Tierärztliche Hochschule Hannover · cm. Das Pankreas liegt sekundär retroperitoneal, wobei der...
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Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchung der Auswirkung von Mepazin und Biperiden hinsichtlich extrapyramidal-motorischer Störungen im immundefizienten Mausmodell in der Therapie des humanen Pankreaskarzinoms INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Nadine Scholz geb. Wenzel Lüneburg Hannover 2016
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung der Auswirkung von Mepazin und
Biperiden hinsichtlich extrapyramidal-motorischer
Störungen im immundefizienten Mausmodell in der
Therapie des humanen Pankreaskarzinoms
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Nadine Scholz geb. Wenzel
Lüneburg
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. P. Steinberg
Institut für Lebensmitteltoxikologie und
Chemische Analytik
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. med. Prof. h.c. Dr. h.c. J.R. Izbicki
Klinik und Poliklinik für Allgemein-, Visceral- und
Thoraxchirurgie
Zentrum für Operative Medizin
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
1. Gutachter : Prof. Dr. J.R. Izbicki
Prof. Dr. P. Steinberg
2. Gutachter: Prof. Dr. G. Bicker
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2016
Meinen Eltern in Liebe und Dankbarkeit
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ....................................................................................................... 9
2 LITERATURÜBERSICHT .............................. ................................................... 12
2.1 Das Pankreaskarzinom in der Humanmedizin ...... .................................. 12
2.1.1 Epidemiologie........................................................................................ 12
2.1.2 Anatomie und Histologie ....................................................................... 13
2.1.3 Ätiologie und Pathogenese ................................................................... 15
2.1.4 Diagnostik des Pankreaskarzinoms ...................................................... 17
2.1.5 Pharmakologische Therapie des Pankreaskarzinoms .......................... 19
2.1.6 Chirurgische Therapie des Pankreaskarzinoms .................................... 25
2.2 Das Pankreaskarzinom in der Veterinärmedizin .. ................................... 26
2.2.1 Epidemiologie........................................................................................ 26
2.2.2 Anatomie und Histologie ....................................................................... 28
2.2.3 Ätiologie und Pathogenese ................................................................... 30
2.2.4 Diagnostik des Pankreaskarzinoms ...................................................... 33
2.2.5 Pharmakologische Therapie des Pankreaskarzinoms .......................... 35
2.2.6 Chirurgische Therapie des Pankreaskarzinoms .................................... 38
2.3 Neuroleptika................................... ............................................................ 39
2.3.1 Neuroleptika in der Human- und Veterinärmedizin ............................... 39
2.3.2 Wirkung und Nebenwirkung von Neuroleptika im Hinblick auf extrapyramidal-motorische Störungen ........................................................... 44
2.3.3 Das Phenothiazinderivat Mepazin ......................................................... 53
2.3.4 Das Anticholinergikum Biperiden in der Therapie Neuroleptika-induzierter EPMS ............................................................................................................. 55
2.3.5 Die Paracaspase MALT1 als therapeutisches Ziel des Phenothiazinderivates Mepazin ..................................................................... 58
2.3.6 Einführung in die Vorarbeiten der Arbeitsgruppe um Herrn Dr. El Gammal in der allgemeinchirurgischen Forschung des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf ...................................................................................................... 64
2.4 Verhaltensanalysen ............................ ....................................................... 65
2.4.1 Der Spontaneous Activity in the Cylinder-Test ...................................... 66
2.4.2 Der Challenging Beam Traversal-Test .................................................. 67
2.4.3 Der Adhesive Removal-Test ................................................................. 69
2.5 Die Bedeutung des Doppelknockout Pfp-/-/Rag2-/--Mausmodell ............ 70
2.6 Das Xenograftmodell in onkologischen in vivo Versuchen................... 71
2.7 Medikamentenapplikation und Injektionstechnik . .................................. 73
2.8 Ziele der vorliegenden Arbeit ................. .................................................. 74
3 MATERIAL UND METHODEN ........................... ............................................... 76
3.1 Materialien.................................... .............................................................. 76
3.1.1 Injektionslösungen und Substanzen ...................................................... 76
3.1.2 Verbrauchsmaterialien .......................................................................... 77
3.1.3 Geräte und Software ............................................................................. 78
3.1.4 Mausstamm .......................................................................................... 79
3.1.5 Tierhaltung ............................................................................................ 79
3.1.6 Genehmigung........................................................................................ 80
3.2 Methoden ...................................... ............................................................. 81
3.2.1 Zellbiologische Methoden ..................................................................... 81
3.2.1.1 Die humane Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 ................................. 81
3.2.1.2 Kultivierung eukaryotischer Zellen ..................................................... 81
3.2.1.3 Passagieren von Zellen mittels Trypsin-EDTA-Lösung ...................... 81
3.2.1.4 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Zählkammer .......................... 82
3.3 Tierversuche .................................. ............................................................ 82
3.3.1 Lösen des Mepazin-Hydrochlorids ........................................................ 82
3.3.2 Tumorinduktion durch subkutane Injektion ............................................ 83
3.3.3 Intraperitoneale Medikamentenapplikation von Mepazin, Biperiden und der Mepazin-Biperiden-Kombination .............................................................. 83
3.3.4 Markierung ............................................................................................ 84
3.3.5 Körpergewichtsbestimmung und Messen der Tumorgröße ................... 84
3.4 Verhaltensanalysen ............................ ....................................................... 85
3.4.1 Zylinder-Test ......................................................................................... 85
3.4.2 Auswertung des Zylinder-Tests ............................................................. 87
3.4.3 Beam-Test ............................................................................................ 87
3.4.4 Auswertung des Beam-Tests ................................................................ 90
3.4.5 Adhesive Removal-Test ........................................................................ 90
3.4.6 Auswertung des Adhesive Removal-Tests ............................................ 92
3.4.7 Versuchsabbruch mittels kardialer Punktion in der final anästhetisierten Maus .............................................................................................................. 92
3.5 Statistische Auswertung ....................... ................................................... 93
4 ERGEBNISSE ................................................................................................... 96
4.1 Zylinder-Test ................................. ............................................................. 96
4.1.1 Analyse der Anzahl der Aufrichtungen im Zylinder-Test ....................... 96
4.1.2 Analyse der Anzahl der Vorderfußschritte im Zylinder-Test .................. 99
4.1.3 Analyse der Anzahl der Hinterfußschritte im Zylinder-Test ................. 102
4.1.4 Analyse der Dauer der Pflegezeit im Zylinder-Test ............................. 105
4.2 Beam-Test ..................................... ........................................................... 107
4.2.1 Analyse der Schrittanzahl des Beam-Tests ........................................ 107
4.2.2 Analyse der Fehleranzahl des Beam-Tests ........................................ 110
4.2.3 Analyse der Zeit im Beam-Test ........................................................... 113
4.3 Adhesive Removal-Test ......................... ................................................. 117
5 DISKUSSION .................................................................................................. 120
5.1 Diskussion der Methodik ....................... ................................................. 120
5.2 Diskussion der Ergebnisse des Zylinder-Tests .. .................................. 129
5.3 Diskussion der Ergebnisse des Beam-Tests ...... .................................. 131
5.4 Diskussion der Ergebnisse des Adhesive Removal- Tests .................. 134
5.5 Abschließende Betrachtung und Ausblick ........ ................................... 135
6 ZUSAMMENFASSUNG ................................. ................................................. 137
7 SUMMARY ...................................................................................................... 139
8 LITERATURVERZEICHNIS ............................ ................................................ 141
9 ANHANG .......................................... ............................................................... 170
9.1 Abbruchkriterien .............................. ....................................................... 170
9.2 Abbildungsverzeichnis ......................... .................................................. 172
9.3 Tabellenverzeichnis ........................... ..................................................... 174
9.4 Abkürzungsverzeichnis ......................... ................................................. 175
10 DANKSAGUNG ..................................... ....................................................... 176
9
1 EINLEITUNG
In Deutschland erkranken jährlich mehr als 15.000 Menschen an einem duktalen
Pankreaskarzinom (SEUFFERLEIN et al. 2014), wobei sich die Hauptzahl der
Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose bereits in einem weit fortgeschrittenen
Erkrankungsstadium befindet. Dies ist einer der Gründe, warum die Inzidenz des
Pankreaskarzinoms sehr nahe bei der jährlichen Mortalitätsrate liegt. Ein
Langzeitüberleben stellt die Ausnahme dar. Die relative 5-Jahres-Überlebensrate
beim Pankreaskarzinom ist in Deutschland die niedrigste Überlebensrate unter allen
Krebserkrankungen (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2015). Über die Jahre wurden
viele Patienten in klinische Studien eingeschlossen, ohne dass sich daraus ein
neues Therapiekonzept ergeben hat (CHIEN et al. 2015). Neue Therapiestrategien,
die im Gesamtüberleben einen Vorteil gegenüber dem Therapiestandard
Gemcitabin zeigen, werden dringend benötigt.
Einer von mehreren Ansätzen ist die Induktion von Apoptose in Tumoren. Die
Arbeitsgruppe um Herrn Dr. med. Alexander T. El Gammal in der
allgemeinchirurgischen Forschung des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf
(UKE) hat anhand von in vitro Experimenten zeigen können, dass eine
Apoptoseinduktion bei Pankreaskarzinomzellen MALT1-abhängig ist.
Diese MALT1-Abhängigkeit haben auch NAGEL et al. (2012) in vitro bei diffus
großzelligen Lymphomen des Subtyps ABC (activated-B-cell-like diffuse large B-
cell lymphoma) gezeigt. Ein Wirkstoffscreening zur Identifikation von MALT1-
Hemmstoffen führte zu der Stoffklasse der Phenothiazine. Mepazin zeigte hier im
Vergleich zu anderen Phenothiazinen das größte inhibitorische Potential (NAGEL
et al. 2012).
Des Weiteren konnte die Arbeitsgruppe am UKE zeigen, dass Mepazin als MALT1-
Inhibitor zu einer Proliferationshemmung und Apoptosesteigerung in humanen
Pankreaskarzinomzellen führt. Inwieweit eine Behandlung durch Mepazin als
Therapieoption im humanen Pankreaskarzinom in Frage kommt, soll durch in vivo
10
Versuche an einem immundefizienten Mausmodell in der vorliegenden Arbeit
geklärt werden.
Mepazin ist ein klassisches Neuroleptikum aus der Gruppe der
Phenothiazinderivate, welche als Nebenwirkung extrapyramidal-motorische
Störungen (EPMS) verursachen können (ALTHAUS 2010; MUTSCHLER 2012).
Eine Therapie der Neuroleptika-induzierten EPMS besteht in der Gabe von
Biperiden (FRÖLICH et al. 2013).
Die in vitro Vorversuche der Arbeitsgruppe am UKE zeigten des Weiteren, dass
Biperiden aufgrund ähnlicher Struktur-Wirkungsbeziehungen wie Mepazin an die
allosterische MALT1-inhibierende Tasche bindet und ebenfalls einen
antiproliferativen Effekt hat (EL GAMMAL et al. (2015) und unveröffentlichte Daten).
Hauptaugenmerk dieser Arbeit ist die Auswirkung der Therapie mit Mepazin
hinsichtlich der möglichen Ausbildung von EPMS und die Antagonisierbarkeit mit
Biperiden sowie die Auswirkung einer Kombinationstherapie aus beiden.
Mepazin kam in den 1950er Jahren als Neuroleptikum für die Behandlung der
Schizophrenie unter dem Handelsnamen „Pacatal“ auf den Markt (FELDMAN
1957). Aufgrund fehlender Effektivität und der Neuentwicklung besser wirksamer
Neuroleptika wurde Mepazin wieder vom Markt genommen (KLEIN 2007). Die
Studienlage zu Mepazin hinsichtlich EPMS ist zum einen dadurch sehr veraltet, zum
anderen werden in einer potentiellen antitumoralen Therapie des
Pankreaskarzinoms andere Dosierungen eingesetzt, als es zur Behandlung der
Schizophrenie vor über 60 Jahren üblich war.
Neuroleptikainduzierte EPMS können den Alltag und die Lebensqualität von
Patienten erheblich einschränken (COUREY 2007). Dies kann in der Folge
Auswirkungen auf die sogenannte „Compliance“, die Therapietreue der Patienten
haben.
Der potentielle Einsatz von Mepazin in der Therapie des Pankreaskarzinoms setzt
für einen Erfolg eine hohe Compliance voraus. Dafür ist es wichtig, das Vorkommen
von EPMS unter Mepazintherapie in in vivo Versuchen abzuschätzen.
11
In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen einer Mepazintherapie, einer
Biperidentherapie und einer Mepazin-Biperiden-Kombinationstherapie an einem
Mäusekollektiv mit bekannten und etablierten Verhaltenstests quantitativ erfasst.
Neoplasien des Pankreas sind in der Veterinärmedizin im Vergleich zu anderen
Krebsarten zwar selten, es existieren aber gut dokumentierte Fälle. Die Prognose
für Tiere mit Adenokarzinom des Pankreas ist schlecht, da auch hier der Tumor
äußerst aggressiv wächst und auf eine Therapie kaum anspricht (NELSON et al.
2010). Dies unterstreicht somit die Notwendigkeit, dass genau wie in der
Humanmedizin auch in der Veterinärmedizin dringend neue therapeutische Ansätze
gefunden werden müssen.
12
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Das Pankreaskarzinom in der Humanmedizin
2.1.1 Epidemiologie
In Deutschland erkranken jährlich etwa 16.700 Menschen an einem
Pankreaskarzinom (SEUFFERLEIN et al. 2014; ROBERT-KOCH-INSTITUT 2015).
Wie auch in den USA ist in Deutschland das Pankreaskarzinom die vierthäufigste
krebsbedingte Todesursache mit 16.100 Todesfällen im Jahr 2012 (ROBERT-
KOCH-INSTITUT 2015). Dies zeigt, wie eng Inzidenz und jährliche Mortalitätsrate
beieinander liegen (SEUFFERLEIN et al. 2014; TUMORREGISTER MÜNCHEN
2015). Die Inzidenz der Erkrankung ist stark ansteigend und wird Schätzungen
zufolge im Jahre 2020 die zweithäufigste durch Krebs bedingte Todesursache in
den USA sein (JEMAL et al. 2011; FARRELL et al. 2014). Diese Schätzung muss
aber vor dem Hintergrund der verlängerten Lebenserwartung betrachtet werden.
Das Alter ist einer der Hauptrisikofaktoren um an Bauchspeicheldrüsenkrebs zu
erkranken. So ist mit steigender Lebenserwartung auch ein Anstieg der
Erkrankungsrate zu erwarten (LOWENFELS et al. 2005). CHIEN et al. (2015)
erwarten für das Jahr 2015 in den USA mehr als 45.000 Neuerkrankungen und mehr
als 38.000 Todesfälle im Zusammenhang mit Bauchspeicheldrüsenkrebs.
Achtzig Prozent der Erkrankungsfälle treten zwischen dem 60. und 80. Lebensjahr
auf, Erkrankungen bei Personen jünger als 45 Jahre sind selten (SPALDING et al.
2011). Das mittlere Erkrankungsalter für Männer liegt bei 71Jahren, bei Frauen sind
es 75 Jahre (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2015). Eine Geschlechterpräferenz ist laut
SEUFFERLEIN et al. (2014) nicht zu beobachten, während andere Autoren eine
Verteilung des Geschlechterverhältnisses von etwas über 54 % Frauen zu 46 %
Männern sehen (SAHORA et al. 2008). SPALDING et al. (2011) berichten, dass
weltweit die Inzidenz bei Männern höher ist als bei Frauen und insgesamt ein
Geschlechterverhältnis von Männern zu Frauen von 1,5:1 resultiert.
13
Europaweit ist das Pankreaskarzinom die siebthäufigste Krebsart und geschätzt
verantwortlich für 2,8 % der krebsbedingten Todesfälle bei Männern und für 3,2 %
bei den Frauen im Jahr 2012 in den 27 Mitgliedstaaten der Europäischen Union
(EU) (SEUFFERLEIN et al. 2012). Es ist dabei die fünfthäufigste krebsbedingte
Todesursache mit ca. 70.000 Todesfällen pro Jahr (SEUFFERLEIN et al. 2012).
Das entspricht einem Anteil von 6,2 % aller Krebstoten in der EU in 2012.
Schätzungen zufolge wird es in naher Zukunft die vierthäufigste krebsbedingte
Todesursache europaweit sein (JEMAL et al. 2011; SEUFFERLEIN et al. 2012;
FERLAY et al. 2013).
2.1.2 Anatomie und Histologie
Die Bauchspeicheldrüse entwickelt sich aus dem embryonalen Zwölffingerdarm
(Duodenum) in Form einer ventralen und einer dorsalen Pankreasknospe. Die
ventrale Anlage rotiert um das Duodenum und verschmilzt dort mit dem dorsalen
Teil. Die dorsale Anlage bildet Körper- und Schwanzabschnitt des Pankreas, die
kleinere ventrale Anlage bildet den späteren Pankreaskopf und den hakenförmigen
Fortsatz (Processus uncinatus) (SOBOTTA et al. 2010; SCHÜNKE et al. 2015).
Bei einem erwachsenen Menschen wiegt das Pankreas 70 – 110 g, besitzt eine
Länge von ca. 15 – 20 cm, eine Breite von ca. 5 cm und eine Dicke von etwa 2 – 3
cm. Das Pankreas liegt sekundär retroperitoneal, wobei der Pankreaskopf (Caput
pancreatis) dem absteigenden Anteil des Duodenums anliegt und in den Processus
(Proc.) uncinatus übergeht. Der Proc. uncinatus umfasst die Mesenterialgefäße A.
und V. mesenterica superior. Der Kopf des Pankreas setzt sich in den Körper
(Corpus pancreatis) fort, welcher die Wirbelsäule in Höhe des 1. – 2.
Lendenwirbelkörpers überquert. Der Schwanzabschnitt (Cauda pancreatis) schließt
sich an den Pankreaskörper an und zieht an der linken Niere vorbei bis zur
Milzpforte. Der Ausführungsgang der Bauchspeicheldrüse (Ductus wirsungianus,
Ductus pankreaticus major) durchzieht die gesamte Drüse und nimmt das Sekret
des Pankreas auf. Er mündet gemeinsam mit dem Gallengang auf der Vaterschen
14
Papille (Papilla duodeni major) in den Zwölffingerdarm (BIRMINGHAM 1896;
BADGER et al. 2010; SOBOTTA et al. 2010; SCHÜNKE et al. 2015).
Die Anatomie und Lagebeziehungen des Pankreas sind in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Pankreas, Anatomie und Lagebeziehungen. Ansicht von dorsal (SOBOTTA et al. 2010).
Histologisch besteht das Pankreas aus zwei funktionell getrennten Anteilen, dem
exokrinen und dem endokrinen Teil. Achtundneunzig Prozent der Organmasse
besteht aus dem exokrinen Anteil, dessen Drüsen (Azini) die Verdauungsenyzme
produzieren, die noch als Vorstufen über den Ausführungsgang an das Darmlumen
abgegeben werden. Zu diesen Enzymen zur Eiweiß-, Kohlenhydrat- und
Fettaufspaltung gehören unter anderem Trypsinogen, Alpha-Amylase und
Pankreaslipase.
Die restlichen 2 % der Organmasse macht der sogenannte Inselapparat als
endokriner Anteil aus. Dieser besteht aus ca. einer Million inselartig im endokrinen
Pankreasgewebe verteilter Zellen, welche die Langerhans’schen Inseln (Insulae
pancreaticae) bilden. Dieses endokrine Organ ist unter anderem für die Synthese
15
und Ausschüttung der Hormone Insulin und Glukagon verantwortlich (SOBOTTA et
al. 2010; SCHÜNKE et al. 2015).
2.1.3 Ätiologie und Pathogenese
Mehr als 85 % der Tumore des Pankreas sind duktale Adenokarzinome, welche
durch maligne Transformation von Zellen des exokrinen Pankreas entstehen (LI et
al. 2004a; HEZEL et al. 2006; HIDALGO 2010; ISHIWATA 2013). Weitere, aber
seltenere Formen und ihre Häufigkeiten sind das undifferenzierte Karzinom, (ca.
4%), das adenosquamöse Karzinom (ca. 3 %), das Zystadenokarzinom (ca. 2 %)
und das Siegelringzellkarzinom mit ca. 1 %iger Häufigkeit (BRANDWEIN et al.
2001; VINCENT et al. 2011) . Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC =
Pancreatic Ductal Adenocarcinoma) wird auch als exokrines Pankreaskarzinom
bezeichnet.
Die Ätiologie des Pankreaskarzinoms gilt als komplex und multifaktoriell, wobei
Tabakkonsum und eine familiäre Prädisposition eine Hauptrolle zu spielen scheinen
(BRUNE et al. 2010; MAISONNEUVE et al. 2010). Tabakkonsum ist für ein Viertel
der Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse verantwortlich. Ergebnisse einer
Metaanalyse aus 82 Studien ergaben, dass Rauchen das Risiko für eine
Erkrankung an Bauchspeicheldrüsenkrebs um bis zu 75 % steigert, mit einem
zusätzlich erhöhten Risiko für Langzeitraucher und Kettenraucher (GALL et al.
2015). Als weitere Risikofaktoren werden Alter, Diabetes mellitus Typ 2 (GULLO
1999), Adipositas, familiäre Häufung chronischer Pankreatiden und
afroamerikanische ethnische Abstammung genannt (PETERSEN et al. 2003;
MAISONNEUVE et al. 2010; SPALDING et al. 2011; YADAV et al. 2013;
ZAMBIRINIS et al. 2013). Angenommen wird, dass eine hohe Kalorienzufuhr durch
eine fett- und fleischreiche Diät mit geringem Gemüse- und Folsäureanteil ebenso
zu einem erhöhten Risiko beiträgt wie eine Helicobacter pylori Infektion und
parodontale Erkrankungen (VINCENT et al. 2011). Zu den genetischen
Prädispositionen, die mit einem erhöhten Erkrankungsrisiko einhergehen, zählen
das familiäre Pankreaskarzinom (FPC), das Peutz-Jeghers Syndrom, die hereditäre
Pankreatitis, das hereditäre Mammakarzinom und das Lynch-Syndrom. Ca. 5-10 %
16
der Pankreaskarzinome haben eine heriditäre Ursache (SCHENK et al. 2001;
SAHORA et al. 2008; ESER et al. 2014).
Die intraduktale papillär-muzinöse Neoplasie (IPMN), die intraepitheliale Neoplasie
des Pankreas (PanIN = Pancreatic Intraepithelial Neoplasia) und die muzinös-
zystische Neoplasie (MCN = mucinous cystic neoplasms) gelten als die wichtigsten
Vorläuferläsionen des duktalen Pankreaskarzinoms. (HRUBAN et al. 2007;
GRÜTZMANN et al. 2011). PanIN werden in unterschiedliche Stadien unterteilt,
PanIn-1A, -1B, -2 und -3, wobei das Auftreten einer PanIN-3 Läsion als der
entscheidende Schritt in der Karzinogenese gilt. Die Abgrenzung von PanIN und
IPMN kann sich schwierig gestalten und eine Entwicklung von IPMN aus PanIN ist
denkbar (HEZEL et al. 2006; OTT et al. 2007; ESPOSITO et al. 2011; GRÜTZMANN
et al. 2011).
Abbildung 2 zeigt das Progressionsmodell des duktalen Pankreasadenokarzinoms
und die genetischen Alterationen.
Abbildung 2: Progressionsmodell des duktalen Pankreasadenokarzinoms mit Darstellung der genetischen Alterationen (HRUBAN et al. 2000).
Fünfundsiebzig Prozent aller duktalen Adenokarzinome treten am Pankreaskopf
auf, 15-20 % am Pankreaskörper und 5-10 % der Adenokarzinome betreffen den
Pankreasschwanz. Mehr als 90 % der duktalen Adenokarzinome zeigen genetische
Mutationen auf dem Kirsten-Rat Sarkoma Gen (KRAS Gen), wobei die
Mutationstypen G12V und G12D im Codon 12 überwiegen. Desweiteren zeigen
17
mehr als 80 % der Tumore Mutationen oder epigenetische Veränderungen auf dem
Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 2A Gen (CDKN2A). Mutationen auf dem
Tumorsuppressorgen p53 sind in mehr als 50 % der Fälle zu finden, und weitere 50
% weisen Mutationen oder homozygote Deletionen des Deleted in Pancreatic
Carcinoma locus 4/small mothers against decapentaplegic 4 Gen (DPC4/smad4)
auf (HAHN et al. 1995; VINCENT et al. 2011; SEUFFERLEIN et al. 2012; GALL et
al. 2015).
2.1.4 Diagnostik des Pankreaskarzinoms
Die Symptome des Pankreaskarzinoms sind häufig uncharakteristisch. Im
Frühstadium ist der Krebs meist symptomlos, erst nach Metastasierung und
Invasion in benachbarte Gewebe zeigen sich Symptome. Ungefähr 80 % der
Patienten mit Pankreaskarzinom befinden sich in einem bereits lokal
fortgeschrittenen Erkrankungsstadium bei Diagnosestellung (SAHORA et al. 2008;
VINCENT et al. 2011; KUNZMANN et al. 2014). Patienten mit diagnostiziertem
Pankreaskarzinom berichten über Symptome wie Oberbauchschmerzen,
Abgeschlagenheit, Gewichtsverlust, Übelkeit, Fieber und Rückenschmerzen
(BEGER et al. 2008). In etwa 10 % der Fälle tritt eine Thrombophlebitis auf
(Trousseau-Syndrom). Spezifischere Beschwerden sind ein Ikterus, ein neu
aufgetretener Diabetes mellitus oder eine Pankreatitis. Karzinome des
Pankreaskopfes haben in der Regel das Erstsymptom eines Ikterus (VINCENT et
al. 2011; WOLFGANG et al. 2013).
Bei ca. 25 % der Patienten mit Pankreaskarzinom liegt ein klinisch manifester
Diabetes mellitus vor, bei weiteren 40 % der Patienten wurde eine verminderte
Glukosetoleranz festgestellt (VINCENT et al. 2011).
Laborchemische Parameter zeigen Auffälligkeiten, wenn der Tumor den großen
Gallengang beeinträchtigt (SAHORA et al. 2008). So kommt es zu einer Erhöhung
der Werte von Serum-Bilirubin, alkalischer Phosphatase und γ-Glutamyl-
Transferase. Ein Anstieg der Pankreas-Amylase und der Pankreas-Lipase ist bei
18
Verlegungen des Pankreasganges zu beobachten (SAHORA et al. 2009). Bei
Tumorlokalisation im Bereich des Pankreaskörpers und des Pankreasschwanzes
bestehen lange keine Veränderungen im Laborbild oder es zeigen sich
unspezifische Veränderungen wie Anämie, Hyperglykämie und erhöhte Leberwerte.
Diese Werte resultieren meist aus dem das Pankreasparenchym
beeinträchtigenden Tumor oder aus einer Metastasierung in die Leber (SAHORA et
al. 2008; GALL et al. 2015).
In der Klinik wird das Carbohydrate-Antigen 19-9 (CA 19-9) als valider Tumormarker
genutzt. Eine Erhöhung des CA 19-9-Serumspiegels kann auf das Vorliegen eines
gastrointestinalen Tumors hinweisen (WU et al. 2013). Jedoch ist die Spezifität des
CA 19-9 eingeschränkt (HARSHA et al. 2009), da zum einen auch Magen-, Darm-,
Leber-, Brust- und Lungenkrebs mit einer Erhöhung dieses Wertes einhergehen
können (BHAT et al. 2012; GALL et al. 2015). Zum anderen führen auch
nichtmaligne Erkrankungen wie Pankreatitis, Leberzirrhose und
Lungenerkrankungen zu erhöhten CA 19-9-Werten (BHAT et al. 2012). Eine weitere
Einschränkung ist, dass CA 19-9 von Patienten mit dem negativen
Blutgruppenmerkmal Lewis a-/b- nicht gebildet werden kann (WU et al. 2013). Dies
betrifft etwa 7 – 10 % der Bevölkerung (SAHORA et al. 2009).
Das Ausmaß des Anstiegs des Tumormarker-Serumspiegels korreliert mit der
Tumorgröße, weshalb CA 19-9 zur Verlaufskontrolle von therapierten
Karzinompatienten eingesetzt wird. Ein Anstieg bei einem in Remission befindlichen
Patienten weist stark auf ein Rezidiv hin (SAHORA et al. 2009). Die höchste
diagnostische Sensitivität hat CA 19-9 bei einem Tumordurchmesser von > 3 cm,
sie liegt dann bei 85 – 90 %. Besitzt der Tumor einen kleineren Durchmesser als 3
cm oder ist schlecht differenziert, dann liegt die Sensitivität bei etwa 50 % (HARSHA
et al. 2009; WU et al. 2013; GALL et al. 2015). Ein weiterer serologischer
Prognosemarker ist das A Disintegrin And Metalloproteinase-9-Protein (ADAM-9),
welches in einer Studie von GRÜTZMANN et al. (2004) bei 98,3 % der von ihnen
untersuchten duktalen Pankreaskarzinome nachgewiesen wurde. Die
zytoplasmatische ADAM-9-Expression ist mit einer geringen Tumordifferenzierung
und einer verkürzten Überlebenszeit assoziiert (GRÜTZMANN et al. 2004). Das
19
Carcinoembryonale Antigen (CEA) ist ein weiterer Tumormarker, eine Erhöhung tritt
aber auch bei Erkrankungen wie Hepatitis, Pankreatitis, Leberzirrhose und Colitis
ulcerosa auf (LUNDIN et al. 1994). Es gibt gegenwärtig keinen zuverlässigen
Früherkennungstest für das Pankreaskarzinom (KLEGER et al. 2014; GALL et al.
2015).
Als weitere diagnostische Verfahren sind noch die bildgebenden Verfahren zu
nennen. Abdominaler Ultraschall wird meistens zur primären Diagnostik eingesetzt
(SAHORA et al. 2009). Zur weiterführenden Beurteilung dienen die Endoskopische
Ultraschalluntersuchung (EUS), die kontrastmittelverstärkte Multidetektor-
Computertomographie (MD-CT) und die Magnetresonanztomographie (BEGER et
al. 2008; SEUFFERLEIN et al. 2012). Letztere wird dabei oft zur nichtinvasiven
Beurteilung des Gallengang- und Pankreasgangsystems mit der Magnetresonanz-
Cholangiopankreatikographie (MRCP) kombiniert. Dabei gilt der MD-CT als
Goldstandard in der präoperativen Abklärung eines Pankreaskarzinoms (SAHORA
et al. 2009). Weitere präzisere Verfahren, wie die Endoskopische-Retrograde
Cholangiopankreatikographie (ERCP), dienen als unterstützende Untersuchung in
Abhängigkeit von Lokalisation und Tumorstadium (SAHORA et al. 2008;
SEUFFERLEIN et al. 2012; WOLFGANG et al. 2013).
2.1.5 Pharmakologische Therapie des Pankreaskarzino ms
Bei der pharmakologischen Therapie des Pankreaskarzinoms wird zwischen einer
adjuvanten Chemotherapie, welche im Anschluss an eine operative Sanierung der
Tumorerkrankung durchgeführt wird, und einer palliativen Chemotherapie, welche
bei fortgeschrittener Tumorerkrankung zur Linderung der Beschwerden und zur
Verbesserung der Lebensqualität der Patienten beiträgt, unterschieden
(SEUFFERLEIN et al. 2012). Eine neoadjuvante Therapie zielt auf eine
Verkleinerung des Tumors vor einer Operation ab (SAHORA et al. 2008).
Gemcitabin wurde 1996 in Deutschland für die Behandlung des Pankreaskarzinoms
zugelassen, davor war 5-Fluoruracil (5-FU) das Mittel der Wahl. In einer Studie von
20
BURRIS et al. (1997) zeigt sich eine Verlängerung der Gesamtüberlebenszeit und
eine Verbesserung der Lebensqualität nach einer Gemcitabin-Chemotherapie im
Vergleich zu 5-FU von einem Monat (5,6 Monate vs. 4,4 Monate, p = 0,0025). 5-FU
als Therapiemittel der Wahl geriet dadurch in den Hintergrund, kam jedoch später
in verschiedenen Studien erneut zum Einsatz. Die European Study Group for
Pancreatic Cancer (ESPAC) 1-Studie verglich Patienten, die nur operativ versorgt
wurden, mit Patienten, die nach der Operation eine adjuvante Chemotherapie mit
einer Kombination aus 5-FU und Folinsäure bekamen. Nach fünf Jahren lebten noch
21 % der Patienten, die die adjuvante Chemotherapie zusätzlich zur Operation
erhalten hatten und nur 8 % der Patienten, die nur chirurgisch versorgt wurden
(SAHORA et al. 2008; VALLE et al. 2014). Zu einem ähnlichen Ergebnis kam die
Charité Onkologie-001 (CONKO-001)- Studie. Diese Studie untersuchte sowohl das
krankheitsfreie Überleben als auch das Gesamtüberleben von Patienten nach
Tumorresektion, welche eine adjuvante Gemcitabintherapie erhielten, im Vergleich
zu einer Beobachtungsgruppe (SIEGMUND-SCHULTZE 2014). Es zeigte sich ein
signifikanter Vorteil der Gemcitabingruppe sowohl hinsichtlich des rezidivfreien
Überlebens (13,9 vs. 6,9 Monate, p < 0,001) als auch hinsichtlich einer signifikant
verbesserten 5-Jahres-Überlebensrate (21 % Gemcitabin vs. 9 % nicht adjuvant
behandelt, p < 0,005) (OETTLE et al. 2007; SAHORA et al. 2009; PAULSON et al.
2013).
NEOPTOLEMOS et al. (2010) konnten in der ESPAC3-Studie zeigen, dass eine
adjuvante Chemotherapie mit Gemcitabin bei Patienten mit resektablem
Pankreaskarzinom eine vergleichbare Wirkung hatte wie eine Kombinationstherapie
mit 5-FU und Folinsäure (medianes Überleben: 5-FU/Folinsäure 23,0 Monate vs.
Gemcitabin 23,6 Monate, p = 0,39), jedoch mit geringeren Nebenwirkungen. Auch
das mediane progressionsfreie Überleben war mit rund 14 Monaten bei beiden
Therapieformen vergleichbar. REGINE et al. (2008) verglichen in der Radiation
Therapy Oncology Group Studie (RTOG 9704-Studie) die zusätzliche Gabe von
Gemcitabin zu einem 5-FU-basierten adjuvanten Radiochemotherapieprotokoll.
Dabei wurden die beiden Zytostatika Gemcitabin und 5-FU postoperativ jeweils vor
und nach einer kombinierten Radiochemotherapie mit 5-FU appliziert. Es konnte ein
21
Unterschied im medianen Überleben für Patienten mit Tumoren im Pankreaskopf
gezeigt werden (20,5 Monate Gemcitabin vs. 16,9 Monate 5-FU). Für Patienten mit
Tumoren des Pankreaskorpus oder der Kauda bestand nach multivariater Analyse
ein Trend zu längeren Überlebenszeiten unter Gemcitabintherapie (REGINE et al.
2008).
Die etablierte Chemotherapie bestand somit lange aus entweder einer Gemcitabin-
oder 5-Fluoruracil-Monotherapie oder aus einer der beiden genannten
Komponenten in Kombination mit einer zweiten zytotoxischen Substanz wie
Capecitabin, Oxaliplatin oder Cisplatin. Aber auch diese Therapiekonzepte
verlängerten die Überlebenszeit nur geringfügig. Sechs Monate
Gesamtüberlebenszeit nach der Gemcitabinmonotherapie stehen 7,5 Monaten
nach der Gemcitabin-Cisplatin-Kombinationstherapie gegenüber (HEINEMANN et
al. 2006; CHIEN et al. 2015). Aktuelle Empfehlungen in der adjuvanten Behandlung
sind Gemcitabin und Fluoruoracil, die hinsichtlich der Fünf-Jahres-Überlebensrate
(Gemcitabin: 22,5 % vs. Fluoruoracil: 21 % vs. 9 % ohne adjuvante Therapie) als
gleichwertig eingestuft werden können (KLEGER et al. 2014). In Patienten mit
fortgeschrittenem Pankreaskarzinom zeigt sich nach palliativer Behandlung mit
Gemcitabin eine geringe Verbesserung der Überlebensrate im Vergleich zu mit 5-
FU behandelten Patienten (mediane Überlebenszeit 5,65 Monate versus 4,41
Monate, p = 0,0025) und eine Verbesserung in der Linderung der
krankheitsassoziierten Symptome (WONG et al. 2009).
Die Kombination aus dem Epidermal Growth Factor Receptor- Inhibitor (EGFR)
Erlotinib und Gemcitabin führte zu einer geringen Verbesserung der Überlebenszeit
(Erlotinib/Gemcitabin 6,24 vs. 5,91 Monate medianes Überleben Gemcitabin/
Placebo). Deutlich bessere Überlebenszeiten wurden bei Patienten beobachtet, die
als Nebenwirkung einen Akne-ähnlichen Hautausschlag aufwiesen. Für diese
Patienten betrug das mediane Überleben 10,5 Monate im Vergleich zu 5,3 Monaten
bei Ausbleiben des Hautausschlages. Die Ursache des Hautausschlages ist bisher
noch nicht geklärt und Gegenstand aktueller Forschung (KLEGER et al. 2014).
Deshalb sollte eine Erlotinibtherapie nach acht Wochen beendet werden, wenn kein
22
charakteristischer Hautausschlag auftritt (PAULSON et al. 2013; KLEGER et al.
2014; VALSECCHI et al. 2014).
Das FOLFIRINOX-Protokoll ist eine Gemcitabin-freie Option bei Patienten mit
Metastasen. Behandlungen mit dem FOLFIRINOX Schema, bestehend aus 5-FU,
Leucovorin, Irinotecan und Oxaliplatin, zeigten sowohl eine verlängerte mediane
Überlebenszeit von 11,1 vs. 6,8 Monate im Vergleich zu Gemcitabin als auch eine
verlängerte mediane progressionsfreie Überlebenszeit (6,4 Monate vs. 3,3 Monate).
Die Therapie mit FOLFIRINOX hat jedoch mehr Nebenwirkungen und ist deutlich
toxischer als eine Gemcitabin-Monotherapie. Fünfundvierzig Prozent der Patienten
in der Vergleichsstudie hatten eine Neutropenie, 13 % eine schwere Diarrhoe und
9 % eine Neuropathie (CONROY et al. 2011; KUNZMANN et al. 2014). Trotz dieser
Nebenwirkungen führt FOLFIRINOX zu einer signifikant höheren Lebensqualität als
Gemcitabin, es sollte aber nur bei Patienten (unter 75 Jahren) in einem guten
Allgemeinzustand und mit normalen Leberwerten, normalem Bilirubinspiegel und
ohne kardiale Ischämie eingesetzt werden (CONROY et al. 2011; KLEGER et al.
2014; VALSECCHI et al. 2014).
Nab-Paclitaxel (nanoparticle albumin bound paclitaxel) konnte als erste Substanz in
Kombination mit Gemcitabin eine signifikante Verlängerung des Gesamtüberlebens
beim metastasierten Pankreaskarzinom erreichen (KLEGER et al. 2014;
VALSECCHI et al. 2014). HOFF et al. (2013) berichten über eine
Gesamtüberlebenszeit von 8,5 Monaten bei Patienten, die mit der Kombination aus
nab-Paclitaxel und Gemcitabin behandelt wurden, gegenüber 6,7 Monaten bei
Patienten mit Gemcitabin-Monotherapie. KUNZMANN et al. (2014) kombinierten
nab-Paclitaxel und Gemcitabin mit nachfolgendem FOLFIRINOX Schema und
konnten mit dieser Medikation als neoadjuvante Therapie bei Patienten mit initial
nichtresektablem Pankreastumor eine sekundäre Resektabilität in Form einer R0-
Resektion erreichen. Als R0-Resektion wird eine Resektion des Tumors im
Gesunden bezeichnet (NEOPTOLEMOS et al. 2001; OETTLE et al. 2007).
Neben diesen Standardtherapien werden in klinischen Studien neue und
ergänzende Therapieansätze erprobt, wie z.B. die Immuntherapie, Tumorvakzine,
23
Angiogeneseinhibitoren, Applikation von Prodrugs und personalisierte und
molekularbiologisch stratifizierte Behandlungen (ARSLAN et al. 2014; KLEGER et
al. 2014).
SIKKENS et al. (2014) konnten zeigen, dass besonders bei Patienten mit einem
Tumor im Bereich des Pankreaskopfes die Funktion des exokrinen Pankreas
hochgradig gestört ist. Gerade diese Patienten profitieren bei adjuvanter oder
neoadjuvanter Chemotherapie von einer Enzymsubstitution, welche den
Gewichtsverlust eindämmt und somit den Ernährungs- und Gesundheitszustand der
Patienten verbessert.
GILLEN et al. (2010) und ASSIFI et al. (2011) untersuchten in einer umfangreichen
Literaturrecherche und Metaanalyse die Effekte der neoadjuvanten Chemotherapie
und konnten zeigen, dass auch ein Drittel der als nichtresektabel klassifizierten
Pankreastumore nach neoadjuvanter Chemotherapie eine vergleichbare mediane
Überlebenszeit erzielten wie Patienten mit primär resektablem Tumor. Die mediane
Überlebenszeit von Patienten mit resektablem Pankreaskarzinom und
nachfolgender adjuvanter Chemotherapie gleicht der von Patienten mit resektablem
Tumor, die vorher einer neoadjuvanten Chemotherapie unterzogen wurden. Dies
zeigt keinen offensichtlichen Vorteil der neoadjuvanten Therapie. Bei den als nicht
resektabel eingestuften Tumoren zeigt sich jedoch ein deutlicher Effekt. Ein Drittel
(33,2 %) der Tumore konnte nach neoadjuvanter Chemotherapie chirurgisch
entfernt werden. Die Patienten erreichten danach ähnliche mediane
Überlebenszeiten wie Patienten mit primär resektablem Pankreaskarzinom
(GILLEN et al. 2010). Abbildung 3 zeigt die medianen Überlebenszeiten von
Patienten mit einem resektablen, lokal fortgeschrittenen/nichtresektablen und
metastasierten Pankreaskarzinom.
24
Abbildung 3: Mediane Überlebenszeiten. Die Abbildung gibt einen Überblick über die mediane Überlebenszeit von Patienten mit einem resektablen, lokal fortgeschrittenen/nichtresektablen und metastasierten Pankreaskarzinom
Der Stellenwert einer Strahlentherapie in der Behandlung des Pankreaskarzinoms
wird kritisch diskutiert. Die Ergebnisse von Studien sind widersprüchlich und die
derzeitige S3 Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom von Oktober 2013
(LEITLINIENPROGRAMM ONKOLOGIE 2013) empfiehlt sowohl eine adjuvante
Radiochemotherapie nach R0-Resektion als auch eine additive
Radiochemotherapie nach R1-Resektion nur im Rahmen von randomisiert-
kontrollierten Studien durchzuführen. Eine R1-Resektion wird als eine
makroskopische Entfernung des Tumors definiert, wobei aber Tumoranteile am
Resektionsrand histopathologisch nachweisbar bleiben (NEOPTOLEMOS et al.
2001; VERBEKE et al. 2009). Die palliative Strahlentherapie sollte nur bei
symptomatischen Metastasen zur Symptomkontrolle und Vermeidung von
Komplikationen durchgeführt werden (SEUFFERLEIN et al. 2012; SEUFFERLEIN
et al. 2014). Im Gegensatz zu Europa stellt eine Strahlentherapie in den USA die
Standardtherapie dar (REGINE et al. 2008; VINCENT et al. 2011).
25
Das Pankreaskarzinom bleibt trotz großer Fortschritte im Verständnis der
Pathogenese eine Erkrankung mit einer der niedrigsten 5-Jahres-Überlebensraten
(CHIEN et al. 2015). Aktuelle Therapiestrategien bleiben ohne messbaren Erfolg
bezüglich der Gesamtprognose, woraus sich die dringende Notwendigkeit ergibt, neue
Substanzen für die Therapie zu erforschen (SCHNEIDER et al. 2005).
2.1.6 Chirurgische Therapie des Pankreaskarzinoms
Die chirurgische Therapie ist die einzige potentiell kurative Therapiemaßnahme bei
einem Pankreaskarzinom mit dem Ziel einer R0-Resektion (SAHORA et al. 2008;
SEUFFERLEIN et al. 2014). Die schlechte Prognose hängt ursächlich mit der bei
Diagnosestellung meist schon vorhandenen Lebermetastasierung zusammen. Nur
etwas 10 – 15 % der Tumore sind zu diesem Zeitpunkt unter kurativer Intention
resektabel (NEOPTOLEMOS et al. 2001). Auch nach einer kompletten
Tumorresektion liegt die mediane Überlebenszeit je nach Tumorstadium,
Lymphknotenstatus und adjuvanten Therapiemaßnahmen bei 28,7 Monaten, die
Fünf-Jahres-Überlebensrate liegt bei 5 % (GALL et al. 2015). Die mediane
Überlebenszeit von Patienten mit einer R1/R2-Resektion des Tumors entspricht
etwa sechs Monaten und gleicht damit der Überlebensrate von Patienten, die ohne
Operation eine palliative Therapie erhalten (GALL et al. 2015). Unter einer R2-
Resektion wird eine inkomplette Tumorresektion verstanden. Makroskopisch
sichtbare Teile des Tumors können bei dieser Resektion aufgrund des Erhaltes
lebenswichtiger Strukturen nicht entfernt werden (NEOPTOLEMOS et al. 2001).
Verschiedene Operationsverfahren kommen in Abhängigkeit von der
Tumorlokalisation und –ausbreitung zum Einsatz. Karzinome mit Lokalisation im
Pankreaskörper und im Pankreasschwanz werden mit einer Pankreaslinksresektion
behandelt. Da diese Tumore aufgrund ihrer spät einsetzenden Symptomatik meist
ein fortgeschrittenes Wachstum aufweisen (BACHMANN et al. 2006), wird hier
zusätzlich eine sogenannte multiviszerale Resektion durchgeführt. Der Tumor wird
dann mit den betroffenen Nachbarorganen, wie z.B. Magen, linke Niere, linke
26
Nebenniere und Dickdarm entfernt (SAHORA et al. 2008; WOLFGANG et al. 2013;
SEUFFERLEIN et al. 2014). Bei Tumoren im Pankreaskopf wird die partielle
Duodenopankreatektomie durchgeführt. Da 60-70 % der Pankreaskarzinome im
Pankreaskopf lokalisiert sind, ist diese Operation die häufigste onkologische
Operation des Pankreaskarzinoms (SAHORA et al. 2008).
Die klassische partielle Duodenopankreatektomie ist die Kausch-Whipple’sche
Operation (kurz Whipple-OP). Sie wurde von Kausch erstmals 1912 beschrieben
und von Whipple weiterentwickelt (BACHMANN et al. 2006; SAHORA et al. 2008).
Sie stellt nach wie vor eine Standardoperation beim Pankreaskopfkarzinom dar.
Die Resektion des Magens ist aber meist nicht notwendig, so dass diese
klassische Form der Operation nur noch selten zu Anwendung kommt. Die
Weiterentwicklung dieser Methode ist die pyloruserhaltende partielle
Duodenopankreatektomie (PPPD), auch pyloruserhaltende Whipple´sche
Operation genannt oder nach den Erstbeschreibern aus dem Jahr 1978 Operation
nach Traverso/Longmire (BACHMANN et al. 2006; SAHORA et al. 2008; VERBEKE
et al. 2009). Der Vorteil dieser Methode ist, dass durch den Erhalt der
physiologischen Magenfunktion eine verbesserte Ernährung des Patienten möglich
ist (SAHORA et al. 2008; BADGER et al. 2010).
Die radikalste Therapieform ist die totale Pankreatektomie. Durch ihre
nachfolgenden Probleme für den Patienten in Form schwerster Entgleisungen des
Zuckerstoffwechsels stellt sie die Ultima Ratio in der Behandlung des
Pankreaskarzinoms dar (BACHMANN et al. 2006; WOLFGANG et al. 2013).
2.2 Das Pankreaskarzinom in der Veterinärmedizin
2.2.1 Epidemiologie
Maligne Erkrankungen stellen ein schwerwiegendes Gesundheitsproblem sowohl in
der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin dar. Da Menschen und ihre
27
Haustiere denselben genetischen und umwelttechnischen Risikofaktoren
ausgesetzt sind, gibt es bei bestimmten Tumorarten vergleichbare Inzidenzraten
(GORDON et al. 2009; SINGER et al. 2014). Schätzungen zufolge wird jeder vierte
Hund älter als zwei Jahre an Krebs erkranken (PAOLONI et al. 2007; WITHROW et
al. 2013). Die Krebsprävalenz steigt besonders bei Hunden an. Dies ist zum Teil
auch dem Umstand geschuldet, dass die Population insgesamt wächst. Zum
anderen steigt auch bei Hunden die Lebenserwartung durch die verbesserte
veterinärmedizinische Versorgung und dem Status des Haustiers als vollwertiges
Familienmitglied und Sozialpartner (PAOLONI et al. 2007).
Adenokarzinome des Pankreas kommen in der Veterinärmedizin zwar seltener vor,
werden aber für viele Tierarten beschrieben (ROWLATT 1967; KIRCHER et al.
1976). Meist sind die Fallzahlen jedoch gering. HOEFER et al. (1992) verweisen auf
zwei Fälle bei Frettchen, CHEN et al. (2006) berichten über einen Fall bei einem
Nymphensittich (Nymphicus hollandicus) und RITCHEY et al. (1997) stellten bei
einer Gelbscheitelamazone (Amazona ochrocephala) ein Pankreasadenokarzinom
fest. Bei Rindern wurden Tumore des Pankreas als Nebenbefunde bei der
Untersuchung auf dem Schlachthof festgestellt. Die mikroskopische Untersuchung
der Primärtumore stellte hauptsächlich Inselzelltumore und einen geringen Anteil an
exokrinen Pankreaskarzinomen fest (KELLEY et al. 1996).
Beim Pferd existieren aufgrund der intra vitam schweren Diagnostizierbarkeit
Fallberichte, die ante mortem die Diagnose Pankreaskarzinom bestätigten. Pferde
zeigen eine vorwiegend unspezifische Symptomatik, die durch Inappetenz und
Gewichtsverlust gekennzeichnet ist. Das klinische Bild kann unter anderem auch
Aszites, milde Kolik, Fieber und Ödembildung umfassen (RENDLE et al. 2006;
BARSNICK et al. 2008; STADLER et al. 2013).
PRIESTER sammelte von März 1964 bis Dezember 1972 Daten von 11
veterinärmedizinischen Fakultäten in den Vereinigten Staaten von Amerika und
Kanada (PRIESTER 1974). In einem Kollektiv von 10.500 mikroskopisch
bestätigten Primärtumoren stellten sich 54 Proben als Pankreaskarzinome dar.
Diese teilten sich auf die Tierarten wie folgt auf: 42 Fälle bei Hunden, neun bei
28
Katzen, zwei bei Rindern und ein Fall bei einem Pferd. Basierend auf diesen
erhobenen Daten stellte PRIESTER als prädisponierende Risikofaktoren
fortgeschrittenes Alter und beim Hund die Rassezugehörigkeit Airedale Terrier fest.
Die Inzidenz des Pankreasadenokarzinoms ist bei Hunden und Katzen ungleich
höher als bei anderen Spezies wie Rindern, Pferden und Schweinen (KIRCHER et
al. 1976). Die Inzidenz bei Katzen ist jedoch geringer (ROWLATT 1967; MAYR et
al. 2003b). Das Pankreasadenokarzinom stellt etwa 1 % aller Tumorerkrankungen
beim Hund dar (PRIESTER 1974; KIRCHER et al. 1976; MORRISON 2002). In
einer weiteren retrospektiven Studie, die die Jahre 1978 – 1988 einschloß, wurde
die Pathologie der Erkrankung des exokrinen Pankreas bei Hunden und Katzen
untersucht. Dabei wurden an 9342 Hunden und 6504 Katzen Sektionen
durchgeführt. 1,7 % der Hunde und 1,3 % der Katzen wiesen pathologische
Veränderungen am exokrinen Pankreas auf. Bei 4 % der Hunde und 1,4 % der
Katzen wurde ein Pankreaskarzinom festgestellt (HÄNICHEN et al. 1990).
2.2.2 Anatomie und Histologie
Die Bauchspeicheldrüse entwickelt sich gemeinsam mit der Leber aus dem
hepatopankreatischen Ring der embryonalen Darmanlage (AURICH et al. 2014).
Exokrin-sekretorische und endokrin-inkretorische Anteile des Pankreas liegen in
unterschiedlichen Zellsystemen getrennt vor und bilden den exokrinen (Pars
exocrina pancreatis) und den endokrinen (Pars endocrina pancreatis) Teil der
Bauchspeicheldrüse. Der exokrine Teil macht 98 % des Volumens des Pankreas
aus und ist eine tubuloazinös zusammengesetzte, seröse Drüse (LIEBICH 2004).
Sie sondert den enzymhaltigen Pankreassaft ins Duodenum ab, welcher u.a.
Peptidasen, Nucleasen, Amylasen und Lipasen enthält. Alle enzymatisch
wirksamen Substanzen liegen im Pankreas in ihrer inaktiven Form vor und werden
durch die Sekrete des Dünndarms aktiviert (BJORNEBY et al. 2002; LIEBICH 2004;
ENGELHARDT et al. 2005).
Der kleinere endokrine Anteil der Bauchspeicheldrüse, welcher 1-2 % des
Volumens ausmacht, besteht aus den Pankreasinseln (Insulae pancreaticae),
29
welche man auch als Langerhans-Inseln bezeichnet. Sie bestehen aus vier
unterschiedlichen Zelltypen, die u.a. die Hormone Glukagon, Insulin und
Somatostatin produzieren (LIEBICH 2004; ENGELHARDT et al. 2005).
Die äußere Form des Pankreas der Haussäugetiere unterscheidet sich von der des
Menschen und kann nicht mit der in der Humanmedizin gültigen Nomenklatur
beschrieben werden (FREWEIN 2004). In der Veterinärmedizin werden ein mittlerer
Körper (Corpus pancreatis) von einem rechten Duodenalschenkel (Lobus
pancreatis dexter) und einem linken Milzschenkel (Lobus pancreatis sinister)
unterschieden. Über den Dorsalrand des Pankreaskörpers läuft bei Hund, Katze
und den Hauswiederkäuern die Incisura pancreatis, in der die Vena portae zur Leber
zieht. Beim Schwein und beim Pferd verläuft die Vena portae im Pfortaderring, dem
Anulus pancreatis. Die Ausführungsgänge des Pankreas sind tierartlich
unterschiedlich ausgebildet, wobei Katzen und kleine Wiederkäuer einen Ductus
pancreaticus (Wirsungischer Gang) haben, Schwein und Rind einen Ductus
pancreaticus accessorius (Santorinischer Gang) besitzen, während Hund sowie
Pferd beide Ausgänge besitzen (BJORNEBY et al. 2002; FREWEIN 2004; AURICH
et al. 2014). Abbildung 4 zeigt die Anatomie des Pankreas des Hundes.
30
Abbildung 4: Pankreas des Hundes, modifiziert nach FOSSUM (2009).
2.2.3 Ätiologie und Pathogenese
Pankreaskarzinome sind meist epithelialen Ursprungs und lassen sich in Tumore
des exokrinen und des endokrinen Pankreas unterteilen (DENNIS et al. 2008).
Exokrine Pankreastumore haben ihren Ursprung in den Azinuszellen des Pankreas,
während endokrine Pankreastumore von den Langerhans’schen Inselzellen
ausgehen (LAMB et al. 1995). Exokrine Adenokarzinome des Pankreas sind am
häufigsten im zentralen Teil der Drüse zu finden (KESSLER 2012). Sie besitzen
eine starke Metastasierungstendenz in die Leber, Lunge, Peritoneum und neigen
zur lokalen Infiltration des Duodenums und der regionalen Lymphknoten. Beim
Hund sind Adenokarzinome des Pankreas insgesamt etwas häufiger als die
Inselzelltumore (KIRCHER et al. 1976; LAMB et al. 1995; FOSSUM 2009; KOHN et
al. 2012).
31
Viele der bei Hunden häufigen Krebsarten sind denen des Menschen
histopathologisch ähnlich, was auch Ähnlichkeiten im genetischen Hintergrund
sowie der Entstehungsart annehmen lässt (BANNER et al. 1978). Sie zeigen
ähnliche biologische Verhalten in Bezug auf Metastasierung, Rezidivraten,
therapeutische Reaktion, molekulare Zielstrukturen und Resistenzverhalten
(PAOLONI et al. 2007; GORDON et al. 2009; BUSHELL et al. 2015). Somit werden
auch zunehmend Therapien der Humanmedizin in der Tiermedizin eingesetzt
(SINGER et al. 2014).
In der Regel wird die Diagnose bei älteren Tieren gestellt, das Durchschnittsalter
liegt bei Hunden bei 10 Jahren (Altersbereich 5 – 16 Jahre) und bei Katzen bei 12
Jahren (Altersbereich 2,5 – 22 Jahre) (KIRCHER et al. 1976; HÄNICHEN et al.
1990; MORRISON 2002). Als Rassen mit erhöhtem Risiko gelten neben dem
Airedale Terrier der Boxer, Spaniel-Rassen, Boston Terrier, Labrador Retriever und
Drahthaar-Foxterrier (NELSON et al. 2010; KOHN et al. 2012). Bei Hunden wird die
Geschlechtsprädisposition diskutiert, nach FOSSUM (2009) scheint die Erkrankung
tendenziell häufiger bei Rüden vorzukommen. WITHROW et al. (2013) und
KESSLER (2012) sehen wiederum für ältere Hündinnen ein erhöhtes Risiko.
Die Situation bei Hunden hinsichtlich der Pathogenese scheint der des humanen
Pankreaskarzinoms zu ähneln (NELSON et al. 2010). Die Abbildungen 5 und 6
zeigen histologische Schnittbilder eines Pankreasadenokarzinoms des Menschen
(Abb. 5) und des Hundes (Abb. 6).
32
Abbildung 5 Abbildung 6
Abbildung 5: Humanes duktales Adenokarzinom. Im Kreis ist Anisokaryose dargestellt, die Pfeile zeigen Mitosefiguren, die Sterne markieren nekrotisches Drüsengewebe. Hämatoxylin-Eosin-Färbung, 600fache Vergrößerung (© BELLIZZI et al. (2009)) Abbildung 6: Canines Adenokarzinom des exokrinen Pankreas bei einer 4-jährigen Zwergpinscherhündin. Die neoplastischen Zellen zeigen azinäre (Stern) und tubuläre (Doppelstern) Strukturen. Pleomorphie, Karyomegalie (Pfeile) und Nekrose liegen vor. Hämatoxylin-Eosin-Färbung, 400fache Vergrößerung (© OSKOUI-ZADEH et al. (2008)).
Von den genetischen Veränderungen, die in humanen Neoplasien identifiziert
wurden, ist die Aktivierung von KRAS (Kirsten Rat Sarcoma), einem Mitglied der
Familie der RAS-Protoonkogene, eine der häufigsten (ESER et al. 2014). MAYR et
al. (2003b) und MAYR et al. (2003a) konnten sowohl bei Hunden als auch bei
Katzen mit Pankreasadenokarzinom Mutationen im KRAS-Gen nachweisen.
NELSON et al. (2010) sehen die chronische Pankreatitis, ähnlich wie beim
Menschen, als einen Risikofaktor für die Entwicklung eines Adenokarzinoms des
Pankreas an. Die Autoren gehen davon aus, dass die für chronische Pankreatiden
prädisponierten Spanielrassen deshalb auch zu den Rassen mit einem erhöhten
Risiko für das Pankreaskarzinom zählen.
BUSHELL et al. (2015) beschreiben beispielsweise erstmalig den Nachweis der
Inaktivierung des Tumornekrosefaktor-Receptor-Associated-Factor-3-Gens
33
(TRAF3) im caninen B-Zelllymphom. TRAF3 wirkt als negativer Regulator der NF-
κB-inducing-kinase (NIK) und somit des alternativen NF-κB-Signalweges beim
Hund (BUSHELL et al. 2015) und Menschen (MOORE et al. 2015). Somit gilt auch
in der Veterinärmedizin der NF- κB-Signalweg als ein vielversprechendes
Angriffsziel in der Krebstherapie (BUSHELL et al. 2015).
2.2.4 Diagnostik des Pankreaskarzinoms
Bei Hund und Katze treten als klinische Symptome hauptsächlich Erbrechen,
Bauchschmerzen, Anorexie, Gewichtsverlust, Schwäche, Lethargie und Durchfall
auf. Bei der klinischen Untersuchung sind oft Ikterus durch extrahepatische
Gallengangsobstruktion, abdominaler Palpationsschmerz und Aszites durch
Pankreatitis und Peritonealkarzinomatose feststellbar (BRIGHT 1985; FOSSUM
2009; KOHN et al. 2012). Peritonealmetastasen, raumfordernde Prozesse, sowie
Metastasierung in die Leber und die regionalen Lymphknoten treten lange vor den
klinischen Symptomen auf (DENNIS et al. 2008; OSKOUI-ZADEH et al. 2008). Das
Tumorgeschehen kann sich insgesamt wie eine exogene Pankreasinsuffizienz mit
einem Maldigestionssyndrom darstellen (NOLTE et al. 2000; WITHROW et al.
2013).
Die labormedizinische Untersuchung liefert in den meisten Fällen keine spezifischen
Befunde und es gibt bis jetzt noch keine verlässlichen Laborparameter, die als
spezifisch für eine Neoplasie des exokrinen Pankreas gelten (FOSSUM 2009). In
einigen Fällen besteht eine Erhöhung der alkalischen Phosphatase und der
Serumlipase, eine Hyperbilirubinämie und eine geringgradige Leukozytose. Eine
Erhöhung der Serumlipase ist dabei in fast allen Fällen zu finden (MORRISON
2002; DENNIS et al. 2008; FOSSUM 2009; KESSLER 2012).
Tumormarker sind auch in der Veterinärmedizin von Interesse. Für häufige
Krebsarten wie z.B. Hodentumore beim Rüden sind bereits Inhibin-Alpha, Vimentin
und c-KIT als potentielle Tumormarker identifiziert worden (YU et al. 2009). Die
34
Serum-Thymidin-Kinase gilt als Tumormarker für das maligne Lymphom und
Hämangiosarkom bei Hunden (EULER et al. 2004; THAMM et al. 2012).
ANDREWS et al. (1997) konnten für Inselzelltumore des Pankreas bei Frettchen,
Katzen und Hunden Chromogranin A (CgA) und Neuron-Specific-Enolase (NSE) als
Tumormarker immunhistochemisch identifizieren. Spezifischere Tumormarker für
das Pankreasadenokarzinom in Tieren, welche vergleichbar mit dem humanen CA
19-9 sind, konnten auch nach intensiver Literaturrecherche nicht gefunden werden.
Ähnlich wie in der Humanmedizin ist es schwierig, im frühen Stadium die Diagnose
Pankreaskarzinom zu stellen. Bei klinischer Vorstellung ist der Krebs meist in einem
fortgeschrittenen Stadium und hat somit eine schlechte Prognose und eine kurze
mediane Überlebenszeit. Die Überlebenszeit wird in der Literatur nach Einsetzen
der klinischen Symptomatik mit ca. drei Monaten angegeben (NOLTE et al. 2000;
MORRISON 2002; MAYR et al. 2003a; FOSSUM 2009).
Ein wichtiges diagnostisches Instrument in der Veterinärmedizin ist der abdominale
Ultraschall (LAMB et al. 1995; MORRISON 2002). Die Differenzierung zwischen
Pankreatitis und Tumor kann aber eine Schwierigkeit darstellen (KESSLER 2012;
KOHN et al. 2012). Zuverlässigere diagnostische Techniken sind die
kontrastmittelverstärkte Computertomographie, die Laparoskopie und die
Probelaparotomie mit Biopsieentnahme (EDWARDS et al. 1990; KOHN et al. 2012).
Die Magnetresonanztomographie hat auch in der Veterinärmedizin ihren
Stellenwert, aufgrund des apparativen Aufwandes und der Kosten wird sie zumeist
in Universitätskliniken und Forschungseinrichtungen eingesetzt (KESSLER 2012).
Röntgenaufnahmen sind ohne diagnostischen Wert für das Pankreas, sollten aber
von der Lunge in mindestens zwei Ebenen zur Abklärung von Metastasierungen
angefertigt werden (EDWARDS et al. 1990; FOSSUM 2009; KESSLER 2012;
KOHN et al. 2012).
35
2.2.5 Pharmakologische Therapie des Pankreaskarzino ms
Prinzipiell stehen auch alle Behandlungsmöglichkeiten der Humanmedizin der
Veterinärmedizin zur Verfügung (PAOLONI et al. 2008). Die
Chemotherapieprotokolle, die in der Veterinärmedizin genutzt werden, sind aus der
Humanmedizin adaptiert (PAOLONI et al. 2007). Die verwendeten
Chemotherapeutika müssen dazu für den veterinärmedizinischen Gebrauch aus der
Humanmedizin umgewidmet werden (PAOLONI et al. 2008; ALTHAUS 2010). In
der Behandlung des caninen Mammakarzinoms kommen beispielsweise
Cyclophosphamid, 5-Fluoruoracil und Doxorubicin zum Einsatz, beim caninen
Lymphom Vincristin, Cyclophosphamid, Doxorubicin, Mitoxantron, Cytarabin,
Arabinosid und Methotrexat (GARRETT et al. 2002; PAOLONI et al. 2007). Auch
andere moderne zielgerichtete Therapieansätze wie Tyrosinkinase-Inhibitoren oder
Krebsimpfstoffe kommen in der Veterinärmedizin immer mehr zum Einsatz
(SINGER et al. 2014). Die Toxizität der Medikamente ist bei Hunden ähnlich wie
beim Mensch, allerdings wird die Dosierung oft niedriger gewählt (PAOLONI et al.
2008). Lebensbedrohliche Nebenwirkungen, vielfach hervorgerufen durch
Knochenmarksdepression, sind dadurch selten und kommen nur in ca. 1 % der Fälle
bei veterinärmedizinischen Patienten vor. In Folge der Dosisreduktion sind die
Heilungsraten deutlich geringer als bei humanmedizinischen Patienten, die
dasselbe Protokoll erhalten (GARRETT et al. 2002; PAOLONI et al. 2008). Die
Prognose des Pankreaskarzinoms ist aufgrund der hohen Metastasierungsfrequenz
als infaust zu bezeichnen, weshalb viele Tiere unmittelbar nach der
Diagnosestellung euthanasiert werden. Vereinzelt dokumentierte Überlebenszeiten
betragen 3 - 90 Tage (PAOLONI et al. 2008; KESSLER 2012). Auch in der
Veterinärmedizin ist die de novo Resistenz gegenüber den gängigsten
Chemotherapeutika ein ernsthaftes Problem und trägt zu der extrem schlechten
Prognose von Tieren mit einem Pankreaskarzinom bei (MORRISON 2002;
WITHROW et al. 2013).
Wird ein Therapieversuch gestartet, dann kommt bei Hunden Gemcitabin zum
Einsatz. Ein Standard hat sich aber noch nicht durchgesetzt, was zum Teil auch an
36
der schlechten medikamentösen Ansprechbarkeit des Tumors liegt (ROSATELLI et
al. 2011; TILLEY et al. 2011). TURNER et al. (2006) berichten über den Einsatz von
Gemcitabin bei Hunden mit Lymphom. Die zweimalige Gabe von Gemcitabin führte
dabei zu keiner Minderung des Krankheitsgeschehens, jedoch zu Neutropenie und
Thrombozytopenie.
In einer präklinischen Studie zum Einsatz von Gemcitabin in der Therapie des
humanen Harnblasenkarzinoms bekamen Beaglehunde 350 mg Gemcitabin
intravenös verabreicht. Diese Dosis wurde gut toleriert, bei höheren Dosen, die
intravesical verabreicht wurden, zeigten sich schwere Nebenwirkungen in Form von
Knochenmarkshypoplasie und intestinalen Nekrosen (COZZI et al. 1999).
Das Pankreaskarzinom ist sehr chemoresistent (KESSLER 2012). Mit einer
Kombination aus Gemcitabin und Carboplatin konnte aber bei einer Katze mit einem
histologisch nachgewiesenen Pankreaskarzinom eine komplette Remission erreicht
werden. Das dreiwöchige Behandlungsprotokoll sah eine Dosierung von
Gemcitabin von 2 mg/kg vor, infundiert über mindestens 20 Minuten an Tag 1 und
Tag 8. Carboplatin in der Dosierung 10 mg/kg wurde an Tag 1 vier Stunden nach
Gemcitabingabe intravenös verabreicht. Insgesamt wurden sechs Zyklen dieses
Protokolls durchlaufen. Ein intrakavitärer Einsatz von Cisplatin und Carboplatin
beim Hund beziehungsweise Cisplatin bei der Katze wird diskutiert und könnte
einen Ansatz darstellen (MARTINEZ-RUZAFA et al. 2009; KESSLER 2012).
CHEN et al. (2006) behandelten einen Nymphensittich mit histologisch
nachgewiesenem Adenokarzinom des Pankreas nach erfolgreicher chirurgischer
Intervention mit dem Cyclooxygenase-2-(COX-2)-Inhibitor Celecoxib. Studien aus
der Humanmedizin liefern Hinweise, dass COX-2-Inhibitoren einen
antineoplastischen Effekt haben (DING et al. 2001; THUN et al. 2002; PINO et al.
2004; JENDROSSEK 2013). Die Behandlung in der Dosierung 10 mg/kg per os
einmal täglich für drei Monate hatte jedoch primär die Schmerzlinderung im Sinne
einer palliativen Therapie als Ziel. Der Nymphensittich verstarb viereinhalb Monate
nach der Operation an einem Narkosezwischenfall während einer
Röntgenaufnahme. Die nachfolgende Autopsie zeigte eine hochgradige
37
Metastasierung in die Leber und die Lunge. COX-2 wird aber wiederum in felinen
Pankreaskarzinomen selten exprimiert, so dass ein Einsatz von COX-2-Inhibitoren
hier nicht sinnvoll wäre (KESSLER 2012).
ALTHAUS (2010) berichtet über gute Erfolge in der Behandlung von metastasierten
Tumoren des Gastrointestinaltraktes, des Pankreas und der Blase mit 5-FU bei
Tieren. Die Anwendung kann dabei intrathekal, intravenös oder intraperitoneal
erfolgen. Bei Tieren mit gutem Ernährungszustand wird nach ALTHAUS (2010) eine
Einzeldosierung mittels Infusion über zwei bis vier Stunden von 500 mg/m2 einmal
in der Woche empfohlen. Aufgrund der Neurotoxizität sollte 5-FU bei Katzen nicht
angewendet werden, bei den anderen Spezies kann es zu den typischen
Nebenwirkungen wie Leukopenie, Thrombozytopenie und gastrointestinalen
Störungen kommen (ALTHAUS 2010).
Die starke antitumorale Aktivität von Paclitaxel vor allem gegen solide Karzinome
der Ovarien, der Lunge, bei Tumoren im Ösophagus und Kopf-Hals-Bereich führte
auch zum Einsatz in der Veterinärmedizin. Der Dosierungsvorschlag von ALTHAUS
(2010) sieht 170 mg/m2 bei Hunden als intravenöse Gabe alle drei Wochen vor,
Katzen und kleine Hund sollten 5 mg/kg erhalten.
Die antineoplastischen Behandlungen bei Tieren sind vielfach palliativ und dienen
der Schmerzlinderung sowie der Verhinderung von Übelkeit und Erbrechen
(KESSLER 2012). Pankreastumore werden als äußerst schmerzhaft von
Humanpatienten beschrieben, und es ist sehr wahrscheinlich, dass dies auch in
anderen Spezies so ist (CHEN et al. 2006; DENNIS et al. 2008; KESSLER 2012).
Die Therapieversuche beschränken sich bis dato auf Einzelfallberichte, und einen
Goldstandard für die Behandlung des Pankreaskarzinoms in der Veterinärmedizin
gibt es (noch) nicht (PAOLONI et al. 2007). Wenn durch chirurgische und
chemotherapeutische Maßnahmen keine Besserung der Lebensqualität erreicht
werden kann, dann ist die Euthanasie die einzig ethisch vertretbare Alternative
(KESSLER 2012).
Die Prognose für veterinärmedizinische Patienten mit einem Pankreaskarzinom ist
auch durch die eingeschränkten wirksamen Behandlungsmöglichkeiten fast immer
38
aussichtslos. Dies unterstreicht somit die Notwendigkeit, dass genau wie in der
Humanmedizin auch in der Veterinärmedizin dringend neue therapeutische Ansätze
gefunden werden müssen.
2.2.6 Chirurgische Therapie des Pankreaskarzinoms
Die chirurgischen Verfahren in der Veterinärmedizin sind nahezu identisch mit
denen der Humanmedizin (PAOLONI et al. 2008). Die partielle Pankreatektomie
wird in der Literatur als kurative Maßnahme bei Hunden genauso beschrieben wie
die Pankreatikoduodenektomie nach Vorbild der Whipple-Operation in der
Humanmedizin (DENNIS et al. 2008). Ist in Ausnahmefällen eine totale
Pankreatektomie nötig, wird dies mit einer Resektion und Anastomosierung des
proximalen Duodenums, Ligatur des Ductus choledochus und einer
Cholezystojejunostomie verbunden (Billroth–II–Operation) (FOSSUM 2009). Bei
diesen Operationen ist das Mortalitätsrisiko sehr hoch und die Heilungsraten extrem
gering (WITHROW et al. 2013). Maßnahmen wie ein gastrointestinaler Bypass
(Gastrojejunostomie) sind nur kurzfristige bzw. palliative Optionen bei einem
Darmverschluss. Viele Patienten müssen aufgrund der äußerst ungünstigen
Prognose intraoperativ euthanasiert werden (NOLTE et al. 2000; FOSSUM 2009).
Die mittlere Überlebenszeit nach durchgeführter Operation liegt nach DENNIS et al.
(2008) bei 5 – 120 Tagen.
39
2.3 Neuroleptika
2.3.1 Neuroleptika in der Human- und Veterinärmediz in
Der Begriff Neurolepsie bezeichnet eine psychische Spannungslösung, welche bei
Erhalt der Ansprechbarkeit durch eine Herabsetzung der emotionalen Erregbarkeit,
eine Verminderung des Antriebs, sowie einer Dämpfung der Spontanbewegung und
der Ausdrucksmotorik gekennzeichnet ist. Medikamente, die derartige Zustände
induzieren, werden Neuroleptika genannt (ALTHAUS 2010). Der Begriff
Neuroleptikum fasst dabei Pharmaka zusammen, die auf psychopathologische
Syndrome und psychische Krankheiten einwirken (AKTORIES et al. 2013). Die
typischen Antipsychotika, zu denen die älteren Substanzen gehören, werden
alternativ auch als Antipsychotika der 1. Generation (First Generation
Antipsychotics / FGA) und die neueren atypischen Substanzen als Antipsychotika
der 2. Generation (Second Generation Antipsychotics / SGA) bezeichnet (LAUX et
al. 2013).
Neuroleptika stellen chemisch gesehen eine heterogene Gruppe dar, deren
Wirkung auf einer Beeinflussung der monoaminergen Neurotransmittersysteme
beruht (ALTHAUS 2010).
Die typischen Neuroleptika werden nach ihrer antipsychotischen Potenz und der
chemischen Struktur weiter unterteilt (MUTSCHLER 2012; AKTORIES et al. 2013).
Dabei zeigt sich, dass bei den typischen Antipsychotika große Strukturähnlichkeiten
existieren, wohingegen dies bei den atypischen Antipsychotika nicht der Fall ist
(LAUX et al. 2013). Die atypischen Antipsychotika lassen sich durch ihre chemische
Struktur nicht weiter kategorisieren, und es lässt sich keine Struktur-Wirkungs-
Beziehung wie bei den typischen Antipsychotika herstellen (FREISSMUTH et al.,
2012).
In der Humanmedizin bilden die klassischen Hauptindikationen für Antipsychotika
Schizophrenie, Psychosen und Angststörungen (AMARAL et al. 2012; FARIA et al.
2015). Weitere klinische Anwendungen sind schizoaffektive Erkrankungen sowie
manische Episoden im Rahmen bipolarer Störungen (MUTSCHLER 2012).
40
Außerhalb der Psychiatrie finden einige Antipsychotika auch Anwendung bei der
Behandlung von Erbrechen als Antiemetika, als Antihistaminika oder zur
Behandlung der Hyperkinesien beim Gilles-de-la-Tourette-Syndrom (CHEN et al.
2002; AKTORIES et al. 2013). Der Einsatz hier sollte aber nur nach Ausschöpfung
aller anderen Möglichkeiten erfolgen (AKTORIES et al. 2013).
Die typischen Neuroleptika werden in Phenothiazine, Thioxanthene, Butyrophenone
und Diphenylbutylpiperidine unterteilt (ALTHAUS 2010; MUTSCHLER 2012;
AKTORIES et al. 2013). Gegenstand der hier vorliegenden Arbeit ist das
Phenothiazinderivat Mepazin.
Für die Klinik ist die Einteilung nach der antipsychotischen Potenz von
entscheidender Bedeutung. Diese Einteilung wird dabei anhand der
neuroleptischen Wirkungen vorgenommen, da antipsychotische Wirkungen schwer
zu quantifizieren sind (LAUX et al. 2013). Die neuroleptische Potenz wird durch das
Vorkommen der extrapyramidal-motorischen Symptomatik gemessen
(FREISSMUTH et al. 2012).
Traditionelle Neuroleptika rufen als häufigste Nebenwirkung extrapyramidal-
motorische Störungen (EPMS) hervor (LEHMANN et al. 1997; PELUSO et al. 2012;
FARIA et al. 2015), die nach wie vor ein zentrales Problem in der Therapie mit
Antipsychotika darstellen. In Tabelle1 sind die wichtigsten Nebenwirkungen der
Neuroleptika dargestellt.
Tabelle 1 : Die wichtigsten unerwünschten Arzneimittelwirkungen der klassischen Neuroleptika (LAUX et al. 2013).
41
Neben EPMS als Nebenwirkung bei Patienten unter Phenothiazintherapie wird im
klinischen Gebrauch auch Hepatotoxizität mit dieser Stoffklasse in Verbindung
gebracht (FARIA et al. 2015).
EPMS lassen sich zumeist sehr frühzeitig in der Feinmotorik erkennen und können
in der Humanmedizin z.B. über Veränderungen in der Handschrift erfasst werden
(LEHMANN et al. 1997). Den Dosisbereich, ab dem feinmotorische Veränderungen
beginnen, bezeichnet man als „neuroleptische Schwelle“. Je weniger von einer
Substanz benötigt wird, bis diese neuroleptische Wirkung einsetzt, desto höher ist
deren neuroleptische Potenz, also die antipsychotische Wirksamkeit dieser
Substanz (LAUX et al. 2013).
Die neuroleptische Potenz ist abhängig vom Substituenten des Mittelringes
(FREISSMUTH et al. 2012). Ausgehend von dem Prototyp Chlorpromazin werden
alle typischen Antipsychotika verglichen und in hochpotent, mittelpotent und
niedrigpotent eingeteilt (AKTORIES et al. 2013). Eine aliphatische Seitenkette
bedeutet eine nieder- bis mittelpotente neuroleptische Wirkung, wie sie z.B. bei
Chlorpromazin oder Levopromazin zu beobachten ist. Eine Seitenkette mit einem
Piperidenring führt zu einer niedrigpotenten neuroleptischen Wirkung. Eine
hochpotente neuroleptische Wirkung besitzen Wirkstoffe, bei denen der Substituent
am Mittelring eine Seitenkette mit einem Piperazinring ist. Hierzu gehören unter
anderem Fluphenazin und Perphenazin (FREISSMUTH et al. 2012).
Die Phenothiazine zählen durch ihre chemische Struktur zu den trizyklischen
Antipsychotika (AMARAL et al. 2012; FARIA et al. 2015). Sie besitzen ein
Dreiringsystem als Grundstruktur, ähnlich der Struktur von Anthracen, wobei der
zentrale Ring jeweils ein Schwefel- und Stickstoffatom enthält (FARIA et al. 2015).
Anhand ihrer Substitution an den Positionen 2 und 10 werden die
Phenothiazinderivate weiter unterteilt (CHEN et al. 2002; FARIA et al. 2015).
Abbildung 7 zeigt die Grundstruktur der Phenothiazinderivate.
42
Abbildung 7: Das Phenothiazingrundgerüst, die Substitution erfolgt an den Positionen 2 (R1) und 10 (R2) (CHEN et al. 2002).
Der Substituent an Position 10 ist dabei für die antipsychotische Wirksamkeit
verantwortlich, während die Substitution von elektronenentziehenden Gruppen an
Position 2 die therapeutische Wirksamkeit verstärkt (FARIA et al. 2015).
Basierend auf der Substitution an Position 10 erfolgt die Einteilung in Phenothiazine
mit aliphatischer Seitenkette, Phenothiazine mit Piperidylseitenkette und
Phenothiazine mit Piperazinylseitenkette (CHEN et al. 2002; FARIA et al. 2015).
Phenothiazine mit aliphatischer Seitenkette zeichnen sich durch eine stärkere
Sedation und eine ausgeprägte vegetative Symptomatik aus, während die EPMS
etwas geringer ausfallen. Phenothiazine mit Piperazinylseitenkette weisen eine
geringere Sedation und vegetative Nebenwirkung auf, während die EPMS
Symptomatik ausgeprägter ist. Phenothiazine mit Piperidylseitenkette nehmen eine
Mittelstellung zwischen den beiden Gruppen ein (MÜLLER-OERLINGHAUSEN et
al. 2013). Mepazin gehört zusammen mit Thioridazin, Periciazin und Sulforidazin zu
den Phenothiazinderivaten mit einer Piperidylseitenkette (PONGRATZ et al. 2013).
Das Haupteinsatzgebiet der Neuroleptika in der Veterinärmedizin ist die Sedierung
zur Aggressionsminderung und die Ruhigstellung für kleinere Eingriffe und
Untersuchungen. In der Prämedikation vor Eingriffen sowohl mit lokaler als auch mit
allgemeiner Schmerzausschaltung und zur Neuroleptanalgesie (Kombination aus
einem starken Analgetikum und einem Neuroleptikum) finden diese Substanzen
genauso ihren Einsatz wie im zunehmenden Maße auch in der Verhaltenstherapie
(ALTHAUS 2010).
Chlorpromazin als Prototyp der Phenothiazinderivate wurde auch in der Tiermedizin
im Rahmen der Prämedikation von Narkosen und der Operationsvorbereitung, zur
43
Beruhigung aggressiver Tiere und zur Beruhigung vor Transporten eingesetzt. Seit
1997 ist die Anwendung bei lebensmittelliefernden Tieren aufgrund ungenügender
Toxizitäts- und Rückstandsdepletionsdaten in der Europäischen Union verboten
(LÖSCHER 2014).
Als wirkungstärkster Vertreter aus der Gruppe der Phenothiazinderivate ist
Acepromazin bei Hund, Katze und Pferd zum Beispiel unter den Handelsnamen
Vetranquil® oder Sedalin® im Einsatz (ALTHAUS 2010; LÖSCHER 2014). Seit dem
1. Januar 2000 ist es allerdings für den Gebrauch bei lebensmittelliefernden Tieren
verboten. Bei der Anwendung von Acepromazin bei zur Schlachtung vorgesehenen
Pferden muss diese Behandlung im Equidenpass dokumentiert werden, und eine
sechsmonatige Wartezeit ist einzuhalten (LÖSCHER 2014).
Veterinärmedizinisch zugelassen und zum Einsatz kommen von den
Phenothiazinen somit nur noch Acepromazin und das Butyrophenonderivat
Azaperon (Stresnil®). Auch bei Tieren besteht bei der Anwendung über einen
längeren Zeitraum die Gefahr der Entwicklung Parkinson-ähnlicher Symptome wie
Tremor, Dyskinesie und Rigidität der Muskulatur. Bei Langzeitanwendung lässt die
sedative Wirkung der Neuroleptika nach (LÖSCHER 2014).
Phenothiazine sind seit mehr als 50 Jahren als Antipsychotika im klinischen
Gebrauch (GUTIERREZ et al. 2014). Sie rückten in den letzten Jahren wieder
vermehrt in den klinischen Fokus und sind Gegenstand der aktuellen Forschung.
NAGEL et al. (2012) testeten mit Erfolg den Einsatz von Phenothiazinen in der
Therapie des B-Zell-Lymphoms. MC GUIRE et al. (2014) konnten mit einer
Phenozthiazinbehandlung eine Verbesserung der Symptomatik in einem
Mausmodell der Multiplen Sklerose erreichen. GUTIERREZ et al. (2014) zeigten
eine antitumorale Wirkung des Phenothiazinderivates Perphenazin in vitro und in
vivo in einem Therapieansatz der akuten lymphatischen Leukämie. SACHLOS et al.
(2012) griffen mit dem Phenothiazinderivat Thioridazin gezielt Tumorstammzellen
an. AMARAL et al. (2012) empfehlen Thioridazin auch zur Behandlung der
resistenten und multiresistenten Tuberkulose.
44
2.3.2 Wirkung und Nebenwirkung von Neuroleptika im Hinblick auf
extrapyramidal-motorische Störungen
Antipsychotika entfalten ihre klinische Wirkung hauptsächlich als Antagonisten an
Dopaminrezeptoren (LEHMANN et al. 1997). Dabei hängt bei den typischen
Antipsychotika die Art der antipsychotischen Wirkung linear mit ihrer Affinität zu D2-
Rezeptoren zusammen. D.h. je höher die Affinität ist, desto größer ist die Wirkung
und desto geringer kann die tägliche Dosis ausfallen (AKTORIES et al. 2013). Durch
die Blockade der D2-Rezeptoren entstehen nicht nur gewünschte, sondern auch
unerwünschte Wirkungen (FREISSMUTH et al. 2012).
Durch ihre chemische Ähnlichkeit mit Catecholaminen blockieren die
Phenothiazinderivate eher unspezifisch Rezeptoren der inhibitorischen aminergen
Neurotransmitter, besonders postsynaptische D2-Dopamin- und α1-
Adrenorezeptoren (LEHMANN et al. 1997; ALTHAUS 2010). Phenothiazine
blockieren außerdem stoffspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt auch
muskarinerge Acetylcholinrezeptoren, 5-HT2A-Rezeptoren (Hydroxytryptamin =
Serotonin) und H1-Histaminrezeptoren (OHNO et al. 2011; SHIMIZU et al. 2015).
Die Blockade der D2-Dopaminrezeptoren in der Area postrema bewirkt die
antiemetische Wirkung der Phenothiazinderivate, und die sedative Wirkung wird
durch den Antagonismus der zentralen H1-Histaminrezeptoren hervorgerufen
(ALTHAUS 2010; SHIMIZU et al. 2010). Die Dopaminrezeptoren im Gehirn gehören
zur D1-Rezeptorfamilie, die aus den D1- und D5-Rezeptoren besteht, und der D2-
Rezeptorfamilie, zu der die D2-,D3- und D4-Rezeptoren gehören (ARIAS-CARRIÓN
et al. 2010). Das zentrale dopaminerge System besteht aus vier Systemen: dem
mesolimbischen, dem mesocorticalen, dem tuberoinfundibulären und dem
nigrostriatalen System (ARIAS-CARRIÓN et al. 2010; SHIN et al. 2012). Bei
Blockade von ca. 70-80 % der D2-Rezeptoren im striatalen System durch
Neuroleptika kommt es zu der Entstehung von EPMS (CROCKER et al. 2001;
DIVAC et al. 2014).
Die Theorie der Pathophysiologie der Neuroleptika-induzierten
Bewegungsstörungen geht von einer Blockade der dopaminergen
45
Neurotransmission im nigrostriatalen System aus, ähnlich der Pathogenese des
Morbus Parkinson, welche zu einem Ungleichgewicht zwischen den
Überträgersubstanzen Dopamin, Acetylcholin und Glutamat führt (GOVONI et al.
2001; DOSE 2005). Durch den Dopaminantagonismus an den D2- Rezeptoren im
Bereich des dopaminergen nigrostriatalen Systems kommt es in der Folge zu einer
Störung der Funktion der Basalganglien, welche in Zusammenarbeit mit dem
motorischen Cortex komplexe Bewegungsprogramme ausführen (GOVONI et al.
2001; SHIN et al. 2012). Physiologischerweise hemmt Dopamin als
Neurotransmitter nigrostriataler Neurone über D2-Rezeptoren die efferenten
Gamma-Amino-Buttersäure (GABA)-ergen Neurone und die cholinergen
Schaltneurone im Striatum (ESTLER et al. 2007). Durch den Ausfall der
dopaminergen Hemmung aufgrund der antagonisierenden Wirkung von
Neuroleptika an den Dopaminrezeptoren werden sowohl Glutamat als
exzitatorischer Neurotransmitter der motorischen Schleife als auch die striatalen
cholinergen Schaltneurone überaktiv, so dass es insgesamt zu einer erhöhten
Aktivität der indirekten inhibitorischen motorischen Schleife kommt (THANVI et al.
2009; SHIN et al. 2012). Die Neurone des Nucleus subthalamicus, welcher
funktionell zu den Basalganglien zählt, werden überaktiv, da die Aktivität der
thalamischen GABA-ergen Neurone vermindert ist. Das Ergebnis ist ein erhöhter
inhibitorischer Tonus aus den Basalganglien, der zu den extrapyramidalen
Nebenwirkungen führt (GOVONI et al. 2001; ESTLER et al. 2007).
Der Dopaminmangel bedingt dabei die als Minussymptomatik bezeichneten
Symptome Akinesie und Bradykinesie, der Acetylcholinüberschuss, welcher durch
die reduzierte dopaminerge Hemmung und die verstärkte glutamaterge Erregung
entstanden ist, die als Plussymptomatik bezeichneten Symptome Rigor, Tremor und
erhöhte Muskelspannung (AKTORIES et al. 2013) . Die Pathogenese des Morbus
Parkinson und der Neuroleptika-induzierten EPMS ist aber komplexer, hängt nicht
nur von der D2-Rezeptorblockade ab und ist daher Gegenstand der aktuellen
Forschung (DOSE 2005; MUTSCHLER 2012; SHIN et al. 2012; FRIEDMAN 2014).
Auch die Antipsychotika der zweiten Generation, die atypischen Neuroleptika,
zeigen Formen von EPMS als Nebenwirkung (PRINGSHEIM et al. 2011). In Studien
46
zu den Nebenwirkungen dieser Präparate treten Prävalenzen von EPMS in den
Behandlungsgruppen auf, die denen der Placebogruppe gleichen. Desweiteren
treten bei dieser zweiten Generation der Neuroleptika endokrinologische,
metabolische und kardiale Nebenwirkungen auf (FLEISCHHACKER et al. 2005;
SHIRZADI et al. 2006; PELUSO et al. 2012).
Als Risikofaktoren für das Auftreten von Neuroleptika-induzierten EPMS gelten
fortgeschrittenes Alter und weibliches Geschlecht (KLEBE 2014). Mit zunehmenden
Alter kommt es durch die physiologische Zelldegeneration zu einer Abnahme der
Dopaminkonzentration in der Substantia nigra (SUSATIA et al. 2009; THANVI et al.
2009; KLEBE 2014), bei Frauen scheint die Suppression der Dopaminrezeptoren
durch Östrogen ein zusätzliches Risiko zu sein (KLEBE 2014).
EPMS durch klassische Neuroleptika äußern sich in Form von Dystonie, Akathisie,
Dyskinesien und dem als Parkinsonoid bezeichneten medikamenteninduzierten
Parkinson-Syndrom (LEHMANN et al. 1997). Epidemiologischen Studien zufolge
kann die Prävalenz für Neuroleptika-induzierte EPMS sehr hoch sein, bei
geriatrischen Patienten kann die Parkinson-Symptomatik besonders ausgeprägt
sein (CASEY 1991; HASSIN-BAER et al. 2001).
Abbildung 8 zeigt die aus Patientensicht relevantesten Nebenwirkungen der
klassischen Neuroleptika.
47
Abbildung 8: Die in Bezug auf die Lebensqualität aus Sicht der Patienten (n=504) relevantesten Nebenwirkungen klassischer Neuroleptika (LAUX et al. 2013).
Die Neuroleptika-induzierte Parkinsonsymptomatik wird im englischen Sprachraum
als „neuroleptic induced parkinsonism “ (NIP) bezeichnet (LEIGUARDA et al. 1997).
Diese Symptomatik umfasst motorische Störungen, welche ein Zittern (Tremor),
einen erhöhten Muskeltonus (Rigor), Beeinträchtigungen im Gangbild durch
Kleinschrittigkeit, gebeugte Körperhaltung, Haltungs- und Gleichgewichtsprobleme,
Steifheit, reduzierte Mimik, Akathisie und Bradykinesie beinhalten. Eine erhöhte
Speichelflussrate kann auch auftreten, und dies wird von den Patienten als sehr
belastend empfunden (DOSE 2005; FLEISCHHACKER et al. 2005).
Ein Parkinsonoid tritt meist sehr früh im Behandlungsverlauf auf. Das maximale
Risiko besteht zwischen dem 5. und dem 30. Behandlungstag. Fünfzig Prozent der
Patienten entwickeln akute EPMS in den ersten Behandlungstagen, wobei 90 % der
Fälle in den ersten zehn Behandlungswochen auftreten (FLEISCHHACKER et al.
2005; DIVAC et al. 2014). Im Unterschied zum idiopathischen Morbus Parkinson ist
das Neuroleptika-induzierte Parkinsonsyndrom bilateral symmetrisch ausgeprägt,
wobei Bradykinesie, Akinesie und Rigor stärker im Vordergrund stehen und der
Tremor meist gröber ist (DOSE 2005; SHIN et al. 2012).
48
Als Akathisie wird ein Zustand krankhafter Bewegungsunruhe bezeichnet, dem
sowohl eine motorische als auch eine subjektive Komponente zugrunde liegen. Die
motorische Komponente ist gekennzeichnet durch Bewegungsdrang und
zwanghaftes Ausführen von Bewegungen. Die dabei auch subjektiv stark gefühlte
Unruhe ist für viele Patienten belastender als der Bewegungsdrang. Die Akathisie
gehört genauso wie der Parkinsonoid zu den frühen Nebenwirkungen, sie können
mitunter schon nach der ersten Neuroleptikagabe auftreten (DOSE 2005;
FLEISCHHACKER et al. 2005; COUREY 2007).
Die Bradykinesie bezeichnet eine Verlangsamung der Willkürmotorik (CHOUINARD
et al. 2005; SHIMIZU et al. 2015). Dystonien führen zu unwillkürlichen Kontraktionen
der Muskulatur durch eine Störung im Muskeltonus. Die Folge sind abnormale
Haltungen und Fehlstellungen des Körpers oder einzelner Körperteile.
Unwillkürliche Bewegungen der Patienten werden in diesem Zusammenhang als
Dyskinesien bezeichnet (CHOUINARD et al. 2005).
Die tardive Dyskinesie (Spätdyskiniesie) wird als die schwerwiegendste
Nebenwirkung einer Neuroleptikabehandlung genannt. Die durchschnittliche
Prävalenz liegt bei 24 % aller Patienten mit einer chronischen Erkrankung
(MODESTIN et al. 2008). Tardive Dyskinesien können nach Tagen oder erst nach
Wochen der Behandlung mit Neuroleptika auftreten, sie entwickeln sich in der Regel
nach mehrmonatiger bis mehrjähriger Therapie (GAEBEL 1993; TANDON et al.
2002). Häufig treten sie erst bei Dosisreduktion oder bei Absetzen der Neuroleptika
als Entzugsdyskinesien auf (BURNS et al. 2002). Tardive Dyskinesien beinhalten
periorale Bewegungsunruhe, Kopf- und Rumpfschiefhaltungen sowie unwillkürliche
Bewegungen der Extremitäten (DOSE 2005). Diese Spätdyskinesien können
irreversibel sein, weshalb ein Screening alle drei bis sechs Monate bei einer
Langzeit- oder Dauertherapie mit Neuroleptika empfohlen wird. Risikofaktoren für
das Auftreten von Spätdyskinesien sind fortgeschrittenes Alter und die Dauer der
kontinuierlichen Neuroleptikabehandlung (GAEBEL 1993; TANDON et al. 2002;
FLEISCHHACKER et al. 2005; COUREY 2007). In Tabelle 2 sind die
unerwünschten Wirkungen der typischen Neuroleptika, ihre Symptome und
Häufigkeiten sowie Behandlungsmöglichkeiten zusammengefasst. Auch die
49
Wirkung der Neuroleptika auf weitere neuronale Systeme, die im Rahmen dieser
Arbeit nicht im Fokus stehen, sind in Tabelle 2 kurz skizziert.
Tabelle 2: Unerwünschte Wirkungen typischer Neuroleptika, ihre Symptome und Häufigkeiten sowie Behandlungsmöglichkeiten. Nach ESTLER et al. (2007).
Neuronales System Syndrom Symptome Häufig -
keit zeitliches Auftreten Behandlung
Extra-pyramidal-
motorisches System
Frühdyskinesien Verkrampfung
Muskulatur, v.a. Kopf-Hals-Bereich
~ 5% 1.-5. Tag zentrale Anticholinergika
Extra-pyramidal-
motorisches System
Parkinsonoid Hypo- oder Akinesie,
Rigor, Tremor, Hypersalivation
~ 20-30% bis 8 Wochen
zentrale Anticholinergika, Dosisreduktion
Extra-pyramidal-
motorisches System
Akathisie Bewegungsdrang, Unruhe ~ 25% bis 12
Wochen
Dosisreduktion, Wechsel Neuroleptikum, evtl.
Benzodiazepine
Extra-pyramidal-
motorisches System
Spätdyskinesien (tardive
Dyskinesien)
hyperkinetisches Dauersyndrom (oft
irreversibel), choreaartige Formen,
periorale Bewegungsunruhe
~ 20% > 8
Wochen bis 3 Jahre
Wechsel auf Clozapin, Dosiserhöhung
Extra-pyramidal-
motorisches System
malignes neuroleptischen
Syndrom
Notfall: Rigor, Akinese, Fieber, Tachykardie,
Koma
selten,~ 0.5%
erste 2 Wochen
Sofortiges Absetzen der Neuroleptika, Dantrolen
i.v.
Tubero-infundibuläres
System
Hyper-prolaktinämie
Gynäkomastie, Galaktorrhö,
Appetitsteigerung, Libidostörung
~ 20-30% gesamte Therapie-
dauer
Dosisreduktion, Wechsel auf atyp. Neuroleptikum
Mittelhirn
Weckreaktion ↓, Vigilanzabnahme,
pharmakogene Depression
Müdigkeit, Reaktionsfähigkeit ↓
regel-mäßig
gesamte Therapie-
dauer
Dosisreduktion, Wechsel auf Benzamide
Gesamtes Gehirn
Krampfschwelle ↓ epileptische Krämpfe
bei Patienten mit Vorschädigung
selten gesamte Therapie-
dauer
Dosisreduktion, Antiepileptika
Vegetatives Nerven-system
antiadrenerg, anticholinerg
Hypotonie, Tachykardie,
Mundtrockenheit, Obstipation, Mydriasis,
Akkomodations,-Miktionsstörungen,
Kardiotoxizität
häufig gesamte Therapie-
dauer
Dosisreduktion, Sympathomimetika,
Wechsel zu Butyrophenone
Eine der ersten Studien zum Vorkommen von EPMS unter Neuroleptikatherapie aus
den späten 1950er Jahren fand heraus, dass mehr als 40 % der Patienten, die das
Neuroleptikum Chlorpromazin erhielten, einen Parkinsonoid entwickelten. Über
50
80% der Patienten entwickelten mehr als eine Form der EPMS (SHIN et al. 2012).
MODESTIN et al. (2008) berichten über Prävalenzen für EPMS aus einer Studie im
Jahre 2003/2004. Dabei lag die Prävalenz für Parkinsonoid bei 29 %, für Akathisie
bei 14 % und für eine tardive Dyskinesie bei 13 %. Laut COUREY (2007) kommen
EPMS bei bis zu 75 % der Patienten, die mit typischen Neuroleptika behandelt
werden,vor. CASEY (1991) gibt eine Prävalenz von 90 % an. Die große Spannweite
in der Prävalenz erklärt sich dadurch, dass es gerade in den früheren Studien
Schwierigkeiten gab, dieses Neuroleptika-induzierte Parkinsonsyndrom zu
definieren und zu quantifizieren. Im Jahre 1968 wurde die Simpson-Angus Skala
zur Quantifizierung der Symptomatik eingeführt, und diese wird bis heute dafür
genutzt (HAWLEY et al. 2003; FRIEDMAN 2014). Weitere
Quantifizierungsmöglichkeiten sind die Barnes Akathisia Skala (BAS), die Abnormal
Involuntary Movements Scale (AIMS), die Extrapyramidal Symptom Rating Scale
(ESRS) und die WHO-Instrumente zur Erfassung der Lebensqualität bei Personen
mit physischen oder psychischen Erkrankungen (MODESTIN et al. 2008;
PRINGSHEIM et al. 2011).
Neuroleptika-induzierte EPMS beinträchtigen ernsthaft das Alltagsgeschehen und
die Lebensqualität der Patienten und beeinflussen somit auch die Therapietreue
(CASEY 1991; TANDON et al. 2002; COUREY 2007; SHIMIZU et al. 2015). Gerade
ältere Personen sind stark betroffen, da es durch die Beeinträchtigung des
Gangbildes zu einer Einschränkung der Unabhängigkeit kommt und das Risiko
eines Sturzes stark ansteigt (FRIEDMAN 2014). Eine verminderte Therapietreue
führt im Allgemeinen zu einer Verschlechterung der Prognose und zu einer
Erhöhung des Rezidivrisikos (FLEISCHHACKER et al. 2005). In Abbildung 9 sind
die Belastungen der Patienten und die daraus resultierenden Folgen dargestellt.
51
Abbildung 9: Belastungen von Patienten und ihrem Umfeld durch EPMS und die Auswirkungen auf die Effektivität der Behandlung (FLEISCHHACKER et al. 2005).
TOLLEFSON et al. (1997) geben an, dass die Nebenwirkungen der Neuroleptika
für mehr als 50 % der Therapieabbrüche verantwortlich sind, wobei die EPMS als
Hauptgrund und schwerwiegendste Nebenwirkung angeführt werden.
Die meisten dieser EPMS verschwinden mit dem Absetzen oder der Verringerung
der Dosierung der Medikamente, mit Ausnahme der tardiven Dyskinesien, die als
schlecht therapierbar gelten (COUREY 2007; SHIN et al. 2012). Die
Standardtherapie sowie die Prophylaxe beruhen auf der Gabe von Anticholinergika
wie z. B. Biperiden (COUREY 2007; DESMARAIS et al. 2014; FRIEDMAN 2014).
Zu beachten sind dabei die möglichen Nebenwirkungen der Anticholinergika,
welche kognitive Beeinträchtigungen und ein eventuell erhöhtes Risiko für
Spätdyskinesien umfassen (GOVONI et al. 2001). Durch deren euphorisierende
Wirkung ist auch ein gewisses Missbrauchspotential gegeben (DOSE 2005;
FLEISCHHACKER et al. 2005; FRIEDMAN 2014).
Wie Einzelfallberichte zeigen, kommen auch in der Veterinärmedizin
arzneimittelinduzierten EPMS vor und diese sind als Differentialdiagnose mit in
Betracht zu ziehen. Die antiadrenerge Wirkung der Phenothiazine führt zu einer
Vigilanzstörung, welche sich in Teilnahmslosigkeit der Tiere äußert und auch zu
52
einer Aufhebung bestimmter Reflexe führt (ALTHAUS 2010). Eine Gabe von
Phenothiazinen in hoher Dosierung ist gekennzeichnet durch Anzeichen einer
extrapyramidalen Stimulation: die Symptome sind dabei ähnlich denen der
Parkinson’schen Krankheit (LÖSCHER 2014). Beim Pferd äußert sich dies in
Muskelzittern, Verlangsamung und Kontrollverlust aller Bewegungen, unwillkürliche
Bewegungsstörungen und Koliksymptomatik (LEVIONNOIS 2007). EPMS können
sich bei Tieren aber auch in Form von Muskelrigor und Katalepsie äußern: der
Fluchtreflex wird dabei unterbunden (ALTHAUS 2010).
LEEUW et al. (1979) beschreiben EPMS bei einem Hund nach Haloperidol-
Intoxikation. Der Hund befand sich in Seitenlage in einem konvulsiven Stadium mit
tonisch-klonischen Anfällen, führte kreisende Bewegungen mit allen Läufen aus und
zeigte keine Reaktion auf Ansprechen. Der Hund wurde symptomatisch behandelt:
zur Behandlung der EPMS bekam er das Anticholinergikum Orphenadrin.
STARKEY et al. (2008) beobachteten EPMS bei einem Gelbbrustara (Ara
ararauna). Eine Haloperidolüberdosierung äußerte sich in diesem Fall in
Umherlaufen, zum Teil auch im Kreis, Kopfschütteln, intermittierende Ataxie und
Muskeltremor. Wie auch bei Menschen mit arzneimittelinduzierten EPMS besserte
sich der Zustand des Gelbbrustaras nach Gabe des Antihistaminikums
Diphenhydramin, welches in den USA zur symptomatischen Behandlung von
Parkinson und extrapyramidalen Dyskinesien zugelassen ist (BROCKS 1999).
SHIMIZU et al. (2015) induzierten EPMS in Mäusen, indem sie Haloperidol in einer
Dosierung von 0,5 mg/kg intraperitoneal applizierten. Sie führten dadurch eine
leichte Bradykinesie herbei, welche sie 30 Minuten nach der Injektion in einem
Verhaltenstest (Pole-Test) nachwiesen. OHNO et al. (2011) und TATARA et al.
(2012) induzierten eine EPMS - Symptomatik (Bradykinesie und Katalepsie) bei
Mäusen bereits ab einer Dosierung von 0,3 mg/kg Haloperidol intraperitoneal.
53
2.3.3 Das Phenothiazinderivat Mepazin
Mepazin gehört zu der Stoffklasse der Phenothiazinderivate der ersten Generation
und wurde im Jahr 1954 von Prof. Dr. Otto Nieschulz in Deutschland entwickelt
(SIMPSON 1957; HOOPER 1958). Mepazin wurde unter dem Handelsnamen
„Pacatal" als Antipsychotikum der ersten Generation eingesetzt (FELDMAN 1957;
RUDY et al. 1957; WHITTIER et al. 1960). In den 1950er und 1960er Jahren wurde
Mepazin hauptsächlich zur Behandlung psychischer Erkrankungen und
Unruhezuständen eingesetzt. HOOPER (1958) und DAVIES et al. (1956) testeten
aber auch die Eignung von Mepazin als Anästhetikum während chirurgischer
Eingriffe oder als Narkoseprämedikation. Bei Versuchen Mepazin als Analgetikum
bei Frauen unter der Geburt einzusetzen, erhöhte sich die Anzahl der
Zangengeburten (PURKIS 1960). Dennoch konnte bei den genannten Indikationen
die Überlegenheit von Mepazin im Vergleich zu den konventionellen Medikamenten
nicht herausgestellt werden.
In Abbildung 10 ist die Strukturformel von Mepazin dargestellt. Mepazin liegt als
Enantiomer in der (R)- und (S)-Form vor (SCHLAUDERER et al. 2013a).
Abbildung 10: Strukturformel von Mepazin (C19H22N2S) (NAGEL et al. 2012; SCHLAUDERER et al.
2013b). Der Stern markiert das Chiralitätszentrum.
54
Auch in den Studien zur antipsychotischen Wirkung von Mepazin zeigte sich, dass
Mepazin anderen Phenothiazinderivaten hinsichtlich der Effektivität der Behandlung
psychotischer Patienten unterlegen ist. Dies führte dazu, dass Mepazin vom Markt
genommen wurde (LOMAS 1957; SARWER-FONER et al. 1957; CASEY et al.
1960; KLEIN 2007). DENBER (1958) bezeichnete es sogar als unwirksam, er setzte
Mepazin jedoch in niedrigeren Dosierungen als die anderen Autoren ein. Die
Dosierungen in den Studien lagen zwischen 75 mg – 300 mg täglich, verabreicht in
Tablettenform oder als intramuskuläre Injektion.
Durch NAGEL et al. (2012) rückte Mepazin wieder in den Vordergrund. Die
Forschergruppe entdeckte, dass Mepazin MALT1 in vitro und in vivo reversibel
hemmt. MC GUIRE et al. (2014) zeigten an einem Mausmodell der multiplen
Sklerose, der sogenannten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis
(EAE), dass auch hier Mepazin ein vielversprechender Therapieansatz sein kann.
Auch in der Veterinärmedizin wurde Mepazin eingesetzt. KOCH et al. (1958) und
MCCARTOR (1959) veröffentlichten eine experimentelle Arbeit, in der sie den
Einsatz von Sedativa in der Fütterungsration von Mastochsen testeten. Theoretisch
sollten die Sedativa die Tiere dahingehend beruhigen, dass keine Energieverluste
durch Nervosität oder unnötige Muskelaktivität auftraten und somit mehr Energie für
Wachstum und Mast zur Verfügung stand. Dem Futter der Ochsen wurde Mepazin
unter dem Handelsnamen „Paxital“ beigemischt, es hatte aber keinerlei Auswirkung
auf die täglichen Gewichtszunahmen oder die Futtereffizienz.
LORD et al. (1957) testeten die klinische Effektivität von Mepazin als Sedativum an
50 Hunden. Die Autoren bescheinigten Mepazin eine zufriedenstellende
Wirksamkeit bei der Reduzierung von Nervosität und Stress, der
Narkoseprämedikation sowie der Unterdrückung der Östrussymptome der Katze.
Als Nachteil sahen die Autoren die fehlende analgetische Wirkung an.
Mepazin/Paxital findet zwar noch in späteren Publikationen Erwähnung (SCHEIDY
1961), konnte sich aber in der Veterinärmedizin als Sedativum nicht durchsetzen,
da stärker wirksame Präparate wie z.B. Acepromazin auf den Markt kamen
(ALTHAUS 2010).
55
Aktuelle Daten zur Pharmakokinetik und Pharmakodynamik existieren für Mepazin
zurzeit nicht.
Die im in vitro Experiment eingesetzte Dosis von Mepazin betrug 16 mg/kg,
entnommen aus zwei aktuellen Studien von MC GUIRE et al. (2014), welche Mäuse
zweimal täglich mit 8 mg/kg intraperitoneal behandelten, und NAGEL et al. (2012),
welche 16 mg/kg Mepazin einmal täglich ebenfalls intraperitoneal verabreichten.
Diese Dosierung entspricht einer Verabreichung von 400 µg Mepazin pro Maus (Ø
Körpergewicht 25g) (NAGEL et al. 2012). In keiner dieser zwei genannten Studien
erfolgten Untersuchungen hinsichtlich der durch Mepazinapplikation möglichen
Ausbildung von EPMS.
2.3.4 Das Anticholinergikum Biperiden in der Therap ie Neuroleptika-
induzierter EPMS
Biperiden ist als Anticholinergikum ein Inhibitor der muskarinergen Acetylcholin-
Rezeptoren. Es wird in Deutschland unter dem Handelsnamen Akineton® und als
Generikum vertrieben und ist für die Behandlung des Neuroleptika-induzierten
Parkinsonoid sowie die des Rigors und Tremors bei Morbus Parkinson Patienten
zugelassen (GRIMALDI et al. 1986; IWATA et al. 2005; KLINKENBERG et al. 2012).
Biperiden besitzt eine 10-fach höhere Affinität zu dem Muskarinrezeptor-Subtyp M1
und ist somit ein hochselektiver M1-Rezeptorantagonist (KLINKENBERG et al.
2012). Es wirkt dabei als kompetitiver Rezeptorantagonist und blockiert die
zentralen und peripheren Muskarinrezeptoren (BROCKS 1999; OGINO et al. 2014).
Durch degenerative Veränderungen kommt es beim Parkinson-Syndrom im Corpus
striatum zu einer Dopaminmangelsituation (BROCKS 1999). Infolgedessen entsteht
eine Imbalance zwischen den exzitatorisch-cholinergen und inhibitorisch-
dopaminergen Neurotransmittern. Biperiden hemmt dabei vor allem die zentrale
cholinerge Impulsweiterleitung durch reversible Bindung an die
Acetylcholinrezeptoren. Bei einem medikamentös induzierten Parkinsonsyndrom
entwickelt sich dieser Zustand ohne Degeneration der Nervenzellen (MUTSCHLER
56
2012). Durch die Blockade der zentralen muskarinergen Acetylcholinrezeptoren
unterdrückt Biperiden die durch Neuroleptika-induzierten extrapyramidal-
motorischen Nebenwirkungen (BROCKS 1999; MUTSCHLER 2012). Abbildung 11
zeigt die Strukturformel von Biperiden.
Abbildung 11: Strukturformel von Biperiden (C21H29NO). Biperiden liegt als Racemat 1:1 in den in dieser Abbildung gezeigten Strukturformeln vor (© Prof. Dr. Jürgen Martens, Laboratorium für Organische Chemie, Institut für Chemie, Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften, Carl von Ossietzky Universität Oldenburg).
Die höchste Plasmakonzentration wird beim Menschen ein bis zwei Stunden nach
oraler Einnahme erreicht. Als zentrale Nebenwirkungen werden Benommenheit,
Schwindel und Kopfschmerzen beschrieben, verschwommenes Sehen, Mydriasis,
Mundtrockenheit und Obstipation können als periphere Nebenwirkungen auftreten
(KLINKENBERG et al. 2012; DESMARAIS et al. 2014). GIELING et al. (2013)
nennen auch motorische Unruhe, Hyperaktivität und Ataxie als weitere, häufig
beobachtete Nebenwirkungen einer Biperidengabe.
Die Empfehlungen für die therapeutische Dosierung liegen bei 1 - 4 mg, maximal
16 mg pro Person und Tag (FRÖLICH et al. 2013). Zu beachten ist, dass bei älteren
Patienten die kognitive Leistungsfähigkeit durch Biperiden beeinträchtigt werden
kann (WEZENBERG et al. 2005). Ein Missbrauch von Anticholinergika wie
Biperiden führt zu Euphorie und Psychosen (ESPI MARTINEZ et al. 2012;
DESMARAIS et al. 2014).
57
MODESTIN et al. (2008) berichten, dass in einer Studie aus dem Jahre 1995 33 %
der Patienten mit Neuroleptika-induzierten EPMS durch Biperiden in einer
Dosierung von 5,4 ± 2,5 mg/Tag behandelt wurden, 2004 waren es 20 % und die
Biperidendosierung lag bei 5,0 ± 2,3 mg/Tag.
In Übereinstimmung mit der Ärzteschaft und der Weltgesundheitsorganisation
(WHO) sollten Anticholinergika nicht generell prophylaktisch an Patienten unter
antipsychotischer Therapie verabreicht werden (WORLD HEALTH
ORGANIZATION 2012; DESMARAIS et al. 2014). Die prophylaktische Gabe von
Anticholinergika erfolgt aber zur Vermeidung der EPMS und somit zur Erhöhung der
Therapietreue der Patienten (OGINO et al. 2014). Argumente gegen diese
Prophylaxe stützen sich auf das Nebenwirkungsprofil der Anticholinergika und auf
die Tatsache, dass nicht alle Patienten unter Neuroleptikatherapie EPMS
entwickeln (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1990).
HANNA (1960) untersuchte in einer der ersten Studien die Toxizität von Biperiden.
Als letale Dosis (LD50) für Ratten und Hunde gibt der Autor 750 mg/kg bzw. 340
mg/kg an; die Dosierungsempfehlung für Menschen liegt hier zwischen 2 – 8 mg
pro Tag.
Biperiden hat bisher in der veterinärmedizinischen Praxis nur geringe Bedeutung.
LEEUW et al. (1979) geben ein Dosierungsschema für Biperiden bei Neuroleptika-
induzierten EPMS bei Hunden an. Die initiale Dosis beträgt 0,05 mg/kg
intramuskulär. Nach 30 – 60 Minuten oder bei Wiedereinsetzen der Symptome
werden weitere 0,025 mg/kg intramuskulär verabreicht, bis es zu einem Sistieren
der Symptomatik kommt. Dabei sollte eine Dosis von 2 mg/kg pro Tag nicht
überschritten werden.
WALZER et al. (2006) empfehlen Biperiden zur Behandlung der EPMS nach Gabe
eines Langzeitphenothiazins bei Einfangen und Umsiedlung von Przewalskipferden
und Transkaspischen Halbeseln (Kulan).
Zudem findet es Anwendung in der Induktion von Beeinträchtigungen der kognitiven
Fähigkeiten in tierexperimentellen Projekten zur Erforschung von Krankheiten wie
Morbus Alzheimer (ZACARIAS et al. 2012; GIELING et al. 2013).
58
ZACARIAS et al. (2012) injizierten in ihrer Studie Mäusen Biperiden in einer
Dosierung von 10 mg/kg intraperitoneal; diese Dosierung übernahmen wir für die
hier vorliegende Studie.
2.3.5 Die Paracaspase MALT1 als therapeutisches Zie l des
Phenothiazinderivates Mepazin
Die Paracaspase MALT1 (Mucosa Associated Lymphoid Tissue lymphoma
translocation protein 1) kommt ubiquitär vor (MORGAN et al. 1999). ROSEBECK et
al. (2011a), STAAL et al. (2011a) und THOME et al. (2010) wiesen MALT1 in B- und
T-Zellen nach, KARIM et al. (2015) bewiesen das Vorkommen in Thrombozyten.
Identifiziert wurde sie im MALT-Lymphom als cellular inhibitor of apoptosis 2/MALT1
Onkoprotein (c-IAP2/ MALT1), welches durch eine chromosomale Translokation
entsteht (AKAGI et al. 1999; DIERLAMM et al. 2008; HACHMANN et al. 2015).
Dieses c-IAP2/ MALT1-Onkoprotein wird häufig in Marginalzonen (MALT)-
Lymphomen nachgewiesen und führt zur Deregulation des Nuclear Factor 'kappa-
light-chain-enhancer' of activated B-cells (NF-κB) (ZHOU et al. 2005; DIERLAMM
et al. 2008; KINGETER et al. 2010; FONTAN et al. 2012; FONTÁN et al. 2013). c-
IAP2 ist ein potenter Apoptosehemmer und verhindert so den programmierten
Zelltod (CONTE et al. 2006; PELZER et al. 2013). Die t(11;18)(q21;q21)-
Translokation ist die häufigste und in bis zu 55 % der niedrigmalignen MALT-
Lymphomen zu finden (FONTAN et al. 2012). Bei der Suche nach einem oder
mehreren Genen, die in der Pathogenese der Marginalzonen B-Zell-Lymphome
vom MALT-Typ involviert sind, haben MORGAN et al. (1999) DNA von Tumorzellen
um das Chromosom 18q21 mit der genannten Translokation analysiert. Dort fanden
sie homologe Sequenzen zu Genen, die für die Immunglobulingen-Superfamilie und
Caspasen kodieren. Eine weitere Translokation in MALT-Lymphomen ist
t(1;14)(p22;q32), welche zu einer Überexpression von B-cell lymphoma/leukemia
10 (Bcl10) führt (MCALLISTER-LUCAS et al. 2011; ROSEBECK et al. 2011b).
Beide Translokationen wirken als NF-κB-Aktivatoren und führen somit zu einer
59
erhöhten B-Zellproliferation, die die Entstehung von MALT-Lymphomen fördert
(RUEFLI-BRASSE et al. 2003; PELZER et al. 2013).
MALT1 bekam den Namen Paracaspase aufgrund der Homologie und
Verwandtschaft zu Säugetier-Caspasen und zu der Familie der Metacaspasen
(THOME et al. 2010; HULPIAU et al. 2015). Das Wort Caspase setzt sich
zusammen aus den englischen Wörtern cysteinyl-aspartate specific protease
(LAMKANFI et al. 2002). Caspasen sind wichtige Enzyme der Apoptose und auch
beteiligt an der Zellantwort auf Noxen und bei Entzündungsreaktionen
(THORNBERRY et al. 1998; WIESMANN et al. 2012; MCILWAIN et al. 2013).
Paracaspasen und Metacaspasen sind Caspase-ähnliche Proteine, die in Hefen,
Pflanzen und Protozoen vorkommen (UREN et al. 2000; THOME et al. 2010).
Im Gegensatz zu den gewöhnlichen Caspasen, die ihre Zielproteine spezifisch am
C-terminalen Ende von Aspartat spalten (THORNBERRY et al. 1998; GRÜTTER
2000; UREN et al. 2000), spaltet die Caspase-ähnliche Domäne von MALT1 ihre
Substrate am Argininrest und gilt deshalb als eine argininspezifische Protease
(HACHMANN et al. 2012; YOUNG et al. 2012; HULPIAU et al. 2015).
MALT1 setzt sich aus einer N-terminalen Todesdomäne (DD, engl. Death Domain)
und einer C-terminalen Paracaspase-Domäne zusammen. Die C-terminale
Domäne von MALT1 weist dabei deutliche Homologien zu den katalytischen
Domänen der Caspasen auf (COORNAERT et al. 2008; HULPIAU et al. 2015).
Diese Caspase-Domäne wird N-terminal von zwei und C-terminal von einer
Immunglobulin-ähnlichen Domäne flankiert (THOME et al. 2010; GEWIES et al.
2014). Mit diesen Immunglobulin-ähnlichen Domänen bindet MALT1 konstitutiv an
Bcl10 (LUCAS et al. 2001; CHE et al. 2004; JOST et al. 2006). Abbildung 12 zeigt
schematisch den Aufbau des MALT1-Proteins.
60
Abbildung 12: Schematische Darstellung des MALT1-Proteins. MALT1 enthält N-terminal eine Todesdomäne, gefolgt von zwei Immunglobulin-ähnlichen Domänen, der Caspase-ähnlichen Domäne und am C-terminalen Ende nochmals eine Immunglobulin-ähnliche Domäne (THOME 2008).
Neben dieser Wirkung als Adapterprotein besitzt MALT1 auch eine proteolytische
Aktivität, die für die Aktivierung von T-Lymphozyten wichtig ist (COORNAERT et al.
2008; REBEAUD et al. 2008).
Zu den MALT1-Substraten gehören BCL 10, das Zinkfingerprotein und NF-κB-
Regulatorprotein A20, die NF-κB-Inducing-Kinase (NIK), das Tumorsuppressorgen
Cylindromatosis Gene (CYLD), der Transkriptionsfaktor RelB, die regulatorische
Ribonuclease 1(Regnase-1) und Roquin (COORNAERT et al. 2008; REBEAUD et
al. 2008; ROSEBECK et al. 2011a; STAAL et al. 2011b; HACHMANN et al. 2012;
JELTSCH et al. 2014; HULPIAU et al. 2015).
Die Proteine Carma1 (caspase-recruitment domain [CARD] containing membrane-
associated guanylate kinase [MAGUK] protein 1), Bcl10 und MALT1 bilden
zusammen den sogenannten Carma1/Bcl10/MALT1-Komplex (CBM) und sind
essentielle Faktoren in der antigenrezeptorinduzierten Aktivierung der klassischen
NF-κB-Signalkaskade (THOME 2004; DÜWEL et al. 2009; VUCIC et al. 2009;
STAUDT 2010; HAILFINGER et al. 2011; HACHMANN et al. 2012). Abbildung 13
zeigt die Struktur des CBM-Komplexes.
61
Abbildung 13: Der CBM-Komplex mit Struktur und Interaktionsbereichen, leicht modifiziert nach THOME et al. (2010). Bei Ausbildung des CARMA1-BCl10-MALT1-Komplexes kommt es zu folgenden Interaktionen: 1 CARMA-1 interagiert über die CARD-Domäne mit der CARD-Domäne von BCL10 2 MALT1 bindet mit der Caspase-ähnlichen Domäne an die „Coiled-Coil“-Region von CARMA-1 3 BCL10 bindet über die CARD-Domäne an die beiden Ig-ähnlichen Regionen von MALT1
MALT1 ist für die Erhaltung der Zellvitalität sowie die Aktivierung und Proliferation
der B- und T-Zellen durch rezeptorvermittelte Aktivierung der kanonischen NF-κB-
Signalkaskade verantwortlich (THOME 2008; SCHLAUDERER et al. 2013b). In T-
Zellen vermittelt MALT1 die Aktivierung des NF-κB-Signalweges durch die
signalabhängige Aktivierung des IκBα-Kinase-Komplexes (RULAND et al. 2003).
In Abbildung 14 ist vereinfacht die Bildung des CBM-Komplexes nach Aktivierung
des T-Zell-Rezeptors dargestellt.
62
Abbildung 14: Bildung des CBM-Komplexes. Nach Aktivierung des T-Zell-Rezeptors (TCR) phosphoryliert die Proteinkinase C (PKC) CARMA 1, was zu der Bildung des CARMA1, BCL10, MALT1 (CBM)-Komplexes führt. Dieser CBM-Komplex übermittelt aktivierende Signale, wodurch es zur Ubiquitinierung (U) und zum Abbau des NF-κB-Inhibitors IκBa kommt. Als Folge dessen translozieren die NF-κB-Moleküle in den Zellkern und aktivieren die Transkription von Zielgenen (© Brian C. Schaefer, Ph.D., Uniformed Services University, 4301 Jones Bridge Road, Bethesda, Maryland 20814, USA, 2015).
Der CBM-Komplex spielt eine entscheidene Rolle in der Regulierung des NF-κB-
Signalweges in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen
(ROSEBECK et al. 2011b).
NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor, der eine zentrale Rolle bei
Entzündungsvorgängen und in der Regulation der Immunantwort spielt, indem er
durch Bindung an bestimmte Abschnitte der DNA die Transkription von Zielgenen
beeinflusst (STAAL et al. 2011a).
63
Genetische Knockoutstudien und andere Studien haben die Rolle von NF-κB
sowohl in der Ontogenese des Immunsystems als auch dessen Beteiligung an
vielen Schritten in der Tumorentstehung und der Regulation der Apoptose
beschrieben (HISCOTT et al. 2001).
Eine Deregulation von NF-κB wird mit vielen Erkrankungen wie z. B. AIDS,
Arteriosklerose, Asthma, Diabetes, entzündlichen Darmerkrankungen sowie mit der
Entstehung von Krebs in Zusammenhang gebracht (KUMAR et al. 2004; STAUDT
2010).
Die konstitutive Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB spielt eine große Rolle in
der Tumorentstehung durch Regulation der Expression von Zielgenen, die
Proliferation, Differenzierung und das Überleben der Zellen regulieren (FERCH et
al. 2007; JOST et al. 2007; STAUDT 2010). Die selektive Hemmung der
unkontrollierten Aktivierung des NF-κB-Signalweges ist Gegenstand vieler
Forschungsarbeiten als potentieller therapeutischer Ansatzpunkt (YAMAMOTO et
al. 2001; WHARRY et al. 2009; STAUDT 2010).
Im ABC–DLBCL (engl. activated B-cell like diffus large B-cell-lymphoma =
aktiviertes B-Zellen ähnliches großzelligdiffuses B-Zell- Lymphom) wurde NF-κB als
konstitutiv aktiv nachgewiesen und spielt somit eine entscheidende Rolle in der
Pathogenese dieser Erkrankung (DIERLAMM et al. 2008; NAGEL et al. 2012;
JAWORSKI et al. 2015). Dadurch rückte MALT1 in den Fokus als Therapieansatz
bei MALT1-abhängigen Krebs- und Autoimmunerkrankungen, ursprünglich
ausgehend von einer möglichen, zielgerichteten Behandlung von
Lymphompatienten (SCHLAUDERER et al. 2013b). NAGEL et al. (2012)
identifizierten die Phenothiazinderivate Mepazin, Thioridazin und Promazin als
MALT1-Inhibitoren in einem groß angelegten Screening . Sie untersuchten dabei
18.000 Substanzen auf ihre Fähigkeit, MALT1 zu hemmen, und konnten zeigen,
dass eine Hemmung der MALT1-Protease zu einer Apoptose der Tumorzellen
führte. SCHLAUDERER et al. (2013b) konnten eine hydrophobe Mepazin- und
Thioridazin-Bindungstasche am MALT1-Protein nachweisen und den
nichtkompetitiven, allosterischen Mechanismus der MALT1-Hemmung aufklären.
64
Die Arbeitsgruppe um FONTAN et al. (2012) identifizierte zeitgleich, aber
unabhängig von der Gruppe um NAGEL, ebenfalls einen MALT1-Inhibitor. Dieses
niedermolekulare Wirkstoffmolekül nannten sie MALT1-Inhibitor 2 (MI-2). Im
Gegensatz zu den Phenothiazinderivaten ist MI-2 ein irreversibler Hemmstoff, der
an das aktive Zentrum von MALT1 bindet und die Fähigkeit besitzt, in der Zelle zu
akkumulieren (YOUNG et al. 2012; BURGESS 2013).
2.3.6 Einführung in die Vorarbeiten der Arbeitsgrup pe um Herrn Dr. El Gammal
in der allgemeinchirurgischen Forschung des Univers itätsklinikums
Hamburg-Eppendorf
Aufgrund der zurzeit unbefriedigenden Ergebnisse in der Behandlung des
Pankreaskarzinoms ist es notwendig, neue Therapiestrategien zu entwickeln. Einer
von mehreren Ansätzen ist die Induktion der Apoptose in Tumoren. Unsere
Arbeitsgruppe am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) hat anhand von
in vitro Experimenten zeigen können, dass eine Apoptoseinduktion bei
Pankreaskarzinomzellen MALT1-abhängig ist.
Diese in vitro-Experimente zeigten zum einen, dass MALT1 im humanen
Pankreaskarzinom eine entscheidende Rolle in der Zellproliferation und der
Erhaltung der Viabilität der Zellen spielt, und zum anderen, dass die
Apoptoseinduktion der Pankreaskarzinomzellen MALT1-abhängig ist. Es wurde
nachgewiesen, dass MALT1 im Pankreaskarzinomgewebe und auch in
Tumorzellen exprimiert wird und eine Gabe von Mepazin, einem MALT1-Inhibitor,
zu einer signifikanten Proliferationshemmung und einer Apoptosesteigerung in
humanen Pankreaskarzinomzellen führt ( EL GAMMAL et al. 2015 und teilweise
unveröffentlichte Daten).
Die Therapie möglicher extrapyramidal-motorischer Störungen, die durch eine
Behandlung mit dem Phenothiazinderivat Mepazin hervorgerufen werden, besteht
in der Gabe des Anticholinergikums Biperiden (FRÖLICH et al. 2013). Die in vitro
Vorversuche der Arbeitsgruppe am UKE zeigten desweiteren, dass Biperiden, wie
65
Mepazin, an die allosterische MALT1-inhibierende Tasche bindet und ebenfalls
einen antiproliferativen Effekt hervorruft ( EL GAMMAL et al. 2015 und teilweise
unveröffentlichte Daten).
In der hier vorliegenden Arbeit wurde an immundefizienten Mäusen untersucht, ob
ein therapeutischer Einsatz von Mepazin durch dessen unerwünschte
Nebenwirkungen (d.h. extrapyramidal-motorische Störungen) eingeschränkt ist und
ob diese durch eine Biperiden-Gabe antagonisiert werden können.
2.4 Verhaltensanalysen
Verhaltenstests sind wichtige Komponenten unter anderem in der präklinischen
Forschung bei der Evaluierung potentieller Wirksamkeits- und
Nebenwirkungsprofile von Arzneimitteln (SCHALLERT et al. 2000; DHANUSHKODI
et al. 2011; FLEMING et al. 2013). Welcher Test aber mit welcher Anzahl von
Durchläufen durchgeführt werden sollte, ist Gegenstand erheblicher Debatten und
Diskussionen (SCHALLERT et al. 2000). Die Wahl des Tests ist oft durch
individuelle Präferenzen des jeweiligen Forschers beeinflusst, aber auch durch
Kosten- und Zeitfaktoren. Nicht zuletzt spielt der Aufwand, der zur Durchführung der
Tests betrieben werden muss, eine nicht unerhebliche Rolle (SCHALLERT et al.
2000; KARL et al. 2003).
Die Tests müssen eine Herausforderung sein und das Tier an gewisse Grenzen
bringen, denn sowohl Tiere als auch Menschen besitzen kompensatorische
Mechanismen, die zum Schutz bei einer Verletzung oder anderen
Beeinträchtigungen zum Tragen kommen. Dieser Schutzmechanismus kann dazu
führen, dass insbesondere subtile Veränderungen nur schwer wahrgenommen
werden können (FLEMING 2009; BOUET et al. 2012).
Nicht nur Hirn- und Rückenmarksverletzungen, ein induzierter Schlaganfall,
genetische Manipulationen und andere neurologische Erkrankungen sondern auch
eine pharmakologische Therapie kann zu Veränderungen in den motorischen
66
Fähigkeiten von Mäusen in bestimmten experimentellen Modellen führen (LUONG
et al. 2011).
Ein einziger Test reicht oft nicht aus, um die verschiedenen Ausprägungen
motorischer und sensorimotorischer Defizite darzustellen. Deshalb wird eine
Testbatterie angewandt; somit werden Veränderungen in Gänze erfasst und ein
maximal aussagekräftiges Versuchsergebnis erhalten (BROOKS et al. 2009).
Die meisten Tests wurden ursprünglich für Ratten entwickelt und mussten für Mäuse
angepasst und neu evaluiert werden (CRAWLEY et al. 1997; LI et al. 2004b).
Die im Folgenden beschriebene Testbatterie, bestehend aus dem Spontaneous
Activity in the Cylinder-Test, dem Challenging Beam Traversal-Test und dem
Adhesive Removal-Test sind äußerst aussagekräftige Tests zur Überprüfung der
sensorimotorischen Funktionen in Mäusen (FLEMING et al. 2013).
2.4.1 Der Spontaneous Activity in the Cylinder-Test
Der Spontaneous Activity in the Cylinder-Test, im Folgenden kurz Zylinder-Test
genannt, evaluiert die Spontanaktivität der Mäuse, deren Prüfung als der wichtigste
Test der neuronalen Funktionsfähigkeit gilt. Er wird seit Jahrzehnten eingesetzt, um
Effekte chemischer und physikalischer Beeinflussungen zu testen (MOSER 2011).
Er gilt als leicht durchführbar und wenig zeitintensiv. Desweiteren erfordert dieser
Test kein Vorbereitungstraining der Mäuse und liefert eine akkurate Einschätzung
der lokomotorischen Aktivität (BROOKS et al. 2009). Die spontane Aktivität äußert
sich in einer Zunahme oder Abnahme der willkürlichen Motorik (PIETROPAOLO et
al. 2014).
Der genaue Versuchsaufbau ist im Material und Methoden-Teil dieser Arbeit unter
Punkt 3.4.1 Zylinder-Test ausführlich beschrieben.
Der Zylinder-Test wurde an die Maus adaptiert (LI et al. 2004b) und beruht auf dem
sogenannten „Paw Preference Test“, der in der Schlaganfallforschung und in der
Erforschung des Morbus Parkinson eingesetzt wird. Hier hat man den spontanen
67
Gebrauch der Vorderpfoten bei Aufrichtung zum Anlehnen an einen Glaszylinder
quantifiziert, sowohl nach induziertem Schlaganfall als auch bei der durch 6-
Hydroxydopamin (6-OHDA) Injektion ausgelösten Parkinsonsymptomatik in
Mäusen und Ratten (SCHALLERT et al. 2000; STARKEY et al. 2005; GREALISH
et al. 2010).
Er wurde von LI et al. (2004b) in Schlaganfall-Mausmodellen eingesetzt und gilt als
ein valider Test, der auch bei Langzeitversuchen zuverlässige Daten liefert.
LUNDBLAD et al. (2005) setzten den Zylinder-Test zur Untersuchung des
antiakinetischen Effektes verschiedener Medikamente in einem Mausmodell des
Morbus Parkinson ein. Die spontane Aktivität, anhand der Zahl der Aufrichtungen
und Schritte sowie des Pflegeverhalten quantifizierbar, zeigt sich im explorativen
Verhalten zur Erkundung des neuen Umfeldes.
FLEMING et al. (2013) beobachteten eine signifikante Reduktion der Anzahl der
Hinterfußschritte im Zylinder-Test in einem Mausmodell des Morbus Parkinson im
Vergleich zum Wildtyp. Diese Arbeitsgruppe stuft den Test als besonders sensitiv
auch für geringgradigere Dysfunktionen im nigrostriatalen dopaminergen System
ein. Als Einschränkung wird in diesem Fall jedoch angegeben, dass eine Abnahme
der Aktivität durch einen Gewöhnungseffekt eintreten kann.
2.4.2 Der Challenging Beam Traversal-Test
Der Challenging Beam Traversal-Test eignet sich zum einen zur Beurteilung der
Motorik und Feinmotorik, zum anderen aber auch zur Beurteilung der Koordination
und Balance (CARTER et al. 2001; LUONG et al. 2011; CHESSELET et al. 2012;
SMITH et al. 2012).
Der Maus-Rotarod gilt als der gängigste Test zur Prüfung der motorischen
Koordination und Ausdauer (KARL et al. 2003), ist aber apparativ aufwändig und
die erzielten Ergebnisse sind nur schwer auf den Menschen übertragbar (STANLEY
et al. 2005; LUONG et al. 2011; LEDOUX 2014). Desweiteren gilt der Challenging
Beam Traversal-Test, im Folgenden kurz Beam-Test genannt, auch als sensitiver
68
bezüglich subtiler und frühzeitiger Veränderungen der Motorik und Balance als
andere Tests, wie z.B. der Rotarod (STANLEY et al. 2005; BROOKS et al. 2009;
LUONG et al. 2011; FLEMING et al. 2013). Einen weiteren Vorzug des Beam-Tests
gegenüber dem Rotarod sehen FLEMING et al. (2013) darin, dass der Beam-Test
weniger durch das Körpergewicht der Tiere beeinflusst wird. Besonders alte,
männliche Mäuse, die mehr als 50 g wiegen, fallen schneller vom Rotarod. Dies
kann das Ergebnis des Tests verfälschen
Der genaue Versuchsaufbau ist im Material und Methoden-Teil dieser Arbeit unter
Punkt 3.4.3 Beam-Test ausführlich beschrieben.
Ein über den Balken gelegtes Maschendrahtgitter dient dazu, ein motorisches
Erfahrungslernen zu verhindern, welches bestehende Defizite maskieren könnte,
sowie den Schwierigkeitsgrad zu erhöhen (FLEMING 2009; PIETROPAOLO et al.
2014). Der Beam-Test zeigt sich als ein robuster und zuverlässiger Test zur
Detektion von Beeinträchtigungen der motorischen Funktion und zur Prüfung von
subtilen nigrostriatalen und noradrenergen Defiziten (HWANG 2005;
PIETROPAOLO et al. 2014).
Eine motorische Beeinträchtigung korreliert mit einer erhöhten Fehleranzahl,
welche sich anhand des vermehrten Durchrutschens durch das Gitter zeigt
(ROMMELFANGER et al. 2007).
Nach FLEMING et al. (2011) und HALLETT et al. (2012) hat die Fehleranzahl auf
dem Beam die höchste Aussagekraft bezüglich einer Medikamentenwirksamkeit im
α-Synuclein-Knockout-Mausmodell. Auch STANLEY et al. (2005) halten die
Fehleranzahl im Beam-Test für ein sehr sensitives Maß der motorischen
Koordinationsfähigkeit.
Bei der Aus- und Bewertung des Beam-Tests muss beachtet werden, dass die
Motivation der Maus ein beeinflussender Faktor sein kann. Übertrainierte Mäuse,
die zu oft dem Beam-Test unterzogen werden, werden der Aufgabe überdrüssig und
damit unkooperativ (LUONG et al. 2011). Dies kann sich unter anderem in einer
verlängerten Zeitdauer zur Überquerung des Balkens äußern. Besteht der Verdacht
69
auf motorische Defizite, sollten weitere Tests durchgeführt werden (LUONG et al.
2011).
2.4.3 Der Adhesive Removal-Test
Der Adhesive Removal-Test, im Folgenden kurz Sticker-Test genannt, prüft die
sensorimotorischen Fähigkeiten der Maus (BOUET et al. 2009; BOUET et al. 2012;
WANG et al. 2013). Bei diesem Test können die sensorische und die motorische
Komponente unabhängig voneinander untersucht werden (SCHALLERT 2006). Die
somatosensorische Wahrnehmung wird dabei über die Kontaktzeit bestimmt, d.h.
die Zeit, die die Maus benötigt, um den Aufkleber zu bemerken und Kontakt mit der
Pfote herzustellen. Die zweite Komponente, die Zeitdauer bis zur vollständigen
Entfernung des Aufklebers, wird von der motorischen Ausführung bestimmt
(SCHALLERT 2006).
Der genaue Versuchsaufbau ist im Material und Methoden-Teil dieser Arbeit unter
Punkt 3.4.5 Adhesive Removal-Test ausführlich beschrieben.
Der Sticker-Test wurde ursprünglich von SCHALLERT et al. (1982) zur Erforschung
des Schlaganfalls für Ratten mit nigrostriatalen Schäden entwickelt. Der Test wurde
später für Mäuse adaptiert und findet breiten Einsatz u. a. in Mausmodellen der
Schlaganfallforschung, in Mausmodellen des Morbus Parkinson und in der
Erforschung von Schädel-Hirn-Traumata und Rückenmarksverletzungen
(STARKEY et al. 2005; FRERET et al. 2009; FLEMING et al. 2013).
Der Sticker-Test erfasst sowohl sensorische Defizite, als auch motorische Defizite,
wie sie unter anderem bei einer Akinesie auftreten (LEDOUX 2014).
BOUET et al. (2009) fanden über 250 Literaturverweise in MEDLINE®/PubMed®
zu diesem Test. Für den Sticker-Test gibt es mehrere Ausführungsmöglichkeiten.
Zum einen kann man den Aufkleber an einer oder beiden Pfoten der Maus
platzieren, diese Variante wird häufig in der Erforschung des Schlaganfalls und
anderen unilateralen Läsionen des Zentralnervensystems eingesetzt. Zum anderen
70
wird der Aufkleber auf der Nase der Maus platziert (KULLANDER et al. 2001;
BOUET et al. 2012).
FLEMING et al. (2004), FLEMING et al. (2013) und DHANUSHKODI et al. (2013)
setzen den Aufkleber auf die Nase der Maus bei der Überprüfung motorischer
Defizite im Mausmodell des Morbus Parkinson.
STARKEY et al. (2005) beschreiben den Test als sehr sensitiv im Mausmodell einer
Pyramidenbahnschädigung. Sie setzen dabei die Variante mit der Befestigung des
Aufklebers an den Pfoten ein.
FRERET et al. (2009) zeigten die sehr gute Eignung des Sticker-Tests sowohl bei
der Erfassung von Beeinträchtigungen in einem Mausmodell des Schlaganfalls als
auch bei dessen medikamentöser Behandlung und zur Testung auf
Langzeitschäden. Der Test wird generell als sensitiv, akkurat und leicht
durchführbar beschrieben, so dass auch dieser Test in Medikationstests eingesetzt
wird (BOUET et al. 2012; DHANUSHKODI et al. 2013).
2.5 Die Bedeutung des Doppelknockout Pfp-/-/Rag2-/--Mausmodell
Für die Xenograftversuche wurde spezifisch das Pfp-/-/Rag2-/--Mausmodell gewählt.
Der genetische Hintergrund dieser Mäuse ist C57BL/6;129S6, das heißt der
genetische Hintergrund besteht zu 50 % aus dem Mausstamm C57BL/6 und zu 50
% aus dem Mausstamm 129S6 (TACONIC BIOSCIENCES).
Die Immundefizienz in diesem Mausmodell entsteht durch die Ausschaltung des
pore-forming protein (pfp)-Perforin. Perforin ist ein zytolytisches Protein, welches in
den Granula zytotoxischer T-Zellen und natürlicher Killerzellen (NK-Zellen)
vorkommt, die Zellmembran von Targetzellen zerstört und somit die Apoptose
auslöst (WALSH et al. 1994). Durch das Fehlen des pfp-Proteins kommt es zum
Ausfall der zytotoxischen Wirkung der NK-Zellen (BRODBECK et al. 2014).
71
Die rekombinationsaktivierenden Gene 1 und 2 (RAG1 und RAG2) sind wesentlich
an der Bildung der Immunglobuline und der Antikörperrezeptoren im Zuge der
Desoxyribonukleinsäure–Rekombination durch die Verknüpfung von Variable-,
Diversity- und Joining- Gensegmenten (V(D)J-Rekombination) beteiligt
(MOMBAERTS et al. 1992; SHINKAI et al. 1992; ROTH et al. 1998;
MOSTOSLAVSKY et al. 2004). Die zwei oben genannten RAG-Gene werden nur in
sich entwickelnden Lymphozyten in der Phase, in der die Antigenrezeptoren
zusammengestellt werden, exprimiert (ROTH et al. 1998). Durch den RAG2-
Gendefekt kommt es nicht zu einer Ausreifung von T- und B-Zellen, womit das
adaptive Immunsystem als depletiert betrachtet werden kann (SHINKAI et al. 1992;
SODEUR et al. 2009).
Der Vorteil des Pfp-/-/Rag2-/--Mausmodells gegenüber der severe combined
immunodeficiency (scid) Maus, einem Mausmodell mit schwerem, kombinierten
Immundefekt, besteht darin, dass der genetische Defekt stabil ist. Scid-Mäuse
können „leaky“ (engl. undicht) werden (BOSMA et al. 1988). Das bedeutet, sie
können, wenn sie altern, funktionale B- und T-Zellen entwickeln. Dies kann dann in
der Folge zu einer Abstoßung des Xenotransplantats führen (THOMPSON 1992).
Das Pfp-/-/Rag2-/--Mausmodell gilt als nicht „leaky“ und eignet sich deshalb
besonders gut als xenogenes Tumortransplantationsmodell (SHINKAI et al. 1992;
WALSH et al. 1994; MORTON et al. 2007). Durch die Stabilität der Genmutationen
konnte auf eine Immunglobulintiterbestimmung verzichtet werden. Aufgrund von
Ergebnissen aus der wissenschaftlichen Literatur und der Arbeitsgruppen am
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf fiel die Wahl auf diesen Mausstamm.
2.6 Das Xenograftmodell in onkologischen in vivo Versuchen
Das Maus-Xenograftmodell ist eines der am weitesten verbreiteten Modelle in der
humanen Krebsforschung (TULI et al. 2012; SALUJA et al. 2013; DAI et al. 2015).
Dieses Modell wurde etabliert, um das Tumorwachstum und die
Therapieansprechbarkeit zu untersuchen (TULI et al. 2012). Dabei werden humane
72
Tumorzellen entweder subkutan (die sogenannte heterotrope Transplantation) oder
an der gleichen anatomischen Stelle, an der der Tumor, aus dem die Zellen
stammen, entstand (die sogenannte orthotope Transplantation) injiziert. In
Abhängigkeit von der Anzahl der injizierten Zellen, entwickelt sich in 2 – 5 Wochen
ein Tumor, der dann behandelt werden kann (KIM et al. 2009). Ein weiterer Ansatz
sind gentechnisch veränderte Mäuse (Genetically Engineered Mice, GEM), die
durch Transgene oder knock-out Allele genetische Veränderungen, die in Tumoren
des Menschen nachgewiesen wurden, nachstellen (GUERRA et al. 2013).
Ein Vorteil des subkutanen Xenografts gegenüber des orthotopen ist die einfache
Überprüfbarkeit des Tumorwachstums. Ein subkutaner Tumor ist leicht zugänglich
für eine Größenbestimmung; somit kann auch der Erfolg einer Therapie überprüft
werden (SALUJA et al. 2013; DAI et al. 2015).
Das Xenograftmodell wird von manchen Autoren kritisch betrachtet, da gerade das
Tumormikromilieu im humanen Organismus als ein entscheidender Faktor in der
Kanzerogenese angesehen wird; aber auch die Argumente für und gegen GEM sind
vielfältig (MORTON et al. 2007; RICHMOND et al. 2008; KIM et al. 2009; WILLIAMS
et al. 2013). Ein Vorteil des Xenograftmodells liegt darin, dass das Ansprechen des
humanen Tumors auf ein spezifisches, therapeutisches Regime erforscht werden
kann, und nicht das Ansprechen eines murinen Tumors (RICHMOND et al. 2008;
CHUGH et al. 2012).
Sowohl das Xenograftmodell als auch das GEM-Modell haben ihre Stärken und ihre
Grenzen, erweitern aber das Verständnis der Krebsentstehung und -behandlung
(RICHMOND et al. 2008). Desweiteren sehen RICHMOND et al. (2008) das
Xenograftmodell als ideal bezüglich des Ansprechens humaner Tumore auf
Therapien an und das GEM-Modell als geeignetes Modell zur Erforschung der Rolle
verschiedener Gene in der Tumorentwicklung und -progression.
Bei der Erforschung des Pankreaskarzinoms kommen auch Xenograftmodelle zum
Einsatz (HAHN et al. 1995; KIM et al. 2009; CHUGH et al. 2012; TENTLER et al.
2012; SALUJA et al. 2013).
73
Etablierte Pankreaskarzinomzelllinien können sehr gut zur heterotropen oder
orthotopen Transplantation im Mausxenograftmodell genutzt werden (MORTON et
al. 2007; KIM et al. 2009). Ein Nachteil etablierter Zelllinien gegenüber
Primärtumortransplantaten ist, dass durch die oft jahrelange Zellpassagierung
Zellen selektioniert werden, die nicht mehr repräsentativ für den Originaltumor sind
(MORTON et al. 2007; CHUGH et al. 2012; TENTLER et al. 2012; WILLIAMS et al.
2013).
Zur Xenotransplantation werden sowohl Primärtumore als auch Zelllinien eingesetzt
(MORTON et al. 2007), wobei Zelllinien ein schnelleres Anwachsen zeigen als
Primärtumore. Primärtumore können im Xenograftmodell bis zu 24 Wochen
brauchen, bis sie angewachsen sind (WILLIAMS et al. 2013).
Des Weitern eignen sich Xenograftmodelle sehr gut für Toxizitätsprüfungen, und auf
der Grundlage solcher Studien wurden bereits klinische Studien durchgeführt
(RICHMOND et al. 2008). Xenograftmodelle haben auch zur Entwicklungen
vielversprechender Wirkstoffe beigetragen (WILLIAMS et al. 2013).
Als Limitation des Xenograftmodells muss man erwähnen, dass der Tumor in einem
für ihn unnatürlichen Milieu und unter Ausschluß eines funktionierenden
Immunsystems wächst und dass eine Metastasierung oft nicht stattfindet. Zum
anderen wachsen Xenograftmodelle auf der Basis von Pankreaskarzinomzelllinien
als homogene Tumormasse mit minimaler Infiltration des Stromas, weshalb sie nicht
die humane Tumorarchitektur und die Interaktion mit der Umgebung in Gänze
widerspiegeln. (TENTLER et al. 2012; SALUJA et al. 2013; WILLIAMS et al. 2013).
2.7 Medikamentenapplikation und Injektionstechnik
Die Injektion von Substanzen in die Abdominalhöhle in Form einer intraperitonealen
(i.p.) Injektion ist eine gängige Art der parenteralen Medikamentenapplikation bei
Labornagern (HEDRICH 2012). Bei größeren Säugetieren oder dem Mensch wird
diese Form kaum angewendet (TURNER et al. 2011; HEDRICH 2012). Die i.p.-
Injektion wird insbesondere bei kleinen Spezies wie Maus und Hamster
74
angewendet, da eine intravenöse Applikation bei diesen Spezies zum einen eine
besondere Herausforderung darstellt und zum anderen mit der i.p.-Technik auch
größere Volumina appliziert werden können (HEDRICH 2012). Die Absorption ist
bei i.p.-Gabe etwas langsamer als bei intravenöser Applikation und der First-pass-
Metabolismus der Leber ist durch die Absorption in die Mesenterialgefäße, welche
zur Pfortader ziehen, auch vorgeschaltet (TURNER et al. 2011; HEDRICH 2012).
Generell wird die Geschwindigkeit der Absorption nach Art der Applikation in
folgender Reihenfolge angegeben: Intravenös > intraperitoneal > intramuskulär >
subkutan > per os (HEDRICH 2012).
Substanzlösungen zur intraperitonealen Applikation müssen steril, isotonisch und
nicht reizend sein. Obwohl die Technik als relativ einfach und sicher gilt, ist sie
konzentriert durchzuführen, um Fehlinjektionen und Punktionen innerer Organe zu
verhindern (TURNER et al. 2011; HEDRICH 2012).
CHUGH et al. (2012) behandelten erfolgreich Mäuse in einem humanen
Pankreaskarzinom - Xenograftmodell durch intraperitoneale Applikation des
Medikamentes Minnelide, einer synthetischen Form des aus dem
Spindelbaumgewächs Wilfords Dreiflügelfrucht (Tripterygium wilfordii) gewonnenen
Triptolid.
2.8 Ziele der vorliegenden Arbeit
Sowohl beim Menschen als auch beim Tier sind die Erfolge der bestehenden
therapeutischen Vorgehensweisen beim Pankreaskarzinom zurzeit wenig
zufriedenstellend.
In der vorliegenden Arbeit sollten die Auswirkungen des Phenothiazins Mepazin
anhand einer Verhaltensstudie mit Hilfe etablierter Tests dargestellt werden.
Aufgrund der sehr eindrucksvollen Ergebnisse aus in vitro Experimenten in
verschiedenen humanen Pankreaskarzinomzelllinien ( EL GAMMAL et al. 2015 und
75
teilweise unveröffentlichte Daten) ist davon auszugehen, dass eine
Mepazinbehandlung bei der Bekämpfung eines humanen Pankreaskarzinoms
erhebliche Vorteile (gute Verträglichkeit, geringen Nebenwirkungen) gegenüber
einer Chemotherapie haben wird. Untersucht werden sollten vor allem die
Ausbildung möglicher extrapyramidal-motorischer Störungen (EPMS) und deren
Antagonisierbarkeit mit dem Anticholinergikum Biperiden.
Die vorliegende Arbeit verfolgte das Ziel, die Wirkung von Mepazin als
Monotherapie und von Mepazin und Biperiden als Kombinationstherapie hinsichtlich
der Ausbildung extrapyramidal-motorischen Störungen in einem Mausmodell zur
Erforschung eines neuartigen therapeutischen Ansatzes zur Behandlung des
Pankreaskarzinoms zu untersuchen.
Hierfür wurden folgende Untersuchungen durchgeführt:
1. Die Untersuchung des Einflusses von Mepazin auf EPMS mittels
sensorimotorischer Tests
2. Die Untersuchung des Einflusses von Biperiden auf potentielle motorische
Nebenwirkungen mittels sensorimotorischer Tests
3. Die Untersuchung des Einflusses einer Kombinationstherapie aus Mepazin und
Biperiden auf EPMS mittels sensorimotorischer Tests
76
3 MATERIAL UND METHODEN
Alle Versuche wurden unter Anleitung und Aufsicht von Herrn Dr. Alexander T. El
Gammal auf dem Campus Forschung der Klinik und Poliklinik für Allgemein-,
Viszeral- und Thoraxchirurgie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf
durchgeführt.
3.1 Materialien
3.1.1 Injektionslösungen und Substanzen
Tabelle 3: Injektionslösungen und Substanzen
Injektionslösung Handelsname Firma, Sitz
Biperidenlactat Akineton® 5 mg/ml Injektionslösung
Desma GmbH, Mainz-Kastel
Isotone Kochsalzlösung NaCl 0,9% B. Braun Braun, Melsungen
Ketaminhydrochlorid (100 mg/ml) Ketamin 10% WDT, Garbsen
Mepazin-Hydrochlorid MALT1 Inhibitor II,
Mepazin-Hydrochlorid 25 mg
Calbiochem®Merck Millipore, Billerica, USA
Xylazin (20 mg/ml) Sedaxylan 20mg/ml WDT, Garbsen
Substanzen Handelsname Firma, Sitz
CMF-PBS calcium-magnesium free
phosphate-buffered saline
Gibco® Invitrogen, Eggenstein
CO2/O2 TMG GmbH - Nord, Krefeld
Desinfektionsmittel (Ethanol 94 %ig) Antifect N Liquid Schülke & Mayr GmbH,
Norderstedt
Fötales Kälberserum FBS- Fetal Bovine Serum
Gibco® Invitrogen, Eggenstein
Kulturmedium RPMI 1640 mit L-Glutamin
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX™
Gibco® Invitrogen, Eggenstein
Penicillin/Streptomycin-Lösung Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Gibco® Invitrogen, Eggenstein
Trypsin-EDTA-Lösung Trypsin/EDTA Solution (TE)
Gibco® Invitrogen, Eggenstein
77
3.1.2 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 4: Verbrauchsmaterialien
Material Handelsname Firma, Sitz
1 ml Spritze Omnifix® –F Tuberkulin Braun, Melsungen
Handschuhe Aurelia® Vibrant™ SUPERMAX Deutschland GmbH, Gevelsberg
Kanüle 26G (0,45mm x 13mm) BD Microlance 3® Becton Dickinson GmbH,
Heidelberg
Markierungspunkte Ø 8 mm Avery Zweckform GmbH,
Oberlaindern
Mundschutz MaiMed®- OP-Mundschutz MaiMed GmbH, Neuenkirchen
OP-Haube BARRIER® OP-Haube - Basic
Mölnlycke Health Care GmbH, Erkrath-Unterfeldhaus
Pipetten Aspirationspipette 2 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Pipetten Aspirationspipette 5 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Pipetten Aspirationspipette 10 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Reaktionsgefäße Eppendorf-Gefäße Safe Lock 1,5 ml Eppendorf AG, Hamburg
Zellkulturflasche Zellkulturflasche T-75 Sarstedt AG & Co., Nümbrecht
Zentrifugenröhrchen 15 ml Falcon Tubes Greiner bio one, Frickenhausen
78
3.1.3 Geräte und Software
Tabelle 5: Geräte und Software
Geräte/Software Handelsname Firma, Sitz
CO2-Inkubator Thermo Scientific TM Heracell TM 240i Tri-Gas Inkubator
Thermo Fisher Scientific GmbH, Schwerte
Anatomische Pinzette "STANDARD" HEIKO WILD GmbH Med. Instrumente, Tuttlingen
Aufnahmefunktion in Zeitlupe Application SLOPRO Apple Inc., Cupertino, CA,
USA
Balken aus Holz Hornbach Baumarkt, Hamburg
Glasplatte Protean© Elektrophoresis System
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Glaszylinder SIMAX©, Glashütte
Kavalierglass, a.s., Sazava, Tschechien
Inversmikroskop Primo Vert Carl Zeiss, Jena
Maschengitter Kükendraht Hornbach Baumarkt, Hamburg
Neubauer Zählkammer A. Hartenstein GmbH, Würzburg / Versbach
Ohrlochzange Markierungs-Ø 2 mm Carl Roth GmbH + Co. KG,
Karlsruhe
Pipettierhilfe pipetus© Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG, Eberstadt
Schieblehre Connex COXT710350 Messschieber digital 150 mm
CONMETALL GmbH + Co. KG, Celle
Sicherheitswerkbank Klasse 2 HERAsafe© KS 12 Thermo Fisher Scientific
GmbH, Schwerte
Software Microsoft© Office Excel 2010 Microsoft© Corporation, Redmond, KA, USA
Spiegel (60 x 40 cm) Hornbach Baumarkt, Hamburg
Statistikprogramm SPSS 20 Statistical Package for the
Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA
Videoaufnahmegerät Ipad Air Apple Inc., Cupertino, CA, USA
Vortex-Schüttler FisherbrandTM ZX Wizard vortex mixer FB15013
Fisher Scientific GmbH, Schwerte
Waage EMB 200-2 Kern & Sohn GmbH, Balingen
Zellzähler, mechanisch VWR International GmbH, Darmstadt
Zentrifuge Rotina 35 R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen
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3.1.4 Mausstamm
Für die Versuche wurden 40 mindestens drei Monate alte Pfp-/-/Rag2-/- doppel-
knockout Mäuse beider Geschlechter verwendet. Die Mäuse wurden in der
Versuchstierhaltung des Universitätsklinkums Hamburg-Eppendorf gezüchtet und
stammten ursprünglich vom Taconic-Institut (Quality Laboratory Animals and
Services for Research, DK8680 Ry, Taconic Europe, Denmark). Das Taconic
Mausmodell war der Stamm PFPRAG-MM, und dieser besaß den genetischen
Hintergrund C57BL/6;129S6.
3.1.5 Tierhaltung
Die Tiere wurden in der Versuchstierhaltung des Campus Forschung des
Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf unter standardisierten und speziell
pathogenfreien Bedingungen gehalten. Das Betreten der Haltungsräume erfolgte
ausschließlich nach Bekleiden mit bereitgestelltem Kittel, Laborschuhen,
Mundschutz, OP-Haube und Handschuhen. Alle für die Versuche benötigten
Utensilien wurden unter Standardbedingungen autoklaviert, bevor sie in den
Mausbereich eingeführt wurden.
Die Mäuse wurden in Gruppengrößen von maximal fünf Tieren pro Käfig nach
Geschlecht getrennt gehalten, wobei die Mäuse einer Gruppe jeweils aus dem
gleichen Wurf stammten. Die Haltung erfolgte im einzelbelüfteten Käfigsystem
Sealsafe GM500 IVC Green Line der Firma Tecniplast Deutschland GmbH,
Hohenpeißenberg.
Der Käfig hatte eine Grundfläche von 500 cm² und die maximale
Luftgeschwindigkeit betrug 0,2 m /s auf Höhe der Tiere. Die Raumtemperatur lag
bei 21C° (+/- 2 C°), die relative Luftfeuchtigkeit bei 55 % (+/- 5 %), die Belichtung
während eines 12 Stunden Tag/Nacht-Rhythmus fand von 06.00 bis 18.00 Uhr in
der Sommerzeit und von 05.00 bis 17.00 Uhr in der Winterzeit statt.
80
Die Tiere wurden einmal wöchentlich umgesetzt und Futter sowie Wasser standen
zur ad libitum Aufnahme bereit. Das verwendete Futter war das standardisierte
Alleinfuttermittel Rod16-R für Ratten und Mäuse der Firma LASvendi GmbH, Soest.
Entsalztes, autoklaviertes Leitungswasser stand durch außen am Käfig anliegende
Trinkflaschen jederzeit bereit.
Eingestreut wurden die Käfige mit der Einstreu AB 368 aus Espenholz der Firma
AsBe-wood GmbH, Buxtehude.
Die Käfige wurden zusätzlich mit mehreren Papiertüchern aus ungebleichtem
Zellstoff als Nestmaterial ausgestattet, um den Tieren eine Rückzugsmöglichkeit zu
bieten.
3.1.6 Genehmigung
Die Durchführung aller Tierversuche erfolgte gemäß des Deutschen
Tierschutzgesetzes (Tierschutzgesetz in der Fassung der Bekanntmachung vom
18. Mai 2006 [BGBl. I S. 1206, 1313], das zuletzt durch Artikel 3 des Gesetzes vom
28. Juli 2014 [BGBl. I S. 1308] geändert worden ist) und nach Genehmigung durch
die Behörde für Gesundheit und Verbraucherschutz der Freien und Hansestadt
Hamburg, Amt für Verbraucherschutz, Lebensmittelsicherheit und Veterinärwesen
unter dem Aktenzeichen G 102/13.
81
3.2 Methoden
3.2.1 Zellbiologische Methoden
3.2.1.1 Die humane Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1
Die Zelllinie Panc-1 stammt aus einem duktalen humanen Pankreaskarzinom und
wurde von der ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)
Zellbank bezogen.
3.2.1.2 Kultivierung eukaryotischer Zellen
Alle Zellkulturarbeiten fanden unter einer sterilen Werkbank statt. Die adhärent
wachsende Zelllinie Panc-1 wurde in RPMI-1640 Medium, welches mit 1 % L-
Glutamat, 1 % Penicillin/Streptomycin (10.000 IU/ml / 10 mg/ml) und 10 % fötalem
Kälberserum (FBS) versetzt war, kultiviert. Dieses Medium wird im Folgenden als
Kulturmedium bezeichnet.
Die Zellen wurden in einem CO2-Inkubator bei 37°C und 5 % CO 2 inkubiert. Die
Kultivierung erfolgte in liegenden T 75-Kulturflaschen. Die Zellen erhielten alle zwei
bis drei Tage neues Kulturmedium, bei Erreichen einer Konfluenz von 70 – 80 %
wurden die Zellen passagiert und auf neue Kulturflaschen verteilt oder den
Versuchen zugeführt.
3.2.1.3 Passagieren von Zellen mittels Trypsin-EDTA -Lösung
Die auf dem Boden der T 75-Kulturflasche haftenden Zellen wurden nach Absaugen
des Kulturmediums zunächst mit 5 ml CMF-PBS gewaschen. Zur Ablösung der
bestehenden Zell-Zell- sowie Zell-Matrix-Kontakte wurden 5 ml Trypsin-EDTA-
Lösung zugegeben und die Kulturflasche wurde für fünf Minuten im Kulturschrank
inkubiert. Wenn sich nicht alle Zellen sichtbar vom Boden gelöst hatten, wurde die
Zeit im Kulturschrank um ein bis zwei Minuten verlängert. Zur Kontrolle der
Ablösung erfolgte eine lichtmikroskopische Durchsicht der Kulturflaschen unter dem
82
Inversmikroskop. Bei vollständiger Ablösung der Zellen wurde die Reaktion durch
Zugabe von 5 ml Kulturmedium gestoppt.
3.2.1.4 Zellzahlbestimmung mittels Neubauer-Zählkam mer
Nach der in Kapitel 3.2.1.3 beschriebenen Trypsinierung wurden von der
Zellsuspension 1,5 ml in ein Reaktionsgefäß überführt und von dort aus wurden 10
µl in den Kapillarspalt der Neubauer-Zählkammer pipettiert. Nachfolgend wurden
vier Quadrate dieser Zählkammer mithilfe eines mechanischen Zellzählers
ausgezählt und das Ergebnis wurde zur Bildung eines Mittelwertes durch vier geteilt.
Da die Kammer eine Tiefe von 0,1 mm besaß, musste die Summe der ausgezählten
Zellen mit 10000 multipliziert werden, um die Zellzahl pro ml zu erhalten. Das
Volumen, das die benötigten 1 Million Zellen enthielt, wurde im nächsten Schritt
berechnet. Dieses Volumen wurde in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und
bei 1500 x g vier Minuten abzentrifugiert. Der so entstandene Zellpellet wurde dann
durch vorsichtiges auf- und abpipettieren in 200 µl RPMI 1640 + L-Glutamin (ohne
FBS und Penicillin) resuspendiert. Zweihundert Mikroliter RPMI 1640 + L-Glutamin
enthielten somit eine Million Panc-1 Zellen für die subkutane Injektion in jede Maus.
3.3 Tierversuche
3.3.1 Lösen des Mepazin-Hydrochlorids
Das pulverförmige Mepazin-Hydrochlorid wurde für die intraperitoneale Injektion in
Lösung gebracht. Alle Arbeiten hierzu fanden unter einer sterilen Werkbank unter
aseptischen Bedingungen statt.
83
Die Berechnung der Löslichkeit ergab, dass 25 mg Mepazin-Hydrochlorid in 10 ml
physiologischer Kochsalzlösung (NaCl) lösbar waren.
Zunächst wurde das Glasfläschchen mit dem Mepazinpulver mit 3 ml NaCl befüllt
und kräftig geschüttelt. Der Inhalt wurde in ein 15 ml Falconröhrchen (FALCON™)
überführt und das Glasfläschchen wurde noch zweimal mit jeweils 2 ml NaCl
nachgespült. Dieser Inhalt wurde jeweils restlos in das Falconröhrchen überführt.
Im Anschluss wurde der Inhalt des Falcons auf 10 ml mit NaCl aufgefüllt und durch
Ansaugen mit einer Pipette durchmischt.
Im Anschluss wurden jeweils 1,8 ml des gelösten Mepazins in 2,0 ml Eppendorf-
Gefäße pipettiert und für den späteren Gebrauch bei -20 ° C eingefroren. Nach dem
Ausfrieren wurde das Mepazin mit dem Vortexmischer gründlich durchmischt und
die entsprechenden Injektionsvolumina wurden in die 1 ml Feindosierungsspritzen
aufgezogen.
3.3.2 Tumorinduktion durch subkutane Injektion
Zur Tumorinduktion wurde den 40 Mäusen in CO2/O2-Kurznarkose eine subkutane
Injektion dorsal im Bereich der rechten Skapulagegend verabreicht. Nach Einstich
der Nadel wurde die Verschieblichkeit dieser überprüft, um sicherzustellen, dass die
Injektion auch subkutan erfolgte. Die Injektion bestand aus 1x106 humanen
Pankreaskarzinom-Tumorzellen (Panc-1) in einem Suspensionsvolumen von 200 µl
FBS- und penicillinfreiem Kulturmedium pro Tier.
3.3.3 Intraperitoneale Medikamentenapplikation von Mepazin, Biperiden und
der Mepazin-Biperiden-Kombination
Die Behandlung der Mäuse mit dem jeweiligen Medikament wurde täglich um 9 Uhr
morgens unter denselben Bedingungen und zur selben Uhrzeit (+/- 1 Stunde)
durchgeführt. Für die Injektion wurden die Mäuse mit Daumen und Zeigefinger am
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Nackenfell gefasst, während die restlichen Finger derselben Hand den Schwanz der
Maus fixierten.
Die Injektion erfolgte im kaudalen Drittel der Bauchhöhle paramedian. Um
Mehrfachinjektionen zu vermeiden, wurden die Tiere im Anschluss an die Injektion
übergangsweise in einen separaten sterilen Käfig gesetzt, bis alle Mäuse einer
Gruppe behandelt waren.
Die Medikation erfolgte körpergewichtsadaptiert 12 Tage nach der subkutanen
Tumorzellapplikation. Mepazin wurde einer Gruppe von 10 Tieren in einem Volumen
von 154 µl i.p. injiziert, das entspricht einer Dosierung von 16 mg/kg Körpergewicht.
Biperiden wurde weiteren 10 Tieren in einem Volumen von 48 µl ebenfalls i.p.
injiziert, entsprechend einer Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht. Für die
Kombinationstherapie aus Mepazin und Biperiden wurden die beiden Volumina
addiert, in einer Mischspritze aufgezogen und i.p. appliziert. Auch die Gruppe der
Kombinationstherapie bestand aus 10 Mäusen, weitere 10 Mäuse bildeten die
Kontrollgruppe und blieben unbehandelt.
Grundlage für die körpergewichtsadaptierte Berechnung war das
Durchschnittsgewicht der Mäuse von 24 g.
3.3.4 Markierung
Zur zweifelsfreien und dauerhaften Identifikation wurden die Mäuse unter CO2/O2-
Kurznarkose mittels einer Ohrlochzange an den Ohren markiert.
3.3.5 Körpergewichtsbestimmung und Messen der Tumor größe
Zur Feststellung des Körpergewichtes wurden alle Tiere dreimal wöchentlich mit
einer Waage gewogen. Durch die regelmäßige Bestimmung des Körpergewichtes
85
erfolgte unter anderem auch die Überwachung des Allgemeinzustandes der Tiere.
Eine Reduktion um mehr als 20 % des Ausgangsgewichtes führte zum Abbruch des
Versuches (siehe Abbruchkriterien im Anhang, Kapitel 9.1).
Die Tumorgröße wurde bis zum Erreichen der maximal tolerablen Tumorlast von 10
mm Durchmesser mittels der digitalen Schieblehre in den Dimensionen Länge und
Breite jeden dritten Tag erfasst. Um eine möglichst genaue Messung zu
gewährleisten, wurden die Tiere hierzu in eine CO2/O2-Kurznarkose gelegt. Das
palpable subkutane Tumorgewebe wurde mit einer Hand fixiert und anschließend
perkutan in kranio-kaudaler und latero-lateraler Ausdehnung vermessen. Die
Tumorgröße wurde nach der Formel Länge x Breite2 berechnet (TOMAYKO et al.
1989). Im Falle von nicht vorhandenem Tumorwachstum wurde das betreffende
Areal eingehend untersucht und der Negativbefund wurde in das Meßprotokoll
aufgenommen. Eine Messung der dritten Dimension, eine Tiefenmessung, wurde
nicht vorgenommen, da diese nur ungenau durchführbar ist.
3.4 Verhaltensanalysen
3.4.1 Zylinder-Test
Für den Versuchsaufbau des Zylinder-Tests wurden zwei leere Mauskäfige in einem
Abstand von 8 cm parallel zueinander aufgestellt. Darüber wurde eine 10,2 x 8,3
cm große Glasplatte gelegt und darauf ein Glaszylinder gestellt. Der Glaszylinder
hatte ein Fassungsvermögen von 1000 ml, eine Höhe von 14,5 cm und einen
Durchmesser von 10,5 cm. Auf der dem Experimentator gegenüberliegenden Seite
wurde ein Spiegel (60 x 40 cm) vertikal im Winkel von ca. 30° - 45° so aufgestellt,
dass eine vollständige Ansicht der gesamten Zylinderfläche inklusive des Bodens
möglich war.
86
Vor diesem Aufbau wurde das Videoaufnahmegerät (Ipad Air, Apple Inc., Cupertino,
Kalifornien, USA) mittig platziert, so dass der Versuch zur späteren Auswertung
optimal aufgezeichnet werden konnte. Abbildung 15 verdeutlicht den
Versuchsaufbau.
Abbildung 15: Aufbau des Zylinderversuches (erstellt von Dr. A.T. El Gammal)
Die Mäuse wurden für jeweils drei Minuten nacheinander einzeln und ohne
vorherige Gewöhnung in den Glaszylinder gesetzt und gefilmt. Nach jeder Maus
erfolgte eine Reinigung und Desinfektion des Glaszylinders.
Zu Beginn der Aufnahme wurde eine Karte mit dem Datum des Versuchstages, der
Mausidentifikationsnummer, der Mauskennzeichnung und der Versuchsgruppe
aufgezeichnet, um eine zweifelsfreie Zuordnung bei der spätere Auswertung zu
ermöglichen. Es wurde darauf geachtet, dass während der Aufnahme absolute
Ruhe herrschte, um das Verhalten der Mäuse nicht durch Geräusche zu
beeinflussen.
87
Sämtliche Versuche wurden vormittags zwischen 9:00 – 11:00 Uhr durchgeführt,
sodass tageszeitliche Einflüsse auf das Verhalten minimiert werden konnten. Die
Reihenfolge der Tests veränderte sich nicht.
3.4.2 Auswertung des Zylinder-Tests
Im Anschluss an die Versuche wurden die Videos an einem Bildschirm ausgewertet.
Ausgezählt wurden die Anzahl der Schritte der Vorderpfoten und der Hinterpfoten,
die Anzahl der Aufrichtungen und die Zeit, die die Tiere mit Putzverhalten
verbrachten.
Ein Schritt wurde dabei definiert als eine aufeinanderfolgende Bewegung mit der
Vorder- respektive Hinterpfote nacheinander über den Boden des Zylinders. Wenn
die Zeit zwischen der Bewegung einer Vorder- oder Hintergliedmaße und der
nächsten länger als fünf Sekunden betrug, wurde dies nicht als Schritt gezählt.
Als Aufrichtung wurde eine vertikale Bewegung gewertet, bei der die Vorderpfoten
keinen Kontakt mehr zum Zylinderboden besaßen und die Maus auf den
Hinterpfoten stand. Ein mechanischer Zellzähler wurde für die Auszählungen zur
Hilfe genommen.
Der Zeitaufwand für Putzverhalten wurde während der Wiedergabe des Videos in
Echtzeit gemessen. Als Putzverhalten wurden Bewegungen zur Körperpflege an
Schnauze, Vibrissen und am Körper gewertet.
3.4.3 Beam-Test
Der Holzbalken für den Beam-Test (deutsch: Balken-Test) wurde privat von Herrn
Bernd Wolski aus Schretstaken, Deutschland, angefertigt. Er bestand aus 2 cm
dickem Eichenholz und hatte eine Länge von einem Meter. Das breite Ende des
Balkens maß 7 cm und der Balken verjüngte sich auf 2 cm zum Ende hin. Ein
passendes Maschengitter aus Kükendraht mit einer Maschenweite von 1 x 1 cm,
88
ebenfalls angefertigt durch Herrn Bernd Wolski, konnte zusätzlich über den Balken
gelegt werden.
Der Balken wurde auf zwei leere Mauskäfige gelegt, so dass er sich ca. 15 cm über
dem Boden befand. Die breite Seite des Holzbalkens markierte den Startpunkt, das
schmale Ende des Balkens markierte das Ende der Strecke. Dort befand sich als
Motivationsverstärkung der Heimatkäfig der Maus.
Drei Tage vor Versuchsbeginn wurden die Mäuse auf dem Balken trainiert. Dazu
wurde das Maschengitter zunächst entfernt, und die Maus wurde am breiten Ende
auf den Balken gesetzt. Die Maus bekam Zeit, den Balken zu erkunden und sich zu
orientieren. Durch sanftes Leiten mit der Hand wurde die Maus unterstützt, sich in
Richtung des Endes des Balkens zu bewegen. Für die ersten assistierten
Durchgänge der Trainingsrunden wurde der Heimatkäfig der Maus direkt vor die
Maus gehalten und in Richtung schmales Ende des Balkens bewegt. Jede Maus
bekam so viele Trainingsdurchgänge, bis sie den Balken ohne Stoppen und
Unterstützung bis zum Ende lief. Meistens waren dafür fünf Durchgänge pro Maus
ausreichend.
Nach jeder Maus wurde der Balken gereinigt und desinfiziert, damit die Mäuse nicht
durch den Geruch der vorangegangenen Maus irritiert und abgelenkt wurden.
Vierundzwanzig Stunden nach dem ersten Trainingsdurchgang wurden wieder alle
Mäuse auf dem Balken trainiert, diesmal mit dem Maschengitter über dem Balken.
Die Maus wurde dazu an das breite Ende des Balkens gesetzt und - wenn nötig -
mit der flachen Hand sanft unterstützt, sodass sie über die gesamte Länge des
Balkens in Richtung des am Ende aufgestellten Heimatkäfigs lief. Stoppen und
Erkunden der Maus sollte durch das Training unterbunden werden, sodass am Tag
des eigentlichen Tests die Maus ohne Unterstützung den Balken entlanglaufen
konnte. Der Durchgang auf dem Balken endete, wenn die Maus mit einer
Vorderpfote ihren Heimatkäfig berührte.
89
Wie auch am ersten Trainingstag erhielt jede Maus fünf Durchgänge auf dem
Balken mit Maschengitter. Am zweiten Trainingstag konnten alle Mäuse den Balken
ohne Korrekturen überqueren.
Vierundzwanzig Stunden nach dem zweiten Training wurde mit dem Hauptversuch
begonnen. Der Versuchsaufbau bestand aus dem Balken mit Maschengitter über
zwei leeren Mauskäfigen, das breite Ende markierte den Start, das schmale Ende
führte direkt in den Heimatkäfig der Maus als Ziel. Das Videoaufnahmegerät mit
Aufnahmefunktion in Zeitlupe wurde so ausgerichtet, dass der Balken in seiner
vollen Länge aufgezeichnet werden konnte. Siehe dazu nachstehende
schematische Abbildung 16.
Abbildung 16: Versuchsaufbau des Balken-Tests (erstellt von Dr. A.T. El Gammal).
Bei Versuchsbeginn wurde zuerst eine Karte mit dem Datum des Versuchstages,
der Mausidentifikationsnummer, der Mauskennzeichnung und der Versuchsgruppe
für einige Sekunden aufgezeichnet, um eine zweifelsfreie Zuordnung bei der
späteren Auswertung zu ermöglichen. Dann wurde die Maus auf die breiteste Stelle
am Anfang des Balkens gesetzt. Das Video wurde gestoppt und der Versuch galt
als beendet, wenn die Maus den Heimatkäfig mit einer Vorderpfote berührte.
90
3.4.4 Auswertung des Beam-Tests
Schrittanzahl, Fehler und Zeit wurden an einem Bildschirm ausgewertet. Für die
Auswertung der Fehler wurde das Video in Zeitlupe abgespielt. Als ein Fehler galt,
wenn die Maus mit einer Gliedmaße abrutschte und dabei mindestens 0,5 cm unter
die Maschengitteroberfläche rutschte. Wenn die Maus stoppte und keine
Vorwärtsbewegung erkennbar war, wurde ein Durchrutschen einer Gliedmaße nicht
als Fehler gewertet.
Auch die Schritte wurden in Zeitlupe ausgewertet. Um die Anzahl der Schritte zu
verfolgen, wurde das der Kamera zugewandte Hinterbein benutzt. Das Zählen
begann, wenn die Maus mit eben diesem Hinterbein die erste Bewegung nach vorne
ausführte und endete, sobald die erste Vorderpfote im Heimatkäfig platziert wurde.
Die Messung der Zeit fand bei Wiedergabe des Videos in Echtzeit statt. Die
Zeitmessung wurde gestartet, wenn die Maus, nachdem sie an den Anfang des
Balkens gesetzt wurde, begann, sich vorwärts zu bewegen, und wurde gestoppt,
wenn die erste Vorderpfote den Heimatkäfig berührte. Bei der Analyse der Laufzeit
der Mäuse wurden Ruhephasen, die den Lauf unterbrochen haben, nicht mit in die
Berechnung der Gesamtzeit einbezogen. Die Zählung der Schritte und Fehler
erfolgte unter Zuhilfenahme des mechanischen Zellzählers.
3.4.5 Adhesive Removal-Test
Für den Adhesive Removal-Test wurden Futter und Nestmaterial aus dem
Heimatkäfig der Maus entfernt. Die Käfiggefährten wurden für die Dauer des
Versuches in einen anderen sauberen Käfig umgesetzt, so dass die Testmaus sich
alleine in ihrem Heimatkäfig befand.
91
Über dem Heimatkäfig wurde das Videoaufnahmegerät so aufgestellt, dass das
Käfiginnere gefilmt werden konnte. Als Aufkleber dienten Markierungspunkte der
Firma Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, im runden Format mit 8 mm
Durchmesser. Zum Anbringen der Aufkleber wurde die Maus im Zwangsgriff an
Schwanzwurzel und Nackenhaut fixiert und der Markierungspunkt wurde mit einer
anatomischen Pinzette leicht auf der Schnauze der Maus angedrückt. Zu Beginn
der Videoaufnahme wurde eine Karte mit dem Datum des Versuchstages, der
Mausidentifikationsnummer, der Mauskennzeichnung und der Versuchsgruppe für
einige Sekunden aufgezeichnet, um eine zweifelsfreie Zuordnung für die spätere
Auswertung zu ermöglichen. Danach wurde die Maus mit dem Markierungspunkt
auf der Schnauze in den Käfig gesetzt und gefilmt. Abbildung 17 zeigt den
Versuchsaufbau.
Abbildung 17: Versuchsaufbau des Adhesive Removal-Test (erstellt von Dr. A. T. El Gammal).
Die Aufnahme und somit der Versuch wurde beendet, wenn die Maus sich den
Aufkleber von der Schnauze entfernte. War dies nicht innerhalb von 60 Sekunden
geschehen, so wurde der Aufkleber durch den Experimentator entfernt. Versuche,
bei denen der Aufkleber von alleine abfiel, wurden nicht gewertet und wiederholt.
92
3.4.6 Auswertung des Adhesive Removal-Tests
Die Videos wurden an einem Bildschirm in Echtzeit ausgewertet. Es wurde die Zeit
gemessen, die die Maus benötigte, um den Aufkleber mit einer oder beiden Pfoten
zu berühren, sowie die benötigte Zeitspanne, um den Aufkleber zu entfernen.
3.4.7 Versuchsabbruch mittels kardialer Punktion in der final anästhetisierten
Maus
Bei Erreichen der maximal tolerablen Tumorlast von 10 mm Durchmesser oder
eines anderen Versuchsabbruchkriteriums (siehe Versuchsabbruchkriterien im
Anhang, Kapitel 9.1) erfolgte die Beendigung des Versuchs. Dazu wurden die
Mäuse mittels intraperitonealer Applikation der im Folgenden beschriebenen
Ketamin-Xylazin-Lösung in Narkose gelegt:
8,0 ml NaCl-Lösung 0,9 %
+ 0,8 ml Xylazin 2 %
+ 1,2 ml Ketamin 10 %.
10 ml dieser Lösung enthielten 16 mg Xylazin und 120 mg Ketamin. Die Mäuse
erhielten gewichtsadaptiert 0,15 – 0,2ml / 10 g KGW in einer Mischspritze. Die
Narkosetiefe wurde anhand des Zwischenzehenreflexes überprüft (ARRAS et al.
2001), bei nicht ausreichender Narkosetiefe wurde ggf. nachdosiert.
Die kardiale Punktion wurde nach HOFF (2000) und PARASURAMAN et al. (2010),
durchgeführt. Die narkotisierte Maus wurde in Rückenlage auf eine feste Unterlage
gelegt. Eine 1 ml Spritze mit einer 26 G Nadel wurde von linkslateral ca. 0,5 cm
unterhalb der Achselhöhle in einem Winkel von ca. 30° nach kranial waagerecht
durch den Brustkorb in das Herz eingeführt. Durch vorsichtiges Aspirieren wurde
der richtige Sitz der Kanüle im Ventrikel überprüft. Anschließend wurde das Blut
entnommen. Pro Tier konnten ca. 0,6 - 0,8 ml Vollblut gewonnen werden. Nach dem
Ausbluten wurde das Tier durch zervikale Dislokation getötet. Das Blut, der Tumor,
die Lunge und das Knochenmark der Maus wurden entnommen und zur
93
Untersuchung der Metastasierung aufbereitet. Diese weitergehenden Analysen sind
nicht Teil der hier vorliegenden Studie.
3.5 Statistische Auswertung
Die statistische Analyse der Daten wurde mit IBM® SPSS® Statistics Version 22 for
Mac (Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)
durchgeführt. Die Dateneingabe und die Erstellung der Grafiken erfolgten unter
Verwendung von MS Excel (Microsoft® Office Excel 2010, Microsoft® Corporation,
Redmond, USA).
Zur Prüfung auf Normalverteilung wurden vor der Durchführung statistischer Tests
Histogramme angefertigt. Die Verteilung der abhängigen Variablen wurde als
ausreichend normalverteilt angesehen. Die Varianzanalyse gilt aber generell als
robust gegen Verletzungen der Normalverteilung bei gleichem und genügend
großen Stichprobenumfang (n ≥ 10) (BORTZ et al. 2011).
Abbildung 18 und 19 zeigen exemplarisch zwei Histogramme für die Datensätze.
Abbildung 18
94
Abbildung 19
Abbildung 18 und Abbildung 19: Histogramme zur Überprüfung der Normalverteilung der abhängigen Variablen am Beispiel Schritte auf dem Beam (Abb. 18) und Pflegezeit (PZ) im Zylinder (Abb. 19). Auf der Abszisse sind die Werte der jeweiligen abhängigen Variable aufgetragen, auf der Ordinate die Anzahl der aufgetretenen Häufigkeiten.
Zur Analyse der Verhaltensdaten wurde im ersten Schritt eine einfaktorielle
Varianzanalyse mit Messwiederholungen (repeated measures analysis of variance
= rm ANOVA) durchgerührt. Die unabhängigen Variablen (Faktoren) wurden als
Gruppe und Messwiederholungen definiert. Der Faktor Gruppe hatte dabei die
Ausprägungen (Faktorenstufen) Kontrolle, Mepazin, Biperiden und Mepazin-
Biperiden-Gruppe. Die Messwiederholungen waren die 14 wiederholten Messungen
im zeitlichen Verlauf des neurologischen Scorings.
Die abhängige Variable war die in dem jeweiligen Verhaltenstest gemessene
Größe. Die Gruppenzugehörigkeit stellte den Zwischensubjektfaktor dar; die
Innersubjektfaktoren wurden als Messwiederholung und als Messwiederholungs-
Gruppen-Interaktion definiert.
Berechnet wurden somit die zwei Haupteffekte Gruppenzugehörigkeit und
Messwiederholung sowie der Interaktionseffekt hieraus.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 36
Hä
ufi
gk
eit
Pflegezeit in sec
Histogramm Zylinder PZ
Häufigkeit
95
Die Überprüfung der Varianzhomogenität geschah mittels Mauchly-Test auf
Sphärizität. Wurde die Sphärizitätsannahme verletzt (p < 0,05) und der Mauchly-
Test war signifikant, so erfolgte eine entsprechende Korrektur. War das Epsilon (ε)
≤ 0,75, wurde die Korrektur nach Greenhouse-Geisser vorgenommen. Bei einem ε
≥ 0,75 erfolgte die Korrektur nach Huynh-Feldt (BENDER et al. 2007a).
Mittels der rm ANOVA wurde überprüft, ob signifikante Unterschiede zwischen den
Mittelwerten der einzelnen Gruppen bestanden. War dies der Fall, wurde ein
gepaarter t-Test mit Bonferroni-Korrektur (zur Verhinderung der Kumulierung des α-
Fehlers) als post-hoc Test angewendet. Hierbei wurde ermittelt, welche Mittelwerte
signifikante Unterschiede zueinander aufwiesen (BENDER et al. 2007b).
Das Signifikanzniveau lag bei allen Tests bei 5 % (α = 0,05).
96
4 ERGEBNISSE
4.1 Zylinder-Test
4.1.1 Analyse der Anzahl der Aufrichtungen im Zylin der-Test
Im Zylinder-Test zur Überprüfung der Spontanaktivität wurden die zehn Mäuse der
Kontrollgruppe mit den aus jeweils zehn Mäusen bestehenden Gruppen Mepazin,
Biperiden und Mepazin-Biperiden verglichen. Signifikante Unterschiede in der
Anzahl der Aufrichtungen bestanden zwischen der Mepazingruppe und der
Biperidengruppe sowie der Mepazin-Biperidengruppe. Abbildung 20 zeigt diese
signifikanten Unterschiede zwischen den behandelten Gruppen.
Abbildung 20: Ergebnisse des Zylinder-Tests: Durchschnittliche Anzahl der Aufrichtungen in der dreiminütigen Testzeit. Dargestellt sind die geschätzten Randmittel und der Standardfehler (SE) der gepoolten Daten des neurologischen Scorings über 14 Versuchstage. Signifikante Unterschiede sind durch ein Sternchen * (p < 0,05) dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen den SE an.
Die Varianzanalyse wurde mit der abhängigen Variable Anzahl Aufrichtungen im
Zylinder durchgeführt.
97
Der Mauchly-Test war signifikant und eine Verletzung der Sphärizität war somit
gegeben. Es wurde die Korrektur der Freiheitsgrade nach Greenhouse-Geisser
vorgenommen (Mauchly-Test auf Sphärizität p < 0,001 [p < 0,05]; �2 (90) = 163,07;
ε = 0,576 [ε ≤ 0,75]).
Nach Testung der Innersubjekteffekte durch die ANOVA mit Messwiederholungen
erwies sich der Effekt der Messwiederholung als statistisch signifikant (F7,49;254,57 =
3,53; p = 0,001), nicht aber die Messwiederholung-Gruppenzugehörigkeit-
Interaktion (F22,46;193,23 = 0,899; p = 0,598).
Der Test der Zwischensubjekteffekte des Faktors Gruppe (F3,34 = 6,34; p = 0,002)
ergab einen signifikanten Haupteffekt.
Die Varianzanalyse zeigt, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen den
Mittelwerten der Aufrichtungsanzahl zu den unterschiedlichen Messzeitpunkten
gab. Alle Tiere richteten sich, über den zeitlichen Verlauf gesehen, immer weniger
auf.
Die Interaktion der beiden Variablen Gruppenzugehörigkeit und Messwiederholung
hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der Aufrichtungen im Zylinder-Test. Die
nichtsignifikante Interaktion besagt dabei, dass sich die Werte der Gruppen ähnlich
über den Zeitverlauf ändern.
Das heißt, dass es sowohl eine Veränderung innerhalb der Messwiederholungen
als auch Unterschiede zwischen mindestens zwei Gruppen gab.
Die Ergebnisse der Einzeltage und des Gesamtverlaufes der Anzahl der
Aufrichtungen pro Gruppe im Zylinder-Test ist in der Abbildung 21 graphisch
dargestellt. Zu sehen ist der signifikante Einfluß der Messwiederholung und die
abnehmende Anzahl der Aufrichtungen über die Zeit. Gleichzeitig zeigt diese
Abbildung auch, dass die einzelnen Gruppen unterschiedliche Aktivitätslevel haben.
98
Abbildung 21: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Gruppen für die einzelnen Messzeitpunkte bezüglich der Aufrichtungen im Zylinder-Test über die Zeit.
In Tabelle 6 ist die gemittelte Anzahl der Aufrichtungen pro Gruppe über die 14
Versuchstage des neurologischen Scorings aufgeführt. Die Zahlen zeigen dabei die
Unterschiede in der Aktivität zwischen den einzelnen Gruppen.
Tabelle 6: Geschätzte Randmittel und Standardfehler zur Darstellung des Gruppeneffektes über die Zeit für die Anzahl der Aufrichtungen im Zylinder-Test.
95%-Konfidenzintervall Gruppe M SE Untergrenze Obergrenze
Kontrolle 9,58 2,00 5,51 13,65 Biperiden 16,46 2,00 12,39 20,53 Mepazin 4,79 2,24 0,24 9,34 Mepazin-Biperiden 15,03 2,00 10,96 19,10
M = Mittelwert, SE = Standardfehler
Der anschließende post-hoc-T-Test mit Bonferroni-Korrektur zur Überprüfung des
Unterschiedes zwischen den Gruppen ergab signifikante Unterschiede zwischen
den Gruppen Mepazin, Biperiden und Mepazin-Biperiden.
99
Die Mepazingruppe machte dabei signifikant weniger Aufrichtungen als die
Biperidengruppe (Mittelwertsdifferenz [MWD] = -11,67; SE = 3,00; p = 0,003) und
die Mepazin-Biperiden-Gruppe (MWD = -10,24; SE = 3,00; p = 0,010).
Der signifikante Effekt der Messwiederholung zeigte sich in der Abnahme der
Anzahl der Aufrichtungen über die Zeit. Während die über alle Gruppen gemittelte
Anzahl der Aufrichtungen am ersten Tag des Neuroscorings bei 17,05 ± 1,70 lag,
so lag sie am letzten Tag (Tag 14) 10,47 ± 1,72.
4.1.2 Analyse der Anzahl der Vorderfußschritte im Z ylinder-Test
Die Varianzanalyse wurde mit der abhängigen Variable Anzahl der
Vorderfußschritte im Zylinder durchgeführt.
Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Vorderfußschritte
zwischen den einzelnen Gruppen. Dies zeigt die Abbildung 22.
Abbildung 22: Ergebnisse des Zylinder-Tests: Durchschnittliche Anzahl der Vorderfußschritte während der dreiminütigen Testzeit. Dargestellt sind die geschätzten Randmittel und Standardfehler (SE) der gepoolten Daten über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings. Die Fehlerbalken zeigen den SE an.
100
Für den Test auf Innersubjekteffekte wurde die Greenhouse-Geisser-Korrektur
verwendet, da eine Verletzung der Sphärizitätsannahme vorlag (Mauchly-Test auf
Sphärizität p = 0,011 [p < 0,05]; �2 (90) = 125,06; ε = 0,635 [ε ≤ 0,75]).
Die ANOVA zeigte einen signifikanten Messwiederholungseffekt (F8,25;280,68 = 8,39;
p<0,001). Die Interaktion Messwiederholung-Gruppe war nicht signifikant
(F24,76;280,68 = 1,09; p = 0,351). Nach Testung des Zwischensubjekteffekte musste
auch der Haupteffekt der Gruppe als nicht signifikant eingestuft werden (F3,34 = 2,03;
p = 0,129).
Dies deutet darauf hin, dass weder die Variable Gruppe alleine noch der
Interaktionseffekt Messwiederholung-Gruppe einen Einfluss auf die Anzahl der
Vorderfußschritte im Zylinder-Test hat. Es lassen sich anhand des signifikanten
Messwiederholungeffektes Veränderungen der Mittelwerte zu den
unterschiedlichen Messzeitpunkten des Neuroscorings nachweisen. Die
Ergebnisse der Einzeltage und des Gesamtverlaufes der Anzahl der
Vorderfußschritte pro Gruppe im Zylinder-Test ist in der Abbildung 23 graphisch
dargestellt. Zu sehen ist der signifikante Einfluß der Messwiederholung und die
abnehmende Anzahl der Vorderfußschritte über die Zeit. Gleichzeitig zeigt diese
Abbildung auch, dass die einzelnen Gruppen unterschiedliche Aktivitätslevel haben.
101
Abbildung 23: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Gruppen für die einzelnen Messzeitpunkte bezüglich der Anzahl der Vorderfußschritte im Zylinder-Test über die Zeit.
Tabelle 7 zeigt den signifikanten Effekt der Messwiederholung durch die Abnahme
der Anzahl der Vorderfußschritte über die Zeit. Die mittlere Anzahl der
Vorderfußschritte pro Gruppe, auszugsweise an Tag 1, 7 und 14 des
neurologischen Scorings, sind hier aufgelistet.
102
Tabelle 7: Geschätzte Randmittel und Standardfehler zur Darstellung des Messwiederholungseffektes für die Anzahl der Vorderfußschritte im Zylinder-Test. 95%-Konfidenzintervall Gruppe Messwdh. M SE Untergr. Obergr.
Kontrolle 1 49,90 5,79 38,12 61,67 7 38,50 4,91 28,50 48,49 14 28,20 5,35 17,31 39,09
Biperiden 1 54,60 5,79 42,82 66,37 7 33,00 4,91 23,00 42,99 14 32,10 5,35 21,21 42,99
Mepazin 1 46,00 6,48 32,83 59,16 7 23,12 5,50 11,94 34,30 14 22,62 5,99 10,44 34,80
Mepazin-Biperiden 1 37,90 5,79 26,12 49,67 7 33,10 4,91 23,10 43,09 14 21,90 5,35 11,01 32,79
M = Mittelwert, SE = Standardfehler, Messwdh. = Messwiederholung, Untergr. = Untergrenze, Obergr. = Obergrenze
4.1.3 Analyse der Anzahl der Hinterfußschritte im Z ylinder-Test
Die Varianzanalyse wurde mit der abhängigen Variable Anzahl der Hinterfußschritte
im Zylinder durchgeführt.
Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Hinterfußschritte
zwischen den einzelnen Gruppen. Dies zeigt die Abbildung 24.
103
Abbildung 24: Ergebnisse des Zylinder-Tests: Durchschnittliche Anzahl der Hinterfußschritte während der dreiminütigen Testzeit. Dargestellt sind die geschätzten Randmittel und Standardfehler (SE) der gepoolten Daten über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings. Die Fehlerbalken zeigen den SE an.
Im Test nach Mauchly war Sphärizität nicht gegeben und es wurde die Korrektur
der Freiheitsgrade nach Greenhouse-Geisser verwendet (Mauchly-Test auf
Sphärizität p < 0,001 [p < 0,05]; �2 (90) = 159,32; ε = 0,564 [ε ≤ 0,75]).
Die daraus resultierenden Innersubjekteffekte in der ANOVA zeigten signifikante
Effekte für den Faktor Messwiederholung (F7,33;249,37 = 7,45; p < 0,001). Die
Wechselwirkung Messwiederholung-Gruppenzugehörigkeit (F22;249,37 = 1,40; p =
0,114) war nicht signifikant.
Der Test der Zwischensubjekteffekte des Faktors Gruppe (F3,34 = 2,56; p = 0,071)
war ebenfalls nicht signifikant.
Auch hier zeigt sich, ähnlich wie bei der abhängigen Variable Anzahl der
Vorderfußschritte, dass weder die Variable Gruppe alleine noch der
Interaktionseffekt Messwiederholung-Gruppe einen Einfluss auf die Anzahl der
Hinterfußschritte im Zylinder-Test hat. Es lassen sich anhand des signifikanten
Messwiederholungseffektes Veränderungen der Mittelwerte zu den
unterschiedlichen Messzeitpunkten des Neuroscorings nachweisen. Abbildung 25
104
zeigt sowohl die Abnahme der Anzahl der Hinterfußschritte über die Zeit, als auch
die unterschiedlichen Aktivitätslevel der einzelnen Gruppen an.
Abbildung 25: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel zu den einzelnen Messzeitpunkten bezüglich der Anzahl der Hinterfußschritte im Zylinder-Test über die Zeit
Tabelle 8 zeigt die mittlere Anzahl der Hinterfußschritte pro Gruppe auszugsweise
an Tag 1 der Messungen sowie die Messwiederholungen 7 und 14 des
neurologischen Scorings. Die Daten zeigen die Abnahme der Anzahl der
Hinterfußschritte über die Zeit.
105
Tabelle 8: Geschätzte Randmittel und Standardfehler zur Darstellung des Messwiederholungseffektes für die Anzahl der Hinterfußschritte im Zylinder-Test.
95%-Konfidenzintervall Gruppe Messwdh. M SE Untergr. Obergr.
Kontrolle 1 41,90 5,23 31,25 52,54
7 24,50 4,21 15,93 33,06 14 21,90 4,53 12,69 31,10
Biperiden 1 35,10 5,23 24,45 45,74 7 15,80 4,21 7,23 24,36 14 14,50 4,53 5,29 23,70
Mepazin 1 30,25 5,85 18,35 42,15 7 10,25 4,71 0,67 19,82 14 11,87 5,06 1,57 22,17
Mepazin-Biperiden 1 25,80 5,23 15,15 36,44 7 18,60 4,21 10,03 27,16 14 8,80 4,53 -0,40 18,00
M = Mittelwert, SE = Standardfehler, Messwdh. = Messwiederholung, Untergr. = Untergrenze, Obergr. = Obergrenze
4.1.4 Analyse der Dauer der Pflegezeit im Zylinder- Test
Die Varianzanalyse wurde mit der abhängigen Variable Dauer der Pflegezeit im
Zylinder durchgeführt.
Es gab keine Unterschiede in der Dauer der Pflegezeit zwischen den Gruppen, wie
Abbildung 26 zeigt.
106
Abbildung 26: Ergebnisse des Zylinde-Tests: Durchschnittliche Dauer der Pflegezeit während der dreiminütigen Testzeit. Dargestellt sind die geschätzten Randmittel und Standardfehler (SE) der gepoolten Daten über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings. Die Fehlerbalken zeigen den SE an.
Der Mauchly-Test zeigte, dass Sphärizität angenommen werden konnte (Mauchly-
Test auf Sphärizität p = 0,509 [p > 0,05]; �2 (90) = 90,02) und somit eine Korrektur
der Freiheitsgrade nicht notwendig wurde.
Nach Testung auf Innersubjekteffekte erwies sich der Messwiederholungseffekt als
statistisch nicht signifikant (F13,442 = 1,49; p = 0,114), genauso wenig die
Messwiederholungs-Gruppen-Interaktion (F39,442 = 1,17; p = 0,230). Als
Zwischensubjekteffekt verfehlt der Gruppen-Effekt gleichfalls die
Signifikanzschwelle (F3,34 = 2,02; p = 0,129).
Bei der abhängigen Variable Pflegezeit im Zylinder-Test haben weder die beiden
Haupteffekte Messwiederholung und Gruppenzugehörigkeit alleine noch deren
Interaktion eine Auswirkung auf die Pflegezeit. Es gibt weder Unterschiede
zwischen den Gruppen noch im Verlauf der Messwiederholungen. Die Ergebnisse
der Einzeltage und des Gesamtverlaufes der Dauer der Pflegezeit im Zylinder-Test
sind in der Abbildung 27 graphisch dargestellt.
107
Abbildung 27: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Gruppen für die einzelnen Messzeitpunkte bezüglich der Dauer der Pflegezeit im Zylinder-Test über die Zeit.
4.2 Beam-Test
4.2.1 Analyse der Schrittanzahl des Beam-Tests
Der Beam-Test überprüft Motorik, Feinmotorik, Balance und Koordination. Die aus
zehn Mäusen bestehende Kontrollgruppe wurde mit den jeweils zehn Mäusen
umfassenden Gruppen Mepazin, Biperiden und Mepazin-Biperiden verglichen.
Die Kontrollgruppe brauchte signifikant weniger Schritte, um den Balken zu
überqueren als die Biperidengruppe und die Mepazin-Biperidengruppe. Abbildung
28 zeigt diese signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15
Ge
sch
ätz
teR
an
dm
itte
l
Messwiederholungen
Zylinder Pflegezeit
Kontrolle
Biperiden
Mepazin
Mepazin+Biperiden
108
Abbildung 28: Ergebnisse des Beam-Tests: Durchschnittliche Schrittanzahl, die zur Überquerung des Balkens benötigt wurde. Dargestellt sind geschätzte Randmittel und Standardfehler (SE) der gepoolten Daten über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings. Signifikante Unterschiede sind durch ein Sternchen * (p < 0,05) dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen den SE an.
Die Varianzanalyse wurde für die abhängige Variable Schrittanzahl, die benötigt
wurde, um den Balken zu überqueren, durchgeführt.
Für den Test auf Innersubjekteffekte wurde die Greenhouse-Geisser-Korrektur
verwendet, da eine Verletzung der Sphärizitätsannahme vorlag (Mauchly-Test auf
Sphärizität p < 0,001 [p < 0,05]; �2 (90)= 179,74; ε = 0,52 [ε ≤ 0,75]).
Die daraus resultierenden Innersubjekteffekte zeigten signifikante Unterschiede
zwischen den Mittelwerten zu den unterschiedlichen Messzeitpunkten für den
Faktor Messwiederholung (F6,77;216,36 = 9,31; p < 0,001). Auch die Interaktion
Messwiederholung-Gruppenzugehörigkeit (F20,28;216,36 = 2,14; p = 0,004) war
signifikant.
Der Test auf den Zwischensubjektfaktor Gruppe war ebenfalls signifikant (F1,3 =
6,70; p < 0,001).
Die signifikante Interaktion der beiden Variablen Gruppenzugehörigkeit und
Messwiederholung besagt, dass sich die Gruppen über die Zeit unterschiedlich
ändern.
109
Das heißt, dass es sowohl eine Veränderung innerhalb der Messwiederholungen
gab als auch Unterschiede zwischen mindestens zwei Gruppen.
Die Ergebnisse der Einzeltage und des Gesamtverlaufes der benötigten
Schrittanzahl im Beam-Test ist in der Abbildung 29 graphisch dargestellt. Auch hier
zeigt sich durch den signifikanten Faktor Messwiederholung eine abnehmende
Tendenz in der Anzahl der benötigten Schritte. Gleichzeitig zeigt diese Abbildung
auch, dass die einzelnen Gruppen unterschiedliche Aktivitätslevel haben.
Abbildung 29: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Gruppen für die einzelnen Messzeitpunkte bezüglich der Schrittanzahl im Beam-Test über die Zeit.
Der anschließende post-hoc-T-Test mit Bonferroni-Korrektur zur Überprüfung des
Unterschiedes zwischen den Gruppen ergab signifikante Unterschiede zwischen
den Gruppen Kontrolle, Biperiden und Mepazin-Biperiden, wobei sowohl die
Biperidengruppe (Mittelwertsdifferenz [MWD] = 1,75; SE = 0,42; p = 0,001) als auch
die Mepazin-Biperiden-Gruppe (MWD = 1,40; SE = 0,42; p = 0,013) signifikant mehr
Schritte machte als die Kontrollgruppe.
In Tabelle 9 ist diese gemittelte Anzahl der benötigten Schritte zur Überquerung des
Balkens pro Gruppe über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings
aufgeführt.
110
Tabelle 9: Geschätzte Randmittel und Standardfehler zur Darstellung des Gruppeneffektes über die Zeit für die Anzahl der Schritte auf dem Balken.
95%-Konfidenzintervall Gruppe M SE Untergrenze Obergrenze
Kontrolle 12,77 0,29 12,16 13,37 Biperiden 14,52 0,29 13,91 15,12 Mepazin 13,47 0,38 12,69 14,25 Mepazin-Biperiden 14,17 0,29 13,56 14,77
M = Mittelwert, SE = Standardfehler
4.2.2 Analyse der Fehleranzahl des Beam-Tests
Die Varianzanalyse wurde für die abhängige Variable Fehleranzahl beim
Überqueren des Balkens durchgeführt. Es gab keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Gruppen. In Abbildung 30 ist dies graphisch dargestellt.
Abbildung 30: Ergebnisse des Beam-Tests: Durchschnittliche Anzahl der Fehler, die bei der Überquerung des Balkens gemacht wurden. Dargestellt sind geschätzte Randmittel und Standardfehler (SE) der gepoolten Daten über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings. Die Fehlerbalken zeigen den SE an.
111
Der Mauchly-Test zeigte, dass Sphärizität angenommen werden konnte (Mauchly-
Test auf Sphärizität p = 0,37 [p > 0,05]; �2 (90) = 96,34) und somit eine Korrektur
der Freiheitsgrade nicht notwendig wurde.
Die daraus resultierenden Innersubjekteffekte in der ANOVA zeigten signifikante
Effekte für den Faktor Messwiederholung (F13,416 = 6,05; p < 0,001). Die Interaktion
Messwiederholung-Gruppenzugehörigkeit (F39,416 = 1,28; p = 0,125) und der Test
des Gruppenhaupteffektes (F1,32 = 0,36; p = 0,360) waren nicht signifikant.
Es konnte somit davon ausgegangen werden, dass weder die Variable Gruppe noch
die Interaktion Messwiederholung-Gruppenzugehörigkeit einen Einfluss auf das
Ergebnis des Beam-Tests hinsichtlich der Fehlerzahl hat.
Die Varianzanalyse zeigt, dass es zwar einen signifikanten Unterschied zwischen
den Mittelwerten der Fehleranzahl zu den unterschiedlichen Messzeitpunkten gab,
aber keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. Die
nichtsignifikante Interaktion besagt, dass die Veränderung über die Zeit in allen
Gruppen ähnlich verläuft. Der zeitliche Verlauf zeigt durch den signifikanten
Messwiederholungsfaktor einen tendenziell ansteigenden Trend der Fehleranzahl
in den letzten Versuchstagen. Siehe dazu den graphischen Verlauf in Abbildung 31.
112
Abbildung 31: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Gruppen für die einzelnen Messzeitpunkte bezüglich der Fehleranzahl im Beam-Test über die Zeit
Tabelle 10 zeigt die mittlere Anzahl der Fehler auf dem Balken pro Gruppe
auszugsweise an Tag 1, 7 und 14 des neurologischen Scorings.
113
Tabelle 10: Geschätzte Randmittel und Standardfehler zur Darstellung des Messwiederholungseffektes für die Anzahl der Fehler im Beam-Test.
95%-Konfidenzintervall Gruppe Messwdh. M SE Untergr. Obergr.
Kontrolle 1 2,80 0,46 1,85 3,74
7 2,70 0,47 1,74 3,65 14 3,40 0,34 2,68 4,11
Biperiden 1 2,00 0,46 1,05 2,94 7 3,60 0,47 2,64 4,55 14 2,40 0,34 1,68 3,11
Mepazin 1 1,83 0,59 0,61 3,05 7 4,33 0,60 3,10 5,56 14 2,66 0,45 1,74 3,58
Mepazin-Biperiden 1 2,70 0,46 1,75 3,64 7 3,40 0,47 2,44 4,35 14 3,10 0,34 2,38 3,81
M = Mittelwert, SE = Standardfehler, Messwdh. = Messwiederholung, Untergr. = Untergrenze, Obergr. = Obergrenze
4.2.3 Analyse der Zeit im Beam-Test
Es wurde die Varianzanalyse für die abhängige Variable Zeit, die benötigt wurde,
um den Balken zu überqueren, durchgeführt. Die Mäuse der Biperidengruppe
brauchten signifikant mehr Zeit zur Überquerung des Balkens als die Mäuse der
Kontrollgruppe, der Mepazingruppe und der Mepazin-Biperiden-Gruppe. Abbildung
32 zeigt die signifikanten Unterschiede.
114
Abbildung 32: Ergebnisse des Beam-Tests: Zeit, die zur Überquerung des Balkens benötigt wurde. Dargestellt sind geschätzte Randmittel und Standardfehler (SE) der gepoolten Daten über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings. Signifikante Unterschiede sind durch ein Sternchen * (p < 0,05) dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen den SE an.
Im Test nach Mauchly war Sphärizität nicht gegeben und es wurde die Korrektur
der Freiheitsgrade nach Greenhouse-Geisser verwendet (Mauchly-Test auf
Sphärizität p < 0,001 [p < 0,05]; �2 (90) = 219,27; ε = 0,46 [ε ≤ 0,75]).
Die daraus resultierenden Innersubjekteffekte in der ANOVA zeigten signifikante
Effekte für den Faktor Messwiederholung (F6,04;193,23 = 13,15; p < 0,001). Die
Wechselwirkung Messwiederholung-Gruppenzugehörigkeit (F18,11;193,23 = 1,17; p =
0,291) war nicht signifikant.
Der Test der Zwischensubjekteffekte des Faktors Gruppe (F1,32 = 9,10; p < 0,001)
war signifikant.
Das heißt, dass es sowohl eine Veränderung innerhalb der Messwiederholungen
als auch Unterschiede zwischen mindestens zwei Gruppen gab.
Insgesamt ist ein Trend zur Abnahme des Effektes mit der Zeit feststellbar; dies
zeigt sich in dem signifikanten Effekt der Messwiederholung. Die benötigte Zeit zur
Überquerung des Balkens an den Einzeltagen und während der Gesamtdauer des
Versuchs sind in der Abbildung 33 graphisch dargestellt.
115
Abbildung 33: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Gruppen für die einzelnen Messzeitpunkte bezüglich der benötigten Zeit zur Überquerung des Balkens.
Der anschließende post-hoc-T-Test mit Bonferroni-Korrektur zur Überprüfung des
Unterschiedes zwischen den Gruppen ergab signifikante Unterschiede zwischen
der Biperidengruppe und den drei anderen Gruppen.
Dabei brauchten die Mäuse der Biperidengruppe signifikant mehr Zeit, den Balken
zu überqueren als die Mäuse der Kontrollgruppe (Mittelwertsdifferenz [MWD] =
6,60; SE = 1,35; p < 0,001). Auch die Unterschiede der Biperidengruppe zu der
Gruppe Mepazin (MWD = 5,87; SE = 1,56; p = 0,004) und Mepazin-Biperiden (MWD
= 4,03; SE = 1,35; p = 0,032) waren signifikant.
In Tabelle 11 ist die gemittelte Zeit in Sekunden, die zur Überquerung des Balkens
benötigt wurde, pro Gruppe über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings
aufgeführt.
116
Tabelle 11: Geschätzte Randmittel und Standardfehler zur Darstellung des Gruppeneffektes bezüglich der benötigten Zeit zur Überquerung des Balkens über die Gesamtdauer des Versuches.
95%-Konfidenzintervall Gruppe M SE Untergrenze Obergrenze
Kontrolle 8,14 0,95 6,19 10,08 Biperiden 14,74 0,95 12,79 16,68 Mepazin 8,88 1,23 6,37 11,39 Mepazin-Biperiden 10,71 0,95 8,77 12,65
M = Mittelwert, SE = Standardfehler
117
4.3 Adhesive Removal-Test
In der Varianzanalyse des Adhesive Removal-Test war die benötigte Zeit zur
Entfernung des Aufklebers von der Nase die abhängige Variable. Es gibt keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, siehe dazu Abbildung 34.
Abbildung 34: Ergebnisse des Adhesive Removal-Tests: Zeit in Sekunden, die zur Entfernung des Aufklebers benötigt wurde. Dargestellt sind die geschätzten Randmittel und Standardfehler (SE) der gepoolten Daten über die 14 Versuchstage des neurologischen Scorings. Die Fehlerbalken zeigen den SE an.
Im Test nach Mauchly war Sphärizität nicht gegeben und es wurde die Korrektur
der Freiheitsgrade nach Greenhouse-Geisser verwendet (Mauchly-Test auf
Sphärizität p = 0,025 [p < 0,05]; �2 (90) = 119,52; ε = 0,629 [ε ≤ 0,75]).
Auf der Suche nach Innersubjekteffekten findet sich ein statistisch signifikanter
Messwiederholungseffekt (F8,17;277,97 = 3,05; p = 0,002), jedoch ist die Interaktion
Messwiederholung-Gruppe als statistisch nicht signifikant zu bewerten (F24,53;277,97
= 1,30; p = 0,161). Darüber hinaus muss als Zwischensubjekteffekt der Gruppen-
Effekt als nicht signifikant eingestuft werden (F3,34 = 0,140; p = 0,935).
118
Dies zeigt, dass weder der Faktor Gruppe, noch der Interaktionseffekt aus Gruppe
und Messwiederholung einen Einfluss auf die Zeitdauer bis zur Entfernung des
Aufklebers von der Nase der Mäuse haben.
Es lässt sich somit keine Hauptwirkung des Faktors Gruppe auf die benötigte Zeit
zur Entfernung des Aufklebers von der Nase der Maus feststellen. Der nicht
signifikante Interaktionseffekt besagt, dass sich die Veränderungen über die Zeit
zwischen den Gruppen nicht unterscheiden. Es besteht somit nur ein signifikanter
Unterschied zwischen den Mittelwerten zu den unterschiedlichen Zeitpunkten. Der
signifikante Messwiederholungseffekt spiegelt sich in einer Abnahme der Zeit bis
zur Aufkleberentfernung wieder. Der Trend zur abnehmenden Zeitdauer ist in
Abbildung 35 zu sehen.
Abbildung 35: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Gruppen für die einzelnen Messzeitpunkte bezüglich der Zeit bis zur Aufkleberentfernung im Adhesive Removal-Test.
Tabelle 12 zeigt die mittlere Anzahl der benötigten Sekunden bis zur Entfernung
des Aufklebers von der Nase auszugsweise an Tag 1, 7 und 14 des neurologischen
Scorings.
119
Tabelle 12: Geschätzte Randmittel und Standardfehler zur Darstellung des Messwiederholungs-effektes bezüglich der Dauer bis zur Aufkleberentfernung im Adhesive Removal-Test.
95%-Konfidenzintervall Gruppe Messwdh. M SE Untergr. Obergr.
Kontrolle 1 7,70 2,81 1,98 13,41
7 7,20 3,28 0,53 13,86 14 3,60 3,81 −4,14 11,34
Biperiden 1 15,90 2,81 10,18 21,61 7 3,90 3,28 −2,76 10,56 14 7,10 3,81 −0,64 14,84
Mepazin 1 11,75 3,14 5,36 18,13 7 3,87 3,66 −3,58 11,33 14 10,25 4,25 1,59 18,90
Mepazin-Biperiden 1 9,80 2,81 4,08 15,51 7 10,70 3,28 4,03 17,36 14 3,20 3,81 −4,54 10,94
M = Mittelwert, SE = Standardfehler, Messwdh. = Messwiederholung, Untergr. = Untergrenze, Obergr. = Obergrenze In der letzten Versuchswoche verstarben zwei Mäuse der Mepazingruppe. Die
Obduktion ergab intraperitoneale Blutungen. Es konnte kein Zusammenhang mit
der Behandlung festgestellt werden.
120
5 DISKUSSION
5.1 Diskussion der Methodik
Von vielen Patienten wird das Vorkommen extrapyramidal-motorischer Störungen
als die am stärksten belastende Nebenwirkung einer Neuroleptikatherapie
empfunden (TOLLEFSON et al. 1997; LAUX et al. 2013). Die EPMS-Symptomatik
zählt zu den Hauptgründen für eine mangelnde Compliance und führt in mehr als
50 % der Fälle zum Therapieabbruch. Sie tritt bei bis zu 75 % der Patienten unter
Neuroleptikatherapie auf (TOLLEFSON et al. 1997). CASEY (1991) berichtet über
ein Auftreten bei 90 % der Patienten. In letzter Zeit sind Phenothiazine in
verschiedenen Studien als Therapieansatz wieder in den Fokus geraten (AMARAL
et al. 2012; NAGEL et al. 2012; SACHLOS et al. 2012; GUTIERREZ et al. 2014; MC
GUIRE et al. 2014). YOUNG et al. (2012) und AFONINA et al. (2015) sehen zwar
Potential in dem Einsatz von Phenothiazinen als Chemotherapeutika, Limitationen
für eine längerfristige Nutzung dieser Stoffklasse sind aber laut den Autoren die
bekannten Nebenwirkungen. Zur Überprüfung dieser Nebenwirkungen wurden in
der vorliegenden Studie Mäuse in einem tumortragenden Xenograftmodell des
humanen Pankreaskarzinoms, die unter einer Langzeittherapie mit dem
Phenothiazinderivat Mepazin standen, einer neurologischen Verhaltenstestung auf
mögliche EPMS unterzogen. Diese Tests lassen eine Aussage bezüglich
Spontanaktivität, Motorik, Koordination, Feinmotorik und somatosensorischer
Koordination zu.
Diese aktiven Tests eröffnen zudem die Möglichkeit, extrapyramidal-motorische
Störungen besser identifizieren zu können, als es durch passives Beobachten der
Therapie- und Kontrollgruppen alleine möglich wäre (COMBS et al. 1987). Ein
weiterer Vorteil einer Verhaltenstestung gegenüber der Erfassung pathologischer
Parameter liegt laut MOSER (2011) in der Möglichkeit, ein einzelnes Tier mehrfach
zu testen. Der Beginn, der Verlauf, die Dauer und die Reversibilität einer
Veränderung können somit genau bestimmt werden. HWANG (2005) konnte sogar
deutlich zeigen, dass in einem Mausmodell des Morbus Parkinson im Zuge einer
121
allgemeinen Beobachtung der Tiere keine Defizite vorzuliegen schienen. Bei Tests
zur Prüfung der Funktion des nigrostriatalen Systems traten jedoch eindeutig
motorische Defizite auf. Deshalb stuft diese Arbeitsgruppe Tests mit spezifischen
Aufgaben im Vergleich zu mehr allgemeineren motorischen Tests wie z.B. der Open
Field-Test oder der Rotarod als sensitiver ein.
Die Testbatterie der Untersuchungen in der vorliegenden Studie umfasst etablierte
Tests, mit Hilfe derer man qualitative und quantitative Aussagen hinsichtlich
extrapyramidal-motorischer Störungen treffen kann.
Wie viele Tests sind nötig? Gibt es den einen „Goldstandardtest“, den jeder
benutzen sollte? CRAWLEY (2008) beantwortet diese Fragen mit Nein, und auch
KARL et al. (2003) und SCHALLERT et al. (2000) geben an, dass die Testauswahl
erheblich von den Präferenzen des jeweiligen Forschers und auch vom zeitlichen
Aufwand und den finanziellen Mitteln abhängt.
Gewählt wurden für die vorliegende Studie bereits etablierte Tests zur Prüfung der
motorischen und sensorischen Fähigkeiten. Die Tests wurden in der Vergangenheit
in dieser Form bereits unter anderem von FLEMING et al. (2013), BOUET et al.
(2009), BROOKS et al. (2009) und HWANG (2005) durchgeführt. Vorteil dieser
Testbatterie ist der geringe apparative Aufwand und die damit verbundenen
geringen Anschaffungskosten. Gleichzeitig lassen sich mit dieser Testbatterie
motorische und sensorische Parameter quantitativ und zielgerichtet erfassen.
Die Tests wurden immer zur gleichen Zeit zwischen neun und elf Uhr vormittags
von der gleichen Person durchgeführt. Prinzipiell sollten Verhaltensanalysen zur
aktiven Zeit der Mäuse (d.h.nachts) durchgeführt werden, oder man legt die aktive
Phase der Mäuse mit der aktiven Phase des Untersuchers zusammen. In diesem
Fall werden die Mäuse in einem separaten Raum einem entgegengesetzten Tag-
Nacht-Rhythmus ausgesetzt. Die Arbeiten während der aktiven Nachtphase der
Mäuse müssen dann unter Rotlicht vorgenommen werden. Die Versuche dieser
Studie wurden tagsüber durchgeführt, da der Versuchsaufbau
Videoaufzeichnungen vorsah, welche im Anschluss ausgewertet werden mussten,
da viele Parameter gleichzeitig überprüft wurden. Dies wäre bei einer Beobachtung
122
in Echtzeit während des laufenden Versuches nicht möglich gewesen. Eine
Videoaufzeichnung während der Dunkelphase mit Rotlicht wäre deutlich zu Lasten
der Auswertbarkeit des Videomaterials gegangen, weshalb man sich für die Zeit von
9 bis 11 Uhr entschied. Desweiteren geben FLEMING et al. (2013) an, dass eine
Versuchsdurchführung mit den gewählten Tests auch während der inaktiven Phase
der Mäuse möglich ist.
Mäuse reagieren sehr sensibel auf Veränderungen, wie z. B. wechselnde
Experimentatoren, Unruhe und Geräuschkulisse, inkonstanter Tagesablauf und
Veränderungen im Versuchsablauf (CRAWLEY 2008; LEDOUX 2014). Deshalb ist
es wichtig, dass auf absolute Konstanz geachtet wird, wenn Verhaltenstests
durchgeführt werden. Auch die Reihenfolge innerhalb einer Testbatterie ist wichtig.
Mit dem am wenigsten Stress für die Mäuse verursachenden Test sollte begonnen
werden. Der Test, welcher am meisten Stress verursacht, sollte am Schluss
durchgeführt werden (CRAWLEY 2008). Deshalb führten wir unsere Testbatterie in
folgender Reihenfolge durch: den Zylinder-Test zu Beginn, gefolgt vom Beam-Test
und dem Sticker-Test am Ende. Der Zylinder-Test ruft am wenigsten Stress bei den
Mäusen hervor, da sie nur kurz angefasst werden und dann für drei Minuten im
Zylinder sitzen. Der Beam-Test führt zu etwas mehr Stress, da die Mäuse eine
motorische Leistung erbringen müssen. Am meisten Stress verursacht der Sticker-
Test, da die Tiere zum Anbringen des Aufklebers stark fixiert werden müssen.
Die Tiere wurden nicht täglich dem neurologischen Scoring unterzogen, um die
Motivation zur Durchführung der Tests nicht überdurchschnittlich zu beanspruchen.
Eine fehlende Motivation kann zu einer mangelnden Kooperationsbereitschaft
führen, und dies wiederum könnte Ergebnisse negativ beeinflussen.
Die gewählten Tests erschienen uns angemessen, um die Mäuse zum einen
entsprechend zu fordern und zum anderen Verhaltensauffälligkeiten aufzudecken.
Besteht der Verdacht auf motorische Defizite, so sollte die Annahme durch weitere
Tests überprüft werden (LUONG et al. 2011). Aus diesem Grund haben wir in der
vorliegenden Studie eine Testbatterie bestehend aus den genannten Tests
eingesetzt.
123
In dieser Studie wurden Mäuse nach der Medikamentenapplikation einer
Verhaltenstestbatterie unterzogen. In früheren Studien, welche diese oder ähnliche
Tests anwendeten, handelte es sich um gentechnisch veränderte Mäuse oder um
Mäuse, die einem operativen Eingriff unterzogen wurden, um ein spezifisches
Krankheitsbild hervorzurufen. Das durch gentechnischen knock-out oder operativ
erzeugte Krankheitsbild wurde dann medikamentös behandelt und das Resultat
anhand von Verhaltenstests überprüft.
In dieser Arbeit wurde erstmalig sowohl eine Mepazinmonotherapie als auch die
Kombinationstherapie aus diesem Neuroleptikum der ersten Generation und
Biperiden einer Prüfung auf extrapyramidal-motorische Störungen unterzogen. Im
Rahmen dieser Studie konnten wir zeigen, dass eine Therapie mit Mepazin zwar zu
einer Reduktion der Spontanaktivität im Zylinder-Test führt, Motorik, Koordination
und Feinmotorik aber unverändert bleiben.
Mepazin wurde in den 1950er Jahren in Form von Tabletten oder als Injektion
verabreicht (FELDMAN 1957; SARWER-FONER et al. 1957; HOOPER 1958;
CASEY et al. 1960). Wiederholte intraperitoneale Injektionen bedeuten zwar für das
Versuchstier mehr Stress und ein erhöhtes Risiko, Spritzabszessen und Peritonitis
zu induzieren. Trotzdem erschien diese Art der Medikamentenapplikation am
sinnvollsten, da die orale Medikation bei Tieren über Futter oder Trinkwasser oft
nicht zu einer hundertprozentig genauen Dosierung führt. Die Aufnahme von Futter
und Wasser kann zum einen individuell unterschiedlich sein, zum anderen nehmen
kranke Tiere generell weniger Futter und Wasser auf. Da die Mäuse auch mit bis zu
fünf Tieren in einem Käfig verblieben, konnte so nicht sichergestellt werden, dass
jede Maus das Medikament in der gewünschten Dosierung aufnimmt. Durch das
tägliche Überprüfen des Gesundheitszustandes wären Anzeichen einer
Verschlechterung des Allgemeinzustandes oder Aszites durch eine Peritonitis
aufgefallen. Alle Mäuse wiesen während der gesamten Dauer der Behandlung das
Verhalten gesunder Tiere auf. In Betracht zu ziehen ist die orale Applikation des
Medikamentes über eine Schlundsonde, wobei der Stress für die Tiere vergleichbar
mit dem bei einer intraperitonealen Injektion ist. Die intraperitoneale Injektion ist
allerdings einfacher durchzuführen. In Rahmen von weiterführenden Studien zur
124
Pharmakodynamik und Pharmakokinetik von Mepazin sollte auch die Möglichkeit
der oralen Applikation untersucht werden.
Als Ausgangspunkt für die Dosisfestlegung in dieser Studie dienten Daten aus der
Literatur. Die eingesetzte Dosis von Mepazin betrug 16 mg/kg, entnommen aus
einer Studien von MC GUIRE et al. (2014), in der Mäuse zweimal täglich mit 8 mg/kg
intraperitoneal behandelten wurden, und einer Studie von NAGEL et al. (2012),
welche 16 mg/kg Mepazin einmal täglich ebenfalls intraperitoneal verabreicht
haben. Diese Dosierung entspricht einer Menge von 400 µg Mepazin pro Maus (bei
einem Körpergewicht von durchschnittlich 25g) (NAGEL et al. 2012).
In der letzten Zeit sind Phenothiazine gezielt als potentielles Krebstherapeutikum in
verschiedenen Studien eingesetzt worden (NAGEL et al. 2012; SACHLOS et al.
2012; GUTIERREZ et al. 2014; MC GUIRE et al. 2014). Eine explizite Testung
bezüglich der bei Phenothiazinen bekannten Nebenwirkung der EPMS ist in keiner
dieser Studien vorgenommen worden. Ebenso wenig ist bis jetzt in diesem
Zusammenhang über eine kombinierte Behandlung mit Biperiden berichtet worden.
Die Ermittlung des optimalen Zeitpunktes der Durchführung der Verhaltenstests
nach Mepazinapplikation gestaltete sich als schwierig, da zur Pharmakokinetik und
Pharmakodynamik von Mepazin keine aktuellen Angaben existieren. In den älteren
Studien gibt es verschiedene Anhaltspunkte, wobei in diesen Studien hauptsächlich
die Wirksamkeit der Medikamente be- oder widerlegt wurde. PURKIS (1958) wies
einen Effekt fünf Minuten nach intravenöser Applikation von Mepazin in einer
Dosierung zwischen 25 – 200 mg nach. Sie testeten den Einsatz von Mepazin in
Kombination mit Analgetika während der Geburt. DAVIES et al. (1956) berichten,
dass Mepazin schnell absorbiert und eliminiert wird, wobei „schnell“ nicht weiter
quantifiziert wurde und diese These in keiner Art und Weise begründet wurde. Im
Rahmen der neuen Studien von NAGEL et al. (2012) und MC GUIRE et al. (2014)
wurden keine Tests zur Erfassung von EPMS nach der Gabe von
Phenothiazinderivaten durchgeführt. Die Studie von FLEMING et al. (2013), nach
dessen Vorbild die vorliegenden Untersuchungen liefen, liefert auch keinen Hinweis
auf die Zeitspanne zwischen Medikamentenapplikation und Versuchsbeginn.
125
NAGEL (2013) untersuchte in seiner Dissertationsschrift die Wirksamkeit von
Mepazin und Thioridazin in der Therapie des großzelligen B-Zell-Lymphoms.
Anhand der Ergebnisse des murinen Tumorxenograftmodells, in welchem Mepazin
und Thioridazin eine ähnliche Wirkung zeigten, verdichtete sich für NAGEL der
Hinweis, dass Mepazin und Thioridazin höchstwahrscheinlich eine vergleichbare
Pharmakokinetik aufweisen. Diese Vermutung wird auch durch die strukturelle
Ähnlichkeit der beiden Substanzen gestützt, wie Abbildung 36 zeigt.
Abbildung 36: Strukturformeln von Mepazin und Thioridazin im Vergleich (NAGEL et al. 2012).
NAGEL et al. (2012) untersuchten die Pharmakokinetik von Thioridazin, in dem sie
Mäusen Blut zur Bestimmung des Thioridazin-Serumspiegels 0, 1, 2, 6 und 24
Stunden nach intraperitonealer Injektion von 12 mg/kg Thioridazin abnahmen. Nach
einer Stunde konnten sie einen Serumspiegel von Thioridazin nachweisen, der noch
im therapeutischen Bereich der Dosierung beim Menschen lag. Der Serumspiegel
fiel im weiteren Verlauf des Versuches rapide ab und lag nach 24 Stunden unterhalb
der Nachweisgrenze. SHIMIZU et al. (2015), TATARA et al. (2012) und OHNO et
al. (2011) induzierten eine EPMS Symptomatik in Mäusen in Form von Bradykinesie
und Katalepsie nach intraperitonealer Injektion von 0,3 – 0,5 mg/kg des
126
Neuroleptikums Haloperidol. Diese EPMS konnten sie 30 Minuten nach
Medikamentenapplikation in einem Verhaltenstest (Pole-Test) nachwiesen.
Aufgrund der oben genannten Studien wurde entschieden, die Verhaltenstests 30
Minuten nach intraperitonealer Applikation von Mepazin, Biperiden und der
Kombination aus Mepazin und Biperiden durchzuführen. Dennoch wird es wichtig
sein, in weiterführenden Studien die Pharmakokinetik von Mepazin genau zu
untersuchen.
Eine Monotherapie mit Mepazin bzw. mit Biperiden fand aus dem Grunde statt, dass
die Effekte der einzelnen Medikamente erfasst werden sollten. Darüber hinaus
sollten das therapeutische Nutzen sowie die eventuellen extrapyramidal-
motorischen Nebenwirkungen der einzelnen Therapiekomponenten sowie die der
Kombination bestimmt werden. Keine Therapiekomponente sollte die Wirkung einer
anderen überdecken.
Zur Therapie des neuroleptikainduzierten Parkinsonoid werden Anticholinergika,
wie z.B. Biperiden, verabreicht. Empfohlen wird begleitend dazu eine
Dosisreduktion oder eine Umstellung auf ein anderes Präparat bzw. der Wechsel
zu einem atypischen Neuroleptikum (GAEBEL 1993; HASSIN-BAER et al. 2001;
COUREY 2007), was jedoch bei dem angestrebten Gebrauch als onkologisches
Medikament nicht möglich ist. Deshalb ist ein Screening auf potentielle EPMS in
Form einer präklinischen Studie unter Mepazintherapie eine wichtige Maßnahme,
insbesondere wenn man bedenkt, dass das Ausmaß der Nebenwirkungen die
Compliance des Patienten beträchtlich beeinflusst. Eine prophylaktische Gabe von
einem Anticholinergikum wie Biperiden unter Neuroleptikatherapie wird von der
WHO zwar nicht empfohlen (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1990, 2012;
DESMARAIS et al. 2014). In der vorliegenden Studie wird diese Vorgehensweise
aber dadurch gerechtfertigt, dass sowohl Biperiden als Monotherapie als auch die
Kombinationstherapie aus Mepazin und Biperiden in den vorangegangenen in vitro
Versuchen antiproliferative Effekte zeigten ( EL GAMMAL et al. 2015 und
unveröffentlichte Daten). Zum anderen hat auch Biperiden durch seinen
stimulierenden Effekt - die Einnahme höherer Dosierungen kann zur
127
Orientierungslosigkeit und motorischer Unruhe führen - einen Einfluss auf die
Motorik (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1990; ALLAHVERDIYEV et al. 2011).
Desweiteren wird von GIELING et al. (2013) als weitere häufige Nebenwirkung von
Biperiden Unruhe, Hyperaktivität und Ataxie beschrieben.
Die Dosierung für Biperiden in Mäusen wurde aus einer Studie von ZACARIAS et
al. (2012), die Biperiden in einer Dosierung von 10 mg/kg intraperitoneal
verabreichten hatten, entnommen.
In der hier vorliegenden Studie wurde Mepazin über einen Zeitraum von 45 Tagen
täglich appliziert. Dieser Zeitraum wurde aufgrund des Abbruchkriteriums der
maximal tolerierbaren Tumorlast, welches ab einem Tumorvolumen von 10 mm3
Anwendung findet, gewählt. Zum anderen wurde eine möglichst lange
Therapiedauer angestrebt, um mögliche Effekte sicher zu erfassen.
FLEISCHHACKER et al. (2005) und DIVAC et al. (2014) geben als Zeitraum, in dem
das maximale Risiko für das Auftreten des Parkinsonoids unter
Neuroleptikatherapie besteht, den 5. bis 30. Behandlungstag an. Fünfizg Prozent
der Patienten entwickeln dabei akute EPMS in den ersten Behandlungstagen, 90 %
der Fälle treten in den ersten zehn Behandlungswochen auf. Vor diesem
Hintergrund deckt der gewählte Zeitraum von 45 Tagen einen Großteil der
Risikoperiode ab, in dem wir während des gesamten Behandlungszeitraums jeden
dritten Tag Verhaltensanalysen durchführten, um EPMS sofort zu erkennen.
Subkutane Tumormodelle finden eine weite Verbreitung in der tierexperimentellen
Krebsforschung. Dieses Modell weist Vor- und Nachteile auf. Zu den Vorteilen
gehört zweifelsohne die Tatsache, dass Veränderungen in der Tumorgröße
aufgrund einer Pharmakotherapie einfach erfasst werden können (RICHMOND et
al. 2008; TULI et al. 2012; SALUJA et al. 2013; DAI et al. 2015). Ein weiterer Vorteil
ist die mit geringem Stress für die Maus verbundene Implantation der Tumorzellen
durch subkutane Injektion. Zu den negativen Seiten zählt die Ulzerationsneigung
der Tumore, die auch mit einem erhöhten Infektionsrisiko einhergeht. Als wichtigster
Nachteil wird von einigen Autoren (TENTLER et al. 2012; SALUJA et al. 2013;
WILLIAMS et al. 2013) vorgetragen, dass das Modell die klinische Situation nur
128
bedingt widerspiegelt. Die Metastasierungsrate ist gering und die Interaktion mit den
Stroma- und Parenchymzellen des Organs fehlt.
Das subkutane Xenograftmodell wurde dennoch für diese Studie ausgewählt, da
Veränderungen im Tumorwachstum aufgrund der verabreichten Medikation sowie
das Auftreten möglicher extrapyramidal-motorischer Störungen einfach analysiert
werden konnten.
Die Ergebnisse sollten jedoch im Anschluss in einem orthotopen Tumormodell
überprüft werden, welches die in vivo-Situation (d.h. die Entstehung eines spontan
entstandenen Tumors) besser darstellt. Für die Untersuchung auf mögliche EPMS
unter Neuroleptikatherapie spielt die Wahl des Tumormodells aber nur eine
untergeordnete Rolle.
Desweiteren wurden gemischtgeschlechtliche Gruppen verwendet, da es laut
SEUFFERLEIN et al. (2014) keinen Unterschied zwischen den Geschlechtern
bezüglich des Vorkommens des Pankreaskarzinoms gibt. Andere Autoren sehen
kleine Unterschiede in der Inzidenz von Pankreastumoren zwischen den
Geschlechtern (SAHORA et al. 2008; SPALDING et al. 2011).
Die Todesursache der zwei verstorbenen Mäuse der Mepazingruppe wenige Tage
vor Abschluss der Versuchsreihe konnte auch durch eine Obduktion nicht
abschließend geklärt werden. Festgestellt wurde eine intraperitoneale Blutung. Eine
Erklärung dafür könnte eine Fehlinjektion sein, obwohl laut der GV-SOLAS (2010)
eine Stichverletzung innerer Organe als Folge einer intraperitonealen Injektion
äußerst selten vorkommt und aufgrund der klinischen Befunde leicht erkennbar sein
sollte. Ein weiterer Erklärungsansatz ist die von KARIM et al. (2015) beschriebene
und durch Inhibition der MALT1-Ubiquitinierung bedingte
Blutplättchenaggregationshemmung. Dies führt in der Folge zu einer Störung der
Thrombogenese und Hämostase und zu einer inneren Blutung, möglicherweise
begünstigt durch eine leichte Stichverletzung. Die Anwendung von Mepazin im
klinischen Gebrauch sollte in jedem Fall von einer engmaschigen Überprüfung aller
Vitalparameter und einer hämostaseologischen Labordiagnostik begleitet werden.
129
5.2 Diskussion der Ergebnisse des Zylinder-Tests
Der Spontaneous Activity in the Cylinder-Test, im Folgenden als Zylinder-Test
bezeichnet, testet die Spontanmotorik in horizontaler und vertikaler Ebene. In
seinen vier auswertbaren Komponenten - Anzahl der Aufrichtungen, Anzahl der
Vorderfußschritte, Anzahl der Hinterfußschritte und Dauer der Pflegezeit - zeigten
sich nur in der Anzahl der Aufrichtungen signifikante Unterschiede zwischen den
Gruppen. Die Mepazingruppe zeigte eine signifikant geringere vertikale
Spontanaktivität als die Biperidengruppe und die Mepazin-Biperiden-Gruppe.
Ansonsten gab es keine signifikanten Unterschiede bezüglich der anderen
Testkomponenten, obwohl die Mäuse der Mepazingruppe tendenziell
bewegungsärmer im Vergleich zu den drei anderen Gruppen waren.
FLEMING et al. (2011) setzten den Zylinder-Test in einem α-Synuclein-über-
exprimierenden Mausmodell der Parkinson-Krankheit ein und konnten robuste
Veränderungen in allen Parametern des Tests im Parkinson-Mausmodell
gegenüber Wildtyp-Mäusen zeigen. In einer Studie aus dem Jahr 2013 konnten
FLEMING et al. wiederholt eine Reduktion der Anzahl der Hinterfußschritte im
Zylinder-Test bei α-Synuclein-überexprimierenden Mäusen nachweisen. Die
Autoren dieser Studie gaben auch an, dass dieser Test anfällig bezüglich einer
Gewöhnung der Tiere ist, und stellten bereits nach dem zweiten Testdurchlauf eine
reduzierte Aktivität fest. Diese Reduktion der Aktivität durch repetitives Testen
wurde ebenfalls in der vorliegenden Studie festgestellt. Dabei nahmen die
Testparameter Vorderfuß- und Hinterfußschritte sowie Aufrichtungen und Dauer der
Pflegezeit in allen Gruppen ab. Die Gruppen befanden sich jedoch auf
verschiedenen Aktivitätsstufen, d.h. die Kontrollgruppe zeigte eine Abnahme der
Aktivität über die Zeit auf einem höheren Aktivitätsniveau als die Mepazingruppe,
welche generell in diesem Test das niedrigste Aktivitätsniveau aufwies.
HWANG (2005) setzte den Zylinder-Test in einer Studie an Pitx3-defizienten
Aphakia-Mäusen ein, welche einen Verlust an dopaminergen Neuronen in der
130
Substantia nigra, die mit motorischen Defiziten einhergehen, aufweisen und sich
deshalb als Mausmodell des Morbus Parkinson eignen. Die Studie dieser
Arbeitsgruppe zeigte unter anderem, dass der Zylinder-Test als dreiminütige
Aktivitätsmessung sensitiver ist als eine 22-stündige Dauermessung.
Wie in der vorliegenden Studie zeigten auch die Mäuse in der Studie von HWANG
(2005) eine signifikante Reduktion der vertikalen Spontanaktivität und eine
tendenzielle Reduktion der Anzahl der Hinterfußschritte, nicht aber der Anzahl der
Vorderfußschritte oder der Dauer der Pflegezeit.
Dies lässt den Schluss zu, dass es durch die Medikation mit Mepazin bei den
Mäusen zu einer Hypokinesie als Ausdruck einer teilweise reduzierten
Spontanmotorik kommt. Dieser Effekt ist bei der Mepazin-Biperiden-Gruppe nicht
zu sehen; dies bedeutet, dass die Hypokinesie durch Biperidengabe aufgehoben
werden kann. LANGER et al. (2013) empfehlen den Einsatz von Biperiden bei
auftretendem Rigor und Hypokinese in der Behandlung Neuroleptika-induzierter
motorischer Störungen. Die vorliegenden Ergebnisse sind in Einklang mit denen
von HWANG (2005), FLEMING et al. (2011) und FLEMING et al. (2013), wobei die
durch Mepazin hervorgerufene EPMS-Symptomatik als geringgradig eingestuft
werden kann. Des Weiteren zeigen die Ergebnisse, dass diese Hypokinese durch
Biperidengabe therapierbar ist.
FLEMING et al. (2013) wenden den Zylinder-Test mit einer geringeren
Wiederholungszahl an, um der Habituation der Mäuse entgegenzuwirken. Sie
geben eine Testfrequenz von zwei bis viermal an, wobei zwischen den Tests jeweils
eine Woche liegt. In der vorliegenden Studie wurde eine engmaschigere
Testfrequenz (d.h. eine Testung jeden dritten Tag) gewählt, um die während der
von uns durchgeführten Langzeitmedikation möglicherweise auftretenden EPMS
sofort festzustellen und gegebenenfalls eine Dosisanpassung oder einen
Versuchsabbruch aus Tierschutzgründen durchführen zu können. Eine Testung im
wöchentlichen Rhythmus hätte unserer Ansicht nach dazu geführt, dass das
Vorliegen von EPMS erst zu einem späteren Zeitpunkt erkannt worden wäre.
131
5.3 Diskussion der Ergebnisse des Beam-Tests
Der Beam-Test ist weit verbreitet und wird zur Erfassung und Beurteilung
verschiedenster Schädigungen eingesetzt (CARTER et al. 2001; FLEMING 2009;
FLEMING et al. 2011; LUONG et al. 2011; CHESSELET et al. 2012; SMITH et al.
2012; FLEMING et al. 2013).
Dieser Test kann motorische Defizite, bedingt durch Alter, Läsionen des
Zentralnervensystems sowie durch genetische oder pharmakologische Einflüsse,
aufdecken (LUONG et al. 2011). STANLEY et al. (2005) wiesen motorische Defizite
durch Benzodiazepinbehandlung mit dem Beam-Test nach und konnten eine
größere Sensitivität des Beam-Tests im Vergleich zum Rotarod-Test feststellen.
Auch FLEMING et al. (2013) halten den Beam-Test gegenüber dem Rotarod für
sensitiver, insbesondere bezüglich der Detektion subtiler Veränderungen im
nigrostriatalen dopaminergen System.
In dem in dieser Studie durchgeführten Beam-Test konnten keine motorischen
Defizite durch eine Behandlung mit Mepazin als Monotherapie oder in Kombination
mit Biperiden auf einem signifikanten Niveau nachgewiesen werden. Der
Testparameter Fehleranzahl wies keine signifikanten Unterschiede zwischen den
Gruppen auf. Tendenziell machte zwar die Mepazingruppe mehr Fehler, dies ließ
sich aber nicht statistisch belegen. Die Fehleranzahl auf dem Beam gilt als das
sensitivste Maß zur Detektion von Störungen der Motorik und Koordination und eine
hohe Fehleranzahl ist korreliert mit einer motorischen Beeinträchtigung (STANLEY
et al. 2005; ROMMELFANGER et al. 2007; FLEMING et al. 2011; HALLETT et al.
2012).
LUONG et al. (2011) stellten fest, dass Mäuse, die motorisch und koordinativ
beeinträchtigt sind, länger brauchen, um den Balken zu überqueren. In der hier
vorliegenden Studie brauchte die Biperidengruppe signifikant mehr Zeit und mehr
Schritte zur Balkenüberquerung als die anderen Gruppen. Bei diesem Ergebnis
handelt es sich aber nicht um eine extrapyramidal-motorische Störung, welche bei
132
einer Medikation mit Biperiden auch nicht zu erwarten ist. Ein Ergebnis im Sinne
einer EPMS-Symptomatik wäre eine erhöhte Fehleranzahl als Ausdruck eines
motorischen Defizites, sowie eine erhöhte Schrittanzahl infolge der Kleinschrittigkeit
als eine der Ganganomalien beim Parkinsonoid gewesen. Als Resultat aus beidem
wäre desweiteren noch eine Erhöhung der benötigten Zeit zur Überquerung des
Balkens zu erwarten gewesen, wie es HWANG (2005) und FLEMING et al. (2004)
in ihren Studien an Mäusen zeigten. Die Biperidengruppe ist in keinem anderen
Verhaltenstest durch ein signifikantes Ergebnis auffällig geworden. Ein
Erklärungsansatz für dieses Ergebnis kann ein von LUONG et al. (2011)
beschriebenes Übertraining oder eine fehlende Motivation sein. Die Arbeitsgruppe
beobachtete, dass Mäuse auch einer Aufgabe überdrüssig werden können, was
sich in Unkooperativität und in der Folge in einer verlängerten Zeitdauer auf dem
Balken äußert. Desweiteren empfiehlt diese Arbeitsgruppe bei einem Verdacht auf
motorische Defizite die Anfangsbefunde durch weitere Tests zu bestätigen. Dem
wurde in der vorliegenden Studie dadurch Rechnung getragen, dass anhand des
Adhesive Removal-Tests die motorischen Fähigkeiten auch geprüft wurden.
Generell wird bei der präklinischen Prüfung der Wirkung einer Medikation auf das
Verhalten die Durchführung von mehreren Tests gefordert (BROOKS et al. 2009;
FLEMING et al. 2013). So können, wie im vorliegenden Fall, Ergebnisse noch
einmal durch eine andere Testbatteriekomponente bestätigt oder widerlegt werden.
Als Kritikpunkt zum Versuchsaufbau in diesem Zusammenhang kann angemerkt
werden, dass man für jede Mausgruppe einen Ausgangswert ohne Medikation hätte
messen sollen. In dem hier gewählten und von FLEMING (2009) und FLEMING et
al. (2013) etablierten Tests wurde jeweils eine Kontrollgruppe bzw. Wildtyp-Mäuse
als Vergleichsgruppe herangezogen und eine Habituationsphase wurde nicht in die
Auswertung mit einbezogen. Anhand der Ergebnisse der Messung der benötigten
Zeit zur Überquerung des Balkens im Beam-Test ist zuerkennen, dass die
Biperidengruppe vom ersten Versuchstag an mehr Zeit und Schritte benötigte als
die anderen Gruppen. Dies spricht gegen die Theorie des Übertrainings, denn dann
hätte man eine Verlängerung der Zeitspanne zur Überquerung des Balkens erst im
Verlauf des Versuchs beobachten müssen.
133
Eine weitere Erklärung für mit der Biperidengruppe im Beam-Test erzielte Ergebnis
ist die Beeinträchtigung der kognitiven Leistung durch die Biperidengabe.
ZACARIAS et al. (2012), aus deren Studie die Biperidendosierung von 10 mg/kg
übernommen wurde, untersuchten den Einfluss von Biperiden auf Kokain-
konditionierte Platzpräferenzen innerhalb einer Testkammer in einem Mausmodell
zur Erforschung von Substanzabhängigkeiten. Die Arbeitsgruppe konnte zeigen,
dass Biperiden die durch Kokain hervorgerufene Platzpräferenz in einer
Testkammer reduziert. Als Erklärung für diesen Effekt gaben sie den Einfluss von
M1-Rezeptorantagonisten auf die Gedächtnisleistung an. Die cholinerge Aktivität
am Muskarinrezeptor ist wichtig für die kognitive Funktion, besonders im Hinblick
auf Lernleistung und Gedächtnisfunktion (MIRANDA et al. 2007). Der Antagonismus
von Biperiden am M1-Rezeptor führt zu einer reduzierten Lern- und
Gedächtnisleistung in einem passiven Vermeidungstest bei Mäusen und Ratten
(ZACARIAS et al. 2012).
Da der Beam-Test der einzige Test in unserer Testbatterie ist, der ein vorheriges
Training benötigte, und somit einem gewissen Lernprozess unterliegt, lässt sich das
Abschneiden der Biperidengruppe im Vergleich zu den Testleistungen der anderen
Gruppen im Beam-Test am ehesten mit einer reduzierten kognitiven Leistung
erklären. Auch die von GIELING et al. (2013) genannten Nebenwirkungen
(motorische Unruhe, Hyperaktivität und Ataxie) können zu dem von der
Biperidengruppe gezeigten Testergebnis beitragen. Aber sowohl die
Biperidengruppe als auch alle anderen Gruppen zeigten mit zunehmender
Testerfahrung über die Zeit bezüglich der drei Testparameter des Beam-Tests eine
verbesserte Bewältigung der Aufgabe. Vergleichbare Studien, in denen Mäuse
unter Biperidengabe den gleichen oder ähnlichen Tests unterzogen wurden wie in
der hier vorliegenden Studie, konnten bisher in der Literatur nicht gefunden werden.
Das über den Balken gelegte Maschendrahtgitter, welches ein motorisches
Erfahrungslernen nach FLEMING (2009) und PIETROPAOLO et al. (2014)
verhindern soll, indem der Schwierigkeitsgrad der Aufgabe erhöht wird, konnte
diesen Effekt nur bedingt verhindern. Dies lässt auf der einen Seite den Schluss zu,
dass läsionsinduzierte oder durch genetischen Knock-out hervorgerufene Defizite
134
robuster sind als medikamentös herbeigeführte. In diesem Zusammenhang
empfehlen DHANUSHKODI et al. (2011), FLEMING et al. (2013) und SCHALLERT
et al. (2000) den Einsatz von Verhaltenstests zur Evaluierung der Wirkungen und
Nebenwirkungen von Arzneimitteln. Auf der anderen Seite wurden in den Studien,
die die gleichen Tests anwendeten wie die in der vorliegenden Studie, keine Daten
bezüglich Veränderungen der Testparameter mit der Zeit anhand von
Verlaufsdiagrammen gezeigt. Die meisten Studien geben ihre Ergebnisse als
gepoolte Mittelwerte wieder, die keine Rückschlüsse auf den Zeitverlauf zulassen.
Dennoch bildete in diesen Studien die ANOVA, wie das in der hier vorliegenden
Arbeit der Fall ist, die methodische Grundlage zur statistischen Auswertung.
Besonders im Fall der Studien von FLEMING et al. (2013) und FLEMING et al.
(2011) wäre es äußerst interessant gewesen, die Daten der einzelnen Testtage zu
sehen, um diese mit den hier vorliegenden Daten vergleichen zu können.
5.4 Diskussion der Ergebnisse des Adhesive Removal- Tests
Der Adhesive Removal-Test, auch als Sticker-Test bekannt, findet eine breite
Anwendung und wird von vielen Autoren als sensitiv beschrieben (BOUET et al.
2009; BOUET et al. 2012; DHANUSHKODI et al. 2013; WANG et al. 2013).
Der Sticker-Test konnte in dieser Studie keine signifikanten Unterschiede zwischen
den Gruppen feststellen. In keiner der Mausgruppen liegt eine Beeinträchtigung der
Feinmotorik oder der somatosensorischen Koordination vor. FLEMING et al. (2013)
beschreiben diesen Test als robust gegenüber Wiederholungen. Das bedeutet,
dass Lerneffekte oder Motivationsverluste durch Übertraining in diesem Test nicht
vorkommen sollten. Dennoch lässt sich die festgestellte Verkürzung der
Reaktionszeit mit einem gewissen Trainingseffekt durch zunehmende
Testerfahrung infolge des repetitiven Testens begründen.
Eine Beeinträchtigung der Feinmotorik äußert sich nach CHESSELET et al. (2012)
auch in einem reduzierten Putzverhalten. Das Putzverhalten, welches auch durch
135
die Dauer der Pflegezeit im Zylinder-Test mitbestimmt wurde, zeigte zwischen den
Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Darüber hinaus konnten durch die
tägliche Beobachtung der Mäuse keine Abweichungen oder Reduktion im
Putzverhalten bemerkt werden, was sich zum Beispiel durch schmutziges und
verklebtes Fell äußern kann.
LEDOUX (2014) und FLEMING et al. (2004) zeigten bei Parkin-Knock-out-Mäusen
und bei Mäusen mit α–Synuclein-Überexpression Beeinträchtigungen in der Antwort
auf sensorische Reize in diesem Test.
In den in dieser Studie generierten Daten zeigten sich noch nicht einmal
tendenzielle Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. Die Sensitivität des
Tests ist aber in vielen Studien belegt (STARKEY et al. 2005; BOUET et al. 2009;
FRERET et al. 2009; DHANUSHKODI et al. 2013). Die methodische Ausführung
kann als korrekt angesehen werden. Dies lässt den Schluss zu, dass durch eine
Medikation mit Mepazin als Monotherapie keine Beeinträchtigung der Feinmotorik
und der somatosensorischen Koordination stattfindet.
5.5 Abschließende Betrachtung und Ausblick
Abschließend kann gesagt werden, dass eine Therapie mit dem Neuroleptikum
Mepazin alleine oder in Kombination mit dem Anticholinergikum Biperiden auf der
Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Studie als vertretbar sowohl im Hinblick
auf die Schwere der zugrundeliegenden Primärerkrankung Pankreaskarzinom
eingestuft werden kann, als auch hinsichtlich der Schwere der Nebenwirkungen der
derzeitigen Chemotherapie. Es zeigte sich lediglich eine Reduktion der
Spontanaktivität. Feinmotorik, somatosensorische Koordination, Motorik und
Koordination bleiben hingegen durch eine Medikation mit dem Neuroleptikum
Mepazin unbeeinflusst. Eine hohe Compliance und Akzeptanz von Seiten des
Patienten kann somit erwartet werden.
136
Vor dem Hintergrund der seit jeher breit geführten Debatte über die Übertragbarkeit
von Tierversuchen auf den Menschen muss auch diese Studie mit der notwendigen
Vorsicht betrachtet werden. Eine direkte Übertragbarkeit ist mit Vorbehalten
anzunehmen, dennoch ist davon auszugehen, dass Wirkungen und
Nebenwirkungen von Medikamenten vor der Anwendung am Patienten zu fast 80
% in Tierversuchen erkannt werden und somit wichtige Basisdaten liefern (ELSNER
2004).
Diese Studie liefert somit einen wichtigen Anhaltspunkt bezüglich der zu
erwartenden Nebenwirkungen einer solchen Therapie und dürfte deren Akzeptanz
erhöhen.
In weiterführenden Studien sollten unter anderem Daten zur Pharmakodynamik und
Pharmakokinetik von Mepazin generiert werden und eine Überprüfung der
Ergebnisse in einem orthotopen Tumormodell stattfinden.
Die Onkologie hat mittlerweile in der Veterinärmedizin den gleichen Stellenwert wie
in der Humanmedizin. Denn auch hier wird die Krebserkrankung beim Hund als die
häufigste Todesursache angesehen (PAOLONI et al. 2007; WITHROW et al. 2013).
Die Tatsache, dass Mensch und Haustier Lebensumfeld und Umweltfaktoren teilen,
lässt vermuten, dass auch die Mechanismen der Entstehung der Krankheitsbilder
in beiden Spezies ähnlich sind (GORDON et al. 2009; SINGER et al. 2014). So
könnte auch hier die Rolle der MALT1-Inhibition weiter erforscht werden, d.h. es
besteht weiterhin Forschungsbedarf auf diesem Gebiet. Ein Einsatz von Mepazin
und Biperiden in der Veterinärmedizin mit dem in dieser Studie ermittelten
Nebenwirkungsprofil stellt eine Option dar. In weiterführenden Studien sollte unter
anderem geklärt werden, ob und in welchem Umfang MALT1 in Tumoren des
Pankreas bei Patienten der Veterinärmedizin exprimiert wird.
137
6 ZUSAMMENFASSUNG
Nadine Scholz
Untersuchung der Auswirkung von Mepazin und Biperid en hinsichtlich
extrapyramidal motorischer Störungen im immundefizi enten Mausmodell in
der Therapie des humanen Pankreaskarzinoms
Das Adenokarzinom des Pankreas zählt zu den aggressivsten Tumoren. Die
Prognose ist in vielen Fällen durch das späte Auftreten der Symptome und die
ausgeprägte Metastasierungsrate infaust. Dieses gilt sowohl für die Humanmedizin
als auch für die Veterinärmedizin. Aufgrund dessen und durch die zunehmende
Resistenz gegenüber therapeutischen Maßnahmen ist es zwingend erforderlich,
neue Therapieansätze zu etablieren.
Vorausgegangene in vitro Versuche zeigten, dass eine Apoptoseinduktion bei
Pankreaskarzinomzellen Mucosa Associated Lymphoid Tissue lymphoma
translocation protein 1 (MALT1)-abhängig ist und eine Hemmung von MALT1 zu
einer Proliferationshemmung und Apoptosesteigerung führt. Einen neuen
therapeutischen Ansatz stellt dabei die Hemmung dieser MALT1-Paracaspase
durch das Phenothiazinderivat Mepazin sowohl als Monotherapie als auch in einer
Kombinationstherapie mit dem Anticholinergikum Biperiden dar. Als eine massive
Einschränkung und ein Faktor, der die Therapietreue des Patienten stark
beeinflusst, kann das Auftreten möglicher extrapyramidal-motorischer Störungen
(EPMS) angesehen werden. Neuroleptika der ersten Generation, zu deren
Stoffklasse Mepazin gehört, können EPMS in Form von Parkinsonoid, Früh- und
Spätdyskinesien und Akathisie hervorrufen. Die Therapie beruht auf Absetzen des
Medikamenets oder dem Wechsel zu einem niederpotenten Neuroleptikum. Diese
Möglichkeit besteht bei der Indikation Pankreaskarzinom nicht. Eine weitere
Therapieoption der EPMS ist die Gabe des Anticholinergikums Biperiden.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Auftreten von EPMS im Zuge einer
Langzeitmedikation mit Mepazin, Biperiden und einer Mepazin-Biperiden-
Kombination an einem tumortragenden Xenograftmausmodell untersucht. Hierzu
138
wurden 40 Pfp-/- / Rag2-/--Doppelknockout-Mäuse gleichen Alters auf vier Gruppen
verteilt: jeweils zehn Tiere bildeten die Mepazin-Gruppe, die Biperiden-Gruppe, die
Mepazin-Biperiden-Gruppe und die Kontrollgruppe.
Zum Einsatz kamen dabei die etablierten Tests „Spontaneous Activity in the
Cylinder Test“ als Test zur Prüfung der Spontanaktivität, der „Challenging Beam
Traversal Test“ als Test zur Prüfung der Motorik und Koordination und der
„Adhesive Removal Test“ als Test zur Prüfung der Feinmotorik und
somatosensorischen Koordination. Die Tests wurden jeden dritten Tag während der
Behandlungsperiode durchgeführt.
Es konnte gezeigt werden, dass eine Mepazinmonotherapie zu einer Reduktion der
vertikalen Spontanaktivität führt, aber keine Auswirkungen auf die Motorik,
Koordination, Feinmotorik und somatosensorische Koordination hat. Eine Mepazin-
Biperiden-Kombinationstherapie hatte ebenfalls keine Auswirkungen auf die
Spontanaktivität und Feinmotorik sowie die somatosensorische Koordination. Die
zur Interpretation der Effekte der Medikation durchgeführte Biperidenmonotherapie
zeigte erwartungsgemäß keine Abweichungen in der Spontanaktivität, Feinmotorik
und somatosensorischen Koordination, führte aber zu einer verlängerten
Verweildauer und einer erhöhten Schrittanzahl auf dem Balken, was als eine leichte
Beeinträchtigung der Motorik, aber nicht als EPMS im eigentlichen Sinn bewertet
werden muss.
Die Beeinträchtigungen einer Mepazinmonotherapie oder einer
Kombinationstherapie aus Mepazin und Biperiden können anhand der momentanen
Datenlage nach der vorliegenden Studie als geringfügig und vertretbar im Hinblick
auf die Schwere der zugrundeliegenden Primärerkrankung Pankreaskarzinom
eingestuft werden.
Die Therapie mit Mepazin alleine oder in Kombination mit Biperiden als Inhibitor der
MALT1 Paracaspase eröffnet somit neue Möglichkeiten in der Behandlung und
Therapie des humanen Pankreaskarzinoms.
139
7 SUMMARY
Nadine Scholz
Evaluation of the effects of mepazine and biperiden regarding extrapyramidal
motor side-effects in an immunodeficient xenograft mouse model in the
therapy of human pancreatic cancer
Pancreatic adenocarcinoma is one of the most aggressive tumors. Because of the
late onset of symptoms and the by then advanced stage of metastasis the prognosis
often is considered to be infaust. This holds true both for human medicine as well
as veterinary medicine. Because of this and the increasing resistance to therapeutic
interventions there is an urgent need to find new therapeutic approaches.
One new therapeutic approach represents the inhibition of the Mucosa-Associated
Lymphoid Tissue lymphoma translocation protein 1 (MALT1) by the phenothiazine
derivate mepazine as a monotherapy or as a therapy combining mepazine with the
anticholinergicum biperiden. Preliminary in vitro tests have shown that induction of
apoptosis in human pancreatic cancer cells is MALT1-dependent and inhibition of
MALT1 resulted in decreased proliferation and increased rate of apoptosis. A
limiting factor which could also influence the compliance of the patient would be the
occurrence of extrapyramidal motor side-effects (EPS) caused by a phenothiazine
therapy.
The side-effects profile for first generation antipsychotics, with mepazine belonging
to that group, is characterized by extrapyramidal-motoric side-effects such as
Parkinson-like symptoms, early and tardive dyskinesia and akathisia. The clinical
management of the symptoms is discontinuation of medication, lowering of the dose
or replacement by a second generation neuroleptic. These options are not possible
with a medication considering the indication pancreatic cancer. Another therapeutic
option to approach EPS is the use of the anticholinergic biperiden.
In the present study a long-term medication of mepazine as a monotherapy,
biperiden as a monotherapy and a combination of both agents mepazine and
140
biperiden in a mouse xenograft model of pancreatic cancer was conducted to screen
for possible EPS as a side effect.
For this purpose 40 Pfp-/- / Rag2-/- double knockout mice of the same age were
divided into four groups: each of the groups included ten mice, namely the mepazine
group, the biperiden group, the mepazine-biperiden group and the control group.
To screen for EPS a battery of well-established tests such as the “spontaneous
activity in the cylinder test” as a test of the spontaneous activity, the “balance beam
traversal test” as a test of motor function and coordination and the “adhesive
removal test” as a test of fine motor skills and somatosensory coordination was
used. These tests were performed every third day during the treatment period.
This study shows that a mepazine monotherapy resulted in a reduction of the
vertical spontaneous activity, but does not affect motor function, coordination, fine
motor skills or somatosensory coordination. The mepazine-biperiden combination
therapy has no effects on spontaneous activity, fine motor skills and somatosensory
coordination. The biperiden monotherapy, which was carried out to faciliate the
interpretation of the effects, did not show any alterations in spontaneous activity,
fine motor skills or somatosensory coordination as expected. The biperiden group
took the longest time and showed the highest step count in the beam test, thereby
suggesting a slight impairment of motor coordination. However, this could not be
interpreted as neuroleptic-induced EPS in the strict sense.
In conclusion, a treatment with either mepazine alone or a combination therapy of
mepazine and biperiden in a xenograft mouse model of pancreatic cancer lead to
minor and acceptable extrapyramidal motor side-effects when taking into account
the severity of pancreatic cancer illness.
Thus, the therapy with the phenothiazine derivate mepazine alone or in combination
with biperiden as an inhibitor of MALT1 opens up promising new possibilities in the
treatment and therapy of human pancreatic cancer.
141
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170
9 ANHANG
9.1 Abbruchkriterien
TV (Nr. 102/13): " Immunregulatrische Rolle des Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B (RANK) und seines Liganden (RANKL) in Pankreaskarzinom-Mausmodellen "
Bei Anzeichen der Verschlechterung der Tiere 3 mal tägliche Kontrolle, ansonsten täglich.
Belastungsscore/Abbruchkriterien
Beobachtung Punktewertung 2,3
I Körpergewicht bezogen auf Ausgangsgewicht [X ]bezogen auf Kontrollgruppe [ ]unbeeinflusst oder Anstieg 0Reduktion > 10 % 10Reduktion > 20 % 20II Allgemeinzustand
Fell glatt, glänzend, anliegend; Körperöffnungen sauber 0Fell stumpf, gesträubt; Augen trüb 5verklebte oder feuchte Körperöffnungen; unnormale Haltung; hoher Muskeltonus; Dehydratation 10Krämpfe; Lähmungen; Atemgeräusche; Tier fühlt sich kalt an 20III Spontanverhaltennormales Verhalten (Schlafen, Reaktion auf Anblasen und Berührung, Neugier, Sozialkontakte) 0ungew öhnliches Verhalten, eingeschränkte Motorik oder Hyperkinetik 5Isolation; Schmerzäußerungen; Apathie; ausgeprägte Hyperkinetik bzw . Stereotypien; Koordinationsstörungen 10Automutilation 20IV Versuchsspezifische Kriterien a) Äußerliche Tumoren:Tumordurchmesser: Einzeltumor ≥ 1,0 cm 20Tumordurchmesser: Summe aller Einzeltumoren ≥ 3 cm 20Ulzeration 20b) Body Condition Score:
Body Condition ≤2 (Deutliche Unterernährung: Einzelne Wirbel der Rückgrat-, Lenden- und Kruppenregion vorstehend und deutlich getrennt. Hüft- und Sitzbeinhöcker sehr leicht palpierbar) 20c) weitere KriterienAszites 10Starker Aszites mit sichtlich vermehrtem Bauchumfang 20Wundheilungsstoerungen 5Tumorgroesse > 1 cm Durchmesser oder Hautulzeration 20Katatonischer Stupor nach Mepazingabe (Maus verharrt regungslos in Käfig und zeigt keine Reaktion auf äußerliche Reize wie Berührung) 10Besserung nach Medikationsdosisreduktion um 50% 0Erneutes Auftreten eines katonischen Stupors nach 50%iger Medikationsdosisreduktion 20Generalisierter Krampfanfall nach Biperidengabe (Maus zeigt multiple Zuckungen und liegt dabei auf der Seite/auf dem Rücken) 20Hinweis auf Glaukomanfall nach Biperidengabe (mind. ein Auge ist gerötet und tränt stark) 20Bewertung, Maßnahmen Punktsummekeine Belastung 0geringe Belastung: sorgfältig weiter beobachten (1x tägl), evtl unterstützende Maßnahmen (z.B. Wärmezufuhr, Spezialfutter) 5-9mittelgradige Belastung: ggf. medizinische Versorgung einleiten (Analgesie, Antibiotikum) längerandauernd als 72 h gilt als hochgradige Belastung 10-19hochgradige Belastung:Tierschutzbeauftragten konsultieren; tierärztliche Versorgung einleiten; ggf. Tier einschläfern 20 oder höher
Abbruchkriterien zu Antrag :
Beobachtungsintervalle :
171
TV (Nr. 102/13): " Immunregulatrische Rolle des Rec eptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B (RANK) und seines Liganden (RANKL) in Pankr easkarzinom-Mausmodellen "
Bei Anzeichen der Verschlechterung der Tiere 3 mal tägliche Kontrolle, ansonsten 1x tägliche Kontrolle.
Belastungsscore/Abbruchkriterien
Maus Nummer
Beobachtung Punktewertung 2,3
I Körpergewicht (bitte Zutreffendes ankreuzen)bezogen auf Ausgangsgewicht [ ]bezogen auf Kontrollgruppe [ ]unbeeinf lusst oder Anstieg 0Reduktion > 10 % 10Reduktion > 20 % 20II Allgemeinzustand
Fell glatt, glänzend, anliegend; Körperöffnungen sauber 0Fell stumpf, gesträubt; Augen trüb 5verklebte oder feuchte Körperöffnungen; unnormale Haltung; hoher Muskeltonus; Dehydratation 10Krämpfe; Lähmungen; Atemgeräusche; Tier fühlt sich kalt an 20III Spontanverhaltennormales Verhalten (Schlafen, Reaktion auf Anblasen und Berührung, Neugier, Sozialkontakte) 0ungew öhnliches Verhalten, eingeschränkte Motorik oder Hyperkinetik 5Isolation; Schmerzäußerungen; Apathie; ausgeprägte Hyperkinetik bzw . Stereotypien; Koordinationsstörungen 10Automutilation 20
IV Versuchsspezifische Kriterien 1 Punktewertung1
Body Condition Score: ≤2 (Deutliche Unterernährung: Einzelne Wirbel der Rückgrat-, Lenden- und Kruppenregion vorstehend und deutlich getrennt. Hüft- und Sitzbeinhöcker sehr leicht palpierbar) 20Aszites 10Starker Aszites mit sichtlich vermehrtem Bauchumfang 20Wundheilungsstoerungen 5Katatonischer Stupor nach Mepazingabe (Maus verharrt regungslos in Käfig und zeigt keine Reaktion auf äußerliche Reize wie Berührung) 10Besserung nach Medikationsdosisreduktion um 50% 0Erneutes Auftreten eines katonischen Stupors nach 50%iger Medikationsdosisreduktion 20Generalisierter Krampfanfall nach Biperidengabe (Maus zeigt multiple Zuckungen und liegt dabei auf der Seite/auf dem Rücken) 20Hinweis auf Glaukomanfall nach Biperidengabe (mind. ein Auge ist gerötet und tränt stark) 20Bewertung, Maßnahmen Punktsummekeine Belastung 0geringe Belastung: sorgfältig weiter beobachten (1x tägl), evtl unterstützende Maßnahmen (z.B. Wärmezufuhr, Spezialfutter) 5-9mittelgradige Belastung: ggf. medizinische Versorgung einleiten (Analgesie, Antibiotikum) längerandauernd als 72 h gilt als hochgradige Belastung 10-19hochgradige Belastung:Tierschutzbeauftragten konsultieren; tierärztliche Versorgung einleiten; ggf. Tier einschläfern 20 oder höher1 Diese Punkte müssen von dem Antragsteller ergänzt werden.2 Punktzahl (0/5/10/20) wird pro Zeile 1x vergeben sobald ein Kriterium erfüllt ist. Auch bei mehreren positiven Befunden pro Zeile kommt es zu keiner Addition der Punkte pro Zeile. Handzeichen
Abbruchkriterien zu Antrag 1:
Beobachtungsintervalle 1:
UntersuchungsbefundeDatum:
172
9.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Pankreas, Anatomie und Lagebeziehungen …………………....14
Abbildung 2: Progressionsmodell des duktalen Pankreasadenokarzinoms mit Darstellung der genetischen Alterationen .........…...……………16
Abbildung 3: Mediane Überlebenszeiten …………………………………….…24
Abbildung 4: Pankreas des Hundes …………………………………………….30
Abbildung 5: Humanes duktales Adenokarzinom ……………………………..32
Abbildung 6: Canines Adenokarzinom des exokrinen Pankreas ……………..32
Abbildung 7 : Das Phenothiazingrundgerüst ……………………………………42
Abbildung 8 : Die in Bezug auf die Lebensqualität aus Sicht der Patienten relevantesten Nebenwirkungen klassischer Neuroleptika …….47
Abbildung 9 : Belastungen von Patienten und ihrem Umfeld durch EPMS ….51
Abbildung 10 : Strukturformel von Mepazin ………………………………………53
Abbildung 11 : Strukturformel von Biperiden ……………………………………..56
Abbildung 12 : Schematische Darstellung des MALT1-Proteins ……………….60
Abbildung 13 : Der CBM-Komplex mit Struktur und Interaktionsbereichen ……61
Abbildung 14 : Bildung des CBM-Komplexes …………………………………….62
Abbildung 15 : Aufbau des Zylinderversuches …………………………………...86
Abbildung 16 : Versuchsaufbau des Balken-Tests ..……...……………………..89
Abbildung 17 : Versuchsaufbau des Adhesive Removal-Test ………………….91
Abbildung 18 : Histogramm Schritte auf dem Beam ……………………………..93
Abbildung 19 : Histogramm Pflegezeit im Zylinder ………………………………94
Abbildung 20 : Ergebnisse des Zylinder-Test, durchschnittliche Anzahl Aufrichtungen in der dreiminütigen Testzeit …………………….96
Abbildung 21 : Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Aufrichtungen im Zylinder-Test ….………………………..……...98
Abbildung 22 : Ergebnisse des Zylinder-Tests, durchschnittliche Anzahl der Vorderfußschritte während der dreiminütigen Testzeit ………...99
173
Abbildung 23 : Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Vorderfußschritte im Zylinder-Test …..…………………………101
Abbildung 24 : Ergebnisse des Zylinder-Tests, durchschnittliche Anzahl der Hinterfußschritte während der dreiminütigen Testzeit ………..103
Abbildung 25: Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Hinterfußschritte im Zylinder-Test …………..……………….…104
Abbildung 26 : Ergebnisse des Zylinder-Tests, durchschnittliche Dauer der Pflegezeit während der dreiminütigen Testzeit ………………..106
Abbildung 27 : Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Pflegezeit im Zylinder-Test ………………...……………………107
Abbildung 28 : Ergebnisse des Beam-Tests, durchschnittliche Schrittanzahl zur Überquerung des Balkens ………………………………………108
Abbildung 29 : Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Schrittanzahl im Beam-Test ……………..…….………………..109
Abbildung 30 : Ergebnisse des Beam-Tests, durchschnittliche Anzahl der Fehler bei Überquerung des Balkens …………………………………..110
Abbildung 31 : Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Fehleranzahl im Beam-Test ……..……………….……………..112
Abbildung 32: Ergebnisse des Beam-Tests, benötigte Zeit zur Überquerung des Balkens ……………………………………………………………114
Abbildung 33 : Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel der Zeit im Beam-Test …………………..…………………………………...115
Abbildung 34 : Ergebnisse des Adhesive Removal-Test, Zeit bis Entfernung des Aufklebers ………………………………………………………...117
Abbildung 35 : Graphische Darstellung der geschätzten Randmittel des Adhesive Removal-Tests ………………………………………..118
Abbildung 36 : Strukturformeln von Mepazin und Thioridazin …………………125
174
9.3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Die wichtigsten unerwünschten Arzneimittelwirkungen der klassischen Neuroleptika ……………………………………………...40
Tabelle 2 : Unerwünschte Wirkungen typischer Neuroleptika ………………….49
Tabelle 3 : Injektionslösungen und Substanzen ………………………………….74
Tabelle 4 : Verbrauchsmaterialien ………………………………………………...75
Tabelle 5 : Geräte und Software …………………………………………………...76
Tabelle 6 : Geschätzte Randmittel und Standardfehler der Aufrichtungen im Zylinder-Test ……………………………………………………………98
Tabelle 7 : Geschätzte Randmittel und Standardfehler der Vorderfußschritte im Zylinder-Test ……….…..……………………………………………..102
Tabelle 8 : Geschätzte Randmittel und Standardfehler der Hinterfußschritte im Zylinder-Test ……….…..……………………………………………..105
Tabelle 9 : Geschätzte Randmittel und Standardfehler der Schrittanzahl im Beam-Test …….………..……………………………………………..110
Tabelle 10 : Geschätzte Randmittel und Standardfehler der Fehleranzahl im Beam-Test …….……..………………………………………………..113
Tabelle 11 : Geschätzte Randmittel und Standardfehler der benötigten Zeit im Beam-Test …….………………………………………………..……..116
Tabelle 12 : Geschätzte Randmittel und Standardfehler der Dauer bis Aufkleberentfernung im Sticker-Test …….…………………..……..119
175
9.4 Abkürzungsverzeichnis
° Grad (Winkelmaß)
° C Temperatur in Grad Celsius
Abb. Abbildung
ANOVA Varianzanalyse (Analysis of variance)
bzw. beziehungsweise
cm Zentimeter
CMF-PBS Calcium-Magnesium-freie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EPMS Extrapyramidal-motorische Störungen
et al. et alii
FBS fötales Kälberserum
g mittlere Erdschwerebeschleunigung
g Gramm
G Gauge Nadelstärke
GABA gamma-aminobutyric acid = γ-Aminobuttersäure
ggf. gegebenenfalls
i.p. intraperitoneal
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
mg Milligramm
ml Milliliter
mm Millimeter
MWD Mittelwertdifferenz
NaCl Natriumchlorid
p Statistische Signifikanz
SE Standardfehler des Mittelwertes (Standard Error of the Mean)
vs. versus
µl Mikroliter
176
10 DANKSAGUNG
Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Prof. h. c. J. R. Izbicki, Direktor der Klinik und
Poliklinik für Allgemein-, Viszeral- und Thoraxchirurgie des Universitätsklinikums
Hamburg-Eppendorf, für die Möglichkeit, meine Dissertation an seiner Klinik
anzufertigen und für die Begutachtung dieser Arbeit.
Ich danke meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. P. Steinberg, Leiter des Institutes
für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover, für die wissenschaftliche Betreuung, Begutachtung und
Vertretung meiner Arbeit gegenüber der Tierärztlichen Hochschule.
Mein ganz besonderer Dank geht an Dr. med. Alexander T. El Gammal für die
Bereitstellung des sehr interessanten Themas und die engagierte Betreuung. Der
mir sowohl während der Versuchsphase und Versuchsauswertung als auch beim
späteren Schreiben der Arbeit immer und jederzeit mit Rat zur Seite gestanden hat.
Vielen Dank auch an Doerthe Kruse für die schnelle Beantwortung aller
verzweifelten computertechnischen Fragen sowie die stundenlange Überarbeitung
des Layouts.
Birte Kretschmer danke ich für die kritische Durchsicht des Manuskriptes und die
konstruktive Kritik.
Insgesamt für die mühevolle Arbeit des Korrekturlesens möchte ich mich herzlich
bei Birte, Doerthe und meinem Bruder Christoph bedanken.
Mein größter Dank aber gilt meinen Eltern Evelin und Jürgen Wenzel. Ohne ihre
Unterstützung wären Studium und Promotion niemals möglich gewesen. Meiner
Mutter möchte ich ganz besonders dafür danken, dass sie für die gesamte Dauer
der Fertigstellung dieser Arbeit und darüber hinaus mir immer den Rücken frei
gehalten hat und sich aufopfernd und liebevoll um meinen Sohn Florian kümmert.
„Leider läßt sich eine wahrhafte Dankbarkeit mit Worten nicht ausdrücken.“
Johann Wolfgang von Goethe, deutscher Dichter (1749-1832)
Goethe an Amalie von Gallitzin, 6. Februar 1797, Briefe, II, p. 255
