Tierärztliche Hochschule Hannover...neuartige Tierseuchenerreger, Insel Riems-Greifswald 1....

Tierärztliche Hochschule Hannover

Ausbreitung der klassischen BSE-Prion-Erreger vom

Darm über das periphere Nervensystem zum Gehirn

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

Vorgelegt von

Martin Kaatz

Schwedt/Oder

Hannover 2014

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Martin Groschup

Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für neue und

neuartige Tierseuchenerreger, Insel Riems-Greifswald

1. Gutachter: Prof. Dr. Martin Groschup

Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für neue und

neuartige Tierseuchenerreger, Insel Riems-Greifswald

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner

Institut für Pathologie, Tierärztliche Hochschule

Hannover

Tag der mündlichen Prüfung: 17.7.2014

Wer den Blick hebt, sieht keine Grenzen.

aus Japan

Für meine Familie

1 Einleitung .............................................................................................................................. 15

2 Literaturübersicht .................................................................................................................. 16

2.1 Anatomische Grundlagen .................................................................................................. 16

2.1.1 Bauelemente des Nervensystems ................................................................................ 17

2.1.2 Zentrales Nervensystem (ZNS) ................................................................................... 17

2.1.2.1 Rückenmark ......................................................................................................... 17

2.1.2.2 Gehirn/Stammhirn ............................................................................................... 18

2.1.3 Peripheres Nervensystem (PNS) ................................................................................. 20

2.1.3.1 Vegetatives Nervensystem (VNS) ....................................................................... 20

2.1.4 Enterisches Nervensystem (ENS) ............................................................................... 22

2.2 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien ................................................................. 23

2.2.1 Das Prion-Protein ........................................................................................................ 24

2.2.1.1 Struktur des zellulären Prion-Proteins (PrPC) ....................................................... 24

2.2.1.2 Eigenschaften und Funktion des PrPC ................................................................. 24

2.2.1.3 Das pathologische Prion-Protein (PrPSc

) ............................................................. 25

2.2.2 Erregerhypothese ........................................................................................................ 25

2.2.3 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien der Tiere ........................................... 27

2.2.3.1 Pathologie der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien ........................ 29

2.2.3.2 Diagnostik ............................................................................................................ 31

2.2.3.3 Scrapie ................................................................................................................. 32

2.3.3.4 Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) ..................................................... 34

2.3 Pathogenese der TSE-Erkrankungen ................................................................................. 36

2.3.1 Dosis und Inkubationszeiten ....................................................................................... 37

2.3.2 Das lymphatische System ........................................................................................... 38

2.3.3 Das Periphere Nervensystem (PNS) ............................................................................ 41

2.3.3.1 Neuroinvasion ...................................................................................................... 41

2.3.3.2 Ausbreitung von PrPSc

im PNS ............................................................................ 42

2.3.3.3 Ausbreitungsmechanismen im Nervensystem ..................................................... 43

2.3.4 Alternative Ausbreitungswege von PrPSc

im Körper .................................................. 44

2.3.5 Akkumulation von PrPSc

in extraneuronalen Geweben und Ausscheidung ............... 45

2.3.6 Entzündungen und TSE .............................................................................................. 46

3 Tiere, Material und Methoden .............................................................................................. 48

3.1 Tiere .................................................................................................................................. 48

3.1.1 Rinder ......................................................................................................................... 48

3.1.2 Durchführung der Rinder-Pathogenesestudie ............................................................. 48

3.1.2.1 Tierhaltung ........................................................................................................... 48

3.1.2.2 Inokulat und Inokulation ...................................................................................... 48

3.1.2.3 Verhaltensstudie ................................................................................................... 49

3.1.2.4 Probenentnahme ................................................................................................... 49

3.1.2.5 Bestandsbetreuung ............................................................................................... 50

3.1.3 Mäuse .......................................................................................................................... 51

3.1.3.1 Mauslinien ........................................................................................................... 51

3.1.3.2 Inokulate .............................................................................................................. 51

3.1.3.3 Durchführung des Tierversuchs ........................................................................... 52

3.1.3.4 Probenentnahme ................................................................................................... 53

3.1.3.5 Inkubationszeiten ................................................................................................. 53

3.2 Probenmaterial .................................................................................................................. 54

3.3 Histologische Methoden .................................................................................................... 57

3.3.1 Herstellung der histologische Präparate ..................................................................... 57

3.3.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ...................................................................................... 58

3.3.3 Bewertung der Hämatoxylin-Eosin-Färbung .............................................................. 58

3.3.4 Immunhistologische Untersuchungen ........................................................................ 59

3.3.5 Immunhistologische Kontrollen ................................................................................. 60

3.3.6 Bewertung der immunhistologischen Untersuchungen .............................................. 60

3.4 Proteinbiochemische Methoden ........................................................................................ 61

3.4.1 Homogenatherstellung ................................................................................................ 61

3.4.2 Fällung mit Phosphorwolframsäure (PTA-Fällung) ................................................... 62

3.4.3 Proteinauftrennung mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ........................ 62

3.4.4 Western Blot ............................................................................................................... 63

3.4.5 Bewertung der Ergebnisse und Kontrollen ................................................................. 64

4 Ergebnisse ............................................................................................................................ 65

4.1 Allgemeine Ergebnisse ...................................................................................................... 65

4.1.1 Klinische Symptomatik .............................................................................................. 65

4.1.2 Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung .................................................... 66

4.1.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung .............................................. 67

4.1.3.1 Quantifizierung der Ergebnisse ........................................................................... 67

4.1.3.2 Lokalisation und Reaktionsmuster von PrPSc

...................................................... 68

4.1.4 Ergebnisse des Maus-Bioassay (Tgbov XV-Mäuse) ................................................... 73

4.2 Zusammenfassende Betrachtung ....................................................................................... 74

4.2.1 Assoziation von Teilergebnissen ................................................................................ 74

4.2.2 Strukturierung der Ergebnisse .................................................................................... 76

4.3 Einzeltierergebnisse .......................................................................................................... 77

4.3.1 Ergebnisse der Tiere ohne Beteiligung der Medulla oblongata ................................. 77

4.3.1.1 IT 28 (16 mpi) ....................................................................................................... 78

4.3.1.2 IT 46 (16 mpi) ....................................................................................................... 79

4.3.1.3 IT 50 (20 mpi) ....................................................................................................... 79

4.3.1.4 IT 60 (20 mpi) ....................................................................................................... 80

4.3.1.5 IT 58 (24 mpi) ....................................................................................................... 81

4.3.1.6 IT 52 (28 mpi) ....................................................................................................... 82

4.3.2 Ergebnisse der Tiere mit geringgradiger Beteiligung der Medulla oblongata ........... 84

4.3.2.1 IT 24 (24 mpi) ....................................................................................................... 84

4.3.2.2 IT 61 (32 mpi) ....................................................................................................... 85

4.3.2.3 IT 25 (40 mpi) ....................................................................................................... 86

4.3.3 Ergebnisse der Tiere mit mittel- bis hochgradiger Beteiligung

der Medulla oblongata ................................................................................................ 89

4.3.3.1 IT 21 (28 mpi) ....................................................................................................... 89

4.3.3.2 Zusammenfassung der weiteren Ergebnisse ........................................................ 91

4.4 Natürlich infiziertes Rind (R09/06).................................................................................... 97

5 Diskussion ............................................................................................................................ 98

5.1 Ziel der Arbeit ................................................................................................................... 98

5.2 Kritische Betrachtung des Untersuchungsmaterials .......................................................... 98

5.3 Allgemeine Betrachtungen .............................................................................................. 100

5.3.1 Ergebnisüberblick ..................................................................................................... 100

5.3.2 Dosis, Inkubationszeiten und klinische Symptomatik .............................................. 101

5.3.3 Zusammenhänge von erhobenen Befunden .............................................................. 102

5.3.4 Vergleich von Feldinfektion vs. experimenteller Studie .......................................... 103

5.4 Pathogenese der BSE ...................................................................................................... 104

5.4.1 Rolle des lymphatischen Systems ............................................................................. 104

5.4.2 Rolle des ENS und Neuroinvasion ........................................................................... 106

5.4.3 Ausbreitung im peripheren Nervensystem ............................................................... 107

5.4.3.1 Ausbreitungsrichtung ......................................................................................... 108

5.4.3.2 Gehirn ................................................................................................................ 108

5.4.3.3 Rückenmark ....................................................................................................... 109

5.4.3.4 Gemischtfaserige Ganglien ................................................................................ 110

5.4.3.5 Sympathikus ....................................................................................................... 112

5.4.3.6 Parasympathikus ................................................................................................ 112

5.4.4 Hypothese zur Ausbreitung im PNS ......................................................................... 113

5.4.5 Transport des PrPSc

................................................................................................... 116

5.5 Pathogenese und Pathologie ............................................................................................ 118

6 Zusammenfassung ............................................................................................................... 120

7 Summary ............................................................................................................................. 122

8 Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 124

9 Anhang ................................................................................................................................ 167

9.1 Histologische Methoden .................................................................................................. 167

9.1.1 Entparaffinierungs- und Differenzierungsprotokoll ................................................. 167

9.2 Legende zur Verhaltensbeobachtung der Rinder ............................................................ 167

9.3 Puffer und Lösungen ....................................................................................................... 171

9.3.1 Immunhistochemie ................................................................................................... 171

9.3.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung .................................................................................... 172

9.3.3 Westernblot ............................................................................................................... 173

Abkürzungsverzeichnis

µm Mikrometer

A Alanin

A. bidest. bidestilliertes Wasser

Abb. Abbildung

AG Antigen

AK Antikörper

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosäure

BA Bioassay

BBP12/92 Boviner Brain Pool 12/1992

BHV1 Bovine Herpesvirus-1

bov bovine

BRSV Bovines Respiratorisches Synzytialvirus

BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie

bzw beziehungsweise

CJK, CJD Creutzfeldt-Jakob-Krankheit

CO2 Kohlendioxid

C-terminal Carboxy-terminal

CWD Chronic Wasting Disease

d.h. das heißt

DAB Diaminobenzidintetrahydrochloride

DC Dendritische Zellen

DMNV Dorsaler motorischer Kern des Nervus vagus

DNA Desoxyribonukleinsäure

Dpi days post infection

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ENS Enterisches Nervensystem

ER Endoplasmatisches Retikulum

EU Europäische Union

exp experimentell

FA Firma

FAE Follikel-assoziiertes Epithel

fCJD familiäre Creutzfeldt-Jakob-Krankheit

FDC Follikulär Dendritische Zellen

FFI Fatale Familiäre Insomnie

FLI Friedrich-Loeffler-Institut

FSE Feline Spongiforme Enzephalopathie

g Gramm

GALT Darm-assoziiertes lymphatisches Gewebe

GG gemischtfaserige Ganglien

Ggl Ganglion

GMGC Ganglion coeliacum-Komplex

GPI-Anker Glykosylphosphatidylinositol-Anker

GSS Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom

GT Ganglion trigeminale

HE Hämatoxylin-Eosin

hu human

i.c. intrazerebral

i.p. intraperitoneal

ID infektiöse Dosis

IgG Immunglobulin G

IHC Immunhistochemie

INNT Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger

IT Infektionstier

Kap Kapitel

kDa Kilo-Dalton

l Liter

Lnn. Lymphonodi

LRS Lymphoretikuläres System

M Molar; Mol/Liter

mab monoklonaler Antikörper

max maximal

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

mM Millimolar

MO Medulla oblongata

mpi Monate post infectionem

n Anzahl

N Nervus

n.a. nicht auswertbar

n.d. nicht durchgeführt

neg negativ

Nn Nervi

NP 40 Nonidet P 40

N-terminal Amino-terminal

o.g. oben genannt

O.I.E. Office International des Epizooties - Weltorganisation für Tiergesundheit

OHV2 Ovines Herpesvirus Typ 2

ov ovin

PAGE Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

PBS Phosphat-gepufferte Natriumchloridlösung

PCR Polymerasekettenreaktion

PET-Blot Paraffin Embedded Tissue Blot

p.i. post infection

PK Proteinase K

PMCA Protein Misfolding Cyclic Amplification

PNS Peripheres Nervensystem

PP Peyer´sche Platten

Prion Proteinaceous infectious particle

Prnp Prion-Protein-Gen

PrP Prion-Protein

PrP27-30 Proteinase K resistenter Teil des PrPSc

PrPC zelluläres Prion-Protein

PrPSc

Scrapie-Isoform des Prion-Proteins

PS Parasympathikus

PTA Phosphorwolframsäure

PVDF Polyvinylpyrrolidon

Q Glutamin

R Arginin

rER rauhes Endoplasmatisches Retikulum

RM Rückenmark

RNA Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

S Sympathikus

s. siehe

S.E.M. Standardabweichung des Mittelwertes

SAF Scrapie-assoziierte Fibrillen

sCJD sporadische Creutzfeldt-Jakob-Krankheit

SDS Natriumdodecylsulfat

sog. sogenannt

Tab. Tabelle

TBM Tingible body macrophages

TBS Tris-gepufferte Natriumchloridlösung

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin

TME Transmissible Enzephalopathie der Nerze

TNT tunneling nano tubes

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

TSE Transmissible Spongiforme Enzephalopathie

Tween 20 Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaureat

U Unit

u.a. unter anderem

ud undefiniert

UK United Kingdom

UV Ultraviolett

V Valin

vCJD Variante der CJD

VLA Veterinary Laboratories Agency

VNS Vegetatives Nervensystem

WB Western blot

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

ZNS Zentrales Nervensystem

ZVO Zirkumventrikuläre Organe

μg Mikrogramm

μl Mikroliter

15 Einleitung

1. EINLEITUNG

Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) treten bei unterschiedlichen Spezies auf.

Am bekanntesten sind dabei Scrapie bei Schafen, die chronisch zehrende Krankheit der

Hirsche (CWD) und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) der Rinder. Bei all

diesen Infektionskrankheiten wird ein pathogenes Prion-Protein als ursächlicher Erreger

vermutet.

Im Jahre 1987 erstmals detailliert beschrieben, geriet BSE durch die sogenannte BSE-Krise in

den Fokus der Öffentlichkeit. Am stärksten waren Rinder im Vereinigten Königreich

betroffen und neben einer Vielzahl von europäischen Ländern wurden Fälle auch in den USA,

Kanada und Japan nachgewiesen. Die Brisanz der Epidemie ergibt sich aus der

Übertragbarkeit der BSE-Erreger auf den Menschen. Die als Variante der Creutzfeldt-Jakob-

Krankheit (vCJD) bekannte Erkrankung wurde vermutlich durch den Verzehr von infiziertem

Rindfleisch ausgelöst.

Als natürlicher Infektionsweg von BSE im Rind wird die orale Aufnahme von verseuchten,

d.h. ungenügend vorbehandelten, Futtermitteln vermutet. Dies führte in den Jahren 1988 bzw.

1996 im Vereinigten Königreich sowie 2001 in der gesamten EU zu einem vollständigen

Fütterungsverbot von Tiermehlen, weshalb es nach ca. 5 Jahren, der durchschnittlichen BSE-

Inkubationszeit bei Rindern, zu rückläufigen Fallzahlen kam. Eine eindeutige Diagnostik

kann bis zum heutigen Zeitpunkt lediglich post mortem durchgeführt werden, da ein

zugelassener Lebendtest trotz interessanter Ansätze nicht zur Verfügung steht. Vor allem aus

Versuchen mit Labortieren (Hamster, Maus) stammen die bisherigen Erkenntnisse über die

Ausbreitung der BSE-Erreger im Tierkörper. Die lange Inkubationszeit und das zoonotische

Potential ließen nur wenige Studien am natürlichen Wirt mit begrenzten Tierzahlen zu. So ist

die Frage nach der Pathogenese von BSE nach oraler Infektion nach wie vor nur

unvollständig beantwortet.

Der am Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) durchgeführte Tierversuch zur Pathogenese der BSE

umfasste insgesamt 74 Tiere, von denen 56 Kühe infektiöses Gehirn-Inokulat erhielten. Die

umfassende Probenentnahme an präklinisch und klinisch erkrankten Rindern führte zu einem

einzigartigen Pool von Geweben. Die hier vorgelegte Arbeit basiert auf der Untersuchung von

Gewebeproben aus dem zentralen und peripheren Nervensystem sowie des Darms

ausgewählter Tiere, um die neuronale Ausbreitung des BSE-Agens zum Gehirn darzustellen.

Literaturübersicht 16

2. LITERATURÜBERSICHT

2.1 Anatomische Grundlagen

Für das Verständnis der in dieser Dissertation verwendeten Termini erfolgt zunächst die

Beschreibung der Bestandteile des Nervensystems unter Berücksichtigung der für die

Pathogenese der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien (TSE) relevanten

Strukturen.

Wenn nicht anders gekennzeichnet, sind die folgenden Angaben dem Lehrbuch der Anatomie

der Haustiere (NICKEL, SCHUMMER, SEIFERLE, 3. Auflage, 1991) entnommen.

Das Nervensystem wird in das Zentrale Nervensystem (ZNS), durch Gehirn und Rückenmark

repräsentiert, und das Periphere Nervensystem (PNS) mit Nerven und Ganglien eingeteilt.

Morphologisch und funktionell ist die Grenze weniger deutlich, da die zum Großteil im

zentralen Anteil liegenden Nervenzellen ihre Axone als periphere Nerven abgeben.

Das Enterische Nervensystem (ENS) ist im Schema der Abbildung 2.1 als eigenständiger

Anteil dargestellt. Anderen Lehrmeinungen zufolge wird es dem vegetativen Anteil

zugeordnet, da seine Steuerung den parasympathischen und sympathischen Nervenbahnen

obliegt.

Abb. 2.1 Hierarchie des Nervensystems


2.1.1 Bauelemente des Nervensystems

Das Nervengewebe baut sich aus den funktionell unterschiedlichen Zellelementen, Neuroglia

und den Nervenzellen auf:

Die Neuroglia lassen sich in Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia und die

Schwann´schen Zellen unterscheiden, die verschiedene Aufgaben wahrnehmen. Sie

gewährleisten die Funktion des Nervengewebes, indem die unterschiedlichen Gliazellen den

Liquor cerebrospinalis produzieren, den Stoffwechsel ermöglichen, Axone mit Mark- oder

Myelinscheide umhüllen und phagozytierende Eigenschaften besitzen.

Die Nervenzellen bestehen aus dem kernhaltigen Zellkörper, dem Perikaryon, und den

Fortsätzen, das bei jeder Nervenzelle nur einmal vorkommende Axon und die vielfach

auftretenden Dendriten. Die Axone leiten Erregungen vom Zell-Leib weg und können damit

Ausgangspunkt eines peripheren Nervens sein.

Die Gesamtheit der die Perikaryen einbettenden Nerven- und Gliazellfortsätze wird unter dem

Begriff Neuropil zusammengefasst.

Im ZNS lässt sich immer die mehr oder weniger deutlich abgrenzbare graue Substanz

(Substantia grisea) und die weiße Substanz (Substantia alba) unterscheiden. Die graue

Substanz enthält Gliazellen (vor allem Astrozyten) und Neurone, während in der weißen

Substanz die umhüllten Axone verlaufen.

2.1.2 Zentrales Nervensystem (ZNS)

2.1.2.1 Rückenmark

Die Ausdehnung des Rückenmarks erstreckt sich vom ersten Halswirbel bis zum Kreuzbein.

Es wird aufgrund seiner Lage im Wirbelkanal und durch die segmental abgehenden

Rückenmarksnerven (Nn. spinales) in das Halsmark (Pars cervicalis), das Brustmark (Pars

thoracica), das Lendenmark (Pars lumbalis) und das Kreuzmark (Pars sacralis) sowie das

Schwanzmark (Pars caudalis) unterteilt.

Der innere Aufbau des Rückenmarks ist mit der H- oder der Schmetterlingsform der grauen

Substanz und der sie umgebenen weißen Substanz makroskopisch sichtbar (s. Abb. 2.2, S.18).

Im Feinbau weist die graue Substanz bilateral symmetrisch das Dorsalhorn (Cornu dorsale)

und das Ventralhorn (Cornu ventrale) auf. Die jeweiligen Seiten korrespondieren über die

18 Literaturübersicht

Commissura grisea, die ihrerseits in die Substantia intermedia lateralis und die den Canalis

centralis umschließende Substantia intermedia centralis unterteilt werden kann.

Die sensiblen Neurone des Dorsalhorns empfangen Reize über afferente Nervenfasern der

Radix dorsalis und ihrem Spinalganglion (Ganglion spinale). Im Ventralhorn finden sich

große motorische Neuronen, deren efferenten Axone als Radix ventralis gemeinsam mit der

Radix dorsalis als gemischtfaseriger Spinalnerv, Truncus nervi spinalis, den Wirbelkanal

verlassen. Motorische sympathische Wurzelzellen sind in der Substantia intermedia lateralis

lokalisiert.

Die weiße Substanz lässt sich in einen Dorsalstrang (Funiculus dorsalis), einen Lateral- und

Ventralstrang (Funiculus lateralis/ventralis) einteilen. Weiterhin werden Commisura alba,

Fissura mediana ventralis und der Sulcus medianus dorsalis beschrieben. Funktionell besteht

die weiße Substanz aus markhaltigen Nervenfasern, die als Bündel (Tractus) funktionell

unterschiedlich in aufsteigenden und absteigenden Bahnen verlaufen.

Abb. 2.2 Schematische Darstellung des Rückenmarks

Strukturen der grauen Substanz: 1. Cornu ventrale, 2. Cornu dorsale, 3. Commisura grisea;

Strukturen der weißen Substanz: 4. Funiculus anterior, 5. Funiculus lateralis, 6. Funiculus

posterior, 7. Commisura alba, 8. Fissura mediana ventralis; 9. Sulcus medianus dorsalis; 10.

Canalis centralis, 11. Radix ventralis, 12. Radix dorsalis, 13. Ganglion spinale

2.1.2.2 Gehirn/Stammhirn

Als zentrales, übergeordnetes Steuerungsorgan entspringen dem Gehirn 12 paarige Nerven

(Nervi craniales), die ihren Ursprung in den verschiedenen Abschnitten des Gehirns finden.

Je nach Funktion weisen die einzelnen Nerven einen sensiblen, sensorischen oder

motorischen Fasergehalt auf. Neben diesen reinen treten auch gemischte Nerven auf, die


durch den Faseraustausch mit Ganglien zusätzlich sympathische und parasympathische

Qualitäten besitzen können.

Ein spezielles Endothel mit tight junctions schützt als Blut-Hirn-Schranke und Blut-Liquor-

Schranke das Gehirn und gewährleistet über aktive und passive Transportvorgänge die

Versorgung. Eine eingeschränkte Blut-Hirn-Schrankenfunktion weisen die

zirkumventrikulären Organe (ZVO) auf, die über ein fenestriertes Endothel Hormone

sezernieren und sensorische Funktionen besitzen.

Abb. 2.3 Schematischer Querschnitt der Medulla oblongata mit den für die TSE Diagnostik

relevanten Kerngebieten, Abb. aus CASALONE et al. 2005

Für die BSE-Routine-Diagnostik wird die Region des Obex im Bereich des verlängerten

Marks (Medulla oblongata) untersucht. Die Medulla oblongata als Teil des Stammhirns

(Myelencephalon) bildet den am weitesten kaudal gelegenen Teil des Gehirns und stellt die

Verbindung zum Rückenmark her. Der Obex selbst bildet mit anderen Strukturen den

kaudalen Abschluss des Daches des IV. Ventrikels.

Die graue Substanz dieses Anteils der Medulla oblongata wird durch mikroskopisch

isolierbarer Nervenzellnester als Kerngebiete (Nuclei) bestimmter Gehirnnerven repräsentiert

(s. Abb. 2.3), die von der weißen Substanz umschlossen und teilweise durchzogen wird.

Funktionell ist die Medulla oblongata damit ein wichtiges Zentrum peripherer Nerven und

kann als Koordinations- und Reflexzentrum charakterisiert werden.


2.1.3 Peripheres Nervensystem (PNS)

Das PNS umfasst alle für die Erregungsleitung verantwortlichen Nerven und Ganglien, die

direkt oder indirekt Kontakt zum ZNS haben.

Die Skelettmuskulatur und Sinnesorgane werden durch das somatische System innerviert,

während vegetative oder autonome Nerven und Ganglien für die adäquate Steuerung der

Organe und Organsysteme sorgen.

Im Folgenden werden lediglich die für diese Arbeit relevanten Strukturen beschrieben.

2.1.3.1 Vegetatives Nervensystem (VNS)

Im VNS wird das sympathische vom parasympathischen System differenziert, die sich durch

ihre antagonistische Wirkungsweise und durch die chemische Natur ihrer

Transmittersubstanzen (Sympathikus: Adrenalin, Noradrenalin; Parasympathikus:

Acetylcholin) unterscheiden. Eine schematische Übersicht der für diese Arbeit relevanten

Anteile des vegetativen Nervensystems zeigt die Abb. 2.4 (S.21).

Sympathisches Nervensystem

Der Ursprung des Sympathikus liegt in den Wurzelzellen der Substantia intermedia des

Rückenmarks. Die entsprechenden Axone verlassen den Wirbelkanal über die Ventralwurzel

und finden größtenteils Anschluss an die Ganglienkette des Grenzstranges (Truncus

sympathicus), wo zum Teil die Umschaltung auf das sekundäre Neuron erfolgt. Manche

Fortsätze durchziehen jedoch diese sogenannten Paravertebralganglien und werden erst in den

sogenannten Prävertebralganglien auf das zweite Neuron verschaltet.

Der Halsteil des sympathischen Grenzstranges enthält das Ggl. stellatum und im Kopfbereich

das Ggl. cervicale craniale. Dieses Paravertebralganglion stellt nach erfolgter Umschaltung

größtenteils den sympathischen Anteil der Gehirnnerven. Der Brustteil besteht aus einer Kette

symmetrisch und segmental angeordneter Paravertebralganglien (Ganglia trunci sympathici),

welche die Nervi splanchnici majores abgeben, die als Eingeweidenerven zum Plexus bzw.

Ggl. coeliacum ziehen.

Das Ggl. coeliacum wird zusammen mit dem anatomisch nicht separierbaren Ggl.

mesenteriale craniale als Ganglionkomplex (englisch: Coeliac Mesenteric Ganglion

Complex, CMGC) angesprochen und ist dem Bauchteil des Sympathikus zugeordnet. In enger

Verbindung mit dem Ggl. mesentericum caudale ist es für die sympathische Innervation des


Darmsystems verantwortlich. In diesem als Prävertebralganglion fungierende

Nervenzellknoten werden die Fasern des N. splanchnicus auf die sekundären

postganglionären Neurone umgeschaltet und führt durch den Anschluss von Zweigen des N.

vagus der Ganglienkomplex auch parasympathische Fasern.

Parasympathisches System

Der kraniale Teil des Parasympathikus hat seine Ursprung im Mittelhirn und der Medulla

oblongata, während die Wurzelzellen des kaudalen Anteils in der Substantia intermedia des

Kreuzmarks (Pars sacralis) lokalisiert sind. Erstgenannter Teil versorgt die Organe des

Kopfes und der Bauch- und Beckenhöhle, die parasympathische Innervation der

Beckenorgane und des Geschlechtsapparates erfolgt durch den Pars sacralis.

Abb. 2.4 Schematische Darstellung von Anteilen des zentralen und peripheren Nerven-

systems

ZNS: 1-Gehirn, 1a-Ebene des Obex in der Medulla oblongata, 2a-Halsmark, 2b-Brustmark,

2c-Lendenmark, 2d-Kreuzmark des Rückenmarks; sympathisches System: 3-sympathischer

Grenzstrang, 4-Ggl. cervicale craniale, 5-Ggl. stellatum, 6-Nn. splanchnici majores, 7-Nn.

splanchnici lumbales; parasympathisches System: 8-N.vagus, 9-Ggl. nodosum; somatisches

System: 10 Ggl. trigeminale; gemischte Anteile: 11-Ggl. coeliacum, 12-Ggl. mesenteriale

caudale, 13- Plexus aorticus abdominalis (Abb. modifiziert nach (NICKEL, SCHUMMER,

SEIFERLE, 3. Auflage, 1991)


Der N. vagus ist der bedeutsamste Nerv des parasympathischen Systems, führt aber auch

somatomotorische, sensible und sympathische Fasern. Im Bereich des Nucleus tractus

solitarii und Nucleus tractus nervi trigemini der Medulla oblongata enden die afferenten

Wurzelfasern, während die parasympathischen Wurzelzellen im Kern des N. vagus (s. Abb.

2.4, S.21) des verlängerten Marks liegen.

Der N. vagus enthält im Nervenstrang selbst z.T. zahlreiche Neuronennester und durchläuft

das Ggl. distale oder nodosum, welches die sekundären Neurone der afferenten Nervenfasern

enthält. Über eine Vielzahl von Ästen ist der N. vagus unter anderem an der Steuerung der

Kehlkopffunktion und des Herzens beteiligt, besitzt aber auch viszerosensible und -

motorische Fasern für die Funktion der meisten Organe im Brust- und Bauchraum. Im

Bauchraum erhält er dabei eine anatomische Verbindung mit den Ggl. coeliacum.

Des Weiteren führt der N. vagus auch einige sympathischen Fasern, die ihm durch das Ggl.

cervicale craniale zugeführt werden.

2.1.4 Enterisches Nervensystem (ENS)

Die folgenden Angaben sind dem Buch „The enteric nervous system“ (FURNESS, 2006)

entnommen und durch weitere Literaturangaben ergänzt.

Das ENS setzt sich aus Neuronen, ihren Axonen und Gliazellen in Form kleiner, aber sehr

zahlreicher Ganglien zusammen. So wird der Darm einerseits autark über Reflexbögen

gesteuert, über ein weitreichend verschaltetes Netzwerk erfolgt aber auch eine intensive

Kommunikation mit dem ZNS.

Die extrinsische Steuerung wird vor allem durch Nerven sympathischer Qualität

gewährleistet (OHMORI et al. 2008), die auch für die direkte Innervation der Peyer`schen

Platten bestimmt werden konnten (DEFAWEUX et al. 2007; CHIOCCHETTI et al. 2008)

und somit eine funktionelle Verbindung zwischen dem Nerven- und dem Immunsystem

darstellen.

Nach der Lokalisation werden zwei Plexus unterschieden. Zu Veranschaulichung der

anatomischen Verhältnisse dient Abb. 2.5 (S.23).

Der Plexus myentericus (Auerbach`scher Plexus) befindet sich zwischen der longitudinalen

und der zirkulären Schicht der äußeren Muskulatur des Verdauungstraktes. Der myenterische

Plexus, dessen Ganglien über sogenannte interganglionäre Stränge vernetzt sind, ist in allen

Abschnitten das Gastrointestinaltraktes zu finden. Dabei wird primär unabhängig vom ZNS


die Motilität und Peristaltik des Verdauungssystems gesteuert. Allerdings greifen

Parasympathikus und Sympathikus in die Aktivität des Plexus ein und beeinflussen somit die

Darmmotilität.

Das Auftreten des Plexus submucosus (Meißner`scher Plexus) ist auf die Bereiche des Dünn-

und Dickdarms beschränkt. Die variable Lokalisation der Ganglien und funktionell

verschiedenen Neuronen-Typen konzentrieren sich auf die Submukosa und können dort die

Follikel der Peyer`schen Platten umspannen, während einzelne Neurone aber auch in der

Mukosa zu finden sind. Funktionell ist dieser Plexus für die Innervation der Mukosa, für den

transepithelialen Ionentransport, die Regulation der mukösen Blutversorgung und für

Immunreaktionen verantwortlich (SURPRENANT, 1994).

Abb. 2.5 Schematische Darstellung der Anteile des enterischen Nervensystems

A: Mukosa; B: Muscularis mucosae; C: Submukosa; D: zirkuläre Muskulatur; E:

longitudinale Muskulatur; 1: Peyer´sche Platten; 2: Follikel-assoziiertes Epithel (FAE);

Neurone des 3: internen mukösen Plexus; 4: des externen mukösen Plexus; 5: des

myenterischen Plexus; 6: interganglionäre Stränge

2.2 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien

Bei den Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien (TSE) handelt es sich um

übertragbare, progressiv verlaufende neurodegenerative Erkrankungen, die bei verschiedenen

Säugetierspezies auftreten. Als ursächlicher Erreger wird für diese Krankheiten nach

heutigem Wissenstand eine abnormale Form des eigentlich zellulären, d.h. körpereigenen,

Prion-Proteins (PrPC, C von cellular) (PRUSINER 1982; PRUSINER et al. 1990)


angenommen. Diese abnormale, fehlgefaltete Isoform akkumuliert bei den bekannten TSE

und wird als PrPSc

(Sc von Scrapie) bezeichnet.

2.2.1 Das Prion-Protein

2.2.1.1 Struktur des zellulären Prion-Proteins (PrPC)

Prion-Protein PrPC ist ein körpereigenes, extrazelluläres und hochkonserviertes Glykoprotein

(RIEK et al. 1996; HORNEMANN et al. 2004; GOSSERT et al. 2005; LYSEK et al. 2005),

welches durch das Prion-Protein-Gen (Prnp) kodiert wird und sich im Genom einer Vielzahl

von Säugetierspezies, Reptilien, Vögeln und Amphibien findet (WOPFNER et al. 1999;

CALZOLAI et al. 2005).

Die posttranslationalen Modifikationen des Proteins im Endoplasmatischen Reticulum und

dem Golgi-Apparat umfassen die Bildung einer Disulfid-Brücke und die Glykosylierung

(PRUSINER 1998; HARRIS 2003), die zur Bildung dreier Isoformen führt: unglykosyliert,

einfach oder zweifach glykosyliert (RUSSELAKIS-CARNEIRO et al. 2002).

Am reifen Protein lässt sich ein N-Terminus mit einer hochkonservierten Oktarepeatregion

und ein globulärer C-terminaler Bereich unterscheiden (RIEK et al. 1996).

2.2.1.2 Eigenschaften und Funktion des PrPC

PrPC ist gut löslich, wird durch Proteinasen vollständig abgebaut und weist zudem im

Gegensatz zu seiner pathologischen Isoform eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Hitze,

pH-Wert-Schwankungen und UV-Strahlung auf. Die PrPC-Expression findet bei Säugern vor

allem im ZNS und in geringeren Mengen in nahezu allen Körpergeweben statt (BENDHEIM

et al. 1992; FORD et al. 2002), darunter auch Zellen des Immunsystems (DODELET u.

CASHMAN 1998). Die physiologische Funktion des Proteins wurde von WESTERGARD et

al. (2007) zusammenfassend diskutiert: Neben zytoprotektiven Effekten scheint das Protein

indirekte Auswirkungen auf die neuronale Differenzierung, Reifung und Regeneration zu

haben. Als interaktives Transmembranprotein ist die Beteiligung an Signalkaskaden und bei

der synaptischen Übertragung wahrscheinlich. Darüber hinaus ist PrPC offensichtlich an der

Zelladhäsion beteiligt und bedingt die zelluläre Aufnahme und Bindung von Kupferionen.

Eine aufgrund des hohen Konservierungsgrades vermutete essentielle Rolle des Prion-

ProteinPrion-Proteins wird durch Lebensfähigkeit von PrP- knock-out-Mauslinien (PrP0/0

) in


Frage gestellt. Die Herstellung dieser transgenen Mäuse führte zu phenotypisch

unveränderten Tiere (BÜELER et al. 1992).Allerdings berichten andere Studien eine gestörte

neuronale Erregung (COLLINGE et al. 1994; COLLING et al. 1995), eine höhere

Anfälligkeit gegenüber oxidativem Stress (BROWN et al. 1999) und anormale

Schlafrhythmen bei PrP0/0

-Mäusen (TOBLER et al. 1996).

2.2.1.3 Das pathologische Prion-Protein (PrPSc

)

PrPC und das pathologische Prion-Protein (PrP

Sc) besitzen die gleiche Aminosäuresequenz. Es

bestehen jedoch deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen

Eigenschaften und ihrer Struktur.

So zeigt die pathologische Form des Prion-Proteins eine ausgesprochen hohe

Widerstandsfähigkeit gegenüber chemischen und physikalischen Einflüssen (HUNTER et al.

1964; ALPER et al. 1966, 1967). Neben der Unlöslichkeit in wässrigen Lösungen sind

herkömmliche Desinfektionsmittel gegen PrPSc

kaum oder gar nicht wirksam.

Als wichtigstes Unterscheidungskriterium gilt die partielle Resistenz der pathologischen

Isoform gegen Proteinasen, beispielsweise Proteinase K (PK) (OESCH et al. 1985). Durch die

Inkubation mit PK werden wird ein 27-30 kDa (PrP 27-30) großes Proteinfragment gebildet,

das das Kernstück des PrPSc

darstellt (PRUSINER et al. 1987). Untersuchungen mit

transgenen, PrP27-30

exprimierenden Mäusen zeigten, dass dieses Fragment des Proteins für

die Infektion der Tiere ausreicht (FISCHER et al. 1996). Es aggregiert und bildet

regelmäßige, amyloide Strukturen, die man nach Aufreinigung als Prion-Rods bzw. Scrapie-

assoziierte Fibrillen (SAF) anspricht (PRUSINER et al. 1983). Anhand der charakteristischen

Verschiebung (shift) der molekularen Masse von PrPSc

im Western Blot kann anhand der

Glykosylierungsformen (un-, mono-, di-glykosyliert) der Erreger charakterisiert werden

(KUCZIUS et al. 1998). So dominiert bei BSE anders als bei Scrapie die diglykosylierte

Form (STACK et al. 2002), obwohl eine Diskriminierung von BSE und Scrapie nicht immer

eindeutig möglich ist (BARON et al. 1999).

2.2.2 Erregerhypothese

Aufgrund der Tatsache, dass sich die Infektiosität des Scrapie-Erregers nicht durch

herkömmliche Verfahren und Substanzen zum Abbau von Nukleinsäuren verringern lässt,


wurde erstmals durch ALPER et al. (1966) der Verdacht eines infektiösen Proteins geäußert.

Die Anreicherung eines Proteins der Größe von 27-30 kDa aus TSE-infiziertem

Gehirnmaterial (PRUSINER et al. 1980) führte im Folgenden zur Formulierung der protein-

only-hypothesis (OESCH et al. 1985). Diese Theorie postuliert PrPSc

als infektiöses Agens,

welches für die Erkrankung verantwortlich ist und seine Fehlfaltung auf das vorhandene,

körpereigene PrPC überträgt. Die Replikation erfolgt durch die autokatalytische Konversion

von Alpha-helix-reichem PrPC

in die pathologische, Beta-faltblatt-reiche Isoform

(PRUSINER 1998). Diese Konformationsänderung wird als entscheidendes Ereignis in der

Pathogenese der Prion-Erkrankungen diskutiert. Für diesen neuartigen Erreger prägte

PRUSINER aus der Bezeichnung „proteinaceous infectious particle“ den Begriff „Prion“,

dem eine eigenständige Nukleinsäure fehlt (PRUSINER 1998).

Vielfältige Hinweise stützen diese Hypothese So konnte PrPC in vitro durch die Zugabe von

PrPSc

in die fehlgefaltete Form konvertiert werden (GASSET et al. 1992; KOCISKO et al.

1994). Weiterhin gelang mit hoch aufgereinigtem PrPSc

die Infektion von Wildtypmäusen

(PRUSINER 1982). Zudem war in vitro hergestelltes rekombinantes PrPC nach

anschließender Überführung in eine Beta-Faltblatt-reiche Struktur für transgene Mäuse

infektiös (LEGNAME et al. 2004). In einem entgegengesetzten Ansatz erwiesen sich PrPC-

defiziente Mäuse gegen eine Infektion als resistent (BUELER et al. 1993).

Der Nachweis bei Wildtyptieren wäre ein finaler Hinweis für die Gültigkeit der 'protein-only-

hypothesis'. Mittels zyklischer Amplifikation der Protein-Fehlfaltung (engl., protein

misfolding cyclic amplification, PMCA) war in vitro generiertes PrPSc

in der Lage, Wildtyp-

Hamster zu infizieren (CASTILLA et al. 2005). Ein weiteres Experiment generierte ein Prion

aus bakteriell exprimierten PrP, welches nicht nur die typischen Eigenschaften von PrPSc

aufwies, sondern auch ohne Co-Faktoren für Wildtypmäuse infektiös war (WANG et al.

2010). Diese Ergebnisse wurden als Durchbruch für die Gültigkeit der 'protein-only-

hypothesis' gewertet.

Dennoch war die mögliche Beteiligung anderer Faktoren am Infektionsprozess bis dato einer

der Kritikpunkte (ABID u. SOTO 2006). Des Weiteren bestanden Zweifel, dass durch die

unterschiedliche Faltung des Prion-Proteins die Information für verschiedene TSE Stämme

kodiert werden kann. Außerdem konnte in einer Studie mit BSE-infizierten und klinisch

erkrankten Mäusen bei 55% der Tiere kein PrPSc

nachgewiesen werden. Erst nach mehreren

Subpassagen gelang die Detektion von pathologischem Prion-Protein. Aus diesem Grund

wurde ein bisher unbekannter Faktor für die eigentliche, klinische Infektion diskutiert

(LASMEZAS et al. 1997).


Eine andere Theorie beschäftigt sich mit der Beteiligung von Viren am Krankheitsgeschehen.

In dieser Virus-Hypothese von DIRINGER et al. (1994) und MANUELIDIS (1994) dient das

Prion-Protein lediglich als Rezeptor für ein bisher nicht bekanntes Virus. Eine Prion-Infektion

hat in vivo wie auch in der Zellkultur einen steigernden Einfluss auf die Expression

bestimmter Retroviren (CARP et al. 1999; STENGEL et al. 2006). Deren Expression förderte

die Freisetzung von Prionen/Infektiosität in den Überstand und die Verbreitung innerhalb der

Kultur (LEBLANC et al. 2006).

Als mögliche Co-Faktoren erleichterten in vitro insbesondere kleine, hoch-strukturierte RNAs

oder unspezifische DNAs die Konversion von Hamster-PrPC

(CORDEIRO et al. 2001;

DELEAULT et al. 2003, 2005). Ergänzend zu vorherigen Studien zur Interaktion von PrPSc

mit RNA (WEISS et al. 1997; DERRINGTON et al. 2002; ADLER et al. 2003;

SUPATTAPONE 2004), wird die Beteiligung eines RNA-haltigen Nukleoprotein-Komplexes

diskutiert (SIMONEAU et al. 2009).

2.2.3 Transmissible Spongiforme Enzephalopathien bei Tieren

Die das ZNS betreffenden Erkrankungen (s. Tab. 2.1, S.28) treten nach einer verhältnismäßig

langen Inkubationszeit von mehreren Monaten bis Jahren auf und enden stets letal (BUDKA

et al. 1995). Sie führen zu neurodegenerativen Schädigungen, die durch spongiforme

Läsionen im Neuropil, Degeneration von Nervenzellen und Astrozytose gekennzeichnet sind

(FIELD u. PEAT 1969). Der progressive Krankheitsverlauf beginnt mit dem Einsetzen von

Symptomen wie Verhaltensänderungen, Bewegungs- und Sensibilitätsstörungen und ist beim

Menschen mit einer fortschreitenden Demenz verbunden.

Ähnlich wie bei anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer´schen oder der

Parkinson´schen Krankheit können auch bei TSEs amyloide Plaques auftreten (SOTO 2003).

Prion-Krankheiten treten nicht nur sporadisch oder hereditär auf, sondern können auch auf

natürliche, akzidentielle oder experimentelle Infektionen zurückgehen (CHANDLER 1961;

CHANDLER u. TURFREY 1972; WELLS et al. 2003). Bedeutsam ist das zoonotische Potentials

der BSE-Erreger (BRUCE et al. 1997) – humane Infektionen sind seit Mitte der neunziger

Jahre als Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (vCJD) bekannt (WILL et al. 1996;

BUDKA 2001).


Allen Prion-Erkrankungen gemein ist das Ausbleiben einer detektierbaren humoralen und

zellulären Immunantwort. Wirkungsvolle Therapie-Ansätze gegen TSEs bei Mensch und

Tier gibt es derzeit noch nicht (VANA et al. 2007).

Am lebenden Tier kann anhand der klinischen Symptome lediglich eine Verdachtsdiagnose

gestellt werden. Die Diagnose einer TSE-Erkrankung kann bis dato ausschließlich post

mortem durch biochemische und immunhistochemische Tests gestellt werden.

Tab. 2.1 Liste natürlich auftretender Transmissibler Spongiformer Enzephalopathien

Natürliches

Vorkommen TSE Literatur

Mensch

Kuru ZIGAS u. GAJDUSEK (1957)

Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJK) (iatrogen, sporadisch, familiär-

genetisch, Variante)

CREUTZFELDT (1920), JAKOB

(1921a; 1921b; 1921c) vCJK: WILL et al. (1996)

Gerstmann-Sträussler-Scheinker-

Syndrom (GSS)

GERSTMANN et al. (1936)

Fatale familiäre Insomnie (FFI) LUGARESI et al. (1986)

Schaf

Scrapie MCGOWAN (1922)

atypische Scrapie BENESTAD et al. 2003

Rind

Bovine spongiforme Enzephalopathie

(BSE) WELLS et al. (1987)

JEFFREY u. WELLS (1988)

atypische BSE CASALONE et al. 2004

BIACABE et al. 2004

Cerviden chronisch zehrende Krankheit der

Hirsche (CWD) WILLIAMS u. YOUNG (1980)

Katzen schwammartige Hirndegeneration der

Katzen (FSE) WYATT et al. (1990)

PEARSON et al. (1992)

Nerz übertragbare Hirndegeneration der

Nerze (TME) BURGER et al. (1965)

HARTSOUGH et al. (1965)


2.2.3.1 Pathologie der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien

Pathologische Veränderungen konnten bisher ausschließlich im ZNS lokalisiert werden. Es

handelt sich dabei um neurodegenerative Prozesse, die nicht mit einem spezifischen

inflammatorischen Geschehen einhergehen.

Histopathologische Veränderungen des Gehirns kommen bei allen TSE´s vor, sie

unterscheiden sich aber hinsichtlich ihrer Ausprägung und Lokalisation. Die im Vordergrund

stehenden spongiformen Veränderungen entstehen bilateral durch das Anschwellen von

Perikarien (neuronale Vakuolen) und der Nervenfortsätze (Auflockerung des Neuropils) bei

gleichzeitigem Verlust intrazellulärer Organellen.

Die histopathologischen Vakuolen bei klassischer BSE sind unabhängig von Rasse, Dosis und

Art der Inokulation (WELLS u. SIMMONS, 1996). Die Läsionen in den Kerngebieten des

Tractus solitarii, Tractus spinalis, N. trigeminus, N. vestibulares und der Substantia grisea

periaquaeductalis der Medulla oblongata (Obex) können für eine BSE-Diagnose

herangezogen werden, die Läsionen erstrecken sich aber auch auf das Cerebellum,

Diencephalon, Mesencephalon und die Pons (WELLS u. WILESMITH, 1995).

Für Scrapie wird das Auftreten von Vakuolen im Mesencephalon, Diencephalon,

Telencephalon, Corpus striatum beschrieben, die aber nicht in den Olivkernen, dem

zerebralen Cortex und dem Hippocampus vorkommen (JEFFREY u. GONZÁLEZ, 2004).

Weiterhin weisen die Ergebnisse verschiedener Studien eine Vielzahl von Variationen

abhängig vom Scrapie-Stamm, Genotyp und anderen individuellen Faktoren auf (ZLOTNIK

1958; WOOD et al. 1997; BEGARA-MCGORUM et al. 2002; LIGIOS et al. 2002).

Die Unterschiede in der neuroanatomischen Verbreitung der Vakuolen nach Adaptation an

definierte Nagetiere können in Form von Läsionsprofilen dargestellt werden, durch die

verschiedene Scrapie-Stämme differenzierbar sind (BEGARA-MCGORUM et al. 2002;

LIGIOS et al. 2002). Auch BSE-Infektionen zeichnen sich durch ein charakteristisches

Läsionsprofil aus, identische Läsionsmuster von BSE und vCJD in Mäusen ließen zudem den

Schluss eines direkten Zusammenhangs zwischen beiden TSE´s zu (BRUCE et al. 1997).

Wie auch die Vakuolisierung sind das Vorkommen einer Gliose und der Verlust von

Nervenzellen keineswegs einheitlich. Bei einer Gliose handelt es sich um eine über das

physiologische Maß hinausgehende erhöhte Anzahl von Gliazellen in einem geschädigten

Bereich des Zentralnervensystems. Der Nachweis eines apoptotischen Neuronenuntergangs in

signifikanten Tierzahlen konnte weder für Scrapie (LYAHYAI et al. 2006) noch für BSE

(THEIL et al. 1999) erbracht werden, obwohl die Steigerung pro-apoptotischer Faktoren bei


Scrapie (SERRANO et al. 2009) und der Verlust von Nervenzellen bei BSE-Rindern

(JEFFREY u. HALLIDAY 1994) beschrieben wurden. Für beide Erkrankungen können

allerdings die Veränderungen auch unter einem lichtmikroskopisch detektierbaren Level

liegen (FRASER 1976; WELLS et al. 1989, 1994; SOMERVILLE et al. 1997; CHAPLIN et

al. 1998).

Als weiterer pathologischer Aspekt gilt der Nachweis von PrPSc

-Akkumulationen mittels

Immunhistochemie. Diese treten an den gleichen neuroanatomischen Lokalisationen wie die

spongiformen Veränderungen auf (WELLS u. WILESMITH, 1995).

Tab. 2.2 Pathologische Befunde bei BSE und Scrapie

BSE Scrapie

Immunhistochemie - PrPSc

- Akkumulation (4)

korreliert mit Vakuolisierung Lokalisation korreliert mit Vakuolisierung

Akkumulationen:

perineuronal, linear, extrazellulär Neuropil-assoziiert

fein-punktiert,

(linear, fein-punktiert und grobkörnig-partikulär ,

koaleszieren und perineuronal),

grobkörnig-partikulär

Astrozyten-assoziiert

(sternförmig, subpial, subependymal und

perivaskulär),

Ependymalzellen-assoziiert

(supraependymal)

Endothelzellen-assoziiert

(vaskuläre Plaques)

intraneuronal, intraglial intrazellulär intraneuronal, intraglial

(1) WELLS u. WILESMITH, 1995; (2) JEFFREY et al. 2011; (3) HADLOW et al. 1982,

(4) JEFFREY u. GONZÁLEZ, 2004

Bei der Bewertung der morphologischen und topographischen Muster, dem sogenannten

PrPSc

-profiling, lassen sich für klassische BSE relativ gleichmäßige und einheitliche PrPSc

-

Akkumulationen nachweisen. Dagegen weisen die Gehirne klinischer Scrapie-Fälle eine hohe

Variabilität im PrPSc

-Profil auf (s. Tab. 2.2). Dadurch lassen sich nicht nur Informationen zum

Stamm und Ursprung des Scrapie-Erregers ableiten, es konnte ebenfalls die Abhängigkeit von

der Inokulationsroute und dem Genotyp bei klinisch erkrankten Schafen gezeigt werden

(JEFFREY u. GONZÁLEZ, 2007). Das sogenannte PrPSc

-mapping bedient sich dagegen


unterschiedlicher Antikörper, die spezifische Epitope des pathologischen Prion-Proteins

erkennen und erlaubt so die immunhistologische Unterscheidung von BSE und Scrapie.

Die Korrelation zwischen Pathologie, Erregernachweis und Symptomen gestaltet sich

ebenfalls uneinheitlich. So besteht bei einzelnen Individuen die Möglichkeit einer klinischen

TSE-Erkrankung gänzlich ohne nachweisbare pathologische Veränderungen (KONOLD et al.

2008). Während Gliose und Neuronenverlust mit Depositionen des pathologischen Prion-

Proteins assoziiert sind, trifft diese Korrelation nicht auf die spongiformen Veränderungen

und apoptotische Prozesse zu. Als eigentliche Krankheitsursache wird daher der Verlust der

protektiven PrPC-Funktion anstatt einer direkt schädigen Wirkung des PrP

Sc diskutiert

(JEFFREY et al. 2011).

2.2.3.2 Diagnostik

Die Routine-Diagnostik bedient sich zunächst kommerzieller Schnelltests, die im Falle eines

Reagenten weitergehende Untersuchungen in den nationalen Referenzlaboren zur

Diagnosestellung nach sich ziehen. Hier kommen OIE-zertifizierte Testmethoden zur

Anwendung, zu denen die Histopathologie, Immunhistochemie (IHC) und der Scrapie-

assoziierte-Fibrillen (SAF)- Immunoblot gehören.

Abb. 2.6: Vergleich der elektrophoretischen Profile und der Antikörperbindung nach

Proteinase K Verdau, PTA-Präzipitation und Immunoblot bei Verwendung der monoklonalen

Antikörper P4 und L42 (modifiziert nach Gretzschel 2007).


Da sich die neuropathologischen Veränderungen aller TSE’s vorrangig in der Obexregion der

Medulla oblongata befinden, wird als Probenmaterial für die Diagnostik das Stammhirn

eingesetzt. Bei Scrapie sollte zur Abklärung möglicher atypischer Fälle auch das Kleinhirn

untersucht werden.

In der histopathologischen Untersuchung auftretenden Vakuolen allein sind jedoch nicht

beweisend. Der direkte Nachweis von PrPSc

-Ablagerungen im Rahmen der

Immunhistochemie unter Verwendung spezifischer Antikörper stellt hingegen einen

wesentlichen Bestandteil der Diagnostik dar.

Als biochemische Methode kommt der Immunoblot zur Anwendung, der nach

elektrophoretischer Auftrennung des mit Proteinase K degradierten Proteins unter

Verwendung spezifischer Antikörper die drei Glykosylierungsformen des pathologischen

Prion-Proteins als einzelne Banden visualisiert. Darüber hinaus kann unter Berücksichtigung

des Antikörperbindungsverhältnisses, des Glykosylierungsverhältnisses und der molekularen

Masse des unglykosylierten PrPSc

eine Charakterisierung des PrPSc

zur Unterscheidung von

BSE und Scrapie vorgenommen werden (s. Abb.2.6, S.31).

2.2.3.3 Scrapie

Scrapie (von engl. scrape „kratzen“, „schaben“) oder Traberkrankheit ist eine übertragbare,

langsam tödlich verlaufende Erkrankung des Gehirns bei Schafen und in geringerem Ausmaß

auch bei Ziegen, deren Erstbeschreibung auf das Jahr 1750 zurückgeht (LEOPOLDT 1750).

Allerdings erwähnt ein 1772 erschienener Aufsatz in England Scrapie-Fälle, die sogar auf das

Jahr 1732 zurückgehen (COMBER 1772). Sie gilt damit als Prototyp der TSE und tritt in

zahlreichen Ländern endemisch bei kleinen Wiederkäuern auf.

Für Scrapie gilt nur die Zusammenfassung der histopathologischen Befunde in Kombination

mit den typischen PrPSc

-Ablagerungen als pathognomisch, da auch bei gesunden Tieren

spongiforme Veränderungen in geringerer Zahl gefunden wurden (ZLOTNIC u. RENNIE

1958, ZIOTNIK 1962).

Das Auftreten klinisch erkrankter und unauffälliger Tiere innerhalb einer Schafherde beruht

auf einer Resistenz, die durch Polymorphismen im Prnp-Genotyp kodiert sind, die vor allem

am Codon 136, 154 und 171 auftreten (GOLDMANN et al. 1990; HUNTER et al. 1994a;

BELT et al. 1995; BOSSERS et al. 1996) (s. Tab. 2.3, S.33). Vor diesem Hintergrund sind

seit 2003 alle EU-Mitgliedsstaaten aufgefordert, Programme zur Resistenzzucht bezüglich

Scrapie aufzustellen.


Scrapie- Erreger werden horizontal über die infektiöse Plazenta übertragen (TOUZEAU et al.

2006; BROTHERSTON et al. 1968; PATTISON et al. 1972; DICKINSON et al. 1974).

Allerdings gelingt der Nachweis des PrPSc

nur in der Plazenta von Föten des empfänglichen

Genotyps (ANDREOLETTI et al. 2002; LACROUX et al. 2007) und die Übertragung auf

den Embryo ist nicht obligatorisch (FOSTER et al. 2006).

Schafe infizieren sich direkt an der infektiösen Nachgeburt und indirekt an mit dieser

kontaminiertem Weideland (HOINVILLE, 1996; FOSTER et al. 1996, 2006; VAN KEULEN

et al. 2008). Möglicherweise spielen auch Kot (GONZÁLES et al. 2006) und Urin (SISÓ et

al. 2006) eine Rolle bei der horizontaler Übertragung.

Tab. 2.3 Übersicht Scrapie

Scrapie klassisch atypisch

Symptome Unruhe, Schreckhaftigkeit, Ataxie,

Abmagerung, Juckreiz, Festliegen v.a. Ataxie

(1)

Einfluss des Genotyps PrP

ARR - unempfänglich, PrP

VRQ -

hoch empfänglich (2) (3)

PrPVRQ

- unempfänglich, PrPARR

- hoch empfänglich

(4)

Infektionsquelle Kontamination der Umwelt, direkter

Tierkontakt spontanes Auftreten

(4)

intra-spezies

Übertragung horizontal

Übertragbarkeit auf Schafe

experimentell nachgewiesen (5)

Erregeraufnahme oral

(6), konjunktival

(7), dermal

(8),

gingival (9)

unklar

(1) BENESTAD et al. 2003; (2) VAN KEULEN et al. 2000; (3) ANDREOLETTI et al. 2000;

(4) BENESTAD et al. 2008; (5) SIMMONS et al. 2007; (6) HADLOW et al. 1982; (7)

SCOTT et al. 1993; (8) MOHAN et al. 2004; (9) CARP, 1982

Des Weiteren sprechen PrPSc

-Akkumulationen im Euter (LIGIOS et al. 2005), den

Speicheldrüsen (VACELLARI et al. 2007), der Zunge (CASALONE et al. 2005) und

Infektiosität im Kolostrum und der Milch (LACROUX et al. 2008) für die Möglichkeit einer

Übertragung durch direkten Tierkontakt. Als Erregerreservoir werden zudem Rötelmäuse

aufgrund ihrer hohen Empfänglichkeit gegenüber Scrapie diskutiert (PIENING et al. 2006).

In Norwegen wurde 1998 erstmals eine atypische Variante von Scrapie festgestellt

(BENESTAD 2003, BUSCHMANN et al. 2004). Retrospektive Analysen ergaben aber, dass

atypische Fälle bereits Ende der 80ziger Jahre in Großbritannien auftraten und weltweit mit


einer vergleichbaren Prävalenz wie klassischen Scrapie vorkommen (FEDIAEVSKY et al.

2008). Im Gegensatz zur klassischen Form weist sie eine vermehrte Akkumulation des

pathologischen Prion-Proteins vor allem im Kleinhirn und weniger im Stammhirn auf.

Weitere Unterscheidungskriterien sind das fehlende Vorkommen von PrPSc

in

lymphoretikulären Geweben und deutlich unterschiedliche biochemische Eigenschaften

(BENESTAD et al. 2003; BUSCHMANN et al. 2004; GAVIER-WIDEN et al. 2005; LE

DUR et al. 2005).

2.2.3.4 Bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE)

Die spongiforme Enzephalopathie der Rinder wurde 1985 in Vereinten Königreich

Großbritannien entdeckt und erstmals 1987 beschrieben (WELLS et al.).

Die Frage nach dem Ursprung konnte noch nicht eindeutig geklärt werden. Diskutiert wurde

zunächst die Übertragung von Scrapie-Erregern aus infizierten Schafen (WILESMITH et al.

1988, WILESMITH et al. 1991). Trotz der erfolgreichen Übertragung von Scrapie auf Rinder

wies die Infektion nach intra-zerebraler Inokulation andere proteinbiochemische und

histopathologische Merkmale auf und scheint daher als Ursache wenig wahrscheinlich

(KONOLD et al. 2006).

Die Hypothese, dass spontan an BSE erkrankte Rinder den Ausgangspunkt für die Epidemie

darstellten (EDDY 1995), fand mit Entdeckung der sporadisch auftretenden, sogenannten

atypischen BSE-Fälle, Unterstützung (BUSCHMANN et al. 2006; CAPOBIANCO et al.

2007).

Die klinischen Symptome (s. Tab. 2.4, S.35) treten erst nach einer sehr langen Inkubationszeit

deutlich in Erscheinung, auf die eine relativ kurze progressive Krankheitsperiode folgt.

Für die Verbreitung unter den Rindern wird die Verfütterung von infektiösem Tiermehl oder

Milchaustauschern angenommen (WILESMITH et al. 1988; PAISLEY u. HOSTRUP-

PEDERSEN 2004). Die Persistenz und Inzidenz des BSE-Erregers bei der

Tiermehlherstellung entstand durch die im Vereinigten Königreich der siebziger Jahre

beschlossenen Reduzierung der Behandlungstemperaturen und -zeiten und durch die

Steigerung der Tiermehlfütterung an Rinder (HÖRNLIMANN 2001). Ein

Verfütterungsverbot von Tiermehl an Wiederkäuer erfolgte Großbritannien bereits 1988, dem

sich die EU 2001 anschloss. So ist die Zahl der aufgetretenen BSE-Fälle in Großbritannien

seit 1993 und in Deutschland seit 2001 rückläufig. Hierzulande wurden bisher insgesamt 413

Fälle registriert (Stand: 10.08.2012).


Als natürliche Übertragung gilt die orale Aufnahme infektiösen Materials als sicher, da bisher

weder eine vertikale noch eine horizontale Übertragung durch die Ausscheidung von Sekreten

oder Exkreten beschrieben wurde (CURNOW u. HAU, 1996) und auch im Blut keine

Infektiosität nachgewiesen werden konnte (WELLS et al. 1998; ESPINOSA et al. 2007).

In den letzten Jahren ließ sich das Auftreten zweier atypische BSE-Varianten nachweisen. Es

wird der sogenannte H- Typ (BIACABE et al. 2004) von dem im gleichen Jahr erstmals

detektierten L-Typ (oder Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy - BASE)

unterschieden (CASALONE et al. 2004; BARON u. BIACABE, 2006). Beide Formen der

atypischen BSE wurden auch in Deutschland dokumentiert (BUSCHMANN et al. 2006).

Dabei weist der L-Typ durch das etwas geringere Molekulargewicht ein deutlich anderes

Glykosylierungsprofil auf. Die IHC weist PrPSc

-Akkumulationen in Form von amyloiden

Plaques vor allem in Thalamus und Cortex (CASALONE et al. 2004) anstelle der typischen

granulären und linearen Ablagerungen im Hirnstamm auf. Eine an Primaten durchgeführte

Studie zeigte markante klinische und neuropathologische Unterschiede (COMOY et al. 2008).

Die Inokulation humanes PrP exprimierender Mäuse mit dem L-Typ war effizienter als bei

der Verwendung der klassischen Variante (KONG et al. 2008) und Mäuse mit bovinem PrP

wiesen deutlich verkürzte Inkubationszeiten auf (BUSCHMANN et al. 2006).

Tab. 2.4 Übersicht BSE

BSE Klassisch atypisch

Symptome Abmagerung, Verhaltensänderungen,

erhöhte Sensibilität, Ataxie Abmagerung, Verhaltensänderungen,

erhöhte Sensibilität, Ataxie (3)

Einfluss des Genotyps ggf. Polymorphismen oder Depletion

der Promotorregion des Prion-Protein-

Gens (Prnp) und im Intron 1 (1) (2)

keine bekannt

Infektionsquelle infektiöses Tiermehl spontanes Auftreten

intra-spezies

Übertragung nur experimentell oral oder

intra-zerebral intrazerebrale Übertragbarkeit auf

Rinder experimentell nachgewiesen (3)

Erregeraufnahme oral -

(1) HAASE et al. 2007; (2) JULING et al. 2006; (3) BALKEMA-BUSCHMANN et al. 2011

Neben der BSE-Erkrankung beim Hausrind traten auch TSE-Erkrankungen bei exotischen

Wiederkäuern in zoologischen Gärten auf (JEFFREY u. WELLS 1988, KIRKWOOD et al.

1990). Desweiteren wurden in Frankreich und im Vereinten Königreich zwei BSE-

Infektionen bei Ziegen identifiziert (ELOIT et al. 2005; VACCARI et al. 2009).


Im Gegensatz dazu lässt sich der H-Typ vor allem durch sein signifikant höheres

Molekulargewicht von klassischer BSE unterscheiden (CASALONE et al. 2004). Die

Infektion von bovines PrP exprimierenden Mäusen ging mit einer Verlängerung der

Inkubationszeit gegenüber der klassischen Form einher (BUSCHMANN et al. 2006).

Grundsätzlich wird angenommen, dass diese atypischen TSE-Formen spontan entstehen

können und angesichts der in der Vergangenheit stattgefundenen Verfütterung von

infektiösem Tiermehl an Wiederkäuer eine mögliche Ursache für die klassische BSE-

Infektion gewesen sein könnten (BIACABE et al. 2004, CASALONE et al. 2004,

BUSCHMANN et al. 2006, CAPOBIANCO et al. 2007). Der im Western-Blot durch einen

Scrapie-spezifischen Antikörper detektierbare H-Typ wirft die Frage auf, ob es sich

tatsächlich um eine neuartigen BSE-Typ handelt oder eher eine natürliche Scrapie-Infektion

beim Rind darstellt (BIACABE et al. 2004).

2.3 Pathogenese der TSE-Erkrankungen

Zur Klärung der TSE-Pathogenese (griechisch, páthos, Leiden und génesis, Entstehung)

wurden verschiedene In vivo-Infektionsstudien mit unterschiedlichen Tierarten durchgeführt.

Die kann die ausgewählte Infektionsroute (oral, intrazerebral oder intraperitoneal) kann dabei

eine wesentlichen Einfluss haben und ergaben mitunter unterschiedliche Ergebnisse.

Experimentelle Studien zu BSE an oral inokulierten Rindern wurden lediglich am damaligen

Veterinary Laboratory Agency, Weybridge, Vereinigtes Königreich Großbritannien und am

Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems, Deutschland durchgeführt.

Im Folgenden soll die Pathogenese nach Prion-Infektionen bei verschiedenen Tieren erörtert

werden, wobei der Schwerpunkt auf Ergebnissen aus Studien mit dem Scrapie- und BSE-

Erregern liegen soll. In die Verbreitung des PrPSc

ist nach derzeitigem Kenntnisstand neben

lymphoiden Strukturen das PNS über parasympathische und sympathische Bahnen involviert.

Im Zuge einer Scrapie-Infektion weisen Studien auch auf eine mögliche hämatogene

Verbreitung hin. Dagegen wird insbesondere für BSE beim Rind aufgrund strenger Indizien

die neuronale Route favorisiert. Detaillierten Ergebnisse zur anterograden Ausbreitung des

pathologischen Prion-Proteins beim Rind liegen bisher jedoch noch nicht vor (s. Abb. 2.7,

S.37).


Abb. 2.7 Möglicher Ausbreitungsweg des PrPSc

bei klassischer Scrapie (modifiziert nach

VAN KEULEN et al. 2002), grau hinterlegt: vermutete Beteiligung bei BSE; 1: Infektion des

GALT; 2: Ausbreitung im lymphatischen System; 3: Neuroinvasion, GC: Ganglion

coeliacum; GN: Ganglion nodosum

2.3.1 Dosis und Inkubationszeiten

Die durch epidemiologische Studien geschätzte Inkubationsperiode einer natürlichen BSE-

Erkrankung liegt bei 5-5,5 Jahren (ARNOLD u. WILESMITH, 2004; WILESMITH et al.

1988). Dies würde im Tierexperiment einer einmaligen Dosis von 0,1g bis 1g eines

Hirnhomogenat-Pools entsprechen (ARNOLD et al. 2007; WELLS et al. 2007).

Unberücksichtigt bleibt bei dieser Betrachtung eine im Feld mögliche mehrfache Aufnahme

infektiösen Materials, die im Nagetiermodell eine erhöhte Infektionswahrscheinlichkeit und

verkürzte Inkubationszeiten zur Folge hatte (DIRINGER et al. 1998; GRAVENOR et al.

2003). Statistischen Schätzungen zufolge liegt das höchste Infektionsrisiko bei Kälbern in den

ersten sechs Lebensmonaten (ARNOLD u. WILESMITH, 2004).


Tab. 2.5 Korrelation zwischen Dosis und PrPSc

-Nachweis/Symptomatik

Dosis initialer PrP

Sc- Nachweis

im Obex

definierte klinische Symptome frühestens

nach

1 g 44 mpi (1)

; 42-47 mpi (2)

0,001 g 68 mpi (5)

0,1 g

1 g

53 mpi (5)

45 mpi (5)

100 g 24 mpi (3)

; 27 mpi (4)

; 10 g 44 mpi (1)

41 mpi (5)

30 mpi (1) (2)

100g 31 mpi (5)

; 35 mpi (1)

(1) MASUJIN et al, 2007 (2) ARNOLD et al. 2007 (3) HOFFMANN et al. 2007 (4)

ESPINOSA et al. 2007 (5) WELLS et al. 2007; mpi: Monate post infectionem

Im Maus- und Rindermodell (MCLEAN u. BOSTOCK, 2000; WELLS et al. 2007) ließ sich

zwar keine Schwellendosis für eine Infektion ermitteln, dennoch beeinflusst die Menge des

infektiösen Materials die Zeit bis zum Auftreten definierter klinischer Symptomatik ebenso

wie die erstmalige Detektion von PrPSc

im Hirnstamm (s. Tab. 2.5). Nach der Gabe von hohen

Dosen lässt sich nicht nur PrPSc

im Hirnstamm deutlich früher detektieren, es kommt zudem

zu einer Verringerung der Inkubationszeit und deren Variabilität (WELLS et al. 2007).

Weiterhin konnte nach oraler Verabreichung von 100g Homogenat PrPSc

im ZNS signifikant

früher vor dem Auftreten klinischer Symptome nachgewiesen werden als bei niedriger

dosierten Tieren (ARNOLD et al. 2007).

2.3.2 Das lymphatische System

Der initiale Nachweis nach oraler Scrapie-Inokulation erfolgt in Form von PrPSc

-

Akkumulationen im Darm-assoziierten-lymphatischen Geweben (engl., gut associated

lymphoid tissue, GALT), speziell in den Peyer´schen Platten (MAIGNIEN et al. 1999; VAN

KEULEN et al. 1999; BEEKES u. MCBRIDE, 2000) und der Tonsille (ANDREOLETTI et

al. 2000; VAN KEULEN et al. 2002). Im weiteren Verlauf erfolgt bei Scrapie der Befall des

Retropharyngeal- und der Mesenteriallymphknoten durch die das GALT drainierenden

Lymphgänge (ANDREOLETTI et al. 2000; VAN KEULEN et al. 2002).

Die Mechanismen für die Überwindung der Darmwand können für PrPSc

bisher lediglich

vermutet werden. Sogenannte M-Zellen, die im Follikel-assoziierten Epithel (FAE) der

Peyer´schen Platten lokalisiert sind, können verschieden Pathogene (Viren, Bakterien,

Prionen) transportieren (NEUTRA et al. 1996; HEPPNER et al. 2001). Auch ein


enzymatischer Abbau in kleinere PrPSc

-Fragmente und ein vermuteter Transport von

Proteinkomplexen über einen Ferritin-gekoppelten Endozytosemechanismus wurde

beschrieben (MISHIRA et al. 2004). Ebenfalls über Endzytose durch Enterozyten könnte das

pathologische Prion-Protein die Darmwand passieren (JEFFREY et al. 2006). Für Bakterien

konnte eine direkten Aufnahme durch sogenannte dendritische Zellen (DC) gezeigt werden,

die mit ihren Fortsätzen Antigene direkt aus dem Darmlumen aufnehmen können (RESIGNO

et al. 2001).

Für die Beteiligung an der Pathogenese werden DC, sowie Makrophagen (TBM) und

follikulär dendritische Zellen (FDC) diskutiert, da eine direkte Assoziation zwischen diesen

Zellen und PrPSc

-Ablagerungen bei infizierten Hamstern (BEEKES u. MCBRIDE, 2000;

MCBRIDE et al. 2001) und bei Scrapie-inokulierten Schafen (ANDREOLETTI et al. 2000;

JEFFREY u. GONZALES, 2007) hergestellt werden konnte.

Die stationären FDC´s sind in primären B-Zellfollikeln lokalisiert und können, ohne selbst

phagozytotisches Potential zu besitzen, Antigene über einen langen Zeitraum präsentieren

(MANDEL et al. 1980; SHORTMAN et al. 2002). Da das zelluläre Prion-Protein als die

Voraussetzung für eine Infektion (BÜELER et al. 1993) auf den FDC exprimiert wird, besteht

über die Möglichkeit der Konversion von PrPC

zu PrPSc

die Involvierung der FDC in der

Pathogenese (BROWN et al. 1999). Fehlende oder deaktivierte FDC’s verzögern die

Neuroinvasion bei Mäusen (MABBOTT et al. 2000; MONTRASIO et al. 2000) und im

gleichen Tiermodell wird die Akkumulation von PrPSc

im lymphoiden Geweben durch die

Abwesenheit FDC-assoziierter Zytokine verhindert (KLEIN et al. 1997; MABBOTT et al.

2000). Gegen eine essentielle Beteiligung der FDC spricht die unbeeinflusste Pathogenese

transgener Mäuse ohne B-Zellfollikel (PRINZ et al. 2003) und eine Neuroinvasion des Agens

trotz pharmakologischer FDC-Depletion (OLDSTONE et al. 2002).

In den Peyer´schen Platten bilden die Dendritischen Zellen (DC) eine Zellschicht mit engen

Kontakt zu den M-Zellen (KELSALL et al. 1996), die in Versuchen an Ratten PrPSc

aufnahmen und zu den Mesenteriallymphknoten beförderten (HUANG et al. 2002).

Allerdings ist durch die präferierte Migration der DC in die T-Zellregionen der Lymphfollikel

ein Kontakt zu den FDC eingeschränkt (SHORTMAN et al. 2002) und die Fähigkeit zur

Degradation des pathologischen Prion-Proteins in vitro (RYBNER-BARNIER et al. 2006)

lassen Zweifel an einer effektiven Verbreitung von PrPSc

durch die DC aufkommen.

In vitro-Studien konnten eine Degradation des PrPSc

durch zur Phagozytose fähige

Makrophagen zeigen (CARP et al. 1981 und 1982; SASSA et al. 2010), deren

pharmakologische Depletion in vivo mit erhöhten PrPSc

-Ablagerungen einherging


(BERINGUE et al. 2000; MAIGNIEN et al. 2005). In Scrapie-infizierten Schafen ließ sich

PrPSc

in Makrophagen detektieren, welches sehr wahrscheinlich von phagozytierten

Fortsätzen der FDC stammt (HERRMANN et al. 2003).

Die Integration mobiler und stationärer Immunzellen in die TSE-Pathogenese ist demnach

noch nicht vollständig geklärt.

Es gibt jedoch auch Studien, die gänzlich gegen eine Beteiligung des lymphatischen Systems

sprechen. Eine reduzierte Empfänglichkeit von immundefizienten Mäusen wurde durch eine

hochdosierte, parenterale Infektion überwunden (LASZEMAS et al. 1996; KLEIN et al.

1998). Die Inokulation verschiedener TSE-Agens in stark innervierte, extraneuronale Gewebe

(z.B. Zunge) von Hamstern und von transgenen Mäusen, die PrPC ausschließlich in

neuronalen Geweben exprimierten, führte zu einer Erkrankung ohne Beteiligung des

Lymphsystems (RACE et al. 2000). Weiterhin sei angemerkt, dass in Fällen atypischer

Scrapie bei Schafen (BENESTAD et al. 2003), bei Schafen mit heterologen VRQ/ARR-

Genotyp (VAN KEULEN et al. 1996) und in experimentell infizierten Schafen (JEFFREY et

al. 2002) die Etablierung einer Erkrankung ohne nachgewiesene Beteiligung lymphatischer

Gewebe verläuft.

Mit dem BSE-Erreger inokulierte Mäuse, Schafe und Primaten zeigen ebenfalls eine

Beteiligung des lymphatischen Systems (FOSTER et al. 1996, 2001; MAIGNIEN et al.

1999; HERZOG et al. 2004) und weisen damit auf eine Wirtsspezifität hin. In experimentell

infizierten Rindern konnte bisher lediglich PrPSc

in vereinzelten Peyer´schen Platten ab dem

4. Monat post infectionem (mpi) detektiert werden (HOFFMANN et al. 2011). Dagegen

wurde für natürlich erkrankte Tiere bisher zwar Infektiosität (BUSCHMANN u.

GROSCHUP, 2005) aber keine PrPSc

-Akkumulationen (TERRY et al. 2003; IWATA et al.

2006) detektiert. Die Ablagerungen waren mit FDC und Makrophagen PrPSc

bereites 24 mpi

assoziiert (HOFFMANN et al. 2007), während in anderen Studien FDC erst in der klinischen

Phase in Erscheinung traten (TERRY et al. 2003). Weitere Studien zeigen Infektiosität in der

Tonsille in einem präklinischen Rind (WELLS et al. 2005) als auch bei Tieren im terminalen

Stadium der Krankheit (ESPINOSA et al. 2007), die aber nicht als Hinweis auf eine

weitergehende lymphatische Ausbreitung verstanden werden wollen.

Die Frage, ob das lymphatische System eine notwendige Voraussetzung, einen optionalen

Mediator oder einen autarken Beteiligten an der Neuroinvasion darstellt, lässt sich mit den

Ergebnissen der bisherigen Studien nicht vollständig beantworten. Für BSE-infizierte Rinder

konnte lediglich das GALT als beteiligte lymphatische Komponente nach experimenteller

Inokulation hoher oraler Dosen nachgewiesen werden.


2.3.3 Das periphere Nervensystem (PNS)

2.3.3.1 Neuroinvasion

Für die Neuroinvasion wird die Beteiligung lymphoider Strukturen kontrovers diskutiert.

Studien an verschiedenen Tiermodellen suggerieren (a) die Neuroinvasion über das Lymph-

und Blutsystem, (b) den Aufstieg von PrPSc

/Infektiosität über Strukturen des ENS/PNS nach

initialer Replikation im lymphatischen Gewebe und (c) die direkte Aufnahme des Erregers

über Nervenenden des PNS.

Scrapie und BSE-Infektionen zeigen in verschiedenen Tiermodellen den primären Nachweis

von PrPSc

-Ablagerungen im GALT vor der Einbeziehung des ENS (ANDREOLETTI et al.

2000; VAN KEULEN et al. 2000; MCBRIDE et al. 2001; IWATA et al. 2006; HOFFMANN

et al. 2011). Die Verbindung zwischen immunologischen Zellen insbesondere des GALT´s

und Nervenenden des ENS wird als möglicher Übergang in das neuronale Gewebe

angenommen (HEGGEBØ et al. 2003; PRESS et al. 2004; DEFAWEUX et al. 2005). Dafür

wird neben Zell-Zell-Kontakten auch die Möglichkeit eines aktiven Transports zwischen der

Lymphe und dem ENS in Betracht gezogen (HEGGEBØ et al. 2003). Ebenfalls ist ein

interzellulärer Transport durch von infizierten Zellen (FDC, DC, Makrophagen) abgegebene

Exosomen denkbar (FEVRIER. et al. 2004).

Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen zwar ein Inokulat-unabhängiges de novo

generiertes PrPSc

in den Peyer´schen Platten, doch der fehlende Nachweis des pathologischen

Prion-Proteins in anderen, möglicherweise als Mediatoren fungierenden Zellen legt die

Möglichkeit einer Neuroinvasion unabhängig vom Befall der lymphoiden Strukturen und des

ENS durch Fasern peripherer Nerven direkt unterhalb der Basallamina nahe (JEFFREY et al.

2006). Bei Rindern konnte ein direkter Kontakt sympathischer Nervenfasern des PNS mit den

FDC’s und mit Makrophagen gezeigt werden (DEFAWEUX et al. 2007). Außerdem wies das

ENS erst im klinischen Stadium von BSE PrPSc

-Ablagerungen sowohl bei Infektionen

natürlichen Ursprungs als auch bei experimentell infizierten Tieren auf (TERRY et al. 2003).

Zudem konnte für DC in vitro eine Verbindung zu Fortsätzen peripherer Neurone gezeigt

werden (DORBAN et al. 2010), ebenso ließ sich im Mausmodell ein direkter Transport von

infektiösem Agens durch DC zu Anteilen des peripheren Nervengewebes beobachten

(AUCOUTURIER et al. 2001).


2.3.3.2 Ausbreitung von PrPSc

im PNS

Es sind vor allen Studien bei Schafen und Hamstern, die bisher (I) sympathische Nerven und

alternativ (II) auch den parasympathischen N. vagus als beteiligte Komponenten des PNS bei

der Ausbreitung des TSE-Agens beschreiben.

Der Sympathikus ist dabei in Form der Efferenzen der Nn. splanchnici und der

postganglionären Nervenzellen des Ggl. coeliacum beteiligt, die mit den sympathischen

präganglionären Neuronen in der Substantia intermedia lateralis des Rückenmarks

kommunizieren (MCBRIDE u. BEEKES, 1999; VAN KEULEN et al. 2000, 2002;

MCBRIDE et al. 2001).

Tab. 2.6 Übersicht PrPSc

-Nachweis/Infektiosität von Proben des peripheren Nervensystems

beim Rind

(1) ARNOLD et al. 2007; (2) MASUJIN et al. 2007; (3) KIMURA et al. 2008; (4)

ESPINOSA et al. 2007; # nicht durchgeführt; ud: undefiniert; exp: experimentell; IHC:

Immunhistochemie; WB: Western Blot; BA: Bioassay; mpi: Monate post infectionem; * Bio-

Rad TeSeE

Status

IHC WB BA klinisch Obex mpi Infektion

Ggl.

trigeminale

+ # # - + 32 exp (1)

# + # + + ud natürlich (2)

Ggl. spinale + # # - + 32 exp (1)

Ggl.

stellatum

- - # + + ud natürlich (3)

# + # + + 36 exp (2)

Ggl. cervicale craniale - -* # - + 32 exp (1)

sympathischer

Grenzstrang - # # + + ud natürlich

(3)

N. vagus # + + + + ud natürlich

(2)

- # # + + ud natürlich (3)

Nebenniere # + + + + ud natürlich

(2)

- # # + + ud natürlich (3)

N. ischiadicus # # + - + 30 exp (4)


Alternativ könnte der Aufstieg über die efferenten parasympathischen Bahnen des N. vagus

zu den entsprechenden präganglionären Neurone im dorsalen motorischen Kern des N. vagus

(engl. dorsal motor nucleus of the vagus – DMNV) in der Medulla oblongata erfolgen. Dieser

Pfad wird aus der Lokalisation einzelner PrPSc

-positiven Neuronen im DMNV abgeleitet und

als initialer Befall des ZNS interpretiert (BALDAUF et al. 1997; VAN KEULEN et al. 2000,

2002; MCBRIDE et al. 2001).

Indizien sprechen für einen ähnlichen neuronalen Ausbreitungsweg bei BSE. So gelang bei

einem oral infizierten, präklinischen Rind der Nachweis von PrPSc

zum einen im Ggl.

coeliacum, Ggl. mesenteriale caudale und dem ZNS (DMNV, Rückenmark) wie auch im

DMNV des Obex, jedoch ohne weitere Beteiligung des PNS (HOFFMANN et al. 2007). Mit

der deutlichen Beteiligung des ZNS sind weitere Daten zur Ausbreitung im PNS (s. Tab.2.6,

S.42) verfügbar, die allerdings eher auf eine zentrifugale Infektion hindeuten. Indizien für

eine solche sekundäre Ausbreitung nach Replikation des Agens im ZNS ist die nach initialen

Befall des Rückenmarks gleichzeitig auftretende zentrifugale und zentripetale Ausbreitung

mit einer Geschwindigkeit von 0,8-1,0 mm/Tag (BEEKES et al. 1996) und die ebenfalls

zentrifugal erfolgte Infektion des Ischias-Nerven der kontralateralen Seite nach unilateraler

Inokulation in die Fußsohle bei Hamstern (KRATZEL er al., 2007a).

2.3.3.3 Ausbreitungsmechanismen im Nervensystem

Der zugrunde liegende Mechanismus des Transports des infektiösen Agens ist bisher nur

unvollständig geklärt.

Eine der diskutierten Möglichkeiten ist der axonale Transport, der für verschiedene Toxine

wie z.B. das Tetanustoxin (MANNING et al. 1990) und das Choleratoxin (WAN et al. 1982;

AGELUCCI et al. 1996) sowie für Vertreter aus der Familie der Herpesviridae

(TOMISHIMA et al. 2001) gezeigt und für das Tollwutvirus vermutet wird (VON

BARTHELD, 2004). Für das körpereigene PrPC wurde die Möglichkeit einer axonalen

Weiterleitung berichtet (BORCHELT et al. 1994). Dies wird auch aus dem Vergleich der

Inkubationszeiten zu der geschätzten axonalen Ausbreitungsgeschwindigkeit im Maus- und

Hamsterversuch vermutet (KIMBERLIN et al. 1983, 1987; MCBRIDE et al. 2001).

Studien am Nagetiermodell weisen nach Einschränkung des axonalen Transports jedoch keine

Beeinflussung der Inkubationszeit auf (KUNZI et al. 2002; HAFEZPARAST et al. 2005;

KRATZEL et al. 2007a,b). Letztgenannte Autoren beobachteten wie schon GROSCHUP et

al. (1999) adaxonale PrPSc

-Akkumulationen zwischen der Myelinscheide und dem Axon. Für


Schwann´sche Zellen konnte in vivo die PrPC-Expression sowie die Konvertierbarkeit und die

Infektiosität dieser Zellen in vitro gezeigt werden. Sie könnten damit als Mediatoren im

Transportprozess für das pathologische Prion-Protein beteiligt sein (FOLLET et al. 2002).

Eine weitere Möglichkeit ist die „Domino“-ähnliche Konversion von PrPC zu PrP

Sc entlang

der Nerven, wie sie von GLATZEL u. AGUZZI (2000) diskutiert wurden.

Verschiedene Zellkulturmodelle zeigen eine Ausschleusung des pathologischen Prion-

Proteins in Exosomen (FEVRIER et al. 2005; VELLA et al. 2007), deren Nachweis in

Scrapie-infizierten Neuronen mittels Elektronenmikroskopie allerdings nicht erbracht werden

konnte (JEFFREY et al. 2009).

Für die Ausbreitung im ZNS kommen verschieden Mechanismen in Frage. So kann PrPSc

von

Membranen der Dendriten freigesetzt werden und sich im extrazellulären Raum zu Fibrillen

zusammenlagern (JEFFREY et al. 1994). Scrapie-infizierte Gehirne von Mäusen zeigten in

Vorläufern der extrazellulären Exosomen eine Anreicherung von PrPSc

(ARNOLD et al.

1995). Sogenannte „Tunneling nanotubes“ (TNTs) sind nanometer-dünne Membran-Kanäle,

die Zellen zu komplexen Netzwerken verknüpfen und für den interzellulären Transfer

unterschiedlicher Biomoleküle verantwortlich sind. Somit können diese Strukturen als weitere

potentielle Kandidaten für den Transfer des infektiösen Agens gehandelt werden (CAUGHEY

et al. 2009; GERDES, 2009).

2.3.4 Alternative Ausbreitungswege von PrPSc

im Körper

Über das eigentliche Vorkommen des Scrapie-Erregers im Blut hinaus (SCHMERR et al.

1999; SAA et al. 2006), konnten Transfusionsexperimente am Schaf die Infektiosität des

Blutes bereits in der präklinischen Phase der Spendertiere zeigen (HUNTER et al. 2002; SISO

et al. 2006, 2009; HOUSTON et al. 2008). Für vCJD wurde von vier bestätigten Fälle einer

Übertragung durch Transfusionen berichtet, bei denen drei Patienten darauffolgend eine

klinische Symptomatik zeigten (LLEWELYN et al. 2004; PEDEN et al. 2004;

http://www.hpa.org.uk).

Der Nachweis von PrPSc

in verschieden peripheren Geweben wird als Folge einer

hämatogenen Infektion bewertet. Beispielsweise sprechen Akkumulationen des

pathologischen Prion-Protein in den Mesenchymzellen der renalen Papille nachdrücklich für

den Befall der Niere nach Filtration des Blutes (SISO et al. 2008).


Letztgenannte Studie setzt somit das Vorliegen des infektiösen Agens als zellfreies, lösliches

Molekül im Blutplasma voraus. Unter diesen Voraussetzungen könnte eine hämatogene

Neuroinvasion über die zirkumventrikulären Organe (ZVOs) erfolgen, für die PrPSc

-

Akkumulationen unabhängig von der Inokulationsroute früh und einheitlich bei Schafen

(SISO et al. 2009) ebenso wie in retrospektiven Studien bei oral infizierten, klinisch an BSE

erkrankten Rindern (SISO et al. 2010) gezeigt werden konnte.

2.3.5 Akkumulation von PrPSc

in extraneuronalen Geweben und Ausscheidung

Die in Kap. 2.3.3.2 (s. S. 42) und 2.3.6 (s. S. 46) beschriebenen Ausbreitungswege können

auch zu PrPSc

-Akkumulationen in nicht-neuronalen Geweben führen.

Die experimentelle orale Inokulation von Hamstern und Schafen führte wie auch bei

natürlichen vorkommenden Scrapie-Fällen zum Nachweis von PrPSc

und/oder Infektiosität in

der Muskulatur, einschließlich der Zunge bei präklinischen und klinischen Tieren

(THOMZIG et al. 2003, 2004; ANDREOLETTI et al. 2004; CASALONE et al. 2005,

BALKEMA-BUSCHMANN et al. 2011). Auch bei einer BSE-Infektion konnte die

Beteiligung der Muskulatur gezeigt werden, so wurde bei Hamstern PrPSc

(THOMZIG et al.

2006) und bei Rindern Infektiosität im Musculus semitendinosus detektiert (BUSCHMANN

u. GROSCHUP, 2005).

Mit dem Nachweis infektiösen Fettgewebes bei Mäusen (RACE et al. 2008) wird eine weitere

Möglichkeit von kontaminierten Material in der humane Nahrungskette erfasst. Des Weiteren

konnte Ablagerungen in der Haut experimentell mit Scrapie infizierter Hamster und

klinischen Scrapie-Schafen nachgewiesen werden (THOMZIG et al. 2007). Wie auch bei der

Muskulatur wird ursächlich eine Infektion des Gewebes auf neuronalem Wege nach

anterograder Ausbreitung diskutiert.

Das Scrapie-Agens wurde zudem im Kolostrum und der Milch (LACROUX et al. 2008), in

der Niere (SISO et al. 2006; LIGIOS et al. 2007) sowie in der Speicheldrüse (VASCELLARI

et al. 2007) bei infizierten Schafen detektiert. KRÜGER et al. (2009) unterscheiden

nachgewiesenes PrPSc

im Kot Scrapie-infizierter Hamstern zwischen einer frühen Inokulat-

Ausscheidung (24 und 72 Stunden post infectionem) und marginalen, neu generierten Mengen

bei terminal erkrankten Tieren. In den Experimenten von SAFAR et al. (2005) ließen sich

Hamster infizieren, die Faeces inokulierter Tiere exponiert waren.


Die in verschiedenen Studien bei Scrapie gezeigte Präsens von krankheitsassoziiertem Prion-

Protein in Exkreten und Sekreten lässt auf eine horizontalen Übertragung bei Schafen

schließen, während es keine Hinweise für einen solchen Übertragungsweg bei BSE-infizierten

Rindern gibt (CURNOW u. HAU, 1996; WRATHALL et al. 2002).

2.3.6 Entzündungen und TSE

Obwohl das pathologische Prion-Protein auch in verschiedenen Organen ohne entsprechende

Entzündungsprozesse lokalisiert werden konnte (s. Kap. 2.3.5, S.45), scheinen

inflammatorische Prozesse die Darmpassage bzw. die Neuroinvasion und die Ausscheidung

von PrPSc

und/oder Infektiosität zu erleichtern.

So war bei Mäusen die Empfänglichkeit für eine Scrapie-Infektion nach einer Salmonellen-

induzierten Kolitis stark erhöht (SIGURDSON et al. 2009). Es kam zudem zu einer

schnelleren Ausbildung des terminalen Stadiums (THACKRAY et al. 2003).

Entzündungsherde im Abomasum bei Schafen wiesen Ablagerungen von PrPSc

auf

(JEFFREY et al. 2001). Dafür werden vielfältige pathogenetische Mechanismen diskutiert.

Häufig auftretende Darmerkrankungen, hervorgerufen durch Viren, Bakterien oder Parasiten,

beeinflussen die tight junctions des Darmepithels (SAKAGUCHI et al. 2001; MILLING et al.

2007) und induzieren eine gesteigerten Aufnahme von Protein-Antigenen (SODERHOLM et

al. 2004). Durch z.B. gastrointestinale Entzündungen wird die PrPC-Expression erhöht

(PAMMER et al. 2000), was eine effizientere Neuroinvasion zur Folge haben könnte

(THACKRAY et al. 2003). Weiterhin ist über die Aktivierung von DC (BROWN et al. 1999)

als Folgeerscheinung einer Darminfektion eine Beeinflussung der TSE-Pathogenese denkbar.

Der physiologische Status des Verdauungstraktes scheint somit einen Einfluss auf die

Empfänglichkeit für eine TSE-Erkrankung zu haben und könnte sich so auf die Akkumulation

bzw. Replikation des pathologischen Prion-Proteins auswirken.

Außerhalb des Verdauungstraktes wurde bei einem sCJK-Patienten mit sporadischer

Einschlusskörpermyositis beträchtliche PrPSc

-Ablagerungen in der Muskulatur gefunden

(KOVACS et al. 2004). Bei Mäusen führt eine chronische lymphozytäre Entzündung in

verschiedenen Organen zu einer Veränderung des Organtropismus; pathologisches Prion-

Protein wurde in der Niere, dem Pankreas und der Leber entdeckt (HEIKENWALKER et al.

2005). Infolge einer Nephritis kam es zur Ausscheidung von infektiösem Urin (SEEGER et


al. 2005) und bei Schafen wurde das Auftreten von PrPSc

im Euter von Tieren mit Mastitis

nachgewiesen (LIGIOS et al. 2005).

Material und Methoden 48

3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN

3.1 Tiere

3.1.1 Rinder

Am Friedrich-Loeffler-Institut wurden 2002/2003 insgesamt 74 ausschließlich weibliche

Kälber für die Pathogenesestudie eingestallt. Bei den Rindern handelte es sich um Fleckvieh-

Simmental-Kreuzungen, die aus einem ökologisch geführten Mutterkuh-Betrieb in

Mecklenburg-Vorpommern stammen.

Die Tiere waren vor dem Einstallen gegen das Bovine Parainfluenza 3-Virus, das Bovine

Respiratorische Synzytialvirus (BRSV) und das Bovine Herpesvirus-1 (BHV1) geimpft.

Das Tierversuchsvorhaben wurde unter dem Aktenzeichen LALLF M-V/TSD/7221.3-1.2-

008/07 genehmigt.

Eine Liste der ausgewählten Infektionstiere mit den zugehörigen klinischen Daten findet sich

in Tab. 3.3 (S.56).

3.1.2 Durchführung der BSE-Pathogenesestudie

3.1.2.1 Tierhaltung

Die Haltung der infizierten Rinder erfolgte in einem separaten Stallgebäude der

Sicherheitsstufe L3**. Die anfallenden Abwässer inklusive der Fäkalien aus dem Stall

wurden für vier Stunden bei 136°C autoklaviert und anschließend in der institutseigenen

Kläranlage aufbereitet. Die Tiere der Kontrollgruppe waren in einem Quarantänestall

untergebracht. Die Fütterung der Tiere erfolgte unter Aufsicht mit Heu und Heucobs, die mit

Kraftfutter und Mineralfutter supplementiert wurden. Wasser stand ad libitum zur Verfügung.

3.1.2.2 Inokulat und Inokulation

Insgesamt wurden zwischen Januar und April 2003 56 Rinder peroral mit BSE infiziert, 18

weitere Tiere dienten als negative Kontrolltiere. Am Tag der Inokulation waren die Tiere

zwischen 4 und 6 Monaten alt.


Die Infektionstiere erhielten hierzu jeweils 100g eines Hirnhomogenates über eine

Schlundsonde oral appliziert, das aus einem Pool von nachweislich BSE-positiven

Rindergehirnen aus dem Vereinigten Königreich hergestellt war. Der über eine Endpunkt-

Titration in transgenen, bovines PrPC-überexprimierenden Tgbov XV-Mäusen ermittelte

Infektionstiter des Homogenates betrug 106.1

ID pro g Gewebe (HOFFMANN et al. 2007).

Die Kontrolltieren erhielten 100g eines negativen Gehirnhomogenates.

3.1.2.3 Verhaltensstudie

Um Verhaltensaufälligkeiten bei den Tieren festzustellen, wurde alle 8 Wochen (beginnend

mit 18 Monaten nach der Inokulation) ein Verhaltenstest durchgeführt. Dabei kamen

unterschiedliche Methoden zum Einsatz, nach deren Bewertung und Auswertung der Status

der Tiere bestimmt wurde:

Status 0 - keine Anzeichen von BSE

Status 1 - möglicherweise BSE, d.h. Verhaltens- oder Sensibilitätsstörungen

treten nur gelegentlich auf

Status 2 - vermutlich BSE, d.h. Störungen treten regelmäßig (bei mindestens

zwei aufeinanderfolgenden Untersuchungen) auf oder mindestens zwei

der Tests auf Übererregbarkeit fallen positiv aus, selbst wenn sie

erstmals beobachtet werden

Status 3 - definitiv BSE, d.h. progressiver Verlauf, auch wenn nicht alle

Symptome/Verhaltens- bzw. Bewegungsstörungen nachweisbar sind

Die Kriterien für die eingesetzten Verhaltenstests befinden sich im Anhang (s. Kap. 9.2,

S.165).

3.1.2.4 Probenentnahme

Vor der Inokulation wurden Blut, Harn- und Liquor-Proben als sogenannte Nullproben

gewonnen und die Tiere danach regelmäßig beprobt (s. Tab 3.1, S.50). Die Liquorentnahme

erfolgte nach Verabreichung von 0,5-1ml Xylazin (Rompun®, Fa. Bayer-Vital, Leverkusen).

Ferner erforderte die Entnahme der Blutproben zeitweise eine Sedation.

Einen Monat nach der Inokulation beginnend, erfolgten die Sektionen in einem 4-monatigen

Rhythmus. Dazu wurden vier oder fünf zufällig ausgewählte Tiere je Sektionszeitpunkt unter

TSE-sterilen Bedingungen seziert. Von einer zufälligen Auswahl wurde abgesehen, wenn

50 Material und Methoden

Tiere eindeutige BSE-Symptomatik aufwiesen oder wenn durch andere tierschutzrelevante

Gründe ein Verbleib im Versuch nicht möglich war.

Tab. 3.1 Beprobungsintervalle für die Entnahme der Körperflüssigkeiten während der

Inkubationszeit

Probe Intervall

Blut 8 Wochen

Harn 3 dpi, 5 dpi,14 dpi*, anschließend 8 Wochen

Liquor 16 Wochen

*dpi: Tage nach der Inokulation

Das Sektionsprotokoll sah eine genau definierte Reihenfolge der Probennahme vor, um eine

Kreuzkontamination auszuschließen. Dazu wurden zunächst die Probenentnahme am Kopf,

Tierkörper und Verdauungstrakt räumlich, personell und instrumentell getrennt. Nach einer

Vorpräparation wurde jede einzelne Probe mit sterilem Einmalbesteck entnommen und in

ebenfalls sterile Einmalbehältnisse verbracht.

Die entnommenen Gewebeproben wurden, abhängig von der geplanten Verwendungs- bzw.

Detektionsmethodik, unterschiedlich behandelt. Bei paarigen Organen, bzw. Geweben

wurden die Proben der rechten Tierkörperseite in 4%ig neutral gepufferten Formalin fixiert,

während das Äquivalent der linken Körperhälfte im Rahmen der BSE-Probenbank bei -70°C

und -20°C gelagert wurde. Lagen die Proben unpaar vor, so wurden sie unter

Berücksichtigung der TSE-Sterilität in zwei Teile präpariert und entsprechend in Formalin

fixiert bzw. eingefroren.

Die weiterführenden Untersuchungen der entnommenen Proben wurden teilweise in L3**-

Laboratorien durchgeführt, die besondere Sicherheitsmaßnahmen wie das Tragen von

Schutzkleidung, separaten Laborschuhen und von Einmal-Handschuhen erforderten.

3.1.2.5 Bestandsbetreuung

Drei Monate nach der Inokulation fand eine prophylaktische Impfung der Tiere gegen

Kälberflechte statt.

Zu Beginn des Jahres 2004 zeigten drei der infizierten Tiere klinische Symptome einer

Infektion mit dem Ovinen Herpesvirus Typ 2 (OHV2)- Infektion. Diese löst bei Rindern das

Bösartige Katarrhalfieber aus, welches sich in einer perakuten Kopf-Augen-Form, einer

intestinalen Form oder einer milden Form äußern kann. Ein Tier verstarb an dieser Krankheit,


zwei andere wurden euthanasiert. Alle Rinder wurden nach dem Standardprotokoll seziert.

Durch eine umfassende Blutuntersuchung gelang bei sechs Tieren der Nachweis von Antigen,

insgesamt 27 Rinder wiesen mindestens zu einem Untersuchungszeitpunkt (8, 10, 12 14 mpi)

Antikörper gegen das OHV2 auf (s. Tab. 3.3, S.56). Die Kontrolltiere wurden dagegen

negativ getestet.

Angesichts eines Kokzidienbefalls im Darm aller Tiere fand in regelmäßigen Abständen eine

Bekämpfung der Ekto- und Endoparasiten statt.

Weitere gesundheitliche Aspekte stellten temporäre Klauenprobleme, sporadisch auftretende

Infektionen des respiratorischen Systems sowie Hämatome und Abszesse dar. Diese Probleme

konnten durch individuelle Therapien, unter Umständen durch den Einsatz von Antibiotika,

behoben werden.

3.1.3 Mäuse

3.1.3.1 Mauslinien

Mit dem Maus-Bioassay steht eine äußerst sensitive Methode zur Detektion auch geringer

Spuren von Infektiosität in den Proben zur Verfügung. Für die Versuche wurden Tgbov XV-

Mäuse verwendet, die aufgrund einer Überexpression des bovines Prion-Proteins die

Speziesbarriere zwischen Maus und Rind aufheben und sich durch eine sehr hohe

Empfänglichkeit für den BSE-Erreger auszeichnen. Die Vorteile dieser transgenen Mauslinie

im Vergleich zu konventionellen RIII-Mäusen liegen in einer 10.000fach höheren Sensitivität

und deutlich verkürzten Inkubationszeiten (BUSCHMANN u. GROSCHUP 2005). Auch im

Vergleich zum Rinder-Bioassay (HAWKINS et al. 2000) sind die Tgbov XV-Mäuse

bezüglich der Sensitivität deutlich überlegen. Diese am FLI generierten Mäuse wurden dem

Bedarf entsprechend in der Kleintierzucht des Instituts gezüchtet.

Dieser Tierversuch wurde unter dem Aktenzeichen LVL M-V/310-4/7221.3-2.1-012/03

genehmigt.

3.1.3.2 Inokulate

Aus den in der Sektion eingefrorenen und bei -70°C gelagerten Gewebe wurde für jede Probe

circa 1,5 ml steriles Inokulat mit einer Zielkonzentration von 10% hergestellt. Die dafür


benötigten repräsentativen Anteile wurden frisch präpariert, abgewogen und mit Hilfe von

Skalpell-Klingen zerkleinert. Gemeinsam mit der entsprechenden Menge steriler isotonischer

(0,9%ig) NaCl-Lösung wurde jede Probe in ein Einmal-Schraubdeckelgefäß mit

Keramikkugeln (Precellys Keramik-Set, Fa. Peqlab) gegeben. Je nach Beschaffenheit des

Gewebes waren bis zu acht Durchgänge im Ribolyser bei einer Geschwindigkeit von 6,5 und

einer Laufzeit von 45sek notwendig. Das Inokulat wurde mit einer Kanüle (0,6 x 30mm)

abgehoben und in ein steriles Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Zur Lagerung wurden die

Proben nochmals bei -20°C eingefroren. Diese wurden vor der Inokulation aufgetaut und für

zwei Minuten mit Ultraschall homogenisiert.

3.1.3.3 Durchführung des Tierversuchs

Für die Inokulation wurden männliche und weibliche Tgbov-XV-Mäuse im Alter von 8 bis 12

Wochen verwendet. Bei einer Gruppengröße von 15 Mäusen pro Gewebeprobe wurden

jeweils 30µl des Inokulates jeder Maus unter Isofluran-Kurznarkose intrazerebral verabreicht.

Von zwei Tieren aus sechs Sektionszeitpunkten zwischen 16 und 36 mpi standen für 11

Proben Inokulate bereit. Aufgrund von unzweifelhaften immunhistologischen Befunden war

für insgesamt 11 ZNS-Proben die Durchführung des Bioassays nicht notwendig. Daraus

ergibt sich die Gesamtzahl inokulierter Mäuse von 2485.

Dreimal wöchentlich wurden alle Mäuse auf das Vorhandensein klinischer Symptome

untersucht. Die folgenden Erscheinungsbilder wurden zur Beurteilung herangezogen:

Apathie

Abmagerung

Ataxie

Verhaltensauffälligkeiten

gestörtes Allgemeinbefinden,

stumpfes und gesträubtes Fell

getrübte Augen

gekrümmter Rücken

Pruritus

Tiere mit spezifischer Symptomatik wurden aus dem Versuch genommen und durch CO2-

Intoxikation euthanasiert. Des Weiteren wurden Tiere mit sonstigen Erkrankungen wie

beispielsweise fehlerhaftem Zahnwuchs oder Tumoren unter Dokumentation der


Verdachtsdiagnose ebenfalls durch CO2-Intoxikation euthanasiert. Nach maximal 700 Tagen

erfolgte die Euthanasierung aller noch im Versuch befindlichen Mäuse.

3.1.3.4 Probenentnahme

Ausgehend vom Foramen occipitale wurde der Schädel mit einer kleinen Schere an der

rechten Seite aufgeschnitten und das Gehirn heraus präpariert. Mit einem Einmalskalpell

wurde das Gehirn mit einem leicht paramedianen Sagittalschnitt, circa 2mm neben dem

Sulcus longitudinalis, von dorsal nach ventral gerade durchtrennt. Der größere Teil des

Gehirns wurde für die histologischen Untersuchungen in 4%igem, neutral gepufferten

Formalin fixiert. Der kleinere Anteil wurde für die Untersuchungen im Western Blot

verwendet und bei –20°C gelagert.

3.1.3.5 Inkubationszeiten

Die Inkubationszeit ist definiert als die Zeit von der Infektion (Inokulation) bis zum Auftreten

der ersten eindeutigen Krankheitserscheinungen. In den hier durchgeführten Versuchen wurde

jeweils der Todestag der Tiere als Ende der Inkubationszeit definiert und ungeachtet ob eine

Euthanasie wegen eindeutiger klinischer Symptome oder ein natürlicher/pathologischer Tod

eintraf als Parameter zur weiteren Berechnung verwendet. Für jede Tiergruppe einer Probe

wurden hierzu der Mittelwert und die Standardabweichung der Inkubationszeiten aller

positiven Mäuse berechnet.

Wie gezeigt werden konnte (BUSCHMANN u. GROSCHUP, 2005), liegen die

Inkubationszeiten der Tgbov XV-Mäuse nach intrazerebraler Inokulation des hochpositiven

Gehirnmaterials bei über 200 Tagen. Nimmt die Infektiosität ab, kann sich die Inkubationszeit

auf knapp 600 Tage verlängern. So wurden in diesem Versuch alle euthanasierten und tot

aufgefundenen Mäuse mit einer Inkubationszeit von ≥ 100 Tagen im Westernblot auf das

Vorhandensein von PrPSc

untersucht.

Dagegen wurden die Mäuse, die in der Zeit bis zum 100. Tag nach der Inokulation

euthanasiert oder tot aufgefunden wurden, nicht für die weiteren Untersuchungen

berücksichtigt und fanden somit keinen Eingang in die Statistik.


3.2 Probenmaterial

Die Pathogenese der BSE stand im Fokus dieser Untersuchung. Primäres Ziel war es, neue

Erkenntnisse über den Ausbreitungsweg des PrPSc

vom Darm in das ZNS als Zielorgan zu

erhalten.

Bei der Auswahl der Rinder wurde der Untersuchungszeitraum so bestimmt, dass sowohl

Tiere mit präklinischen, BSE-freiem Status bis hin zu klinischen Fällen erfasst werden

konnten. Die Auswahl fiel auf jeweils zwei Tiere pro Tötungszeitpunkt im Sektionszeitraum

von 16 bis 44 Monate p.i. (also insgesamt 16 Rinder) für die immunhistochemischen

Untersuchung, während Proben der gleichen Tiere im verkürzten Zeitraum von 16 bis 36

Monate p.i. für den Bioassay verwendet wurden.

Der Zielstellung entsprechend kamen Gewebe des zentralen und peripheren Nervensystems

sowie der ilealen Peyer´schen Platten zur Untersuchung. Im Falle der Medulla oblongata

wurde die Ebene des Obex für die Immunhistochemie verwendet, während der kaudale

Medulla-Anteil im Maus-Bioassay zum Einsatz kam.

In Tabelle 3.2 (S.55) sind die Infektionstiere, die Gewebe und die vorgenommenen

Untersuchungen aufgelistet.


Tab. 3.2 Liste der untersuchten Proben und der durchgeführten Untersuchung

IT

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IT50

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Tab. 3.3 Liste der ausgewählten Infektionstiere mit den zugehörigen klinischen Daten

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3.3. Histologische Methoden

3.3.1 Herstellung der histologischen Präparate

Für die histologischen Untersuchungen wurden in 4%igen, neutral gepufferten Formalin

fixierte Gewebeproben verwendet.

Das zugeschnittene Gewebe wurde zur Verringerung der Oberflächen-Infektiosität für eine

Stunde in Ameisensäure inkubiert und anschließend für 40 Minuten unter fließendem

Leitungswasser gespült. Im Folgenden automatisierten Schritt (ASP 300, Fa. Leica) erfolgte

die Entwässerung des Gewebes in einer aufsteigenden Alkoholreihe, dann wurde der Alkohol

durch das Intermedium Xylol entfernt und mit Paraffin durchtränkt. An der Ausgießstation

(Modell EG1140, Fa. Leica) wurden die Paraffinblöcke gegossen.

Die histologischen Schnitte wurden am Mikrotom (Rotationsmikrotom RM2145, Fa. Leica)

angefertigt.

Abb.3.1 Schematische Darstellung der in der Histologie angewendeten Schnitttechnik

Um eine möglichst hohe Durchdringtiefe zu erreichen, wurden pro Block auf fünf Ebenen

jeweils drei µm dicke Schnitte angefertigt. Zu einer Ebene zählen drei aufeinander folgende

Schnitte, zwei für die immunhistologische Untersuchung und ein Schnitt für den Einsatz bei


der HE-Färbung. Danach wurden 6 bis 8 Schnitte verworfen bzw. einzelne als Reserve

verwendet und entsprechend gekennzeichnet, d.h. es wurde ein Abstand von circa 18-24µm

zwischen den einzelnen Ebenen erreicht. Demzufolge ermöglichte diese Schnitttechnik, wie

in Abb. 3.1 (S.56) schematisch dargestellt, eine Gesamtdurchdringtiefe von 117 bis 141µm.

Auf Objektträger (IHC: Superfrost plus; HE: Superfrost; Fa. Menzel-Gläser) gezogen,

erfolgte eine Aufbewahrung der Schnitte für mindestens 48h im Wärmeschrank (Incucell, Fa.

MMM Medcenter) bei 60°C für die optimalen Haftung der Präparate.

3.3.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Nach der Entparaffinierung der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe wurden die

Schnitte für 3min in A. bidest. inkubiert. Anschließend erfolgte für 10min die Färbung in

filtrierter Hämatoxylin-Lösung. Die Schnitte wurden dann 15min durch die Inkubation mit

Leitungswasser gebläut.

Nach zweiminütiger Inkubation in 50%igem Ethanol erfolgte die Gegenfärbung der Schnitte

in Eosin für fünf Minuten. In der aufsteigenden Alkoholreihe wurden die Schnitte entwässert

und mit Entellan eingedeckt.

3.3.3 Bewertung der Hämatoxylin-Eosin-Färbung

In der Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung werden durch das Hämatoxylin alle basophilen

Strukturen blau angefärbt, insbesondere die Desoxyribonukleinsäure (DNA) der Zellkerne

und das raue endoplasmatische Retikulum (rER). Dagegen färbt Eosin als saurer Farbstoff

alle acidophilen (eosinophilen) Strukturen rot, was vor allem die Zellplasmaproteine umfasst.

So wurden die Präparate an einem Lichtmikroskop unter Verwendung von 2,5x, 10x, 20x und

40x Objektiven mit dem Ziel untersucht, morphologische Alterationen zu dokumentieren.

Durch die immunhistochemische und pathologisch-histologische Bewertung von Schnitten

der gleichen Ebene sollten mögliche Zusammenhänge zwischen morphologischen

Alterationen und PrPSc

-Ablagerungen erschlossen werden.


3.3.4 Immunhistologische Untersuchungen

Vorversuche

Zur Optimierung des Färbeergebnisses wurden Untersuchungen mit verschiedenen

Konjugaten durchgeführt. Dabei wurde die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode

(Vectastain ABC Kit Elite Standard, Fa. Vector Laboratories) dem gebrauchsfertigen

EnVision+TM

(Fa. Dako) gegenübergestellt. Es zeigte sich, dass das EnVision+TM- System

der ABC-Methode hinsichtlich Sensitivität und unspezifischen Hintergrundfärbungen deutlich

überlegen war und daher als Standardkonjugat eingesetzt wurde.

Hauptversuche

In Abhängigkeit vom verwendeten Antikörper wurden verschiedene Vorbehandlungen zur

Demaskierung der Epitope verwendet. Als erster Vorbehandlungsschritt nach der

Entparaffinierung erfolgte eine Inkubation in Ameisensäure für 15min. War eine Färbung mit

dem monoklonalen Antikörper (mab) 6C2 geplant, verlängerte sich diese Inkubationszeit auf

30min. Nach anschließenden Spülen der Objektträger unter fließendem Leitungswasser für

fünf min wurden die Schnitte, zur Blockierung der endogenen Peroxidase, für 30min in

Methanol mit 3% Wasserstoffperoxid inkubiert. Die Verwendung des mab 12F10 erforderte

einen Verdau mit Proteinase K (Fa. Roche). Dazu wurden die Schnitte in PK-Puffer fünf min

äquilibriert und anschließend bei einer Enzymendkonzentration von vier µg/ml für 15min bei

37°C inkubiert. Die Vorbehandlung für den Antikörper 6C2 beinhaltete eine

Hitzebehandlung. Demnach wurden die Objektträger in 0,1M Citratpuffer für 20min bei

121°C in einem Dampfsterilisator autoklaviert (Varioklav, Fa. Thermo Scientific).

Nach der Zusammensetzung des Coverplates® mit den Objektträgern und dem Einbringen in

die Shandon Coverplate® Kassette erfolgte mit einer Spülung mit TBS die Überprüfung des

korrekten Zusammenbaus des Systems.

Für die Standardfärbung wurde der mab 12F10 in der Verdünnung 1:150 in 10% Ziegenserum

in TBS mit 0,03% Natriumazid eingesetzt. Für den mab 6C2 wurde für die Verdünnung 1:50

das gleiche Verdünnungsmedium verwendet. Beide Antikörper wurden über einen Zeitraum

von zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Tabelle 3.6 (S.63) gibt eine Übersicht

über die eingesetzten Antikörper und die entsprechenden Konjugate.

Nach der Inkubation wurden die Schnitte dreimalig mit TBS gespült. Als Konjugat wurde

EnVision+TM

(Fa. Dako) mit einer Inkubationszeit von 30min bei Raumtemperatur

verwendet. Nach dreimaligem Spülen mit TBS wurden die Objektträger aus dem

Coverplate®

-Systems entfernt und wieder in eine Küvette verbracht.


Daraufhin erfolgte für zehn Minuten die Inkubation der Schnitte mit dem Enzymsubstrat

DAB. Nach dreimaligem Waschen in TBS und kurzem Spülen in Aqua bidest. erfolgte die

Gegenfärbung in Hämatoxylin für zehn min, anschließend wurden die Präparate 15 min unter

fließendem Leitungswasser gebläut.

Die Dehydrierung der Schnitte wurde nach der Färbeprozedur in einer aufsteigenden

Alkoholreihe durchgeführt und das Eindecken mit Entellan vorgenommen.

3.3.5 Immunhistologische Kontrollen

Der für die Immunhistochemie eingesetzte zweite Schnitt jeder Ebene wurde mit der

Antikörper-Verdünnungslösung (10% Ziegenserum in TBS mit 0,03% Natriumazid) als

Kontrolle inkubiert.

Positive Kontrollschnitte waren Gehirnschnitte aus der Routinediagnostik, die in

vorangegangenen immunhistochemische Untersuchungen eindeutig das Vorkommen von

PrPSc

zeigten. Zur Kontrolle auf unspezifischen Anfärbungen wurde ebenfalls ein

nachweislich PrPSc

-freies Gehirnpräparat mitgeführt. Für beide Schnitte erfolgte während der

immunhistologischen Untersuchung eine Behandlung sowohl mit dem entsprechenden

Antikörper als auch mit der verwendeten Antikörper- Verdünnungslösung.

3.3.6 Bewertung der immunhistologische Untersuchungen

Tab.3.4 Immunhistologischer Auswertungsindex für Proben des ZNS und VNS

1 vereinzelt positive Zellen (5-10%)

2 einzelne positive Zellen (max. 20%)

3 mehrere positive Zellen (max. 40%)

4 viele positive Zellen (max. 60%)

5 sehr viele positive Zellen (max. 80%)

6 (fast) alle Zellen positiv (80 – 100%)

max.: maximal

Alle fünf Ebenen jedes Blocks wurden mit dem Lichtmikroskop unter Verwendung von 2,5x,

10x, 20x und 40x Objektiven auf das PrPSc

- Akkumulation hin untersucht. Als positives

Bewertungskriterien galten in der Schnittebene liegende, mittel-bis dunkelbraune,

feingranuläre Reaktionsprodukte, die in den Kontrollschnitten nicht nachweisbar waren. Dazu

war ein klarer Strukturbezug notwendig.


Für die Proben des vegetativen und zentralen Nervensystems wurde die Zahl der positiven

Zellen/Strukturen gezählt bzw. geschätzt und in Prozent zur Gesamtzellzahl/Gesamtstruktur

angegeben (s. Tab. 3.4, S.60).

Für die Schnitte des Ileums wurden Befunde einerseits für die Lymphfollikel der Peyer`schen

Platten und andererseits für Anteile des enterischen Nervensystems erhoben. Tabelle 3.5 zeigt

den Auswertungsindex für die Peyer`schen Platten abhängig vom Reaktionsmuster und

Lokalisation der beobachteten Anfärbung. Das Verhältnis zwischen der Gesamtanzahl und

den positiven Follikeln wurde in der Auswertung ebenfalls berücksichtigt. Für das ENS kam

die der Auswertungsindex des ZNS und VNS (s. Tab. 3.4, S.60) zur Anwendung.

Tab. 3.5 Immunhistologischer Auswertungsindex für die Untersuchung der Peyer`schen Platten des

Ileums

0 negativ

X unvollständig angeschnittener Follikel

1 1-2 Zellen in der Light Zone positiv

2 mehrere Zellen in der Light Zone positiv

3 Makrophagen in Light/Dark Zone positiv

4 Makrophagen in Light/Dark Zone positiv, FDC schwach positiv

5 Makrophagen in Light/Dark Zone positiv, FDC deutlich positiv

FDC: Follikulär-dendritische Zellen

Als eindeutig negativ wurden Anfärbungen labortechnisch bedingter Schnittartefakte

gewertet. Dies trifft auch auf ein in den Schnitten des Ileums auftauchendes granulär

angeordnetes, braunes, oftmals zellassoziiertes Pigment (Hämosiderin) zu, das im

entsprechenden Kontrollschnitt ebenfalls nachweisbar und somit von einem echten, reaktiven

Präzipitat eindeutig abzugrenzen war.

3.4 Proteinbiochemische Methoden

3.4.1 Homogenatherstellung

Zunächst wurde aus den bei -20°C gelagerten Mäusegehirnen 500µl eines 10%igen

Hirnhomogenates hergestellt. Das abgewogene Material wurde zusammen mit dem

neunfachen Volumen (w/v) an Sucrose-DOC-NP40-Lysispuffer versetzt und in Einmal-

Schraubdeckelgefäßen mit Keramik-Kugeln (Precellys Keramik-Set, Fa. Peqlab)

homogenisiert. Dazu waren zwei Durchgängen im Ribolyser (Geschwindigkeit 6500rpm; Zeit


45sek) ausreichend. Anschließend wurden die Proben bei 6000rpm über fünf min

zentrifugiert, anschließend 200µl des Homogenates für die anschließende Fällungsreaktion in

ein Eppendorf-Reaktionsgefäß aliquotiert und der Rest bei -20°C gelagert.

3.4.2 Fällung mit Phosphorwolframsäure (PTA-Fällung)

Durch die PTA-Fällung kommt es zu einer spezifischen Anreicherung von PrPSc

(WADSWORTH et al. 2001). Phosphorwolframsäure bildet bei neutralem pH-Wert unter der

Anwesenheit von Magnesiumionen spezifische Aggregate mit PrPSc

-Molekülen, aber nicht

mit PrPC-Molekülen, aus. Durch die Zentrifugation dieser Aggregate gelingt eine

Anreicherung von PrPSc

in den entstandenen Pellets.

Für 200µl-Aliqots des Homogenates wurde ein Verdau mit 10µl Proteinase K (Fa. Roche) für

eine Stunde bei 55°C auf einem Thermoschüttler (Fa. Eppendorf) durchgeführt. Der Verdau

wurde mit 4µl PEFA-Block abgestoppt und es folgte ein Denaturierungsschritt über fünf

Minuten bei 95°C. Anschließend wurde 200µl PBS mit 4% Sarkosyl und 32µl 4%iger

Phosphorwolframsäure zugegeben und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Durch Zentrifugation

für 30min bei 13.000rpm entstand ein Pellet, das nach Abnahme des Überstandes in 20µl

zweimal Lade-Puffer aufgenommen wurde.

3.4.3 Proteinauftrennung mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese

Die Auftrennung der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE in einer Minigel-Elektrophorese-

Apparatur (BioRad, München) in einem 16%igen, 0,75mm dicken Acrylamidgel. Nach der

Denaturierung der Proben für fünf Minuten bei 95°C wurden 20μl der Ansätze in die

einzelnen Taschen des Sammelgels pipettiert und in einem 4%igen Sammel- oder Taschengel

bei 100 Volt fokussiert. Nach Eintritt in das Trenngel wurde die Spannung auf 200 Volt

erhöht, um die Proteine ihren unterschiedlichen Molekulargewichten entsprechend vollständig

aufzutrennen. Neben einem Proteinmarker (5µl) zur Ermittlung der Molekulargewichte wurde

ebenfalls eine Positivkontrolle mit bovinem PrPSc

(10μl) mitgeführt.


3.4.4 Western Blot

In einer Semi-Dry-Blotting-Apparatur (BioRad, München) wurden die Proteine auf eine

Immobilon-Transfermembran (Polyvinylpyrrolidon) übertragen, die zuvor fünf min in

Methanol aktiviert und anschließend in Blotting-Puffer äquilibriert wurde. Zwischen

mehreren Lagen ebenfalls mit Blotting-Puffer befeuchteten Whatman®

Chromatographie-

Papier erfolgte der 45 minütige Blot-Vorgang bei einer Spannung von 15 Volt und einer

Stromstärke von 0,3 Ampere pro Gel.

Anschließend wurden die freien Bindungsstellen in 5%iger Magermilch (5%

Magermilchpulver in PBST) eine Stunde abgesättigt. Die Inkubation mit dem primären

Antikörper in der entsprechenden Verdünnung (s.Tab. 3.6) erfolgte eine Stunde bei

Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C. Anschließend wurde die Membran dreimal zehn

min mit PBS-Tween gewaschen und eine Stunde mit dem zweiten Alkalische-Phosphatase-

konjugierten Antikörper (s. Tab. 3.6) versehen. Nach drei weiteren Waschschritten von

jeweils 10min wurde zweimal zwei Minuten mit Assay-Puffer inkubiert und anschließend

mittels CDP-Star entwickelt. Die Intensität der Reaktion wurde im Versa Doc®

-Imager über

einen Zeitraum von 120sek gemessen.

Tab. 3.6 Übersicht über die in der Immunhistologie und in der biochemischen Untersuchung

eingesetzten Antikörper und deren Konjugate

Methode Anti-

körper Epitop Herkunft Verdünnung Konjugat

Verdün

nung Herkunft

IHC

12F10 hu

142-160

Cayman

Chemical,

USA

1 : 150

in TBS-ZS**

EnVisionTM

- Dako,

Hamburg

6C2 bov

117-130

Jan

Langeveld,

CIDC-

Lelystad, NL

1 : 50

in TBS-ZS

Western

Blot L42

ov

145-163 r-biopharm

1:2000

in 5% MM-

PBST

Ziege anti-

Maus IgG

AP*-

gekoppelt

1:2000

in

TBST

Dianova,

Hamburg

hu: human; bov: bovin; ov: ovin; *AP: alkalische Phosphatase; **TBS-ZS: TBS in

Ziegenserum


3.4.5 Bewertung der Ergebnisse und Kontrollen

Als positives Signal wurde das eindeutige Erkennen der drei Glykosylierungsformen des

PrPSc

als Banden mit der entsprechenden molekularen Masse bewertet. In einigen Fällen war

ein Wiederholungsversuch mit einer erhöhten (bis 500µl) oder verringerten (100µl)

Probenmenge erforderlich.

Als Referenz wurde auf jedem Blot ein definitiv BSE-positives Hirnhomogenat desselben

Mausstammes sowie unbehandeltes PrPC-Hirnhomogenat mitgeführt.

65 Ergebnisse

4. ERGEBNISSE

Für jede Gewebeprobe wurden immunhistochemische und histopathologische

Untersuchungen durchgeführt und für ausgewählte Proben (16 bis 36 mpi) zusätzlich der

Bioassay. Letztere Methode ermöglicht Aussagen zur Infektiosität der Gewebeprobe,

während die Immunhistochemie den direkten Nachweis des pathologischen Prion-Proteins

erbringt.

4.1 Allgemeine Ergebnisse

4.1.1 Klinische Symptomatik

Aus den Resultaten der regelmäßigen klinischen Untersuchungsgänge ergaben sich die

Bewertungen des Krankheitsstatus der einzelnen Rinder. Diese wurden in regelmäßigen

Abständen auf eine erhöhte Sensibilität, abnorme Bewegungsabläufe und Kondition getestet

und in Kategorien von 0 (keine Symptome) bis 3 (definitive BSE-Symptomatik) eingeordnet

(s. Kap.3.1.2.3, S.48).

Abb. 4.1 Numerische Verteilung der in dieser Studie analysierten Rinder nach klinischem

Status

Über die Hälfte der Tiere (n=9) zeigten bis zu ihrer Euthanasie keine klinischen Symptome (s.

Abb. 4.1). Bei erkrankten Tieren zeigte sich in den wiederholten Untersuchungen oft eine

vielgestaltige klinische Symptomatik, die nur schwer als eindeutig für BSE anzusprechen war

(n=5). Diese Tiere reagierten vermehrt sensibel auf Geräusche, Licht und Berührungen am

Kopf und den Gliedmaßen. Weiterhin fielen Veränderungen im Verhalten sowie hinsichtlich

66 Ergebnisse

ihrer Kondition und Bewegung auf. Lediglich bei zwei Tieren war das klinische

Erscheinungsbild so eindeutig, dass sie als BSE (Status 3) eingestuft werden konnten.

4.1.2 Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung

Die Auswertung der histopathologischen Untersuchung der Obexregion ergab bei sieben

Tieren spongiforme Veränderungen, von denen zwei als verdächtig, drei als gering- und zwei

als hochgradig bewertet wurden. Eine Verdachtsdiagnose wurde aufgrund marginaler,

spongiformer Auflockerungen des Neuropils auch bei unilateralem Auftreten gestellt.

Hingegen waren bereits geringgradige Degenerationen immer bilateral lokalisiert.

Unabhängig vom Ausprägungsgrad der Erkrankung waren schon in den initialen Stadien der

DMNV, Tractus solitarii, Tractus spinalis N. Trigemini und die Nuclei olivares besonders

häufig betroffen. Beim Auftreten hochgradiger spongiformer Auflockerungen zeigten sich

entsprechende Veränderungen in allen Kerngebieten des Obex (s. Abb. 4.2, S.67).

Neben konstanten Veränderungen im Neuropil aller betroffenen Tiere traten bei drei Rindern

(IT 11, IT 49, beide 36 mpi; IT 22, 44 mpi) zusätzlich vakuoläre Degenerationen in den

Perikaryia des DMNV, der Formatio reticularis und der Nuclei olivares auf.

Beide Tiere mit hochgradigen histopathologisch erkennbaren Alterationen zeigten eine

definitive BSE-Symptomatik. Mit Ausnahme der IT 38 (44 mpi), die den Status 2 zugeordnet

wurde, gingen geringfügige spongiforme Veränderungen mit unspezifischen (IT 09 und IT 61

beide 32 mpi sowie IT 11, 36 mpi) bzw. ohne (IT 56, 40 mpi) klinisch manifestierte

Symptome einher.

Als weiterer pathologischer Befund wurde bei 12 der 16 Tiere eine Gliose diagnostiziert.

Diese trat nicht nur in Form einer diffusen rein numerischen Erhöhung der Zahl der Gliazellen

auf, sondern wies zum Teil auch sogenannte Glia-Knoten auf. Lokalisiert waren diese

Veränderungen hauptsächlich im DMNV, dem Tractus trigeminus und seltener im Nucleus

cuneatus. Die Gliose trat bei Tieren in jedem klinischem Stadium auf, vier Tiere waren dabei

unauffällig, sechs unspezifisch und zwei definitiv erkrankt.

Ergebnisse 67

Abb. 4.2 Hauptlokalisation der spongiformen Enzephalopathie in der Medulla oblongata of

Höhe des Obex; Abb. modifiziert, aus CASALONE et al. 2005

Des Weiteren fielen bei acht Tieren im Zeitraum von 24 bis 44 mpi inflammatorische

Prozesse in verschiedenen Anteilen des PNS auf. Es handelte sich dabei um fokale

geringgradige bis multifokal auftretende mittelgradige lymphohistiozytäre Ganglio-

Neuritiden. Obwohl in allen Anteilen des PNS auftretend, ließ sich eine Tendenz zugunsten

der sympathischen Anteile erkennen, da das Ggl. Stellatum (n=7), das Ggl. Coeliacum (n=6)

und die Nn. Splanchnici (n=5) besonders häufig betroffen waren. Mit einer Ausnahme (IT 58,

24 mpi) zeigten alle betroffenen Tiere sowohl PrPSc

Ablagerungen im PNS und ZNS als auch

eine klinische Symptomatik.

Allen Tieren gemein war das Auftreten einer mittelgradigen eosinophilen Enteritis im distalen

Ileum.

4.1.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen

4.1.3.1 Quantifizierung der Ergebnisse

Mittels der Immunhistochemie erfolgte der direkte Nachweis von PrPSc

und ermöglichte die

Beurteilung betroffener zellulärer Strukturen. Für die Proben des Nervensystems wurde die

Zahl der positiven Zellen gezählt bzw. geschätzt. Das Verhältnis zur

Gesamtzellzahl/Gesamtstruktur wird im Auswertungsindex der Tabelle 4.1 (S.71)

wiedergegeben. Die Quantifizierung der positiven Follikel des Ileums erfolgte im Verhältnis

68 Ergebnisse

zur Follikel-Gesamtzahl, während für das stets nur geringgradig betroffene ENS die

Lokalisation der Ablagerung im Plexus submucosus bzw. Plexus muscularis bestimmt wurde.

4.1.3.2 Lokalisation und Reaktionsmuster von PrPSc

Zentrales Nervensystem:

Initial war PrPSc

zunächst auf die Formatio reticularis bzw. den Nucleus tractus solitarii und

den Nucleus motorius nervi trigemini des Obex beschränkt. Im terminalen Stadium hingegen

traten die hochgradigen Akkumulationen von PrPSc

in allen Bereichen der Obexregion auf.

Die initialen Ablagerungen von PrPSc

in der Obexregion waren vorwiegend

zelloberflächenassoziiert diffus feingranulär im Neuropil sowie perineuronal nachweisbar.

Weiterhin waren intragliale Akkumulationen wie auch geringe intraneuronale Ablagerungen

zu beobachten (s. Abb. 4.3A). Mit fortschreitender Akkumulation nahmen alle beschriebenen

Reaktionsmuster an Stärke zu, dabei zeigten insbesondere die extrazellulären Aggregate ein

grobgranuläres bis koaleszierendes Erscheinungsbild und in einigen Arealen dominierte ein

lineares Reaktionsmuster.

Abb. 4.3 PrPSc

-Akkumulation im ZNS

(A) geringe Ablagerungen in der Formatio reticularis der Medulla oblongata (Obex, IT 61,

32 mpi), das einzelnes Neuron zeigt ein intra- und perineuronales Reaktionsmuster. (B)

moderate PrPSc

-Akkumulation sind in der Substantia intermediolateralis des lumbalen

Rückenmarkssegmentes intraneuronal (Asterisk), intraglial (Pfeil) und linear (Pfeilkopf)

nachweisbar. (IT38, 44 mpi).

Immunhistochemie, PrP mAb L42 (A) and PrP mAb 12F10 (B), Nomarski

Interferenzkontrast, Bars 50 µm

Im Rückenmark war zunächst die Substantia intermedia lateralis betroffen (s. Abb. 4.3B),

wobei sich die Ablagerungen im Verlaufe der Erkrankung zunehmend auf das Cornu dorsale,

Ergebnisse 69

das Cornu ventrale sowie auf die Substantia intermedia centralis ausbreiteten. In keinem Fall

konnte pathologisches Prion-Protein in der weißen Substanz des Rückenmarkes detektiert

werden. Die zellulären Reaktionsmuster entsprachen den in der Medulla oblongata

beschriebenen Verhältnissen.

Peripheres Nervensystem:

Abb. 4.4 PrPSc

-Akkumulationen im peripheren Nervensystem

Für das parasympathische Gewebe konnten PrPSc

-Ablagerungen (A) im N. vagus (IT 38, 44

mpi) perineuronal und im geringen Grad auch intraneuronal sowie im (B) Ggl. nodosum (IT

22, 44 mpi) ebenfalls perineuronal nachgewiesen werden. PrPSc

-Akkumulationen im

sympathischen System traten (C) hautsächlich intraneuronal im Ggl. cervicale craniale (IT

11, 36 mpi) und (D) perineuronal im Ggl. stellatum (R09/06) auf.

Die Pfeile zeigen betroffene Neurone.

Immunhistochemie, PrP mAb 12F10; Nomarski Interferenzkontrast, Bars 20µm

Ausschließlich nach ersten detektierbaren Akkumulationen im ZNS traten PrPSc

-positive

Nervenzellen vereinzelt in den Ganglien des PNS auf (s. Abb. 4.4 und Abb. 4.5, S.70). Dabei

war das Ggl. coeliacum bereits nach geringgradiger Beteiligung des ZNS konstant involviert

und wies bei insgesamt sieben Tieren PrPSc

-Akkumulationen auf. Nach hochgradigen

70 Ergebnisse

Ablagerungen im Obex waren im N. vagus von vier Rindern vereinzelte intra- und

perineuronale Reaktionsmuster detektierbar.

Die Reaktionsmuster der in allen untersuchten Anteilen des PNS stets nur vereinzelt

nachweisbaren positiven Neurone zeigten eine deutliche Übereinstimmung. Die dominanten

Ablagerungen befanden sich extrazellulär mit Assoziation zur Zellmembran (perineuronal).

Diffuse intraneuronale Akkumulationen von PrPSc

traten in geringerem Maße auf. Seltener

gelang der intrazelluläre Nachweis von granulärem PrPSc

in den Satellitenzellen, die

eigenständig oder assoziiert mit ebenfalls betroffenen Neuronen sein konnten.

Abb. 4.5 PrPSc

-Akkumulationen im peripheren Nervensystem

Die gemischtfaserigen (A) Ggl. coeliacum (IT 09, 32 mpi) und (B) Ggl. mesenteriale caudale

(IT 09, 32 mpi) weisen deutliche perineuronale als auch geringe intraneuronale

Reaktionsmuster neben einer geringgradigen Beteiligung der Satellitenzellen auf. (C) Eine

dominante Anfärbung von Satellitenzellen konnte im Ggl. trigeminale (IT 49, 36 mpi)

beobachtet werden.

Pfeile zeigen auf betroffene Neurone, Asterisken markieren die Satellitenzellen.

Immunhistochemie, PrP mAb 12F10 (A;B) und PrP mAb 6C2 (C), Nomarski

Interferenzkontrast, Bars 20µm (A;B) und 50 µm (C)

Ergebnisse 71

Eine Sonderstellung nahm das Ggl. trigeminale ein. Die Ergebnisse schienen eng mit denen

der Medulla oblongata assoziiert zu sein, da PrPSc

-Ablagerungen bereits nach geringgradiger

Akkumulation von PrPSc

im Obex nachweisbar waren. Dabei zeigten sich deutliche

Unterschiede zu den anderen untersuchten Anteilen des PNS hinsichtlich der Intensität und

des Reaktionsmusters. Zum einen zeigten bis zu 20% der Zellen im weiteren Verlauf der

Erkrankung eine positive Reaktion. Zum Anderen war ein dominantes intrazellulär-granuläres

Reaktionsmuster der Satellitenzellen dominant.

Peyer`sche Platten und Enterisches Nervensystem :

In den Peyer´schen Platten des Ileums waren in 11 der 16 untersuchten Tiere PrPSc

-

Ablagerungen nachweisbar. Assoziiert mit dem zunehmenden Lebensalter wiesen die Tiere

mit längeren Inkubationszeiten jedoch quantitativ weniger Follikel auf. So war bis 32 mpi mit

einer Ausnahme (IT46, 16 mpi) PrPSc

bei allen Tieren in den Follikeln darstellbar. Dagegen

zeigten lediglich zwei Tiere (IT 49, 36mpi; IT 56, 40 mpi) zum späten

Untersuchungszeitpunkt noch PrPSc

-Ablagerungen in den Follikeln. Die Anzahl positiver

Follikel gegenüber der Gesamtanzahl lag bei den meisten Tieren unter einem Prozent. Bei

drei Tieren fiel hingegen eine deutlich erhöhte Anzahl positiver Follikel auf. So konnte beim

Tier IT 24 (24 mpi) in 5,5% der Follikel (15/272), IT 09 (32 mpi) in 16,7% (2/12) und IT 49

(36 mpi) in 5% der Follikel (3/60) pathologische Prion-Proteine nachgewiesen werden. Die

betroffenen Follikel zeigten vorwiegend multigranuläre bis globuläre, intrazytoplasmatische

Ablagerungen in den mononukleären Zellen des Centrum germinativum, die morphologisch

als Tingible body macrophages (TBM) anzusprechen sind. Des Weiteren waren bei den

Tieren ab 16 mpi in sechs der 11 Rinder mit PrPSc

-Nachweis in den Follikeln fein-granuläre,

netzförmige Akkumulationen zu beobachten, die verstärkt 24, 32 und 36 mpi auftraten und

morphologisch den FDC zugeordnet werden können (s. Abb. 4.6, S.72).

Die Detektion des pathologischen Prion-Proteins in den Plexus des ENS gelang in acht von 16

Rindern. In keinem Fall der untersuchten Peyer’schen Platten trat jedoch eine anatomische

Assoziation zwischen PrPSc

-Ablagerungen in den Follikeln und dem ENS auf. Allerdings ging

die Steigerung der Akkumulationen im ENS mit der bei den älteren Rindern auftretenden

quantitativen Abnahme und der damit verbundenen sinkenden Anzahl positiver Follikel

einher. In der präklinischen Phase war vor allem der Plexus myentericus und erst im späteren

Verlauf der Erkrankung auch der Plexus submucosus betroffen. In den stets vereinzelt

72 Ergebnisse

betroffenen Plexus war ein intragliales, intraneuronales und/oder perineuronales

Reaktionsmuster darstellbar (s. Abb. 4.6).

Abb. 4.6 PrPSc

-Detektion im Darm.

(A). Lymphatische Follikel der Peyer´s Platten zeigen moderate Ablagerungen im Zytoplasma

sogenannter Tingible body macrophages (TBM) ebenso wie ein netzförmiges, FDC-

assoziiertes Reaktionsmuster (IT60, 20 mpi). Neurone des Enterischen Nervensystems wiesen

(B) im Plexus submucosus (IT22, 44 mpi) und (C) im the myenterischen Plexus (IT09, 32

mpi) peri- und intraneuronale als auch intragliale Reaktionsmuster auf.

Immunhistochemie PrP mAb 12F10, Nomarski Interferenzkontrast, Bars 50µm (A) und 20µm

(B, C)

Zur Verifizierung der ermittelten immunhistologischen Befunde wurde als zusätzlicher

Antikörper der mab 6C2 eingesetzt. Für alle positiven, fraglichen und zusätzlich für das Ggl.

coeliacum auch alle negativen Ergebnisse erfolgte eine Färbung frisch angefertigter Präparate.

Dabei konnten zwei zusätzliche positive Befunde im ENS und dem Ggl. trigeminale erhoben

werden.

Ergebnisse 73

4.1.4 Ergebnisse des Maus-Bioassays (Tgbov XV-Mäuse)

Die für diesen Maus-Bioassay verwendeten transgenen Tgbov XV-Mäuse überexprimieren

bovines PrPC um den Faktor 10.000 und sind damit deutlich sensitiver gegenüber einer BSE-

Infektion als andere Mauslinien. Durch diese hohe Empfänglichkeit geben sie das infektiöse

Potential (Infektiosität) einer inokulierten Gewebeprobe wieder, dessen Grad in dieser Studie

über die Transmissionsraten und die Inkubationszeiten bestimmt wurde.

Von den 12 untersuchten Rindern im Zeitraum von 16 bis 36 mpi wiesen 11 Tiere

Infektiosität im PNS und/oder ZNS auf. Die Anzahl erkrankter Mäuse/Gruppe

(Transmissionsrate) zusammen mit dem Zeitraum bis zur Ausprägung klinischer Symptome

(Inkubationszeit) war mit der Infektiosität der jeweiligen Gewebeprobe assoziiert. Bei

niedrigen Transmissionsraten wiesen die Mäuse deutlich längere Inkubationszeiten auf (292

bis 561 Tage) sowie auch eine sehr hohe Variabilität (Standardabweichung von 63 bis 100

Tage) in der Dauer bis zu erkennbaren Krankheitssymptomen. In Gruppen mit hohen

Transmissionsraten ergaben sich bei den Mäusen Inkubationszeiten von im Schnitt 332 Tagen

(mittlere Standardabweichung 39 Tage) bis zur Ausbildung der spezifischen klinischen

Symptomatik und wiesen damit auf eine starke Infektiosität des Ausgangsgewebes hin. Um

die Auswertung der erhobenen Daten zu objektivieren und zu vereinfachen, wurde daher die

Infektiosität der einzelnen Proben lediglich auf Grundlage der Transmissionsraten klassifiziert

(s. Tab.4.1).

Tab. 4.1 Auswertungsindex für Proben des ZNS und PNS

Auswertungs-

index für IHC IHC Intensität Bioassay

1 vereinzelt positive Zellen

(5-10%) geringe Intensität

≤ 20% der Mäuse erkrankt

2 einzelne positive Zellen

(11-20%)

3 mehrere positive Zellen

(21-40%) mittlere Intensität

21%- 60% der Mäuse erkrankt

4 viele positive Zellen

(41-60%)

5 sehr viele positive Zellen

(61-80%) hohe Intensität

> 61% der Mäuse erkrankt

6 (fast) alle Zellen positiv

(81 – 100%)

74 Ergebnisse

4.2 Zusammenfassende Betrachtung

4.2.1 Assoziation von Teilergebnissen

Es wurde untersucht, ob im untersuchten Material eine Assoziation zwischen dem Grad der

PrPSc

-Ablagerungen im ZNS, dem Nachweis pathomorphologischer Veränderungen und dem

Auftreten neurologischer Symptomatik bestand (s. Abb. 4.7).

Abb. 4.7 Korrelation der erhobenen Befunde; bei den Tieren ohne Klinik und spongiformer

Enzephalopathie 40 mpi handelt es sich um zwei unterschiedlich Tiere: *: IT 56, **: IT 25

Tab. 4.2 Zusammenhänge zwischen dem Grad der PrPSc

-Akkumulationen und klinischen

Status

PrPSc

Klinischer Status Anzahl der

betroffenen Tiere

ohne 0 n=6

gering 0 n=1

1 n=1

mittel bis hoch

0 n=2

1 n=1

2 n=1

3 n=2

In Tab. 4.2 wird ersichtlich, dass der Grad der PrPSc

- Ablagerung nicht mit der Ausprägung

der BSE-typischen Symptome assoziiert ist. Bei mittelgradigen PrPSc

-Ablagerungen im

Stammhirn war ein Rind (IT 56, 40 mpi) noch klinisch unauffällig, Weiterhin führten mittel-

Ergebnisse 75

bis hochgradige Akkumulationen bei zwei Rindern ebenfalls nicht immer zu einer sicheren

klinischen Diagnose (IT 09,32 mpi; IT 11, 36 mpi). Auf der anderen Seite traten auch

unspezifische Symptome bereits bei geringen Ablagerungen des pathologischen Prion-

Proteins auf (IT 61, 32 mpi). Klinische Symptome des Status 2 bzw 3 sind allerdings immer

ein Hinweis auf hohe Akkumulationen im Gehirn.

Tab. 4.3 Zusammenhänge zwischen dem Grad der PrPSc

-Akkumulationen und dem Grad der

spongiformen Enzephalopathie

PrPSc

spongiforme Enzephalopathie Anzahl der

betroffenen Tiere

ohne keine n=7

gering keine n=2

Verdacht n=1

mittel bis hoch

Verdacht n=1

geringgradig n=3

hochgradig n=2

Dagegen schien der Grad der Ablagerung des pathologischen Prion-Proteins im ZNS mit der

Ausprägung der spongiformen Enzephalopathie assoziiert zu sein (s. Tab. 4.3). Auch wenn

bei einem Tier (IT 56, 40 mpi) mittelgradige Ablagerungen nur zu einem Verdacht einer

spongiformen Enzephalopathie führen, so gehen hohe PrPSc

-Level stets mit entsprechenden

pathomorphologischen Veränderungen einher.

Tab. 4.4 Zusammenhänge zwischen dem Grad der spongiformen Enzephalopathie und dem

klinischen Status der Tiere

spongiforme Enzephalopathie Klinischer Status Anzahl der

betroffenen Tiere

keine 0 n=8

1 n=1

Verdacht 0 n=1

1 n=1

geringgradig 1 n=2

2 n=1

hochgradig 3 n=2

Es deutete sich zudem eine Assoziation zwischen dem Auftreten klinischer Symptomatik und

dem Grad der spongiformen Enzephalopathie an, da eine klinisch manifestierte BSE-

Erkrankung stets mit hochgradigen pathomorphologischen Veränderungen einherging (s. Tab.

4.4)

76 Ergebnisse

4.2.2 Strukturierung der Ergebnisse

Tab. 4.5 Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse aus der Untersuchung der Medulla

oblongata

Medulla oblongata

Monate p.i. IT-Nummer Klinischer

Status Obex

kaudale

Medulla Grad der

Beteiligung

IHC BA

16

28 0 - 0/12

- 473 (± 104)

46 0 - 0/13

- 448 (± 97)

20

50 0 - 0/10

- 476 (± 108)

60 0 - 0/13

- 464 (± 116)

24

24 0 - 1/7

gering 433

58 0 - 0/9

- 308 (± 36)

28

21 0 + 8/12

hoch (1) 337 (± 37)

52 0 - 0/8

- 420 (± 119)

32

09 0-1 +

n.d. mittel (4)

61 0-1 + 0/9

gering (1) 387 (± 129)

36

11 0-1 +

n.d. mittel (4)

49 3 +

n.d. hoch (6)

40

25 0-1 +

gering (1)

56 0 +

mittel (2-3)

44

22 3 +

mittel (4)

38 2 +

mittel (4)

n.d.: nicht durchgeführt; 8/12: Anzahl positiver Mäuse/Anzahl untersuchter Mäuse; 337±(37):

Inkubationszeit in Tagen (Standardabweichung); Blau: positives Ergebnis mittels IHC; dunkel

grau: positives Ergebnis mittles Bioassay

Für jedes Tier konnte im Verlauf der Untersuchung mindestens ein positives Ergebnis erzielt

werden, sodass grundsätzlich von einer erfolgreichen Infektion ausgegangen werden konnte.

Die mit Hilfe der Tabelle 4.1 (s. S.73) vorgenommene Quantifizierung positiver Ergebnisse

aus dem Maus-Bioassay und der IHC führt mit Bezug auf die Ergebnisse der Medulla

oblongata zur Einteilung der Tiere in drei Gruppen. Entsprechend dem Grad der PrPSc

-

Ergebnisse 77

Akkumulation bzw. der Infektiosität der Probe konnte, ohne Berücksichtigung der

Inkubationszeit, zwischen fehlender, geringer oder mittlerer/hochgradiger Beteiligung der

Medulla oblongata unterschieden werden (s. Tab. 4.5, S.76). Die quantitative Verteilung der

einzelnen Gruppen zeigt Abb. 4.8.

Abb. 4.8 Verteilung nach Zuordnung der Tiere in die Gruppen nach Grad der PrPSc

Akkumulation im Gehirn

4.3. Einzeltierergebnisse

In den folgenden Kapiteln werden die Strukturen beschrieben, bei denen ein positives

Ergebnis erzielt wurde. Untersuchte Proben mit negativen Resultaten bleiben unerwähnt.

Die Zusammenstellung der Ergebnisse aus der histopathologischen Untersuchung erfolgt in

Tabelle 4.25 (s. S.94) im Anschluss an die Besprechung der einzelnen Ergebnisse.

Da bei allen Tieren eine eosinophile Enteritis diagnostiziert wurde, wird dieser Befund bei

den einzelnen Tieren nicht wiederholt aufgeführt.

4.3.1 Ergebnisse der Tiere ohne Beteiligung der Medulla oblongata

Insgesamt sechs Tiere zwischen 16 und 28 mpi wiesen weder Ablagerungen noch Infektiosität

der Medulla oblongata auf, wobei keines der Tiere klinische Symptome zeigte. In den

Peyer´schen Platten des Ileums zeigte nur ein Tier (IT 46, 16 mpi) keine PrPSc

-Ablagerungen.

In den beteiligten Komponenten des PNS wiesen die Tiere mit Ausnahme der IT 58 (24 mpi;

negativ im PNS) geringe Infektiosität entweder im Sympathikus oder Parasympathikus auf.

78 Ergebnisse

Unabhängig davon war das gemischtfaserige Ggl. coeliacum bei vier der sechs Rinder

infektiös. Eine Besonderheit stellt Tier IT 28 dar, das bereits 16 mpi nicht nur pathologisches

Prion-Protein erstmals im ENS sondern auch geringgradige Infektiosität im Rückenmark

aufwies. Eeine Übersicht der Ergebnisse der Rinder ohne Beteiligung der Medulla oblongata

gibt Tab. 4.12 (s. S.81).

4.3.1.1 IT 28 (16 mpi)

Klinik: unauffällig (0)

PrPSc

-Detektion: Von 76 untersuchten Follikeln der Peyer´schen Platten des Ileums konnte in

einem Follikel (≙1,3%) PrPSc

-Ablagerungen bei FDC und TBM nachgewiesen werden. Im

Plexus muscularis des ENS wurden mit Hilfe des Antikörpers 6C2 zudem geringgradige

Akkumulationen an vereinzelten Neuronen und Satellitenzellen festgestellt (s. Tab. 4.6).

Maus-Bioassay: Der thorakale Rückenmarksabschnitt zeigte einen geringen Erregergehalt.

Für das sympathische Nervensystem konnte in den Nn. splanchnici geringe und dem Ggl.

cervicale craniale mittlere Transmissionsraten detektiert werden.

Histopathologische Untersuchung: Die untersuchten Gewebe zeigten keinen besonderen

Befund.

Tab. 4.6 Ergebnisübersicht IT 28, 16 mpi

Klinik 0

Diagnose o.b.B.

ZNS Ileum PNS

MO RM PP ENS GG S PS GT

IHC - - + + - - - -

BA - + - +(+) -

Verwendete Abkürzungen: MO: Medulla oblongata; RM; Rückenmark; PP: Peyer´sche

Platten; GG: gemischtfaserige Ganglien; S: Sympathikus; PS: Parasympathikus; GT: Ggl.

trigeminale, hellgrau hinterlegt: nicht durchgeführt

Ergebnisse 79

4.3.1.2 IT 46 (16 mpi)


PrPSc

-Detektion: Die immunhistologische Untersuchung erbrachte für die ausgewählten

Proben keinen positiven Befund (s. Tab. 4.7).

Maus-Bioassay: Neben einem geringen Erregergehalt im Ggl. coeliacum und dem Ggl.

cervicale craniale ließen sich in den Nn. splanchnici des sympathischen Nervensystems

mittlere Transmissionsraten feststellen.

Histopathologische Untersuchung: Es konnte eine geringgradige gemischtzellige Infiltration

der Meningen unbekannter Genese festgestellt werden, weitere untersuchte Gewebe blieben

jedoch ohne besonderen Befund.


Klinik 0

Diagnose ggr. akute eitrige Meningitis

ZNS Ileum PNS


IHC - - - - - - - -

BA - - + +(+) -




4.3.1.3 IT 50 (20 mpi)


PrPSc

-Detektion: Von 253 untersuchten Follikeln wies ein Follikel (≙ 0,4%) spezifische

PrPSc

-Ablagerungen in FDC und TBM auf (s. Tab. 4.8, S.80).

80 Ergebnisse

Maus-Bioassay: Ein geringer Erregergehalt für das gemischtfaserige Ggl. coeliacum wurde

ebenso wie eine mittlere Transmissionsrate für das parasympathische Ggl. nodosum

detektiert.

Histopathologische Untersuchung: Es wurde eine fokale geringgradige Gliose im Nucleus

cuneatus des Obex diagnostiziert.


Klinik 0

Diagnose fokale geringgradige Gliose

ZNS Ileum PNS


IHC - - + - - - - -

BA - - + - ++




4.3.1.4 IT 60 (20 mpi)


PrPSc

-Detektion: Einer von 184 untersuchten Follikeln (≙ 0,5%) war positiv für PrPSc

-

spezifische Akkumulationen an FDC und TBM (s. Tab. 4.9).


Klinik 0

Diagnose diffuse geringgradige Gliose

ZNS Ileum PNS


IHC - - + - - - - -

BA - - ++ - ++




Ergebnisse 81

Maus-Bioassay: Der Bioassay wies sowohl für das gemischtfaserige Ggl. coeliacum als auch

für den parasympathischen N. vagus (Halsteil) mittlere Erregergehalte aus.

Histopathologische Untersuchung: Im Obex dieses Tieres wurde eine diffuse geringgradige

Gliose diagnostiziert.

4.3.1.5 IT 58 (24 mpi)


PrPSc

-Detektion: Im Ileum fiel ein von 82 untersuchten Follikeln (≙ 1,2%) mit spezifischen

Ablagerungen an FDC und TBM auf (s. Tab. 4.10).

Maus-Bioassay: Der Bioassay konnte für keine der untersuchten Proben Infektiosität

nachweisen.

Histopathologische Untersuchung: Es fallen inflammatorische Prozesse in mehreren Anteilen

des PNS auf. Im Ggl. coeliacum sind geringgradige lymphohistiozytäre Infiltrationen zu

beobachten, die in den Nn. splanchnici, dem N. vagus und dem Ggl. stellatum eine

mittelgradige Ausprägung erreichen.


Klinik 0

Diagnose gering- bis mittelgradige, nichteitrige Ganglioneuritis

ZNS Ileum PNS


IHC - - + - - - - -

BA - - - - -




82 Ergebnisse

4.3.1.6 IT 52 (28 mpi)


PrPSc

-Detektion: Lediglich ein von 332 Follikel (≙ 0,3%) wies nach immunhistochemischer

Untersuchung auf die FDC beschränkte PrPSc

-Ablagerungen auf (s. Tab. 4.11).

Maus-Bioassay: Neben dem Ggl. coeliacum mit mittleren Erregergehalt ließen sich für die

sympathischen Ganglien Ggl. stellatum und Ggl. cervicale craniale geringe

Transmissionsraten feststellen.

Histopathologische Untersuchung: Das Ggl. coeliacum und Ggl. stellatum zeigten geringe,

das Ggl. cervicale craniale mittelgradige lymphohistiozytäre Infiltrationen.


Klinik 0

Diagnose gering- bis mittelgradige, nichteitrige Ganglioneuritis

ZNS Ileum PNS


IHC - - + - - - - -

BA - - ++ + -




83 Ergebnisse

Tab. 4.12 Detektion von PrPSc

/Infektiosität ohne Akkumulation in der Medulla oblongata IT

Infe

kti

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± 11

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6 (

± 10

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6 (

± 10

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± 8

6)

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4 (

± 11

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± 9

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± 3

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± 8

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± 6

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± 11

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± 7

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± 9

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± 12

4)

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± 13

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± 10

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--

-

84 Ergebnisse

4.3.2 Ergebnisse der Tiere mit geringgradiger Beteiligung der Medulla oblongata

Der geringe und damit initiale Befall des Obex konnte bei insgesamt drei Tieren entweder

durch die Detektion von PrPSc

und/oder in Form von Infektiosität nachgewiesen werden und

ging bei zwei dieser Rinder mit unspezifischen klinischen Symptomen einher. Von den drei

betroffenen Tieren war zum frühesten Zeitpunkt der kaudal an den Obex grenzende Anteil der

Medulla oblongata der IT 24 (24 mpi) infektiös, während für zwei weitere Rinder vereinzelte

PrPSc

-positive Neurone mit Beschränkung auf die Formatio reticularis (IT 61, 32 mpi) bzw.

den Nucleus tractus solitarii und den Nucleus motorius nervi trigemini (IT 25, 40 mpi)

auftraten. Für die IT 61 (32 mpi) fiel der Nachweis im Maus-Bioassay negativ aus. Ein

solcher Test wurde aufgrund der Inkubationszeit (40 mpi) beim Tier IT 25 nicht

durchgeführt.

Beim Rind IT 24 (24 mpi) konnte als einzigem Tier dieser Gruppe im Rückenmark weder

Infektiosität noch PrPSc

nachgewiesen werden. Interessanterweise wurden aber mittel- bis

hochgradigen Transmissionsraten für alle untersuchten Anteile des Sympathikus detektiert,

wohingegen die Proben des Parasympathikus in diesem Rind keine positive Befunde

aufwiesen.

Weiterhin fällt auf, dass mit der IT 25 (40 mpi) ein Tier aus der späten Inkubationsperiode

zwar nur geringe PrPSc

-Akkumulationen im Obex aufwies, diese aber bereits im Ggl.

trigeminale zu finden waren.

Bei allen Tieren war der Nachweis des pathologischen Prion-Proteins in den Peyer´schen

Platten und/oder im ENS erfolgreich.

Die Zusammenstellung der Ergebnisse der Rinder mit geringgradiger Beteiligung der Medulla

oblongata erfolgt in Tab.4.16 (s. S.86).

4.3.2.1 IT 24 (24 mpi)


PrPSc

-Detektion: Bemerkenswert ist der Nachweis von PrPSc

in den Follikeln der Peyer´schen

Platten. Von 272 Follikeln waren insgesamt 15 positiv (≙ 5.5%) und wiesen ein

Reaktionsmuster spezifisch sowohl für FDC als auch TBM auf. Im Plexus muscularis des

ENS ließen sich an vereinzelten Neuronen und Satellitenzellen geringgradige

Akkumulationen des pathologischen Prion-Proteins detektieren (s. Tab. 4.13, S 85).

Ergebnisse 85

Maus-Bioassay: Der Bioassay wies für die kaudale Medulla einen geringgradigen

Erregergehalt auf und in allen untersuchten Anteilen des sympathischen Nervensystem

wurden mittlere bis hohe Transmissionsraten detektiert.

Histopathologische Untersuchung: Der Obex wies eine geringgradige Gliose im DMNV,

Nucleus cuneatus und Tractus spinalis des N. trigeminus auf. Im Ggl. coeliacum, Ggl.

stellatum und dem N. vagus konnten geringgradige lymphohistiozytäre Infiltrationen

festgestellt werden.


Klinik 0

Diagnose diffuse geringgradige Gliose; gering- bis mittelgradige, nichteitrige Ganglioneuritis

ZNS Ileum PNS


IHC - - + + - - - -

BA + - - ++(+) -




4.3.2.2 IT 61 (32 mpi)

Klinik: unspezifisch, wiederholte Verhaltens- und Sensibilitätsanomalien (0-1)

PrPSc

-Detektion: Intra- und perineuronale PrPSc

-Ablagerungen an einer einzelnen Nervenzelle

waren in der Formatio reticularis des Obex nachweisbar.

Im Ileum wiesen zwei von 78 untersuchten Follikeln (≙ 2,6%) PrPSc

-Akkumulationen in den

FDC und in den TBM auf.

Das perineuronale Reaktionsmuster eines Neurons dokumentierte die Einbeziehung des Ggl.

coeliacum (s. Tab. 4.14, S. 86).

Maus-Bioassay: Mittels des Maus-Bioassays ließ sich ein niedriger Erregergehalt in beiden

untersuchten Rückenmarks-Abschnitten detektieren.

86 Ergebnisse

Hohe Transmissionsraten wurden für das Ggl. coeliacum ermittelt. Im Ggl. cervicale craniale

ließ sich Beteiligung des sympathischen Nervensystems durch mittlere Erregergehalte

feststellen.

Histopathologische Untersuchung: Für den Obex bestand der Verdacht einer spongiformen

Enzephalopathie im Neuropil des DMNV. In der gleichen Lokalisation war eine geringgradige

Gliose zu beobachten. Im PNS fanden sich verbreitete lymphohistiozytäre Infiltrationen, die

im Ggl. cervicale craniale und Ggl. mesenteriale caudale geringgradig und im Ggl.

coeliacum, Ggl. stellatum und den Nn. splanchnici mittelgradig ausfielen.


Klinik 0-1

Diagnose ggr. spongiforme Enzephalopathie, ggr. Gliose; ggr.- mgr., nichteitrige Ganglioneuritis

ZNS Ileum PNS


IHC + - + - + - - -

BA - + +++ ++ -




4.3.2.3 IT 25 (40 mpi)

Klinik: unspezifische, wiederholte Verhaltens- und Sensibilitätsanomalien (0-1)

PrPSc

-Detektion: Im Nucleus tractus solitarii und Nucleus motorius nervi trigemini des Obex

konnten vereinzelte PrPSc

-Akkumulationen mit einem überwiegend intraneuronalen

Reaktionsmuster nachgewiesen werden. Der immunhistochemische Nachweis von

pathologischem Prion-Protein in beiden untersuchten Anteilen des Rückenmarks beschränkte

sich auf das Vorkommen einzelner Nervenzellen der Substantia intermedia lateralis und der

Substantia intermedia centralis mit dominanten intraneuronalen Reaktionsmustern. Trotz

Untersuchung zahlreicher verschiedener Abschnitte des Ileums fanden sich insgesamt

lediglich 8 Follikel, von denen keiner spezifische Akkumulationen zeigt. Es konnten hingegen

in wenigen Lokalisationen PrPSc

-Akkumulationen in Neuronen sowohl des Plexus muscularis

als auch des Plexus submucosus des ENS nachgewiesen werden.

Ergebnisse 87

Im PNS wies das Ggl. coeliacum perineuronale PrPSc

-Ablagerungen in mehreren

Nervenzellen auf. Im Ggl. trigeminale wurden geringe Ablagerungen an zwei verschiedenen

Satellitenzellen detektiert (s. Tab. 4.15).

Maus-Bioassay: Der Bioassay wurde aufgrund des späten Sektionszeitpunktes von 40 mpi

nicht durchgeführt.

Histopathologische Untersuchung: Der Obex wies eine geringgradige Gliose in Form von

vereinzelten Glia-Knoten im DMNV auf. Geringgradige lymphohistiozytäre Infiltrationen

ließen sich im Ggl. coeliacum, Ggl. cervicale craniale und den Nn. splanchnici beobachten.


Klinik 0

Diagnose fokale ggr. Gliose; ggr.- mgr, nichteitrige Ganglioneuritis

ZNS Ileum PNS


IHC + + - + + - - +

BA




88 Ergebnisse


/Infektiosität mit geringer Akkumulation in der Medulla

oblongata IT

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89 Ergebnisse

4.3.3 Ergebnisse der Tiere mit mittel- bis hochgradiger Beteiligung der Medulla

oblongata

Insgesamt zählten sieben Tiere ab dem 28. Monat p.i. zu dieser Gruppe.

Für die IT 21 waren zwar nur geringe PrPSc

-Ablagerungen an einzelnen Neuronen des Obex

nachweisbar, allerdings gab in diesem Fall die hohe Übertragungsrate des Maus-Bioassays

den Ausschlag für die Zuordnung in diese Gruppe.

Dabei waren bei zwei Tieren (IT 21, 28 mpi; IT 56, 40 mpi) keine nachweisbaren klinischen

Symptome feststellbar. Zwei Rinder dieser Gruppe zeigten hingegen definitive Anzeichen für

eine BSE-Erkrankung (IT 49, 36 mpi; IT 22, 44 mpi). Die weiteren Rinder waren entweder

unspezifisch (IT 09, 32 mpi; IT 11, 36 mpi) oder vermutlich (IT 38, 44 mpi) an BSE erkrankt.

Der Maus-Bioassay führte in drei von vier untersuchten Tier zur Detektion von Infektiosität

im gesamten PNS mit hohen, teils maximalen Transmissionsraten. Tier IT 21 wies nur für die

Proben des Sympathikus solch hohe Übertragungsraten auf, die im Parasympathikus lediglich

geringe bis mittlere Intensität erreichten.

Erstmals gelang sporadisch der immunhistochemische Nachweis von PrPSc

in Proben des

Sympathikus und Parasympathikus, wobei vor allem der N. vagus häufiger betroffen war.

Weiterhin konnte bei allen Tieren im Ggl. trigeminale (Ausnahme IT 21) und im Rückenmark

deutliche Ablagerungen des pathologischen Prion-Proteins detektiert werden. Dieser

Nachweis war hinsichtlich des Ileums leicht in Richtung des ENS verschoben, auch weil die

absolute Anzahl der Follikel mit steigender Inkubationsdauer und dem damit einhergehenden

steigenden Alter der Tiere abnahm. Bei Rind IT 38 (44 mpi) blieb die Detektion von PrPSc

im

Ileum ganz aus.

Eine Übersicht zu den Ergebnissen von Tieren mit mittel- bis hochgradiger Beteiligung der

Medulla oblongata gibt Tab. 4.24 s. S.93).

4.3.3.1 IT 21 (28 mpi)

Die im Bioassay nachgewiesene Transmissionsrate führte anstelle des geringen PrPSc

-

Nachweises mittels IHC zur Einbeziehung dieses Tieres in diese Gruppe.

Klinik: Unauffällig (0)

90 Ergebnisse

PrPSc

-Detektion: In der immunhistochemischen Untersuchung konnte lediglich an einer

Nervenzelle perineuronale PrPSc

-Akkumulationen in der Formatio reticularis des Obex

nachgewiesen werden. In der Substantia intermedia lateralis und der Substantia intermedia

centralis beider Rückenmarksabschnitte fanden sich fokale intraneuronale Ablagerungen des

pathologischen Prion-Proteins dominant gegenüber extrazellulären Akkumulationen im

Neuropils oder in Assoziation mit der Zellmembran der Nervenzellen.

In einem von 101 untersuchten Follikel (≙ 1%) fanden sich netzartige PrPSc

-Ablagerungen,

die auf die Beteiligung der FDC hindeuten (s. Tab. 4.17).

Bioassay: Für die kaudalen Abschnitte der Medulla oblongata wurde ein hoher BSE-

Erregergehalt detektiert.

Mit genau 60% TSE-positiver Mäuse wies der Bioassay für das Ggl. stellatum Infektiosität

mittlerer Intensität auf, während das Ggl. cervicale craniale und die Nn. splanchnici mit

hohen Transmissionsraten die umfangreiche Ausbreitung im sympathischen Nervensystem

dokumentieren.

Das parasympathische System war geringgradig im N. vagus und mit mittleren

Transmissionsraten im Ggl. nodosum involviert.

Histopathologische Untersuchung: Eine geringgradige Gliose trat im DMNV, Nucleus

cuneatus und der Formatio reticularis auf, in der letztgenannten Lokalisation in Form von

Glia-Knoten. Im Ggl. coeliacum, Ggl. stellatum und dem N. vagus konnten geringgradige

lymphohistiozytäre Infiltrationen beobachtet werden.


Klinik 0

Diagnose diffuse ggr. Gliose; gering- bis mittelgradige, nichteitrige Ganglioneuritis

ZNS Ileum PNS


IHC + + + - - - - -

BA ++ - ++(+) +(+)




Ergebnisse 91

4.3.3.2 Zusammenfassung der weiteren Ergebnisse

Bei den Tieren mit mittlerer oder starker Beteiligung der Medulla oblongata handelte es sich

um die IT 09, IT 11, IT 49, IT 56, IT 22 und IT 38. Der Sektionszeitpunkt dieser Rinder

variierte zwischen 32 und 44 mpi. Dabei trat bei den einzelnen Rindern eine höchst

unterschiedliche klinische Ausprägung auf. Diese reichte von Symptomfreiheit (IT 56) über

ein unspezifisches Krankheitsbild (IT 09 und IT 11) bis hin zu definitiven BSE-Erkrankungen

(IT 49 und IT 22).

PrPSc

-Detektion: In den untersuchten Anteilen des ZNS waren bei allen Tieren die PrPSc

-

Akkumulationen bzw. Erregergehalte mindestens mittleren Grades nachweisbar. In der

Obexregion fanden sich in sämtlichen Kerngebieten intra- und perineuronale sowie intragliale

Reaktionsmuster. Die extrazelluläre Ablagerungen des Neuropils traten weitverbreitet diffus

fein-bis grobgranulär bis hin zu koaleszierend auf und zeigten sich je nach Kerngebiet auch

deutlich als lineare Akkumulationen. Die Reaktionsmuster der grauen Substanz des

Rückenmarks waren mit denen des Obex vergleichbar, stimmten aber nicht zwangsläufig mit

deren Grad der Intensität überein. Die weiße Substanz des Rückenmarks zeigte keine PrPSc

-

Ablagerungen.

Im Vergleich zu den jüngeren Tieren nahm die Zahl auswertbarer Follikel im Ileum deutlich

ab. In nur drei der sechs Tiere konnten FDC-spezifische PrPSc

-Ablagerungen mit einer

Häufigkeit von 0,8 bis 16,7% detektiert werden. In fünf der sechs Fälle war das ENS

betroffen, wobei bei drei Tieren Akkumulationen parallel in Follikeln und ENS auftraten.

PrPSc

ließ sich multifokal in wenigen vereinzelten Neuronen mit perineuronalen

Reaktionsmustern nachweisen. Obwohl beide Plexus involviert waren, gelang die Detektion

positiver Nervenzellen im muskulären Plexus häufiger.

Im PNS gestaltete sich die Detektion des pathologischen Prion-Proteins uneinheitlich. Konnte

durch die immunhistochemische Untersuchung ein positiver Befund erhoben werden, zeigten

sich stets vereinzelte Neurone mit perineuronalen Reaktionsmuster. Seltener konnte auch eine

intraneuronale und intragliale Akkumulation beobachtet werden. Am häufigsten wurde der

Nachweis für das Ggl. coeliacum geführt (5/6), aber auch der parasympathische N. vagus war

in vier Fällen positiv. Im sympathischen System konnte lediglich einmal PrPSc

im Ggl.

cervicale craniale (IT 11) nachgewiesen werden.

Das Ggl. trigeminale zeigte bei allen Tieren dieser Gruppe hauptsächlich in den

Satellitenzellen spezifische intragliale diffus-granuläre oder verdichtete PrPSc

-Ablagerungen.

92 Ergebnisse

Weiterhin zeigten in deutlich geringerem Ausmaß Neurone extra- und intrazelluläre

Akkumulationen. Insgesamt waren bis zu 20% der vorhandenen Zellpopulationen betroffen

(s. Tab. 4.18; s. Tab. 4.19, 4.20, 4.21, S.93; s. Tab. 4.22, 4.23, S. 94).

Maus-Bioassay: Die eindeutigen IHC-Befunde führten für die Tiere bis 36 mpi (IT 09, IT 11,

IT 49) zur Restriktion des BA auf die Proben des PNS. Alle untersuchten sympathischen und

parasympathischen Gewebe wiesen eine mittlere bis hohe BSE-Erregergehalte auf, wobei

mehrmals 100%ige Transmissionsraten auftraten.

Der Bioassay wurde für die Tiere der Sektionszeitpunkte 40 und 44 mpi nicht durchgeführt.

Histopathologische Untersuchung: Die Befunde der histopathologischen Untersuchung

gestalteten sich uneinheitlich. In der Obexregion konnte für alle untersuchten Tiere die

Diagnose einer diffusen geringgradigen Gliose und einer spongiforme Enzephalopathie von

geringem bis hohem Grad gestellt werden. Die spongiformen Veränderungen traten häufig im

DMNV, Tractus solitarii, dem Nucleus cuneatus und dem Tractus spinalis des N. trigeminus

auf und fanden sich hochgradig und weitverbreitet in den Kerngebieten des Obex.

Gering- bis mittelgradige lymphohistiozytäre Infiltrationen im PNS fanden sich nur in den

sympathischen Proben zweier Rinder (IT 09 und IT 38).


Klinik 0-1

Diagnose ggr. spongiforme Enzephalopathie; ggr.- mgr. nichteitrige Ganglioneuritis im Sympathikus

ZNS Ileum PNS


IHC ++ +++ + + + - + +

BA +++ +++ +++




Ergebnisse 93


Klinik 0-1

Diagnose ggr. spongiforme Enzephalopathie

ZNS Ileum PNS


IHC ++ +++ - + + + - +

BA +++ +++ +++





Klinik 3

Diagnose hgr. spongiforme Enzephalopathie

ZNS Ileum PNS


IHC +++ +++ + + + - - +

BA +++ +++ +++





Klinik 0

Diagnose ggr. Gliose; ggr. spongiforme Enzephalopathie

ZNS Ileum PNS


IHC ++ ++ + + + - + +

BA




94 Ergebnisse


Klinik 3

Diagnose ggr. Gliose; hgr. spongiforme Enzephalopathie

ZNS Ileum PNS


IHC ++ +++ - + + - + +

BA





Klinik 2

Diagnose fokale ggr. Gliose; ggr. nichteitrige Ganglioneuritis

ZNS Ileum PNS


IHC ++ ++ - - + - + +

BA




95 Ergebnisse


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96 Ergebnisse

Tab. 4.25 Zusammenfassende Darstellung der histopathologischen Ergebnisse aller

untersuchten Tiere

Ergebnisse 97

4.4 Natürlich infiziertes Rind (R09/06)

Im Obex dieses Rindes ließ sich in hohem Grad das pathologische Prion-Protein in allen

Kerngebieten nachweisen. Intra- und perineuronale Akkumulationen der Nervenzellen sowie

fein- bis grobgranuläre Ablagerungen im Neuropil waren wie bei den experimentell

inokulierten Tieren die häufigsten Reaktionsmuster. Die Proben des Ileums wiesen eine

fortgeschrittene Autolyse auf, die ein Ansprechen der einzelnen Strukturen erschwerte. So

konnte mittels immunhistochemischer Anfärbung weder für die Follikel der Peyer’schen

Platten noch für das ENS ein eindeutig positives Ergebnis erzielt werden. In vereinzelten

Neuronen des Ggl. coeliacum, der sympathischen Ganglien (Ggl. stellatum, Ggl. cervicale

craniale) und des N. vagus konnte PrPSc

in Form des PNS-typischen perineuronalen

Reaktionsmusters detektiert werden. Für das Ggl. trigeminale wurden ebenfalls eindeutige

spezifische PrPSc

-Ablagerungen hauptsächlich in den Satellitenzellen beobachtet. Weitere für

diesen Versuch relevante Proben standen nicht zur Verfügung.

98 Zusammenfassung

5. DISKUSSION

5.1 Ziel der Arbeit

Ziel dieser Arbeit war es, mittels der im Rahmen der deutschen BSE-Pathogenesestudie

gewonnenen Daten und Materialien nach oraler experimenteller den Ausbreitungsweg des

pathologischen Prion-Proteins (PrPSc

) in der präklinischen und klinischen Phase der

Erkrankung aufzuklären. Dafür wurden repräsentative Gewebe vorwiegend aus dem

peripheren Nervensystem auf Infektiosität über den Maus-Bioassay als auch auf PrPSc

-

Ablagerungen in den Proben untersucht.

5.2 Kritische Betrachtung des Untersuchungsmaterials

Das bei der Infektion verwendete infektiöse Hirnhomogenat stammte von englischen an BSE

erkrankten Rindern. Das Homogenat zeigte im SAF-Immunoblot ein für klassische BSE

typisches Glykosylierungs-Profil und wies einen Infektionstiter von 106.1

infektiösen Dosen

(ID) pro g Gewebe auf (HOFFMANN et al, 2007).

Jedes Rind erhielt oral die einmalige Dosis von 100g Inokulat unter der Verwendung einer

Schlundsonde. Die experimentelle Applikation dieser hohen Infektionsdosis soll die

Reproduzierbarkeit und Auswertbarkeit der Infektion verbessern, ist aber wesentlich höher als

die geschätzte natürliche Infektionsdosis von 0,1 bis 1g (WELLS et al. 2007) unter

Feldbedingungen. Deutlich wird dies z.B. durch die wesentlich kürzere Inkubationszeit nach

experimenteller Infektion (ARNOLD et al. 2007). Da jedoch in vorangegangenen Studien

beim Rind äquivalente Dosen eingesetzt wurden (ARNOLD et al. 2007; ESPINOSA et al.

2007; MASUJIN et al. 2007; WELLS et al. 2007), sind die Resultate der vorliegenden Studie

mit denen aus der aktuellen Literatur bekannten Ergebnissen vergleichbar.

Um experimentelle Artefakte z.B. durch Kontaminationen, zu vermeiden, wurde die Sektion

der Rinder nach einem klar definierten Ablauf durchgeführt. So wurden für die

Probenentnahme Einmal-Präparationsbestecke verwendet und die Entnahmen der einzelnen,

unterschiedlich infektiösen Organsysteme, wie beispielsweise Darm und ZNS, räumlich und

personell strikt voneinander getrennt. Ähnlich sorgsame Vorkehrungen wurden später auch

bei der Präparation der Mäusegehirne angewandt.

Diskussion 99

Bisherige Studien wiesen, wenn überhaupt, Ablagerung des PrPSc

nur sehr geringgradig im

PNS BSE- infizierter Tiere nach (ARNOLD et al. 2007; ESPINOSA et al. 2007;

HOFFMANN et al. 2007; MASUJIN et al. 2007). Um eine repräsentative Untersuchung der

Gewebe sicherzustellen, wurden daher bei mindestens 3 Paraffin-Blöcken jeder Probe jeweils

5 Ebenen getestet. Jede Ebene umfasste 5 sukzessive Schnitte und somit eine Tiefe von 15-

25µm. Somit standen Schnitte aus einer Gesamt-Durchdringtiefe von 150-200µm pro Block

für die immunhistochemische und histopathologische Untersuchung zur Verfügung. Der

Anteil der untersuchten Strukturen konnte dadurch deutlich erweitert werden. Frisch

angefertigte Präparate für alle fraglichen Ergebnisse und alle Proben des Ggl. coeliacum und

des Ileums wurden mit einem zweiten Antikörper (6C2) nachuntersucht.

Die verwendete transgene Mauslinie (Tgbov XV) ist hochsensitiv für bereits äußerst geringe

Erregergehalte, da sie das bovine Prion-Protein um den Faktor 10.000 überexprimiert. Eine

spontane, Inokulat-unabhängige Konversion des zellulären Prion-Proteins konnte

ausgeschlossen werden, da diese Mauslinie uninfiziert auch nach über 700 Tagen keine

klinische Erkrankung und kein neu generiertes PrPSc

aufwies (BUSCHMANN u.

GROSCHUP, 2005).

Abhängig von der Untersuchungsmethodik sind Infektiosität und PrPSc

-Ablagerungen als

Parameter für eine BSE-Infektion voneinander abzugrenzen. Der Maus-Bioassay bestimmt

das infektiöse Potential des Ausgangsgewebes über dessen Fähigkeit, in hochempfänglichen

Mäusen BSE zu induzieren. Dagegen weist die IHC direkt die PK-resistente pathologische

Isoform des Prion-Proteins nach. Beobachtungen an Scrapie-infizierten Hamstern (BEEKES

et al. 1996) unterstützten die Prion-Hypothese, in der PrPSc

als alleiniges Pathogen infektiös

ist (PRUSINER et al. 1982, 1987, 1991). Andere Studien wiesen allerdings Infektiosität auch

in Geweben ohne entsprechende Ablagerungen des pathologischen Prion-Proteins nach

(CZUB et al. 1988; BALKEMA-BUSCHMANN et al. 2011).

In der vorliegenden Untersuchung wurden positive Ergebnisse überwiegend mit dem Maus-

Bioassay erzielt, dem lediglich ein einziger Nachweis von PrPSc

ohne Infektiosität (Medulla

oblongata, IT 61, 32 mpi) gegenüberstand. Wies eine Probe gleichzeitig beide BSE-

assoziierte Parameter auf, gingen geringgradige PrPSc

-Akkumulationen in der Regel mit

einem mittel- bis hochgradigen Erregergehalt einher.

Die deutlich höhere Sensitivität des Maus-Bioassays ist hierfür die wahrscheinlichste

Erklärung. Die durchgeführten Untersuchungen basierten jedoch stets auf Stichproben, sodass

negative Befunde auch durch Beprobungsartefakte bedingt sein können.

100 Zusammenfassung

5.3 Allgemeine Betrachtungen

Für das BSE-Agens ist bekannt, dass lediglich die Peyer´schen Platten des Dünndarms und

die Tonsille als lymphatische Komponenten betroffen sind (TERRY et al. 2003; WELLS et

al. 2005; ESPINOSA et al. 2007; HOFFMANN et al. 2011). Darüber hinaus besteht eine

Restriktion auf das Nervensystem (BUSCHMANN u. GROSCHUP, 2005). PrPSc

-

Ablagerungen im Obex und dem Rückenmark lassen eine Ausbreitung des Agens über die

Strukturen des PNS vermuten, wobei wahrscheinlich beim Rind sowohl sympathische als

auch parasympathische Nerven beteiligt sind (HOFFMANN et al. 2007). Welche Strukturen

zu welchem Zeitpunkt involviert sind, konnten die bis dato durchgeführten Studien allerdings

nicht zweifelsfrei bestimmen.

5.3.1 Ergebnisüberblick

Von den 16 ausgewählten mit BSE-Material inokulierten Rindern wiesen alle Tiere PrPSc

und/oder Infektiosität in mindestens einer der 12 untersuchten Gewebe auf. Die ilealen

Peyer`schen Platten waren bei 13 Rindern betroffen und lassen diesen Abschnitt des Darms

als primären Eintrittsstelle des Erregers vermuten. Die Ergebnisse deuten allerdings auf einen

direkten Kontakt des pathologischen Prion-Proteins mit den im Darm lokalisierten Nerven als

Ausgangspunkt für eine weitere Ausbreitung im PNS hin. Die Ausbreitung erfolgt dann vor

allem über autonome Fasern, wobei ein Schwerpunkt auf den sympathischen Strukturen zu

liegen scheint.

Die Nachweise bzw. unterschiedlichen Nachweisintensitäten im ZNS traten bei den einzelnen

Rindern zu mitunter höchst unterschiedlichen Zeitpunkten auf. Daher wurden die Ergebnisse

nicht strikt nach den Inkubationszeiten zusammengefasst, sondern anhand der Ergebnisse im

Obex. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf den sechs Tieren, die negative Befunde in der

Medulla oblongata aufwiesen. Dadurch ließen sich zuverlässige Rückschlüsse auf die

zentripetale Ausbreitung im PNS ziehen, da eine zentrifugale Migration des Agens vom ZNS

aus in diesen Fällen äußerst unwahrscheinlich ist.

Diskussion 101

5.3.2 Dosis, Inkubationszeiten und klinische Symptomatik

Bei der oralen Verabreichung von 1 mg bis 100 g BSE-Homogenat wurde bei Rindern eine

deutliche Dosis-Wirkungsbeziehung hinsichtlich der Inkubationsdauer und dem

Infektionserfolg beobachtet. Schätzungen zufolge liegt die mittlere Inkubationszeit im Feld

bei 5 bis 5,5 Jahren (ARNOLD u. WILESMITH 2004), der vermutlich eine natürliche Dosis

zwischen 0.1g und 1g zugrunde liegt (WELLS et al. 2007). Hohe oral inokulierte Dosen

lassen daher Auswirkungen auf die Transmissionsrate und auf die Länge der Inkubationszeit

erwarten. So beschrieben WELLS et al. (2007) bei einer Dosis von 100g eine

Transmissionsrate von 100%, die auch bei der deutschen BSE-Pathogenesestudie erreicht

wurde. Davon zeugte neben positiven Ergebnissen in mindestens einer der untersuchten

Körperproben auch der Nachweis von Infektiosität bzw. PrPSc

im Darm bei 41 von 46 Tieren

der FLI-Studie (HOFFMANN et al. 2011).

Eine weitere Dosis-Wirkungsbeziehung besteht für den Zeitpunkt der Detektion des

pathologischen Prion-Proteins vor dem Einsetzen klinischer Symptome. Nach Berechnungen

von ARNOLD et al. (2007) war PrPSc

im Obex bei 50% der Tiere, die 100g Inokulat

erhielten, neun Monate vor dem Auftreten einer definitiven Symptomatik nachweisbar.

Wurde lediglich 1g Homogenat verabreicht, verringert sich dieser Zeitraum auf 1,7 Monate.

Diese von Arnold et al. (2007) berechneten Korrelationen waren auch in der FLI-Studie

zutreffend. Die Detektion von PrPSc

bzw. von Infektiosität im Hirnstamm erfolgte acht (28

mpi, IT 21) bzw. 12 Monate (IT 24, 24 mpi) vor den ersten eindeutigen klinischen

Symptomen (36 mpi, IT 49).

Die offensichtlichen Unterschiede sowohl zwischen den einzelnen Pathogenese-Studien als

auch innerhalb der hier untersuchten Tiergruppe sind am ehesten durch eine hohe biologische

Varianz zwischen den einzelnen Tieren erklärbar. Bei einer Dosis von 100g liegt die

Zeitspanne für das Auftreten klinischer Symptome in der Studie von WELLS et al. (2007)

zwischen 31-60 mpi, bei ARNOLD et al. (2007) bei 35-59 mpi und in der FLI-Studie

zwischen 32 und 54 mpi. Diese Varianz verdeutlicht, dass sich die Rinder nicht anhand der

Inkubationszeiten vergleichen ließen. Dieser Tatsache wurde in der eigenen Studie Rechnung

getragen, indem die Ergebnisse der Medulla oblongata als Grundlage für die Einordnung in

eine der drei Gruppen dienten (kein Nachweis, geringer Nachweis, mittel- bis hochgradiger

Nachweis). So konnten die weiteren Resultate aus dem PNS, Rückenmark und Darm von

Tieren des gleichen Inkubationsstatus vergleichend betrachtet werden.

102 Zusammenfassung

Für die immer noch unterschiedlichen Resultate ist neben den individuellen Schwankungen

der einzelnen Rinder die unterschiedliche effektive Dosis der Homogenate bei identisch

verabreichten Mengen von 100g in Betracht zu ziehen. So basierten die oralen Inokulationen

bei den in Großbritannien durchgeführten Experimenten und bei der deutschen

Pathogenesestudie zwar auf ähnlichen Dosen (VLA: 103.10

- 103.5

i.c./i.p. ID50 x g-1

[WELLS

et al. 1996; ARNOLD et al. 2007; MASUJIN et al. 2007]; FLI: 106.1

ID50 x g-1

). Ein direkter

Vergleich der Infektiosität der verwendeten Homogenate ist jedoch aufgrund der

unterschiedlichen für die Titerbestimmung eingesetzten Mauslinien (VLA: RIII; FLI: Tgbov

XV) nur bedingt möglich. Dies wird besonders bei der Gegenüberstellung der Ergebnisse

unter Verwendung desselben Inokulates deutlich (BUSCHMANN u. GROSCHUP 2005). Die

Unterschiede hinsichtlich der Sensitivität des Maus-Bioassays werden sowohl durch höhere

Transmissionsraten (Hirnstamm: 7/15 für RIII; 14/14 für Tgbov XV) als auch verkürzte

Inkubationszeiten (Hirnstamm: 394d für RIII; 208d für Tgbov XV) offensichtlich.

Rasse-und Genotyp-spezifische Effekte bei den Rindern wurden bisher noch nicht

beschrieben (WELLS u. SIMMONS 1996), sind aber als weitere mögliche Co-Faktoren

dennoch nicht vollständig auszuschließen.

5.3.3 Zusammenhänge von erhobenen Befunden

In vorangegangenen Publikationen wurde bereits versucht, Zusammenhänge zwischen der

PrPSc

-Detektion im Gehirn, der vakuolären Degeneration und klinischen Symptomen

herzustellen. Besonders ausführlich diskutierten JEFFREY u. GONZALES (2007) mögliche

Korrelationen für Ergebnisse bei Scrapie, eindeutige Erkenntnisse konnten dabei aber nicht

gewonnen werden.

Eine histopathologisch nachweisbare spongiforme Enzephalopathie konnte eindeutig bei fünf

der 16 hier untersuchten Tiere und bei zwei weiteren Tieren ansatzweise nachgewiesen

werden. Bei all diesen Tieren waren PrPSc

-Akkumulationen nachweisbar, sodass ein

neurotoxischer Einfluss des pathologischen Prion-Proteins möglich erscheint. Morphologisch-

funktionelle, aber auch molekularbiologische Methoden könnten in Zukunft bei der

Ermittlung eines Zusammenhanges zwischen PrPSc

-Ablagerungen und den spongiformen

Auflockerungen hilfreich sein.

Auch im eigenen Untersuchungsgut zeigte das Auftreten klinischer Symptome weder mit

PrPSc

-Ablagerungen noch dem Auftreten spongiformer Veränderungen klare

Diskussion 103

Zusammenhänge. Insbesondere bei der Einschätzung des klinischen Status sind die

subjektiven Einflüsse unterschiedlichen Arbeitsgruppen zu beachten. Obgleich die Parameter

für die Bestimmung der Klinik ähnlich waren, so gestaltete sich die Bestimmung

abweichender Verhaltensweisen insbesondere im frühen Stadium äußerst schwierig.

Die fehlende Korrelation zwischen den verschiedenen Parametern verdeutlicht, dass die

Kenntnisse über die Mechanismen der entscheidenden pathologischen Manifestation einer

BSE-Erkrankung weiterhin fehlen. Die neueste Pathogenesestudie an der VLA (ARNOLD et

al. 2007) scheint aufgrund ihrer hohen Tierzahl geeignet, hierzu weiterführende Erkenntnisse

zu gewinnen.

5.3.4 Vergleich von Feldinfektion vs. experimentelle Studie

Mit der immunhistologischen Untersuchung eines natürlichen BSE-Falls konnte ein Vergleich

zum Reaktionsmuster der experimentell infizierten Rinder gezogen werden. Geboren im März

2000 war das dieses Tier zum Zeitpunkt der Euthanasie 6 Jahre alt und gelangte als klinischer

Verdachtsfall R09/06 zur Untersuchung an das FLI.

Bereits in den Studien von WELLS et al. (2007) wiesen Feldinfektionen und Versuchstiere

nahezu identische PrPSc

-Reaktionsmuster auf. Und so ließen sich auch bei der R09/06 die

gleichartigen Akkumulationen in den vorliegenden Proben des zentralen und peripheren

Nervensystems detektieren. Dabei blieb in Übereinstimmung mit den Daten von TERRY et

al. (2003) ein Nachweis von PrPSc

im Darm aus, möglicherweise bedingt durch die

fortgeschrittenen autolytischen Prozesse. Bei der Verwendung der hohen Dosis in den

experimentellen Studien scheint sich die Ausbreitung des pathologischen Prion-Proteins

allerdings zu beschleunigen (s. Kap 2.3.1, S.37). Vergleichbare Reaktionsmuster legen jedoch

eine enge Beziehung in Bezug auf die in die Pathogenese involvierten Nerven und Ganglien

des PNS zwischen der natürlichen und experimentellen Infektion nahe.

104 Zusammenfassung

5.4. Pathogenese der BSE

5.4.1 Rolle des lymphatischen Systems

Vorherige Studien zeigten, dass von einer weitgehenden Restriktion des BSE-Agens auf das

Nervensystem auszugehen ist (BUSCHMANN u. GROSCHUP, 2005) und dass das

lymphoretikuläre System bis auf wenige Ausnahmen nicht in die Erregerausbreitung

involviert zu sein scheint. So konnte für BSE beim Rind Infektiosität im lymphatischen

System bisher lediglich in der Tonsille (WELLS et al. 2005; ESPINOSA et al. 2007) und den

Peyer‘schen Platten des Jejunums, Ileums und Ileozäkal-Einganges (HOFFMANN et al.

2011) detektiert werden. Entsprechende PrPSc

-Ablagerungen waren zudem in den

lymphatischen Einrichtungen von Jejunum (STACK et al. 2011), Ileum (TERRY et al. 2003;

HOFFMANN et al. 2011) und Kolon (OKADA et al. 2010) nachweisbar. Als die

wahrscheinlichsten Eintrittsorte für den Erreger wurden in der hier vorliegenden Studie somit

nur die Peyer`schen Platten des distalen Ileums berücksichtigt.

Während der PrPSc

-Nachweis bei Scrapie im Schaf bereits nach 30 Tagen p.i. in den

Peyer’schen Platten des distalen Ileums erfolgte (JEFFREY et al. 2006; RYDER et al. 2009),

war diese Zeitspanne beim Rind deutlich länger. Ein erster Nachweis des pathologischen

Prion-Proteins in den darmassoziierten Lymphfollikeln gelang bei experimentell (mit 100g

Inokulat) infizierten Rindern ab dem vierten mpi (HOFFMANN et al. 2011, STACK et al.

2011), gefolgt von beständigen Ablagerungen bis zum 44./45. mpi. Der in der deutschen

BSE-Pathogenese-Studie beobachtete deutliche Peak positiver Follikel 12 und 24 mpi (im

geringeren Ausmaß auch bei 36 mpi) (HOFFMANN et al. 2011), wurde als Verschiebung des

Gleichgewichtes zwischen Akkumulation und Abbau zugunsten der Akkumulation gedeutet

und konnte in der britischen Studie nicht gezeigt werden (STACK et al. 2011). Die eigenen

Ergebnisse waren Teil der erwähnten deutschen Publikation und ergaben bei den meisten

(11/16) Tieren nur in vereinzelten Follikeln ein positives Ergebnis. Lediglich drei Tiere (24

mpi, 32 mpi, 36 mpi) wiesen einen deutlich erhöhten Anteil positiver Follikel zwischen 5%

und 16,7% auf. Die Ursache dafür bleibt unklar, eine lokal begrenzte Aufnahme der Prion-

Erreger aus dem Darmtrakt ist dabei ebenso möglich wie ein bestehendes Gleichgewicht

zwischen Akkumulation und Abbau. Auch eine Akkumulation unterhalb der

Sensitivitätsgrenze der immunhistologischen Untersuchung ist denkbar, obwohl die

Ergebnisse von HOFFMANN et al. (2011) im Bereich des Ileums keine wesentlichen

Unterschiede zwischen Maus-Bioassay und IHC aufwiesen.

Diskussion 105

Wie auch bei den älteren Tieren in der hier vorgelegten Studie ließen auch alle vorherigen

Untersuchungen eine Abnahme der Gesamtzahl untersuchter Follikel im Verlauf des

Versuchs erkennen. Dieses Phänomen ist durch die altersabhängige physiologische Involution

dieser lokalen lymphatischen Komponente erklärbar (DEFAWEUX et al. 2007).

Interessanterweise steht dem bis zu einem gewissen Punkt ein erhöhter Anteil an PrPSc

-

positiven Follikeln gegenüber. Dieser stellte sich in der Studie am FLI als bereits erwähnte

Peaks dar (HOFFMANN et al. 2011). Allerdings war in den Untersuchungen des britischen

VLA-Experiments (STACK et al. 2011) ein eher stetiger Anstieg zu beobachten. In der

späten Inkubationsperiode war beiden Studien (ab ca. 40 mpi) dann der nur noch sporadische

Nachweis von PrPSc

in den Follikeln gemein. Dies konnte auch bei den hier untersuchten

Proben beobachtet werden, hier wiesen vier der fünf negativen Tiere Inkubationszeiten von

36-44 mpi auf. Wahrscheinlich ist die altersabhängige Abnahme der Anzahl der vorhandenen

Follikel für die Reduzierung der Nachweiswahrscheinlichkeit verantwortlich und erklärt

dessen nur noch sporadischen Nachweis zu den späten Inkubationszeitpunkten. Die von

TERRY et al. (2003) diskutierte verringerte Involution von PrPSc

enthaltenen Follikeln ist für

die verbleibenden positiven Nachweise denkbar.

Die von PrPSc

-Akkumulationen betroffenen zellulären Strukturen innerhalb der Follikel

wiesen in allen Studien inklusive der eigenen Ergebnisse stets Reaktionsmuster auf, die eine

Assoziation mit TBM und/oder FDC wahrscheinlich machen. Kontrovers wurden allerdings

die Ergebnisse hinsichtlich des Auftretens der entsprechenden Zelltypen beschrieben.

Während in der frühen Inkubationsperiode zunächst übereinstimmend TBM-assoziierte

Ablagerungen detektiert wurden, waren in der Untersuchung von TERRY et al. (2003) die

FDC erst im klinischen Stadium zusammen mit dem Nachweis von PrPSc

im ZNS involviert.

Im Gegensatz dazu beschrieben HOFFMANN et al. (2011) die Beteiligung von FDC bereits

16 mpi bei einem präklinischen Tier und weiterhin das simultane Auftreten beider Zelltypen

während der gesamten untersuchten Inkubationsperiode. Auch im eigenen Untersuchungsgut

ließ sich keine temporäre Dominanz hinsichtlich der beteiligten Zelltypen feststellen.

Es muss jedoch betont werden, dass die Einbeziehung der FDC zu keinem Zeitpunkt der

BSE-Infektion dem Ausmaß entspricht, wie sie beispielsweise für Scrapie beschrieben ist.

Wie in der Studie von TERRY et al. (2003) so lieferte auch diese Studie keine spezifischen

Ablagerungen in den Follikeln nach einer Feldinfektion. Das hier untersuchte Ileum der

R09/06 wies allerdings eine fortgeschrittene Autolyse auf und ließ deshalb ein eindeutiges

106 Zusammenfassung

Ansprechen der Follikel nicht zu. Die bereits erwähnte altersbedingte Involution der Follikel

erschwerte die Detektion zusätzlich. Des Weiteren ist die Detektionswahrscheinlichkeit

positiver Follikel dosisabhängig. Diese lag nach experimenteller Inokulation von 1g

Homogenat nur bei einem Prozent und stieg erst bei Verabreichung von 100g Inokulat auf

45,5% an (STACK et al. 2011). Somit lässt sich das Ausbleiben einer Detektion auch durch

die natürlich vorkommende geringe Exposition mit infektiösem Material erklären. Weiterhin

könnte die angesprochene Degradation des PrPSc

durch TBM für Akkumulationen unterhalb

der IHC-Nachweisgrenze verantwortlich sein.

Die Frage nach der Rolle des lymphatischen Systems, insbesondere der der Peyer`schen

Platten des Ileums, bei der BSE-Pathogenese lässt sich mit den Ergebnissen dieser Studie

nicht vollständig beantworten. Indizien, wie die des bisher fehlenden Nachweises in natürlich

infizierten Rindern und die frühe Beteiligung des ENS (16 mpi) als möglicher Ausgangspunkt

für eine weitere Ausbreitung, sprechen aber gegen eine essentielle Beteiligung der

Peyer`schen Platten. Vielmehr kann aufgrund der hohen Dosis und dem damit verbundenen

Infektionsdrucks eine lokal begrenzte Akkumulation nach der Aufnahme des BSE-Agens über

den Darm vermutet werden. Warum allerdings bisher noch keine Involvierung von weiteren

lymphatischen Geweben beschrieben wurde, bleibt unklar. Der Einsatz des hochsensitiven

Maus-Bioassay mit der Inokulation verschiedener Lymphgewebe könnte einen möglichen

Ansatz zur weiteren Klärung darstellen.

5.4.2 Rolle des ENS und Neuroinvasion

Resultate aus Studien mit Scrapie zeigten in klinisch erkrankten Schafen PrPSc

-Ablagerungen

im ENS Schafen, die vermutlich auf eine initiale Infektion des lymphatischen Systems

zurückzuführen ist (VAN KEULEN et al. 2000, 2002). Dabei traten eindeutige lokale

Zusammenhänge zwischen positiven Neuronen des ENS und positiven Follikeln auf

(HEGGEBØ et al. 2003). Bei BSE-infizierten Rindern war der Nachweis im ENS zunächst

nur 38 Monate p.i. möglich und auf klinisch erkrankte Tieren beschränkt (TERRY et al.

2003). Nur eines von 98 Rindern wies dabei PrPSc

-Akkumulationen im ENS bei einer Dosis

von 100g Inokulat nach 36 mpi auf, die Reduktion der verabreichten Menge auf 1g führte erst

nach 51 mpi zu einem positiven Ergebnis. Interessanterweise wies das mit der geringen Dosis

infizierte Tier dabei keine Ablagerungen in den Follikeln auf. In der Publikation von

Diskussion 107

HOFFMANN et al. (2011), die die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit mit einbezieht, wurde

die Beteiligung des ENS bei 18 von 46 untersuchten Rindern gezeigt. Dabei gelang die

initiale Detektion von PrPSc

im frühen präklinischen Stadium nach 16 und 24 mpi bei zwei

Rindern dieser Untersuchung. Ab dem 32. Monat p.i. waren dann zuverlässig Ablagerungen

nachweisbar. Ausgehend von den Tieren dieser Studie waren beide Plexus mit dem

Schwerpunkt auf dem Plexus myentericus involviert, während im Gegensatz dazu STACK et

al. (2011) ausschließlich die Beteiligung des Plexus submucosus beschreibt. Eine

topographische Assoziation zwischen PrPSc

-Akkumulationen in den Follikeln und im ENS

konnte dabei mit Ausnahme der IT 09 nicht hergestellt werden.

Dieser fehlende Bezug lässt einen frühen pathogenetischen Zusammenhang zwischen beiden

Lokalisationen von PrPSc

eher zweifelhaft erscheinen. Für eine entscheidende Beteiligung des

ENS an der Ausbreitung des BSE-Agens sind die anatomischen Voraussetzungen einerseits

über die Nervenendigungen in der Submukosa nahe dem Darmlumen (FURNESS, 2006) und

andererseits über den direkten Kontakt sympathischer Nervenfasern mit den FDC’s und

Makrophagen der Follikel (DEFAWEUX et al. 2007) am wahrscheinlichsten. DEFAWEUX

et al. (2007) beschrieben weiterhin den direkten Kontakt zwischen intestinal aufgenommenem

PrPSc

und freien Nervenendigungen der Darmschleimhaut für den möglichen Beginn der

Neuroinvasion. Eine Infektionsroute über Nervenendigungen unterhalb der intestinalen

Mukosa wurde auch von JEFFREY et al. (2006) favorisiert. Die geringe Ausprägung der

PrPSc

-Akkumulationen im ENS deutet auf eine kurze Transitphase des Erregers an der Grenze

der immunhistochemischen Detektierbarkeit hin. Diese Nachweiswahrscheinlichkeit steigt

mit der Untersuchung von jeweils fünf Ebenen jedes Paraffinblockes. Diese hier erstmals

angewendete Schnitttechnik kann als Erklärung für die Diskrepanz der Ergebnisse zu früheren

Studien angesehen werden. Die zum späteren Zeitpunkt der Erkrankung vermehrt

beobachteten Anfärbungen könnten ursächlich auf eine vermehrte lokale Akkumulation

zurückzuführen sein. Eine zentrifugale Ausbreitung des PrPSc

nach Replikation im ZNS kann

in diesem Fall jedoch nicht sicher ausgeschlossen werden.

5.4.3 Ausbreitung im peripheren Nervensystem

Basierend auf den Ergebnissen früherer Studien (BUSCHMANN u. GROSCHUP, 2005;

HOFFMANN et al. 2007) wurde der Fokus der vorliegenden Arbeit auf die Ausbreitung des

108 Zusammenfassung

BSE-Agens entlang den Strukturen des PNS während der frühen und späten Phase der

Erkrankung gelegt.

5.4.3.1 Ausbreitungsrichtung

Bei der Betrachtung der Verbreitung des infektiösen BSE-Agens im Körper werden in der

Literatur die Termini zentrifugal und zentripetal unterschieden. Dabei beschreibt zentripetal

die Ausbreitung von PrPSc

zum Gehirn hin. Zu einer zentrifugalen Dissemination ausgehend

vom ZNS in Richtung des PNS kommt es nach der Replikation von PrPSc

im Gehirn und

Rückenmark. (BEEKES u. MCBRIDE 2007; KRATZEL et al. 2007b)

In dieser Studie wurde unter anderem das Ggl. trigeminale untersucht, das über den N.

trigeminus mit einem Kerngebiet im Obex weite Teile des Kopfes sensibel und motorisch

innerviert und damit unabhängig vom PNS des Brust- und Bauchraumes agiert.

Bei der Betrachtung der anatomischen Lage dieses Ganglions war weniger der Zeitpunkt in

der Inkubationsperiode als der Grad der PrPSc

-Akkumulationen im Obex interessant. Von

einem sekundären Befall des Ganglions ausgehend, konnte es als Bestimmung der ersten

zentrifugalen Dissemination herangezogen werden. So lässt sich der Nachweis des

pathologischen Prion-Proteins im Ggl. trigeminale bereits nach äußerst geringer

Akkumulation im Obex (IT 25, 40 mpi) als eine sehr frühzeitige zentrifugale Ausbreitung auf

periphere Strukturen deuten.

Die für die Betrachtung der frühen Pathogenese notwendige Unterscheidung zwischen

zentripetaler und zentrifugaler Ausbreitung lässt sich daher anscheinend nur ohne vorherige

Beteiligung des ZNS feststellen. Diese Voraussetzung konnten die vergleichbaren Studien

allerdings bisher nicht erfüllen (s. Tab.2.6, S.42).

5.4.3.2 Gehirn

Nach den OIE-Statuten ist die Medulla oblongata mit der Obexregion für die BSE-Diagnostik

heranzuziehen. ARNOLD et al. stellten (2007) in ihren Studien zum Nachweis von PrPSc

in

Relation zur klinischen Symptomen nochmals heraus, dass im Obex der früheste Nachweis

von PrPSc

geführt werden kann. Wie für Scrapie (BEEKES et al. 1999; VAN KEULEN et al.

2000, 2002; MCBRIDE et al. 2001) so wird auch für BSE im Rind stets der DMNV als

initiale Eintrittsstelle des pathologischen Prion-Proteins (SCHULZ-SCHAEFFER et al. 2000;

HOFFMANN et al. 2007) angenommen.

Diskussion 109

Im eigenen Untersuchungsgut zeigten sechs Tiere weder PrPSc

-Akkumulation noch

Infektiosität im Gehirn, während drei Tiere eine geringe und sieben Rinder eine mittel- bis

hochgradige Beteiligung der Medulla oblongata aufwiesen. Interessanterweise fiel die

Diskrepanz zwischen den Ergebnissen des Maus-Bioassay und der IHC im Gehirn deutlich

geringer aus als für die Gewebe des PNS, d.h. Infektiosität konnte nicht deutlich vor den

ersten Ablagerungen detektiert werden. Während nahezu alle Tiere sowohl Infektiosität als

auch PrPSc

-Akkumulationen auswiesen, konnte bei einem Tier (IT24, 24 mpi) Spuren von

Infektiosität ohne detektierbare Akkumulationen nachgewiesen werden. Dagegen zeigte ein

weiteres Rind (IT61, 28 mpi) eine lokale, sehr geringgradige neuronale Akkumulation bei

einem negativen Ergebnis im Maus-Bioassay. Neben individuellen Unterschieden zwischen

den Versuchsrindern kann das auf eine schnellere Replikation im ZNS als im PNS hinweisen,

so dass sehr schnell in der IHC detektierbare PrPSc

-Level erreicht werden.

Geringgradige PrPSc

-Ablagerungen traten im Obex erstmals nach 28 mpi und 32 mpi (IT 21,

IT 61) in der Formatio reticularis sowie im Nucleus motorius nervi trigemini und dem

Nucleus tractus solitarii 40 mpi (IT 25) auf. Neben feingranulären Ablagerungen im Neuropil

waren dabei auch extra- und intrazelluläre Akkumulationen einzelner Neurone zu beobachten.

Interessanterweise war der DMNV bei keinem dieser drei Rinder involviert.

Mittel- bis hochgradige PrPSc

-Akkumulationen fanden sich wie in vorangegangenen Studien

zu Scrapie (VAN KEULEN et al. 2000) weitverbreitet in den verschiedenen Regionen des

Obex.

Mögliche Theorien für das Auftreten des PrPSc

in den hier beobachteten Kerngebieten werden

im Kap. 5.4.4 (S.113) diskutiert.

5.4.3.3 Rückenmark

Die zweite Komponente des ZNS stellt das Rückenmark dar. PrPSc

-Ablagerungen waren

zumeist mit Akkumulationen im Obex assoziiert. So ließen sich einzelne PrPSc

-positive

Neurone im ZNS (DMNV) und der Substantia intermedia lateralis des Rückenmarkes bei

präklinischen Schafen mit Scrapie 10 mpi (VAN KEULEN et al. 2000) nachweisen.

Ausgehend vom thorakalen Abschnitt 8-10 (10 mpi) breitete sich das pathologische Prion-

Protein beim Schaf zentrifugal und zentripetal über das gesamte Rückenmark (26 mpi) aus.

Während sich bei einem Rind der deutschen Pathogenesestudie 24 mpi PrPSc

in allen

Abschnitten des Rückenmarks nachweisen ließ (HOFFMANN et al. 2007), konnten WELLS

et al. (1998) Akkumulationen des pathologischen Prion-Proteins 32 mpi bei einem Tier ohne

110 Zusammenfassung

gleichzeitige Ablagerungen im Obex im thorakalen und zervikalen Segment zeigen. Oral

inokulierte Hamster wiesen 89 Tage p.i. PrPSc

Initial in den Thorakalsegmenten 4-9 auf,

wobei den Berechnungen zufolge insbesondere der siebte Abschnitt durch periphere Nerven

infiziert wird (BEEKES et al. 1996). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden für die

vorliegende Studie repräsentative Rückenmarksproben aus dem siebten thorakalen und dem

dritten lumbalen Segment untersucht.

Im eigenen Untersuchungsgut stellte die Detektion von Infektiosität im siebten thorakalen

Segment 16 mpi (IT 28) ohne Beteiligung des Obex den bisher frühesten Nachweis im

Rückenmark beim Rind dar. Im Zusammenhang mit geringen Ablagerungen in der Medulla

oblongata ließen sich PrPSc

-Akkumulationen erstmals in beiden untersuchten Abschnitten 28

mpi (IT 21) beobachten. Interessanterweise wies der Obex beim Tier IT 61 (32 mpi) dann ein

positives Neuron auf, während im Thorakal- und Lumbalabschnitt ausschließlich Infektiosität

detektiert wurde. Nach umfangreicher Replikation des pathologischen Prion-Proteins im

Gehirn decken sich die beobachteten Reaktionsmuster sowie die Lokalisation der

Ablagerungen mit den Ergebnissen vorangegangener Studien (VAN KEULEN et al. 2000,

2002; HOFFMANN et al. 2007).

Der Vergleich von Ablagerungen/Infektiosität im Obex und dem Rückenmark zeigte

besonders im präklinischen Stadium keine offensichtliche Assoziation. In keinem Fall war der

Nachweis von Infektiosität in den Rückenmarkssegmenten äquivalent zur Detektion in der

Medulla oblongata. Und auch bei der Betrachtung der Intensität der PrPSc

-Ablagerungen

wichen die Ergebnisse in den untersuchten Anteilen des ZNS voneinander ab. Es lässt sich

somit durchaus vermuten, dass es sich bei der Infektion von Gehirn und Rückenmark um zwei

separate Prozesse handelt. Die Rolle des Rückenmarks in der Pathogenese wird bei der

abschließenden Diskussion möglicher Ausbreitungswege behandelt.

5.4.3.4 Gemischtfaserige Ganglien

Die gemischtfaserigen Ganglien wurden im eigenen Untersuchungsgut durch das Ggl.

coeliacum und das Ggl. mesenteriale caudale repräsentiert.

Das erstgenannte Ganglion fungiert als Prävertebralganglion und schaltet die den Darm

innervierenden Nervenfasern des sympathischen N. splanchnicus auf die sekundären

postganglionären Neurone des Rückenmarkes um. Dabei führt es durch den Anschluss von

Zweigen des N. vagus auch parasympathische Fasern. Im Rahmen von TSE-Erkrankungen

konnte PrPSc

in der Regel bisher nur im Zusammenhang mit Akkumulationen im ZNS im Ggl.

Diskussion 111

coeliacum von Hamstern (MCBRIDE u. BEEKES 1999; MCBRIDE et al. 2001), Schafen

(VAN KEULEN et al. 2000, 2002) und einem Rind (HOFFMANN et al. 2007) nachgewiesen

werden.

In dieser Studie wurde im Ggl. coeliacum ab 16 und 20 mpi Infektiosität in Zusammenhang

mit dem initialen Nachweis von Infektiosität im sympathischen und parasympathischen

Nervensystem detektiert. Der Obex war zu diesem Zeitpunkt nicht betroffen. Die erstmalige

PrPSc

-Akkumulation 32 mpi (IT 09, IT 61) ging wie in der Fallstudie (24 mpi) von

HOFFMANN et al. (2007) mit der Detektion im Obex einher. Mit dem Fortschreiten der

Inkubationszeit waren Ablagerungen/Infektiosität dann konstant nachweisbar. In

Übereinstimmung mit den Thesen vorangegangener Untersuchungen kann das Ggl. coeliacum

als erste Struktur des PNS in der Pathogenese angesehen werden. Der zunächst fehlende

Nachweis im Obex sowie die anatomische Lage dieses Ganglion unterstreichen die

Verlässlichkeit dieser Hypothese. Die funktionelle Rolle wird im Kapitel 5.4.4 (S.113)

ausführlicher diskutiert.

In der o.g. Fallstudie (HOFFMANN et al. 2007) wies zusätzlich auch das Ggl. mesenteriale

caudale des präklinischen Rindes 24 mpi Ablagerungen des pathologischen Prion-Proteins

auf. Dieses Ganglion ist u.a. für die Innervation des Colon descendens und des Rectum

verantwortlich, hat jedoch zusätzlich zahlreiche Verbindungen mit den anderen

Bauchganglien. Sowohl für BSE-infizierte Rinder (OKADA et al. 2010) als auch für Scrapie-

infizierte Schafe (RYDER et al. 2009) konnten bereits PrPSc

-Akkumulationen im Colon

nachgewiesen werden. Diese Akkumulationen könnten eine denkbare Erklärung für die

Einbeziehung des Ggl. mesenteriale caudale sein. Dem gegenüber steht die Fallstudie von

HOFFMANN et al. (2007), bei der sich PrPSc

im Ganglion (bei gleichzeitigen geringgradigen

Befall des Obex), nicht aber im Colon nachweisen ließ. Die Autoren interpretierten dieses

Phänomen als mögliche zentrifugale Ausbreitung, möglicherweise auch über die Verbindung

zu den ebenfalls betroffenen Ggl. coeliacum. Die am eigenen Untersuchungsgut erhobenen

Befunde unterstützten diese Theorie, da sowohl Infektiosität als auch pathologisches Prion-

ProteinPrion-Protein erst nach hoher Akkumulation im ZNS (Obex) detektierbar waren.

Die Beteiligung des Ggl. mesenteriale caudale an der zentripetalen Ausbreitung ließ sich über

die Verbindung zum Ggl. coeliacum oder die angeschlossenen Nn. splanchnici minores zum

lumbalen Anteil des Rückenmarks nicht sicher ausschließen. Letztere Möglichkeit ist

aufgrund der initiale Befalls des thorakalen Abschnittes beim Hamster (BEEKES et al. 1996)

und der IT 28 (16 mpi) dieser Studie aber eher unwahrscheinlich.

112 Zusammenfassung

Da das Ggl. mesenteriale caudale im Gegensatz zum Ggl. coeliacum bei der Probenentnahme

nicht makroskopisch sichtbar war, führte das daraus resultierende Fehlen an auswertbaren

Nervenzellen in einer Vielzahl der Proben zu einer eingeschränkten Aussagekraft und zu

Schwierigkeiten bei der Interpretation der Ergebnisse.

5.4.3.5 Sympathikus

In der vorliegenden Arbeit wurden als sympathische Komponenten der N. splanchnicus, das

Ggl. cervicale craniale (GCC) und das Ggl. stellatum untersucht. Der N. splanchnicus stellt

nicht nur eine funktionelle Verbindung zwischen dem Ggl. coeliacum und dem thorakalen

Rückenmark her, es besteht auch ein direkter Kontakt zum sympathischen Grenzstrang.

Dieser Nervenstrang wiederum enthält sowohl das GCC als auch das Ggl. stellatum.

Über die Beteiligung des sympathischen Nervensystems an der Pathogenese der BSE ist

wenig bekannt, andere Autoren (ARNOLD et al. 2007; KIMURA et al. 2008) berichteten

zudem von negativen Ergebnissen für die Anteile des Sympathikus wie dem GCC, dem

sympathischen Grenzstrang und dem Ggl. stellatum. Der bisher einzige Nachweis von PrPSc

in Anteilen des Sympathikus gelang im Ggl. stellatum bei drei experimentell infizierten

Tieren, die ausnahmslos Ablagerungen des pathologischen Prion-Proteins im Obex aufwiesen

(MASUJIN et al. 2007). In der eigenen Untersuchung konnte hingegen bereits in der sehr

frühen präklinischen Phase eine erste Beteiligung des Sympathikus in Form von Infektiosität

ab 16 mpi ohne gleichzeitige Beteiligung der Medulla oblongata nachgewiesen werden.

Weiterhin erfolgte der Nachweis einer marginalen Infektiosität für die kaudalen Abschnitte

der Medulla oblongata bei gleichzeitig mittleren bis hohen Übertragungsraten für die

untersuchten sympathischen Proben (IT 24, 24 mpi). Ein Nachweis von PrPSc

-

Akkumulationen gelang jedoch lediglich im GCC der IT 11 (36 mpi).

Diese Ergebnisse zeigen den bisher umfangreichsten und frühesten Nachweis von

Infektiosität im sympathischen Teil des PNS von Rindern. Dabei war das GCC besonders

präsent und wies so auf eine entscheidende Rolle des sympathischen Nervensystems in der

Pathogenese der BSE hin (s. Kap. 5.4.4, S.113).

5.4.3.6 Parasympathikus

Aufgrund der initialen Beteiligung des DMNV bei der Akkumulation von PrPSc

in der

Obexregion wurde die zentripetale Ausbreitung des pathologischen Prion-Proteins entlang des

Diskussion 113

N. vagus im Scrapie-Hamster-Modell (BEEKES et al. 1998), bei Scrapie infizierten Schafen

(VAN KEULEN et al. 2002) und auch bei BSE-infizierten Rindern (HOFFMANN et al.

2007) diskutiert. Erst im terminalen Stadium konnte Infektiosität direkt im N. vagus bei

Hamstern (MCBRIDE et al. 2001) und Rindern (MASUJIN et al. 2007) nachgewiesen

werden. PrPSc

-Ablagerungen wurden zudem in Scrapie-infizierten Hamstern nach Beteiligung

des ZNS im Ggl. nodosum detektiert (MCBRIDE et al. 2001). Ohne den direkten Nachweis

im N. vagus in der frühen Inkubationsperiode lässt sich aus den bisherigen Studien daher

lediglich die Beteiligung dieses Nerven an der zentripetalen Ausbreitung vermuten. So

wurden in der vorliegende Studie daher der Hals- und Brustabschnitt des N. vagus sowie

dessen kaudal dem ZNS angeschlossenen Ggl. nodosum untersucht.

Im Gegensatz zu den vorgenannten Autoren wurde im eigenen Untersuchungsgut bereits sehr

früh und ohne Beteiligung des ZNS Infektiosität im N. vagus der IT 60 und im Ggl. nodosum

der IT 50 (beide 20 mpi) detektiert, was eindeutig die frühe zentripetale Beteiligung

parasympathischer Strukturen zeigt. Darüber hinaus gelang es erstmalig bei mehreren Tieren

beginnend 32 mpi (IT 09) PrPSc

-Akkumulationen in eingelagerten Neuronen des N. vagus zu

detektieren. Aufgrund der schwer zu separierenden anatomischen Strukturen des Ggl.

nodosums waren Neurone in den Gewebeproben nur spärlich vorhanden, sodass hier lediglich

ein klinisch erkranktes Tier (IT 22, 44 mpi) PrPSc

-Akkumulationen aufwies. Diese traten

jedoch im Zusammenhang mit mittelgradigen PrPSc

-Ablagerungen im Gehirn und hohen

Transmissionsraten im Maus-Bioassay in allen Anteilen des PNS auf und zeugten bereits von

einer intensiven zentrifugalen Verbreitung des BSE-Agens im Körper.

So bestätigten die Ergebnisse dieser Studie die bereits diskutierte These von der zentripetalen

Ausbreitung entlang des N. vagus. Diese schließt im Gegensatz zu den Vermutungen von

BEEKES et al. (2006) das Ggl. nodosum mit ein. Die Bedeutung des parasympathischen

Systems bei der zentrifugalen Ausbreitung wird im anschließenden Kapitel erläutert.

5.4.4 Hypothese zur Ausbreitung im PNS

Basierend auf den Erkenntnissen der aktuellen Literatur ist das Ileum mit den assoziierten

Peyer’schen Platten der wahrscheinlichste Eintrittsort des BSE-Agens nach oraler Exposition.

Dabei kann anhand der vorliegenden Ergebnisse sowie den Ergebnissen anderer Autoren eine

entscheidende Beteiligung der lymphatischen Komponente bezweifelt werden, vielmehr

gelten die Strukturen des ENS als Ausgangspunkt für die Ausbreitung entlang der peripheren

neuronalen Strukturen auf dem Weg zum Gehirn (s. Kap.5.4.2, S.106)

114 Zusammenfassung

Mit den Ergebnissen aus Scrapie-Studien am Hamster- und Schafmodell (BALDAUF et al.

1997; BEEKES et al. 1998; MCBRIDE & BEEKES, 1999; VAN KEULEN et al. 2000, 2002;

MCBRIDE et al. 2001) wurden zwei Routen des Agens auf dem Weg zum Gehirn diskutiert.

Auch die Fallstudien von HOFFMANN et al. (2007) für BSE am Rind unterstützen diese

Möglichkeiten, die (1) den parasympathischen Weg entlang des N. vagus zum DMNV des

Obex und (2) eine Verbreitung über das Ggl. coeliacum, und sympathische Strukturen (N.

splanchnici) zum Rückenmark als zentrale Komponente des Nervensystems umfassen. Mittels

der in dieser Untersuchung erhobenen Befunde lassen sich die bereits bestehenden Theorien

zur Pathogenese der BSE beim Rind weitgehend bestätigen, darüber hinaus können weitere

Hypothesen formuliert werden. Die Abb. 5.1 (S.116) gibt einen schematischen Überblick zu

den hier vorgestellten Überlegungen.

Die vorliegenden Ergebnisse bestätigen die Vermutung, dass die Ausbreitung des PrPSc

sowohl entlang sympathischer als auch parasympathischer Nervenfasern verläuft. Dabei ist

das Ggl. coeliacum die erste Struktur, in der die den Darm innervierende Nerven

umgeschaltet werden. Im Untersuchungsgut dieser Studie finden sich neben Infektiosität (ab

16 mpi) auch PrPSc

-Ablagerungen an vereinzelten Neuronen bereits in der frühen

Inkubationsphase (ab 32 mpi). Da die Qualität der betroffenen Neurone des

Ganglionkomplexes im Rahmen dieser Untersuchung nicht bestimmt wurde, kann hier

lediglich spekuliert werden, ob der sympathische oder parasympathische Ausbreitungsweg im

ENS oder im Ggl. coeliacum determiniert wird. Die von DEFAWEUX et al. (2007) im ENS

verwendete Markierung für Tyrosin-Hydroxylase (TH) ist spezifisch für sympathische

Nervenfasern und könnte als Doppelfärbung mit PrPSc

angewendet für das Ggl. coeliacum

Aufschluss über die beteiligten Strukturen geben.

Im Darm sind parasympathische Komponenten in Form sensorischer Fasern des N. vagus weit

verbreitet (GOEHLER et al. 1999, 2000). Des Weiteren finden sich efferente Synapsen des N.

vagus in den intrinsischen Ganglien des ENS, die die Darmwand innervierend in der Mukosa

und Submukosa lokalisiert sind (FURNESS et al. 1999). Andererseits wird von einer

intensiven Beteiligung des Sympathikus im ENS (CHIOCCHETTI et al. 2008) und der

umfangreichen sympathischen Innervation lymphatischer Strukturen berichtet (FELTON et

al. 1985, 1988; DEFAWEUX et al. 2007). Diese topographisch-anatomischen

Zusammenhänge lassen die Möglichkeit beider Infektionswege mit einem sympathischen

Schwerpunkt zu.

Das hauptsächlich sympathische Ggl. coeliacum könnte ebenfalls den entscheidenden

Modulator darstellen, da mit der Aufnahme parasympathische Fasern des N. vagus die

Diskussion 115

Voraussetzungen für das Vorkommen beider Routen gegeben sind. Der enge Kontakt beider

qualitativ unterschiedlicher Nervenfasern und Neuronen kann als entscheidender Faktor für

den weiteren Verlauf der Infektion nicht sicher ausgeschlossen werden.

Die Ergebnisse ohne eine simultane Beteiligung der Hirnstammes (IT 28 und 46, 20 mpi; IT

52, 28 mpi) legen den Schluss nahe, dass der Sympathikus eine überragende Rolle bei der

zentripetalen Ausbreitung spielt. Ausgehend vom Ggl. coeliacum verlaufen die Nn.

splanchnici in dorsaler Richtung und nehmen Kontakt zum sympathischen Grenzstrang auf,

um dann im thorakalen Abschnitt des Rückenmarks zu münden. Das im besagten Grenzstrang

eingelagerte GCC stellt durch seine anatomische Lage nahe des Kopfes und der Abgabe

sympathischer Nervenfasern an ein Großteil der Gehirnnerven (unter anderem N. vagus und

den N. trigeminus) möglicherweise den entscheidenden Transmitter für die Ausbreitung des

Erregers in das Gehirn dar. Damit ließen sich die beobachteten initialen PrPSc

-Ablagerungen

in unerwarteten (Formatio reticularis, Nucleus motorius nervi trigemini) oder

parasympathischen (DMNV, Nucleus tractus solitarii) Lokalisationen des Obex erklären. Es

ist herauszustellen, dass es sich dabei entgegen bisheriger Vermutungen um eine Ausbreitung

unter Umgehung des Rückenmarks handeln würde. Trotz des Nachweises von Infektiosität im

Rückenmark eines Tieres 16 mpi, lässt diese Untersuchung Zweifel, dass eine zentripetale

Verbreitung über den N. splanchnicus zwangsläufig den Thorakal-Abschnitt des

Rückenmarks erreicht. Die umfangreiche Einbeziehung sympathische Strukturen neben einer

nur geringgradigen Infektiosität in der Medulla oblongata (IT 24, 24 mpi) veranschaulichen

die Bedeutung des Sympathikus nochmals nachhaltig. Diese Theorie wird ebenfalls durch die

Verzögerung einer Scrapie-Erkrankung bei Mäusen nach Sympathektomie unterstützt

(GLATZEL et al. 2001).

In Einklang mit vorhergehenden Studien zeigen auch die hier vorliegenden

Resultate, dass parasympathische Strukturen auf dem Weg zum Gehirn involviert sind. Ließ

sich bisher aufgrund der Detektion von PrPSc

im DMNV des Obex eine parasympathische

Beteiligung vermuten, kann nun der direkte Nachweis von Infektiosität im N. vagus und im

Ggl. nodosum ohne Beteiligung des ZNS und des sympathischen Systems als entscheidendes

Indiz angesehen werden.

Zusammenfassend lässt sich nicht nur zweifelsfrei die zentripetale Ausbreitung des BSE-

Agens über das PNS nachweisen. Während beide Komponenten des PNS separat in der

Ausbreitung involviert sein können, so überrascht wie deutlich das sympathische

Nervensystem als Schwerpunkt gegenüber einer parasympathischen Ausbreitung determiniert

116 Zusammenfassung

werden konnte. Das Rückenmark ist somit wahrscheinlich als zusätzlicher Infektionsweg zu

bewerten.

Abb. 5.1 Schematische Darstellung zu möglichen Ausbreitung des BSE-Agens im Rind nach

oraler Inokulation

Violett: Zentrales Nervensystem; Rot: Sympathikus; Blau: Parasympathikus

1: Nach Passage der Darmwand wird der Erreger über sympathische oder parasympathische

Fasern aufgenommen und gelangt in das Ggl. coeliacum; 2: Entlang der Fasern des N.

splanchnicus findet die BSE-Erreger Eingang in den sympathischen Grenzstrang; 3: Das Ggl.

cervicale craniale moduliert den Übergang in unterschiedliche Areale des Gehirns; 4: Als

alternative Route kann die Ausbreitung entlang des N. vagus erfolgen; 5. Als zusätzlicher

zentripetaler Infektionsweg könnte über den N. splanchnicus das Rückenmark involviert sein.

5.4.5. Transport des PrPSc

Ein interessanter Aspekt in der Pathogenese von BSE ist der Nachweis des pathologischen

Prion-Proteins im PNS ausschließlich in Assoziation mit Neuronen und Satellitenzellen.

Dabei eröffneten vor allen die Transversalschnitte des N. vagus und des Rückenmarks die

Möglichkeit, PrPSc

auch in den von Markscheiden umhüllten Axonen zu detektieren. Dies

gelang in keiner der Proben dieser Studie und hinterlässt die Frage nach dem eigentlichen

Transportmechanismus des pathologischen Prion-Proteins.

Diskussion 117

Für PrPC wurde ein axonaler Transportmechanismus entlang der Nerven gezeigt

(BORCHELT et al. 1994; BUTOWT et al. 2006), der für die pathologische Isoform bisher

noch nicht erbracht werden konnte. In einer Studie wird eine Translokation von PrPSc

entlang

etablierter axonaler Transportmechanismen (MCBRIDE et al. 2001) vermutet. In den

Untersuchungen von KIMBERLIN et al. (1983) führte eine intraneuronale Inokulation

schneller zum Befall des ZNS als eine extraneuronale Infektion. Die daraus geschlussfolgerte

Ausbreitungsgeschwindigkeit von 1-2 mm/Tag spricht ebenfalls für eine axonale Verbreitung,

wie sie für Makromoleküle (TYTELL et al. 1981) bekannt ist. Einige neurotrope Viren

breiten sich intraneuronal allerdings um das 50fache schneller aus (KIMBERLIN et al. 1983).

Einschränkungen des axonalen Transports am Nagetiermodell weisen jedoch keine

Beeinflussung der Inkubationszeit auf (KUNZI et al. 2002; HAFEZPARAST et al. 2005;

KRATZEL et al. 2007a,b). Als weiteres Indiz für eine adaxonale Ausbreitung werden die

beobachteten PrPSc

-Akkumulationen zwischen der Myelinscheide und dem Axon bewertet

(GROSCHUP et al. 1999; KRATZEL et al. 2007a). Des Weiteren wird eine adaxonale

„Domino“-ähnliche Konversion von PrPC zu PrP

Sc entlang der Nerven diskutiert (GLATZEL

u. AGUZZI, 2000).

Einer Bewertung der Ausbreitungsgeschwindigkeit ausgehend von den Ergebnissen dieser

Studie steht die Problematik der biologischen Varianz entgegen. So handelte es sich bei der

initialen PrPSc

-Detektion im GALT der Rinder nach vier mpi (HOFFMANN et al. 2011) und

der frühesten Detektion im Obex nach 24 mpi um zwei verschiedene Rinder. Die Schätzung

der Länge der für die Ausbreitung relevanten Nervenachse ENS - Ggl. coeliacum - N.

splanchnicus - sympathischer Grenzstrang ist ebenfalls äußerst ungenau. Somit kann die

Ausbreitungsgeschwindigkeit aufgrund der fehlenden fundierten Daten nicht durchgeführt

werden.

Die Limitierung der in dieser Untersuchung nachweisbaren PrPSc

-Akkumulationen auf

Neurone und Gliazellen bedeutet auch, dass der für die Beteiligung der Myelinscheiden

entscheidende Nachweis in der weißen Substanz des Rückenmarks nicht erbracht werden

konnte.

Aufgrund dieser fehlenden Indizien und der langen Inkubationszeit lässt sich daher über eher

langsame intra-axonalen Transportmechanismen spekulieren, wie sie für neurotrope Viren

bereits bekannt sind. So sind zur weiteren Klärung In vivo- und In vitro-Untersuchungen,

möglicherweise unter Verwendung der Elektronenmikroskopie, notwendig.

118 Zusammenfassung

5.5 Pathogenese und Pathologie

In der Literatur werden inflammatorische Prozesse unterschiedlichster Art als mögliche

Einflussfaktoren auf die Pathogenese der TSE-Erkrankungen diskutiert. So führte eine

infektiöse Darmschädigung bei Mäusen zu einer erhöhten Scrapie-Empfänglichkeit

(SIGURDSON et al. 2009) und einer schnelleren Ausbildung des terminalen

Krankheitsstadiums (THACKRAY et al. 2003). Bakterielle, virale oder parasitäre Infektionen

beeinflussten die tight junctions des Darmepithels (SAKAGUCHI et al. 2001; MILLING et

al. 2007) und führten zu einer gesteigerten Aufnahme von Proteinen (SODERHOLM et al.

2004). Speziell für die TSE ist die Erhöhung der PrPC-Expression infolge gastrointestinaler

Entzündungen interessant. Der im Gegensatz zu vergleichbaren Studien in England

(ARNOLD et al. 2007) bis zu 8 Monaten schnellere Krankheitsverlauf in der FLI-Studie ließe

sich durch die bei allen im Versuch befindlichen Rindern beobachtete massive chronisch

aktive oberflächliche eosinophile Enteritis erklären. Der unter Feldbedingungen

unumgängliche Kontakt mit Enteritis-Erregern könnte somit auch bei natürlichen Infektionen

eine nicht unerhebliche Rolle spielen. Ob bei einer vorliegenden Enteritis die Darmpassage

erleichtert wird oder eine erhöhte PrPC-Expression im Darmepithel vorliegt, kann anhand der

hier vorliegenden Ergebnisse jedoch nicht beantwortet werden. Weiterführende Studien mit

Doppelfärbungen für entzündungsassoziierte Marker und für PrPSc

könnten zur Klärung

dieser Fragestellung beitragen.

Bei Mäusen und Schafen wurde unter Einbeziehung des lymphatischen Systems eine

Korrelation von Entzündungen und dem Organtropismus festgestellt. So führen chronische

mononukleäre Entzündungen zum Nachweis des pathologisches Prion-Protein in der Niere,

dem Pankreas und der Leber (HEIKENWALKER et al. 2005). Infektiöser Urin infolge einer

Nephritis (SEEGER et al. 2005) wurde bei Schafen ebenso beobachtet wie das Auftreten des

pathologischen Prion-Proteins im Euter von Tieren mit Mastitis (LIGIOS et al. 2005).

In diesem Zusammenhang muss jedoch betont werden, dass sich in anderen Untersuchungen

PrPSc

in der Niere und der Milch bei Schafen auch ohne entsprechende entzündliche Prozesse

(SISO et al. 2008; LACROUX et al. 2007) detektierten ließ. Die im eigenen

Untersuchungsgut in zahlreichen Proben des PNS festgestellten lymphohistiozytären

Infiltrationen standen ohne kausale Zusammenhänge zu den Befunden aus IHC und BA.

Weiterhin waren altersabhängig deutlich später in der Inkubationsperiode auch die

Kontrolltiere von diesen Entzündungen betroffen (FAST, mündliche Mitteilung). Somit bleibt

Diskussion 119

weiter unklar, inwieweit inflammatorische Prozesse und die BSE-assoziierte Pathologie

verknüpft sind.

120 Zusammenfassung

6. ZUSAMMENFASSUNG

Martin Kaatz

Ausbreitung der klassischen BSE-Prion-Erreger vom Darm über das periphere Nervensystem

zum Gehirn

Wie für die anderen Vertreter der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien (TSE) gilt

auch für die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) die Prion-Hypothese, die von einem

pathologischen Prion-Protein (PrPSc

) als Erreger ausgeht. Dabei ist die Pathogenese der BSE

im natürlichen Wirt weitestgehend ungeklärt und die derzeitigen Annahmen basieren zum

Großteil auf Erkenntnissen aus Versuchen an anderen Spezies. Die am Friedrich-Loeffler-

Institut initiierte deutsche BSE-Pathogenesestudie umfasste neben 18 Kontrolltieren 56 oral

inokulierte Rinder. In einem viermonatigen Rhythmus wurden jeweils vier Tiere aus dem

Versuch genommen und seziert. Von zwei Rindern an acht Sektionszeitpunkten (insg. 16

Tiere, 16 bis 44 Monate post infectionem [mpi]) wurden neben Gewebeproben des zentralen

Nervensystems (ZNS) sympathische und parasympathische Proben aus dem peripheren

Nervensystem (PNS) und des Ileums analysiert. Der ausgewählte Untersuchungszeitraum

umfasste mehrheitlich präklinische Tiere, um die zentripetale neuronale Ausbreitung des

pathologischen Prion-Proteins vom Darm zum Gehirn aufzuklären.

Als Nachweisverfahren zur Detektion des BSE-assoziierten Agens kamen mit der

Immunhistochemie (IHC) und dem Maus-Biosassay (Maus-BA) zwei Methoden mit

unterschiedlichen Strategien zum Einsatz. Mittels IHC werden die mikroskopisch

lokalisierbaren PrPSc

-Ablagerungen nachgewiesen. Die Hämatoxylin-Eosin- (HE) Färbung

dient in der TSE-Diagnostik zum Nachweis spongiformer Enzephalopathien als auch zum

Nachweis möglicher pathologischer Veränderungen. Der hochsensitive Maus-Bioassay

ermöglicht Aussagen über den Erregergehalt von intrazerebral in transgene Mäuse

inokulierten Gewebeproben. Die Gehirne klinisch erkrankter Mäuse wurden anschließend

biochemisch auf PrPSc

-Akkumulationen als Nachweis einer BSE-Infektion hin untersucht.

Jedes in dieser Untersuchung analysierte Rind war mindestens in einer der untersuchten

Proben positiv. Klinische Symptome einer BSE-Erkrankung waren bei zwei Rindern (36 und

44 mpi) eindeutig zu beobachten, bei einem Tier (44 mpi) bestand ein Verdacht auf eine ZNS-

Erkrankung und vier Rinder (32 bis 40 mpi) wiesen unspezifische Krankheitsbilder auf. Bei

neun Rindern ließen sich bis hin zu 40 mpi keine klinischen Symptome nachweisen.

Zusammenfassung 121

In der Medulla oblongata des Gehirns waren BSE-Erreger frühestens nach 24 mpi und PrPSc

-

Ablagerungen erstmals ab 28 mpi detektierbar. Der früheste Nachweis im Rückenmark

erfolgte bei einem Tier 16 mpi (Maus-BA) bzw. 28 mpi (IHC). Die histopathologische

Untersuchung des ZNS wies bei sieben Tieren ab 32 mpi eine spongiforme Enzephalopathie

auf. Bei dem Versuch, eine Assoziation zwischen den Ergebnissen der IHC, den

histopathologischen und den klinischen Untersuchungen herzustellen, schien eine Verbindung

zwischen PrPSc

-Ablagerungen und dem Auftreten einer spongiformen Enzephalopathie zu

bestehen.

Für eine zuverlässige Bestimmung des zentripetalen Ausbreitungsweges wurden

ausschließlich Proben von Rindern ausgewertet, bei denen PrPSc

oder der BSE-Erreger im

PNS, aber noch nicht im ZNS nachweisbar waren. So konnte eine terminale zentrifugale

Ausbreitung ausgeschlossen werden. Das eine solche Ausbreitung sehr schnell nach dem

Befall des Gehirns beginn kann, zeigt der erstmalige PrPSc

-Nachweis im Ggl. trigeminale bei

nur geringgradigen PrPSc

-Akkumulation im Obex (IT 25, 40 mpi). In dieser Studie konnte

erstmals bei sechs Tieren (16-28 mpi) BSE-Erreger im PNS deutlich vor dem initialen

Nachweis in der Medulla oblongata detektiert werden. Von diesen Tieren waren vier im

gemischtfaserigen Ggl coeliacum positiv. Interessanterweise ließ sich bei beiden Rindern 16

mpi sowie bei einem weiteren Tier 28 mpi ausschließlich in den sympathischen Geweben des

Ggl. cervicale craniale, Nn. splanchnici bzw. des Ggl. stellatum BSE-Erreger detektieren. Im

Gegensatz dazu waren 20 mpi lediglich parasympathische Anteile (Ggl. nodosum, N. vagus)

betroffen. Unabhängig von diesen Befunden konnte in zahlreichen Ganglien/Nerven eine

geringgradige lymphohistiozytäre Ganglioneuritis festgestellt werden.

Die Vermutungen bisheriger Studien zur zentripetalen Ausbreitung des BSE-Agens anhand

parasympathischer und sympathischer Nerven konnten mit den Ergebnissen dieser Arbeit

zweifelsfrei nachgewiesen werden. Allerdings stellt die dominante und bemerkenswert frühe

Beteiligung des Sympathikus eine neue Erkenntnis dar. Hierbei ist besonders das Ggl.

cervicale craniale herauszustellen, das anatomisch und funktionell Verbindungen zu einer

Vielzahl von Gehirnerven besitzt. Somit könnte diesem Ganglion eine entscheidende

Bedeutung beim Übergang der BSE-Erreger aus dem PNS in die unterschiedlichen

Kerngebiete des Gehirns zukommen. Das Rückenmark, welches bisher neben den N. vagus

als ein primäres zentripetales Ausbreitungsorgan betrachtet wurde, scheint dagegen lediglich

einen zusätzlichen Weg darzustellen. Da alle hier untersuchten Tiere eine Beteiligung des

PNS/ZNS zeigten, liegt die initiale Infektion peripherer Nerven vor dem 16. Monat p.i.. Dies

macht weitere Untersuchungen von Tieren mit einer geringeren Inkubationszeit notwendig.

122 Summary

7. SUMMARY

Martin Kaatz

Spread of classic BSE-Prions from the gut via the peripheral nervous system to the brain

Like other members of the transmissible spongiform encephalopathies (TSE) the prion-

hypothesis is also considered for Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) with a

pathological prion protein (PrPSc

) as the infectious agent. The pathogenesis of BSE is not well

understood and is based mainly on data from other species. Therefore, the Friedrich-Loeffler

institute initiated a trial including 56 orally infected cows and 18 control animals. Every four

month four animals were euthanized and a necropsy was performed. From in total 16 cows at

the time period between 16 and 44 months post infectionem (two cows at each necropsy date)

tissue samples from the central nervous system (CNS), sympathetic and parasympathetic parts

of peripheral nervous system (PNS) and the ileum were examined. The animals (mpi)

included primarily pre-clinical animals to clarify the centripetal spread of the pathological

prion protein from the gut to the brain.

Two different strategies, the immunhistochemistry (IHC) and a mouse bioassay (mouse-BA),

were chosen as detection methods. The IHC detects PrPSc

and enabled the analysis of the

cellular structures involved. The hematoxylin-eosin (HE) staining revealed pathological

diagnostics and a potential association to BSE. The highly sensitive mouse-BA detected the

infectious potential of the examined tissues. These transgenic mice were over-expressing the

physiologic bovine Prion protein which made them highly susceptible to a BSE-infection.

After an intracerebral inoculation a biochemical method (Immunoblot) was used to detect

PrPSc

in the brain of clinical affected mice.

At least one positive result for the examined samples was established for every animal of this

study. Clinical signs were definitively observed for two cows (36 and 44 mpi), one animal

was presumptively affected with BSE and four showed an unspecific disease pattern (32 to 44

mpi).

At the medulla oblongata of the brain we detected infectivity by the mouse-BA initially at 24

mpi and PrPSc

accumulations by IHC at 28 mpi. For the spinal cord the earliest evidence was

found 16 mpi by the mouse bioassay and 28 mpi with the IHC. The histopathologic

examination showed a spongiform encephalopathy for seven cows after 32 mpi. An

Summary 123

association between the revealed results was only established for the PrPSc

accumulation and

the occurrence of a spongiform encephalopathy.

For a reliable determination of the centripetal route it is mandatory to examine animals prior

to an involvement of the brain. The first detection of PrPSc

at the Ggl. trigeminale was

accompanied by a mild PrPSc

accumulation at the Obex (IT 25, 40 mpi). Therefore this

ganglion could indicate a fast centrifugal spread. For the first time this study detected BSE

infectivity in the PNS well before the initial involvement of the Medulla oblongata in six

animals. Four of these cows were positive at the Ggl. coeliacum, which contains both

sympathetic and parasympathetic fibers. Interestingly, both animals at 16 mpi and one animal

28 mpi showed infectivity exclusively in the sympathetic tissues of the Ggl. cervicale

craniale, Nn. splanchnici and Ggl. stellatum respectively. In contrast, in two animals

examined at 20 mpi, only parasympathetic tissues (Ggl. nodosum, N. vagus) revealed positive

results. Irrespective of these findings a mild lymphohistocytic ganglioneuritis was observed in

multiple ganglia and nerves.

In agreement with previous reports, the results of this study showed the centripetal spread of

the BSE-agent along parasympathetic and sympathetic nerves. However, the dominant and

early involvement of the sympathetic nervous system is novel. In this regard, the Ggl.

cervicale craniale has to be emphasized in terms of its anatomical and functional connections

to multiple cranial nerves. Therefore, this ganglion could be considered to play a crucial role

for the spread of the BSE-agent from the PNS to the different nuclei of the brain. Besides the

N. vagus, hitherto the spinal cord was considered to be involved in the primary centripetal

spread of the agent, but our results indicate that this is likely an additional pathway. Because

all animals showed positive findings in the PNS/CNS the definitive determination of the

initial onset of the centripetal spread cannot be confidently ascertained and further

investigations are warranted.

124 Literaturverzeichnis

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167

9.ANHANG

9.1 Histologische Methoden

9.1.1 Entparaffinierungs- und Differenzierungsprotokoll

Für die Entparaffinierung und Rehydrierung wurden die Schnitte wie folgt behandelt:

5 min Xylol

5 min Xylol

3 min Isopropanol

3 min Isopropanol

3 min 96% Ethanol

3 min 70% Ethanol

3 min 50% Ethanol

In der aufsteigenden Alkoholreihe wurden die Schnitte nach dem folgenden Protokoll

entwässert und am Ende mit Entellan und einem Deckglas auf dem Objektträger fixiert.

2 min 50 % Ethanol

2 min 70 % Ethanol

2 min 96 % Ethanol

2 min Isopropanol I

3 min Isopropanol II

3 min Xylol I

3 min Xylol II

9.2 Legende zur Verhaltensbeobachtung der Rinder

A. Herantreten des Tierpflegers

(1) neugierig, Kopf bleibt nach vorn gestreckt

(2) tritt rückwärts, weicht mit dem Kopf zurück

168

(3) schreckt ruckartig zurück, Kopf kracht heftig in das Fressgatter

B. Droh-Reflex (Hand bewegt sich in Richtung Tierkopf ohne diesen zu berühren)

(1) Tier zuckt nicht zurück, maximal leichtes Blinzeln

(2) Tier bewegt sich rückwärts, Blepharospasmus-Blinzeln

(3) rasches Zurückziehen des Kopfes mit/ohne Blepharospasmus

(4) schwere Überreaktion (Zurückspringen, Kopfschlagen, Schnauben, Brüllen)

C. Sensibilität am Kopf (mittels kleiner Arterienklemme am N. trigeminus/N. facialis)

(Ohr-Reflex, Lidreflex, Berührung der Nasenlöcher und des Flotzmauls)

(1) keine bis leichte Abwehrbewegung

(2) Abwehrbewegungen ohne Kopfschlagen / Schnauben, Kopfregionen können

präzise berührt werden

(3) Abwehrbewegungen mit Kopfschlagen / Schnauben, einzelne Kopfpartien

können nur schwer präzise berührt werden

(4) Schwere Überreaktion (Übererregung des Tieres mit heftigem Kopfschlagen

und extremer Unruhe, so dass Verletzungsgefahr für Tier oder Untersucher

besteht)

D. Blitzlicht-Probe (Test wird wiederholt: 2x bei leichter, 4x bei schwerer Über-Reaktion)

(1) keine Überreaktion beim ersten Test, max. leichtes Zusammenzucken

(2) Tier schreckt nur beim ersten Test zurück

(3) wechselweise keine Reaktion bzw. Überreaktion oder lediglich zwei

Reaktionen

(4) Überreaktion ist wiederholbar (mindestens drei aufeinanderfolgende

Reaktionen)

E. Klatsch-Test oder metallisches Geräusch

169

Ausführung hinter dem Tier stehend um zusätzlichen visuellen Stimulus zu

vermeiden; mind. 3x und weitere 2x, falls das Tier abwechselnd oder bei den ersten

zwei Tests überreagiert – dann jeweils das Tier beruhigen lassen

(1) keine Überreaktion, max. leichtes Zusammenzucken beim ersten Test

(2) Tier schreckt nur beim ersten Test zurück

(3) wechselweise keine Reaktion bzw. Überreaktion oder lediglich zwei

Reaktionen


Reaktionen)

F. Besen-Probe (mittels leichter Gerte jedes Bein mindestens ein Mal)

bei Reaktion wiederholen – Tier soll insgesamt ruhig dabei bleiben, ggf. einen

Moment warten)

(1) Tier steht ruhig

(2) Anheben eines oder abwechselnd beider Beine

(3) Leichtes, langsames Ausschlagen eines oder beider Beine

(4) Kräftiges, schnelles Ausschlagen ohne Verzögerung

G. Kondition

Beurteilung von 1-5 siehe Anlage „Body Condition Score“

H. Clipboard-Test

Das Tier steht frei 1-3m vor dem Untersucher, der 5x mit dem Clipboard in dessen

Augenhöhe wedelt – Tier muss vor jedem Wedeln ruhig sein

Achtung: Vorsicht vor aggressiven BSE-Tieren, die ggf. den Untersucher attackieren!

(1) normal (keine Überreaktion, max. leichtes Zusammenzucken beim ersten Test

(2) leichte Reaktion (Tier schreckt nur beim ersten Test zurück)

170

(3) zweifelhaft (wechselweise keine Reaktion bzw. Überreaktion oder lediglich

zwei Reaktionen)


Überreaktionen

I. Bewegung

Allgemein – das Tier wird hin- und her getrieben

(1) keine Auffälligkeiten

(2) Lahmheit, steifer Gang - ggf. Wertung von 1-5

(3) Ataxie – ggf. Wertung von 1-5

(4) Hypermetrie – welche Gliedmaßen

Verhalten während der Bewegungs-Beurteilung – freies Laufen

(1) kommt neugierig näher oder bleibt stur stehen, Berührung möglich

(2) leicht kopfscheu – Annährung von vorn möglich, lässt sich nur von hinten

berühren

(3) stark kopfscheu – Annährung nur von hinten möglich, flüchtet aber bei

Berührung

(4) hochgradig furchtsam und unsicher, flieht bei Annährung

Fluchtverhalten – Tier wird getrieben

(1) Berührung möglich, Tier läuft trotz des Treibens ruhig weiter

(2) Annährung möglich, verfällt bei Berührung in schnelleres Tempo

(3) flieht bei Annährung, lässt sich nicht berühren

(4) flüchtet in panischer Angst, heftige Galoppsprünge, Ausschlagen

J Weitere Symptome:

171

Zähneknirschen

Tremor durch Erregung/Nervosität (nicht zur Abwehr von Fliegen!)

Nase lecken

Flotzmaul rümpfen, flehmen ohne normalen Anlass

BSE-typische Verhaltensserien, z.B.:

- Kopfschlagen nach vorn, gefolgt von Kopfschlagen zur Seite mit Lecken der

Flanke

- Flotzmaul rümpfen und Zähneknirschen oder Flehmen gefolgt von Lecken des

Flotzmauls und Gähnen

9.3 Puffer und Lösungen

Soweit nicht anders angegeben, wurden die Puffer und Lösungen in Aqua dest. angesetzt.

9.3.1 Immunhistochemie

Proteinase K-Stammlösung

10 mg PK

in 10 ml Aqua dest.

Gebrauchslösung: 760 µl Proteinase K-Stammlösung in 190 ml PK-Puffer

3,5% gepuffertes Formalin nach Lillie (für 5 l)

500 ml 37% Formol

4500 ml Aqua dest.

20 g NaH2PO4 x H2O

32,5 g Na2HPO4 (wasserfrei) oder

40,75 g Na2HPO4 x 2H2O

10x PK-Puffer pH 8,3 (500ml):

30,28 g Tris

1,46 g EDTA

5 ml Tween

172

Der pH-Wert von 8,3 wird mit 37% HCl eingestellt.

Enzymsubstrat Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) pH 7,1

100 mg 3,3′-Diaminobenzidintetrahydrochlorid

Imidazol/HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,1) ad 200 ml

70 µl H2O2 (kurz vor Gebrauch zufügen)

10x TBS pH 7,6 (1000 ml)

60,57 g Tris

80,0 g NaCl

Der pH-Wert von 7,6 wird mit 37% HCl eingestellt.

Hämatoxylin

Siehe 3.4.2

9.3.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Mayer’s saures Hämatoxilin:

1 g Hämalaun

0,2 g NaJO3

50 g Kalialaun (Kaliumaluminiumsulfat zur Analyse)

50 g Chloralhydrat

1 g Zitronensäure zufügen

in 1000ml Aqua bidest lösen

Eosinlösung

1g Eosin gelblich

1 Tropfen Eisessig

in 100 ml 50% Ethanol lösen

173

9.3.3 Western Blot

APS 10 %

1 g Ammoniumpersulfat

in 10 ml Aqua dest.

Acrylamidgel

Trenngel, 16 %ig (zwei Gele) Sammelgel (zwei Gele)

Aqua dest. 3,0 ml Aqua dest. 6 ml

1,5 M Tris HCl (pH 8,8) 3,75 ml 0,5 M Tris HCl (pH 6,8) 2,5 ml

30 % Bis-Acrylamid 8,0 ml 30 % Bis-Acrylamid 1,3 ml

10 % SDS 750 µl 10 % SDS 500 µl

10 % APS 100 µl 10 % APS 200 µl

TEMED 10 µl TEMED 20 µl

Blottingpuffer für Western-Blot, pH 8,3

25 mM Tris

192 mM Glycin

20% (v/v) Methanol

0,2% (w/v) SDS

Lade-Puffer (10x)

10% (w/v) SDS

0,25 M Tris

25% (v/v) β-Mercaptoethanol

15% (w/v) Saccharose

0,05% (w/v) Bromphenolblau

pH 6,8 mit HCl einstellen, bei -20 °C lagern

Magermilch

5% (w/v) Magermilchpulver in PBS-Tween

Natriumhypochlorid (2,4%ig)

1 L Natriumhypochlorid (12%ig)

174

4 L Aqua dest.

Natronlauge (2 M)

80 g Natriumhydroxid

in 1 L Aqua dest.

PBS (10x)

1,4 M NaCl

27 mM KCl

65 mM Na2HPO4 x 2H2O

15 mM KH2PO4

pH 6,9 überprüfen; autoklavieren (121 °C, 20 min)

PBS mit 4% Sarkosyl (pH 7,4)

Sarkosyl 10 g

PBS ad 250 ml

PBS-Tween

1 L 1x PBS

0,1% (v/v) Tween 20

Pefabloc (0,1 M)

Pefabloc 100 mg

A. bidest. ad 4,17 ml

Powerstrippuffer

0,2 M Glycin

1% (w/v) SDS

pH 2,0 mit konzentrierter Salzsäure einstellen

4% PTA mit 34 mM MgCl2 (pH 7,4)

4 g PTA

691 mg Magnesiumchloridhexahydrat

Aqua. bidest. ad 100 ml

175

Der pH-Wert wurde mit Natronlauge (NaOH) eingestellt.

SDS (10%)

1 g Natriumdodecylsulfat (SDS)

in 10 ml Aqua dest.

Tris HCl (1,5 M; pH 8,8)

90,86 g Tris

in 500 ml Aqua dest.


Tris HCl (0,5 M; pH 6,8)

30,29 g Tris

in 500 ml Aqua dest.


176

DANKSAGUNG

„Am Ende wird alles gut. Und wenn es nicht gut ist, ist es nicht das Ende.“

Oscar Wilde

Viele Menschen haben mich über die letzten Jahre auf durchaus schwierigen Pfaden begleitet.

Das ich jetzt tatsächlich diese Arbeit zu einem erfolgreichen Abschluss bringen kann,

verdanke ich auch genau diesen Menschen. Und denen möchte ich an dieser Stelle danken.

Auch wenn sie vielleicht nicht namentlich erwähnt sind.

Prof. Dr. Martin H. Groschup, der mir mit der Überlassung des Themas die Tür zur TSE-

Forschung aufgestoßen hat, der viele weitere positive Erfahrungen folgten. Danke für die

Diskussionen und Anregungen, die Korrekturen trotz des vollen Terminkalenders und für Ihre

Geduld.

Prof. Dr. med. vet. Wolfgang Baumgärtner, der als Zweitgutachter ebenfalls entscheidend zur

Fertigstellung der Arbeit beigetragen hat.

Dr. Christine Fast, ohne Ihre Aufmunterungen, Anweisungen, Hilfestellungen und

Korrekturen hätte diese Arbeit niemals fertiggestellt werden können.

Danke an alle Mitarbeiter des INNT des Friedrich-Loeffler-Instituts. Herausstellen möchte ich

dabei Bärbel, Leila, Anja, Jule, Katja, Imke, Anne und Dan, die neben der fachlichen

Unterstützung auch für eine großartige Zeit außerhalb des Instituts gesorgt haben. Besondere

Aufmerksamkeit gilt den Tierpflegern Benn und Volker, die sich trotz aller Strapazen und

Widrigkeiten aufopferungsvoll um die Rinder gekümmert haben.

Und zum Schluss gilt mein Dank meiner Familie. Ihnen ist nicht nur diese Arbeit gewidmet,

es sei Ihnen auch für die bedingungslose Unterstützung in all diesen Jahren von Herzen

gedankt.

177

ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Ausbreitung der klassischen BSE-Prion-Erreger

vom Darm über das periphere Nervensystem zum Gehirn“ selbstständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

• _____________________________________________________________________

• _____________________________________________________________________

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir

unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im

Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

_________________________________________________________________________

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

___________________________________________

Martin Kaatz

Tierärztliche Hochschule Hannover...neuartige Tierseuchenerreger, Insel Riems-Greifswald 1....

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