Thrombozytäre Antikörperdiagnostik - Transfusionspraxis · Typ I Antigene (auf Thrombozyten,...

Thrombozytäre Antikörperdiagnostik

Susanne Macher Thrombozytenlabor, UBT Graz

45. Jahreskongreß der DGTI 11. - 14. September 2012 Graz

MEDIZINISCHE UNIVERSITÄT GRAZ

UNIV. KLINIK FÜR BLUTGRUPPENSEROLOGIE UND TRANSFUSIONSMEDIZIN GRAZ

Übersicht

• Bildung und Funktion der Thrombozyten

• Thrombozytopenie – immunologische Ursachen

• Nachweismethoden für thombozytäre Antikörper

• Beispiele für Krankheitsbilder bedingt durch thrombozytäre Antikörper

• Refraktärzustand auf Thrombozytentransfusionen

• Fetale/neonatale Alloimmunthrombozytopenie



Thrombozyten - Blutplättchen

• Durchmesser 2 – 4 µm (kleinster „zellulärer“ Blutbestandteil)

• Normbereich für Thrombozyten 150.000 – 450.000 / µl

• Bildung im Knochenmark aus Megakaryozyten (1000 – 4000

Plättchen / Megakaryozyt)

• Physiologische Lebenszeit ~ 7 - 10 Tage

• Abbau im RES (Milz, Leber)

Wichtigste Funktion – physiologische Blutstillung

• Plättchenaggregation

• Aktivierung der plasmatischen Gerinnungskaskade

• Vasokonstriktion

• Aufrechterhaltung der Gefäßwandintegrität

Thrombozyten sind der zelluläre Bestandteil des Hämostasesystems



Thrombozytopenie → Störung der Hämostase

Definition Thrombozytopenie: Thrombozyten < 150.000/µl

Auftreten von petechialen Haut und Schleimhautblutungen bei

Werten < 40.000 – 50.000/µl

Cines DB, N Engl J Med 2002





Übersicht







ÄTIOLOGIE DER THROMBOZYTOPENIE

Primär kongenital Sekundär bei Erkrankungen des Knochenmarks mit Verdrängung der Megakaryo- und Thrombopoiese

Kongenital Fanconi-Syndrom Wiskott-Aldrich-Syndrom May-Hegglin-Anomalie Amegakaryozytäre Thrombozytopenie (TAR-Syndrom) Hereditäre Thrombozytopenien mit Nierenerkrankungen Alport-Syndrom Epstein.Syndrom Fechtner-Syndrom Hereditäre Thrombozytopenien ohne Organanomalien Montreal-Platelet-Syndrom Sebastian-Platelet-Syndrom Mediterrane Makrozytopenie

Verbrauch

Synthese

Erworben Amegakaryozytäre Thrombozytopenie Knochenmarksinfiltration (Leukämien, Karzinome, Maligne Lymphome) Knochenmarksschädigung (Medik., Ionisierende Strahlen, Toxine, Alkohol) Virale Infektion der Megakaryozyten Verdrängungsmyelopathie (Lipidspeicherkrankheiten, Osteomyelofibrose Osteomyelosklerose) Megakaryozytäre Thrombozytopenie (ineffektive Megakaryozytopoese) Mangelzustände (Folsäure-, Eisen-, Vitamin B12-Mangel) Akuter u. chronischer Alkoholabusus Zyklische Thrombozytopenie bei chron. Niereninsuffizienz bei paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie

Bildungsstörungen

Courtesy of Katharina Schallmoser

ÄTIOLOGIE DER THROMBOZYTOPENIE

Erhöhter Verbrauch bei Blutungen Immunmediierte Aktivierung und Abbau Verteilungsstörung bei Splenomegalie

Erworben

Nicht immunologisch bedingt Splenomegalie Hämorrhagie mit massiver Bluttransfusion Infektionen bei DIC und Verbrauchskoagulopathie mechanisch (künstl. Herzklappen, extrakorporaler Kreislauf) ausgedehnte operative Eingriffe Heparin-assoziierte Thrombozytopenie Hämangiome, arteriovenöse Anastomosen Hypothermie Weichteiltrauma Venöse Stase Thrombotische Mikroangiopathien (TTP, HUS, HELLP-Syndrom) Immunologisch bedingt Akute postinfektiöse oder chronische ITP Medikamentös-allergisch Heparin-induzierte Thrombozytopenie Refraktärzustand bei Thrombozytentransfusionen TP nach Antilymphozytenglobulintherapie Posttransfusionelle Purpura Evans-Syndrom (Autoimmun-Bizytopenie) Infektionsassoziierte Immunthrombozytopenie (HIV, HCV, H. pylori)

Verbrauch

Synthese

Kongenital

Nicht immunologisch bedingt bei Mb. hämolyticus neonatorum Unreife des Neugeborenen Nierenvenenthrombose bei liegendem Umbilikalvenenkatheter Infektionen (Röteln, Zytomegalie, HIV der Mutter) Kasabach-Meritt-Syndrom Immunologisch bedingt Mütterliche ITP Fetale/Neonatale Alloimmunthrombozytopenie (F/NAIT)


• Typ I Antigene (auf Thrombozyten, anderen Blutzellen und auf

Gewebezellen nachweisbar):

ABH-Blutgruppenantigene

HLA-Antigene der Klasse I

• Typ II Antigene = plättchenspezifische Antigene = Human

Platelet Antigens (HPA) (typisch für Thrombozyten und

Megakaryozyten, genetisch determinierte molekulare

Varianten von Glykoproteinen auf der Plättchenmembran)



Thrombozyten - Antigene



Human Platelet Antigens (HPA)

HPA Antigene – genetisch determinierte molekulare Varianten von Glykoproteinen auf der Plättchenoberfläche

Adaptiert von Arnold DM et al., Transf Med Rev 2008




www.transfusionguidelines.org.uk

• 6 diallele Antigensysteme (HPA 1 - 5, HPA 15) : „a“ für das hochfrequente Allel, „b“ für das antithetische niedrigfrequente Allel

• Niedrigfrequente Antigene

bisher publizierte HPAs:

http://www.transfusionguidelines.org.uk/



Thrombozyten - Antikörper

HLA Klasse I Antigene


Bei Inkompatibiltäten im Rahmen von

Transfusionen

Transplantationen

Schwangerschaften

Bildung von thrombozytären Alloantikörperbildung

mit ev. immunologischen Thrombozytopenien



Übersicht









Nachweismethoden für thrombozytäre Antikörper

• ELISA Serum wird gegen rekombinante Plättchen Antigene (GPIIb/IIIa HPA 1a/b, HPA 2a/b, HPA 3a/b, GPIa/IIa, HPA 4a/b, HPA 5a/b, GPIb/IX, GPIV) und gegen HLA I Antigene aufgetragen, Sichtbarmachen ev. gebundener Antikörper durch enzymatisch ausgelöste Farbreaktion

• Festphasen – Immunoassay Serum wird gegen Plättchenmembranen der BG O mit bekannten HLA - A, und - B Antigenen und HPA Antigenen aufgetragen, Sichtbarmachen ev. gebundener Antikörper durch Aufbringen von mit Anti-IgG gecoateten Indikatorerythrozyten

• Thrombozyten - Crossmatch als „Kreuzprobe“ – Festphasen-Immunoassay, Thrombozyten der zu testenden Konzentrate werden vorgelegt



Nachweismethoden für thrombozytäre Antikörper

• MAIPA (Monoclonal Antibody-specific Immobilisation of Platelet

Antigens)

• Durchflußzytometrische Testverfahren zum Nachweis von Anti-

HLA und plättchenspezifischer Antikörper

• Lymphozytotoxischer Test (LCT) für HLA-Klasse-I-Antikörper

• ELISA (Screening und Differenzierung v. HLA-Klasse-I-Antikörper)



Übersicht









Auswirkungen von thrombozytären Antikörpern → Refraktärität auf Thrombozytenkonzentrate

Definition der Refraktärität: mindestens zweimaliges Ausbleiben eines adäquaten Thrombozytenanstieges nach Transfusion einer ausreichenden Menge ABO-kompatibler, möglichst frischer Thrombozyten. Beurteilung des Transfusionserfolges mittels Inkrement (Plättchenanstieg nach Transfusion) bzw. Berechnung des korrigierten Inkrements (CCI):

CCI = Inkrement (x109/l) x Körperoberfläche (m2)

Anzahl der transf. Plt (x1011)



Welche CCI Werte sind unzureichend?

CCI < 7.500/µl 1 Stunde posttransfusionell

CCI < 5.000/µl 24 Stunde posttransfusionell

Refraktärität auf Thrombozytentransfusionen

Pavenski K et al., Tissue Antigens 2012



Ursachen für Refraktärität auf Pättchentransfusionen

Pavenski K et al., Tissue Antigens 2012



Wie häufig findet man thrombozytäre Antikörper bei refraktären Patienten

Nachweis thrombozytärer Ak

bei 113/252 (44.8%) der

refraktären Patienten:

108/252 (42.9%) HLA Klasse I

Antikörper

20/252 (8%) HPA Antikörper

Eigene Anforderung mit Zuweisung Refraktärität n = 13 (Zeitraum 2008 – 2011)

7/13 keine thrombozytären Antikörper nachweisbar

6/13 (46%) HLA Klasse I Antikörper nachweisbar (davon 1 Patient zusätzlich Antikörper gegen thrombozytäre Glykoproteinkomplexe)



• Behandlung der nicht immunologischen Ursachen

• Wenn Immunisierung nachgewiesen ist, dann Versorgung mit

kompatiblen Thrombozytenkonzentraten:

Versorgung von Thrombozytenrefraktären Patienten

3 Strategien:

• HLA-matching (HLA - A und - B)

• Crossmatching

• Vermeidung der Antigene gegen die der Patient

sensibilisiert ist

Hod et al., British Journal of Haematology, 2008



1. A match: alle 4 A und B Loci sind ident

2. BU match: der Spender hat keine Allele die dem Empfänger

fehlen aufgrund von homozygoten Allelen beim Spender

3. BX match: eine kreuzreaktive HLA-A oder -B Inkompatibilität

4. C match: der Spender hat eine nicht kreuzreaktive

Inkompatibiltät

5. D match: der Spender hat zwei oder mehr kreuzreaktive

Inkompatibiltäten

Übereinstimmungsgrade des HLA - matches bei Thrombozytentransfusionen

→ Korrelation zwischen Match Grad und CCI

Moroff et al., 1992



• Crossmatching:

Der Pool an Spendern kann enorm erweitert werden da auch HLA

match Grad C oder D Spender im Crossmatch negativ sein können

und damit für die Versorgung in Frage kommen

• Suche nach Antigen - negativen Spendern:

Wenn beim Patienten spezifische Antikörper identifiziert wurden,

sucht man solche Spender denen die korrespondierenden Antigene

fehlen → weitere Erhöhung der Spenderanzahl

Versorgung von Thrombozytenrefraktären Patienten

Kooperation zwischen behandelndem Arzt und Transfusionsmediziner



Figure (Fig) 1. Clinical course of the patient, showing plt counts, plt concentrates

(continuous arrows) and erythrocyte transfusions, plt platelet

Thrombozytenrefratärität und Beeinträchtigung der Thrombopoese durch Anti-HPA-1a nach allogener HSCT

• 52 jähriger männl. Patient

• Diagnose: Multiples Myelom

• hämatopoetische Stammzellen vom HLA-A,-B,-C,-DR identen Bruder

• nach nicht myeloablativer Chemotherapie

• Engraftment der Erythrozyten und Leukozyten am Tag 12

• kontinuierlichen Abfall der Plättchen



→ Nachweis von HPA-1a Antikörpern und HLA I Antikörpern zum

Zeitpunkt der Thrombozytopenie

Anti-HPA-1a nach allogener Stammzell-Transplantation



HPA -1bb, -2aa, -3ab, -5aa

HPA -1ab, -2aa, -3aa, -5aa

HPA -1ab, -2aa, -3aa, -5aa

Control (Contr.) bands

Specific (Spec.) bands

Contr. bands

Spec. bands

Contr. bands

Spec. bands

HPA Genotypisierung des

Patienten vor der

Transplantation


Spenders


Patienten 14 Tage nach

der Transplantation

→ HPA-1a Antikörper wurden von Empfänger-Zellen gebildet und

beeinträchtigte die HPA-1a positive Spenderthrombopoese

Anti-HPA-1a nach allogener Stammzell-Transplantation









Übersicht



Fetale / Neonatale Alloimmunthrombozytopenien (F/NAIT)

• Isolierte Antikörperbedingte Thrombozytopenie des Fetus oder

Neugeborenen mit petechialen Blutungen

• Milde Verlaufsformen bleiben oft unentdeckt

• Häufigkeit 1 : 1.500 – 1 : 5000 aller Neugeborenen

• In 50% ist bereits die erste Schwangerschaft betroffen

Wenn ein Kind betroffen ist, dann beinahe 100% Risiko

für eine NAIT beim nächsten inkompatiblen Kind

Komplikation: Auftreten von intrazerebralen Blutungen

bei 10% der betroffenen Kinder (davon 10% mit letalem

Ausgang und 20% mit neurologischen

Folgeerkrankungen)



Pathogenese der F/NAIT

• Ab der 16. SSW sind fetale Thrombozytenantigene nachweisbar

• fetaler Plättchen treten in den mütterlichen Kreislauf über

• Bei Inkompatibilität der mütterlichen HPAs und der vom Vater

vererbten fetalen HPAs kann es zu einer Alloimmunisierung der

Mutter kommen

• Mütterliche IgG Antikörper gegen HPA Antigene des Feten

gelangen in den fetalen Kreislauf

• Fc-mediierter Thrombozytenabbau im fetalen RES

→ Fetale / neonatale Immunthrombozytopenie

SPEKTRUM HPA-SPEZIFISCHER AK BEI F/NAIT

HPA-spezifische Ak bei

1162 (31%) von 3743 Müttern mit

Verdacht auf NAIT

nachgewiesen (1990 – 2002).

Davoren A. et al., Transfusion 2004 Courtesy of Katharina Schallmoser

DIAGNOSE DER NAIT

• Klinische Verdachtsdiagnose

• Ev. positive Anamnese früherer SS

Testung auf thrombozytäre Alloantikörper der Mutter

HPA-Genotypisierung der Eltern und des Kindes


Zwei mögliche Ansätze:

• Screening in der Schwangerschaft für HPA-1bb Genotypus

und konsekutiv für Anti-HPA-1a Antikörper

nur in ~ 80% kausal für F/NAIT

• Screening der Neugeborenen für Thrombozytopenie

(Blutbild aus NS-Blut)

nur postnatale Diagnose

SCREENING FÜR F/NAIT




Thrombozytenbestimmung von 1929 EDTA - Nabelschnurblutproben

innerhalb 24 Stunden nach der Geburt am automatischen

Blutbildautomat (Sysmex) (Oktober 2003 bis Februar 2005)

744 Proben ausgeschlossen aufgrund von

Koagel n = 146

Plättchenaggregate n = 596

zu geringes Probenvolumen n = 10

Evaluierung der F/NAIT Frequenz in Graz



1185 Proben wurden ausgewertet 1130 Proben mit Plt > über 150.000/µl 40 Proben mit Plt 100.000 – 149.000/µl

Anamnese: keine Blutungssymptomatik >

15 Proben mit Plt < 100.000/µl:

Leuco (x10E3/µl) Hb (g/dl) Plt (x10E3/µl) MPV (fl)

Median (range) 6,4 (2,2-21,3) 15,4 (11,8-18,3) 62,0 (5,0-92,0) 11,6 (10,0-12,8)

12 NG: Kapilläre BB-Kontrolle o.B., keine Blutungsneigung.

1 NG: Sepsis, daher thrombozytopenisch

1 NG: Thrombozytopenie, Antikörperscreening negativ, kein Genotypenmismatch

Evaluierung der F/NAIT Frequenz in Graz



Männl., 3250g, 51cm Plt Zahl im NS-Blut 10.000/µl, kapilläre Kontrolle 82.000/µl, Petechien Anamnese: Mutter D.M., 39a, 4 Gravida, Spontangeburt in 40.SSW Frühere SS komplikationslos, Autoimmunthyreoiditis, normale Plt-Werte, keine Medikamente → Testung auf mütterliche thrombozytäre Alloantikörper

→ Anti-HPA-1a im mütterlichen Serum nachweisbar Genotypus: Mutter HPA-1bb Vater HPA-1ab Plt-Wert des NG am Tag 3: ~ 200.000/µl; Milder selbst limitierender Verlauf ohne Therapie, aber erhöhtes Risiko in weiterer SS!

NAIT in 1 von 1185 NS-Proben 0,08%

Neugeborenes D.J., geb. 20.04.2004



NAIT durch Anti-HPA-3a

NG, männl., 38.SSW, I Gravid

Petechien, Plt 9.000/µl, keine Entzündungs- od. Infektionsmarker, Verdacht auf

NAIT

Thrombozytenkonzentrat HPA-1bb transfundiert + IVIG Plt 119.000/µl

Genotypisierung Mutter HPA-1ab,-2aa,-3bb,-4aa,-5aa,-15bb

Neugeb. HPA-1ab,-2aa,-3ab,-4aa,-5aa,-15bb

Tag 2: Plt ↓ 19.000/µl

Thrombozytenkonzentrat HPA-3bb transfundiert Plt 106.000/µl



NAIT durch Anti-HPA-3a

Serologische HPA-Antikörperabklärung: Anti-HPA-3a nur in Assays mit intakten Plt-Membranen (Solid-Phase-Assays) direkt post partum und bis 6 Monate danach nachweisbar, ELISA und MAIPA negativ.



Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

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