das Addukt hinweg zu transkribieren verringern

oder gar ganz verhindern könnte. Weiterhin sei die Art (die Struktur) des

aromatischen Systems verantwortlich für die Stabilität der Addukte gegenüber

Reparaturmechanismen. So scheint eine planare aromatische Struktur (wie beim 2-

Aminofluoren 6) persistenter in den untersuchten Zelllinien zu sein.[61-63]

Um genauere Aussagen über den räumlichen Einfluss der Modifikation machen zu

können wurden bislang jedoch nur wenige Strukturuntersuchungen vorgenommen.

1998 veröffentlichten Broyde et al. computergestützte Rechnungen (minimized

potential energy calculations), in denen sie zeigen konnten, dass für ein C8-Anilin

modifiziertes Oligonucleotid die B-Konformation mit dem Amin in der major groove

begünstigt zu sein scheint. Im Gegensatz dazu seien beim C8-2-Aminofluoren

modifizierten Oligonucleotid auch anderen Konformationen (z.B. die syn-

Konformation) möglich.[64]

Ein Beweis für die Existenz einer solchen syn-Konformation bei C8-2-Aminofluoren-

modifizierten Oligonucleotiden lieferte Beland et al. Sie konnten mittels NMR-

Spektroskopie zwei Konformationen nachweisen. Zum Einen eine Konformation, in

der der 2-Aminofluorenyl-Rest in der major groove (anti-Konformation des

Nucleosids) und zum Anderen in den DNA-Dublex interkalierend.[65] Im Falle des

4-Aminobiphenyl konnten sie zeigen, dass eine solche zweite Konformation immerhin

zu 5-10% vorhanden ist.[66]

Weitere Strukturaufklärungen, auch mit monocyclischen Arylamin-Addukten, sowie

kristallographische Untersuchungen sind bislang nicht bekannt. Da hierüber jedoch

möglicherweise eine Differenzierung von poly- und monocyclischen Arylaminen im

Hinblick auf ihren Einfluss auf die Struktur von Oligonucleotid-Duplexen erfolgen

könnte, ist dieses ein Fernziel, für welches im Rahmen dieser Arbeit erste

Grundlagen geschaffen werden sollen.

23

Aufgabenstellung

3. Aufgabenstellung

Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Unterschied in der Mutagenität/Carcinogenität

von mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen untersucht werden.

Die Bearbeitung dieses Gebietes gestaltete sich dabei in drei Themenkomplexen:

Zum Einen sollte zunächst die von S. Gräsl entwickelte Syntheseroute für die C8-

Arylamin-modifizierten-2’-dG Phosphoramidite optimiert werden. Hauptaugenmerk

lag dabei auf der Einführung einer labilen Schutzgruppe für die exocyclische

Aminofunktion, um eine Abspaltung nach der Oligonucleotidsynthese unter

basischen Bedingungen zu verkürzen und damit die Ausbeute an modifiziertem

Oligonucleotid zu steigern. Außerdem sollte die Syntheseroute eine

Allgemeingültigkeit besitzen und auch auf aromatische Amine wie 2-Aminofluoren 3

anwendbar sein. Dies war bislang nicht möglich.

Ein zweites Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von geeigneten Syntheserouten

zur Darstellung weiterer in vivo gefundener Adduktformen am 2’-Desoxyguanosin.

Dabei sollte neben der Synthese der O6-Addukte des Typs 21 (s. S. 9) vor allem die

Synthese der beiden bislang noch nicht chemisch dargestellten N2-Addukte 19 und

20 (s. S. 9) im Vordergrund stehen. Nach erfolgreicher Darstellung der Addukte

sollten diese mit einer geeigneten Schutzgruppenstrategie in die entsprechenden

modifizierten Phosphoramidite überführt werden und neben den C8-Arylamin-

modifizierten-2’-dG Phosphoramiditen als Bausteine für die Oligonucleotidsynthese

zur Verfügung stehen.

Die Phosphoramidite sollten dann in Oligonucleotide gezielt eingebaut werden.

Hierbei sollten drei verschiedene Sequenzen einen Einblick in die Eigenschaften

solcher modifizierten Oligonucleotide geben (s. Abb. 17).

5'-d(CTCGGCGCCATC) 5'-d(GTAGAATTCTAC)

5'-d(AAATGAACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

56 57

58 Abb. 17 Im Rahmen dieser Arbeit synthetisierte Oligonucleotid-Sequenzen

Für alle Sequenzen sollten Untersuchungen hinsichtlich der thermischen Stabilität

(Tm-Wert) und der Konformation des Doppelstranges (Circular Dichroismus) 24

Aufgabenstellung

vorgenommen werden. Außerdem sollte für die selbstkomplementäre Sequenz 57

ein Restriktionsverdau mittels EcoRI etabliert werden und den Einfluss der

Modifikation auf die Halbwertszeit untersucht werden.

Um eine mögliche Erklärung der unterschiedlichen Mutagenität/Cancerogenität von

mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen geben zu können sollten weitere

biochemische Untersuchungen mit der Sequenz 58 durchgeführt werden. So sollte

der Einfluss der verschiedenen Arylamin-Modifikationen bei der Replikation mittels

Primer-Verlängerungs-Experimenten in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von

Prof. A. Marx, Universität Konstanz untersucht werden. Abschließend sollten, um

Aussagen über den Einfluss der Modifikation auf die Struktur des DNA-

Doppelstranges machen zu können, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof.

C. Betzel, Universität Hamburg und dem in Hamburg ansässigen DESY erste

Versuche zur Kristallisation solcher modifizierten Oligonucleotide durchgeführt

werden.

25

Resultate und Diskussion

26

4. Resultate und Diskussion 4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine

Die Darstellung der C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotidbausteine sollte

ausgehend vom 2’-Desoxyguanosin 52 erfolgen.

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HNAryl NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HNAryl

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HNAryl

N(Me)2

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HNAryl

N(Me)2

PO N(iPr)2

NC

52

59 60

6162

63

Abb. 18 Retrosynthese der Darstellung C8-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite 59


27

Der entscheidende Schritt bei der gewählten Syntheseroute ist dabei die Einführung

der Modifikation in die C8-Position des Guanosins 63 (s. Abb. 18, S. 26).

Diese C-N-Bindungsknüpfung sollte mittels einer Buchwald-Hartwig-Kupplung

erfolgen. Die für diese Kupplung notwendigen Schutzgruppen sollten dafür zunächst

eingeführt werden. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass eine

Schützung der exocyclischen Aminofunktion bei der Kreuzkupplung nicht notwendig

ist.[67] Nach der C8-Modifizierung sollten dann die Schutzgruppen abgespalten, die

Einführung der basenlabilen NH2-Schutzgruppe (Formamidin), sowie die für die

Oligonucleotid-Festphasensynthese notwendige 5‘-OH-Schutzgruppe (DMTr),

erfolgen und abschließend die Phosphoramiditfunktion 59 generiert werden.

Zur Anwendung der Buchwald-Hartwig-Reaktion war die Synthese eines allgemeinen

Bausteins 63 notwendig. Hierbei war besonders wichtig, dass die verwendeten

Schutzgruppen nicht nur den Bedingungen der Kupplungsreaktion standhalten

(80 °C und schwach basische Reaktionsbedingungen), sondern auch unter möglichst

milden Bedingungen nach der Kupplung abzuspalten waren. Aufgrund dieser

Voraussetzungen und bereits von S. Gräsl in vergangenen Arbeiten durchgeführten

Synthesen kamen für die beiden Hydroxylgruppen eine Schützung mit tert-

Butyldimethylsilylchlorid als entsprechende Silylether in Frage.[44]

Für die zwingend notwendige Schützung des Amids des Guanosins als Azaenolether

sollte die Benzylgruppe dienen, da diese sich mittels Hydrogenolyse mild abspalten

lässt.

Zunächst musste 2’-Desoxyguanosin 52 an der C8-Position bromiert werden. Die

Reaktion wurde nach P. M. Gannet und T. P. Sura durchgeführt (s. Abb. 19).[68]

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

Br

52 64

NBS, H2O

Rt, 15 min.

79%

Abb. 19 Synthese von 8-Brom-2’-desoxyguanosin (8-Br-dG) 64


28

Hierbei wurden feingepulvertes 2’-Desoxyguanosin 52 und N-Bromsuccinimid

vorgelegt, mit Wasser versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das

Produkt konnte nach anschließender Filtration ohne Reinigung in einer Ausbeute von

79% isoliert werden. Allerdings war diese Reaktion nicht auf Mengen über 500 mg

2’-Desoxyguanosin 52 übertragbar, da es dabei zu einer Spaltung der glycosidischen

Bindung kam. Größere Mengen 8-Br-dG 64 waren nur durch Parallelansätze

zugänglich, die dann vereinigt werden konnten.

Der nächste Syntheseschritt bestand darin, die tert-Butyldimethylsilylgruppen an der

3‘- und 5‘-Hydroxylfunktion einzuführen (s. Abb. 20).

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

Br

64

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br

65

TBDMSCl,Imidazol,Pyridin

Rt, 1 h

74% Abb. 20 Synthese von 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 65

Die Synthese wurde analog zu P. B. Hopkins et al. durchgeführt.[69] Zunächst wurden

Imidazol und tert-Butyldimethylsilylchlorid in Pyridin gelöst vorgelegt und

anschließend mit 8-Br-dG 64 versetzt. Nach Aufarbeitung und Reinigung wurde das

Produkt in 74% Ausbeute erhalten.

Anschließend erfolgte die Überführung der Amidfunktion in einen Azaenolether

ebenfalls analog zu Hopkins et al., wobei die Benzylgruppe mittels einer Mitsunobu-

artigen Reaktion mit Benzylalkohol eingeführt werden konnte (s. Abb. 21).[70]

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br

65

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br

63

Benzylalkohol,PPh3, DIAD,1,4-Dioxan

0 °C -> Rt, 1 h

57% Abb. 21 Synthese von O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63


29

Bei der Reaktion wurden 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin

65 und Triphenylphosphin in 1,4-Dioxan mit Benzylalkohol und

Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur und

abschließender Aufarbeitung konnte das Produkt und damit der Ausgangsstoff für die

Buchwald-Hartwig-Kupplung mit einer Ausbeute von 57% isoliert werden.

Mit dieser Ausgangsverbindung 63 konnte nun die Buchwald-Hartwig-Reaktion

durchgeführt werden (s. Abb. 22).

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br

63

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

66-72

Aryl

Pd2(dba)3, rac-BINAP,K3PO4, Aryl-NH2,1,2-DME

80 °C, 55-84 h

55-91% Abb. 22 Einführung der C8-Arylamin-Modifikationen zu den Produkten 66-72

Der Palladium-Katalysator, rac-BINAP und Kaliumphosphat wurden unter Stickstoff

eingewogen und anschließend mit O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-

2’-desoxyguanosin 63, absolutem 1,2-Dimethoxyethan (1,2-DME) und dem

entsprechenden Arylamin versetzt. Die Reaktionsmischungen wurden für 55-84 h bei

80 °C gerührt. Die Produkte 66-72 konnten nach Aufarbeitung und

säulenchromatographischer Reinigung in einer Ausbeute von 55-91% isoliert werden

(s. Tab. 2).

Produkt Aryl Reaktionszeit Ausbeute

66 Phenyl 70 h 64%

67 4-Methoxyphenyl 70 h 62%

68 4-Methylphenyl 70 h 75%

69 4-Cyanophenyl 84 h 55%

70 3,5-Dimethylphenyl 72 h 66%

71 4-Biphenyl 55 h 65%

72 2-Fluorenyl 78 h 91% Tab. 2 Zusammenfassung aller Adduktsynthesen zu den Produkten 66-72


30

Eine Ausbeutesteigerung durch eine Vorreaktion des Katalysators mit dem Liganden

konnte nicht beobachtet werden.

Der Mechanismus dieser Kupplungsreaktion ist noch nicht vollständig geklärt, wurde

aber von S. L. Buchwald et al. postuliert und konnte auf die hier durchgeführte

Arylaminierung der C8-Position übertragen werden (s. Abb. 23).[71]

Pd2(dba)3 + BINAP

(BINAP)Pd(dba)

(BINAP)Pd(0)

NN

NOBn

NH2O

OTBDMS

NTBDMSOBr

NN

NOBn

NH2

O

OTBDMS

N

TBDMSO

PdPP

Br(+II)

NN

NOBn

NH2

O

OTBDMS

N

TBDMSO

PdBr

NH2

Ar

P

P

+-

NN

NOBn

NH2

O

OTBDMS

N

TBDMSO

PdPP

NH(+II)

Ar

Ar-NH2

K3PO4

K2HPO4 + KBr

NN

NOBn

NH2O

OTBDMS

NTBDMSOHN

Ar

I

II

III

IV

V

Abb. 23 Postulierter Mechanismus der Buchwald-Hartwig-Reaktion

Die Pd-katalysierte Arylaminierung verläuft wahrscheinlich über die oxidative Addition

des Arylbromids I an die Pd0-Spezies (BINAP)Pd0, welches sich aus Pd2(dba)3 (Tris-

Dibenzylidenacetondipalladium) und rac-BINAP bildet. Das entstehende Pd2+-

Intermediat II bildet durch die Koordination des verwendeten Arylamin die trigonal-

bipyramidale Verbindung III. Durch Deprotonierung mit der zugesetzten Base


31

entsteht die Verbindung IV, die durch reduktive Eliminierung neben dem

gewünschten Arylaminaddukt V den Pd0-Katalysator zurückbildet.

Um nun, ausgehend von den vollgeschützten Addukten 66-72, die Synthese der

Oligonucleotidbausteine vorzunehmen, mussten zunächst die Benzylgruppe sowie

die Hydroxylschutzgruppen abgespalten, die exocyclische Aminofunktion mit einer

basenlabilen Schutzgruppe, sowie die 5’-O-Position mit der Dimethoxytritylfunktion

(DMTr) geschützt und abschließend die Reaktion zu den entsprechenden

Phosphoramiditen durchgeführt werden.

Die zunächst durchgeführte Debenzylierung wurde durch Lösen des entsprechenden

C8-Adduktes in Methanol und Zugabe von Palladium auf Aktivkohle bei

anschließendem Rühren unter einer Wasserstoff-Atmosphäre erreicht (s. Abb. 24).

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

66-72

Aryl NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

73-79

ArylPd/C, H2, MeOH

Rt, 4-48 h

78-96% Abb. 24 Debenzylierung der C8-Arylamin-Addukte 66-72

Die entsprechenden Produkte 73-79 konnten dabei nach Reaktionszeiten von 4-48 h

in zufriedenstellenden Ausbeuten von 78-96% durch mehrmaliges Zentrifugieren und

Waschen des Katalysators mit Methanol ohne weitere Aufarbeitung in reiner Form

erhalten werden (s. Tab. 3).


73 Phenyl 24 h 90%






79 2-Fluorenyl 48 h 84% Tab. 3 Zusammenfassung aller durchgeführten Debenzylierungen


32

Der nächste Syntheseschritt bestand in der Deblockierung der beiden

Hydroxylgruppen. Hierbei konnte ich in vorangegangenen Arbeiten während meiner

Diplomarbeit zeigen, dass die Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid zu einer

Dearylierung führt. Eine milde Abspaltung konnte jedoch durch die Verwendung von

Triethylamin-Trihydrofluorid in Gegenwart von Triethylamin erreicht werden (s. Abb.

25).[67]

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

73-79

Aryl NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

80-86

ArylEt3N*3HF,Et3N, DCM,THF

Rt, 2-12 h

61-96% Abb. 25 Desilylierung der C8-Addukte 73-79

Hierzu wurden die entsprechenden Addukte 73-79 in THF/DCM (1:1 v/v) gelöst, bei

Raumtemperatur mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5 Äquivalenten

Triethylamin-Trihydrofluorid versetzt und für 2-12 Stunden gerührt. Die

entsprechenden Produkte 80-86 konnten nach chromatographischer Reinigung (zur

Abtrennung gebildeter Triethylammonium-Salze waren bis zu 3 Trennungen

erforderlich) mit Ausbeuten von 61-96% erhalten werden (s. Tab. 4).


80 Phenyl 3 h 78%






86 2-Fluorenyl 5 h 61% Tab. 4 Zusammenfassung aller durchgeführten Desilylierungen zu den entschützten Addukten 80-86


33

Die geringere Ausbeute bei der Darstellung der komplett entschützten Addukte 80,

84 und 86 ist möglicherweise auf die niedrige Stabilität dieser Verbindungen

gegenüber den anderen Addukten zurückzuführen. So konnte eine deutliche

Verfärbung der erhaltenen Feststoffe innerhalb von wenigen Minuten an der Luft

beobachtet werden. Die mehrmalige säulenchromatographische Reinigung kann

somit mögliche Ausbeuteverluste erklären. Eine direkte Umsetzung (ohne

säulenchromatographische Abtrennung der Salze) der entschützten Addukte 80-86,

in der folgenden Schützung der exocyclischen Aminofunktion mit Formamidin, könnte

diese Verluste verhindern. Für die Schützung der NH2-Gruppe wurden in

vorangegangenen Arbeiten Versuche unternommen die Phenoxyacetyl-Funktion

einzuführen.[67] Da diese Versuche nicht erfolgreich verliefen, wurde auf die bereits

von Rizzo verwendete Formamidin-Gruppe zurückgegriffen.[45] Diese ist unter

basischen Bedingungen (konz. Ammoniak) innerhalb von 2 h bei 45 °C abspaltbar

und sollte eine schnellere Entschützung nach der Oligonucleotid-Synthese und damit

eine Steigerung der Ausbeute der modifizierten Oligonucleotide im Vergleich zu der

bislang verwendeten isoButyryl-Strategie ermöglichen.

Die selektive Schützung der exocyclischen Aminofunktion der entschützten Addukte

80-86 konnte durch die Reaktion mit Dimethylformamiddiethylacetal in Pyridin bei

Raumtemperatur innerhalb von 24-72 h erreicht werden (s. Abb. 26).

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

80-86

Aryl NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

87-93

ArylDimethylformamid-diethylacetal,Pyridin

Rt, 24-72 h

47-94%

N(Me)2

Abb. 26 Formamidin-Schützung der C8-Addukte 80-86

Die entsprechenden geschützten Addukte 87-93 konnten dabei in Ausbeuten von 47-

94% isoliert werden (s. Tab. 5, S. 34).


34


87 Phenyl 24 h 67%






93 2-Fluorenyl 24 h 60% Tab. 5 Zusammenfassung aller durchgeführten Formamidin-Schützungen

Auch hier ist die vermeintliche Instabilität der Edukte eine Erklärung für die teilweise

nicht zufriedenstellenden Ausbeuten. Eine alternative, schnellere Umsetzung der

Addukte zu den geschützten Produkten 87-93 in Methanol unter Refluxbedingungen

für eine Stunde führte nicht zum Erfolg, vielmehr war eine Zersetzung der Edukte 80-

86 zu beobachten.

Um erste Informationen über den Einfluss der Modifikation auf die Struktur zu

erhalten, konnte mit den stabilen Produkten 87-93 eine Konformationsanalyse mittels

NOESY-Spektroskopie durchgeführt werden. Mit Hilfe der beobachteten NOE-Effekte

ist es möglich die Stellung der modifizierten Guanosin-Basen zu bestimmen. Sollte

die anti-Stellung auch bei den Addukten vorliegen, so würde man einen NOE-Effekt

zwischen der 5‘-Hydroxygruppe und dem NH-Proton des jeweiligen Arylamin

erwarten. Dieses lässt sich anhand der aufgenommenen Spektren bestätigen. In

Abbildung 27, S. 35 sind exemplarisch die relevanten Kopplungen der NOESY-

Spektren des Anilin-modifizierten Adduktes 87 und des 4-Aminobiphenyl-

modifizierten Adduktes 92 dargestellt. Diese bestätigen das Vorliegen einer anti-

Stellung. Bei einer durch die Modifikation verursachte syn-Stellung würde ein solcher

NOE-Effekt zwischen dem NH-Proton und der 5‘-OH-Gruppe nicht zu beobachten

sein, vielmehr müsste eine Kopplung des α-Protons der Formamidin-Schutzgruppe

zu eben dieser 5‘-OH-Gruppe gemessen werden können, was jedoch in keinem Fall

zu beobachten war.


35

ppm (t2)8.508.608.708.808.90

5.850

5.900

5.950

6.000

6.050

ppm (t1

ppm (t2)8.5008.5508.6008.6508.7008.750

5.800

5.850

5.900

5.950

ppm (t1

5'-OH 5'-OH

NH-Anilin H-α NH-4-Amino- biphenyl

H-α

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

87

N(Me)2

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

92

N(Me)2

α α

Abb. 26 relevante Kopplungen der NOESY-Spektren des Anilin-modifizierten Addukt 87 und des 4-

Aminobiphenyl-modifizierten Addukt 92

Da aus den gemessenen Spektren, wie zu erwarten war, eine räumliche Nähe des

Arylamin-NH der modifizierten Nucleobase zu der 5‘-Hydroxyfunktion zu erkennen

ist, sollte im Folgenden der Einfluss einer Phosphatgruppe an der 5‘-Position auf die

Stellung der Base untersucht werden. Die hierüber erhaltenen Daten könnten dabei

Aufschluss geben, ob bei den dargestellten Addukten eine Umwandlung in eine syn-

Konformation innerhalb eines Oligonucleotidstranges vorliegen könnte.

Die Synthese der C8-Arylamin-modifizierten 5‘-Monophosphate sollte zunächst

analog zu der von Moffat etablierten Methode erfolgen (s. Abb. 27).[72]

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

87

N(Me)2

NH

N

N

O

NN

O

OH

O

HN

94

N(Me)2POO

OPOCl3, Pyridin,H2O, MeCN

0 °C -> Rt, 4- 24 h

Abb. 27 Versuch der C8-Anilin-modifizierten 5‘-Monophosphat-Synthese nach Moffat


36

Nach der Herstellung des Phosphatylierungsreagenz aus Phosphorylchlorid, Wasser

und Pyridin bei 0 °C wurde das entschützte Anilin-modifizierte C8-Addukt 87 in situ

zu der Reaktionslösung gegeben und die Lösung bei Raumtemperatur gerührt. Nach

der für solche Umsetzungen typischen Reaktionszeit von 4 Stunden konnte jedoch

keine Umsetzung beobachtet werden und das Edukt nach Aufarbeitung und

Reinigung wieder reisoliert werden. Bei einem analog durchgeführten Versuch mit

einer Reaktionszeit von 24 Stunden konnte dünnschichtchromatographisch kein

Edukt mehr detektiert werden. Nach anschließender hydrolytischer Aufarbeitung,

Neutralisation mit Ammoniumhydrogencarbonat und RP-Säulenchromatographie

konnten jedoch nur nicht identifizierbare Zersetzungsprodukte isoliert werden.

Eine weitere Möglichkeit, Zugang zu modifizierten 5‘-Monophosphaten zu erlangen,

ist die selektive Hydrolyse von cycloSal-Phosphattriestern. Zur Darstellung dieser

Verbindungen sind zwei Synthesewege denkbar. Zum Einen die Kupplung eines

cycloSaligenylchlorphosphits mit dem modifizierten Nucleosid und anschließender

Oxidation zum entsprechenden cycloSal-Phosphattriester. Zum Anderen ist die

Darstellung eines cycloSaligenylchlorophosphidates möglich, welches analog zu der

von O. Ludek entwickelten Methode ohne einen folgenden Oxidationsschritt direkt

zum entsprechenden cycloSal-Phosphattriester mit dem Nucleosid gekuppelt werden

kann.[73]

Bereits 1990 publizierten Johnson et al. die starke Oxidationsempfindlichkeit solcher

C8-Arylamin-modifizierten 2‘-dG Addukte.[74,75] Aus diesem Grund wurde hier die

gewünschte Darstellung C8-Arylamin-modifizierter cycloSal-Phosphattriester mittels

der zweiten Route versucht, um den Oxidationsschritt mit tert-Butylhydroperoxid oder

Oxon und die mögliche oxidative Spaltung zu vermeiden.

Die Kupplungsreaktion sollte ausgehend vom Addukt 88 durch langsame Zugabe bei

-40 °C eines von S. Warnecke im Rahmen ihrer Dissertation synthetisierten

cycloSaligenylchlorophosphidates 95 erfolgen (s. Abb. 28, S. 37).[76]


37

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

88

N(Me)2

O

ClO

OP

O

Cl

95

NH

N

N

O

NN

O

OH

O

HN

96

N(Me)2

O

PO

O

ClO

Pyridin,Toluol

- 40 °C, 5 h

Abb. 28 Versuch der Darstellung des C8-4-Methoxyanilin-modifizierten cycloSal-Phosphattriesters 96

Nach einer Reaktionszeit von 5 Stunden bei -40 °C konnte jedoch dünnschicht-

chromatographisch kein Umsatz beobachtet werden. Ein anschließendes Erwärmen

auf Raumtemperatur führte zu einer Zersetzung des Eduktes 95.

Da es auf den durchgeführten Wegen nicht möglich war, die 5‘-Phosphatfunktion

nach der Einführung der C8-Arylaminmodifikation zu generieren, scheint der einzige

Zugang zu solchen Monophosphaten eine Kreuzkupplungsreaktion mit einem

geschützten, an 5‘-Position bereits phosphoryliertem, Nucleosid zu sein. Allerdings

müsste eine geeignete Schutzgruppenstrategie für die Phosphatgruppe für eine

durchzuführende Kreuzkupplung etabliert werden. Diese Versuche wurden nicht

mehr im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt.

Die erhaltenen entschützten Addukte 87-93 wurden im Folgenden zu den

geschützten Bausteinen für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt.

Zunächst musste die 4,4’-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe (DMTr) an der primären

Hydroxylgruppe eingeführt werden (s. Abb. 29, S. 38).


38

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

87-93

Aryl

N(Me)2

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

97-103

Aryl

N(Me)2

DMTrCl,Pyridin

Rt, 3.5-12 h

45-84%

Abb. 29 DMTr-Schützung der C8-Addukte 87-93

Die Edukte 87-93 wurden jeweils in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei

Äquivalenten 4,4’-Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur

gerührt. Nach Aufarbeitung sowie chromatographischer Reinigung konnten die

entsprechenden Produkte 97-103 in Ausbeuten von 45-84% isoliert werden

(s. Tab. 6).


97 Phenyl 3.5 h 79%

98 4-Methoxyphenyl 3.5 h 79%


100 4-Cyanophenyl 3.5 h 45%


102 4-Biphenyl 3.5 h 84%

103 2-Fluorenyl 3.5 h 78% Tab. 6 Zusammenfassung aller durchgeführten DMTr-Schützungen

An die Dimethoxytritylierung schloss sich die Überführung in das entsprechende

Phosphoramidit an.

Das benötigte Phosphitylierungsreagenz, Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-

phosphit 107, wurde zunächst in zwei Schritten aus Phosphortrichlorid 104, 3-

Hydroxypropionsäurenitril 105 und N,N’-Diisopropylamin dargestellt (s. Abb. 30, S.

39).[77]


39

PCl3 HOCN P

Cl

ClO

CNPyridin,Diethylether

- 78 °C -> Rt, 12 h

Diisopropylamin,Diethylether

- 10 °C -> Rt, 12 h

PN

NO

CN

104 105 106 107

41%

Abb. 30 Synthese von Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107

Phosphortrichlorid 104 wurde hierbei zunächst in einem Lösungsmittelgemisch aus

absolutem Pyridin und absolutem Diethylether gelöst, bei – 78 °C tropfenweise mit

3-Hydroxypropionsäurenitril 105 versetzt und für 14 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Das nach Filtration erhaltene Rohprodukt 106 wurde direkt in absolutem

Diethylether aufgenommen und bei – 10 °C mit N,N’-Diisopropylamin versetzt. Nach

Aufarbeitung und anschließender Destillation konnte das Produkt 107 in einer

Ausbeute von 41% über beide Stufen erhalten werden.

Das so erhaltene Phosphitylierungsreagenz 107 konnte nun zur Umsetzung mit den

DMTr-geschützten Addukten 97-103 eingesetzt werden (s. Abb. 31).

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

97-103

Aryl

N(Me)2

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HN

108-114

Aryl

N(Me)2

PO N(iPr)2

NC

107, DCI,DCM, MeCN

Rt, 1 h

47-100%

Abb. 31 Synthese der Arylamin-modifizierten Phosphoramidite 108-114

Die DMTr-geschützten Addukte 97-103 wurden jeweils mit Dichlormethan

coevaporiert, in Dichlormethan/Acetonitril gelöst und zunächst mit 4,5-

Dicyanoimidazol (DCI) und anschließend tropfenweise mit 1.5 Äq. Bis-N,N’-

Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung

mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung und chromatographischer Reinigung mit

Dichlormethan/Methanol (0-2%) über Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3)


40

wurden die entsprechenden Phosphoramidite von den ebenfalls entstehenden H-

Phosphonaten mit Ausbeuten von 47-100% abgetrennt (s. Tab. 7, S. 40).

Produkt Aryl Ausbeute

108 Phenyl 61%

109 4-Methoxyphenyl 61%

110 4-Methylphenyl 68%

111 4-Cyanophenyl 47%

112 3,5-Dimethylphenyl 97%

113 4-Biphenyl 60%

114 2-Fluorenyl 100% Tab. 7 Zusammenfassung aller durchgeführten C8-Arylamin-modifizierten Phosphoramiditsynthesen

Die Phosphoramidite wurden anschließend jeweils nach Abkondensierung aus

Benzol als farblose Schäume erhalten.

14

8.

93

00

14

8.

86

90

( p p m)- 1 4 0- 1 0 0- 6 0- 2 02 06 01 0 01 4 01 8 02 2 0

Abb. 32 exemplarisch abgebildetes 31P-NMR des C8-Arylamin-modifizierten Phosphoramidites 110

Aus dem 31P-NMR des Phosphoramidites 110 (s. Abb. 32) ist die Reinheit zu

erkennen, da außer den beiden Diastereomeren weder das


41

Phosphitylierungsreagenz 107 (bei einer chemischen Verschiebung von 123.34 ppm)

noch die entsprechenden H-Phosphonate (bei -5 – 20 ppm) zu erkennen sind. Die

Phosphoramidite sind an der Luft einige Tage stabil und können unter Stickstoff im

Tiefkühlschrank mehrere Monate gelagert werden. Diese, im Gegensatz zu den von

Rizzo et al. synthetisierten C8-IQ-modifizierten Phosphoramiditen in Acetonitril

ausgezeichnet löslichen modifizierten Phosphoramidite, lagen nun als Bausteine für

die Festphasensynthese modifizierter Oligonucleotide vor.

Neben den hier synthetisierten Arylamin-modifizierten C8-Addukten des 2‘-

Desoxyguanosins kommen weiteren Addukten eine Bedeutung in der chemischen

Carcinogenese zu (s. Abb. 5, S. 9). Diese an der N2- sowie O6-Position gebildeten

Addukte und deren Phosphoramidite sind bislang chemisch noch nicht zugänglich

gewesen, so dass ein gezielter Einbau in Oligonucleotide und damit eine gezielte

Untersuchung der Auswirkungen solcher Modifikationen auf die Eigenschaften des

DNA-Duplex noch nicht möglich waren. Im Folgenden sollen die Syntheseversuche

zur Darstellung dieser Adduktformen und die Überführung in die entsprechenden

Phosphoramidite beschrieben werden.

4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine

Die Darstellung der N2-Arylamin-modifizierten Phosphoramidite 115 sollte ausgehend

vom 2‘-Desoxyguanosin 52 erfolgen. Es sollte zunächst eine Überführung wiederum

in einen an der O6-Position sowie den beiden Hydroxyfunktionen geschützten

Baustein 117 erfolgen. Dieser sollte an der 2-Position eine funktionelle Gruppierung

besitzen, die es ermöglichen sollte, die gewünschte Modifikation einzuführen und das

Addukt 116 darzustellen (s. Abb. 33, S. 42). Die im Einzelnen gewählten

funktionellen Gruppen und die damit verbundenen Synthesewege sollen im

Folgenden diskutiert werden.


42

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

52

N

N

N

OBn

FGN

O

OTBDMS

TBDMSO

117FG: NH2, OTf, Br

N

N

N

OBn

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

116

HN

ArylNH

N

N

O

NH

N

O

O

DMTrO

115

HN

Aryl

PO

NCN(iPr)2

Abb. 33 allgemeines Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite

4.2.1 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Azokupplung

Bei dem zunächst gewählten Syntheseweg sollte das N2-Arylamin-modifizierte

Addukt 118 ausgehend vom Bis-TBDMS-geschützten 2‘-Desoxyguanosin 121

dargestellt werden (s. Abb. 34, S. 43). Nach erfolgreicher Schützung sollte die

Modifikation durch eine Kupplung mit der entsprechend hergestellten Nitrosoaryl-

Verbindung 120 eingeführt werden. Das entstehende Addukt 119, mit einer N-N-

Doppelbindung, könnte anschließend selektiv zum Produkt 118 reduziert (analog zu

einer an Azobenzen bekannten Reduktion) werden. Vorteil dieser Synthese wäre die

einfache Zugänglichkeit des Nucleosidbausteins 121, die kurze Synthesesequenz

und das Vorliegen eines zweiten, in der Carcinogenese eine Rolle spielenden, N2-

Adduktes 119. Dieses könnte ebenfalls in das entsprechende Phosphoramidit

überführt und als Baustein für die Oligonucleotidsynthese verwendet werden.


43

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

NO

120

NH

N

N

O

NN

O

OTBDMS

TBDMSO

119

NNH

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

118

HN

Abb. 34 Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Azokupplung

Die für die Azokupplung benötigten beiden Edukte 120 und 121 mussten zunächst

hergestellt werden. Die Darstellung von Nitrosobenzol 120 sollte dabei ausgehend

vom Anilin 1 durch selektive Oxidation erfolgen (s. Abb. 35).

NH2 NO

1 1

H2O2, H2OMoO3, KOH

Rt, 24 h

13% 20

Abb. 35 Darstellung von Nitrosobenzol 120

Die Reaktion wurde analog zu der von Defoin beschriebenen Methode

durchgeführt.[78] Hierfür wurde die Ausgangssubstanz Anilin 1 mit 30%igem H2O2 und

H2O, anschließend mit MoO3 in einer KOH-Lösung versetzt und 24 h bei

Raumtemperatur gerührt. Nach erfolgter Aufarbeitung wurden braune Kristalle mit

einer Ausbeute von 13% erhalten. Die Ausbeute liegt im Vergleich zu den von Defoin

beschriebenen (53-80%) deutlich niedriger, da als Hauptprodukt die Entstehung von

Nitrobenzol beobachtet werden konnte.


44

Neben dem Nitrosobenzol 120 sollte als zweites Edukt das 3´,5´-Bis(tert-

butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121 dargestellt werden (s. Abb. 36).

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

52

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

TBDMSCl,Imidazol, Pyridin

Rt, 14 h

98%

Abb. 36 Darstellung von 3´,5´-Bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121

Dabei wurde 2´-Desoxyguanosin-Monohydrat als Ausgangssubstanz verwendet, mit

Imidazol in Pyridin suspendiert und anschließend mit TBDMS-Cl versetzt. Die

Reaktion lief innerhalb von 14 h bei Raumtemperatur ab. Nach chromatographischer

Reinigung konnte das Produkt in 98% Ausbeute erhalten werden.

Nach der erfolgreichen Synthese der beiden Kupplungsedukte sollte anschließend

die Umsetzung zu dem gewünschten Produkt 119 erfolgen (s. Abb. 37).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

NO

120

NH

N

N

O

NN

O

OTBDMS

TBDMSO

119

N

Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute

EtOH, Essigsäure Rt 26 h Kein Umsatz

EtOH, Essigsäure 40 °C 26 h Zersetzung

Chloroform Rt 24 h Kein Umsatz Abb. 37 Versuche zur Darstellung des N2-Adduktes 119

Die Syntheseversuche erfolgten dabei analog zu denen in der Literatur

beschriebenen Kupplungen zu verschieden substituierten Azobenzenen.[79-82]


45

Bei den durchgeführten Reaktionen konnte jedoch in keinem der Fälle das

gewünschte Produkt isoliert werden. Bei der Umsetzung der Edukte 120 und 121 in

Ethanol unter Zugabe von Essigsäure bei Raumtemperatur konnte

dünnschichtchromatographisch keine Umsetzung detektiert werden. Bei einer

Durchführung der Reaktion bei 40 °C wurde eine Spaltung der glycosidischen

Bindung beobachtet und es konnten lediglich Zersetzungsprodukte isoliert werden.

Ebenfalls keine Umsetzung konnte bei der analog zu der von Yunes et al.

durchgeführten Azokupplung in Chloroform bei Raumtemperatur beobachtet

werden.[82]

Da durch die beschriebenen Versuche gezeigt werden konnte, dass die

gewünschten N2-Addukte mittels Azokupplung nicht zugänglich sind, wurde im

Folgenden ein alternativer Syntheseweg durchgeführt, bei dem die Einführung der

Arylaminmodifikation mittels Substitution erfolgen sollte.

4.2.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution

Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der N2-

Position analog zu der von Boche für modifizierte 3‘-Monophosphate durchgeführten

Substitution eines Triflat-Intermediats 123 mit einem Arylhydrazin erfolgen (s. Abb.

38, S. 46).[49] Das Intermediat 123 musste dafür zunächst aus dem geschützten

Xanthosin-Derivat 124 hergestellt werden, welches aus dem entsprechenden

geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 generiert werden sollte. Als

Schutzgruppen sollten dabei die schon bei den C8-Addukten erfolgreich etablierten

TBDMS-Gruppen (für die Hydroxyfunktionen) und die Benzylgruppe für die O6-

Position dienen, welche zunächst ausgehend vom 2‘-Desoxyguanosin eingeführt

werden sollten.


46

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

40

N

NH

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

124

O

N

N

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

123

OTf

N

N

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

122

NH

HN

Abb. 38 Retrosyntheseschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Substitution

Die Darstellung des 3´,5´-Bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyguanosin 121 erfolgte

wie in Abb. 36, S. 44 gezeigt. Anschließend erfolgte die Schützung der O6-Position

mittels der Benzylschutzgruppe zum Produkt 40 (s. Abb. 39).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

40

Benzylalkohol,PPh3, DIAD,1,4-Dioxan

Rt, 1 h

68%

Abb. 39 Darstellung des geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivates 40

Die Reaktion wurde analog zu der Benzylschützung des C8-bromierten 2‘-

Desoxyguanosin-Derivates 65 durchgeführt. Dabei konnte nach einer Reaktionszeit

von einer Stunde bei Raumtemperatur und anschließender


47

säulenchromatographischer Reinigung das Produkt 40 mit einer Ausbeute von 68%

(10% höher als bei der bromierten Verbindung 63) erhalten werden.

Anschließend sollte die Überführung in das entsprechende Xanthosin-Derivat 124

erfolgen. Für diesen Syntheseschritt erfolgten drei alternative Umsetzungen, um eine

möglichst effektive Methode zur Darstellung der gewünschten Verbindung zu

erhalten (s. Abb. 40).

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

40

N

NH

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

124

O

Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute

tertButylnitrit 0 °C 5 min. 9%

Na2Fe(CN)5NO*2H2O, NaOH 70 °C 4 h ---

Aceton, H2O, HClO4, NaNO2, DCM 10 °C 1 h 6% Abb. 40 Zusammenfassung der Darstellungen des Xanthosin-Derivates 124

Die Synthese wurde zunächst analog zu der von Boche für das geschützte

Monophosphat 45 beschriebenen Methode durchgeführt. Hierbei wurde das Produkt

124 durch Reaktion der Ausgangssubstanz 40 mit tertButylnitrit innerhalb von 5

Minuten bei 0 °C erhalten.[49] Das Produkt konnte nach Aufarbeitung und Reinigung

jedoch nur, im Gegensatz zu den 25% von Boche, mit einer Ausbeute von 9% isoliert

werden.

Eine alternative Umwandlung aus dem geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 in

das Produkt 124 unter der Verwendung von Dinatriumpentacyanonitrosoferrat(II)-

dihydrat unter alkalischen Bedingungen bei 70 °C, wie von Keefer et al. für 2’-dG 52

beschrieben, führte zu keiner Umsetzung des Eduktes.[83]

Eine weitere Möglichkeit zur Darstellung des gewünschten Produktes 124 schien die

Umsetzung nach Pfleiderer et al..[84] Hierzu wurde das Edukt O6-Benzyl-3´,5´-bis-

(TBDMS)-2´-dG 40 in Aceton und Wasser gelöst und mit 70%iger HClO4 und NaNO2


48

bei 10 °C versetzt und 1 h gerührt. Nach anschließender Aufarbeitung wurde das

Produkt mit einer Ausbeute von 6% erhalten.

Insgesamt ließ sich in keiner der durchgeführten Synthesemethoden eine

zufriedenstellende Ausbeute erreichen, was somit eine Schwierigkeit zur Darstellung

größerer Mengen des Produktes 124 darstellt.

Die aus den verschiedenen Synthesen vereinigten Produktmengen des geschützten

Xanthosin-Derivates 124 wurden anschließend zum Triflat-Intermediat 123

umgesetzt (s. Abb. 41). Dabei wurde ebenfalls auf die von Boche beschriebene

Methode zurückgegriffen.[49]

N

NH

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

124

O

N

N

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

123

OTfEt3N, DMAP, DCM, Tf2O

0 °C, 30 min.

37%

Abb. 41 Darstellung des Triflat-Intermediats 123

Es wurde dabei das Edukt 124 mit Triethylamin und einer katalytischen Menge 4-

(Dimethylamino)-pyridin (DMAP) in Dichlormethan versetzt und auf 0 °C gekühlt.

Anschließend erfolgten die Zugabe von Trifluormethansulfonsäureanhydrid und das

Rühren für 0.5 h bei dieser Temperatur. Nach der folgenden Reinigung wurde das

Produkt in 37% Ausbeute erhalten und stand somit für die Umsetzung mit

entsprechenden Arylhydrazinen zur Verfügung.

Die für eine solche Substitution benötigten monocyclischen Arylhydrazine sind als

entsprechende Hydrochloride kommerziell erhältlich. Da die Darstellung

polycyclischer Arylaminmodifikationen an der N2-Position ebenfalls ein Ziel war,

mussten die entsprechenden Arylhydrazine zunächst dargestellt werden (s. Abb. 42).

NH2

2

HN

125

NH2

1) NaNO2, HCl,H2O, SnCl22) konz. NH3

-10 °C, 4 h

80% Abb. 42 Darstellung von 4-Hydrazinobiphenyl 125


49

Die Synthese von 4-Hydrazinobiphenyl erfolgte analog zu der von Müller

beschriebenen Methode.[85] Dabei wurde 4-Aminobiphenyl 2 zunächst in Wasser und

konz. Salzsäure suspendiert und bei –10 °C mit Natriumnitrit versetzt. Nach

anschließender Reduktion des entstehenden Diazoniumsalzes mittels Zinn(II)chlorid

konnte das Produkt als Hydrochlorid isoliert werden. Zur Darstellung des instabilen

freien Hydrazins 125 wurde das Hydrochlorid basisch mit Diethylether extrahiert und

nach dem Einengen in reiner Form mit einer Ausbeute von 80% erhalten. Mittels

dieser Methode konnte ebenfalls das entsprechende Fluorenyl-Derivat dargestellt

werden (s. S. 223).

Für die Umsetzung zu dem gewünschten N2-Addukt, ausgehend vom Triflat-

Intermediat 123, wurde zunächst das kommerziell erworbene Phenylhydrazin nach

der von Boche beschriebenen Methode verwendet (s. Abb. 43).[49]

N

N

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

123

OTf

N

N

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

122

NH

HNPhenylhydrazin,

DMF

Rt, 10 d

(53%)

Abb. 43 Erste Darstellung des N2-Arylhydrazino-Adduktes 122

Hierbei wurde das Triflat-Intermediat 123 mit Phenylhydrazin in DMF versetzt und 10

Tage bei Raumtemperatur gerührt. Nach der entsprechenden Aufarbeitung konnte

mit einer Ausbeute von 53% ein Produktgemisch erhalten werden. Zwar zeigten die

NMR-Messungen das gewünschte Produkt, jedoch lag dieses in einer nicht

trennbaren Mischung verschiedener nicht identifizierbarer Produkte nur zu ca. 10%

vor, weshalb eine genaue Ausbeutebestimmung für die durchgeführte

Substitutionsreaktion nicht möglich ist.

Mittels dieser Substitution ist es möglich, die gewünschte N2-Modifikation am

2‘-Desoxyguanosin einzuführen, jedoch ist es aufgrund der geringen Ausbeuten nicht

durchführbar größere Mengen der Addukte herzustellen, welche für eine weitere

Umsetzung zu den entsprechenden Phosphoramiditen nötig wäre.

Eine alternative Darstellung zur Einführung der Arylaminmodifikation sollte analog zu

den synthetisierten C8-Addukten mittels einer Palladium-katalysierten


50

Kreuzkupplungsreaktion erfolgen. Die entsprechenden Ergebnisse sollen im

Folgenden aufgezeigt und diskutiert werden.

4.2.3 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Palladium-katalysierter

Kreuzkupplung

Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der N2-

Position analog zu den C8-Addukten mittels einer Palladium-katalysierten

Kreuzkupplung an einem an der 2-Position bromierten, geschützten

2‘-Desoxyguansoin-Derivat 126 mit einem Arylhydrazin erfolgen (s. Abb. 44).

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

40

N

N

N

OBn

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

126

N

N

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

122

NH

HN

Abb. 44 Retrosynthesschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte mittels Kreuzkupplung

Der Baustein 126 sollte dabei direkt aus dem entsprechenden geschützten

2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40, welches aus den vorangegangenen Versuchen

bereits vorlag, generiert werden. Anschließend sollte eine Buchwald-Hartwig-


51

ähnliche Kreuzkupplungsreaktion mit den Arylhydrazinen die Einführung der N2-

Arylamin-Modifikation ermöglichen und das gewünschte Produkt 122 liefern.

Nach der bereits beschriebenen Schützung der beiden Hydroxylgruppen mit TBDMS

sowie der Blockierung der O6-Position mit der Benzylgruppe, sollte eine Methode zur

selektiven Bromierung der 2-Position gefunden werden.

Hierfür wurden drei unterschiedliche Methoden angewendet, um eine möglichst

effiziente Synthese zu entwickeln (s. Abb. 45).

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

40

N

N

N

OBn

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

126

Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute

tert-Butylnitrit, CHBr3 90 °C 30 min. ---

NaNO2, TMSBr, BnBu3NCl, CCl4 0 °C 1.5 h ---

tert-Butylnitrit, CH2Br2, Sb(III)Br3 - 10 °C 1 h 40% Abb. 45 Zusammenfassung der Bromierungsversuche zur Darstellung des Produktes 126

Die Synthese wurde zunächst analog zu der von Nair beschriebenen Methode

durchgeführt.[86] Hierbei sollte das Edukt 40 durch Reaktion mit tertButylnitrit

innerhalb von 30 Minuten bei 90 °C in die Diazonium-Verbindung überführt werden

und anschließend mit einem Bromid des Lösungsmittels Bromoform zum Produkt

126 reagieren. Nach Reinigung des Reaktionsgemisches konnte das Produkt jedoch

nicht isoliert werden. Vielmehr trat hierbei eine Vielzahl nicht identifizierbarer

Produkte auf.

Auch die Umwandlung aus dem geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 40 in das

Produkt 126 unter der Verwendung von Trimethylsilylbromid als Bromid-Donor in

Gegenwart von Benzyltributylammoniumchlorid bei einer Temperatur von 0 °C, wie

von Lee et al. beschrieben, führte zu keiner Umsetzung des Eduktes.[87]


52

Die Synthese des gewünschten Produktes 126 gelang schließlich durch die

Umsetzung nach Harwood et al..[88] Hierzu wurde das Edukt O6-Benzyl-3´,5´-bis-

(TBDMS)-2´-dG 40 in Dibrommethan bei -10 °C gelöst, mit Antimon(III)-bromid und

tertButylnitrit versetzt und eine Stunde gerührt. Nach anschließender Aufarbeitung

und säulenchromatographischer Reinigung wurde das Produkt mit einer Ausbeute

von 40% erhalten.

Ausgehend von dem dargestellten Baustein 126 sollte nun die Einführung der

Arylaminmodifikation erfolgen. Für die notwendige Kreuzkupplungsreaktion wurde

auf die Bedingungen der C8-Kreuzkupplung zurückgegriffen. Um für diese

Anwendung die optimalen Reaktionsbedingungen zu finden, wurden die

Komponenten Lösungsmittel, Base und Salzzusatz variiert (s. Abb. 46).

N

N

N

OBn

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

126

N

N

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

122

NH

HN

Pd2(dba)3, rac-BINAP,Phenylhydrazin,Base, LM

Lösungsmittel Base Zusatz (0.2 Äq.) Zeit Ausbeute

Toluol KtOBu --- 24 h ---

1,2-DME K3PO4 --- 48 h (14)

1,2-DME K3PO4 Et3NHCl 24 h (100)

1,2-DME K3PO4 LiCl 24 h (52)

1,2-DME K3PO4 Bu4NCl 24 h (45)

1,2-DME Cs2CO3 Et3NHCl 24 h (56) Abb. 46 Zusammenfassung der Kreuzkupplungen zum Produkt 122

Zunächst wurde die Reaktion in Toluol mit Kaliumtertbutanolat als Base durchgeführt.

Der Palladiumkatalysator wurde dabei mit rac-BINAP und dem Kupplungsedukt 126 in abs. Toluol gelöst. Anschließend erfolgte die Zugabe von Phenylhydrazin und der

Base. Die Reaktionsmischung wurde 24 h bei 80 °C gerührt, wobei eine Zersetzung

des Eduktes dünnschichtchromatographisch beobachtet werden konnte. Da diese


53

Beobachtung bereits bei der Verwendung von Kaliumtertbutanolat als Base bei der

durchgeführten C8-Addukt-Synthese gemacht wurde, wurden für die folgenden

Synthesen schwächere Basen, wie Kaliumphosphat und Cäsiumcarbonat gewählt.

Bei der Verwendung von Kaliumphosphat als Base (analoge Bedingungen der C8-

Kreuzkupplung) konnte die Bildung des Produktes dünnschichtchromatographisch

detektiert werden. Nach erfolgter Aufarbeitung und Reinigung konnten allerdings nur

14% eines Produktgemisches erhalten werden. Bei diesem nicht trennbaren

Gemisch handelt es sich um das Produkt 122 und einem Nebenprodukt, welches aus

dem Liganden rac-BINAP entstanden sein könnte, im Verhältnis 2:1. Das

Nebenprodukt wurde jedoch nicht weiter charakterisiert.

Im Jahr 2005 publizierten Cacchi et al. eine Kreuzkupplungsreaktion von Hydrazinen

mit Arylbromiden. Ihnen gelang es durch Addition von Lithiumchlorid als Chlorid-

Donor eine deutliche Steigerung der Ausbeute zu erzielen.[89]

Auch für die hier durchgeführte Kreuzkupplung ließ sich durch Addition von 0.2

Äquivalenten Lithiumchlorid eine Ausbeutesteigerung auf 52% erzielen, wobei

ebenfalls das zuvor beobachtete Produktgemisch im gleichen Verhältnis vorlag.

Neben Lithiumchlorid wurden unter gleichen Bedingungen weitere Zusätze getestet,

welche ebenfalls als Chlorid-Donatoren dienen sollten. Bei der Verwendung von

Tetrabutylammoniumchlorid konnte dabei eine Ausbeute von 45% erzielt werden.

Eine deutliche Steigerung konnte bei der Verwendung von Triethylammoniumchlorid

als Salzzusatz erreicht werden.[90] Nach erfolgter Reinigung konnten 100% des

Produktgemisches erhalten werden. Auch in diesem Fall lag das Produkt 122 und

das Nebenprodukt im zuvor beschriebenen Verhältnis vor.

Die deutliche Ausbeutesteigerung durch die Addition von Chlorid-Ionen kann durch

einen von Amatore postulierten Mechanismus erklärt werden (s. Abb. 46, S. 54).[90]

Beim diesem postulierten Mechanismus geht man von dem bereits in Abb. 23, S. 29

beschriebenen Mechanismus aus. Hier wird zusätzlich ein zweifach negativ

geladener Komplex, welcher durch den Zusatz von Chlorid-Ionen hervorgerufen wird,

angenommen. Durch die Koordination der Chlor-Atome an den 0-wertigen Pd-

Katalysator werden ein Zwei-Zentren-Drei-Elektronen-Übergangszustand und eine

Stabilisierung im jeweiligen Lösungsmittel erreicht. Dieser wird erst durch die

Reaktion mit dem Edukt I aufgelöst. Durch diese Stabilisierung wird möglicherweise


54

ein anderer Reaktionsweg eingeschlagen, wodurch die Ausbeute des Produktes

gesteigert werden kann.

Pd2(dba)3 + BINAP

(BINAP)Pd(dba)

(BINAP)Pd(0)

NN

NOBn

BrO

OTBDMS

NTBDMSO

NN

NOBn

Pd

O

OTBDMS

N

TBDMSO(+II)N

N

NOBn

Pd

O

OTBDMS

N

TBDMSO

+-

NN

NOBn

O

OTBDMS

N

TBDMSO

Ar-NH-NH2

K3PO4

K2HPO4 + KBr

NN

NOBn

NH-NH-ArO

OTBDMS

NTBDMSO

I

II

III

IV

V

PBr

PNH2-NH-Ar

Br

PP

Pd(+II)

PNH-NH-Ar

P

(Et)3N Cl

PdP

P

0

Cl

Cl

PdP

P

0

-2

Abb. 46 Postulierter Mechanismus der Buchwald-Hartwig-Reaktion mit Zusatz von (Et)3N+Cl- nach C. Amatore


55

Eine weitere Optimierung der Salzzusatzkonzentration (0.1, 0.5, 1, 2 Äquivalente)

brachte keine Steigerung der Ausbeute bzw. eine Verschiebung des Verhältnisses im

Produktgemisch.

Auch die unter optimierten Bedingungen durchgeführte Verwendung von

Cäsiumcarbonat als Base führte zu keiner weiteren Verbesserung (56% Ausbeute

des beschriebenen Produktgemisches).

Nach erfolgter Kupplung, sollte nun die Umsetzung des Produktgemisches zum

entsprechenden Phosphoramidit erfolgen. Diese Umsetzung sollte analog zu den

bereits durchgeführten Synthesen zu den C8-Arylamin-modifizierten

Phosphoramiditen 108-114 erfolgen.

Zunächst erfolgte die Debenzylierung in O6-Position mit Hilfe von Pd/C unter einer

H2-Atmosphäre (s. Abb. 47).

N

N

N

OBn

N

O

OTBDMS

TBDMSO

122

NH

HN

NH

N

N

O

N

O

OTBDMS

TBDMSO

118

NH

HNPd/C, H2, MeOH

Rt, 5 h

40%(über 2 Stufen)

Abb. 47 Debenzylierung zum Produkt 118

Hierfür wurde O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 mit einer

katalytischen Menge Pd/C in Methanol versetzt und unter H2-Atmosphäre 5 Stunden

bei Raumtemperatur gerührt. Nach der entsprechenden Aufarbeitung konnte das

Produkt 118 über beide Syntheseschritte, Kupplung und Debenzylierung, mit einer

Ausbeute von 40% in reiner Form erhalten werden.

Der nächste Syntheseschritt bestand in der Entfernung der TBDMS-Schutzgruppen.

Nach einer Vorschrift von De Riccardis wurde die Entschützung mit

Tetrabutylammoniumfluorid in THF vorgenommen (s. Abb. 48, S. 56).[48] Die Reaktion

führte nicht zu dem gewünschten Produkt 127, vielmehr konnte eine Dearylierung

beobachtet werden.


56

NH

N

N

O

N

O

OTBDMS

TBDMSO

118

NH

HN

TBAF, THF

Rt, 3 h

NH

N

N

O

N

O

OH

HO

127

NH

HN

Abb. 48 Versuch der Desilylierung mittels Tetrabutylammoniumfluorid zum Produkt 127

Als Alternative erfolgte die Entschützung mit Triethylamin-Trihydrofluorid unter

Zusatz von Triethylamin in Dichlormethan/THF (s. Abb. 49).

NH

N

N

O

N

O

OTBDMS

TBDMSO

118

NH

HN

Et3N*3HF,Et3N, DCM,THF

Rt, 24 h

68%

NH

N

N

O

N

O

OH

HO

127

NH

HN

Abb. 49 Desilylierung zum Produkt 127

Das Produkt 127 konnte dabei nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden und

entsprechender Reinigung mit einer Ausbeute von 68% erhalten werden. Mittels

dieser schonenden Methode war es erstmals möglich, das vollständig entschützte

N2-Phenylhydrazino-2‘-desoxyguanosin 127 darzustellen. Verbindungen dieser Art

könnten in zukünftigen Untersuchungen als Referenz zur weiteren Identifizierung

solcher Addukte dienen und damit eine Quantifizierung solcher Addukte auch für

weitere aromatische Amine möglich machen.

Das erhaltene entschützte N2-Addukt 127 sollte im Folgenden zum geschützten

Baustein für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt werden.


Hydroxylgruppe eingeführt werden (s. Abb. 50, S. 57).


57

NH

N

N

O

N

O

OH

HO

127

NH

HN

DMTrCl,Pyridin

Rt, 20 h

10%

NH

N

N

O

N

O

OH

DMTrO

128

NH

HN

Abb. 50 DMTr-Schützung des N2-Addukt 127

Das Edukt 127 wurden in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei Äquivalenten 4,4’-

Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach

Aufarbeitung, sowie chromatographischer Reinigung konnte das entsprechende

Produkt 128 in einer Ausbeute von 10% isoliert werden. Diese für eine solche

Reaktion unbefriedigende Ausbeute ließ sich aber auch durch eine Wiederholung der

Synthese nicht steigern.

Im Anschluss an die Dimethoxytritylierung sollte sich die Überführung in das

entsprechende Phosphoramidit 129 anschließen (s. Abb. 51).

NH

N

N

O

N

O

OH

DMTrO

128

NH

HN

107, DCI,DCM, MeCN

Rt, 1 h

NH

N

N

O

N

O

O

DMTrO

129

NH

HN

PO

NCN(iPr)2

Abb. 51 Versuch der Synthese des Phosphoramidit 129

Das DMTr-geschützte Addukt 128 wurde mit Dichlormethan coevaporiert, in

Dichlormethan/Acetonitril gelöst und zunächst mit 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) und

anschließend tropfenweise mit Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit

107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung

und chromatographischer Reinigung mit Dichlormethan/Methanol (0-2%) über

Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3) konnte jedoch kein Produkt 129 isoliert.

Vielmehr war bereits während der Reaktion eine, auf eine Zersetzung hindeutende,

starke Verfärbung der Reaktionslösung zu beobachten, welche während der


58

Aufarbeitung und Reinigung noch deutlich stärker wurde. Zwar konnte die

Entstehung des Produktes massenspektrometrisch aus der Reaktionslösung

nachgewiesen werden, jedoch machten es auch eine kürzere Reaktionszeit sowie

eine Aufarbeitung und Reinigung unter Schlenk-Bedingungen nicht möglich, das

gewünschte Produkt 129 zu isolieren. Bei Produkten der Art 129 scheint es sich also

um an Luft instabile Verbindungen zu handeln, welche es nicht ermöglichen, eine

Darstellung, Isolierung oder gar Lagerung durchzuführen. Diese Instabilität könnte

bereits die Ursache für die niedrige Ausbeute bei der DMTr-Schützung gewesen sein

und deshalb auch die Darstellung einer solchen Verbindung erschweren.

Die Isolierung der angestrebten N2-Arylamin-modifizierten Phosphoramidite kann aus

den erhaltenen Ergebnissen nur durch eine Stabilisierung des Systems geschehen.

Diese Stabilisierung müsste durch eine funktionelle Gruppe geschehen, welche erst

nach dem erfolgreichen Einbau in Oligonucleotide abgespalten werden kann. Über

solche Schutzgruppen berichteten Pfleiderer et al. im Jahre 1981.[91] Die für die

Blockierung der O6-Position eingesetzten p-subsituierten (p-Nitro bzw. p-Cyano)

2-Phenylethyl-Gruppen erfüllen diese Anforderungen. Da bereits aus vorangegangen

Arbeiten hervorging, dass eine Schützung mit einer p-Nitro-2-phenylethyl-Gruppe an

der O6-Position des 2‘-Desoxyguanosin eine Kreuzkupplungsreaktion nicht möglich

macht, sollte für die Stabilisierung die p-Cyano-2-phenylethyl-Gruppe (CPE-Gruppe)

angewendet werden (s. Abb. 52, S. 59).

Die Synthese eines CPE-geschützten bromierten Bausteins 132 sollte ausgehend

vom bereits 3‘,5‘-BisTBDMS-2´-desoxyguanosin 121 geschehen. Anschließend sollte

die CPE-Schutzgruppe in die O6-Position eingeführt werden und die Bromierung der

N2-Position erfolgen. Ausgehend von diesem bromierten Baustein 132 sollte die

Einführung der Modifikation in die N2-Position des Guanins wiederum durch die

entwickelte Buchwald-Hartwig-Kupplung vorgenommen werden.

Nach erfolgter Kupplung sollten die 3´- und 5´-Position wieder entschützt und nach

der Einführung der 5‘-DMTr-Schutzgruppe das Phosphoramidit 130 generiert werden.


59

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

N

N

N

OCPE

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

132

N

N

N

OCPE

N

O

OTBDMS

TBDMSO

131

NH

HN

Aryl

N

N

N

OCPE

N

O

O

DMTrO

130

NH

HN

Aryl

PO

NCN(iPr)2

Abb. 52 Retrosyntheseschema zur Darstellung N2-Arylamin-modifizierter Addukte unter Verwendung der O6-

CPE-Schutzgruppe

Für die angedachte Einführung der CPE-Schutzgruppe musste zunächst der

entsprechende Alkohol, 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134, analog zu Pfleiderer

hergestellt werden (s. Abb. 53).[91]

OH

NH2

133OH

CN

134

1) NaNO2, HCl, H2O2) CuCN,Toluol, Benzol

0 °C -> 50 °C,3.5 h

44%

Abb. 53 Darstellung von 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134

In dieser Sandmeyer-Reaktion wurde zunächst der 2-(p-Aminophenyl)ethanol 133 in

einem Wasser/Salzsäure-Gemisch suspendiert und bei einer Temperatur von 0 °C


60

mit Natriumnitrit diazotiert. Anschließend konnte die Reaktion mit frisch hergestelltem

Kupfer(I)cyanid erfolgen. Das Produkt 134 konnte nach Aufarbeitung und Reinigung

mit einer Ausbeute von 44% erhalten werden.

Die Einführung der CPE-Schutzgruppe geschah analog zu der Einführung der

Benzylschutzgruppe mittels einer Mitsunobu-Reaktion (s. Abb. 54).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

N

N

N

OCPE

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

135

134, PPh3, DIAD,1,4-Dioxan

0 °C -> Rt, 14 h

92%

Abb. 54 Darstellung der O6-CPE-geschützten Verbindung 135

Bei der Reaktion wurden zunächst 3’,5’-Bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin 121 und

Triphenylphosphin in 1,4-Dioxan mit 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134 vorgelegt und mit

Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur und

abschließender Aufarbeitung konnte das Produkt mit einer Ausbeute von 92% isoliert

werden.

Die anschließende Bromierung in 2-Position erfolgte ebenfalls analog zu der bereits

durchgeführten Synthese des Benzyl-geschützten Derivates 126 (s. Abb. 55).

N

N

N

OCPE

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

135

N

N

N

OCPE

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

132

tert-Butylnitrit,Sb(III)Br3, CH2Br2

- 10 °C, 1 h

50%

Abb. 55 Darstellung von O6-CPE-3´,5´-bis-(TBDMS)-2-brom-2´-desoxyguanosin 132

Das Produkt 132, und damit der Ausgangsbaustein für die Buchwald-Hartwig-

Kupplung, konnte nach analoger Durchführung und Reinigung mit einer Ausbeute

von 50% isoliert werden. Bereits bei den ersten Schritten scheint der Einfluss der


61

CPE-Schutzgruppe erkennbar zu sein, denn sowohl die Einführung der O6-

Schutzgruppe, als auch die anschließende Bromierung gelangen mit höheren

Ausbeuten, als dieses bei den entsprechenden Benzyl-geschützten Derivaten 40 und

126 möglich war.

Anschließend konnte die Kupplungsreaktion mit den entsprechenden Arylhydrazinen

zu den Kupplungsprodukten 136-139 durchgeführt werden (s. Abb. 56).

N

N

N

OCPE

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

132

Pd2(dba)3, rac-BINAP,K3PO4, Et3NHCl,Arylhydrazin1,2-DME

80 °C, 24 h

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

136-139

HN

Aryl

Abb. 56 Einführung der N2-Arylamin-Modifikationen zu den Produkten 136-139

Die Reaktionen wurden dabei unter den für die Darstellung des Benzyl-geschützten

Produktes 122 optimierten Bedingungen durchgeführt. Die Produkte 136-139

konnten nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer Reinigung in einer

Ausbeute von 52-80% in reiner Form isoliert werden (s. Tab. 8).


136 Phenyl 80%

137 4-Biphenyl 50%

138 4-Methylphenyl 75%

139 3,5-Dimethylphenyl 52% Tab. 8 Zusammenfassung aller Adduktsynthesen zu den Produkten 136-139

Eine Ausbeutesteigerung durch eine Vorreaktion des Katalysators mit dem Liganden

konnte wiederum nicht beobachtet werden.

Anschließend sollten unter den ebenfalls erprobten Bedingungen die TBDMS-

Gruppen exemplarisch für die Verbindungen 136-137 abgespalten werden (s. Abb.

57, S. 62).


62

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

136-137

HN

Aryl

Et3N*3HF,Et3N, DCM,THF

Rt, 2-12 h

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OH

HO

140-141

HN

Aryl

N

N

N

OCPE

NN

O

OH

HO

142-143

NAryl

Abb. 57 TBDMS-Entschützung der N2-Arylamin-Addukte 136-137

Hierzu wurden die entsprechenden Addukte 136-137 in THF/DCM (1:1 v/v) gelöst,

bei Raumtemperatur mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5 Äquivalenten

Triethylamin-Trihydrofluorid versetzt und bei Raumtemperatur für 2-12 Stunden

gerührt. Nach anschließender chromatographischer Reinigung konnten jedoch nur

jeweils Produktgemische aus den gewünschten entschützten N2-Addukten 140-141 (im Folgenden als Hydrazinoaryl-Addukt bezeichnet), sowie deren

Oxidationsprodukten 142-143 (im Folgenden als Azoaryl-Addukt bezeichnet) erhalten

werden. Die unerwartete Entstehung der Oxidationsprodukte 142-143 konnte bisher

nicht mit Sicherheit aufgeklärt werden. Eine dünnschichtchromatographische

Reaktionsverfolgung sowie eine NMR-spektroskopische Analyse des

Reaktionsgemisches zeigen, dass die Bildung dieser Produkte nicht während der

Reaktion zu beobachten ist. Ebenfalls kann eine Oxidation während der wässrigen

Aufarbeitung ausgeschlossen werden. Somit müsste die Oxidation während der

Säulenchromatographie über Silica-Gel stattfinden. In Abbildung 58, S. 63 sind

exemplarisch die NMR-Spektren vor und nach säulenchromatographischer

Reinigung über Silica-Kieselgel abgebildet. Es ist deutlich zu erkennen, dass

ausgehend von einem nucleosidischen Produkt nach der Trennung eine

Verdopplung der Signale vorliegt. Dieses weist auf das Entstehen der oxidierten

Form während der Säulenchromatographie hin.


63

( p p m)2 . 02 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 56 . 06 . 57 . 07 . 58 . 08 . 5

( p p m)2 . 42 . 83 . 23 . 64 . 04 . 44 . 85 . 25 . 66 . 06 . 46 . 87 . 27 . 68 . 0

H-82 x H-8

Abb. 58 1H-NMR-Spektren vor (links) und nach (rechts) einer durchgeführten Kieselgeltrennung bei der

Entschützung des N2-Adduktes 136

Durch die Verwendung von Aluminiumoxid könnte eine solche Reaktion unterbunden

werden. Da beide Adduktformen jedoch in der chemischen Carcinogenese eine Rolle

spielen, sollte sich diese partielle Oxidation zu Nutze gemacht und eine Möglichkeit

gefunden werden, die jeweiligen Addukte quantitativ darzustellen und separat in die

entsprechenden Phosphoramidite zu überführen. Da eine säulenchromatographische

Trennung ausgeschlossen werden konnte, wurde zunächst einmal untersucht, ob

eine chemische, quantitative Überführung des Reaktionsgemisches 140/142 in die

reduzierte Form 140 möglich ist (s. Abb. 59, S. 64).

Zunächst wurde das Produktgemisch 140/142 in Methanol gelöst und mit Magnesium

und Ammoniumchlorid versetzt und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.[92]

Nach dieser Zeit konnte mittels 1H-NMR-Spektroskopie der Reaktionslösung keine

merkliche Verschiebung des Produktverhältnisses 140/142 beobachtet werden.

Eine weitere Möglichkeit zur Reduktion von Azoverbindungen zu den

entsprechenden Hydrazinoverbindungen besteht durch die Reaktion mit

Natriumhydrogencarbonat, Hydrazin-Hydrat und Zirkoniumdioxid als Katalysator in

Ethanol.[93] Auch bei dieser durchgeführten Reaktion konnte jedoch keine quantitative

Reduktion erreicht werden. Gleiches gilt für den Reduktionsversuch mit

Natriumborhydrid und Iod, welches in Tetrahydrofuran gelöst wurde.[94]

Diese Reaktionen fanden alle bei Raumtemperatur für 24 Stunden statt, lieferten

allerdings ebenso keine quantitative Umsetzung wie die Reaktion mit Iod,

Magnesiumiodid und Magnesium. Als Lösungsmittel wurde bei dieser Reaktion ein


64

Ether/Benzol-Gemisch verwendet. Die Reaktion fand bei Raumtemperatur für 72

Stunden statt.[95]

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OH

HO

140

HN

N

N

N

OCPE

NN

O

OH

HON

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OH

HO

140

HN

142

Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute*

MeOH, Mg, Ammoniumchlorid Rt 24 h ---

NaHCO3, EtOH, Hydrazinhydrat, ZrO2 Rt 24 h ---

Iod, Magnesiumiodid, Diethylether, Benzol, Mg Rt 72 h ---

NaBH4, Iod, THF Rt 24 h ---

Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH Rt 14 h ---

Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH (Ultraschall-Bad) Rt 14 h ---

Hydrazinhydrat, Pd/C, MeOH 60 °C 14 h ---

Hydrazinhydrat, Pd/C, EtOH 60 °C 14 h ---

*Ausbeute bezieht sich auf eine quantitative Reduktion zum Produkt 140

Abb. 59 Zusammenfassung aller Versuche zur quantitativen Darstellung von 140

In weiteren Versuchen wurden die Reaktionsbedingungen für die Reaktion mit

Hydrazin-Hydrat und Palladium auf Aktivkohle als Katalysator in Methanol variiert.[96]

Im Allgemeinen wurde Methanol als Lösungsmittel verwendet und die Zeit des

Ultraschallbades zum Aktivieren des Katalysators variiert. Dieses lieferte allerdings

keine quantitative Umsetzung zum Hydrazino-Produkt 140, ebenso wie bei einem

Erhitzen der Reaktionslösung auf 50 °C. Es wurde zwar eine Verschiebung der


65

Verhältnisse beobachtet, aber es erfolgte keine quantitative Umsetzung. Letztlich

wurde versucht, die Reaktion ohne Katalysator stattfinden zu lassen. Auch hierbei

konnte sowohl in Methanol, als auch in Ethanol kein reines Hydrazino-Produkt 140

erhalten werden.

Es scheint somit nicht möglich zu sein eine quantitative Reduktion des

Produktgemisch 140/142 zur reinen Hydrazinoform 140 chemisch zu erreichen.

Neben der reduzierten Form 140 spielt die oxidierte Form 142 eine wichtige Rolle in

der chemischen Carcinogenese, weshalb im Folgenden versucht wurde, das

Produktgemisch 140/142 zur reinen Azoform 142 zu oxidieren (s. Abb. 60).

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OH

HO

140

HN

N

N

N

OCPE

NN

O

OH

HON

N

N

N

OCPE

NN

O

OH

HO

142

N

142

Reagenzien/Lösungsmittel Temp. Zeit Ausbeute*

KO2, Toluol Rt 48 h ---

NBS, Pyridin, DCM Rt 1.5 h ---

*Ausbeute bezieht sich auf eine quantitative Oxidation zum Produkt 142

Abb. 60 Zusammenfassung aller Versuche zur quantitativen Darstellung von 142


66

Die Oxidation zum Azo-Produkt 142 sollte zum Einen mit Hilfe von Kaliumsuperoxid

in Toluol bei Raumtemperatur erfolgen.[97] Hierbei verschoben sich laut NMR zwar

nach einer Reaktionszeit von 48 Stunden die Verhältnisse zu Gunsten der Azo-

Komponente, jedoch war keine quantitative Reaktion zu beobachten.

Zum Anderen wurde das Produktgemisch 140/142 in Dichlormethan gelöst, mit

Pyridin und NBS versetzt und anschließend bei Raumtemperatur gerührt.[98] Auch

hier erfolgte allerdings keine reproduzierbare quantitative Umsetzung zum Azo-

Produkt 142. Mit dem bei der DNA-Synthese verwendeten Oxidationsreagenz (THF,

Pyridin, Iod) konnte ebenfalls keine Verschiebung des Hydrazino / Azo –

Gleichgewichtes gefunden werden.

Da auch in diesem Fall keine quantitative Überführung des Produktgemisches

möglich war, wurde nach einer geeigneten Trennmethode der beiden Komponenten

140/142 gesucht. Eine Trennung über Aluminiumoxid verlief dabei allerdings

aufgrund des geringen Polaritätsunterschiedes der beiden Verbindungen erfolglos.

Letztendlich konnte eine Trennung des Produktgemisches 140/142 mittels Reversed

Phase-Säulenchromatographie erreicht werden. Für die Trennung des

Produktgemisches mittels RP-Säule wurde Wasser mit einem Acetonitril-Gradienten

(20-40%) als Laufmittel verwendet. Hiermit gelang es die Produkte 140 und 142

getrennt in reiner Form zu isolieren. Die 1H-NMR-Spektren der isolierten Produkte

sind in Abb. 61, S. 66 dargestellt. Die erfolgreiche Trennung wurde durch die

Ergebnisse der MS-Spektren bestätigt. Auch ließ sich die Trennung des

Produktgemisches 141/143 mit dieser Methode durchführen. In Tab. 9 sind die

isolierten Ausbeuten der Produkte 140-143 aus der TBDMS-Entschützung

zusammengefasst.


140 Phenyl 48%

141 4-Biphenyl 31%

142 Phenyl 27%

143 4-Biphenyl 25% Tab. 9 Zusammenfassung der Ausbeuten aus den TBDMS-Entschützungen der Addukte 136-137


67

1.

02

41

2.

30

89

2.

29

82

2.

18

62

2.

10

94

1.

10

08

1.

00

00

1.

96

82

1.

06

60

2.

18

53

1.

07

79

1.

08

80

2.

22

38

2.

05

96

1.

15

22

1.

03

18

In

te

gr

al

7.

64

75

7.

64

49

7.

63

98

7.

62

59

7.

62

33

7.

42

31

7.

40

21

7.

33

73

7.

31

89

7.

30

24

7.

29

73

7.

10

53

7.

08

69

7.

06

85

6.

32

36

6.

30

77

6.

30

45

6.

28

86

5.

31

43

5.

29

27

4.

89

16

4.

63

74

4.

62

03

4.

60

31

4.

37

37

4.

36

67

3.

84

80

3.

83

60

3.

82

90

3.

82

39

3.

81

69

3.

54

17

3.

14

13

3.

12

41

3.

10

70

2.

77

08

2.

75

61

2.

75

17

2.

73

77

2.

72

31

2.

71

86

2.

70

40

2.

26

61

2.

25

85

2.

25

09

2.

24

32

2.

23

31

2.

22

54

2.

21

78

2.

21

02

( p p m)0 . 01 . 02 . 03 . 04 . 05 . 06 . 07 . 08 . 09 . 0

1.

05

35

1.

54

63

2.

20

65

1.

83

18

2.

42

04

0.

96

68

1.

00

00

2.

21

35

1.

29

23

1.

18

91

1.

02

46

1.

30

65

1.

19

30

1.

17

23

In

te

gr

al

7.

99

89

7.

99

51

7.

98

75

7.

80

00

7.

77

97

7.

75

93

7.

68

05

7.

67

61

7.

67

10

7.

66

78

7.

66

21

7.

60

74

7.

58

65

6.

48

06

4.

90

69

4.

89

04

4.

87

39

4.

44

99

4.

44

17

4.

43

47

3.

90

14

3.

89

38

3.

66

05

3.

64

91

3.

63

07

3.

61

92

3.

56

58

3.

55

44

3.

53

60

2.

77

65

2.

76

12

2.

74

34

2.

38

94

2.

38

11

2.

37

48

2.

36

53

2.

33

16

2.

32

65

( p p m)2 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 56 . 06 . 57 . 07 . 58 . 08 . 59 . 0

Abb. 61 1H-NMR-Spektren des entschützten N2-Phenylhydrazino-modifizierten Adduktes 140 (oben) und des N2-

Azophenyl-modifizierten Adduktes 142 (unten)


68

Die erhaltenen entschützten N2-Hydrazinoaryl-Addukte 140,141, sowie die

entschützten N2-Azoaryl-Addukte 142,143 sollte im Folgenden zu geschützten

Bausteinen für die Oligonucleotidsynthese umgesetzt werden.


Hydroxylgruppe der N2-Hydrazino-Addukte 140,141 eingeführt werden (s. Abb. 62).

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OH

HO

140,141

HN

Aryl

DMTrCl,Pyridin

Rt, 12 h

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OH

DMTrO

144,145

HN

Aryl


144 Phenyl 69%

145 4-Biphenyl 62% Abb. 62 DMTr-Schützung der N2-Addukte 140,141

Die Edukte 140,141 wurden in absolutem Pyridin gelöst und mit zwei Äquivalenten

4,4’-Dimethoxytritylchlorid (DMTrCl) versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach

Aufarbeitung sowie chromatographischer Reinigung über Aluminiumoxid (zur

Vermeidung einer weiteren Oxidation) konnten die entsprechenden Produkte

144,145 in einer Ausbeute von 62-69% isoliert werden.

Analog konnte die Schützung der entschützten N2-Azoaryl-Addukte 142,143 erfolgen

(s. Abb. 63, S. 69). Hierbei konnte auf die Verwendung von Aluminiumoxid verzichtet

werden und die Trennung mittels Silica-Kieselgel erfolgen. Die Produkte konnten mit

Ausbeuten von 68-76% isoliert werden.


69

N

N

N

OCPE

NN

O

OH

HO

142,143

NAryl

DMTrCl,Pyridin

Rt, 12 h

N

N

N

OCPE

NN

O

OH

DMTrO

146,147

NAryl


146 Phenyl 68%

147 4-Biphenyl 76% Abb. 63 DMTr-Schützung der N2-Addukte 142,143

An die Dimethoxytritylierung sollte sich die Überführung in die entsprechenden

Phosphoramidite anschließen. Zunächst wurden wiederum die N2-Hydrazinoaryl-

Addukte 144,145 umgesetzt (s. Abb. 64).

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OH

DMTrO

144,145

HN

Aryl

107, DCI,DCM, MeCN

Rt, 12 h

N

N

N

OCPE

N

O

O

DMTrO

148,149

NH

HN

Aryl

PO

NCN(iPr)2


148 Phenyl 75%

149 4-Biphenyl 90% Abb. 64 Synthese des Phosphoramidite 148,149

Die DMTr-geschützten Addukte 144,145 wurde mit Dichlormethan coevaporiert, in

Dichlormethan/Acetonitril gelöst und zunächst mit 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) und

anschließend tropfenweise mit Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit

107 versetzt. Nach wässriger Aufarbeitung mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung

und chromatographischer Reinigung über Aluminiumoxid (Neutral, Aktivitätsstufe 3)


70

konnten die Produkte 148,149 in reiner Form mit Ausbeuten von 75-90% isoliert

werden. Abbildung 65 zeigt exemplarisch die NMR-Spektren der Verbindung 149.

0.

69

39

1.

34

46

12

.4

45

0.

95

61

5.

28

33

4.

32

15

2.

61

46

2.

06

83

1.

00

00

0.

98

47

1.

98

87

4.

22

97

8.

69

56

0.

67

96

2.

53

83

0.

22

42

2.

05

88

18

.4

45

In

te

gr

al

6.

85

53

6.

85

22

6.

84

33

6.

82

32

6.

77

71

6.

77

15

6.

75

95

6.

75

38

6.

68

45

6.

67

38

6.

66

87

6.

65

80

6.

36

68

6.

35

35

4.

53

43

4.

52

80

4.

51

98

4.

50

97

4.

21

60

4.

20

90

4.

20

27

4.

18

95

3.

66

25

3.

64

86

3.

63

54

3.

62

85

3.

62

22

3.

61

52

3.

60

14

3.

57

93

3.

57

11

3.

55

35

3.

54

97

3.

54

46

3.

53

90

3.

53

45

3.

53

01

3.

51

82

3.

51

50

3.

51

19

3.

51

00

3.

50

43

3.

50

18

3.

49

86

3.

49

04

3.

48

85

3.

48

35

3.

47

84

3.

47

21

3.

46

71

3.

46

52

3.

45

89

3.

45

26

3.

43

87

3.

39

78

( p p m)0 . 51 . 01 . 52 . 02 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 56 . 06 . 57 . 07 . 58 . 08 . 59 . 0

14

9.

13

09

14

8.

35

32

( p p m)- 7 0- 5 0- 3 0- 1 01 03 05 07 09 01 1 01 3 01 5 01 7 01 9 02 1 0

Abb. 65 1H-NMR- (oben) und 31P-NMR- (unten)

Spektren des N2-Biphenylhydrazino-modifizierten Phosphoramidites 149

Die Phosphoramidite wurden abschließend jeweils als farblose Schäume nach

Abkondensierung aus Benzol erhalten. Analog konnte die Überführung der N2-Azoaryl-Addukte 146,147 erfolgen (s. Abb. 66,

S. 71).


71

N

N

N

OCPE

NN

O

OH

DMTrO

146,147

NAryl

107, DCI,DCM, MeCN

Rt, 12 h

N

N

N

OCPE

N

O

O

DMTrO

150,151

NN

Aryl

PO

NCN(iPr)2


150 Phenyl 51%

151 4-Biphenyl 35% Abb. 66 Synthese des Phosphoramidite 150,151

Hierbei konnte erneut auf die Verwendung von Aluminiumoxid verzichtet werden und

die Trennung mittels Silica-Kieselgel erfolgen. Auch hier war es möglich die Produkte

150,151 in reiner Form mit Ausbeuten von 35-51% zu isolieren. Die Phosphoramidite

wurden abschließend jeweils als orangefarbene Schäume nach Abkondensierung

aus Benzol erhalten und konnten ebenfalls mittels ESI-MS eindeutig charakterisiert

werden.

Mittels der hier beschriebenen Methode ist es somit erstmals möglich N2-Arylamin-

modifizierte 2‘-Desoxyguanosinaddukte herzustellen und diese in die

entsprechenden Phosphoramidite zu überführen. Diese entwickelte Syntheseroute

liefert neben den N2-Hydrazinoaryl-Addukten zusätzlich noch die ebenfalls in der

chemischen Carcinogenese eine Rolle spielenden N2-Azoaryl-Addukte. Diese

konnten in sehr guten Ausbeuten isoliert und ebenfalls in die entsprechenden

Phosphoramidite überführt werden, wodurch auch diese als Bausteine für die

Oligonucleotidsynthese zum gezielten Einbau in DNA und damit zur gezielten

Untersuchung solcher Modifikationen auf die Eigenschaften eines DNA-Dublex zur

Verfügung stehen.

Die für die Synthese eines weiteren Typs von aromatischen Aminen gebildeten

Addukten, den O6-2‘-dG-Addukten, unternommenen Versuche sollen im Folgenden

diskutiert werden.


72

4.3 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine

Die Darstellung der Arylamin-modifizierten Oligonucleotidbausteine sollte ausgehend

vom 2’-Desoxyguanosin 52 erfolgen. Bei der gewählten Syntheseroute stellt die

Einführung der Modifikation in die O6-Position des Guanins den bedeutendsten

Schritt dar. Dabei sollte die C-O-N-Bindung des Adduktes 153 generiert und dieses

anschließend in das Phosphoramidit 152 überführt werden (s. Abb. 67).

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

52

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

153

HNAryl

N

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

152

HN

N(Me)2

PO

NCN(iPr)2

Aryl

Abb. 67 Retrosynthese der Darstellung O6-Arylamin-modifizierter Phosphoramidite

Die Einführung einer solchen Modifikation ist prinzipiell auf mehreren Wegen

denkbar. In den durchgeführten Fällen wurde von einer bereits bestehenden C-O-N-

Bindung an einem Hydroxylamin ausgegangen und versucht, diese zunächst mittels

Mitsunobu-Reaktion oder durch Substitution einzuführen. Die Versuche hierzu sollen

im Folgenden aufgezeigt werden.


73

4.3.1 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine

mittels Mitsunobu-Reaktion

Bei diesem Syntheseweg sollte die Einführung der Arylaminmodifikation an der O6-

Position mittels einer Mitsunobu-artigen Reaktion am bereits synthetisierten TBDMS-

geschützten 2‘-dG 121 mit einem Arylhydroxylamin 155 erfolgen (s. Abb. 68).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

NHHO

NO2

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

154

HN

155 156 Abb. 68 Retrosyntheseschema zur Darstellung O6-modifizierter Addukte mittels Mitsunobu-Reaktion

Das für die Mitsunobu-Reaktion benötigte Hydroxylamin 155 sollte dabei aus der

entsprechenden Nitroarylverbindung 156 zugänglich sein.

Die Synthese hierfür wurde analog zu Brink et al. durchgeführt (s. Abb. 69, S. 74).[99]


74

NO2

156

NH4Cl, Zn,H2O

60 °C, 20 min.

NHHO

15543%

Abb. 69 Darstellung des N-Phenylhydroxylamin 155

Bei dieser Reaktion wurde zunächst eine Lösung aus Nitrobenzol und einer

wässrigen Ammoniumchlorid-Lösung auf 60 °C erhitzt und dann in einem Zeitraum

von ca. 20 Minuten mit der entsprechenden Menge Zink versetzt. Nach

anschließender Aufarbeitung konnte das Produkt mit einer Ausbeute von 43%

erhalten werden.

Die Einführung der O6-Arylamin-Modifikation sollte nun an dem bereits

synthetisierten 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 mittels einer Mitsunobu-Reaktion erfolgen

(s. Abb. 70).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

NHHO

155

PPh3, DIAD,1,4-Dioxan

0 °C -> Rt, 14 h

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

154

HN

Abb. 70 Versuch der Darstellung des O6-Adduktes 154

Hierzu wurden die bereits für die Benzylierung der C8-Addukte und für die CPE-

Schützung der N2-Addukte etablierten Synthesebedingungen angewandt. Die Edukte

121 und 155 wurden dabei mit Triphenylphosphin vorgelegt, in 1,4-Dioxan gelöst und

bei 0 °C mit DIAD versetzt. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur und einer

Reaktionszeit von 14 Stunden konnte jedoch kein Umsatz des geschützten 2‘-dG

121 beobachtet werden. Vielmehr war eine unerwünschte Reaktion an der NH-


75

Gruppierung des Hydroxylamins 155 zu beobachten, welches die Bildung des

gewünschten Produktes unmöglich machte.

Um das Problem der höheren Reaktivität der NH-Funktion des Hydroxylamin 155 im

Vergleich zu der Hydroxyl-Gruppe zu umgehen, sollte eine selektive Schützung der

NH-Funktion erfolgen. Als Schutzgruppen sollten dabei basenlabile Gruppen (um

eine Abspaltung nach der Oligonucleotidsynthese mit Ammoniak zu garantieren) wie

Acetyl und Benzoyl eingesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit sollte die

hydrogenolytisch abspaltbare Benzylgruppe sein.

Zunächst erfolgte die Acetyl-Schützung zur N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157

analog zu Trager et al. (s. Abb. 71).[100]

NHHO

155

Et2O, NaHCO3,AcCl

Rt, 16 h

49%

NAcHO

157 Abb. 71 Acetyl-Schützung des Hydroxylamins 155

Die Umsetzung des Hydroxylamin 155, welches in Diethylether gelöst wurde, erfolgte

mit Natriumhydrogencarbonat und Acetylchlorid bei einer Temperatur von 0 °C und

anschließendem 16-stündigen Rühren und Aufarbeitung mit einer Ausbeute von

49%.

Eine Benzyl-NH-Schützung konnte analog zu Utzinger erreicht werden (s. Abb.

72).[101]

NHHO

155

Pyridin, H2OBnCl

Rt, 16 h

46%

NBnHO

158 Abb. 72 Benzyl-Schützung des Hydroxylamins 155

Die Einführung der Benzyl-Gruppe an das Hydroxylamin 155 erfolgte durch Reaktion

unter Lichtausschluss mit Benzylchlorid in Pyridin und einigen Tropfen Wasser. Nach


76

16-stündigen Rühren und Aufarbeitung wurde das Produkt mit einer Ausbeute von

46% erhalten.

Als drittes konnte die Schützung mit der Benzoyl-Gruppe analog zu Nikrad erreicht

werden (s. Abb. 73).[102]

NHHO

155

Et2O, NaHCO3,BzCl

0 °C , 3 h

68%

NBzHO

159 Abb. 73 Benzoyl-Schützung des Hydroxylamins 155

Die Reaktion erfolgte durch Zugabe von Benzoylchlorid zu bereits gelöstem

Hydroxylamin 155 in Diethylether in Gegenwart von Natriumhydrogencarbonat bei

einer Temperatur von 0 °C. Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden konnte das

Produkt in reiner Form durch Filtration mit einer Ausbeute von 68% erhalten werden.

Die folgenden Reaktionen, die Umsetzung des 3´,5´-Bis-(TBDMS)-2´-dG-Derivates

121 mit der N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157 bzw. dem N-Benzyl-N-

phenylhydroxylamin 158 erfolgten unter unterschiedlichen Synthesebedingungen (s.

Abb. 74, S. 77). Dabei erfolgte stets zunächst die Zugabe von Triphenylphosphin und

DIAD, welche zur Bildung eines Betains führen, das wiederum durch das geschützte

Hydroxylamin protoniert werden sollte. Das auf diese Weise aktivierte

Triphenylphosphin sollte unter Addition mit dem O6-Atom des 2´-dG reagieren.

Triphenylphosphinoxid stellt eine gute Abgangsgruppe dar und könnte durch die

geschützten Hydroxylamine in einer SN2-Reaktion angegriffen werden.[103-104]

Bei den Durchführungen der in der Abbildung 74, S. 76 aufgeführten Reaktionen

fanden vor allem Variationen in Bezug auf die Lösungsmittel statt. Hier wurden

Acetonitril, 1,4-Dioxan, Dichlormethan sowie THF verwendet. Außerdem wurden die

Reaktionen unter Zugabe von Imidazol durchgeführt, welches als

Deprotonierungsreagenz für das jeweils eingesetzte N-geschütze Hydroxylamin

dienen sollte.[105]


77

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

154

SGN

SG: Ac, Bn, Bz

PPh3, DIAD,LM, Zusatz

geschütztes Hydroxylamin

Lösungsmittel Base Temp. Zeit Ausbeute

157 THF --- Rt 16 h ---

157 THF Imidazol Rt 16 h ---

157 MeCN --- -40 °C -> Rt 20 h ---

157 DCM Imidazol Rt 20 h ---

157 Dioxan --- Rt 16 h ---

158 THF Imidazol Rt 16 h --- Abb. 74 Versuche zur Darstellung von O6-Addukten unter Mitsunobu-Bedingungen

Sämtliche Variationen führten jedoch leider nicht zu einer Umsetzung und zu dem

gewünschten Produkt 154, wodurch eine Reaktion unter Mitsunobu-Bedingungen als

Syntheseweg zum O6-Addukt ausgeschlossen werden kann.

Als eine weitere Möglichkeit der Darstellung der O6-Addukte kommt eine Einführung

der Modifikation durch eine Substitutionsreaktion mit den bereits dargestellten

geschützten Hydroxylaminen 157-159 in Frage. Die entsprechenden Versuche sollen

im Folgenden aufgezeigt und diskutiert werden.


78

4.3.2 Versuche zur Synthese O6-Arylamin-modifizierter Oligonucleotidbausteine

mittels einer Substitutions-Reaktion

Eine einfache Methode zur Einführung einer Propiohydroxamsäure in die O6-Position

von Guanosin unter Abspaltung von Wasser wurde von Shibaeva beschrieben.[106]

Diese Methode sollte auf das ungeschützte 2‘-Desoxyguanosin 52 und das

geschützte Arylhydroxylamin 159 angewendet werden (s. Abb. 75).

NBzHO

159

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

52

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

161

BzNAryl

LM, H2O

Lösungsmittel pH Temp. Zeit Ausbeute

MeCN 9 Rt 7 d ---

MeCN 10 Rt 7 d ---

Pyridin 10 Rt 7 d ---

MeOH 10 Rt 7 d --- Abb. 75 Versuche zur direkten Einführung der O6-Arylamin-Modifikatinon nach Shibaeva

Für die Reaktionen wurde 2‘-dG 52 in einer Mischung aus dem verwendeten

Lösungsmittel und einer wässrigen pH-definierten Lösung (pH 9 und 10) gegeben

und mit der Benzoyl-geschützten Hydroxamsäure 159 versetzt. Nach einer

Reaktionszeit von 7 Tagen konnte jedoch dünnschichtchromatographisch kein

Umsatz detektiert werden. Eine Erhöhung der Temperatur führte ebenfalls nicht zu

einer Umsetzung und das Edukt konnte reisoliert werden. Es ist davon auszugehen,

dass der Grund für das Misslingen dieser Reaktionen die Eigenschaft des O6-

Sauerstoffs als schlechte Austrittsgruppe zu fungieren ist. Diese Art von Substitution

mit einer Propiohydroxamsäure konnte jedoch von Shibaeva bei Ribonucleosiden

beobachtet werden konnte.


79

Um eine Substitutionsreaktion möglich zu machen, sollten im Folgenden

verschiedene Austrittsgruppen an der 6-Position eingeführt werden (s. Abb. 76).

NH

N

N

O

NH2N

O

OSG

SGO

164SG: Ac, TBDMS

N

N

N

AG

NH2N

O

OSG

SGO

163AG: Cl, N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl, benzotriazoyl

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

162

HNAryl

Abb. 76 Retrosyntheseschema der O6-Arylamin-Addukt Darstellung mittels Substitution

Ausgehend von an den Hydroxyfunktionen geschützten 2‘-dG-Derivaten 164 sollte im

Folgenden eine Austrittsgruppe in der 6-Position eingeführt werden, welche nach

Substitution und anschließender Schutzgruppenabspaltung das gewünschte O6-

Addukt 162 liefern sollte. Als Abgangsgruppen sollte dabei zunächst Chlorid

Verwendung finden. Als alternative Gruppen kämen N-Phenyl-2,2,2-

trifluoracetimidoyl und Benzotriazoyl in Frage. Die durchgeführten Versuche sollen im

Folgenden aufgezeigt werden.

Für die Einführung der Chlorid-Funktion in 6-Position mussten zunächst die

Hydroxylgruppen des 2‘-Desoxyguanosin 52 durch Acetylgruppen geschützt werden.

Die Synthese geschah analog zu Matsuda (s. Abb. 77, S. 80).[107]


80

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

52

Et3N, DMAP,Ac2O, Pyridin,MeCN

Rt, 20 h

NH

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

16598%

Abb. 77 Acetylierung von 2‘-Desoxyguanosin 52

Die Darstellung von 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165 erfolgte ausgehend von

2’-Desoxyguanosin-Monohydrat 52, welches in Pyridin und Acetonitril suspendiert

wurde. Nachdem DMAP, Triethylamin und Essigsäureanhydrid zugegeben wurde,

wurde die Lösung für 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und nach

anschließender Filtration konnte das Produkt in einer sehr guten Ausbeute von 98%

erhalten werden.

Anschließend erfolgte die Umsetzung zum 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-

desoxyribosylpurin 166 (s. Abb. 78).[108]

NH

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

165

Et4NCl, POCl3N,N-Dimethyl-anilin, MeCN

reflux, 10 min.

70%

N

N

N

Cl

NH2N

O

OAc

AcO

166 Abb. 78 Chlorierung des 2‘-Desoxyguanosinderivates 165

Dazu wurde das zuvor dargestellte 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165 zusammen

mit Tetraethylammoniumchlorid in Acetonitril gelöst und mit N,N-Dimethylanilin und

Phosphorylchlorid versetzt. Nach kurzem Erhitzen auf 80 °C und Aufarbeitung mit

chromatographischer Reinigung wurde das Produkt in einer Ausbeute von 70%

erhalten.

Bereits 2003 gelang es Zemlicka et al., an solchen Derivaten eine nucleophile

Substitution an der 6-Position, u. a. mit Alkoholen oder Aminen, durchzuführen.[109]

Diese Durchführungen sollten sich auf die Substitution mit den geschützten


81

Hydroxylaminen 157-158 übertragen lassen und eine Darstellung der gewünschten

O6-Addukte ermöglichen. Die durchgeführten Synthesen sind in Abb. 79

zusammengefasst.

N

N

N

Cl

NH2N

O

OAc

AcO

166

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

167

SGN

SG: Ac, Bn


Lösungsmittel/Reagenzien Temp. Zeit Ausbeute

158 EtOH, Et3N, DMAP 80 °C 20 h ---

158 THF, NaH Rt 20 h ---

158 THF, NaH 80 °C 20 h ---

158 EtOH Rt 70 h ---

158 EtOH 80 °C 70 h ---

158 Pyridin Rt 70 h ---

158 Pyridin 80 °C 70 h ---

158 Formamid 100 °C 40 h ---

158 1,2-DME, K2CO3 80 °C 40 h ---

157 EtOH Rt 72 h ---

157 EtOH, Pyridin 80 °C 72 h ---

157 EtOH, DIPEA 80 °C 72 h ---

157 EtOH 80 °C 72 h --- Abb. 79 Zusammenfassung der Versuche zur Substitution am 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-

desoxyribosylpurin 166

Bei den durchgeführten Testreaktionen wurden dabei jeweils 50-100 mg des 2-

Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurins 166 mit 2 Äquivalenten des

geschützten Hydroxylamins 157, 158 in dem verwendeten Lösungsmittel gelöst und


82

bei der angegebenen Temperatur (ggf. unter Zugabe der aufgeführten Basen zur

Deprotonierung der Hydroxylamine) für 20 – 72 Stunden gerührt.

Hierbei wurden Variationen in Bezug auf das Lösungsmittel, die Reaktionstemperatur

und die Deprotonierungsreagenzien durchgeführt, wobei SN2-begünstigende protisch

polare wie Ethanol und Formamid, aber auch als Deprotonierungsreagenzien

wirkende Lösungsmittel wie Pyridin zum Einsatz kamen.

Für die mit dem N-Benzyl-N-phenylhydroxylamin 158 durchgeführten Reaktionen

führte weder eine Erhöhung der Temperatur noch ein Zusatz von

Deprotonierungsreagenzien wie Kaliumcarbonat oder Triethylamin in dieser Reihe zu

dem gewünschten O6-Addukt. Dabei konnte durch dünnschichtchromatographische

Überprüfung keine Umsetzung der Edukte bei Raumtemperatur beobachtet werden.

Bei den bei 80 °C durchgeführten Reaktionen fand eine Zersetzung (Abspaltung der

Acetylgruppe) des Zucker-Derivates statt.

Bei den Reaktionen mit N-Acetyl-N-phenylhydroxamsäure 157 konnten die zuvor

beschriebenen Beobachtungen bestätigt werden und außerdem eine Zersetzung des

Eduktes 166 dünnschichtchromatographisch detektiert werden. Auch in dieser

Versuchsreihe konnte das gewünschte O6-Addukt nicht isoliert werden.

Eine Ausnahme bildet die bei Raumtemperatur in Ethanol durchgeführte Reaktion

des 2‘-dG-Derivates 166 mit der Hydroxamsäure 157. Bei dieser Reaktion erfolgte

wahrscheinlich die Abspaltung der Acetyl-Schutzgruppe der Hydroxamsäure 157,

wodurch die reaktivere NH-Funktion mit dem Desoxyribosylpurin-Derivat unter

Wasserabspaltung zu einem Produkt führte, in dem sich das Stickstoff-Atom direkt

am C6 befindet.

Da bei den durchgeführten Reaktionen mit Hilfe der aufgenommenen NMR-Spektren

zum Teil Abspaltungen der Acetyl-Schutzgruppen beobachtet wurden, sollten im

Folgenden Versuchsreihen mit TBDMS-Schutzgruppen in 3´- und 5´-Position des

Desoxyribosylpurin-Derivates durchgeführt wurden.

Da eine analog durchgeführte Chlorierung mit dem bereits Bis-TBDMS-geschützten

2‘-dG-Derivat 121 zu einer Abspaltung der TBDMS-Gruppen und zu unerwünschten

Nebenprodukten führte, sollte die Darstellung ausgehend vom 2-Amino-6-chlor-3´,5´-

O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166 durch Entschützung und anschließende TBDMS-

Schützung erfolgen.


83

Zunächst wurden die Acetyl-Schutzgruppen durch Zugabe eines Gemisches aus

Triethylamin, Wasser und Methanol und anschließendem 3-stündigen Rühren bei

Raumtemperatur abgespalten. Nach Aufarbeitung konnte das gewünschte Produkt in

einer Ausbeute von 99% erhalten werden (s. Abb. 80).

N

N

N

Cl

NH2N

O

OAc

AcO

166

N

N

N

Cl

NH2N

O

OH

HO

168

Et3N, H2O,MeOH

Rt, 3 h

99%

Abb. 80 Entschützung von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166

Es folgte die TBDMS-Schützung analog zu den bereits durchgeführten Reaktionen,

wodurch das 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxyribosyl-

purin 169 mit einer Ausbeute von 90% erhalten wurde (s. Abb. 81).

N

N

N

Cl

NH2N

O

OH

HO

168

TBDMSCl,Imidazol, Pyridin

Rt, 16 h

90%

N

N

N

Cl

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

169 Abb. 81 TBDMS-Schützung von 2-Amino-6-chlor-2´-desoxyribosylpurin 168

Im Folgenden wurden Versuche unternommen die O6-Modifikation durch eine

Umsetzung des 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-

desoxyribosylpurins 169 mit einem geschützten Hydroxylamin zu erreichen. Bei den

durchgeführten Testreaktionen wurden dabei jeweils 50-100 mg des 2-Amino-6-

chlor-3´,5´-O-TBDMS-2´-desoxyribosylpurins 169 mit 2 Äquivalenten des

geschützten Hydroxylamins 157, 158 in dem verwendeten Lösungsmittel gelöst und

bei 80 °C unter Zugabe der beschriebenen Base gerührt. Abbildung 82, S. 84 fasst

die Ergebnisse dieser Versuche zusammen.


84

N

N

N

Cl

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

169

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

170

SGN

SG: Ac, Bn



158 EtOH 80 °C 16 h ---

158 EtOH, K2CO3 80 °C 16 h ---

158 EtOH, DIPEA 80 °C 16 h ---

158 DMSO, DIPEA 80 °C 16 h ---

157 EtOH 80 °C 16 h ---

157 EtOH, K2CO3 80 °C 16 h ---

157 DMSO, DIPEA 80 °C 16 h ---

157 EtOH 80 °C 16 h --- Abb. 82 Zusammenfassung der Versuche zur Substitution am 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-TBDMS-2´-

desoxyribosylpurin 169

Auch bei diesen durchgeführten Reaktionen konnte kein Umsatz des Eduktes 169

beobachtet werden. Einzige Ausnahmen bilden die in Ethanol unter Zugabe von

Kaliumcarbonat durchgeführten Reaktionen. In diesen Fällen konnte eine Umsetzung

beobachtet werden. Nach anschließender Aufarbeitung und Reinigung gelang es

nicht, das entstandene Produkt in reiner Form zu isolieren. Aus den NMR-Daten ließ

sich jedoch erkennen, dass nicht das gewünschte Produkt 170 entstanden war,

vielmehr scheint eine Reaktion am C8-Atom der Nucleobase stattgefunden zu haben.

Eine genaue Identifizierung dieses in geringen Mengen gebildeten Produktes war

jedoch nicht möglich.

Die beschriebenen Versuche zeigen, dass im vorliegenden Fall Chlorid als

Abgangsgruppe ungeeignet ist und eine Substitutionsreaktion zu dem gewünschten

O6-Addukt auf diesem Wege nicht möglich ist.


85

Eine Alternative als Abgangsgruppe stellt die von Papot et al. verwendete N-Phenyl-

2,2,2-trifluoracetimidoyl-Gruppe dar.[110] Ihnen gelang es, an einer glycosidischen

Hydroxylgruppe diese Funktion einzuführen und mit einer Hydroxamsäure zu

substituieren. Das für die Einführung dieser Abgangsgruppe benötigte Chlorid sollte

zunächst aus Anilin und Trifluoressigsäure hergestellt werden (s. Abb. 83).

N

CF3

Cl

172

NH2

OH

1 171

PPh3, Et3N,CCl4

reflux, 20 h

22%

F3C

O

Abb. 83 Darstellung von N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoylchlorid 172

Dabei wurden Triphenylphosphin, Anilin 1, Triethylamin zunächst in

Tetrachlorkohlenstoff suspendiert und unter Reflux mit Trifluoressigsäure versetzt

und für 20 Stunden gerührt. Das Produkt konnte nach Aufarbeitung und

abschließender Destillation mit 22% Ausbeute erhalten werden.

Die Einführung dieser Schutzgruppe geschah anschließend unter den von Papot

beschriebenen Bedingungen (s. Abb. 84).[110]

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

N

CF3

ClN

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

173172

Et3N, DMAP,DCM

Rt, 14 h

40%

N CF3

Abb. 84 N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-Schützung

Dabei wurden die beiden Edukte 121 und 172 zunächst in Dichlormethan gelöst und

anschließend mit Triethylamin und DMAP versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 14


86

Stunden bei Raumtemperatur und anschließender chromatographischer Reinigung

konnte das Produkt 173 in 40% Ausbeute erhalten werden.

Die abschließende Substitutionsreaktion unter Verwendung von TMSO-Triflat wurde

ebenfalls analog zu den von Papot beschriebenen Versuchen durchgeführt (s. Abb.

85).[110]

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

173

N CF3

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

170

AcN

157, TMSOTf,DCM

- 20 °C -> Rt, 4 h

Abb. 85 Versuch der TMSOTf-katalysierten Substitutionsreaktion nach Papot

Hierbei wurde das geschützte 2‘-dG-Derivat 173 in Dichlormethan unter Zugabe von

aktiviertem Molekularsieb gelöst und nach der Zugabe von TMSO-Triflat mit dem

geschützten Hydroxylamin 157 bei einer Temperatur von – 20 °C versetzt. Nach

anschließendem Erwärmen und einer Reaktionszeit von vier Stunden konnte kein

Umsatz des Nucleosid 173 dünnschichtchromatographisch detektiert werden.

Allerdings konnte eine Zersetzung des geschützten Hydroxylamins 157 beobachtet

werden. Auch diese Methode eignet sich damit nicht, um mittels einer

Substitutionsreaktion die gewünschten O6-Addukte zu synthetisieren.

Als eine letzte Abgangsgruppe sollte die von Lakshman zur Synthese C6-

modifizierter Inosin-Derivate etablierte Benzotriazoyl-Funktion untersucht werden.[111]

Ihm gelang es, nach Addition von Benzotriazol an die O6-Position des Inosins

nucleophile Substitutionsreaktionen mit Alkoholen, Aminen, Phenolen und Thiolen

durchzuführen.

Das hierfür benötigte, geschützte 2‘-Desoxyguanosin-Derivat 174 musste zunächst

hergestellt werden (s. Abb. 86, S. 87).


87

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

174

N

NN

BOP, DIPEA,DMF

Rt, 72 h

65%

Abb. 86 Benzotriazol-Schützung von 3’,5’-BisTBDMS-2‘-dG 121

Das geschützte Nucleosid 121 wurde dafür in DMF gelöst und anschließend mit BOP

(Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat) und

Diisopropylethylamin (Hünigs Base) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 72

Stunden konnte das Produkt nach Aufarbeitung und säulenchromatographischer

Reinigung in einer Ausbeute von 65% isoliert werden.

Die Substitutionsreaktion sollte zunächst aufgrund möglicher Selektivitäten

metallkatalysiert durchgeführt werden. Ähnliche Versuche zur Verwendung von

Hydroxylaminen als Sauerstoff-Nucleophile wurden von Takemoto 2005

beschrieben.[112] Die analog durchgeführten Versuche sind in Abb. 87, S. 88

zusammengefasst.

Bei den Reaktionen wurde das Benzotriazol-geschützte 2‘-dG-Derivat 174 in dem

verwendeten Lösungsmittel vorgelegt und anschließend mit dem Katalysator sowie

dem geschützten Hydroxylamin 159 versetzt. Als Katalysator wurden dabei die von

Takemoto verwendeten Tetrakis(triphenylphosphino)palladium und das dimere

Iridiumcyclooctadienchlorid eingesetzt. Nach Reaktionszeiten von 24 Stunden bei

Raumtemperatur konnte jedoch erneut in beiden Fällen kein Umsatz des Eduktes

174 dünnschichtchromatographisch detektiert werden.


88

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

174

N

NN

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

170

BzN



159 DCM, [IrCl(cod)]2 Rt 24 h ---

159 MeCN, Pd(PPh3)4 Rt 24 h --- Abb. 87 Versuche zur metallkatalysierten Substitution an 174

Als letzte Variante sollte eine basen-katalysierte Substitution mit dem Benzotriazol-

geschützten 2‘-dG-Derivat 174 durchgeführt werden. Nach der durch die Base

erfolgten Deprotonierung sollte die Hydroxamsäure 157 an der C6-Position selektiv

angreifen und unter Abspaltung von Hydroxybenzotriazol das gewünschte

geschützte O6-Addukt liefern. Als Base sollte neben Cäsiumcarbonat (mit 1,2-DME

als Lösungsmittel) auch Pyridin Verwendung finden, welches sowohl als Base als

auch als Lösungsmittel dienen sollte. Für die Versuche wurden 174 und 1.5

Äquivalente Hydroxamsäure 157 in dem jeweiligen Lösungsmittel gelöst, ggf. mit der

Base versetzt, und bei Raumtemperatur gerührt. Bei den durchgeführten Reaktionen

konnte bereits nach kurzer Zeit eine dünnschichtchromatographische Umsetzung zu

zwei Produkten beobachtet werden. Diese konnten nach kompletter Umsetzung und

anschließender säulenchromatographischer Reinigung sauber erhalten werden.

Neben dem erhaltenen 3’,5’-BisTBDMS-2‘-dG 121 konnte auch das zweite Produkt

charakterisiert werden. Zwar handelt es sich auch bei diesem nicht um das

gewünschte O6-Addukt, vielmehr konnte das unerwartet entstandene C8-N-Ac-

geschützte Addukt 175 isoliert werden (s. Abb. 88, S. 89).


89

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

174

N

NN

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

175

AcN


157, Cs2CO3, 1,2-DME Rt 2 h 52%

157, Pyridin Rt 16 h 75% Abb. 88 Zusammenfassung der Versuche zur basenkatalysierten Substitution an 174

Die Umsetzung zum Produkt 175 gelang dabei in 1,2-DME unter Zugabe von

Cäsiumcarbonat mit einer Ausbeute von 52% nach zwei Stunden, während die

Verwendung von Pyridin als Base und Lösungsmittel nach 16 Stunden gar eine

Ausbeute des sauberen Produktes von 75% lieferte.

Mittels dieser Methode sind offensichtlich die O6-Addukte nicht zugänglich, jedoch ist

hiermit eine neue und erste Methode gefunden worden, die einen schnellen und

einfachen Zugang zu den C8-N-Ac-Addukten liefert, welche ebenfalls eine Rolle in

der chemischen Carcinogenese spielen. Im Gegensatz zu der bislang einzigen

veröffentlichten Syntheseroute solcher Addukte von Schärer et al. (s. Abb. 16, S. 20)

ist hier keine komplexe Schutzgruppenstrategie sowie keine metallkatalysierte

Kreuzkupplungsreaktion nötig. Allerdings scheint hier eine zunächst durchgeführte

Aktivierung der O6-Position mit Benzotriazol elementar. In einer durchgeführten

Testsynthese zur direkten Umsetzung von 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 unter Zugabe

der Hydroxamsäure 157, BOP und DIPEA in DMF konnte auch nach 96 Stunden

keine Umsetzung detektiert werden (s. Abb. 89, S. 90). Auch eine zu erwartende

erneute Aktivierung der O6-Position mit Benzotriazol konnte nicht beobachtet werden.


90

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

175

AcN157, BOP, DIPEA, DMF

Rt, 96 h

Abb. 89 Versuch zur direkten Umsetzung von 121 zu dem C8-N-Ac-Addukt 175

Diese Beobachtungen geben einen ersten Aufschluss über den Mechanismus,

welcher zu dem unerwarteten Produkt 175 führen könnte. Da ebenfalls kein an der

O6-Position Benzotriazol-geschütztes C8-N-Ac-Addukt erhalten werden konnte,

scheint zunächst eine Reaktion der Hydroxamsäure mit der Benzotriazol-Gruppe

stattzufinden (s. Abb. 90).

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

174

N

NN

NOH

O

157

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

N

NN

ON

O

NN

N

O

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSON

ONH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

175

AcN

Abb. 90 Postulierter Mechanismus zur Darstellung der C8-N-Ac-Addukte aus 174


91

Nach einer Addition der Hydroxamsäure 157 an die Benzotriazol-Gruppe könnte sich

unter Abspaltung von Hydroxybenzotriazol neben 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG ein

hochreaktives Nitreniumion bilden, welches analog zu dem in vivo gefundenen

Mechanismus (s. Abb. 6, S. 10) zu dem C8-N-Ac-Addukt 175 reagiert. Durch diesen

Mechanismus würde ebenfalls die Entstehung des 3’,5’-Bis-TBDMS-2‘-dG 121 als

Nebenprodukt erklärt werden, da möglicherweise keine quantitative Umsetzung mit

dem intermediär gebildeten Nitreniumion erfolgt. Ein solcher Mechanismus wäre

insofern bemerkenswert, da hier ein Beispiel für eine elektrophile Arylaminierung

vorliegen würde. Diese Methode wurde in vorangegangenen Arbeiten zur Darstellung

von C8-Arylamin-Addukten angewendet, lieferte aber mit 2.5% sehr schlechte

Ausbeuten (s. Abb. 7, S. 13). Zukünftige Arbeiten sollen Aufschluss über den

Mechanismus dieser Reaktion geben. Hierbei könnte ein intermediär entstehendes

Nitreniumion abgefangen werden oder eine Reaktionsverfolgung isotopen-markierter

Edukte mittels NMR-Spektroskopie erfolgen.

Die NMR-Spektren des hier dargestellten C8-N-Ac-Adduktes 175 weisen eine starke

Verbreiterung der Signale auf. Diese Beobachtung wurde bereits von Beland et al.

gemacht.[113] Diese beschrieben, dass eine solche Verbreiterung möglicherweise

durch vorliegende Rotationsisomere verursacht wird. Diese These sollte anhand von

NMR-spektroskopischen, temperaturabhängigen Messungen gestützt werden. Diese

wurden exemplarisch mit dem Addukt 175 durchgeführt. Dazu wurde die Substanz in

DMSO-d6 gelöst und bei verschiedenen Temperaturen spektroskopisch untersucht.

Abbildung 91, S. 92 enthält exemplarisch einen Ausschnitt (H1‘, NH2-Funktion, sowie

aromatischer Bereich) aus den jeweils durchgeführten Messung aus denen eine für

diese Verbindung charakteristische Koaleszenztemperatur (Temperatur, bei der sich

beide Signale komplett zu einem überlagern) ermittelt werden kann. Diese liegt über

einem Wert von 353 K.


92

4 . 85 . 25 . 66 . 06 . 46 . 87 . 27 . 68 . 08 . 48 . 8( p p m)

300 K

323 K

333 K

353 K

Abb. 91 Koaleszenz im Bereich von 5-8 ppm der Verbindung 175

Um die Zugänglichkeit solcher Addukte für die Oligonucleotidsynthese zu zeigen,

sollte das dargestellte Addukt 175 in das entsprechende Phosphoramidit überführt

werden. Hierzu wurden bei allen weiteren durchgeführten Reaktionen jeweils die für

die C8-Addukte etablierten Bedingungen mit einer Ausgangsmenge von 150 mg

angewendet.

Zunächst erfolgte die Abspaltung der TBDMS-Gruppen mittels Triethylamin-

Trihydrofluorid (s. Abb. 92).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

175

AcNEt3N*3HF,Et3N, DCM,THF

Rt, 3 h

96%

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

176

AcN

Abb. 92 TBDMS-Entschützung des C8-N-Ac-Adduktes 175

Das komplett entschützte Addukt 176 konnte dabei mit einer sehr gute Ausbeute von

96% isoliert werden. Anschließend erfolgte die Einführung der basenlabilen

Schutzgruppe Formamidin an der exocyclischen Aminofunktion (s. Abb. 93, S. 93).


93

Dimethylformamid-diethylacetal,Pyridin

Rt, 24 h

61%

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

176

AcNNH

N

N

O

NN

O

OH

HO

177

AcNN(Me)2

Abb. 93 Formamidin-Schützung des C8-N-Ac-Adduktes 176

Nach säulenchromatographischer Reinigung konnte dabei das entsprechende

Produkt 177 mit einer Ausbeute von 61% isoliert werden.

Als weitere Schutzgruppe wurde die DMTr-Funktion an der 5‘-OH-Gruppe eingeführt

(s. Abb. 94).

DMTrCl,Pyridin

Rt, 3.5 h

56%

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

177

AcNN(Me)2

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

178

AcNN(Me)2

Abb. 94 DMTr-Schützung des C8-N-Ac-Adduktes 176

Das entsprechend geschützte Produkt konnte dabei nach Aufarbeitung und

Reinigung mit einer Ausbeute von 56% erhalten werden.

Abschließend sollte die Überführung in das Phosphoramidit 179 erfolgen (s. Abb. 95,

S. 94).


94

107, DCI,DCM, MeCN

Rt, 1 h

68%

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

178

AcNN(Me)2

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

AcN

179

N(Me)2

PO N(iPr)2

NC

Abb. 95 Überführung des C8-N-Ac-Addukt 178 in das entsprechende Phosphoramidit 179

Auch diese Überführung gelang unter den für die C8-Addukte etablierten

Reaktionsbedingungen und das Produkt 179 konnte mit einer zufriedenstellenden

Ausbeute von 68% erhalten werden.

Somit ist es gelungen das C8-N-Ac-Arylamin-modifizierte Addukt darzustellen und in

insgesamt sieben Syntheseschritten, ausgehend vom 2‘-dG, in das entsprechende

Phosphoramidit 179 mit einer Gesamtausbeute von 20% zu überführen und damit

eine höchst effiziente Syntheseroute für die Zugänglichkeit solcher Addukt und deren

Einbau in Oligonucleotide zu entwickeln. Die Untersuchungen dieser Addukte und

deren gezielter Einbau in Oligonucleotide sind Gegenstand gegenwärtiger Arbeiten in

unserem Arbeitskreis und werden von Frau Sarah Krüger durchgeführt.

4.4 Synthese Arylamin-modifizierter Oligonucleotide

Die im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten C8- und N2-Arylamin-modifizierten

Phosphoramidite sollten nun gezielt in verschiedene Oligonucleotide eingebaut und

deren Einfluss auf die Eigenschaften untersucht werden.

Oligonucleotide sind Polymere, die durch Polykondensation von

Nucleosidphosphaten entstehen. Im Gegensatz zu der auf 5’-Triphosphaten

basierenden natürlichen DNA-Synthese verläuft die Oligonucleotidsynthese am DNA-

Synthesizer aufgrund der höheren Reaktivität der 5’-Hydroxygruppe in 3’→5’-

Richtung. Die Methoden zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden

unterscheiden sich im Wesentlichen durch die Art wie die

Phosphorsäureesterbindung erhalten wird. Man unterscheidet die Triester-,


95

Phosphit-, Phosphoramidit-, bzw. H-Phosphonatmethode (s. Abb. 96). Als

Ausgangsverbindung der Synthese fungiert das entsprechend geschützte

Nucleosidderivat 180.

ODMTrO

O

180

P

B

OHO

OR1

B+

1) Katalyse

ODMTrO

OP

OO

B

O

OR1

B2) Oxidation

X OR2

181

R2O

182X = Cl, N

B = N

NN

NNH

O

N

N

N

O

HO

NH

NN

NO

N

NH

N

O

OO

O

DMTr =

ABz CBz Gform T

ODMTrO

O

180P

O OR2O

B

OHO

OR1

B+

Kondensation

ODMTrO

OP

OO

B

O

OR1

BR2O

ODMTrO

O

180P

O HO

B

OHO

OR1

B+

1) Kondensation

ODMTrO

OP

OO

B

O

OR1

BO2) Oxidation

Phosphit- (X=Cl) bzw. Phosphoramiditmethode (X=N(i-Pr)2):

H-Phosphonatmethode:

Triestermethode:

N(Me)2

Abb. 96 Methoden der Oligonucleotidsynthese


96

Obgleich viele Schutzgruppen bekannt sind, haben sich aufgrund der

Automatisierung der DNA-Synthese einige wenige Schutzgruppen durchgesetzt. Dies

sind im Wesentlichen die von Khorana[114] eingeführten Acylgruppen für die

exocyclischen Aminofunktionen an Adenin und Cytosin, die Formamidin-Gruppe am

Guanin sowie die 4,4’-Dimethoxytriphenylmethylgruppe (DMTr) an der 5’-

Hydroxylgruppe der Desoxyribose.

Das Startmolekül wird bei der automatisierten Festphasensynthese über die

3’-Hydroxylgruppe und einem Linker an einen sogenannten „controlled pore glass“-

Träger (CPG-Träger) gebunden. Der Linker zwischen dem festen Trägermaterial und

dem Startnucleosid ist im allgemeinen eine Dicarbonsäure (meist Bernsteinsäure),

die wiederum an ein langkettiges Alkylamin (Long Chain Amino Alkyl) gebunden ist.

Die wegen ihrer sehr guten Ausbeuten standardmäßig angewandte Methode ist die

Phosphoramiditmethode. Hier wird ein geschütztes Nucleosidphosphoramidit 181 in

Gegenwart eines Aktivators wie Tetrazol oder Dicyanoimidazol mit einem 5’-OH-

freien Nucleosid 180 zu einem Phosphittriester umgesetzt. Eine nachfolgende

Oxidation führt zum entsprechenden Phosphattriester 182.

Durch die höhere Reaktivität der P(III)-Verbindungen im Gegensatz zu den P(V)-

Verbindungen sind die Phosphoramidite attraktive Edukte, wobei zunächst ihre

schlechte Zugänglichkeit und Lagerfähigkeit der monomeren Bausteine im Wege

stand. Mit der Einführung der durch milde Säuren aktivierbaren Phosphoramidite

durch H. Köster et al.[115] und deren Optimierung durch M. H. Caruthers et al.[116]

gelang der Durchbruch, wobei heute die Diisopropylaminoverbindungen in

Verbindung mit der 2-Cyanoethylschutzgruppe den besten Kompromiss darstellen.

Der Synthesezyklus (s. Abb. 97, S. 97) beginnt mit der Abspaltung der DMTr-

Schutzgruppe durch Trifluoressigsäure (TFA, 1% in Acetonitril) (Schritt 1). Darauf

folgt die Addition des Nucleosidphosphoramidits, das zuvor durch DCI aktiviert wurde

(Schritt 2). Man erhält zunächst ein 3’→5’-verknüpftes Dinucleosidphosphit mit einer

Ausbeute von über 99% (Schritt 3). Zur Vermeidung von Fehlsequenzen werden

daraufhin nicht abreagierte 5’-Hydroxygruppen mit Essigsäureanhydrid und N-

Methylimidazol als 5’-Acetate blockiert (Schritt 4). Der anschließenden Oxidation des

dreiwertigen Phosphits zum fünfwertigen Phosphat mit einer Iodlösung (Schritt 5)


97

folgen erneut die saure Abspaltung der nächsten DMTr-Gruppe und der Eintritt in den

sich wiederholenden Synthesezyklus.

PN O CN

OTrMDO

O

B

OTrMDO

OP O

O

B

O

O

BNC

CPG

O

OHO

O

B

CPG

OP O

B

O

O

BONC

CPG

OTrMDO

TrMDO

O

BO

CPG

OAcO

O

B

CPG

Kettenabbruch

B = ABz, GForm, CAc oder T

F3CCOOH

HN

N CN

CN

NH4OH

4. Capping

< 1%

I2/H2O

5. Oxidation

3. Addition

Oligonucleotid6. Schutzgruppen abspaltung

2. Aktivierung

1. Detritylierung

Abb. 97 Synthesezyklus der Phosphoramiditmethode

Nach Abschluss der Synthese wird unter Standardbedingungen das Oligonucleotid

mit konzentrierter, wässriger Ammoniaklösung von der festen Phase abgespalten

und die Schutzgruppen der Nucleobasen sowie der Phosphatgruppen im gleichen

Medium bei erhöhter Temperatur (45 °C) entfernt.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Herstellung verschiedener modifizierter und

unmodifizierter Oligonucleotide dreier Sequenzen erfolgen.


98

Zunächst sollte die bereits von Rizzo für das heterocyclische Amin IQ verwendete

NarI-Sequenz 56 verwendet werden. Das als Hotspot für aromatische Amine

bekannte 12mer sollte an verschiedenen Positionen C8-modifiziert und der Einfluss

der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation untersucht werden (s. Tab.

10).

Oligonucleotid Sequenz

56 5'-d(CTCGGCGCCATC)

183 5'-d(GATGGCGCCGAG)

184 5'-d(CTC[G(Anil)]GCGCCATC)

185 5'-d(CTC[G(4-ABP)]GCGCCATC)

186 5'-d(CTCGGC[G(Anil)]CCATC)

187 5'-d(CTCGGC[G(4-ABP)]CCATC)

188 5'-d(CTCGGCG[(4-Anis)]CCATC) Tab. 10 Zusammenfassung aller synthetisierten Oligonucleotide der NarI-Sequenz

Als weitere Sequenz wurde ein selbstkomplementäres 12mer gewählt, welches eine

Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRI besitzt (Sequenz wird im Folgenden

als EcoRI-Sequenz bezeichnet).

Hier sollten neben den C8-Addukten, welche an verschiedenen Stellen der Sequenz

eingebaut wurden, auch die synthetisierten N2-Addukte eingebaut werden (s. Tab.

11, S. 99). Anschließend sollten erneut Untersuchungen bezüglich des Einflusses

der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation, sowie den Restriktionsabbau

durch das EcoRI-Enzym durchgeführt werden.

Um den Einfluss solcher Modifikationen auf längere Oligonucleotide zu untersuchen,

wurden als Weiteres die synthetisierten Phosphoramidite in ein nicht-palindromisches

30mer eingebaut (s. Tab. 12, S. 99). Nach den Standarduntersuchungen bezüglich

des Einflusses der Modifikation auf den Tm-Wert und die Konformation, sollten in

Kooperation mit Prof. Andreas Marx, Universität Konstanz, Primer-

Verlängerungsuntersuchungen mit den dargestellten C8-Arylamin-modifizierten

Oligonucleotiden 203-208 erfolgen.


99


57 5'-d(GTAGAATTCTAC)

189 5'-d(GTA[G(Anil)]AATTCTAC)

190 5'-d(GTA[G(4-Anis)]AATTCTAC)

191 5'-d(GTA[G(4-Tol)]AATTCTAC)

192 5'-d(GTA[G(4-Cyano)]AATTCTAC)

193 5'-d(GTA[G(3,5-DMA)]AATTCTAC)

194 5'-d(GTA[G(4-ABP)]AATTCTAC)

195 5'-d(GTA[G(2-AF)]AATTCTAC)

196 5'-d([G(Anil)]TAGAATTCTAC)

197 5'-d([G(4-ABP)]TAGAATTCTAC)

198 5'-d(GTA[G(N2-Hydr. Anil)]AATTCTAC)

199 5'-d(GTA[G(N2-Hydr. 4-ABP)]AATTCTAC)

200 5'-d(GTA[G(N2-Azo Anil)]AATTCTAC)

201 5'-d(GTA[G(N2-Azo 4-ABP)]AATTCTAC) Tab. 11 Zusammenfassung aller synthetisierten Oligonucleotide der EcoRI-Sequenz


58 5'-d(AAATGAACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

202 5‘-d(CGTTGGTCCTGAAGGAGGATAGGTTCATTT)

203 5'-d(AAAT[G(Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

204 5'-d(AAAT[G(4-Anis)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

205 5'-d(AAAT[G(4-Tol)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

206 5'-d(AAAT[G(3,5-DMA)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

207 5'-d(AAAT[G(4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

208 5'-d(AAAT[G(2-AF)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

209 5'-d(AAAT[G(N2-Hydr. Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

210 5'-d(AAAT[G(N2-Hydr. 4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

211 5'-d(AAAT[G(N2-Azo Anil)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

212 5'-d(AAAT[G(N2-Azo 4-ABP)]AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) Tab. 12 Zusammenfassung aller synthetisierten 30mer-Oligonucleotide


100

Die Synthesen der unmodifizierten Oligonucleotide wurden mittels Festphasen-

synthese nach der Phosphoramiditmethode auf einem DNA-Synthesizer der Firma

Applied Biosystems (Modell 392/394) durchgeführt. Zur Synthese der unmodifizierten

Oligonucleotide wurden sowohl die Standard-Chemikalien als auch die

Syntheseprotokolle des Herstellers (s. Anhang) verwendet. Als Trägermaterial

wurden kommerziell erhältliche Succinyl-CPG-Träger eingesetzt. Die

Kupplungsausbeuten lagen bei jedem Schritt bei ca. 98% (ermittelt über einen Trityl-

Assay).

Zur Synthese der modifizierten Oligonucleotide wurden die zuvor synthetisierten

Oligonucleotidbausteine in ein spezielles (spitz zulaufendes) Synthesizerfläschchen

überführt und in absolutem Acetonitril gelöst. Die Konzentration der eingesetzten

Phosphoramidite betrug stets 0.1 M. Es wurden die Standard-Chemikalien der

Hersteller eingesetzt. Beim Einbau des modifizierten Amidits wurde das

Kupplungsprotokoll leicht verändert (s. Anhang). Es wurde ein dritter

Kupplungsschritt eingefügt und die Kupplungszeit bei jedem der drei Schritte von 15

auf 500 sec verlängert. Dies konnte die Kupplungsausbeute jedoch nicht über 60%

bei den C8-Addukten (NH und N-Ac) bzw. 80% bei den N2-Addukten steigern und

liegt damit deutlich unter den Ausbeuten der Standardkupplungen, die auch in

diesem Fall ca. 98% betrugen. Alle Synthesen wurden im 1 μM-Maßstab

durchgeführt. Nach den Synthesen wurden die Oligonucleotide unter den im

Folgenden beschriebenen identischen Bedingungen gereinigt, isoliert und

charakterisiert.

4.4.1 Synthese C8-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide

Die letzte DMTr-Schutzgruppe wurde noch am Synthesizer entfernt. Anschließend

wurden die Oligonucleotide manuell mit konzentriertem Ammoniak und

β-Mercaptoethanol vom CPG-Träger abgespalten. Zur Abspaltung der

Schutzgruppen der einzelnen Basen wurde diese Lösung anschließend für 4 h im

Thermomixer bei 45 °C inkubiert und abschließend im Vakuum (Speed-Vac)

aufkonzentriert.[117,118]


101

Die erhaltenen Rohprodukte wurden in Reinstwasser aufgenommen und auf eine

RP-18-Säule gegeben und mit einem Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer,

pH 6.9) und einem Acetonitrilgradienten eluiert. Der Gradient wurde für die

Oligonucleotide so gewählt, dass der (n-1) – Peak des um eine Base kürzeren

Oligonucleotids eindeutig vom Produktpeak zu unterscheiden war. Die

Säulentemperatur betrug 25 °C.

Anschließend wurde das Roh-Oligonucleotid mit dem optimierten Gradienten

gereinigt. Die Absorption wurde bei 260 nm gemessen. Abbildung 98 zeigt

exemplarisch das Roh-Chromatogramm des C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids

189. Der gewünschte Peak wurde in einzelnen Fraktionen gesammelt und

anschließend von jeder Fraktion eine Probe chromatographisch über die HPLC

analysiert. Abbildung 99, S. 102 zeigt exemplarisch das Chromatogramm des

gereinigten C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189. Gleiche Fraktionen wurden

dabei vereinigt und in einem Speed-Vac-Probenkonzentrator bis zur Trockene

eingeengt.

0 10 20 30 40 50 60

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

t [min]

Abb. 98 Rohgemisch des Anilin-modifizierten Oligonucleotids d(GTA[G(Anil)]AATTCTAC) 189


102

0 10 20 30 40 50 6

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0

t [min]

Abb. 99 Isoliertes gereinigtes Anilin-modifiziertes Oligonucleotid d(GTAG(Anil)AATTCTAC) 189

Analoge Trennungen wurden für alle synthetisierten Oligonucleotide durchgeführt.

Die gereinigten und getrockneten Oligonucleotide wurden erneut in je 200 μL

Reinstwasser aufgenommen. Von 20 μL dieser Oligonucleotidlösung wurde nun die

Absorption bei 260 nm (A260) gemessen. Aus dem A260-Wert ließ sich durch

Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor die optische Dichte der Gesamtlösung

(OD260) und daraus die Menge des in den Fraktionen erhaltenen Oligonucleotids

berechnen (s. Abschnitt 8.3.1 S. 159). Die erhaltenen Mengen der modifizierten

Oligonucleotide lagen dabei 4-5fach höher als dieses über die isoButyryl-Strategie

bislang möglich war.

Zur Identifizierung der erhaltenen, sauberen Fraktionen der Oligonucleotide mittels

ESI-MS wurde eine Lösung aus 20% Isopropanol und 1% Triethylamin in Wasser

hergestellt. Die ESI-MS Messungen wurden von Frau Christine Christ, unter der

Anleitung von Dr. Stefan Franke, mit einer Oligonucleotidkonzentration von 5 pM/ μL

durchgeführt. Mittels dieses Lösungsmittelgemisches gelang eine erfolgreiche

Vermessung und Charakterisierung aller synthetisierten 12mere 56,57 und 183-197.


103

Abbildung 100 zeigt exemplarisch das aufgenommene ESI-MS-Spektrum des

modifizierten Oligonucleotids 189.

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700m /z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

465 532

535

468 621

471 538624

500 544492485414 473 563 628571554424 476 590 632494 584503 514 636519441 573 668416 527425 609459452408406 606 671598 642 664617440 696690

- 8 - 7

- 6

Abb. 100 Spektrum des modifizierten Oligonucleotids 189

Oligonucleotide sind Polyanionen und liegen in größeren Ladungen als -1 vor.

Maximale Ladung des Dodecamers ist -11. Bei den ESI-MS-Spektren muss somit

die m/z mit der dort vorliegenden Ladung multipliziert werden, um die Masse des

Oligonucleotids zu erhalten.

Für die synthetisierten 30mere 58 und 202-208 war eine Vermessung in Hamburg

und die damit verbundene Charakterisierung nicht möglich. Die Charakterisierung

erfolgte mittels ESI-MS-Spektrometrie durch die Arbeitsgruppe von Prof. A. Marx an

der Universität Konstanz.


104

4.4.2 Synthese N2-Arylamin-modifizierter Oligonucleotide

Bei den N2-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden war die Entschützung in konz.

Ammoniak nicht ausreichend, da die modifizierten Nucleotide an der O6-Position

CPE geschützt waren und die Schutzgruppe, obwohl auch sie basenlabil ist, nicht mit

Ammoniak abgespalten werden konnte.

Stengele et al. berichteten über die erfolgreiche Verwendung von

2-(4-Nitrophenyl)ethyl- (NPE) und 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl- (NPEOC)

Schutzgruppen. NPEOC wurde anstelle der Benzoyl- bzw. der iBu-Gruppe zur

Blockierung des N6 am dA und des N2 am dG benutzt und die NPE-Schutzgruppe

wurde zur Schützung der Amidfunktion des dG verwendet.[119] Die Abspaltung (β-

Eliminierung) wurde mit 0.5 M DBU in Acetonitril innerhalb von 6 h bei Rt erfolgreich

durchgeführt. DBU in abs. Pyridin wurde von Uhlmann et al. für die Abspaltung der

NPE-Schutzgruppe an Phosphorsäuretriestern verwendet, wobei sie dort als

Schutzgruppe am Phosphorzentrum diente.[120] 1995 berichteten Pfister et al.

außerdem über die Verwendung von der 2-(4-Nitrophenyl)ethylsulfonyl- (NPES)

Schutzgruppe für Schützungen der 2’-Hydroxygruppe an Ribonucleotiden und deren

erfolgreiche Abspaltung mit DBU in Acetonitril.[121]

Da die CPE-Schutzgruppe eine ähnliche Reaktivität wie die NPE-Schutzgruppe

besitzt, sollte sie sich unter gleichen Bedingungen abspalten lassen. Die

Verwendung von DBU als sterisch anspruchsvolle, nicht nucleophile, aber trotzdem

starke Base bietet noch den weiteren Vorteil, dass das Oligonucleotid nicht von der

festen Phase abgespalten wird und somit die DBU-Salze durch Filtration entfernbar

sind.

Zu Testzwecken wurde das Oligonucleotid 200 hergestellt, um dann die idealen

Bedingungen zur CPE-Abspaltung bestimmen zu können. Zuerst wurde Acetonitril

als Lösungsmittel benutzt und die DBU Konzentration sowie die Temperatur variiert.

Wie in Tab. 13, S. 104 zu erkennen ist, fand nach 24 h Reaktionszeit weder bei 0.1 M

noch bei 0.5 M DBU eine Abspaltung der CPE-Gruppe statt. Auch eine Erhöhung der

Temperatur von RT auf 45 °C brachte in beiden Fällen keinen Erfolg. Die

Verwendung von Pyridin als Alternative zu Acetonitril führte bei 0.1 M DBU ebenfalls


105

zu keinem erfolgreichen Ergebnis. Jedoch konnte mit 0.5 M DBU in Pyridin bei Rt die

CPE-Schutzgruppe ohne störende Nebenreaktionen quantitativ abgespalten werden.

Lösungsmittel Temp. Zeit c (DBU) Abspaltung

Acetonitril Rt 24 h 0.1M Nein

Acetonitril 45 24 h 0.1M Nein

Acetonitril Rt 24 h 0.5M Nein

Acetonitril 45 24 h 0.5M Nein

Pyridin Rt 24 h 0.1M Nein

Pyridin 45 24 h 0.1M Nein

Pyridin Rt 24 h 0.5M JA

Tab. 13 Abspaltungsmethoden der CPE-Gruppe nach der Oligonucleotidsynthese

Nach der CPE-Abspaltung fand die vollständige Entschützung und Abspaltung von

der festen Phase unter den bekannten Bedingungen mit konz. Ammoniak und β-

Mercaptoethanol (4 h bei 45 °C) statt. Anschließend konnten die Reinigungen mittels

HPLC und die anschließende Charakterisierung mittels ESI-MS analog zu den

dargestellten C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden erfolgen.

Mittels dieser Methoden gelang die Darstellung N2-Azoaryl-modifizierter

Oligonucleotide.

In den ESI-Spektren der N2-Hydrazinoaryl-modifizierten Oligonucleotide trat bei der

Charakterisierung das Problem auf, dass nur die Masse des gewünschten

Oligonucleotides plus 40 gefunden wurde. Da eine zusätzliche Acetylgruppe die

Gesamtmasse exakt um 40 erhöhen würde, liegt die Vermutung nahe, dass eine

Acetylierung des Oligonucleotides durch das verwendete Essigsäureanhydrid im

Capping-Schritt bei der chemischen DNA-Synthese stattgefunden hat (vgl. Abb. 97,

S. 97). Da außer der Hydrazinofunktion alle anderen funktionellen Gruppen

geschützt sind, kann die Acetylierung somit nur dort stattgefunden haben. Um diese

Vermutung zu bestätigen, wurde die geschützte N2-Hydrazinophenyl-modifizierte


106

Verbindung 136 mit Essigsäureanhydrid unter den am Synthesizer verwendeten

Bedingungen umgesetzt (s. Abb. 101). Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden

konnte dabei das doppelt acetylierte Produkt 213 erhalten werden.

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

136

HN Ac2O, THF

Rt, 3 h

N

N

N

OCPE

NAc

N

O

OTBDMS

TBDMSO

213

AcN

Abb. 101 Acetylierungsreaktion am N2-Addukt 136

Eine anschließende Abspaltung mit Ammoniak unter den Standardbedingungen (4 h,

45 °C) lieferte das erwartete monoacetylierte Produkt 214 (s. Abb. 102).

N

N

N

OCPE

NAc

N

O

OTBDMS

TBDMSO

213

AcN konz. NH3

45 °C, 4 h

N

N

N

OCPE

NAc

N

O

OTBDMS

TBDMSO

214

HN

Abb. 102 Entschützung des diacetylierten N2-Addukt 213

Die Position der Acetylgruppe konnte dabei mit Hilfe der 2D-NMR-Spektren bestimmt

werden.

Um die Acetylgruppe wieder abzuspalten wurde zuerst die Dauer der normalen

Entschützung mit Ammoniak von 4 auf 24 h verlängert, was jedoch keine Abspaltung

bewirkte. Reddy et al. berichteten über die Verwendung von Methylamin/Ammoniak

1:1 zur Entschützung von Oligonucleotiden, wodurch sich die Reaktionszeit von 4 h

auf 10 min bei 55 °C verkürzen ließ, was auf die größere Nucleophilie des

Methylamins zurückgeführt wurde.[122] Außerdem wurde berichtet, dass mit dieser

Methode die Ausbeute bei der Synthese von Oligoribonucleotiden deutlich gesteigert


107

werden konnte. Bei der testweise durchgeführten Entschützung der N2-

Hydrazinoaryl-modifizierten Dodecamere führte die Anwendung von

Methylamin/Ammoniak 1:1 jedoch wiederum nur zu dem monoacetylierten Produkt

und dies in schlechteren Ausbeuten.

Bei der Verwendung von stärkeren Basen wie 1 N Natriumhydroxidlösung konnte

eine Zersetzung des modifizierten Oligonucleotids beobachtet werden.

Somit scheint eine nachträgliche Abspaltung dieser Acetylgruppe nicht durchführbar.

Zur Darstellung der gewünschten N2-Hydrazinoaryl-modifizierten Oligonucleotide

muss deshalb diese Acetylierung vermieden werden.

Im Jahre 2001 berichtete Greenberg von der Verwendung anderen Reagenzien zum

„cappen“ der Abbruchstränge wie Trimethylessigsäureanhydrid zur Vermeidung

unerwünschter Acetylierungen.[123] Durch dieses Ersetzen des Capping-Reagenzes

gelang es nach analogem Entfernen der Schutzgruppen die N2-Hydrazinoaryl-

modifizierten Oligonucleotide 198, 199 und 209, 210 erfolgreich darzustellen. Eine

Reaktion mit dem Trimethylessigsäureanhydrid konnte auch in geringem Maße nicht

beobachtet werden. Für die synthetisierten N2-Arylamin-modifizierten Oligonucleotide

erfolgte die Charakterisierung mittels ESI-MS-Spektrometrie durch die Arbeitsgruppe

von Prof. A. Marx an der Universität Konstanz. Abbildung 103, S. 108 zeigt

exemplarisch das aufgenommen ESI-MS-Spektrum des modifizierten Oligonucleotids

209.

Eine Alternative zur Verwendung des Trimethylessigsäureanhydrids zur Vermeidung

der Acetylierung wäre das Auslassen des Capping-Schrittes bei allen Schritten nach

dem erfolgten Einbau der N2-Hydrazinoaryl-Modifikation. Dieses hätte jedoch eine

erschwerte Abtrennung der Abbruchstränge zur Folge, weswegen auf die

Anwendung diese Methode verzichtet wurde.


108

416.9 465.9 489.9

547.5

581.8

620.7 665.2 716.5

776.3

847.0

931.8

1035.5

1165.2 1194.5 1313.4

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 5 x10 Intens.

400 600 800 1000 1200 1400 m/z

- 8

- 9

- 10

- 11

- 12

- 13 - 14 - 15

- 16

Abb. 103 ESI-MS-Spektrum des N2-Hydrazinobiphenyl-modifizierten Oligonucleotids 209

Für die Untersuchungen hinsichtlich des Einflusses einer Arylamin-Modifikation lagen

nun, neben den synthetisierten C8-Arylamin-modifizierten Oligonucleotiden, auch die

entsprechenden N2-Azo- und N2-Hydrazino-modifizierten Oligonucleotide in reiner

Form vor.

Zunächst sollte dabei die Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte) erfolgen,

um Aussagen über die thermische Stabilität der modifizierten Oligonucleotide im

Vergleich zu den unmodifizierten machen zu können. Ebenfalls sollten hierüber

Aussagen über den Einfluss unterschiedlicher Arylamin-Modifikationen und

unterschiedlicher Modifikationsarten (C8 und N2) gemacht werden können.


109

4.5 Messung der Schmelztemperaturen (Tm-Werte)

Bei Oligonucleotiden kann durch Messung der UV-Absorption als Funktion der

Temperatur der thermisch induzierte Übergang von einer geordneten, helikalen

Struktur in einen ungeordneten Zustand mit statistischer Verteilung der Konformation

verfolgt werden. Die elektronische Wechselwirkung der π-Systeme der Basen, die in

der helikalen Form in Stapeln senkrecht zur Helixachse angeordnet sind, führt zu

einer deutlichen Reduktion der UV-Absorption, dem hypochromen Effekt

(Hypochromizität).[124]

Beim Erwärmen der Probe sollte der Absorptionswert zunächst langsam, dann

sprunghaft und später wieder langsam steigen. Dieser sigmoide Verlauf resultiert aus

dem Phänomen, dass von einem Startpunkt aus, meistens den Strangenden, die

Denaturierung sehr schnell den Duplex entlang verläuft, da der Zustand eines

Nucleotids die Konformation der benachbarten Nucleotide beeinflusst.

Der Grad der Hypochromizität ist ein Maß für die Basenpaarung und –stapelung der

Sekundärstruktur. Der Wendepunkt der sigmoiden Kurve, bzw. das Maximum der

1. Ableitung, das man durch Auftragung der UV-Absorption gegen die Temperatur

erhält, entspricht dem Schmelzpunkt (Tm-Wert) des Duplexes.

Die in dieser Arbeit synthetisierten und untersuchten Oligonucleotide wurden in

einem 2 μM-Maßstab (2 nmol der komplementären Stränge), in einem 10 mM

Phosphat-Puffer mit 140 mM NaCl und 1 mM EDTA, pH 6.8 vermessen. Die

Messungen wurden in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 80 °C durchgeführt,

wobei jeweils dreimal von 5 °C auf 80 °C erhitzt und dreimal von 80 °C auf 5 °C

abgekühlt wurde. Die Heiz- bzw. Kühlrate betrug hierbei 0.5 °C/min, wobei alle 0.5 °C

ein Datenpunkt aufgenommen wurde. Vor der eigentlichen Messung wurde die

Probelösung zweimal schnell von 5 °C auf 80 °C erhitzt und wieder auf 5 °C

abgekühlt. Die Heiz- bzw. Kühlrate hierbei lag bei 10 °C/min. Mit dieser „Rampe“

wurde die DNA-Struktur zunächst in Einzelstränge auseinander geschmolzen, damit

sie bei der folgenden Abkühlung eine wohldefinierte Struktur ausbilden konnte. Die

Absorption der Probelösung wurde bei einer Wellenlänge von 260 nm verfolgt. Von

der resultierenden sigmoiden Kurve kann das Maximum der 1. Ableitung zur

Bestimmung des Schmelzpunktes berechnet und die einzelnen Werte gemittelt


110

werden. Der so erhaltene Mittelwert wird als Tm-Wert des Duplexes angegeben. Der

Fehler bei dieser Methode beträgt ±1 °C. Eine weitere Möglichkeit den Tm-Wert zu

bestimmen, ist die van’t Hoff’sche Kurvenanalyse. Sie lieferte mit einem Fehler von

±0.5 °C die genaueren Ergebnisse und wurde für die hier angegebenen Werte

verwendet. Zusätzlich dazu lassen sich mittels dieser Methode thermodynamische

Daten (ΔH und ΔS) der Oligonucleotid-Stränge bestimmen.

In Tabelle 14 und Tabelle 15, S. 111 sind die ermittelten Werte für die NarI-Sequenz

aufgelistet.

Oligonucleotid Tm [°C] ΔH [kcal/mol] ΔS [cal/mol/K]

56 (unmod.) 58.2/65[125] -79.1 -267.7

184 (Anil) 50.3 -88.5 -303.0

185 (4-ABP) 40.4 -72.9 -254.8

IQ 58[125] keine Angabe keine Angabe

Tab. 14 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 56 und den an G1-modifizierten NarI-

Oligonucleotiden 184, 185 mit 183 als Gegenstrang

Die dargestellten Tm-Werte wurden für den unmodifizierten Strang 56

5'-d(CTCGGCGCCATC), sowie die modifizierten Stränge 184, 185

5'-d(CTCG*GCGCCATC) mit dem komplementären Strang 183

5'-d(GATGGCGCCGAG) gemessen.

Es ist ein deutlicher Einfluss der beiden Arylamin-Modifikationen auf die thermische

Stabilität zu erkennen. So liegt der Wert für das C8-Anilin-modifizierte Oligonucleotid

184 mit 50 °C bereits 8 °C tiefer als der für das unmodifizierte Oligonucleotid 56.

Einen noch stärkeren Effekt lässt sich bei dem 4-Aminobiphenyl-modifizierten

Oligonucleotid 185 beobachten. Hier reicht eine einzelne Modifikation in dem

vorliegenden 12mer aus, um den Tm-Wert um 18 °C auf 40 °C zu senken. Der Grund

für diesen signifikanten Unterschied muss das polycyclische aromatische System des

4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotids 185 zu sein, welches eine merkliche

Verkrümmung des DNA-Duplexes zur Folge haben könnte. Dieser Einfluss scheint

jedoch nicht in dem Maße für polycyclische, heterocyclische Amine zu gelten. Bereits


111

2007 publizierten Rizzo et al. für die verwendete Sequenz den Einbau des C8-IQ-

modifizierten 2‘-Desoxyguanosin.[125] In Tabelle 14, S. 109 ist vergleichend der von

gemessene Wert mit aufgenommen. Dieser liegt mit 58 °C höher, als die hier

vermessenen modifizierten Oligonucleotide 184, 185. Im Vergleich zu dem hier

vermessenen unmodifizierten Strang 56 scheint also kein Effekt beobachtet werden

zu können. Bei den von Rizzo durchgeführten Messungen betrug dieser Tm-Wert

allerdings 65 °C, so dass also auch dort eine Erniedrigung von 7 °C vorliegt, die dem

Einfluss der Anilin-Modifikation entsprechen würde. Der Unterschied in den

gemessenen Tm-Werten für den unmodifizierten Strang 56 liegt an der Verwendung

eineinhalbfach höherer Salzkonzentrationen von Rizzo et al., welche zu einer

zusätzlichen Stabilisierung des Duplexes führen.

Um eine eventuelle Abhängigkeit des Tm-Wertes von der Lage der Modifikation

innerhalb einer bestimmten Sequenz zu ermitteln, wurden neben der G1-Position

ebenfalls analoge Messungen mit den in G3-Position modifizierten Oligonucleotiden

186-188 durchgeführt. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle 15, wiederum

vergleichend zu dem an dieser Stelle IQ-modifizierten Oligonucleotid,

zusammengefasst.


56 (unmod.) 58.2/65[125] -79.1 -267.7

186 (Anil) 50.3 -47.5 -122.4

187 (4-ABP) 39.2 -47.9 -182.5

188 (4-Anis) 51.4 -65.5 -169.9

IQ 61[125] --- ---

Tab. 15 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 56 und den an G3-modifizierten NarI-

Oligonucleotiden 186-188 mit 183 als Gegenstrang

Auch aus diesen gemessenen Werten ist der unterschiedliche Einfluss der mono-

bzw. polycyclischen aromatischen Modifikation auf die thermische Stabilität zu

erkennen. In diesem Fall haben die monocyclischen Modifikationen der

Oligonucleotide 186 (Anilin) und 188 (4-Anisidin) eine Erniedrigung des Tm-Wertes


112

um 7-8 °C auf 50.3 bzw. 51.4 °C zur Folge. Einen erneut stärkeren Einfluss weist die

polycyclische Modifikation 4-Aminobiphenyl im Oligonucleotid 187 auf. Hier ist, wie

schon bei der analogen G1-Modifikation 185, eine starke Senkung auf 39 °C zu

beobachten.

Insgesamt lässt sich allerdings keine Abhängigkeit des Tm-Wertes durch die Position

(G1 oder G3) einer Arylamin-Modifikation feststellen. Anders ist die Beobachtung von

Rizzo für das an G3 IQ-modifizierte Oligonucleotid. Hier ist, anders als an der G1-

Position, nur eine halb so große Senkung des Tm-Wertes (-4 °C) zu beobachten, was

auf eine Abhängigkeit in der Lage einer solchen Modifikation innerhalb eines

Oligonucleotidstranges hindeutet.[125]

Um weitere Informationen über den Einfluss der Arylamin-Modifikationen zu erhalten,

wurden analoge Messungen auch für die selbstkomplementäre Sequenz 57

5'-d(GTAGAATTCTAC) und den an der G2-Position modifizierten Strängen 189-195

und 198-201 5'-d(GTAG*AATTCTAC) gemacht. Die Ergebnisse dieser Messungen

sind in Tabelle 16 dargestellt.


57 (unmod.) 42.1 -74.4 -269.5

189 (Anil) 29.5 -88.9 -323.1

190 (4-Anis) 25.5 -90.7 -276.1

191 (4-Tol) 23.2 -50.2 -142.0

192 (4-Cyano) 23.7 -70.5 -212.4

193 (3,5-DMA) 24.0 -80.7 -243.4

194 (4-ABP) 23.9 -87.5 -267.5

195 (2-AF) 23.3 -56.5 -164

198 (N2-Hydr. Anil) --- --- ---

199 (N2-Hydr. 4-ABP) --- --- ---

200 (N2-Azo Anil) --- --- ---

201 (N2-Azo 4-ABP) --- --- ---

Tab. 16 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 57 und den an G2-modifizierten

Oligonucleotiden 189-195 und 198-201


113

Wie schon erwartet, sind auch hier die Tm-Werte für die modifizierten Oligonucleotide

niedriger als für den unmodifizierten Referenzstrang 57, der einen Tm-Wert von 42.1

°C aufweist. Dabei lässt sich generell erkennen, dass eine zweite Modifikation

nahezu eine Verdopplung des Effektes bewirkt, wie er bei den Strängen mit einer

monocyclischen Modifikation zu beobachten war. Der geringste Einfluss ist dabei für

das C8-Anilin-modifizierte Oligonucleotid 189 zu erkennen. Hier konnte eine

Senkung, verursacht durch die beiden Modifikationen, des Tm-Wertes um 13 °C auf

29.5 °C beobachtet werden. Für alle weiteren C8-Arylamin-modifizierten

Oligonucleotide 190-195 ist diese Senkung in stärkerem Maße zu beobachten. Die

hierfür gemessenen Tm-Werte liegen im Bereich von 23.2 - 25.5 °C und lassen in

diesem Fall keinen Unterschied im Einfluss poly- bzw. monocyclischer Modifikationen

erkennen.

Einen großen Unterschied machen die N2-modifizierten Oligonucleotide 198-201. In

der vorliegenden selbstkomplementären Sequenz konnte in keinem Fall eine

Paarung des DNA-Stranges beobachtet werden, was auf eine deutlich größere

Destabilisierung dieser Modifikationen gegenüber der analogen Modifikation an der

C8-Position hindeutet. Dabei scheint die Art der Modifikation (N2-Hydrazinoaryl oder

N2-Azoaryl) keine Rolle zu spielen. Ebenso lässt sich zunächst keine Aussage über

einen möglichen unterschiedlichen Einfluss poly- bzw. monocyclischer Modifikationen

machen.

Neben den Modifikationen an der G2-Position sollte exemplarisch eine poly- bzw.

monocyclische Modifikation an der G1-Position eingeführt werden. Die Ergebnisse

der Tm-Wert-Messungen sind in Tabelle 17 zusammengefasst.


57 (unmod.) 42.1 -74.4 -269.5

196 (Anil) 35.0 -81.2 -237.1

197 (4-ABP) 30.9 -88.1 -263.1

Tab. 17 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 57 und den an G1-modifizierten

Oligonucleotiden 196-197


114

Auch bei diesen Messungen ist augenscheinlich eine Senkung des Tm-Wertes zu

erkennen. Diese ist jedoch im Vergleich zu den Modifikationen in der G2-Position

deutlich geringer, was auf die ohnehin schwächere Basenpaarung an den Enden des

DNA-Doppelstranges zurückzuführen ist. Für das C8-Anilin-modifizierte

Oligonucleotid 196 liegt der gemessene Tm-Wert mit 35 °C lediglich 7.1 °C niedriger

als für den unmodifizierten Strang 57. Ein Unterschied im Einfluss auf die thermische

Stabilität ist hier für die polycyclische Modifikation zu erkennen. So erfolgt eine

deutliche größere Destabilisierung durch die C8-4-Aminobiphenyl-Modifikation auf

30.9 °C. Diese Beobachtung stimmt also mit den für die NarI-Sequenz erhaltenen

Ergebnissen überein.

Um diese Ergebnisse weiter zu bestätigen und den Einfluss der N2-Modifikation auf

die thermische Stabilität zu untersuchen, wurden diese Modifikationen ebenfalls in

ein nicht selbstkomplementäres 30mer-Oligonucleotid eingebaut. Die Ergebnisse der

Tm-Wert-Messungen sind in Tabelle 18 dargestellt.


58 (unmod.) 62.3 -67.5 -232.9

203 (Anil) 62.2 -131.7 -361.1

204 (4-Anis) 62.3 -120.6 -389.3

205 (4-Tol) 62.6 -72.7 -246.2

206 (3,5-DMA) 59.0 -89.4 -238.5

207 (4-ABP) 58.7 -72.3 -299.6

208 (2-AF) 59.2 -55.3 -197.7

209 (N2-Hydr. Anil) 60.8 -67.5 -173

210 (N2-Hydr. 4-ABP) 59.8 -53.1 -188.1

211 (N2-Azo Anil) 60.5 -71.5 -214

212 (N2-Azo 4-ABP) 59.2 -62.9 -218.2

Tab. 18 Tm-Werte und thermodynamische Daten von 58 und den modifizierten

Oligonucleotiden 203-212 mit 202 als Gegenstrang

Aus den Werten lässt sich klar der Unterschied in dem Einfluss der verschiedenen

Modifikationen auf die thermische Stabilität erkennen. So liegen die Tm-Werte der


115

monocyclischen C8-Modifikationen 203-205 exakt in dem Bereich des

unmodifizierten Stranges 58, welcher einen Tm-Wert von 62.3 °C aufweist. Ein

Einfluss ist lediglich für die Modifikationen mit den starken Carcinogenen, dem 3,5-

Dimethylanilin und den polycyclischen Arylaminen, erkennbar. Diese Modifikation

führen wie erwartet zu einer Senkung des Tm-Wertes, in diesen Fällen um ca. 3 °C

auf 58.7 - 59.2 °C.

Für beide N2-Anilin-Modifikationen kann eine Reduktion des Tm-Wertes um 2 °C auf

60.5 bzw. 60.8 °C beobachtet werden. Es ist zu erkennen, dass die N2-

Modifikationen in diesen Fällen einen höheren Effekt haben, als die entsprechende

C8-Modifikation (hier war keine Änderung des Tm-Wertes zu erkennen). Dabei

scheint es keine Rolle zu spielen, ob eine N2-Hydrazinoaryl- oder N2-Azoaryl-

Modifikation vorliegt.

Auch für die N2-Modifikation lässt sich beobachten, dass die polycyclische

Modifikation, in diesem Fall 4-Aminobiphenyl, einen höheren Einfluss und damit ein

stärkeres Absenken des Tm-Wertes im Vergleich zur monocyclischen Modifikation,

hier Anilin, ausübt. So ist für beide N2-4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotide

210 und 212 eine Senkung des Tm-Wertes um ca. 3.5 °C zu beobachten. Auch hier

ist kein signifikanter Unterschied zwischen der N2-Hydrazino- oder N2-Azo-

Modifikation zu erkennen.

Alle durchgeführten Messungen geben erste Hinweise darauf, dass der Einfluss auf

die thermische Stabilität durch polycyclische Arylamin-Modifikationen höher ist, als

durch monocyclische Modifikationen. Auch scheint der Einfluss abhängig von der Art

der Modifikation zu sein, so haben die N2-Modifikationen einen höheren Einfluss als

die korrespondierenden C8-Modifikationen.

Um Aussagen über den Einfluss der Modifikationen auf die Konformation des DNA-

Duplexes machen zu können, wurden Untersuchungen mittels circularer Dichroismus

durchgeführt. Die Ergebnisse sollen im Folgenden gezeigt und diskutiert werden.


116

4.6 Messung des circularen Dichroismus

Links und rechts zirkular-polarisiertes Licht wird beim Durchtritt durch ein optisch

aktives Medium unterschiedlich stark absorbiert - dieser Effekt wird als Zirkularer

Dichroismus bezeichnet (CD). Beim CD-Experiment bestimmt man also nicht nur die

spezifische Drehung, sondern man misst auch die Intensitätsunterschiede von links-

und rechts-linear polarisiertem Licht.

Zum CD-Effekt kommt es durch Wechselwirkungen der helikalen Struktur des

zirkular-polarisierten Lichtes mit den Gruppen um ein asymmetrisches C-Atom. Ein

Maximum im CD-Spektrum ist für das eine Enantiomer positiv, für das andere

negativ. Durch die CD-Spektroskopie ist somit eine Bestimmung der absoluten

Konfiguration möglich. Außerdem gehört sie zu den wichtigsten Methoden zur

Konformationsanalyse von Peptiden und Oligonucleotiden. In

Oligonucleotiddoppelsträngen sind die Nucleobasen als Chromophore konformativ

fixiert, während in Einzelsträngen eine statistische Verteilung der Basenorientierung

vorliegt. Dadurch entsteht eine chirale Doppelhelix. Diese bewirkt im DNA-

Doppelstrang eine Vorzugsrichtung der Nucleobasen gegenüber dem Rückgrat einen

Cotton-Effekt.[126] Abb. 104 zeigt die CD-Spektren der verschiedenen DNA-

Konformationen.

Abb. 104 CD-Spektren der verschiedenen DNA-Konformationen


117

Diese können anhand der charakteristischen Lage der Maxima und Minima

zugeordnet werden. Dabei handelt es sich bei der B-DNA um die natürlich

vorkommende DNA-Konformation, während die A-DNA-Konformation nur in

dehydratisierter DNA und die Z-DNA-Konformation nur in stark salzhaltigen

Lösungen und Sequenzen mit alternierenden Pyrimidin- und Purinbasen vorliegen.

Die CD-Messungen wurden mit der gleichen Lösung durchgeführt wie die Tm-Wert-

Bestimmung. Die Absorption wurde dabei in einem Bereich von 220-350 nm bei einer

Temperatur von 10 °C gemessen. Mit Hilfe dieser Spektren kann analysiert werden,

welche Konformation der DNA bei allen modifizierten Oligonucleotiden im Vergleich

zu dem unmodifizierten Doppelstrang vorliegt.

Die gemessenen CD-Spektren der Oligonucleotide der NarI-Sequenz 56 und 184-

188 mit 183 als Gegenstrang sind in Abb. 105 dargestellt.

220 240 260 280 300 320 340-2

0

2

4 unmod. 56 Anil G1 184 4-ABP G1 185 Anil G3 186 4-ABP G3 187 4-Anis G3 188

mol

are

Elli

ptiz

ität

Wellenlänge [nm]

Abb. 105 CD-Spektren der NarI-Sequenz 56 und 184-188 mit 183 als Gegenstrang

Die CD-Spektren der modifizierten Sequenzen 184-188 zeigen, wie auch das

unmodifizierte Oligonucleotid 56, im Duplex das typische CD-Spektrum einer B-DNA.

Charakteristisch für diese Konformation ist dabei das Maximum bei einer

Wellenlänge von ca. 265 nm sowie das Minimum bei einer Wellenlänge von 250 nm.

Unterschiede zwischen den verschiedenen Modifikationen, sowohl was die Arylamin-

Modifikation als auch die Position betrifft, sind nicht erkennbar. Die Untersuchungen


118

(exemplarisch für das C8-Anilin, das C8-4-Aminobiphenyl und das C8-2-

Aminofluoren-modifizierte Oligonucleotid) für die an der G2-Position modifizierten

selbstkomplementären Oligonucleotide sind im Folgenden dargestellt.

220 240 260 280 300 320 340-4

-2

0

2

4

6 unmod. 57 2-AF 195 4-ABP 194 Anil 189

mol

are

Ellip

tizitä

t

Wellenlänge [nm]

Abb. 106 CD-Spektren der selbstkomplementären Sequenz 57 und der modifizierten

Oligonucleotide 189, 194 und 195

Auch diese CD-Spektren der modifizierten und des unmodifizierten Oligonucleotids

zeigen das eindeutige Vorhandensein einer B-DNA-Konformation. Die Verschiebung

der lokalen Maxima und Minima für die polycyclisch-modifizierten Oligonucleotide

194 und 195 zu höheren Wellenlängen (bathochromer Effekt) lässt sich durch die

Vergrößerung des π-Systems und der damit verbundenen stärkeren Delokalisation

erklären. Analoge Beobachtungen können auch bei den CD-Spektren für die an G1-

Position modifizierten Oligonucleotide der selbstkomplementären Sequenz 57

gemacht werden. Die gemessenen Spektren sind in Abb. 107, S. 119 dargestellt.


119

220 240 260 280 300 320 340

-2

0

2

4

6

8 unmod. 57 Anil 196 4-ABP 197

mol

are

Elli

ptiz

ität

Wellenlänge [nm]

Abb. 107 CD-Spektren der selbstkomplementären Sequenz 57 und der modifizierten

Oligonucleotide 196, 197

Abschließend sollten diese konformativen Untersuchungen ebenfalls für das

synthetisierte 30mer 58 und die entsprechend modifizierten Oligonucleotide 203-212 durchgeführt werden. Abb. 108, S. 120 zeigt die erhaltenen CD-Spektren für die C8-

modifizierten Oligonucleotide 203-208. In Abb. 109, S. 120 sind die Ergebnisse der

CD-Spektren der N2-modifizierten Oligonucleotide 209-212 zusammengefasst. Auch

diese CD-Spektren des unmodifizierten und der modifizierten Oligonucleotide zeigen

das Vorliegen einer B-DNA-Konformation. Auch in diesen Fällen ist kein Unterschied

in der Lage der Maxima bzw. Minima zwischen den Spektren des unmodifizierten

und der modifizierten Dublices erkennbar.


120

220 240 260 280 300 320 340-10

-5

0

5

10 unmod. 58 Anil 203 4-Anis 204 4-Tol 205 3,5-DMA 206 4-ABP 207 2-AF 208

mol

are

Elli

ptiz

ität

Wellenlänge [nm]

Abb. 108 CD-Spektren der 30mer-Sequenz 58 und der C8-modifizierten

Oligonucleotide 203-208 mit 202 als Gegenstrang

220 240 260 280 300 320 340

-5

0

5

unmod. 58 N2 Hydr. Anil 209 N2 Hydr. 4-ABP 210 N2 Azo Anil 211 N2 Azo 4-ABP 212

mol

are

Ellip

tizitä

t

Wellenlänge [nm]

Abb. 109 CD-Spektren der 30mer-Sequenz 58 und der N2-modifizierten

Oligonucleotide 209-212 mit 202 als Gegenstrang

Zusammenfassend kann aus den aufgenommenen CD-Spektren geschlossen

werden, dass die hier angewandte CD-Spektroskopie keinen Hinweis auf strukturelle


121

oder auf die unterschiedliche Interaktion mit Enzymen

esultierenden Ergebnisse sollen im Folgenden aufgezeigt und diskutiert

erden.

.7 Restriktionsabbau mittels EcoRI

den

ntsprechenden Tetra- bzw. Octameren abgebaut werden können (s. Abb. 110).

C T A C-3'

3'-C A T C T T A A G A T G-5'

Veränderungen der DNA durch Modifikation eines 2‘-Desoxyguanosin liefert. So kann

kein konformativer Einfluss einer C8- oder einer N2-Modifikation erkannt werden. Die

Unterschiede in der Carcinogenität sind demnach auf lokale strukturelle

Veränderungen

zurückzuführen.

Um diese Vermutung zu stützen, sollten erste Informationen über die Interaktion mit

Enzymen, am Beispiel des Restriktionsenzyms EcoRI sowie verschiedener

Polymerasen, durch verschiedene Assays erhalten werden. Abschließend sollten

erste Experimente zur Kristallisation und damit zur Strukturuntersuchung solcher

modifizierten Oligonucleotide erfolgen. Die durchgeführten Experimente und die

daraus r

w

4

Um den Einfluss der Modifikation auf die Restriktion durch das EcoRI-Enzym

untersuchen zu können, wurde die von Seela et al. beschriebene Sequenz 57

verwendet.[127] Diese selbstkomplementäre Sequenz beinhaltet die Erkennungs-

sequenz für EcoRI und sollte somit mittels diesem durch Restriktion zu

e

5'-G T A G A A T T 5'-

3'-C A T C T T A A-5'

5'-A A T T C T A C-3'

3'-G A T G-5'

EcoRI G T A G-3'

Rt

ATCTTAA-5'5'-GTAG-3' 3'-C Abb. 110 Restriktionsabbau des Oligonucleotids 57 mittels EcoRI

Zunächst sollten die experimentellen Bedingungen für diesen Test am Beispiel des

unmodifizierten Oligonucleotids 57 etabliert werden. Dabei sollte die Temperatur

20 °C betragen, um auch diesen Test mit den modifizierten Oligonucleotiden 189-197


122

litative Versuche durchgeführt.

ab. 19 fasst die erhaltenen Ergebnisse zusammen.

Puffer (pH 7.5) Units EcoRI Restriktion

durchführen zu können. Da diese teilweise einen Tm-Wert von 23 °C besitzen war es

wichtig eine geringere Temperatur während des Restiktionsassays einzuhalten, um

das Vorliegen der DNA-Doppelstränge zu gewährleisten. Optimiert werden sollten

dabei das verwendete Puffersystem, sowie die für den Abbau benötigte Menge

(Units) des EcoRI-Enzym. Um festzustellen, ob eine Restriktion unter den gewählten

Bedingungen erfolgt, wurden zunächst lediglich qua

T

Tris/HCl 100 nein

Tris/HCl 270 nein

DTE 100 nein

DTE 270 nein

DTT 100 nein

DTT 270 ja Tab. 19 Zusam riktionsassay

am unmodifizierten Oligonucleotid 57 bei 20 °C

on 270 Units Enzym gelang der gewünschte Abbau des

menfassung der Reaktionsoptimierung des Rest

Zunächst wurden die von Seela für einen solchen Abbau beschriebenen

Bedingungen angewendet.[127] Hierbei konnte auch durch die Verwendung von 270

Units EcoRI Enzym keine Restriktion erreicht werden.[128] Ursache hierfür könnte die

Temperatur von 20 °C sein, da Seela seine Experimente bei einer Temperatur von

37 °C durchgeführt hat. Dieses könnte eine Verringerung der Enzymaktivität, bis hin

zur vollkommenen Inaktivität zur Folge haben. Da die Enzymaktivität ebenfalls durch

die Verwendung anderer Puffersysteme beeinflusst werden kann, wurden ebenfalls

DTE- und DTT-Puffersysteme verwendet.[129,130] Auch bei der Verwendung des DTE-

Puffers konnte weder unter der Zugabe von 100 bzw. 270 Units des EcoRI-Enzyms

eine Restriktion beobachtet werden. Erst durch die Verwendung eines DTT-Puffers

und der Zugabe v

Oligonucleotids 57.

Für den Abbau wurden zunächst je 0.4 OD des Oligonucleotids in 100 μL eines DTT-

Puffers (pH 7.5) gelöst und für 2 Minuten auf 70 °C erhitzt. Nach Abkühlen auf 20 °C


123

matogramme zu verschiedenen Zeitpunkten bei dem Abbau des Oligonucleotids

57.

Abb. 111 Restriktionsabbau des unmodifizierten Oligonucleotids 57

, die Halbwertszeit für

nschließend graphisch die Halbwertszeit ermittelt werden(s. Abb.

112, S. 124):[131]

μ [Fläche d(GTAG)][ C AATTCTAC)orig.]

Olig leo=

folgte die Inkubation mit 270 Units EcoRI. Nach gewählten Reaktionsdauern wurden

Aliquote entnommen und mittels der HPLC vermessen. Abb. 111 zeigt die erhaltenen

Chro

10 20 -0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10 t=0h t=1h t=2h t=3h t=5h

t [min]

Aus den dargestellten Chromatogrammen ist deutlich die Abnahme des 12mer-

Peaks zu erkennen, welcher bei andauernder Inkubation mit dem Enzym immer mehr

abnimmt, während im Gegensatz dazu die Fläche des 4-mers und des 8-mers größer

werden. Mittels der erhaltenen Chromatogramme ist es möglich

den Restriktionsabbau des Oligonucleotids 57 zu berechnen.

Mittels der anhängenden Formeln konnte die Menge an abgebautem Oligonucleotid

berechnet und a

M gespaltenes ε260[GTAGAATTCTA ]][μM d(GTAG

onuc tid [(Gesamtfläche) * [ε260[d(GTAG)]]]


124

μM Ausgangsm Oligonucleotid

X =

μM Ausgangsmenge Oligonucleotid

enge Oligonucleotid - μM gespaltenes

Abb. 112 Graph zur Berechnung der H lbwertszeit τ ½ des Oligonucleotids 57

tion handelt, ist k die negative

exemplarisch

ie Chromatogramme des C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189.

y = 2.4572e

2.5

2

a

Da es sich hierbei um eine Reak erster Ordnung

Hochzahl und es folgt daraus: τ ½ = ln 2 / k

= 2.45 h

Somit erhält man eine Halbwertszeit von 2.45 h.

Analoge Versuche wurden für die an der G2-Position modifizierten Oligonucleotide

189-195 durchgeführt. Diese direkt an der Schnittstelle modifizierten Oligonucleotide

werden im Gegensatz zu dem unmodifizierten Oligonucleotid auch nach einer

Inkubationszeit von 76 Stunden nicht gespalten. Abb. 113, S. 125 zeigt

d

-0.2825x 1.5ln [x]

1

0.5

00 1 2 3 4 5 6

t [h]


125

10 20 -0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25 t=0h t=1h t=5ht=24ht=76h

t [min]

Abb. 113 Restriktionsabbau des G2-C8-Anilin modifizierten Oligonucleotids 189

Hier wird ein erster immenser Einfluss einer C8-Arylamin modifizierten 2‘-

Desoxyguanosinbase deutlich. Durch diese Modifikation scheint es dem

Restriktionsenzym EcoRI nicht mehr möglich zu sein an den Oligonucleotid-

Doppelstrang zu binden und die enzymatische Spaltung durchzuführen. Diese

Beobachtung ist dabei unabhängig von der aromatischen Modifikation.

Neben der Modifikation der Guanosinbase an der Schnittstelle des EcoRI-Enzyms

sollte untersucht werden, ob auch eine C8-Arylamin-Modifikation außerhalb dieser

Schnittstelle einen Einfluss auf die Aktivität des Enzyms hat. Dazu wurden

exemplarisch die an G1-modifizierten Oligonucleotide 196 (C8-Anilin-modifiziert) und

197 (C8-4-Aminobiphenyl-modifiziert) untersucht. Bei diesen analog durchgeführten

Experimenten konnte auch für diese modifizierten Oligonucleotide eine Spaltung

beobachtet werden. Die Chromatogramme des Verdaus des Oligonucleotid 197 sind

exemplarisch in Abb. 114, S. 126 dargestellt.


126

10 20-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h

t [min]

Abb. 114 Restriktionsabbau des G1-C8-4-Aminobiphenyl modifizierten Oligonucleotids 197

Aus diesen Chromatogrammen ist der Abbau des Oligonucleotids 197 klar zu

erkennen. Die Abnahme des durch das 12mer hervorgerufenen Peaks führt in

diesem Fall nur zu Entstehung eines weiteren Peaks (nach kompletten Verdau ist nur

dieser zu erkennen). Dieser wird nicht nur durch das entstehende Octamer, sondern

auch durch das Tetramer welches die Modifikation beinhaltet, verursacht. Analoge

Beobachtungen konnten auch bei dem Abbau des Oligonucleotids 196 gemacht

werden.

In beiden Fällen war eine Berechnung der Halbwertszeit möglich. Tabelle 20 fasst die

Ergebnisse im Vergleich zum unmodifizierten Oligonucleotid 57 zusammen.

Oligonucleotid t1/2 [h]

57 (unmod.) 2.5

196 (Anil) 6.5

197 (4-ABP) 3.4

Tab. 20 Zusammenfassung der berechneten Halbwertszeiten

des EcoRI-Restriktionsverdaus


127

Aus den erhaltenen Werten ist deutlich der Einfluss der Modifikationen auf die

Enzymaktivität zu erkennen. Auch außerhalb der Erkennungssequenz des EcoRI-

Enzyms ist eine Verminderung der Enzymaktivität zu beobachten. So beträgt die

Halbwertszeit für das C8-4-Aminobiphenyl-modifizierte Oligonucleotid 197 mit 3.4 h

nahezu das 1.5-fache wie für das unmodifizierte Oligonucleotid 57. Deutlicher ist der

hemmende Einfluss für die monocyclische Modifikation des Oligonucleotids 196. Für

dieses C8-Anilin-modifzierte Oligonucleotid ist mehr als eine Verdopplung der

Halbwertszeit auf 6.5 Stunden zu beobachten. Somit scheint der Effekt einer

Grenzcarcinogen-modifizierten Guanosinnucleobase größer zu sein, als das einer in

C8-Position mit einem starken Carcinogen modifizierte Guanosinbase.

Dieses unerwartete Ergebnis lässt sich bislang nicht erklären, gibt jedoch einen

ersten Hinweis darauf, dass der Unterschied in der Carcinogenität mono- und

polycyclischer aromatischer Amine durch unterschiedliche Interaktionen mit Enzymen

verursacht werden könnte.

Um einen weiteren Einblick und eine mögliche Bestätigung dieser Überlegung zu

erhalten, wurden in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Andreas Marx,

Universität Konstanz, erste Primer-Verlängerungs-Experimente durchgeführt. Die

ersten Ergebnisse hierzu sollen im Folgenden aufgezeigt werden.

4.8 Primer-Verlängerungs-Untersuchungen

Mit Primer-Verlängerungs-Untersuchungen sollte der Einfluss von C8-Arylamin-

Modifikationen am 2’-Desoxyguanosin in Oligonucleotiden auf die Selektivität

verschiedener DNA-Polymerasen untersucht werden.

DNA-Polymerasen lassen sich nach Strukturhomologien in mindestens sechs

Familien einteilen, darunter Familie B (z.B. Pfu), Familie X (z.B. Pol β) und Familie Y

(z.B. Dpo4). Die DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Pfu) arbeitet mit einer

extrem hohen Genauigkeit. Da sie zusätzlich noch thermostabil ist, wird sie häufig für

die PCR verwendet.[132]


128

Pol β ist eine Polymerase, die durch Basen-Excisions-Reparatur entstandene

„Löcher“ in der DNA wieder auffüllt. In vitro macht Pol β jedoch vergleichsweise sehr

viele Deletionen und Einbaufehler (ein Fehler pro103 bp).[133] Es wird weiter

angenommen, dass Pol β in der Neurogenese eine entscheidende Rolle spielt und

auch bei der Meiose beteiligt ist.[134]

Dpo4 (Y-Familie) aus Sulfolobus solfataricus wird häufig als strukturelles und

funktionelles Modell für eine DNA-Polymerase der Y-Familie verwendet. Sie ist

ebenfalls eine thermostabile Polymerase, welche eine Fehlerrate von 8 × 10–3 bis 3 ×

10–4 besitzt.[135]

Die in dieser Arbeit synthetisierten, modifizierten Oligonucleotide (58 und 203-208)

sollten nun mit den DNA-Polymerasen aus den drei verschiedenen Familien (Pfu

exo-, Polβ, Dpo4) untersucht werden.

Es wurde untersucht, welche Auswirkungen der Einbau einer C8-Arylamin-

Modifikation in den Templatstrang auf die Genauigkeit beim komplementären

Nucleotideinbau bzw. beim Einbau des darauffolgenden Nucleotids hat.

Für die Versuche zur Einbaugenauigkeit gegenüber dem C8-modifizierten

Desoxyguanosin wurden „standing-start“-Reaktionen durchgeführt. Das heißt, die

DNA-Polymerase ist noch nicht in Bewegung, wenn sie an die zu untersuchende

Stelle kommt. Sie muss dort zuerst an die DNA binden und dann mit der Synthese

beginnen. Dafür wurde ein Primer verwendet, der direkt vor dem

Desoxyguanosinanalogon endet.

Um ein Nucleotid verlängert ist der Primer für die Einbauversuche des

darauffolgenden Nucleotids. Diese Experimente werden im weiteren Verlauf der

Arbeit als „standing-start +1“-Versuche bezeichnet. Hierbei sollte das Nucleotid des

verwendeten Primers, welches sich gegenüber der Modifikation befindet, dem bei

den „standing-start“-Reaktionen bevorzugt eingebauten entsprechen.

Die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Bilder (PAGE) wurden folgendermaßen

beschriftet:

Die Abkürzungen über jeder Bande geben die Art der C8-Modifikation an.

Die Buchstaben unter jeder Bande zeigen, mit welchem dNTP das Reaktionsgemisch

versetzt wurde: C: dCTP, A: dATP, G: dGTP, T: dTTP, N: alle dNTP


129

Zunächst wurden die „standing-start“-Reaktionen exemplarisch mit dem

4-Aminobiphenyl-modifizierten Oligonucleotid 207 und dem 4-Anisidin-modifizierten

Oligonucleotid 204 im Vergleich zum unmodifizierten Referenzstrang 58 mit den

verschiedenen Polymerasen durchgeführt. Zu der Lösung mit dem Reaktionspuffer,

Primer und dem jeweiligen Templat wurden die DNA-Polymerase und das

entsprechende dNTP gegeben. Abb. 115 zeigt die Polyacrylamid-Gele.

Abb. 115 Polyacrylamid-Gele der ersten „standing-start“-Reaktionen

Bei den Reaktionen des unmodifizierten Templat 58 ist für alle drei verwendeten

Enzyme der kanonische Einbau von dCTP zu erkennen. Neben diesem sind lediglich

für die Pfu DNA-Polymerase geringe Fehleinbauten aller drei übrigen Nucleotide zu


130

sehen. Bei der Zugabe aller vier dNTPs ist für das Templat 58 jeweils unabhängig

vom verwendeten Enzym eine vollständige Elongation des Stranges zu beobachten.

Bei den Versuchen der modifizierten Template 207 und 204 mit der Pfu DNA-

Polymerase ergeben sich erste Unterschiede. So ist bei dem 4-Aminobiphenyl-

modifizierten Templat 207 neben dem kanonischen Einbau von dCTP ebenfalls,

wenn auch in geringerer Häufigkeit, der Einbau von dATP zu beobachten. Auffällig ist

der Abbruch bei der Zugabe aller dNTPs nach dem Einbau eines Nucleotids. Es

erfolgt hier keine vollständige Elongation zum 30mer. Diese Beobachtung tritt

ebenfalls beim 4-Anisidin-modifizierten Templat 204 auf. Auch hier erfolgt der

Kettenabbruch nach dem Einbau eines Nucleotids. Unterschiedlich, im Vergleich zum

Templat 207, ist jedoch die Häufigkeit eines nicht-kanonischen Einbaus. Das 4-

Ansidin-Addukt bewirkt einen Fehleinbau von dATP und dTTP. Diese haben jeweils

die gleiche Häufigkeit wie der Einbau des dCTP. Die monocyclische Modifikation hat

also einen größeren Einfluss auf die Genauigkeit der Pfu DNA-Polymerase und führt

zu einer höheren Fehlerrate als die verwendete polycyclische Modifikation im

Templat 207.

Analoge Beobachtungen können auch bei der Verwendung der Dpo4 DNA-

Polymerase gemacht werden. Auch hier erfolgt keine vollständige Elongation der

Template 204 und 207. Erneut kommt es zu dem bereits für die Pfu DNA-Polymerase

beobachteten Kettenabbruch. Ebenfalls ist die Häufigkeit eines Fehleinbaus bei dem

4-Anisidin-modifizierten Templat 204 höher als bei dem entsprechend

4-Aminobiphenyl-modifizierten Templat 207. Insgesamt ist jedoch ein geringerer

Fehleinbau bei der Dpo4 DNA-Polymerase als bei der Pfu DNA-Polymerase zu

erkennen.

In gleicher Häufigkeit wie bei der Dpo4 DNA-Polymerase erfolgt auch der fehlerhafte

Einbau bei der Verwendung der humanen pol β DNA-Polymerase. Auch hier ist der

Anteil des nicht-kanonischen Einbaus von dATP und dTTP bei dem 4-Anisidin-

modifizierten Templat 204 größer als beim 4-Aminobiphenyl-modifizierten Templat

207. Einen Unterschied zu den anderen verwendeten Enzymen besteht bei der

Zugabe aller vier dNTPs. Hier ist in beiden Fällen neben einer vollständigen

Elongation auch das Auftreten eines um ein bzw. zwei Nucleotide verkürzten

Stranges zu beobachten. Die Modifikationen könnten also in diesen Fällen zu einer


131

ein- bzw. zwei-Basendeletion führen, wie sie für heterocyclische Modifikationen

bereits von Rizzo beschrieben worden sind.[136]

Um genauere Aussagen über die Häufigkeit eines nicht-kanonischen Einbaus

machen zu können, wurden weitere „standing-start“-Reaktionen mit den modifizierten

Oligonucleotiden 204-208 durchgeführt. In diesen Fällen wurde neben der humanen

pol β DNA-Polymerase die Dpo4 DNA-Polymerase verwendet. Abbildung 116 zeigt

die erhaltenen PAGE-Gele.

Abb. 116 PAGE-Gele der durchgeführten „standing-start“-Reaktion mit den Oligonucleotiden 58 und 204-208

unter der Verwendung der humanen pol β und der Dpo4 DNA-Polymerase

Bei diesen durchgeführten Versuchen lassen sich die zuvor erhaltenen Ergebnisse

bestätigen. Bei der humanen pol β DNA-Polymerase erfolgt bei dem unmodifizierten


132

Templat 58 einzig der kanonische Einbau von dCTP. Für alle modifizierten Template

204-208 ist eine deutlich geringere Einbaurate zu erkennen. Dabei kommt es bei den

polycyclisch modifizierten Templaten 207 und 208 nur zu einem Einbau von dCTP,

während bei den monocyclischen Templaten 204-206 auch der Einbau von dATP

und, im Falle des 4-Anisidin Adukktes 204, von dTTP zu beobachten ist. Der höhere

Einfluss der monocyclischen Modifikation auf einen nicht-kanonischen Einbau

bestätigt sich auch hier und lässt auf eine Allgemeingültigkeit schließen. Auch scheint

dieser Trend nicht vom Enzym abhängig zu sein. Bei der Verwendung der Dpo4

DNA-Polymerase bestätigen sich wiederum die Unterschiede in der Häufigkeit der

Fehleinbauten. Bei den monocyclischen Modifikationen 204-206 überwiegt erneut

der nicht-kanonische Einbau im Unterschied zu den entsprechend polycyclisch

modifizierten Templaten 207 und 208, wo ein solcher nur mit geringerer Häufigkeit zu

beobachten ist. Allgemein lässt sich erkennen, dass die Dpo4 DNA-Polymerase im

Vergleich zur humanen pol β DNA-Polymerase eine deutlich höhere Häufigkeit von

nicht-kanonischen Einbauten aufweist, was bereits am unmodifizierten Templat 58 deutlich wird. Auch hier kommt es zum Einbau von dATP, dGTP und dTTP.

Um Informationen zu erhalten, welche Effekte solche Modifikationen auf eine weitere

Elongation haben, wurden im Folgenden „standing-start +1“-Versuche durchgeführt.

Hierzu wurde der in den vorigen Versuchen eingesetzte Primer um ein Nucleotid

verlängert. Zum Einen, dem kanonischen Einbau entsprechend, mit dC (F26C) und

zum Anderen, einem nicht-kanonischen Einbau entsprechend, mit dA (F26A).

Anschließend wurden den „standing-start“-Experimenten analoge Reaktionen mit

dem Reaktionspuffer, den beiden Primern, dem jeweiligen Templat und der DNA-

Polymerase sowie dem entsprechenden dNTP durchgeführt. Für diese

Untersuchungen wurden neben der humanen pol β DNA-Polymerase die Dpo4 DNA-

Polymerase verwendet.

In Abb. 117, S. 133 sind die PAGE-Gele der „standing-start +1“-Versuche unter

Verwendung der humanen pol β DNA-Polymerase dargestellt.


133

Abb. 117 „standing-start +1“-Versuche der Template 58 und 203-208 unter Verwendung

der humanen pol β DNA-Polymerase

Bei der Verwendung des F26A-Primers (exemplarisch für einen nicht-kanonischen

Einbau) kann man lediglich bei den polycyclisch modifizierten Templaten 207 und

208 einen weiteren Einbau erkennen. Dieser ist mit dTTP ebenfalls nicht-kanonisch

und führt daher erneut zu einer Mutation, möglicherweise durch das Überspringen (1-

Basendeletion) des im Templat befindlichen T. Für die monocyclisch modifizierten

Template 203-206, sowie für den unmodifizierten DNA-Strang 58 erfolgt ein

Kettenabbruch. Hier kommt es zu keinem weiteren (fehlerhaften) Einbau. Grund

hierfür könnte eine Erkennung des nicht-kanonische Einbaus an der vorherigen

Position durch die Polymerase sein. Die polycyclische Modifikation könnte also einen

Einfluss auf die Exonuclease-Aktivität der humanen pol β DNA-Polymerase haben.

Bei der Verwendung des F26C-Primers (kanonischer Einbau) hingegen kommt es in

allen Fällen zu einer weiteren Elongation. Es wird dabei jeweils mit dATP ein

korrekter Einbau vorgenommen und kein weiterer Einfluss der Modifikation auf die

Polymerase-Aktivität beobachtet.


134

Für die Dpo4 DNA-Polymerase wurden analoge Experimente durchgeführt. Die

Ergebnisse sind in Abb. 118 zusammengefasst.

Abb. 118 „standing-start +1“-Versuche der Template 58 und 203-208 unter Verwendung

der Dpo4 DNA-Polymerase

Bei der Verwendung des F26A-Primers (exemplarisch für einen nicht-kanonischen

Einbau) kommt es bei der weiteren Elongation durch die Dpo4 DNA-Polymerase zu

einem massiven Fehleinbau. So kann in allen Fällen neben dem kanonischen Einbau

von dATP auch der Einbau von dTTP beobachtet werden. Es kommt weiterhin zu

keinem Kettenabbruch, sondern zum weiteren Einbau von dTTP. Dieses weist auf

eine Ein-Basendeletion hin, welche durch den nicht-kanonischen Einbau des dATP

gegenüber der Modifikation hervorgerufen sein könnte. Auch bei der weiteren

Elongation des F26C-Primers (kanonischen Einbau) durch die Dpo4 DNA-

Polymerase ist eine solche Basendeletion zu vermuten, da es hier ebenfalls nicht nur

zu dem kanonischen Einbau von dATP kommt. Vielmehr ist hier auch eine weitere

Elongation mit dATP zu erkennen. Die höchste Fehlerrate beim Einbau weist dabei

das unmodifizierte Templat 58 auf, was ein Hinweis auf die hohe Ungenauigkeit der


135

verwendeten Dpo4 DNA-Polymerase ist. Die mit der Dpo4 DNA-Polymerase

durchgeführten „standing-start +1“-Versuche lassen keinen Unterschied in dem

Einfluss mono- bzw. polycyclischer Modifikationen erkennen und geben somit keinen

Anhaltspunkt für eine mögliche Erklärung der unterschiedlichen Carcinogenität

solcher Verbindungen.

Allgemein können jedoch aus den durchgeführten Experimenten erste Schlüsse

hinsichtlich der durch die C8-Arylamin-modifizierten dGs verursachten Einflüsse auf

die Replikation gezogen werden. Zum Einen sind diese Einflüsse abhängig von der

verwendeten Polymerase und zum Anderen vom aromatischen System der

Modifikation. So führen Schäden durch monocyclische Arylamine, verglichen mit den

polycyclischen, vermehrt zu einem Fehleinbau. Diese Ergebnisse widersprechen

somit zunächst den im Ames-Test gefundenen Daten. Allerdings ist auch durch

diesen höheren Einfluss die Möglichkeit gegeben, dass diese Art von Modifikationen

in vivo schneller durch Enzyme erkannt und repariert werden. Versuche hierzu sind

Gegenstand zukünftiger Projekte der Arbeitsgruppe von Prof. C. Meier. Ebenso

werden gegenwärtig Versuche mit den N2-modifizierten Oligonucleotiden 209-212

sowie kinetische Messungen der „standing-start“-Versuche durchgeführt, wodurch

weitere Information hinsichtlich des Einflusses solcher Modifikationen auf

verschiedene Polymerasen erhalten werden können.

Sollten sich die hier erhaltenen Ergebnisse bestätigen, so würde der Unterschied in

der Carcinogenität durch die verschieden starke Interaktion der Modifikationen mit

den Enzymen herrühren. Als Ursache dafür kämen strukturelle Unterschiede in

Frage. Da durch die durchgeführten Messungen des Circular Dichroismus keine

konformative Veränderung der modifizierten Oligonucleotide gefunden werden

konnte, sollte eine Methode zur strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide

etabliert werden, um diese in Zukunft untersuchen zu können.

Für solche strukturellen Untersuchungen kommen hauptsächlich drei Methoden in

Frage:

1) Molecular Modelling

2) NMR-Strukturanalyse

3) Kristallisation


136

Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Grundlagen zur Kristallisation und damit zur

strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide geschaffen werden. Diese

Methode erscheint für die gewünschten strukturellen Untersuchungen am besten

geeignet, da zum Einen vergleichsweise wenig Substanz benötigt wird (im

Gegensatz zur NMR-Strukturanalyse), jedoch eine Struktur aufgrund von

gemessenen Datenpunkten berechnet werden kann (im Gegensatz zur

computergestützten Berechnung mittels molecular modelling). Die ersten Versuche

hierzu sollen im Folgenden beschrieben werden.

4.9 Erste Versuche zur Kristallisation von Oligonucleotiden

Die Versuche wurden in Kooperation mit Dr. Markus Perbandt, Universität Hamburg

und dem in Hamburg ansässigen DESY durchgeführt.

Im Gegensatz zu kleinen Molekülen wie Zucker oder Salze, die häufig problemlos

auskristallisieren und sehr regelmäßige Kristalle bilden, kristallisieren die oft sehr

großen DNA-Moleküle mit ihrer unregelmäßigen dreidimensionalen Struktur nur unter

ganz bestimmten Bedingungen, die in Versuchsreihen ermittelt werden müssen.

Für diese Versuche wird eine Oligonucleotid-Lösung mit einer Konzentration von 2.5

mg/mL verwendet. Da zunächst optimale Kristallisationsbedingungen gefunden

werden sollten, wurde zunächst das selbstkomplementäre unmodifizierte

Oligonucleotid 57 für diese Zwecke verwendet. Der erste Schritt ist die Wahl des

richtigen Puffersystems. Das gewählte System sollte die DNA-Moleküle mit dem

negativ geladenen Phosphatrückgrat stabilisieren, jedoch nicht mit dem Duplex in

Wechselwirkung treten oder gar reagieren.

Ziel ist es durch die Wahl eines geeigneten Puffers eine monodisperse Lösung zu

erhalten. D.h., dass sich in der Lösung nur Teilchen einer Größe befinden, in diesem

Fall des DNA-Duplex. Unerwünscht sind Einzelstränge, sowie die Bildung höhere

Aggregate, wie z.B. eine Triplehelix oder das Annealing mehrerer DNA-Duplices

aneinander. Zur Bestimmung der Monodispersität wird die dynamische Lichtstreuung

der Probe vermessen.


137

Bei der dynamischen Lichtstreuung (DLS) handelt es sich um eine Methode, bei der

das Streulicht eines Lasers an einer gelösten Probe analysiert wird. Sie wird am

häufigsten bei Polymeren und Biopolymeren wie zum Beispiel Proteinen angewandt,

um den hydrodynamischen Radius der Moleküle zu bestimmen.

Strahlt man mit einem Laser auf eine gelöste Probe, so wird ca. 1 % des Lichts an

den gelösten Molekülen gestreut. Analysiert man die Intensität des Streulichts unter

einem bestimmten Winkel, so erhält man eine Messgröße, die eine Aussage über die

Molekülmasse der Moleküle erlaubt. Man spricht hierbei zur klaren Unterscheidung

von der dynamischen Lichtstreuung auch von 'statischer Lichtstreuung'.

Da die Moleküle sich in Lösung aber auch bewegen (Brown‘sche

Molekularbewegung), wird die Wellenlänge des gestreuten Lichtes minimal

verändert. Dies hat zur Folge, dass die Intensität des Streulichtes kleine

Schwankungen aufweist. Misst man nun diese Schwankungen im Millisekunden-

Bereich, so spricht man von 'dynamischer Lichtstreuung'. Aus den Schwankungen

kann man die Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle in Lösung bestimmen. Und

kann den hydrodynamischen Radius der Moleküle in Lösung bestimmen.[137]

Mittels solcher Messungen konnte ein Puffersystem gefunden werden, welches alle

genannten Bedingungen erfüllt. Abb.119 zeigt die Ergebnisse der DLS-Messungen

unter der Verwendung eines Natriumcacodylat-Puffers.[138]

Abb. 119 Ergebnisse der DLS-Messung des Oligonucleotids 57 unter Verwendung des Natriumcacodylat-Puffers;

links: zeitabhängige Messung, rechts: berechneter hydrodynamischer Radius

http://de.wikipedia.org/wiki/Streuung_%28Physik%29

http://de.wikipedia.org/wiki/Laser

http://de.wikipedia.org/wiki/L%C3%B6sung_%28Chemie%29

http://de.wikipedia.org/wiki/Polymer

http://de.wikipedia.org/wiki/Biopolymer

http://de.wikipedia.org/wiki/Proteine

http://de.wikipedia.org/wiki/Hydrodynamischer_Radius

http://de.wikipedia.org/wiki/Molek%C3%BCl

http://de.wikipedia.org/wiki/Molek%C3%BClmasse

http://de.wikipedia.org/wiki/Brownsche_Molekularbewegung

http://de.wikipedia.org/wiki/Brownsche_Molekularbewegung

http://de.wikipedia.org/wiki/Diffusion


138

Aus den erhaltenen Daten ist die einheitliche Teilchengröße in der verwendeten

Lösung zu erkennen. Der berechnete hydrodynamische Radius beträgt in diesem

Fall 2.90 nm.

Anschließend erfolgt ein erstes Screening, bei dem eine Reihe von Bedingungen

austestet. Hierzu wurden die Bedingungen käuflich erworbener Kristallisations-Kits

ausgetestet. Zum Einen wurde der Natrix-Screen (s. Anhang) angewendet. Zum

Anderen kam der MPD-Screen (s. Anhang) zum Einsatz. Beide Kits wurden von der

Firma Hampton Research erworben.

Die in diesem Screening ermittelten Bedingungen (0.01M Magnesiumchlorid, 0.5M

HEPES-Puffer pH 7.0, 25% Polyethylenglycolmonomethylether 550), bei denen

Kristallisationskeime gebildet werden, wurden anschließend systematisch durch

Konzentrationsvariationen mittels der hanging drop-Methode optimiert.

Es gibt grundsätzlich zwei verschiedene Methoden zur Kristallisation, die sitting drop-

und die hanging drop-Methode. Bei der hier angewendeten hanging drop-Methode

werden ein paar Mikroliter der Oligonucleotid-Lösung mit einem gleichen Volumen

einer Reservoir-Lösung gemischt, die das Präzipitationsmittel enthält. Ein Tropfen

dieser Mischung wird auf einen Glasträger gegeben, der das Reservoir bedeckt (s.

Abb. 120, S. 139).

Da die Lösung im Reservoir eine höhere Konzentration des Präzipitationsmittels

enthält als der Tropfen (der ja ein Gemisch mit Oligonucleotid ist), tritt im Laufe der

Zeit Wasser von dem Tropfen in das Reservoir über und sowohl die DNA-

Konzentration als auch die Konzentration des Präzipitationsmittels im Tropfen erhöht

sich sukzessive. Dieser Vorgang wird mikroskopisch verfolgt, immer in der Hoffnung,

dass sich Kristallisationskeime bilden.

Für die Vermessung von Kristallen mittels Synchrotronstrahlung[139] (besondere Form

der Bremsstrahlung durch elektromagnetischen Wellen, die tangential zur

Bewegungsrichtung von Elektronen austreten, wenn sie durch ein Magnetfeld

abgelenkt werden) müssen diese neben einer homogenen, möglichst kubischen

Form auch eine Größe von 1 mm pro Seite aufweisen. Abb. 121, S. 140 zeigt einige

für das Oligonucleotid 57 erhaltenen Kristalle.

http://de.wikipedia.org/wiki/Elektromagnetische_Welle

http://de.wikipedia.org/wiki/Elektron

http://de.wikipedia.org/wiki/Magnetfeld


139

Abb. 120 hanging drop-Methode zur Kristallisation von Oligonucleotiden

Zwar wurde mit allen erhaltenen Kristallen eine Vermessung durchgeführt, jedoch

konnte in keinem Fall ein verwertbarer Datensatz erhalten werden. Als mögliche

Gründe hierfür ist neben der Inhomogenität der Kristalle auch die geringe Größe zu

nennen. Zwar konnte anhand der Reflexmuster gezeigt werden, dass es sich um

DNA-Kristalle, und nicht um auskristallisierte Salze des verwendeten Puffers,

handelt, jedoch konnte keine Kristallstruktur des unmodifizierten

selbstkomplementären Oligonucleotids 57 (EcoRI-Sequenz) erhalten werden.


140

Abb. 121 erhaltene Kristalle des Oligonucleotides 57

Um eine Inhomogenität durch die vorliegende Selbstkomplimentarität der

Oligonucleotids 57 auszuschließen, wurde ein entsprechendes Screening mit dem

unmodifizierten DNA-Doppelstrang 58/202 durchgeführt.

Auch hier konnte das Wachstum von ersten Kristallen beobachtet werden.

Gegenwärtig werden die ersten Ansätze zur Optimierung der

Kristallisationsbedingungen für diesen unmodifizierten DNA-Duplex 58/202

durchgeführt. Diese vielversprechenden Kristallisationsansätze werden in

zukünftigen Arbeiten von Frau Sarah Krüger aus der Arbeitsgruppe von Prof. Meier

weiter verfolgt werden.

Zusammenfassung

5. Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit war der Unterschied in der Mutagenität/Carcinogenität von

mono- bzw. polycyclischen aromatischen Aminen zu untersuchen. Diese nach

Metabolisierung unter Bildung von hochreaktiven Nitreniumionen umgewandelten

Verbindungen reagieren mit den Nucleobasen der DNA und führen in

unterschiedlichem Maße zur Bildung von Mutationen. Die Bearbeitung dieses

Themas unterteilte sich dabei in mehrere Punkte.

Um die Auswirkungen solcher Modifikationen in DNA-Doppelsträngen untersuchen

zu können, mussten in einem ersten Teil zunächst die Nucleosid-Addukte hergestellt

und in die entsprechenden Phosphoramidite überführt werden. Als zweiter

wesentlicher Teil dieser Arbeit sollten nach dem erfolgten Einbau in ausgewählte

DNA-Sequenzen die Eigenschaften der modifizierten DNA-Duplices bestimmt und

möglicherweise erste Informationen für den Carcinogenitätsunterschied mono- bzw.

polycyclischen aromatischer Amine erhalten werden.

Zunächst wurde eine Optimierung der Synthese von C8-Arylamin-modifizierten

2‘-Desoxyguanosinaddukten und deren anschließende Überführung in die

modifizierten Phosphoramidite mit einer möglichst basenlabilen Schutzgruppe der

exocyclischen Aminofunktion (zur Verkürzung der Schutzgruppenabspaltung nach

der Oligonucleotidsynthese) vorgenommen. Nach der dreistufigen Darstellung des

geschützten, bromierten Bausteins 63 gelang die Einführung der C8-Arylamin-

Modifikation mittels einer Palladium-katalysierten Kreuzkupplungsreaktion

(Buchwald-Hartwig-Reaktion) in Ausbeuten von 55-91% (s. S. 29). Diese

geschützten Addukte 66-72 konnten in zwei Stufen jeweils komplett entschützt und

anschließend die exocyclische Aminofunktion mit der Formamidin-Schutzgruppe

blockiert werden.

Dabei führten diese Addukte 87-93 zu keiner Konformationsänderung und so lag bei

allen eine anti-Stellung der Nucleobase vor (s. S. 35). Abschließend gelang es diese

Addukte in weiteren zwei Syntheseschritten in die entsprechenden Phosphoramidite

108-114 zu überführen, die Bausteine zur Oligonucleotidsynthese zu generieren und

damit die Allgemeingültigkeit dieser Syntheseroute klar zu belegen unter der

Verwendung der labilen Schutzgruppe der exocyclischen Aminofunktion.

Neben den synthetisierten Arylamin-modifizierten C8-Addukten des 2‘-Desoxy-

guanosin kommen weiteren Addukten eine Bedeutung in der chemischen

141

Zusammenfassung

Carcinogenese zu (s. Abb. 5, S. 9). Die Darstellung der N2-Arylamin-modifizierten

Addukte wurde dabei auf drei verschiedenen Syntheserouten untersucht (s. Kap. 4.2,

S. 41). Eine zunächst durchgeführte Azokupplung eines Nitrosoaryl mit dem

2‘-Desoxyguanosin-Derivat 121 zur Darstellung der N2-Addukte scheiterte.

Ebenfalls erfolglos verlief die Umsetzung des Triflat-Intermediats 123 mit

Phenylhydrazin. Zwar konnte hier das gewünschte Addukt 122 in geringer Ausbeute

hergestellt werden, jedoch bleiben als Ergebnis dieser Syntheseroute mehrere

Probleme bestehen. Zum Einen erwies sich die Zugänglichkeit des Triflat-

Intermediats 123 als sehr schwierig und gelang nur in einer Gesamtausbeute von

2%, was eine Darstellung größerer Mengen nicht möglich macht. Zum Anderen ließ

sich das N2-Addukt 122 nicht in reiner Form isolieren und lag in einem nicht

trennbaren Produktgemisch vor.

Erfolgreich, und damit die erstmalige Darstellung in guten Ausbeuten, verlief der

Syntheseweg mittels einer Buchwald-Hartwig-Reaktion-ähnlichen Synthese unter der

Verwendung des entsprechenden Arylhydrazins und einem an 2-Position bromierten

Baustein 126.

Die dreistufige Darstellung dieses Bausteins gelang dabei mit einer Gesamtausbeute

von 30% und lässt somit auch die Darstellung größerer Mengen zu (s. S. 51). Nach

der Optimierung dieser Kreuzkupplungsreaktion und der erfolgreichen Darstellung

des N2-Adduktes 122 erfolgte die Umwandlung in die entschützte Form 127. Eine

anschließende Schützung mit DMTr verlief in schlechten Ausbeuten und eine

Überführung in das entsprechende Phosphoramidit 129 scheiterte an einer

vermeintlichen Instabilität dieser Verbindung (s. S. 57).

Es gelang im Folgenden eine Stabilisierung des Systems durch die Verwendung

einer O6-Schutzgruppe, welche nach der Oligonucleotidsynthese abgespalten

werden kann. Hierfür wurde die von Pfleiderer etablierte CPE-Gruppe verwendet (s.

S. 59 ff.). Auch hier gelang es den bromierten Baustein 132 in einer guten

Gesamtausbeute von 47% herzustellen. Die Arylmodifikationen konnten dann mittels

der in dieser Arbeit etablierten Kreuzkupplungsreaktion eingeführt werden und die

entsprechenden N2-Addukte 136-139 erstmalig in sehr guten Ausbeuten synthetisiert

werden (s. S. 61). Bei der anschließend für die Addukte 136 und 137 durchgeführten

TBDMS-Entschützung kam es neben der Bildung der gewünschten Produkte 140,

141 auch zur Entstehung der Azoprodukte 142, 143. Diese spielen ebenfalls eine

Rolle in der chemischen Carcinogenese. Das Produktgemisch 140/142 sollten

142

Zusammenfassung

zunächst chemisch quantitativ in die jeweiligen reinen Komponenten 140 bzw. 142

überführt werden, welches jedoch in keinem Fall gelang. Eine Trennung und damit

die saubere Isolierung beider Adduktformen gelang mittels RP-

Säulenchromatographie in guten Ausbeuten (s. S. 66). Anschließend gelang es die

jeweiligen N2-Addukte nach einer durchgeführten DMTr-Schützung in die

Phosphoramidite 148-151 zu überführen und somit erstmalig die Darstellung solch

modifizierter Bausteine für die Oligonucleotidsynthese mittels einer höchst effizienten

Syntheseroute zu ermöglichen. Diese neu etablierte Syntheseroute bietet dabei den

Vorteil, dass neben den N2-Hydrazinoaryl- auch die N2-Azoaryl-Addukte erstmalig

zugänglich sind und die Darstellung der entsprechenden Phosphoramidite auch in

größeren Mengen problemlos zu erzielen ist.

Zur Darstellung der O6-Arylamin-modifizierten Addukte wurden zwei Synthesewege

beschritten. Zunächst sollte die Arylamin-Modifikation mittels einer Mitsunobu-artigen

Reaktion unter Verwendung eines geschützten Hydroxylamin eingeführt werden. Da

jedoch unter keinen gewählten Bedingungen eine Reaktion zu beobachten war (s.

Kap. 4.3.1) wurden Versuche zur Einführung der Modifikation mittels Substitution

unternommen (s. Kap. 4.3.2). Die Darstellung von 2‘-Desoxyguanosinderivaten,

welche eine gute Abgangsgruppe an der 6-Position besitzen, gelang dabei für die

Chloride 166 und 169 sowie das N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-Derivat 173 in

guten Ausbeuten. Jedoch konnte auch hier unter keiner Reaktionsbedingung die

Bildung des gewünschten Produktes beobachtet werden. Eine weitere Einführung

einer Abgangsgruppe bestand in der Schützung der O6-Position mit Benzotriazol. Die

Darstellung des analogen Benzotriazol-geschützten 2‘-Desoxyguanosin-Derivates

174 gelang in einer guten Ausbeute von 63%. Bei den durchgeführten Reaktionen

konnte eine rasche Umsetzung beobachtet werden. Zwar handelt es sich auch bei

diesem Produkt nicht um das gewünschte O6-Addukt, vielmehr konnte das

unerwartete C8-N-Ac-geschützte Addukt 175 isoliert werden (s. S. 90). Durch eine

Optimierung der Reaktionsbedingungen war es möglich, die Ausbeute auf 75% zu

steigern und somit eine neue, einfache und höchst effektive Darstellungsmethode für

C8-N-Ac-geschützte Addukte zu entwickeln. In weiteren vier Syntheseschritten war

die Überführung in das entsprechende Phosphoramidit 179 mit einer

Gesamtausbeute von 45% möglich (s. S. 93). Diese entwickelte Syntheseroute

macht es möglich auch diese Adduktform in zukünftigen Arbeiten weiter auf ihren

Einfluss auf die Eigenschaften der DNA durch gezielte Synthese und Einbau in

143

Zusammenfassung

Oligonucleotide zu untersuchen, was bislang aufgrund einer einfachen fehlenden

Syntheseroute nicht möglich war.

Mit den C8- und N2-modifizierten Phosphoramiditen 108-114 und 148-151 wurden

unter Verwendung eines abgewandelten Standard-Syntheseprotokolls (s. Anhang)

verschiedene, modifizierte Oligonucleotide synthetisiert (s. Kap. 4.4, S. 94 ff.). Für die

C8-modifizierten Oligonucleotide konnten nach einer durch die verwendete labilere

Schutzgruppe verkürzten Abspaltungszeit mit Ammoniak und anschließender

Reinigung mittels HPLC die gewünschten Oligonucleotide mit einer 4-5fach höheren

Ausbeute erhalten werden, als dieses mit der bislang verwendeten isoButyryl-

Strategie möglich war (s. Kap. 4.4.1). Für die N2-modifizierten Oligonucleotide wurde

zunächst eine geeignete Methode zur Abspaltung der CPE-Schutzgruppe unter

Verwendung von DBU etabliert. Nach analog zu den C8-modifizierten

Oligonucleotiden erfolgter Abspaltung mit Ammoniak und abschließender Reinigung

konnten alle modifizierten Oligonucleotide in reiner Form erhalten werden (s. Kap.

4.4.2).

Bei den gewählten Sequenzen handelt es sich zum Einem um die NarI-Sequenz

5'-d(CTCGGCGCCATC), einem Hot Spot für Arylamin-Modifikationen. Hier konnten

C8-Arylamin-Modifikationen erfolgreich in Position 4 und 7 eingebaut werden und

anhand von Schmelzpunktexperimenten und CD-spektroskopischen Untersuchungen

dieser modifizierten Oligonucleotide mit den entsprechenden Antisense-Strängen der

Einfluss der Modifikation auf das Hybridisierungsverhalten oder die Konformation der

entstehenden DNA-Helix festgestellt werden. Dabei bleibt als Ergebnis festzuhalten,

dass die polycyclische C8-Modifikation einen massiven Einfluss auf den Tm-Wert hat

und zu einer deutlicheren Senkung dieses führen. Ein Einfluss eines Schadens auf

die Konformation konnte in keinem Fall beobachtet werden.

Als weitere Sequenz wurde das selbstkomplementäre 12mer

5'-d(GTAGAATTCTAC) gewählt welche eine Erkennungssequenz für das Enzym

EcoRI besitzt. Neben den C8-Addukten wurden erstmals die N2-Addukte eingebaut.

Es konnte hier außer dem Einfluss auf den Tm-Wert und die Konformation auch die

Auswirkungen auf die Aktivität des Restriktionsenzym EcoRI durch einen in dieser

Arbeit etablierten Abbau untersucht werden (s. Kap. 4.7). Aus den Untersuchungen

ging hervor, dass eine N2-Modifikation im Allgemeinen einen größeren Einfluss auf

die Schmelztemperatur hat als die entsprechenden C8-Modifikationen. So war in

keinem Fall eine Duplex-Bildung oberhalb von 5 °C zu beobachten (s. S. 112). Ein

144

Zusammenfassung

Einfluss auf die Konformation war jedoch erneut nicht zu beobachten. Bei den in

Position 1 und 4 C8-modifizierten Oligonucleotiden ergaben sich einige

Rückschlüsse auf den Einfluss solcher Modifikationen auf Enzyme durch den

durchgeführten Restriktionsabbau. Eine Modifikation direkt an der Schnittstelle führt

zu einer kompletten Inaktivität des EcoRI-Enzyms, während eine Modifikation

außerhalb der Schnittstelle immerhin noch eine Erniedrigung der Aktivität zur Folge

hat. Hierbei ist der Einfluss der polycyclischen Modifikation geringer als der eines

monocyclischen Arylamin-Schadens (s. S. 126).

Zur Klärung der Auswirkungen von C8-Arylamin-Addukten auf die Wirkungsweise

verschiedener DNA-Polymerasen wurden modifizierte 30mer-Oligonucleotide mit der

Sequenz 5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) synthetisiert und als

Templat in Primer-Verlängerungs-Untersuchungen mit drei verschiedenen DNA-

Polymerasen (Pfu, Pol β, Dpo4) eingesetzt (s. Kap. 4.8, S. 127). Als Ergebnis dieser

Untersuchungen lässt sich festhalten, dass die C8-DNA-Addukte starker

Carcinogene bei Versuchen eine geringere Rate an Fehleinbauten besitzen, als die

monocyclischen DNA-Schäden. So findet hier für die monocyclischen Modifikationen

neben dem kanonischen Einbau eines dCTPs mit derselben Häufigkeit auch der

nicht-kanonischer Einbau eines dTTPs und dATPs statt (s. S. 129). Somit scheinen

auch in diesen Fällen die monocyclischen Modifikationen einen höheren Einfluss auf

die Enzyme zu haben.

Abschließend wurden erste Versuche unternommen strukturelle Informationen mittels

Kristallisation zu erhalten. Zwar gelang es das selbstkomplementäre Oligonucleotid

57 zu kristallisieren, jedoch waren diese Kristalle zu inhomogen oder wiesen eine zu

kleine Oberfläch auf, um verwertbare Messungen zur Strukturanalyse mittels

Synchrotronstrahlung durchführen zu können (s. Kap. 4.9, S. 136 ff.). Weitere

vielversprechende Ansätze zur Kristallisation des 30mer-Oligonucleotide laufen

zurzeit und waren bei der Beendigung der Arbeit nicht abgeschlossen und werden an

einer anderen Stelle publiziert.

Insgesamt scheinen im Rahmen dieser Arbeit erste Anhaltspunkte für die Ursache

der unterschiedlichen Mutagenität mono- bzw. polycyclischer aromatischer Amine

gefunden worden zu sein. So haben die monocyclischen Modifikationen einen

stärkeren Einfluss auf enzymatische Aktivitäten, was eventuell zu einer schnelleren

Erkennung eines solchen Schadens und damit zu einer schnelleren Reparatur führen

könnte, als dieses für die polycyclischen Modifikationen der Fall ist.

145

Summary

6. Summary

Polycyclic aromatic amines belong to the class of strong chemical carcinogens,

whereas monocyclic aromatic amines are only borderline carcinogens, which act as

carcinogens after a longer exposition or at high concentrations. Until now no reason

for their different carcinogenic potential was found. Both types form covalently

bonded adducts with DNA after metabolic activation. If these damages are not

repaired, they can compromise the fidelity of DNA replication and cause mutations

and possibly cancer. To properly study the mutagenic effects, structure and repair of

these adducts, it was the aim of this thesis, to develop strategies for the site-specific

incorporation of these dG-carcinogen-adducts into oligonucleotides.

The first section of this thesis deals with the synthesis of the arylamine-modified

phosphoramidites. Primary goal was to achieve an optimization of the synthesis of

C8-arylamine-adducts using a base labile protecting group for the exocyclic amino

function of 2’-dG to shorten the period of time for the alkaline cleavage after

oligonucleotide synthesis. The key step for this synthesis was the Pd-catalyzed

Buchwald-Hartwig reaction (see p. 29). After the complete deprotection of these

adducts 66-72 the formamidine group was introduced to block the exocyclic amino

function. After that the compounds 87-93 were converted into the corresponding

oligonucleotide building blocks 108-114 by dimethoxytritylation and phosphitylation.

In the second part of this thesis a synthetic route to the N2-arylamine-adducts was

found. A direct azo-coupling as well as a substitution using a triflated 2’-dG-derivative

123 failed. Again a Pd-catalyzed cross-coupling reaction with the bromide 132 and

the corresponding arylhydrazines was used to introduce the N2-modification (see p.

61). During the subsequently performed deprotection a partial oxidation to the

corresponding azo-products 142, 143 could be observed. The mixture of the two N2-

adduct forms (N2-hydrazino and N2-azo) could be separated using RP column

chromatography (see p. 66). Afterwards a dimethoxytritylation and phosphitylation led

to the desired N2-arylamine modified phosphoramidites 148-151. Therefore a

blocking of the O6-position using a protecting group which could be cleaved after

oligonucleotide synthesis (Pfleiderers CPE-group) was found to be essential to

stabilize the system and for the isolation of these oligonucleotide building blocks.

As a third class of adducts the O6-arylamine modified 2’-dG-derivatives were target

molecules. Unfortunately, the modifications could be introduced neither by a

146

Summary

Mitsunobu-reaction nor by a substitution using different protected hydroxylamines

(see chapter 4.3). When using the O6-benzotriazol protected 2’-dG-derivative 174 a

quick and highly efficient conversion to the unexpected product 175, the C8-N-Ac-

adduct, was observed. In four additional synthetic steps a conversion into the

corresponding phosphoramidite 179 with an overall yield of 20% was achieved and

therewith a new and short synthesis for this type of adduct been developed.

The C8- and N2-modified phosphoramidites 108-114 and 148-151 were incorporated

into three different oligonucleotide sequences.

First the NarI-sequence with a modification in position 4 or 7

5'-d(CTCGGCGCCATC), and a self complementary sequence with a recognition site

for then EcoRI enzyme 5'-d(GTAGAATTCTAC) were used to investigate the effects

of the modification on hybridisation and structure of the resulting DNA-helices. The

result of these CD- and Tm-value studies were that no difference in structure was

observed, but a higher decrease of the polycyclic modifications of the Tm-value. Also

the influence of the N2-modifications compared to the corresponding C8-adducts was

bigger and for these modified oligonucleotides a lower Tm-value was measured.

Using the oligonucleotides of the EcoRI-sequence a restriction assay was performed.

As a result, a total prevention was achieved by modifying the dG-nucleotide at the

cleavage site. When the modification was outside the recognition sequence a higher

influence, leading to a higher half-live, for the C8-monocyclic-adducted

oligonucleotides than for the polycyclic-modified one was observed (see p. 126).

To study the influence of C8-arylamine adducts on the effectiveness of DNA-

polymerases, oligonucleotides of the following sequence were synthesized

5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG) and used as templates in

primer-extension experiments. Three different polymerases were used, Pfu, Pol β

and Dpo4 (see chapter 4.8, p. 127).

The primer-extension experiments with the modified oligonucleotides revealed

differences between the three polymerases and between the modifications. The most

outstanding result is that there is a much more significant introduction of a wrong

base for the monocyclic modifications (dGTP and dATP instead of dCTP) opposite

the modified base. This effect was also observed for the strong-carcinogen adducts,

but was in comparison only very small (see p. 129).

To gain information about the structure of the modified oligonucleotides first

experiments for the crystallization of the oligonucleotide 57 were performed. The first

147

Summary

obtained crystals were too small or too inhomogeneous. Promising experiments for

the crystallization of the 30mer sequence are currently underway in our laboratories

and were not terminated when this thesis was finished.

148

Ausblick

7. Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Reihe modifizierter Oligonucleotide mit

verschiedenen Addukten unterschiedlich starker Carcinogene synthetisiert und

sowohl strukturell als auch molekularbiologisch untersucht. Die dabei erhaltenen

Ergebnisse geben erste Hinweise auf die mögliche Ursache der unterschiedlichen

Carcinogenitäten mono- bzw. polycyclischer Arylamine durch deren unterschiedliche

Interaktion mit verschiedenen Enzymen. Dabei scheinen diese Wechselwirkungen

nicht nur abhängig von der Art des aromatischen Systems, sondern auch von der Art

der Modifikation zu sein. Um weitere Informationen hierüber zu erhalten ist es nötig,

neben zusätzlichen Modifikationen in der N2-Position (z.B. 2-Aminofluoren) auch

einen geeigneten Syntheseweg zur Darstellung der O6-Addukte zu finden. Eine

Alternative zu den in dieser Arbeit nicht erfolgreichen Syntheserouten wäre die

Darstellung dieser Addukte mittels einer Buchwald-Hartwig-Reaktion. In diesem Fall

konnte eine Reaktion eines Arylbromids mit einem entsprechenden

2‘-Desoxyguanosin-Derivat 215 zu dem gewünschten Produkt 216 führen (s. Abb.

122).

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

215

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

216

Pd2(dba)3, rac-BINAP,K3PO4, Aryl-Br,1,2-DME

80 °C

NH2 HNAryl

Abb. 122 mögliche Synthesestrategie zur Darstellung der O6-Arylamin-Addukte

Für die Darstellung eines solchen Kupplungsbausteins 215 bieten sich mehrere

Wege an (s. Abb. 123, S.150).

Zum Einen wäre eine Darstellung ausgehend vom TBDMS-geschützten 2‘-dG 121

denkbar. Durch eine Mitsunobu-Reaktion mit N-Hydroxyphthalimid und

anschließender Reaktion mit Hydrazinhydrat oder Methylhydrazin könnte das

gewünschte Produkt 215 liefern.[140,141]

149

Ausblick

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

215

NH2

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

N

N

N

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

169

Cl

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

121

N

N

N

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

169

Cl

N

N

N

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

169

Cl

1) PhthNOH, PPh3,DIAD (rt)2) CH3NHNH2, CH2Cl2

1) PhthNOH, PPh3,DIAD (reflux)2) H2NNH2

. H2O, EtOH

1) PhthNOH, Et3N, MeCN2) H2NNH2

. H2O, EtOH

1) tBu N-hydroxycarbamat2) CF3COOH

1) NH2OH . HCl, Na2CO3, H2O2) KOH, nBu4NBr3) HCl

Abb. 123 mögliche Synthesen zur Darstellung des Hydroxylamin 215

Zum Anderen wäre eine Darstellung ausgehend vom in dieser Arbeit bereits

synthetisierten Chlorid 169 auf unterschiedlichen Wegen denkbar.[142-144]

Neben der Darstellung der O6-Addukte am 2‘-Desoxyguanosin und den bereits in der

Arbeitsgruppe synthetisierten dA-Addukten könnten auch die Synthesen der an den

Pyrimidin-Basen gefundenen Addukte von Interesse sein. Hier wurden in Versuchen

neben C5-dC-, N4-dC- auch C5-dT-Addukte aromatischer Amine in geringen Mengen

nachgewiesen und identifiziert.[145-147]

Auch die weitere Darstellung und der gezielte Einbau in Oligonucleotide der N-

acetylierten Addukte sollte in zukünftigen Arbeiten eine wichtige Rolle spielen. Dabei

könnte mit Paracetamol (4-Hydroxyacetanilin) auch eine in der Medizin wichtige

Verbindung verwendet werden und die Darstellung der entsprechenden Addukte

wichtige Informationen über die möglichen Nebenwirkungen bei anhaltender

Verabreichung geben.

150

Ausblick

Außer der Synthese modifizierter Phosphoramidite sollte in Zukunft das

Hauptaugenmerk auf den Einbau in Oligonucleotide und die Untersuchungen deren

Eigenschaften gelegt werden. Hierbei sollte neben den bereits in dieser Arbeit

angewandten Methoden (Tm-Wert, CD, Restriktionsabbau, Polymerase-Experimente)

auch die Untersuchung in Repair-Assays möglich gemacht werden, um Aussagen

über die Resistenz der unterschiedlichen Modifikationen gegenüber den

Reparaturmechanismen der Zelle machen zu können.[148] Die beschriebenen

Untersuchungen könnten dabei vergleichend zu einem heterocyclischen DNA-

Schaden, z.B. durch IQ 33, untersucht werden

Eine weitere Möglichkeit, Informationen bezüglich des Verhaltens von dG-Addukten

in biologischen Systemen zu erhalten, könnte beispielsweise die Einführung von

diesen an der Schnittstelle der Topoisomerase 1 (top1) sein (Abb. 124).

5'-AAAAAGACTT-GGAAAAATTTTT TTTTTCTGAA-CCTTTTTAAAAA-3’

Abb. 124 Topoisomerase 1 Schnittstelle

Topoisomerasen sind zusammen mit Helikasen dafür verantwortlich, dass die DNA

nach der Verdoppelung wieder funktionsfähig gemacht wird. Wird beispielsweise die

Topoisomerase 1 blockiert, so ist eine geordnete Weitergabe genetischer Information

für die betroffenen Zellen nicht mehr möglich. Topoisomerase-Hemmer wie z.B.

Camptothecin werden in der Krebstherapie verwendet und können DNA-Brüche, und

damit verbunden, den programmierten Zelltod (Apoptose) auslösen.[149]

Auch die in dieser Arbeit begonnenen Versuche zur Kristallisation und damit zur

strukturellen Analyse modifizierter Oligonucleotide sollte in folgenden Arbeiten

weitergeführt werden.

Als weiteres zukünftiges Projekt wäre eine Anwendung der Synthesen und der

durchgeführten Untersuchungen auf RNA-Ebene vorstellbar. Dieses könnte dann im

Zusammenhang mit einer möglichen Untersuchung der Einflüsse solcher

Modifikationen im Hinblick auf die Translation stehen.

151

Experimentalteil

8. Experimentalteil

8.1 Allgemeines 8.1.1 Lösungsmittel und Reagenzien

Acetonitril: C2H3N [41.05]; Sdp.: 81-82 °C; d = 0.78

a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 0.001%; Fluka Nr.0069

b) zur Synthese; Merck Nr. 800015.

c) technische Qualität; über Calciumhydrid getrocknet und bei

Normaldruck abdestilliert.

Dichlormethan: CH2Cl2 [84.93]; Sdp.: 39-40 °C; d = 1.325

a) technische Qualität; über Calciumchlorid getrocknet und bei


b) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 66749

Diethylether: C4H10O [74.12]; Sdp.: 34.5 °C; d = 0.70

a) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normal-

druck abdestilliert.

1,2-Dimethoxyethan: C4H10O2 [90.12]; Sdp.: 84-86 °C; d = 0.867



N,N’-Dimethylformamide: C3H7N1O1 [73.09]; Sdp.: 153 °C; d = 0.94

a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 0.001%; Fluka Nr.40248

1,4-Dioxan: C4H8O2 [88.10]; Sdp.: 101.5 °C; d = 1.03



Essigsäureethylester: C4H8O2 [88.11]; Sdp.: 77 °C; d = 0.902

a) technische Qualität; über Calciumchlorid getrocknet und bei


n-Hexan: C6H14 [86.17]; Sdp.: 68.7 °C; d = 0.65

a) technische Qualität; über Normaldruck abdestilliert.

Methanol: CH4O [32.04]; Sdp.: 64 °C; d = 0.791


b) puriss. Absolut, über Molsieb, Fluka Nr. 65542

152

Experimentalteil

Petrolether 50-70: ---; Sdp.: 50-70 °C; ---


Pyridin: C5H5N [79.10]; Sdp.: 115 °C; d = 0.980

a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 82704

b) technische Qualität; über Calciumhydriddispersion getrocknet

und bei Normaldruck abdestilliert.

Tetrahydrofuran: C4H8O [72.11]; Sdp.: 65-66 °C; d = 0.890

a) puriss. Absolut, über Molsieb, H2O: 50 ppm; Fluka Nr. 87371

b) technische Qualität; über Kalium getrocknet und bei Normal-


Triethylamin C6H15N [101.19]; Sdp.: 89 °C; d = 0.72

a) technische Qualität; über Natrium getrocknet und bei Normal-


racemisches 2,2´-Bis(diphenylphosphino)-1,1´-binaphthyl:

C44H32P2 [633.70] luftdicht verpackt unter Argon, STREM Nr.

98327-87-8 I

Tris(dibenzylidenaceton)-dipalladium(0):

C51H42O3Pd2 [915.70] luftdicht verpackt unter Argon, STREM Nr.

52409-22-0

EcoRI Enzym: aus Escherichia Coli BS5; fermentas ER 0271; 5000 units

DTT-Puffer (pH = 7.5) für den EcoRI-Restriktionsabbau

Es wurden 190.4 mg Magnesiumchlorid, 1.17 g Natriumchlorid

und 1.21 g Tris in ca. 180 mL Reinstwasser gelöst, mit konz.

Salzsäure auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt und auf 200 mL

aufgefüllt. Anschließend wurden zu 200 mL Puffer noch 15.4 mg

DTT hinzugefügt.

153

Experimentalteil

Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer) pH = 8.0 für die HPLC (EcoRI Abbau)

Es wurden 3.00 mL Eisessig und 5.00 mL Triethylamin sowie

50 mL Acetonitril in ca. 900 mL Reinstwasser gelöst und auf einen

pH-Wert von 8.0 eingestellt und mit Reinstwasser auf 1000 mL

aufgefüllt.

Triethylammoniumacetat-Puffer (TEAA-Puffer) pH = 6.9 für die HPLC (Trennung der

Oligonucleotide)

Es wurden 5.88 mL Eisessig und 10.12 mL Triethylamin in ca.

900 mL Reinstwasser gelöst und auf einen pH-Wert von 6.9

eingestellt und mit Reinstwasser auf 1000 mL aufgefüllt.

Natriumcacodylat-Puffer (10 mM; pH = 7.0)

Es wurden 214.03 mg Natriumcacodylat in 80 mL Reinstwasser

gelöst und auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt. Danach wurden

noch 952.18 mg Magnesiumchlorid hinzugefügt und auf 100 mL

aufgefüllt.

8.1.2 Chromatographie und Geräte

8.1.2.1 Dünnschichtchromatographie (DC)

Es wurden mit Kieselgel beschichtete Aluminiumfolien mit Fluoreszenzindikator

(Merck Nr. 5554; Schichtdicke 0.2 mm) verwendet. Die Platten wurden auf eine Größe

von 1-8 x 10 cm zugeschnitten; die Laufstrecke betrug 5-10 cm. Alle Rf-Werte wurden

bei Kammersättigung ermittelt. Die Detektion der UV-aktiven Substanzen erfolgte mit

einer UV-Lampe bei einer Wellenlänge von 254 nm.

8.1.2.2 Präparative Säulenchromatographie

Substanzgemische mit mehr als 4 g Rohausbeute wurden über eine Säule mit

leichtem Überdruck aufgereinigt. Als Trennmaterial wurde Kieselgel mit einer

Korngröße von 63-200 µm (Baker Nr. 0253) verwendet.

154

Experimentalteil

8.1.2.3 Zirkulare präparative Dünnschichtchromatographie (Chromatotron)

Substanzgemische mit weniger als 4 g Rohausbeute wurden über eine Platte mit einer

Schichtdicke von 1-4 mm aufgereinigt. Als Trennmaterial wurde Kieselgel Merck Typ

7749 mit Gipszusatz und Fluoreszenzindikator verwendet.

8.1.2.4 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die Hochleistungflüssigkeitschromatographie wurde an einer Merck-Hitachi-Anlage

durchgeführt.

Software: Chromatography Data Station Software

HPLC System Manager Version 3.1.1.

Interface: Model L-7000

Pumpe: Model L-7100

Automatischer Probenwechsler: Model L-7200

Dioden Array Detektor: Model L-7455

Säule: RP-18 endcapped 5 μm Li Chrosphor 100,

EcoCART 125-3

HPLC-Methoden:

Methode A: Reinigung (12mere)

Acetonitril-Gradient von 0-23% in TEAA-Puffer (pH 6.9) bis 50 Minuten, dann 100%

Acetonitril für 5 Minuten und abschließend 100% TEAA-Puffer für 10 Minuten.

Methode B: Reinigung (30mere)

Acetonitril-Gradient von 0-26% in TEAA-Puffer (pH 6.9) bis 50 Minuten, dann 100%

Acetonitril für 5 Minuten und abschließend 100% TEAA-Puffer für 10 Minuten.

Methode C: Enzymatischer Abbau durch EcoRI

Acetonitril-Gradient von 0-25% in Triethylammoniumacetat-Puffer (pH 8.0) bis

20 Minuten, dann für 5 Minuten 100% Acetonitril und abschließend 100%

Triethylammoniumacetat-Puffer für 10 Minuten.

155

Experimentalteil

8.1.2.5 Kernresonanzspektroskopie (NMR)

Die NMR-Spektren wurden in der spektroskopischen Abteilung der Universität

Hamburg aufgenommen. Es standen folgende Geräte zur Verfügung:

1H-NMR:

Bruker AMX 400 (400 MHz), Bruker DMX 500 (500 MHz), Bruker AV 400 (400MHz)

Die Standardisierung erfolgte gegen DMSO-d6 (δ= 2.50 ppm) und C6D6 (δ= 7.26 ppm). Die

Aufnahmen erfolgten bei 400 MHz in 5-mm-Röhrchen über einen Messbereich von 0

bis 14 ppm.

13C-NMR:

Bruker AMX 400 (101 MHz), Bruker AV 400

Die Standardisierung erfolgte gegen DMSO-d6 (δ= 39.52 ppm) und C6D6 (δ= 128.0 ppm).

Die Aufnahmen erfolgten bei 100.6 MHz in einen Messbereich von 0 bis 220 ppm.

31P-NMR:

Bruker DMX 500 (202 MHz).

Die Standardisierung erfolgte gegen einen externen Standard (85% Phosphorsäure).

Zur Wiedergabe der Multiplizitäten in den 1H-, 13C- und 31P-NMR-Spektren finden

folgende Abkürzungen Verwendung:

s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quadruplett, quin = Quintett, sept = Septett,

m = Multiplett.

Die Zuordnung der Signale erfolgte durch die Aufnahme zweidimensionaler Spektren

(H,H-COSY; HSQC; HMBC; NOESY; TOCSY).

8.1.2.6 Massenspektrometrie (MS)

Die FAB-Massenspektren wurden an der Universität Hamburg mit einem

doppelfokussierenden Spektrometer VG/70-250 F der Firma VG Analytical gemessen.

Als Stoßgas wurde Xenon, als Matrix wurde m-Nitrobenzylalkohol verwendet.

Die EI-Massensprektren wurden an der Universität Hamburg mit einem

doppelfokussierenden VG Analytical VG/70-250S-Spektrometer aufgenommen.

Die ESI-Massenspektren wurden an der Universität Hamburg mit einem ThermoQuest

Spektrometer der Marke Finnigan, Modell MAT 95 XL gemessen.

156

Experimentalteil

8.1.2.7 Schmelzpunktbestimmung

Die Schmelzpunkte wurden mit einem Schmelzpunkt-Bestimmer apotec der Firma

Otto Stein ermittelt.

8.1.2.8 Infrarot-Spektrometer

Die IR-Spektren wurden an einem IR-Spektrometer AVATAR 370 FT-IR bei

Raumtemperatur in einem Messbereich von 400 - 4000 cm-1 aufgenommen. Die

Substanzen wurden als KBr - Presslinge und teils mit Hilfe von NaCl-Platten

gemessen.

8.1.2.9 Polarimeter

Der Drehwert der chiralen Verbindungen wurde an einem Perkin Elmer Polarimeter

341 mit einer Hg-Lampe (546 nm) bei 20 °C aufgenommen.

8.1.2.10 Zentrifuge

Die Entfernung des Palladium-Katalysators erfolgte mit Hilfe einer Biofuge der Firma

Heraeus, Modell Pico.

8.1.2.11 UV-Spektrometer

Die UV-Spektren wurden an einem UV-Spektralphotometer (CARY 1E) der Firma

Varian aufgenommen.

8.1.2.12 Thermomixer

Die Abspaltung vom Träger wurde in einem Eppendorf Thermomixer, Modell 5436, bei

45 °C durchgeführt.

8.1.2.13 Speed-Vac-Probenkonzentrator

Die Oligonucleotide wurden in einem Speed-Vac-Probenkonzentrator, einer Zentrifuge

mit integrierter Membranpumpe, der Firma Eppendorf getrocknet.

8.1.2.14 DNA/RNA-Synthesizer

Die modifizierten und unmodifizierten Oligonucleotide wurden in einem DNA-

Synthesizer der Firma Applied Biosystems, Modell 394 DNA/RNA Synthesizer,

157

Experimentalteil

synthetisiert. Die Synthesen wurden dabei nach der Phosphoramidit-Methode

durchgeführt.

8.1.2.15 circularer Dichroismus

Die Messungen des Circular Dichroismus wurden an einem CD Instrument Model 215

der Firma AVIV durchgeführt.

8.2 Synthese von Oligonucleotiden

8.2.1 Synthese

Die Synthese der DNA-Oligonucleotide wurde im Maßstab 1.00 μM mit Hilfe der

Phosphoramidit-Methode durchgeführt. Für unmodifizierte DNA-Stränge wurde das

Standardprotokoll der DNA-Synthese verwendet (s. Anhang).

Für die Synthese der modifizierten DNA-Oligonucleotide wurde dieses Protokoll

abgewandelt und ein weiterer Kupplungsschritt eingeführt, sowie die Kupplungszeit

erhöht (s. Anhang). Für den Einbau der N2-Hydrazinoaryl-modifizierten

Phosphoramidite wurde als Capping-Reagenz eine Mischung aus THF/2,6-

Lutidin/Trimethylessigsäureanhydrid (8:1:1 v/v) verwendet.

8.2.2 Entschützung und Trägerabspaltung

Am Ende der DNA-Synthese wurde von allen Oligonucleotiden die letzte DMTr-

Schutzgruppe mit dem Synthesemodus „Trityl-off“ entfernt. Die weitere Entschützung

und die Abspaltung vom Träger wurden manuell durchgeführt.

Für die N2-modifizierten Oligonucleotide wurde zunächst die Abspaltung der CPE-

Schutzgruppe vorgenommen. Dazu wurden die noch festphasengebundenen

Oligonucleotide mit 1 mL absolutem Pyridin und 100 μL DBU versetzt und für 24 h bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die DBU-Lösung durch Filtration

entfernt und die weitere Abspaltung analog zu den C8-modifizierten Oligonucleotiden

vorgenommen.

Für die Abspaltung von der festen Phase, sowie der Schutzgruppen der Nucleobasen

wurden die noch festphasengebundenen Oligonucleotide mit 1 mL konzentriertem

Ammoniak und 17.5 μL ß-Mercaptoethanol versetzt und für mindestens 4 Stunden im

Thermomixer bei 45 °C geschüttelt. Der Überstand wurde vorsichtig abgenommen,

158

Experimentalteil

der Rückstand noch zweimal mit Reinstwasser gewaschen und in einem Speed-Vac-

Probenkonzentrator getrocknet.

8.2.3 Reinigung der Oligonucleotide

Das getrocknete Roh-Oligonucleotid wurde in 100 μL Reinstwasser aufgenommen und

in zwei Portionen über die Säule an der HPLC gereinigt. Hierbei wurden manuell

jeweils 0.5-1.0 mL-Fraktionen in Eppendorf-Caps aufgefangen und anschließend

mittels analytischen Läufen die Reinheit der Fraktionen untersucht. Gleiche Fraktionen

wurden vereinigt, an einem Speed-Vac-Probenkonzentrator bis zur Trockne

eingeengt, und bei Bedarf noch einmal getrennt.

8.3 Analytik der Oligonucleotide

8.3.1 Bestimmung der Optischen Dichte (OD260)

Eine OD260-Einheit ist die Menge, die in 1.0 mL Wasser gelöst, im Spektralphotometer

(1 cm Küvettendicke) bei 260 nm einen Absorptionswert von 1.0 erzeugt. Um die

OD260-Menge zu bestimmen, wurde das gereinigte Oligonucleotid in 200 μL

Reinstwasser gelöst und 20 μL davon mit 980 μL Reinstwasser auf 1000 μL

Gesamtlösung verdünnt. Diese Lösung wurde in einer Quarzküvette in einem UV/VIS-

Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm vermessen. Der

Absorptionswert (A260) wurde mit dem Faktor 10 (für zehnfache Verdünnung)

multipliziert und ergibt den OD260-Wert.

Mittels des Oligo Calculator 3.1 der Firma Northwestern

(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html) wurden die Stoffmengen,

sowie die Mengen der Oligonucleotide ausgehend vom gemessenen OD260-Wert

berechnet. Bei modifizierten Basen wurde dabei der Extinktionskoeffizient der

unmodifizierten Base als Näherungswert verwendet.

8.3.2 Präparation der Oligonucleotide für das ESI – MS Verdünnung der Oligonucleotide mit einer Lösung aus 20% Isopropanol in Wasser

und 1% Triethylamin, auf eine Konzentration von 5 pmol/ μL.

159

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html

Experimentalteil

8.3.3 Bestimmung der Schmelztemperatur (Tm-Wert) Die Tm-Werte wurden im 1 μM-Maßstab (1 nmol je Strang gelöst in 1 mL Puffer), in

einem 10 mM Phosphat-Puffer mit 140 nM NaCl und 1 mM EDTA, pH 6.8 vermessen.

Die Messungen wurden in einem Temperaturbereich von 5 °C bis 80 °C durchgeführt.

Die Probe wurde jeweils dreimal von 5 °C auf 80 °C erhitzt und dreimal von 80 °C auf

5 °C abgekühlt. Die Heiz- bzw. Kühlrate betrug hierbei 0.5 °C/min., wobei alle 0.5 °C

ein Datenpunkt aufgenommen wurde. Die Absorption der Probelösung wurde bei einer

Wellenlänge von 260 nm verfolgt. Von der resultierenden sigmoiden Kurve wurde das

Maximum der 1. Ableitung zur Bestimmung des Schmelzpunktes berechnet und die

einzelnen Werte gemittelt.

8.3.4 Messung des circularen Dichroismus

Für die Messung des Circular Dichroismus wurden die verwendeten Lösungen der

Schmelzpunktbestimmung auf 3 mL mittels des Phosphatpuffers (pH=6.8) verdünnt

und die molare Elliptizität von 350-200 nm gemessen.

8.3.5 Enzymatischer Abbau der Oligonucleotide mittels des EcoRI

Restriktionsenzym Es wurden jeweils so viele μL wässrige Oligonucleotid-Lösung eingesetzt, dass mit

einem OD von 0.4 gearbeitet werden konnte. Nach der Aufkonzentration wurde das

Oligonucleotid in 100 μL DTT-Puffer aufgenommen, für ca. 2 Minuten auf 70 °C erhitzt

und durch Eiskühlung wieder abgekühlt. Es folgte die Inkubation mit 27 μL EcoRI

(270 Units) bei ca. 20 °C im Thermomixer. Je Probe wurden 20 μL Reaktionslösung

und 40 μL Reinstwasser verwendet und sofort an der HPLC vermessen.

Für die Bestimmung der Halbwertszeit wurden die Integrale des Oligonucleotids und

der beiden Restriktionsprodukte bestimmt und die Menge des geschnittenen

Oligonucleotides zu den jeweiligen Zeitpunkten mittels der folgenden Formel

bestimmt:[131]

μM geschnittenes [Integral d(GTAG)][ε260[GTAGAATTCTAC]][μM d(GTAGAATTCTAC)orig.]

Oligonucleotid =

[(Summe aller Integrale) * [ε260[d(GTAG)]]]

160

Experimentalteil

Nach Auftragung des natürlichen Logarithmus der berechneten Menge gegen die Zeit

konnte, unter der Annahme einer Reaktion 1. Ordnung, die Halbwertszeit nach

folgender Formel berechnet werden:

τ ½ = ln 2 / k

(k: ergibt sich aus der Gleichung des Graphen)

8.4 Allgemeine Arbeitsvorschriften

Darstellung der C8-Arylamin-Addukte mittels der Buchwald-Hartwig-Reaktion

(AAV 1)

In einem ausgeheizten Kolben wurden, unter Stickstoffatmosphäre, das Bromid,

1.5 Äquivalente der Base (K3PO4), 10 mol% Tris(dibenzylidenaceton)-dipalladium(0)

(Pd2(dba)3), 30 mol% racemisches 2,2’-Bis(diphenylphosphino)-1,1’-binaphthyl

(rac-BINAP) und 2 Äquivalente Amin eingewogen und in absolutem 1,2-

Dimethoxyethan (1,2-DME) (15 mL pro mmol des Bromid) gelöst. Anschließend wurde

die Reaktionsmischung bei 80 °C solange gerührt bis dünnschichtchromatographisch

kein Edukt mehr detektiert werden konnte.

Nach Abkühlen der Reaktion auf Raumtemperatur wurden 5 mL gesättigte

Natriumhydrogencarbonat-Lösung zugegeben und die Mischung kurz gerührt. Nach

Zugabe von 10 mL gesättigter Natriumchloridlösung wurden die Phasen getrennt. Die

wässrige Phase wurde dreimal mit je 30 mL Essigsäureethylester extrahiert, und die

vereinigten organischen Phasen anschließend zweimal mit je 10 mL gesättigter

Natriumchloridlösung und einmal mit einer Mischung aus 10 mL gesättigter

Natriumchloridlösung und 2 mL Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde

über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck

abdestilliert. Durch säulenchromatographische Reinigung mit Essigsäureethylester in

Petrolether (10-33%) konnten die Arylamin-Addukte erhalten werden.

Debenzylierung der 8-N-Arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-

Derivate (AAV 2)

161

Experimentalteil

In einem ausgeheizten Kolben wurden, unter Stickstoffatmosphäre, das 8-N-

Arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivat in absolutem

Methanol (20 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit einer Spatelspitze Pd/C versetzt.

Nach kurzem Halten ins Ultraschall-Bad wurde das Reaktionsgemisch bei

Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre für 1-48 h gerührt und

anschließend durch mehrmalige Zentrifugation vom Katalysator befreit. Die

Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck lieferte das saubere

Produkt.

Desilylierung der 8-N-Arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-

Derivate (AAV 3)

In einem ausgeheizten Kolben wurde, unter Stickstoffatmosphäre, das 8-N-Arylamino-

3’,5’-bis-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivat in absolutem

Tetrahydrofuran (THF) und absolutem Dichlormethan (DCM) im Verhältnis 1:1 v/v

(20 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 10 Äquivalenten Triethylamin und 12.5

Äquivalenten Triethylamintrihydrofluorid versetzt und bis zur vollständigen Umsetzung

des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand

säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem

Methanolgradient (10-40%).

Formamidin-Schützung der 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 4)

In einem ausgeheizten Kolben wurden unter Stickstoffatmosphäre 1 Äquivalent des 2’-

Desoxyguanosin-Derivats in absolutem Pyridin (25 mL je mmol Edukt) gelöst und mit

2 Äquivalenten N,N-Dimethylformamiddiethylacetal versetzt und bis zur vollständigen

Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde

das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand



162

Experimentalteil

Dimethoxytritylierung der 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 5)

Das 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosine-Derivat wurde zweimal mit Pyridin

coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 2 Äquivalenten

Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt und bis zur

vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von

gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden die Phasen

getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die

vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter

vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde


Methanolgradient und 0.1% Triethylamin.

Phosphitylierung der 8-N-Arylamino-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin-Derivate

(AAV 6)

Das 8-N-Arylamino-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde zweimal mit absolutem

Acetonitril coevaporiert, unter einer Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan:

absolutem Acetonitril (1:1 v/v) (30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent

einer 0.25 M DCI-Aktivator-Lösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5

Äquivalente Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die

Reaktionsmischung bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei

Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-

Lösung wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit

Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über

Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit.

Der Rückstand wurde säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (neutral,

Aktivitätsstufe III) gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit 0-2% Methanol.

Eine anschließende Gefriertrocknung mit Benzol lieferte das gewünschte Produkt als

Feststoff.

163

Experimentalteil

Darstellung der N2-Arylamin-Addukte mittels der Buchwald-Hartwig-Reaktion (AAV 7)

In einer Stickstoffatmosphäre wurden 1 Äquivalent O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-3’,5’-

bis(TBDMS)-2-brom-2’-dG mit 30mol% rac-BINAP, 10mol% Pd2(dba)3, 2 Äquivalenten

Kaliumphosphat, 0.2 Äquivalenten Triethylammoniumchlorid und 2 Äquivalenten des

Arylhydrazin versetzt. Die Reaktanden wurden in abs. 1,2-DME (20 mL pro mmol

Edukt) gelöst und 24 h bei 80 °C gerührt. Nach Abkühlen der Reaktionslösung wurden

1 mL gesättigte Natriumhydrogencarbonat-Lösung und anschließend 10 mL ges.

Natriumchloridlösung dazugeben. Nach Trennung der Phasen wurde die wässrige

dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden

zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung und anschließend mit Wasser

gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel entfernt.

Die Reinigung erfolgte säulenchromatographisch (PE/EE: 10% -35 %).

Desilylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-arylamino-3’,5’-bis(tert-

butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 8)

In einem ausgeheizten Kolben wurde, unter Stickstoffatmosphäre, das O6-2-(p-

Cyanophenyl)-ethyl-N2-arylamino-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin-

Derivat in absolutem Tetrahydrofuran (THF) und absolutem Dichlormethan (DCM) im

Verhältnis 1:1 v/v (20 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 10 Äquivalenten Triethylamin

und 12.5 Äquivalenten Triethylamintrihydrofluorid versetzt und bis zur vollständigen

Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Ende der Reaktion wurde

Natriumhydrogencarbonat-Lösung hinzugegeben und die wässrige Phase dreimal mit

Dichlormethan extrahiert. Nach anschließendem Trocknen über Natriumsulfat wurde

das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand



Die Trennung der Azo- und Hydrazinoform erfolgte mittels RP-18-Chromatographie.

Als Eluent diente dabei Wasser:Acetonitril (10-40%).

164

Experimentalteil

Dimethoxytritylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-2’-desoxyguanosin-

Derivate (AAV 9)

Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde zweimal

mit Pyridin coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst, mit 2

Äquivalenten Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt und bis

zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe

von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden die

Phasen getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert.

Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter




Dimethoxytritylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-2’-

desoxyguanosin-Derivate (AAV 10)

Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-2’-desoxyguanosin-Derivat wurde

zweimal mit Pyridin coevaporiert, in absolutem Pyridin (25 mL pro mmol Edukt) gelöst,

mit 2 Äquivalenten Dimethoxytritylchlorid unter einer Stickstoffatmosphäre versetzt

und bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach

Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Dichlormethan wurden

die Phasen getrennt, und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet

und unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde

säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (Neutral; Aktivitätsstufe III) gereinigt.

Als Eluent diente Dichlormethan.

165

Experimentalteil

Phosphitylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’-

desoxyguanosin-Derivate (AAV 11)

Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-azoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin-

Derivat wurde zweimal mit absolutem Acetonitril coevaporiert, unter einer

Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan: absolutem Acetonitril (1:1 v/v)

(30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent einer 0.25 M DCI-Aktivator-

Lösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5 Äquivalente Bis-N,N’-

Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die Reaktionsmischung

bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach

Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurden die Phasen

getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die



säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit 0-2%

Methanol.


Feststoff.

Phosphitylierung der O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-O-5’-

dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin-Derivate (AAV 12)

Das O6-2-(p-Cyanophenyl)-ethyl-N2-hydrazinoaryl-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxy-

guanosin-Derivat wurde zweimal mit absolutem Acetonitril coevaporiert, unter einer

Stickstoffatmosphäre in absolutem Dichlormethan: absolutem Acetonitril (1:1 v/v)

(30 mL pro mmol Edukt) gelöst und mit 1 Äquivalent einer 0.25 M DCI-Aktivator-

Lösung in THF versetzt. Unter Rühren wurden dann 1.5 Äquivalente Bis-N,N’-

Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-phosphit 107 zugetropft und die Reaktionsmischung

bis zur vollständigen Umsetzung des Eduktes bei Raumtemperatur gerührt. Nach

Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurden die Phasen

getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die



166

Experimentalteil

säulenchromatographisch über Aluminiumoxid (Neutral; Aktivitätsstufe 3) gereinigt. Als

Eluent diente Dichlormethan:Ethylacetat 1:2.


Feststoff.

8.5 Synthesen Synthese von 8-Brom-2’-desoxyguanosin (Br-dG) 64

571 mg (2.00 mmol) feingepulvertes 2’-Desoxyguanosin 52 wurden in 20 mL dest. Wasser suspendiert, mit 534 mg

(3.00 mmol) N-Bromsuccinimid versetzt, kurz im

Ultraschallbad suspendiert und für genau 15 Minuten bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließendes Filtrieren vom

Lösungsmittel mit Unterdruck liefert das Produkt

8-Brom-2’-desoxyguanosin 64.

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

Br

1

2

34

5 67

8

9

1'

2'3'4'

5'

64

Ausbeute: 545 mg (1.58 mmol, 79%) eines orangenen Feststoffs. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.03. - Smp.: Zersetzung bei 217 °C. - [α]20546:

- 15.4 ° (c = 0.5, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.83 (s,

1H, NH), 6.50 (s, 2H, NH2), 6.14 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 4.39

(ddd, 3JHH = 3.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 2.7 Hz, 1H, H3’), 3.79 (ddd, 3JHH = 5.3 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.61 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 5.3 Hz, 1H,

H5a’), 3.48 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.13 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.10 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH

= 2.7 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 166.8 (C6), 163.3 (C2),

145.7 (C8), 139.5 (C4), 135.4 (C5), 88.1 (C4’), 81.8 (C1’), 65.3 (C3’), 63.2 (C5’), 36.8

(C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3168, 1650, 1460, 1290, 1064, 789, 626. - MS

(FAB, m/z): ber.: 345.00, gef.: 346.01 (M+H+).

167

Experimentalteil

Synthese von 8-Brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 65

Unter Stickstoffatmosphäre wurden 8.00 g

(23.1 mmol) 8-Brom-2’-desoxyguanosin 64, 14.9 g

(99.2 mmol) tert-Butyldimethylsilylchlorid und 10.4 g

(152 mmol) Imidazol in 60 mL absolutem Pyridin

suspendiert und für eine Stunde bei Raumtemperatur

gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dabei klar.

Nach langsamer Zugabe von 4 mL Methanol und

anschließendem fünfminütigem Rühren, wurde das Lösungsmittel im

Ölpumpenvakuum in eine Kühlfalle abkondensiert. Der Rückstand wurde zweimal mit

je 40 mL Toluol coevaporiert und säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent

diente Dichlormethan mit 5% Methanol.

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

65

Ausbeute: 9.77 g (17.0 mmol, 74%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlor-

methan/Methanol 9:1 v/v): 0.21. - Smp.: 66 °C. - [α]20546: + 29.5 ° (c = 0.8, CHCl3). -

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.81 (s, 1H, NH), 6.41 (s, 2H, NH2), 6.14 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 4.58 (ddd, 3JHH = 3.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH =

3.1 Hz, 1H, H3’), 3.74 (ddd, 3JHH = 7.6 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.63

(dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H5a’), 3.42 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz,

1H, H5b’), 3.16 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.14

(ddd,2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3

an C3’), 0.82 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5’), 0.10 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), - 0.01 (s, 3H,

Si-(CH3)2 an C5’), - 0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 155.6 (C6), 153.5 (C2), 152.3 (C8), 120.8 (C4), 117.6 (C5), 87.3 (C4’),

84.9 (C3’), 83.0 (C1’), 72.6 (C5’), 36.2 (C2’), 25.9 (SiC(CH3)3), 25.8 (SiC(CH3)3), 18.1

(SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3

(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 2928, 1693, 1471, 1082, 836, 777. - MS

(FAB, m/z): ber.: 573.18, gef.: 574.18 (M+H+).

168

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-8-brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63

Ein Kolben mit 5.50 g (9.57 mmol) 8-Br-3’,5’-

TBDMS-dG 65 und 5.02 g (19.1 mmol)

Triphenylphosphin (PPh3) wurde 10 min. im

Ölpumpenvakuum evakuiert. Dann wurden, unter

Stickstoffatmosphäre, 50 mL absolutes 1,4-Dioxan

und 2 ml Benzylalkohol über eine Spritze

zugegeben. Nach zehnminütigem Rühren wurde die

Reaktionsmischung auf 0 °C abgekühlt und 3.7 mL

Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) zugetropft. Die Reaktion wurde auf

Raumtemperatur erwärmt und eine Stunde gerührt. Anschließend wurde das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand am

Chromatotron gereinigt. Als Eluent diente Petrolether mit 10% Essigsäureethylester.

α β

γ δ

ε

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

63

Ausbeute: 4.36 g (5.45 mmol, 57%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan):

0.22. - [α]20546: + 12.2 ° (c = 2.80, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

7.49-7.46 (m, 2H, Hγ), 7.41-7.36 (m, 2H, Hδ), 7.30-7.28 (m, 1H, Hε), 6.46 (s, 2H, NH2),

6.18 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H1’), 5.47 (d, 2JHH = 7.2 Hz, 2H, Hα), 4.66

(ddd, 3JHH = 3.0 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.77 (ddd, 3JHH = 7.6 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 3.3 Hz, 1H, H4’), 3.63 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H,

H5a’), 3.42 (dd, 2JHH = 11.5 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.21 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 6.9 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, H2a’), 2.18 (ddd, 2JHH = 13.4 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 3JHH

= 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C3’), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5’),

0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.06 (s, 3H, Si-(CH3)2

an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.4 (C6), 159.2 (C2), 154.8 (C8),

136.5 (Cβ), 128.6 (Cγ + Cδ), 128.3 (Cε), 125.9 (C4), 114.6 (C5), 87.4 (C4’), 85.2 (C3’),

82.8 (C1’), 72.4 (Cα), 67.1 (C5’), 35.9 (C2’), 26.5 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1

(SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2), -5.3

(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 2954, 2929, 1614, 1585, 1251, 1077, 836,

777. - MS (FAB, m/z): ber.: 665.78, gef.: 666.80 (M+H+).

169

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-8-N-(phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl-silyl)-2’-

desoxyguanosin 66

Die Reaktion wurde nach AAV 1 durchgeführt.

170

Es wurden 3.00 g (4.51 mmol) O6-Benzyl-8-brom-

3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 63 eingesetzt.

Reaktionszeit: 70 h. - Ausbeute: 1.97 g (2.90 mmol,

64%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert

(Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v): 0.48. -

Smp.: 161.1 °C. - [α]20546: +13.8 (c= 1.64, CHCl3). -

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.69 (s, 1H, H10), 7.59 (dd, 3JHH= 7.6 Hz, 2H,

Hg), 7.49 (dd, 3JHH= 6.7 Hz, 2H, Hd), 7.47 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 2H, Hγ), 7.40-7.38 (m, 4H,

He, Hδ + Hε), 7.37-7.33 (m, 2H, Hc), 7.26 (ddd, 3JHH= 7.5 Hz, 3JHH= 7.5 Hz, 2H, Hh),

6.91 (ddd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, Hi), 6.31 (dd, 3JHH= 6.9 Hz, 3JHH= 6.9 Hz,

1H, H1´), 6.05 (s, 2H, H11), 5.48 (s, 2H, Hα), 4.64 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 6.2 Hz, 1H, H3´), 3.88-3.80 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.68 (dd, 3JHH= 4.4 Hz, 2JHH=

10.0 Hz, 1H, H5´b), 3.47-3.40 (m, 1H, H2´a), 2.15-2.10 (m, 1H, H2´b), 0.90 (s, 9H, Si-

C(CH3)3 an H3´), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.12 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.02, -0.03

(2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6 (C2), 157.4

(C6), 147.2 (C8), 137.3 (C(A)), 133.9 (Cβ), 128.6 (Cγ + C(C)), 128.5 (Cδ), 128.1 (Cε +

C(B)), 127.1 (C(D)), 86.6 (C4´), 82.4 (C3´), 72.1 (C1´), 65.8 (Cα), 62.4 (C5´), 35.8

(C2´), 25.2 (Si(CH3)2), 17.4 (SiC(CH3)3), 17.2 (SiC(CH3)3), -5.2 (SiC(CH3)3), -5.4

(Si(CH3)3), -6.0 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3227, 3034,

1180, 1005, 917, 895, 725, 669, 560, 505. - MS (FAB, m/z): ber.: 678.3745, gef.:

677.3616 [M-H]+

α β

γ δ

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

Dε

66

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl-

silyl)-2’-desoxyguanosin 67


171




62%) eines gelben Feststoff. -DC: Rf-Wert


Smp.: 117-121 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 0.1, CHCl3).

- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.47 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.51 (d, 3JHH =

9.0 Hz, 2H, H(C)), 7.47 (d, 3JHH = 7.2 Hz, 2H, Hγ), 7.38 (dd, 3JHH = 7.2 Hz, 3H, Hδ +

Hε), 6.88 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.29 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1’), 5.97 (s, 2H,

NH2), 5.46 (s, 2H, Hα), 4.63 (ddd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’),

3.84-3.81 (m, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 9.6 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70 (s, 3H,

OMe), 3.68 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.43 (ddd, 2JHH = 13.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.10 (ddd, 2JHH = 13.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H,

H2b’), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.12 (s, 6H, Si-

(CH3)2 an C3’), -0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-

NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6 (C2), 157.4 (C6), 147.2 (C8), 139.1 (C(D)),

137.3 (C(A)), 133.9 (Cβ), 128.6 (Cγ + C(C)), 128.5 (Cδ), 128.1 (Cε + C(B)), 120.0 (C4),

114.0 (C5), 87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 72.9 (C3’), 66.6 (Cα), 63.2 (C5’), 55.3 (O-CH3), 36.6

(C2’), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.0 (SiC(CH3)3), -5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):

3332, 2952, 2929, 1633, 1605, 1565, 1414, 1256, 835. - MS (FAB, m/z): ber.:

706.3718, gef.: 707.3622 (M+H+).

α β

γ δ

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

Dε

67

O

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-methylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-

2’-desoxyguanosin 68


172



Reaktionszeit: 70 h. - Ausbeute: 1.96 g

(2.83 mmol, 75%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-

Wert (Petrolether/Essigsäureethylester 2:1 v/v):

0.4. - Smp.: 86 °C. - [α]20546: + 16.9 ° (c = 0.9,

CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.56 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.47-

7.49 (m, 2H, Hδ), 7.30-7.40 (m, 3H, H(B) + Hε), 7.07 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hγ), 6.80

(d, 3JHH = 8.0 Hz, 2H, H(C)), 6.30 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1’), 6.01 (s, 2H, NH2), 5.47

(s, 2H, Hα), 4.62 (ddd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H3’), 3.82-3.79

(m, 2H, H5a’, H4’), 3.68 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.5 Hz, 1H, H5b’), 3.42-3.38 (m,

1H, H2a’), 2.22 (s, 3H, CH3), 2.11 (m, 1H, H2b’), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.80

(s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.11 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an

C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.6

(C2), 157.4 (C6), 146.4 (C8), 138.1 (C(D)), 137.0 (C(A)), 129.9 (Cβ), 129.2 (Cγ), 128.4

(Cδ), 128.3 (C(B)), 127.9 (Cε), 123.9 (C4), 117.4 (C(C)), 111.0 (C5), 87.1 (C1’), 83.0

(C4’), 72.7 (C3’), 66.4 (Cα), 63.0 (C5’), 36.5 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 20.3 (CH3-

Toluidin), 18.0 (SiC(CH3)3), -4.6, -5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3465,

3348, 2953, 1600, 1409, 1257, 1105, 1060, 835, 698. - MS (FAB, m/z): ber.:

690.3745, gef.: 691.3809 (M+H+).

α β

γ δ

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

Dε

68

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 69


173



Reaktionszeit: 84 h. - Ausbeute: 1.27 g (1.81

mmol, 55%) eines gelben Feststoffs. - DC: Rf-Wert


Smp.: 70 °C. - [α]20546: + 19 ° (c = 0.28,

CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 9.39 (s, 1H, NH-p-

Cyanophenylamin), 7.71-7.67 (m, 4H, H(C) + Hγ), 7.50-7.48 (m, 2H, H(B)), 7.28-7.41

(m, 3H, Hδ + Hε), 6.30 (dd, 3JHH = 6.9 Hz, 1H, H1´), 6.12 (s, 2 H, NH2), 5.50 (s, 2 H,

Hα), 4.64-4.60 (m, 1H, H3´), 3.81-3.78 (m, 2H, H4´+ H5a´), 3.65 (dd, 3JHH = 8.2 Hz,

1H, H5b´), 3.52 (dd, 2JHH = 13.2 Hz , 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a´), 2.13 (ddd, 2JHH = 13.2

Hz , 3JHH = 6.7 Hz , 3JHH = 3.2, 1H, H2b´), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3´), 0.80 (s, 9H,

Si-C(CH)3 an C5´), 0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.34 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5´), -

0.43 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.0 (C2),

156.6 (C6), 144.6 (C8), 139.9 (C(D)), 136.8 (C(A)), 133.1 (Cβ), 128.4 (C(C) + Cγ),

128.3 (Cδ), 127.9 (C(B) + Cε), 124.3 (C4), 117.2 (C5), 111.1 (CN), 87.3 (C4´), 83.0

(C1´), 72.6 (Cα), 66.4 (C3´), 62.9 (C5´), 36.1 (C2´), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3),

-4.9, -5.6 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3215, 2953, 2929, 1622, 1595,

1540, 1304, 1176, 950, 697. - MS (FAB, m/z): ber.: 701.3541, gef.: 702.3641 (M+H+).

α β

γ δ

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

Dε

69

NC

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-

butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 70


174


3´,5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxy-

guanosin 63 eingesetzt.


mmol, 66%) eines orangen schmierigen Feststoff.

- DC: Rf-Wert (Petrolether/Essigsäureethylester

2:1 v/v): 0.58. – Smp.: 135 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 1.64, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm]

(400 MHz, DMSO-d6): 8.38 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin), 7.46 (d, 3JHH= 7.2 Hz, 2H,

H(B)), 7.36 (t, 3JHH= 7.5 Hz, 2H, Hδ), 7.32-7.29 (dd, 3JHH= 7.2 Hz, 3JHH= 8.2 Hz, 2H,

Hγ), 7.25 (d, 3JHH= 7.1 Hz, 1H, Hε), 6.55 (s, 1H, H(D)), 6.26 (t, 3JHH= 6.9 Hz, 1H, H1’),

6.02 (s, 2H, NH2), 5.49 (s, 2H, Hα), 4.59 (s, 1H, H3´), 3.85-3.79 (m, 2H, H5´a, H4´),

3.67 (dd, 3JHH= 4.6 Hz, 3JHH= 5.8 Hz, 1H, H5´b ), 2.20 (s, 6H, Me-aromat.), 2.08 (s, 2H,

H2´), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C3´), 0.80 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an C5´)), 0.10 (d, 3JHH=

2.1 Hz, 6H, Si(CH3)2), 0.00 (d, 3JHH= 3.3 Hz, 6H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101

MHz, DMSO-d6): 157.8 (Cβ), 154.9 (C6), 154.1 (C2), 149.3 (C8), 141.0 (C4), 137.7

(C5), 128.7 (C(D)), 128.5 (C(B)), 128.4 (Cε), 128.3 (Cδ), 128.0 (Cγ), 120.8 (C(C)),

117.9 (C(A)), 87.2 (C4´), 84.0 (C3´), 72.8 (C1´), 66.6 (Cα), 63.2 (C5´), 36.7 (C2´), 25.9

(Si(CH3)2), 21.4 (Me-aromat.), 17.4 (SiC(CH3)3), 16.7 (SiC(CH3)3), -5.2 (SiC(CH3)3), -

5.4 (Si(CH3)3), -6.0 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3377, 3333, 2950, 2857,

1616, 1565, 1464, 1413, 1253, 1108, 833, 783. - MS (FAB, m/z): ber.: 704.902, gef.:

705.3993 (M+H+).

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

NH

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

AB

CD

70

B

C

α β

χδ

ε

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-8-N-(4-aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 71


175




mmol, 65%) eines gelben Feststoff. -DC: Rf-Wert


Smp.: 146 °C. - [α]20546: + 16.3° (c = 0.32, CHCl3).

- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.05 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.52-7.20

(m, 14H, Hγ + Hδ + Hε + H(B) + H(C) + H(F) + H(G) + H(H)), 6.50 (s, 2H, NH2), 6.20

(dd, 3JHH = 6.8 Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H1’), 5.48 (s, 2H, Hα), 4.51 (ddd, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H, H3’), 3.81 (dd, 2JHH = 10.6 Hz, 3JHH = 5.0 Hz, 1H,

H5a’), 3.73 (ddd, 3JHH = 5.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H4’), 3.69 (dd, 2JHH =

10.6 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H5b’), 3.63 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.8

Hz, 1H, H2a’), 2.26 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H2b’), 0.89

(s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.85 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.10 (s, 3H, Si-(CH3)2 an

C3’), 0.09 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.04 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.05 (s, 3H, Si-

(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.2 (C2), 159.9 (C6),

154.3 (C(A)), 148.5 (C8), 140.9 (C(D)), 137.8 (C(E)), 136.8 (Cβ), 128.9 (Cγ), 128.6

(Cδ), 128.4 (C(B)), 128.2 (Cε), 127.5 (C4), 127.4 (C(C)), 127.2 (C5), 125.8 (C(F)),

125.5 (C(G)), 114.4 (C(H)), 82.5 (C1’), 72.4 (C4’), 72.3 (C3’), 67.0 (Cα), 62.9 (C5’),

37.2 (C2’), 26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5

(Si(CH3)2), -4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1]

(KBr): 2940, 2908, 2877, 1607, 1559, 1423, 1159, 1005, 938, 785. - MS (FAB, m/z):

ber.: 752.3902, gef.: 753.3992 (M+H+).

α β

γ δ

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

EF

G

H

ε

71

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-8-N-(2-aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 72

176


Es wurden 1.95 g (2.91 mmol) O6-Benzyl-8-

brom-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 63 eingesetzt.


mmol, 91%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-

Wert (Petrolether/Essigsäureethylester 2:1

v/v): 0.44. - Smp.: 85 °C. - [α]20546: - 5.2 ° (c =

0.5, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.77 (s, 1H, NH-2-

Aminofluoren), 7.88 (m, 1H, H(E)), 7.76 (dt, 3JHH = 7.8 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H(B)),

7.59 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(L)), 7.46-7.52 (m, 3H, H(F) + Hγ), 7.20-

7.42 (m, 5H, H(J) + H(I) + Hδ + Hε), 7.07-7.00 (m, 1H, H(K)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.9 Hz,

1H, H1’), 6.07 (s, 2H, NH2), 5.50 (s, 2H, Hα), 4.63 (ddd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz,

1H, H3’), 3.92 (s, 2H, CH2-AF), 3.86-3.81 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.69-3.65 (m, 1H, H5b’),

3.43 (ddd, 2JHH = 10.1 Hz, 3JHH = 6.5 Hz, 1H, H2a’), 2.13 (ddd, 2JHH = 10.1 Hz, 3JHH =

7.2 Hz, 3JHH = 3.5 Hz, 1H, H2b’), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.81 (s, 9H, Si-C(CH)3

an C5’), 0.12 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.00 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.01 (s, 3H, Si-

(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.8 (C(A)), 157.6 (C2),

153.9 (C6), 146.1 (C8), 143.8 (C(D)), 142.5 (C(M)), 141.3 (C(H)), 140.1 (C(C)), 137.0

(C(A)), 134.5 (Cβ), 128.4 (Cγ), 128.4 (Cδ), 127.9 (Cε), 126.7 (C(F)), 124.9 (C(B)),

124.3 (C4), 120.1 (C(K)), 119.0 (C(I) + C(J)), 116.8 (C(L)), 114.4 (C(E)), 111.3 (C5),

87.2 (C4’), 83.0 (C1’), 72.7 (Cα), 66.5 (C3’), 63.0 (C5’), 57.9 (C(G)), 36.5 (C2’), 25.7

(SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.7, -5.4 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3495,

3357, 2952, 2927, 1597, 1560, 1456, 1416, 1254, 835, 778. - MS (FAB, m/z): ber.:

764.3902, gef.: 765.3974 (M+H+).

α β

γ δ

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

ε

72

AB

C

D

EF

GH

IJ

K

L M

Experimentalteil

Synthese von 8-N-(Phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin

73


177

Es wurden 1.90 g (2.80 mmol) O6-Benzyl-8-N-

(phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-



90%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.9. - Smp.:

155°C. - [α]20546: - 10.8 ° (c = 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

10.52 (s, 1H, NH), 8.35 (s, 1H, NH-Anilin), 7.45 (dd, 3JHH= 7.6 Hz, 2H, H(B)), 7.23 (dd, 3JHH= 8.5 Hz, 2H, H(C)), 6.87 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.22 (dd, 3JHH= 7.1 Hz, 1H, H1´), 6.19 (s, 2H, NH2), 4.53 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH=

6.2 Hz, 1H, H3´), 3.84-3.78 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.71 (ddd, 3JHH= 8.2 Hz, 3JHH= 8.2 Hz, 3JHH= 8.1 Hz, 1H, H5´b), 3.23-3.16 (m, 1H, H2´a), 2.18-2.14 (m, 1H, H2´b), 0.88 (s,

9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.10 (s, 6H, (Si(CH3)2)2), 0.00

(s, 6H, (Si(CH3)2)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.3 (C6), 152.0 (C2),

149.5 (C8), 143.2 (C4), 141.3 (C5), 128.2 (C(D)), 120.0 (C(C)), 116.5 (C(B)), 113.0

(C(A)), 86.8 (C4´), 82.5 (C3´), 72.3 (C1´), 62.7 (C5´), 36.5 (C2´), 25.4 (Si(CH3)2), 25.3

(Si(CH3)2), 17.7 (SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)3), -5.3 (SiC(CH3)3). - IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3353, 1179, 1006, 953, 692, 667, 576, 501. - MS (FAB, m/z):

ber.: 586.8736, gef.: 587.8705 (M+H+).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

73

Experimentalteil

Synthese von 8-N-(4-Methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 74


178

Es wurden 1.92 g (2.69 mmol) O6-Benzyl-8-N-(4-

methoxyphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-

2’-desoxyguanosin 67 eingesetzt.


96%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert


112°C. - [α]20546: - 9.9 ° (c = 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

10.53 (s, 1H, NH), 8.14 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.42 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 6.84

(d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.20 (dd, 3JHH = 7.1 Hz, 1H, H1’), 6.15 (s, 2H, NH2), 4.52

(ddd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 3JHH = 3.1 Hz, 1H, H3’), 3.83-3.79 (m, 2JHH = 13.2

Hz, 3JHH = 9.6 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70 (s, 3H, OMe), 3.68 (dd, 2JHH =

13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.20 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’),

2.10 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s, 9H, Si-

C(CH)3 an C3’), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.10 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.00 (s,

3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 155.8 (C2), 153.9 (C6), 152.2 (C8), 150.0 (C(D)), 144.7 (C(A)), 134.8

(C(C)), 128.4 (C(B)), 119.3 (C4), 114.0 (C5), 87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 72.9 (C3’), 63.3

(C5’), 55.3 (O-CH3), 37.0 (C2’), 26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.0 (SiC(CH3)3),

17.9 (SiC(CH3)3), -4.6 (Si(CH3)2), - 5.2 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):

2929, 2856, 1698, 1613, 1513, 1248, 1108, 834, 777. - MS (FAB, m/z): ber.:

616.3222, gef.: 617.3312 (M+H+).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

O

A

BCD

74

Experimentalteil

Synthese von 8-N-(4-Methylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 75

179



methylphenylamino)- 3’,5’- bis(tert-butyldimethylsilyl)-



85%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-Wert


119 °C. - [α]20546: - 7.9 ° (c = 0.47, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

10.55 (s, 1H, NH), 8.22 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.37 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(B)), 7.04

(d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.20 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’), 6.17 (s, 2H, NH2), 4.52

(m, 1H, H3’), 3.81-3.76 (m, 3JHH = 8.3 Hz, 3JHH = 9.3 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.70-3.66 (m,

1H, H5b’), 3.18 (ddd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 7.0 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2a’), 2.23 (s,

3H, CH3), 2.06 (ddd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s,

9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.83 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’),

0.02 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), 0.00 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101

MHz, DMSO-d6): 155.7 (C2), 152.3 (C6), 146.0 (C8), 143.9 (C(D)), 139.0 (C(A)), 128.3

(C(B)), 123.9 (C4), 114.5 (C(C)), 111.0 (C5), 87.1 (C1’), 82.9 (C4’), 72.7 (C3’), 63.1

(C5’), 36.9 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 20.1 (CH3-Toluidin), 18.1 (SiC(CH3)3), -4.6, -5.3

(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3312, 2918, 1693, 1603, 1517, 1369, 1252,

1083, 837, 776. - MS (FAB, m/z): ber.: 600.3276, gef.: 601.3344 (M+H+).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

75

Experimentalteil

Synthese von 8-N-(4-Cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy-

guanosin 76


180


cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-



95%) eines farblosen Feststoff. -DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.49. - Smp.: 148

°C. -[α]20546: - 8.6 ° (c = 0.5, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.65

(s, 1H, NH), 9.14 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin), 7.67 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)),

7.53 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 6.24 (s, 2H, NH2), 6.29 (dd, 3JHH = 7.0 Hz, 1H, H1’),

4.51 (ddd, 3JHH = 5.8 Hz, 3JHH = 2.7 Hz, 1H, H3’), 3.81-3.78 (m, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH =

8.0 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.64 (dd, 2JHH = 9.7 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5b’),

3.43 (ddd, 2JHH = 13.1 Hz, 3JHH = 6.5 Hz, 1H, H2a’), 2.09 (ddd, 2JHH = 13.1 Hz, 3JHH =

6.8 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H2b’), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.82 (s, 9H, Si-C(CH)3

an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), -0.01 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ

[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.8 (C2), 152.6 (C6), 150.0 (C8), 146.4 (C(D)), 141.8

(C(A)), 133.2 (C(C)), 116.4 (C(B)), 114.3 (C4), 113.7 (C5), 101.6 (CN), 87.3 (C4’), 82.9

(C1’), 66.6 (C3’), 63.2 (C5’), 36.6 (C2’), 25.7 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.7, -5.4

(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3499, 3211, 2218, 1634, 1471, 1175, 1031,

777, 544. - MS (FAB, m/z): ber.: 611.3072, gef.: 612.3144 (M+H+).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

76

NC

Experimentalteil

Synthese von 8-N-(3,5-Dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxy-guanosin 77


181

Es wurden 1.71 g (1.54 mmol) O6-Benzyl-8-N-(3,5-

dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-



78%) eines bräunlichen Feststoff. - DC: Rf-Wert


185°C. - [α]20546: - 43 ° (c = 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ

[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.57 (s, 1H, NH), 8.04 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin),

7.28-7.21 (m, 2H, H(B)), 6.97 (s, 1H, H(D)), 6.51 (s, 2H, NH2), 6.20-6.11 (m, 1H, H1´),

4.49 (t, 3JHH= 2.8 Hz, 1H, H3´), 4.02 (q, 3JHH= 7.1 Hz, 1H, H4´), 3.82-3.75 (m, 2H, H5´),

3.08 (q, 3JHH= 6.8 Hz, 1H, H2´a), 2.19 (s, 1H, H2´b), 0.86 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´),

0.83 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.7 (s, 6H, (Si(CH3)2)2), 0.00 (s, 6H, (Si(CH3)2)2). – 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.9 (C6), 152.7 (C2), 150.2 (C8), 143.6

(C4), 142.0 (C5), 137.7 (C(C), 119.7 (C(D), 117.8 (C(B)), 112.2 (C(A)), 93.7 (C4´),

87.2 (C3´), 73.0 (C1´), 63.2 (C5´), 37.2 (C2´), 30.5 (Si(CH3)2), 26.0 (Si(CH3)2), 26.0

(Me-aromat.), 21.4 (Me-aromat.), 18.3 (SiC(CH3)3), 17.3 (SiC(CH3)3), -4.7 (SiC(CH3)3),

-6.1 (SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3489, 2928, 2857, 1696, 1596, 1497,

1406, 1285, 1091, 836, 775. - MS (FAB, m/z): ber.: 614.3439, gef.: 615.3510 (M+H+).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

77

Synthese von 8-N-(4-Aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy-

guanosin 78



aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-des-

oxyguanosin 71 eingesetzt.

Reaktionszeit: 16 h. - Ausbeute: 820 mg (1.23 mmol,

93%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert


NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

EF

G

H

78

Experimentalteil

Zersetzung bei 200 °C. - [α]20546: - 8 ° (c = 0.3, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,

DMSO-d6): 10.59 (s, 1H, NH), 7.87 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.83 (d, 3JHH = 8.3

Hz, 2H, H(B)), 7.60 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd,3JHH = 7.6 Hz, 2H,

H(G)), 7.29 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.47 (s, 2H, NH2), 6.10 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H1’), 4.48 (ddd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 5.3 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H,

H3’), 3.81 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5a’), 3.73 (ddd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH

= 4.7 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 1H, H4’), 3.69 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H5b’),

3.63 (ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H2a’), 2.22 (ddd, 2JHH =

13.0 Hz, 3JHH = 4.3 Hz, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H2b’), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’), 0.86

(s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.08 (s, 3H, Si-(CH3)2 an

C3’), -0.03 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’), -0.04 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ

[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.4 (C2), 159.9 (C6), 154.5 (C(A)), 148.6 (C8), 140.9

(C(D)), 139.8 (C(E)), 128.9 (C(B)), 127.6 (C4), 127.3 (C(C)), 127.2 (C5), 125.8 (C(F)),

125.5 (C(G)), 114.4 (C(H)), 82.3 (C1’), 72.4 (C4’), 72.3 (C3’), 62.9 (C5’), 37.2 (C2’),

26.0 (SiC(CH3)3), 25.9 (SiC(CH3)3), 18.1 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), -4.5 (Si(CH3)2),

-4.7 (Si(CH3)2), -5.2 (Si(CH3)2), -5.3 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3346,

3173, 2954, 2928, 1647, 1603, 1537, 1486, 1383, 1169, 1075, 776. - MS (FAB, m/z):

ber.: 662.3432, gef.: 663.3496 (M+H+).

Synthese von 8-N-(2-Aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy-

guanosin 79


182


aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)- 2’ -



84%) eines beigen Feststoff. - DC: Rf-Wert


169 °C. - [α]20546: - 21 ° (c = 0.34, CHCl3). - 1H-NMR:

δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.61 (s, 1H, NH),

8.50 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 7.80-7.75 (m, 1H, H(E)), 7.75 (dt, 3JHH = 7.9 Hz, 3JHH

= 6.0 Hz, 1H, H(B)), 7.63 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(L)), 7.50-7.46 (m,

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

79

AB

C

D

EF

GH

IJ

K

L M

Experimentalteil

1H, H(F)), 7.41 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4JHH = 2.0 Hz, 1H, H(I)), 7.32 (dt, 3JHH = 7.6 Hz, 1H,

H(J)), 7.06-7.01 (m, 1H, H(K)), 6.55 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’), 6.21 (s, 2H, NH2),

4.53-4.49 (m, 1H, H3’), 3.99 (s, 2H, CH2-AF), 3.65-3.92 (m, 3H, H5a’, H5b’, H4’), 3.21

(dd, 3JHH = 6.8 Hz, 1H, H2a’), 2.09-2.01 (m, 1H, H2b’), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C3’),

0.84 (s, 9H, Si-C(CH)3 an C5’), 0.09 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C3’), 0.08 (s, 3H, Si-(CH3)2

an C5’), 0.01 (s, 3H, Si-(CH3)2 an C5’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6):

158.3 (C(A)), 157.3 (C2), 152.3 (C6), 149.8 (C8), 143.9 (C(D)), 143.5 (C(M)), 140.9

(C(H)), 140.1 (C(C)), 137.0 (C(A)), 126.9 (C(F)), 125.4 (C(B)), 124.8 (C4), 120.1

(C(K)), 118.9 (C(I) + C(J)), 115.9 (C(L)), 113.4 (C(E)), 110.3 (C5), 87.2 (C4’), 83.0

(C1’), 72.6 (C3’), 63.1 (C5’), 57.9 (C(G)), 36.9 (C2’), 25.8 (SiC(CH3)3), 17.9

(SiC(CH3)3), -4.7, -5.4 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3357, 2952, 2928,

1684, 1591, 1562, 1456, 1359, 1256, 836. - MS (FAB, m/z): ber.: 674.3432, gef.:

675.3483 (M+H+).

Synthese von 8-N-(Phenylamino)-2’-desoxyguanosin 80

183


Es wurden 1.41 g (2.40 mmol) 8-N-(Phenylamino)-3’,5’-

bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 73 einge-

setzt.

Reaktionszeit: 3 h. - Ausbeute: 820 mg (2.05 mmol, 78%)

eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.02. - Smp.: 103 °C. - [α]20546: - 3.4 ° (c = 1.0,

CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.52 (s, 1H, NH), 8.62 (s,

1H, NH-Anilin), 7.72 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 2H, H(B)), 7.25 (ddd, 3JHH= 7.4 Hz, 3JHH= 7.4

Hz, 2H, H(C)), 6.89 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.38 (s, 2H, NH2), 6.32

(dd, 3JHH= 5.6 Hz, 3JHH= 9.7 Hz, 1H, H1´), 5.92 (dd, 3JHH= 4.7 Hz, 3JHH= 4.7 Hz, 1H,

5´-OH), 5.34 (d, 3JHH= 3.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.42-4.41 (m, 1H, H3´), 3.92-3.88 (m, 2H,

H5´a, H4´), 3.75-3.74 (m, 1H, H5´b), 3.35 (dd, 1H, H2´a), 2.03-2.00 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.1 (C6), 152.3 (C2), 148.9 (C8), 142.7

(C4), 140.3 (C5), 128.0 (C(D)), 120.0 (C(C)), 116.8 (C(B)), 112.7 (C(A)), 86.6 (C4´),

82.3 (C3´), 70.7 (C1´), 60.7 (C5´), 45.1 (C2´). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3423,

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

80

Experimentalteil

2982, 1638, 1476, 1037. - UV: λMax [nm] MeCN: 285. - MS (FAB,m/z): ber.: 358.1390,

gef.: 359.1402 (M+H+).

Synthese von 8-N-(4-Methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 81


Es wurden 1.80 g (2.92 mmol) 8-N-(4-Methoxy-

phenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxy-



eines farblosen Öls. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.48. - [α]20546: - 0.9 ° (c

= 1.0, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,

DMSO-d6): 10.73 (s, 1H, NH), 8.47 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.64 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H,

H(C)), 6.83 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)), 6.62 (s, 2H, NH2), 6.31 (dd, 3JHH = 9.7 Hz, 3JHH

= 5.7 Hz, 1H, H1’), 5.90 (s, 1H, 5’-OH), 5.34 (s, 1H, 3’-OH), 4.42 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz,

1H, H3’), 3.91 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 2H, H5a’, H4), 3.74 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5

Hz, 1H, H5b’), 3.71 (s, 3H, OMe), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’),

1.99 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm]

(101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9 (C(D)), 144.1 (C(A)),

134.5 (C(C)), 128.4 (C(B)), 119.3 (C4), 112.0 (C5), 87.5 (C1’), 83.0 (C4’), 71.7 (C3’),

61.7 (C5’), 55.5 (O-CH3), 38.5 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3423, 2982, 1638,

1476, 1037. - UV: λMax [nm] MeCN: 294, 255. - MS (FAB,m/z): ber.: 388.1495, gef.:

389.1501 (M+H+).

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

O

A

BCD

81

184

Experimentalteil

Synthese von 8-N-(4-Methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 82


185

Es wurden 1.30 g (2.16 mmol) 8-N-(4-Methylphenylamino)-

3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 75 ein-

gesetzt.


eines weißen klebrigen hochviskosen Öls. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.65. - [α]20546: - 1.8 °

(c = 0.94, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.92 (s, 1H, NH),

8.53 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 7.62 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 7.04 (d, 3JHH = 8.5 Hz,

2H, H(C)), 6.56 (s, 2H, NH2), 6.31 (dd, 3JHH = 9.7 Hz, 3JHH = 5.6 Hz, 1H, H1’), 5.75 (s,

1H, 5’-OH), 5.32 (s, 1H, 3’-OH), 4.42-4.38 (m, 1H, H3’), 3.91-3.88 (m, 2H, H5a’, H4’),

3.74-3.69 (m, 1H, H5b’), 3.16-3.10 (m, 1H, H2a’), 2.23 (s, 3H, CH3), 1.99 (dd, 2JHH =

12.9 Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 155.7

(C2), 153.0 (C6), 149.5 (C8), 143.4 (C(D)), 138.4 (C(A)), 129.2 (C4), 128.6 (C(B)),

117.4 (C(C)), 111.8 (C5), 87.1 (C1’), 82.7 (C4’), 71.3 (C3’), 61.3 (C5’), 38.3 (C2’), 20.3

(CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3468, 3095, 2938, 1676, 1647, 1561,

1474, 1361, 736. - UV: λMax [nm] MeCN: 312, 255, 213. - MS (FAB, m/z): ber.:

372.1546, gef.: 373.1611 (M+H+).

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

82

Synthese von 8-N-(4-Cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 83


Es wurden 900 mg (1.47 mmol) 8-N-(4-

Cyanophenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl) - 2’ -



88%) eines farblosen Öl. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.06. - [α]20546: + 14 ° (c

= 1.3, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.33 (s, 1H, NH),

9.25 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin), 7.91 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)), 7.68 (d, 3JHH =

8.9 Hz, 2H, H(B)), 6.98 (s, 2H, NH2), 6.33 (dd, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H1’),

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

83

NC

Experimentalteil

5.75 (s, 1H, 5’-OH), 4.82 (s, 1H, 3’-OH), 4.42 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H3’), 3.92-3.88

(m, 2H, H5a’, H4’), 3.74-3.66 (m, 1H, H5b’), 3.16-3.09 (m, 1H, H2a’), 2.06 (ddd, 2JHH =

12.6 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 154.1

(C2), 153.3 (C6), 149.6 (C8), 144.9 (C(D)), 141.7 (C(A)), 133.1 (C(C)), 119.7 (C4),

117.1 (C(B)), 113.7 (C5), 101.6 (CN), 87.3 (C4’), 83.0 (C1’), 71.3 (C3’), 61.3 (C5’),

38.6 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3422, 2974, 2937, 2676, 1685, 1647, 1170,

1027, 736, 418. - UV: λMax [nm] MeCN: 335, 212. - MS (FAB, m/z): ber.: 383,1342,

gef.: 384.2351 (M+H+).

Synthese von 8-N-(3,5-Dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 84


186

Es wurden 1.17 g (1.75 mmol) 8-N-(3,5-

dimethylphenylamino)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2’-



79%) eines braunen Öls. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.85. - [α]20546: - 17 ° (c

= 1.0, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.53 (s, 1H, NH),

8.41 (s, 1H, NH-3,5-Dimethylanilin), 7.30 (s, 2H, H(B)), 6.52 (s, 1H, H(D)), 6.45 (s, 2H,

NH2), 6.29 (dd, , 3JHH= 5.7 Hz, , 3JHH= 3.9 Hz, 1H, H´1), 5.86 (s, 1H, 5´-OH), 5.03 (s,

1H, 3´-OH), 4.40 (d, 3JHH= 5.2 Hz, 1H, H3´), 3.89 (d, 3JHH= 1.9 Hz, 1H, H4´), 3.70-3.65

(m, 2H, H5´), 2.21 (s, 6H, Me-aromat.), 1.98-1.91 (m, 2H, H2´). - 13C-NMR: δ [ppm]

(101 MHz, DMSO-d6): 155.6 (C6), 154.4 (C2), 150.7 (C8), 147.9 (C4), 137.5 (C5),

133.6 (C(D)), 130.9 (C(B)), 130.8 (C(B)), 127.5 (C(C)), 127.0 (C(C)), 115.2 (C(A)),

95.4 (C4´), 90.4 (C3´), 71.3 (C1´), 58.7 (C5´), 45.8 (C2´), 21.4 (Me-aromt.). - IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3438, 2941, 2677, 1684, 1476, 1397, 1069, 736, 519. - UV:

λMax [nm] MeCN: 335, 212. - MS (FAB, m/z): ber.: 386.1703, gef.: 387.1751 (M+H+).

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

84

Experimentalteil

Synthese von 8-N-(4-Aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 85


Es wurden 600 mg (0.90 mmol)

8-N-(4-Aminobiphenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethyl-

silyl)-2’-desoxyguanosin 78 eingesetzt.

187


94%) eines farblosen Feststoff. -DC: Rf-Wert


197 °C. - [α]20546: + 3.8 ° (c = 0.5, CH2Cl2/MeOH). -

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.92 (s,

1H, NH), 8.77 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 7.83 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2H, H(B)), 7.60

(dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 2H, H(G)), 7.29 (dd, 3JHH

= 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.65 (s, 2H, NH2), 6.34 (dd, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H1’),

6.02 (s, 1H, 5’-OH), 5.39 (s, 1H, 3’-OH), 4.44 (ddd, 3JHH = 5.6 Hz, 1H, H3’), 3.93 (dd, 2JHH = 10.2 Hz, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, H5a’), 3.77-3.64 (m, 3H, H4’ + H5b’ + H2a’), 2.22

(ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 5.6 Hz, 3JHH = 12.6 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm]

(101 MHz, DMSO-d6): 158.9 (C2), 156.0 (C6), 153.3 (C(A)), 149.7 (C8), 140.5 (C(D)),

140.3 (C(E)), 132.4 (C5 + C4), 126.7 (C(F) + C(B) + C(C)), 126.2 (C(G)), 117.8 (C(H)),

87.3 (C1’), 83.0 (C4’), 71.4 (C3’), 61.5 (C5’), 38.6 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):

3427, 2979, 1559, 1475, 1400, 1035, 720. - UV: λMax [nm] MeCN: 327, 233, 213. - MS

(FAB, m/z): ber.: 434.1703, gef.: 435.1805 (M+H+).

Synthese von 8-N-(2-Aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 86


Es wurden 1.35 g (2.00 mmol) 8-N-(2-

Aminofluorenyl)-3’,5’-bis(tert-butyldimethylsilyl)- 2’

-desoxyguanosin 79 eingesetzt.

Reaktionszeit: 5 h. - Ausbeute: 548 mg (1.22

mmol, 61%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-

Wert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.81. -

Smp.: Zersetzung bei 240 °C. - [α]20546: - 18 ° (c =

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

86

AB

C

D

EF

GH

IJ

K

L M

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

EF

H

85

G

Experimentalteil

0.16, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.55 (s, 1H, NH),

8.73 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.09 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H, H(E)), 7.76 (dt, 3JHH = 7.4

Hz, 3JHH = 9.8 Hz, 2H, H(B) + H(L)), 7.67 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 4JHH = 1.9 Hz, 1H, H(F)),

7.52 (d, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(I)), 7.33 (t, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(J)), 7.21 (dt, 3JHH = 7.4

Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 4JHH = 1.0 Hz, 1H, H(K)), 6.36 (s, 2H, NH2), 6.34-6.29 (m, 1H, H1’),

5.98 (t, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.34 (d, 3JHH = 3.6 Hz, 1H, 3’-OH), 4.43-4.37 (m,

1H, H3’), 3.93-3.88 (m, 1H, H5a’), 3.89 (s, 2H, CH2-AF), 3.78-3.70 (m, 2H, H5b’, H4’),

2.56-2.52 (m, 1H, H2a’), 2.09-2.00 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 157.3 (C(A)), 155.7 (C2), 152.8 (C6), 149.5 (C8), 143.8 (C(D)), 143.3

(C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4 (C(C)), 140.0 (C(A)), 134.0 (C(F)), 126.6 (C(B)), 124.9

(C4), 120.0 (C(K)), 119.0 (C(I) + C(J)), 116.3 (C(L)), 113.9 (C(E)), 112.2 (C5), 87.2

(C4’), 82.8 (C1’), 71.3 (C3’), 61.3 (C(G) + C5’), 36.5 (C2’). - IR: Wellenzahl [cm-1]

(KBr): 3330, 1676, 1593, 1561, 1432, 1415, 1356, 1325, 1095, 767, 731. - UV: λMax

[nm] MeCN: 317, 260, 206. - MS (FAB, m/z): ber.: 446.1703, gef.: 447.1790 (M+H+).

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87


188

Es wurden 800 mg (1.95 mmol) 8-N-

(Phenylamino)-2’-desoxyguanosin 80 eingesetzt.


mmol, 67%) eines hellgelben Feststoff. - DC: Rf-


Smp.: 161 °C. - [α]20546: + 18.8 ° (c = 1.2,


1H, NH-Anilin), 8.53 (s, 1H, Hα), 7.74 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 2H, H(B)), 7.26 (ddd, 3JHH=

7.4 Hz, 3JHH= 7.4 Hz, 2H, H(C)), 6.92 (dd, 3JHH= 7.3 Hz, 3JHH= 7.3 Hz, 1H, H(D)), 6.44

(dd, 3JHH= 5.6 Hz, 3JHH= 9.3 Hz, 1H, H1´), 5.87 (dd, 3JHH= 4.8 Hz, 3JHH= 4.8 Hz, 1H, 5´-

OH), 5.39 (d, 3JHH= 3.9 Hz, 1H, 3´-OH), 4.46-4.44 (m, 1H, H3´), 3.92 (d, 3JHH= 2.2 Hz,

2H, H5´a, H4´), 3.76 (dd, 3JHH= 2.0 Hz, 3JHH= 4.6 Hz, 1H, H5´b), 3.17 (d, 3JHH= 5.6 Hz,

1H, H2´a), 3.15 (s, 3H, Me-Formamidin), 3.02 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.09-2.04 (m,

1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.1 (Cα), 156.2 (C6), 155.5

(C2), 147.7 (C8), 143.9 (C4), 140.3 (C5), 128.1 (C(D)), 120.4 (C(C)), 117.1 (C(B)),

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

A

BCD

N(Me)2

α

87

Experimentalteil

115.2 (C(A)), 86.8 (C4´), 82.3 (C3´), 70.7 (C1´), 60.8 (C5´), 38.0 (C2´), 34.2 (Me-

Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3265, 1115, 991, 960, 915, 859, 504. - MS

(FAB,m/z): ber.: 414.1812, gef.: 415.2543 (M+H+).

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 88


189


Methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 81 einge-

setzt.


mmol, 81%) eines farblosen Feststoff. – DC: Rf-Wert


°C. - [α]20546: + 8.4 ° (c = 0.8, CH2Cl2/MeOH). - 1H-

NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.21 (s, 1H, NH), 8.57 (s, 1H, Hα), 8.51 (s, 1H,

NH-p-Anisidin), 7.64 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 6.85 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(B)),

6.42 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H1’), 5.86 (dd, 3JHH = 4.8 Hz, 1H, 5’-OH),

5.37 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.44 (ddd, 3JHH = 5.7 Hz, 1H, H3’), 3.91 (ddd, 3JHH =

5.7 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.73 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H5b’), 3.71 (s, 3H,

OMe), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H2a’), 3.14, 3.01 (2x s, 2x 3H,

Me-Formamidin), 2.04 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ

[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.3 (Cα), 156.1 (C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9

(C(D)), 144.1 (C(A)), 120.8 (C4), 119. 3 (C(C)), 113.9 (C(B)), 112.0 (C5), 87.5 (C1’),

83.0 (C4’), 71.7 (C3’), 61.7 (C5’), 55.4 (O-CH3), 38.5 (C2’), 34.7 (Me-Formamidin). -

IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3338, 3161, 2944, 2910, 1651, 1599, 1531, 1475, 1361,

1139, 1038, 776. - MS (FAB,m/z): ber.: 443.4699, gef.: 444.4802 (M+H+).

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

O

A

BCD

N(Me)2

α

88

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 89


190


Methylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 82 einge-

setzt.


mmol, 68%) eines farblosen Feststoff. - DC: Rf-Wert


°C. - [α]20546: + 28.5 ° (c = 0.33, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-

d6): 11.24 (s, 1H, NH), 8.64 (s, 1H, NH-p-Toluidin), 8.52 (s, 1H, Hα), 7.63 (d, 3JHH = 8.5

Hz, 2H, H(B)), 7.06 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.42 (dd, 3JHH = 9.4 Hz, 3JHH = 5.9 Hz,

1H, H1’), 5.87 (dd, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.39 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.45-

4.39 (m, 1H, H3’), 3.91-3.85 (m, 1H, H5a’), 3.75-3.67 (m, 2H, H4’, H5b’), 3.01, 3.14

(2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.57 (ddd, 3JHH = 13.1 Hz, 3JHH = 9.5 Hz, 3JHH = 6.4 Hz,

1H, H2a’), 2.24 (s, 3H, CH3), 2.05-1.99 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 157.5 (Cα), 156.5 (C2), 155.8 (C6), 148.1 (C8), 144.5 (C(D)), 138.2 (C(A)),

129.5 (C4), 128.9 (C(B)), 117.6 (C(C)), 115.6 (C5), 87.2 (C1’), 82.7 (C4’), 71.1 (C3’),

61.2 (C5’), 38.3 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin), 20.3 (CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl

[cm-1] (KBr): 3307, 1667, 1632, 1533, 1344, 1114, 1061, 960, 819. - MS (FAB, m/z):

ber.: 427.1968, gef.: 428.2046 (M+H+).

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

89

N(Me)2

α

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 90



Cyanophenylamino)-2’-desoxyguanosin 83 einge-

setzt.


mmol, 91%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-Wert


154 °C. - [α]20546: + 3.6 ° (c = 0.43, CH2Cl2/MeOH). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,

DMSO-d6): 11.34 (s, 1H, NH), 9.40 (s, 1H, Hα), 9.29 (s, 1H, NH-p-Cyanophenylamin),

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

90

NC

N(Me)2

α

Experimentalteil

7.70 (d, 3JHH = 8.8 Hz, 2H, H(C)), 7.38 (d, 3JHH = 7.5 Hz, 2H, H(B)), 6.45 (dd, 3JHH = 9.2

Hz, 3JHH = 6.0 Hz, 1H, H1’), 5.75 (s, 1H, 5’-OH), 4.78 (s, 1H, 3’-OH), 4.46 (ddd, 3JHH =

5.7 Hz, 1H, H3’), 3.93 (dd, 1H, H5b’), 3.75-3.70 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.16-3.09 (m, 1H,

H2a’), 2.88, 2.72 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.12 (ddd, 2JHH = 12.2 Hz, 3JHH = 5.2

Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 155.7 (C2),

155.4 (C6), 147.3 (C8), 143.8 (C(D)), 141.8 (C(A)), 132.0 (C(C)), 118.6 (C4), 116.3

(C(B)), 114.6 (C5), 100.8 (CN), 86.4 (C4’), 81.9 (C1’), 70.1 (C3’), 60.3 (C5’), 38.2

(C2’), 34.7 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3446, 2738, 2676, 1598,

1392, 1176, 1061, 916, 844, 643, 579. - MS (FAB, m/z): ber.: 438.1764, gef.:

439.1797 (M+H+).

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 91


191

Es wurden 520 mg (1.35 mmol) 8-N-(3,5-

dimethylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 84

eingesetzt.


mmol, 47%) eines gelben Feststoff. - DC: Rf-Wert


151 °C. - [α]20546: - 10 ° (c = 1.0, CHCl3). - 1H-

NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.23 (s, 1H, NH), 8.50 (s, 1 H, NH-3,5-

Dimethylanilin), 8.49 (s, 1H, Hα), 7.30 (s, 2H, H(B)), 6.53 (s, 1H, H(D)), 6.39 (dd, 3JHH=

5.9 Hz, 3JHH= 6.7 Hz, 1H, H1´), 5.81 (dd, 3JHH= 4.6 Hz, 3JHH= 9.2 Hz, 1H, 5´-OH), 5.34

(d, 3JHH= 3.9 Hz, 1H, 3´-OH), 4.42 (s, 1H, H3´), 3.88 (d, 3JHH= 2.3 Hz, 1H, H5´a), 3.73-

3.68 (m, 2H, H5´b, H4´), 3.12 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.99 (s, 3H, Me-Formamidin),

2.52-2.39 (m, 1H, H2´a), 2.20 (s, 6H, Me-aromat.), 2.04-1.99 (m, 1H, H2´b). – 13C-

NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.6 (Cα), 157.8 (C6), 156.8 (C2), 156.03 (C8),

148.5 (C4), 144.5 (C5), 140.8 (C(A)), 137.6 (C(D)), 122.3 (C(C)), 115.6 (C(B)), 87.3

(C4´), 82.1 (C3´), 71.2 (C1´), 61.3 (C5´), 38.5 (C2´), 34.8 (Me-Formamidin), 21.5

(Mearomat.). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3302, 2921, 1675, 1630, 1560, 1345, 1113. -

MS (FAB, m/z): ber.: 438.1764, gef.: 439.1797 (M+H+).

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

91

N(Me)2

α

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 92

Die Reaktion wurde nach AAV 4

durchgeführt.

192


Aminobiphenyl)-2’-desoxyguanosin 85 einge-

setzt.

Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 167 mg

(0.34 mmol, 94%) eines farblosen Feststoff. -

DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1

v/v): 0.13. - Smp.: 245 °C. - [α]20546: + 28.9 °


8.68 (s, 1H, NH-4-Aminobiphenyl), 8.57 (s, 1H, Hα), 7.85 (d, 3JHH = 8.3 Hz, 2H, H(B)),

7.63 (dd, 3JHH = 8.3 Hz, 4H, H(C) + H(F)), 7.42 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 2H, H(G)), 7.29 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 1H, H(H)), 6.46 (dd, 3JHH = 9.3 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H1’), 5.93 (s, 1H,

5’-OH), 5.40 (s, 1H, 3’-OH), 4.47 (ddd, 1H, H3’), 3.94 (dd, 3JHH = 2.1 Hz, 1H, H5a’),

3.77-3.72 (m, 3H, H4’ + H5b’ + H2a’), 3.07, 3.06 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.08

(ddd, 2JHH = 13.0 Hz, 3JHH = 5.9 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-

d6): 157.7 (Cα), 156.7 (C2), 156.0 (C6), 149.7 (C(A)), 148.3 (C8), 140.4 (C(D)), 140.1

(C(E)), 132.7 (C5 + C4), 129.0 (C(F)), 126.9 (C(B)), 126.8 (C(C), 126.2 (C(G)), 115.8

(C(H)), 87.4 (C1’), 83.0 (C4’), 71.3 (C3’), 61.4 (C5’), 38.6 (C2’), 34.8 (Me-

Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3346, 3173, 2954, 2928, 1647, 1603, 1537,

1486, 1383, 1169, 1075, 776. - MS (FAB m/z): ber.: 489.2125, gef.: 490.2229 (M+H+).

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

EF

G

H

α

N(Me)2

92

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 93


durchgeführt.


Aminofluorenyl)-2’-desoxyguanosin 86 eingesetzt.

Reaktionszeit: 24 h. - Ausbeute: 237 mg

(0.47 mmol, 60%) eines roten Feststoff. -


v/v): 0.4. - Smp.: 209 °C. - [α]20546: + 5 °


8.83 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.53 (s, 1H, Hα), 8.11 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H, H(E)),

7.77-7.73 (m, 2H, H(B) + H(L)), 7.68 (dd, 3JHH = 8.4 Hz, 4JHH = 1.8 Hz, 1H, H(F)), 7.53

(d, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(I)), 7.33 (t, 3JHH = 7.4 Hz, 1H, H(J)), 7.22 (dt, 3JHH = 7.4 Hz, 3JHH = 7.4 Hz, 4JHH = 1.0 Hz, 1H, H(K)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.0 Hz, 3JHH = 9.3 Hz, 1H,

H1’), 5.96 (t, 3JHH = 4.7 Hz, 1H, 5’-OH), 5.41 (d, 3JHH = 3.7 Hz, 1H, 3’-OH), 4.48-4.44

(m, 1H, H3’), 3.94-3.89 (m, 1H, H5a’), 3.90 (s, 2H, CH2-AF), 3.79-3.71 (m, 2H, H5b’,

H4’), 3.15, 3.02 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.61-2.55 (m, 1H, H2a’), 2.08-2.01 (m,

1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 156.6 (C(A)), 155.9

(C2), 152.8 (C6), 148.1 (C8), 144.2 (C(D)), 143.8 (C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4 (C(C)),

139.9 (C(E)), 134.1 (C4), 126.7 (C(F)), 125.4 (C(B)), 124.9 (C(K)), 120.0 (C(I)), 119.0

(C(J)), 116.5 (C(L)), 115.6 (C5), 114.0 (C(F)), 87.2 (C4’), 82.8 (C1’), 71.1 (C3’), 61.3

(C(G)), 48.6 (C5’), 36.5 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):

3283, 2923, 1673, 1630, 1343, 1113, 1058, 946, 731. - MS (FAB, m/z): ber.:

501.2203, gef.: 502.2237 (M+H+).

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

93

AB

C

D

EF

GH

IJ

K

L M

N(Me)2

α

193

Experimentalteil

Versuch der Darstellung von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin-5‘-

monophosphat 94

Die Reaktion wurde unter einer

Stickstoffatmosphäre durchgeführt, um

Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.

194

Es wurden 44 µL (0.47 mmol)

Phosphorylchlorid, 4.2 µL (0.23 mmol) Wasser

und 38 µL (0.47 mmol) Pyridin in 2 mL abs.

Acetonitril bei 0 °C gelöst. Anschließend wurde 40 mg (0.10 mmol) N2-Formamidin-8-

N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87, gelöst in 1 mL abs. Acetonitril hinzugetropft

und die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und 4 Stunden gerührt. Nach erfolgter

Hydrolyse mit Eis bei 4 °C für eine Stunde erfolgte die Neutralisation mit

Ammoniumhydrogencarbonat und Lyophillisation der Reaktionslösung. Nach

abschließender RP-säulenchromatographischer Reinigung mit Wasser konnten jedoch

nur Zersetzungsprodukte isoliert werden.

NH

N

N

O

NN

O

OH

O

HN

94

N(Me)2P

Versuch der Darstellung von 5-Chlor-cycloSal-N2-formamidin-8-N-(4-

methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosinmonophosphat 96

Die Reaktion wurde unter einer

Stickstoffatmosphäre durchgeführt,

um Sauerstoff und Feuchtigkeit

auszuschließen.

Es wurden 25 mg (0.06 mmol) N2-

Formamidin-8-N-(4-methoxyphenyl-

amino)-2’-desoxyguanosin 88 in 500

µL abs. Pyridin gelöst und bei – 40 °C mit einer 0.1 M Lösung des Chlorophosphidates

95 (0.1 mL) über einen Zeitraum von einer Stunde versetzt. Nach weiteren 5 h Rühren

konnte jedoch keine Umsetzung des Eduktes beobachtet werden.

OO

O

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

A

BCD

α

NH

N

N

O

NN

O

OH

O

HN

96

N(Me)2

O

PO

O

ClO

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

A

BCD

αA'

B'C'

D'

E'F'

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(Phenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-

desoxyguanosin 97


195

Es wurden 542 mg (1.31 mmol) N2-Formamidin-8-

N-(phenylamino)-2’-desoxyguanosin 87 einge-

setzt.

Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 737 mg (1.03

mmol, 79%) eines hellgelben Feststoff. - DC: Rf-


Smp.: 168 °C. - [α]20546: - 2.9 ° (c = 1.0, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-

d6): 11.30 (s, 1H, NH), 8.69 (s, 1H, NH-Anilin), 8.23 (s, 1H, Hα), 7.66 (dd, 3JHH= 7.7

Hz, 2H, H(B)), 7.60 (dd, 3JHH= 7.7 Hz, 1H, H(D)), 7.33-7.30 (m, 2H, H(C)), 7.20-7.13

(m, 13H, DMTr), 6.37 (dd, 3JHH= 5.0 Hz, 3JHH= 7.7 Hz, 1H, H1´), 5.36-5.35 (m, 1H, 3´-

OH), 4.59 (ddd, 3JHH= 5.5 Hz, 1H, H3´), 3.90 (ddd, 3JHH= 3.1 Hz, 3JHH= 6.8 Hz, 3JHH=

6.9 Hz, 2H, H5´a, H4´), 3.70-3.68 (m, 7H, DMTr-CH3; H5´b), 3.17 (d, 3JHH= 4.6 Hz, 1H,

H2´a), 2.99 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.97 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.24-2.20 (m, 1H,

H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.2 (Cα), 156.7, 156.5, 156.4 (C6),

155.6, 155.2 (C2), 155.0, 154.7, 153.7, 153.4, 146.7 (C8), 146.3 (C4), 143.6 (C5),

128.4, 128.3, 128.2, 128.1 (C(D)), 128.0, 127.8, 127.1, 126.5, 126.4, 126.2, 126.1,

125.1, 119.1 (C(C)), 115.7 (C(B)), 115.4 (C(A)), 111.8 (DMTr-CH3), 111.5 (DMTr-CH3),

84.0 (C4´), 83.9 (C3´), 81.0 (C1´), 62.6 (C5´), 36.1 (C2´), 33.1 (Me-Formamidin). - IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr): 2931, 2835, 914, 790, 777, 727, 583, 555, 503. - MS

(FAB,m/z): ber.: 715.3118, gef.: 716.3202 (M+H+).

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

A

BCD

N(Me)2

α

97

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-

desoxyguanosin 98

196


Es wurden 650 mg (1.46 mmol) N2-Formamidin-

8-N-(4-methoxyphenylamino)-2’-desoxyguanosin 88 eingesetzt.




Smp.: 131 °C. - [α]20546: - 10.6 ° (c = 0.76, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,

DMSO-d6): 11.24 (s, 1H, NH), 8.47 (s, 1H, Hα), 8.22 (s, 1H, NH-p-Anisidin), 7.60 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H, H(C)), 7.13-7.26 (m, 10 H, DMTr-H), 6.86 (d, 3JHH = 9.0 Hz, 2H,

H(B)), 6.70-6.75 (m, 5H, DMTr-H), 6.42 (dd, 3JHH = 7.5 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’),

5.34 (d, 3JHH = 5.4 Hz, 1H, 3’-OH), 4.58 (ddd, 3JHH = 5.4 Hz, 1H, H3’), 4.09 (ddd, 3JHH

= 5.2 Hz, 3JHH = 5.4 Hz, 2H, H5a’, H4’), 3.73 (dd, 2JHH = 13.2 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H,

H5b’), 3.71 (s, 3H, OMe), 3.68 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.40 (ddd, 2JHH = 13.8 Hz, 3JHH =

6.6 Hz, 1H, H2a’), 3.17, 3.16 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.32 (ddd, 2JHH = 12.6 Hz, 3JHH = 5.4 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.3 (Cα), 156.1

(C2), 153.8 (C6), 153.3 (C8), 149.9 (C(D)), 144.1 (C(A)), 140.6, 139.9, 135.8, 135.7,

132.6, 129.7, 129.6, 128.9, 127.8, 127.4, 126.8, 126.6, 126.4, 126.0, 120.8 (C4),

119.2 (C(C)), 113.9 (C(B)), 113.1 (C5), 87.5 (C1’), 83.0 (C4’), 71.7 (C3’), 61.7 (C5’),

55.4 (O-CH3), 38.5 (C2’), 34.7 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3423,

3041, 2982, 1638, 1476, 1037. - MS (FAB,m/z): ber.: 745.3224, gef.: 746.3215 (M+H+)

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

O

A

BCD

N(Me)2

α

98

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-

desoxyguanosin 99

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

99

N(Me)2

α



Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-2’-


Experimentalteil

Reaktionszeit: 5 h. - Ausbeute: 675 mg (0.92 mmol, 81%) eines farblosen Feststoff. -

DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.35. - Smp.: 165 °C. - [α]20546: - 9.7 °

(c = 0.69, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.27 (s, 1H, NH), 8.56 (s,

1H, NH-p-Toluidin), 8.23 (s, 1H, Hα), 7.56 (d, 3JHH = 8.5 Hz, 2H, H(B)), 7.13-7.28 (m,

8H, DMTr-H), 7.06 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, H(C)), 6.68-6.77 (m, 5H, DMTr-H), 6.42 (dd, 3JHH = 7.7 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’), 5.34 (d, 3JHH = 3.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.48-4.41 (m,

1H, H3’), 3.90-3.81 (m, 1H, H5a’), 3.72-3.66 (m, 2H, H4’, H5b’), 3.67 (s, 6H, DMTr-

CH3), 3.21-3.15 (m, 1H, H2a’), 2.99, 2.96 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.24 (s, 3H,

CH3), 2.19 (ddd, 3JHH = 12.3 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101

MHz, DMSO-d6): 157.9, 157.8, 157.0 (Cα), 156.6 (C2), 155.1 (C6), 148.1 (C8), 144.9

(C(D)), 138.7 (C(A)), 135.5, 129.6, 129.5, 129.3 (C4), 128.9 (C(B)), 127.6, 126.5,

117.4 (C(C)), 116.8 (C5), 112.9, 85.4 (C1’), 82.3 (C4’), 70.6 (C3’), 64.0 (C5’), 54.9 (O-

CH3), 37.5 (C2’), 34.5 (Me-Formamidin), 20.3 (CH3-Toluidin). - IR: Wellenzahl [cm-1]

(KBr): 3361, 2927, 1674, 1628, 1527, 1342, 1247, 827. - MS (FAB, m/z): ber.:

729.3275, gef.: 730.3353 (M+H+).

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-

desoxyguanosin 100

197

300 mg (0.68 mmol) N2-

ute: 225 mg


Es wurden

Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-2’-


Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbe

(0.30 mmol, 45%) eines gelben Feststoff. -


v/v): 0.4. - Smp.: 133 °C. - [α]20546: + 10.6 ° (c = 1.68, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400

MHz, DMSO-d6): 11.36 (s, 1H, NH), 9.61 (s, 1H, Hα), 9.40 (s, 1H, NH-p-

Cyanophenylamin), 6.71-7.80 (m, 17H, H(C) + H(B) + DMTr-H), 6.35 (dd, 3JHH = 7.7

Hz, 3JHH = 5.0 Hz, 1H, H1’), 5.35 (s, 1H, 3’-OH), 4.58-4.51 (m, 1H, H3’), 3.90-3.86 (m,

1H, H5b’), 3.75-3.72 (m, 2H, H5a’, H4’), 3.68 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.15-3.10 (m, 1H,

H2a’), 2.88, 2.72 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.12-2.04 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ

[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.5 (Cα), 157.2, 156.7 (C2), 155.6 (C6), 149.6, 148.2

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

100

NC

α

N(Me)2

Experimentalteil

(C8), 145.7, 144.9 (C(D)), 143.1 (C(A)), 133.1 (C(C)), 129.7, 129.6, 129.4, 128.9,

127.7, 127.5, 126.5, 119.7 (C4), 117.2 (C(B)), 116.8 (C5), 101.4 (CN), 85.6 (C4’), 82.5

(C1’), 70.6 (C3’), 64.0 (C5’), 54.9 (CH3-DMTr), 37.5 (C2’), 34.6 (Me-Formamidin). - IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3338, 2219, 1675, 1605, 1421, 1250, 1114, 1031, 754, 583,

546. - MS (FAB, m/z): ber.: 740.3071, gef.: 741.6171 (M+H+).

198

ynthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-

ie Reaktion wurde nach AAV 5 durchgeführt.

-

: 383 mg (0.51

(s, 1H, NH), 8.41 (s, 1H, NH-3,5-

S

desoxyguanosin 101

D

Es wurden 280 mg (0.63 mmol) N2-Formamidin

8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-2’-


Reaktionszeit: 12 h. - Ausbeute

mmol, 82%) eines rosafarbenen Feststoff. - DC:

Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.36. -

Smp.: 164 °C. - [α]20546: + 10 ° (c = 1.0, CHCl3). -

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.25

Dimethylanilin), 8.20 (s, 1H, Hα), 8.05 (s, 1H, H(D)), 7.24-7.10 (m, 11H, DMTr-H), 6.68

(dd, 3JHH= 8.9 Hz, 3JHH= 4.6 Hz, 4H, H(B), DMTr-H), 6.29 (dd, 3JHH= 5.1 Hz, 3JHH= 2.6

Hz, 1H, H1’), 5.28 (d, 3JHH= 4.8 Hz, 1H, 3’-OH), 4.52 (dd, 3JHH= 5.7 Hz, 3JHH= 6.2 Hz,

1H, H3’), 3.86-3.82 (m, 2H, H5’a, H4´), 3.64 (d, 3JHH= 1.1 Hz, 6H, DMTr-CH3), 3.12 (d, 3JHH= 5.2 Hz, 1H, H5´b), 2.94 (d, 3JHH= 8.9 Hz, 6H, Me-Formamidin), 2.18 (s, 7H, Me-

aromat., H2’a), 1.99-1.86 (m, 1H, H2’b) – 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6):

159.3 (Cα), 159.2, 159.1 (C6), 158.6, 158.4 (C2), 156.3, 152.3, 149.5, 148.0, 146.6,

(C8), 146.3 (C4), 136.1 (C5), 130.6 (C(D)), 128.8 (C(B)), 118.9 (C(C)), 117.8 (C(A)),

113.7 (DMTr-CH3), 113.6 (DMTr-CH3), 85.9 (C4´), 85.3 (C3´), 80.0 (C1´), 64.4 (C5´),

54.9 (Me-Formamidin), 34.9 (C2´). 24.7, 20.0 (Me-aromat.) - IR: Wellenzahl [cm-1]

(KBr): 3366, 2921, 1675, 1629, 1560, 1342, 1249, 1113, 1032, 830.

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BD

101

C

N(Me)2

α

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxy-

guanosin 102


199

NH

N


Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-2’-desoxy-





Smp.: 120 °C. - [α]20546: - 15.4 ° (c= 0.5,

CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.29 (s, 1H, NH), 8.81 (s, 1H, NH-

4-Aminobiphenyl), 8.24 (s, 1H, Hα), 6.70-7.65 (m, 22H, DMTr-H, H(B) + H(C) + H(F) +

H(G) + H(H)), 6.39 (dd, 3JHH = 7.6 Hz, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H1’), 5.34 (s, 1H, 3’-OH), 4.60

(ddd, 1H, H3’), 3.91 (dd, 3JHH = 2.1 Hz, 1H, H5a’), 3.71-3.65 (m, 3H, H4’ + H5b’ +

H2a’), 3.67 (s, 6H, DMTr-CH3), 3.00, 2.98 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.22 (ddd, 3JHH = 5.1 Hz, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.7 (Cα), 156.7

(C2), 156.0 (C6), 149.7 (C(A)), 148.3 (C8), 140.4 (C(D)), 140.1 (C(E)), 139.9, 135.8,

135.7, 132.7 (C5 + C4), 132.6, 129.7, 129.6, 129.0 (C(F)), 128.9, 127.8, 127.4, 126.9

(C(B)), 126.8 (C(C), 126.2 (C(G)), 115.8 (C(H)), 87.4 (C1’), 83.0 (C4’), 71.3 (C3’),

61.4 (C5’), 55.4 (O-CH3), 38.6 (C2’), 34.8 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1]

(KBr): 3380, 2931, 1672, 1628, 1527, 1343, 1249. - MS (FAB, m/z): ber.: 791,3431,

gef.: 792.3535 (M+H+).

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

EF

G

H

102

N(Me)2

α

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxy-

guanosin 103


durchgeführt.


N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)- 2’ -


N

O

NN

O

OH

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

103

AB

C

D

EF

GH

IJ

K

L M

α

N(Me)2

Experimentalteil

Reaktionszeit: 3.5 h. - Ausbeute: 247 mg (0.30 mmol, 78%) eines lachsfarbenen

Feststoff. - DC: Rf-Wert (Dichlor-methan/Methanol 9:1 v/v): 0.31. - Smp.: 180 °C. -

[α]20546: - 11 ° (c = 0.3, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.32 (s, 1H,

NH), 8.79 (s, 1H, NH-2-Aminofluoren), 8.25 (s, 1H, Hα), 8.03 (d, 4JHH = 1.3 Hz, 1H,

H(E)), 7.76-7.70 (m, 2H, H(B) + H(L)), 7.56 (dd, 3JHH = 8.4 Hz, 4JHH = 2.0 Hz, 1H,

H(F)), 6.65-7.53 (m, 16H, H(I) + H(J) + H(K) + DMTr-H), 6.40 (dd, 3JHH = 5.1 Hz, 3JHH =

7.7 Hz, 1H, H1’), 5.35 (d, 3JHH = 3.6 Hz, 1H, 3’-OH), 4.59-4.51 (m, 1H, H3’), 3.91-3.84

(m, 1H, H5a’), 3.88 (s, 2H, CH2-AF), 3.67-3.62 (m, 8H, H5b’, H4’ + DMTr-CH3), 3.18-

3.09 (m, 1H, H2a’), 3.00, 2.98 (2x s, 2x 3H, Me-Formamidin), 2.22-2.18 (m, 1H, H2b’).

- 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.9, 157.8 (Cα), 157.0, 156.7 (C(A)),

155.9 (C2), 152.8 (C6), 148.2 (C8), 145.0 (C(D)), 143.8 (C(M)), 142.4 (C(H)), 141.4

(C(C)), 140.0 (C(E)), 135.6, 134.9 (C4), 133.9, 129.6, 129.5, 126.7 (C(F)), 126.5,

125.5 (C(B)), 124.9 (C(K)), 120.1 (C(I)), 119.0 (C(J)), 116.9 (C5), 116.2 (C(L)), 113.6

(C(F)), 112.9, 85.5 (C4’), 82.5 (C1’), 70.6 (C3’), 64.1 (C(G) + C5’), 54.9 (O-CH3), 36.5

(C2’), 34.5 (Me-Formamidin). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3354, 2928, 1674, 1628,

1455, 1424, 1342, 1175, 1031, 827, 765, 701. - MS (FAB, m/z): ber.: 803.3431, gef.:

804.3483 (M+H+).

Synthese des Phosphitylierungsreagenz Bis-N,N´-Diisopropylamino-(2-cyanoethyl)-

phosphit 107

Unter Schlenkbedingungen wurden 12.9 mL (147 mmol)

Phosphortrichlorid 104 mit 12.2 mL abs. Pyridin und 30 mL

Diethylether versetzt. Nach Kühlung mit einem Stickstoff/Aceton-

Kältebad auf -78 °C wurden 10.4 mL (153 mmol)

3-Hydroxypropionsäurenitril 105 innerhalb von 1.5 h dazugetropft. Nach langsamem

Aufwärmen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung für 16 h gerührt. Das

entstandene Pyridiniumhydrochlorid unter Schlenkbedingungen filtriert und mit abs.

Diethylether gewaschen. Zum Filtrat wurde nach Aufnahme in 150 mL abs.

Diethylether bei -10 °C innerhalb von einer Stunde 130 mL (925 mmol)

Diisopropylamin hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde erneut für 16 h bei

Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Diisopropylammoniumhydrochorid wurde

über eine Schlenkfritte filtriert und wiederum mit Diethylether gewaschen.

αPN

N OCN

107

β

200

Experimentalteil

Anschließend wurde das Filtrat im Ölpumpenvakuum eingeengt. Das erhaltende

Rohprodukt wurde unter Zugabe von 297 mg (7.06 mmol) Calciumhydrid im Vakuum

destilliert. Die Übergangstemperatur des Produkts betrug 190 – 200 °C.

Ausbeute: 18.4 g (61.0 mmol, 41%) einer farblosen Flüssigkeit. 1H-NMR: δ [ppm] (400

MHz, Benzol-d6): 3.51-3.42 (m, 4 H, iPr-H), 3.41-3.35 (m, 2H, H-α), 1.85-1.81 (m, 2H,

H-β), 1.20-1.25 (m, 24 H, iPr-CH3). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 118.0

(CN), 60.2 (C-α), 45.3 (iPr-CH), 27.1 (iPr-CH3), 23.9 (iPrCH3), 19.8 (C-β). - 31P-NMR: δ

[ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 122.15. – IR: Wellenzahl [cm-1] (Film): 3332, 2952, 2929,

1633, 1605, 1565, 1414, 1256, 835. MS (FAB, m/z): ber.: 301.283, gef.: 301 [M].

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(phenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’-

diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 108

201


Es wurden 20.0 mg (0.02 mmol) N2-Formamidin-8-

N-(phenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-



61%) eines farblosen Feststoffs als Gemisch

zweier Diastereomere (I + II) im Verhältnis 1:1. -

DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.49. - Smp.: 136 °C. -[α]20546: + 7 ° (c

= 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 11.29 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36

(s, 1H, Hα (I)), 8.23 (s, 1H, Hα (II)), 7.62-6.62 (m, 38H, DMTr-H (I+II) + Anilin-H (I+II),

NH-Anilin (I+II)), 6.41 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.31 (dd, 3JHH =

6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.88-4.86 (m, 1H, H3’ (I)), 4.85-4.82 (m, 1H, H3’

(II)), 4.37-4.33 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.56-3.30 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) +

H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.77-2.66 (m, 1H,

H2b’ (II)), 2.58-2.50 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha (I)), 2.23 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.85 (dd, 3JHH

= 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 1.15-0.96 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.2, 147.6, 147.5,

145.3, 145.3, 136.3, 133.2, 130.9, 130.8, 130.7, 130.6, 130.5, 129.3, 128.8, 128.7,

128.6, 128.4, 118.4, 118.2, 114.6, 113.7, 113.6, 87.1, 86.6, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0,

73.8, 64.1, 64.0, 58.7, 58.6, 58.5, 58.5, 55.1, 54.9, 54.8, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 38.6,

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

A

BCD

N(Me)2

α

108PO N

NCα'

β'

Experimentalteil

38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - 31P-NMR: δ [ppm] (161 MHz,

Benzol-d6): 148.03, 148.21. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3385, 2964, 2930, 1628,

1527, 1509, 1344, 1250, 1032, 978. - UV: λMax [nm] MeCN: 345, 256. - MS (ESI, m/z):

ber.: 915.4197, gef.: 938.4091 (M+Na+).

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-

(N,N’-diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 109


202

Es wurden 20.0 mg (0.02 mmol) N2-Formamidin-

8-N-(4-methoxyphenylamino)-O-5’-

dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 98 eingesetzt.

Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 14.0 mg (0.01

mmol, 61%) eines farblosen Feststoffs als

Gemisch zweier Diastereomere (I + II) im

Verhältnis 1:2. - DC: Rf-Wert (Dichlor-

methan/Methanol 9:1 v/v): 0.52. - Smp.: 122 °C. - [α]20546: + 15 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-

NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 10.99 (s, 2H, NH (I+II)), 8.35 (s, 1H, Hα (I)), 8.31

(s, 1H, Hα (II)), 7.68 (s, 1H, NH-p-Anisidin (I)), 7.66 (s, 1H, NH-p-Anisidin (II)), 7.59-

6.71 (m, 34H, DMTr-H (I+II) + ANIS-H (I+II)), 6.44 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz,

1H, H1’ (I)), 6.37 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.92-4.89 (m, 1H, H3’

(I)), 4.85-4.81 (m, 1H, H3’ (II)), 4.36-4.28 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.64-3.16 (m, 44H, DMTr-

CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Anis-CH3 (I+II) +

Formamidin-CH3 (I+II)), 2.80-2.76 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.54-2.50 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha

(I)), 2.20 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.89 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, β’Ha (II)), 1.83-

1.80 (m, 1H, β’Hb (II)), 1.24-1.10 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101

MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.3, 155.5, 155.4, 147.6, 147.5, 145.3, 145.3,

136.1, 136.0, 136.0, 135.9, 133.9, 133.8, 130.7, 130.6, 130.6, 130.5, 128.8, 128.7,

128.6, 128.3, 128.2, 128.0, 127.2, 127.2, 120.4, 120.3, 118.9, 118.8, 118.2, 114.6,

113.6, 113.6, 87.1, 86.6, 86.5, 86.4, 86.3, 86.2, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1,

64.0, 58.8, 58.6, 58.6, 58.5, 55.2, 54.9, 54.9, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 38.6, 38.4, 37.7,

30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - 31P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6):

147.34, 148.63. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3411, 2965, 2360, 1628, 1527, 1510,

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

O

A

BCD

N(Me)2

α

109PO N

NCα'

β'

Experimentalteil

1344, 1247, 1114. - UV: λMax [nm] MeCN: 331, 258, 224. - MS (ESI, m/z): ber.:

945.4302, gef.: 968.4191 (M+Na+).

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-methylphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-



203

Es wurden 50.3 mg (0.05 mmol) N2-Formamidin-

8-N-(4-methylphenylamino)-O-5’-dimethoxytrityl-


Reaktionszeit: 1 h. - Ausbeute: 43.1 mg (0.03



Verhältnis 1:1. - DC: Rf-Wert (Dichlor-

methan/Methanol 9:1 v/v): 0.50. - Smp.: 111 °C. - [α]20546: - 21 ° (c = 0.07, CHCl3). -

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 12.04 (s, 2H, NH (I+II)), 8.47 (s, 1H, Hα (I)),

8.42 (s, 1H, Hα (II)), 6.66-8.00 (m, 36H, DMTr-H (I+II) + Tol-H (I+II)), 6.43 (dd, 3JHH =

6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.39 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)),

5.00-4.96 (m, 1H, H3’ (I)), 4.94-4.90 (m, 1H, H3’ (II)), 4.33-4.28 (m, 2H, H4’ (I+II)),

3.32-3.51 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b

(I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.85-2.79 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.54-2.48 (m, 8H, H2b’ (I)

+ β’Ha (I) + Tol-CH3), 2.05 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 1.81 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.2 Hz,

1H, β’Ha (II)), 1.72-1.68 (m, 1H, β’Hb (II)), 1.15-1.10 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13C-

NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.2, 158.3, 155.5, 155.4, 148.1, 147.1, 145.3,

145.3, 136.1,135.9, 133.9, 133.8, 130.6, 130.5, 129.7, 128.8, 127.2, 127.2, 120.4,

120.3, 118.9, 118.8, 117.3, 116.1, 114.6, 113.6, 113.6, 87.1, 86.9, 85.6, 75.0, 74.8,

74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 54.9, 43.6, 43.6, 43.5, 43.5, 40.7, 38.6, 38.4, 36.3, 30.2, 24.6,

20.8, 19.6. - 31P-NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 148.93, 148.87. - IR: Wellenzahl

[cm-1] (KBr): 3853, 3744, 3675, 2927, 2219, 1669, 1628, 1528, 1249, 1115. - UV: λMax

[nm] MeCN: 330, 297. - MS (ESI, m/z): ber.: 929.4353, gef.: 952.4256 (M+Na+).

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

A

BCD

N(Me)2

α

110PO N

NCα'

β'

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’-

diisopropyl-amino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 111


204


Formamidin-8-N-(4-cyanophenylamino)- O - 5’-

di-methoxytrityl-2’-desoxyguanosin 100 eingesetzt.


mmol, 47%) eines gelben Feststoff als


Verhältnis 2:1. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 19:1 v/v): 0.2. - Smp.: 104 °C. -

[α]20546: + 10 ° (c = 0.12, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 10.59 (s,

2H, NH (I+II)), 8.68 (s, 1H, Hα (I)), 8.51 (s, 1H, Hα (II)), 7.87 (s, 2H, NH-p-

Cyanophenylamin (I+II)), 6.70-7.60 (m, 34H, H(C) + H(B) + DMTr-H), 6.51-6.49 (m,

1H, H1’ (II)), 6.44-6.40 (m, 1H, H1’ (I)), 5.01-4.98 (m, 1H, H3’ (II)), 4.59-4.54 (m, 1H,

H3’ (I)), 4.26-4.22 (m, 1H, H4’ (II)), 4.20-18 (m, 1H, H4’ (I)), 3.67-3.29 (m, 24H, DMTr-

CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II)), 3.06-3.01 (m, 1H, H2a’ (II)),

2.87-2.84 (m, 1H, H2a’ (I)), 2.72, 2.48 (2x s, 2x 6H, Me-Formamidin), 2.04-1.99 (m,

2H, H2b’ (I+II)), 1.81-1.89 (m, 4H, β’Ha (I+II) + β’Hb (I+II)), 0.99-1.01 (m, 24H, iPr-CH3

(I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.5, 159.3, 158.8, 155.2, 155.1,

147.8, 147.7, 145.4, 145.4, 136.2, 136.1, 136.0, 135.9, 134.3, 134.1, 131.0, 130.9,

130.9, 130.5, 129.4, 129.3, 128.6, 128.5, 128.4, 128.1, 127.5, 127.4, 120.4, 120.3,

119.1, 119.0, 118.2, 116.4, 114.8, 114.7, 101.3, 101.1, 87.0, 86.8, 86.7, 86.3, 86.2,

86.1, 85.4, 74.8, 74.6, 73.9, 73.6, 64.0, 64.0, 58.9, 58.6, 58.5, 58.3, 55.0, 54.8, 54.7,

43.4, 43.4, 43.2, 43.2, 38.4, 38.2, 37.5, 30.0, 24.7, 24.6, 24.3, 20.4, 20.3, 20.1. - 31P-

NMR: δ [ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 150.79, 148.83. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):

3412, 2964, 2929, 1629, 1528, 1346, 1252, 1177, 1033, 702. - UV: λMax [nm] MeCN:

330, 271, 243. - MS (FAB, m/z): ber.: 940.4149, gef.: 941.42 (M+H+).

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BC

D

111

NC

N(Me)2

α

α'

β'PNC

O N

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-



205


Formamidin-8-N-(3,5-dimethylphenylamino)-O-

5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 101

eingesetzt.




Verhältnis 1:1. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan /Methanol 9:1 v/v): 0.58. - Smp.: 124 °C.

- [α]20546: - 28 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 11. 61 (s,

1H, NH (I)), 11.43 (s, 1H, NH (II)), 8.51 (s, 1H, NH-Dimethylanilin (I)), 8.43 (s, 1H, NH-

3,5-Dimethylanilin (II)), 6.54-7.65 (m, 36H, DMTr-H (I+II) + H-3,5-Dimethylanilin (I+II),

Hα (I+II)), 6.46 (dd, 3JHH = 5.5 Hz, 3JHH = 5.5 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.36 (dd, 3JHH = 6.2 Hz, 3JHH = 6.2 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.96-5.02 (m, 1H, H3’ (I)), 4.79-4.85 (m, 1H, H3’ (II)), 4.33-

4.37 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.33-3.74 (m, 26H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II)

+ H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II)), 2.59-2.79 (m, 13H, H2b’ (II) + Formamidin-CH3 (I+II)),

2.29-2.46 (m, 3H, H2b’ (I) + β’Ha (I) + β’Hb (I)), 2.16, 2.18 (2xs, 2x 6H, Dimethylanilin-

CH3 (I+II)), 1.89-1.94 (m, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 0.91-1.16 (m, 24H, iPr-CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.3, 159.2, 158.4, 158.0, 156.2, 146.1,

145.4, 145.3, 140.9, 140.7, 138.7, 138.6, 136.1, 116.5, 116.4, 113.7, 87.1, 86.8, 85.0,

84.8, 78.6, 78.7, 73.9, 73.1, 63.6, 62.9, 59.1, 57.2, 56.8, 54.9, 43.7, 43.6, 43.5, 41.1,

39.8, 34.8, 34.7, 24.7, 24.6, 24.5, 21.6, 21.5, 21.4, 20.6, 20.2, 20.1, 16. - 31P-NMR: δ

[ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 149.3, 148.7. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3411, 2965,

1686, 1629, 1528, 1341, 1250, 1103. - MS (ESI, m/z): ber.: 943.4510, gef.: 965.7158

(M+Na+).

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'4'

5'

2'

A

BCD

N(Me)2

α

112PO N

NCα'

β'

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(4-aminobiphenyl)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’-

diisopropylamino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 113

206


Es wurden 45 mg (0.05 mmol) N2-Formamidin-8-

N-(4-aminobiphenyl)-O-5’-dimethoxytrityl-2’-



mmol, 60%) eines gelben Feststoffs als Gemisch

zweier Diastereomere (I + II) im Verhältnis 1:1. -

DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v):

0.45. - Smp.: 64 °C. - [α]20546: + 13 ° (c = 0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,

Benzol-d6): 12.23 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36 (s, 1H, Hα (I)), 8.34 (s, 1H, Hα (II)), 7.96 (s,

2H, NH-4-Aminobiphenyl (I+II)), 7.52-6.67 (m, 44H, DMTr-H (I+II) + 4-Aminobiphenyl-

H (I+II)), 6.34 (dd, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.29 (dd, 3JHH = 6.3 Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 5.00-4.91 (m, 2H, H3’ (I+II)), 4.29-4.20 (m, 2H, H4’ (I+II)),

3.64-3.29 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’ (I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b

(I+II) + Formamidin-CH3 (I+II)), 2.80-2.75 (m, 1H, H2b’ (II)), 2.37-2.31 (m, 3H, H2b’ (I)

+ β’Ha (I) + β’Hb (I)), 1.81-1.73 (m, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 0.99-0.96 (m, 24H, iPr-

CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 177.3, 158.2, 158.1, 157.3,

154.6, 154.2, 146.6, 146.5, 144.3, 144.2, 136.1, 136.0, 136.0, 135.9, 133.9, 133.8,

130.7, 130.6, 130.6, 130.5, 128.8, 128.7, 128.6, 128.3, 128.2, 128.0, 127.2, 127.2,

120.4, 120.3, 118.9, 118.8, 118.2, 114.6, 113.6, 113.6, 87.1, 86.6, 86.5, 86.4, 86.3,

86.2, 85.6, 75.0, 74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 58.8, 58.6, 58.6, 58.5, 55.2, 46.6, 46.6,

46.5, 46.5, 38.6, 38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 19.6, 19.5, 19.3. - 31P-NMR: δ

[ppm] (161 MHz, Benzol-d6): 149.04, 149.01. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3422,

2926, 1629, 1529, 1384, 1249, 1103. - UV: λMax [nm] MeCN: 330,296, 251, 226. - MS

(ESI, m/z): ber.: 991.4510,gef.: 1014.4410 (M+Na+).

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

EF

G

H

113

N(Me)2

PO N

NC

α

α'β'

Experimentalteil

Synthese von N2-Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)-O-3’-[(2-cyanoethoxy)-(N,N’-

diisopropyl-amino)phosphinyl]-O-5’-dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 114


durchgeführt.

207


Formamidin-8-N-(2-aminofluorenyl)- O - 5’-

dimethoxytrityl-2’-desoxyguanosin 103 ein-

gesetzt.


mmol, 100%) eines farblosen Feststoffs

(zwei Diastereomere I + II). - DC: Rf-Wert

(Dichlor-methan/Methanol 9:1 v/v): 0.46. -

Smp.: 112 °C. - [α]20546:+ 3 ° (c = 0.21, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-

d6): 11.05 (s, 2 H, NH (I+II)), 8.39 (2 x s, 2 H, NH-Aminofluoren (I+II)), 8.10 (s, 1 H,

Hα(I)), 8.08 (s, 1 H, Hα(II)), 8.02 (m, 2 H, H(E)(I+II)), 7.76-7.70 (m, 4H, H(F)(I+II) +

H(B)(I+II)), 7.62-7.36 (m, 26 H, DMTr(I+II)), 7.28 (d, 3JHH =7,3 Hz, 2H, H(L)(I+II)),

7.21-7.15 (m, 2H, H(I)(I+II)), 7.03-7.01 (m, 4H, H(J)(I+II) + H(K)(I+II)), 6.59 (dd, 3JHH =

6.7 Hz, 1H, H1´(I)), 6.53 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1´(II)), 5.01-4.98 (m, 1H, H3´(I)),

4.91-4.88 (m, 1H, H3´(II)), 4.39 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.70 (m, 10 H, H(G)(I+II), H3´(I+II),

H5a´(I+II), H5b´(I+II)), 3.33-3.18 (m, 12H, DMTr-CH3(I+II)), 2.63-2.51 (m, 14H,

N(Me)2(I+II), H2a´(I+II)), 1.89 (ddd, 3JHH = 5.6 Hz, 3JHH = 11.5 Hz, 2H H2b´(I+II)), 1.12

(dd, 3JHH = 6.1 Hz, 12H, Hα’ (I+II), Hβ’ (I+II), iPr-H(I+II)), 1.06 (d, 3JHH = 6.7 Hz, 6H,

iPr-CH3(I)), 0.93 (d, 3JHH = 6.7 Hz, 6H, iPr-CH3(II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

Benzol-d6): 160.7, 159.2, 158,2, 157.9, 156.1, 155.7, 149.3, 143.4, 136.1, 135.8,

130.6, 128.8, 128.6, 128.5, 128.3, 128.0, 127.8, 113.6, 54.9, 43.6, 34.7, 24.7, 24.6,

21.2, 20.5, 20.1, 8.4. - 31P-NMR: δ [ppm] (202 MHz, Benzol-d6): 162.0, 161.78. -IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3377, 2966, 2930, 2836, 2760, 2722, 1681, 1607, 1575, 1457,

1427, 1344, 1301, 1251, 1178, 1154, 1115, 1076, 1033, 978, 829, 767, 732, 703. -

UV: λMax [nm] MeCN: 336. - MS (FAB, m/z): ber.: 1003.4823, gef.: 1026.4440 (M+Na+).

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

114

AB

C

D

EF

GH

IJ

K

L M

N(Me)2

α

PO N

NC α'

β'

Experimentalteil

Synthese von 3´,5´-Bis-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-2´-dG 121 Unter Stickstoffatmosphäre wurden 18.09 g

(67.67 mmol) 2´-dG*H2O 52 zweimal mit jeweils

20 mL abs. Pyridin coevaporiert. Anschließend

wurden 90 mL abs. Pyridin, 65.0 mL (173 mmol)

TBDMS-Cl (50%ig in Toluol) und 17.1 g (249

mmol) Imidazol hinzugegeben und über Nacht

bei RT gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte

mit Hilfe der DC (DCM/MeOH 9:1). Nach Zugabe von MeOH und Toluol und Entfernen

des Lösungsmittels erfolgte eine säulenchromatographische Reinigung (DCM/MeOH:

3% → 18%).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

4´3´ 2´

1´

9

8

7 65

43

2

5´

121

Ausbeute: 32.8 g (66.3 mmol, 98%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert

(DCM/MeOH 9:1): 0.31. - Smp.: 261 °C. - [α]20546: -17.6 ° (c= 1, CHCl3). - 1H-NMR: δ

[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.51 (s, 1H, NH), 7.77 (s, 1H, H8), 6.38 (s, 2H, NH2),

6.02 (dd, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 1H, H1´), 4.40 (ddd, 3JH,H= 3.0 Hz, 3JH,H= 3.0

Hz, 3JH,H= 5.6 Hz, 1H, H3´), 3.72-3.69 (m, 1H, H4´), 3.61 (dddd, 2JH,H= 15.6 Hz, 2JH,H=

11.0 Hz, 3JH,H= 5.2 Hz, 2H, H5´a, H5´b), 2.57-2.50 (m, 1H, H2´a), 2.16 (ddd, 2JH,H=

13.2 Hz, 3JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H2´b), 0.80 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.77

(s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.06, -0.07 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2) - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.7 (C6), 153.7 (C2), 135.1 (C8), 133.5

(C4), 130.6 (C5), 87.0 (C4´), 82.1 (C3´), 72.1 (C1´), 62.8 (C5´), 36.6 (C2´), 25.7

(SiC(CH3)3), 22.3 (SiC(CH3)3), 18.2 (SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0

(SiC(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 1830, 1280, 1208, 1005, 987,

968, 713, 694, 620, 572, 498. - MS (FAB, m/z): ber.: 495.2697, gef.: 496.2789

[M+H]+.

208

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 Unter Schlenkbedingungen wurden 5.00 g (10.3 mmol)

3´,5´-Bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-dG 121 mit 5.32 g

(20.1 mmol) Triphenylphosphin versetzt und 15 Minuten

unter Vakuum gerührt. Nach Zugabe von 175 mL abs.

1,4-Dioxan, 2.1 mL (20.16 mmol) destilliertem

Benzylalkohol und 3.4 mL (20.16 mmol) DIAD wurde die

Reaktionsmischung 1.5 h bei RT gerührt. Nach Entfernen

des Lösungsmittels wurde der gelbe, ölige Rückstand in

60 mL Diethylether aufgenommen und 1 h bei -20 °C aufbewahrt. Der so entstandene

Niederschlag wurde filtriert und mit kaltem Ether gewaschen. Nach Einengen des

Filtrats konnte die weitere Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 10% → 30%)

erfolgen.

O1

4´3´ 2´

1´

9

8

7 65

4

3

2

5´

N

N

N

NH2N

O

OTBDMS

209


(Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.84. - Smp.: 69.2 °C. - [α]20546: -1.5° (c= 1, CHCl3). -

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.05 (s, 1H, H8), 7.51-7.49 (m, 2H, Hc), 7.42-

7.37 (m, 2H, Hd), 7.37-7.33 (m, 1H, He), 6.48 (s, 2H, H2a), 6.21 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 5.5 (s, 2H, Ha), 4.52 (dd, 3JH,H= 7.1 Hz, 3JH,H= 5.4 Hz, 3JH,H=

2.8 Hz, 1H, H3´), 3.82 (ddd, 3JH,H= 4.3 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 1H, H4´), 3.72

(dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H5´a), 3.65 (dd, 2JH,H= 12.9 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H5´b), 2.73 (ddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H=

5.8 Hz,1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2JH,H= 12.9 Hz, 3JH,H= 5.8 Hz, 3JH,H= 3.2 Hz, 1H, H2´b),

0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.86 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H,

Si(CH3)2), 0.03, 0.02 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-

d6): 160.0 (C6), 159.7 (C2), 137.4 (C8), 136.5 (Cb), 128.3 (Cc), 128.2 (Cd), 128.0

(Ce), 122.9 (C4), 113.0 (C5), 86.8 (C4´), 82.2 (C3´), 71.5 (C1´), 66.7 (Ca), 62.9 (C5´),

59.5 (C2´), 25.5 (2 x SiC(CH3)3), 21.7 (Si(CH3)2), 20.7 (Si(CH3)2), 13.9 (2 x SiC(CH3)3).

- IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3396, 2770, 2711, 1876, 1755, 1705, 1674,

1614, 1574, 1557, 1548, 1486, 1463, 1416, 1005, 985, 919, 619, 508. - MS (FAB,

m/z): ber.: 585.3167, gef.: 586.3253 [M+H]+.

TBDMSO

dc

ba

e

40

Experimentalteil

Darstellung von Nitrosobenzol 120 Es wurden 2.79 g (30.0 mmol) Anilin 1 in 9 mL MeOH gelöst und mit 16.5

mL (120 mmol) 30% H2O2 und 13.5 mL H2O versetzt. Anschließend erfolgte

die Zugabe von 432 mg (3.0 mmol) Mo(IV)O3 und 3 mL 1 mM KOH-Lösung.

Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Zugabe

von 45 mL H2O wurde der braune Niederschlag filtriert, zweimal mit

jeweils 30 mL H2O und anschließend 15 mL kaltem MeOH gewaschen. Der

Niederschlag wurde aus Methanol umkristallisiert.

43

21

NO

120

Ausbeute: 420 mg (3.93 mmol, 13%) brauner Kristalle. – DC: Rf-Wert (Dichlormeth-

an/Methanol 9:1): 0.93. – Tm: 60.4 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.94

(dd, 3JH,H= 8.4 Hz, 4JH,H= 1.3 Hz, 2H, H2), 7.88 (tt, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, 1H,

H4), 7.75 (dt, 3JH,H= 7.6 Hz, 3JH,H= 7.6 Hz, 2H, H3). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 166.1 (C1), 136.6 (C3), 129.7 (C4), 120.6 (C2). - IR: Wellenzahl [cm-1]

(KBr-Pressling): 3091, 3059, 1990, 1706, 1456, 1295, 1255, 1126, 923, 714. - MS (EI,

m/z): ber.: 107.0371, gef.: 107 [M].

Versuch zur Darstellung von N2-Aza-anilino-2´-dG 119 Es wurden 41.0 mg (0.38 mmol) Nitrosobenzol

120 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL Essigsäure

gelöst und auf 40 °C geheizt. Anschließend

wurde eine Lösung von 100 mg (0.35 mmol) 2´-

dG·H2O 52 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL

Essigsäure langsam hinzugetropft. Die

Reaktionsmischung wurde 26 h bei 40 °C

gerührt. Unter Eiskühlung wurde die

Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung alkalisch gemacht und mit Ether

dreimal extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit H2O gewaschen.

Die Reaktionskontrolle erfolgte dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1).

1´

5´

4´

3´ 2´

7

8

9b´

e´

d´c´

5

43

2

16

119

NH

N

N

N

O

OH

HO

O

NN

Es konnten nur Zersetzungsprodukte erhalten werden.

210

Experimentalteil

Versuch zur Darstellung von 3´,5´-Bis(TBDMS)-N2-aza-anilino-2´-dG 119 Es wurden 50.0 mg (0.40 mmol)

Nitrosobenzol 120 in 3.5 mL Ethanol und

3.5 mL Essigsäure gelöst und auf 40 °C

geheizt. Anschließend wurde eine Lösung

von 200 mg (0.40 mmol) 3´,5´-Bis(TBDMS)-

2´-dG 121 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL

Essigsäure langsam hinzugetropft. Die

Reaktionsmischung wurde 26 h bei 40 °C

gerührt. Unter Eiskühlung wurde die Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung

alkalisch gemacht und mit Ether dreimal extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden mit H2O gewaschen. Die Reaktionskontrolle erfolgte

dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1).

119

NH

N

N

N

O

OTBDMS

TBDMSO

O

NN

1´

b´9

8

7 65

43

2

1

5´

4´

3´ 2´

e´

d´c´

Bei dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung. Das Edukt konnte reisoliert werden.

Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-Bis(TBDMS)-N2-aza- anilino-2´-dG 119b Es wurden 40.0 mg (0.38 mmol) Nitrosobenzol

120 in 3.5 mL Ethanol und 3.5 mL Essigsäure

gelöst und auf 40 °C geheizt. Anschließend

wurde eine Lösung von 183 mg (0.31 mmol) O6-

Benzyl-3´,5´-Bis(TBDMS)-2´-dG 40 in 3.5 mL

Ethanol und 3.5 mL Essigsäure langsam

hinzugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 26

h bei 40 °C gerührt. Unter Eiskühlung wurde die

Reaktionslösung mit halb konz. NaOH-Lösung

alkalisch gemacht und mit Ether dreimal

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit H2O gewaschen. Die

Reaktionskontrolle erfolgte dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 2:1).

211

Bei dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung. Das Edukt konnte reisoliert werden.

119b

NH

N

N

N

O

OTBDMS

TBDMSO

O

ed

c

b

a

NN

1´

b´9

8

7 65

43

2

1

5´

4´

3´ 2´

e´

d´c´

Experimentalteil

Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxanthosin 124 Es wurden 300 mg (0.52 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-

bis(TBDMS)-2´-dG 121 mit 500 mg Na2Fe(CN)5NO ·

2H2O in 5 mL 1 M NaOH gegeben. Die

Reaktionsmischung wurde 4 h bei 70 °C gerührt. Nach

Abkühlen der Reaktionslösung auf 25 °C wurden 10 mL

H2O hinzugegeben. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure

auf 3.8 eingestellt. Nach Zugabe von 5 mL MeOH wurde

die Reaktionsmischung filtriert. Das Filtrat wurde

chromatographisch (PE/EE; 4:1) gereinigt.

N

NH

N

N

O

OTBDMS

TBDMSO

O

O

1

a

9

8

7 65

43

2

4´3´ 2´

1´

ed

c

b

5´

124

Es konnte keine Reaktion beobachtet werden. Das Edukt konnte reisoliert werden.

Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 Es wurden 300 mg (0.52 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-

bis(TBDMS)-2´-dG 121 auf 0 °C gekühlt und mit

3.2 mL (2 mmol) tert-Butylnitrit versetzt. Die

Reaktionsmischung wurde 5 Minuten gerührt. Nach

Einengen der Reaktionslösung erfolgte die

chromatographische Aufreinigung am Chromatotron

(PE/EE; 4% → 100%).

N

NH

N

N

O

OTBDMS

DMSO

O

O

212

Ausbeute: 27 mg (0.05 mmol, 9%) eines orange

farbenen Feststoffs. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.56. -[α]20546: -0.6 °

(c= 0.64, CHCl3). - Smp.: 107 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 11.22 (s,

1H, NH), 8.27 (s, 1H, H8), 7.43-7.31 (m, 5H, arom.-H), 6.26 (dd, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H=

7.6 Hz, 1H, H1´), 5.54 (s, 2H, Ha), 4.59-4.54 (m, 1H, H3´), 3.86-3.83 (m, 1H, H4´),

3.60-3.49 (m, 2H, H5´a, H5´b), 2.73-2.66 (m, 1H, H2´a), 2.26 (dddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 2.9 Hz, 1H, H2´b), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.87 (s, 9H,

Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.1, 0.08 (s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ

[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.7 (C6), 154.3 (C2), 134.6 (C8), 129.7 (Cb), 128.4

(Cc), 128.1 (Cd), 128.0 (Ce), 125.5 (C4), 117.5 (C5), 88.0 (C4´), 87.4 (C3´), 48.6

(C1´), 47.7 (Ca), 45.0 (C5´), 38.2 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 22.3 (SiC(CH3)3), 18.2

1

a

9

8

7 65

43

2

4´3´ 2´

1´

ed

c

b

5´

124

TB

Experimentalteil

(SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-

Pressling): 3302, 2983, 2930, 2857, 1740, 1648, 1593, 1444, 1403, 1374, 1359, 1242,

1103, 1047, 836, 779, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.: 586.3007, gef.: 587.3085

[M+H]+.

2. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 Es wurden 265 mg (0.451 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-

bis(TBDMS)-2´-dG 121 in 6.7 mL Aceton und 1.3

mL H2O gelöst. Nach Zugabe von 0.1 mL 70%

HClO4 wurde die Reaktionslösung auf 10 °C gekühlt

und mit 57 mg (0.82 mmol) NaNO2 in 2.6 mL H2O

tropfenweise versetzt. Nach 1 h Rühren bei 10 °C

wurde das Lösungsmittel abdestilliert und der

Rückstand in 13 mL CH2Cl2 aufgenommen. Die

wässrige Phase wurde 3 x mit DCM extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen

wurden über Natriumsulfat getrocknet. Die Reinigung erfolgte am Chromatotron

(DCM/MeOH; 0% → 100%).

TB

N

NH

N

N

O

OTBDMS

DMSO

O

O

1

a

9

8

7 65

43

2

4´3´ 2´

1´

ed

c

b

5´

124

Ausbeute: 17 mg (0.03 mmol, 6%) eines orangenen Feststoffs. Analytik siehe Seite

212.

Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-O2-trifluormethansulfonyl-2´-dG 123 Es wurden 15 mg (0.03 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-

bis(TBDMS)-2´-desoxyxhanthosin 124 mit 12 mg

(0.12 mmol) Triethylamin und einer katalytischen

Menge DMAP in 0.3 mL DCM versetzt. Unter

Eiskühlung erfolgte die Zugabe von 5 µL (5.23

mg; 0.03 mmol) Trifluor-

methansulfonsäureanhydrid. Die Reaktions-

mischung wurde 0.5 h bei 0 °C gerührt. Nach

Entfernen des Lösungsmittels konnte die

N

N

N

N

O

OTBDMS

TBDMSO

O

OS

O

O CF31´

2

1

5´

4´3´ 2´

9

8

7 65

43

dc

ba

e

123

213

Experimentalteil

Aufreinigung am Chromatotron erfolgen (DCM/MeOH; 0% → 100%).

Ausbeute: 8.0 mg (0.01 mmol, 37%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.98. -[α]20546: -0.2 ° (c= 0.72, CHCl3). - 1H-NMR: δ

[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.26 (s, 1H, H8), 7.42-7.34 (m, 5H, arom.-H), 6.26 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 7.4 Hz, 1H, H1´), 5.54 (s, 2H, Ha), 4.59-4.54 (m, 1H, H3´), 3.86-

3.84 (m, 1H, H4´), 3.60-3.57 (m, 2H, H5á, H5´b), 3.53-3.50 (m, 1H, H2á), 2.26 (dddd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 5.9 Hz, 3JH,H= 2.9 Hz, 1H, H2´b), 0.90 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an

H3´), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.11 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.1, 0.07 (s, 2 * 3H,

Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.3 (C6), 153.3 (C2), 143.8

(CF3), 131.7 (C8), 130.0 (Cb), 128.4 (Cc), 128.1 (Cd), 128.0 (Ce), 125.7 (C4), 116.5

(C5), 88.0 (C4´), 81.1 (C3´), 72.5 (C1´), 67.6 (Ca), 61.2 (C5´), 32.2 (C2´), 25.7

(SiC(CH3)3), 24.8 (SiC(CH3)3), 19.2 (SiC(CH3)3), 17.7 (SiC(CH3)3), -3.6, -5.1

(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3433, 2855, 1735, 1685, 1511,

1431, 1253, 1102, 1031, 739, 481. - MS (FAB, m/z): ber.: 686.5171, gef.: 686.6

[M+H]+.

1. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 Es wurden 20 mg (0.03 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-

bis(TBDMS)-O2-trifluormethansulfonyl-2´-dG 123

mit 20 µL Phenylhydrazin in 0.5 mL DMF versetzt.

Die Reaktionsmischung wurde 10 Tage bei RT

gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels

erfolgte die Reinigung am Chromatotron (PE/EE;

10%).

N

N

N

N

O

OTBDMS

TBDMSO

O

NH

HN

1´

65

4

3

2

1

5´

4´

3´ 2´

7

8

9

c

ba d

e

b´

e´d´

c´

122Ausbeute: 10 mg (0.01 mmol, 53%) eines

(Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.45. – [α]

gelben Öls. - DC: Rf-Wert 20

546: + 13 °(c = 1.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ

[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 9.41 (s, 1H, NH an Cb´), 8.91 (d, 3JH,H= 2.3 Hz, 1H, NH

an C2), 8.09 (s, 1H, H8), 7.34-7.30 (m, 10H, arom.-H), 6.68 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H=

7.3 Hz, 1H, H1´), 5.45 (s, 2H, Ha), 4.49 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 5.7 Hz, 2H, H3´,

H4´), 3.70-3.63 (m, 2H, H5á, H5´b), 3.60-3.57 (m, 1H, H2á), 2.26 (dddd, 2JH,H= 13.1

Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 3.3 Hz, 1H, H2´b), 0.88 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.85 (s,

9H, Si-C(CH3)3 an H5´), 0.07 (dd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 2.5 Hz, 6H,

214

Experimentalteil

Si(CH3)2), 0.02 (s, 6H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.1

(C6), 159.8 (C2), 138.6 (C8), 137.1 (Cb), 136.3 (Cb´), 128.8, 128.5, 128.3, 128.1,

128.0, 127.7, 127.0 (arom.-C), 126.1 (C4), 118.9 (C5), 87.2 (C4´), 82.8 (C3´), 72.2

(C1´), 66.9 (Ca), 62.8 (C5´), 38.4 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9

(SiC(CH3)3), 17.6 (SiC(CH3)3), -5.0, -5.5 (Si(CH3)2). - MS (FAB, m/z): ber.: 676.5953,

gef.: 677.6 [M+H]+.

1. Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126 Es wurden 100 mg (1.70 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-

bis(TBDMS)-2´-dG 40 mit 0.6 mL tert-Butylnitrit und

0.6 mL Bromoform versetzt und 30 Minuten bei

90 °C refluxiert. Die Reaktionskontrolle erfolgte

dünnschichtchromatographisch (PE/EE; 4:1). Nach

Entfernen des Lösungsmittels erfolgte die Reinigung

am Chromatotron (PE/EE; 10%).

N

N

N

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

a

5´

4´

e

dc

b

126Das Produkt konnte nicht erhalten werden.

2. Versuch zur Darstellung von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126

215

Es wurden 352 mg (5.12 mmol) NaNO2 und 0.66 mL

(5.1 mmol) TMS-Br in 2 mL CCl

4 gelöst und auf 0 °C

gekühlt. Nach Zugabe von 100 mg (1.70 mmol)

O

O

6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 wurde die

Reaktionsmischung weitere 1.5 h bei dieser

Temperatur gerührt. Nach Erwärmen auf RT erfolgte

die dünnschichtchromatographische Reaktions-

kontrolle (PE/EE; 4:1). Nach Entfernen des Lösungsmittels erfolgte eine weitere

Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 10%).

Das Produkt konnte nicht erhalten werden.

N

N

N

N

O

Br

OTBDMS

TBDMSO

1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

a

5´

4´

e

dc

b

126

Experimentalteil

Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-brom-2´-dG 126

Es wurden 3.00 g (4.60 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2´-dG 40 mit 2.62 g (7.07

mmol) Antimon(III)bromid zusammen gegeben und

auf 0 °C gekühlt. Es wurden 41 mL zuvor auch auf

0 °C gekühltes CH2Br2 hinzugegeben. Anschließend

wurde die gesamte Reaktionsmischung auf -10 °C

gekühlt und mit 2.10 mL (17.6 mmol) t-Butylnitrit

versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -10

°C gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte

dünnschicht-chromatographisch (PE/EE; 4:1). Der

Reaktionsabbruch erfolgte durch Zugabe von 8.13 g (96.8 mmol) Natriumbicarbonat in

203 mL Eis-Wasser. Der Niederschlag wurde filtriert und das Filtrat dreimal mit

Dichlormethan gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden über

Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels konnte die

Aufreinigung am Chromatotron (PE/EE; 5% → 10%) erfolgen.

N

N

N

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

a

5´

4´

e

dc

b

126

Ausbeute: 1.21 g (1.86 mmol, 40%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert (Dichlor-

methan/Methanol 9:1): 0.88. - [α]20546: + 3.1 ° (c= 0.8, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm]

(400 MHz, DMSO-d6): 8.53 (s, 1H, H8), 7.53-7.51 (m, 2H, Hc), 7.44-7.38 (m, 3H, Hd,

He), 6.33 (dd, 3JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 5.60 (s, 2H, Ha),

4.82-4.76 (m, 1H, H3´), 3.87-3.78 (m, 2H, H5´a, H4´), 3.65 (dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 4.2 Hz, 1H, H5´b), 2.92 (ddd, 3JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 8.9 Hz, 3JH,H=

4.5 Hz, 1H, H2´b), 2.37 (ddd, 2JH,H= 9.3 Hz, 3JH,H= 6.9 Hz, 3JH,H= 1.8 Hz, 1H, H2´b),


Si(CH3)2), 0.00, -0.01 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-

d6): 159.0 (C6), 152.6 (C2), 143.4 (C8), 138.6 (Cb), 128.6 (Cc), 128.4 (Cd), 128.1

(Ce), 117.7 (C4), 110.6 (C5), 87.0 (C4´), 84.0 (C1´), 71.4 (C3´), 69.0 (Ca), 62.1 (C5´),

38.1 (C2´), 25.5 (2 x SiC(CH3)3), 21.7 (Si(CH3)2), 20.7 (Si(CH3)2), 13.9 (2 x SiC(CH3)3).

- IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3629.90, 3448.12, 2928.88, 2856.67, 1735.58,

1701.46, 1654.92, 1594.63, 1566.17, 1459.15, 1313.12, 836.83. - MS (FAB, m/z):

ber.: 648.2163, gef.: 649.2281 [M+H]+.

216

Experimentalteil

2. Synthese von O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 122 Die Synthese wurde nach AAV 7 mit 782 mg

(1.25 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-

brom-2´-dG 126 durchgeführt.

N

N

N

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

O

HN

1

2´

1´

e

dc

ba

9

8

7 65

43

2

5´

4´

3´

e´

d´

c´b´

122

Ausbeute: 707 mg (1.04 mol, 83%) eines

orange farbenen Feststoffs.

Analytik siehe Seite 214.

Synthese von 3´,5´-Bis(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 118

Unter Wasserstoffatmosphäre wurden 210 mg

(0.32 mmol) O6-Benzyl-3´,5´-bis(TBDMS)-2-N-

phenylhydrazino-2´-dG 122 mit einer Spatelspitze

Pd/C und in 8 mL abs. Methanol versetzt und 5 h

bei RT gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte

dünnschicht-chromatographisch (DCM/MeOH;

9:1). Der Katalysator wurde mittels Zentrifuge entfernt. Nach Entfernen des

Lösungsmittels erfolgte die Reinigung am Chromatotron (DCM).

1´

65

43

2

1

5´

4´

3´ 2´

7

8

9b´

e´

d´

cŃH

N

N

N

O

OTBDMS

TBDMSO

O

NH

HN

118

Ausbeute: 140 mg (0.21 mmol, 60%) eines gelben Öls. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol 9:1): 0.50. - [α]20546: - 2.0 ° (c= 0.18, CHCl3). - 1H-NMR: δ

[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.58 (s, 1H, NH), 10.20 (s, 1H, NH an Cb´), 8.42 (s, 1H,

NH an C2), 7.94 (s, 1H, H8), 7.74-7.63 (m, 2H, Hc´), 7.41-7.35 (m, 1H, He´), 7.18 (dd, 3JH,H= 8.4 Hz, 3JH,H= 7.5 Hz, 2H, Hd´), 6.12 (dd, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´),

4.74-4.71 (m, 1H, H3´), 4.49-4.47 (m, 2H, H4´, H5á), 4.36-4.32 (m, 1H, H5´b), 3.71-

3.61 (m, 2H, H2á, H2´b), 0.89 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an

H5´), 0.10 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.04 (d, 3JH,H= 8.4 Hz, 4JH,H= 1.7 Hz, 6H, Si(CH3)2). - 13C-

NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 163.5 (C6), 151.1 (C2), 140.8 (C8), 139.8 (Cb´),

129.8 (Cc´), 128.8 (Cd´), 128.1 (Ce´), 127.0 (C4), 109.5 (C5), 87.1 (C4´), 82.3 (C3´),

72.2 (C1´), 62.8 (C5´), 36.7 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.7

(SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.0 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-

217

Experimentalteil

Pressling): 2954, 2928, 2857, 1687, 1109, 776, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.:

586.3119, gef.: 587.3197 [M+H]+.

Synthese von 2-N-Phenylhydrazino-2´-dG 127 Unter Schlenkbedingungen wurden 140 mg (0.21

mmol) 3´,5´-Bis(TBDMS)-2-N-phenyl-hydrazino-2´-dG

118 in 4 mL abs. THF und 4 mL abs. DCM gelöst und

mit 0.1 mL Et3N und 0.3 mL Et3N·3HF versetzt. Die

Reaktionsmischung wurde 24 h bei RT gerührt. Die

Aufreinigung erfolgte am Chromatotron (DCM/MeOH;

9:1).

1´

65

43

2

1

5´

4´

3´ 2´

7

8

9b´

e´

dć´

NH

N

N

N

O

OH

HO

O

NH

HN

127

Ausbeute: 100 mg (0.27 mmol, 68%) eines roten Feststoffs. – DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol; 9:1): 0.12. – Smp.: 89 °C. - [α]20546: + 5.0 ° (c= 0.15,


1H, NH an Cb´), 8.04 (s, 1H, NH an C2), 7.96 (s, 1H, H8), 7.73-7.69 (m, 2H, Hc´),

7.20-7.16 (m, 1H, He´), 6.79-6.75 (m, 2H, Hd´), 6.42 (dd, 3JH,H= 6.8 Hz, 3JH,H= 6.8 Hz,

1H, H1´), 5.33 (d, 3JH,H= 4.2 Hz, 1H, 3´-OH), 4.93 (dd, 3JH,H= 5.6 Hz, 3JH,H= 5.6 Hz, 1H,

5´-OH), 4.42-4.41 (m, 1H, H3´), 3.90-3.85 (m, 1H, H5á), 3.74-3.75 (m, 2H, H5´b, H4´),

2.66-2.59 (m, 1H, H2á), 2.19-2.10 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 155.7 (C6), 152.7 (C2), 145.8 (C4), 134.2 (C8), 130.5 (C5), 129.7 (Ce´),

128.7 (Cd´), 123.6 (Cc´), 114.6 (Ca´), 83.6 (C4´), 82.5 (C5´), 70.5 (C1´), 61.5 (C5´),

45.6 (C2´). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3415, 2922, 1685, 1570, 1316,

1091. – UV: λMax [nm] MeCN: 256, 390. - MS (FAB, m/z): ber.: 358.1390, gef.: 359.1

[M+H]+.

218

Experimentalteil

Synthese von 5´-O-(DMTr)-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 128


2-N-Phenylhydrazino-2´-dG 127 in 12 mL

Pyridin gelöst und mit 376 mg (1.11 mmol)

DMTrCl versetzt und 20 h bei

Raumtemperatur gerührt. Die

Reaktionskontrolle erfolgte dünnschicht-

chromatographisch (DCM/MeOH: 9/1). Zur

Beendigung der Reaktion wurden je 20 mL Natriumcarbonatlösung und Dichlormethan

zugegeben und die wässrige Phase dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die

vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Das

Lösungsmittel wurde durch zweimalige Coevaporation mit Toluol entfernt. Das Produkt

wurde am Chromatotron (DCM/MeOH 0% → 50%) aufgereinigt.

O

NH

N

N

NH

N

O

OH

219

Ausbeute: 49 mg (0.07 mmol, 10%) eines orangefarbigen Feststoffes. - DC: Rf-Wert

(Dichlormethan/Methanol: 9/1): 0.37. - Smp.: 89 °C. - [α]20546:+ 5.0 ° (c= 0.15, CHCl3).

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.20 (s, 1H, NH), 8.36 (s, 1H, H8), 7.91 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, HB), 7.51 (d, 3JH,H= 8.5 Hz, 2H, HC), 7.29-7.27 (m, 1H, NH an CA),

7.19-7.10 (m, 10H, Hc, Hg, Hh, Hi, NH an C2), 6.74-6.68 (m, 4H, Hd), 6.45 (dd, 3JH,H=

6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 5.40 (d, 3JH,H= 4.7 Hz, 1H, 3’-OH), 4.43-4.40 (m, 1H,

H3´), 4.03-3.99 (m, 1H, H4´), 3.68 (s, 6H, 2xOMe), 3.74-3.67 (m, 2H, H5’a, H5´b),

2.87-2.82 (m, 1H, H2´a), 2.47 (s, 3H, Me), 2.39-2.32 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ

[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160 (C6), 158.2 (2xCe), 156.0 (C2), 149.2 (CD), 145.3

(CA), 140.4 (C8), 130-128 (aromatische C), 124.7 (C4), 124.5 (C5), 113.3 (4x Cd),

86.0 (C4´), 86.9 (Ca), 83.7 (C1´), 70.9 (C3´), 61.5 (C5´), 55.3 (2xOMe), 40.1 (C2´),

21.7 (Me). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3415, 2922, 1685, 1570, 1316,

1091. - MS (FAB, m/z): ber.: 674.2853, gef.: 675.2932 [M+H]+.

DMTrO

1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

128

HN

D

CB

A

4´

Experimentalteil

Versuch zur Darstellung von 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)-

phosphinyl)]-5´-O- (DMTr)-2-N-p-tolylhydrazino-2´-dG 129 33 mg (0.049 mmol) 5’-O-DMTr-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 128 wurden in je 3 mL

Dichlormethan und Acetonitril gelöst und mit 2 mL Bis-N,N’-Diisopropylamino-(2-

cyanoethyl)-phosphit 107 versetzt und 1.5 h bei Raumtemperatur gerührt.

220

.Ausbeute: 30 mg (0.034 mmol, 70%)

Nach Zugabe von 5%iger

Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurde die

wässrige Phase dreimal mit DCM extrahiert.

Die vereinigten organischen Phasen wurden

über Natriumsulfat getrocknet, vom

Lösungsmittel befreit und säulen-

chromatographisch über Aluminium(III)oxid

getrennt ( Laufmittel: DCM/MeOH 0% → 2%)

eines gelben Feststoffes, welcher sich jedoch augenblicklich an der Luft zersetzt

(Grünfärbung).

NH

N

N

NH

N

O

O

DMTrO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

129

HN A

D

CB

PO N

NC

Synthese von 2-(p-Cyanophenyl)ethanol 134

In einem Kolben wurden 12.5 g (200 mmol) Natriumnitrit in 10 mL Wasser

gelöst und zu einer Lösung aus 25.0 g (185 mmol)

2-(4-Aminophenyl)ethanol 133 und 125 mL eines Salzsäure/Eis-Gemisches

(Verhältnis 2:3) bei 3 °C getropft. Nach anschließender Neutralisation mit

Natriumcarbonat-Lösung wurde die Lösung bei 0 °C zu 300 mL einem mit

Kupfercyanid-Lösung (18.5 g Kupferchlorid und 24.5 g Natriumcyanid in 125

mL Wasser) überschichteten Toluol/Benzol-Gemisch (Verhältnis 1:1) getropft. Nach

weiterem Rühren für eine Stunde bei 0 °C, wurde die Lösung bei Raumtemperatur

eine Stunde und anschließend für 1.5 Stunden bei 50 °C stehengelassen. Nach

Abtrennung der organischen Phase wurde die wässrige Phase dreimal mit je 50 mL

Dichlormethan extrahiert, bevor die vereinigten organischen Phasen über

Natriumsulfat getrocknet und vom Lösungsmittel befreit wurden. Das Rohprodukt

wurde säulenchromatographisch gereinigt (DCM/MeOH; 0% → 5%).

CN

OH

αβ

γδ

12

134

Experimentalteil

Ausbeute: 12.0 g (81.6 mmol, 44%) eines orangenen Feststoffs. – DC: Rf-Wert

(DCM/Methanol 9:1): 0.54 – Smp.: 49 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

7.73 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hγ), 7.43 (d, 3JHH = 8.4 Hz, 2H, Hβ), 4.70 (t, 3JHH = 5.2 Hz, 3JHH = 5.2 Hz, 1H, OH), 3.63 (ddd, 3JHH = 5.2 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 3JHH = 6.6 Hz, 2H,

H1), 2.79 (t, 3JHH = 6.7 Hz, 3JHH = 6.7 Hz, 2H, H2) - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 146.2 (Cα), 132.1 (Cβ), 130.0 (Cγ), 119.2 (Cδ), 108.8 (CN), 61.5 (C1), 39.0

(C2) – IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2356, 2078, 1826, 1705, 1676, 1207, 741

- MS (FAB, m/z): ber.: 147.06, gef.: 148.07 (M+H+).

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2´-dG 135 Es wurden 32.8 g (66.3 mmol) 3´,5´-bis-O-

(TBDMS)-2´-dG 121 mit 42.3 g (161 mmol)

Triphenylphosphin und 33.2 g (225 mmol) 2-(4-

Cyanophenyl)ethanol 134 in 500 mL abs. Dioxan

gelöst. Bei 0 °C wurden 22.7 mL (22.1 g, 109 mmol)

DIAD zugetropft und die Lösung über Nacht bei RT

gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels DC

(PE/EE: 1:1). Nach Entfernen des Lösungsmittels

wurde das Produkt säulenchromatographisch

(PE/EE: 10% → 30%) gereinigt.

N

N

N

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

135

a

bc

fe

d CN

Ausbeute: 38 g (61 mmol, 92%) eines gelben Feststoffes. - DC: Rf-Wert (PE/EE: 1:1):

0.51. - Smp.: 69 °C. - [α]20546: -0.5 ° (c= 1.67, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,

DMSO-d6): 7.93 (s, 1H, H8), 7.68-7.62 (m, 2H, Hd), 7.46 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, He),

6.36 (s, 2H, NH2), 6.11 (dd, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 7.4 Hz, 1H, H1´), 4.70 (ddd, 3JH,H=

6.2 Hz, 3JH,H= 6.2 Hz, 3JH,H= 12.4 Hz, 1H, H3´), 3.95 (q, 3JH,H= 7.1 Hz, 3JH,H= 7.1 Hz, 3JH,H= 7.1 Hz, 1H, H4´), 3.73-3.70 (m, 1H, H5´a), 3.63 (dd, 3JH,H= 5.9 Hz, 2JH,H= 11.0

Hz, 1H, H5´b), 3.55 (dd, 3JH,H= 5.2 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz, 2H, Ha), 2.69 (t, 3JH,H= 5.7 Hz,

2H, Hb), 2.66-2.60 (m, 1H, H2´a), 2.17 (ddd, 2JH,H= 13.1 Hz, 3JH,H= 6.0 Hz, 3JH,H= 3.2

Hz, 1H, H2´b), 0.78 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.75 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s,

6H, Si(CH3)2), -0.07, -0.08 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 160.4 (C6), 160.2 (C2), 137.9 (C8), 137.8 (Cf), 134.9 (Cb), 133.4 (Cc),

221

Experimentalteil

130.4 (Cd), 129.2 (C4), 119.1 (Ce), 114.1 (C5), 109.7 (CN), 87.3 (C4´), 82.6 (C3´),

72.5 (C1´), 67.59 (Ca), 65.9 (C5´), 60.1 (C2´), 26.0 (2 * SiC(CH3)3), 22.2 (Si(CH3)2),

21.1 (Si(CH3)2), 14.4 (2 * SiC(CH3)3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3373,

2929, 2884, 2857, 2228, 1733, 1611, 1585, 1506, 1462, 1410, 1372, 1332, 1252,

1178, 1111, 1070, 968, 939, 838, 780, 671, 640, 562. - MS (FAB, m/z) ber.: 625.3354,

gef.: 625.3348 [M+H]+.

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-brom-2´-dG 132 Es wurden 37.95 g (60.73 mmol) O6-2-(4-

Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2´-dG

135 mit 30.00 g (46.23 mmol) Antimon(III)bromid

zusammengegeben und auf 0 °C gekühlt. Dann

wurden 150 mL zuvor auch auf 0 °C gekühltes

CH2Br2 hinzugegeben, die gesamte

Reaktionsmischung auf -10 °C gekühlt und mit

22.0 mL (22.8 g, 119.4 mmol) t-Butylnitrit versetzt.

Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei -10 °C

gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte mittels DC (PE/EE: 4:1). Der

Reaktionsabbruch erfolgte durch Zugabe zu 60 g Natriumhydrogencarbonat in 1000

mL Eis-Wasser. Der Niederschlag wurde filtriert und dreimal gründlich mit DCM

gewaschen. Die wässrige Phase wurde dreimal mit DCM extrahiert und die

vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen

des Lösungsmittels konnte die Reinigung säulenchromatographisch (PE/EE: 10% →

35%) erfolgen.

132

N

N

N

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

Ausbeute: 20.9 g (30.3 mmol, 50%) eines gelben Sirups - DC: Rf-Wert (PE/EE: 4:1):

0.61. - [α]20546: +8.7 ° (c= 0.19, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.38

(s, 1H, H8), 7.66 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, Hd), 7.44 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, He), 6.22 (t, 3JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 4.58 (dd, 3JH,H= 9.4 Hz, 3JH,H= 4.8 Hz, 1H, H3´),

3.93-3.88 (m, 2H, H4´, H5´a), 3.74-3.65 (m, 2H, Ha), 3.54 (dd, 2JH,H= 11.0 Hz, 3JH,H=

4.3 Hz, 1H, H5´b), 3.11 (t, 3JH,H= 6.5 Hz, 2H, Hb), 2.82-2.76 (m, 1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2JH,H= 13.2 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz, 3JH,H= 4.8 Hz, 1H, H2´b), 0.77 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´),

0.67 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.13, -0.17 (2 * s, 2 * 3H,

222

Experimentalteil

Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.6 (C2), 160.2 (C6), 152.9

(C5), 144.4 (C8), 143.8 (Cb), 142.3 (Cf), 132.6 (Cc), 130.4 (Cd), 121.1 (C4), 119.2

(Ce), 109.8 (CN), 87.4 (C4´), 84.3 (C3´), 71.1 (C1´), 67.8 (C5´), 62.5 (Ca), 60.1 (C2´),

26.0 (2 * SiC(CH3)3), 22.6 (Si(CH3)2), 21.1 (Si(CH3)2), 18.1 (2 * SiC(CH3)3) - IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3446, 2954, 2930, 2857, 2228, 1734, 1653,

1596, 1569, 1507, 1472, 1430, 1362, 1314, 1256, 1227, 1164, 1110, 1070, 1030, 837,

778. - MS (FAB, m/z): ber.: 729.3854, gef.: 730.3899 [M+H]+.

Synthese von 4-Hydrazinobiphenyl 125 1.52 g (9.00 mmol) 4-Aminobiphenyl 2 wurden in einem

Gemisch aus 15 mL Wasser und 5.7 mL konzentrierter

Salzsäure suspendiert und auf -10 °C gekühlt. Dann wurde

eine Lösung aus 0.65 g (9.00 mmol) Natriumnitrit in 5 mL

Wasser langsam zugetropft. Man ließ noch 4 Stunden bei -10 °C rühren und gab dann

die hellgelbe Lösung in der Kälte zu einer Lösung von 7.6 g (40 mmol) SnCl2 in 7.6 g

konzentrierter Salzsäure. Nach 1 Stunde wurde der Niederschlag abfiltriert und das

Produkt durch Eintragen des Niederschlages in 25%-ige Ammoniaklösung in Freiheit

gesetzt. Das Hydrazin 125 wurde mit Ether extrahiert, die organische Phase über

Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

3

4

5 6

1

2

1'

2' 3'

4'

5'6'

NHNH2

125

Ausbeute: 1.42 g (7.21 mmol, 80%) hellgelbe, glänzende Blättchen. - DC: Rf-Wert

(DCM/MeOH 19:1): 0.65. - Smp.: 135 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, CDCl3): 7.48

(d, 3JH,H= 7.2 Hz, 2H, H2´, H6´), 7.42 (d, 3JH,H= 8.7 Hz, 2H, H2, H6), 7.34 (d, 3JH,H= 7.2

Hz, 2H, H3´, H5´), 7.31-7.28 (m, 1H, H4´), 6.82 (d, 3JH,H= 8.7 Hz, 2H, H3, H5), 5.17 (s,

1 H, NH), 3.54 (2H, NH2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, CDCl3):150.7 (C8), 132.5

(C4), 128.8 (C2,C2´), 128.0 (C8, C8´), 126.6 (C1, C3, C3´), 126.5 (C5), 112.5 (C7,

C7´). - MS (EI, m/z): ber.: 184.10, gef.: 184 [M].

Synthese von 2-Hydrazinofluoren 125.2

223

HN NH2

1

2

34

5

67

89

10

1112

13

125.2

Es wurden 1.0 g (5.5 mmol) 2-Aminofluoren 3 in 4 mL

konz. Salzsäure suspendiert und auf 0 °C gekühlt. Es

Experimentalteil

erfolgte die tropfenweise Zugabe von 378 mg (5.50 mmol) Natriumnitrit, gelöst in 4 mL

kaltem Wasser, und weiteres Rühren bei 0 °C für 30 Minuten. Anschließend erfolgte

die tropfenweise Zugabe von 3.10 g (16.5 mmol) Zinnchlorid, gelöst in 6 mL kalter

konz. Salzsäure, bei 0 °C. Nach Lagerung über Nacht wurde der Niederschlag filtriert

und mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung und Petrolether:Diethylether (2:1)

gewaschen. Nach Aufnahme des Niederschlags in frisch angesetzter Natronlauge

wurde mit Diethylether extrahiert und die organische Phase über Natriumsulfat

getrocknet. Das Hydrochlorid konnte nachließen durch Fällung mit konz. Salzsäure

unter Eiskühlung erhalten werden. Das freie Hydrazin wurde durch Extraktion mit

Diethylether gegen Natronlauge und abschließendem Einengen der organischen

Phase erhalten.

Ausbeute: 533 mg (2.36 mmol, 43%) eines orangen Feststoffs. - Smp.: 104 °C. - 1H-

NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 7.89 (d, 3JHH = 7.7Hz, 1H, H(4)), 7.59-7.67 (m,

2H, H(1) + H(12)), 7.24-7.50 (m, 3H, H(3)+H(9)+) H(10), 7.08-7.21 (m, 1H, H(11)),

5.16 (s, 1H, NH), 3.91 (s, 1H, CH2-a), 3.77 (s, 1H, CH2-b), 3.72 (s, 2H, NH2). - 13C-

NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 157.3 (C(2)), 148.4 (C(5)), 143.3 (C(13)), 142.4

(C(8)), 141.4 (C(6)), 126.7 (C(3)), 126.6 (C(1)), 125.1 (C(11)), 120.4 (C(9)), 119.9

(C(10)), 117.8 (C(12)), 112.8 (C(4)), 36.2 (C(7)). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3822,

3736, 3650, 3283, 1582, 1455, 730. - MS (EI, m/z): ber.: 196.1008, gef.: 196 (M).

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-

2’-dG 136 Die Synthese wurde nach AAV 7 durchgeführt.

Es wurden 3.05 g (4.40 mmol) O6-2-(4-

Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-brom-

2’-dG 132 eingesetzt.

Ausbeute: 2.52 g (3.52 mmol, 80%) eines

braunen Feststoffes. - DC: RF-Wert (PE/EE 1:1)

0.24. - [α]20546: -3° (c= 1.0, CHCl3). - Smp.: 84-87

°C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

8.46 (s, 2H, H-8), 7.43– 6.82 (m, 9H, HAr), 6.67

(dd, 3JH,H = 7.3 Hz, 3JH,H

= 7.2 Hz, 1H, H-1’), 5.34 (s, 2H, NH), 4.42 – 4.19 (m, 2H, H-

N

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

CN

136

1'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9A B

C

D

a

b c

de

f

224

Experimentalteil

a), 3.72-3.71 (m, 3H, H4´, H5á, H5´b), 3.06 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb),

2.97-2.91 (m, 1H, H2á), 1.91 (s, 1H, H2´b), 0.75 (s, 9H, Si(CH3)3 an C3´), 0.80 (s, 9H,

Si(CH3)3 an C5´), 0.00 (s, 6H, Si(CH3)2), -0.15 (2 * s, 2 * 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ

[ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C-6), 156.7 (C-2), 152.4 (C-D), 145.7 (C-A), 144.4

(C-f), 139.6 (C-8), 130.0 (C-C), 129.5 (C-c), 127.6 (C-d), 127.5 (C-e), 123.6 (C-4),

119.0 (C-B), 118.6 (-CN), 114.8 (C-5), 87.1 (C-4´), 84.0 (C-1´), 71.6 (C-3´), 67.8 (C-a),

62.8 (C-5´), 39.7 (C-2´), 34.7 (2 * SiC(CH3)3), 34.3 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):

3744, 3037, 1737, 1695, 1612, 1507, 1110, 838. - MS (FAB, m/z): ber.: 715.3698,

gef.: 716.3736 (M+H+).

Synthese von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(TBDMS)-2-(4-

methylphenylhydrazino)-2’-desoxyguanosin 138

Die Synthese wurde nach AAV 7

durchgeführt.

225

Es wurden 150 mg (2.12 mmol) O6-2-(p-

Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(tert.-butyl-

trimethylsilyl)-2-brom-2’-desoxyguanosin

132 eingesetzt.

Ausbeute: 103 mg (1.85 mmol; 75%) als

orangenes Öl erhalten.

DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1):

0.48. – [ ]20 °C

546 nm Hgα = + 10.1 ° (c = 1.0, CH2Cl2).- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-

d6): 8.62 (s, 1H, H8), 7.79-7.89 (m, 2H, Hd), 7.56-7.61 (m, 2H, He), 7.33-7.47 (m, 6H,

Hb’, Hc’, NH), 6.43 (dd, 3JH,H= 6.3 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 1H, H1´), 4.87 (t, 3JH,H= 6.8 Hz,

2H, Ha), 4.47-4.53 (m, 1H, H3’), 3.79-3.88 (m, 1H, H4´), 3.59-3.70 (m, 2H, H5’), 3.21-

3.25 (m, 2H, Hb), 2.99-3.03 (m, 1H, H2á), 2.44 (s, 3H, He’), 2.39-2.41 (m, 1H, H2´b),

0.84 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C3´), 0.76 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C5´), 0.10 (s, 3 H, Si-

(CH3)2 an C3´), -0.05 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.08 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13C-

NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C6), 152.3 (C2), 150.1 (C(d’)), 144.2 (C8),

143.5 (Cf), 142.7 (Cc), 132.1 (Cd), 129.9 (Ce), 128.9 (C(b’)), 128.5 (C4), 123.2 (C(c’)),

120.8 (C(a’)), 118.9 (CN), 109.3 (C5), 87.1 (C4´), 83.9 (C1´), 72.2 (C3´), 66.8 (Ca),

62.3 (C5´), 58.1 (C2´), 34.4 (Cb), 25.7 (SiC(CH3)3), 21.8 (Ce’), 14.0 (SiC(CH3)3), -4.7, -

N

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

CN

138

1'

2'3'

4'

5'

1

34 2

5 67

8

9a' b'

c'

d'

a

b c

de

f

e'

Experimentalteil

5.6 (Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3211, 2929, 1696, 1569, 1471,

1361, 1254, 836. - MS (FAB, m/z): ber.: 729.3854, gef.: 730.3899 [M+H]+

Synthese von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(TBDMS)-2-(3,5-

dimethylphenylhydrazino)-2’-desoxyguanosin 139

Es wurden 330 mg (0.48 mmol) O6-2-(p-

Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis(tert.-butyl-

trimethylsilyl)-2-brom-2’-desoxyguanosin

132 eingesetzt.

226

Ausbeute: 184 mg (0.25 mmol; 52%) eines

gelben Öl.

DC: Rf-Wert (Dichlormethan /Methanol 9:1):

0.44. – [α]20546: = + 7.8 ° (c = 1.2, CH2Cl2). -

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

8.86 (s, 2H, NH), 8.16 (s, 1H, H8), 7.73-7.75 (m, 2H, Hd), 7.40-7.44 (m, 2H, He), 7.26

(s, 2H, Hb’), 6.70 (s, 1H, Hd’), 6.26-6.30 (m, 1H, H1´), 4.73-4.80 (m, 2H, Ha), 4.58-

4.64 (m, 1H, H3’), 3.81-3.83 (m, 1H, H4´), 3.55-3.64 (m, 2H, H5’), 3.12-3.17 (m, 2H,

Hb), 2.95-3.00 (m, 1H, H2´a), 2.24-2.27 (m, 1H, H2´b), 2.21 (s, 6H, He’), 0.89 (s, 9 H,

Si-C(CH)3 an C3´), 0.83 (s, 9 H, Si-C(CH)3 an C5´), 0.10 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´),

0.00 (s, 3 H, Si-(CH3)2 an C3´), -0.02 (s, 6H, Si-(CH3)2 an C5´). - 13C-NMR: δ [ppm]

(101 MHz, DMSO-d6): 156.1 (C6), 153.2 (C2), 144.8 (C(c’)), 140.2 (C8), 144.1 (Cf),

136.3 (Cc), 132.1 (Cd), 130.0 (Ce), 124.8 (C(b’)), 128.0 (C4), 121.3 (C(d’)), 118.9

(CN), 118.8 (C(a’)), 109.3 (C5), 87.9 (C4´), 83.4 (C1´), 73.5 (C3´), 65.9 (Ca), 62.8

(C5´), 59.7 (C2´), 34.5 (Cb), 25.2 (SiC(CH3)3), 21.9 (Me), 9.6 (SiC(CH3)3), -4.1, -5.4

(Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2930.90, 2835.32, 2226.98,

1618.35, 1463.31, 1384.12, 1301.26, 1256.47, 1175.19, 1032.77, 827.69, 703.66,

583.54. - MS (FAB, m/z): ber.: 743.4011, gef.: 744.4125 [M+H]+

N

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

CN

139

1'

2'3'

4'

5'

1

34 2

5 67

8

9a' b'

c'

d'

a

b c

de

f

e'

Experimentalteil

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-N-4-

biphenylhydrazino-2´-dG 137 Die Synthese wurde nach AAV 7

durchgeführt. Es wurden 2.36 g

(3.42 mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-

3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-brom-2’-dG 132

eingesetzt.

Ausbeute: 1.35 g (1.71 mmol, 50%) eines

gelben Feststoffes. - DC: Rf-Wert (PE/EE:

9:1): 0.12. – [α]20546: +25 ° (c= 0.4,

CHCl3). - Smp.: 75-78 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.19 (s, 1H, H8),

7.77-7.33 (m, 13H, Har), 6.31 (dd, 3JH,H= 6.7 Hz, 1H, H1´), 5.37, 5.20 (2 * s, 2 * 1H,

NH), 4.70 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Ha), 4.54-4.51 (m, 2H, H3´), 3.85-3.82 (m, 1H, H4´),

3.72-3.62 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.17 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb), 2.97-2.90 (m, 1H,

H2´a), 2.30-2.24 (m, 1H, H2´b), 0.88, 0.84 (2 * s, 2 * 9H, Si(CH3)3 ), 0.10, 0.00 (2 * s, 2

* 6H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.2 (C6), 157.5, 153.1

(C4), 148.2 (C2), 144.1, 139.7 (C8), 132.0, 128.7, 126.1, 118.7 (CN), 115.1 (C5), 87.1

(C4´), 83.2 (C1´), 72.3 (C3´), 65.8 (Ca), 62.8 (C5´), 38.3 (C2´), 34.1 (Cb), 25.6, 25.5 (2

* SiC(CH3)3), -5.6, -5.1 (2 * Si(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2954,

2928, 2857, 1687, 1109, 776, 740, 482. - MS (FAB, m/z): ber.: 791.4011, gef.:

791.4035 [M+H]+.

N

N

N

O

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

CN

1371'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

E

H

G

F

227

Experimentalteil

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-2’-dG 140 und

O6-2-(4-Cyano-phenyl)ethyl-2-N-phenylazo-2’-dG 142

Die Synthese wurde nach AAV 8 durchgeführt. Es wurden 1.18 g (1.65 mmol) O6-2-(4-

Cyanophenyl)ethyl-3’,5’-bis-O-(TBDMS)-2-N-phenylhydrazino-2’-dG 136 eingesetzt.

O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-2’-dG 140

Ausbeute: 385 mg (0.79 mmol, 48%) eines beigen

Feststoffes. - DC: Rf-Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.38.

- [α]20546: +34° (c = 1.0, DCM/MeOH 1:1). - Smp.:

95-99 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-

d6): 8.22 (s, 1H, H-8), 7.75 (d, 3JH,H= 8.4 Hz, 2H,

H-e), 7.64 (dd, 4JH,H= 1.2 Hz, 3JH,H= 8.7 Hz, 2H,

H-B), 7.41 (d, 3JH,H= 8.4 Hz, 2H, H-d), 7.35-7.29

(m, 2H, H-C), 7.07 (dd, 3JH,H= 7.4 Hz, 4JH,H= 1.1

Hz, 1H, H-D), 6.31 (dd, 3JH,H= 7.4 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz

3’-OH), 4.94-4.84 (m, 1H, 5’-OH), 4.62 (t,

N

N

N

O

NH

N

O

OH

HO

HN

CN

140

1'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

, 1H, H-1’), 5.34-5.26 (m, 3H, NH, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-a), 4.40-4.35 (m, 1H, H-

3’), 3.86-3.81 (m, 1H, H-4’), 3.60-3.44 (m, 2H, H-5’), 3.12 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-b),

2.78-2.73 (m, 1H, H-2’a), 2.24 (ddd, 3JH,H= 3.1 Hz, 3JH,H = 6.2, 1H, H-2’b). - 13C-NMR:

δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C-6), 157.7 (C-2), 145.1 (C-A), 144.0 (C-f),

139.6 (C-8), 132.2 (C-e), 130.0 (C-d), 127.7(C-C), 123.7 (C-B), 123.3 (C-D), 119.5 (C-

4), 118.8 (CN), 114.9 (C-5), 109.2 (C-c), 87.7 (C-4’), 83.2 (C-1’), 70.8 (C-3’), 65.7 (C-

a), 61.7 (C-5’), 38.7 (C-2’), 34.4 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3403,

2361, 2227, 1653, 1611, 1577, 1507, 1395, 1241, 1056. - MS (FAB, m/z): ber.:

487.1968, gef.: 488.2046 [M+H]+.

228

Experimentalteil

O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylazo-2’-dG 142

Ausbeute: 216 mg (0.44 mmol, 27%) eines orangen

Feststoffes. - DC: Rf-Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.39. -

[α]20546: +71° (c = 1.0, DCM/MeOH 1:1). - Smp.: 95-

99 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

8.72 (s, 1H, H-8), 8.01-7.98 (m, 2H, H-B), 7.81-7.77

(d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, H-e), 7.68 (d, 3JH,H= 1.7 Hz,

2H, H-C), 7.66 (d, 3JH,H= 2.1 Hz, 1H, H-D), 7.60 (d, 3JH,H= 8.3 Hz, 2H, H-d), 6.48 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 3JH,H= 6.6 Hz, 1H, H-1’), 5.39-5.30 (m, 1H, 3’-OH), 5.01 – 4.92 (m, 1H, 5’-OH), 4.89 (t, 3JH,H= 6.6 Hz, 2H, H-a), 4.46-4.42 (m, 1H, H-3’), 3.92-3.88 (m, 1H, H-4’), 3.58-3.49 (m,

2H, H-5’), 3.29-3.27 (m, 2H, H-b), 2.78-2.70 (m, 1H, H-2’a), 2.40-2.31 (m, 1H, H-2’b).

- 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 160.4 (C-6), 152.2, 144.8 (C-f), 132.1 (C-e),

130.1 (C-d), 129.6 (C-C), 123.1 (C-B), 119.3 (-CN), 109.3 (C-c), 86.1 (C-1’), 83.8 (C-

4’), 71.4 (C-5’), 70.5 (C-3’), 66.9 (C-a), 61.5, 39.1 (C-2’), 34.3 (C-b). - IR: Wellenzahl

[cm-1] (KBr-Pressling): 3886, 3854, 3744, 3752, 3675, 3447, 1701, 1654, 1597, 1437. -

MS (FAB, m/z): ber.: 485.4946, gef.: 486.1890 [M+H]+.

N

N

N

O

NN

O

OH

HO

N

CN

142

1'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

Des Weiteren wurden 75 mg (0.15 mmol, 9%) als Mischfraktion erhalten.

1. Versuch der quantitativen Darstellung von O6-2-(p-Cyanophenyl)ethyl-2-N-

phenylhydrazino-2´-dG 140

56 mg (0.12 mmol) des Produktgemisches

140 / 142 wurden in Methanol gelöst und

mit 25 mg (1.04 mmol) Magnesium und 56

mg (11.2 mmol) Ammoniumchlorid versetzt.

Es wurde für 24 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt, die

Reaktionslösung anschließend filtriert und

mit Methanol gewaschen. Das

Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in

Chloroform aufgenommen. Anschließend wurde zweimal mit gesättigter

N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

HN A

BC

D

140

229

Experimentalteil

Natriumchlorid-Lösung und einmal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat

getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand

wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit einem

Methanolgradient (0 - 10%).

Das gewünschte Produkt konnte nicht quantitativ erhalten werden.



52 mg (0.11 mmol) des

Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden mit

18 mg (0.22 mmol) Natriumhydrogencrbonat

versetzt und in Ethanol gelöst. Es wurde

eine katalytische Menge Zirkoniumdioxid

und 10 µL (0.17 mmol) Hydrazinhydrat

hinzugegeben und anschließend für 24

Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das

Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde



N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

HN A

BC

D

140





Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden zu

einer Lösung aus 70 mg (0.28 mmol) Iod

und 35 mg (0.13 mmol) Magnesiumiodid in

2 mL Ether/Benzol (1:2) gegeben. Es wurde

eine Spatelspitze Magnesium hinzugegeben

und für 72 Stunden bei Raumtemperatur

N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

HN A

BC

D

140

230

Experimentalteil

gerührt.





Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in

THF gelöst. Diese Lösung wurde zu einer

Lösung aus 11 mg (0.21 mmol)

Natriumborhydrid in 1 mL THF gegeben. Die

Reaktionslösung wurde mit 25 mg (0.10

mmol) Iod in 2 mL THF versetzt.

Anschließend wurde 24 Stunden bei

Raumtemperatur gerührt. Nach der Zugabe von 3 M Salzsäure wurde mit Ether

extrahiert und mit 3 M Natronlauge gewaschen. Es wurde über Natriumsulfat

getrocknet, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand



N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

HN A

BC

D

140





Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in 5

mL abs. Methanol gelöst, mit einer

Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 5 min

mit Ultraschall behandelt. Nach der Zugabe

von 50 µL Hydrazinhydrat wurde die

Suspension über Nacht bei

Raumtemperatur gerührt. Der Katalysator

N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

HN A

BC

D

140

231

Experimentalteil

wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die erhaltene

Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand








mL abs. Methanol gelöst, mit einer

Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 10

min mit Ultraschall behandelt. Nach der

Zugabe von 50 µL Hydrazinhydrat wurde

die Suspension über Nacht bei

Raumtemperatur gerührt. Der Katalysator

wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die erhaltene

Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand



N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

HN A

BC

D

140




fe

d CN

232


Reaktionsgemisches 140 / 142 wurden in

30 mL abs. Methanol gelöst, mit einer

Spatelspitze Pd/C (10%) versetzt und 10

min mit Ultraschall behandelt. Nach der

Zugabe von 100 µL Hydrazinhydrat wurde

N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

HN A

BC

D

140

Experimentalteil

die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es wurden zusätzlich 300 µL

Hydrazinhydrat hinzugegeben und die Reaktionslösung auf 50 °C erhitzt. Der

Katalysator wurde durch Zentrifugation und Dekantieren der Lösung entfernt. Die

erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der

Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente

Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%).






mL abs. Methanol gelöst und mit 100 µL

Hydrazinhydrat versetzt. Es wurde auf die

Zugabe von Katalysator verzichtet und

stattdessen über Nacht auf 60 °C erhitzt.

Das Lösungsmittel wurde unter

vermindertem Druck vom Lösungsmittel

befreit. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent

diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 10%).

N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

HN A

BC

D

140




fe

d CN

233



mL abs. Ethanol gelöst und mit 1 mL

Hydrazinhydrat versetzt. Die

Reaktionslösung färbte sich rot. Es wurde

über das Wochenende auf 60 °C erhitzt.

N

N

N

NH

N

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

HN A

BC

D

140

Experimentalteil

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der

Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente




phenylazo-2´-dG 142

Es wurden 650 mg (1.37 mmol) des

Reaktionsgemisches 140 / 142 in 30 mL

Toluol gelöst und mit 840 mg (1.18 mmol)

Kaliumsuperoxid versetzt. Es wurde 48

Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach

der Zugabe von 20 mL Wasser wurden die

Phasen getrennt. Die wässrige Phase wurde

fünfmal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über

Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt.

Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente


N

N

N

NN

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

4´

a

bc

fe

d CN

N AB

C

D

142



phenylazo-2´-dG 142

Es wurden 40 mg (0.08 mmol) des

Reaktionsgemisches 140 / 142 in 2 mL

DCM gelöst und mit 40 μL Pyridin und 10

mg (0.13 mmol) NBS versetzt. Es wurde

1.5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Nach der Entfernung des Lösungsmittels

wurde der Rückstand

säulenchromatographisch gereinigt. Als

fe

d CN

234

N

N

N

NN

O

OH

HO

O1

8

7 65

43

2

3´ 2´

1´

9

5´

a

4´

bc

N AB

C

D

142

Experimentalteil

Eluent diente Dichlormethan mit einem Methanolgradient (0 - 5%).


Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 141 und O6-

2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 143

Die Synthese wurde nach AAV 8 durchgeführt. Es wurden 1.35 g (1.71 mmol) O6-2-(p-

Cyanophenyl)ethyl-3´,5´-bis-O-(TBDMS)-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 137 einge-

setzt.

O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 141 Ausbeute: 299 mg (0.53 mmol, 31%) eines hell-orangen Feststoffes. - DC: Rf-Wert

(DCM/MeOH: 9:1): 0.35 - [α]20546: +54 °

(c= 0.8, DCM/MeOH). - Smp.: 90 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

8.25 (s, 1H, H8), 7.77-7.32 (m, 13H,

Har), 6.34 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 1H, H1´),

5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 1H, NH), 5.30 (d, 3JH,H= 4.0 Hz, 1H, 3´-OH), 4.90 (t, 3JH,H=

5.5 Hz, 1H, 5´-OH), 4.66 (t, 3JH,H= 6.9

Hz, 2H, Ha), 4.41-4.38 (m, 1H, H3´),

3.86-3.83 (m, 1H, H4´), 3.58-3.49 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.15 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb),


DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4), 144.1 (Ca), 139.7 (C8), 134.6, 130.0

(Cb, Cb´), 118.8 (C5), 116.2 (CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1 (C1´), 70.8 (C3´), 65.8

(Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´), 34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3448,

2922, 2857, 2227, 1718, 1609, 1384, 1238, 1105, 832, 763, 701. - MS (FAB, m/z):

ber.: 563.2281, gef.: 563.2402 [M].

N

N

N

O

NH

N

O

OH

HO

HN

CN

1411'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

E

H

G

F

235

Experimentalteil

O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 143 Ausbeute: 240 mg (0.43 mmol, 25%) eines orangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert

(DCM/MeOH: 9:1): 0.34 - [α]20546: +4 °

(c= 1.2, DCM/MeOH). - Smp.: 92 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

8.15 (s, 1H, H8), 7.86-7.62 (m, 13H,

Har), 6.38 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´),

5.36 (d, 3JH,H= 4.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.90

(t, 3JH,H= 5.5 Hz, 1H, 5´-OH), 4.79 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Ha), 4.50-4.43 (m,

1H, H3´), 3.97-3.93 (m, 1H, H4´), 3.67-

3.63 (m, 2H, H5´a, H5´b), 3.26 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Hb), 3.02-2.94 (m, 1H, H2´a),

2.41-2.35 (m, 1H, H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.2 (C6), 157.5,

153.1 (C4), 148.2 (C2), 144.1, 139.7 (C8), 132.0, 128.7, 126.1, 118.7 (CN), 115.1

(C5), 87.1 (C4´), 83.2 (C1´), 72.3 (C3´), 65.8 (Ca), 62.8 (C5´), 38.3 (C2´), 34.1 (Cb). -

IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3473, 1718, 1637, 1384, 1237, 1150, 767, 701,

636. - MS (FAB, m/z): ber.: 561.2125, gef.: 561.3241 [M].

N

N

N

O

NN

O

OH

HO

N

CN

1431'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

E

H

G

F

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylhydrazino-O-5’-dimethoxytrityl-2’-

dG 144 Die Synthese wurde nach AAV 10 durchgeführt. Es wurden 371 mg (0.76 mmol) des

Hydrazino-Addukt 140 eingesetzt,

Ausbeute: 414 mg (0.52 mmol, 69%) eines

gelborangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert:

(DCM/MeOH 9:1) 0.84. - [α]20546: -19 ° (c = 1.2,

CHCl3). - Smp.: 124-125 °C. 1H-NMR: δ [ppm]

(400 MHz, DMSO-d6): 8.01 (s, 1H, H-8), 7.35 -

7.16 (m, 22H, HAr), 6.09 (t, 3JH,H= 6.5 Hz, 1H,

H-1’), 5.75 (s, 2H, NH), 5.26 (d, 3JH,H= 3.7 Hz,

1H, 3’OH), 4.35 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, H-a),

4.15-4.06 (m, 1H, H-3’), 3.98-3.91 (m, 1H, H-4’), 3.58 (m, 8H, -O-CH3, H-5’), 2.95 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, H-b), 2.69-2.59 (m, 1H, H-2’a), 2.25-2.14 (m, 1H, H-2’b). - 13C-NMR:

N

N

N

O

NH

N

O

OH

DMTrO

HN

CN

1441'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

236

Experimentalteil

δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 158.5 (C-6), 157.9, 157.3 (C-8), 152.9 (C-4), 144.8 (C-

Ar), 143.8 (C-Ar), 141.5 (C-8), 136.2 (C-Ar), 135.5, 132.1 (C-e), 130.3, 129.6, 129.0

(C-Ar), 127.6 (C-Ar), 124.9, 113.0, 112.2, 109.2 (C-d), 86.5 (C-4’), 79.2 (C-1’), 71.1 (C-

3’), 65.4 (C-a), 60.9 (C-5’), 54.9, 39.1 (C-2’), 34.2 (C-b). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-

Pressling): 3447, 2930, 2834, 2361, 2227, 1609, 1579, 1507, 1442, 1382, 1300, 1249,

1176, 1070, 1033, 827, 789. - HRMS (FAB, m/z): ber.: 789.3275, gef.: 790.3353

[M+H]+.

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenylazo-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG

146

Die Synthese wurde nach AAV 9 durchgeführt.

Es wurden 114 mg (0.23 mmol) des Azo-

Addukts 142 eingesetzt.


orangen Feststoffes. - DC: Rf-Wert:

(DCM/MeOH 9:1) 0.72. - [α]20546: -42° (c = 0.9,

CHCl3). - Smp.: 98-102 °C. - 1H-NMR: δ [ppm]

(400 MHz, DMSO-d6): 8.71 (s, 1H, H-8), 7.81 –

6.84 (m, 22H, HAr), 6.21 (s, 1H, H-1’), 5.43 -

5.29 (m, 1H, 3’-OH), 4.76-4.71 (m, 3H, H-a, H-3´), 3.97-3.96 (m, 2H, H-5´a, H-5´b),

3.90-3.87 (m, 1H, H-4´), 3.20-3.16 (m, 6H, DMTr-CH3), 3.15 (t, 3JH,H= 6.6 Hz, 3JH,H=

6.6 Hz, 2H, H-b), 2.98-2.95 (m, 1H, H-2´a), 1.95 (s, 1H, H-2´b). - 13C-NMR: δ [ppm]

(101 MHz, DMSO-d6): 158.1 (C-6), 139.9 (C-8), 137.1, 132.1 (C-e), 130.0 (C-c), 129.6,

128.8, 127.6, 123.1, 115.2 (-CN), 112.7, 109.7, 87.6 (C-4’), 79.5 (C-1’), 70.6 (C-3’),

61.5 (C-5’), 54.1, 39.2 (C-2’). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3821,

3752, 3675, 3421, 1735, 1701, 1607, 1507, 1437, 1249, 1176, 1033, 827. - MS (FAB,

m/z): ber.: 787.3118, gef.: 788.3201 (M+H+).

N

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

N

CN

1461'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

237

Experimentalteil

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-biphenylhydrazino-O-5’-dimethoxytrityl-

2’-dG 145 Die Synthese wurde nach AAV 10

durchgeführt. Es wurden 150 mg (0.27

mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-

biphenyl-hydrazino-2´-dG 141 eingesetzt.


orangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert

(PE/EE: 9:1): 0.76. - Smp.: 85 °C. - [α]20546:

+92 ° (c= 0.6, DCM/MeOH). - 1H-NMR: δ

[ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.02 (s, 1H, H8), 7.66-6.61 (m, 26H, Har), 6.11 (dd, 3JH,H=

6.9 Hz, 1H, H1´), 5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 1H, NH), 5.25 (d, 3JH,H= 4.0 Hz, 1H, 3´-OH),

4.38 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Ha), 3.95-3.93 (m, 1H, H4´), 3.72-3.64 (m, 8H, H5´a, H5´b,

OCH3), 2.98 (t, 3JH,H= 6.9 Hz, 2H, Hb), 2.70-2.64 (m, 1H, H2´a), 2.24-2.19 (m, 1H,

H2´b). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4),

144.1 (Ca), 139.7 (C8), 135.6, 134.6, 130.0 (Cb, Cb´), 127.8, 122.3, 118.8 (C5), 116.2

(CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1 (C1´), 70.8 (C3´), 65.8 (Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´),

34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3462, 1718, 1701, 1654, 1637,

1560, 1508, 1384, 1247, 1107, 701, 582, 465. - MS (FAB, m/z): ber.: 865.3588, gef.:

865.3781 [M].

N

N

N

O

NH

N

O

OH

DMTrO

HN

CN

1451'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

E

H

G

F

238

Experimentalteil

Synthese von O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-biphenylazo-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG

147 Die Synthese wurde nach AAV 9


mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-4-

biphenylazo-2´-dG 143 eingesetzt.

Ausbeute: 168 mg (0.19 mmol, 76%)

eines orangenen Feststoffes. - DC: Rf-

Wert (PE/EE: 9:1): 0.87. - Smp.: 112 °C. -

[α]20546: -69 ° (c= 1.6, DCM/MeOH). - 1H-

NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.15

(s, 1H, H8), 7.86-6.62 (m, 26H, Har), 6.38 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 1H, H1´), 5.36 (d, 3JH,H=

4.5 Hz, 1H, 3´-OH), 4.79 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Ha), 4.50 -4.43 (m, 1H, H3´), 3.97-3.93

(m, 1H, H4´), 3.67-3.63 (m, 8H, H5´a, H5´b, OCH3), 3.26 (t, 3JH,H= 6.8 Hz, 2H, Hb),


DMSO-d6): 159.1 (C6), 155.6 (C2), 153.2 (C4), 144.1 (Ca), 139.7 (C8), 135.6, 134.6,

130.0 (Cb, Cb´), 127.8, 122.3, 118.8 (C5), 116.2 (CN), 109.1 (Cd), 87.6 (C4´), 83.1

(C1´), 70.8 (C3´), 65.8 (Ca), 61.7 (C5´), 39.7 (C2´), 34.4 (Cb). - IR: Wellenzahl [cm-1]

(KBr-Pressling): 3416, 1637, 1617, 1560, 1508, 1458, 1384, 1314, 1247, 1175, 1075,

619, 477. - MS (FAB, m/z): ber.: 863.3431, gef.: 864.2978 [M+H]+.

N

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

N

CN

1471'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

E

H

G

F

239

Experimentalteil

Synthese von 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N'-diisopropyl-amino)-phosphinyl)]-O6-2-(4-

cyanophenyl)ethyl-5’-O-dimethoxytrityl-2-N-phenylhydrazino-2´-dG 148



O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-2-N-phenyl-

hydrazino-O-5’-dimethoxytrityl-2’-dG 144 einge-

setzt.

240


beigen Feststoffes, welcher als

Diastereomerengemisch (I+II) vorliegt. - DC: Rf-

Wert: (DCM/MeOH 9:1) 0.93. - [α]20546: +183° (c

= 1.0, CHCl3). - Smp.: 68-71 °C. 1H-NMR: δ

[ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 7.84 (s, 1H, H-8

(I)), 7.81 (s, 1H, H-8 (II) ), 7.71-7.41 (m, 44H,

HAr(I+II), DMTr-H (I+II)), 6.25 (dd, 3JH,H= 6.4 Hz, 3JH,H= 6.3 Hz, 2H, H-1’(I+II)), 4.74-

4.58 (m, 2H, NH (I)), 4.47-4.37 (m, 2H, NH (II)), 4.16-4.05 (m, 4H, H-a (I+II)), 3.58-

3.35 (m, 12H, -OCH3, H-5’a/b (I-II), H-b(I)) 3.15-3.02 (m, 2H, H-b (II)), 2.54-2.29 (m,

12H, iPr-H (I+II), H-α (I+II), H-2’a/b (I+II)), 1.81 (t, 2H, H-β (I)), 1.73 (m, 2H, H-β(II)),

1.15-1.01 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 160.1,

159.3, 158.7, 148.2, 145.8, 143.3, 138.0, 137.4, 136.1, 132.0, 131.4, 130.6, 130.1,

129.8, 119.0, 113.7, 113.0, 111.0, 87.1, 74.4, 74.2, 66.0, 54.8, 45.3, 43.6, 35,1, 24.7,

24.6, 22.8. - 31P-NMR: δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 149.35, 149.19. - IR: Wellenzahl

[cm-1] (KBr-Pressling): 3870, 3816, 3752, 3744, 3676, 3447, 2966, 1654, 1609, 1581,

1508,1465, 1383, 1250, 1179, 1034, 829. - MS (FAB, m/z): ber.: 989.4353 , gef.:

990.5 [M+H]+.

N

N

N

O

NH

N

ODMTrO

HN

CN

1481'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

O

PON

CNα

β

Experimentalteil

Synthese von 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N'-diisopropyl-amino)-phosphinyl)]-O6-2-(4-

cyanophenyl)ethyl-5’-O-dimethoxytrityl-2-N-phenylazo-2´-dG 150


Es wurden 125 mg (0.16 mmol) des Azo-Addukts

146 eingesetzt.


gelborangenen Feststoffes. - DC: Rf-Wert:

(DCM/MeOH 9:1): 0.92. - [α]20546:+39° (c = 1.0,

CHCl3). - Smp.: 86-89 °C. 1H-NMR: δ [ppm] (400

MHz, Benzol-d6): 7.88 (s, 1H, H-8 (I)), 7.85 (s, 1H,

H-8 (II)), 7.62-6.58 (m, 49 H, DMTr-H (I+II), HAr

(I+II)), 6.27-6.18 (m, 2H, H-1´(I+II)), 5.07-4.95 (m,

2H, H-3´(I+II)), 4.73-4.67 (m, 4H, H-a (I+II)), 4.13-

4.06 (m, 2H, H-4´(I+II)), 3.54-3.26 (m, 20H, -OCH3 (I+II), H-b (I+II), H-5´(I+II)), 3.00-

2.82 (m, 2H, H-2´a (I+II)), 2.72-2.61 (m, 8H, iPr-H(I+II), H-α (I+II)), 2.56-2.47 (m, 1H,

H-2´b(I)), 2.41-2.29 (m, 1H, H-2´b(II)), 1.73-1.67 (m, 4H, H-β(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H,

CH3iPr (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 190.6, 186.5, 185.4, 177.7,

169.4, 168.0, 163.6, 159.3, 153.4, 146.1, 145.8, 143.3, 136.3, 132.1, 130.7, 129.9,

129.4, 124.0, 113.8, 87.6, 87.0, 54.8, 47.5, 43.6, 35.2, 24.6. - 31P-NMR: δ [ppm] (162

MHz, Benzol-d6): 149.46, 149.16. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3854, 3744,

3676, 3432, 2965, 2227, 1607, 1508, 1445, 1341, 1251, 1178, 1034. - MS (FAB, m/z):

ber.: 987.4197, gef.: 988.7 [M+H]+.

N

N

N

O

NN

ODMTrO

N

CN

1501'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

AB

C

D

a

b c

d

ef

O

PON

CNα

β

241

Experimentalteil

Synthese von 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)-phosphinyl)]-O6-2-(4-

Cyanophenyl)ethyl-O-5´-dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-dG 149


durchgeführt. Es wurden 135 mg (0.15 mmol)

O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-O-5´-

dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylhydrazino-2´-

dG 145 eingesetzt.

242


orangenen Feststoffes, welcher als

Diastereomerengemisch (I+II) vorliegt. -

Smp.: 75-78 °C. - DC: Rf-Wert (DCM/MeOH:

9:1): 0.84. - [α]20546: +33° (c= 0.1, CHCl3). -

1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6): 7.88

(s, 1H, H8 (I)), 7.86 (s, 1H, H8 (II)), 7.62-6.58 (m, 52 H, DMTr-H (I+II), Har (I+II)), 6.29-

6.19 (m, 2H, H1´(I+II)), 5.76, 5.37 (2 * s, 2 * 2H, NH(I+II)), 5.04-5.01 (m, 2H, H3´(I+II)),

4.60-4.50 (m, 4H, Ha (I+II)), 4.13-4.08 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.52-3.17 (m, 20H, OCH3

(I+II), Hb (I+II), H5´(I+II)), 2.98-2.93 (m, 1H, H2´a (I)), 2.89-2.84 (m, 1H, H2´a (II)),

2.71-2.68 (m, 8H, iPr-H(I+II)+α(I+II)), 2.56-2.48 (m, 1H, H2´b(I)), 2.41-2.34 (m, 1H,

H2´b(II)), 1.73-1.67 (m, 4H, ß(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13C-NMR: δ

[ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 159.1, 155.6, 153.2, 144.1, 139.7, 135.6, 134.6, 130.0,

127.8, 122.3, 118.8, 116.2, 109.1, 87.6, 83.1, 70.8, 65.8, 61.7, 39.7, 34.4. - 31P-NMR:

δ [ppm] (162 MHz, Benzol-d6): 149.87, 149.09. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling):

3744, 3675, 2966, 1607, 1457, 1200, 1077, 978. - MS (FAB, m/z): ber.: 1065.4666,

gef.: 1066.6 [M+H]+.

N

N

N

O

NH

N

ODMTrO

HN

CN

1491'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

a

b c

d

ef

O

P

AB

C

DE

H

G

F

ONCN

α

β

Experimentalteil

Synthese von 3’-O-[(2-Cyanoethoxy)-(N,N’-diisopropylamino)-phosphinyl)]-O6-2-(4-

Cyanophenyl)ethyl-O-5´-dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 151



mmol) O6-2-(4-Cyanophenyl)ethyl-O-5´-

dimethoxytrityl-2-N-4-biphenylazo-2´-dG 147 eingesetzt.

243

Ausbeute: 70 mg (66 µmol, 35%) eines

orangenen Feststoffes, welcher als

Diastereomerengemisch (I+II) vorliegt. -

Smp.: 63-65 °C. - DC: Rf-Wert

(DCM/MeOH: 9:1): 0.85. - [α]20546: -13 ° (c=

0.4, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,

Benzol-d6): 7.88 (s, 1H, H8 (I)), 7.86 (s, 1H, H8 (II)), 7.62-6.58 (m, 59 H, DMTr-H (I+II),

Har (I+II)), 6.29-6.19 (m, 2H, H1´(I+II)), 5.04-5.01 (m, 2H, H3´(I+II)), 4.60-4.50 (m, 4H,

Ha (I+II)), 4.13-4.08 (m, 2H, H4´(I+II)), 3.52-3.17 (m, 20H, OCH3 (I+II), Hb (I+II),

H5´(I+II)), 2.98-2.93 (m, 1H, H2´a (I)), 2.89-2.84 (m, 1H, H2´a (II)), 2.71-2.68 (m, 8H,

iPr-H(I+II)+α(I+II)), 2.56-2.48 (m, 1H, H2´b(I)), 2.41-2.34 (m, 1H, H2´b(II)), 1.73-1.67

(m, 4H, ß(I+II)), 1.13-1.05 (m, 24H, CH3iPr (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

Benzol-d6): 159.1, 155.6, 153.2, 144.1, 139.7, 135.6, 134.6, 130.0, 127.8, 122.3,

118.8, 116.2, 109.1, 87.6, 83.1, 70.8, 65.8, 61.7, 39.7, 34.4. - 31P-NMR: δ [ppm] (162

MHz, Benzol-d6): 149.29, 149.08. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3821, 3675,

3447, 2966, 1734, 1700, 1653, 1507, 1363, 1179, 1033, 829. - MS (FAB, m/z): ber.:

1063.4510, gef.: 1064.7 [M+H]+.

N

N

N

O

NN

ODMTrO

N

CN

1511'

2'3'

4'

5'

1

34 2

567

8

9

a

b c

d

ef

O

P

AB

C

DE

H

G

F

ONCN

α

β

Experimentalteil

Synthese von N-Phenylhydroxylamin 155 In einem 500 mL Kolben wurden 24.1 (0.45 mol) Ammoniumchlorid in

240 mL dest. Wasser gelöst und 12.55 mL (97.88 mmol) Nitrobenzol 156

dazugegeben. Anschließend wurde der Reaktionsansatz auf 60°C

erhitzt und über einen Zeitraum von 20 min sukzessive mit 17.7 g

(270 mmol) Zink versetzt. Nach der Zugabe wurde die noch heiße Lösung filtriert und

der Rückstand mit 200 mL dest. Wasser (90°C) gewaschen. Das Filtrat wurde mit 200

g (3.42 mol) Natriumchlorid gesättigt und über Nacht im Kühlschrank gelagert. Der

entstandene Niederschlag wurde filtriert und in Diethylether aufgenommen und über

Natriumsulfat getrocknet. Schließlich wurde das Lösungsmittel unter vermindertem

Druck entfernt und ein leuchtend gelber, kristalliner Feststoff erhalten.

3

41

2

NHOH

155

Ausbeute: 4.6 g (42 mmol, 43%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: Rf-Wert

(DCM/Methanol 9:1): 0.61. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.32 (d, 1H, 3JH,H= 2.2 Hz, NH), 8.25 (bs, 1H, OH), 7.19 (dd, 2H, 3JH,H= 7.4 Hz, 3JH,H= 8.4 Hz, H-3),

6.87 (d, 1H, 3JH,H= 7.9 Hz, H-2), 6.78 (t, 1H, 3JH,H= 7.3 Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, H-4). - 13C-

NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 152.0 (C-1), 128.7 (C-3), 119.2 (C-4), 113.0 (C-

2). Weitere Analytik konnte aufgrund der Instabilität des Produktes nicht durchgeführt

werden.

Synthese von N-Phenylbenzohydroxamsäure 159 Es wurden 3.18 g (29.1 mmol) N-Phenylhydroxylamin 155 in 25 mL

Diethylether gelöst und mit 2.2 g (40 mmol)

Natriumhydrogencarbonat in 50 mL Wasser versetzt und auf 0°C

gekühlt. Über einen Zeitraum von 20 Minuten wurden 2.9 mL (25.1

mmol) Benzoylchlorid, gelöst in 12.5 mL Diethylether hinzugegeben,

wobei die Temperatur 5 °C nicht überstieg. Nach anschließender 3stündigem Rühren

wurde das Produkt filtriert und getrocknet.

NOH

O

a

b

cd

a'b'

c'

d'

159


(Petrolether/Ethylacetat 1:1 v/v): 0.36. - Schmelzpunkt: 117 °C. - [α]20546: + 2 ° (c = 0.1,

CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.70 (s, 1H, OH), 7.62-7.64 (m, 2H,

H-b’), 7.55-7.57 (m, 2H, H-b), 7.35-7.46 (m, 5H, H-c’, H-c, H-d’), 7.18-7.22 (m, 1H, H-

244

Experimentalteil

d). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 167.8 (quart. Bz-C), 141.9 (Ca’), 135.4

(Ca), 130.1 (Cd’), 128.4 (Cb’), 128.2 (Cc’), 127.7 (Cc), 125.5 (Cd), 122.1 (Cb). - IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3131, 1921, 1578, 1495, 1322, 1221, 1181, 1075, 1025, 844.

- MS (FAB, m/z): ber.: 213.0790, gef.: 214.0887 (M+H+).

Synthese von N-Benzyl-N-phenylhydroxylamin 158 Unter Stickstoffgasatmosphäre wurden 2.00 g (18.3 mmol) 155 in

einen 50 mL Kolben eingewogen und in 4 mL abs. Pyridin gelöst.

Dann wurden unter Lichtausschluss 2.00 mL (2.43 g; 19.3 mmol)

Benzylchlorid hinzugegeben und die gelbe Lösung bei RT für 19 h

gerührt. Die nun orange-gelbe Lösung wurde auf 50 °C erhitzt

und anschließend auf 0 °C gekühlt. Dann wurden 4 mL 2N Salzsäure (kalt)

hinzugegeben. Nach Zugabe von Diethylether wurden die Phasen getrennt und die

wässrige Phase dreimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet. Schließlich wurde das Lösungsmittel

unter vermindertem Druck entfernt und der gelbe Feststoff im Hochvakuum

getrocknet. Die Reinigung des Rohproduktes erfolgte am Chromatotron mittels DCM

als Eluent.

4

3 2

1 NOH

5 69

87

158

Ausbeute: 771 mg (3.87 mmol, 21%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: Rf-

Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.84. – Smp.: 66-69 °C. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz,

DMSO-d6): 8.83 (s, 1H, OH), 7.39 (d, 2H, 3JH,H= 7.1 Hz, H-7), 7.30-7.33 (m, 2H, H-8),

7.20-7.26 (m, 3H, H-3 und H-9), 7.11-7.14 (m, 2H, H-2), 6.84 (t, 1H, 3JH,H= 7.2 Hz,

3JH,H= 7.2 Hz, H-4), 4.44 (s, 2H, H-5). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 153.8

(C-1), 138.4 (C-6), 128.4 (C-7), 128.0 (C-3) 127.6 (C-8), 126.5 (C-9), 119.6 (C-4),

114.7 (C-2), 62.1 (C-9). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3059, 2888, 1700,

1696, 1635, 1506, 1487, 1387, 1295, 1190, 1027, 892, 693, 572. - MS (FAB, m/z):

ber.: 199.0997, gef.: 199.0994 [M].

245

Experimentalteil

Synthese von N-Acetyl-phenylhydroxamsäure 157

In einen 100 mL Kolben wurden unter Inertgasatmosphäre 2.00 g

(18.3 mmol) 155 und 1.7 g (20 mmol) Natriumhydrogencarbonat

eingewogen und mit 20 mL abs. Diethylether versetzt. Anschließend

wurde die Suspension mit Hilfe eines Eisbades auf 0 °C gekühlt und 1.50 mL (1.65 g,

210 mmol) Acetylchlorid hinzugegeben, dabei trat eine Entfärbung der Lösung auf und

die Lösung wurde trübe. Schließlich wurde bei RT für 40 h gerührt. Nach beendeter

Reaktion wurde die Suspension filtriert und mit dest. Wasser ausgeschüttelt. Dann

wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase noch dreimal mit Diethylether

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet

und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Nach Trocknung im

Hochvakuum wurde das Rohprodukt (gelbes Öl) am Chromatotron mit DCM als Eluent

gereinigt.

3

41

2

NOH

5

O6

157

Ausbeute: 1.65 g (10.9 mmol, 60%) eines braunen, viskosen Öls. – DC: Rf-Wert

(DCM/Methanol 9:1): 0.63. - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.62 (s, 1H,

OH), 7.61 (d, 2H, 3JH,H= 7.9 Hz, H-2), 7.34-7.38 (m, 2H, H-3), 7.14 (t, 1H, 3JH,H= 7.3

Hz, 3JH,H= 7.3 Hz, H-4), 2.20 (s, 3H, H-6). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6):

170.1 (C-5), 142.0 (C-1), 128.7 (C-3), 123.3 (C-4), 119.3 (C-2), 22.8 (C-6). - IR:

Wellenzahl [cm-1]: 2901, 1641, 1593, 1545, 1308, 1177, 1101, 1034, 907, 691. - MS

(FAB, m/z): ber.: 151.0633, gef.: 152.0712 [M+H]+.

Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-

desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 154 mittels Mitsunobu-Reaktion:

246

Versuch Nr. 1

Zu einer Lösung aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 53 mg

(0.1 mmol) Triphenylphosphin, 35 mg (0.2 mmol) 157

und 8 mL abs. THF wurden und 39 µL (0.2 µmol) DIAD

hinzugefügt. Nachdem die Lösung 16 Stunden bei RT

gerührt wurde, wurde das Lösungsmittel unter

vermindertem Druck entfernt und das erhaltene

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

154

NAca

b

cd

Experimentalteil

Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dichlormethan mit

einem Methanolgradienten (0 - 25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten

werden.

Versuch Nr. 2


(0.1 mmol) Triphenylphosphin und 8 mL abs. THF

wurden 35 mg (0.2 mmol) 157, 14 mg (0.2 mmol)

Imidazol und 39 µL (0.2 µmol) DIAD hinzugefügt.

Nachdem die Lösung 16 Stunden bei RT gerührt

wurde, wurde das Lösungsmittel unter vermindertem

Druck entfernt und das erhaltene Rohprodukt

säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente

Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 -

25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht isoliert werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

154

NAca

b

cd

Versuch Nr. 3

Für diesen Versuch wurden zwei verschiedene

Reaktionslösungen angefertigt.

Für die Reaktionslösung I wurden zu einer Lösung aus

79 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin und 5 mL

Acetonitril bei einer Temperatur von 0 °C 54 µL (0.3

µmol) DIAD hinzugefügt. Diese Lösung wurde

anschließend noch 30 Minuten bei 0 °C gerührt um

anschließend bei -40 °C zu der Lösung II

hinzugegeben zu werden, welche sich aus 100 mg

(0.2 mmol) 121, 15 mg (0.1 mmol) 157 und 5 mL abs.

Acetonitril zusammensetzte. Die gesamte Lösung wurde dann für weitere 20 Stunden

bei RT gerührt und schließlich unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit.

Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte zunächst mit Petrolether und

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

154

NAca

b

cd

247

Experimentalteil

Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit Dichlormethan mit einem

Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte Produkt konnte nicht

erhalten werden.

Versuch Nr. 4

Für diesen Versuch wurden zwei verschiedene

Reaktionslösungen angefertigt.

Für die Reaktionslösung I wurden zu einer Lösung aus

79 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin und 5 mL

Acetonitril bei einer Temperatur von 0 °C 54 µL (0.3

µmol) DIAD hinzugefügt. Diese Lösung wurde

anschließend noch 30 Minuten bei 0 °C gerührt um

anschließend bei - 40 °C zu der Lösung II

hinzugegeben zu werden, welche sich aus 50 mg (0.1

mmol) 121, 30 mg (0.2 mmol) 157 und 5 mL abs.

Acetonitril zusammensetzte. Die gesamte Lösung wurde dann ebenfalls für 20

Stunden bei RT gerührt und schließlich unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel

befreit. Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte zunächst mit Petrolether

und Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit Dichlormethan mit einem

Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte Produkt wurde nicht

erhalten.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

248

Versuch Nr. 5

Eine Lösung aus 100 mg (0.2 mmol) 121, 8 mL abs.

Dichlormethan, 150 mg (1 mmol) 157 und 262 mg (1

mmol) Triphenylphosphin wurde zunächst für 30

Minuten gerührt bevor die Zugabe von 193 µL (1

mmol) DIAD und 68 mg (1 mmol) Imidazol erfolgte.

Die Lösung wurde dann 20 Stunden bei RT gerührt

und anschließend unter vermindertem Druck vom

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

154

NAca

b

cd

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

154

NAca

b

cd

Experimentalteil

Lösungsmittel befreit. Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte auch hier

zunächst mit Petrolether und Ethylacetat in einem Verhältnis von 2:1 und endete mit

Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent. Das gewünschte

Produkt konnte nicht erhalten werden.

Synthese von 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin 165

Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um


Es wurden 8.0 g (30 mmol) 2’-Desoxyguanosin-

Monohydrat 52 zweimal mit je 40 mL absolutem Pyridin

coevaporiert und anschließend in 400 mL absolutem

Acetonitril suspendiert. Nach Zugabe von 330 mg (1.2

mmol) DMAP, 10 mL (14.4 mmol) Triethylamin und 7.0

mL (72 mmol) Essigsäureanhydrid wurde für 20 Stunden bei Raumtemperatur

gerührt. Nach Zugabe von 5 mL Methanol, Filtration und Waschen mit Ethanol und

Diethylether wurde das Produkt erhalten.

NH

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

165

Insgesamt konnten 10.3 g (29.3 mmol, 98%) eines farblosen Farbstoffes erhalten

werden. – DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 7:3 v/v): 0.64. - Smp: 235 °C. -

[α]20546: + 16 ° (c = 0.67, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.66 (s,

1H, NH), 7.91 (s, 1H, H8), 6.49 (s, 2H, NH2), 6.13 (dd, 3JHH = 5.8 Hz, 3JHH = 8.7 Hz,

1H, H1’), 5.29 (ddd, 3JHH = 1.9 Hz, 3JHH = 4.2 Hz, 1H, H3’), 4.15-4.20 (m, 3H, H4’,

H5’a, H5’b), 2.91 (m, 1H, H2a’), 2.44 (m, 1H, H2b’), 2.07 (s, 3H, Ac-CH3), 2.03 (s, 3H,

Ac-CH3). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.1 (quart. Ac-C), 169.9

(quart.Ac-C), 156.6 (C6), 153.7 (C2), 151.1 (C4), 135.1 (C8), 116.7 (C5), 82.5 (C1’),

81.4 (C4’), 74.4 (C3’), 63.5 (C5’), 35.4 (C2’), 20.7 (Ac-CH3), 20.5 (Ac-CH3). - IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3177, 1743, 1685, 1634, 1228, 1081, 844. - MS (FAB, m/z):

ber.: 351.1179, gef.: 352.1238 (M+H+).

249

Experimentalteil

Synthese von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-acetyl-2´-desoxyribosylpurin 166

Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um Sauerstoff

und Feuchtigkeit auszuschließen.

Es wurden 7.0 g (20 mmol) 3’,5’-O-Acetyl-2’-desoxyguanosin

165 und 9.8 g (59 mmol) vorgetrocknetes (2 d bei 120 °C im

vakuumierten Exsikkator über Phosphorpentoxid)

Tetraethylammoniumchlorid in 70 mL absolutem Acetonitril

gelöst und mit 2.8 mL (20 mmol) destilliertem N,N-

Dimethylanilin und 9.8 mL (20 mmol) Phosphorylchlorid versetzt. Die Lösung wurde

anschließend zehn Minuten mit einem vorgewärmten Ölbad unter Rückfluss gerührt,

bevor die flüchtigen Komponenten im Vakuum entfernt wurden und der ölige

Rückstand in Chloroform und Eis aufgenommen wurde. Nach 15minütigem Rühren

wurde die wässrige Phase fünfmal mit Chloroform extrahiert, bevor die vereinigten

organischen Phasen zunächst dreimal mit kaltem Wasser, einmal mit 5%iger

Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, anschließend über Magnesiumsulfat

getrocknet und vom Lösungsmittel befreit wurden. Eine chromatographischen

Reinigung mit Dichlormethan: Methanol (0 - 25%) lieferte das gewünschte Produkt.

N

N

N

Cl

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

166

Insgesamt konnten 5.18 g (22.1 mmol; 70%) eines farblosen Feststoffs erhalten

werden. - DC: Rf-Wert (Dichlormethan/Methanol 9:1 v/v): 0.57. - Smp: 71 °C. - [α]20546:

- 5 ° (c = 0.2, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.34 (s, 1H, H8), 7.00

(s, 2H, NH2), 6.24 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 8.2 Hz, 1H, H1’), 5.33 (m, 1H, H3’), 4.18-

4.29 (m, 3H, H4’, H5’a, H5’b), 3.03 (ddd, 3JHH = 6.5 Hz, 3JHH = 8.3 Hz, 2JHH = 14.4 Hz,

1H, H2a’), 2.50-2.55 (m, 1H, H2b’), 2.08 (s, 3H, Ac-CH3), 2.01 (s, 3H, Ac-CH3). - 13C-

NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.1 (quart. Ac-C), 169.9 (quart.Ac-C), 159.7

(C6), 153.7 (C2), 159.6 (C4), 130.7 (C8), 123.5 (C5), 83.0 (C1’), 81.6 (C4’), 74.3 (C3’),

63.5 (C5’), 35.1 (C2’), 20.7 (Ac-CH3), 20.5 (Ac-CH3). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr):

3367, 1742, 1616, 1560, 1230, 1100, 909. - MS (FAB, m/z): ber.: 369.0840, gef.:

370.0908 (M+H+).

250

Experimentalteil

Versuch zur Synthese von O6-N-(Phenylamino)-3’,5’-O-acetyl-2’-desoxyguanosin 167

Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um


Es wurden 100 mg (0.27 mmol) 6-Chlor-3’,5’-O-

acetyl-2’-iso-desoxyadenosin 166 und 100 mg (0.95

mmol) Phenylhydroxylamin in 12 mL abs. Ethanol

vorgelegt und bei 80 °C für 15 h gerührt. Nach

Filtration des entstandenen Niederschlags, Einengen

und chromatographischer Reinigung (Petrolether

/Essigsäureethylester 10-50%) konnte ein

gekuppeltes Produkt erhalten werden, welches jedoch nicht mit der Hydroxylgruppe

substituiert wurde, sondern mit der NH-Funktion. Desweiteren konnte die Abspaltung

der OH-Gruppe (als Wasser) beobachtet werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NHa

b

cd

Versuche der Darstellung von N-Benzyl-N-(3´5´-diacetyldesoxyguanosin-O6-yl)-

phenylamin 167 mittels Substitution:

Versuch Nr.1

Zunächst wurden 100 mg (0.3 mmol) 166 und 700 mg (3.5 mmol) 158 mit 12 mL Ethanol versetzt, 0.1 mL (0.7

mmol) Triethylamin und eine Spatelspitze DMAP

hinzugefügt und die Lösung dann 20 Stunden bei 80 °C

gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter


Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als

Eluent diente Dichlormethan mit einem

Methanolgradienten (0 - 25%).

251

Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd

Experimentalteil

Versuch Nr. 2

Einer Lösung aus 100 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.5

mmol) 158 und 12 mL abs. THF wurden 24 mg (1 mmol)

Natriumhydrid hinzugefügt. Die Lösung wurde dann 20

Stunden bei 80 °C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und

Dichlormethan wurden die Phasen getrennt, und die

organische Phase dreimal mit Wasser extrahiert. Die

vereinigten organischen Phasen wurden über

Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck

vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde

säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent diente Dic


N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd

hlormethan mit einem

Das gewünschte Produkt wurde nicht erhalten.

Versuch Nr. 3

Zunächst wurde eine Lösung aus 100 mg (0.5 mmol) 166,

24 mg (1 mmol) Natriumhydrid und 12 mL abs. THF zwei

Stunden bei RT gerührt. Anschließend wurden 100 mg (0.3

mmol) 158 hinzugefügt und die Lösung 20 Stunden bei 80

°C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und Dichlormethan

wurden die Phasen getrennt, und die organische Phase

dreimal mit Wasser extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter

vermindertem Druck wurden flüchtige Komponenten

entfernt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt, wobei

Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%) als Eluent diente.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd

Das gewünschte Produkt konnte nicht isoliert werden.

252

Experimentalteil

Versuch Nr. 4

253

Eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3

mmol) 158 und 12 mL abs. Ethanol ca. 70 Stunden bei 80

°C gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter


Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als Eluent

diente Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 -

25%).

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd


Versuch Nr. 5


mmol) 158 und 12 mL abs. Pyridin ca. 70 Stunden bei 80

°C gerührt. Die erhaltene schwarze Lösung wurde

verworfen, da eine Zersetzung der Edukte dünnschicht-

chromatographisch beobachtet wurde.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd

Versuch Nr. 6


mmol) 158 und 12 mL abs. Pyridin ca. 70 Stunden bei

RT gerührt. Die erhaltene schwarze Lösung wurde

verworfen, da eine Zersetzung der Edukte

dünnschichtchromatographisch beobachtet wurde.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd

Experimentalteil

Versuch Nr. 7


mmol) 158 und 12 mL abs. Ethanol ca. 70 Stunden bei RT





25%). Es wurden die Edukte reisoliert.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd

Versuch Nr. 8

Es wurde eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg

(0.3 mmol) 158 und 12 mL Formamid ca. 40 Stunden bei

100 °C gerührt. Nach Zugabe von Wasser und Diethylether

wurden die Phasen getrennt, und die organische Phase

dreimal mit Wasser extrahiert. Die vereinigten organischen

Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter

vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit. Der

Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt. Als



N

N

N

O

NH2N

O

OAc

254

Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten werden

Versuch Nr. 9

Zu eine Lösung aus 50 mg (0.3 mmol) 166, 100 mg (0.3

mmol) 158 und 12 mL abs. DME wurden 80 mg (0.6 mmol)

Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung wurde ca. 40

Stunden bei 100 °C gerührt und da bei der

dünnschichtchromatographischen Überprüfung keine

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NBna

b

cd

Experimentalteil

Umsetzung der Edukte beobachtet werden konnte, wurde die Lösung dann verworfen.

Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-diacetyl-2´-desoxyguanosin-O6-yl)-

phenylamin 167 mittels Substitution:

Versuch Nr. 1

255


mmol) 157 und 12 mL abs. Ethanol für 3 Tage bei 80 °C



Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt. Als


Methanolgradienten (0 - 25%). Das gewünschte Produkt

konnte nicht erhalten werden.

Versuch Nr. 2

Zu einer Lösung aus 100 mg (0.3 mmol) 166, 30 µL (0.4

µmol) abs. Pyridin und 12 mL abs. Ethanol wurden 50

mg (0.3 mmol) 157 hinzugefügt. Die Lösung wurde für 3

Tage bei 80 °C gerührt. Anschließend wurde das

Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und

eine säulenchromatographische Reinigung mit

Dichlormethan mit einem Methanolgradienten (0 - 25%)

als Eluent durchgeführt. Das gewünschte Produkt wurde

nicht erhalten.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NAca

b

cd

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NAca

b

cd

Experimentalteil

Versuch Nr. 3


mmol) 157, 55 µL (0.3 µmol) DIPEA und 12 mL abs.

Ethanol für 3 Tage bei 80 °C gerührt. Danach wurde das

Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das erhaltene



25%). Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten

werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NAca

b

cd

Versuch Nr. 4

256


mmol) 157 und 12 mL abs. Ethanol 16 Stunden bei 80 °C





25%). Das gewünschte Produkt wurde jedoch nicht

erhalten.

N

N

N

O

NH2N

O

OAc

AcO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

167

NAca

b

cd

Synthese von 6-Chlor-2’-iso-desoxyadenosin 168

N

N

N

Cl

NH2N

O

OH

HO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

168

In ein Gemisch aus 11.5 mL Triethylamin (82.9 mmol), 4.5

mL Wasser (254 mmol) und 23.6 mL Methanol (580 mmol)

wurden 1.8 g 166 (4.9 mmol) gegeben und bei RT für 3

Stunden gerührt.

Danach wurde das Produkt unter vermindertem Druck vom

Lösungsmittel befreit. Insgesamt konnten 1.4 g (4.9 mmol, 99%) eines farblosen

Feststoffs erhalten werden. – Smp.: 113.4 °C. -DC: Rf-Wert (DCM/MeOH 9:1) = 0.77.

Experimentalteil

– [α]20546: + 17 ° (c = 0.3, MeOH/CH2Cl2). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6):

8.33 (s, 1H, H8), 6.93 (s, 2H, NH2), 6.21 (t, 3JHH = 7.1 Hz, 1H, H1’), 5.29 (s, 1H, H3’),

4.93 (s, 1H, NH), 4.37 (t, , 3JHH = 2.6 Hz, 1H, H-3´), 4.08 (s, 2H, H5á+b), 3.83 (dd, 3JHH = 4.5 Hz, 3JHH = 3.0 Hz, 1H, H-4´), 3.54 (ddd, 3JHH = 4.6 Hz, 3JHH = 7.2 Hz, 2JHH =

11.7 Hz, 1H, H-2a´), 2.64-2.58 (m, 1H, H2b’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-

d6): 159.7 (C-2), 153.6 (C-6), 149.4 (C-4), 141.0 (C-8), 123.5 (C-5), 87.7 (C-4), 83.0

(C-1´), 70.5 (C-4´), 61.5 (C-3´), 48.6 (C-5´), 45.7 (C-2´). – MS (EI, m/z): ber.:

285.0629, gef.: 285 [M]. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2955, 1613, 1472,

1258, 1110.

Synthese von 2-Amino-6-chlor-3´,5´-O-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-desoxy-

ribosylpurin 169 Zu einer Lösung aus 1.4 g (4.9 mmol) 168 und 15 mL

Pyridin wurden 2 g (29 mmol) Imidazol und 2.3 g (15.2

mmol) TBDMS-Cl-Lösung hinzugegeben und 16

Stunden bei RT gerührt. Abschließend wurde das

Produkt unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel

befreit und säulenchromatographisch gereinigt

(DCM/MeOH; 0% - 25%).

N

N

N

Cl

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

169Insgesamt konnten 2.3 g (4.5 mmol, 90%) eines hellgelben Feststoffs erhalten

werden. – Smp.: 51.0 °C. -DC: Rf-Wert (DCM/MeOH 9:1) = 0.87. – [α]20546: - 35 ° (c =

0.5, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.28 (s, 1H, H8), 6.94 (s, 2H,

NH2), 6.20 (t, 3JH,H= 6.7 Hz, 1H, H1´), 4.51 (ddd, 3JH,H= 2.7 Hz, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H=

5.3 Hz, 1H, H3´), 3.84-3.81 (m, 1H, H4´), 3.71 (dd, 2JH,H= 16.8 Hz, 3JH,H= 5.7 Hz, 1H,

H5á), 3.63 (dd, 2JH,H= 15.6 Hz, 3JH,H= 4.47 Hz, 1H, H5´b), 2.79-2.72 (m, 1H, H2á),

2.31-2.25 (m, 1H, H2´b), 0.87 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an H3´), 0.84 (s, 9H, Si-C(CH3)3 an

H5´), 0.10 (s, 6H, Si(CH3)2), 0.02, 0.01 (2 x s, 2 x 3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm]

(101 MHz, DMSO-d6): 159.8 (C6), 153.7 (C2), 149.5 (C4), 123.6 (C5), 135.1 (C8),

87.1 (C4´), 82.7 (C3´), 71.9 (C1´), 62.6 (C5´), 38.6 (C2´), 25.7 (SiC(CH3)3), 25.6

(SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), 17.6 (SiC(CH3)3), -4.8, -5.5 (Si(CH3)2). – MS (EI, m/z):

ber.: 513.2358, gef.: 513 [M]. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2927, 1613,

1373, 1093.

257

Experimentalteil

Versuche der Darstellung von N-Benzyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-

desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 170 mittels Substitution:

Versuch Nr. 1

258


mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurde 16

Stunden bei 80 °C gerührt. Nach Entfernung des

Lösungsmittels unter vermindertem Druck, folgte eine

säulenchromatographische Reinigung mit

Dichlormethan mit einem Methanol-Gradienten

(0 - 25%) als Eluent.

Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten

werden.

Versuch Nr. 2


(0.03 mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 8 mg

(0.06 mmol) Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung

wurde 16 Stunden bei 80 °C gerührt. Anschließend

wurde das Rohprodukt säulenchromatographisch

gereinigt, wobei Dichlormethan mit einem Methanol-

Gradienten (0 - 25%) als Eluent diente.


N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

170

NBna

b

cd

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

170

NBna

b

cd

Experimentalteil

Versuch Nr. 3

Einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg (0.03

mmol) 158 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 5.50 µL

(0.03 mmol) DIPEA hinzugefügt. Die Lösung wurde

anschließend 16 h bei 80 °C gerührt, bei vermindertem

Druck vom Lösungsmittel befreit und das erhaltene

Rohprodukt säulenchromatographisch gereinigt, wobei

Dichlormethan mit einem Methanol-Gradienten (0 -

25%) als Eluent diente.

Das gewünschte Produkt konnte nicht erhalten

werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

170

NBna

b

cd

Versuch Nr. 4

259


(0.03 mmol) 158 und 1.2 mL abs. Dimethylsulfoxid

wurden 5.50 µL (0.03 mmol) DIPEA hinzugefügt bevor

diese 16 Stunden bei 80 °C gerührt wurde. Nach

Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem

Druck konnte das gewünschte Produkt jedoch nicht

erhalten werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

170

NBna

b

cd

Experimentalteil

Versuche zur Darstellung von N-Acetyl-N-(3´5´-bis(tert-butyldimethylsilyl)-2´-

desoxyguanosin-O6-yl)-phenylamin 170 mittels Substitution:

260

Versuch Nr. 1


mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurde 16

Stunden bei 80 °C gerührt. Bei dieser Reaktion

erfolgte keine Umsetzung. Die Edukte konnte

reisoliert werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

170

NAca

b

cd

Versuch Nr. 2

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

170

NAca

b

cd


(0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 8 mg

(0.06 mmol) Kaliumcarbonat hinzugefügt. Die Lösung

wurde 16 Stunden bei 80 °C gerührt. Bei dieser

Reaktion konnte keine Umsetzung beobachtet werden.

Versuch Nr. 3

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

170

NAca

b

cd

Einer Lösung aus 10 mg (0.02 mmol) 169, 5 mg

(0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Ethanol wurden 5.5

µL (0.03 µmol) DIPEA hinzugefügt. Die Lösung

wurde anschließend 16 h bei 80 °C gerührt. Bei

dieser Reaktion erfolgte keine Umsetzung.

Experimentalteil

Versuch Nr. 4

261


(0.03 mmol) 157 und 1.2 mL abs. Dimethylsulfoxid

wurden 5.5 µL (0.03 µmol) DIPEA hinzugefügt bevor

diese 16 Stunden bei 80 °C gerührt wurde. Eine

Umsetzung konnte bei dieser Reaktion nicht

beobachtet werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

170

NAca

b

cd

Synthese von N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoylchlorid 172

Es wurden 34.5 g (132 mmol) PPh3, 7.3 mL (53 mmol) Triethylamin

in 21.1 mL (220 mmol) Tetrachlorkohlenstoff vorgelegt und unter

Eiskühlung mit 3.4 mL (44 mmol) Trifluoressigsäure 171 versetzt

und für 10 min. gerührt. Nach anschließender Zugabe von 6.3 mL

(53 mmol) Anilin 1, gelöst in 21.1 mL Tetrachlorkohlenstoff, wurde die Lösung für 20 h

refluxiert. Nach Einengen der Lösung wurde der Rückstand in Hexan aufgenommen

und filtriert. Der Niederschlag wurde mehrmals mit Hexan gewaschen. Nach dem

Einengen des Filtrats wurde der Rückstand im Vakuum destilliert. Die

Übergangstemperatur betrug 33 °C (Ölpumpenvakuum).

N

Cl

FF

F172

EA

B

C

D

Ausbeute: 2.04 g (9.82 mmol, 22%) einer farblosen Flüssigkeit - 1H-NMR: δ [ppm] (400

MHz, CDCl3): 7.44 (t, 3JH,H= 7.86 Hz, 3JH,H= 7.86 Hz, 2H, HC), 7.30 (t, 3JH,H= 7.48 Hz, 3JH,H= 7.48 Hz, 1H, HD), 7.10 dd, 3JH,H= 8.46 Hz, 4JH,H= 1.09 Hz, 2H, HB). - 13C-NMR:

δ [ppm] (101 MHz, CDCl3 ): 143.6 (CA), 129.3 (CC), 127.5 (CE), 120.8 (CB), 118.3

(CF3), 115.6. - 19F-NMR: δ [ppm] (188 MHz, CDCl3 ): - 76. - IR: Wellenzahl [cm-1]

(NaCl): 3071, 1696, 1489, 1287, 1222, 1162, 947, 827, 764, 691. - MS (FAB, m/z):

ber.: 207.0063, gef.: 207.0063 (M+H+).

Experimentalteil

Synthese von O6-N-Phenyl-2,2,2-trifluoracetimidoyl-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-

2’-desoxyguanosin 173

.

262

DMSO

N

FF

F

Unter Stickstoffatmosphäre wurden 1.4 g (2.8 mmol)

TBDMS-dG 121 in 56 mL abs. Dichlormethan gelöst.

Es wurden 1.3 g (0.4 mmol) N-Phenyl-2,2,2-

trifluoracetimidoyl-chlorid, 0.78 mL (4.8 mmol) abs.

Triethylamin sowie eine Spatelspitze

Dimethylaminopyridin hinzugegeben. Die Lösung wurde

über Nacht gerührt. Die Reaktionskontrolle erfolgte

mittels DC in DCM/MeOH 9:1. Das Lösungsmittel

wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit Hilfe des

Chromatotron gereinigt. Zunächst mit DCM als Eluenten und bei zweiten Durchlauf mit

PE mit einem Ethylacetatgradienten von 0-10%.

TBO

N

N

N

N

O

NH2

OTBDMS

1731'

2'3'

4'

5'

1

2

34

5 6

10

8

A

B

C

D

Ausbeute: 750 mg (1.13 mmol, 40%) eines hellgelben klebrigen Öls. -[α]20546: -93°

(c=0.025, CHCl3)- 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.19 (s, 1H, H8), 7.31-7.27

(m, 2H, HC), 7.17-7.11 (m, 3H, HB, HD), 6.77 (bs, 2H, NH2), 6.15 (dd, 3JH,H= 6.6 Hz, 3JH,H= 6.6 Hz, 1H, H1´), 4.52-4.49 (m, 1H, H3´), 3.81 (dd, , 3JH,H= 7.8 Hz, 3JH,H= 5.1

Hz, 1H, H4´), 3.71-3.61 (m, 2H, H5´), 2.75-2.70 (m, 1H, H2´a), 2.26 (ddd, 2JH,H= 13.1

Hz, 3JH,H= 6.1 Hz, 3JH,H= 3.7 Hz, 1H, H2´b), 0.88 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.84 (s,

9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.09 (s, 6H, Si(CH3)2 an C5’), 0.01 (s, 3H, Si(CH3) an C3’),

0.00 (s, 3H, Si(CH3) an C3’). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6 ): 159.2 (C6),

155.8 (C2), 155.7 (C10), 143.6 (C8), 139.9 (C4), 129.4 (C5), 129.3 (CC), 128.9

(CA),126.9 (CD), 121.5 (CB), 118.9 (CF3), 87.0 (C4´), 82.8 (C1´), 72.0 (C3´), 62.5

(C5´), 39.9 (C2´), 25.6 ( SiC(CH3)3), 25.6 (SiC(CH3)3), 17.9 (SiC(CH3)3), 17.6

(SiC(CH3)3), -5.5, -5.6 (SiC(CH3)2). - 19F-NMR: δ [ppm] (188 MHz, CDCl3 ): - 58. - IR:

Wellenzahl [cm-1] (NaCl): 3853, 3821, 3801, 3752, 3744, 3675, 3628, 3339, 2930,

2857, 2359, 1718, 1684, 1653, 1635, 1576, 1507, 1472, 1405, 1323, 1205, 1068, 836,

779, 668. - MS (FAB, m/z): ber.: 666.2993, gef.: 667.3071 (M+H+).

Experimentalteil

Versuch der Darstellung von O6-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert-

butyldimethylsilyl)-2’-desoxyguanosin 170

Unter Stickstoffatmosphäre wurden in einen

100 mL Kolben 1 g aktiviertes Molsieb gegeben. Es

wurden 150 mg (0.22 mmol) 173 sowie 72 mg (0.48

mmol) 157 hinzugegeben und in 3 mL abs. DCM

gelöst. Die Lösung wurde für 1 h bei RT gerührt und

anschließend auf -20°C abgekühlt und 40 μL (0.22

mmol) TMSOTf zugegeben. Anschließend für 3 h bei

RT gerührt. Dann mit 0.2 mL Triethylamin versetzt

und filtriert, das Filtrat wurde eingeengt und am Chromatotron, mit DCM, mit einem

Methanolgradienten von 0-5%, als Eluenten getrennt. Das gewünschte Produkt konnte

auf diesem Weg nicht erhalten werden.

ON

N

N

N

O

NH2

OTBDMS

TBDMSO

N

O

CH3

1701'

2'3'

4'

5'

1

2

34

5 6

1011

12

13

8

14

1. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-

desoxyguanosin 170 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt,

um Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen.

263

174, 17.5

Es wurden 50 mg (0.08 mmol) O6-Benzotriazolyl-

3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin

mg (0.08 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure

159 und 3.6 mg (0.0032 mmol) [IrCl(cod)]2 in 2

mL Dichlormethan gelöst und 24 h bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden

6 mg (0.08 mmol) Calciumhydroxid hinzugegeben und weitere 72 h bei

Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein Umsatz beobachtet werden. Das

Edukt konnte reisoliert werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 678

9

1'3'

4'

5'

2'

170

N

O

AB

C

DA'B'

C'

D'

Experimentalteil




264

174, 17.5


3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin


159 und 3.6 mg (0.0032 mmol) Pd(PPh3)4 in 2

mL Acetonitril gelöst und 24 h bei

Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden

6 mg (0.08 mmol) Calciumhydroxid hinzugegeben und weitere 72 h bei

Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein Umsatz beobachtet werden. Das

Edukt konnte reisoliert werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 678

9

1'3'

4'

5'

2'

170

N

O

AB

C

DA'B'

C'

D'




Es wurden 495 mg (1 mmol) 3’,5’-bis-TBDMS-2’-

desoxyguanosin 121, gelöst in 20 mL

Dichlormethan, mit 0.52 mL (3.7 mmol)

Triethylamin, 10 mg (0.08 mmol) DMAP und 500

mg (1.6 mmol) Mesitylsulfonylchlorid versetzt

und für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Anschließend wurde die Reaktion auf 0 °C gekühlt und mit 1 mL (9.5 mmol) N-

Methylpyrrolidin, gelöst in 3 mL Dichlormethan, langsam versetzt und für 3 h in der

Kälte gerührt, bevor die Zugabe von 280 mg (1.4 mmol) N-

Phenylbenzohydroxamsäure 159, gelöst in 3 mL Dichlormethan erfolgte und für 48

Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach anschließendem Einengen und Trennung

des Substanzgemisches mit Dichlormethan/Methanol (0-20%) konnte jedoch kein

gekuppeltes Produkt erhalten werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 678

9

1'3'

4'

5'

2'

170

N

O

AB

C

DA'B'

C'

D'

Experimentalteil

1. Versuch zur Synthese von O6-N-(N-Benzoylphenylamino)-2’-desoxyguanosin 160

Es wurden 28.5 mg (0.1 mmol) 2’-

Desoxyguanosin-Monohydrat 52, gelöst in 2 mL

Wasser (pH=9), mit 2 mL Acetonitril und 100 mg

(0.46 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 159

versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur

gerührt. Es konnte jedoch keine Umsetzung

beobachtet werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

1

2

34

5 678

9

1'3'

4'

5'

2'

160

N

O

AB

C

DA'B'

C'

D'




Wasser (pH=10), mit 2 mL Acetonitril und 100


159 versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur


beobachtet werden.

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

1

2

34

5 678

9

1'3'

4'

5'

2'

160

N

O

AB

C

DA'B'

C'

D'




Wasser (pH=10), mit 2 mL Pyridin und 100 mg

(0.46 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 159

versetzt und für 7 Tage bei Raumtemperatur


beobachtet werden.

265

N

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

1

2

34

5 678

9

1'3'

4'

5'

2'

160

N

O

AB

C

DA'B'

C'

D'

Experimentalteil

Synthese von O6-(Benzotriazol-1-yl)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 174

Unter Inertgasatmosphäre wurden 1.10 g

(2.21 mmol) 3’,5’-Bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 121 und 2.03 g (4.59 mmol) BOP

in einem 100 mL Kolben eingewogen, in 23 mL

abs. DMF gelöst und mit 0.80 mL (0.60 g, 4.6

mmol) DIPEA versetzt. Anschließend wurde die

Lösung bei RT für 72 h gerührt, dabei färbte sich

die Lösung langsam rot-braun. Dann wurde das

DMF unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (50 mL)

aufgenommen, mit dest. Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und

schließlich das Ethylacetat am Rotationsverdampfer entfernt. Das rot-braun viskose

Rohprodukt wurde am Chromatotron gereinigt. Als Eluent wurde mit PE (EE-

Gradienten von 50% → 100%) begonnen, dann EE mit einem DCM Gradienten von

0% → 100% verwendet und schließlich DCM mit einem Methanolgradienten von 0%

→ 10% abgeschlossen.

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

174

N

NN

16 15

14

1312

11

Ausbeute: 0.89 g (1.45 mmol, 65%) eines gelben kristallinen Feststoffs. – DC: Rf-Wert

(DCM/Methanol 9:1): 0.89. - Smp: 88-90 °C. - [ ]546

20α : + 27° (c = 0.22, CHCl3). - 1H-

NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 8.30 (s, 1H, H-8), 8.11 (d, 1H, 3JH,H= 8.4 Hz, H-

14), 7.75 (d, 1H, 3JH,H= 8.3 Hz, H-11), 7.64 (t, 1H, 3JH,H= 7.2 Hz, 3JH,H= 7.2 Hz, H-12),

7.51-7.55 (m, 1H, H-13), 6.74 (bs, 2H, NH2), 6.25 (dd, 1H, 3JH,H= 6.7 Hz, 3JH,H= 6.7 Hz,

H-1’), 4.54 (ddd, 1H, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H= 3.4 Hz, 3JH,H= 8.6 Hz, H-3’), 3.83-3.86 (m,

1H, H-4’), 3.70 (dddd, 2H, 3JH,H= 5.2 Hz, 2JH,H= 11.1 Hz, 2JH,H= 15.6 Hz, H-5’a, H-5’b),

2.75-2.82 (m, 1H, H-2’a), 2.31 (ddd, 1H, 3JH,H= 3.6 Hz, 3JH,H= 6.1 Hz, 2JH,H= 13.2 Hz,

H-2’b), 0.89 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C3´), 0.86 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.11 (s, 6H,

Si(CH3)2 an C3’), 0.04, 0.03 (2·s, 2·3H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 159.1 (C-6), 158.9 (C-2), 156.7 (C-4), 142.6 (C-15), 139.7 (C-8), 129.2 (C-

10), 128.9 (C-12), 124.9 (C-13), 119.3 (C-14), 111.8 (C-5), 109.0 (C-11), 86.9 (C-4’),

82.6 (C-1’), 71.8 (C-3’), 62.4 (C-5’), 38.8 (C-2’), 26.1 (SiC(CH3)3), 24.6

(SiC(CH3)3),17.9 (SiC(CH3)3), 17.5 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)2), -6.5 (SiC(CH3)2). -

IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 3204, 2954, 2928, 2884, 1514, 1445, 1280,

266

Experimentalteil

1227, 1190, 946, 882, 780, 742. - MS (FAB, m/z): ber.: 612.3024, gef.: 613.3102

[M+H]+.

Synthese von C8-N-(N-Benzoylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxyguanosin 175.2 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um



3’,5’-bis-TBDMS-2’-desoxy-guanosin 174, 26 mg

(0.12 mmol) N-Phenylbenzohydroxamsäure 158 und

39 mg (0.12 mmol) Cäsiumcarbonat in 2 mL 1,2-

Dimethoxyethan gelöst und 12 h bei

Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 3 mL Wasser wurden die Phasen

getrennt und die wässrige Phase dreimal mit Dichlormethan extrahiert, bevor die

vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat getrocknet und vom

Lösungsmittel befreit wurden. Eine chromatographische Reinigung erfolgte am

Chromatotron mit Dichlormethan/Methanol (0-5%).

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

BzN

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

A

BCD

175.2

Ausbeute: 11.0 mg (0.02 mmol, 20%) eines farblosen Feststoffs. - DC: Rf-Wert

(Ethylacetat/Petrolether 1:1 v/v): 0.25. - Schmelzpunkt: 148 °C. - [α]20546: + 61 ° (c =

0.1, CHCl3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.78 (s, 1H, NH), 7.14-7.63 (m,

10H, HB, HC, HD, Bz-H), 6.36 (s, 2H, NH2), 5.97-6.07 (m, 1H, H1´), 4.39-4.49 (m, 1H,

H3´), 3.68-3.75 (m, 3H, H5´, H4´), 2.95-3.01 (m, 1H, H2´a), 1.71-1.75 (m, 1H, H2´b),


(Si(CH3)2)2), 0.03 (s, 6H, (Si(CH3)2)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 167.4

(quart. Bz-C), 155.3 (C6), 152.0 (C2), 149.5 (C8), 143.2 (C4), 141.9 (Ca’), 141.3 (C5),

135.3 (CA), 130.1 (Cd’), 128.4 (Cb’), 128.2 (C(D)), 128.0 (Cc’), 127.0 (C(C)), 122.5

(C(B)), 86.8 (C4´), 82.5 (C3´), 72.3 (C1´), 62.7 (C5´), 36.5 (C2´), 25.4 (Si(CH3)2), 25.3

(Si(CH3)2), 17.7 (SiC(CH3)3), 17.4 (SiC(CH3)3), -5.1 (SiC(CH3)3), -5.3 (SiC(CH3)3).- IR:

Wellenzahl [cm-1] (KBr): 3853, 3744, 3447, 2927, 1700, 1696, 1653, 1570, 1437, 1030.

- MS (FAB, m/z): ber.: 690.3381, gef.: 691.3403.

267

Experimentalteil

1. Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 175

Unter Inertgasatmosphäre wurden 321 mg (520 µmol)

174, 340 mg (1.04 mmol) Cäsiumcarbonat und 157

mg (1.04 mmol) 157 in einen 25 mL Kolben

eingewogen und in 7 mL abs. DME suspendiert.

Anschließend wurde die Suspension bei RT für 2 h

gerührt. Danach wurde die Suspension in DCM

aufgenommen und mit dest. Wasser ausgeschüttelt.

Die wässrige Phase wurde noch zweimal mit DCM extrahiert und die vereinigten

organischen Phasen über Magensiumsulfat getrocknet. Nach der Entfernung des

Lösungsmittels wurde das Rohprodukt am Chromatotron mit DCM/MeOH 19:1

gereinigt.

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

175

15

14

13 12

11

NO

Ausbeute: 171 mg (272 µmol, 52%) eines hellbraunen Feststoffs – DC: Rf-Wert

(DCM/Methanol 19:1): 0.17. – Smp.: 227-229 °C (Zersetzung). - [ ] : + 90° (c =

0.17, CHCl

546

20α

3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, DMSO-d6): 10.65 (s, 1H, H-1), 7.60-7.62

(m, 2H, H-11), 7.33-7.36 (m, 2H, H-12), 7.12-7.15 (m, 1H, H-13), 6.40 (bs, 2H, NH2),

5.90-6.09 (m, 1H, H-1’), 4.49-4.58 (m, 1H, H-3’), 3.66-3.75 (m, 4H, H-2’a, H-4’, H-5’a

und H-5’b), 3.06-3.17 (m, 1H, H-2’b), 2.19 (s, 3H, H-15), 0.86 (s, 9H, SiC(CH3)3 an

C3´), 0.80 (s, 9H, SiC(CH3)3 an C5´), 0.07 (m, 6H, Si(CH3)2), -0.04 (s, 6H, Si(CH3)2). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-d6): 170.2 (C-14), 156.2, 153.5, 141.6, 129.1,

128.6, 128.3, 122.9, 118.9, 118.7, 115.1, 87.3 (C-4’), 83.2 (C-1’), 72.2 (C-3’), 63.8 (C-

5’), 25.6 (SiC(CH3)3), 25.5 (SiC(CH3)3), 22.4 (C-15), 17.8 (SiC(CH3)3), 17.5

(SiC(CH3)3), -5.4 (SiC(CH3)2), -5.5 (SiC(CH3)2). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling):

2954, 2886, 1704, 1602, 1542, 1431, 1330, 1112, 1031, 812, 779, 691. - MS (FAB,

m/z): ber.: 628.3225, gef.: 629.3303 [M+H]+.

268

Experimentalteil

2. Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-3’,5’-bis-O-(tert-butyldimethylsilyl)-2’-

desoxyguanosin 175

Unter Inertgasatmosphäre wurden 100 mg (161 µmol)

174 und 157 mg (1.04 mmol) 157 in einen 25 mL

Kolben eingewogen und in 5 mL abs. Pyridin

suspendiert. Anschließend wurde die Suspension bei

RT für 16 h gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel

entfernt und das Rohprodukt am Chromatotron mit

DCM/MeOH 19:1 gereinigt.

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

175

15

14

13 12

11

NO

Ausbeute: 75 mg (120 µmol, 75%) eines hellbraunen Feststoffs.

Analytik siehe Seite 268.

Versuch zur direkten Synthese von C8-N-(N-Acetylylphenylamino)-3’,5’-bis-TBDMS-2’-

desoxyguanosin 175 Die Reaktion wurde unter Stickstoff ausgeführt, um

Sauerstoff und Feuchtigkeit auszuschließen. NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

1

2

34

5 678

9

1'3'

4'

5'

2'

175

A

B

CD

NOEs wurden 50 mg (0.1 mmol) 3’,5’-bis-TBDMS-2’-

desoxyguanosin 121, 36 mg (0.16 mmol) N-

Acetylbenzohydroxamsäure 157 und 57 mg (0.11

mmol) BOP in 2 mL DMF gelöst und 96 h bei

Raumtemperatur gerührt. Es konnte jedoch kein

Umsatz beobachtet werden.

269

Experimentalteil

Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-2’-desoxyguanosin 176

Die Synthese wurde nach AAV 3 durchgeführt. Es wurden

140 mg (222 µmol) 175 eingesetzt.

Ausbeute: 85 mg (0.21 mmol, 96%) eines gelb-hellbraunen

Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.11. –

Smp.: 138-140 °C. - [ ] : + 55° (c = 0.29, DCM/MeOH

1:1). -

546

20α


1H, H-1), 7.35-7.50 (m, 5H, H-11, H-12 und H-13), 6.44

(bs, 2H, NH2), 6.04-6.10 (m, 1H, H-1’), 5.24 (bs, 1H, OH), 4.96 (bs, 1H, OH), 4.35-4.40

(m, 1H, H-3’), 3.80-3.83 (m, 1H, H-4’), 3.53-3.67 (m, 2H, H-5’a und H-5’b), 3.06-3.12

(m, 2H, H-2’a und H-2’b), 2.02 (s, 3H, H-15). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, DMSO-

d6): 128.9, 126.1 und 125.0 (C-11, C-12 und C-13), 87.9 (C-4’), 83.6 (C-1’), 71.3 (C-

3’), 62.3 (C-5’), 45.5 (C-2’), 22.3 (C-15). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2937,

1718, 1680, 1671, 1647, 1576, 1369, 842. - MS (FAB, m/z): ber.: 400.15, gef.: 401.3

[M+H]+.

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

176

15

14

13 12

11

NO

Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-N2-formamidin-2’-desoxyguanosin 177

Die Synthese wurde nach AAV 4 durchgeführt. Es

wurden 75 mg (0.18 mmol) 176 eingesetzt

270

Ausbeute: 50 mg (0.11 mmol, 61%) eines gelben, leicht

bräunlichen Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol

7:3): 0.81. – Smp.: 153-155 °C. - [ ]546

20α 59° (c = 0.29,

DCM/MeOH 1:1). -

: + 1H-NMR: δ [ppm] (500 MHz, DMSO-

d6): 11.48 (s, 1H, H-1), 8.47 (s, 1H, Hα), 7.33-7.45 (m,

5H, H-11, H-12 und H-13), 6.11-6.15 (m, 1H, H-1’), 5.30-5.33 (m, 1H, H-3’), 4.87-4.90

(m, 1H, H-5’a), 4.42-4.47 (m, 1H, H-5’b), 3.80-3.86 (m, 1H, H-4’), 3.52-3.65 (m, 2H, H-

2’a und H-2’b), 3.13 (s, 3H, Me-Formamidin), 3.03 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.03 (s,

3H, H-15). - 13C-NMR: δ [ppm] (125.7 MHz, DMSO-d6): 158.4, 129.0, 126.7, 87.8,

83.9, 70.8, 61.4, 40.7, 34.5, 22.1. - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2931, 1734,

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

177

15

14

13 12

11

NO

N

α

Experimentalteil

1653, 1594, 1569, 1491, 1436, 1357, 1286, 1055, 844. - MS (FAB, m/z): ber.:

455.1917, gef.: 456.1977 [M+H]+.

Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)-N2-formamidin-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2’-

desoxyguanosin 178


wurden 45 mg (98 µmol) 177 eingesetzt. Ausbeute:

42 mg (55 µmol, 56%) eines weiß-hellbraunen

Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1): 0.13.

- Smp.: 111 °C. - [ ]546

20α : + 21° (c = 0.1, CHCl3). -


1H, H-1), 8.19 (s, 1H, H-16), 7.11-7.41 (m, 14H, H-

11, H-12, H-13 und arom. H vom DMTr) 6.67-6.74 (m, 4H, H-11, H-12, H-13 und

arom. H vom DMTr), 6.17-6.23 (m, 1H, H-1’), 5.31-5.39 (m, 1H, H-3’), 4.58-4.62 (m,

1H, H-4‘), 3.89-3.94 (m, 1H, H-5’a), 3.68-3.70 (m, 8H, OCH3-DMTr und H-5’b), 3.00 (s,

3H, Me-Formamidin), 2.94 (s, 3H, Me-Formamidin), 2.04 (s, 3H, H-15), die 2’-Protonen

wurden vom Wasser und DMSO Signal überlagert. - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz,

DMSO-d6): 156.9 (Cα), 129.4, 128.9, 127.2, 126.6, 112.6, 112.4, 85.5 (3.9), 82.9 (C-

1’), 70.5 (4.6), 54.6 (OCH3-DMTr), 40.6 (Me-Formamidin), 34.4 (Me-Formamidin), 22.4

(C-15). - MS (FAB, m/z): ber.: 757.3224, gef.: 758.3336 [M+H]+.

NH

N

N

O

NN

O

OH

DMTrO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

178

15

14

13 12

11

NO

N

α

271

Experimentalteil

Synthese von 8-(N-Phenylacetamido)- N2-formamidin-3’-O-[(2-cyanoethoxy)-(N,N-

diisopropylamino)-phosphinyl]-5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-2’-desoxyguanosin 179


wurden 39 mg (51 µmol) 178 eingesetzt.

Ausbeute: 34 mg (35 µmol, 68%) eines weißen

Feststoffs – DC: Rf-Wert (DCM/Methanol 9:1):

0.26. – Smp.: 68-70 °C. - : + 74° (c = 0.06,

CHCl

[ ]546

20α

3). - 1H-NMR: δ [ppm] (400 MHz, Benzol-d6):

11.39 (s, 2H, NH (I+II)), 8.36 (s, 1H, Hα (I)), 8.23

(s, 1H, Hα (II)), 7.62-6.62 (m, 36H, DMTr-H (I+II) +

Anil-H (I+II)), 6.41 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 1H, H1’ (I)), 6.31 (dd, 3JHH = 6.3

Hz, 3JHH = 6.3 Hz, 1H, H1’ (II)), 4.88-4.86 (m, 1H, H3’ (I)), 4.85-4.83 (m, 1H, H3’ (II)),

4.37-4.33 (m, 2H, H4’ (I+II)), 3.56-3.30 (m, 38H, DMTr-CH3 (I+II) + iPr-H (I+II) + H2a’

(I+II) + H5’a+b (I+II) + α’Ha+b (I+II) + Me-Formamidin + H15 (I+II)), 2.77 (m, 1H, H2b’

(II)), 2.58 (m, 2H, H2b’ (I) + β’Ha (I)), 2.23 (ddd, 1H, β’Hb (I)), 2.04 (s, 6H, H-15 (I+II)),

1.85 (dd, 3JHH = 6.1 Hz, 3JHH = 6.1 Hz, 2H, β’Ha (II) + β’Hb (II)), 1.15-0.96 (m, 24H, iPr-

CH3 (I+II)). - 13C-NMR: δ [ppm] (101 MHz, Benzol-d6): 178.7, 159.3, 159.2, 158.2,

147.6, 147.5, 145.3, 145.3, 136.3, 133.2, 130.9, 130.8, 130.7, 130.6, 130.5, 129.3,

128.8, 128.7, 128.6, 128.4, 118.4, 118.2, 114.6, 113.7, 113.6, 87.1, 86.6, 85.6, 75.0,

74.8, 74.0, 73.8, 64.1, 64.0, 58.7, 58.6, 58.5, 58.5, 55.1, 54.9, 54.8, 43.6, 43.6, 43.5,

43.5, 38.6, 38.4, 37.7, 30.2, 24.8, 24.7, 24.6, 20.6, 20.5, 20.3. - 31P-NMR: δ [ppm] (162

MHz, Benzol-d6): 147.4 und 147.1 (Diastereomere des Phosphoramidits), 9.5 (H-

Phosphonat). - IR: Wellenzahl [cm-1] (KBr-Pressling): 2968, 2932, 1700, 1696, 1680,

1672, 1629, 1554, 1517, 1493, 1368, 1326, 1116, 1079, 979. - MS (ESI+, m/z): ber.:

957.4302, gef.: 980.4199 [M+Na]+.

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

1

2

34

5 67

8

9

1'3'

4'

5'

2'

179

15

14

13 12

11

NO

N

α

PO N

NC α'

β'

272

Experimentalteil

8.6 Oligonucleotide

Synthese des Standardoligonucleotids 56 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´

M: 3582.4

HPLC: tR (Methode A): 27.33 min.

MS: ESI, m/z (Ladung): 594.46 (-6), 713.32 (-5), 892.16 (-4), 1189.34 (-3).

Synthese des Standardoligonucleotids 183 5´-dGpdApdTpdGpdGpdCpdGpdCpdCpdGpdApdG-3´

M: 3711.5


MS: ESI, m/z (Ladung): 615.93 (-6), 739.36 (-5), 924.39 (-4), 1232.76 (-3).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 184 5´-dCpdTpdCpdG(Anilin)pdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´

M: 3673.4


MS: ESI, m/z (Ladung): 609.7 (-6), 731.42 (-5), 1219.37 (-3).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 185 5´-dCpdTpdCpdG(4-Aminobiphenyl)pdGpdCpdGpdCpdCpdApdTpdC-3´

M: 3750.4


MS: ESI, m/z (Ladung): 626.01 (-6), 751.71 (-5), 940.15 (-4).

273

Experimentalteil

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 186 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(Anilin)pdCpdCpdApdTpdC-3´

M: 3673.4


MS: ESI, m/z (Ladung): 523.46 (-7), 731.78 (-5), 914.92 (-4).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 188 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(Anisidin)pdCpdCpdApdTpdC-3´

M: 3703.4


MS: ESI, m/z (Ladung): 468.03 (-8), 737.18 (-5), 921.79 (-4).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 187 5´-dCpdTpdCpdGpdGpdCpdG(4-Aminobiphenyl)pdCpdCpdApdTpdC-3´

M: 3750.4


MS: ESI, m/z (Ladung): 626.44 (-6), 751.62 (-5), 939.50 (-4).

Synthese des Standardoligonucleotids 57 5´-dGpdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3643.5


MS: ESI, m/z (Ladung): 454 (-8), 519 (-7), 606 (-6).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 189 5´-dGpdTpdApdG(Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3736.63


MS: ESI, m/z (Ladung): 465.39 (-8), 531.98 (-7), 620.71 (-6).

274

Experimentalteil

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 196 5´-dG(Anilin)pdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3736.63


MS: ESI, m/z (Ladung): 531.38 (-7), 619.84 (-6), 743.78 (-5), 930.72 (-4), 1240.74

(-3).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 190 5´-dGpdTpdApdG(4-Anisidin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3765.56


MS: ESI, m/z (Ladung): 472.03 (-8), 550.31 (-7), 624.60 (-6).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 191 5´-dGpdTpdApdG(4-Toluidin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3749.56


MS: ESI, m/z (Ladung): 471.85 (-8), 536.15 (-7), 625.30 (-6).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 192 5´-dGpdTpdApdG(4-Cyanoanilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3735.55


MS: ESI, m/z (Ladung): 468.24 (-8), 535.41 (-7), 624.75 (-6).

275

Experimentalteil

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 193 5´-dGpdTpdApdG(3,5-Dimethylanilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3764.68


MS: ESI, m/z (Ladung): 468.79 (-8), 536.02 (-7), 625.26 (-6).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 194 5´-dGpdTpdApdG(4-Aminobiphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3812.73


MS: ESI, m/z (Ladung): 474.91 (-8), 542.87 (-7), 633.08 (-6).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 197 5´-dG(4-Aminobiphenyl)pdTpdApdGpdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3812.73


MS: ESI, m/z (Ladung): 476.18 (-8), 540.48 (-7), 631.24(-6).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 195 5´-dGpdTpdApdG(2-Aminofluoren)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3823.74


MS: ESI, m/z (Ladung): 476.33 (-8), 544.48 (-7), 635.30 (-6).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 200 5´-dGpdTpdApdG(N2-Azo-Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3733.74


MS: ESI, m/z (Ladung): 621 (-6), 745 (-5), 931 (-4).

276

Experimentalteil

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 201 5´-dGpdTpdApdG(N2-Azo-Biphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3810.74


MS: ESI, m/z (Ladung): 632 (-6), 750 (-5).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 198 5´-dGpdTpdApdG(N2-Hydrazino-Anilin)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3735.74


MS: ESI, m/z (Ladung): 466 (-8), 531 (-7), 619 (-6).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 199 5´-dGpdTpdApdG(N2-Hydrazino-Biphenyl)pdApdApdTpdTpdCpdTpdApdC-3´

M: 3812.74


MS: ESI, m/z (Ladung): 631 (-6), 757 (-5), 1263 (-3).

Synthese des Standardoligonucleotids 58 5´-dApdApdApdTpdGpdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCpdApdGp

dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9104

HPLC: tR (Methode B): 26.24 min.

MS: ESI, m/z (Ladung): 700 (-13), 759 (-12), 826(-11).

Synthese des Standardoligonucleotids 202 5´-dCpdGpdTpdTpdCpdGpdTpdCpdCpdTpdGpdApdApdGpdGpdApdGpdGpdApdTpdApdGp

dGpdT pdTpdCpdApdTpdTpdT-3´

M: 9308.1


MS: ESI, m/z (Ladung): 716 (-13), 775 (-12), 846 (-11), 931 (-10). 277

Experimentalteil

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 203 5´-dApdApdApdTpdG(Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp

dApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9195


MS: ESI, m/z (Ladung): 723 (-13), 781 (-12), 881 (-11).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 204 5´-dApdApdApdTpdG(Anisidin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp


M: 9225.1


MS: ESI, m/z (Ladung): 708 (-13), 767(-12), 835 (-11), 921 (-10).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 205 5´-dApdApdApdTpdG(Toluidin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTpdTpdCp


M: 9209.1


MS: ESI, m/z (Ladung): 708 (-13), 837 (-11).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 206 5´-dApdApdApdTpdG(3,5-Dimetyhlanilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCp

dTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9223.1


MS: ESI, m/z (Ladung): 719 (-13), 769 (-12), 837 (-11), 910 (-10).

278

Experimentalteil

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 207 5´-dApdApdApdTpdG(4-Aminobiphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCp

dCpdTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9271.2


MS: ESI, m/z (Ladung): 772 (-12), 842 (-11), 926 (-10).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 208 5´-dApdApdApdTpdG(2-Aminofluoren)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTp

dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9283.2


MS: ESI, m/z (Ladung): 713 (-13), 772 (-12), 843 (-11), 927 (-10), 1030 (-9).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 211 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Azo-Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCpdCpdTp

dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9193


MS: ESI, m/z (Ladung): 757 (-12), 841 (-11), 1016 (-10)

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 212 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Azo-Biphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTp

dCpdCpdTpdTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9269.2


MS: ESI, m/z (Ladung): 656 (-14), 712 (-13), 771 (-12), 853 (-11), 926 (-10).

279

Experimentalteil

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 209 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Hydrazino-Anilin)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCpdCpdTpdCp

dCpdTpdTpdCpdApdGpdGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9195


MS: ESI, m/z (Ladung): 658 (-14), 709 (-13), 768 (-12), 803 (-11).

Synthese des modifizierten Oligonucleotids 210 5´-dApdApdApdTpdG(N2-Hydrazino-Biphenyl)pdApdApdCpdCpdTpdApdTpdCp

dCpdTpdCpdCpdTp dTpdCpdApdGp dGpdA pdCpdCpdApdApdCpdG-3´

M: 9271.2


MS: ESI, m/z (Ladung): 723 (-13), 779 (-12), 844 (-11).

280

Gefahrstoffverzeichnis

9. Gefahrstoffverzeichnis

Substanz Gefahren-symbole R-Sätze S-Sätze

Aceton F, Xi 11-36-66-67 9-16-26

Acetonitril F, T 11-23/24/25 16-27-45

Acetylchlorid F, C 11-14-34 9-16-26-45

4-Aminobiphenyl T 45-22 53-45

2-Aminofluoren Xn 20/21/22-40 ?

2-(4-Aminophenyl)ethanol A - ?

Ammoniak C, N 34-50 26-36/37/39-45-61

Ammoniumchlorid Xn 22-36 22

Ammoniumsulfat - - -

Anilin T, N 20/21/22-40-48/23/24/25-

50

28.6-36/37-45-61

p-Anisidin T+, N 45-

E26/27/28-33-50

53-28.1-36/37-45-61

Antimon(III)bromid C,N 34-51/53 26-45-61

Benzol T, F

45-46-11-36/38-

48/23/24/25-65

53-45

Benzoylchlorid C 34 26-45

Benzylalkohol Xn 20/22 26

Benzylbromid Xi 36/37/38 39

Benzylchlorid T 45-E22-E23-37/38-41

53-45

BOP Xi 36/37/38 -

Bromoform T, N 23-36/38-51/53

28-45-61

N-Bromsuccinimid Xn 22-36/37/38 26-36

281


tertButylnitrit F, Xn 11/20-22 16-24-46

Cäsiumcarbonat Xi 36/37/38-46 -

Chloroform Xn 22-38-40-48/20/22

36/37

p-Cyanoanilin Xn 20/21/22-36/37/38

-

DBU C 22-34-52/53 26-36/37/39-45

2’-Desoxyguanosin - - -

Dibrommethan Xn, N 20-52/53-59 26/59/61

DCI F, T 11-23/24/25 16-28-36/37-39-45

DIAD Xn36/37/38-40-

48/20/22 36

Dibrommethan Xn 20-52/53 24-61

Dichlormethan Xn 40 23-24/25-36/37

Diethylether F+, Xn12-19-22-66-

67 9-16-29-33

Diisopropylamin F, C 11-20/22-34 16-26-36/37/39-45

Diisopropylethylamin

F, C 11-22-34-52/53

16-26-36/37/39-45-61

1,2-DME Xn 20/21/22-37 24/25

N,N-Dimethylamin F, C 11-20/22-34 3-16-26-29-36/37/39-45

4-Dimethyl-aminopyridin T 24/25-36/38 22-36/37-45

3,5-Dimethylanilin T, N 23/24/25-33-51/53

(1/2)28-36/37-45-61

N,N-Dimethyl-formamid-diethylacetal Xi 10-36/37/38 16-26-36

DMSO - - -

1,4-Dioxan F, Xn11-19-36/37-

40-66 9-16-36/37-46

DTT Xn 22-36/38 -

Essigsäure C 10-35 23.2-26-45

Essigsäureanhydrid C 10-20/22-34 26-36/37/39-45

282


Ethanol F 11 7-16

Ethylacetat F, Xi 11-36-66-67 16-26-33

Formamid T 61 53-45

Hexan F, Xn, N 11-38-48/20-51/53-62-65-

67

9-16-29-33-36/37-61-62

Hydrazin-Hydrat T, C, N 45-10-23/24/25-34-

45-50/53

?

Imidazol C 22-34-63 22-26-36/37/39-45

KBr - - -

Kaliumcarbonat Xi 36/37/38 22-26

Kaliumphosphat Xi 36/38 -

Kalium-superoxid O, C 8-35 17-26-36/37/39-45

Kieselgel T - 22

Kupfer(I)chlorid Xn, N 22-50/53 22-60-61

Mesitylensulfonylchlorid C 34 26-36/37/39-45

Methanol F, T 11-23 /24/ 25-39/23/

24/25 7-16-36-37-45

Methylamin F+, Xn 12-20-37/38-41 16-26-29

β-Mercaptoethanol T, N 22-24-34-51/53 26-36/37/39-45

Molybdän(VI)oxid Xn36/37-

48/20/22 (2)-22-25

Natriumacetat - - -

Natriumborhydrid F, T 15-24/25-35 14-26-36/37/39-43-45

Natriumcacodylat N, T 23/25-50/53 1/2-20/21-28-45-60-61

Natriumcyanid T+, N 26/27/28-32-50/53

7-28-29-45-60-61

Natriumhydrogencarbonat - - -

Natriumhydrid F, C 15-34 7/8-26-36/37 /39-43.6-45

283


Natriumhydroxid C 35 26-36/37/39-45

Natriumnitrit O, T, N 8-25-50 45-61

Natriumsulfat - - -

Na2Fe(CN)5NO · 2H2O T 23/24/25-32 ?

Nitrobenzol T, N 23/24/25-40-48/23/ 24-51/53-62

28.3-36/37-45-61

Oxone® O, C 8-34 26-36/37/39-45

Pd/C - - -

Perchlorsäure C, O 5-8-35 23B-26-36/37/39-45

Petrolether F, Xn 11-52/53-65 9-16-23.2-24-33-62

Phenylhydrazin T, N

45-23/24/25-36/38-43-

48/23/24/25-50-68

53-45-61

Phosphortrichlorid T+, C 14-26/28-35-48/20 7/8-26-36/37/39-45

Phosphorylchlorid T+, C 14-22-26-35-48/23

7/8-26-36/37/39-45

Pyridin F, Xn 11-20/21/22 26-28.1

rac-BINAP Xi 38 -

Salzsäure C 34-37 26-36/37/39-45

TBDMS-Cl C 22-35-40 26-27-28-36/37/39-45

TBAI Xn 22

Tetrachlorkohlenstoff T, N 23/24/25-40-48/23-52/53-

59

(1/2-)23-36/37-45-59-61

Tetrahydrofuran F, Xi 11-19-36/37 16-29-33

p-Toluidin T, N 23/24/25-36-40-43-50 28-36/37-45-61

Toluol F, Xn 11-20 16-23-25-29

Triethylamin F, C 11-20/21/ 22-35

3-16-26-29-36/37/39-45

Triethylamin-Trihydrofluorid T+, C 26/27/28-35 7/9-26-36/37/39-45

284


Triethylammoniumchlorid C 34 26-36/37/39-45

Trifluoressigsäure C 20-35-52/53 9-26-27-28-45-61

Trifluoressigsäureanhydrid C 14-20-35-52/53

9-26-36/37/39-45-61

Trimethylsilylbromid C 10-34 ?

Triphenylphosphin Xn 22-43-53 36/37-60

Tris Xi 36/37/38 -

Wasserstoffperoxid 30% Xn 22-41 26-39

Zink-Pulver N 50/53 60-61

Zinnchlorid Xn22-36/37/38-

43 24-26-37

Zirkoniumoxid A - -

285

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300

Anhang

301

11. Anhang Synthese-Protokoll für unmodifizierte Phosphoramidite

Schritt Funktion Zeit [s]

1 Begin

2 MeCN to waste 3

3 MeCN to Column 10

4 Reverse Flush 10

5 Block Flush 4

6 Phos Prep 3

7 Column 1 On

8 Block Vent 2

9 DCI to Waste 1.7

10 Base+DCI to Column 5

11 DCI to Column 2


13 DCI to Column 2


15 Push to Column

16 Column 1 Off

17 Wait 25

18 Cap Prep 3

19 MeCN to Waste 4

20 Reverse Flush 7

21 Block Flush 3

22 Cap to Column 10

23 Wait 5

24 MeCN to Waste 4

25 Reverse Flush 7

26 Block Flush 3

Anhang

302

27 Ox. to Column 8

28 MeCN to Waste 4

29 Block Flush 3

30 Wait 15

31 MeCN to Column 10

32 Flush to Waste 6


34 Reverse Flush 7

35 Block Flush 3

36 Start Detrityl

37 MeCN to Waste 4


39 Reverse Flush 7

40 Block Flush 3

41 If Monitoring

42 DCM to Column 35

43 Deblok. to Column 3

44 Monitor Trityl


46 Monitor Noise


48 Stop Monitor


50 Reverse Flush 8

51 If not Monitoring


53 Trityl Flush 5


55 Wait 5

56 Trityl Flush 5


58 Wait 5

Anhang

303

59 Trityl Flush 5


61 Wait 5

62 Trityl Flush 5


64 Trityl Flush 8

65 End Monitoring

66 MeCN to Column 8

67 Reverse Flush 7

68 Block Flush 4

69 End

Anhang

304

Synthese-Protokoll für modifizierte Phosphoramidite

Schritt Funktion Zeit [s]

1 Begin

2 MeCN to waste 3

3 MeCN to Column 10

4 Reverse Flush 10

5 Block Flush 4

6 Phos Prep 3

7 Column 1 On

8 Block Vent 2

9 DCI to Waste 2

10 DCI to Column 3



13 Wait 500

14 DCI to Column 3



17 Wait 500

18 MeCN to Column 5

19 Push to Column

20 Block Vent 2

21 DCI to Waste 2

22 DCI to Column 3



25 Wait 500

26 DCI to Column 3



29 Wait 500

Anhang

305

30 MeCN to Column 5

31 Push to Column

32 Block Vent 2

33 DCI to Waste 2

34 DCI to Column 3



37 Wait 500

38 DCI to Column 2



41 Wait 500

42 MeCN to Column 5

43 Push to Column

44 Block Vent 2

45 Wait 30

46 Cap Prep 3

47 MeCN to Waste 4

48 Reverse Flush 7

49 Block Flush 3

50 Cap to Column 10

51 Wait 5

52 MeCN to Waste 4

53 Reverse Flush 7

54 Block Flush 3

55 Ox. to Column 8

56 MecN to Waste 4

57 Block Flush 3

58 Wait 15


60 Flush to Waste 6


Anhang

306

62 Reverse Flush 7

63 Block Flush 3

64 Start Detrityl

65 MeCN to Waste 4


67 Reverse Flush 7

68 Block Flush 3

69 If Monitoring

70 DCM to Column 35


72 Monitor Trityl


74 Monitor Noise


76 Stop Monitor


78 Reverse Flush 8

79 If not Monitoring


81 Trityl Flush 5


83 Wait 5

84 Trityl Flush 5


86 Wait 5

87 Trityl Flush 5


89 Wait 5

90 Trityl Flush 5


92 Trityl Flush 8

93 End Monitoring

Anhang

307

94 MeCN to Column 8

95 Reverse Flush 7

96 Block Flush 4

97 End

Anhang

308

Natrix Kristallisations-Screen

Anhang

309

MPD Kristallisations-Screen

Anhang

310

Verbindungsliste

NH

N

N

O

NH2N

O

OH

HO

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

Br

N

N

N

OBn

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

HNAryl

Aryl: phenyl 66 4-methoxyphenyl 67 4-methylphenyl 68 4-cyanophenyl 69 3,5-dimethylphenyl 70 4-biphenyl 71 2-fluorenyl 72

52 63

NH

N

N

O

NN

O

OH

HO

HNAryl


N(Me)2

NH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

HNAryl


N(Me)2

PO N(iPr)2

NC

N

N

N

OCPE

BrN

O

OTBDMS

TBDMSO

132

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OTBDMS

TBDMSO

HN

Aryl

Aryl: phenyl 136 4-biphenyl 137 4-methylphenyl 138 3,5-dimethylphenyl 139

N

N

N

OCPE

NH

N

O

OH

HO

HN

Aryl

Aryl: phenyl 140 4-biphenyl 141

N

N

N

OCPE

NN

O

OH

HON

Aryl


Anhang

311

N

N

N

OCPE

NH

N

O

O

DMTrO

HN

Aryl


N

N

N

OCPE

NN

O

O

DMTrON

Aryl


P PO

NCN(iPr)2 O N(iPr)2

NC

N

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

174

NNH

N

N

O

NN

O

O

DMTrO

AcNN(Me)2

PO N(iPr)2

NC

NH

N

N

O

NH2N

O

OTBDMS

TBDMSO

AcN

175 179

NN

5'-d(CTCG*GCGCCATC)

5'-d(GTAG*AATTCTAC) 5'-d(AAATG*AACCTATCCTCCTTCAGGACCAACG)

5'-d(CTCGGCG*CCATC) 5'-d(G*TAGAATTCTAC)

G*: C8-Anil 184 C8-4-ABP 185

G*: C8-Anil 186 C8-4-ABP 187 C8-Anis 188

G*: C8-Anil 196 C8-4-ABP 197

G*: C8-Anil 189 C8-Anis 190 C8Tol 191 C8-4-Cyano 192 C8-3,5-DMA 193 C8-4-ABP 194 C8-2-AF 195 N2-Hydr. Anil 198 N2-Hydr. 4-ABP 199 N2-Azo Anil 200 N2-Azo 4-ABP 201

G*: C8-Anil 203 C8-Anis 204 C8Tol 205 C8-3,5-DMA 206 C8-4-ABP 207 C8-2-AF 208 N2-Hydr. Anil 209 N2-Hydr. 4-ABP 210 N2-Azo Anil 211 N2-Azo 4-ABP 212

Persönliches

12. Persönliches Veröffentlichungen

- Vukadinović, D; Böge, N.P.H.; Balzarini, J.; Meier, C. Nucl., Nucl., Nucleic

Acids, 2005, 24, 939-942.

- Böge, N.; Gräsl, S.; Meier, C. J. Org. Chem. 2006, 71, 9728-9738.

- Böge, N.; Szombati, Z.; Meier, C. Nucl., Nucl., Nucleic Acids 2007, 26, 705-

708.

- Böge, N.; Krüger, S.; Schröder, M.; Meier, C. Synthesis 2007, 24, 3907-3914.

- Böge, N.; Krüger, S.; Meier, C. Coll. Czech. Chem. Commun. 2008, submitted.

- Böge, N.; Schröder, M.; Meier, C. Synlett 2008, submitted.

- Böge, N.; Jacobsen, M.; Di Pasquale, F.; Marx, A; Meier, C. Angew. Chem.

2008, submitted.

Posterbeiträge 12.5.2005 Criegee-Festveranstaltung an der Universität Karlsruhe

3.9.-6.9.2006 17th International Roundtable on Nucleosides,

Nucleotides and Nucleic Acids in Bern

312

Persönliches

Persönliche Daten

Nicolas Böge

am 21.4.1981 geboren

in Hamburg

Schul- und Hochschulausbildung 1987-1991 Besuch der Grundschule Turmweg in Hamburg

1991-2000 Besuch des Gymnasium Eppendorf mit Abschluss Abitur

Oktober 2000 Beginn des Chemie-Studiums an der Universität Hamburg

16.9.2004 Mündliche Diplomhauptprüfungen an der Universität

Hamburg

1.10.2004-24.3.2005 Anfertigung der Diplomarbeit („Arylamin-modifizierte

Oligonucleotide“) im Arbeitskreis von Prof. Dr. C. Meier im

Institut für Organische Chemie an der Universität

Hamburg

24.3.2005 Verleihung des akademischen Grad des Diplom-Chemiker

1.4.2005 Beginn der Promotion im Arbeitskreis von Prof. Dr. C.

Meier im Institut für Organische Chemie an der Universität

Hamburg

Universitäre Arbeiten 2004-2006 Betreuung des „Integrierten Synthesepraktikum“

2004-2006 Betreuung des „Fortgeschrittenenpraktikum in

Organischer Chemie“

2006-2007 Betreuung des „Grundpraktikum in Allgemeiner Chemie“

Stipendien und Einladungen - Einladung zur Criegee-Festveranstaltung 2005 in Karlsruhe durch Prof.

Richert

- Reisekostenstipendium durch die „Gesellschaft deutscher Chemiker“

(Fachgruppe Biochemie) zur Teilnahme am 17. International Roundtable on

Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids in Bern 2006

313

Persönliches

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig

angefertigt habe und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und

Hilfsmittel verwandt habe.

Ich erkläre außerdem, dass diese Dissertation werde in gleicher noch in anderer

Form bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.

Ich habe früher außer mit den im Zulassungsversuch urkundlich vorgelegten Graden

keine weiteren akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.

Hamburg, den 17.1.2008

314

Synthese von Arylamin-modifizierten 2’-dG...

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