Thrombopoietinproduktion in Wildtyp- und Interleukin-6 ... · Aus dem Institut für Physiologie der...

Aus dem Institut für Physiologie

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. W. Jelkmann

Thrombopoietinproduktion

in Wildtyp- und Interleukin-6-"knock-out"-Mäusen mit akuter Entzündung

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

- Aus der Medizinischen Fakultät -

vorgelegt von

Helen Burmester

aus Hamburg

Lübeck 2008

2

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Wolfgang Jelkmann

2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Peter Maria Rob

3

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ............................................................................. 3

Abkürzungsverzeichnis .................................................................... 4

1 Einleitung ............................................................................... 6 1.1 Physiologie der Thrombozyten ............................................................................ 6 1.2 Biochemische Eigenschaften von Thrombopoietin .............................................. 8 1.3 Orte der Thrombopoietinproduktion .................................................................. 10 1.4 Regulation der Megakaryopoiese und Thrombozytenproduktion ....................... 11 1.5 Thrombopoietinregulation bei Entzündungen und die Bedeutung von

Zytokinen .......................................................................................................... 14 1.6 Fragestellung .................................................................................................... 15

2 Material und Methoden ........................................................ 16 2.1 Versuchstiere .................................................................................................... 16 2.2 In vitro Inkubation von Vollblut .......................................................................... 17 2.3 IL-6 Bestimmung ............................................................................................... 18 2.4 Thrombopoietinbestimmung im Plasma ............................................................ 19 2.5 RNA-Extraktion ................................................................................................. 19 2.6 Reverse Transkription ....................................................................................... 20 2.7 Polymerase Kettenreaktion ............................................................................... 20 2.8 Thrombopoietin mRNA Quantifizierung mittels kompetitiver PCR ..................... 21 2.9 Thrombopoietin mRNA Bestimmung mit "Real-Time" PCR ............................... 23 2.10 Statistik ............................................................................................................. 24 2.11 Puffer und Lösungen ......................................................................................... 25 2.12 Chemikalien und Reagenzien ........................................................................... 27

3 Ergebnisse ........................................................................... 28 3.1 IL-6 Produktion in ex-vivo Vollblutkulturen ........................................................ 28 3.2 In-vivo IL-6 Produktion nach der Applikation von LPS oder Terpentin ............... 29 3.3 Plasma IL-6 Konzentration in Terpentin behandelten Wildtyp- und IL-6-

"knockout"-Mäusen ........................................................................................... 30 3.4 Plasma Thrombopoietin Konzentration in Terpentin behandelten Wildtyp- und IL-

6-"knockout"-Mäusen ........................................................................................ 31 3.5 Thrombopoietin mRNA Quantifizierung mittels kompetitiver PCR ..................... 32 3.6 Thrombopoietin mRNA Quantifizierung mittels "Real-Time" PCR ..................... 36 3.7 Einfluss der Terpentinapplikation auf das Blutbild der Tiere .............................. 37

4 Diskussion ........................................................................... 41

5 Zusammenfassung .............................................................. 45

Referenzen ....................................................................................... 46

Veröffentlichung .............................................................................. 54

Danksagung ..................................................................................... 55

Lebenslauf ....................................................................................... 56

4

Abkürzungsverzeichnis

% (v/v) Volumenanteil

% (w/w) Gewichtsanteil

Abb. Abbildung

bp Basenpaare

ca. circa

cDNA komplementäre DNA

CP Crossing Point

CSF Kolonien-stimulierender Faktor

c-mpl Gen für MPL

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EPO Erythropoietin

fg Femtogramm

g Gramm

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GTC Guanidiniumthiocyanat

h Stunden

HCl Salzsäure

IFN Interferon

i.m. intramuskulär

IL Interleukin

i.p. intraperitoneal

JAK Janus-Kinase

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

LPS Lipopolysaccharid

min Minuten

ml Milliliter

MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure

MPL TPO-Rezeptor

5

mRNA Boten-RNA

NaCl Kochsalz

nM nanomolar

nl Nanoliter

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCR Polymerasekettenreaktion

pg Pikogramm

rh IL-6 rekombinantes Interleukin 6

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

RT reverse Transkription

s.c. subkutan

SCF Stammzellfaktor

SD Standardabweichung

sek Sekunden

sog. sogenannte

TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer

Tg transgen

TNF Tumornekrosefaktor

TPO Thrombopoietin

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

U Enzym-Aktivitätseinheit

Wt wildtyp

µl Mikroliter

z.B. zum Beispiel

Einleitung

6

1 Einleitung

1.1 Physiologie der Thrombozyten

Thrombozyten spielen bei der primären Hämostase eine wichtige Rolle. Nach einer

Gefäßverletzung heften sie sich an Bindegewebsfasern des Subendothels,

verformen sich und bilden stachelartige Fortsätze. Sie setzen gefäßverengende und

aggregationsfördernde Stoffe frei. Es bildet sich der sog. weiße

Abscheidungsthrombus, der die Blutung zum Stillstand bringt. Bei

Thrombozytopenien oder –pathien ist die primäre Hämostase gestört, und es kommt

zu verstärkten Blutungen nach Schnittverletzungen, zu oberflächlichen Hämatomen

und petechialen Blutungen (6). Normalerweise ist die Thrombozytenkonzentration im

Blut relativ konstant. Sie zeigt allerdings beim Menschen interindividuelle

Schwankungen zwischen 150 und 400 pro nl (78). Ein Thrombozytenverlust, z.B.

während operativer Eingriffe, führt innerhalb von 1-2 Wochen zu einer reaktiven

sekundären Thrombozytose. Aus dieser Beobachtung wurde schon frühzeitig

gefolgert, dass die Thrombozytenbildung humoral geregelt sei (59).

Thrombozyten stammen ebenso wie die Erythrozyten, Monozyten und Granulozyten

von pluripotenten Stammzellen des Knochenmarks ab (CFU-GEMM, s. Abb.1-1). Die

Differenzierungsreihe von der pluripotenten Stammzelle bis zu den Megakaryozyten

umfasst ca. 10 Teilungsschritte. Die Megakaryopoiese wird durch verschiedene

Zytokine gefördert wie z.B. den Stammzellfaktor, den Granulozyten/Monozyten-

Kolonien stimulierenden Faktor (GM-CSF), Erythropoietin und die Interleukine (IL) 1,

3, 4, 6, 7 und 11 (3; 10). Seit 1994 ist gesichert, dass die Megakaryopoiese

außerdem durch ein spezifisches Hormon gefördert wird, das allgemein

Thrombopoietin genannt wird (5; 70; 55; 74; 83). Der Entdeckung des Hormons ging

die Charakterisierung seines Rezeptors voraus. Dieser wurde ursprünglich MPL

genannt. Sein Gen c-mpl ist das zelluläre Homolog des Onkogens v-mpl, eines

murinen Retrovirus, welches eine myeloproliferative Leukämie verursacht

("Myeloproliferative leukemia oncogene-encoded receptor" (80; 60; 75)).

Thrombopoietin hemmt die Apoptose megakaryozytärer Vorläufer und fördert deren

Einleitung

7

Proliferation und Differenzierung (9; 66). Außerdem beschleunigt es die

Megakaryozytensequestrierung und steigert die Aggregationsfähigkeit zirkulierender

Thrombozyten (48). Thrombopoietin wirkt dabei nicht direkt auf die

Plättchenaggregation, sondern fördert die Aktivierung verschiedener

Gerinnungsfaktoren. Es erhöht die Thrombozyten-Fibrinogen Bindung und deren

Adhäsion an Kollagen, fördert die Freisetzung von Adenosin-Diphosphat und

sensibilisiert die Thrombozyten gegenüber der Wirkung von Thrombin (14).

TPOSCFIL-3

IL-6IL-11TPO

Megakaryozyt

ThrombozytenCFU-Mega

CFU-Bas

CFU-Eo

CFU-GM

BFU-E

CFU-GEMM

IL-3, IL-4, CSF

GM-CSF, IL-3, IL-5

GM-CSF, G-CSF

GM-CSF, M-CSF

EPO

Basophiler Granulozyt

Eosinophiler Granulozyt

Neutrophiler Granulozyt

Monozyt

Erythrozyt

Abb. 1-1: (Verändert nach Wolber und Jelkmann, News Physiol Sci 17: 6-10,

2002) Darstellung eines vereinfachten Schemas der Hämatopoiese. Die

Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen (CFU, colony-forming unit)

von Megakaryozyten (M, Meg), Granulozyten (G), Monozyten (M) und

Erythrozyten (E) wird durch Wachstumsfaktoren (TPO, Thrombopoietin; IL,

Interleukin; SCF, Stammzellfaktor; CSF, Kolonien-stimulierende Faktoren; EPO,

Erythropoietin) gesteuert.

Einleitung

8

1.2 Biochemische Eigenschaften von Thrombopoietin

Das menschliche Thrombopoietin-Gen wurde auf Chromosom 3 q27-28 lokalisiert.

Es umfasst 6 Kilobasenpaare und enthält 5 kodierende Exons (26; 30). Die

molekulare Masse beträgt 70 kDa. Zusätzlich sind weitere Isoformen identifiziert

worden, die durch alternatives „splicing“ entstehen. Die verschiedenen Isoformen

sind in unterschiedlicher Menge über die verschiedenen Gewebe verteilt, ihre

physiologische Rolle ist jedoch noch unklar (89).

Das primäre Translationsprodukt des menschlichen Thrombopoietingens ist aus 353

Aminosäuren zusammengesetzt. Diese schließen ein Starterpeptid aus 21

Aminosäuren ein. Zirkulierendes Thrombopoietin (TPO) besteht aus 332

Aminosäuren. Die biologische Halbwertszeit des Hormons ist mit 20-30 h beim

Menschen länger als die anderer hämopoietischer Wachstumsfaktoren. Das reife

TPO-Molekül besteht aus zwei Domänen: Die ersten 153 Aminosäuren bilden den

NH2-terminalen Abschnitt und sind für die Bindung an den Thrombopoietinrezeptor

notwendig. Die zweite Domäne bildet der COO-terminale Abschnitt, der 177

Aminosäuren umfasst.

Die NH2-terminale Domäne zeigt eine 23%ige Sequenzhomologie zum

menschlichen Erythropoietin (EPO), weitere 27% der Aminosäuren sind dem EPO

auch funktionell ähnlich. Die letzten 40 Aminosäuren der EPO-ähnlichen Domäne

beinhalten vier Cystein-Reste, die wahrscheinlich essentiell für die Vermittlung der

biologischen Aktivität des TPO sind (19).

Der COO-terminale Abschnitt weist 6 N- und ca. 8 O-gekoppelte

Kohlenhydratseitenketten sowie 2 Bisulfidbrücken auf. Er gewährleistet die lange

Lebenszeit des Moleküls dadurch, dass er wahrscheinlich die schnelle Entfernung

von Thrombopoietin aus der Zirkulation verhindert (37). Außerdem spielt diese

Domäne eine Rolle bei der effizienten Sekretion von TPO (53).

Große Hoffnung wurde in die klinische Anwendung von Thrombopoietin bei

verschiedenen, mit Thrombozytopenien einhergehenden, Krankheitsbildern gesetzt

(53). Gegenstand der intensiven klinischen Forschung waren zwei rekombinante

humane Thrombopoietinpräparate:

Ein glykosyliertes, vollständiges rekombinantes humanes Thrombopoietinpräparat

(rHu-TPO) und ein mit Polyethylenglykol verbundenes, verkürztes rekombinantes

Einleitung

9

Thrombopoietin-Analogon (PEG-rHu-MGDF: rekombinanter humaner

„megakaryocyte growth and development factor“) (s. Abb.1-2).

1.Thrombopoietin cDNA

SC CT C T C TTSN NT N STSTSSSTSS NNN

ss

ss

ss

ss

2. rHu-TPO

3. PEG-rHu-MGDF

EPO-gleiche Domäne Kohlenhydratreiche Domäne

PEG

Kohlenhydratseitenketten

Abb. 1-2: (Verändert nach Kaushansky, N Engl J Med 339: 746-754, 1998)

(1) Modell der Thrombopoietin-cDNA bzw. des kodierten Polypeptids mit einer

Sequenzhomologie der NH2-terminalen Domäne zum Erythropoietin. Die

Aminosäuren mit wichtigen Eigenschaften beinhalten Serin (S), Cystein (C),

Threonin (T) und Asparagin (N). (2) Das glykosylierte, vollständige rekombinante

humane Thrombopoietinpräparat (rHu-TPO) und (3) das mit Polyethylenglykol

verbundene, verkürzte rekombinante Thrombopoietin-Analogon (PEG-rHu-MGDF).

Einleitung

10

1.3 Orte der Thrombopoietinproduktion

Untersuchungen zur Lokalisation der Thrombopoietin produzierenden Organe

wurden zunächst an Versuchstieren durchgeführt. Thrombopoietin-mRNA wurde in

Leberextrakten fetaler sowie in Leber- und Nierenextrakten adulter Tiere

nachgewiesen. Andere Gewebe bzw. Zellen, die nach Literaturangaben

Thrombopoietin-mRNA exprimieren können, sind in vivo glatte Muskelzellen, Milz,

Gehirn, Lunge, Darm und Knochenmark sowie in der Zellkultur Endothelzellen,

Fibroblasten und Hepatozyten (Übersichten in (20; 45; 77; 30)). Untersuchungen an

den Organen verstorbener menschlicher Feten und Neugeborener haben gezeigt,

dass über 95% der gesamten Thrombopoietin-mRNA des Menschen in der Leber

exprimiert wird (84). Tierexperimentelle Studien deuten an, dass – anders als bei der

Synthese des verwandten Hormons Erythropoietin – die Leber zeitlebens das

dominierende Organ der Thrombopoietinsynthese bleibt (65). Erythropoietin wird im

fetalen und neonatalen Lebensabschnitt hauptsächlich in der Leber gebildet,

während die mRNA-Expression in der Niere ab der 30. Schwangerschaftswoche

stark zunimmt (17) und im Erwachsenalter Hauptbildungsort für Erythropoietin ist

(43).

In-situ-Hybridisierungsstudien ergaben, dass die Thrombopoietin-mRNA

exprimierenden Zellen der Leber Hepatozyten und die der Niere proximale

Tubuluszellen sind (77). Klinische Untersuchungen stehen im Einklang mit der

Vorstellung, dass die Leber das wichtigste Organ der Thrombopoietinproduktion

beim Menschen ist. Patienten mit Leberzirrhose leiden an einer Thrombozytopenie,

die zumindest partiell auf einer Einschränkung der Thrombopoietingenexpression

beruht (57; 40; 86). Es wurden stark erniedrigte Thrombopoietinkonzentrationen im

Plasma dieser Patienten gefunden (69). Nach erfolgreicher Lebertransplantation

steigt die Thrombopoietinkonzentration im Plasma der Transplantierten an, und die

Plättchenzahl im Blut normalisiert sich. Dagegen ist nie berichtet worden, dass es bei

einer chronischen Niereninsuffizienz zu einer Thrombozytopenie aufgrund eines

Thrombopoietinmangels kommt.

Einleitung

11

1.4 Regulation der Megakaryopoiese und Thrombozytenproduktion

Thrombopoietin ist der wichtigste physiologische Faktor, der die Megakaryopoiese

und die Thrombozytenproduktion reguliert (19; 51). Es induziert die Proliferation der

„colony forming units“ der Megakaryozyten (CFU-Meg) und die Entwicklung der

reifen polyploiden Megakaryozyten, welche zu der Bildung von Thrombozyten führt

(55).

Zusätzlich wirkt Thrombopoietin zusammen mit anderen Zytokinen auf die

Proliferation von Vorläuferzellen der Erythrozyten (47) und auf primitive

hämatopoietische Vorläuferzellen (73).

In der Thrombopoiese spielen nach den bisherigen Studien drei Regelmechanismen

eine Rolle.

Der als erstes beschriebene Mechanismus ist die „feed back“-Regulation (52) (Abb.

1-3). Thrombopoietin wird in einer konstanten Menge hauptsächlich in der Leber,

aber auch in der Niere produziert. Es wird angenommen, dass die

Thrombopoietinkonzentration im Blutplasma vor allem von der Internalisierung des

Hormons durch seine Zielzellen abhängt (23; 76; 21; 63; 71). Der MPL-Rezeptor der

Thrombozyten kann Thrombopoietin binden und prozessieren. Dadurch wird in

normalen menschlichen Thrombozyten die Tyrosin Phosphorylierung verschiedener

Signalproteine aktiviert, wie unter anderem die der Janus Kinase 2 (JAK 2) und von

Shc , Stat3 und Stat5 (61). Somit wird um so mehr Thrombopoietin aus dem

Blutplasma entfernt, desto mehr Plättchen und Megakaryozyten vorhanden sind.

Folglich ist die Thrombopoietinkonzentration im Plasma bei Thrombozytopenie hoch

und bei normaler oder vergrößerter Megakaryozyten- und Thrombozytenmasse

niedrig. Tierexperimentelle und klinische Untersuchungen unterstützen dieses

Konzept. In Mäusen, denen der Thrombopoietinrezeptor MPL fehlt (MPL-“knockout“-

Mäuse), sind durch eine sehr hohe Plasmathrombopoietinkonzentration

gekennzeichnet (23). Nach Transfusion normaler Thrombozyten fällt die

Plasmathrombopoietinkonzentration sehr rasch ab (23). Umgekehrt kommt es bei

Tumorpatienten nach Chemotherapie zu einer Thrombozytopenie, die einen inversen

Anstieg der Thrombopoietinkonzentration im Blut verursacht (33).

Als weiterer Regelmechanismus wurde die Rolle der Thrombozyten als Speicherort

für das Thrombopoietin beschrieben, wobei das Thrombopoietin nach Aktivierung der

Thrombozyten freigesetzt wird (24).

Einleitung

12

Der dritte Mechanismus ist die Steigerung der Thrombopoietinproduktion durch

erhöhte mRNA-Expression im Knochenmarkstroma bei Thrombozytopenie.

Verschiedene Arbeitsgruppen haben tierexperimentelle Untersuchungen

durchgeführt, um zu prüfen, ob die Thrombopoietingenexpression in der Leber und in

anderen Thrombopoietin produzierenden Organen von der

Thrombozytenkonzentration im Blut abhängt. Die meisten Arbeiten haben gezeigt,

dass eine solche Beziehung nicht besteht. Der Thrombopoietin-mRNA Gehalt der

Leber war in Tieren mit einer experimentell erzeugten Thrombozytopenie oder

Thrombozytose gleich groß wie in Normaltieren (58; 23; 16; 76). Abweichend wurde

in verschiedenen Spezies – und auch beim Menschen - gefunden, dass es bei einer

Thrombozytopenie zu einer zusätzlichen Thrombopoietin-mRNA Expression in

Stromazellen des Knochenmarks kommt (77; 36).

Darauf aufbauend wurden in neueren Studien an Ratten mit systemischen

entzündlichen Erkrankungen, die mit einer reaktiven Thrombozytose einhergehen,

eine gesteigerte Thrombopoietin-mRNA Expression in der Leber gefunden. Diese

Reaktion könnte einen Mechanismus der Infektionsabwehr darstellen und liefert neue

Erkenntnisse über die Regulation der Thrombopoietin-mRNA Expression bei

Entzündungen (85).

Einleitung

13

LeberNiere

Thrombopoietin

Thrombozyten

MegakaryozytenHypoplasie:Thrombozytopenie

Hohe PlasmaThrombopoietinKonzentrationen

MegakaryozytenHyperplasie:Thrombozytose

Niedrige PlasmaThrombopoietinKonzentrationen

Knochenmark

“Steady-state” ThrombozytenProduktion

Abb. 1-3: Modell der Thrombopoietinregulation. Leber und Niere produzieren

Thrombopoietin (TPO) und geben es ans Blut ab.

Bei einer Thrombozytopenie (linke Seite der Abbildung) wird nur wenig des

freigesetzten TPOs metabolisiert, woraus eine hohe TPO-Konzentration im Plasma

resultiert, die das hypoplastische Knochenmark stimuliert. Zusätzlich produziert das

Knochenmarkstroma TPO (gebogener, dicker Pfeil). Die hohen TPO-

Konzentrationen helfen, die Thrombozyten- und Megakaryozytenproduktion wieder

anzuregen.

Während einer Thrombozytose (rechte Seite der Abbildung) entfernen die

zahlreichen Thrombozyten einen Grossteil des TPOs aus dem Blut und die

Produktion durch die Stromazellen im Knochenmark ist stark reduziert. Folglich steht

Einleitung

14

wenig TPO zur Verfügung, um auf die Megakaryozyten zu wirken (gebogener,

dünner Pfeil). Es kommt zu einer “steady-state“ Thrombozytenproduktion.

1.5 Thrombopoietinregulation bei Entzündungen und die Bedeutung von

Zytokinen

Abweichend von den normalen Regelmechanismen ist bei entzündlichen Prozessen

sowohl die Thrombozyten- als auch die Thrombopoietinkonzentration im Blut

abnormal hoch (12; 42), es kommt zur sog. reaktiven Thrombozytose. Während der

akuten Entzündungsphase steigt die Thrombopoietinkonzentration stark an und

erreicht in der ersten Woche den höchsten Wert. Die Thrombozytenzahl hingegen ist

in der ersten Woche unverändert und erreicht die Höchstwerte erst zwei bis drei

Wochen nach Entzündungsbeginn (39). Aufgrund dieser Ergebnisse und aufgrund

von Versuchen an gesunden Menschen, deren Thrombozytenzahlen 12 Stunden

nach Thrombopoietin Injektion ihre Höchstwerte erreichten (31), lässt sich vermuten,

dass der Thrombopoietinanstieg die Thrombozytose in akuten Infektionen induziert

und Teil einer Akut-Phase-Reaktion ist (85). Diese Reaktion findet sich

beispielsweise bei Autoimmunerkrankungen wie Morbus Crohn, bei Infektionen, nach

einem Trauma, nach chirurgischen Eingriffen und bei malignen Erkrankungen vor

Beginn der Chemotherapie. Prinzipiell könnte der Verlust der inversen Beziehung

zwischen der Thrombozytenmasse und der Thrombopoietinkonzentration auf einer

verlängerten Lebenszeit des Hormons oder auf einer abnormal gesteigerten

Stimulation der Thrombopoietinproduktion beruhen. Experimentelle Hinweise auf

eine verlängerte Thrombopoietinlebenszeit bei entzündlichen Erkrankungen sind in

der Literatur nicht zu finden. Die zweite Erklärungsmöglichkeit ist wahrscheinlicher.

Das Zytokin Interleukin-6 (IL-6) stimuliert die Reifung von Megakaryozyten und die

Thrombozytenbildung im Knochenmark (4; 64), außerdem steigert es die Synthese

verschiedener Akut-Phase-Proteine in der Leber (32). In Zellkulturversuchen mit

humanen Hepatomzellen wurde gefunden, dass das proentzündliche Zytokin IL-6 die

Thrombopoietin-mRNA Expression steigert. Die Promoter Sequenz des

Thrombopoietin-Gens enthält außerdem 13 mutmaßliche IL-6-Antwort-Sequenzen.

Andere Zytokine wie IL-1, IL-11 oder der Tumornekrosefaktor α (TNF α) zeigen keine

solche Wirkung (88). Bei entzündlichen Erkrankungen ist neben Thrombopoietin also

Einleitung

15

auch die IL-6 Konzentration im Blut erhöht und diese Werte korrelieren stark

miteinander (39; 38). Aufgrund dieser Untersuchungen entstand die Hypothese, dass

die hohen IL-6 Konzentrationen und eine Thrombozytose bei entzündlichen

Prozessen und malignen Erkrankungen durch einen IL-6-induzierten

Thrombopoietinanstieg hervorgerufen werden könnten (44). Es wurde außerdem

gezeigt, dass die Verabreichung von rekombinantem IL-6 (rhIL-6) im Versuchstier

eine Thrombozytose hervorruft. In Tumorpatienten bewirkt die Gabe von rhIL-6 eine

Zunahme der Plättchenkonzentration im Blut (82). Durch die wiederholte Applikation

hoher Dosen von IL-6 lässt sich im Versuchstier (Maus) ein Anstieg der

Plasmathrombopoietinkonzentration erwirken (44). Inwieweit endogen gebildetes IL-6

bei entzündlichen Prozessen die Thrombopoietin-mRNA Expression und

Thrombopoietinproduktion steigert, ist bislang unbekannt.

1.6 Fragestellung

Die Untersuchungen, über die hier berichtet wird, sollten einem besseren

Verständnis der Vermittlerrolle von IL-6 bei der gesteigerten

Thrombopoietinproduktion bei entzündlichen Prozessen dienen. Hierzu wurden

tierexperimentelle Studien an Wildtyp-Mäusen (Bl/6) und an transgenen IL-6

defizienten Mäusen (IL-6-"knockout") durchgeführt. In den Tieren wurde durch

subkutane Applikation von Terpentin ein steriler Abszess gesetzt. Bestimmungen

der IL-6- und Thrombopoietinkonzentration im Plasma sowie des Thrombopoietin-

mRNA Gehaltes im Lebergewebe der Tiere erbrachten Ergebnisse, die die

Hypothese stützen, dass Thrombopoietin zur Gruppe derjenigen Akut-Phase-

Proteine gehört, deren Syntheserate durch IL-6 gesteigert wird.

Material und Methoden

16

2 Material und Methoden

2.1 Versuchstiere

Für die Untersuchungen wurden Mäuse des Stammes C57 Bl/6 verwendet. IL-6-

defiziente (IL-6-"knockout") Mäuse nach Rückkreuzung auf den genetischen

Hintergrund des Stammes C57Bl/6 wurden freundlicherweise von Herrn Prof.

Manfred Kopf (Institut für Molekulare Biomedizin, ETH Zürich, Schweiz) zur

Verfügung gestellt. In den IL-6 defizienten Tieren ist das IL-6-Gen im zweiten Exon

(erstes kodierendes Exon) durch eine Neomycin-resistente Kassette zerrissen, so

dass sie kein IL-6 produzieren (49). Die Mäuse wurden in der Tierhaltung der

Vorklinischen Institute unter konventionellen Bedingungen bei freiem Zugang zu

Standardfutter und Wasser und einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und

vermehrt. Experimente wurden mit männlichen Tieren mit einem Körpergewicht

von 25-32 g durchgeführt. Um akute Entzündungsreaktionen zu erzeugen, wurde

den Tieren subkutan (s.c.) 150 µl Terpentin (Karl Roth GmbH, Karlsruhe) unter die

Rückenhaut appliziert. Kontrolltiere erhielten 150 µl sterile physiologische

Kochsalzlösung. Die Injektion von Terpentinöl führt zu einem sterilen Abszess

(27). Nach Literaturangaben (8) bewirkt die Terpentinölinjektion in Mäusen einen

ausgeprägteren IL-6 Anstieg im Plasma als die Gabe von bakteriellem

Lipopolysaccharid (LPS). Zum Vergleich wurde in dieser Arbeit einigen Tieren

intraperitoneal LPS (0,1 µg/g Körpergewicht, Stammlösung 10 µg/ml in

physiologischer Kochsalzlösung; Escherichia coli, Serotyp 0:III:B4; Fa. Sigma,

Taufkirchen) verabreicht.

6 h, 24 h oder 72 h später wurden die Tiere intramuskulär (i.m.) mit Ketamin (25

mg/ml) und Pentobarbital (30 mg/ml) narkotisiert und aus der Vena cava caudalis

Blut entnommen. Zur Erstellung des Blutbildes wurden EDTA beschichtete

Spritzen (1,35 mg Na2-EDTA/ml Blut) und Blutröhrchen benutzt. Das Plasma

wurde durch 15 min Zentrifugation bei 2900 rpm und 20°C gewonnen (Eppendorf

Zentrifuge 5402; Eppendorf, Hamburg). Die Leber und die Nieren wurden

entnommen, sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur Aufarbeitung bei

–80°C gelagert. Der sterile Abszess der mit Terpentinöl behandelten Mäuse wurde


17

durch Eröffnen der Rückenhaut sichtbar gemacht, bei den Kontrolltieren war

dieser nicht nachweisbar. Untersuchungen des Blutbildes wurden mit einem

veterinärmedizinischen Blut-Analysegerät durchgeführt (ABC Vet, Scil animal care

company GmbH, Viernheim). Mess- und Normalwerte-Kennung waren auf die

Spezies "Maus" eingestellt.

Die Versuche waren durch das zuständige Ministerium am 4. September 2000

genehmigt worden (Nr. 21-1c/00).

2.2 In vitro Inkubation von Vollblut

Um abzusichern, dass die IL-6 "knockout"-Mäuse kein IL-6 produzieren, wurden in

vitro Studien durchgeführt. Dabei wurden Vollblutproben der Wildtyp- und IL-6

"knockout"-Tiere nach Stimulation mit LPS im ex vivo Modell nach der für

menschliches Blut beschriebenen Methode (18; 56) auf IL-6 Bildung untersucht. Den

unbehandelten Tieren wurde in Äthernarkose durch Herzpunktion Blut in Lithium-

Heparin-Monovetten (Sarstedt, Nürmbrecht) entnommen. Je 50 µl heparinisiertes

Vollblut wurde im zweifach Ansatz pro Blutspender unverdünnt unter sterilen

Bedingungen in die – mit Inkubationslösung versetzten – Zellkulturplatten überführt

(24er Platten, Nunc, Wiesbaden). Die Inkubationslösungen bestanden aus 450 µl

Zellkulturmedium RPMI 1640 (Invitrogen, Karlsruhe) mit 100 ng/ml LPS und

Antibiotika (100 µg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin). Die Suspensionskulturen

wurden 6 h bzw. 24 h im Brutschrank inkubiert (37°C, Inkubationsgas 5% CO2 in Luft,

Wasserdampfsättigung). Anschließend wurde die Suspension 10 min bei 1000 rpm

und 4°C zentrifugiert und der Überstand zur enzymimmunologischen IL-6

Bestimmung bei -40°C eingefroren.


18

2.3 IL-6 Bestimmung

Zur Bestimmung der IL-6 Konzentration im Mausplasma bzw. in den

Vollblutkulturüberständen wurde zunächst das kommerzielle

enzymimmunologische (ELISA) Testbesteck Quantikine M Maus-IL-6 der Fa. R&D

Systems (Minneapolis, MN, USA, Katalog-Nr. M6000) verwendet. Dabei stellte

sich heraus, dass entgegen den Literaturangaben (67) das Testbesteck, das

polyklonale Antikörper gegen Maus IL-6 enthielt, für die Plasmaproben keine

validen Ergebnisse lieferte. Dies war erkenntlich an den hohen IL-6 Werten (ca.

150 pg/ml) im Plasma normaler Wildtyp- und IL-6 "knockout" -Tiere und der

Beobachtung, dass Verdünnungsreihen mit Mausplasma keinen parallelen Verlauf

gegenüber dem rekombinanten Maus IL-6 Standard lieferten. Nach Schriftwechsel

mit der Herstellerfirma wurde im September 2002 ein neues Testsystem auf den

Markt gebracht (M6000B), das sich für die Messung von IL-6 im Mausplasma als

geeignet erwies. Im Ergebnisteil sind nur die mit dem neuen Testbesteck

(M6000B) bestimmten Plasma IL-6 Werte gezeigt. Dabei wurden 50 µl der zu

untersuchenden Probe bzw. des rekombinanten IL-6 Standards mit

Inkubationspuffer 2 h bei Raumtemperatur in den mit monoklonalem Anti-IL-6

Antikörper beschichteten Mikrotiterplatten auf einer Schüttelplattform inkubiert,

anschließend fünfmal gewaschen, mit Meerrettichperoxidase gekoppeltem

polyklonalem Anti-IL-6 Antikörper erneut 2 h bei Raumtemperatur inkubiert,

wiederum fünfmal gewaschen und mit dem Substratpuffer mit Chromogen (H2O2

und Tetramethylbenzidin) 30 min inkubiert. Die Reaktion wurde mit Salzsäure

(HCl) gestoppt und die Absorption mittels eines Mikrotiterplatten-Photometers

(Rainbow; SLT, Kreilsheim) bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem

Referenzfilter von 570 nm ermittelt. Es wurden Doppelbestimmungen

durchgeführt. Das untere Detektionslimit betrug 3 pg/ml. Die Inter- und Intra-Test-

Variationskoeffizienten betrugen < 10% bzw. < 5%.


19

2.4 Thrombopoietinbestimmung im Plasma

Zur Bestimmung der Thrombopoietinkonzentration im Mausplasma wurde das

kommerzielle enzymimmunologische Testbesteck Quantikine M Maus-

Thrombopoietin der Fa. R & D Systems (Katalog-Nr. MTP00) verwendet. Nach

Herstellerangaben beträgt die untere Detektionsgrenze 20 pg/ml Thrombopoietin,

die Koeffizienten für die Intra- und Interassay-Variabilität ≤ 8%.

2.5 RNA-Extraktion

Die tiefgefrorenen Organe wurden in 4 mol/l Guanidiniumthiocyanat (GTC; ca. 10

ml pro g Gewebe) auf Eis homogenisiert (Ultra Turrax T25; IKA-Labortechnik,

Stauffen im Breisgau). Die Gesamt-RNA wurde mittels saurer Phenolextraktion

aus dem Gewebehomogenat nach (15) isoliert. Die Methode nutzt die

unterschiedliche Verteilung von DNA, RNA und Proteinen zwischen der

organischen und der wässrigen Phase, in welcher die RNA verbleibt. Das

Originalprotokoll (15) wurde für ein Zellhomogenatvolumen von 700 µl adaptiert,

welches mit 560 µl Phenol (pH 4,5) und 280 µl Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol

im Verhältnis 25:24:1 (Lösungen von Sigma) sowie 70 µl 2 mol/l Natriumacetat-

Puffer (pH 4,0) in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß gemischt wurde. Die Ansätze

wurden 20 min auf Eis inkubiert und anschließend bei 12.000 rpm und 4°C 20 min

zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5402; Eppendorf, Hamburg). Nach der

Zentrifugation wurde die obere wässrige Phase abpipettiert und mit einem

gleichen Volumen Isopropanol (Merck, Darmstadt) versetzt. Nach einer 30

minütigen Präzipitationsphase bei –80°C wurde die RNA-Lösung wie o.a.

zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 300 µl GTC resuspendiert und erneut mit

Isopropanol gefällt. Anschließend wurde die RNA mit 75% Ethanol gewaschen,

getrocknet und in 20-40 µl mit Diäthylpyrocarbonat behandeltem Wasser

aufgenommen.

Die Konzentration der RNA-Lösungen wurde anhand der Extinktion bei 260 nm

ermittelt. Zudem wurde der Quotient der Absorptionen bei 260 und 280 nm zur

Prüfung auf Verunreinigungen der RNA durch Proteine oder Phenol bestimmt. Nur


20

RNA mit einem Quotienten zwischen 1,8 und 2,0 wurde verwendet. Alle RNA-

Lösungen wurden bei –80°C aufbewahrt.

2.6 Reverse Transkription

Vor der reversen Transkription wurden 5 µg Gesamt-RNA auf einem

denaturierenden Agarose-Gel visualisiert, um Degradationen und ungenaue

Konzentrationsbestimmungen ausschließen zu können. Die RNA wurde mit 6 µl

Ladepuffer gemischt und 10 min bei 68° C im Wasserbad denaturiert. Auf einem

1,1%igen Agarose-Gel mit 2% Formaldehyd wurde die RNA in MOPS-Puffer

elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurden 5 µg Gesamt-RNA

transkribiert (84). Der vollständige Reaktionsansatz von 25 µl enthielt 1 µg

oligo(dT)15 als Startermolekül für die Polymerase, je 500 nM dNTPs und 100 U der

reversen Transkriptase (Maus- Moloney Leukämievirus reverse

Transkriptase/MMLV TR). Die RNA und die Oligonukleotide wurden in 14,5 µl

Wasser gemischt und für 15 min bei 68°C denaturiert. Nach 15 minütigem

Abkühlen bei 4°C wurden die restlichen Reagenzien hinzugefügt und der Ansatz

45 min bei 42°C und 45 min bei 52°C inkubiert. Durch 10 minütiges Erhitzen auf

100°C wurde das Enzym inaktiviert und der Ansatz auf 4°C heruntergekühlt. Die

so gewonnene cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt.

2.7 Polymerase Kettenreaktion

Vor der Quantifizierung wurden qualitative PCR-Analysen für Thrombopoietin und

Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) cDNAs durchgeführt.

Das PCR-Signal für GAPDH diente dabei als Kontrolle für die Integrität und die

gleichmäßige Konzentration der cDNA.

Es wurde 1 µl cDNA in einem 50 µl-Ansatz benutzt, der 0,75 U Taq-Polymerase

(Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe), je 200 nM dNTPs und je 400 nM

Oligonukleotide im vom Enzymhersteller mitgelieferten Reaktionspuffer enthielt.

Zur Denaturierung wurden die Reaktionsansätze 3 min auf 94°C erhitzt.

Anschließend wurden 27 - 35 PCR-Zyklen von 1 min Denaturierung bei 94°C, 90 s


21

Anheftung bei 55°C für die GAPDH- und 60°C für m-TPO-Startermoleküle (s.Tab

2-1) und 3 min Elongation bei 72°C durchgeführt. Der abschließende

Elongationsschritt dauerte 10 min.

Danach wurden 20 µl des Reaktionsansatzes mit 2 µl DNA-Ladepuffer versetzt

und zur Agarose-Gelelektrophorese eingesetzt. Es wurden Gele mit 2% (w/w)

Agarose und 0,5 µg/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer, welcher auch als

Elektrophoresepuffer diente, benutzt. Die Länge der PCR-Produkte wurde durch

Vergleich mit einem Molekulargewichtsstandard ermittelt (100 bp DNA Standard).

Name Position Sequenz TAn

5'-GAPDH 4296 - 4315 5'-ATC ATC CCT GCC TCT ACT GG-3'

55°C 3'-GAPDH 4533 - 4552 5'-TGG GTG TCG CTG TTG AAG TC-3'

5'-mTPO 229 – 247 5'-CTC TGT CCA GCC CCG TAG C-3'

60°C

3'-mTPO 525 - 542 5'-CCC CAA GAG GAG GCG AAC-3'

Tab. 2-1: Als Startermoleküle verwendete Oligonukleotide. 5'-GAPDH und 3'-

GAPDH dienten zur Amplifizierung von GAPDH-cDNA (PCR-Produkt 256 bp) und

5'-mTPO und 3'-mTPO von TPO-cDNA (314 bp). Die angegebenen Positionen

bezeichnen das erste und das letzte Nukleotid, an das das Oligonukleotid bindet.

TAn, Anheftungstemperatur in der PCR.

2.8 Thrombopoietin mRNA Quantifizierung mittels kompetitiver PCR

Zur Quantifizierung der Thrombopoietin-mRNA wurde zunächst die klassische

Methode nach Gilliland et al. (28) in der Modifikation von Siebert und Larrick (72)

verwendet. Dabei wird eine unbekannte Menge cDNA mit der bekannten Menge

einer Kompetitor-DNA in derselben PCR koamplifiziert und konkurriert dabei mit


22

der TPO-cDNA um die Bindung der Oligonukleotide. Das PCR-Produkt dieses

Kompetitors besitzt eine Größe von 252 bp.

Die kompetitive PCR wurde ebenso durchgeführt wie die qualitative PCR für TPO

(siehe Abschnitt 2.7), zusätzlich zu 1 µl cDNA wurden dem Ansatz auch 1 µl

Kompetitorlösung mit bekannter Konzentration als interner Standard zugesetzt.

Für jede cDNA-Probe wurden vier PCR-Reaktionen mit unterschiedlichen

Konzentrationen an Kompetitor angesetzt. Von der cDNA und den

Kompetitorlösungen wurden 1:10 Vorverdünnungen hergestellt, um Fehler beim

Pipettieren zu reduzieren. Die Lösungen wurden mit den übrigen Reagenzien

vermischt.

Nach der PCR-Reaktion und Agarose-Gel Elektrophorese sind die aus der cDNA

und dem Kompetitor gebildeten PCR-Produkte anhand ihrer Größe unterscheidbar

(314 bp für m-TPO und 252 bp für den Kompetitor), so dass aus

Äquivalenzmengen die Ausgangs-mRNA-Menge abgeschätzt werden kann.

Aus der Äquivalenzkonzentration wurde die TPO-mRNA Konzentrationen pro

Mikrogramm Gesamt-RNA errechnet. Dabei wurden die molekulare Masse des

Kompetitors, die in der RT eingesetzte Menge Gesamt-RNA, die RT-Effizienz und

die Tatsache, dass der Kompetitor doppelsträngig ist, wohingegen die cDNA

einzelsträngig vorliegt, in folgender Formel berücksichtigt:

cTPO-mRNA = 2000 * q / (MKomp * cRNA * fRT)

cTPO-mRNA TPO-mRNA-Konzentration [amol/µg Gesamt-RNA]

q Äquvalenzkonzentration [fg Kompetitor/50 µL PCR-Ansatz]

MKomp molekulare Masse des Kompetitors [g/mol]

cRNA Gesamt-RNA-Konzentration [µg/µL RT-Ansatz]

fRT RT-Effizienz

Die so gewonnenen Ergebnisse bestätigten jedoch den bekannten Nachteil einer

großen Intra- und Inter-Assay Variation. Daher wurden die Proben zusätzlich den

neueren Light-Cycler Verfahren der “Real-Time“ PCR unterzogen. Da zum

Zeitpunkt der hier berichteten Untersuchungen ein solches Gerät am Institut für

Physiologie der Universität zu Lübeck nicht verfügbar war, wurde die Möglichkeit

genutzt, die Messungen am Institut für Physiologie der Universität Duisburg-Essen

durchzuführen (Direktor Prof. Dr. Joachim Fandrey). Dabei wurde davon


23

ausgegangen, dass die Präzision (geringe Intra- und Inter-Assay Variation) der

“Real-Time“ PCR Bestimmung größer als bei der bislang praktizierten

kompetitiven PCR ist.

2.9 Thrombopoietin mRNA Bestimmung mit "Real-Time" PCR

Für die Quantifizierung der TPO cDNA wurden der 5´-Primer 5´-CCT GGG AGA

ATG GAA AAC CC-3´ und der reverse 3´-Primer 5´-ACT GTC CTC GTG CTG

CCA TC-3´ verwendet, der ein Amplifikationsprodukt von 108 Basenpaaren ergibt.

Bei dieser Methode wird ein Farbstoff in das PCR-Produkt eingebaut und zum

Fluoreszieren gebracht. Die Fluoreszenz wird einmal pro Zyklus am Ende der

Elongationsphase gemessen und zeitgleich auf dem Bildschirm dargestellt.

Dadurch kann der Anstieg des PCR–Produktes Zyklus für Zyklus verfolgt werden.

In Abhängigkeit von der Ausgangskonzentration wird ab einem bestimmten Zyklus

ein spezifisches Signal messbar. Dieser Wert, an dem die Proben erstmals eine

ausreichende Konzentration aufweisen, um aus dem Hintergrund hervorzutreten,

wird auch als Crossing-Point (CP) bezeichnet und lieferte die Grundlage für die

Quantifizierung.

Es gibt mehrere Fluoreszenzformate, von denen SYBR Green gewählt wurde

(SYBR-Green, GeneAmp 5700 Sequence Detection System, Applied Biosystem,

Weiterstadt, Germany). Dabei handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der

in doppelsträngige DNA eingebaut wird. Am Beginn der Reaktion enthält der

Reaktionsansatz die denaturierte DNA, die Primer und den Farbstoff SYBR Green.

Die ungebundenen Moleküle des Farbstoffs strahlen nur eine schwache

Fluoreszenz aus. Nach dem Binden der Primer an die DNA können Moleküle des

Farbstoffs an die doppelsträngig vorliegende DNA binden. Dadurch kommt es zu

einem sichtbaren Anstieg der Fluoreszenz. Während der Elongationsphase binden

immer mehr Farbstoffmoleküle an die neusynthetisierte DNA. Wenn die Reaktion

kontinuierlich am Monitor aufgezeigt wird, ist es möglich, den Anstieg der

Fluoreszenz und damit des Amplifikationsproduktes zeitgleich (“Real-Time“) zu

verfolgen. Während der Denaturierungsphase, die sich anschließt, erlischt das

Signal, da die DNA dann wieder einzelsträngig vorliegt (11).


24

Für die Quantifizierung wurde dann eine 2-Schritt-“Real-Time“ PCR mit einem

Denaturierungsschritt bei 95°C für 10 min und anschließend 40 Zyklen bei 95°C

für 15 s und 60°C für 1 min durchgeführt.

Als interner Standard diente das TPO-cDNA Amplifikationsprodukt, das nach

Gelelektrophorese aufgereinigt worden war. Die Konzentration dieses

aufgereinigten DNA-Fragments wurde durch Messung der OD bei 260 nm

bestimmt und in Konzentrationen von 1 pg/µl bis 0,1 fg/µl als Standard in der PCR

eingesetzt. Zusätzlich wurde mit einer “Real-Time“ PCR für β-Aktin mit dem 5´-

Primer 5´-CCC TCT GAA CCC TAA GGC CA-3´ und dem reversen 3´-Primer 5´-

GGG ACA ACA CAG CCT GGA TG-3´ für 25 Zyklen bei 95°C für 15 s und 57°C

für 1 min die β-Actin cDNA quantifiziert. Die Ergebnisse der Quantifizierung

werden als Quotient der TPO-cDNA zur β-Aktin-cDNA dargestellt.

2.10 Statistik

Normalverteilte Daten sind mit Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die

Bestimmung der Signifikanz der Unterschiede erfolgte bei gleicher

Standardverteilung bei 2 Gruppen mit dem ungepaarten Student´s T-Test.

Nicht-normalverteilte Ergebnisse sind als Box-Plot mit Median aufgetragen. Zur

Abschätzung der Signifikanz der Unterschiede zwischen einer Kontrollgruppe

(unbehandelte oder NaCl-behandelte Kontrolltiere) und Tieren mit entzündlicher

Reaktion (Terpentin- oder LPS- Applikation) wurden bei 2 Gruppen die nicht-

parametrischen Verfahren nach Mann-Whitney bzw. bei mehr als 2 Gruppen der

Dunn`s Test angewendet (GraphPad InStat Version 3,05; GraphPad Software,

San Diego, Ca, USA). P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Der Dixon Test wurde als Ausreißertest benutzt.


25

2.11 Puffer und Lösungen

DEPC-Wasser:

0,1% (v/v) DEPC in Wasser

über Nacht rühren, autoklavieren

DNA-Ladepuffer (1:10 mit Probe zu mischen):

10 mM Tris-Acetat, pH 8,0

1 mM EDTA

50% (v/v) Glycerin

0,25% (w/w) Bromphenolblau

75% (v/v) Ethanol:

75% (v/v) Ethanol

in DEPC-Wasser

GTC-Lösung:

4 M GTC

25 mM Natriumacetat

filtrieren mit Whatman-Filter Nr. 1

0,1 M β-Mercaptoethanol

MOPS-Puffer:

40 mM MOPS, pH 7,0

10 mM Natriumacetat

1 mM EDTA

autoklavieren

Natriumacetat-Puffer:

2 M Natriumacetat, pH 4,0

autoklavieren


26

PBS :

8,5 mM Na2HPO4

1,5 mM KH2HPO4

137 mM NaCl

3 mM KCl

mit 85% (v/v) H3PO4 auf pH 7,3 einstellen

autoklavieren oder steril filtrieren

Phenol: (Fertiglösung von Sigma)

Phenol

äquilibriert mit 0,1 M Natriumcitrat, pH 4,3

Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol: (Fertiglösung von Sigma)

50% (v/v) Phenol

48% (v/v) Chloroform

2% (v/v) Isoamylalkohol

äquilibriert mit 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA

RNA-Ladepuffer (1:1 mit Probe mischen):

40 mM MOPS, pH 7,0

10 mM Natriumacetat

1 mM EDTA

7% (v/v) Formaldehyd

50% (v/v) Formamid

10% (v/v) Glycerin

0,05% (w/w) Bromphenolblau

40 µg/ml Ethidiumbromid

TAE-Puffer:

10 mM Tris-Acetat, pH 8,0

1 mM EDTA


27

2.12 Chemikalien und Reagenzien

Soweit nicht anders erwähnt, wurden alle Chemikalien oder Reagenzien bei

Sigma (Deisenhofen), Roth (Karlsruhe) oder Merck (Darmstadt) im höchst-

möglichen Reinheitsgrad erworben. Ausnahmen waren:

100 bp DNA Standard Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe

Agarose Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe

dNTPs Takara Biomedicals, Shiga, Japan

Ethidiumbromid Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe

FKS Sigma, Deisenhofen; Seromed Biochrom KG, Berlin

oligo(dT)15 MWG Biotech, Ebersberg

PCR-Startermoleküle MWG Biotech, Ebersberg

Restriktionsenzyme MBI Fermentas, St. Leon-Rot

reverse Transkriptase Promega, Mannheim

rNTPs Promega, Mannheim

Taq-DNA-Polymerase Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe

Zellkulturmedien RPMI 1640, Invitrogen, Karlsruhe

Ergebnisse

28

3 Ergebnisse

3.1 IL-6 Produktion in ex-vivo Vollblutkulturen

Mononukleäre weiße Blutzellen produzieren verschiedene Zytokine einschließlich

IL-6, wenn sie in-vitro mit LPS stimuliert werden. In Abb. 3-1 ist die Rate der IL-6

Produktion in Vollblutproben dargestellt, die von BL-6 Wildtyp- oder transgenen IL-

6-"knockout"-Tieren stammten. Nur im Medium der Suspensionskulturen des

Blutes der Wildtyp-Tiere war ein Anstieg der IL-6 Konzentration nachweisbar.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

IL-6[pg/ml]

0 h 6 h 24 h 0 h 6 h 24 h

Wildtyp (wt) Transgen (tg)

*

*

Abb. 3-1: IL-6 Produktion in Vollblutproben von Wildtyp- (n = 5) und transgenen

IL-6-“knockout“- Mäusen (n = 5) nach in-vitro Stimulation mit LPS. Die Rechtecke

bezeichnen die 25%- und 75%-Quantilen und den Median (durchgezogene Linie).

Zusätzlich sind 10%- und 90%-Quantilen (Fehlerbalken) und Mittelwert

(gestrichelte Linie) angegeben.

* P<0,01 (Dunn´s Test, Wildtyp 0 h versus 6 h und Wildtyp 0 h versus 24 h).

Ergebnisse

29

3.2 In-vivo IL-6 Produktion nach der Applikation von LPS oder Terpentin

In Abb. 3-2 ist die IL-6 Konzentration im Plasma von Wildtyp-Mäusen, denen

entweder 300 µl LPS (0,1 µg/g Körpergewicht; i.p.) oder Terpentinöl (s.c.)

appliziert worden war, gegenübergestellt. In den LPS-behandelten Tieren war die

IL-6 Konzentration 6 h nach der Behandlung gegenüber der IL-6 Konzentration im

Plasma von unbehandelten Wildtyp-Tieren etwa verdoppelt (13,7 pg/ml versus

23,1 pg/ml, jeweils Median). Demgegenüber war die IL-6 Konzentration im Plasma

der mit Terpentinöl behandelten Tieren auf 169 pg/ml angestiegen.

0

100

200

300

400

500

600

700

Unbehandelt LPS Terpentin

IL-6 [pg/ml]

*

Abb. 3-2: IL-6 Produktion in Plasmaproben von Wildtyp- Mäusen nach Applikation

von LPS (n = 5) oder Terpentin (n = 6). Die Rechtecke bezeichnen die 25%- und

75%-Quantilen und den Median (durchgezogene Linie). Zusätzlich sind 10%- und

90%-Quantilen (Fehlerbalken), Ausreißer (Kreise) und Mittelwert (gestrichelte

Linie) angegeben.

* P<0,001 (Dunn´s Test, Terpentin versus unbehandelt).

Ergebnisse

30

3.3 Plasma IL-6 Konzentration in Terpentin behandelten Wildtyp- und IL-6-

"knockout"-Mäusen

Abb. 3-3 zeigt die Ergebnisse der Messungen der IL-6 Konzentrationen im Plasma

der Versuchstiere 6 h, 24 h und 72 h nach subkutaner Terpentinapplikation. In den

Wildtyp-Mäusen war die IL-6 Konzentration nach 6 h und 24 h mit nachfolgendem

Abfall bei 72 h signifikant erhöht (Abb. 3-3). In den IL-6-"knockout"-Mäusen war

kein signifikanter Anstieg der IL-6 Konzentration im Plasma nach der

Terpentinbehandlung feststellbar.

0

100

200

300

400

0

25

50

75

100400

NaClTerpentin

6h 24h 72h

IL-6-knockout

IL-6 [pg/ml]

* *

**

Wildtyp

2.

1.

Ergebnisse

31

Abb. 3-3: IL-6 Konzentration in Plasmaproben von (1) Wildtyp- (n = 6) und (2) IL-

6-“knockout“- Mäusen (n = 6) nach Applikation von Kochsalzlösung (weiße

Säulen) oder Terpentin (graue Säulen). Es sind die Standardabweichungen als

Balken angegeben.

* P<0,01, * * P<0,05 ( Mann-WhitneyTest).

3.4 Plasma Thrombopoietin Konzentration in Terpentin behandelten

Wildtyp- und IL-6-"knockout"-Mäusen

Die Thrombopoietinkonzentration im Plasma NaCl behandelter Wildtyp-Mäuse

betrug ca. 8 pg/ml (Abb. 3-4). Die interindividuelle Streuung war relativ breit. Zu

allen untersuchten Zeitpunkten war die Plasmathrombopoietinkonzentration in den

Terpentin behandelten Wildtyp-Mäusen gegenüber der in den NaCl behandelten

Kontrolltieren erhöht, wobei der Unterschied nur nach 6 h und 24 h das

Signifikanzniveau erreichte. In den IL-6-“knockout“-Tieren war zu keinem Zeitpunkt

ein signifikanter Unterschied der Plasmathrombopoietinkonzentration zwischen

den NaCl behandelten Kontrolltieren und den Terpentin behandelten Mäusen

feststellbar (Abb. 3-4).

Ergebnisse

32

0

600

1200

1800

Wildtyp

IL-6-knockout

6h 24h 72h

0

600

1200

1800

TPO [pg/ml]NaClTerpentin

1.

2.

*

*

Abb. 3-4: Thrombopoietin Konzentration in Plasmaproben von (1) Wildtyp- (n = 6)

und (2) IL-6-“knockout“- Mäusen (n = 6) nach Applikation von Kochsalzlösung

(weiße Säulen) oder Terpentin (graue Säulen). Es sind die

Standardabweichungen als Balken angegeben.

* P<0,05 (Student´s T-Test, Terpentinbehandlung versus NaCl-Behandlung ).

3.5 Thrombopoietin mRNA Quantifizierung mittels kompetitiver PCR

TPO-mRNA konnte in Leber und Niere von allen Mäusen nachgewiesen werden.

Die TPO-PCR zeigte leichte Unterschiede zwischen den verschiedenen Organen

der selben Maus und Unterschiede zwischen den unterschiedlich behandelten

Mäusen, wie in Abbildung 3-5 ersichtlich.

Ergebnisse

33

TPO

GAPDH

Wt 6

h N

aCl

Wt 2

4 h

NaC

l

Wt 7

2 h

NaC

l

Wt 6

h T

erpe

ntin

Wt 2

4 h

Terp

entin

Wt 7

2 h

Terp

entin

L L L L L LN N N N N N

Neg

ativ

kont

rolle

Kom

petit

or

Abb. 3-5: Ergebnisse der qualitativen Analyse zur TPO-mRNA-Bestimmung in

Lebern (L) und Nieren (N) von Wildtyp- (Wt) Mäusen nach Behandlung mit

steriler Kochsalzlösung (NaCl) oder Terpentin für 6, 24 oder 72 Stunden (h).

Abbildung 3-6 zeigt repräsentative Agarose-Gele der kompetitiven PCR für

TPO in Lebern und Nieren der Wildtyp- und IL6-“knockout“-Mäuse nach

Injektion von steriler Kochsalzlösung oder Terpentin. In den Leberproben der

Wildtyp-Mäuse ist schon nach 6 Stunden ein Anstieg der TPO mRNA

ersichtlich (hier von 2,5 fg auf 12,2 fg), nicht hingegen bei den IL6-“knockout“-

Tieren.

TPO mRNA Leber 6h

Wt NaCl Tg NaClWt Terpentin Tg Terpentin

cDNAKomp.

20 fg

48,8

fg

40 fg

40 fg

10 fg

24,4

fg

20 fg

20 fg5 fg

12,2

fg

10 fg

10 fg

2,5

fg

6,1

fg

5 fg

5 fg

1.

Ergebnisse

34

TPO mRNA Niere 6h

Wt NaCl Tg NaClWt Terpentin Tg Terpentin

cDNAKomp.

40 fg

40 fg

40 fg

40 fg

20 fg

20 fg

20 fg

20 fg

10 fg

10 fg

10 fg

10 fg5 fg

5 fg

5 fg

5 fg

2.

Abb. 3-6: Exemplarische Ergebnisse der kompetitiven PCR zur TPO mRNA-

Bestimmung in (1) Lebern und (2) Nieren von Wildtyp- (Wt) und IL-6- “knockout“-

(Tg) Mäusen nach Applikation von Kochsalzlösung (NaCl) oder Terpentin nach 6

Stunden.

Die obere Bande besteht aus dem PCR-Produkt der TPO-cDNA, die untere Bande

aus dem PCR-Produkt des TPO-Kompetitors (Komp.). Die PCR-Ansätze

enthielten die gleiche Menge cDNA. Die eingesetzte Menge an Kompetitor ist

unter den Abbildungen angegeben. Die Pfeile zeigen den Äquivalenzpunkt der

Kompetitor- und der TPO-cDNA-Konzentration.

Die Quantifizierung der Leberproben ergab zwischen 0,382 und 7,460 amol TPO-

mRNA/µg Gesamt-RNA, die der Nierenproben zwischen 0,573 und 4,586 amol

TPO-mRNA/µg Gesamt-RNA (Abb. 3-7).

Die Unterschiede der Wildtyp-Mäuse, die mit Terpentin gegenüber steriler

Kochsalzlösung behandelt wurden, waren statistisch signifikant (ungepaarter T-

Test). Die Expression 6 h nach Terpentin- (Median 1,86) versus 6 h nach

Kochsalzlösungbehandlung (Median 0,68) ergab einen p-Wert von <0,01,

24 h nach Terpentin- (Median 2,01) versus 24 h nach Kochsalzlösungbehandlung

(Median 0,80) ergab einen p-Wert von <0,01 und die Expression 72 h nach

Terpentin- (Median 3,45) versus 72 h nach Kochsalzlösungbehandlung (Median

1,08) zeigten einen p-Wert von <0,02.

Ergebnisse

35

0

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

5

TP O [am ol/µg R N A ]

N aC lTerpentin

6h 24h 72h

Leber

N iere

* **

***

1.

2 .

Abb 3-7: Vergleich der Thrombopoietin-mRNA Expression (kompetitive RT-PCR)

in (1) Lebern und (2) Nieren von Wildtyp-Mäusen nach Applikation von

Kochsalzlösung (weiße Säulen) oder Terpentin (graue Säulen), nach 6, 24 und 72

Stunden (jeweils n = 6). Es sind die Standardabweichungen als Balken

angegeben.

* P<0,01, * * P<0,01, * * * P<0,05 ( ungepaarter T-Test vs. NaCl-Kontrolle).

Ergebnisse

36

3.6 Thrombopoietin mRNA Quantifizierung mittels "Real-Time" PCR

Die Messungen mittels "Real-Time“ PCR bestätigen die Ergebnisse der

kompetitiven PCR.

Abb. 3-8 zeigt, dass die Terpentinapplikation nach 6 h in den Wildtypmäusen eine

Zunahme der Thrombopoietin mRNA in der Leber bewirkte, der Gehalt an

Thrombopoietin mRNA in den IL-6-“knockout“-Tieren war niedriger als in den

Wildtyp-Tieren. Alle Werte für die Thrombopoietin mRNA wurden auf den Gehalt

an β-Aktin mRNA bezogen. Die Expression 6 h nach Terpentin- versus 6 h nach

Kochsalzlösungbehandlung ergab einen p-Wert von <0,05.

Abb 3-8: In der “Real-Time“ PCR gemessene Thrombopoietin-mRNA Expression

in der Leber von Wildtypmäusen (Wt) (n = 4) und IL-6-“knockout“-Mäusen (n = 4) 6

Stunden nach Applikation von Terpentin. Als mRNA Referenz wurde β-Aktin

benutzt. Es sind die Standardabweichungen als Balken angegeben. * P<0,05 (

ungepaarter T-Test vs. NaCl-Kontrolle ).

Ergebnisse

37

3.7 Einfluss der Terpentinapplikation auf das Blutbild der Tiere

In Abb. 3-9, 3-10 und 3-11 sind die Konzentrationen der Thrombozyten,

Erythrozyten und Leukozyten 6 h, 24 h und 72 h nach der Erzeugung eines

sterilen Abszesses durch die Applikation von Terpentinöl gezeigt. Weder in den

Wildtyp-Tieren noch in den IL-6-"knockout"-Tieren bewirkte die Entzündung eine

signifikante Veränderung der jeweiligen Zellzahl. Als Nebenbefund wurde

festgestellt, dass die Plazebo (NaCl) behandelten IL-6-"knockout"-Tiere zu allen

untersuchten Zeitpunkten signifikant niedrigere Erythrozytenkonzentrationen als

die NaCl behandelten Wildtyp-Tiere aufwiesen.

Ergebnisse

38

0

500

1000

1500

2000

6 hThrombozyten [103/mm3]

0

500

1000

1500

2000 24 h

0

500

1000

1500

2000 72 h

WtNaCl

TgNaCl

WtTerpentin

TgTerpentin

Abb. 3-9: Thrombozytenkonzentration in Plasmaproben von Wildtyp- (Wt) (n = 8)

und IL-6-“knockout“- Mäusen (Tg) (n = 8) nach Applikation von steriler

Kochsalzlösung (NaCl) oder Terpentin. Die Rechtecke bezeichnen die 25%- und



Linie) angegeben.

Ergebnisse

39

0

3

6

9

12

15 6 h

Erythrozyten [106/mm3]

0

3

6

9

12

15 24 h

0

3

6

9

12

15 72 h

WtNaCl

TgNaCl

WtTerpentin

TgTerpentin

Abb. 3-10: Erythrozytenkonzentration in Plasmaproben von Wildtyp- (Wt) (n = 8)

und IL-6-“knockout“- Mäusen (Tg) (n = 8) nach Applikation von steriler




Linie) angegeben.

Ergebnisse

40

0

2

4

6

8

106 hLeukozyten [103/mm3]

0

2

4

6

8

10 24 h

0

2

4

6

8

1072 h

WtNaCl

TgNaCl

WtTerpentin

TgTerpentin

Abb. 3-11: Leukozytenkonzentration in Plasmaproben von Wildtyp- (Wt) (n = 8)

und IL-6- “knockout“- Mäusen (Tg) (n = 6-8) nach Applikation von steriler




Linie) angegeben.

Diskussion

41

4 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde die TPO-Bildung, die TPO-Konzentration im Blut

und die Thrombozytenzahl unter pathophysiologischen Aspekten in

Wildtypmäusen und IL-6-“knockout“-Mäusen untersucht.

Die Leber wurde als das Organ mit dem größten Anteil an der TPO-Synthese

identifiziert (65). Die TPO-Produktion in der Leber ist aber nicht unter allen

Umständen konstant, sondern kann durch pathophysiologische Einflüsse

verändert werden. Daher wurde hier an Wildtyp- und IL-6-“knockout“-Mäusen der

Einfluss von IL-6 auf die TPO-Bildung bei einer akuten Entzündung untersucht.

Von dem Zytokin IL-6 ist bekannt, dass es die Reifung von Megakaryozyten und

die Bildung von Blutplättchen stimulieren kann (64; 4). Andererseits ist IL-6 auch in

der Lage, die Genexpression und Proteinproduktion in der Leber anzuregen, z.B.

die Bildung von EPO (22).

IL-6 ist der Hauptvermittler bei der Bildung von Akut-Phase-Proteinen (32).

Tatsächlich ist die Konzentration von Plasma TPO im Blut von Patienten mit

reaktiver Thrombozytose durch maligne, infektiöse oder autoimmune

Erkrankungen oft abnormal hoch (13; 81; 34; 7).

Auch nach großen Operationen steigt der Plasma TPO Spiegel früher an als die

Thrombozytenzahl. Das bedeutet, dass TPO auch verantwortlich ist für das

Entstehen der postoperativen Thrombozytose (25).

Daher ist es berechtigt anzunehmen, dass die TPO Produktion Teil der Akut-

Phase-Reaktion bei Entzündungen, neoplastischem Wachstum oder

immunologischen Prozessen ist.

Die Fähigkeit von IL-6, die TPO Produktion in menschlichen Hepatomzellkulturen

zu stimulieren wurde durch verschiedene Arbeitsgruppen gezeigt (25; 44; 88),

auch wenn ein gegenteiliger Artikel vorliegt (35).

Die in vitro Studien haben IL-6 als das bedeutendste immunmodulatorische Peptid

identifiziert, das die hepatische TPO-Synthese bei entzündlichen Prozessen

stimuliert. IL-1 (88), IL-11 (88), Tumor Nekrose Faktor α (TNF-α) (88) und

Diskussion

42

Interferone (68; 87) erhöhen die TPO mRNA Expression und die TPO-Synthese in

menschlichen Hepatomzelllinien jedoch nicht. Unter den verschiedenen getesteten

Zytokinen an Kulturen primärer Rattenhepatozyten wurde herausgefunden, dass

der growth factor/scatter factor in einer Studie die TPO mRNA Expression

stimuliert (90), in einer anderen hingegen nicht (41).

Die wichtigste neue Erkenntnis unserer Untersuchungen ist, dass die TPO mRNA

der Leber und die TPO Blutspiegel der Wildtypmäuse nach Verursachen eines

sterilen Abszesses durch die Injektion von Terpentin erhöht sind, während dieser

Effekt bei den IL-6-“knockout“-Mäusen nicht auftrat.

Unsere Ergebnisse zeigen eine wichtige Verbindung zu anderen Studien, in denen

durch die Behandlung mit LPS eine Entzündung in Ratten erzeugt wurde und

daraufhin erhöhte TPO-mRNA Spiegel in der Leber (85) nachgewiesen werden

konnten und im Mausversuch sowohl TPO-mRNA und TPO im Plasma nach der

Injektion von IL-6 angestiegen sind (44).

Aufgrund dieser Ergebnisse liegt es nahe anzunehmen, dass die Stimulation der

TPO-mRNA Expression und die darausfolgende erhöhte TPO-Synthese in der

Leber im Rahmen einer entzündlichen Reaktion auf die Wirkung von IL-6

zurückzuführen sind.

Die Beobachtung, dass IL-6 die TPO-Produktion in Hepatomzellen und in

Wildtypmäusen steigern kann, liefert eine Erklärung für die relativ hohen TPO-

Spiegel bei den Patienten mit reaktiver Thrombozytose durch eine entzündliche

Erkrankung. Das IL-6 kann direkt durch Anregung der Thrombopoiese eine

Erhöhung der Blutplättchen verursachen (64; 4).

Hierbei müsste es aber eigentlich zu einem Absinken des TPO-Spiegels kommen,

da durch die vermehrte Bindung von TPO an den MPL Rezeptor mehr TPO aus

dem Blut entfernt werden müsste. Wenn aber das IL-6 die Hepatozyten zur

Bildung von mehr TPO anregt, dann führt eine gesteigerte TPO-Bildung zu einem

höheren TPO-Spiegel.

Während die Leber als TPO-Syntheseort feststeht, ist wenig über die Beteiligung

der Nieren am zirkulierenden TPO bekannt. Die TPO-Konzentration ist bekanntlich

erhöht bei Patienten mit terminalen Nierenerkrankungen aufgrund der reduzierten

Thrombozytenzahl (1; 54).

Diskussion

43

In dieser Arbeit war die Entzündung nicht mit einem erhöhten TPO-mRNA Gehalt

der Nieren in den Wildtyp-Mäusen assoziiert. Die konstante Produktion von TPO

in den Nieren könnte eine Erklärung liefern für die Beobachtung, dass die Plasma-

TPO-Konzentration nur mäßig ansteigt trotz der deutlich erhöhten TPO-mRNA

Menge in der Leber der Wildtypmäuse mit Entzündung. Tatsächlich war die

relative zur gesamten Konzentration von TPO-mRNA von Leber- und

Nierengewebeproben fast gleich. Die selbe Beobachtung wurde in Bezug auf die

TPO-mRNA Expression in Leber, Nieren, Milz und Knochenmark von

menschlichen Feten und Neugeborenen gemacht (84). In dieser Studie wurde aus

den Ergebnissen geschlossen, dass die Leber aufgrund des viel größeren

Organgewichtes Hauptsyntheseort von TPO ist (84).

Folglich ist der mäßige Anstieg der Plasma-TPO-Konzentration in den

Wildytpmäusen mit Entzündung eher durch den Mechanismus der

Wiederaufnahme von zirkulierendem TPO durch die Zielzellen (52; 23; 16; 21), als

durch die in Leber und Niere synthetisierte Menge zu erklären.

Neben dem Effekten auf die hepatische TPO-Genexpression stimuliert IL-6 die

Proliferation weniger differenzierter hämatopoetischer Vorläuferzellen, Dieser

Effekt könnte eine Erklärung für die beobachtete erniedrigte basale

Erythrozytenzahl in IL-6-“knockout“-Mäusen sein. Einzelne IL-6 Injektionen an

Ratten bewirkten eine vorübergehende Stimulation der Erythropoiese und eine

Retikulozytose (79). Der erniedrigte Hämatokrit bei Krebspatienten unter einer IL-6

Therapie wurde auf ein durch IL-6 erhöhtes Plasmavolumen zurückgeführt, wobei

der Mechanismus bisher nicht geklärt ist (2). Zusätzlich scheint die Anzahl der

Thrombozyten im Blut in den IL-6-“knockout“-Mäusen reduziert zu sein.

In Synergie mit TPO, IL-3 und IL-1 stimuliert IL-6 die Bildung und Reifung der

Megakaryozyten und die Produktion der Pro-Plättchen. Klinische Versuche an

thrombozytopenischen Patienten mit soliden Tumoren (82) oder

myelodysplastischen Syndromen (29) haben gezeigt, dass die Therapie mit IL-6

die Thrombopoiese bei Menschen fördert.

IL-6 wirkt synergistisch mit IL-1 und TNF-α bei der Induktion der Akut-Phase-

Antwort. Akut-Phase-Proteine, die bei Infektionen oder Entzündungen zunehmen,

dienen wahrscheinlich protektive Funktionen. Das beinhaltet auch hämostatische

Diskussion

44

Funktionen (z.B. Fibrinogen), antithrombotischen Funktionen und mikrobizide und

phagozytische Funktionen (z.B. Komplementfaktoren, C-reaktives Protein) (62).

Daraus ergibt sich die Frage nach der Rolle von TPO in der Familie der Akut-

Phase Proteine. Zielgerichtet schützt eine große Menge von Thrombozyten den

Organismus vor Blutverlusten durch krankheitsbedingten Schaden der

Gefäßwand. Außerdem spielen die Thrombozyten eine wichtige Rolle bei der

Hämostase. Sie zeigen Merkmale immunkompetenter Zellen und sind an der

antimikrobiellen Abwehr beteiligt (91; 46). Thrombozyten sind die ersten zellulären

Bestandteile, die durch Gewebsverletzung oder das Eindringen von Pathogenen

am Ort des Schadens der Gefäßwand akkumulieren. Stimulierte Blutplättchen

setzen eine Vielzahl von Zytokinen und anderen Mediatoren der Immunantwort

frei. Zusätzlich unterstützen sie die Leukozyten und Endothelzellen bei der

Kontrolle der Entzündungsreaktion, z.B. dadurch, dass sie die transendotheliale

Migration der Leukozyten in das umliegende Gewebe unterstützen.

Elektronenmikroskopische Studien haben gezeigt, dass Thrombozyten Bakterien

und Viren internalisieren durch das offene kanalikuläre System und durch

Vakuolen, welche mit α-Granula fusionieren (92). Diese α-Granula der

Thrombozyten enthalten antibakterielle Proteine, sog. Thrombozidine, die das

Abtöten der Bakterien unterstützen (50). Die Blutplättchen werden generell

unterschätzt für ihren Beitrag an der antimikrobiellen Abwehr, obwohl Ergebnisse

vorliegen, dass thrombozytopenische Patienten anfälliger für Infektionskrankheiten

sind (91) .

Zusammenfassung

45

5 Zusammenfassung

Klinische und experimentelle Studien zeigen, dass die Thrombopoietin-

Genexpression bei akuten Entzündungen gesteigert ist. Um die Rolle von IL-6 in

diesem Prozess zu klären, wurden Blutbilder, Plasma TPO-Konzentrationen und

die hepatische und renale TPO-mRNA-Konzentrationen in Wildtyp- und IL-6-

“knockout“- Mäusen mit sterilen Abszessen durch subkutane Injektion von

Terpentinöl untersucht. Diese Behandlung hat nach 72 h keine Veränderungen im

Blutbild gezeigt. Die Anzahl der Thrombozyten und Erythrozyten waren nach allen

Behandlungen in den IL-6-“knockout“-Tieren geringfügig niedriger als in den

Wildtypmäusen.

Die IL-6- und TPO-Konzentrationen im Plasma nach Terpentininjektion waren nur

in den Wildtypmäusen erhöht. Außerdem zeigte die Behandlung mit Terpentin in

diesen Tieren einen Anstieg der hepatischen TPO-mRNA-Konzentration, welche

mittels kompetitiver PCR (RT-PCR) und “Real-Time“ PCR bestimmt wurde. Die

renale TPO-mRNA-Konzentration blieb unverändert. Die TPO-mRNA-

Konzentration in den Lebern der IL-6-“knockout“-Mäuse nach Terpentininjektion

war nicht erhöht.

Diese Ergebnisse unterstützen das Konzept, dass sich TPO wie ein Akut-Phase-

Protein verhält, dadurch, dass seine Synthese durch IL-6 in der Leber induziert

wird.

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Veröffentlichungen

54

Veröffentlichung

Burmester H, Wolber E-M, Freitag P, Fandrey J, Jelkmann W, Thrombopoietin

production in wild-type and interleukin-6 knockout mice with acute inflammation.

Journal of Interferon & Cytokine Research 25:407-413, 2005.

Danksagung

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Danksagung

Ich danke Herrn Professor Jelkmann und Frau Doktor Wolber für die Bereitstellung

des Themas und die fachkundige Betreuung.

Bei Herrn Professor Jelkmann möchte ich mich außerdem für seine Geduld und die

Hilfe bei meiner Arbeit und der Publikation herzlich bedanken.

Herrn Professor Fandrey danke ich für die Durchführung der “Real-Time“ PCR.

Herrn Professor Knopf bin ich für die Bereitstellung der adulten IL-6- “knockout“-

Mäuse sehr dankbar.

Frau Dorothea Brennecke danke ich für die administrative Hilfe.

Weiterhin danke ich allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Institutes für

Physiologie für die Unterstützung und freundliche Hilfe bei meiner Arbeit.

Ganz besonders möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, die niemals den

Glauben an mich aufgibt und mich immer unterstützt.

Lebenslauf

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Lebenslauf

Persönliche Daten Name Helen Burmester

Geburtsdatum und – ort 10.11.1975 in Hamburg

Religion evangelisch-lutherisch Beruflicher Werdegang Seit Feb 2008 Assistenzärztin für Pädiatrie

in der Fachklinik Gaißach Okt 2004 – Jan 2008 Assistenzärztin für Pädiatrie

in der Kinderklinik Dritter Orden, München

Juli – Sep 2004 Ärztin im Praktikum für Pädiatrie in der Kinderklinik Dritter Orden, München

Hochschulausbildung Okt 1996 - Mai 2004 Studium der Humanmedizin an der

Universität zu Lübeck Sep 1999 - Apr 2000 Studium der Humanmedizin an der

Rijksuniversiteit Groningen, Niederlande im Rahmen des ERASMUS-Programms der EU Juli 1999 United States Medical Licensing Examination

(USMLE) Step 1 Forschung Seit Feb 2001 Dissertation am Institut für Physiologie der

Universität zu Lübeck (Prof. Jelkmann)

April - Nov 2000 Forschungsprojekt an der Klinik für Anästhesiologie und operative Intensivmedizin

der Humboldt-Universität zu Berlin, Charité (Prof. Petzelt) Thema: „Hypoxie-induzierte Neurotransmitterfreisetzung, die Regulation durch Calciumionen“

Schulausbildung 1982-1995 Grundschule und Gymnasium in Hamburg Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

Thrombopoietinproduktion in Wildtyp- und Interleukin-6 ... · Aus dem Institut für Physiologie der...

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