Tierärztliche Hochschule Hannover · SDZ Sulfadiazin, sulfadiazine SF Sinus frontalis SI gesuchte...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Etablierung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Sulfonamidkonzentrationen

in der Nasennebenhöhlenschleimhaut des Pferdes

INAUGURAL-DISSERATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Caroline Gietz

Bremen

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Bernhard Ohnesorge

Klinik für Pferde

1. Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Ohnesorge 2. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer Tag der mündlichen Prüfung: 08.05.2012 Gefördert durch: CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH, Burgdorf

Meinen Eltern und Großeltern

Teile dieser Dissertation wurden in Form eines Vortrags auf folgender

Fachtagung präsentiert:

22. Arbeitstagung der Fachgruppe Pferdekrankheiten der Deutschen Veterinär-

medizinischen Gesellschaft e. V. in Hannover (2012):

GIETZ C, OHNESORGE B, KIETZMANN M, STAHL J, STASZYK C,

BIENERT-ZEIT A

Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Sulfadimidin in der Nasenneben-

höhlenschleimhaut von Pferden mittels Mikrodialyse.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Literaturübersicht 3

2.1 Sinusitis des Pferdes 3

2.1.1 Klinische Anatomie der Nasennebenhöhlen 3

2.1.2 Vorkommen von Sinusitiden 5

2.1.3 Ätiopathogenese von Sinusitiden 6

2.1.4 Symptome von Sinusitiden 7

2.1.5 Diagnose von Sinusitiden 8

2.1.6 Therapie von Sinusitiden 12

2.1.7 Prognose von Sinusitiden 14

2.2 Potenzierte Sulfonamide 15

2.2.1 Struktur und Klassifizierung 15

2.2.2 Pharmakokinetische Eigenschaften 16

2.2.3 Pharmakodynamische Eigenschaften 19

2.2.4 Resistenzen 23

2.2.5 Indikationen und Kontraindikationen 24

2.2.6 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen 25

2.2.7 Anmerkung zum verantwortungsbewussten Umgang mit Antiinfektiva in der Veterinärmedizin 27

2.2.8 Verwendetes Präparat 27

2.3 Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben 28

2.3.1 Definition: Zielgewebe von Antiinfektiva 28

2.3.2 Einflussfaktoren auf die Gewebegängigkeit von Antiinfektiva 29

2.3.3 Notwendigkeit der Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Ziel- geweben 31

2.3.4 Methoden zur Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben 33

2.4 Mikrodialyse 37

2.4.1 Grundprinzip der Mikrodialyse 37

2.4.2 Berechnung der Wiederfindung 38

2.4.3 Anwendung der Mikrodialyse 44

2.4.4 Vor- und Nachteile der Mikrodialyse 46

Inhaltsverzeichnis

3 Material und Methoden 47

3.1 Vorversuche 47

3.1.1 Implantation des Mikrodialysekatheters 47

3.1.2 In-vitro-Kalibration der Mikrodialysekatheter 48

3.2 Hauptversuch 53

4 Ergebnisse 55

4.1 Vorversuche 55

4.1.1 Implantation des Mikrodialysekatheters 55

4.1.2 In-vitro-Kalibration der Mikrodialysekatheter 57

4.2 Hauptversuch 58

5 Manuscript I 61

5.1 Abstract 61

5.2 Introduction 62

5.3 Materials and Methods 63

5.3.1 Horses 63

5.3.2 Microdialysis equipment 64

5.3.3 Microdialysis probe implantation 64

5.3.4 In vivo microdialysis study 67

5.3.5 Post-surgical treatment 67

5.3.6 Histological analysis 68

5.4 Results 68

5.4.1 Microdialysis probe implantation 68

5.4.2 In vivo microdialysis study 69

5.4.3 Post-surgical outcome 70

5.4.4 Histological analysis 71

5.5 Discussion 72

5.6 Conclusion 75

5.7 Tables and Figures 76

Inhaltsverzeichnis

6 Manuscript II 81

6.1 Abstract 81

6.2 Introduction 82

6.3 Materials and Methods 84

6.3.1 Horses 84

6.3.2 Microdialysis equipment and probe implantation 84

6.3.3 Reagents 85

6.3.4 In vivo experiment 85

6.3.5 Drug analysis 86

6.3.6 Calculation of recovery values and paranasal mucosa concentrations 87

6.3.7 Data analysis 88

6.4 Results 88

6.5 Discussion 90

6.6 Conclusion 95

6.7 Figures and Tables 96

7 Übergreifende Diskussion 99

7.1 Implantation des Mikrodialysekatheters 99

7.1.1 Methodisches Vorgehen 99

7.1.2 Auswirkungen der Katheterimplantation auf Knochen und Schleimhaut 100

7.1.3 Eignung des verwendeten Mikrodialysesystems für die Anwendung in der Nasennebenhöhle des Pferdes 102

7.2 Mikrodialyse 103

7.2.1 Kalibration des Mikrodialysesystems 103

7.2.2 Schwankungen der Dialysatvolumina 106

7.3 Sulfadimidinkonzentration 107

7.3.1 Nachweis von Sulfadimidin im Mikrodialysat und Berechnung der Sulfadimidinkonzentrationen in der Nasennebenhöhlenschleimhaut 107

7.3.2 Beziehung zwischen den Wirkstoffkonzentrationen im Plasma und in der Nasennebenhöhlenschleimhaut 108

7.3.3 Pharmakokinetische Simulation 108

7.3.4 Gewebekonzentration im Verhältnis zu MHK-Werten 111

7.3.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die Gewebekonzentration 111

Inhaltsverzeichnis

7.4 Auswirkungen der Mikrodialyse-Studie auf die Pferde 113

7.4.1 Postoperative Auswirkungen der Katheterimplantation 113

7.4.2 Durchführung In-vivo-Mikrodialyse-Studie 114

7.5 Schlussfolgerungen 115

8 Zusammenfassung 117

9 Summary 119

10 Literaturverzeichnis 121

11 Danksagung 141

Abkürzungsverzeichnis


Abb. Abbildung

AP Appaloosa

AR Araber, Arabian

AUC Fläche unter der Kurve, area under the curve

AUMC Fläche unter der ersten-Moment-Kurve, area under the first moment curve

bilat. bilateral

bzw. beziehungsweise

C Konzentration, concentration

C0 Initialwirkstoffkonzentration, initial drug concentration

Clast Wirkstoffkonzentration zur Zeit des letzten Probenentnahmezeitpunktes innerhalb eines Dosierungsintervalls, drug concentration at the last observation during the respective dosing interval

Cmax maximale Wirkstoffkonzentration, maximum drug concentration

ca. circa

Ch. Kapitel, chapter

Cl Gesamtkörperclearence, total body clearence

cm Zentimeter, centimeter

CMS Sinus maxillaris caudalis

CT Computertomographie

d Tag(e), day(s)

d. h. das heißt

DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraacetat, ethylendiamintetraacetic acid

e. g. exempli gratia

http://www.duden.de/rechtschreibung/DNA#Bedeutunga


EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products

et al. et alii

etc. et cetera

evtl. eventuell

F weiblich, female

FDA Food and Drug Administration

Fig. Abbildung, figure

FS Sinus frontalis

g Gramm, gram

ggf. gegebenenfalls

h Stunde(n), hour(s)

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, high-performance liquid chromatography

HWZ Halbwertszeit

i. d. R. in der Regel

IS interner Standard, internal standard

ISF interstitielle Flüssigkeit, interstitial fluid

i. v., IV intravenös, intravenous(ly)

k. A. keine Angabe

Kap. Kapitel

kg Kilogram, kilogram

l Liter, liter

L links, left

Lnn. mand. Lymphonodus mandibularis

M männlich, male

MD Mikrodialyse, microdialysis


µg Mikrogramm, microgram

mg Milligramm, milligram

MHK minimale Hemmkonzentration

MIC minimale Hemmkonzentration, minimal inhibitory concentration

Min, min Minute(n), minute(s)

µl, µL Mikroliter, microliter

µm Mikrometer, micrometer

mm Millimeter, millimeter

Mo. Monat(e), month(s)

MRT mittlere Verweildauer, mean residence time

MW Mittelwert

n Anzahl, amount

NA Nasenausfluss

ND Nasenausfluss, nasal discharge

NMA Apertura nasomaxillaris

NNH Nasennebenhöhle(n)

No. Nummer, number

NQ nicht quantifizierbar

Nr. Nummer

NSAID nicht-steroidale Antiphlogistika, non-steroidal anti-inflammatory drugs

OAW obere Atemwege

PBS phosphat-gepufferte Salzlösung, phosphate buffered saline

PEH progressives Siebbeinhämatom

PD Pharmakodynamik, pharmacodynamic

pH negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration


PK Pharmakokinetik, pharmacokinetic

pKa negativ dekadischer Logarithmus der Ionisationskonstante einer Säure

q quaque: jede, every

R rechts, right

Ref. Referenzphase

RL relativer Verlust, relative loss

RMS Sinus maxillaris rostralis

rpm Umdrehungen pro Minute, revolutions per minute

RR relative Wiederfindung, relative recovery

s Sekunde(n), second(s)

S Sulfonamid

SD Standardabweichung, standard deviation

SDM Sulfadimidin, sulfadimidine

SDZ Sulfadiazin, sulfadiazine

SF Sinus frontalis

SI gesuchte Substanz, substance of interest

sog. sogenannt

ssp. subspecies

ST Traber, Standardbred

Staph. Staphylococcus

Strept. Streptococcus

t Zeit, time

tmax Zeit bis zum Erreichen der maximalen Wirkstoffkonzentration, time to reach maximum drug concentration

t1/2 Halbwertszeit, elimination half-life

Tab. Tabelle, table


TMP Trimethoprim

TMS Trimethoprim-Sulfonamid, trimethoprim-sulfonamide

US Untersuchung

U. S. United States (of America)

Vss Verteilungsvolumen im Steady State, volume of distribution at steady state

Vz Verteilungsvolumen während der terminalen Phase, volume of distribution based on the terminal phase

v. a. vor allem

vs. versus

WB Warmblut, warmblood

y Jahr(e), year(s)

z. B. zum Beispiel

°C Grad Celsius, degree Celcius

% Prozent, percent

λz terminale Dispositionskonstante, elimination rate constant

< kleiner als, less than

> größer als, greater than

≤ kleiner oder gleich, less than or equal to

≥ größer oder gleich, greater than or equal to

= gleich, equals

~ ungefähr, approximately

Die chemischen Elemente werden gemäß des internationalen Periodensystems abgekürzt.

Einleitung 1

1 Einleitung

Die Sinusitis des Pferdes stellt die häufigste Erkrankung der Nasennebenhöhlen

(NNH) des Pferdes dar (NICKELS 2006). Bei der Therapie von equinen Sinusitiden

werden vielfach Antiinfektiva eingesetzt, obwohl regelmäßig unzureichende

Therapieerfolge beschrieben worden sind (MASON 1975; BOULTON 1985;

TROTTER 1993; TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON u. O'LEARY 2012). Der

klinische Erfolg einer antimikrobiellen Therapie ist in hohem Maße davon abhängig,

ob und über welchen Zeitraum effektive Wirkstoffkonzentrationen am Ort der

Infektion erreicht werden (MCKENZIE 2009). Subinhibitorische

Wirkstoffkonzentrationen können eine Persistenz der Erreger zur Folge haben,

welche ihrerseits mit einem Therapieversagen und der Entstehung von bakteriellen

Resistenzen vergesellschaftet sein kann (MÜLLER et al. 2004; STEINER et al.

2004). Diese Aspekte sollten auch bei der Therapie equiner Sinusitiden in Betracht

gezogen werden.

Innerhalb eines Gewebes ist eine bakterielle Infektion zumeist auf den interstitiellen

Raum begrenzt, welcher somit das Zielgewebe für einen antimikrobiellen Wirkstoff

darstellt. Lediglich der nicht-plasmaproteingebundene Wirkstoffanteil kann

Kapillarmembranen überwinden und aus dem Plasmakompartiment in die

interstitielle Flüssigkeit übertreten (RYAN 1993). In Bezug auf Antiinfektiva bedeutet

dies, dass nur der ungebundene Wirkstoffanteil seine antimikrobielle Wirkung in der

interstitiellen Flüssigkeit (ISF) entfalten kann. Das Konzentrationsprofil eines

antimikrobiellen Wirkstoffs im Zielgewebe ist in besonderem Maße geeignet den

klinischen Erfolg einer Therapie abzuschätzen, daher sollten

Wirkstoffkonzentrationen direkt am Ort der Infektion, d. h. im Interstitium des zu

untersuchenden Gewebes bestimmt werden (JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et

al. 2004). Die Mikrodialyse (MD) stellt eine Methode dar, welche die gezielte

Bestimmung des pharmakologisch aktiven Wirkstoffanteils in der ISF ermöglicht

(MÜLLER et al. 1996; JOUKHADAR et al. 2001; BRUNNER et al. 2005;

CHAURASIA et al. 2007). Diese Technik ist bereits zur Untersuchung

2 Einleitung

verschiedenster Wirkstoffe in humanen und tierischen Geweben, jedoch nicht im

Bereich der NNH, eingesetzt worden.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Methode der MD für die

Anwendung in der NNH-Schleimhaut des Pferdes etabliert. Dies beinhaltete

zunächst die Methodenentwicklung zur Implantation eines MD-Katheters in die NNH

von Pferden. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die kontinuierliche Bestimmung des

pharmakologisch aktiven Wirkstoffanteils des Antiinfektivums Sulfadimidin in der

NNH-Schleimhaut von Pferden mithilfe der In-vivo-MD nach systemischer

Wirkstoffapplikation.

Literaturübersicht 3

2 Literaturübersicht

2.1 Sinusitis des Pferdes

2.1.1 Klinische Anatomie der Nasennebenhöhlen

Die NNH stellen luftgefüllte und mit respiratorischer Schleimhaut ausgekleidete

Hohlräume dar, die sich ausgehend von der Nasenhöhle zwischen den Außen- und

Innenlamellen einzelner Schädelknochen entwickelt haben. Das Pferd besitzt sieben

paarige NNH (Abb. 2.1), welche in direkter und indirekter Verbindung mit der

Nasenhöhle der jeweiligen Seite stehen (NICKEL et al. 2001):

Stirnhöhle (Sinus frontalis)

rostrale Kieferhöhle (Sinus maxillaris rostralis)

kaudale Kieferhöhle (Sinus maxillaris caudalis)

Gaumenkeilbeinhöhle (Sinus sphenopalatinus)

dorsale Muschelhöhle (Sinus conchae dorsalis)

mittlere Muschelhöhle (Sinus conchae mediae)

ventrale Muschelhöhle (Sinus conchae ventralis)

Ein knöchernes Septum (Septum sinuum maxillarium) trennt die kleinere rostrale

Kieferhöhle von der größeren kaudalen und lässt so zwei funktionelle Kompartimente

innerhalb des NNH-Systems entstehen.


Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Nasennebenhöhlen des Pferdes (Sinus conchae mediae nicht dargestellt) (KÖNIG u. LIEBICH 2009).

Die NNH des Pferdes sind mit einer respiratorischen Schleimhaut ausgekleidet, die

bei gesunden Pferden einen glatten, feuchtglänzenden, rosafarbenen Überzug der

knöchernen Unterlage (TREMAINE et al. 1999) von 0,05 bis maximal 0,25 mm Dicke

(JLLIG 1910) darstellt. Auf histologischer Ebene (Abb. 2.2) besteht sie aus einem

zwei- bis vierschichtigen Flimmerepithel (Lamina epithelialis), welches vereinzelt

Becherzellen enthält. Die daruntergelegenen subepithelialen Schichten, Lamina

propria mucosae und Tela submucosa, bestehen aus einem lockeren Bindegewebe,

welches eine enge Verbindung mit dem sich knochenwärts anschließenden Periost

eingeht. Eingebettet in diese Schichten finden sich zahlreiche Gefäße und Drüsen

(JLLIG 1910; TREMAINE et al. 1999), letztere produzieren kontinuierlich ein

muköses Sekret, welches aktiv durch den ziliären Transportmechanismus in

Richtung der sinunasalen Öffnung (Apertura nasomaxillaris; NMA) transportiert wird

(BARAKZAI 2004). Über den so genannten „sinus drainage angle“ (Abflusswinkel) im

kaudalen Abschnitt des mittleren Nasenganges gelangt das Sekret in die kaudale

Nasenhöhle, von dort aus wird es weiter in den Nasopharynx transportiert und

schließlich abgeschluckt. Das Auftreten größerer Sekretmengen kann das

mukoziliäre Transportsystem überfordern, die Folge ist das Abfließen des Sekrets in

Richtung der Nüstern als Nasenausfluss (O'LEARY u. DIXON 2011).


Abb. 2.2: Histologischer Schnitt durch die paranasale Schleimhaut eines Pferdes (Sinus frontalis). Die Lamina epithelialis (a) bildet ein mehrreihiges Flimmerepithel, welches vereinzelte Becherzellen (Pfeile) enthält. Knochenwärts schließen sich die subepithelialen Schichten (b) an, welche schließlich in das Periost (c) des Knochens (d) übergehen. (Bild: eigene Untersuchung)

2.1.2 Vorkommen von Sinusitiden

Der Begriff Sinusitis beschreibt die entzündliche Erkrankung der NNH. Die Inzidenz

von Erkrankungen der Nasen- und Nasennebenhöhlen des Pferdes wird von

BOULTON (1985) mit 1,06 % aller Patienten beziffert.

Sinusitiden können primär, d. h. ohne erkennbare prädisponierende Ursache, oder

sekundär als Folge von Erkrankungen der Zähne oder der NNH (Mykose,

Sinuszyste, progressives Siebbeinhämatom, Neoplasie, Trauma) auftreten

(O'LEARY u. DIXON 2011). Die Sinusitis des Pferdes ist zumeist sekundär bedingt,

ungefähr die Hälfte der Erkrankungen sind dentogenen Ursprungs (MASON 1975;

FEIGE et al. 2000; STOIAN et al. 2006). Sinusitiden treten beim Pferd i. d. R.

einseitig auf, können aber in seltenen Fällen auch bilateral vorkommen (TREMAINE

a

b

d

c

100 µm


u. FREEMAN 2007; O'LEARY u. DIXON 2011). Die Mehrheit der Pferde befindet sich

bei Vorstellung bereits in einem chronischen Krankheitsstadium (BOULTON 1985;

TREMAINE u. DIXON 2001a). Es sind weder Alters-, Rasse- noch

Geschlechtsprädispositionen für bestimmte Formen der Sinusitis nachweisbar

(TREMAINE u. FREEMAN 2007).

2.1.3 Ätiopathogenese von Sinusitiden

Es gibt drei Schlüsselelemente, welche die physiologische Funktion der NNH

maßgeblich beeinflussen (REIMER et al. 1978): die Durchgängigkeit der natürlichen

Drainagewege, die Funktion des mukoziliären Systems sowie die Qualität und die

Menge der Sekrete. Diese Faktoren beeinflussen einander und so kann sich die

Störung eines dieser Faktoren nachteilig auf das gesamte System der NNH

auswirken.

Das Einwirken eines entzündlichen Reizes auf die Schleimhaut führt zu einer

erhöhten Sekretproduktion sowie zu einer Obstruktion der ohnehin englumigen NMA

durch hyperplastische und hypertrophische Veränderungen der Schleimhaut

(SIMHOFER u. ZETNER 2003; TREMAINE u. FREEMAN 2007). Dieses

Ungleichgewicht hat eine Ansammlung von Sekret und entzündlichem Exsudat in

den NNH zur Folge. Einwandernde Bakterien finden dadurch günstige

Wachstumsbedingungen vor (O'LEARY u. DIXON 2011). Eine granulozytäre

Einwanderung und Phagozytose führen schließlich zur Ausbildung eines Empyems

(SIMHOFER u. ZETNER 2003). Im weiteren Verlauf kann eingetrockneter Eiter

weitere Entzündungserscheinungen hervorrufen und so die Voraussetzungen für die

chronische Manifestation der Sinusitis schaffen (PERKINS u. BARAKZAI 2005;

DIXON u. O'LEARY 2012).

Primäre Sinusitis

Bakterielle oder virale Infektionen der oberen Atemwege schädigen das mukoziliäre

Reinigungssystem der paranasalen Schleimhaut und führen zu einer Stagnation von

Sekreten in den betroffenen Sinuskompartimenten mit den oben genannten

Konsequenzen (RUSH u. MAIR 2004). Bakterielle Erreger, die bei primären


Sinusitiden kulturell nachgewiesen werden können, sind typischerweise β-

hämolysierende Streptokokken (BEARD u. HARDY 2001). Seltener werden auch

Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides ssp., Escherichia coli, Staphylococcus ssp.,

Peptostreptococcus ssp. und Corynebacterium ssp. nachgewiesen (RUGGLES et al.

1993), wobei die ätiologische Bedeutung der Erreger häufig unklar bleibt

(TREMAINE u. FREEMAN 2007).

Es scheint, dass ältere Ponys mit equinem Cushing-Syndrom eine Prädisposition für

chronische oder rekurrierende Sinusitiden haben (TREMAINE u. DIXON 2001a;

RUSH u. MAIR 2004). Möglicherweise besteht ein Zusammenhang mit peridontalen

Erkrankungen und einer Immunsuppression durch Hyperadrenocortizismus (RUSH

u. MAIR 2004).

Sekundäre Sinusitiden

Bei sekundären Sinusitiden können einerseits Bakterien, die durch eine primäre

Grunderkrankung in die Sinus gelangt sind, zu den oben beschriebenen

entzündlichen Veränderungen führen, andererseits können raumfordernde Prozesse

in den NNH zu einer Obstruktion der NMA führen und so den Abfluss der

natürlicherweise auftretenden Sekrete verhindern (O'LEARY u. DIXON 2011).

Einzelheiten zu den Grunderkrankungen sind in Tab. 2.1 aufgeführt.

2.1.4 Symptome von Sinusitiden

Typischerweise werden Sinusitiden von einem einseitigen, mukopurulenten oder

purulenten Nasenausfluss begleitet (Tab. 2.1). Schwellungen im Angesichtsbereich

treten vermehrt bei Sinuszysten, sinunasalen Neoplasien und Traumata auf, d. h. vor

allem bei Läsionen, die mit raumfordernden Prozessen einhergehen (TREMAINE u.

DIXON 2001a). Auch die benachbarten Strukturen der Sinus, wie die

Nasenmuscheln, das Nasenseptum, die knöcherne Orbita oder der Ductus

nasolacrimalis können von diesen Mechanismen betroffen sein. In der Folge kann es

zur Verlegung der Nasengänge mit Dyspnoe und Stridor sowie zu Exophthalmus und

Epiphora kommen (BERTONE et al. 1993; FREEMAN 2003). Weiterhin sind

regelmäßig Vergrößerungen der ipsilateralen, mandibulären Lymphknoten


feststellbar; Fistelbildungen im Angesichtsbereich hingegen sind seltener zu

beobachten und zumeist begleitend bei dentalen Sinusitiden und sinunasalen

Traumata (TREMAINE u. DIXON 2001a).

2.1.5 Diagnose von Sinusitiden

Die Diagnose sinunasaler Erkrankungen wird durch die Größe und räumliche

Ausdehnung der beteiligten Strukturen und ihre komplexe Anatomie erschwert. Hinzu

kommt, dass sich die Erkrankungen bei Diagnosestellung meist bereits in einem

chronischen Stadium befinden (FREEMAN 2003).

Klinische Allgemeinuntersuchung

Die Durchführung der klinischen Allgemeinuntersuchung ist an anderer Stelle

ausführlich beschrieben (GLITZ u. DEEGEN 2010). Bei Verdacht auf das Vorliegen

einer sinunasalen Erkrankung ist v. a. auf etwaigen Nasenausfluss und dessen

Charakter zu achten. Ein abgeschwächter oder seitenvergleichend ungleichmäßiger

Luftstrom aus den Nüstern sowie abnormale Atemgeräusche bei In- und Exspiration

geben Hinweise auf eine Einengung der Nasengänge (BEARD u. HARDY 2001).

Schwellungen im Angesichtsbereich mit möglicherweise asymmetrischer

Ausprägung, Exophthalmus und Epiphora deuten auf raumfordernde Prozesse in

den Sinus hin. Die Untersuchung mittels Perkussion ist auf die Stirn- und

Kieferhöhlen beschränkt: ein dumpfer Schall kann das Vorhandensein von

Flüssigkeit oder pathologischen Gewebsmassen in diesen Sinus anzeigen, jedoch

gilt diese Technik als wenig zuverlässig (BERTONE et al. 1993; FREEMAN 2003).

Auch Vergrößerungen der mandibulären Lymphknoten (i. d. R. einseitig) können

regelmäßig bei sinunasalen Erkrankungen festgestellt werden (TREMAINE u. DIXON

2001a).

Untersuchung der Maulhöhle

Die Untersuchung der Maulhöhle (EASLEY 1998) kann wichtige Hinweise auf

mögliche dentale Ursachen einer Sinusitis liefern. Frakturierte Backenzähne im

Bereich des Oberkiefers sowie – vorrangig bei jüngeren Pferden – eröffnete


Pulpenhöhlen und Diastasen oder andere tiefe periodontale Erkrankungen bei

älteren Pferden können Auslöser für Sinusitiden sein (O'LEARY u. DIXON 2011).

Gelegentlich können Ausführungsgänge in der Gingiva beobachtet werden, die auf

das Vorliegen oro-maxillärer Fisteln hindeuten (BEARD u. HARDY 2001).

Proliferative Weichteilmassen am harten Gaumen sprechen für neoplastische

Vorgänge, die auch die NNH betreffen können (BEARD u. HARDY 2001; O'LEARY

u. DIXON 2011).

Endoskopie

Die nasale Endoskopie ermöglicht die nicht-invasive Untersuchung der Nasenhöhle

und dient bei Sinusitiden vor allem dem Ausschluss differentialdiagnostischer

Erkrankungen der oberen und tiefen Atemwege (BEARD u. HARDY 2001;

FREEMAN 2003). Die Nasengänge werden nach vorhandenem Sekret bzw.

Exsudat, mykotischen Läsionen, Traumata und sinunasalen Fisteln abgesucht

(O'LEARY u. DIXON 2011). Deutliche Hinweise auf das Vorliegen pathologischer

Veränderungen in den Sinus geben der Abfluss von entzündlichem Exsudat oder das

Herausragen von Gewebe aus der NMA. In seltenen Fällen kann es möglich sein, die

Sinus während einer nasalen Endoskopie zu untersuchen, dies gilt z. B. für Pferde

mit vorhergehendem operativen Eingriff in diesem Bereich (BEARD u. HARDY

2001).

Röntgen

Typische röntgenologische Befunde bei Sinusitiden sind Flüssigkeitsansammlungen

in den Sinus, die sich auf laterolateralen Aufnahmen in Form von horizontalen Linien

zeigen, wobei die Bereiche unterhalb der Linien eine höhere Dichte aufweisen als

jene darüber (BARAKZAI u. MCALLISTER 2007). Primäre Sinusitiden verursachen

durch eine stark angeschwollene Schleimhaut und/oder Eiteransammlungen häufig

diffuse Verschattungen im Bereich der Sinus (O'LEARY u. DIXON 2011). Die

meisten raumfordernden Läsionen der NNH stellen sich röntgenologisch ähnlich dar,

nämlich als runde, expansive, weichteildichte Strukturen (BEARD u. HARDY 2001).


Refe

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Weitere bildgebende Verfahren

Moderne bildgebende Verfahren wie die Computertomographie (HENNINGER et al.

2003), die Magnetresonanztomographie (ARENCIBIA et al. 2000) sowie die

Szintigraphie (BARAKZAI et al. 2006) finden ihren Einsatz vor allem in der

Absicherung und Ergänzung der röntgenologischen Untersuchungsergebnisse.

Sinuszentese

Die Sinuszentese erlaubt den Zugang zu den NNH unter minimalinvasiven

Bedingungen. Diese Technik ist geeignet um Flüssigkeiten für zytologische oder

bakteriologische Untersuchungen aus den Sinus bzw. um Gewebebiopsien für

histologische Untersuchungen zu gewinnen (BERTONE et al. 1993). Die Zentese

kann am stehenden, sedierten Pferd nach aseptischer Vorbereitung und

Lokalanästhesie mittels eines Steinman-Pins (2 - 4 mm) oder einer Kanüle

(16 Gauge) erfolgen (FREEMAN 2003). Die Lokalisationen für eine Zentese der

entsprechenden Kieferhöhlen sind an anderer Stelle ausführlich beschrieben

(RUGGLES et al. 1991; BERTONE et al. 1993).

Sinuskopie

Die Sinuskopie erlaubt – nach Trepanation der Stirn- oder Kieferhöhlen – die

Untersuchung der meisten Strukturen innerhalb der NNH und ggf. die gleichzeitige

Entnahme von Biopsien unter direkter Sichtkontrolle (BEARD u. HARDY 2001;

O'LEARY u. DIXON 2011). Sie ermöglicht die adspektorische Beurteilung der

paranasalen Schleimhaut und der darunterliegenden Alveolen sowie den Nachweis

von Flüssigkeitsansammlungen, mykotischen Plaques und abnormen Geweben

(progressives Siebbeinhämatom, Sinuszyste, Neoplasie).

Die Lokalisationen für die Endoskopieportale wurden wie im Folgenden aufgeführt

von RUGGLES et al. (1991) und BERTONE et al. (1993) beschrieben:

Sinus frontalis: 60 % der Strecke zwischen dorsaler Mittellinie des Kopfes und

medialem Augenwinkel in laterale Richtung und 0,5 cm kaudal dieser Linie


Sinus maxillaris caudalis: 2 cm rostral und 2 cm ventral des medialen

Augenwinkels

Sinus maxillaris rostralis: 50 % der Strecke zwischen dem rostralen Ende der

Crista facialis und dem medialen Augenwinkel sowie 1 cm ventral der

Verbindungslinie zwischen Foramen infraorbitalis und medialem Augenwinkel

Histopathologie

Eine Biopsieentnahme kann während einer Sinuszentese oder einer Sinuskopie

erfolgen (TREMAINE et al. 1999). Bei der Auswertung der Biopsien ist zu beachten,

dass häufig nur sekundäre pathologische Veränderungen nachgewiesen werden

können, jedoch kaum Hinweise auf die eigentliche Ursache zu finden sind

(TREMAINE et al. 1999; O'LEARY u. DIXON 2011).

2.1.6 Therapie von Sinusitiden

Primäre Sinusitis – konservativ

Die Wiederherstellung einer adäquaten Abflussmöglichkeit und einer aktiven

mukoziliären Selbstreinigung (Clearence) ist das vorrangige Therapieziel bei

primären Sinusitiden (LANE 1993b). Im akuten Stadium primärer Sinusitiden können

Dampfinhalation (RUSH u. MAIR 2004) oder Mukolytika (PERKINS u. BARAKZAI

2005) den Abfluss von Exsudat aus den NNH fördern. Nicht-steroidale

Antiphlogistika wie Phenylbutazon oder Flunixin-Meglumin können dazu beitragen,

Schwellungen der Drainageöffnungen und weitere Entzündungserscheinungen zu

reduzieren (FREEMAN 1991). Weiterhin sollten die Patienten vom Boden gefüttert

(PERKINS u. BARAKZAI 2005) und leicht bewegt werden, da dies die

Schleimsekretion und den Abfluss der Exsudate fördert (TROTTER 1993).

Der systemische Einsatz von Antiinfektiva ist nur bei bakteriell bedingten Sinusitiden

angezeigt (DIXON u. O'LEARY 2012) und sollte erst nach eingehender Diagnostik

und in Verbindung mit weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen (BEARD u.

HARDY 2001). Der alleinige Einsatz einer systemischen, antimikrobiellen Therapie


kann zwar in Einzelfällen zielführend sein, jedoch wird eine komplette Eliminierung

der Infektion selten erreicht (TROTTER 1993; TREMAINE u. DIXON 2001b). Von

einer (alleinigen) Langzeittherapie mit Antibiotika ist aufgrund des Risikos von sich

möglicherweise entwickelnden Resistenzen abzuraten (SCOTT 1987). Die Auswahl

des Antiinfektivums sollte individuell nach Antibiogramm erfolgen (FREEMAN 2003).

Primäre Sinusitis – chirurgisch

In Fällen chronischer Sinusitiden, in denen konservative Maßnahmen keine oder nur

eine temporäre Besserung erbringen, ist häufig eingedickter Eiter in den Sinus für

das Sistieren und Fortschreiten der Krankheit verantwortlich (SCHUMACHER et al.

1987; TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON u. O'LEARY 2012). Um dies zu

verhindern, wird ein chirurgisches Eingreifen notwendig.

Die Sinuslavage stellt eine minimalinvasive Möglichkeit dar, angesammelte

Flüssigkeit und ggf. eingedickten Eiter aus den Sinus zu spülen und so die bakterielle

Population in den betroffenen NNH zu dezimieren (SCOTT 1987; FREEMAN 1991).

Es wird dafür – nach Trepanation (Kap. 2.1.5) – ein großlumiger Verweilkatheter in

die Stirn- oder Kieferhöhle eingebracht, welcher es erlaubt die NNH über mehrere

Tage oder Wochen mehrmals täglich mit großen Volumina (4 - 5 l) körperwarmer

Lösungen zu spülen (TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON u. O'LEARY 2012). Als

Spülflüssigkeit eignen sich 0,9-prozentige Natriumchloridlösung sowie

hochverdünnte Povidoniod-Lösung (PERKINS u. BARAKZAI 2005), ggf. unter Zusatz

von antimikrobiellen Substanzen oder Enzymen (z. B. Trypsin), wobei deren

Anwendung umstritten ist (FREEMAN 1991). Die Spülungen werden solange

wiederholt, bis die abfließende Flüssigkeit klar und geruchlos ist (TREMAINE u.

DIXON 2001b).

Sollte sich das eitrige Sekret durch die Lavage nicht lösen oder die Schleimhaut

bereits stark verändert sein, kann eine Sinustomie in Form eines frontonasalen oder

eines maxillären Boneflaps durchgeführt werden (FREEMAN et al. 1990;

SCHUMACHER et al. 2000; NICKELS 2006). Diese Öffnungen erlauben eine

chirurgische Entfernung der Exsudate und die Kürettage abnormer


Schleimhautbereiche unter Sichtkontrolle. Am Ende des Eingriffs wird mitunter eine

sinunasale Fistel im Dach der ventralen Nasenmuschel geschaffen, die den Abfluss

von Exsudat in die Nasenhöhle ermöglichen soll; der Nutzen einer solchen Fistel gilt

jedoch inzwischen als fragwürdig (SCHUMACHER et al. 2000; TREMAINE u. DIXON

2001b).

Sekundäre Sinusitis

Bei sekundären Sinusitiden steht die Therapie der zugrundeliegenden Erkrankung im

Vordergrund (Tab. 2.1), die Sinusitis selbst wird mit den oben genannten

begleitenden Maßnahmen behandelt.

2.1.7 Prognose von Sinusitiden

Die Prognose für akute, primäre Sinusitiden ist generell gut (TREMAINE u. DIXON

2001b). Bei sekundären Sinusitiden ist die Prognose maßgeblich von der

Grunderkrankung abhängig: bei dentogenen, mykotischen, traumatischen sowie

durch Sinuszysten verursachten Sinusitiden ist die Prognose grundsätzlich gut

(TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON et al. 2011). Es ist jedoch davon auszugehen,

dass die Therapie von chronischen NNH-Entzündungen langwierig sein kann und

mehrere Behandlungen erfordert (TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON et al. 2011).

Progressive Siebbeinhämatome neigen zu Rezidiven, daher ist die Prognose hier

vorsichtig einzuschätzen. Liegt der Sinusitis ein malignes, neoplastisches

Geschehen zugrunde, so ist die Prognose schlecht (TREMAINE u. DIXON 2001b;

DIXON et al. 2011).


2.2 Potenzierte Sulfonamide

2.2.1 Struktur und Klassifizierung

Potenzierte Sulfonamide bestehen aus einem Sulfonamid und einem antibakteriell

wirksamen Diaminopyrimidin (PRESCOTT 2006). Es handelt sich bei den beiden

Substanzen um synthetisch hergestellte Chemotherapeutika (SKOLD 2001), welche

– im Gegensatz zu rein fermentativ hergestellten Antibiotika – auch als Antiinfektiva

bezeichnet werden (TROLLDENIER u. UNGEMACH 2000).

Sämtliche Sulfonamide sind Derivate des Sulfanilamids, welches strukturell der Para-

Aminobenzoesäure (PABA) ähnelt (PAPICH u. RIVIERE 2009) und damit die

Voraussetzungen für die antimikrobielle Aktivität bildet (PRESCOTT 2006). Die

Grundstruktur aller Sulfonamide besteht aus einer Amidgruppe (-SO2NHR), die an

einen Benzolring gebunden ist und einer paraständigen Aminogruppe (-NH2). Die

einzelnen Derivate unterscheiden sich durch funktionelle Gruppen, welche üblicher-

weise an die Amidgruppe gebunden sind oder (seltener) die Aminogruppe

substituieren (Abb. 2.3). Die entstehenden Derivate unterscheiden sich in ihren

physikochemikalischen und pharmakokinetischen Eigenschaften sowie in dem Grad

ihrer antimikrobiellen Aktivität (PRESCOTT 2006).

Abb. 2.3: Struktur des Sulfadimidins (links) und des Sulfadiazins (rechts) (PRESCOTT 2006).

Die antibakteriell wirksamen Diaminopyrimidine (Trimethoprim, Aditoprim,

Baquiloprim, Ormetoprim) bestehen aus einem Pyrimidinring, an den typischerweise

zwei Aminogruppen sowie unterschiedliche funktionelle Gruppen gebunden sind

(Abb. 2.4). Die verschiedenen Diaminopyrimidine ähneln sich in ihrer antimikrobiellen


Wirksamkeit, wobei die anderen Diaminopyrimidine dem Trimethoprim (TMP) in

Hinblick auf die Gewebeverteilung und längere Halbwertszeiten überlegen sind

(PRESCOTT 2006).

Abb. 2.4: Struktur des Trimethoprims (PRESCOTT 2006).

Die Vorteile der potenzierten Sulfonamide werden in einem synergistischen

Zusammenwirken der beiden Wirkstoffe gesehen. Dieses soll die Dosisreduzierung

der Einzelkomponenten bei gleichzeitiger Reduktion der minimalen

Hemmkonzentration (MHK) zur Folge haben. Weiterhin wird angenommen, dass die

Wirkstoffkombination zu einer Erweiterung des antibakteriellen Spektrums, einer

bakteriziden Wirkung und schließlich zu einer Verlangsamung bzw. Verhinderung der

Resistenzentwicklung führt (LÖSCHER 1984; VAN DUIJKEREN et al. 1994b).

2.2.2 Pharmakokinetische Eigenschaften

Die Pharmakokinetik (PK) beschreibt die Wirkungen des Organismus auf ein

Arzneimittel (FREY 2002) bzw. die Änderung der Wirkstoffkonzentrationen im

Organismus über die Zeit (KIETZMANN 2000).

Sulfonamide sind schwache organische Säuren, deren pKa-Werte (negativ

dekadischer Logarithmus der Ionisationskonstante für Säuren; FREY 2002)

wirkstoffabhängig zwischen 5,0 und 10,4 liegen (Sulfadimidin [SDM] 7,7; Sulfadiazin

[SDZ] 6,4 - 6,6). Sulfonamide sind in ihrer ursprünglichen Form kaum wasserlöslich.

Ihre Löslichkeit erhöht sich in alkalischen Medien oder in Verbindung mit Salzen.

TMP ist eine schwache organische Base mit pKa-Werten von 7,1 bis 7,6 und ist

ebenfalls in Wasser schwer löslich (PAPICH u. RIVIERE 2009). Sowohl TMP als


auch Sulfonamide verfügen über lipophile Eigenschaften, wobei TMP stärker

lipidlöslich ist als z. B. SDZ (HAGGETT u. WILSON 2008).

Resorption

Die orale Bioverfügbarkeit von Trimethoprim-Sulfonamid(TMS)-Präparaten bei

Pferden ist grundsätzlich gut (VAN DUIJKEREN et al. 1994b; HAGGETT u. WILSON

2008), sie beträgt ca. 58 - 84 % für Sulfonamide und 67 % für TMP (VAN

DUIJKEREN et al. 1994a; VAN DUIJKEREN et al. 1994b). Es ist jedoch zu

beachten, dass die Futteraufnahme den Grad und die Geschwindigkeit der

Resorption beeinflusst: Bei Verabreichung des Wirkstoffs mit dem Futter wurde bei

Pferden eine reduzierte und verzögerte Resorption beobachtet (VAN DUIJKEREN et

al. 1995).

Distribution

Ein Teil der Wirkstoffmoleküle bindet an Plasmaproteine (v. a. Albumin) und kann

aufgrund dieser Bindung nicht in die Gewebe diffundieren (Kap. 2.3.2; RYAN 1993).

Die Höhe der Plasmaproteinbindung ist wirkstoff- und speziesabhängig, für

Sulfonamide variiert sie zusätzlich in Abhängigkeit von der Wirkstoffkonzentration im

Plasma (VAN DUIJKEREN et al. 1994b). Die Plasmaproteinbindung von SDM

beträgt beim Pferd 50,5 - 73,3 % (NOUWS et al. 1985). Das TMP liegt – unabhängig

von der Plasmakonzentration – zu ca. 50 bis 60 % an Plasmaproteine gebunden vor

(VAN DUIJKEREN et al. 1994b; PRESCOTT 2006).

Die lipidlöslichen Diaminopyrimidine penetrieren die zellulären Barrieren schnell

mittels Diffusion und reichern sich in den Geweben an (PRESCOTT 2006). Die

weniger lipophilen Sulfonamide (HAGGETT u. WILSON 2008) verbleiben länger im

Plasmakompartiment (PRESCOTT 2006) und kommen in den Geweben v. a. in der

wässrigen Phase des interstitiellen Raums vor (VAN DUIJKEREN et al. 1994b).

Während die TMP-Konzentrationen im Gewebe jene im Plasma übersteigen, verhält

es sich für die Sulfonamide umgekehrt. Das TMP hat mit 1,5 - 2,7 l/kg ein höheres

Verteilungsvolumen als die Sulfonamide (0,3 - 0,7 l/kg) (VAN DUIJKEREN et al.

1994b).


Grundsätzlich verteilen sich jedoch sowohl die Diaminopyrimidine als auch die

meisten Sulfonamide in alle Gewebe und Körperflüssigkeiten (PRESCOTT 2006).

Beispielsweise konnten sowohl Sulfonamide als auch TMP nach intravenöser

Applikation in Blut, Urin, Synovia, zerebrospinaler und peritonealer Flüssigkeit sowie

im Endometrium von Pferden nachgewiesen werden (BROWN et al. 1983; BROWN

et al. 1988). OH-ISHI (1968) untersuchte die Gewebeverteilung von zwei

Sulfonamiden nach intravenöser Injektion bei Pferden und konnte die Wirkstoffe in

einer Vielzahl von Geweben und Körperflüssigkeiten nachweisen.

Metabolismus

Sowohl Sulfonamide als auch Diaminopyrimidine werden hauptsächlich in der Leber

verstoffwechselt. Sulfonamide unterliegen dabei zum Großteil einer Acetylierung der

Aminogruppe. Weiterhin werden die Wirkstoffmoleküle karboxyliert und hydroxyliert

(Methylgruppe am Pyrimidinring) oder glukuronidiert (PAPICH u. RIVIERE 2009).

Unabhängig vom Stoffwechselpfad haben die entstehenden Metaboliten keine oder

eine stark herabgesetzte antibakterielle Wirkung (VAN DUIJKEREN et al. 1994b;

PAPICH u. RIVIERE 2009). Für das TMP bilden die Oxidation und die anschließende

Konjugation in der Leber die vorrangigen Stoffwechselprozesse (PRESCOTT 2006).

Exkretion

Sulfonamide werden hauptsächlich renal ausgeschieden. Der Exkretions-

mechanismus beinhaltet die glomeruläre Filtration des nicht-proteingebundenen

Wirkstoffs aus dem Plasma und die aktive, transportprotein-gesteuerte Ausscheidung

des ionisierten Wirkstoffanteils und seiner Metaboliten im proximalen Tubulussystem.

Gleichzeitig findet eine passive Reabsorption von nicht-ionisiertem Wirkstoff aus dem

distalen Tubulussystem statt (PRESCOTT 2006; PAPICH u. RIVIERE 2009).

Geringe Konzentrationen an Sulfonamiden werden über die Tränenflüssigkeit,

Schweiß, Milch, Galle und Kot ausgeschieden (VAN DUIJKEREN et al. 1994b;

PAPICH u. RIVIERE 2009). TMP wird zu gleichen Teilen in Harn und Kot

ausgeschieden, der Anteil des metabolisierten Wirkstoffs überwiegt dabei (VAN

DUIJKEREN et al. 1994b).


Die Halbwertszeiten (HWZ) von Sulfonamiden und TMP unterscheiden sich deutlich.

Während die HWZ des TMP beim Pferd bei 1,9 - 4,3 h liegt, unterliegen die HWZ der

Sulfonamide wirkstoffabhängig starken Schwankungen (2,7 - 14 h), für das SDM

beträgt die HWZ zwischen 5,4 und 11,4 h (VAN DUIJKEREN et al. 1994b).

2.2.3 Pharmakodynamische Eigenschaften

Die Pharmakodynamik (PD) beschreibt die Wirkungen eines Arzneimittels auf den

Organismus (FREY 2002) bzw. das Ausmaß und den zeitlichen Verlauf eines

pharmakologischen Effekts (EMEA 2000).

Wirkmechanismus

Die Folsäure ist ein wichtiges Substrat für die DNA-Synthese von Bakterien und

Säugetieren. Die antimikrobiellen Eigenschaften der potenzierten Sulfonamide

beruhen auf dem Zusammenwirken von Sulfonamiden und Diaminopyrimidinen,

welche beide selektiv in den Folsäure-Metabolismus von Bakterien eingreifen

(Abb. 2.5; PRESCOTT 2006).

Sulfonamide ähneln strukturell der Para-Aminobenzoesäure (PABA) und hemmen

kompetitiv deren Einbau in die Folsäuremoleküle. Während Säugetiere die benötigte

Folsäure mit der Nahrung aufnehmen, sind einige Bakterienarten darauf angewiesen,

die Folsäure selbst zu synthetisieren. Somit hemmen Sulfonamide selektiv die

bakterielle Neusynthese der Folsäure (PRESCOTT 2006).

Diaminopyrimidine wie das TMP inhibieren die Weiterverarbeitung der Folsäure

durch Blockade der Dihydrofolat-Reduktase (PRESCOTT 2006). Dieses Enzym ist

sowohl bei Bakterien als auch bei Säugetieren vorhanden (VAN DUIJKEREN et al.

1994b). Da aber die bakterielle Dihydrofolat-Reduktase eine um den Faktor 50.000

bis 100.000 höhere Wirkstoffaffinität hat als das entsprechende Säugerenzym

(PAPICH u. RIVIERE 2009), entfalten auch die Diaminopyrimidine ihre antibakterielle

Wirkung selektiv (PRESCOTT 2006).

Sowohl Sulfonamide als auch Diaminopyrimidine wirken, einzeln angewendet,

bakteriostatisch. Die Kombination aus Sulfonamid und Diaminopyrimidin jedoch führt


dazu, dass aufeinanderfolgende Schritte der Folsäuresynthese gehemmt werden.

Die Wirkstoffkombination hat einen in vitro nachweisbaren Synergismus zur Folge,

der zu einer bakteriziden Wirkung führt (PRESCOTT 2006). Dieser synergistische

Effekt ist vermutlich auf die Behinderung des Dihydrofol- bzw. Tetrahydrofolsäure-

Recyclings durch das Diaminopyrimidin zurückzuführen (BUSHBY 1980;

PRESCOTT 2006).

Abb. 2.5: Wirkmechanismus der Sulfonamide und des Trimethoprims (KROKER et al. 2002).

Die antimikrobielle Aktivität von TMP ist in vitro um den Faktor 20 größer als jene der

Sulfonamide. Dementsprechend wurde für die meisten empfänglichen Bakterien ein

maximaler Synergieeffekt nachgewiesen, welcher in Abhängigkeit von dem

jeweiligen Sulfonamid und Bakterium bei einem Wirkstoffverhältnis von ca. 1:20

(TMP:Sulfonamid) vorliegt. Dieses sog. optimale Verhältnis beschreibt jenes In-vitro-

Wirkstoffverhältnis, bei dem die Wirksamkeit der Wirkstoffkombination bei maximaler

Dosisreduktion der Einzelkomponenten ohne Einbußen erhalten bleibt (BUSHBY

1980; FEY u. SCHMID 1995). Im Blut des Menschen wird das angestrebte

Wirkstoffverhältnis (1:20) zumindest zeitweise mittels einer – oral oder parenteral

verabreichten – Wirkstoffpräparation im Verhältnis 1:5 erreicht (LÖSCHER 1984;

PAPICH u. RIVIERE 2009). Die Verschiebung des Verhältnisses ist darauf

zurückzuführen, dass sich die Diaminopyrimidine im Gewebe anreichern, während

Sulfonamide hauptsächlich im extrazellulären Raum verbleiben (PRESCOTT 2006).

Die meisten der im Handel verfügbaren TMS-Präparate in der Human- und


Veterinärmedizin beruhen auf dem genannten Wirkstoffverhältnis von 1:5. In diesem

Zusammenhang ist allerdings zu beachten, dass das Wirkstoffverhältnis von 1:5 im

Arzneimittel bei Tieren wahrscheinlich nur kurzfristig und nicht in allen Geweben zu

dem angestrebten Wirkstoffverhältnis von 1:20 im Körper führt (LÖSCHER 1984;

PRESCOTT 2006). Dies liegt darin begründet, dass sich die Wirkstoffkomponenten

unterschiedlich schnell und unterschiedlich stark in die Gewebe verteilen und dass

das TMP im tierischen Organismus sehr viel schneller eliminiert wird als das

Sulfonamid (PRESCOTT 2006). Obwohl demzufolge unter In-vivo-Bedingungen die

Hauptwirkung vom länger wirksamen Sulfonamid getragen wird und ein

synergistischer Effekt nur in einem kurzen Zeitfenster nach der Wirkstoffapplikation

zu erwarten ist, scheint diese kurze Phase bereits zu der Überlegenheit der Wirk-

stoffkombination gegenüber der alleinigen Anwendung eines Sulfonamids

beizutragen (LÖSCHER 1984). Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass

signifikante Synergieeffekte über einen großen Bereich von Wirkstoffverhältnissen

(1:1 - 1:500) auftreten (FEY u. SCHMID 1995).

Bei den potenzierten Sulfonamiden handelt es sich um zeitabhängige Wirkstoffe

(HAGGETT u. WILSON 2008), d. h. ihre Wirksamkeit ist davon abhängig, dass die

erreichten Wirkstoffkonzentrationen im Körper über einen längeren Zeitraum die

MHK überschreiten. MHK-überschreitende Konzentrationen führen nicht zu einer

Erhöhung der Wirksamkeit.

Wirkspektrum

Potenzierte Sulfonamide zeichnen sich durch ein breites Wirkspektrum aus, welches

eine bakterizide Wirkung gegen viele grampositive und -negative Bakterien sowie

Protozoen hat (Tab. 2.2; PRESCOTT 2006).

Während TMS-Kombinationen in vitro eine gute Aktivität gegen Anaerobier zeigen,

ist diese Wirkung in vivo i. d. R. nicht vorhanden. Vermutlich ist dies darauf

zurückzuführen, dass in infizierten und nekrotischen Geweben erhöhte

Konzentrationen an Thymidin und PABA vorliegen, welche die antimikrobielle


Aktivität der beiden Komponenten hemmen (PRESCOTT 2006; PAPICH u. RIVIERE

2009).

Tab. 2.2: Wirkspektrum potenzierter Sulfonamide (PRESCOTT 2006).

Gute Wirksamkeit MHK ≤ 0,5/9,5 µg/ml

Grampositive Aerobier Streptococcus spp., Staphylococcus aureus , Corynebacterium spp.,

Actinomyces spp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria monocytogenes

Gramnegative Aerobier Actinobacillus spp., Bordetella spp., Brucella spp.

Enterobactericeae: Escherichia coli , Klebsiella spp., Proteus spp.,

Salmonella spp., Yersinia spp., Haemophilus spp., Pasteurella spp.

Anaerobier Bacteroides spp. , Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Clostridium

spp., Chlamydia spp.

Moderate Wirksamkeit MHK ≤ 2/38 µg/ml

Mycobacterium spp., Nocardia spp.

Resistenz MHK ≥ 4/76 µg/ml

Pseudomonas aeruginosa , Rickettsia spp., Leptospira spp.,

Mycoplasma spp.

fettgedruckte Erreger: bei primären Sinusitiden nachgewiesen

Zur Einschätzung der Wirksamkeit von Chemotherapeutika wird die MHK ermittelt,

welche die niedrigste Konzentration einer antimikrobiellen Substanz angibt, die unter

standardisierten In-vitro-Bedingungen das Bakterienwachstum vollständig zu

hemmen vermag (EMEA 2002). Der MHK-Wert ermöglicht die Einstufung eines

Keims als “empfindlich” (sensibel), “intermediär” oder “unempfindlich” (resistent)

gegenüber dem jeweils getesteten Wirkstoff. Diese Einteilung erfolgt

präparatspezifisch anhand von Grenzwerten (breakpoints), welche unter

Einbeziehung von chemisch-physikalischen Eigenschaften, pharmakokinetischen

und mikrobiologischen Daten sowie Angaben zur klinischen Wirksamkeit ermittelt

werden (BÖTTNER et al. 2000). Werden TMS-Kombinationen getestet, so werden

die MHK-Werte – i. d. R. unter Angabe des verwendeten Wirkstoffverhältnisses –

gemeinsam angeben (MHKTMP/MHKS [µg/ml]). Ein Überblick über aktuelle MHK-

Werte von TMS-Kombinationen ist Tab. 2.3 zu entnehmen.


Tab. 2.3: MHK-Werte für Trimethoprim-Sulfonamid-Kombinationspräparate.

MHK-Wert

TMP/S (µg/ml)

Verhältnis

TMP:S

Sulfonamid Erreger (Ursprung) Referenz

k. A. Sulfadiazin Staph. aureus BERTONE et al. 1988

1:19 Sulfamethoxazol equine Isolate

(Respirationstrakt)

WINTHER et al. 2010

k. A. Sulfadiazin equine Isolate ADAMSON et al. 1985

1:19 Sulfamethoxazol adaptiert aus Human-

medizin, systemische

Infektion

CLSI 2008

1:20 Sulfamethoxazol equine Isolate HIRSH u. JANG 1987

0,5/32 1:1 - 1:500 Sulfadoxin bzw.

Sulfadimethoxin

equine Isolate

(Respirationstrakt)

FEY u. SCHMID 1995

1/20 1:20 Sulfadiazin bzw.

Sulfatroxazol

equine Isolate ENSINK et al. 1993

0,25/4,75

0,5/9,5

k. A.: keine Angabe, MHK: minimale Hemmkonzentration, S: Sulfonamid, Staph.: Staphylococcus ,

TMP: Trimethoprim

2.2.4 Resistenzen

Der Begriff der Resistenz beschreibt die Unempfindlichkeit eines Mikroorganismus

gegen einen antimikrobiellen Wirkstoff. Bei Vorliegen einer Resistenz kann dieser

nicht in den bakteriellen Stoffwechsel eingreifen. Dementsprechend ist bei

Feststellung einer Resistenz (in vitro) kein klinischer Erfolg des jeweiligen

Chemotherapeutikums zu erwarten (TROLLDENIER 2000). Der alleinige Einsatz von

Sulfonamiden hat in den vergangenen Jahren durch die weite Verbreitung von

Resistenzen an Wert verloren. Zwar durchlaufen auch die Resistenzen gegenüber

der Wirkstoffkombination mit Diaminopyrimidinen eine progressive Entwicklung,

jedoch haben die potenzierten Sulfonamide durch diese Kombination wieder an

Bedeutung gewonnen (PRESCOTT 2006).

Den häufigsten Resistenzmechanismus gegen Sulfonamide stellen die sich schnell

entwickelnden plasmid- und Integron-vermittelten Resistenzen dar. Sie beruhen auf

der Produktion einer sulfonamidresistenten Dihydrofolat-Synthetase und einer

beeinträchtigten Wirkstoffpenetration. Im Gegensatz dazu entwickeln sich

chromosomale Resistenzen langsam und stufenweise. Sie resultieren in der

Beeinträchtigung der Wirkstoffpenetration, der Produktion einer sulfonamid-

resistenten Dihydropterin-Synthetase und der Überproduktion von PABA

(PRESCOTT 2006; PAPICH u. RIVIERE 2009).


Auch Resistenzen gegen TMP (und die anderen antibakteriellen Diaminopyrimidine)

werden immer häufiger beobachtet (PRESCOTT 2006). Chromosomale Resistenzen

bestehen in der Überproduktion oder Modifikation der Dihydrofolat-Reduktase.

Zusätzliche plasmidvermittelte Resistenzen beruhen auf der Synthese einer

Dihydrofolat-Reduktase, welche nicht an das TMP bindet (VAN DUIJKEREN et al.

1994b; SKOLD 2001).

Resistenzen gegenüber den Sulfonamiden sind häufig mit Kreuzresistenzen

verbunden (VAN DUIJKEREN et al. 1994b). Bei Resistenzen gegen

Diaminopyrimidine handelt sich oft um multiple Resistenzen, die auch gegenüber

Sulfonamiden ausgebildet sind (PRESCOTT 2006). Es wird davon ausgegangen,

dass sich die Resistenzlage bei Einsatz der Kombinationspräparate langsamer

entwickelt als bei Einsatz der Einzelkomponenten (VAN DUIJKEREN et al. 1994b).

Kritische Stimmen bezweifeln dies jedoch, da die Resistenzfaktoren für TMP und

Sulfonamide – zumindest in vitro – bei vielen gramnegativen Bakterienstämmen

gekoppelt sind und so die Kombination der Wirkstoffe keine Vorteile erzielen würde

(LÖSCHER 1984).

In den vergangenen Jahren wurden vermehrt Resistenzen von Streptococcus equi

spp. zooepidemicus gegenüber TMS registriert (PRESCOTT 2006). Darüber hinaus

wurde berichtet, dass dieser Erreger in experimentell induzierten Gewebekammern

trotz ausreichender TMS-Spiegel und gegebener Wirksamkeit (in vitro) nicht

eliminiert werden konnten (ENSINK et al. 2003; ENSINK et al. 2005).

2.2.5 Indikationen und Kontraindikationen

TMS-Kombinationspräparate werden in der Pferdemedizin häufig eingesetzt

(PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008). Sie zeichnen sich durch ein

breites Wirkspektrum und klinische Effizienz zu einem relativ kostengünstigen Preis

aus (VAN DUIJKEREN et al. 1994b), darüber hinaus stehen sie auch in oralen

Applikationsformen zur Verfügung (PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008).

TMS-Präparate werden in der Veterinärmedizin u. a. für die Therapie von akuten

Infektionen der oberen und tiefen Atemwege mit entsprechend empfänglichen


Erregern eingesetzt (Tab. 2.2). Darüber hinaus werden sie bei akuter

Harnwegsinfektion (PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008), Plazentitis,

septischer Arthritis, Osteomyelitis und Meningitis verwendet (HAGGETT u. WILSON

2008). Für die Wirkstoffkombination TMP-SDZ wurden im Rahmen einer klinischen

Studie an Pferden gute bis sehr gute Therapieerfolge bei der Behandlung bakterieller

Infektionen verschiedener Organsysteme nachgewiesen (MILLER et al. 1984). Für

die Therapie von eitrigen Abszessen ist TMS nur bedingt geeignet, da freie Purine im

Eiter den Effekt der Sulfonamide neutralisieren. Die Entfernung von purulentem

Material, Gewebeexsudaten und nekrotischem Gewebe ist daher vor dem

Therapiebeginn unbedingt erforderlich (PRESCOTT 2006).

TMP-Sulfonamide sollten nicht bei Tieren mit schweren Leber- und Nierenfunktions-

störungen, Azidurie, unzureichender Flüssigkeitsversorgung oder Schädigungen des

hämatopoetischen Systems angewendet werden. Weiterhin sollten die Wirkstoffe

nicht gemeinsam mit zentralnervös wirkenden Substanzen (Kap. 2.2.6) eingesetzt

werden. Resistenzen gegen eine oder beide der Wirkstoffkomponenten (Kap. 2.2.4,

Tab. 2.2) stellen weitere Ausschlusskriterien dar (CP-PHARMA 2010).

2.2.6 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen

Sollten im Zusammenhang mit einer TMS-Therapie unerwünschte Arzneimittel-

wirkungen auftreten, so sind diese i. d. R. auf die Sulfonamidkomponente zurückzu-

führen (PRESCOTT 2006; PAPICH u. RIVIERE 2009). Sofern die Tiere über

sinnvolle Therapiezeiträume (< 2 Wochen) mit therapeutischen Konzentrationen

behandelt werden, sind jedoch auch die durch Sulfonamide hervorgerufenen

Nebenwirkungen selten zu beobachten. Zu den häufigsten dieser Art zählen

Auswirkungen auf die Harnwege (Kristallurie, Hämaturie, Obstruktion der renalen

Tubuli) sowie hämatopoetische Störungen (Thrombozytopenie, Anämie, Leukopenie)

und dermatologische Reaktionen (Pruritus) (PRESCOTT 2006).

Vereinzelt wurden bei adulten Pferden systemische Nebenwirkungen in Form von

reversiblen neurologischen Ausfallerscheinungen beschrieben, die im Zusammen-

hang mit der intravenösen Injektion von TMS-Kombinationspräparaten in


therapeutischer Dosierung aufgetreten waren. Sie äußerten sich in hypermetrischem

Gang, Agitation und unberechenbarem Verhalten (STACK u. SCHOTT 2011).

Darüber hinaus können bei Pferden lebensbedrohende anaphylaktische oder

anaphylaktoide Schockreaktionen im Zusammenhang mit intravenösen Injektionen

von TMS auftreten (CP-PHARMA 2010). Die genauen Gründe für diese Fälle sind

derzeit nicht bekannt, es wurde jedoch beobachtet, dass diese fatalen

Nebenwirkungen vor allem dann auftreten, wenn die Pferde mit

Detomidinhydrochlorid oder anderen α2-Agonisten sediert wurden (VAN

DUIJKEREN et al. 1994b; PRESCOTT 2006). Möglicherweise führen Stress oder

Anästhesie zu einer kardialen Sensibilisierung und stellen so einen

prädisponierenden Faktor dar (VAN DUIJKEREN et al. 1994b). ZELLER et al. (1988)

berichteten von einer statistisch signifikanten Senkung des systolischen und

diastolischen arteriellen Blutdrucks sowie einer Steigerung der Herzfrequenz bei der

Gabe von Sulfonamiden an allgemeinanästhesierte Pferde. Zusätzlich beobachteten

sie bei der Gabe von SDM einen Abfall des endexspiratorischen CO2-Anteils in der

Exspirationsluft sowie bei 3/6 Pferden einen kurzfristigen Atemstillstand. Im

Gegensatz dazu führte die intravenöse Gabe zweier TMP-Sulfonamid-Präparate an

unsedierte Pferde zu temporären Blutdruckschwankungen, jedoch konnten keine

kontinuierlichen Veränderungen des Blutdrucks nachgewiesen werden (BRANDT

1993). Aus den genannten Gründen sollte sowohl die intravenöse Injektion von TMS-

Präparaten allgemein vermieden oder langsam durchgeführt werden als auch die

Gabe von TMS an mit α2-Agonisten sedierte Pferde unterbleiben (VAN DUIJKEREN

et al. 1994b).

Es wurde vermutet, dass die orale Gabe von TMS-Präparaten bei Pferden vermehrt

zu gastrointestinalen Störungen in Form von Kolitis und Diarrhö führt (HAGGETT u.

WILSON 2008). Entsprechende Studien konnten jedoch keine langfristigen

Auswirkungen auf die intestinale Bakterienflora nachweisen (GUSTAFSSON et al.

1999). Das Auftreten von Diarrhö nach oraler Applikation von TMS scheint nicht

höher zu sein als bei oraler Gabe anderer Antiinfektiva (WILSON et al. 1996).


2.2.7 Anmerkung zum verantwortungsbewussten Umgang mit Antiinfektiva in der Veterinärmedizin

Die Bundestierärztekammer sowie die Arbeitsgruppe Tierarzneimittel der Länder-

arbeitsgemeinschaft Verbraucherschutz formulieren in ihren “Leitlinien für den

sorgfältigen Umgang mit antibakteriell wirksamen Tierarzneimitteln”

Mindestanforderungen für den verantwortungsbewussten Einsatz antimikrobieller

Wirkstoffe bei Tieren (BTK u. AGTAM 2010). Die Gesellschaft für Pferdemedizin

spezifiziert in Anlehnung an diese Leitlinien die Voraussetzungen für den

verantwortungsvollen Gebrauch von Antibiotika in der Pferdemedizin (GPM et al.

2006). Demnach sollte der Einsatz von Antibiotika nur bei Vorliegen einer

gesicherten Indikation, d. h. im Falle einer bakteriellen Infektion, erfolgen. Die Wahl

eines geeigneten Wirkstoffs sollte nach Möglichkeit auf einer bakteriologischen

Untersuchung und einem Antibiogramm basieren. Weiterhin sollte kritisch hinterfragt

werden, ob der gewählte Wirkstoff sowie dessen Dosis und Applikationsintervall

geeignet sind, ausreichend hohe und lange Wirkspiegel im infizierten Gewebe zu

erzeugen. Die Therapiedauer muss dem jeweiligen Krankheitsgeschehen angepasst

sein.

2.2.8 Verwendetes Präparat

TMP-Sulfadimidin wird unter dem Präparatenamen Bigram®, einem Produkt der

Firma CP-Pharma Handelsgesellschaft, Burgdorf, Deutschland, vertrieben. Es

handelt sich dabei um eine Injektionslösung zur intravenösen oder intramuskulären

Verabreichung. Ein Milliliter der Lösung enthält 215,8 mg SDM-Natrium (entspricht

200 mg SDM) und 40 mg TMP.

Als Indikationsgebiet nennt der Hersteller die Therapie von akuten Infektions-

erkrankungen (u. a. Primär- und Sekundärinfektionen des Respirationstraktes) mit

SDM- und TMP-empfindlichen Erregern bei Pferden, Rindern und Schweinen. Er

empfiehlt zur Anwendung am Pferd die intravenöse Gabe von 16 - 24 mg

Gesamtwirkstoff/kg Körpergewicht/Tag über drei bis fünf Tage bei gegebener

Empfindlichkeit der Erreger gegen beide Einzelkomponenten (CP-PHARMA 2010).


2.3 Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben

2.3.1 Definition: Zielgewebe von Antiinfektiva

Damit Antiinfektiva ihre antimikrobielle Wirkung entfalten können, ist es notwendig,

dass sie sich im selben Kompartiment befinden wie die infizierenden Mikro-

organismen (THEURETZBACHER 2007). Es gilt daher zunächst den Ort der

Infektion und damit das Zielgewebe eines Antiinfektivums zu bestimmen.

Bakterielle Infektionen betreffen im Allgemeinen periphere Organe und seltener das

Plasmakompartiment (MÜLLER et al. 1999). Innerhalb eines Gewebes sind die

Infektionen i. d. R. auf den interstitiellen Raum begrenzt (RYAN 1993), die wenigen

Ausnahmen davon stellen intrazelluläre Infektionen, z. B. mit Rickettsien,

Chlamydien und Mykoplasmen dar (MCKELLAR et al. 2004; MÜLLER et al. 2004).

Die darauf beruhende Annahme, dass der interstitielle Raum der Ort der Infektion ist

und damit die ISF das Zielgewebe der Antiinfektiva darstellt, findet breite

Zustimmung (CHAURASIA 1999; JOUKHADAR et al. 2001; HERKNER et al. 2002;

MÜLLER et al. 2004; THEURETZBACHER 2007).

Für infektiöse Erkrankungen der NNH ist der Ort der Infektion nicht eindeutig

definiert. Angesichts der Tatsache, dass die bakterielle Besiedlung der Sinus i. d. R.

über einen Bakterieneinstrom aus dem Nasenrachen erfolgt und die

Mikroorganismen dementsprechend zuerst im Sinussekret nachgewiesen werden

können, wird das Sinussekret als primärer Ort der Infektion angesehen

(THEURETZBACHER, persönliche Mitteilung; THEURETZBACHER 2007). Darüber

hinaus können bakterielle Infektionen zu sekundären Epithelschäden führen, und es

muss davon ausgegangen werden, dass sich die Bakterien auch in der ISF der

Schleimhaut befinden (THEURETZBACHER, persönliche Mitteilung; EKEDAHL et al.

1978). In diesem Fall wäre die sinunasale Mukosa Ort der Infektion bei Sinusitiden

(EKEDAHL et al. 1978). In Hinblick darauf, dass sich Sinusitiden bei Pferden zum

Zeitpunkt der Diagnosestellung i. d. R. in einem chronischen Krankheitsstadium

befinden und sekundäre, entzündliche Veränderungen der Schleimhaut häufig zu

beobachten sind (TREMAINE et al. 1999; TREMAINE u. DIXON 2001a), wird in der


vorliegenden Arbeit die ISF der sinunasalen Schleimhaut als Ort der Infektion bei

Sinusitiden des Pferdes angenommen.

Anmerkung: In der verwendeten Literatur werden die Begriffe der interstitiellen

Flüssigkeit (ISF) und der extrazellulären Flüssigkeit teilweise synonym genutzt. Um

Verständnisproblemen vorzubeugen, sollen die Begrifflichkeiten kurz erläutert

werden: Das Körperwasser verteilt sich im Intrazellularraum (~ 60 %) sowie im

Extrazellularraum (~ 40 %). Letzterer wird weiter in einen intravasalen (Blut, ~ 5 %),

einen interstitiellen (ISF, ~ 15 %) sowie einen transzellulären (Wasser in epithelial

ausgekleideten Hohlräumen, ~ 20 %) Anteil gegliedert (GÄBEL 2005). In der vor-

liegenden Arbeit wird einheitlich der Begriff der ISF genutzt, um Prozesse und

Konzentrationsgehalte im Interstitium des Gewebes zu beschreiben.

2.3.2 Einflussfaktoren auf die Gewebegängigkeit von Antiinfektiva

Die Penetrationsfähigkeit eines Antiinfektivums wird einerseits durch den Wirkstoff

selbst und andererseits durch patientenspezifische Faktoren beeinflusst (Tab. 2.4).

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Wirkstoffs sowie dessen

Molekulargewicht, elektrische Ladung und lipo- oder hydrophiler Charakter

bestimmen, ob und wie leicht ein Wirkstoff aus dem Plasmakompartiment in die ISF

und damit in das Gewebe übertreten kann. Kleine, lipophile und ungeladene

Substanzen können am leichtesten in das Gewebe übergehen (STEINER et al.

2004).

Die Verteilung des Wirkstoffs im Körper basiert grundsätzlich auf dem Blutfluss. Im

Gewebe treten die Wirkstoffmoleküle dann aus dem Blutplasma durch die

Kapillarmembran hindurch in den interstitiellen Raum des Gewebes über (RYAN

1993). Die Kapillardichte des Gewebes bestimmt die zur Verfügung stehende

Oberfläche für den Stoffaustausch. Der Stoffaustausch zwischen den beiden

Kompartimenten erfolgt entweder passiv und unspezifisch entlang eines

Konzentrations- (Diffusion) oder Druckgradienten (Massenstrom) oder über aktive,

spezifische Transportmechanismen (STEINER et al. 2004). Welche dieser

Transportformen stattfindet bzw. dominiert, wird auch durch die Beschaffenheit der


Kapillarwände vorgegeben (RYAN 1993). Fenestrierte Kapillaren mit Poren in

Basalmembran und Endothel erlauben eine schnelle Diffusion durch die Poren

(BARZA 1993a; BARZA 1993b). In kontinuierlichen Kapillaren, zu denen auch jene in

der menschlichen Kieferhöhlen-Schleimhaut zählen (TOPPOZADA u. TALAAT

1980), findet die transepitheliale Diffusion unter erschwerten Bedingungen deutlich

langsamer statt (BARZA 1993a; BARZA 1993b; RYAN 1993).

Ein weiterer wichtiger Aspekt für die Gewebegängigkeit von Antiinfektiva ist die sog.

Plasmaproteinbindung. Ein Teil der Wirkstoffmoleküle bindet an Plasmaproteine

(v. a. Albumin) und ist aufgrund dieser Bindung weder im Plasma pharmakologisch

aktiv, noch können diese proteingebundenen Wirkstoffmoleküle die Kapillarmembran

durchdringen und in die ISF übertreten (RYAN 1993). Dementsprechend führt eine

hohe Plasmaproteinbindung (> 80 %) des Wirkstoffs in Hinblick auf die Gesamt-

wirkstoffkonzentration zu hohen Plasma- und niedrigen Gewebespiegeln (RYAN

1993; STEINER et al. 2004). Die Höhe der Plasmaproteinbindung ist grundsätzlich

wirkstoffabhängig, jedoch schwankt sie bei den meisten Substanzen in Abhängigkeit

von der Wirkstoffkonzentration und dem Proteingehalt des Plasmas (STEINER et al.

2004).

Weiterhin nimmt der pH-Wert von Plasma und Gewebe Einfluss auf die

Penetrationsfähigkeit von Antiinfektiva, indem er maßgeblich den Ionisationsgrad der

Wirkstoffmoleküle bestimmt. In ihrer Eigenschaft als schwache Säuren oder Basen

liegen die meisten Antiinfektiva pH-abhängig sowohl in ionisierter als auch in nicht-

ionisierter Form vor. Lediglich der nicht-ionisierte Wirkstoffanteil kann

Zellmembranen passieren und so führt ein herabgesetzter pH-Wert, wie er in

entzündeten oder hypoxischen Geweben vorkommt, dazu, dass sich basische

Arzneimittel in dem vorherrschenden sauren Milieu anreichern, während saure

Wirkstoffe schlechter in diese Gewebe penetrieren können (STEINER et al. 2004).


Tab. 2.4: Einflussfaktoren auf die Gewebegängigkeit von Antiinfektiva (nach STEINER et al. 2004).

Chemische Struktur

Relative Molekülmasse

Elektrische Ladung

Hydro-/Lipophilie

Patientenspezifische Faktoren Durchblutung Blutfluss

Kapillardichte

Perfusionsdruck

Proteingehalt des Plasmas

Wirkstoffgehalt des Plasmas

Begleitmedikation

Zielgewebe Gewebetyp

pH-Wert

Konzentrationsgradient

Stofftransport Kapillartyp

Diffusionsbarrieren

aktive Transportmechanismen

Entzündung Dilatation

Granulation

Wirkstoffspezifische Faktoren Chemisch/physikalische

Eigenschaften

Plasmaproteinbindung

2.3.3 Notwendigkeit der Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben

Der klinische Erfolg einer antimikrobiellen Therapie ist unmittelbar davon abhängig,

ob und wie lange therapeutische Wirkstoffkonzentration am Ort einer Infektion

erreicht werden (MCKENZIE 2009). Das Streben nach der optimalen Dosierung

eines Antiinfektivums beruht daher auf dem Ziel eine therapeutisch wirksame

Konzentration im Zielgewebe zu erreichen (JOUKHADAR et al. 2001).

Bedauerlicherweise basiert jedoch die Auswahl eines Wirkstoffs in vielen Fällen nur

auf der Annahme und nicht dem wissenschaftlichen Beweis, dass dieser das

Zielgewebe tatsächlich erreicht (BRUNNER et al. 2005). Ist dies nicht der Fall oder

sind die erreichten Konzentrationen subinhibitorisch, so treten mitunter

schwerwiegende klinische Folgen auf, die Erregerpersistenz, Therapieversagen und

die Entwicklung bakterieller Resistenzen beinhalten können (MÜLLER et al. 2004;

STEINER et al. 2004).

Die Bestimmung pharmakokinetischer Daten basierte in der Vergangenheit vielfach

auf den Wirkstoffkonzentrationen in leicht zu entnehmenden Proben, wie

beispielsweise Blut, Urin und Speichel sowie Gewebebiopsien (MÜLLER et al. 2004;


BRUNNER et al. 2005). Sollen Rückschlüsse aus der Plasma- auf die

Gewebekonzentrationen gezogen werden, so ist zu beachten, dass die wenigsten

Substanzen ihre Wirkung im Plasmakompartiment, sondern in definierten

Zielgeweben entfalten (MÜLLER et al. 2004). Diese Tatsache trifft in besonderem

Maße auf Antiinfektiva zu (Kap. 2.3.1).

Es wird davon ausgegangen, dass in Geweben ohne spezielle Barrieren oder aktive

Transportmechanismen während eines pharmakologischen Gleichgewichtzustandes

(Steady State) ein Äquilibrium zwischen der freien, pharmakologisch aktiven

Konzentration im Plasma und jener der ISF mittels Diffusion eintritt (BARZA 1993a;

BARZA 1993b). In diesen Fällen wäre die Konzentration des ungebundenen

Wirkstoffs im Plasma als Ersatzparameter für die Konzentration in der ISF geeignet

(THEURETZBACHER 2007). In der praktischen Anwendung aber haben sich

während des Wirkstoffverteilungsprozesses im Körper große Schwankungen sowohl

zwischen verschiedenen Geweben als auch innerhalb von Geweben gezeigt

(JOUKHADAR et al. 2001). Teilweise wurden MHK-überschreitende Plasmaspiegel

bei gleichzeitig subinhibitorischen Gewebekonzentrationen nachgewiesen

(JOUKHADAR et al. 2001; STEINER et al. 2004). Ein komplettes und andauerndes

Gleichgewicht zwischen den beiden Kompartimenten Plasma und Gewebe kann

daher nicht vorausgesetzt werden (MÜLLER et al. 2004).

Eine Behinderung der Zielgewebspenetration wurde bisher für einige Organe

(zentrales Nervensystem, Auge, Prostata) (BARZA 1993a; STEINER et al. 2004),

aber auch im Verlauf entzündlicher Erkrankungen (JOUKHADAR et al. 2001), u. a.

bei der Sinusitis des Menschen (EKEDAHL et al. 1978), beschrieben. Im Falle akuter

Entzündungen führt eine Dilatation der Kapillaren zu einer erhöhten Durchblutung

des entzündeten Gewebes. Entsprechend wird davon ausgegangen, dass zeitgleich

mehr Wirkstoff in das Gewebe gelangt. Chronische Entzündungen hingegen neigen

eher zur Bildung von Granulationsgewebe, welches eine verminderte Durchblutung

zur Folge hat (RYAN 1993). Darüber hinaus beeinflusst auch ein veränderter pH-

Wert in entzündeten Geweben die Penetrationsfähigkeit von Antiinfektiva

(Kap. 2.3.2). Abseits dieser theoretischen Überlegungen erbrachten Untersuchungen


zu der Fragestellung, ob sich die Gewebespiegel in gesunden und entzündeten

Geweben unterscheiden, keine einheitlichen Ergebnisse (MÜLLER et al. 1996;

JOUKHADAR et al. 2001; STEINER et al. 2004).

Abschließend lässt sich festhalten, dass das Konzentrationsprofil im Zielgewebe

besser geeignet ist, den klinischen Erfolg einer Therapie vorherzusagen, als die

Plasmakonzentration (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER et al. 2005). Daher sollte die

Konzentrationsbestimmung der ungebundenen Wirkstofffraktion direkt am Wirkort,

d. h. im interstitiellen Raum, erfolgen (JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et al.

2004).

2.3.4 Methoden zur Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben

Im Folgenden werden die verschiedenen Methoden vorgestellt, die zur Bestimmung

von Antiinfektiva-Konzentrationen in Zielgeweben geeignet sind (Tab. 2.5).

Gewebebiopsie

Die Entnahme einer Gewebeprobe ist im Allgemeinen ein einfach durchzuführendes,

aber invasives Verfahren (BRUNNER u. LANGER 2006), wobei die Invasivität für

Gewebeentnahmen aus den NNH durch die Notwendigkeit der chirurgischen

Eröffnung der Sinus erhöht ist. Die Aufbereitung einer Gewebebiopsie beinhaltet eine

Homogenisierung des Gewebes. Die damit einhergehende Zelllyse führt zu einer

Vermischung der Flüssigkeitsanteile der verschiedenen Gewebekompartimente (Blut,

extra- und intrazelluläre Anteile) (MÜLLER et al. 2004; PLOCK u. KLOFT 2005;

BRUNNER u. LANGER 2006), in denen sich der untersuchte Wirkstoff nicht

notwendigerweise gleichmäßig verteilt hat (MÜLLER et al. 2004; MOUTON et al.

2008). Entsprechend erlaubt die Analyse des Homogenates lediglich eine Aussage

über die Gesamtwirkstoffkonzentration, jedoch nicht über die Wirkstoffgehalte in

einem bestimmten Kompartiment. In Bezug auf Antiinfektiva, die ihre Wirkung

zumeist in der ISF entfalten, kann dieser Umstand dazu führen, dass die tatsächlich

am Ort der Infektion zur Verfügung stehende Wirkstoffkonzentration falsch

eingeschätzt wird: Die Konzentrationen von Substanzen, die sich ausschließlich in


der ISF aufhalten (z. B. β-Laktam-Antibiotika), werden durch das beschriebene

Verfahren verdünnt und erscheinen niedriger als sie tatsächlich sind. Im Gegensatz

dazu werden die Wirkort-Konzentrationen von vorrangig intrazellulär

akkumulierenden Wirkstoffen (z. B. Chinolone und Makrolide) zu hoch eingeschätzt

(MÜLLER et al. 1996). Weiterhin ist es bei dieser Methode nicht möglich, zwischen

der proteingebundenen, unwirksamen und der ungebundenen, pharmakologisch

wirksamen Form zu unterscheiden (MÜLLER et al. 2004).

Die Notwendigkeit der wiederholten Probenentnahme ist mit einer erhöhten

Infektionsgefahr und Narbenbildung sowie damit einhergehenden ethischen

Limitationen behaftet. Daher sind Gewebebiopsien nicht bzw. nur in begrenztem Maß

für Konzentrations-Zeit-Verläufe im Rahmen von pharmakokinetischen

Untersuchungen geeignet (PLOCK u. KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006)

Hautblasenversuch

Die Technik des Hautblasenversuches (skin blister) beruht auf der Trennung von

Epidermis und Dermis durch das Aufbringen von negativem Druck oder chemischen

Irritantien auf die Oberfläche der äußeren Haut (BRUNNER u. LANGER 2006). Es

wurde ursprünglich davon ausgegangen, dass die sich in der Blase ansammelnde

Flüssigkeit den interstitiellen Raum der peripheren Kompartimente repräsentiert

(BRUNNER et al. 1998). Diese Annahme wird jedoch inzwischen kontrovers

diskutiert: Erstens bedingt die entzündliche Reaktion bei chemisch induzierten

Hautblasen eine veränderte Zusammensetzung der Blasenflüssigkeit im Vergleich zu

der regulären ISF (DAY et al. 2001). Zweitens können gerade diese entzündlichen

Veränderungen zur Folge haben, dass bestimmte Wirkstoffe bevorzugt in der Blase

akkumulieren und es zu einer Überschätzung der Konzentration kommt (MÜLLER et

al. 1999; BRUNNER et al. 2002). Drittens ist davon auszugehen, dass die

Wirkstoffkonzentration in der Blase durch die Veränderung des physiologischen

Verhältnisses der Kapillaroberfläche zum Volumen des interstitiellen Raums

beeinflusst wird (RYAN 1985). Zu guter Letzt gilt es inzwischen als unwahrscheinlich,

dass die mittels dieser Methode erhaltenen Ergebnisse tatsächlich die ISF in

anderen peripheren Kompartimenten als der Haut widerspiegeln (MÜLLER et al.


2004). Aufgrund der begrenzten Probenanzahl ist der Hautblasenversuch darüber

hinaus nicht für die Erstellung von Konzentrations-Zeit-Profilen geeignet (PLOCK u.

KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006).

Saliva-Beprobung

Die Konzentrationsbestimmung von Wirkstoffen im Speichel galt ursprünglich als

geeignet, um Rückschlüsse auf die Wirkstoffkonzentrationen in peripheren

Kompartimenten zu ziehen. Die Entnahmetechnik ist einfach und nicht-invasiv und

erlaubt die Erstellung kontinuierlicher Konzentrations-Zeit-Profile (BRUNNER u.

LANGER 2006). Die Aussagekraft der Methodik wurde jedoch inzwischen

angezweifelt, da die gemessene Wirkstoffkonzentration im Speichel kontinuierlich

höher war als die korrespondierende Serumkonzentration (BRUNNER et al. 1998).

Bildgebende Verfahren

In den letzten Jahren erwiesen sich einige ursprünglich in der klinischen Diagnostik

eingesetzten, bildgebenden Verfahren wie die Positronen-Emissionstomographie und

die Magnetresonanzspektroskopie als wertvolle Methoden für pharmakokinetische

Untersuchungen (BRUNNER u. LANGER 2006). Die Positronen-Emissions-

tomographie beispielsweise ermöglicht sowohl die Visualisierung der

Wirkstoffverteilung aus dem Plasmakompartiment in die peripheren Organe

(BRUNNER et al. 2004) als auch die Konzentrationsbestimmung in einzelnen

Organen (FISCHMAN et al. 1998). Der größte Vorteil der bildgebenden Methoden

liegt in ihrer nicht-invasiven Natur. Als nachteilig anzusehen ist, dass diese Verfahren

keine Rückschlüsse auf einzelne Kompartimente erlauben und teilweise keine

Unterscheidung zwischen Muttersubstanz und Metaboliten ermöglichen (BRUNNER

u. LANGER 2006).


Ultrafiltration

Bei der Ultrafiltration wird eine spezielle Sonde in das zu untersuchende Gewebe

eingebracht. Durch den Aufbau eines negativen Drucks wird die ISF aus dem

umliegenden Gewebe durch eine semipermeable Membran in den Katheter

“gezogen” und ermöglicht so die Entnahme proteinfreier ISF-Proben, in denen der

ungebundene Wirkstoffanteil analysiert werden kann. Eine Kalibration, wie sie bei der

später beschriebenen Mikrodialyse (MD) notwendig ist, entfällt bei dieser Methode.

Nachteilig ist der (wenn auch geringe) Volumenverlust der ISF, der die

kontinuierliche Beprobung im Rahmen pharmakokinetischer Studien einschränkt

(PLOCK u. KLOFT 2005).

Mikrodialyse

Die MD ermöglicht die direkte Bestimmung der ungebundenen, pharmakologischen

Wirkstoffanteile am Ort der Infektion und ist in dieser Hinsicht derzeit die einzige

Methode, die die Ansprüche regulativer Behörden erfüllt (Kap. 2.4.3) (MÜLLER et al.

2004). Sie wird im folgenden Kapitel (2.4) ausführlich dargestellt.

Tab. 2.5: Methoden zur Bestimmung der Zielgewebskonzentration (nach PLOCK u. KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006).

Mikro-

dialyse

Gewebe-

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Keine Größenlimitation für den Wirkstoff - + + + - -

Einfache technische Durchführung - + - + - -

Keine Kalibration notwendig - + + + + +

Kostengünstig + + + + + -

(+): Ja, (-): Nein; ISF: interstitielle Flüssigkeit


2.4 Mikrodialyse

2.4.1 Grundprinzip der Mikrodialyse

Die MD beruht auf dem Prinzip der Dialyse (von griechisch dialysis, Auflösung;

CHAURASIA 1999). Sie geht in ihrer heutigen Form zurück auf Untersuchungen von

Prof. Ungerstedt (UNGERSTEDT u. PYCOCK 1974; UNGERSTEDT 1991). Die MD

findet Einsatz in In-vitro-Experimenten und bei der In-vivo-Bestimmung von endo-

und exogenen Substanzen in Körperflüssigkeiten oder in der ISF von Geweben

(PLOCK u. KLOFT 2005).

Das MD-System (Abb. 2.6 - A) besteht aus einer Mikroperfusionspumpe, einem MD-

Katheter und einem Probensammelgefäß (Microvial). Es gibt verschiedene Modelle

von MD-Kathetern (CHAURASIA 1999; PLOCK u. KLOFT 2005), die folgenden

Ausführungen beziehen sich auf den in der vorliegenden Arbeit verwendeten

konzentrischen Kathetertyp (Abb. 2.6 - B). Zur Anwendung der Methode in vivo wird

der MD-Katheter in ein Gewebe oder in eine Körperflüssigkeit eingebracht und über

die Pumpe kontinuierlich mit einer Perfusionslösung gespült. Bei dieser handelt es

sich i. d. R. um eine wässrige Lösung, die der umgebenden Flüssigkeit in ihrer

Zusammensetzung möglichst ähnlich sein sollte, um unerwünschte, auf osmotischen

Prozessen beruhende, Molekülbewegungen zwischen Perfusionslösung und

umgebender Flüssigkeit zu verhindern (PLOCK u. KLOFT 2005). Der MD-Katheter

besitzt am distalen Ende seines Schaftes eine semipermeable Membran, die eine

Diffusion von Substanzen zwischen der Perfusionslösung und der den Katheter

umgebenden Flüssigkeit erlaubt. Die Größe der Poren (Cut-off, üblicherweise 5.000 -

50.000 Dalton) gibt dabei vor, welche Substanzen die Membran passieren können

(i. d. R. Wasser und niedermolekulare Substanzen), während der Konzentrations-

gradient zwischen den beiden Lösungen die Richtung der Diffusion bestimmt (DE

LANGE et al. 2000). Es ist sowohl der Übertritt von Stoffen aus der Perfusionslösung

in die ISF (delivery) als auch von Substanzen aus der ISF in die Perfusionslösung

(recovery) möglich. Die Mikroperfusionspumpe hält den Flüssigkeitsstrom innerhalb

des Katheters bei niedrigen Flussraten (0,5 - 5 µl/Min) konstant und befördert die


Perfusionsflüssigkeit (nach dem Kontakt an der Membran: Dialysat) schließlich weiter

bis in das Probensammelgefäß (PLOCK u. KLOFT 2005).

Abb. 2.6: (A) Verwendetes MD-System bestehend aus Mikroperfusionspumpe (a), MD-Spritze (b), MD-Katheter (zuführender Schlauch [c], Katheterschaft [d] mit semipermeabler Membran [e], abführender Schlauch [f], Probensammelgefäßhalter [g]) und Probensammelgefäß (h); (B) Schematischer Aufbau eines konzentrischen MD-Katheters (CHAURASIA et al. 2007).

2.4.2 Berechnung der Wiederfindung

Der Begriff der Wiederfindung beschreibt das Verhältnis des Wirkstoffanteils im

Dialysat zu jenem in der Katheterumgebung. Es werden die absolute und die relative

Wiederfindung unterschieden:

Absolute Wiederfindung: im Dialysat nachgewiesene Wirkstoffkonzentration

pro Zeiteinheit

Relative Wiederfindung (RR, relative recovery): im Dialysat nachgewiesene

Wirkstoffkonzentration im Verhältnis zu der Wirkstoffkonzentration der

Katheterumgebung

Beim Einsatz der MD zum Nachweis exogener Substanzen steht die Frage nach der

tatsächlichen Gewebekonzentration im Vordergrund (DE LANGE et al. 2000). Die im

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Dialysat ermittelte Konzentration (CDialysat) spiegelt, aufgrund der Tatsache, dass der

konstante Fluss der Perfusionslösung einen vollkommenen Konzentrationsausgleich

zwischen den beiden Lösungen verhindert, nur eine Fraktion der Konzentration in der

ISF (CISF) wider (CHAURASIA 1999; PLOCK u. KLOFT 2005; CHAURASIA et al.

2007):

Eine quantitative Aussage über die Wirkstoffkonzentration in der ISF des Gewebes

ist erst unter Einbeziehung der RR möglich (PLOCK u. KLOFT 2005).

Die RR ist abhängig von der Diffusionsgeschwindigkeit, welche ihrerseits von der

Temperatur, der Beschaffenheit der Membran (Material, Cut-off, Oberfläche) und

dem Konzentrationsgradienten abhängig ist sowie weiterhin von der

Zusammensetzung der Perfusionslösung, der Flussrate und der Tortuosität

(Diffusionsweg im Gewebe) des untersuchten Gewebes (PLOCK u. KLOFT 2005;

CHAURASIA et al. 2007). Idealerweise würde die RR 100 % betragen, jedoch wird

diese Größenordnung in tierexperimentellen Studien selten erreicht (CHAURASIA et

al. 2007) und so erfordert die Berechnung der tatsächlichen Gewebekonzentration

aufwendige Kalibrationsschritte.

Kalibration

Die Bestimmung der RR eines Katheters kann sowohl in vitro als auch in vivo

erfolgen (Tab. 2.6). Die bei der In-vitro-Kalibration erhaltenen RR-Werte wurden

lange Zeit als Bezugsgröße für die RR unter In-vivo-Bedingungen genutzt. Jedoch

wurde in der Vergangenheit festgestellt, dass diese Vorgehensweise nicht sinnvoll ist

(CHAURASIA 1999). Die Diffusionsrate in vivo ist im Allgemeinen geringer als in

vitro, was auf den verlängerten Diffusionsweg und den geringeren Volumenanteil der

ISF im Gewebe im Vergleich zu einer wässrigen Lösung zurückzuführen ist (KOVAR

et al. 1997). Eine In-vitro-Kalibration führt damit zu einer Überschätzung der


Wiederfindung und zu einer Unterschätzung der Gewebekonzentration (KOVAR et

al. 1997; CHAURASIA 1999). Damit kann eine In-vitro-Kalibration die Kalibration

unter In-vivo-Bedingungen nicht ersetzen, wohl aber dazu herangezogen werden, die

Eignung der eingesetzten Komponenten auf einer Vorversuchsebene zu überprüfen

(DE LANGE et al. 2000; CHAURASIA et al. 2007; HOLMGAARD et al. 2010).

Für die In-vivo-Kalibration stehen verschiedene Methoden zur Verfügung (Tab. 2.6).

Für einige der Methoden ist ein Gleichgewichtszustand der Gewebekonzentration

notwendig, welcher durch kontinuierliche intravenöse Infusion mit der gesuchten

Substanz erreicht wird (KOVAR et al. 1997). Andere Methoden erfordern den Einsatz

sehr langsamer Perfusionsraten. Die daraus resultierenden langen

Probennahmezeiten führen zu einer entsprechend geringen zeitlichen Auflösung,

während die gleichzeitig geringen Probenvolumina hohe Ansprüche an die Analytik

stellen. Die genannten Umstände schließen den Einsatz der entsprechenden

Methoden für Verlaufsuntersuchungen aus, so dass diese eine geringe Bedeutung

für den Einsatz in pharmakokinetischen Studien haben (CHAURASIA 1999; PLOCK

u. KLOFT 2005).

Für die In-vivo-Kalibration im Rahmen pharmakokinetischer Studien ist in besonderer

Weise die Retrodialyse geeignet (THALLINGER u. JOUKHADAR 2005). Der Begriff

Retrodialyse beschreibt die Umkehr des MD-Prinzips durch den Zusatz einer

Substanz zur Perfusionslösung (KOVAR et al. 1997; DE LANGE et al. 2000). Dabei

kann es sich einerseits um die gesuchte Substanz (SI, substance of interest) selbst

oder um eine Eichsubstanz (IS, internal standard) handeln (LARSSON 1991).

Beruhend auf der Annahme, dass die Diffusion einer Substanz gleichwertig in beide

Richtungen stattfinden kann, wird bei der Retrodialyse der relative Verlust (RL,

relative loss) einer Substanz aus der Perfusionslösung in das umgebende Medium

als Maß für die RR genutzt (SCHELLER u. KOLB 1991):


Bei der Retrodialyse mittels gesuchter Substanz wird die SI der Perfusionslösung

zugesetzt und der Katheter (in situ) in einer vorgeschalteten Referenzphase damit

gespült. Der ermittelte RL wird der RR im weiteren Versuchsverlauf gleichgesetzt

und zur Berechnung der Gewebekonzentration herangezogen. Wichtig dabei ist,

dass die Retrodialyse zu einem Zeitpunkt durchgeführt wird, an dem sich noch keine

SI im Gewebe befindet (DE LANGE et al. 2000). Weiterhin muss zwischen dem Ende

der Kalibrationsphase und dem eigentlichen Versuchsbeginn eine angemessene

Auswaschperiode (washout period) eingehalten werden, sodass zu Beginn des

eigentlichen Versuchs keine Rückstände der SI aus der Perfusionslösung im

Gewebe vorhanden sind; i. d. R. wird ein Zeitraum von ca. einer Stunde als

ausreichend angesehen (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998; CLEMENT et

al. 1998). Vorteilhaft an dieser Methode ist, dass die SI selbst zur Kalibration genutzt

wird, allerdings können keine Veränderungen der Wiederfindung über die Zeit

(BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998; CHAURASIA et al. 2007) festgestellt

werden.

Bei der Retrodialyse mittels Eichsubstanz wird der Perfusionslösung über die

gesamte Versuchsdauer ein IS zugesetzt (LARSSON 1991). Dieser sollte der SI in

ihren physikalischen (Diffusion, Analysemethode) und biologischen (Metabolismus,

Proteinbindung) Eigenschaften möglichst ähnlich sein (CHAURASIA et al. 2007), da

der RLIS mit der RRSI gleichgesetzt wird (DE LANGE et al. 2000). Vorteilhaft an

dieser Methode ist, dass Veränderungen der Wiederfindung über die gesamte

Versuchsdauer (z. B. durch Veränderungen an der Membran oder Luftblasen in der

Perfusionslösung) wahrgenommen werden können und bei der Berechnung der

Gewebekonzentration berücksichtigt werden können (DE LANGE et al. 2000). Die

Eichsubstanz dient somit als Qualitätskontrolle für die Katheterfunktion (BOUW u.

HAMMARLUND-UDENAES 1998). Als nachteilig ist zu bewerten, dass nicht die

gesuchte Substanz selbst eingesetzt wird und Unterschiede in dem biologischen

Verhalten der Substanzen häufig nicht berücksichtigt werden (CHAURASIA 1999).

Der von BOUW und HAMMARLUND-UDENAES (1998) beschriebene Ansatz der

kombinierten Retrodialyse verbindet die Vorteile der beiden zuvor genannten


Methoden: Der Perfusionslösung werden vor Versuchsbeginn in einer

Referenzphase sowohl die gesuchte Substanz als auch die Eichsubstanz zugesetzt.

Es wird jeweils der RL der beiden Substanzen bestimmt, das Verhältnis dieser

beiden wird als „K-Faktor“ beschrieben (LARSSON 1991; CLEMENT et al. 1998).

In der folgenden Auswaschperiode und dem eigentlichen Versuch enthält die

Perfusionslösung nur noch die Eichsubstanz. Die Gewebekonzentration wird über

den RLIS (in jeder einzelnen Probe der Versuchsphase oder als gleitender

Durchschnitt) und den K-Faktor (aus der Referenzphase) errechnet (BOUW u.

HAMMARLUND-UDENAES 1998).

In der vorliegenden Arbeit wurde die kombinierte Retrodialyse mit SDM als gesuchte

Substanz und SDZ als Eichsubstanz angewandt.


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2.4.3 Anwendung der Mikrodialyse

Einsatz in der Antiinfektiva-Forschung

Die MD wurde erstmals 1995 zur Erforschung der Gewebepenetration von

antimikrobiellen Wirkstoffen eingesetzt (MÜLLER et al. 1995). Diese und weitere

Studien belegten, dass die Methode geeignet ist, reproduzierbare Ergebnisse für die

PK-Charakterisierung von Antiinfektiva bereitzustellen (MÜLLER et al. 1995;

MÜLLER 2000; JOUKHADAR et al. 2001). In Kombination mit anderweitig

bestimmten PD-Daten können die mittels MD bestimmten PK-Daten dazu genutzt

werden, bestehende Dosierungsschemata und Therapiekonzepte zu reevaluieren

(MÜLLER et al. 1996; BRUNNER et al. 2005).

Regulative Behörden in Europa (European Agency for the Evaluation of Medicinal

Products, EMEA) und in den Vereinigten Staaten (U. S. Food and Drug

Administration, FDA) befürworten die Bestimmung von PK- und PD-Daten

antimikrobieller Wirkstoffe im Zielgewebe (FDA 1998; EMEA 2000). Die MD wird als

die derzeit einzig verfügbare wissenschaftliche Methode angesehen, welche die

Anforderungen der regulativen Behörden an klinische PK-Studien mit anti-

mikrobiellen Wirkstoffen erfüllt (JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et al. 2004).

Einsatz im Bereich der Atemwege

Die MD ist für den Einsatz in nahezu allen Geweben geeignet (DE LA PENA et al.

2000; CHOU et al. 2001; PLOCK u. KLOFT 2005) und wurde Anfang der 1990er

Jahre erstmals im Bereich der Lunge angewandt (LARSSON 1991; INGVAST-

LARSSON et al. 1992). Weitere Untersuchungen belegen, dass die MD-Technik eine

geeignete Methode darstellt, um exogene Substanzen (u. a. Antiinfektiva) in der ISF

des Lungengewebes (DE LA PENA et al. 2001; HERKNER et al. 2002; TOMASELLI

et al. 2003) und im Sekret des Bronchialepithels (EISENBERG et al. 1993; TYVOLD

et al. 2007) nachzuweisen.

Im Bereich der oberen Atemwege ist die MD bisher lediglich an der nasalen

Schleimhaut erfolgt. GRUBB et al. untersuchten die Unterschiede der


Ionenzusammensetzung des Nasensekrets (2002) und der mukoziliären Aktivität

(2004) von normalen und an zystischer Fibrose erkrankten Mäusen auf der

Nasenschleimhaut. Bisher beschreibt lediglich eine Studie den Einsatz der MD in der

Nasenschleimhaut: LEE et al. (2005) platzierten einen MD-Katheter in der Lamina

propia der unteren Nasenmuschel und spülten ihn dort über 180 Minuten mit steriler

Kochsalzlösung. Das Ziel dieser Studie war es, Konzentrationsunterschiede von

bestimmten Aminosäuren bei gesunden und an allergischer Rhinitis erkrankten

Menschen zu bestimmen. Die Autoren schlussfolgerten, dass die MD-Technik,

welche große Vorteile für die Erhebung von pharmakokinetischen Wirkstoffdaten in

der Nasenschleimhaut bietet, auch zur Konzentrationsbestimmung von Wirkstoffen

eingesetzt werden könnte, die der Therapie von entzündlichen Erkrankungen der

Nase oder der NNH dienen (LEE et al. 2005). Eine ausführliche Literaturrecherche

erbrachte keine Hinweise darauf, dass die MD-Technik bereits in den NNH

eingesetzt worden ist.

Einsatz am Pferd

Die MD ist bereits erfolgreich bei Pferden eingesetzt worden (INGVAST-LARSSON

et al. 1992; WAELCHLI et al. 2000; CHOU et al. 2001; EDNER et al. 2005;

MURCHIE et al. 2006; VICKROY et al. 2008; EDNER et al. 2009; NOURIAN et al.

2010a; NOURIAN et al. 2010b). Die Herausforderungen des In-vivo-Einsatzes bei

den großen Haussäugetieren sind deutlich komplexer als bei Kleintieren. Bei der

Anwendung am wachen, unsedierten Tier muss das gesamte MD-Equipment so am

Tier angebracht werden, dass einerseits dessen Bewegungsfreiheit nicht zu stark

eingeschränkt wird und andererseits die Ausrüstung ausreichend geschützt wird.

Weiterhin sollten bei der Anbringung am Tier die relative Lage der Komponenten

zueinander und deren Auswirkungen auf die Flussrate beachtet werden.

Höhenunterschiede > 30 cm zwischen der Kathetermembran, der MD-Pumpe und

dem Probensammelgefäß können den hydrostatischen Druck im System erhöhen,

während lange Schlauchsysteme (> 1,5 m) zu einem erhöhten Fließwiderstand

führen können (CHOU et al. 2001). EDNER et at. (2009) implantierten MD-Katheter

in die Glutealmuskulatur von Pferden. Nur ein kleiner Teil der Katheter konnte über


die gesamte Versuchsdauer von 24 Stunden genutzt werden, der Großteil der

Katheter wurde während des Versuchs beschädigt oder war – vermutlich durch die

natürliche Bewegung der Pferde – aus der Muskulatur herausgerutscht.

2.4.4 Vor- und Nachteile der Mikrodialyse

Die MD ermöglicht die kontinuierliche In-vivo-Konzentrationsbestimmung

ungebundener, exogener Substanzen in der ISF von Geweben (ELMQUIST u.

SAWCHUK 1997) und ist damit anderen Methoden zur Konzentrationsbestimmung

überlegen (JOUKHADAR et al. 2001). Die Bestimmung der ungebundenen

Wirkstofffraktion in der ISF ist v. a. bei Antiinfektiva von großer Bedeutung (DE LA

PENA et al. 2000; BRUNNER u. LANGER 2006).

Darüber hinaus ist die MD am wachen Tier durchführbar und erlaubt damit die

dynamische und kontinuierliche Probennahme über einen längeren Zeitraum

(Stunden bis Tage) ohne den möglicherweise negativen Einfluss von Anästhetika

(CHAURASIA et al. 2007). Die Möglichkeit an einem Tier mehrere Proben über einen

längeren Zeitraum zu nehmen, trägt dazu bei die Anzahl der Versuchstiere zu

reduzieren (DE LANGE et al. 2000). Weiterhin vorteilhaft ist, dass durch die

Dialysetechnik proteinfreie Proben entstehen und eine Probenaufarbeitung entfällt

(CHAURASIA et al. 2007).

Gleichzeitig jedoch stellt die Methode sehr hohe Ansprüche an die Analytik, da im

Allgemeinen nur sehr kleine Probenvolumina mit geringen Konzentrationen erreicht

werden (DE LANGE et al. 2000; CHAURASIA et al. 2007). Die Berechnung absoluter

Gewebekonzentrationen setzt eine In-vivo-Kalibration voraus, die sehr zeitaufwendig

sein kann (DE LANGE et al. 2000). Trotz der Tatsache, dass es sich bei der MD um

eine semiinvasive Technik handelt, wird durch die Katheterimplantation ein

Gewebetrauma gesetzt (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u. KLOFT 2005). Das

Trauma ist i. d. R. gering, dennoch besteht die Möglichkeit, dass dieses die

Ergebnisse der MD beeinflusst (CHAURASIA et al. 2007).

Material und Methoden 47

3 Material und Methoden

3.1 Vorversuche

3.1.1 Implantation des Mikrodialysekatheters

Die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen dienten der Entwicklung einer

Methode, welche es ermöglicht einen MD-Katheter im Bereich der NNH von Pferden

zu implantieren. Das primäre Ziel war es, die Membran des MD-Katheters in der

NNH-Schleimhaut zu platzieren ohne diese zu perforieren oder die Membran des

Katheters zu beschädigen. Weiterhin sollte es die Methode ermöglichen den

Katheter auch unter In-vivo-Bedingungen am sedierten Pferd kontrolliert und

minimalinvasiv in der gewünschten Position zu platzieren.

Die Versuche zur Methodenentwicklung wurden an isolierten Pferdeköpfen (n = 20)

durchgeführt. Dabei handelte es sich um adulte Warmblutpferde, die aufgrund

anderer Erkrankungen als der NNH euthanasiert worden waren. Zwischen dem

Zeitpunkt der Euthanasie und den Versuchen lagen drei Stunden bis maximal drei

Tage. Zur Durchführung der Versuche wurden die abgetrennten Köpfe so gelagert,

dass sie mit den Unterkieferästen einer geraden Oberfläche auflagen. Bei den ersten

Tieren wurden zur besseren Übersicht Haut und Unterhaut auf Stirn und

Nasenrücken mithilfe eines Skalpells entfernt, so dass nur noch das Periost dem

Knochen auflag. Im späteren Stadium der Vorversuche wurde der Knochen nur im

Bereich der benötigten Zugänge freigelegt. Die Durchführung der Versuche erfolgte

jeweils auf beiden Angesichtshälften.

Als mögliche Lokalisationen wurden die Bereiche des Sinus frontalis und des Sinus

maxillaris caudalis in Betracht gezogen, da diese Sinus von außen gut zugänglich

sind. Für den Bereich des Sinus maxillaris caudalis wurden die Zugänge im Bereich

der üblichen Lokalisation für Trepanationen dieses Sinuskompartiments gewählt

(Kap. 2.1.5). Für den Sinus frontalis wurden verschiedene Positionen in einem

Bereich ca. 2 cm lateral der Mittellinie des Nasenrückens bis 2,5 cm medial des

Orbitarandes (mediolaterale Ausdehnung) sowie zwischen den Verbindungslinien der


Foramina supraorbitalia und der medialen Augenwinkel (rostrokaudale Ausdehnung)

genutzt.

Als Instrumentarium zur schleimhautschonenden Perforation des Knochens dienten

im frühen Stadium der Vorversuche Handbohrer und Druckluftbohrer mit

Bohraufsätzen von 1,5 bis 2,5 mm Durchmesser. Im weiteren Verlauf wurde eine

elektrische Fräse (Model 398 Professional; Dremel®, Breda, Niederlande) in

Kombination mit einem ovalen Fräskopf (4 x 8 mm, Ultrapower Bur; ConMedTM

Linvatech, Largo, Florida, USA) verwendet. Zur visuellen Kontrolle der

Katheterplatzierung wurden in den ersten Versuchen mithilfe einer oszillierender

Säge Knochenfenster in den Bereich von Sinus maxillaris caudalis bzw. Sinus

frontalis eingebracht. Diese ermöglichten den Zugang für einen Handspiegel und

somit die visuelle Kontrolle innerhalb des jeweils anderen Sinuskompartiments.

Später erfolgte die Kontrolle videoendoskopisch (GIF Type N180, Evis Exera II video

gastroscope; Olympus®, Tokyo, Japan) über ein Portal im Sinus maxillaris caudalis

(Kap. 2.1.5). Zur Simulation des MD-Katheters wurde zunächst ein dünner Draht

(Durchmesser 0,9 mm) mit abgerundeter Spitze verwendet; später wurde ein original

MD-Katheter (CMA 70 Brain Microdialysis Catheter; CMA Microdialysis AB, Solna,

Schweden) verwendet. Beurteilt und dokumentiert wurden neben dem Gelingen der

schleimhautschonenden Perforation des Knochens und der Insertion (von lateinisch

inserere, hineinstecken) des Katheters auch positive und negative Einflussfaktoren

auf das Gelingen der Kathetherimplantation.

3.1.2 In-vitro-Kalibration der Mikrodialysekatheter

Ziel der folgenden Untersuchung war die Funktionsüberprüfung und die Bestimmung

der Wiederfindungsparameter der einzelnen MD-Katheter vor dem In-vivo-Einsatz.

Mikrodialysezubehör

Das verwendete MD-System besteht aus einem MD-Katheter, einer Mikroperfusions-

pumpe, Perfusorspritzen und Probensammelgefäßen. Die verwendeten Materialen

wurden von der Firma CMA Microdialysis AB (Solna, Schweden) bezogen.


Bei dem verwendeten MD-Katheter (CMA 70 Brain Microdialysis Catheter) handelt

es sich um ein konzentrisches Kathetermodell. Der Katheter besteht aus einem

zuführenden Schlauch (Länge: 600 mm, Außendurchmesser: 1 mm, Material:

Polyurethan), einem Katheterschaft (60 mm, 0,9 mm, Polyurethan) und einem

abführenden Schlauch (220 mm, 1 mm, Polyurethan), an dessen Ende sich eine

Halterung für das Probensammelgefäß befindet. Der distale Abschnitt des äußeren

Katheterschaftes beinhaltet die semipermeable Membran (10 mm, 0,6 mm,

Polyamid), welche eine Porengröße von 20.000 Dalton (Cut-off) hat.

Zur Inbetriebnahme des Systems wird das proximale Ende des zuführenden

Schlauchs mit einer flüssigkeitsgefüllten Perfusorspritze (CMA 106 Syringe)

verbunden. Die batteriebetriebene Mikroperfusionspumpe (CMA 107 Microdialysis

Pump) ermöglicht die Perfusion des Katheters mit Flussraten von 0,1 bis 5 µl/Min.

Lediglich der Spülzyklus, welcher durch das Öffnen und Schließen der

Pumpenverschlussklappe bei eingelegter Perfusorspritze ausgelöst wird, erlaubt

kurzfristig (fünf Minuten) eine höhere Flussrate von 15 µl/Min. Das entstehende

Dialysat wird in einem austauschbaren Probensammelgefäß (Microvial,

Fassungsvermögen jeweils 200 µl) am Ende des abführenden Schlauches

aufgefangen.

Ansetzen der Lösungen

Es wurden separate Stammlösungen für SDM und SDZ mit einer

Wirkstoffkonzentration von 1 mg/ml PBS hergestellt. Ausgehend von diesen

Stammlösungen wurden folgende Arbeitslösungen erstellt:

SDM: 0,1 µg SDM/ml PBS; 0,5 µg SDM/ml PBS; 1 µg SDM/ml PBS

SDZ: 1 µg SDZ/ml PBS

SDM und SDZ: 1 µg SDM und 1 µg SDZ/ml PBS


Die Lösungen wurden bis zu ihrer Verwendung in geschlossenen Glasgefäßen bei

2 - 8 °C aufbewahrt. Der Wirkstoffgehalt der angesetzten Lösungen wurde in

Kontrollproben ermittelt.

Bestimmung der Wiederfindungsparameter

Die Funktion und die Wiederfindungsparameter jedes einzelnen MD-Katheters

wurden vor dem In-vivo-Einsatz in Form eines In-vitro-Experiments überprüft. Für

jedes Pferd wurde ein neuer Katheter verwendet, dementsprechend wurden die im

Folgenden beschriebenen In-vitro-Versuche an insgesamt zwölf Kathetern

durchgeführt.

Jeder MD-Katheter wurde erst unmittelbar vor der Durchführung des In-vitro-

Versuchs aus seiner Verpackung (einzeln steril verpackt) entnommen. Im folgenden

Versuchsaufbau wurde die Membran des Katheters jeweils zentral in ein mit ca.

30 ml Flüssigkeit gefülltes Becherglas (Außendurchmesser: 35 mm, Höhe: 60 mm)

getaucht. Die enthaltene Flüssigkeit wurde mithilfe eines Magnetrührers langsam

umgerührt und mittels eines Wasserbades konstant auf 37 °C gehalten (Abb. 3.1).

Zunächst wurde der Katheter in PBS getaucht und ca. 20 Minuten lang mit PBS

gespült (Flussrate: 15 µl/Min). Das gewonnene Dialysat wurde gesammelt und als

Leerprobe verwendet. Anschließend wurde die Wiederfindung von SDM aus dem

umgebenden Medium bei drei verschiedenen SDM-Konzentrationen (0,1, 0,5,

1 µg/ml PBS) bestimmt. Dafür wurde die Kathetermembran in die Lösung der

entsprechenden Konzentrationsstufe (beginnend mit der niedrigsten und endend mit

der höchsten) getaucht; gleichzeitig wurde der Katheter mit einer SDZ-Lösung

(1 µg/ml PBS) und einer Flussrate von 2 µl/Min perfundiert. Die Probenintervalle

betrugen jeweils 90 Minuten. Nach dem Wechsel der Konzentrationsstufe wurde

jeweils eine Äquilibrierungszeit von zehn Minuten eingehalten. In dieser Zeit wurde

der Katheter wie bereits beschrieben perfundiert, während die Membran in die neue

SDM-Lösung getaucht wurde. Das während dieser Phase gesammelte Dialysat

wurde verworfen. Abschließend wurde die Membran des Katheters in PBS getaucht

und mit einer Perfusionslösung, welche jeweils 1 µg SDM und 1 µg SDZ pro ml PBS


enthielt, durchspült (Referenzphase). Die Flussrate von 2 µl/Min sowie die Länge des

Probenintervalls wurden beibehalten.

Abb. 3.1: Versuchsanordnung des MD-Systems im Rahmen der In-vitro-Kalibration: (a) Stoppuhr, (b) Mikroperfusionspumpe, (c) Microvial, (d) Thermometer, (e) Wasserbad, (f) Heizplatte mit Magnetrührer: Die Membran des MD-Katheters befindet sich in einem flüssigkeitsgefüllten Becherglas. Der Inhalt dieses Becherglases wird mittels eines Magnetrührers umgerührt, ein Wasserbad hält die Temperatur konstant bei 37 °C.

Der beschriebene Untersuchungsgang wurde für jeden Katheter an drei

aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt. Nach jedem Versuchstag wurde der

Katheter 30 Minuten mit Aqua bidestillata und einer Flussrate von 15 µl/Min gespült,

a

b

c

d

e

f


die Membran wurde dabei in ein Becherglas mit Aqua bidestillata getaucht. Nach

Beendigung des Spüldurchgangs wurde der Katheterschaft in die mitgelieferte

Schutzhülse eingeführt und der zuführende Schlauch mit einer Luer-Lock-Kappe

verschlossen. Die Aufbewahrung des Katheters erfolgte in einem mit Aqua

bidestillata gefüllten wiederverschließbaren Kunststoffgefäß bei 2 - 8 °C.

Das Dialysat jeder Probe wurde mithilfe einer Pipette aus den Microvials in HPLC-

Vials transferiert. Dabei wurde das überführte Volumen gemessen und dokumentiert.

Anschließend wurde jede Probe mit PBS auf jeweils 290 µl aufgefüllt. Die Proben

wurden bis zur Analyse bei − 20 °C gelagert.

Berechnung der Wiederfindungsparameter

Die relative Wiederfindung (RR) von SDM wurde für jeweils drei unterschiedliche

SDM-Konzentrationen an drei aufeinanderfolgenden Tagen bestimmt. Die exakte

SDM-Konzentration der jeweiligen Arbeitslösung wurden mittels der entnommenen

Kontrollproben bestimmt. Die RR wurde mit Hilfe der SDM-Konzentrationen in den

Arbeitslösungen (CSDM, Arbeitslösung) und den SDM-Konzentrationen im Dialysat

(CSDM, Dialysat) wie folgt berechnet:

Der relative Verlust von SDM (RLSDM, Ref.) und SDZ (RLSDZ, Ref.) während der

Referenzphase sowie der relative Verlust von SDZ während des restlichen In-vitro-

Versuchs ergab sich aus der folgenden Gleichung:

Der K-Faktor beschreibt das Verhältnis des relativen Verlusts von zwei Substanzen

aus der Perfusionslösung (Referenzphase) und wurde wie folgt berechnet:


Analytische Methode

Die Quantifizierung der Sulfonamidkonzentrationen erfolgte mittels Hochleistungs-

flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Einbeziehung der Methode des externen

Standards. Die HPLC-Anlage enthielt folgende Elemente: Pumpe (126 Solvent

Module Pump), Probeninjektor (507 Autosampler), Detektor (168 Detector) und die

Computersoftware 24 Karat 5.0 (Beckmann, München). Die Trennsäule (LichroCART

25-4, C18, 5 µm) und die Vorsäule (LichroCART 4-A, 5 µm, Merck, Darmstadt)

wurden gemeinsam in einer Säulenheizung (40 °C, Spark Holland, Emmen,

Niederlande) platziert. Der verwendete Eluent bestand zu 15 % aus Methanol und zu

85 % aus McIlvaine Zitratpuffer (pH 2,2; 20,8 g Zitronensäure, 0,4 g Na2HPO4 x H2O

in 1 l destilliertem Wasser). Es wurden jeweils 100 µl/Probe injiziert. Die

anschließende Analyse erfolgte bei einer Wellenlänge von 254 nm und einer

Flussrate von 1 ml/Min.

Die Nachweisgrenze betrug 0,07 µg/ml (SDM) bzw. 0,08 µg/ml (SDZ). Die

Quantifizierungsgrenze lag bei 0,14 µg/ml (SDM) bzw. bei 0,15 µg/ml (SDZ).

3.2 Hauptversuch Die Ziele des Hauptversuchs waren die Etablierung der Implantation des MD-

Katheters in die NNH-Schleimhaut von Pferden unter In-vivo-Bedingungen sowie die

nachfolgende Konzentrationsbestimmung des Antiinfektivums SDM in der NNH-

Schleimhaut nach dessen systemischer Applikation.

Die Angaben zu Material und Methoden dieser Versuche sind detailliert in den

Kapiteln 5.3 und 6.3 aufgeführt.

Ergebnisse 55

4 Ergebnisse

4.1 Vorversuche

4.1.1 Implantation des Mikrodialysekatheters

Der Sinus frontalis erwies sich, wie im Folgenden beschrieben, als für die

Katheterinsertion geeignet. Die konkrete Lokalisation des Insertionsortes wurde

durch die anatomischen Gegebenheiten des Sinus frontalis vorgegeben: Das

Septum nasi sowie die Orbita stellten die medialen und lateralen Begrenzungen dar,

während die kaudale Begrenzung durch das vermehrte Auftreten von

Knochenspangen kaudal der Verbindungslinie der beiden Foramina supraorbitale

vorgegeben wurde. Die Ausdehnung nach rostral wurde durch den Sinus conchae

dorsalis begrenzt. Innerhalb der genannten Grenzen war die Kathetherinsertion

grundsätzlich möglich, wobei die Auswahl der Katheterinsertionsstelle im Einzelfall

zu erfolgen hatte und maßgeblich von dem individuellen Verlauf und der Ausdehnung

der Knochenspangen entlang der Lamina externa des Os frontale bestimmt wurde.

Bei der Knochenperforation mittels Handbohrer und Druckluftbohrer wurde zunächst

eine kleine Vertiefung in den Knochen gebohrt, welche es im Folgenden ermöglichte

den Bohrkopf von kaudal kommend in einem Winkel von 15 bis 45° auf dem

Stirnbein aufzusetzen. Nachteilig an beiden Instrumenten (Handbohrer und

Druckluftbohrer) war die fehlende Möglichkeit zur Regulation des Drucks.

Dementsprechend gelang die schleimhautschonende Perforation des Knochens und

die anschließende Katheterinsertion nur in wenigen Fällen.

Eine geeignete Technik der Knochenperforation wurde mit einer elektrischen Fräse

(Model 398 Professional; Dremel®, Breda, Niederlande) in Kombination mit einem

ovalen Fräskopf (4 x 8 mm, Ultrapower Bur; ConMedTM Linvatech, Largo, FL, USA)

erarbeitet. Der Fräsaufsatz wurde zunächst senkrecht auf den Knochen aufgesetzt.

Dabei wurden punktuell und sukzessive die oberen Knochenschichten abgetragen,

bis der Knochen augenscheinlich sehr dünn, aber noch nicht vollständig perforiert

war. Der Perforation der Schleimhaut wurde vorgebeugt, indem eine

56 Ergebnisse

flüssigkeitsgefüllte Blase zwischen Knochen und paranasaler Schleimhaut

geschaffen wurde. Zu diesem Zweck wurde der Konus einer mit Wasser gefüllten

20 ml Spritze fest auf das Fräsloch aufgesetzt. Mikrorisse im Bereich des dünn

gefrästen Knochens ermöglichten das Eindringen von Flüssigkeit in die

subepithelialen Schichten der Mukosa. Durch das wiederholte Fräsen und

Applizieren von Flüssigkeit bildete sich eine flüssigkeitsgefüllte Blase unterhalb des

Fräsloches, welche durch die weitere Applikation von Wasser schließlich auf eine

Größe von 20 bis 30 mm Durchmesser vergrößert wurde. Die Lösung der

Schleimhaut unterhalb des Fräsloches ermöglichte schließlich die finale Perforation

des Knochens mit der Fräse ohne dabei die Schleimhaut zu verletzen. Der MD-

Katheter musste von kaudal in die geschaffene Blase inseriert werden, da im

Folgenden das gesamte MD-System im kaudalen Bereich des Pferdekopfes (Schopf

und Genick) angebracht wurde. Daher erforderte die Insertion des Katheters eine

Ausdehnung der Flüssigkeitsblase von mindestens 1,5 cm nach rostral. Darüber

hinaus erwies sich ein flacher Insertionswinkel des Katethers insofern als günstig, als

dass der Katheter parallel zur Schleimhaut und damit schonend in die Blase

eingeführt werden konnte. Aus diesem Grund wurde abschließend eine ca. 1 cm

lange Vertiefung in den kaudalen Rand der Knochenöffnung gefräst. Darin wurde

später der Katheterschaft positioniert. Insgesamt ermöglichte die beschriebene

Technik die zuverlässige, schleimhautschonende Perforation des Os frontale und die

anschließende Katheterinsertion. Dennoch waren zum Teil mehrere Versuche bis zur

erfolgreichen Katheterinsertion notwendig. Diese konnten zwar auf derselben

Kopfseite durchgeführt werden, aufgrund des Flüssigkeitsverlustes über die

bestehenden Perforationen sollte jedoch ein Mindestabstand von 10 bis 15 mm zu

den vorherigen Fräslöchern eingehalten werden. Wichtig ist weiterhin, dass die für

die Vorversuche verwendeten Köpfe möglichst nicht älter als 24 Stunden sein sollten.

Die Austrocknung der Schleimhautauskleidung war nach Ablauf dieser Zeit so stark

fortgeschritten, dass sie die Blasenbildung maßgeblich erschwerte.

Abschließend soll erwähnt werden, dass auch der Sinus maxillaris caudalis als

mögliche Katheterinsertionsstelle erprobt wurde. Jedoch erwies sich die kontrollierte

und schleimhautschonende Perforation der vergleichsweise dünnen Knochen (Os

Ergebnisse 57

lacrimale, Os zygomaticum und Maxilla) als problematisch. Darüber hinaus erwies

sich das Anbringen des MD-Systems am Pferdekopf als schwierig, da die zu- und

abführenden Schläuche über eine vergleichsweise lange Strecke über das Angesicht

des Pferdes geleitet werden mussten. Der Sinus maxillaris caudalis wurde damit als

ungeeignet für die Katheterimplantation betrachtet. Jedoch wurde er im Folgenden

gemäß der für seine Trepanation beschriebenen Lokalisation (RUGGLES et al. 1991;

BERTONE et al. 1993) als endoskopischer Zugang in die Stirnhöhle genutzt (Kap. 5).

4.1.2 In-vitro-Kalibration der Mikrodialysekatheter

Die In-vitro-Anwendung der MD-Katheter diente einerseits der Sicherung ihrer

Funktionsfähigkeit vor dem In-vivo-Einsatz sowie der orientierenden Bestimmung der

Wiederfindungsparameter unter In-vitro-Bedingungen. Zwei der verwendeten

Katheter produzierten nach einem bzw. zwei unauffälligen Versuchsdurchgängen

kein Dialysat. Bei einem der Katheter erschien die MD-Membran gestaucht, an dem

zweiten Katheter waren keine Veränderungen erkennbar, die einen Ausfall hätten

erklären können; beide Katheter wurden ersetzt.

Die Tab. 4.1 gibt einen Überblick über die In-vitro-Wiederfindungsparameter jener

MD-Katheter, die im Rahmen des 48-stündigen MD-Versuchs an zehn Pferden

eingesetzt wurden (Kap. 6). Die angegebenen Katheternummern entsprechen dabei

den Tieren, an denen der jeweilige In-vivo-Einsatz erfolgte. Die angegebenen

Wiederfindungsparameter stellen den Mittelwert aus drei Versuchstagen dar.

Die entnommenen Leerproben ergaben keinerlei Hinweise auf Sulfonamidrückstände

im MD-Katheter. Die Wiederfindung von SDM aus den niedrig-konzentrierten SDM-

Medien (0,1 und 0,5 µg/ml) weisen hohe Standardabweichungen auf. Für die

Konzentrationsstufe 0,1 µg/ml waren die Werte von vier Kathetern (Nr. 2 bis 5)

aufgrund zu geringer SDM-Konzentrationen in den Dialysaten nicht auswertbar.

Sowohl die RRSDM-Werte aus dem höher konzentrierten Medium (1 µg/ml) sowie die

Werte für RLSDM, Ref. wiesen deutlich geringere Standardabweichungen auf. Bei der

Kalibration der Katheter 7 und 8 war die RLSDM, Ref. nicht auswertbar, da die

Perfusionslösung zu hohe SDM-Konzentrationen enthielt (Kontrollprobe).

58 Ergebnisse

Der relative Verlust des internen Standards SDZ zeigte sowohl innerhalb einer SDM-

Konzentrationsstufe als auch während der Referenzphase keine großen

Schwankungen. Die RLSDZ-Werte weisen bei steigenden SDM-Konzentrationen im

Medium eine sinkende Tendenz auf. Der durchschnittliche relative Verlust von SDZ

für die SDM-Wiederfindungsversuche beträgt 58,0 % und ist damit übereinstimmend

mit dem RLSDZ-Wert der Referenzphase (57,5 %).

Der errechnete K-Faktor, welcher das Verhältnis von RLSDZ, Ref. zu RLSDM, Ref.

beschreibt, konnte bei zwei Kathetern (7 und 8) aufgrund der fehlenden RLSDM, Ref.

nicht berechnet werden.

4.2 Hauptversuch Die Ziele des Hauptversuchs waren die Etablierung der Implantation des MD-

Katheters in die NNH-Schleimhaut von Pferden unter In-vivo-Bedingungen sowie die

nachfolgende Konzentrationsbestimmung des Antiinfektivums SDM in der NNH-

Schleimhaut nach dessen systemischer Applikation.

Die Angaben zu den Ergebnissen dieser Versuche sind detailliert in den Kapiteln 5.4

und 6.4 aufgeführt.

Ergebnisse 59

SD

0,0

69,0

31,5

31,8

20,6

12,2

10,9

9,1

10,0

0,3

MW

0,0

74,7

34,6

60,2

68,3

63,1

58,9

51,9

57,5

0,9

10 0

75,5

43,3

38,0

85,8

80,9

71,7

60,4

72,4

0,8

9 0

70,1

34,0

36,0

75,6

78,2

75,7

63,6

61,4

0,8

8 0

18,3

5,4

81,8 -

63,9

60,1

53,8

58,7 -

7 0

80,3

17,2

137,0

-

63,0

61,0

54,2

59,7 -

6 0 4,3

17,7

69,1

64,0

63,7

58,1

54,9

56,7

0,9

5 0 NQ

24,5

37,2

80,7

65,3

60,4

53,4

66,1

0,8

4 0 NQ

11,6

45,9

83,7

70,7

65,4

53,7

66,0

0,8

3 0 NQ

24,2

32,0

81,2

46,5

44,1

36,0

41,8

0,5

2 0 NQ

113,9

67,2

28,1

56,4

51,5

52,9

47,5

1,7

1 0

199,7

54,5

58,0

47,6

42,8

41,6

35,9

45,0

0,9

Perf

usat

PB

S

SD

Z (

1,0

)

SD

Z (

1,0

)

SD

Z (

1,0

)

SD

M (

1,0

)

SD

Z (

1,0

)

SD

Z (

1,0

)

SD

Z (

1,0

)

SD

Z (

1,0

)

SD

M (

1,0

)

SD

Z (

1,0

)

Mediu

m

PB

S

SD

M (

0,1

)

SD

M (

0,5

)

SD

M (

1,0

)

PB

S

SD

M (

0,1

)

SD

M (

0,5

)

SD

M (

1,0

)

PB

S

Leerp

robe

RR

SD

M (%

)

RL

SD

M,

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(%

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RL

SD

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- 1

0.

Manuscript I 61

5 Manuscript I

Application of in vivo microdialysis for investigation of unbound drug

concentrations in the paranasal sinus mucosa of adult horses.

5.1 Abstract Microdialysis (MD) has been used to investigate concentrations of exogenous

substances in the interstitial fluid of various tissues, but it has apparently not been

used within the paranasal cavity of any species. The objective of the present study

was to establish a novel method of inserting a MD probe into the paranasal mucous

membrane of horses.

A MD probe was implanted into the frontal sinus (FS) of healthy horses (n = 12; age

5 - 23 y; 410 - 675 kg). Implantation was done in standing, sedated horses under

endoscopic guidance (caudal maxillary sinus portal). A skin flap (~ 3 x 3 cm),

centered at the FS, was created; next, an opening (diameter: ~ 3 mm) was drilled into

the frontal bone (4 x 8 mm bur, attached to a corded drill), without lacerating the

underlying paranasal sinus mucosa. Using the bore hole, sterile fluid (PBS) was

forced between the frontal bone and the underlying mucosa, creating a fluid-filled

blister within the subepithelial layers of the sinus mucosa (histologically approved).

The MD probe was inserted into the fluid-filled blister, and the complete MD system

(tubing, microperfusion pump, sampling vial) was affixed to the horse (forehead, poll).

Complications during probe implantation were perforation of the mucous membrane

during drilling or probe placement, or rupture of the blister while applying PBS; the

mean procedure time was 295 min (SD ± 106 min). Subsequent in vivo MD was

performed in 10 horses for 52 h (4 h calibration, 48 h sample collection). These

horses were administered a trimethoprim-sulfadimidine formulation (30 mg/kg, IV)

twice (t0, t24); dialysate samples were continuously collected every 90 min for 48 h,

revealing consistent dialysate levels in most horses. Horses displayed minimal signs

of discomfort (headshaking, rubbing heads: n = 3). Short-term complications

associated with the surgery were mild and only of temporary nature (nasal discharge

62 Manuscript I

n = 5; lymphadenopathy n = 5; emphysema n = 6; swelling of portals n = 12;

incisional infection n = 2), whereas long-term results were excellent.

This study demonstrates the feasibility of placing a MD probe within the paranasal

sinus mucosa in standing, sedated horses, and performance of subsequent in vivo

MD over 52 h in horses with minimal restraint. The results of the present study

therefore lay the foundations for continuous monitoring of substances of interest

within the paranasal sinus mucosa in unsedated horses.

Keywords: equine, microdialysis, pharmacokinetic, trimethoprim-sulfonamide,

paranasal sinus mucosa

5.2 Introduction Sinusitis is the most frequent disorder of the paranasal sinuses in horses (NICKELS

2006). It may be caused by infections of the upper respiratory tract (primary sinusitis)

or by dental disease, facial trauma, sinus cysts, progressive ethmoid hematoma,

sinonasal mycosis or neoplasia (secondary sinusitis) (TREMAINE u. DIXON 2001a;

O'LEARY u. DIXON 2011). Clinical significance of equine sinonasal disorders derives

from their chronicity and the fact that they are usually difficult to treat (TREMAINE et

al. 1999; TREMAINE u. DIXON 2001a). Anti-infective drugs are frequently used in

treatment of equine sinusitis, although poor response to antimicrobial therapy has

been reported repeatedly (MASON 1975; BOULTON 1985; TROTTER 1993;

TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON u. O'LEARY 2012). Unfortunately, critical

information on antimicrobial therapy in sinusitis of horses is rare.

For most bacterial infections, the infection site is the interstitial fluid (RYAN 1993),

making this compartment the target site for anti-infective drugs. In absence of

detailed information, choice of anti-infective substances is often based on the

assumption – contrary to scientific evidence – that these drugs reach the infection

site (BRUNNER et al. 2005). If this is not the case, subinhibitory drug concentrations

may cause treatment failure by persistence of the causative organisms and bacterial

resistance (MÜLLER et al. 2004; STEINER et al. 2004). Therefore, concentration

Manuscript I 63

profiles of anti-infective drugs should be obtained directly from their target site, e. g.

the interstitial fluid (JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et al. 2004). Microdialysis

(MD) has been reported to be a suitable technique for continuous monitoring of

unbound, pharmacologically active drug concentrations in the interstitium (MÜLLER

et al. 1996; JOUKHADAR et al. 2001; BRUNNER et al. 2005; CHAURASIA et al.

2007). MD has been utilized for various tissues (DE LA PENA et al. 2000; PLOCK u.

KLOFT 2005), but it has apparently not been used in the paranasal sinuses of any

species.

Information presented below is part of an investigation using in vivo MD to

characterize the pharmacokinetics of an anti-infective drug within the paranasal

cavity of horses. The primary objective of the present work was to establish and

evaluate a method for inserting a MD probe into the paranasal mucosal lining of

horses. Subsequently, MD was used to detect local concentrations of a systemically

administered trimethoprim-sulfadimidine formulation within the paranasal mucous

membrane; those results are presented in a second publication (Ch. 6).

5.3 Materials and Methods

5.3.1 Horses

Adult, university-owned horses (n = 12) of various breeds, 11 mares and one stallion,

were used. Horses weighed from 410 to 675 kg (mean 557.9 kg) and were from 5 to

23 y of age (mean 13.9 y). All horses were considered healthy based on a general

physical examination, routine hematology, and blood chemistry. None of the horses

had a history or clinical signs of paranasal sinus disease. Lateral and dorsoventral

radiographs (done prior to the study) of the paranasal sinuses revealed no

abnormalities. The horses had not received any medical treatment for at least 3 wk

before enrollment. Horses were housed in individual stalls, fed hay and mixed feed

twice daily, and had ad libitum access to water.

64 Manuscript I

All procedures were performed under a protocol approved by the Ethical Committee

of the Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety

(No. 33.9-42502-04-10/0227).

5.3.2 Microdialysis equipment

Concentric MD probes (CMA 70 Brain Microdialysis Catheter; CMA Microdialysis AB,

Solna, Sweden) were used for both preliminary investigations and in vivo studies.

The probe system (Fig. 5.1) consisted of polyurethane inlet (length: 600 mm, outer

diameter: 1 mm) and outlet tubes (220 mm, 1 mm). The probe shaft (60 mm, 0.9 mm)

was made from polyurethane, whereas the MD membrane (10 mm, 0.6 mm) was

polyamide. When the equipment was in use, the inlet tube was connected to a CMA

106 Syringe (CMA Microdialysis AB), which in turn was placed in a CMA 107

Microdialysis Pump (CMA Microdialysis AB).

Prior to installation, each probe was tested under in vitro conditions to ensure

function. After testing, probes were stored in aqua bidestillata. Before in vivo

application, probes were flushed with sterile-filtered phosphate buffered solution

(PBS, pH 7.4) and kept in PBS until immediately prior to implantation.

5.3.3 Microdialysis probe implantation

Preliminary studies were done to establish the surgical procedure of implanting a MD

probe into the paranasal cavity of horses (data not shown). These studies used

isolated equine heads (n = 20), euthanized for reasons other than disorders of the

paranasal sinuses.

The in vivo surgical procedure was carried out at the Clinic for Horses of the

University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Germany. The horses were

restrained in stocks. A 12-gauge indwelling intravenous catheter (EquiCathTM

Fastflow; B. Braun Vet Care GmbH, Tuttlingen, Germany) was aseptically inserted

into one of the jugular veins. Horses were sedated with IV injections of detomidine

hydrochloride (0.015 - 0.03 mg/kg; Cepesedan® RP; CP-Pharma Handelsgesellschaft

mbH, Burgdorf, Germany) and butorphanol tartrate (0.1 mg/kg, Alvegesic® PH; CP-

Manuscript I 65

Pharma), with additional injections given as needed. The dorsolateral aspect of the

head was prepared for aseptic surgery. The proposed incision lines were infiltrated

subcutaneously with 2 % lidocaine hydrochloride (Lidocainhydrochlorid 2 %®; bela-

pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Germany).

The implantation of the MD probe required two points of access into the skull

(Fig. 5.2). Firstly, a sinoscopy portal was created to allow endoscopic guidance for

implantation of the MD probe. The portal was located at the caudal maxillary sinus

(CMS), approximately 2 cm rostral and 2 cm ventral to the medial canthus of the eye

(RUGGLES et al. 1991; BERTONE et al. 1993). A 25 to 30 mm longitudinal incision

was made through skin and subcutaneous tissues. Tissues were retracted (Weitlaner

retractor) and the underlying periosteum was reflected (periosteal elevator). An oval

bur (4 x 8 mm, Ultrapower Bur; ConMedTM Linvatech, Largo, FL, USA; Fig. 5.3)

attached to a high-speed, corded drill (Model 398 Professional; Dremel®, Breda,

Netherlands) was used for creating the opening. The hole was sequentially expanded

by gently rotating the sharp edges of the bony margins. The shortened and rounded

end of a 2 mL syringe (outer diameter: 10 mm) was inserted into the CMS portal to

provide protection of the endoscope.

A flexible video endoscope with an outer diameter of 4.9 mm (GIF Type N180, Evis

Exera II video gastroscope; Olympus®, Tokyo, Japan) was inserted into the CMS and

advanced into the FS via the fronto-maxillary aperture. The FS and the lamina

externa of the frontal bone were assessed for the appearance of the sinus mucosa

and potential bony lamellae to determine the location of the MD portal (the second

opening into the skull). A second incision was made to create a three-sided

rectangular skin flap (~ 3 x 3 cm), located over the centre of the FS (Fig. 5.2). The

caudal edge of the flap was on a line connecting the dorsal midline of the skull

perpendicularly with the surpraorbital foramen. The ventral edge was applied at the

level of the medial canthus of the eye, parallel to the caudal edge. The lateral edge

connected both lines. The periosteum was incised and reflected towards the medial

border of the flap.

66 Manuscript I

The objective was to create an opening (~ 1 to 2 mm) in the frontal bone for probe

placement inside the FS, without perforation of the underlying paranasal mucosa.

Firstly, the bur was positioned perpendicularly on the frontal bone and used to

remove the outermost layers of the frontal bone and create a depression of

approximately 3 mm diameter. Drilling was done intermittently for brief intervals,

intermixed with firm application of gauze swabs (soaked in cold sterile saline), for

hemostasis and tissue cooling. Sinoscopy was used to monitor drilling; when the

remaining bone appeared thin, the luer tip of a 20 mL syringe, filled with sterile-

filtered PBS, was positioned on the depression, and light pressure was applied.

Smallest fissures in the bone (caused by drilling) enabled PBS to be forced between

bone and mucosa. By alternating drilling (brief) and application of PBS (extensive)

over a prolonged interval, a fluid-filled blister was established within the subepithelial

layers of the sinus mucosa (Fig. 5.4 - A). The blister was eventually expanded to a

diameter of approximately 20 to 30 mm by applying further PBS (Fig. 5.4 - B). Since

the majority of PBS did not penetrate the area under the bone, on average,

approximately 0.5 to 1.0 L of PBS was necessary to create the blister. Finally, the

opening in the bone (overlying the blister) was enlarged to approximately 2 mm, and

the caudal edge of the hole was beveled. A non-functional test probe was inserted

through the opening from the caudal direction and advanced until its membrane was

completely positioned within the blister (Fig. 5.4 - C). Only when the test probe was

inserted far enough and without resistance, the functional probe was used (otherwise

the blister, the opening, or both, was enlarged).

The shaft of the probe was secured to the skin of the horse’s forehead with tissue

glue (Dermabond®; Ethicon Products, Norderstedt, Germany) (Fig. 5.5 - a). Next, the

dermal flap was repositioned and the skin of both incisions was closed with

disposable skin staples or simple interrupted stitches (Dafilon® 1 USP; B. Braun Vet

Care GmbH). The tubing of the MD system was directed caudally and sutured to the

forehead with one or two simple interrupted stitches; the vial holder was taped to the

forelock (overflow valve of the vial upwards; Fig. 5.5 - b). The inlet tube was

connected to the MD syringe, which in turn was placed inside the MD pump. The

latter was secured in a metal box (120 x 85 x 40 mm), and stowed in a small bag

Manuscript I 67

(Fig. 5.6 - A). The bag (total weight, including contents, ~ 400 g) was placed at the

poll and taped to the horse’s halter (Fig. 5.6 - B).

5.3.4 In vivo microdialysis study

Horses 2 to 12 participated in the in vivo MD study, described in detail in the

companion publication (Ch. 6). These studies were initiated by an in vivo calibration

period (~ 4 h) immediately after probe placement. Then, horses were given a

trimethoprim-sulfadimidine formulation (30 mg/kg, IV, Bigram®; CP-Pharma), defining

the start of the MD study (t0). The MD system was continuously perfused with

perfusion solution containing 1 µg sulfadiazine/mL PBS at a flow rate of 2 µL/min.

The study was performed for 28 h (4 h in vivo calibration and 24 h sample collection;

Horse 2) or 52 h (4 h in vivo calibration and 48 h sample collection; Horses 3 to 12),

respectively. The operation of the MD system was closely monitored and the vials of

collected dialysate were changed every 90 min. Horses 3 to 12 received a second

trimethoprim-sulfadimidine treatment after 24 h (t24). After collection of the last

sample, MD system and IV catheter were removed.

Horse 1 served for preliminary investigations: it had a MD probe implanted into its FS

and left in situ for 12 h, but no MD was performed.

5.3.5 Post-surgical treatment

After successful installation of the MD system, horses were returned to individual

stalls. Packed cell volume and total protein were determined on the day of probe

implantation and daily on the following 2 d. A routine physical examination was done

once daily for 2 wk, or until euthanasia due to enrollment in an unrelated study

(n = 8). Furthermore, at each examination, specific assessments were done to detect

discomfort, nasal discharge or epistaxis, swollen mandibular lymph nodes, and

incisional complications. Follow-up sinoscopy was performed in Horses 2 (d 1),

5 (d 4), and 9 (d 2 and 4) reusing the existing CMS portals. Staples or stitches were

removed 14 d after surgery or the last follow-up sinoscopy, respectively, and the

cosmetic outcome was assessed 30, 60, and 90 d after surgery (n = 4).

68 Manuscript I

5.3.6 Histological analysis

Horse 12 was euthanized 5 d after MD probe implantation and subsequent

performance of in vivo MD for 52 h. After collection of the last sample, the inlet and

outlet tubes of the probe were cut and the MD system was removed; only the probe

membrane and shaft were left in situ. After the horse was humanely euthanized, the

head was detached and perfused with Bouin’s solution via the common carotid

arteries. Subsequently, samples were obtained from: (1) the central area of the

blister including the MD probe, (2) the transition region between blister and blister

margin, (3) the area of the drilled hole, and (4) from the lateral and ventral walls of

the FS (control tissues). Samples were decalcified in a solution of 25 %

ethylendiamintetraacetic acid (EDTA), pH 7.8, at 37 °C for 28 d, routinely embedded

in paraffin, sectioned (6 µm), and stained with toluidine blue. Sections were

examined under light microscopy.

5.4 Results

5.4.1 Microdialysis probe implantation

Implantation of a MD probe into the FS was successfully performed in all 12 horses.

The duration of the procedure ranged from 180 to 480 min (mean ± SD,

295 ± 106 min). Sedation provided excellent chemical restraint in all horses. Neither

of the two surgical interventions (CMS portal incision and SF skin flap creation)

resulted in substantial hemorrhage.

The sinoscopy portal provided direct access to the CMS in 12 of 14 cases (Tab. 5.1).

In two cases, the rostral maxillary sinus was entered inadvertently, so a second

portal was created caudal to the first. In all horses, the endoscope was easily

directed through the fronto-maxillary aperture into the FS. Exploration of the CMS

and FS revealed healthy sinus mucosa in all horses. Each horse had a unique

configuration of bony lamellae within its FS. Detection of presence and extent of bony

lamellae was assisted by the endoscope light visible through the frontal bone.

Manuscript I 69

Creation of an efficient MD portal, using the selected side of the head, was

successful in 10 horses. In these horses, one to three attempts (mean ± SD,

1.7 ± 0.8) had to be made until successful probe implantation. In two horses (3 and

6), creation of a MD portal on the initially chosen side of the head failed and a second

approach was successfully created on the contralateral side.

Appropriate blisters for probe implantation were established at first trial in six horses

(Tab. 5.1). In four horses (3, 4, 6, and 11), the mucous membrane was perforated by

the bur while drilling (Fig. 5.7 - A). In two horses (11 and 12), the mucous membrane

ruptured while applying pressure with the PBS syringe. In two horses (8 and 12), the

blister underlined the hole safely, but expanded in a caudal direction (Fig. 5.7 - B);

consequently, the probes could not be inserted far enough to place the MD

membrane area completely within the blister. In these cases, a second hole was

created caudal to the first one under protection of the blister and was used for probe

insertion. In one horse (3, second side of the head), the readily established blister

was perforated by the MD probe (Fig. 5.7 - C), when the horse suddenly moved its

head during probe insertion. This probe produced no dialysate after implantation and

had to be replaced. Replacement of a MD probe due to lacking dialysate production

was necessary in one other case (Horse 8).

During blister establishment, mild hemorrhage into the blister occurred in all horses.

However, this blood accumulated slowly, and appeared to dissipate evenly within the

blister. Hemorrhage did not apparently influence the size of the blister and no

retrograde flow through the drilled hole was detected at any point of time. Follow-up

sinoscopy (Horses 2, 5, and 9) revealed no differences in size, configuration, and

appearance of the blister compared to the situation during surgery. No signs for

mucosal inflammation were noticed.

5.4.2 In vivo microdialysis study

Horses appeared comfortable throughout the entire in vivo MD experiment. However,

headshaking (mild to moderate) and rubbing heads on forelegs or solid objects in the

stall (mild) was observed in three horses (3, 5, and 9). Rubbing or headshaking had

70 Manuscript I

no influence on the position of the MD probe or the remainder of the MD system.

Horses tolerated handling of the MD system well: vial retrieval and replacement was

possible by one person from the outset in eight horses. In two horses, assistance by

a second person was necessary for the first replacements. In these horses a

habituation was noticed within 24 h, and horses could be handled by one person for

the remaining experiment. One horse was adversed to handling throughout the entire

study, consistently requiring two persons to retrieve and replace vials.

The performance of the MD system was fully satisfactory. However, the amount of

dialysate collected was not consistent in Horse 3, apparently due to loss of fluid

through the overflow protection of the vial during headshaking. All probes remained

functional until the end of the intended study period (28 and 52 h after probe

placement) and consistent amounts of dialysate were collected.

5.4.3 Post-surgical outcome

Horses had their vital parameters (pulse, respiratory rate, rectal temperature) within

normal limits up to 14 d after surgery or until euthanasia, respectively. Packed cell

volume and total protein were determined within normal limits in all horses until the

end of the in vivo MD study. Scant serosanguineous nasal discharge from the

ipsilateral nostril was observed for the first 24 h in four horses and for the first 4 d in

one horse. Reactions of the mandibular lymph nodes were detected in five horses

(Tab. 5.1).

Six horses developed subcutaneous emphysema originating from the CMS portal.

Emphysema remained cool and non-painful in all affected horses. The soft tissue

surrounding the CMS and MD portals was mildly to moderately swollen in all horses.

However, swellings remained unobtrusive and resolved between 1 to 2 wk post-

surgery in 6 horses (the other 6 horses were euthanized before resolution).

Cutaneous portions of skin flaps and incisions healed by first intention in all horses

but Horse 3. This horse developed a minor incisional complication at the MD skin

flap. Furthermore, the ipsilateral mandibular lymph node was painful on palpation and

mucopurulent nasal discharge was evident at the same time. Another horse (9)

Manuscript I 71

developed multiple, superficial white plaques (diameter: ~ 1 mm) covering the FS flap

starting 2 wk post surgery. The suspected diagnosis of cutaneous fungus could not

be approved by laboratory examinations. Both horses were locally treated with

povidone-iodine soap (Iodosept®; Chassot GmbH/ Vétoquinol GmbH, Ravensburg,

Germany).

Eight horses were euthanized for reasons unrelated to the present study. They were

euthanized between d 1 and 28 post surgery. The mean observation period was 9 d

in these horses. In the horses observed for 3 months or longer (n = 4), hair had

regrown and scars were difficult to detect. Cosmetic results at d 90 were judged to be

excellent.

5.4.4 Histological analysis

In the periphery of the blister, the mucosa retained its physiological tissue structure

(Fig. 5.8 - B). The epithelial layer consistently appeared continuous, both

macroscopically and microscopically in all sections. The subepithelial connective

tissue contained numerous intact blood vessels, with moderate infiltration of

neutrophilic granulocytes and occasional macrophages at the periphery of the blister.

Approaching the latter, the subepithelial layers diverged and enclosed the blister,

which contained coagulated blood (Fig. 5.8 - C). The MD probe was lost during

sectioning, but a clearly definable, circular area within the coagulated material

indicated its previous position (Fig. 5.8 - D). This area was mainly infiltrated with

neutrophilic granulocytes and fewer macrophages. Sections of the ventral and lateral

walls of the FS contained intact mucosa. In summary, there was a moderate, focal,

purulent to histiocytic, acute inflammation indicating a resorptive inflammatory

process restricted to the direct vicinity of the blister.

Sections of the bony margin of the bore hole revealed a regular, non-ragged cutting

edge. Starting approximately 50 µm from the edge, there was intact bone. Adjacent

to the cutting edge, rebuilding was apparent (newly formed osteoid).

72 Manuscript I

5.5 Discussion The present study describes the implantation of a MD probe into the FS of adult

horses and its subsequent use. This procedure enables in vivo MD to be humanely

conducted in the absence of anti-inflammatory products and with minimal restraint.

The MD probe was implanted in standing, sedated horses. Horses tolerated the

procedure well and there was easy anatomical orientation and a comfortable working

height. Similar observations were previously reported in the context of surgical

exploration of the paranasal sinus in standing, sedated horses (LANE 1993a;

RUGGLES et al. 1993; SCHUMACHER et al. 2000; QUINN et al. 2005). The site

selected for the sinoscopy portal was that recommended for trephination of the CMS

(RUGGLES et al. 1991; BERTONE et al. 1993). This approach facilitated admission

of the endoscope into the FS and subsequent visualization of the probe implantation

procedure. The site of probe placement was chosen based on the presence and

extent of bony lamellae within the FS. Creation of the CMS and MD portals caused

only mild hemorrhage, which might be due to conducting the surgery in standing

versus recumbent horses (SCHUMACHER et al. 2000; QUINN et al. 2005). The

drilling system worked well, enabling variations in speed and applied pressure.

Although only the bur, but not the Dremel®, could be rendered sterile, there were no

increased rates of incisional complications in comparison to other reports (GREET

1992; HART u. SULLINS 2011).

The limiting factor for probe implantation was successful creation of a fluid-filled

blister within the subepithelial layers of the sinus mucosa. Establishment of the blister

was most successful when drilling and applying of PBS were alternated repetitively

over a prolonged interval, with only brief and cautious drilling. Blister development

was accentuated by flushing, but it was not possible to control the extent to which the

blister underlined the drilled hole, nor the direction in which it expanded.

Requirements for appropriate probe placement were a rostral expanding blister of

appropriate size (~ 20 to 30 mm) and a shallow insertion angle, achieved by beveling

the caudal portal edge. These precautions were essential for protection of the

delicate MD membrane and the mucous membrane. Complications during blister

Manuscript I 73

establishment were perforation of the mucous membrane during drilling or probe

placement, or rupture of the blister while applying PBS. If required, three holes could

be made within a single FS skin flap. However, to minimize fluid loss via the mucosa

perforation(s), additional holes should be placed at least 10 mm from previous

hole(s). Overall, there was an obvious learning process; successive procedures

resulted in greater ease in conducting the probe implantation process. Regardless, a

minimum interval of approximately 3 h was needed for the entire procedure of probe

implantation.

Microdialysis membranes were inherently fragile; despite careful handling, two

probes broke during in vitro preparations. In vivo application, including insertion along

the bony margin of the portal and final placement within the blister, was challenging.

Therefore, a non-functional probe was used for all test purposes. Furthermore,

excellent sedation was required while inserting the probe, as even minor movements

of the horse’s head could damage the probe, the mucous membrane, or both. When

the same probe model was implanted in the gluteal muscles of horses that were not

restrained after probe placement, most probes had been pulled out or damaged in

< 24 h, probably due to the horses rubbing stall walls (EDNER et al. 2009). In the

present study, the probe was implanted in an area with no or minimal muscular

activity. Once the probes have successfully been inserted, we were able to collect

dialysate for the complete anticipated period of time (28 to 52 h) in all horses.

However, minor problems with variable dialysate levels occurred in one horse (3),

probably associated with headshaking. Another possible reason for variable dialysate

volume might be an increased resistance within the tubing system, caused by the

elevated position of the sampling vial compared to the sampling site. Long tubes

(> 1.5 m) and positioning of the MD-pump above the probe (> 30 cm) may provide an

increase of resistance to flow and hydrostatic pressure, respectively, and therefore

reduce flow rates (CHOU et al. 2001). In the present study, the inlet and outlet tubes

were only 600 and 200 mm long, respectively, and the vertical displacement of the

pump relative to the probe (~ 20 cm) did not affect dialysate volume in preliminary in

vitro studies (data not shown). Nonetheless, the membrane length (10 mm) facilitated

appropriate positioning of the delicate probe part within the blister. Length and

74 Manuscript I

flexibility of the inlet and outlet tubes allowed the vial holder and MD pump to be

stored in a secure and readily accessible location.

The MD probe was located within the subepithelial layers, but it was not surrounded

by naturally occurring interstitial fluid or other body fluids as usually applied in in vivo

MD (DE LANGE et al. 2000). However, that the FS mucosa of horses is only 110 to

120 µm thick (JLLIG 1910) precluded direct placement of the MD probe in the

subepithelial layers without the means of blister establishment. Although the blister

was filled with PBS and coagulated blood, there was less blood in the direct vicinity

of the MD probe, presumably due to the frequent flow of perfusion solution.

In the present study, use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAID) was

omitted in order to avoid potential effects on the pharmacokinetic (PK) properties of

the substance of interest (SDM), as reported by EL-BANNA (1999). Nevertheless,

the horses’ behavior was normal, with minor exceptions (headshaking, rubbing).

Some horses rejected being touched at their heads during parts of the sampling

period, and changing of the vials had to be performed by two persons. Selection of

docile, well-mannered horses, accustomed to handling, is recommended.

Microdialysis is a semi-invasive technique with minimal impact on tissues

(BRUNNER u. LANGER 2006). Tissue trauma is usually caused by probe

implantation, rather than by the probe itself (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u.

KLOFT 2005). In the present study, the frontal bone was perforated to provide

access to the interior of the FS. The bore hole (diameter: ~ 3 mm) was relatively

small compared to similar procedures, e. g. frontonasal flaps (FREEMAN et al. 1990;

SCHUMACHER et al. 2000). Based on histological evaluation, the bone was healthy

and functional. Moreover, probe implantation caused minor damage to the mucous

membrane, including separation of the subepithelial layers and rupture of arterioles

and venules (the subepithelial layers are well vascularized; TREMAINE et al. 1999);

the concomitant minor hemorrhage was limited by coagulation. However, the blister

was embedded within the subepithelial layers with an intact blood supply and

covered by a continuous epithelial layer. Infiltration of neutrophils and histiocyts was

consistent with focal resorptive inflammation (5 d after surgery). In general, complete

Manuscript I 75

healing of the sinus mucosa is possible; however, it depends on the severity of the

damage (NEGUS 1958). Only an excessive damage would result in formation of

fibrous scar tissue with non-ciliated epithelial lining and, therewith, loss of ability for

mucociliary clearance (TREMAINE u. DIXON 2001b). However, in the present study

the blister was consistently covered with an intact epithelial layer and suchlike

consequences were not to be expected.

Complications associated with the surgical procedure were rare and included mild

reactions of the mandibular lymph nodes and mild to moderate local subcutaneous

emphysema originating from the CMS portal. Such complications have been

described following similar surgical interventions and can be regarded as inoffensive

(RUGGLES et al. 1991; BERTONE et al. 1993; CHAN u. MUNROE 1995). Post

surgical nasal discharge, seen in five horses, presumably consisted of a mixture of

blood and rinsing fluid from the sinoscopy; it resolved without treatment within 1 to

4 d. Incidence of incisional complications in the present study (16.7 %) was lower

than commonly reported for surgical exploration of the paranasal cavities of horses

(39 %, GREET 1992; 29 %, HART u. SULLINS 2011). This might be due to

enrollment of horses without disease of the paranasal cavities, application of

trimethoprim-SDM at a therapeutic dosage (30 mg/kg, IV), and early euthanasia

(≤ d 5) of three horses. Nevertheless, in horses with long-term follow-up (n = 4), all

incisions healed by first intention and cosmetic outcomes were excellent.

5.6 Conclusion The present study describes the development and evaluation of a novel method for

implanting a MD probe into the FS of healthy horses. Both surgical implantation and

the subsequent in vivo trial were well tolerated, with minimal complications, and

excellent long-term cosmetic recovery. Therefore, we conclude that this method is

suitable for in vivo MD in adult horses using minimal restraint. Moreover, this

approach facilitates continuous monitoring of substances of interest within the

paranasal mucosal lining without usage of NSAIDs, which may alter PK properties of

the substances of interest.

76 Manuscript I

5.7 Tables and Figures

Fig. 5.1: Applied MD system, consisting of MD pump (a), MD syringe (b), MD probe (inlet tubing [c], probe shaft [d] with membrane area [e], outlet tubing [f], and vial holder [g]), and microvial (h).

Fig. 5.2: Portal locations. Sinoscopy portal at CMS (●); MD portal at FS (▲).

a

b

c

d e

f

g

h

Manuscript I 77

Fig. 5.3: 4 x 8 mm oval bur used for drilling the portals (both, sinoscopy and MD).

Fig. 5.4: Sinoscopic images of the frontal sinus during probe implantation (view onto sinus mucosa and lamina externa of the frontal bone from ventrally). (A) Bur hole (arrow) visible under intact paranasal mucosa. Small blister filled with externally applied PBS and mild hemorrhage, both dissipate evenly within the blister; (B) Blister increasing in size by administration of PBS, and covering the bur hole (circle); (C) Blister at its final size, MD probe (arrow) at its final position.

Fig. 5.5: Fixation of MD system. MD probe shaft (a) is affixed to the forehead, the vial holder (b) to the forelock (bottom-side up).

A B C

a

b

78 Manuscript I

Fig. 5.6: Fixation of MD system. (A) MD pump placed inside metal box, and bag; (B) Bag positioned at the poll and taped to halter.

Fig. 5.7: Sinoscopic images of the frontal sinus showing typical complications during blister establishment and probe implantation (view onto sinus mucosa and external lamina of the frontal bone from ventrally). (A) Perforation of mucosa during drilling (a), necessitating a second hole (b; Horse 4); (B) Distance between rostral blister edge (top left corner) and bur hole (circle) not leaving enough space to allow correct probe-positioning within the blister. Further administration of PBS did not lead to blister expansion in a rostral, but a caudal direction (arrow; Horse 8); (C) Perforation of mucosa by MD probe (arrow). Perforation was caused by an unexpected movement of the horse’s head during probe insertion.

A B

A B

b aAnderes Bild !!

B C

Manuscript I 79

Fig. 5.8: Histological examination of frontal sinus mucosa (5 d after probe implantation; Horse 12; stain: toluidine blue). (A) Blister and MD probe at its final position, sectional planes for B, C, and D; (B) Intact paranasal mucosa (consisting of Lamina epithelialis [a] and subepithelial layers [b]) and underlying bone (c) (bar = 100 µm); (C) Diverging subepithelial layers enclose the coagulated blister material (d) (bar = 100 µm); (D) Circular area (e) indicates the former position of the MD probe inside the coagulated material. The probe itself is not suitable to be visualized in histological, paraffin embedded sections (bar = 1 mm).

80 Manuscript I

Ou

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Manuscript II 81

6 Manuscript II

Detection of intravenously administered sulfadimidine in the paranasal mucous

membrane of horses: A microdialysis study.

6.1 Abstract Concentrations of sulfadimidine (SDM) were determined in the paranasal mucous

membrane of healthy horses by means of continuous in vivo microdialysis (MD).

Concentric MD probes were implanted into the frontal sinus mucosa of healthy

horses (n = 10). Probes were placed within a surgically created fluid-filled blister

(phosphate buffered solution) located within the subepithelial layers of the mucosa.

Following administration of trimethoprim-SDM (30 mg/kg, IV, q 24 h), dialysate and

plasma samples were collected continuously for 48 h. Both plasma and dialysate

samples were analyzed for concentrations of SDM by high-performance liquid

chromatography. Concentrations of SDM in the paranasal mucosa were estimated

from recovery rates of SDM accomplished prior to the study. Furthermore,

sulfadiazine (SDZ) was applied as an internal standard for in vivo MD in order to

monitor potential changes of recovery over time. Average peak concentrations of

SDM were 55.3 ± 10.3 and 51.5 ± 8.7 µg/mL for plasma, and 9.6 ± 4.5 and

7.0 ± 3.3 µg/mL for the paranasal mucosa (t0-24 and t24-48, respectively). SDM peak

concentrations in the paranasal mucosa were reached at 5.9 ± 2.7 and 5.4 ± 2.3 h

following the first and second treatment, respectively. The average SDM

concentration in the mucosa remained above the breakpoint of susceptibility

(0.25/4.75 µg/mL for trimethoprim/sulfonamid-combinations) for 12 h. Relative loss of

SDZ indicated an average reduction of 24 % for recovery rates during the

experimental period of 48 h.

In conclusion, this study demonstrates the feasibility of in vivo MD for continuous

monitoring of SDM concentrations within the paranasal mucosal lining of adult

horses. Furthermore, these results indicate that the combination of TMP and SDM

(25 mg/kg SDM, 5 mg/kg TMP, IV) is likely to be efficient for treating equine sinusitis

82 Manuscript II

caused by highly susceptible pathogens providing an adaption of the dosage interval

to q 12 h.

Keywords: equine, microdialysis, pharmacokinetic, trimethoprim-sulfonamide,

paranasal sinus mucosa

6.2 Introduction Sinusitis is the most frequent disorder of the paranasal sinuses in horses (NICKELS

2006). It may be caused by infections of the upper respiratory tract (primary sinusitis)

or by dental disease, facial trauma, sinus cysts, progressive ethmoid hematoma,

sinonasal mycosis, or neoplasia (secondary sinusitis) (TREMAINE u. DIXON 2001a;

O'LEARY u. DIXON 2011). Clinical significance of equine sinonasal disorders derives

from their chronicity and the fact that they are usually difficult to treat (TREMAINE et

al. 1999; TREMAINE u. DIXON 2001a). Anti-infective drugs are frequently used in

treatment of equine sinusitis, although poor response to antimicrobial therapy has

been reported repeatedly (MASON 1975; BOULTON 1985; TROTTER 1993;

TREMAINE u. DIXON 2001b). It was suggested that failure of anti-infective treatment

is caused by accumulation of inspissated pus within individual sinus compartments

(primary sinusitis) as well as by persistence of underlying conditions in secondary

sinusitis (SCHUMACHER et al. 1987; TREMAINE u. DIXON 2001b; DIXON et al.

2011). However, as treatment failure of anti-infective agents in general might occur

due to subinhibitory concentrations within the infected tissue (MÜLLER et al. 2004;

STEINER et al. 2004), this aspect should be taken into account for equine sinusitis

as well.

Trimethoprim-sulfonamide (TMS) combinations are frequently used in equine

medicine and are furthermore considered to be appropriate for treatment of infections

of the equine respiratory tract (PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008).

Thus far, trimethoprim (TMP) and sulfonamide concentrations have been detected in

various body fluids and tissues of horses including blood, urine, synovia,

endometrium, and cerebrospinal and peritoneal fluid (BROWN et al. 1983; BROWN

et al. 1988), bronchial epithelial lining fluid (WINTHER et al. 2011), and

Manuscript II 83

subcutaneous tissue chamber fluid (VAN DUIJKEREN et al. 2002; ENSINK et al.

2005). However, there is apparently no data available on drug concentrations of

either TMP or sulfonamides within the paranasal sinuses of horses. However, it is not

appropriate to extrapolate drug concentrations from the plasma compartment or a

different peripheral tissue, as concentrations of anti-infective agents can vary

considerably between different tissues (MÜLLER et al. 2004). Moreover, the clinical

outcome of an anti-infective treatment closely correlates with achievement and

duration of effective drug concentrations at the infection site (MCKENZIE 2009),

which is the interstitial fluid (ISF) in most bacterial infections (RYAN 1993).

Therefore, drug concentrations of anti-infective agents should be obtained not only

from the tissue in question but also directly from the ISF of the respective tissue

(JOUKHADAR et al. 2001; MÜLLER et al. 2004).

Microdialysis (MD) is considered to be a suitable technique for continuous monitoring

of endo- and exogenous compounds in body fluids and in the ISF of tissues in human

beings and animals (UNGERSTEDT 1991; MÜLLER et al. 1996; JOUKHADAR et al.

2001; BRUNNER et al. 2005); however, it has apparently not been used in the

paranasal sinuses of any species. Several reports have addressed the principles of

MD (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u. KLOFT 2005; CHAURASIA et al. 2007).

Briefly, the tip of a MD probe (containing a semipermeable membrane) is introduced

into a tissue or body fluid. The probe is perfused with a perfusion solution and an

exchange of substances from the perfusion solution into the periprobe fluid and vice

versa takes place. The bidirectional mass transport across the membrane pores is

driven by a concentration gradient. Analysis of the resulting sample (= dialysate)

indicates gain or loss of substances from or to the perfusion solution. The term

recovery has been applied to describe the relation of substances in the periprobe

fluid and the dialysate (DE LANGE et al. 2000).

The objective of the present study was to develop and evaluate a technique that

allows continuous monitoring of anti-infective drug concentrations within the

paranasal mucous membrane of unsedated horses. A specific goal of the present

study was to determine concentrations of sulfadimidine (SDM) in the paranasal

84 Manuscript II

mucosa of horses. We hypothesized that in vivo MD was a suitable technique to

detect concentrations of SDM within the paranasal mucosal lining of horses following

IV drug administration.

6.3 Materials and Methods

6.3.1 Horses

Adult, university-owned horses (n = 10) of various breeds, nine mares and one

stallion, were used. Horses weighed from 410 to 675 kg (mean 558.2 kg) and were

from 5 to 23 y of age (mean 13.5 y). All horses were considered healthy based on a

general physical examination, routine hematology, and blood chemistry. None of the

horses had a history or clinical signs of paranasal sinus disease. Lateral and

dorsoventral radiographs (done prior to the study) of the paranasal sinuses revealed

no abnormalities. The horses had not received any medical treatment for at least

3 wk before enrollment. Horses were housed in individual stalls, fed hay and mixed

feed twice daily, and had ad libitum access to water.

All procedures were performed under a protocol approved by the Ethical Committee

of the Lower Saxony State Office for Consumer Protection and Food Safety

(No. 33.9-42502-04-10/0227). The trials were carried out at the Clinic for Horses of

the University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Germany.

6.3.2 Microdialysis equipment and probe implantation

Highly flexible, concentric MD probes (CMA 70 Brain Microdialysis Catheter; CMA

Microdialysis AB, Solna, Sweden) were utilized in the current study. Prior to in vivo

installation, every probe was tested under in vitro conditions to verify probe integrity

and performance parameters (data not presented). After testing, probes were stored

in aqua bidestillata. Before in vivo application, probes were flushed with sterile-

filtered phosphate buffered solution (PBS, pH 7.4) and kept in PBS until immediately

prior to implantation.

Manuscript II 85

Horses received a 12-gauge indwelling intravenous catheter (EquiCathTM Fastflow;

B. Braun Vet Care GmbH, Tuttlingen, Germany) that was placed in one of the jugular

veins using aseptic technique. The technique of probe implantation into the mucosal

lining of the frontal sinus in standing, sedated horses has been described before

(Ch. 5). Briefly, access to the mucosa of the frontal sinus was achieved by drilling an

opening (diameter: 1 - 2 mm) into the frontal bone. Subsequently, a fluid-filled blister

(sterile-filtered PBS, diameter: 20 - 30 mm) was created within the subepithelial

layers of the underlying sinus mucosa. The tip of a MD probe (including the

semipermeable membrane, length: 10 mm, outer diameter: 0.6 mm) was placed in

the blister and the complete MD system was affixed to the horse: the outlet tube

(220 mm, 1 mm) with the vial holder was taped to the horses forelock, whereas the

inlet tube (600 mm, 1 mm) was connected to a CMA 106 Syringe (CMA Microdialysis

AB). The latter was placed in a battery-powered CMA 107 Microdialysis Pump (CMA

Microdialysis AB) which in turn was secured in a light-weighted metal box taped to

the horse’s halter (poll).

6.3.3 Reagents

SDM sodium salt and SDZ sodium salt were provided by Sigma-Aldrich (Steinheim,

Germany). Perchloric acid, potassium carbonate, and sodium chloride were

purchased from Merck (Darmstadt, Germany).

6.3.4 In vivo experiment

Prior to each in vivo experiment, the respective MD probe was subjected to an in vivo

calibration that was subdivided into three successive phases as described by BOUW

and HAMMARLUND-UDENAES (1998). Firstly, the probe was perfused with PBS in

order to obtain a blank sample (duration: 90 min, flow rate: 2 µL/min). Secondly, the

probe was perfused with PBS containing each 1 µg/mL of SDM (substance of

interest) and sulfadiazine (SDZ; internal standard; 90 min, 2 µL/min); this period is

referred to as reference period. Thirdly, a washout period of 60 min was allowed to

ensure removal of SDM from the MD probe and the periprobe fluid. During the

86 Manuscript II

washout period and the following experimental period, the probe was continuously

perfused with PBS containing 1 µg/mL SDZ at a flow rate of 2 µL/min.

Horses were administered a TMP-SDM formulation (30 mg/kg, IV, Bigram®; CP-

Pharma, Burgdorf, Germany) twice: administration of the first dosage at t0 determined

the start of the 48 h experimental period, the second dosage was administered after

24 h (t24). During the experimental period dialysate fractions (180 µL) were collected

in 90 min intervals. The volume of each dialysate fraction was measured and the

maximum available aliquot was transferred from the microvial to a glass vial and

diluted to 290 µL (PBS). Samples were then frozen and kept at − 20 °C until analysis.

Blood samples were collected prior to each drug administration (t0 and t24) and at

predetermined intervals after each drug administration (0.5, 1, 1.5, 3, 6, 12, 18, and

24 h). Prior to blood sample collection aliquots of 10 mL blood were collected from

the jugular vein catheter and discarded. After that, whole blood samples (10 mL)

were collected into EDTA-vacutainer tubes (Vacuette®; Greiner Bio-One,

Kremsmünster, Austria). Immediately after sample collection, the catheter was

flushed with 10 mL of heparinized saline. The blood samples were centrifuged at

3 000 rpm for 6 min; plasma was then transferred to plastic tubes and frozen at

− 20 °C until analysis.

6.3.5 Drug analysis

The thawed dialysate fractions were directly subjected to high-performance liquid

chromatography (HPLC), whereas the plasma samples were subjected to an

extraction procedure prior to drug analysis (adapted from NOUWS et al. 1985). An

aliquot of 500 µL plasma was transferred to an extraction tube and spiked with the

internal standard SDZ (10 µg/mL). To all samples 1000 µL of 0.66 mol/L perchloric

acid was added. After mixing for 10 s, 12 µL of saturated K2CO3 solution and 10 µL

of 4 % NaCl solution were added. The tubes were placed inside a vibrating shaker for

30 min. Subsequently, samples were centrifuged at 15 000 rpm for 10 min. An aliquot

of 300 µL of the resulting supernatant was transferred into a HPLC glass vial,

whereas the residue was dissolved in 1000 µL perchloric acid and processed

following the described scheme for a second time. HPLC samples were stored at

Manuscript II 87

− 20 °C until analysis. Following HPLC performance, results for the two extraction

stages were added.

All test compounds were quantified with the following HPLC system by using the

external standard method: 126 Solvent Module Pump, 507 Autosampler, 168

Detector, and Software 24 Karat 5.0 (Beckmann, Munich, Germany). The

LichroCART 25-4 column (C18, 5 µm) and a LichroCART 4-A guard column (5 µm,

both Merck, Darmstadt, Germany) were placed in a column heater at 40 °C (Spark

Holland, Emmen, Netherlands). The eluent consisted of 15 % methanol (HPLC

grade) and 85 % McIlvaine citrate buffer (pH 2.2; 20.8 g citric acid and 0.4 g

Na2HPO4 x H2O in 1 L purified water). Aliquots of 100 µL were injected and analyzed

at 254 nm with a flow rate of 1.0 mL/min. The limit of detection was 0.07 µg/mL for

SDM and 0.08 µg/mL for SDZ. The limit of quantification was 0.14 µg/mL for SDM

and 0.15 µg/mL for SDZ. The average recovery of SDZ from plasma samples was

74.1 ± 11.9 % (mean ± SD).

6.3.6 Calculation of recovery values and paranasal mucosa concentrations

Recovery rates of SDM and SDZ were assessed according to the retrodialysis

method (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998). Thus, relative loss (RL) from

the perfusion solution to the periprobe fluid was determined for the reference period

(SDM and SDZ) and the experimental period (SDZ) according to:

Cperfusate was the concentration of either SDM or SDZ in the perfusion solution and

Cdialysate was the concentration of either SDM or SDZ in the dialysate.

The relative loss of SDZ (RLSDZ) during the experimental period was calculated in

order to evaluate potential alterations of recovery rates for the remainder of the

experiment (retrodialysis by calibrator). The relative loss of SDM (RLSDM) during the

reference period was used to estimate the unbound SDM concentrations in the

periprobe fluid during the experimental period (retrodialysis by drug). In the present

88 Manuscript II

study, the periprobe fluid was the content of the paranasal sinus blister within the

subepithelial layers of the mucosa and is hereafter referred to as the paranasal

mucosa. In order to determine the unbound SDM concentration within the paranasal

mucosa (CSDM, mucosa), the analyzed SDM concentration of each dialysate fraction

(CSDM, dialysate) during the experimental period was related to the determined relative

loss of SDM during the reference period (RLSDM, Ref.):

The estimated mucosa concentrations reflected the temporal average over the

sampling interval of 90 min.

6.3.7 Data analysis

Pharmacokinetic (PK) parameters of SDM in plasma and paranasal mucosa were

determined for each horse by noncompartmental analysis (WinNonlin Professional

Edition Version 5.3; Pharsight, Mountain View, CA, USA). The calculated values

included maximum concentration (Cmax), time of maximum concentration (tmax), drug

concentration at the last observation of the respective dosing interval (Clast),

elimination half-life (t1/2), elimination rate constant (λz), area under the curve (AUC),

area under the first moment curve (AUMC), mean residence time (MRT), volume of

distribution at steady state (Vss), volume of distribution based on the terminal phase

(Vz), and total plasma clearence (Cl). Data are reported as mean ± SD.

6.4 Results Plasma samples contained SDM peak concentrations of 55.3 ± 10.3 and

51.5 ± 8.7 µg/mL following the first (t0) and second (t24) treatment, respectively

(Fig. 6.1). Average PK parameters for plasma concentrations are presented in

Tab. 6.1.

The average volume of the dialysate fractions available for analytical purposes was

122.7 ± 26.8 µL (mean ± SD) per sample. In Horse 1, the volume of most dialysate

Manuscript II 89

fractions was reduced, most probably due to loss of dialysate through the overflow

valves of the microvials when this horse was headshaking.

Results for RLSDM during the reference period were available for 8/10 horses and

averaged 45.9 ± 8.8 % (Tab. 6.2); reference samples of Horses 1 and 6 were not

evaluable due to analytical difficulties. Unbound SDM concentrations in the paranasal

sinus mucosa were estimated from the determined dialysate concentrations during

the experiment in relation to RLSDM from the reference period. In Horses 1 and 6 the

mean of RLSDM of the other eight horses was applied. Corrected dialysate fractions,

representing temporally averaged estimates of the mucosa concentration for the

respective sample interval, contained mean peak concentrations of 9.6 ± 4.5 and

7.0 ± 3.3 µg/mL following the first (t0) and second (t24) treatment, respectively

(Fig. 6.2). However, substantial differences were evident in the mucosa concentration

of individual horses (Fig. 6.3), exemplified by peak concentrations ranging from 2.7 to

15.3 µg/mL. Average PK parameters for the mucosa concentrations are presented in

Tab. 6.1.

Results for RLSDZ during both the reference and experimental periods were

calculated according to the equation RL = (Cperfusate - Cdialysate)/Cperfusate. In Horse 1,

SDZ was not quantifiable in most dialysate fractions; in Horses 2 and 5, calculations

of RLSDZ revealed no loss, but gain of SDZ in reference samples as well as only

minimal loss or gain of SDZ in most of the dialysate fractions during the experimental

period (Tab. 6.2). As these difficulties were probably due to analytical issues, values

of Horses 1, 2, and 5 were not included into the following calculations. Thus, the

average RLSDZ of 7/10 horses was 40.0 ± 17.7 % during the reference period and

22.0 ± 11.9 % during the experimental period. In all horses, considerable variations in

RLSDZ (experimental period) were evident, as well as a mild negative tendency of

relative loss over the experimental duration of 48 h (Fig. 6.4).

90 Manuscript II

6.5 Discussion Apparently, this is the first study to describe the application of the MD technique in

the paranasal sinus mucosa of horses. Furthermore, concentrations of intravenously

administered SDM could be detected within the paranasal mucosal lining in horses

by the means of continuous in vivo MD.

Potentiated sulfonamides are frequently used in equine medicine in general and they

are furthermore considered to be appropriate for treatment of infections of the equine

respiratory tract (PRESCOTT 2006; HAGGETT u. WILSON 2008). Unlike TMP which

exhibits a short half-life and low tissue concentration in horses (VAN DUIJKEREN et

al. 1994b) and thus requires considerable analytical effort due to expected low TMP

concentrations in dialysate, SDM could be detected without significant problems by

HPLC.

MD is considered to be a semi-invasive technique with minimal impact on the

affected tissue (BRUNNER u. LANGER 2006). Tissue trauma is usually caused by

probe implantation, rather than by the probe itself (DE LANGE et al. 2000; PLOCK u.

KLOFT 2005). In the present study, probe implantation required surgical access to

the frontal sinus mucosa. The fact that the mucosa of the equine frontal sinus only

measures 110 to 120 µm in thickness (JLLIG 1910) precluded direct probe

placement (outer diameter of membrane area: 0.6 mm) in the subepithelial layers of

the paranasal mucosa and creation of a fluid-filled blister was required.

Consequently, the MD probe was not surrounded by naturally occurring ISF or other

body fluids as usually applied in in vivo MD (DE LANGE et al. 2000). The estimated

drug concentration within the paranasal sinus blister may therefore vary from

effective concentrations in unaffected ISF due to several reasons. Firstly, blister

creation might cause dilution to the drug concentration within the blister. As the

definite blister size could neither be measured nor influenced during blister creation,

the factor of dilution was unknown and may vary between individual horses due to

variations in blister size. Secondly, blister creation provided an altered ratio of the

capillary surface area to the volume of the tissue and may therefore influence the

drug delivery into the paranasal mucosa (RYAN 1985). Thirdly, separation of the well

Manuscript II 91

vascularized subepithelial layers of the paranasal mucosa (TREMAINE et al. 1999)

led to rupture of arterioles and venules and subsequent minor hemorrhage within the

blister. Although hemorrhage was apparently limited by coagulation, it cannot be

excluded that drug delivery to the paranasal mucosa was altered by microbleeding

and temporary alterations in capillary permeability. Furthermore, it is possible that

drug levels within the mucosa were diminished due to the fact that sulfadimidine

(weak acid) might not enter an area of reduced pH (inflammatory response) in the

same extent as it would passage into unaffected ISF.

As shown in Fig. 6.1, concentrations of SDM could be detected both in plasma and in

dialysate fractions following IV injection of TMS. The obtained plasma levels and PK

parameters of SDM in plasma are in accordance with previous reports on

sulfonamides in horses (VAN DUIJKEREN et al. 1994a; VAN DUIJKEREN et al.

1995; WINTHER et al. 2011). The average SDM peak concentration in the paranasal

sinus mucosa, estimated from the dialysate fractions, ranged around 8 µg/mL. The

concentration-time profile of SDM concentrations in the paranasal mucosa and in

plasma revealed a delay of approximately 5 h in achievement of tmax in the mucosa

compared to tmax in plasma. Furthermore, average drug concentrations within the

mucosa only achieved 17.4 % and 13.6 % of the peak concentration in plasma (t0-24

and t24-48, respectively). Both a prolonged half-life and MRT in the paranasal mucosa

compared to plasma indicated a temporary accumulation of SDM within the mucosa.

Despite a gradual decrease of SDM concentrations in plasma and in the mucosa

over 24 h, there were average concentrations of ~ 5 µg/mL in plasma and ~ 2 µg/mL

in the mucosa during the last sampling intervals.

SDM concentrations in the paranasal mucosa of individual horses exhibited

considerable interindividual differences. Assessing these differences, it is important

not only to take into account biological reasons, but also potential sources of error

due to technical issues (see below). However, similar variations have been reported

by VAN DUIJKEREN et al. (2002) and ENSINK et al. (2005) who investigated the

distribution of SDZ and TMP into noninfected or infected subcutaneous tissue

chamber fluid of ponies. These authors reported SDZ concentrations of

92 Manuscript II

approximately 20 µg/mL in the tissue chamber fluid following IV or oral SDZ

administration (25 mg/mL). Further authors investigated concentrations of

sulfonamides within various tissues and body fluids including synovia, peritoneal

fluid, pulmonary epithelial lining fluid, and endometrium. Following administration of

dosage regimens comparable to the present study, peak concentrations ranging from

5 to 25 µg/mL depending on the tissue or body fluid were received (BROWN et al.

1983; BERTONE et al. 1988; BROWN et al. 1988; WINTHER et al. 2011). Those

reports confirm the plausibility of the mucosa concentrations estimated by the means

of in vivo MD. However, it is important to keep in mind that the presented study

investigated drug concentrations within the paranasal mucosal lining of healthy

horses in order to evaluate the feasibility of in vivo MD within the paranasal sinus of

horses. Drug distribution patterns for diseased horses might differ from the presented

results (EKEDAHL et al. 1978; RYAN 1993). Nevertheless, this study underscores

the fact that relying on plasma concentrations alone results in an overestimation of

the drug concentrations achieved within the paranasal mucosa and therefore in an

overestimation of the efficacy of the presented SDM treatment in terms of sinusitis

therapy.

The estimated mucosa concentrations were evaluated relative to minimum inhibitory

concentrations (MIC) of potentiated sulfonamides (Fig. 6.3). A MIC of

≤ 0.25/4.75 µg/mL was recommended as a guideline for susceptibility for organisms

of equine origin for TMP/SDZ (BERTONE et al. 1988). The same MIC was given for

bacterial isolates from equine lower airway infections (Strept. equi ssp.

zooepidemicus, Staph. aureus) for TMP/sulfamethoxazole in a 1:19 ratio (WINTHER

et al. 2011). The average mucosal SDM concentration exceeded this MIC for

approximately 12 h. However, in view of the large variations of Cmax between

individual horses, SDM concentrations only exceeded the contemplated MIC for 12 h

in the paranasal mucosa in 5/10 horses. Other authors recommended a higher MIC

(≤ 0.5/9.5 µg/mL) for equine bacterial isolates for TMP/SDZ (ADAMSON et al. 1985)

and TMP/sulfamethoxazole (HIRSH u. JANG 1987) combinations; in the present

study, mean peak concentrations of SDM would have exceeded this MIC only

temporarily in 5/10 horses. Even higher MIC breakpoints as given by ENSINK et al.

Manuscript II 93

(1993; 1/20 µg/mL) and by FEY and SCHMID (1995; 0.5/32 µg/mL) would have not

been attained at all. Based on average SDM concentrations within the paranasal

mucosa and providing effective TMP concentrations, we conclude that the IV

treatment of 25 mg/kg SDM in combination with 5 mg/kg TMP is likely to be efficient

for treating equine sinusitis caused by highly susceptible pathogens. However, the

dosing interval should be adapted to 12 h to ensure long-lasting effective drug

concentrations; similar observations have been made by WINTHER et al. (2011) with

regard to infections of the equine lower respiratory tract. However, it is important to

keep in mind the considerable variations in drug levels between individual horses,

demonstrating that effective drug concentrations cannot be taken as granted.

The major issue for accurate estimations of true tissue concentrations from

microdialysate samples is the reliability of the applied recovery method

(UNGERSTEDT 1991). In the present study, recovery rates of SDM were estimated

by the method of retrodialysis by drug (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998).

Recovery rates of SDM from the reference period were relatively constant in eight

horses (45.9 ± 8.8 %). Consequently, we were able to use the mean of RLSDM as a

measure of recovery in those two horses (1 and 6) in which we could not use the

actual recovery rate of the particular probe due to analytical issues. The substance of

interest itself is considered to be the ideal calibrator in MD experiments (BOUW u.

HAMMARLUND-UDENAES 1998). However, retrodialysis by drug needs to be

performed prior to the actual in vivo experiment and cannot take into account

changes of recovery rates over time. Therefore, additional application of an internal

standard is recommended in order to observe changes in the recovery rate during

the entire in vivo experiment (DE LANGE et al. 2000). In the current study, SDZ was

used as an internal standard as it appeared as a suitable internal standard in

preliminary in vitro experiments. However, some difficulties were encountered during

the in vivo application of SDZ. Firstly, calculations of RLSDZ revealed only minimal

loss or even gain of SDZ in dialysate fractions of Horses 2 and 5. While the reasons

for the reduced recovery rates are not entirely clear, we assumed bioanalytical

concerns due to working with low drug concentrations in all utilized solutions and

samples (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998). In the present study, this

94 Manuscript II

effect might have been increased by the need of diluting the dialysate samples for

HPLC analysis. Secondly, in vivo results of RLSDZ exhibited considerable fluctuations

in values obtained from the experimental period in single probes (SD up to 20.7 %);

however these fluctuations were not evident in the concentration-time profile of SDM.

Similar observations have been reported by BOUW and HAMMARLUND-UDENAES

(1998) who concluded that high coefficients of variation are associated with low

recovery rates. Thirdly, a negative regression slope (Fig. 6.4) indicated a reduction of

RLSDZ values during experimental period of 48 h. Considering the mean of the first

and the last five dialysate fractions of the experimental period (7/10 horses), RLSDZ

decreased by 24 %. Furthermore, considerable variations between RLSDZ from the

reference period (40 %) and the experimental period (22 %) were evident. One

possible reason for the reduction of recovery rates is a progressive occlusion of the

probe membrane pores (DE LANGE et al. 2000). Furthermore, it is possible that

microbleeding (caused by blister creation) was still present at the beginning of the in

vivo experiment and caused an initial increase of recovery rates. This circumstance

would also affect the recovery rates of SDM, meaning that the final SDM

concentrations would be approximately 24 % higher than estimated in above stated.

With regard to increased surgical interventions in the presented study and in order to

prevent alterations of recovery values and estimated drug concentrations, we

recommend to extend the lag time between blister creation and performance of the in

vivo experiment from 1 h to 12 - 24 h, which is in accordance with DE LANGE et al.

(2000) and CHAURASIA et al. (2007). In conclusion, several difficulties were

encountered during the in vivo application of SDZ as an internal standard.

Consequently, further application of RLSDZ, e. g. for estimations of mucosa drug

concentrations (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998), were omitted. In fact,

further studies are necessary to either prove the suitability of SDZ as an internal

standard for the presented study design under different conditions (e. g. higher

concentrations in the perfusion solution) or to find a more suitable substance for

continuous monitoring of recovery values.

Manuscript II 95

6.6 Conclusion The current study demonstrates the suitability of in vivo MD for continuous monitoring

of unbound drug concentrations within the paranasal sinus mucosa in horses for a

period of 48 h. Furthermore, this study provides the first data on concentrations of

SDM in the paranasal mucosa of healthy horses following intravenous drug

administration. Based on our results, we conclude that the combination of TMP and

SDM concentrations following IV treatment (25 mg/kg SDM, 5 mg/kg TMP, IV,

q 12 h) is likely to be efficient for treating equine sinusitis caused by highly

susceptible pathogens.

96 Manuscript II

6.7 Figures and Tables

0 6 12 18 24 30 36 42 480

20

40

60

80

Time (h)

Su

lfad

imid

ine (

µg

/mL

)

Fig. 6.1: Comparison of concentration-time profiles of plasma (squares) and paranasal mucosa (circles) SDM concentrations following IV administration of SDM (25 mg/kg) at t0 and t24 (arrows). Symbols depict the mean ± SD concentration of ten horses.

0 6 12 18 24 30 36 42 480

5

10

15

Time (h)

Su

lfad

imid

ine (

µg

/mL

)

Fig. 6.2: SDM concentrations in the paranasal sinus mucosa of ten horses (mean ± SD) following IV administration of SDM (25 mg/kg) at t0 and t24 (arrows).

Manuscript II 97

6 12 18 24 30 36 42 480

5

10

15

Time (h)

Su

lfad

imid

ine (

µg

/mL

)

Fig. 6.3: SDM concentrations of the paranasal sinus mucosa determined by in vivo MD for 48 h following IV administration of SDM (25 mg/kg) at t0 and t24 (arrows). Boxplots demonstrate variations of SDM concentrations within the paranasal mucosa of ten horses.

MIC breakpoints for susceptibility: 4.75 µg/mL (––) (BERTONE et al. 1988; WINTHER et al. 2011) and 9.5 µg/mL ( ) (ADAMSON et al. 1985; HIRSH u. JANG 1987).

0 6 12 18 24 30 36 42 481

10

100

Slope = -14.29 0.05

r2 = 0.18

Time (h)

RL

SD

Z(%

)

Fig. 6.4: Relative loss (RL) of the internal standard SDZ during in vivo MD study. Data represent the average RL of independent trials in seven horses. Values indicate fluctuations and a reduction of RLSDZ during the experimental period of 48 h.

98 Manuscript II

Tab. 6.1: Pharmacokinetics of SDM following IV administration of 25 mg/kg to ten horses.

t0 - t24 t24 - t48 t0 - t24 t24 - t48

Unity Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD

Cmax µg/mL 55.3 ± 10.5 51.5 ± 8.7 9.6 ± 4.5 7.0 ± 3.3

Clast µg/mL 5.0 ± 2.6 4.6 ± 2.3 1.9 ± 1.2 2.2 ± 1.3

tmax h - - 5.9 ± 2.7 5.4 ± 2.3

t1/2 h 7.7 ± 2.0 7.7 ± 1.5 8.4 ± 2.5 10.9 ± 4.4

λz 1/h 0.10 ± 0.03 0.09 ± 0.02 0.08 ± 0.04 0.07 ± 0.04

AUC µg/mL*h 373.2 ± 105.6 419.4 ± 101.5 110.7 ± 56.7 103.8 ± 51.2

AUMC h*h*µg/mL 2726.3 ± 1185.2 3163.0 ± 1022.0 1126.6 ± 701.7 1129.8 ± 613.6

MRT h 7.0 ± 1.4 7.4 ± 0.7 10.0 ± 1.7 10.8 ± 1.1

Cl mL/h/kg 63.6 ± 21.9 56.6 ± 17.7 217.9 ± 115.1 218.3 ± 137.6

Vss mL/kg 633.2 ± 160.3 567.3 ± 72.9 - -

Vz mL/kg 673.1 ± 178.7 602.2 ± 87.3 3387.9 ± 2649.8 3388.8 ± 1608.6

Plasma Blister

AUC: area under the curve, AUMC: area under the first moment curve, C last: drug concentration at

last observation, Cmax: maximum drug concentration, Cl: clearence, MRT: mean residence time,

tmax: time of maximum drug concentration, t1/2: elimination half-life, Vs: volume of distribution at

steady state, Vz: volume of distribution based on the terminal phase, λz: elimination rate constant

Tab. 6.2: Comparison of in vivo retrodialysis recoveries of SDM and SDZ for individual

horses (n = 10).

Experimental period

(dialysate fractions, n = 32)

Horse RLSDM RLSDZ RLSDZ

(%) (%) Mean ± SD (%)

1 - - -

2 44.9 - 2.1* - 14.9 ± 28.9*

3 47.3 23.7 14.2 ± 5.7

4 34.4 73.0 43.5 ± 20.7

5 35.9 - 6.9* 1.6 ± 9.7*

6 - 35.4 17.3 ± 12.8

7 45.7 18.3 9.6 ± 8.9

8 43.5 40.3 27.8 ± 7.9

9 54.0 44.2 17.6 ± 9.8

10 61.2 44.8 24.2 ± 17.6

Mean ± SD (%) 45.9 ± 8.8 40.0 ± 17.7 22.0 ± 11.9

Reference period

(dialysate fractions, n = 1)

* values not included into calculations of mean ± SD

Übergreifende Diskussion 99

7 Übergreifende Diskussion

7.1 Implantation des Mikrodialysekatheters

7.1.1 Methodisches Vorgehen

Die Methode zur Implantation eines MD-Katheters in die NNH von Pferden wurde an

isolierten Pferdeköpfen (n = 20) erarbeitet. Entsprechend der daraus resultierenden

Vorgehensweise wurde jeweils ein MD-Katheter in einen der beiden Sinus frontalis

von zwölf klinisch gesunden Pferden implantiert.

Das Einsetzen des Katheters erfolgte am stehenden, sedierten Pferd, so dass das

allgemeine Narkoserisiko und damit der deutlich erhöhte Zeitdruck im Vergleich zur

Durchführung des Eingriffs am allgemeinanästhesierten Pferd entfielen. Gleiches gilt

für das mit der Aufstehphase verbundene Verletzungsrisiko und die Gefahr des

Verrutschens oder der Beschädigung von MD-Katheter und/oder Equipment während

dieser Phase. Darüber hinaus ermöglichte die Arbeit am stehenden Pferd eine gute

anatomische Orientierung im Bereich der NNH und führte zu einer geringeren

Ausprägung von Blutungen beim Anbringen der Hautinzisionen als es beim

liegenden Pferd in Allgemeinanästhesie zu erwarten gewesen wäre (SCHUMACHER

et al. 2000; QUINN et al. 2005).

Die Anwendung der elektrischen Fräse ermöglichte durch das geringe Gewicht und

die Möglichkeit zur Regulierung der Drehgeschwindigkeit ein vorsichtiges Arbeiten.

Als Nachteil des verwendeten Systems ist die Tatsache zu werten, dass lediglich der

Fräskopf, nicht aber die gesamte Fräse sterilisiert werden konnten. Unter

Berücksichtigung der vergleichsweise niedrigen Inzidenz von Wundheilungs-

störungen in der vorliegenden Arbeit (16,7 %), schien dieser Umstand jedoch keine

erhöhte Infektionsgefahr nach sich zu ziehen (Kap. 7.4.1).

Der gesamte Vorgang der Katheterimplantation erfolgte unter endoskopischer

Kontrolle. Das Endoskopieportal im Bereich des Sinus maxillaris caudalis

ermöglichte den Zugang in den ipsilateralen Sinus frontalis. Die endoskopische

Visualisierung war essentiell für die Auswahl einer geeigneten


Katheterinsertionsstelle, welche in erster Linie von dem Vorhandensein und der

Ausdehnung knöcherner Lamellen innerhalb des Sinus frontalis abhängig war.

Weiterhin war die Sinuskopie wichtiger Bestandteil der Kontrolle sämtlicher

Arbeitsschritte während der Knochenperforation, der Blasenbildung und der

Katheterinsertion.

Das primäre Ziel der Katheterimplantation war es die Membran des MD-Katheters in

der Schleimhaut zu platzieren ohne letztere dabei zu perforieren. Die Relation von

Außendurchmesser der MD-Membran (600 µm) und Dicke der Schleimhaut (ca. 120

µm, JLLIG 1910) erforderte die Bildung einer flüssigkeitsgefüllten Blase in den

subepithelialen Schichten der Mukosa. Aufgrund der Empfindlichkeit der Schleimhaut

stellte die Blasenbildung stets den limitierenden Faktor für die erfolgreiche

Implantation des MD-Katheters dar. Neben einer grundsätzlich äußerst vorsichtigen

Vorgehensweise mit Fräse und Katheter konnte das Risiko der Schleimhaut-

perforation durch eine ausreichende Größe der Blase (Ausdehnung nach rostral

mindestens 1,5 cm) und einen flachen Insertionswinkel des Katheters (Anschrägen

des kaudalen Fräsrandes) minimiert werden.

Abschließend bleibt festzuhalten, dass sich über die Vorversuche an den isolierten

Pferdeköpfen hinaus ein Lernprozess einstellte, welcher sich vor allem auf die

gezieltere Auswahl einer geeigneten Katheterinsertionsstelle und auf die praktische

Durchführung von Knochenperforation und Katheterinsertion erstreckte. Die

durchschnittliche Dauer des gesamten Implantationsvorgangs konnte dennoch nicht

nennenswert verkürzt werden und blieb mit 295 ± 106 Min relativ lang.

7.1.2 Auswirkungen der Katheterimplantation auf Knochen und Schleimhaut

Die MD gilt als semiinvasive Technik, bei der ein Gewebetrauma weniger durch den

Katheter selbst als durch den Vorgang der Katheterimplantation auftritt (DE LANGE

et al. 2000; PLOCK u. KLOFT 2005; BRUNNER u. LANGER 2006). In der

vorliegenden Arbeit war für die Implantation des MD-Katheters in die

Stirnhöhlenschleimhaut ein Zugang in den Sinus frontalis und damit die Perforation


des Os frontale notwendig. Dieser Zugang erforderte einen erhöhten chirurgischen

Aufwand im Vergleich zu der Anwendung der MD in leichter zugänglichen

Weichgeweben (z. B. Haut, Muskulatur). Verglichen mit der Eröffnung der NNH im

Rahmen diagnostischer und therapeutischer Maßnahmen (z. B. Trepanation,

frontonasaler Flap) stellte das hier angebrachte Fräsloch jedoch einen

minimalinvasiven Eingriff dar. Eine histologische Untersuchung der knöchernen

Fräskanten (Tag 5 nach Katheterimplantation) ergab keine Hinweise auf eine

Schädigung des angrenzenden Knochens.

Die Katheterimplantation in die NHH-Schleimhaut erforderte aus methodischen

Gründen das Erstellen einer flüssigkeitsgefüllten Blase. Die Bildung dieser Blase

führte zu einem Auseinanderweichen der subepithelialen Schleimhautschichten und

damit zum Zerreißen feinster Blutgefäße in der reich vaskularisierten Mukosa

(TREMAINE et al. 1999) und schließlich zum Austritt von Blut in das Blaseninnere.

Trotz der Vermischung des Blutes mit dem extern zugeführten PBS, kam es zu einer

augenscheinlich schnellen Koagulation innerhalb der Blase.

Die histologische Untersuchung des Implantationsbereiches bestätigte die Lage der

Blase innerhalb der subepithelialen Schichten und deren Einbettung in ein

kapillarreiches Gewebe mit intakter Blutversorgung. Weiterhin war die Blase bei den

endoskopischen Nachkontrollen (2 - 4 Tage nach Katheterimplantation) bzw. bei der

histologischen Untersuchung (Tag 5 nach Katheterimplantation) sowohl makro- als

auch mikroskopisch von einer intakten Lamina epithelialis bedeckt, so dass eine

bakterielle Infektion des Implantationsbereiches unwahrscheinlich erscheint. Die

Infiltration des Blaseninhalts und der Blasenumgebung mit neutrophilen

Granulozyten und (vereinzelten) Makrophagen deutet auf eine fokale, resorptive

Entzündung hin. Grundsätzlich ist eine vollständige Heilung der NNH-Schleimhaut

möglich, allerdings ist sie maßgeblich vom Grad der Schädigung abhängig (NEGUS

1958). Lediglich eine massive Schädigung würde zur Ausbildung eines fibrösen

Narbengewebes ohne Zilien und damit zu einem Verlust der Fähigkeit zur

mukoziliären Clearence führen (TREMAINE u. DIXON 2001b). Eine solche

Schädigung ist hier aufgrund der intakten Lamina epithelialis nicht zu erwarten, und


selbst wenn ein Verlust der Zilien im Bereich der Blase auftreten würde, so hätte dies

aufgrund des vergleichsweise kleinen Bereich und der dorsalen Lage der Blase mit

hoher Wahrscheinlichkeit keinen bedeutenden Einfluss auf die Gesamtheit der

mukoziliären Clearence des Sinus frontalis bzw. des NNH-Systems. Eine

abschließende Aussage zum langfristigen Heilungsverlauf der Schleimhaut ist in der

vorliegenden Arbeit aufgrund der kurzen Beobachtungdauer nicht möglich.

7.1.3 Eignung des verwendeten Mikrodialysesystems für die Anwendung in der Nasennebenhöhle des Pferdes

Das verwendete MD-System, bestehend aus MD-Katheter, Mikroperfusionspumpe,

Perfusorspritzen und Probensammelgefäßen, war aufgrund seiner Dimensionen sehr

gut für die Anwendung am lebenden, unsedierten Pferd geeignet. Die MD-Membran

war mit einer Länge von 10 mm gut in der angebrachten Blase zu platzieren. Die

Befestigung des Katheterschafts auf der angrenzenden Haut sicherte die Lage der

Membran in der Blase. Die Flexibilität und Abmessung der zu- und abführenden

Schläuche erlaubten die Positionierung des Probensammelgefäßes am Schopf und

die Sicherung der Mikroperfusionspumpe im Genick des Pferdes. Damit konnten

diese Komponenten sicher am Pferd befestigt werden ohne dessen

Bewegungsfreiheit einzuschränken und waren gleichzeitig gut für den Wechsel der

Probengefäße und der Perfusionsspritzen zugänglich.

Die Membran des verwendeten Kathetermodells war überaus empfindlich. Bereits

unter In-vitro-Bedingungen wurden zwei der Katheter trotz vorsichtiger Handhabung

beschädigt. Das Einführen des Katheters entlang der Fräskanten stellte

dementsprechend eine besondere Herausforderung für die empfindliche

Kathetermembran dar und führte schließlich zur Beschädigung zwei weiterer

Katheter. Zur Minimierung des bestehenden Risikos unter In-vivo-Bedingungen

wurden sämtliche Parameter (Passieren des Fräsloches ohne Widerstand,

Einführtiefe, etc.) vor der Insertion des einzusetzenden Katheters mittels eines

Testkatheters überprüft. Weiterhin erwies sich die Befestigung des Katheterschaftes

auf der angrenzenden Haut mittels Gewebekleber als sehr hilfreich, um den Katheter

in seiner finalen Position zu fixieren. Die Möglichkeit zur Fixierung in diesem wenig


bemuskelten und daher wenig motilen Bereich ist vermutlich der Grund dafür, dass

im Rahmen dieser Arbeit keine Katheter im Verlauf des eigentlichen Versuches

beschädigt wurden. EDNER et al. (2009) hingegen berichteten von Ausfällen eines

Großteils der Katheter während der 24-stündigen Anwendung desselben

Kathetertyps in der Muskulatur von Pferden und vermuteten die Muskelaktivität der

sich frei bewegenden Pferde sowie das Scheuern der Tiere an Stallwänden als

mögliche Gründe.

7.2 Mikrodialyse

7.2.1 Kalibration des Mikrodialysesystems

Die Kalibration des MD-Systems stellt für In-vivo-MD-Experimente die Grundlage für

die quantitative Bestimmung von Wirkstoffkonzentrationen in der interstitiellen

Flüssigkeit dar. In der vorliegenden Arbeit wurde jeder einzelne MD-Katheter sowohl

unter In-vitro- als auch unter In-vivo-Bedingungen kalibriert. Die In-vitro-Kalibration

diente dabei vor allem der Funktionsüberprüfung der Katheter vor dem eigentlichen

In-vivo-Einsatz sowie der orientierenden Bestimmung der Wiederfindungsparameter

unter In-vitro-Bedingungen. Im Allgemeinen ist die Diffusionsrate in vivo geringer als

unter In-vitro-Bedingungen. Als Gründe dafür werden eine erhöhte Tortuosität

(Diffusionsweg im Gewebe) sowie ein geringer Volumenanteil der ISF des Gewebes

im Vergleich zu einer wässrigen Lösung angesehen (KOVAR et al. 1997).

Demzufolge wurden in der vorliegenden Arbeit ausschließlich die unter In-vivo-

Bedingungen ermittelten Wiederfindungsparameter von SDM für die quantitative

Bestimmung der Sulfonamidkonzentration in der NNH-Schleimhaut der

Versuchspferde herangezogen.

In dieser Arbeit wurde die gesuchte Substanz SDM selbst zur Kalibration des

Systems herangezogen. Unter In-vitro-Bedingungen zeigten sich im unteren

Kalibrationsbereich (Medium: 0,1 und 0,5 µg SDM/ml PBS) große Schwankungen in

der Höhe der Wiederfindung. Wie sich im Laufe der Untersuchungen herausstellte,

befand sich die niedrigste Konzentrationsstufe (0,1 µg/ml) bereits unterhalb der

Quantifizierungsgrenze von SDM (0,15 µg/ml), sodass diese Ergebnisse nicht


ausgewertet werden konnten. Im Konzentrationsbereich von 1 µg SDM/ml PBS

waren die Schwankungen sowohl für die Bestimmung von RRSDM als auch von

RLSDM, Ref. wesentlich geringer. Eine Anpassung der Konzentrationsstufen für die In-

vitro-Kalibration ist in dieser Arbeit nicht vorgenommen worden, um den bestehenden

Untersuchungsgang nicht in einem fortgeschrittenen Versuchsstadium zu verändern.

Für mögliche Folgearbeiten ist eine derartige Anpassung jedoch anzuraten.

Die unter In-vivo-Bedingungen ermittelten Werte für RLSDM, Ref. waren zwischen den

einzelnen Experimenten relativ konstant. Der Vergleich der SDM-Verlustraten unter

In-vivo- (RLSDM, Ref. 45,9 %) und In-vitro-Bedingungen (RLSDM, Ref. 68,3 %) ergibt einen

geringeren Verlust unter In-vivo-Bedingungen und steht damit im Einklang mit den

Aussagen von KOVAR et al. (1997). Die Tatsache, dass in den entnommenen

Leerproben (in vitro und in vivo) keinerlei Sulfonamidkonzentrationen nachgewiesen

werden konnten, bestätigt zum einen, dass die Spülung mit Aqua bidestillata bei

einer Flussrate von 15 µl/Min über 30 Minuten ausreichend ist, um

Sulfonamidrückstände aus dem MD-Katheter zu entfernen und zum anderen, dass

keine Verfälschungen der Sulfonamidkonzentrationen in den nachfolgend

entnommenen Proben (in vitro und in vivo) durch die vorhergehenden In-vitro-

Versuche zu erwarten sind.

Grundsätzlich gilt in MD-Experimenten die gesuchte Substanz selbst als die ideale

Kalibrationssubstanz (BOUW u. HAMMARLUND-UDENAES 1998). Jedoch erfordert

deren Zusatz zur Perfusionslösung die Durchführung der Kalibration vor dem

eigentlichen Versuchsbeginn und bietet damit nicht die Möglichkeit, Veränderungen

der Wiederfindung über die Zeit zu untersuchen. Aus diesem Grund wird die

Verwendung eines internen Standards empfohlen, welcher der Perfusionslösung

über die gesamte Versuchsdauer zugesetzt werden kann (DE LANGE et al. 2000). In

der vorliegenden Arbeit wurde SDZ als interner Standard eingesetzt, welches dem

SDM strukturell sehr ähnlich ist, sich jedoch mithilfe der HPLC eindeutig von diesem

differenzieren lässt.

Die In-vitro-Untersuchungen vom RLSDZ ergaben relativ konstante Ergebnisse

während der einzelnen SDM-Konzentrationsstufen (Medium) und der


Referenzphase. Auch der durchschnittliche Verlust von SDZ während der SDM-

Wiederfindungsversuche (58,0 %) war vergleichbar mit den entsprechenden Werten

aus der Referenzphase (57,5 %). Allerdings wiesen die RLSDZ-Werte bei steigenden

SDM-Konzentrationen im Medium eine sinkende Tendenz auf. Die Gründe hierfür

sind unbekannt.

Der Einsatz von SDZ unter In-vivo-Bedingungen war mit verschiedenen Problemen

assoziiert, welche aufgrund der relativ konstanten In-vitro-Ergebnisse nicht

vorhersehbar waren. Es wurden teilweise sehr geringe Verluste von SDZ aus der

Perfusionslösung (RLSDZ) bzw. sogar Zugewinne von SDZ im Dialysat beobachtet.

Die Gründe für diese Beobachtung waren nicht abschließend zu klären, jedoch ist

davon auszugehen, dass geringe Konzentrationsschwankungen in der Perfusions-

lösung diese Unregelmäßigkeiten verursacht haben. Es ist möglich, dass dieses

Problem im Rahmen der vorliegenden Arbeit durch die Verdünnung der Dialysate im

Zuge der analytischen Aufarbeitung verstärkt wurde (Kap. 7.2.2). Weiterhin traten

große Schwankungen des RLSDZ während der einzelnen In-vivo-Experimente auf.

Vergleichbare Schwankungen sind weder unter In-vitro-Bedingungen aufgetreten

noch ließen sie sich an den zugehörigen In-vivo-SDM-Konzentrationsprofilen

erkennen. Auch BOUW und HAMMARLUND-UDENAES (1998) beobachteten unter

In-vivo-Bedingungen Schwankungen, welche lediglich den internen Standard, nicht

aber die gesuchte Substanz betrafen. Bei der Untersuchung dieses Zusammenhangs

stellten sie fest, dass die von ihnen beobachteten hohen Variationskoeffizienten vor

allem mit geringen Wiederfindungsraten assoziiert waren. In der Versuchsphase der

vorliegenden Arbeit wurde die von BOUW und HAMMARLUND-UDENAES (1998) für

den Einsatz eines internen Standards zu Kalibrationszwecken empfohlene

Wiederfindungsrate von mindestens 20 % lediglich bei drei Pferden erreicht

(Tab. 6.2). Des Weiteren wurde ausgehend von der Referenzphase eine Abnahme

von RLSDZ über die gesamte Versuchsdauer von 48 h beobachtet. Ein möglicher

Grund hierfür wäre eine fortschreitende Ablagerung von Zellen und damit der

Verschluss der Poren der semipermeablen Membran (DE LANGE et al. 2000).

Weiterhin ist ein Zusammenhang mit der für die Katheterinsertion notwendigen

Blasenbildung denkbar: möglicherweise führen über die beobachtete Koagulation


hinausgehende Mikroblutungen in den subepithelialen Schichten der paranasalen

Mukosa zu erhöhten Wiederfindungsraten zu Beginn des Versuchs (Kap. 7.3.5).

Abschließend bleibt festzuhalten, dass SDZ für das vorgestellte Studiendesign nicht

als interner Standard geeignet war, dementsprechend wurde von der Verwendung

der in vivo ermittelten Ergebnisse zur weiteren Berechnung von

Gewebekonzentrationen abgesehen. Diese erfolgte, wie bereits beschrieben,

ausschließlich mittels der unter In-vivo-Bedingungen ermittelten Werte des RL von

SDM in der Referenzphase (RLSDM, Ref.).

7.2.2 Schwankungen der Dialysatvolumina

Dank der Mikroperfusionspumpe wurde kontinuierlich Dialysat produziert und die

regelmäßig entnommenen Probengefäße enthielten weitgehend das erwartete

Dialysatvolumen von 180 µl. Lediglich bei einem Pferd schwankte das Volumen der

Dialysate erheblich. Ein möglicher Grund dafür könnten verminderte Flussraten sein,

welche als Folge langer Schlauchsysteme (> 1,5 m) und einer erhöhten vertikalen

Position der Mikroperfusionspumpe im Vergleich zur Kathetermembran (> 30 cm)

auftreten können (CHOU et al. 2001). Jedoch wurden die genannten Parameter

weder bei besagtem Pferd noch in den anderen In-vivo-Versuchen überschritten.

Darüber hinaus konnten diese Veränderungen auch unter vergleichbaren In-vitro-

Bedingungen nicht reproduziert werden. Insgesamt erscheint es demnach

wahrscheinlicher, dass die reduzierten Dialysatvolumina auf das vermehrte

Kopfschütteln dieses Pferdes (Kap. 7.4.2) und den damit einhergehenden Verlust

des Dialysats durch das Überflussventil des Probengefäßes zurückzuführen waren.

Die Differenz des erwarteten Dialysatvolumens (180 µl) und dem tatsächlich für die

Analytik zur Verfügung stehenden Volumen (122,7 ± 26,8 µl) ist auf den Verlust

während des Umfüllens aus dem Microvial in das HPLC-Vial zurückzuführen.


7.3 Sulfadimidinkonzentration

7.3.1 Nachweis von Sulfadimidin im Mikrodialysat und Berechnung der Sulfadimidinkonzentrationen in der Nasennebenhöhlenschleimhaut

Die Methode der In-vivo-MD ermöglichte den Nachweis von SDM in den

Mikrodialysaten und damit die Berechnung der Wirkstoffkonzentration in der NNH-

Schleimhaut von Pferden. Anhand der erstellten Konzentrations-Zeit-Profile ließ sich

nach beiden Applikationszeitpunkten (t0, t24) die An- und Abflutung des Wirkstoffes in

der NNH-Schleimhaut über den gesamten Untersuchungszeitraum von 48 h

darstellen. Die maximale Wirkstoffkonzentrationen in der NNH-Schleimhaut betrugen

durchschnittlich 9,6 µg/ml nach der ersten und 7,0 µg/ml nach der zweiten

Wirkstoffapplikation. Die erreichten Gewebespiegel lagen damit in einem

Konzentrationsbereich, der auch von anderen Autoren für verschiedenste Gewebe

und Körperflüssigkeiten nach der Applikation ähnlicher Sulfonamidkonzentrationen

beim Pferd angegeben wurden (BROWN et al. 1983; BERTONE et al. 1988;

BROWN et al. 1988; WINTHER et al. 2011). Dennoch lagen die im Rahmen dieser

Arbeit bestimmen Werte unter jenen, die von VAN DUIJKEREN et al. (2002) und

ENSINK et al. (2005) für die Verteilung von SDZ in die Flüssigkeit chirurgisch

erstellter Gewebekammern (TCF, tissue chamber fluid) bei Ponys angegeben

wurden: dort wurden nach der Gabe von TMS (30 mg/kg, oral, zweimal täglich über

zwei Tage) maximale SDZ-Wirkstoffspiegel von 23,5 µg/ml in der TCF gemessen

(VAN DUIJKEREN et al. 2002) bzw. jeweils drei Stunden nach der Gabe von TMS

(30 mg/kg, Tag 0: einmal täglich intravenös und oral bzw. Tag 1 - 5: zweimal täglich

oral) SDZ-Wirkstoffspiegel von ca. 20 µg/ml (ENSINK et al. 2005). Weiterhin wurden

sowohl im Rahmen der vorliegenden Arbeit als auch in den Studien von VAN

DUIJKEREN et al. (2002) und ENSINK et al. (2005) erhebliche Schwankungen in

den Gewebekonzentrationen zwischen den einzelnen Probanden beobachtet. Diese

Schwankungen sind wahrscheinlich auf die häufig zu beobachtende hohe

interindividuelle Variabilität der Gewebeverteilung von Antiinfektiva zurückzuführen

(MÜLLER et al. 2004).


7.3.2 Beziehung zwischen den Wirkstoffkonzentrationen im Plasma und in der Nasennebenhöhlenschleimhaut

Die Höhe der im Rahmen dieser Studie erreichten Wirkstoffkonzentrationen und die

errechneten PK-Parameter für SDM im Plasma stehen im Einklang mit

vorhergehenden Berichten für Sulfonamidkonzentrationen bei Pferden (VAN

DUIJKEREN et al. 1994a; VAN DUIJKEREN et al. 1995; WINTHER et al. 2011). Die

maximalen Plasmakonzentrationen wurden 0,5 h nach der systemischen

Verabreichung des SDM und damit in der ersten entnommenen Blutprobe bestimmt.

Das Maximum der SDM-Konzentration in der NNH-Schleimhaut trat mit einer

zeitlichen Verzögerung von ca. sechs Stunden auf. Die durchschnittlichen maximalen

Gewebekonzentrationen betrugen lediglich 17,4 % und 13,6 % (t0-24 bzw. t24-48) der

entsprechenden Plasmakonzentrationen und unterstreichen die Beobachtung, dass

die Ableitung von Gewebe- aus Plasmakonzentration zu einer Überschätzung der

Gewebekonzentration führt (MÜLLER et al. 2004).

7.3.3 Pharmakokinetische Simulation

Die theoretisch mögliche Wirkstoffkonzentration in einem Gewebe nach der

intravenösen Applikation des zu untersuchenden Wirkstoffes SDM wurde anhand

eines PK-Modells simuliert.

Dazu wird der Körper gemäß eines Zwei-Kompartiment-Modells mit intravenöser

Wirkstoffapplikation in ein zentrales Kompartiment (Blut) und ein peripheres

Kompartiment (Gewebe) aufgeteilt (Abb. 7.1). Der Wirkstoffaustausch zwischen dem

Blut- und dem Gewebekompartiment wird mithilfe der Geschwindigkeitskonstanten

erster Ordnung, den sog. Mikrokonstanten, beschrieben. Dabei beschreibt k12 den

Transport vom Blut in das Gewebe und k21 die Rückverteilung vom Gewebe ins Blut.

Die Elimination des Wirkstoffes aus dem Blut wird mit ke beschrieben.


Abb. 7.1: Zwei-Kompartiment-Modell mit intravenöser (i. v.) Wirkstoffapplikation (nach DERENDORF et al. 2010).

Die Berechnung der Wirkstoffkonzentrationen in Blut und Gewebe sowie des

eliminierten Wirkstoffanteils erfolgte entsprechend den folgenden Formeln

(modifiziert nach CHAMBERLAIN 2003):

Die Berechnung der Wirkstoffkonzentrationen zum jeweils aktuellen Simulationszeit-

punkt erfolgte unter Einbeziehung der entsprechenden Konzentrationen des

vorherigen Simulationszeitpunktes (Cx, -1). Die Mikrokonstanten k12, k21 und ke

wurden analog zu DERENDORF et al. (2010) anhand der im Rahmen des

Hauptversuchs erhaltenen PK-Daten errechnet (Kap. 6). Als Anfangskonzentration

des Blutplasmas wurde der Mittelwert der ebenfalls im Rahmen der PK-

Berechnungen ermittelten fiktiven Anfangskonzentration (C0) eingesetzt (Tab. 7.1).

Tab. 7.1: Parameter und Werte, welche für die pharmakokinetische Simulation genutzt wurden.

Parameter Wert

k12 0,8

k21 0,71

ke 0,24

Co (µg/ml) 77,42

Blut

1

Gewebe

2Elimination

k12

k21

ke

i. v.


Abb. 7.2: Zeitlicher Verlauf der SDM-Konzentration in Blut, Gewebe sowie der eliminierten SDM-Konzentration über ein Dosierungsintervall (24 h).

Die simulierten Blutkonzentrationen sind sowohl in der Konzentrationshöhe als auch

in ihrem Verlauf nahezu deckungsgleich zu den unter In-vivo-Bedingungen

gemessenen Plasmakonzentrationen (Abb. 6.1 und 7.2). Die simulierte SDM-

Wirkstoffanflutung im Gewebe erreicht bereits nach 1,5 h die Maximalkonzentration

und findet damit schneller statt als unter In-vivo-Bedingungen (tmax ~ 6 h). Die

simulierte maximale SDM-Gewebekonzentration liegt mit 17,9 µg/ml höher als die

durchschnittliche SDM-Konzentration, die in der vorliegenden Arbeit in der NNH-

Schleimhaut mittels der MD bestimmt wurde. Dieser Umstand kann einerseits darauf

hindeuten, dass in der NNH-Schleimhaut eine Beeinträchtigung der Zielgewebs-

konzentration (Kap. 2.3.3) vorliegt und somit niedrigere Gewebekonzentrationen

erzielt werden als es für ein peripheres Gewebe zu erwarten wäre.

Dementsprechend ist es wichtig die Bestimmung von Antiinfektiva-Konzentrationen

direkt im Zielgewebe vorzunehmen (MÜLLER et al. 2004; BRUNNER et al. 2005). Es

gilt jedoch zu beachten, dass letztlich nicht auszuschließen ist, dass die reduzierte

Wirkstoffkonzentration in der Schleimhaut auf technische Gegebenheiten des

Versuchsdesigns (Bestimmung der Wiederfindung, Lage des MD-Katheters in der

Blase) zurückzuführen ist (Kap. 7.3.5).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 6 12 18 24

Su

lfa

dim

idin

(µ

g/m

l)

Zeit (h)

Blut

Gewebe

Elimination


7.3.4 Gewebekonzentration im Verhältnis zu MHK-Werten

Die ermittelten Wirkstoffkonzentrationen in der NNH-Schleimhaut wurden in

Beziehung zu MHK-Werten für potenzierte Sulfonamide gesetzt. Aufgrund des

Studiendesigns standen lediglich SDM-Konzentrationen zur Verfügung und die

folgenden Aussagen basieren auf der Annahme, dass gleichzeitig wirksame TMP-

Konzentrationen vorlagen.

Beim Vergleich der durchschnittlichen SDM-Konzentrationen in der NNH-

Schleimhaut mit einem MHK-Wert von ≤ 0,25/4,75 µg/ml (BERTONE et al. 1988;

WINTHER et al. 2011) überschreiten diese den genannten MHK-Wert für ca. 12 h. In

Anbetracht der großen Streuung zwischen den einzelnen Tieren ist jedoch zu

bedenken, dass dieser Wert bei einem Pferd überhaupt nicht sowie bei zwei Pferden

nur während eines Applikationsintervalls erreicht wurde. Bei Ansetzen eines höheren

MHK-Werts von ≤ 0,5/9,5 µg/ml (ADAMSON et al. 1985; HIRSH u. JANG 1987; CLSI

2008) wäre die notwendige Gewebekonzentration lediglich bei fünf Pferden erreicht

worden, davon bei drei Pferden nur während eines Applikationsintervalls. Noch

höhere Grenzwerte anderer Autoren (1/20 µg/ml, ENSINK et al. 1993; 0,5/32 µg/ml,

FEY u. SCHMID 1995) wurden in der vorliegenden Studie nicht erreicht. Basierend

auf den genannten Ergebnissen ist davon auszugehen, dass die intravenöse

Therapie mit 25 mg/kg SDM in Kombination mit 5 mg/kg TMP lediglich geeignet ist,

equine Sinusitiden mit hoch empfänglichen bakteriellen Erregern zu therapieren. Um

wirksame Konzentrationen aufrechtzuerhalten, sollte eine Anpassung des

Dosierungsintervalls auf 12 h erfolgen. Diese Ergebnisse stehen in Hinblick auf die

Erregerempfindlichkeit und das Dosierungsintervall im Einklang mit Ergebnissen für

den unteren Respirationstrakt des Pferdes (WINTHER et al. 2011).

7.3.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die Gewebekonzentration

Um die Implantation des MD-Katheters in die NNH-Schleimhaut zu ermöglichen,

wurde eine flüssigkeitsgefüllte Blase in den subepithelialen Schichten geschaffen.

Somit befand sich der Katheter nicht wie normalerweise bei der In-vivo-MD üblich in

der ISF eines Gewebes oder einer anderen Körperflüssigkeit (DE LANGE et al.


2000) und es besteht die Möglichkeit, dass sich die Wirkstoffkonzentration in der

Blase von jener in der unbehandelten ISF unterscheidet.

Die Bildung der Blase führte zu Einblutungen in das Blaseninnere, diese kamen zwar

augenscheinlich schnell durch Koagulation zum Erliegen, jedoch können länger

anhaltende Mikroblutungen oder Veränderungen der kapillaren Permeabilität nicht

sicher ausgeschlossen werden. Derartige Veränderungen könnten zu einer

abweichenden Wirkstoffverteilung im Gewebe oder zu veränderten

Wiederfindungsraten der untersuchten Substanzen führen. Die Tatsache, dass der

Verlust des internen Standards SDZ (RLSDZ) zu Beginn der Versuche höhere

Verlustraten als am Ende der Versuchsperiode anzeigt, könnte ein Hinweis auf

anhaltende Mikroblutungen zu Beginn der Versuche sein (Kap. 7.2.1). Dieser

Umstand beträfe auch die Wiederfindung des SDM und die auf Basis des RLSDM, Ref.

errechneten Gewebekonzentrationen mit der Folge, dass diese höher wären, als die

in Kap. 6.4 angegebenen Werte. Um diese Fehlerquelle für potentielle Folge-

untersuchungen auszuschließen, sollte die Zeitspanne zwischen der Blasenbildung

bzw. Katheterimplantation und der Durchführung der eigentlichen MD-Versuche

verlängert werden. Laut DE LANGE et al. (2000) liegt der optimale Zeitpunkt für den

Beginn der Untersuchungen zwischen dem Abklingen früher und dem Auftreten

später Gewebereaktionen auf die Katheterimplantation, d. h. ein bis zwei Tage nach

der Implantation.

Weiterhin ist es möglich, dass die Blasenbildung durch die Veränderung des

Verhältnisses der kapillaren Oberfläche zum Gewebevolumen den Grad der

Wirkstoffpenetration in den betroffenen Bereich beeinflusst (RYAN 1985). Ferner

könnte die Ansammlung von PBS und koagulierendem Blut in der Blase eine

Verdünnung der Wirkstoffkonzentration zur Folge haben. Der Grad der Verdünnung

zwischen den einzelnen Pferden kann variieren, da die Größe der Blase weder

beeinflusst noch gemessen werden konnte. Jedoch gab es makroskopisch keine

Hinweise darauf, dass sich die Größe der Blase bei den einzelnen Individuen

während des MD-Versuchs veränderte (Kap. 5.4.1). Zu guter Letzt könnte auch ein


entzündungsbedingt erniedrigter pH-Wert im Blaseninneren dazu führen, dass SDM

als schwache Säure diesen Bereich weniger stark penetriert als die normale ISF.

Abschließend ist es wichtig anzumerken, dass im Sinne des primären Ziels der

Methodenetablierung in dieser Arbeit ausschließlich gesunde Pferde untersucht

wurden. Die erhaltenen Gewebekonzentrationen entsprechen daher nicht

notwendigerweise jenen Konzentrationen, welche an sinusitiserkrankten Pferden zu

erheben wären. Die Frage, ob sich die Wirkstoffverteilung und die resultierende

Gewebekonzentration im gesunden und erkrankten Gewebe unterscheidet, gilt als

umstritten (MÜLLER et al. 1996; JOUKHADAR et al. 2001; STEINER et al. 2004).

Die Untersuchung von Antibiotikakonzentrationen in der Schleimhaut bei der

Sinusitis des Menschen ergab Hinweise darauf, dass in der entzündeten

Schleimhaut geringere Wirkstoffkonzentrationen erreicht werden als in der gesunden

Schleimhaut (EKEDAHL et al. 1978).

7.4 Auswirkungen der Mikrodialyse-Studie auf die Pferde

7.4.1 Postoperative Auswirkungen der Katheterimplantation

Komplikationen im Zusammenhang mit dem chirurgischen Eingriff der

Katheterimplantation umfassten das temporäre und selbstlimitierende Auftreten von

Nasenausfluss, subkutanen Emphysemen (ausgehend vom Sinuskopieportal) und

geringgradige Reaktionen der mandibularen Lymphknoten. Komplikationen dieser Art

sind bei vergleichbaren Eingriffen nicht ungewöhnlich (RUGGLES et al. 1991;

BERTONE et al. 1993; CHAN u. MUNROE 1995). Das Auftreten von kurzfristigen

Wundheilungsstörungen bei 2/12 Pferden (= 16,7 %) war im Vergleich zu den

Angaben anderer Autoren nach chirurgischer Eröffnung der NNH gering (39 %,

GREET 1992; 29 %, HART u. SULLINS 2011). Mögliche Gründe hierfür sind die

ausschließliche Verwendung von Pferden ohne Vorerkrankungen der NNH sowie die

Gabe von potenzierten Sulfonamiden in therapeutischer Dosierung. Darüber hinaus

standen nicht alle Pferde über einen ausreichend langen Beobachtungszeitraum,

d. h. bis zum kompletten Abheilen der Portale, zur Verfügung. Bei jenen Pferden, die


für eine Langzeitbeobachtung zur Verfügung standen (n = 4), fand eine primäre

Wundheilung mit gutem Heilungserfolg statt.

Aufgrund des ungestörten Allgemeinbefindens der Probanden wurde – wie im

Tierversuchsantrag dargestellt und entsprechend genehmigt – auf die Applikation

von nicht-steroidalen Antiphlogistika verzichtet. So konnten Interaktionen zwischen

den verschiedenen Wirkstoffen und Auswirkungen auf die Pharmakokinetik, wie sie

für SDM und Flunixin-Meglumin beschrieben worden sind (EL-BANNA 1999),

vermieden werden.

7.4.2 Durchführung In-vivo-Mikrodialyse-Studie

Die Durchführung der In-vivo-MD-Studie beinhaltete die Befestigung des gesamten

MD-Systems im Bereich des Pferdekopfes. Einige Pferde reagierten darauf mit

gelegentlichem Kopfschütteln, lediglich ein Pferd reagierte mit vermehrtem

Kopfschütteln. Auslöser für das Kopfschütteln war wahrscheinlich die Befestigung

der Tasche mit dem MD-Zubehör (Pumpe in Metallbox) im Genick des Pferdes und

damit in unmittelbarer Nähe zu den Ohren.

Sowohl der Wechsel der Probengefäße als auch jener der Perfusorspritzen wurde

von den Pferden allgemein gut toleriert. Lediglich ein kleiner Teil der Pferde

widersetzte sich am Anfang der Versuchsperiode diesen Wechseln, so dass sie

zunächst nur unter Mithilfe einer zweiten Person durchgeführt werden konnten; nur

bei einem Pferd war es über die gesamte Versuchsperiode nicht möglich die

Wechsel alleine vorzunehmen. Grundsätzlich empfiehlt sich jedoch die Auswahl von

Pferden, die den Umgang mit Menschen gewöhnt sind und keinerlei Anzeichen von

Kopfscheue zeigen.


7.5 Schlussfolgerungen Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass die Methode der Mikrodialyse

grundsätzlich geeignet ist, um Wirkstoffkonzentrationen eines systemisch

applizierten Antiinfektivums in der NNH-Schleimhaut von Pferden zu bestimmen.

Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es, einen MD-Katheter direkt in der NNH-

Schleimhaut von Pferden zu platzieren. Letztlich konnte der Katheter zwar in den

subepithelialen Schichten der Mukosa platziert werden, jedoch nur unter

Zuhilfenahme der Bildung einer flüssigkeitsgefüllten Blase. Insgesamt war der

Eingriff der Katheterimplantation ein vergleichsweise aufwendiger Eingriff, der vor

allem durch die Fragilität der Schleimhaut erschwert wurde.

Die In-vivo-Anwendung der MD erlaubte den Nachweis von SDM im Dialysat und

bildete damit die Grundlage für die Erstellung kontinuierlicher Konzentrations-Zeit-

Profile von SDM in der NNH-Schleimhaut. Die Tatsache, dass die MD-Katheter sich

nicht unmittelbar in der ISF der Schleimhaut, sondern in der Blase befanden, kann

Abweichungen der hier ermittelten von den tatsächlichen Konzentrationen in der ISF

bedingen. Darüber hinaus gilt es bei der Auswertung der Gewebekonzentrationen zu

berücksichtigen, dass sie an klinisch gesunden Pferden ermittelt wurden und nicht

notwendigerweise mit den Gewebekonzentrationen sinusitiserkrankter Pferde

übereinstimmen. Die Verwendung des internen Standards SDZ war unter In-vivo-

Bedingungen mit methodischen Problemen behaftet, jedoch erlaubte seine

Anwendung die Vermutung, dass eine Veränderung der Wiederfindung über die Zeit

aufgetreten ist. Zur Abklärung der jeweiligen Gründe sind weitere Untersuchungen

erforderlich.

Ein Vergleich der Sulfonamidkonzentrationen in der NNH-Schleimhaut und dem

Blutplasma zeigte erwartungsgemäß deutliche Unterschiede in der Höhe der

erreichten Wirkstoffkonzentrationen. Dieses Ergebnis unterstreicht die Notwendigkeit

der Konzentrationsbestimmung von antimikrobiellen Wirkstoffen direkt am Ort der

Infektion und somit in der ISF des jeweils zu untersuchenden Gewebes. Unter der

Annahme, dass die gemessenen Sulfadimidinkonzentrationen in der Schleimhaut


zutreffend sind, erscheint es zweifelhaft, dass die bisher verwendeten Dosierungen

von potenzierten Sulfonamiden geeignet sind, um einen ausreichenden antiinfektiven

Effekt in der Nasennebenhöhlenschleimhaut zu erzielen.

Zusammenfassung 117

8 Zusammenfassung

Caroline Gietz (2012)

Etablierung der Mikrodialyse zur Bestimmung von Sulfonamidkonzentrationen

in der Nasennebenhöhlenschleimhaut des Pferdes

In der Therapie equiner Sinusitiden werden vielfach antimikrobielle Wirkstoffe

eingesetzt, obwohl nicht hinreichend bekannt ist, ob diese das Zielgewebe in

ausreichenden Konzentrationen erreichen oder ob ggf. subinhibitorische

Wirkstoffkonzentrationen der Grund für das häufig berichtete Therapieversagen bei

dieser Erkrankung sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die

Konzentrationsbestimmung des systemisch applizierten Antiinfektivums Sulfadimidin

in der Nasennebenhöhlenschleimhaut von Pferden mittels der In-vivo-Mikrodialyse.

Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Methode zur Implantation eines Mikrodialyse-

katheters in die Nasennebenhöhlenschleimhaut von Pferden entwickelt. Die Technik

wurde zunächst an isolierten Pferdeköpfen (n = 20) erarbeitet und nachfolgend unter

In-vivo-Bedingungen an zwölf allgemeingesunden Pferden angewendet. Der Eingriff

der Katheterimplantation erfolgte an stehenden, sedierten Pferden. Der Katheter

wurde unter endoskopischer Kontrolle (Portal: Sinus maxillaris caudalis) in der

Schleimhautauskleidung des Sinus frontalis platziert. Die Insertion erfolgte nach

schleimhautschonender Perforation des Stirnbeins (elektrische Fräse) und Bildung

einer flüssigkeitsgefüllten Blase (Phosphat-gepufferte Salzlösung, Durchmesser der

Blase: 20 - 30 mm) in den subepithelialen Schichten der Mukosa. Nach Insertion der

Kathetermembran (Länge: 10 mm, Außendurchmesser: 0,6 mm) in diese Blase

wurde das komplette Mikrodialysesystem, bestehend aus Mikrodialysekatheter und

-pumpe, Perfusorspritze und Probensammelgefäß am Pferd fixiert und bis zu 52 h

dort belassen. Der Eingriff der Katheterimplantation dauerte durchschnittlich 295 Min.

Komplikationen während der Implantation umfassten die Perforation der Mukosa

während der Knochenperforation oder der Katheterinsertion sowie das Einreißen der

118 Zusammenfassung

Mukosa bei der Erstellung der Blase. Postoperative Komplikationen traten nur

vereinzelt und in geringgradiger Ausprägung auf.

Das Ziel des zweiten Teils dieser Arbeit war die kontinuierliche Konzentrations-

bestimmung eines systemisch applizierten Antiinfektivums (Sulfadimidin) in der

Nasennebenhöhlenschleimhaut von Pferden mittels der In-vivo-Mikrodialyse. Zu

diesem Zweck erhielten 10/12 Pferde aus dem ersten Versuchsteil nach der

erfolgreichen Katheterimplantation und dem Einhalten einer vierstündigen

Kalibrationsphase zweimalig ein Trimethoprim-Sulfadimidin-Kombinationspräparat

(30 mg/kg KGW, intravenös). Die Wirkstoffapplikation erfolgte zum Zeitpunkt 0 (t0)

und nach 24 h (t24), die kontinuierlichen Probenentnahmen (Dialysat und Blut)

erfolgten über 48 h. Die Quantifizierung der Sulfadimidinkonzentrationen in Dialysat

und Blutplasma erfolgte mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Die

maximalen Sulfadimidinkonzentrationen im Blutplasma betrugen 55,3 ± 10,3 nach

der ersten und 51,5 ± 8,7 µg/ml nach der zweiten Wirkstoffapplikation. Die

maximalen Sulfadimidinkonzentrationen in der Schleimhaut betrugen 9,6 ± 4,5 und

7,0 ± 3,3 µg/ml im ersten bzw. zweiten Dosierungsintervall; sie wurden 5,9 ± 2,7 bzw.

5,4 ± 2,3 h nach der jeweiligen Wirkstoffgabe erreicht.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Mikrodialyse eine geeignete Methode

für die kontinuierliche Konzentrationsbestimmung eines systemisch applizierten

Antiinfektivums in der Nasennebenhöhlenschleimhaut von Pferden darstellt. Unter

der Annahme, dass die gemessenen Sulfadimidinkonzentrationen in der Schleimhaut

zutreffend sind, erscheint es zweifelhaft, dass die bisher verwendeten Dosierungen

von potenzierten Sulfonamiden geeignet sind, um einen ausreichenden antiinfektiven

Effekt in der Nasennebenhöhlenschleimhaut zu erzielen. Dementsprechend können

die erhaltenen pharmakokinetischen Daten dazu herangezogen werden, bekannte

Sulfadimidin-Dosierungsschemata zu überarbeiten und so eine verbesserte

Sinusitistherapie zu ermöglichen. Weiterhin steht die vorgestellte Methode der

Mikrodialyse auch zur Ermittlung pharmakokinetischer Daten anderer Wirkstoffe im

Bereich der Nasennebenhöhle des Pferdes zur Verfügung.

Summary 119

9 Summary

Caroline Gietz (2012)

Establishment of microdialysis for investigation of sulfonamide concentrations

within the paranasal mucous membrane of horses

Equine sinusitis is often treated with anti-infective agents. However, there is only

insufficient knowledge if adequate drug concentrations are reached at the target sites

or if subinhibitory drug concentrations may be causative for the frequently

encountered treatment failure in this disease. The objective of the present work was

to determine concentrations of the systemically administered anti-infective agent

sulfadimidine within the paranasal mucosal lining of horses by means of in vivo

microdialysis.

Firstly, a method for implantation of a microdialysis probe into the paranasal mucous

membrane of horses was developed in isolated equine heads (n = 20). This method

was subsequently applied under in vivo conditions in 12 healthy horses. Implantation

of the microdialysis probe into the paranasal mucosal lining of the frontal sinus was

done in standing, sedated horses under endoscopic guidance (caudal maxillary sinus

portal). Therefore, the frontal bone was perforated (corded drill) without lacerating the

underlying mucosal lining and a fluid-filled blister (phosphate-buffered saline,

diameter: 20 - 30 mm) was created within the subepithelial layers of the mucosa. The

probe membrane (length: 10 mm, outer diameter: 0,6 mm) was inserted into the fluid-

filled blister and the complete microdialysis system (probe, microperfusion pump,

perfusion syringe, sampling vial) was affixed to the horse and left in situ up to 52 h.

Complications during probe implantation were perforation of the mucous membrane

during drilling or probe placement, or rupture of the blister while applying phosphate-

buffered saline; the mean procedure time was 295 min. Post-surgical complications

were mild and only of temporary nature.

Secondly, in vivo microdialysis was performed in 10/12 horses for 52 h (4 h

calibration, 48 h sample collection). These horses were administered a trimethoprim-

120 Summary

sulfadimidine formulation (30 mg/kg, intravenously) twice (t0, t24); samples (plasma

and dialysate) were collected for 48 h. Both plasma and dialysate samples were

analyzed for concentrations of sulfadimidine by high-performance liquid

chromatography. Average peak concentrations of sulfadimidine in the paranasal

mucosa were 9.6 ± 4.5 and 7.0 ± 3.3 µg/mL following the first and second treatment;

peak concentrations were reached 5.9 ± 2.7 and 5.4 ± 2.3 h following the respective

treatment. Average sulfadimidine peak concentrations in the plasma were

55.3 ± 10.3 µg/mL following the first and 51.5 ± 8.7 µg/mL following the second

treatment.

This study demonstrates the feasibility of in vivo microdialysis for continuous

monitoring of sulfadimidine concentrations within the paranasal mucosal lining of

horses following its systemic administration. Assuming the accuracy of the

determined concentrations of sulfadimidine within the paranasal sinus mucosa, it

seems questionable if established dosage regimens for potentiated sulfonamides

enable a sufficient antimicrobial effect. The obtained pharmacokinetic data can be

used to revise existing sulfadimidine dosage schedules and improve therapy of

equine sinusitis. Furthermore, the presented method of in vivo microdialysis may be

used for investigation of pharmacokinetic data of further drugs within the paranasal

mucosal lining of horses.

Literaturverzeichnis 121

10 Literaturverzeichnis ADAMSON, P. J., W. D. WILSON, D. C. HIRSH, J. D. BAGGOT u. L. D. MARTIN (1985): Susceptibility of equine bacterial isolates to antimicrobial agents. Am J Vet Res 46, 447-450

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Danksagung 141

11 Danksagung

Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. Bernhard Ohnesorge für die Überlassung des

interessanten Dissertationsthemas sowie für die jederzeit freundliche und konstruktive

Unterstützung dieser Arbeit.

Weiterhin danke ich Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für die Möglichkeit die

analytischen Untersuchungen am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

durchzuführen sowie für die stets freundliche und unkomplizierte Unterstützung.

Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. Astrid Bienert-Zeit für die ausgezeichnete

Betreuung und ihr unermüdliches Engagement bei der Anfertigung dieser Dissertation.

Liebe Astrid, vielen Dank für Deine Unterstützung, Motivation und Dein Vertrauen!!

Frau Dr. Jessica Stahl danke ich ganz herzlich für die Durchführung der HPLC-

Untersuchungen sowie für ihre Ratschläge, Bemühungen und die nette

Zusammenarbeit.

Mein Dank gilt weiterhin Herrn Prof. Dr. Carsten Staszyk für die Unterstützung bei der

Entnahme und Aufarbeitung der histologischen Proben sowie für die sehr angenehme

Zusammenarbeit. An dieser Stelle danke ich auch Frau Gudrun Wirth sehr herzlich für

die Anfertigung der histologischen Schnitte.

Frau Dr. Verena Haist danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und ihren fachlichen Rat bei

der Auswertung der histologischen Schnitte.

Ein ganz großes Dankeschön gebührt meinen freiwilligen Helfern Filip Batkowski,

Markus Brinkschulte, Joachim Kaminski, Isabelle Kern, Tanja Pudert, Caroline

Schöngart, Monika Siroka, Tanja Tesch, Tobias Warnken und Liza Wittenberg, die

durch ihre unermüdliche Hilfs- und Einsatzbereitschaft zu allen Tages- und Nachtzeiten

die praktische Durchführung der Versuche erst möglich gemacht haben.

Mein herzlicher Dank gilt weiter allen Mitarbeitern der Klinik für Pferde, die mich mit Rat

und Tat bei der Vorbereitung und Durchführung meiner Versuche unterstützt haben.

142 Danksagung

Meinen Mitdoktoranden danke ich für ihre Hilfsbereitschaft bei kleinen und großen

Problemen und die nette Zusammenarbeit.

Ebenso gilt mein Dank den Mitarbeitern und Mitdoktoranden in der Pharmakologie für

die freundliche Aufnahme, die Hilfsbereitschaft und Unterstützung bei der Durchführung

meiner Versuche, die konstruktiven Gespräche und nicht zuletzt für den anderen netten

Plausch bei einem Käffchen.

Ein ganz besonderer Dank gilt meiner Mitdoktorandin und Mikrodialyse-Leidensgenossin

Amelie Teepe für den regen Austausch über Freud und Leid der Mikrodialyse und für

die nette gemeinsame Zeit – nicht nur im Labor.

Der CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH danke ich für die finanzielle Unterstützung

dieser Arbeit und für das stetige Interesse am Fortgang dieser Arbeit.

Mein Dank gilt auch Dr. John Kastelic und Rose Kastelic für die Anleitung zum

wissenschaftlichen Schreiben und die sprachliche Korrektur der beiden Manuskripte.

Ich danke Stephan Zeit für die freundliche Unterstützung bei der Bildbearbeitung.

Meinen Freunden danke ich für die vielen schönen Erlebnisse neben dem Studium und

der Doktorarbeit und dafür, dass sie in allen Lebenslagen für mich da sind!! Mela und

Stefan danke ich besonders für ihre Gesellschaft und die kulinarische Verpflegung

während des einen oder anderen Versuchs, für diverse PC-Rettungsaktionen und nicht

zuletzt fürs gelegentliche „Hundis-Leihen“. Liebe Nene, Dir vielen Dank für die

Fehlersuche!!

Von ganzem Herzen danke ich meinem Freund Peter für seine liebevolle Unterstützung,

seine unermüdliche Geduld und sein Verständnis in allen Höhen und Tiefen der

Doktorarbeitszeit. Vielen Dank, dass Du immer für mich da bist, mH!!

Mein abschließender und zugleich größter Dank gilt meinen Eltern für ihre moralische

und auch finanzielle Unterstützung während des gesamten Studiums und der

Anfertigung der Dissertation. Ebenso danke ich meinen Großeltern für ihren Beistand

und ihre Unterstützung während meiner gesamten Ausbildung.

Tierärztliche Hochschule Hannover · SDZ Sulfadiazin, sulfadiazine SF Sinus frontalis SI gesuchte...

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