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MutaPLATE Aldolase B (TM)

PCR-Test für die Untersuchung des A149P-Polymorphismus derhereditären Fruktoseintoleranz in offenen real time PCR - Systemen

(z. B. RotorGene, SmartCycler, Light Cycler, ABI, Stratagene,Amplifa) mittels Taq-Man - Technologie (TM).

Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany www.immundiagnostik.com Tel.: +49 (0)6251/ [email protected] Fax: +49 (0)6251/ 849430

Nur für in-vitro Diagnostik

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®

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(TAQ-Man) real time PCR Kit

Version 1.1 / Januar 2019

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© 2019 Immundiagnostik AG / Version 1.1

Inhaltsverzeichnis

1 Verwendungszweck 3

2 Einleitung 3

3 Testprinzip 3

4 Kitbestandteile 4

5 Erforderliche Materialien 4

6 Lagerung und Haltbarkeit 5

7 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 5

8 Testdurchführung 5

9 Auswertung 7

10 Troubleshooting 8

Verwendungszweck 3


1 Verwendungszweck

MutaPLATE® Aldolase B (TM) ist ein molekularbiologischer Test zur Untersuchung desA149P (G/C) – Polymorphismus in der hereditären Fruktoseintoleranz mittels Taq-Man -Technologie. Das Kit kann in „offenen“ real time PCR – Systemen mit entsprechendenWellenlängen-Messkanälen, wie z. B. RotorGene (Corbett Research), MX3005P(Stratagene), ECO (Amplifa), LightCycler (Roche), ABI 7300 (Applied Bioscience) oderSmart Cycler (Cepheid) verwendet werden.

2 Einleitung

Die hereditäre Fructoseintoleranz ist ein sehr seltener Enzymdefekt, der denFructoseabbau in der Leber betrifft. Die Aldolase B, die normalerweise das Fructose-1-Phosphat in Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehyd spaltet, fehlt. Stattdessen istnur die Aldolase A vorhanden, ein Enzym der Glykolyse, dessen Substrat Fuctose-1,6-Bisphosphat ist und das Fructose-1-Phosphat nur mit fünfzigfach geringererGeschwindigkeit spaltet. Das erste Enzym des Fructoseabbaus, die Fructokinase, istnicht betroffen, so dass die Fructose in die Leberzelle gelangt, phosphoryliert wird und dieZelle nicht mehr verlassen kann. Aufgrund des Enzymdefekts kann das Fructose-1-Phosphat aber nicht gespalten werden, sondern häuft sich an und hemmt Enzyme derGlykolyse, der Gluconeogenese und des Glykogenstoffwechsels. Die schon erwähnteAldolase A ist betroffen, ebenso die Fructose-1,6-Bisphosphatase der Gluconeogeneseund die Glycogenphosphorylase. Hypoglycämien können dadurch die Folge sein, da imHungerzustand das Glycogen dann nicht mehr oder nur noch vermindert abgebaut wirdund auch keine Glucose aus Aminosäuren oder Glycerin gebildet werden kann.

[1] J C Sánchez-Gutiérrez, T Benlloch, M A Leal, B Samper, I García-Ripoll, J E Felíu, Molecular analysis of the aldolase B

gene in patients w ith hereditary fructose intolerance from Spain, J Med Genet 2002;39:e56

3 Testprinzip

MutaPLATE® Aldolase B (TM) real time PCR-Kit enthält spezifische Primer + weitereReagenzien für die Detektion des A149P (früher A149P) (G/C)-Polymorphismus in derhereditären Fruktoseintoleranz, wobei genomische DNA als Matrize dient. Dabei wirddieser variable Bereich durch die spezifischen Primer derart flankiert, dass mittels Taq-Man basierter real time PCR ein 300 bp großes Amplifikat entsteht. Die Standard PCR enthält zusätzlich zwei sequenzspezifische Oligonukleotide, welchejeweils mit Fluoreszenz-Farbstoffen markiert sind (TaqMan-Probes). Beide Sondenbinden an die amplifizierte Ziel-DNA, welche den zu untersuchenden SNP (singlenucleotide polymorphism) an Basenposition 448 enthält. Dadurch wird nach Anregung(geräteabhängig bei ca. 470 nm) ein Fluoreszenzsignal emittiert, welches mit deroptischen Einheit des verwendeten real time PCR-Geräts bei 510 – 530 nm bzw. 550-560nm detektiert wird. Die TaqMan-Sonde für das G-Allel (A149) ist mit FAM (510 nm, grün) markiert, dieTaqMan-Sonde für das C-Allel (P149) ist mit YAK (555 nm, gelb) markiert. Dieentsprechenden Detektionskanäle sind im verwendeten real time PCR-Gerät vor PCR-Testdurchführung unbedingt vorher einzustellen! Mit Hilfe dieser beiden spezifischmarkierten Sonden wird die Identifizierung des mit Fruktoseintoleranz einhergehenden G/C bzw. C/C Genotyps eindeutig möglich. Es können folgende Ergebnisse auftreten:

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1. Homzygot G/G: Nur Anstieg des Signals der FAM-TaqMan-Probe (510 nm-Kanal),aber kein Signal im YY-Kanal (bei 555 nm). D.h. nur grüne Fluoreszenz.

2. Heterozygot G/C: Anstieg des Signals der FAM-TaqMan-Probe (510 nm-Kanal) undgleichzeitig Anstieg des Signals der YY-TaqMan-Probe (555 nm-Kanal). D.h. grüne +gelbe Fluoreszenz.

3. Homozygot C/C: kein Signal im FAM-Kanal (bei 510nm), sondern nur Anstieg desSignals der YY-TaqMan-Probe im 555 nm-Kanal. D.h. nur gelbe Fluoreszenz.

4 Kitbestandteile

Jeder Testkit enthält Reagenzien zur Durchführung von 32 bzw. 96 Bestimmungen, sowieeine Gebrauchsanleitung.

Farbe Bezeichnung Menge (32x) Menge (96x)

Blau Enzymmix 435 µl 3 x 435 µl

GelbDetektionsmix

(A = Alanin/G) 175 µl 3 x 175 µl

WeißDetektionsmix

(P = Prolin/C) 175 µl 3 x 175 µl

Rot Positiv-Kontrolle 15 µl 3 x 15 µl

Grün Negativ-Kontrolle 50 µl 3 x 50 µl

5 Erforderliche Materialien

Benötigte Materialien - mitgeliefert: Reagenzien für die real time PCR

Gebrauchsanweisung

Benötigte Materialien - nicht mitgeliefert: real time PCR - Instrument

PCR - Reaktionsgefäße

Kryoblock für PCR-Reaktionsgefäße

DNA - Extraktionskit zur Isolierung genomischer DNA (ca. 10 ng/ µl), z.B. MutaCLEAN® Universal RNA/DNA, KG1037, Immundiagnostik

Pipetten (0,5 – 200 µl) mit sterilen Filterspitzen fur Mikropipetten

sterile Reaktionsgefäße

Laborhandschuhe (puderfrei)

Erforderliche Materialien 5


6 Lagerung und Haltbarkeit

Alle Reagenzien sollten bis zum unmittelbaren Gebrauch bei <-20 °C gelagertund dann schonend (bei 2-8 °C im Kühlschrank) aufgetaut werden.

Ein mehrfaches Auftauen/ Einfrieren der Reagenzien ist unbedingt zuvermeiden (bei Bedarf nach dem erstmaligem Auftauen geeignete Aliquotsherstellen und die Reagenzien dann sofort wieder einfrieren).

Während der PCR-Vorbereitung alle Arbeitsschritte zügig in einem Kryobehälter

(z.B. Light Cycler® Cooling Block) durchführen bzw. alle Reagenzien stetsgeeignet kühlen.

Detektionsmix stets vor Lichtkontakt schützen.

Alle Reagenzien können bis zum Ablauf des (auf der Kit-Packung angegebenen)Mindesthaltbarkeitsdatum verwendet werden.

7 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen

Nur zur in vitro Diagnostik verwenden.

Dieser Test muss durch speziell in Molekularbiologie-Techniken geschultesPersonal durchgeführt werden: Die Regeln der Good Laboratory Practice (GLP)müssen eingehalten werden.beim Umgang mit humanem Proben ist darauf zu achten, dass es sich umpotentiell infektiöses Material handelt. Die Komponenten vor Gebrauch vorsichtig durch Pipettieren (ca. 15x) mischen -nicht vortexen!Testkit nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden.

Die Arbeiten zügig und gekühlt durchführen: auch alle Stocklösungen während desArbeitens kühlen.Die Kitkomponenten immer in aufrechter Position einfrieren.

8 Testdurchführung

Vor Beginn der Arbeiten sollte sichergestellt sein, dass die Arbeitsflächen undeingesetzten Geräte dekontaminiert sind. Die Kit-Bestandteile auftauen undDetektionsmixe (gelb und weiß) im Dunkeln aufbewahren. Die benötigte Anzahl PCR-Gefäße im Cooling Block vorstecken (die zusätzlichen Gefäße für die Kontrollen (rot,grün) berücksichtigen). Die DNA-Proben bereitstellen und gut mischen.

Enzym Mix (gebrauchsfertig) Dieser gebrauchsfertige Enzym Mix ist ca. 3 Monate bei –20°C haltbar; nach demEinfrieren kann der noch maximal 2 x bei 8°C aufgetaut werden, sofern er während desjeweiligen Arbeitens nicht länger als 1 h gekühlt gelagert wird.

Master Mix - Herstellung

Die unten stehende Tabelle zeigt die Zusammensetzung für 1 Reaktionsansatz (25 µl).

Zur Untersuchung mehrerer Proben werden die jeweiligen Volumina mit derProbenanzahl (incl. Kontrollen) multipliziert (zusätzlich zur Anzahl aller Ansätze solltezum Ausgleich der Pipettier-ungenauigkeit ein 10%- Überschuss mit einberechnetwerden) und in ein steriles Gefäß gegeben (Master Mix).

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Die Lösungen sollten in der gleicher Reihenfolge, wie in der unten stehenden Tabelle,pipettiert werden.

Bestandteil V olumen pro 25 µl- Reaktionsansatz

Detektionsmix A (gelb) 5 µl

Detektionsmix P (weiß) 5 µl

Wasser (grün) 0,5 µl

Enzym Mix (blau) 12,5 µl

Den fertigen Master Mix durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mischen (ca. 15 –20x bis keine Schlieren mehr zu sehen sind) und in jede Kapillare 23 µl davon vorlegen.

Proben - Zugabe

Ab der 3. Kapillare je 2 µl Proben-DNA einfüllen. Die ersten beiden Kapillare solltenimmer für die Kontrollen (1. Negativ-Kontrolle, 2 µl und 2. Positiv-Kontrolle, 2 µl)vorgesehen sein.

Die befüllten Gefäße verschließen, kurz zentrifugieren und in das real time PCR - Geräteinsetzen.

Protokoll (MutaPLATE® Aldolase B TM) Alle PCR-Gefäße möglichst unverzüglich in das real time PCR - Gerät einsetzen und diePCR mit dem nachfolgend angegebenen PCR-Protokoll durchführen (entsprechend dasnotwendige PCR-Cycling-Programm bereits vorab im verwendeten real time PCR-Instrument hinterlegen).

Experimental Protocol

Program: Denaturation 1

Segment

Number

Temperature Target (°C) Hold Time

(sec)

Acquisition

Mode

1 94 120 None

Program: Amplifikation 45

Segment

Number


(sec)

Acquisition

Mode

1 94 10 None

2 62 60 Single

Program: Cooling 1

Segment

Number


(sec)

Acquisition

Mode

1 40 30 None

Testdurchführung 7


9 Auswertung

Die Ergebnisse der Analyse des A149P Polymorphismus werden bei ca. 510 - 530 nm imFAM-/ Grün-Kanal, sowie bei ca. 550 - 560 nm im YAK-/ Gelb-Kanal angezeigt (diekorrespondierenden Kanäle sind im verwendeten real time PCR Instrument entsprechendvorzuwählen): Die Positivkontrolle enthält ein heterozygotes DNA-Template für die A149P Mutation,d. h. sie beinhaltet ein G-Allel und auch ein C-Allel. Die folgenden Abbildungen zeigen typische Beispiele für homozygote bzw.

heterozygote Proben bezüglich des A149P Polymorphismus im LC2.0 real time PCR-Instrument (Roche).

G-Allele at 530 nm

C-Allele at 560 nm

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10 Troubleshooting

Kein Fluoreszenz-Peak bei der Positivkontrolle oder den Proben bei ca. 530 bzw. ca. 555nm:

Überprüfen Sie die Programmierung des real time PCR-Geräts. => Wiederholen Sie die Analyse mit korrigiertem Protokoll.

Der MutaPLATE® Aldolase B (TM) wurde mehr als 2x aufgetaut und wiedereingefroren oder war länger als 4 Tage Temperaturen von 2-8 °C ausgesetzt.

=> Beachten Sie die Lagerbedingungen. Wiederholen Sie die Analyse mit einem neuenMutaPLATE® Aldolase B (TM) - Kit.

Geringe Qualität der untersuchten DNA. =>Halten Sie sich exakt an die Herstellervorschrift zur DNA- Extraktion.

Schwacher Fluoreszenz-Peak bei ca. 530 bzw. ca. 555 nm:

Komponenten vor Gebrauch vorsichtig (nur durch Pipettieren) mischen: nicht vortexen!

Alle Stocklösungen während des Arbeitens kühlen, den Detektionsmix vor Lichtschützen.

Arbeiten Sie nur gekühlt, z.B. mit auf +4 – 8 °C vorgekühltem Cooling Block oder „aufEis“.

MutaPLATE Aldolase B (TM)

PCR test for analysis of the A149P polymorphism of the hereditaryfructose intolerance in open real time PCR systems by Taq-Man

technology.

Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany www.immundiagnostik.com Tel.: +49 (0)6251/ [email protected] Fax: +49 (0)6251/ 849430

Nur für in-vitro Diagnostik

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(TAQ-Man) real time PCR Kit

Version 1.1 / Januar 2019

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Inhaltsverzeichnis

1 Intended Use 3

2 Introduction 3

3 Principle of the test 3

4 Kit content 4

5 Required materials 4

6 Storage and handling 4

7 Warnings and precautions 5

8 Test procedure 5

9 Evaluation 6

10 Troubleshooting 7

Intended Use 3


1 Intended Use

MutaPLATE ® Aldolase B (TAQ-Man) real time PCR kit is a molecular biological test foranalysis of the A149P polymorphism of the aldolase B Aldolase B bisphosphate ALDOBgene in open real time PCR systems (e. g. RotorGene, SmartCycler, Light Cycler, ABI,Stratagene, Amplifa).

2 Introduction

Aldolase B fructose bisphosphate catalyzes the reversible reaction of fructose-1-phosphate to glyceraldehyde and dihydroxyacetone-phosphate. Further conversion ofthese 3-carbon products allows the byproducts of fructose metabolism to enter into theglycolysis pathway. Homozygous loss of function of aldolase B leads to an inability of thebody to break down fructose into byproducts for human consumption. Due to thecontinuation of the first step in fructose breakdown, the conversion of fructose to fructose-1-phosphate, a phosphate sink is created in these patients, in which all the availablephosphate is consumed in the cell. This leads to the halt of gluconeogenesis andglycogenolysis. Symptoms usually begin at the time of weaning and include: bloating,abdominal pain, diarrhea, hypoglycemia, hyperuricemia, mental depression, jaundice, andcirrhosis that can lead to liver failure and death. Many patients display a food aversion tofructose-rich foods and practice strict avoidance of fructose-containing foods before theirdiagnosis. The current gold standard for testing of fructose intolerance is the hydrogenbreath test, in which the patient is administered fructose in the clinical setting, andhydrogen levels are measured before and at intervals after administration of the bolus offructose. An increase in hydrogen produced reflects the failure of the patient to absorbfructose, which is then metabolized by bacteria in the gastrointestinal system to give offhydrogen. The disadvantage of this test is that many patients respond to the fructoseadministration with signs of severe hypoglycemia including altered consciousness,diaphoresis, and seizures, sometimes resulting in death. Therefore, elucidation of thecauses of HFI and available genetic testing can avert the extreme clinical risks associatedwith standard of care diagnosis. There is currently no cure for HFI, with the only treatmentstrict diet modifications to avoid fructose-containing foods.

3 Principle of the test

The assay contains two sequence specific primers flanking the region of interest and twoTaqMan probes specific to the region containing the mutation. The two TaqMan probesare labeled at the 5' end with different fluorophores (reporter dyes) which are used for theallelic discrimination. On the 3' end the TaqMan probes are labeled with a non-fluorescentquencher. The proximity of the reporter dye to the quencher inhibits the fluorescence ofthe reporter molecule. During amplification the probes hybridize specifically to the DNAfragments. The 5' nuclease activity of the Taq polymerase cleaves the hybridized probesreleasing the reporter from the quencher generating a fluorescent signal. The TaqManprobe for the G-allele (wildtype) is marked with FAM (510 nm, green) and the TaqManprobe for the C-allele (mutation) is marked with YAK (555 nm, yellow).

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The following three discriminations are possible:

1. Homozygous G/G:Increase of the fluorescent signal from the FAM labeled TaqMan probe, noincrease of the fluorescent signal from the YAK labeled TaqMan probe.

2. Heterozygous G/C: Increase of the fluorescent signal from the FAM labeled TaqMan probe andincrease of the fluorescent signal from the YAK labeled TaqMan probe.

3. Homozygous C/C: No increase of the fluorescent signal from the FAM labeled TaqMan probe,increase of the fluorescent signal from the YAK labeled TaqMan probe.

4 Kit content

Each kit contains enough reagents to perform 32 respectively 96 tests. Each kit alsocontains a package insert.

Reference Type of reagentVolume (32x) Volume

(96x)

Blue Enzymemix 435 µl 3 x 435 µl

YellowDetectionmix A -

Allele 175 µl 3 x 175 µl

WhiteDetectionmix P -

Allele 175 µl 3 x 175 µl

Red Positive-Control 15 µl 3 x 15 µl

Green Negative-Control 50 µl 3 x 50 µl

5 Required materials

R equired M aterials - not prov ided:

Open Real-Time PCR system200 µL PCR tubes (sterile)Cryo container for PCR reaction tubesPipettes (0,5 – 200 µL)o 0.5 - 10 µLo 10 - 200 µL1.5 mL reaction tubes

6 Storage and handling

All reagents should be stored at -20 °CAvoid several freeze / thaw cycles of the reagents (if necessary prepare aliquots)The detection mixes have to be protected from exposure to light

Storage and handling 5


7 Warnings and precautions

The regulations and principles for working in a biomolecular laboratory have to bestrictly followed.

All steps have to be performed in an uninterrupted mannerAll PCR reagents have to be cooled while in useThe DNA purity (A260/A280 ratio) should be between 1.8 and 2.0

8 Test procedure

Gently thaw all components on ice and gently mix them before use (do not vortex) andshortly spun down. Keep in mind to protect the detection mixes against exposure to light.During the PCR setup all reagents have to be cooled. For the amplification one PCR tubeis needed per sample plus additional tubes for the negative and positive controls. Thefollowing table shows the volume of each reagent per sample. The mastermix have to beprepared for the number of samples (incl. negative and positive control) (N) plus 10 % tocompensate inaccuracies.

Master mix preparation

Following table shows the composition for one reaction (final volume: 25 µl). For analysisof several samples in parallel, a master mix should be prepared in a sterile vialmultiplying each single volume by the number N of samples (incl. controls). Additionally,10% more volume should be calculated for reasons of inaccuracy. The reagents shouldbe pipetted in same order as indicated in the table:

Reagent Volume Master MixVolume

Detection A-Allele (yellow) 5 µl 5 µl x (N + 10%)

Detection P-Allele (white) 5 µl 5 µl x (N + 10%)

Water (green) 0,5 µl 0,5 µl x (N + 10%)

Enzyme Mix ready to use (blue) 12,5 µl 12,5 µl x (N + 10%)

The mastermix has to be carefully mixed through by pipetting up and down orinverting (do not vortex) and shortly spin down. Aliquot 23 µL into each PCR tube.For the negative control add 2 µL of the provided negative control (green).For the positive control add 2 µL of the provided positive control DNA (Red).Add 2 µL of each sample DNA to the corresponding PCR tube.

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Protocol

Activate following PCR-protocol and perform subsequently the real time PCR:

Experimental Protocol

Program: Denaturation 1

Segment

Number


(sec)

Acquisition

Mode

1 94 120 None

Program: Amplifikation 45

Segment

Number


(sec)

Acquisition

Mode

1 94 10 None

2 62 60 Single

Program: Cooling 1

Segment

Number


(sec)

Acquisition

Mode

1 40 30 None

9 Evaluation

Results of the analysis for the A149P polymorphism are shown for at 510 - 530 nm /green and 550 - 560 nm / yellow (choose corresponding channel of your real time PCR

instrument). The positive control (red) contains template heterozygous for the A149Ppolymorphism (one allel carries the G, another allel carries the C).

Following figures shows typical examples for homozygous wildtypes as well as aheterozygous sample on the LightCycler 2.0. Use a appropriate color compensation file,if necessary e.g. LightCycler.

G-Allele at 530 nm

Evaluation 7


C-Allele at 560 nm

10 Troubleshooting

Problem Solution

No or low fluorescence peakwith positive control orsamples

Check PCR-program of the real time PCR instrument inuse and repeat with corrected protocol.

The Detection Mix was thawn / frozen more than twice orstored longer than four days at 2-8 °C. Repeat analysiswith a fresh aliquot or new Detection Mix.

Quality of DNA template is not sufficient. Use freshlyextracted DNA and measure the concentration/puritybefore use.

The Detection Mixes were not protected from light. Repeatanalysis with a fresh aliquot or new PCR reagents.

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