Theoretische Untersuchungen zur Elektrostatik bakterieller ... · PDF fileTheoretische...

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  • Max-Planck-Institut für Biochemie

    Abteilung Molekulare Strukturbiologie

    Theoretische Untersuchungen zur Elektrostatik

    bakterieller Porine und zur

    Anionentranslokation im Porin Omp32

    Ulrich Zachariae

    Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der

    Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines

    Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat)

    genehmigten Dissertation.

    Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. N. Rösch

    Prüfer der Dissertation: 1. Hon.-Prof. Dr. W. Baumeister

    2. Univ.-Prof. Dr. H. Kessler

    3. Univ.-Prof. Dr. S. Weinkauf

    Die Dissertation wurde am 12. 2. 2004 bei der Technischen Universität München

    eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am 12. 7. 2004 angenommen.

  • Certainly no subject or field is making more progress on so many fronts at

    the present moment than biology, and if we were to name the most powerful

    assumption of all, which leads one on and on in an attempt to understand life,

    it is that all things are made of atoms, and that everything that living things do can be

    understood in terms of the jigglings and wigglings of atoms.

    Richard P. Feynman, The Feynman Lectures On Physics, 1965.

    In memoriam Erwin Tschierschke

  • Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis

    1 Zusammenfassung 1

    2 Einleitung 3

    2.1 Die äußere Membran gramnegativer Bakterien . . . . . . . . . . . . . 3

    2.2 Proteine der äußeren Membran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

    2.3 Bakterielle Porine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

    2.4 Das Porin Omp32 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

    2.5 Zielsetzung und Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

    3 Theoretische Grundlagen 16

    3.1 Poisson-Boltzmann-Elektrostatikrechnungen . . . . . . . . . . . . . . 16

    3.1.1 Die Kontinuum-Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

    3.1.2 Lösung der Poisson-Boltzmann-Gleichung über finite Diffe-

    renzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

    3.1.3 Berechnung von Titrationskurven in Proteinen . . . . . . . . . 21

    3.2 Dreidimensionale Poisson-Nernst-Planck-Theorie der Elektrodiffu-

    sion (3D-PNP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

    3.3 Moleküldynamik-Simulationen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

    3.3.1 Lösung der Bewegungsgleichungen . . . . . . . . . . . . . . . 28

    3.3.2 Das Kraftfeld . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

    3.3.3 Berechnung der Freien Energie über Umbrella Sampling sowie

    Kraftspektroskopie-Simulationen . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

    4 Einzelheiten der Simulationen 37

    4.1 Elektrostatik-Rechnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

    4.2 PNP-Modellrechnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

    4.3 Moleküldynamik-Rechnungen zum Ionentransfer durch Omp32 . . . 40

    4.4 Umbrella-Sampling- und Kraftspektroskopie-Simulationen . . . . . . . 42

    4.5 Simulationen von Omp32 mit expliziter Membran . . . . . . . . . . . 43

    4.5.1 Aufbau des Simulationssystems . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

    4.5.2 Simulationsbedingungen der Produktionsphase . . . . . . . . 45

    I

  • Inhaltsverzeichnis

    5 Ergebnisse 48

    5.1 Studien zu den elektrostatischen Eigenschaften von Porinen . . . . . 48

    5.1.1 Die elektrostatischen Eigenschaften von Omp32 . . . . . . . . 48

    5.1.2 Titrationskurven mit funktioneller Bedeutung in den Porinen

    OmpF und PhoE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

    5.1.3 Der Arginin-Cluster in Porin-Aminosäuresequenzen . . . . . . 64

    5.1.4 Die Titrationseigenschaften weiterer proteobakterieller Porine 64

    5.2 Poisson-Nernst-Planck-Rechnungen an Modellkanälen . . . . . . . . 68

    5.3 Moleküldynamik-Studien zur Anionentranslokation in Omp32 . . . 71

    5.3.1 Simulationen mit einem Anion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

    5.3.2 Simulationen mit zwei Anionen und elektrischen Feldern . . 81

    5.3.3 Potential-of-Mean-Force-Profil der Ionentranslokation . . . . . 83

    5.3.4 Kraftspektroskopie-Simulationen . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

    5.4 Moleküldynamik-Simulationen eines Omp32-Trimers mit expliziter

    Membran und Malat-Ionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

    5.4.1 Simulationssystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

    5.4.2 Struktur und Stabilität von Omp32 in der Simulation . . . . . 91

    5.4.3 Diffusion und Bindung von Malat-Ionen in Omp32 . . . . . . 93

    6 Diskussion 101

    6.1 Elektrostatische Eigenschaften von Porinen . . . . . . . . . . . . . . . 101

    6.1.1 Der Arginin-Cluster der Konstriktionszone unspezifischer

    Porine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

    6.1.2 Relevanz der Ergebnisse für die Porine OmpF und PhoE . . . 103

    6.1.3 Verwendete Methodik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

    6.1.4 Vergleich mit weiteren Porinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

    6.2 Poisson-Nernst-Planck-Rechnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

    6.2.1 Beitrag zur Verfeinerung der Methodik . . . . . . . . . . . . . 110

    6.2.2 Ergebnisse an Modell-Ionenkanälen . . . . . . . . . . . . . . . 111

    6.3 Der Ionentransfer in Omp32 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

    6.3.1 Vergleich mit Dynamikstudien am Porin OmpF . . . . . . . . 112

    6.3.2 Vergleich mit experimentellen Daten . . . . . . . . . . . . . . . 115

    II

  • Inhaltsverzeichnis

    6.3.3 Vergleich mit Modelltheorien von Ionenkanälen . . . . . . . . 119

    6.3.4 Verwendete Methodik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

    6.4 Moleküldynamik-Simulationen eines Omp32-Trimers . . . . . . . . . 122

    6.4.1 Simulationstechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

    6.4.2 Struktur des Omp32-Trimers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

    6.4.3 Substratbindung an Omp32 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125

    7 Literatur 128

    III

  • 1 Zusammenfassung

    Die äußere Membran gramnegativer Bakterien enthält porenbildende integrale

    Proteine, die Porine, welche die Translokation von Ionen und kleinen hydrophi-

    len Molekülen durch die Membran erlauben. Sie sind entweder spezifisch auf die

    Bindung von Substratmolekülen ausgerichtet oder dienen als unspezifische Porine

    mit einem breiten Spektrum an translokationsfähigen Molekülen bzw. Ionen. Die

    individuellen Eigenschaften unspezifischer Porine, wie z.B. Ionenselektivität und

    -leitfähigkeit, werden im wesentlichen durch den Einfluß der in den Kanälen in

    großer Anzahl vorkommenden ionisierbaren Aminosäureseitenketten bestimmt.

    In der vorliegenden Arbeit wurden die Titrationseigenschaften der ionisierba-

    ren Gruppen aller unspezifischen Porine berechnet. Dabei wurde ein in allen Struk-

    turen konserviertes, bisher nicht beschriebenes Stabilisierungsmotiv der Ladung

    auf dem besonders bedeutenden basischen Cluster in der engsten Stelle der Poren

    gefunden. Die auf dieser Basis berechneten Titrationskurven decken sich gut mit

    experimentellen Daten und stellen ältere theoretische Arbeiten in Frage. Im Porin

    Omp32 führt diese Stabilität zu einem deutlich positiven elektrostatischen Poten-

    tial im gesamten Kanal, welches eine der wichtigsten Grundlagen für die gemesse-

    ne starke Anionenselektivität dieses Kanals ist.

    In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Poisson-Nernst-Planck-Methode

    zur Berechnung des Ionenflusses in Kanalstrukturen verfeinert, indem Terme für

    die Desolvatationsenergie und die endliche Ausdehnung der Ionen in die Algo-

    rithmen eingebracht wurden. Der neue Algorithmus wurde auf Kanalmodelle an-

    gewendet und zeigte eine deutliche Verbesserung der Methodik.

    Die theoretische Untersuchung der atomaren dynamischen Eigenschaften der

    Anionenleitung in Omp32 führte zur Entdeckung eines neuen, eigenständigen Me-

    chanismus der Ionentranslokation durch ein Kanalprotein. Die Ionen werden dabei

    stufenweise auf einer “Leiter” aus basischen Gruppen durch die Engstelle der Pore

    geführt, wobei starke Wechselwirkungen zwischen den Anionen und den Basen zu

    beobachten sind. Das berechnete zugehörige Profil der Freien Energie der Anionen-

    passage weist Bindungszustände und aktivierte Prozesse des Transfers zwischen

    den entsprechenden Basen auf und erklärt einige der besonderen Eigenschaften

    1

  • 1 Zusammenfassung

    dieses Porins, die in elektrophysiologischen Experimenten beschrieben wurden.

    Schließlich konnten Molekül-Dynamiksimulationen am Gesamtsystem, beste-

    hend aus einem Omp32-Trimer, expliziten Membranmolekülen und Wasser, zei-

    gen, wie effizient das elektrostatische Potential in und um Omp32 Malat als anio-

    nisches Substratmolekül in die Engstelle der Pore leitet und es in der Folge von

    Omp32 gebunden wird. Dabei wurden alle drei Poren innerhalb 1 ns mit Malat-

    Ionen besetzt.

    2

  • 2 Einleitung

    2.1 Die äußer