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Transiente Elastographie und Fibrosemarker ermöglichen die Diagnose einer Leberbeteiligung bei pädiatrischen Mukoviszidosepatienten Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgelegt von Marion Uta Kügler aus Annaberg-Buchholz Gießen 2016

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Transiente Elastographie und Fibrosemarker ermöglichen die

Diagnose einer Leberbeteiligung bei pädiatrischen

Mukoviszidosepatienten

Inauguraldissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

des Fachbereichs Medizin

der Justus-Liebig-Universität Gießen

vorgelegt von

Marion Uta Kügler

aus Annaberg-Buchholz

Gießen 2016

Aus dem medizinischen Zentrum für Innere Medizin

Schwerpunkt Gastroenterologie

des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen

Leiterin: Univ.-Prof. Dr. med. Elke Roeb

1. Gutachter: Frau Univ.-Prof. Dr. med. Elke Roeb

2. Gutachter: Herr Univ.-Prof. Dr. Klaus-Peter Zimmer

Tag der Disputation: 11.07.2017

Inhaltsverzeichnis 1.  Einleitung .............................................................................................................. 1 

1.1 Allgemeines .......................................................................................................... 1 

1.2 Ziel der Arbeit ....................................................................................................... 2 

2.  Literaturübersicht ................................................................................................. 3 

2.1 Mukoviszidose ...................................................................................................... 3 

2.1.1 Genetische Grundlagen ................................................................................. 3 

2.1.2 Epidemiologie ................................................................................................ 5 

2.1.3 Klinik .............................................................................................................. 5 

2.1.4 Diagnostik ...................................................................................................... 6 

2.1.5 Therapie ........................................................................................................ 7 

2.1.6 Prognose ....................................................................................................... 9 

2.2 Leberbeteiligung in der Mukoviszidose ................................................................ 9 

2.2.1 Häufigkeit....................................................................................................... 9 

2.2.2 Ätiologie und Pathogenese .......................................................................... 10 

2.2.3 Risikofaktoren für die Entwicklung einer CFLD ........................................... 14 

2.2.4 Klinik ............................................................................................................ 16 

2.2.5 Diagnostik .................................................................................................... 18 

2.2.5.1 Etablierte Diagnostik .............................................................................. 18 

2.2.5.2 Neue nicht-invasive Diagnoseverfahren ................................................ 22 

2.2.6 Therapie ...................................................................................................... 23 

2.3 Transiente Elastographie ................................................................................... 26 

2.3.1 Aufbau des Gerätes..................................................................................... 26 

2.3.2 Funktionsweise des Gerätes ....................................................................... 27 

2.4 Biomarker als Laborparameter für den Nachweis einer Leberfibrose ................ 29 

2.4.1 Matrixmetalloproteinasen ............................................................................ 30 

2.4.2 Inhibitoren von Matrixmetalloproteinasen .................................................... 31 

2.4.3 Hyaluronsäure ............................................................................................. 32 

2.4.4 Prokollagen III.............................................................................................. 32 

2.4.5 YKL-40......................................................................................................... 33 

2.4.6 M30.............................................................................................................. 34 

2.4.7 M65.............................................................................................................. 34 

3.  Material und Methoden ...................................................................................... 35 

3.1 Patienten ............................................................................................................ 35 

3.1.1 Aufklärung der Patienten ............................................................................. 36 

3.1.2 Besonderheiten bei pädiatrischen Patienten ............................................... 36 

3.2 Geräte und Materialien ....................................................................................... 36 

3.2.1 Geräte.......................................................................................................... 36 

3.2.2 Chemikalien und Reagenzien ...................................................................... 37 

3.2.3 Verbrauchsmaterialien ................................................................................. 38 

3.2.4. kommerzielle ELISA-Kits ............................................................................ 38 

3.3 Methoden ........................................................................................................... 39 

3.3.1 Transiente Elastographie (TE) ..................................................................... 39 

3.3.2 Klinische Routinelaborparameter ................................................................ 40 

3.3.3 Bestimmung von Biomarkern zum Nachweis einer Leberfibrose mittels

ELISA ................................................................................................................... 40 

3.3.3.1 Der Sandwich-ELISA ............................................................................. 40 

3.3.3.2 Kompetitiver ELISA ............................................................................... 41 

3.3.4 Ethikvotum ................................................................................................... 41 

3.3.5 Statistische Analyse .................................................................................... 41 

4.  Ergebnisse und Auswertung ............................................................................. 43 

4.1 Patientencharakteristika ..................................................................................... 43 

4.2 Erhöhte Lebersteifigkeit bei pädiatrischen CF-Patienten mit Leberbeteiligung .. 45 

4.3 Expression von Fibrose-Biomarkern bei CF-Patienten mit Leberbeteiligung ..... 46 

4.4 Diagnostische Aussagekraft von TE und Fibrose-Biomarkern zur Feststellung

einer Leberbeteiligung bei CF .................................................................................. 53 

5.  Diskussion .......................................................................................................... 56 

5.1 Transiente hepatische Elastographie ................................................................. 57 

5.2 Fibrosemarker im Serum .................................................................................... 58 

5.2.1 Die Marker MMPs und TIMPs ......................................................................... 59 

5.2.2 Der Marker YKL-40 ......................................................................................... 61 

5.2.3 Weitere Fibrose-Biomarker ............................................................................. 63 

5.3 Kombinierte diagnostische Ansätze ................................................................... 67 

5.4 Limitationen der Studie ....................................................................................... 67 

5.4.1 Die Leberbiopsie vs. Utraschall (Standard) vs. TE .......................................... 68 

5.4.2 Die Herangehensweise bei Studien innerhalb und außerhalb Europas .......... 68 

5.4.3 Limitationen der TE ......................................................................................... 70 

5.5 Prävalenz und Inzidenz der CFLD in den verschiedenen Studien ..................... 71 

5.5.1 Prävalenz der CFLD in Abhängigkeit vom Alter und Geschlecht in einzelnen

Studien ..................................................................................................................... 71 

5.5.2 Herangehensweisen bei der Diagnosefindung CFLD im Vergleich................. 72 

5.6 Ausblick .............................................................................................................. 75 

6.  Schlussfolgerungen ........................................................................................... 77 

7.  Zusammenfassung ............................................................................................. 78 

8.  Summary ............................................................................................................. 79 

9.  Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 80 

10.   Darstellungsverzeichnis ..................................................................................... 82 

10.1 Abbildungsverzeichnis ...................................................................................... 82 

10.2 Tabellenverzeichnis .......................................................................................... 84 

11.   Literaturverzeichnis ............................................................................................ 85 

12.   Publikationsverzeichnis ................................................................................... 121 

13.   Anhang ............................................................................................................... 123 

13.1 Einwilligungserklärung der Patienten zur Teilnahme an der Studie ............... 123 

13.2 Patienteninformation ...................................................................................... 124 

13.3 Ethikvotum ...................................................................................................... 125 

13.4 Urkunde zur Durchführung der TE ................................................................. 126 

13.5 Durchführung des ELISA exemplarisch für TIMP-1 ....................................... 127 

14.   Erklärung zur Dissertation ............................................................................... 130 

15.   Danksagung ...................................................................................................... 131 

 

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1. Einleitung

1.1 Allgemeines

Die Mukoviszidose, auch zystische Fibrose (engl.: cystic fibrosis) (CF) genannt, ist eine

genetisch bedingte autosomal-rezessive angeborene Stoffwechselerkrankung [An

1946], [He 2010]. Der Begriff Mukoviszidose besteht aus folgenden Bestandteilen: Mu-

ko- (lat. mucus – Wortbildungselement mit der Bedeutung „Schleim“), -viszi- (lat. visci-

dus – „zähflüssig, klebrig“) und -ose (teilweise über neulat. –osis aus griech. –ōsis:

Endung weiblicher Substantive aus Medizin und Biologie mit der Bedeutung „krank-

hafter Zustand, Erkrankung“) [Du 1994]. Das Krankheitsbild Mukoviszidose wurde

erstmals 1938 als eigenständiges klinisches Syndrom beschrieben, indem es vom

Krankheitsbild der Zöliakie differenziert wurde [An 1938].

Der genetische Defekt, der dieser Krankheit zugrunde liegt, besteht in einem mutierten

Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-Gen. Dieses Gen

kodiert einen Chloridkanal. Durch die genetische Mutation kommt es zur Ausbildung

eines defekten Chloridkanals in allen exokrinen Drüsen. Von diesem genetischen De-

fekt sind hauptsächlich Lunge, Pankreas, Darm und Leber betroffen. Ein Teil der be-

troffenen Patienten entwickelt im Verlauf der CF eine Leberbeteiligung in Form einer

Leberfibrose, die zu einer fokal biliären Zirrhose (FBC) und später zu einer multilobulä-

ren biliären Zirrhose (MBC) fortschreiten kann. Diese sogenannte CFLD (Cystic Fibro-

sis Liver Disease) entwickelt sich meist im Laufe von Jahren oder Jahrzehnten. Um die

Progression von Fibrose zu Zirrhose aufzuhalten, ist es notwendig, betroffene Patien-

ten möglichst früh zu identifizieren.

Zur Diagnostik einer Leberbeteiligung existiert noch keine einheitliche Herangehens-

weise. Der Goldstandard zur Diagnose einer Leberfibrose besteht grundsätzlich in der

Leberbiopsie [Sch 2004]. Da allerdings die Form der Fibrose bei CF eher fokaler Natur

ist, wird die Leberbiopsie bei CF kontrovers diskutiert. Wenn es sich bei den be-

troffenen Patienten darüber hinaus um Kinder handelt, muss das Risiko-Nutzen-

Verhältnis bzw. die Zumutbarkeit noch intensiver abgewogen werden. Aufgrund dieser

Gesichtspunkte wurde begonnen, nach nicht-invasiven Verfahren zu suchen, die eben-

so gut in der Lage sind, eine Leberbeteiligung zu verifizieren. Eines dieser Verfahren,

das zurzeit evaluiert wird [Fr 2007], [Fr 2008], ist die transiente Elastographie (TE).

Dabei handelt es sich um ein ultraschallbasiertes Verfahren zur Messung der Le-

bersteifigkeit, aus deren Höhe die Konsistenz des Lebergewebes abgeleitet werden

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kann. Je härter das Gewebe, desto wahrscheinlicher ist eine Leberfibrose oder gar

-zirrhose.

Des Weiteren besteht die Möglichkeit, anhand von Parametern, die im Serum der

Patienten bestimmt werden, indirekt auf eine Fibrose der Leber zu schließen [Sc 1999].

Experimentell sind bereits sogenannte Fibrose-Biomarker in der Erforschung wie z.B.

Matrixmetalloproteinasen (MMPs), Chitinase-3-like Protein 1, auch Cartilage

Glycoprotein 39 oder YKL-40 genannt, oder die Inhibitoren der MMPs (Tissue inhibitor

of metalloproteinases - TIMPs), TIMP-1 und -2.

1.2 Ziel der Arbeit

Ziel dieser vorliegenden Doktorarbeit ist es, ein nicht-invasives Verfahren zur Identifi-

zierung einer Leberbeteiligung bei pädiatrischen Mukoviszidosepatienten zu evaluieren

und mittels Bestimmung von Routinelaborparametern und Fibrose-Biomarkern Er-

kenntnisse über das Vorliegen einer Leberbeteiligung bei CF-Patienten zu gewinnen.

Da es bisher an nicht-invasiven Verfahren zur Erkennung einer Lebererkrankung unter

anderem auch bei Patienten mit zystischer Fibrose mangelt, ist das Ziel, die nicht-

invasive Diagnostik zur Identifizierung von Lebererkrankungen zu verbessern.

1. Zunächst sollte mit Hilfe der transienten Elastographie (Fibroscan®, Echosens

Paris) die Evaluierung der Lebersteifigkeit erfolgen. Die Evaluierung sollte an

pädiatrischen Mukoviszidosepatienten vorgenommen werden.

2. Außerdem sollten mittels ELISA-Messungen verschiedene Fibrose-Biomarker

wie MMP-1, -2, -8, -9 und -13, TIMP-1 und TIMP-2, MMP-9/TIMP-1-Komplex,

Hyaluronsäure, Prokollagen III, YKL-40, M30 und M65 im vorliegenden pädia-

trischen Patientenkollektiv bestimmt werden.

3. Darüber hinaus sollte die diagnostische Aussagekraft bzw. der diagnostische

Nutzen der einzelnen Komponenten wie TE und Fibrose-Biomarker evaluiert

werden.

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2. Literaturübersicht

2.1 Mukoviszidose

2.1.1 Genetische Grundlagen

Der autosomal-rezessive Erbgang, der der CF zugrunde liegt, wurde 1946 entdeckt [An

1946]. 1983 folgte die Identifizierung des Chloridtransportes als grundlegender Defekt

bei CF. 1985 identifizierte man den langen Arm des Chromosoms 7 als Sitz des Gen-

defektes [Kn 1985]. Die zystische Fibrose ist eine komplexe Erbkrankheit, die sich

durch die Mutation in einem CFTR-Gen auszeichnet. Dieses Gen kodiert für einen

Chloridkanal. Die Klonierung des betreffenden Gens gelang 1989. Damit wurde der

grundlegende Defekt im cAMP-abhängigen Chloridkanal aufgezeigt.

Abb. 1: Der CFTR-Kanal (nach http://pflege-und-medizin.de/Atmung/ Mucoviszido-se/muc.jpg) (letzter Zugriff: 19.10.2015) [pf 2015] (mit freundlicher Genehmigung von PD Dr. Volker Schmieden)

Durch das Fehlen oder die Fehlfunktion dieses Chloridkanals kommt es zu einem Defi-

zit an intraluminalem Wasser und dadurch zu einer Akkumulation eines dicken und

hochviskösen Schleims sowie zur Obstruktion der exokrinen Drüsen [Co 2006]. Die

autosomal-rezessive Erkrankung besitzt einen hochvariablen Genotyp, Phänotyp und

ein hochvariables klinisches Erscheinungsbild [Co 2007].

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Das CFTR-Gen auf dem Chromosom 7 hat eine Länge von 250 kB und kodiert ein Pro-

tein aus 1480 Aminosäuren, CFTR [Ke 1989], [Cy 1993], [Wi 1995], [And 1991]. Dieses

Protein besteht aus zwei transmembranären Domänen, aus zwei nukleotid-bindenden

Domänen [He 2010] und aus einer einzigen regulatorischen Domäne, welche als ein

cAMP-abhängiger Chloridkanal fungiert [Fer 2001], [He 2010]. Infolgedessen gehört

CFTR zur Familie der ATP-binding cassette (ABC) Transporter (Unterfamilie C, Num-

mer 7; ABCC7) [He 2010], [Row 2005].

CFTR ist auf der apikalen Membran von sekretorischen und absorbierenden Epithelzel-

len lokalisiert. Betroffen sind überwiegend die exokrinen Drüsen von Lunge, paranasa-

len Sinus [Bo 2007], [nl 2012], Pankreas und Darm, genauso wie die Schweißgänge,

Gallengänge und die Samenleiter bei Männern [Wi 2008], [He 2010], [Ke 1989], [Ri

1989], [Rom 1989]. Außerdem ist CFTR für die Aufrechterhaltung der Flüssigkeitsbi-

lanz über den Epithelzellen verantwortlich [Co 2006].

Im Jahr 2000 sind mehr als 850 verschiedene Allele, die der Krankheit zugrunde

liegen, und im Jahr 2008 1.500 verschiedene Mutationen des CFTR-Gens beschrieben

worden [Zi 2000], [Far 2008]. Bis heute sind bereits mehr als 1.900 Mutationen des

CFTR-Gens bekannt (http:// www.genet.sickkids.on.ca/ cftr/StatisticsPage.html).

Das häufigste von mehr als 1.000 verursachenden Allelen entspricht einer spezifischen

Deletion von drei Basenpaaren im Exon 10, die zu einem Verlust der Aminosäure Phe-

nylalanin in Position 508 des Produktes des CF-Gens führt. Diese Mutation (∆F508)

macht 70% aller bekannten Mutationen aus [Ke 1989], [Cy 1993], [Wi 1995], [And

1991], [Fer 2001].

Des Weiteren werden die Mutationen in sechs verschiedene Klassen eingeteilt, um den

Genotyp besser dem Phänotyp zuordnen zu können. Diese Einteilung richtet sich nach

den molekularen und funktionellen Konsequenzen, die durch die Mutation entstehen

und damit durch den Defekt im CFTR ausgelöst werden. Bei Klasse-I-Mutationen wird

entweder keine CFTR-mRNA oder kein funktionelles CFTR-Protein gebildet wie bei

Nonsense- und Frameshiftmutationen oder bei Mutationen an den Spleißstellen. Bei

Mutationen der Klasse II wie z.B. die Mutation ∆F508 wird CFTR-mRNA hergestellt,

aber es entsteht ein fehlgefaltetes Protein, welches intrazellulär abgebaut wird und

somit nicht zur apikalen Seite der Zellmembran transportiert werden kann. Klasse-III-

Mutationen stellen einen Regulationsdefekt dar. Es entsteht ein Rezeptor, der in die

apikale Zellmembran eingebaut wird. Dieser reagiert allerdings nicht auf die cAMP-

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Stimulation. Bei der Klasse-IV-Mutation handelt es sich um einen Kanaldefekt. Hier

wird ein Protein mit gestörter Funktion hergestellt, woraus eine abnormale Anionenleit-

fähigkeit folgt. Bei Klasse-V-Mutationen wird nur eine reduzierte Anzahl an Rezeptoren

hergestellt und an der apikalen Seite der Membran eingebaut. Die reduzierte Anzahl an

Rezeptoren kommt entweder durch eine zu geringe Synthese oder durch eine defekte

Prozessierung der CFTR-mRNA zustande. Klasse-VI-Mutationen kommen dadurch

zustande, dass durch den vorzeitigen Abbruch des C-Terminus von CFTR ein funktio-

nelles aber instabiles Protein hergestellt wird [Wi 1995], [Wi 2008].

2.1.2 Epidemiologie

Mit einer Häufigkeit von 1:2.500 - 1:3.000 Neugeborenen weltweit ist die CF die häu-

figste bekannte genetische Erkrankung in der kaukasischen Bevölkerung [Wi 2008],

[Co 2006], [Co 2007], [He 2010]. Die Frequenz der verschiedenen Mutationen variiert

signifikant zwischen den einzelnen ethnischen Bevölkerungsgruppen [Mo 2009].

2.1.3 Klinik

Das Krankheitsbild CF stellt ein klinisches Syndrom dar, da multiple Organsysteme

Pathologien durch den Defekt im CFTR-Gen aufweisen [Da 2006], [Wi 2008]. Aufgrund

der in vielen Epithelien vorkommenden Expression von CFTR gestaltet sich das kli-

nische Erscheinungsbild vielfältig. Die Ausprägung der CF ist zum Teil abhängig von

der Art der Mutation, die der Patient aufweist [Wi 2008]. Die Expression des Phänotyps

ist sehr heterogen, im Hinblick auf das Ausmaß der Krankheit und die beteiligten Orga-

ne [Co 2007].

Der Defekt im CFTR-Gen kann zu einer erhöhten Chloridkonzentration im Schweiß, zu

einer Lungenerkrankung durch bakterielle Infektionen und Bronchiektasen, zu Pan-

kreasinsuffizienz, Darmobstruktion, biliärer Zirrhose und kongenitalem bilateralen Ver-

kleben der Vas deferens führen. Häufig treten diese Auffälligkeiten in Kombination auf

[Ke 1989], [Ri 1989]. Die meisten Manifestationen der CF sind bezogen auf die Un-

fähigkeit des Drüsenganglumens, Makromoleküle adäquat zu hydratisieren, was die

Bildung von viskösem Schleim und eine Verstopfung der Drüsengänge zur Folge hat

[Fer 2001].

Erste Symptome können schon bei Neugeborenen auftreten. Dazu zählen u.a. ver-

zögerte Gewichtszunahme, verlangsamtes Wachstum (auch im Verlauf der weiteren

Kindheit), keine Stuhlgänge in den ersten 24-48 Lebensstunden und salzig schme-

ckende Haut. Des Weiteren können Symptome im Zusammenhang mit der Darmtätig-

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keit auftreten. Diese beinhalten Gewichtsabnahme, Übelkeit, Appetitlosigkeit, Bauch-

schmerzen durch schwere Darmträgheit, gesteigerte Gasbildung und Blähungen (ge-

schwollenes, geblähtes Abdomen) und übelriechende farblose oder lehmfarbige Stühle

mit Schleim oder auch als Diarrhoe. In der Lunge und den Nasennebenhöhlen (NNH)

können folgende Symptome auftreten: Husten oder vermehrter Schleim in Lunge und

NNH, Müdigkeit, nasale Polypen, rezidivierende Pneumonien (Fieber, vermehrter

Husten, vermehrte Atemnot, Appetitverlust, vermehrtes Sputum), Schmerzen oder

Druck über den NNH aufgrund von Infektion oder Polypen. Später werden meist noch

weitere Symptome beobachtet wie Infertilität bei Männern, rezidivierende Pankreatiti-

den und respiratorische Symptome [nl 2012].

Mögliche Komplikationen der CF sind sehr vielfältig. Die häufigste stellt die chronische

respiratorische Infektion dar, gefolgt von intestinalen Problemen wie Gallensteine, in-

testinale Obstruktion und Rektalprolaps, Hämoptysen, chronisch respiratorische In-

suffizienz, Diabetes mellitus, Infertilität, Leberbeteiligung oder auch Leberinsuffizienz

(biliäre Zirrhose), Pankreatitis, Malnutrition, nasale Polypen und Sinusitis, Osteoporose

und Arthritis, rezidivierende Pneumonien, Pneumothorax und Cor pulmonale [nl 2012].

2.1.4 Diagnostik

1953 wurde der Defekt in der Elektrolytzusammensetzung des Schweißes entdeckt

[Dis 1953], woraufhin 1959 ein diagnostischer Test, der Schweißtest, unter Nutzung

der Pilocarpin-Iontophorese Technik entwickelt wurde. Dieser Test arbeitet mit der er-

höhten Chloridkonzentration im Schweiß und man konnte nun auch mildere Fälle von

CF z.B. bei Patienten ohne Pankreasinsuffizienz identifizieren [Gi 1959]. Man stellte die

Diagnose CF bei einer Chloridkonzentration im Schweiß von 60 mVal/l oder höher und

einem Geschwister oder einem Cousin ersten Grades mit CF oder bei einer Lungener-

krankung mit passendem klinischen Bild oder bei Pankreasinsuffizienz [Da 1984]. Um

die Aussagefähigkeit des Schweißtestes zu erhöhen, sollte dieser nur in Funktions-

laboren durchgeführt werden, die dafür standardisiert sind. Zudem sollte dieser Test

grundsätzlich wiederholt werden, wobei zu beachten ist, dass erst zwei positive Test-

ergebnisse die Diagnose rechtfertigen. Darüber hinaus wurden altersspezifische Re-

ferenzintervalle für die Chloridwerte im Schweiß etabliert, wodurch die Aussagekraft für

die Diagnose von CF weiter verbessert werden konnte [Mi 2008].

Einige CF-Patienten weisen normale Chloridkonzentrationen im Schweiß auf. Bei die-

sen muss eine umfangreichere Diagnostik betrieben werden wie z.B. der Test auf

Azoospermie bei Männern (fast alle männlichen CF-Patienten leiden an Azoospermie),

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die Untersuchung der Funktion von Leber und Gallenblase, die Identifizierung einer

Pansinusitis, die Nachweise von intestinaler Obstruktion oder Messung der nasalen

Potentialdifferenz (NPD) [Ste 1982]. Im Jahr 1981 wurde nachgewiesen, dass die NPD

bei Patienten mit CF im Vergleich von gesunden und erkrankten Kontrollpersonen ge-

stört ist. Es wurde festgestellt, dass die Natriumreabsorption einen festen Bestandteil

der CF-Erkrankung darstellt [Kno 1981]. Die NPD-Messung kann daher als klinischer

Test verwendet werden. Patienten mit CF haben eine erhöhte Natriumreabsorption und

eine reduzierte Chloridsekretion als Reaktion auf die cAMP-Stimulation.

Seit der Entdeckung des CF-Gens 1989 [Ke 1989], [Ri 1989], [Rom 1989] besteht die

Möglichkeit, die Diagnose mit Hilfe der direkten Identifizierung von zwei mutierten CF-

Allelen zu stellen. Es gibt kommerzielle Tests für die 86 häufigsten Allele. Ca. 93 % der

CF-Patienten können damit identifiziert werden. Des Weiteren ist in vielen Ländern ein

Neugeborenenscreening zur frühzeitigen Diagnose von CF etabliert [Com 2007]. Bei

diesem Screening werden immunreaktive Trypsinwerte im Blut gemessen, das direkt

nach der Geburt abgenommen wird. Diese Werte sind bei Patienten mit CF erhöht

[Dav 1984]. Um falsch positive Messungen auszuschließen, wird bei einem positiven

Test auch ein Screening auf CF-Mutationen oder ein zweiter immunreaktiver Trypsin-

test durchgeführt. Die definitive Diagnose kann indes nur mittels Schweißtest oder

Identifizierung zweier mutierter Allele gestellt werden [Da 2006].

Um die Diagnose möglichst sicher und genau stellen zu können, sollte eine Kombina-

tion aus den genannten diagnostischen Tests verwendet werden [Cast 2009].

2.1.5 Therapie

Eine frühzeitige Diagnose der CF und ein umfangreicher Therapieplan können das

Überleben und die Lebensqualität verbessern [nl 2012]. Seit Mitte der 1950er Jahre

werden CF-Patienten in spezialiserten Zentren behandelt um eine bessere Betreuung

und Therapie zu ermöglichen [Da 2006]. Im Jahr 1964 wurde eine aus drei Säulen be-

stehende Behandlung der CF etabliert: ausreichende Ernährung, Linderung der Atem-

wegsobstruktion und antibiotische Therapie von Lungeninfektionen [Ma 1964], [Da

2006]. Dadurch verbesserten sich die Lebenserwartung und die Lebensqualität der

Patienten. Bis heute ist eine aggressive Therapie das Grundprinzip der Behandlung.

Im Jahr 1955 wurde die „Cystic Fibrosis Foundation“ gegründet. Es wurde ein Netz-

werk aus spezialisierten Zentren aufgebaut um eine evidenzbasierte Betreuung der

Patienten in hoher Qualität zu gewährleisten [Da 2006]. In diesen Zentren erfolgt eine

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interdisziplinäre Therapie durch Spezialisten, um der Tatsache Rechnung zu tragen,

dass zahlreiche Organe der Patienten von der Krankheit beeinträchtigt werden [Da

2006]. Verlaufskontrolle und Überwachung sind sehr wichtig. CF-Patienten sollten in

spezialisierten Zentren für Kinder bzw. für Erwachsene betreut werden.

Derzeit werden folgende Therapiemöglichkeiten vorgenommen: zur Behandlung der

Lunge werden Antibiotika per os, intravenös oder per inhalationem zur Prävention und

Therapie von Lungen- und NNH (Nasennebenhöhlen) -Infektionen verabreicht. Des

Weiteren verwendet man inhalative Medikamente zur Öffnung der Atemwege, das En-

zym DNAse um den Schleim zu verdünnen und zur Erleichterung des Abhustens und

hypertonische Salzlösungen. Darüber hinaus sollten CF-Patienten jährlich gegen

Grippe und Pneumokokken geimpft werden. Weitere Optionen sind, wenn notwendig,

die Sauerstofftherapie und eine Lungentransplantation. Zur Lockerung des Schleims

werden auch verschiedene physiotherapeutische Behandlungen durchgeführt. Zur

Therapie der Darm- und ernährungsbedingten Probleme werden Pankreasenzyme

sowie Vitamine (besonders Vitamin A, D, E und K) zugeführt. Darüber hinaus kommt

eine spezielle proteinreiche und hochkalorische Diät zur Anwendung [nl 2012].

CF-Patienten müssen auch in ihrem persönlichen Umfeld einiges beachten. Es sollten

Rauch, Staub, Schmutz und weitere Luftunreinheiten vermieden werden. Mehrfach am

Tag muss mit Hilfe von Inhalation, Vibration und Abklopfen der Brust und weiteren Ver-

fahren eine Reinigung der Atemwege und ein Abhusten des Schleims erfolgen, es

muss reichlich Flüssigkeit zugeführt werden und es sollte zwei bis drei Mal in der

Woche Ausdauersport betrieben werden, wie Laufen, Schwimmen oder Radfahren [nl

2012].

Durch das heutzutage verbesserte Verständnis der zugrunde liegenden Pathologie der

CF ist die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien möglich. Diese zielen auf die Kor-

rektur des zugrunde liegenden Defekts im CFTR-Protein oder die Verbesserung der

Effekte der gestörten CFTR-Funktion ab. Dabei werden drei Herangehensweisen ver-

folgt:

1. pharmakologische Verhinderung des CF-abhängigen Ionentransportdefektes

mit Hemmung der exzessiven Natriumreabsorption und steigender Chloridsek-

retion;

2. Nutzung allelspezifischer Therapien um spezifische Defekte der mutierten Form

von CFTR zu korrigieren wie bei Medikamenten, die die Herstellung von ∆F508

verbessern oder bei Medikamenten, die frühere Stopcodons fördern und

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3. Nutzung von Gentherapie, indem eine normale Kopie des CF-Gens in die jewei-

ligen Zellen eingebracht wird [Da 2006].

Derzeit befinden sich einige neue Medikamente zur Behandlung von CF in Phase I-III

Studien. Diese schließen hyperosmolare Mittel ein, die entworfen wurden um den Fluss

von Wasser durch das Lungengewebe zu fördern, Salzmodulatoren, die andere Chlo-

rid- oder Natriumkanäle in der Lunge modulieren und Medikamente, entworfen zur Re-

paratur des geschädigten CFTR-Proteins [Sto 2008]. PTC 124, ist ein weiteres zur Zeit

in Phase II Studien getestetes Pharmakon, ein oral bioverfügbares kleines Molekül,

welches zum Anregen von Ribosomen während der mRNA Translation konzipiert wur-

de, selektiv vorzeitige Stopcodons „überliest“ und damit überwiegend funktionelle

CFTR produzieren lässt [Ker 2008]. PTC 124 supprimiert durch diese Wirkungsweise

Nonsensmutationen.

Eine weitere Studie hat gezeigt, dass Kinder mit CF niedrigere Serumwerte von Insulin-

like growth factor-I (IGF-I) aufweisen, als für ihre normale Wachstumshormon-(GH)-

produktion zu erwarten wäre. Weiterhin ist bei Kindern mit CF die Antwort auf endoge-

nes GH vermindert [Mo 2009].

2.1.6 Prognose

Im Jahr 1938, als das Krankheitsbild CF entdeckt wurde, betrug die Lebenserwartung

nur sechs Monate [Da 2008]. Im Laufe der Jahre verbesserte sich diese, da immer

mehr Erkenntnisse über das Krankheitsbild CF entdeckt und bekannt wurden und so-

mit bessere Möglichkeiten der Diagnostik und Therapie entwickelt wurden [Da 2006].

Bedingt durch die frühere Diagnose der Krankheit und die verbesserte unterstützende

Behandlung stieg die durchschnittliche Lebenserwartung im Jahr 1985 auf 25 Jahre

und in den letzten Jahren auf 37 Jahre an [Bo 2007], wobei heute fast ein Alter von 40

Jahren erreicht werden kann [Da 2006], [Wi 2008]. Auf Grundlage dieser Entwick-

lungen ist anzunehmen, dass Kinder, die heute geboren werden, ein Alter von 50

Jahren erreichen könnten [He 2010].

2.2 Leberbeteiligung in der Mukoviszidose

2.2.1 Häufigkeit

Die CF-assoziierte Lebererkrankung (CF-associated Liver Disease – CFLD) ist eine

relativ häufige und frühe Komplikation der Krankheit CF und verantwortlich für 2,5 %

der Gesamtmortalität der Patienten. Sie repräsentiert somit den dritthäufigsten Grund

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für den Tod von CF-Patienten nach pulmonalen und Transplantationskomplikationen

[Mo 2009], [Co 2006]. Insgesamt ist rund ein Drittel der CF-Patienten von einer CFLD

betroffen [Co 2007]. Deren Entstehung ist bisher nicht hinreichend erforscht, jedoch

wurde in verschiedenen Studien nachgewiesen, dass bei 2-10 % [Di 2001], [He 2010],

[Me 2010] der Patienten, eine Entwicklung zur multilobulären Zirrhose stattfindet, die

zu lebensbedrohlichen Komplikationen führen kann. Somit kann man festhalten, dass

das Risiko für Mortalität bei CFLD-Patienten höher ist, als bei den CF-Patienten, die

keine Leberbeteiligung aufweisen [Rowl 2015].

Die Prävalenz der CFLD ist aufgrund der Tatsache, dass es keine sensitiven und spe-

zifischen diagnostischen Marker für die CFLD gibt, nicht eindeutig feststellbar. In Ab-

hängigkeit von der Methodik, die den einzelnen Studien zugrunde gelegt wird, werden

unterschiedliche Anhaltspunkte der Prävalenz gesetzt [Di 2001], [Co 2006], [Co 2007].

Querschnittstudien, in denen die CFLD aktiv unter Nutzung von biochemischer und

ultrasonographischer Beurteilung gesucht wird, haben eine Prävalenz von 18-37 %

geliefert [Co 1994]. Prospektive Studien haben eine kumulative Inzidenz der CFLD von

27-35 % ohne inzidente Fälle nach dem Alter von 18 Jahren ermittelt [Li 1999], [Co

2002]. Folglich ist die CFLD eine relativ frühe Komplikation bei CF – in der Mehrheit

der betroffenen Patienten wird die CFLD in der Kindheit am Ende der ersten Le-

bensdekade klinisch apparent, kann sich aber früher entwickeln, insbesondere bei Pa-

tienten mit Mekoniumileus [Li 1999], [Co 2002].

Weitere Studien zur Prävalenz der CFLD deuten an, dass sich die klinisch eindeutige

CFLD gewöhnlich in der Pubertät oder davor entwickelt, und dass die CFLD eine Prä-

valenz von 13-17 % hat. Das Auftreten einer isolierten Hepatomegalie lässt nicht

zwangsläufig auf eine fortgeschrittene CFLD schließen. Die Hepatomegalie tritt näm-

lich bei 6-30 % der CF-Patienten auf, und ist damit doppelt so häufig wie die CFLD [Li

1999], [Co 2002], [Wi 1999], [Di 2001].

Eine Steatosis hepatis ist die häufigste hepatobiliäre Komplikation bei CF, sie tritt, je

nach Studie bei 23-67 % oder bei bis zu 75 % der Patienten auf [Li 1999], [Chen 2005].

2.2.2 Ätiologie und Pathogenese

Die CFLD zeigt einen langsamen progressiven und häufig asymptomatischen Verlauf

[Li 1999], [Co 2002], [Wi 1999], [Di 2001]. Die Pathogenese stellt sich multifaktoriell mit

einer variablen Beteiligung von umweltbedingten und genetischen Determinanten dar

[Co 2006], [Co 2007].

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Es existiert ein weites Spektrum an hepatobiliären Komplikationen bei CF. Dazu zählen

Steatosis, fokale biliäre Zirrhose (FBC), multilobuläre biliäre Zirrhose (MBC), Mikrogal-

lenblase, aufgetriebene Gallenblase, Cholelithiasis, intrahepatischer Schlamm, Kom-

pression des Hauptgallenganges durch das Pankreas und das Cholangiokarzinom [Wi

2008], portale Hypertension, neonatale Cholestase und sklerosierende Cholangitis [He

2010].

2.2.2.1 Die Entstehung der Fibrose und Zirrhose in der Leber

Die Fibrose in der Leber, ähnlich zu der in anderen Organen beobachteten, ist eine

Antwort der Wundheilung, die nach Gewebeschädigung auftritt [No 2011]. Das Endsta-

dium der CFLD äußert sich überwiegend in einer FBC als eine pathognomonische Le-

bermanifestation. Diese kann man bei einem Drittel der CF-Patienten beobachten [Mo

2009], [So 1999]. Es wird angenommen, dass diese biliäre Zirrhose in Verbindung mit

dem Basisdefekt von CF steht [St 2005], [Ki 2000], [Co 2004], [Di 2001].

Die FBC und die MBC entstehen durch eine Blockade der kleinen Gallengänge mit

dickem eosinophilen PAS-positiven (durch Periodic acid-Schiff Reaktion nachge-

wiesen) Material und führen somit zu einer biliären Obstruktion durch visköse Schleim-

sekretion. Daraus resultiert anschließend eine periduktale Inflammation und Gallen-

gangsepithelproliferation, welche zu einer progressiven periportalen Fibrose [Mo 2009],

[So 1999] führen. Dies ist aufgrund der Ausdehnung der Erkrankung von einer inital

fokalen Leberfibrose zu einer MBC und zu portaler Hypertension klinisch sehr bedeut-

sam [Co 2004], [Da 2006], [Fer 2001].

Die Progression von FBC zu MBC und zu portaler Hypertension, welche bei bis zu 8 %

der Patienten auftritt, kann Jahre bis Jahrzehnte dauern und sollte als ein Kontinuum

gesehen werden [So 1999].

Die CFLD ist in der Anwesenheit eines fehlerhaften CFTR-Proteins im Gallengangsys-

tem begründet. Das normale CFTR-Protein spielt eine Schlüsselrolle bei der Sekretion

der Gallenflüssigkeit und deren Regulierung. CFTR wird ausschließlich auf der apika-

len Oberfläche der Gallengangsepithelzellen, den Cholangiozyten und den Epithelien

der Gallenblase exprimiert. Dieses Protein existiert nicht in Hepatozyten oder anderen

Leberzellen [Di 2001], [Ki 2000], [Co 2006], [Mo 2009]. CFTR formt einen cAMP-

abhängigen Kanal mit niedriger Leitfähigkeit, der Cl--Ionen von der Zelle ins Lumen des

Gallengangs befördert [Co 2006], [Di 2001]. Es reguliert die Flüssigkeit und den Gehalt

an Elektrolyten in der Galle [He 2010].

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Der Reaktionsmechanismus und die Funktionsweise von CFTR laufen wie folgt ab:

Durch die Bindung von Sekretin an Rezeptoren auf der basolateralen Seite der Chol-

angiozyten erhöht sich der intrazelluläre cAMP-Wert [Lev 1976]. Dadurch wird CFTR

aktiviert, wodurch der Cl--, HCO3-- [Al 1993] und der H2O-Transport stimuliert werden.

Ein negatives Potential und ein osmotischer Gradient werden über der Zellmembran

erzeugt, sodass Natrium über die Zellmembran und Wasser aus der Extrazellular-

flüssigkeit in das Lumen des Gallenganges befördert werden [Co 2006], [Di 2001]. Der

Wechsel des apikalen Chloridgradienten und der Aufbau der Cl--Ionen im Lumen för-

dert den Bicarbonationen (HCO3-)-Transfer von der Zelle ins Lumen durch die

Cl-/HCO3--Austauscherpumpe, die dadurch die Alkalisation der Gallenflüssigkeit unter-

stützt [Be 2010]. Durch diesen Prozess wird die Alkalität und Verdünnung der Gallen-

flüssigkeit reguliert [Fer 2001]. Diese Alkalität ist erforderlich für die Verdauungsfunk-

tion und die Löslichkeit der organischen Bestandteile der Gallenflüssigkeit [Di 2001].

Das Fehlen oder die Fehlfunktion von CFTR induziert wahrscheinlich eine Kaskade

von fehlerhafter Sekretin/cAMP-aktivierter Cl-- und HCO3--Sekretion, welche zu ver-

mindertem Gallenfluss führt, die Alkalität der Gallenflüssigkeit reduziert und schließlich

eine Verstopfung der intrahepatischen Gallengänge durch abnormal eingedickten

Schleim verursacht [Co 2006], [Qu 2008]. Durch die intrahepatische Obstruktion und

Verstopfung der Gallengänge mit dickem Sekret werden die Cholangiozyten und He-

patozyten geschädigt. Diese Sequenz findet unter Freisetzung von Zytokinen und

Wachstumsfaktoren statt und mündet in einer Aktivierung der hepatischen Sternzellen,

die zur Kollagensynthese stimuliert werden. Diese Kollagenablagerungen führen letzt-

endlich zu der Entwicklung einer FBC, die zu einer MBC führen kann [Mo 2009], [Fer

2001], [Di 2001].

Die Schädigung der Gallengangsendothelien ist vermutlich das erste Stadium in der

Entwicklung einer periportalen Fibrose. Histologisch wird dies nachgewiesen durch

ultrastrukturelle Anomalien der Cholangiozyten mit unregelmäßigen Formen der

Zellen, Nekrose und periduktulärer Kollagenablagerung [Li 1992]. Es ist anzunehmen,

dass diese Läsionen das anatomische Pendant der jahrelangen Schädigung im duk-

tulären Gallefluss repräsentieren, der die Anfälligkeit des biliären Epithels steigern

kann, durch Detergenzien in Form von endogenen Gallensäuren beeinträchtigt und

durch infektiöse Agentien geschädigt zu werden [Co 2006]. Die Entwicklung der Leber-

fibrose ist charakterisiert durch vermehrte Ablagerung von strukturellen Komponenten

der extrazellulären Matrix (ECM) wie verschiedenen Kollagentypen, Proteoglykanen,

strukturellen Glykoproteinen und Hyaluronsäure (HA) [No 2011].

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Allgemein finden sich bei der Leberfibrose im Wesentlichen qualitative und quantitative

Veränderungen der ECM. Diese Änderungen entstehen infolge der Regulation der Mat-

rixmetalloproteinasen (MMPs) und ihren spezifischen Inhibitoren (TIMPs). Diese kon-

trollieren die Expression und Ablagerung von verschiedenen Bestandteilen der ECM

[Her 2011], [Fri 2010], [Fri 2006]. Einige andere Zelltypen wie Makrophagen (Kupffer-

sche Zellen), Lymphozyten, Endothelzellen, aus dem Knochenmark abgeleitete Vorläu-

ferzellen, portale Fibroblasten und gegebenenfalls andere Zelltypen spielen ebenso

eine Rolle in der Fibrogenese [Her 2011], [Kis 2008], [Duf 2005], [Wy 2010].

Die periportale Fibrose ist geprägt von fibröser Expansion der Portalfelder mit Fibrose,

die sich entlang der terminalen zentroazinären Portalvenen ausdehnt. Es wird das Auf-

treten einer Fibrose der Sternzellen angenommen [Ram 2004].

Während der Fibrogenese bewirkt die Leberschädigung Inflammation, Aktivierung und

Proliferation von hepatischen Sternzellen (HSCs), die die Remodellierung der ECM

kontrollieren und koordinieren [Her 2011], [Fri 2010], [Fri 2006]. Die Umwandlung der

ansässigen HSCs vom ruhenden in den aktivierten Zustand (myofibroblastic-like Zel-

len) ist ein kritischer Bestandteil in der Leberfibrogenese. Außerdem trägt die Produk-

tion von TGF-ß durch die Gallengangsepithelzellen zur Aktivierung der HSCs bei [Lew

2002]. In der normalen Leber sind die HSCs im Disséraum ansässig und sind haupt-

sächlich Speicherungsorte von Vitamin A. Im Rahmen der bedeutendsten funktionellen

Veränderungen in Verbindung mit der Aktivierung der HSCs ist ein signifikanter Anstieg

in der Sekretion von ECM-Proteinen zu verzeichnen, der vermutlich verantwortlich für

die übergreifende fibrogenetische Reaktion ist [No 2011]. Die Ablagerung der ECM im

Disséraum und die Erzeugung subendothelialer Basalmembranen führen zu einem

reduzierten Blutfluss durch das Organ, Strangulierung von in der Nähe befindlichen

Hepatozyten und Beeinflussung der Ausscheidungsfähigkeit aller Leberzellen [No

2010].

Andere Mechanismen verschärfen das Problem. Eine CFTR-abhängige gestörte Sek-

retion von Proteinen wie Muzin, die durch ansteigende Sekretion von Chondroitinsulfat

nachgewiesen wird, führt zur Obstruktion der kleinen Gallengänge und trägt ebenfalls

zu einer Erhöhung der Viskosität der Galle bei [Meh 2005], [Bh 1998], [Di 2001]. Die

Aktivität der freien Radikale kann auf diese Weise in der abnormalen Galle erhöht wer-

den. Die biliäre Stase kann die Anfälligkeit des Gallengangsepithels für infektiöse

Agentien und toxische Komponenten, die in die Galle ausgeschieden werden, erhöhen.

Die Ansammlung hydrophiler toxischer Gallensäuren kann die direkte Schädigung der

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Hepatozyten auslösen [Di 2001]. Dies führt ebenfalls zu einer Verstopfung der Gallen-

gänge mit eosinophilem Material, welches unter der frühen histologischen Umwand-

lung des Gewebes bei Kleinkindern und Kindern mit CF gefunden wurde [Op 1975].

Der Gesamteffekt des fehlerhaften CFTR besteht darin, dass dickere, weniger alkali-

sche Gallenflüssigkeit im Gallengangsystem akkumuliert [Ba 1997], damit die Gallen-

gänge verstopft und den Trigger für den Beginn einer Fibrose liefert. CFTR reguliert

auch andere transmembranäre Ionenaustauscher wie die Na+/H+-Pumpe [Ba 1997].

Ein regulatorischer Faktor der Na+/H+-Pumpe, wenn er überexprimiert wird, kann CFTR

mit ∆F508 so umverteilen, dass mehr Chloridsekretion erfolgen kann und somit die

jeweilige Flüssigkeit weniger viskös ist [Fa 2009].

Andere calciumabhängige und G-Protein-gekoppelte Chloridkanäle im apikalen Gal-

lengangsepithel können teilweise den sekretorischen Defekt der Leber aufgrund des

fehlerhaften CFTR-Proteins kompensieren und als Umgehung des sekretorischen De-

fektes bei CF dienen [Fer 2001], [Di 2001].

Hepatobiliäre Manifestationen treten fast ausschließlich bei CF-Patienten mit schweren

Klasse I-III Mutationen [Mc 2003] auf, betreffend die CFTR-Synthese, -Prozessierung

und -Regulation. Es gibt allerdings keine klaren Verbindungen zwischen Phänotyp und

spezifischen CFTR-Mutationen [He 2010]. Genetische Tests zur Vorhersage einer Le-

berbeteiligung bei CF-Patienten sind dementsprechend nicht sinnvoll. Es ist unklar,

warum nur eine Minderheit der Patienten mit den gleichartigen schweren CFTR-

Mutationen eine CFLD entwickelt [He 2010].

Es gilt, herauszufinden, aus welchen Gründen die CFLD unterschiedlich stark ausge-

prägt ist [Co 2007]. Tatsächlich wird die CFLD derzeitig als erste vererbbare Leberer-

krankung betrachtet, die durch eine gestörte sekretorische Funktion des Gallen-

gangsepithels zustande kommt. Es ist bislang nicht bekannt, weshalb lediglich ein Drit-

tel der CF-Patienten von der CFLD betroffen ist. Nur bei einer Minderheit von Patien-

ten, meist im Kindesalter, stellt die CFLD und ihre ungewöhnlich schnelle Progression

das klinische Hauptproblem dar [Co 2006].

2.2.3 Risikofaktoren für die Entwicklung einer CFLD

Die Entwicklung einer CFLD scheint auf Patienten mit einem Genotyp, der eine beson-

ders schwere Ausprägung der Erkrankung CF verursacht, beschränkt zu sein. Den-

noch ist mit dem Vorhandensein und der Schwere der CFLD keine spezifische CFTR-

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Mutation assoziiert. Eine multifaktorielle Pathogenese ist naheliegend [Co 1994], [Wi

1999].

Obwohl die CFLD fast ausschließlich bei CF-Patienten mit schweren Klasse I-III Muta-

tionen in CFTR auftritt, gibt es keinen Beweis einer Beziehung zwischen Phänotyp und

spezifischer Mutation [Mo 2009]. Modifizierende Gene wie ein Polymorphismus in Ge-

nen, die Inflammation, Fibrose oder oxidativen Stress hochregulieren, scheinen die

Anfälligkeit zur Entwicklung dieser Läsionen zu übertragen [Wi 1999], [Wi 2007], [He

2010].

Neben den genetischen Faktoren spielen auch Umwelteinflüsse eine wesentliche Rolle

bei der Entwicklung der CFLD. Ein schlechter Ernährungsstatus, antioxidative Defi-

zienz, Noncompliance und chronische medikamentöse Hepatotoxizität können den

biliären sekretorischen Defekt und die Leberschädigung verschlechtern. Virale Hepati-

tiden, abdominale Operationen und ausschließliche parenterale Ernährung können die

CFLD ebenfalls negativ beeinflussen [Co 2006].

Auf der anderen Seite hat ein diskordantes Erscheinungsbild der Leber bei CF-

Geschwistern, bei denen gleiche umweltbedingte Faktoren zu vermuten sind, angedeu-

tet, dass die klinische Ausprägung der CFLD durch genetische Faktoren, die unabhän-

gig vom CFTR-Gen vererbt werden, moduliert werden kann [Cas 2001]. Zu einem

früheren Zeitpunkt erhobene Daten bezüglich genetischer Modifikatoren für CFLD lie-

ßen auf eine komplexe multigenetische Vererbung mit möglicher Interaktion von ver-

schiedenen Kandidatengenen (wie α1-Antitrypsinmangel oder α1-Antiprotease (SER-

PINA 1) , TGF-β-1, mannosebindendes Lectin 2 und Glutathion S-Transferase, Angio-

tensin converting enzyme (ACE)) schließen [Co 2006], [Cast 2008], [Bar 2009], [Hen

2002], [Ga 2001]. Die Identifizierung von genetischen Modifikatoren ist eine relevante

Aufgabe, weil diese die Identifizierung von Patienten mit einem Risiko für die Entwick-

lung einer CFLD zum Zeitpunkt der Diagnose CF und eine frühe Einleitung prophylakti-

scher Strategien ermöglichen kann [Co 2006].

Seit Mitte der 1990er Jahre wurden Faktoren festgestellt, die signifikant mit der Ent-

wicklung einer CFLD in Verbindung zu bringen sind. Hierzu gehören das Alter bei der

Diagnosestellung der CF, das männliche Geschlecht, ein Mekoniumileus in der Anam-

nese, die Pankreasinsuffizienz und Genotypen, die ein schweres Krankheitsbild verur-

sachen [Co 1994], [Wi 1999], [Co 2002], [La 2004], [Cor 2004], [Li 1999], aber ihre Rol-

le konnte nicht durchgängig bestätigt werden. Eine Reihe von noch unbekannten Fak-

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toren, eingeschlossen genetische Modifikatoren assoziiert mit Geschlecht oder ethni-

scher Gruppe, können Patienten eine unterschiedliche Anfälligkeit für eine Leberbetei-

ligung verleihen. Es wurde beispielsweise ein modifizierendes Gen gefunden, das häu-

figer einen Mekoniumileus auslösen kann [Zi 1999].

Es ist daher festzustellen, dass keine Korrelation der Entwicklung einer Leberbeteili-

gung mit den verschiedenen Mutationen des krankheitsverursachenden CFTR Gens

existiert. Genetische und umweltbedingte Faktoren können die Expression von Mani-

festationen bei CF modifizieren, eingeschlossen die Lungen- und die Lebererkrankung.

Auch Histokompatibilitätsantigene, Infektionen und Unterschiede in der medizinischen

Behandlung können als Modifikatoren in Frage kommen [Di 2001].

2.2.4 Klinik

Kinder mit CF, die eine Leberdysfunktion haben, zeigen ein unterschiedliches klini-

sches Bild.

1. Neonatale Cholestase: Diese ist nur selten zu beobachten und tritt in Assozia-

tion mit Mekoniumileus und bei Nutzung parenteraler Ernährung in 50% der

Fälle auf. Das eosinophile Sekret wird in den intrahepatischen Gallengängen

eingedickt. Es liegt meist eine konjugierte Hyperbilirubinämie vor, die mit farblo-

sem Stuhl assoziiert sein kann, was zu einer Verwechslung mit dem Krank-

heitsbild der extrahepatischen Gallengangsatresie führen kann. Die Auflösung

der Cholestase tritt dann spontan auf, obwohl eine kleine Anzahl von Kindern

auch eine Leberfibrose entwickelt [Di 2001], [He 2010].

2. Biliäre Abnormitäten: Einige dieser Abnormitäten werden bei der CF beobach-

tet. Gallensteine und Cholezystitis können auftreten, zudem existiert ein alters-

abhängiger Trend für das Auftreten der Symptome. Die Gallensteine sind ge-

wöhnlich aus Calciumbilirubinat zusammengesetzt, welches nicht von Gallen-

säuren gelöst werden kann. Die Obstruktion des Hauptgallenganges kann auf-

grund von Steinen oder biliärem Schlamm auftreten und führt zu abdominalem

Schmerz und akutem Auftreten eines Ikterus. Eine Mikrogallenblase, die bei der

Sonographie als ein asymptomatischer Befund beobachtet wird, ist nicht unge-

wöhnlich. Strikturen und perlschnurartige Veränderungen, ähnlich denen bei

primär sklerosierender Cholangitis (PSC), treten auch bei einigen er-

wachsenen CF-Patienten auf. Auffallend ist, dass die Inzidenz von CFTR-

Mutationen in der Population der Patienten mit PSC höher (10,6 %) ist als in

der Allgemeinbevölkerung (4 %).

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3. Asymptomatische Vermehrung des Oberbauchumfanges: Mit Beginn der Pu-

bertät haben nahezu 10-30 % der an CF erkrankten Kinder eine Hepatomegalie

entwickelt, in den meisten Fällen mit einer Leberfibrose.

4. Hämatemesis: Aufgrund der gestiegenen Sensibilität für eine möglichst frühe

Identifizierung der CFLD tritt die portale Hypertension als Erstmanifestation der

CFLD und damit das Symptom Hämatemesis (Ösophagusvarizenblutung) sel-

tener auf [Di 2001].

5. Andere Leberabnormitäten: Infektionen, metabolische Störungen, Autoimmun-

erkrankungen, Leberschädigung aufgrund von medikamentöser Therapie und

kongenitale Abnormitäten können bei von CFLD betroffenen Kindern genauso

auftreten wie auch bei gesunden Kindern. Heterozygotie für α1-

Antitrypsinmangel ist als ein Risikofaktor für schwere CFLD in einer multizentri-

schen Studie mit 180 Kindern festgestellt worden [Di 2001].

Weitere Symptome, die eine Lebererkrankung vermuten lassen, sind: ein Wechsel in

der Aktivität oder der schulischen Leistung, mangelhafte Gewichtszunahme, Müdigkeit,

Übelkeit, abdominelle Schwellung oder Schmerzen, Ekchymosen, gastrointestinale

Blutungen, Ikterus oder Pruritus.

Wenn eine Lebererkrankung festgestellt wurde, sollte auch eine Überprüfung des Ver-

laufs der Neonatalperiode, der Medikation, der Nahrungsaufnahme, des Alkoholkon-

sums, der Reiseanamnese, der Gabe von Bluttransfusionen in der Vergangenheit und

der familiären Belastung durch Lebererkrankungen stattfinden. Körperliche Anzeichen,

die bei jedem Klinikbesuch überprüft werden sollten, sind: Leberpalpation und Mes-

sung des Leberabstandes zum Rippenbogen und Xiphoid, Perkussion und Messung

der Leberausdehnung, Palpation und Messung der Milz unter dem linken Rippenbo-

gen, Leberhautzeichen (Palmarerythem, Spidernaevi, Ikterus, dilatierte Bauchwand-

venen), Aszites, neurologische Merkmale einer Zirrhose sowie der Ernährungsstatus.

Bei den meisten Patienten zeigen sich vorübergehende nicht signifikante Erhöhungen

der Serumwerte für AST, ALT und γGT 2,5-mal höher, als der höchste Wert des Re-

ferenzbereiches. Diese Laborwerte identifizieren allerdings keine Patienten mit signifi-

kanter Lebererkrankung wie die multilobuläre biliäre Zirrhose und können nicht die

Entwicklung einer terminalen Lebererkrankung prognostizieren [Wi 2008]. Bodewes et

al. konnte zeigen, dass eine hochnormale bis erhöhte γGT bei pädiatrischen CF-

Patienten stark mit einer Leberzirrhose bei CFLD assoziiert ist, vor allem bei wiederhol-

ten γGT-Messungen [Bod 2015]. Dabei ging es auch um die Identifizierung von Patien-

ten, die ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung einer Leberzirrhose bei CFLD aufweisen

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[Bod 2015]. Die CFLD zeigt einen langsamen progressiven Verlauf, Leberversagen

stellt ein spätes Ereignis dar. Die Entwicklung einer portalen Hypertension und die da-

mit verbundenen Komplikationen treten allerdings früher und häufiger auf [Fei 1993],

[De 1999]. Die Pathogenese der Steatosis hepatis ist nicht direkt mit dem Gendefekt

verbunden, wird aber mit Mangelernährung, essentiellem Fettsäurendefizit, Carnitin-

oder Cholindefizit oder Insulinresistenz in Verbindung gebracht und ist bisher nicht hin-

reichend erforscht [Li 1999], [Chen 2005].

2.2.5 Diagnostik

Zur Diagnostik der CFLD gehören Routine-Labortests, Serum-Surrogat-Fibrosemarker,

ECM-Marker und Kombinationen dieser Werte. Des Weiteren zählen zu den nicht-

invasiven Methoden spezialisierte Leberfunktionstests [Lot 2009], radiologische Bild-

gebung und TE (FibroScan®: Echosens, Paris, Frankreich) [Fr 2008].

Da die CFLD oft subklinisch verläuft, ist sie häufig unterdiagnostiziert. Obwohl neueste

Konsensleitlinien für die Diagnose von CF und die Verfahrensweise bei Leber- und

Gallensystemerkrankungen bei CF veröffentlicht wurden, bleibt die frühe Diagnose der

CFLD eine Herausforderung und es sollte eine Kombination von diagnostischen Moda-

litäten genutzt werden [Fa 2008], [So 1999], [He 2010].

Die Erkennung der CFLD ist aus zwei Gründen sehr wichtig. Zum einen erscheinen

erst spät klinische Zeichen, nämlich dann, wenn pathologische Veränderungen ausge-

prägt sind. Zum anderen legen einige Studien nahe, dass wahrscheinlich nur die

frühen Läsionen reversibel sind. Es existiert kein Goldstandard zur Diagnose einer

CFLD, was zu Kontroversen zwecks bester Identifizierung und Evaluierung der Krank-

heit führt. Dennoch hat sich etabliert, dass Kinder mit CF alle sechs bis acht Wochen

untersucht werden und dass ein jährlicher, detaillierter Bericht über ihren Krankheits-

verlauf sowie über ihre Therapie erstellt wird [Lit 2000].

2.2.5.1 Etablierte Diagnostik

Üblicherweise werden vier Verfahren bzw. Screening Tests zum Erkennen der CFLD

genutzt: die reguläre klinische Untersuchung, die laboratorische Blutuntersuchung der

Leberenzyme und der Hämatologie wie z. B. die Prothrombinzeit und die Sonographie

zur Untersuchung der Morphologie der Leber. Die mittels Leberbiopsie gewonnene

Leberhistologie und die gastrointestinale Endoskopie werden in einigen Zentren ge-

nutzt, um das Ausmaß der Erkrankung zu evaluieren und genau zu beurteilen [Di

2001].

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Bluttests werden gewöhnlich jährlich bei Kindern durchgeführt um Patienten zu entde-

cken, die eine asymptomatische Leberbeteiligung aufweisen. Dabei werden folgende

Werte im Labor untersucht: Blutbild, Prothrombinzeit, Transaminasen, Gesamt- und

direktes Bilirubin, AP, γGT, Albumin und Gesamtprotein, Cholesterin und Glucose [So

1999].

Indikatoren für Cholestase (γGT und AP) zeigen eher eine Erhöhung als die Trans-

aminasen. Leberenzyme allein sind weder sensitiv noch spezifisch, denn Abnormalitä-

ten können mild oder intermittierend sein und korrelieren nicht mit der Schwere der

Leberläsion. 20-30 % der pädiatrischen CF-Patienten können zu jederzeit eine einzel-

ne Leberwertenzymerhöhung haben. Eine Stiftung in den USA schlägt vor, dass eine

Leberbeteiligung signifikant verdächtig ist, wenn der Wert eines Leberenzyms, der im

Abstand von sechs Monaten gemessen wird, jeweils mehr als 1,5 mal höher ist als die

Obergrenze des Referenzbereichs [So 1999]. Nicht selten weisen CF-Patienten mit

einer MBC (multilobular biliary cirrhosis – multilobuläre biliäre Zirrhose) aber auch

durchgängig normale Leberwerte im Labor auf [Co 2007].

Der Ultraschall der Leber, der Gallenwege, der Gallenblase, der Gefäße von Leber und

Milz hat einen bewährten Platz in der Evaluation von Kindern mit klinischen oder bio-

chemischen Merkmalen einer Lebererkrankung [Pat 1999]. Andererseits ist seine Rolle

bei der Identifizierung einer Lebererkrankung bei asymptomatischen Kindern mit nor-

maler Biochemie nicht festgelegt. In den letzten 20 Jahren hat die Sonographie eine

immer stärker werdende Rolle in der Evaluation der Lebererkrankung übernommen.

Mit der Sonographie können Hinweise auf fokale biliäre Fibrose, multinoduläre Zirrho-

se, Steatosis hepatis und biliäre Abnormalitäten detektiert werden [No 2011]. Der

Ultraschall ist sinnvoll als eine erste nicht-invasive Untersuchungsmethode zum Scree-

ning einer Lebererkrankung, die zuverlässig unterscheiden kann zwischen Zeichen

einer Zirrhose und portalen Hypertension, fettiger Infiltration und extrahepatischen Gal-

lengangsabnormitäten. Die Sonographie ist allerdings ein sehr untersucherabhängiges

Verfahren [Ak 2007], [Co 2007], [Leu(1) 2015].

Den Goldstandard zur Diagnostik einer Leberfibrose (Staging und Grading) stellt die

Leberbiopsie dar. Wegen des fokalen Charakters der Fibrose bei CF ist die Leber-

biopsie zur Nutzung als Verlaufskontrolle unzumutbar [No 2011], [Br 2001], [Gas 1988].

Die CFLD ist eine fokale Erkrankung und es wird argumentiert, dass eine perkutane

Leberbiopsie aufgrund der Möglichkeit eines Stichprobenfehlers, der bis zu 20-30 %

erreichen kann [Ov 2012] und der mit der Biopsie verbundenen Morbidität (3 %) und

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Mortalität (0,03 %) nicht als Goldstandard genutzt werden kann [No 2011]. Andere For-

scher hingegen argumentieren, dass eine Leberbiopsie essentiell ist, zum einen für die

Unterscheidung zwischen fokal biliärer Fibrose (FBC), Steatosis hepatis und für das

Ausmaß der portalen Fibrose und zum anderen zum Ausschluss anderer Gründe der

Leberdysfunktion [Di 2001]. Des Weiteren kann die Leberbiopsie wichtige Informa-

tionen zur Progressionsrate der Lebererkrankung und zum Ansprechen der Therapie

liefern [Co 2007].

Die Leberbiopsie stellt eine für den Patienten unangenehme, weil invasive und damit

schmerzhafte Untersuchungsmethode dar, die darüber hinaus für die Untersuchenden

einige Limitationen mit sich bringt. Dazu gehören die Intra- und Interbeobachtervariabi-

lität der Pathologen. Zudem repräsentiert die Leberbiopsie nur einen sehr kleinen Teil

des Gewebes, 1/50.000tel der Leber [Br 2001]. Infolge der initial fokalen Veränder-

ungen bei der CFLD kann es bei der Leberbiopsie zu einem erheblichen Stichproben-

fehler und aufgrund der fleckförmigen Verteilung der Läsionen in der Leber zur Unter-

schätzung der Schwere und Ausdehnung der CFLD oder sogar zu falsch negativen

Resultaten kommen [Br 2001], [Leeu 2014]. Des Weiteren trägt diese Prozedur Risiken

wie Blutungen und Infektionen oder auch einen Pneumothorax, der zwar nicht die häu-

figste Komplikation darstellt, aber im Zusammenhang mit CF besonders gefürchtet wird

[Po 1997], [Br 2001], [Ca 2010], [Str 2010]. Aufgrund dessen kann die Leberbiopsie

keine allgemeine Routinediagnostik zur Bestätigung oder zur Kontrolle der CFLD sein

[St 2005], [Co 2006]. Besonders für pädiatrische CF-Patienten, für die das Risiko-

/Nutzenverhältnis noch behutsamer abgeschätzt werden muss, ist es sehr wichtig

nicht-invasive Methoden zu entwickeln, die akkurat eine Fibrose feststellen können

[Ca(2) 2008].

Zurzeit existiert kein einzelner zuverlässiger Test zur Erkennung einer CFLD. Deshalb

verwendet man eine Kombination aus diagnostischen Modalitäten um eine CFLD iden-

tifizieren und diagnostizieren zu können. Die diagnostischen Kriterien wurden initial von

Colombo et al. [Co 2002] etabliert und schließen eine positive Leberhistologie (FBC

oder MBC) oder mindestens zwei der folgenden Auffälligkeiten bei mehr als zwei auf-

einanderfolgenden Untersuchungen innerhalb eines Jahres ein: klinische Hepatomega-

lie (Leberspanne >12cm in der Medioklavikularlinie) bestätigt mit Ultraschall, Leberse-

rumwerte über der Obergrenze des Normalwertes (ALT, AST, γGT oder AP) und ande-

re Ultraschallabnormitäten als Hepatomegalie (z.B. erhöhte heterogene Echogenität;

noduläre Veränderungen; irreguläre Ränder, Splenomegalie). Die Diagnostikkriterien

nach Debray [De 2011] stellen sich ähnlich dar. Laut Debray müssen zwei der folgen-

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den Faktoren/Kriterien vorliegen, damit das Vorliegen einer CFLD in Erwägung gezo-

gen werden kann: Auffälligkeiten bei der körperlichen Untersuchung wie Hepatomega-

lie, die sich als vergrößerte Leberspanne relativ zum Alter zeigt bzw. wenn sich die

palpable Lebergrenze in der Medioclavicularlinie mehr als 2 cm über den unteren Rip-

penrand hinaus erstreckt und/oder Splenomegalie, auch durch Ultraschall bestätigt. Ein

prominenter linker Leberlappen, tastbar im Epigastrium wird oft bei multilobulärer Zir-

rhose gesehen. Weitere Faktoren stellen Auffälligkeiten bei Leberfunktionstests defi-

niert als Anstieg der Transaminasen (AST, ALT) und der GGT über die obere Norm

hinaus an drei unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten in 12 Monaten dar, nach-

dem eine andere Ursache der Lebererkrankung ausgeschlossen wurde. Wenn im Ult-

raschall gezeigt werden kann, dass es eine Leberbeteiligung gibt (erhöhte bzw. hete-

rogene Echogenität, unregelmäßige Ränder, noduläre Veränderungen) oder portale

Hypertension (Splenomegalie, erhöhte Dicke des kleinen Omentums, spontane spleno-

renale Anostomosen, große Kollateralvenen, Aszites) und biliäre Veränderungen (Dila-

tation der Gallengänge), weist dies auf eine CFLD hin. Eine Leberbiopsie kann bei

Zweifel an der Diagnose indiziert sein. Auch bei Debray müssen mehrere Kriterien vor-

handen sein um die Diagnose einer CFLD zu stellen. Bei Zweifeln an der Diagnose

steht aber am Ende immer noch die Leberbiopsie als Goldstandard, welche einen

komplikationsbehafteten und unangenehmen Eingriff vor allem bei Kindern darstellt.

Neben der Sonographie wurden auch einige weitere radiologische Untersuchungsmög-

lichkeiten wie Computertomographie und Magnetresonanz-Bildgebung getestet. Diese

Bildgebungstechniken sind grundsätzlich in der Lage, portale Hypertension nachzuwei-

sen. Sie sind aber typischerweise nicht sensitiv für milde oder moderate Fibrose.

Die hepatobiliäre Szintigraphie ist ebenfalls ein mögliches Untersuchungsverfahren zur

Feststellung einer CFLD, in welcher Derivate der Iminodiessigsäure als Marker ver-

wendet werden. Diese Untersuchung kann mit Dilatation von intra- und extrahepa-

tischen Gallengängen und verzögerter biliärer Exkretion und intestinaler Erscheinung

des Markers ein typisches Bild der Schädigung des biliären Abflusses dokumentieren

[Oc 1996]. Die Szintigraphie liefert ebenfalls funktionelle Informationen und ist ent-

wickelt worden, um eine zeitabhängige Progression der Lebererkrankung zu dokumen-

tieren [Fo 2002] sowie das Ansprechen der Therapie mit Ursodesoxycholsäure (UDCA)

zu kontrollieren [Co(1) 1992]. Allerdings liefert die Szintigraphie nur funktionelle Infor-

mationen. Daher wurde die Suche auf nicht-invasive Methoden zur Untersuchung der

Leberfibrose fokussiert [No 2011], [Br 2001].

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2.2.5.2 Neue nicht-invasive Diagnoseverfahren

Jüngste Herangehensweisen zum Messen einer hepatischen Fibrose bei Er-

wachsenen schließen FibroTest, ELF (enhanced liver fibrosis) (eine Gruppe von Se-

rummarkern), Index des Aspartat-Transaminase-Thrombozyten-Verhältnis (APRI)

[Leu(2) 2015] und die TE [Ci 2014], ein Messverfahren zur Bestimmung der Leberstei-

figkeit, ein [Den 2009], [No 2008], [No(1) 2009], [No(2) 2009], [No 2010], [Sta 2014].

Aufgrund der neuen diagnostischen Möglichkeiten eine Lebererkrankung nicht-invasiv

zu evaluieren, ändert sich die Rolle der Biopsie (eigentlich Goldstandard) zunehmend

vor allem bei Kindern [Ov 2012].

Die transiente Elastographie (TE):

Momentan kann die Lebersteifigkeit mit Hilfe der hepatischen Elastographie, auch TE

genannt, basierend auf Ultraschall oder Magnetresonanz (MR) abgeschätzt werden

[No 2011]. Die ersten klinischen Daten zur transienten Elastographie wurden 2002 ver-

öffentlicht [Sa 2003].

Die Lebersteifigkeit ist bei der Fibrose der Leber signifikant erhöht und liefert daher

einen Wert zur Feststellung einer signifikanten Fibrose (definiert als mindestens perisi-

nusoidale und portale/periportale Fibrose), einer fortgeschrittenen Fibrose (septale

oder überbrückende Fibrose) oder einer Zirrhose, bei der die Aussagekraft der Unter-

suchung am höchsten ist [No 2011]. Es hat sich gezeigt, dass die Lebersteifigkeit mit

der Leberfibrose in einer Vielzahl von Lebererkrankungen sowohl bei Erwachsenen als

auch bei Kindern korreliert [Ca(2) 2008], [Del 2009], [Lé 2007], [Behr 2013], [Kit 2013],

[Fr 2013]. Die Untersuchung der Leber mittels TE erfolgt durch einen rechten Interkos-

talraum an der typischen Lokalisation der Leberpunktion [Fr 2007]. In Abschnitt 2.3.2

wird die genaue Funktionsweise des TE-Gerätes beschrieben.

Mit Hilfe dieses Gerätes kann abgeschätzt werden, wie fest das Lebergewebe des un-

tersuchten Patienten beschaffen ist, wodurch auf das Vorliegen einer Leberfibrose,

-zirrhose geschlossen werden kann. Dazu kommt u.a. das METAVIR-Punktesystem

zur Anwendung, das jedoch vorwiegend für Lebererkrankungen wie z.B. Hepatitis C

verwendet wird [The 1994], [Lé 2007]. Ursprünglich wurde der METAVIR-Score aus-

schließlich für die Hepatitis C entwickelt und dürfte im Grunde nur für virale Leberer-

krankungen gelten [Bed 1996]. Da dieser Score gut etabliert ist, wurde er auch für an-

dere Lebererkrankungen verwendet.

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Das METAVIR-Punktesystem besteht aus fünf Stadien, die nach den morphologischen

Eigenschaften der portalen Fibrose gegliedert sind: F0 = keine Fibrose, F1 = portale

Fibrose ohne Septen, F2 = portale Fibrose mit wenigen Septen, F3 = zahlreiche Sep-

ten ohne Zirrhose und F4 = Zirrhose [The 1994]. Dieses System wird zur Interpretation

der Leberhistologie verwendet. Seitdem bei einer Korrelation von Fibroscanwerten mit

METAVIR-Fibrosestadien ein signifikanter Zusammenhang festgestellt wurde, werden

METAVIR-Fibrosestadien auch in der TE angewendet [Lé 2007]. Der größte klini-

sche Nutzen der TE liegt in der Diagnostik (Nachweis oder Ausschluss) einer Zirrhose

No 2011].

Biomarker als Laborparameter zur CFLD-Diagnostik

Es besteht die Möglichkeit eine Leberfibrose mit Hilfe von Fibrose-Biomarkern nach-

zuweisen. In Kapitel 2.4 wird darauf explizit eingegangen.

Weitere Untersuchungsverfahren:

Um die Einschränkungen der TE zu umgehen, wurden nicht-invasive Methoden für die

Evaluation der Leberfibrose unter Nutzung der Ultraschallwellen entwickelt. Dazu ge-

hören die Realtime Gewebe Elastographie (RT-E), die akustische Stärkestrahlungsim-

puls (ARFI)-Bildgebung [Man 2012], [Mon 2012], [Fr 2013], [Sta 2014] und die Über-

schallscherwellenbildgebung (SSI) [Ka 2009], [Sp 2010], [Mu 2009].

Auch Bildgebungstechniken (Ultraschall, Magnetresonanz und Computertomographie)

haben zunehmend Bedeutung in der Diagnose von hepatobiliären Abnormitäten er-

langt [Ak 2007], [Cha 2006].

2.2.6 Therapie

Zur Therapie der CF ist es notwendig, Ärzte und Therapeuten aus verschiedenen

Fachrichtungen einzubeziehen wie pädiatrische Gastroenterologen oder Hepatologen,

erfahrene Ernährungsberater, Kinderradiologen und hepatobiliäre Chirurgen. Kinder

mit dekompensierter Zirrhose müssen von einem pädiatrischen Lebertransplantations-

zentrum betreut werden [Di 2001].

Obwohl die therapeutischen Möglichkeiten für die CFLD gegenwärtig noch limitiert

sind, besteht ein reges Interesse in der möglichst frühen Entdeckung dieser Krankheit

[He 2010] um frühzeitig therapeutisch eingreifen zu können.

Zurzeit stellt die Gallensäure Ursodesoxycholsäure (UDCA) die einzige Möglichkeit der

Therapie der CFLD dar. Diese Therapie zielt auf eine Verbesserung der biliären Sekre-

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tion bezogen auf die Viskosität der Galle und der Zusammensetzung der Galle ab, ist

frei von ernsthaften Nebenwirkungen und wird generell gut toleriert. Darüber hinaus

kann UDCA auch eine Rolle bei der Prävention der CFLD spielen [Che 2000], [Mo

2009], [Co 2007]. Die Therapie mit der UDCA zeigt Potential insofern, als dass es viele

Marker der CFLD verbessert. Dennoch gibt es keinen direkten Beweis für die Modifizie-

rung des Fortschreitens zur Zirrhose [Che 2000]. Verglichen zu einer neueren Gallen-

säure, der norUrsodesoxycholsäure (norUDCA), ist UDCA signifikant toxischer und

induziert bei Mäusen Galleinfarkte in den von der Versorgung abgebundenen Leber-

lappen. norUDCA lindert nur die Lebererkrankung ohne dabei einen toxischen Einfluss

zu haben und ist vermutlich noch besser zur Therapie der CFLD geeignet [Fic 2013].

Ferner ist anzunehmen, dass einige mögliche Mechanismen als günstige Effekte an-

genommen werden: UDCA verdrängt toxische Gallensäuren aus dem enterohepati-

schen Kreislauf, hat einen stabilisierenden Effekt an Membranen, die toxischen Gallen-

säuren ausgesetzt sind, stimuliert die Chloridsekretion der calciumabhängigen Chlorid-

kanäle und die Bicarbonatsekretion, hat immunmodulatorische Eigenschaften und

schützt die Zellen [Ba 1997], [Ku 2001] [Pa 2002], [Ch 1999], [Mo 2009].

Weitere positive Effekte umfassen eine Verbesserung der Leberbiochemie (AST/ALT,

γGT), eine Verbesserung der hepatischen exkretorischen Funktion und des biliären

Abflusses ebenso wie auch eine Verbesserung der Leberhistologie und des Er-

nährungs- und essentiellen Fettsäurestatus [Co 2006], [Li 1998], [Co 1996], [Le 1997].

Dies wurde in verschiedenen Studien mit jedoch wenigen Probanden und kurzer Lauf-

zeit beobachtet [Co 1994], [Co 1999], [Che 2000]. Allerdings bleibt die Wirkung auf den

natürlichen Verlauf der CFLD noch zu definieren [Che 2000]. 2012 konnte Kappler et

al. feststellen, dass der frühe Beginn einer UDCA-Therapie bei früher Diagnose einer

CFLD durchaus die Entwicklung einer schweren Lebererkrankung verhindern und auch

längerfristig zu einer persistierenden signifikanten Verbesserung der Lebertests im

Serum führen kann [Kap 2012].

Die Behandlung der CFLD bezweckt die Verhinderung der weiter fortschreitenden Le-

berschädigung und die Verhinderung von Komplikationen (z.B. portale Hypertension

und Zirrhose). Dosis-Effekt-Studien zeigen, dass eine Dosis von 20 mg pro kg Körper-

gewicht und Tag am effektivsten ist. Diese Dosis ist höher, als die Dosis, die bei ande-

ren Lebererkrankungen verabreicht wird [Co(2) 1992].

Seite 25 von 131

Trotzdem existiert kein 100%-iger Beweis, dass UDCA eine progressive Leberfibrose

bei CF verzögern oder rückgängig machen kann. Die Gabe von UDCA ist dennoch weit

verbreitet in der Therapie der CFLD, auch wenn die prophylaktische Gabe von UDCA

bei fehlender Leberdysfunktion nicht erforscht ist [Di 2001], [Che 2000]. Asymptomati-

sche Patienten mit einem frühen Stadium der CFLD profitieren mit höherer Wahr-

scheinlichkeit von der UDCA-Anwendung [Co 2007].

Um die Progression der CFLD zu verlangsamen, sollte darüber hinaus ein besonderes

Augenmerk auf das Nahrungsbedürfnis des Patienten gelegt werden [Co 2006]. Au-

ßerdem sollte sorgfältig auf die Energieaufnahme und die Zuführung fettlöslicher Vita-

mine geachtet werden. Die Proteinaufnahme sollte nicht reduziert werden, es sei denn,

es liegen ein dekompensiertes Leberversagen oder eine hepatische Enzephalopathie

vor. Die portale Hypertension und ihre Komplikationen sowie die dekompensierte Le-

bererkrankung werden genauso therapiert wie Patienten mit Zirrhose anderer Ätiologie.

Eine Lebertransplantation sollte als letzte Möglichkeit der Therapie in Betracht gezogen

werden [Di 2001], [Ko 2014].

Die Prognose und die Handhabung der chronischen Lebererkrankungen bei Kindern

hängen größtenteils vom Ausmaß und der Progression der Leberfibrose ab, weil eine

geringfügige Fibrose oft das wichtigste Anzeichen für das Vorliegen einer CFLD dar-

stellt und die Indikation für potentielle Therapien bedeutet [Th 2010], [Leo 2008].

Weitere therapeutische Strategien wie die zielgerichtete Gentherapie der Leber [Ya

1993] und die pharmakologische Korrektur der defekten Ionentransportfunktion befin-

den sich im Forschungsstadium [Roma 1999], [Spi 2005]. Der sogenannte Docosahe-

xaensäureersatz führt zu einer signifikanten Milderung des Ausmaßes der Leberer-

krankung in einem langlebigen CFTR Knockout-Mouse-Model mit einer auffallenden

Reduktion der periportalen Inflammation [Beh 2007]. Die günstige Auswirkung dieser

Therapie, welche mit der Inhibierung von Zytokinen und/oder des Eicosanoidmetabo-

lismus in Zusammenhang steht, muss noch in klinischen Studien bestätigt werden [Co

2007]. Des Weiteren existiert neuerdings eine weitere Therapieoption, Ataluren

(PTC124), ein Medikament, welches den Translationsprozess an den Ribosomen be-

einflusst, um die Produktion von funktionierendem CFTR zu induzieren [Wi 2011].

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2.3 Transiente Elastographie

2.3.1 Aufbau des Gerätes

Bildschirm (Ansicht Patientendaten und Elastogramm)

Ultraschallsonde

Abb. 2: Aufbau des Gerätes der transienten Elastographie (FibroScan®, Echosens, Paris, Frankreich) (modifiziert nach

http://www.medizin2.ukwuerzburg.de/typo3temp/pics/4dbbed2632.jpg) (letzter Zugriff:

22.10.2012) [med 2012]

Knopf zum Auslösen der Messung

Vibrationsgenerator

Abb. 3: Ultraschallsonde des Gerätes (modifiziert nach http://www.medizin2.uk-wuerzburg.de/ uploads/pics/fibro1.jpg) (letzter Zugriff: 22.10.2012) [med 2012]

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2.3.2 Funktionsweise des Gerätes

Die TE (FibroScan®; Echosens, Paris, Frankreich) ist eine nicht-invasive, benutzer-

freundliche und schnelle Untersuchung, die eine objektive und reproduzierbare Mes-

sung der Lebersteifigkeit liefert [Sa 2003], [Cob 2007], [Ca 2008], [Ye 2008], [Roc

2008]. Darüber hinaus wird mit dieser Methode eine exzellente Interbeobachterüber-

einstimmung in Verbindung gebracht [Fr 2007]. Dieses auf Ultraschall basierende Ver-

fahren ist eine neue Technologie, die die Generierung von gepulsten Echo-

Ultraschallsignalen zur Messung der Lebersteifigkeit bei Kindern und Erwachsenen

umfasst [Lé 2007].

Das Gerät generiert eine elastische Welle mittels eines Vibrationsgenerators, die auf

die Thoraxwand auf der Höhe des rechten Leberlappens appliziert wird. Der Vibra-

tionsgenerator sendet kurz ein Signal mit niedriger Amplitude (Vibration und Frequenz)

in die Leber, welches eine elastische Scherwelle induziert, die sich im Lebergewebe

ausbreitet. Die Ausbreitungsgeschwindigkeit der dadurch erzeugten Welle in der Leber

wird mittels Ultraschallsignalen gemessen. Aus der Ausbreitungsgeschwindigkeit (V)

und der Dichte der Leber (p) lässt sich die Steifigkeit des Lebergewebes (E) in kPa

berechnen. Folgende Formel wird für die Berechnung herangezogen: E = 3pV². Die

Puls-Echo Ultraschalltechnik erlaubt die Messung der Geschwindigkeit der Welle, aus-

gedrückt in Kilopascal, die direkt proportional zur Lebersteifigkeit ist [Sa 2003], [Del

2009], [Fra 2007], [Cob 2007], [Fr 2007].

Je fester das Gewebe, also je höher die Steifigkeit des Lebergewebes in kPa, desto

schneller verbreitet sich die Scherwelle und desto schneller ist somit die Ausbreitungs-

geschwindigkeit. Die Steifigkeit des Lebergewebes wird dem Untersuchenden für jede

einzelne Messung vom Gerät angezeigt. Zeitgleich berechnet das Gerät den Median

aller bisher an einem Patienten durchgeführten Messungen.

Die in den Untersuchungen gemessene Lebersteifigkeit variiert zwischen 2,5 und 75

kPa. Dabei liegt die normale Lebersteifigkeit zwischen 4 und 6 kPa, wohingegen bei

Zirrhose die Lebersteifigkeit generell mehr als 12-14 kPa beträgt [Sa 2003], [Del 2009],

[Fra 2007], [Cob 2007], [Fr 2007].

Standardmäßig sollten bei der TE zehn valide Messungen pro Patient durchgeführt

werden. Die Erfolgsrate ist definiert als das Verhältnis zwischen der Zahl an validen

Messungen und der Gesamtzahl der Messungen. Der Medianwert gilt als repräsentativ

für den elastischen Betrag der Leber. Eine Untersuchung mit zehn validen Messungen,

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einer Erfolgsrate von mehr als 60 % und einem Interquartilbereich (IQR) kleiner als

Medianwert/3 gilt als zuverlässig [Fra 2007], [Lu 2009], [Fr 2007]. In 90-96 % der Ge-

samtuntersuchungen wird eine Erfolgsrate von mindestens 60 % erzielt. Die Dauer der

Untersuchung beträgt zwischen fünf und zehn Minuten [Sa 2003], [Fr 2007].

Mit der M-Mode-(Time-Motion-Mode)-Technik kann Lebergewebe von anderen Gewe-

ben, insbesondere Darm und Lunge, unterschieden werden. Auch größere Gefäße,

welche bei der Untersuchung gemieden werden sollten, können hiermit identifiziert

werden. Eine erfolgreiche Messung ist nur im Lebergewebe, nicht in anderen Organen,

möglich. Studien haben eine Korrelation der gemessenen Steifigkeit des Lebergewe-

bes mit dem Fibrosestadium aufgezeigt und entsprechende Schwellenwerte zur Inter-

pretation der Ergebnisse anhand des jeweiligen Studienkollektivs gebildet [Fr 2007].

Während ein Leberstanzbiopsiezylinder nur ein Areal von 1:25.000 bis 1:50.000 der

gesamten Leber repräsentiert, umfasst der im Rahmen der FibroScan-Untersuchung

beurteilte Gewebezylinder ein Areal von 1:500 des Lebergewebes [Fr 2007]. Die TE

erlaubt vielfach Ablesungen von geringfügig verschiedenen Bereichen, dadurch wer-

den Daten von einer größeren Stichprobe bereitgestellt. Somit können Stichprobenfeh-

ler, die mit einer Leberbiopsie assoziiert sein können, eliminiert werden [No 2011]. Die

TE hat einige attraktive Eigenschaften über ihre Nicht-Invasivität hinaus. Am wichtig-

sten ist, dass die TE eine relativ große Stichprobe (Volumen, welches näherungsweise

aus einem Zylinder von 1 cm Breite und 4 cm Länge besteht) der Leber untersucht.

Diese ist, verglichen mit einer Probe aus einer Leberbiopsie, geschätzt einige 100mal

größer [Sa 2003], [Del 2009], [Fra 2007], [Cob 2007], [Ca(1)2008].

Studien haben eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der FibroScan-

Untersuchungen mit einer hohen Intra- (96-98 %) und Interuntersucher- (89-96 %)

Übereinstimmung aufgezeigt. Die Durchführung der FibroScan®-Untersuchung kann

leicht erlernt werden und braucht nur wenige Übungsstunden unter Anleitung [Fr 2007].

Allerdings gibt es einige technische Einschränkungen bei der TE. Für ein Pulssignal

von hoher Qualität, muss ein direkter und relativ kurzer Weg zur Leber gegeben sein.

Die Eindringtiefe ist begrenzt. Somit ist es schwierig, die TE bei adipösen Patienten

oder Patienten mit Aszites durchzuführen. Weiterhin können die Rippen das Signal

undeutlich machen. In etwas mehr als 10 % der untersuchten Patienten kann das Mi-

nimum von zehn validen TE-Messungen nicht erreicht werden. Es ist wahrscheinlich,

dass neue Schallköpfe zumindest einige dieser Defizite überwinden können. Die Kom-

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bination von TE und anderen nicht-invasiven Tests kann helfen, eine bessere Unter-

suchung des Status der Fibrose zu ermöglichen [No 2010], [Lé 2007], [Fra 2007].

2.4 Biomarker als Laborparameter für den Nachweis einer Leberfibrose

In der gesunden Leber stellt sich die Homöostase der extrazellulären Matrix (ECM) als

ein kontinuierlich präzise regulierter andauernder Umsatz mit Hilfe von einer Gruppe

von Enzymen, den Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und ihren Inhibitoren (TIMPs),

dar [Hem 2007]. Bei chronischer Leberschädigung werden hepatic stellate cells – he-

patische Sternzellen (HSCs) aktiviert und differenzieren sich in einen fibroblastenähnli-

chen Phänotyp. In aktivierten HSCs ist speziell die Expression von TIMP-1 hochregu-

liert, welche zu einer Inhibierung der Aktivität der MMPs und nachfolgend zu einer Ak-

kumulation von Matrixproteinen im Extrazellularraum führt. Eine substanzielle Verände-

rung der ECM-Zusammensetzung stellt die Ablagerung von Kollagen dar, hauptsäch-

lich fibrillen-formende Typen wie Typ I, II und IV, welche in fibrotischer ECM bis auf das

Zehnfache ansteigen [Sc 2001]. Daher liegt es nahe, dass diese Gruppe von Enzymen

im dysregulierten Zustand zu einer Fibrose der Leber beitragen kann [Hem 2007].

Von den bekannten MMPs werden nur einige im Lebergewebe exprimiert und unter

den verschiedenen Spezies müssen Unterschiede zwischen dem Genotyp und der

Aminosäuresequenz betrachtet werden.

Als Hinweis auf Leberfibrose bzw. eine Fibrogenese kommen verschiedene Fibrose-

Biomarker in Betracht. Dazu gehören die Familie der MMPs, TIMPs, Hyaluronsäure

(HA), Prokollagen III (PIIIP) und YKL-40, aber auch M30 und M65. Diese Marker sind

sowohl an der Umsetzung der ECM, als auch an der Aktivierung von Zellen, die ECM

produzieren, beteiligt [Nø 2003].

Als weitere neuere Fibrose-Biomarker werden auch Micro-RNAs (miR) betrachtet. Die-

se werden ebenfalls im Serum gemessen. Die kombinierte Verwendung der Serum

miR-122, miR-21 und miR-25 könnte klinischen Nutzen für die frühzeitige Diagnose

einer CFLD bringen und wenn sie in Kombination mit Serum miR-210, miR-148a und

miR-19a verwendet wird, ist es möglich Patienten mit früher Leberfibrogenese (F0-F1)

zu detektieren. Es ist somit nicht-invasiv möglich Kinder mit CFLD mit Fibrose (F1-F4)

von denen mit keiner Fibrose (F0) zu unterscheiden [Coo 2015]. Außerdem wurden

noch zwei weitere mögliche Fibrose-Biomarker beschrieben. Sowohl TIMP-4, als auch

Endoglin sind erhöht bei Patienten mit CFLD und können im Zusammenhang mit der

TE die Sensitivität für die nicht-invasive Diagnose einer CFLD steigern [Ra 2013].

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2.4.1 Matrixmetalloproteinasen

Die Familie der Matrixmetalloproteinasen (MMPs) besteht aus zinkabhängigen proteo-

lytischen Enzymen. Diese beinhalten bislang 22 verschiedene Arten von MMPs [Som

2003]. Obwohl alle von ihnen ein breites Substratspekrum aufweisen, werden sie ba-

sierend auf ihr hauptsächliches Substrat in Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysins,

Matrilysins, Metalloelastasen, Membrantyp-MMPs (MT-MMPs) und andere eingeteilt.

MMPs werden als Zymogene sezerniert und durch Spaltung ihres Propeptids aktiviert.

Die Aktivität der MMPs wird durch die Bindung der TIMPs reguliert [Hem 2007].

MMP-2 (Gelatinase A) und MMP-14 (Membrantyp-MMP1, MT1-MMP), welche zur Le-

berschädigung führen, werden von HSCs während ihrer Aktivierung exprimiert [Kni

1999], [Ik 1999]. Die Aktivierung von MMP-2 wird durch MMP-14 vermittelt und voll-

zieht sich an der Zellmembran durch die Formation eines ternären Komplexes von pro-

MMP-2, TIMP-2 und MMP-14 [Stro 1995]. MMP-2 ist ein autokriner Proliferations- und

Migrationsfaktor für HSCs [Ik 1999], [Beny 1999].

MMP-3 (Stromelysin-1) wird vorübergehend in frühen HSC-Aktivierungsstadien expri-

miert [Kni 1999] und es hat sich gezeigt, dass mehrere pro-MMPs wie MMP-1, -3, -7,

-8, -9 und -13 durch Spaltung des Propeptids durch MMP-3 aktiviert werden [Su 1990],

[Na 1990], [Im 1995], [Knä 1993], [Og 1992], [Knä 1996].

MMP-9 (Gelatinase B) wird von Kupfferzellen in Primärkultur [Kni 1999], von IL-1β- und

TNF-α-stimulierten Hepatozyten [Gia 2006], IL-1α-stimulierten HSCs [Han 2004] und in

Alkohol- oder Kohlenstofftetrachlorid (CCl4) induzierter Leberschädigung [Ro 2006]

hergestellt. MMP-9 wird von MMP-3 aktiviert, welches durch Plasmin aktiviert wird

[Ramo 1999]. Bei Lebererkrankungen sind HSCs [Han 2004] und inflammatorische,

mononukleäre Zellen z.B. Lymphozyten und Neutrophile auch Ursprungsort einer

MMP-9 Synthese [Kni 2000].

MMP-13 wird von HSCs [Ir 1997], [Kni 1999], Fibroblasten, Kupfferzellen und Perisi-

nusoidalzellen [Wat 2000] exprimiert und seine Synthese kann mit Hilfe von Zytokinen

wie IL-1β, TNF-α oder EGF hochreguliert werden [Kni 1999], [Han 2004], [Lee 2003],

[Sak 2004], [Yas 2004]. Die MMP-1/MMP-13 Aktivierung vollzieht sich gewöhnlich in

einem Zwei-Schritt-Mechanismus über Plasmin und MMP-3 [Su 1990] oder über

MMP-14 und MMP-2 bei Fehlen von TIMP-2 [Knä 2002]. MMP-13 kann das umgeben-

de Gewebe abbauen, um neu synthetisierte ECM ablagern zu können [Hem 2007].

Seite 31 von 131

2.4.2 Inhibitoren von Matrixmetalloproteinasen

Bislang wurden vier verschiedene Typen von Inhibitoren der MMPs (TIMPs) identifi-

ziert: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 und TIMP-4. Alle bekannten MMPs können von mindes-

tens einem der vier TIMPs inhibiert werden. Dennoch gibt es individuelle Unterschiede

bezüglich der Bindungsstärke und folglich dem Ausmaß der Inhibierung einer bestimm-

ten MMP. Hinsichtlich des Phänomens der Fibrose spielen TIMP-1 und TIMP-2 eine

ausschlaggebende Rolle [Ir 1997], [Roe 1993], [Roe 1997].

Die vier TIMPs haben einen unterschiedlichen Einfluss auf die Fibrogenese im Leber-

gewebe. Ein initialer Beweis in Bezug auf die Verbindung von TIMP-1 und TIMP-2 und

hepatische Fibrose beruht auf Ergebnissen von Rattenhepatozyten. Bei diesen Versu-

chen stimulierte die Behandlung mit inflammatorischen Zytokinen die Transkription von

beiden Genen [Roe 1993], [Roe 1994], [Roe 1995]. Später wurden erhöhte Expressio-

nen von TIMP-1 und TIMP-2 in zwei Rattenmodellen mit Leberschädigung, die durch

CCl4-Injektion und Gallengangsligierung induziert wurde, gezeigt [Roe 1997]. TIMP-1

und TIMP-2 werden hauptsächlich von HSCs produziert [Ir 1997], [Herb 1997] und sind

in einigen menschlichen Lebererkrankungen hochreguliert [Beny 1996], [Ir 1995].

Das TIMP-1 Protein bindet und hemmt aktivierte Kollagenasen um darauf das neu syn-

thetisierte Kollagen vor dem unmittelbaren Abbau durch die MMPs zu schützen.

TIMP-1 ist ebenfalls in der Lage, die Aktivierung von pro-MMPs, erwiesen in stimulier-

ten HSCs [Han 2004], zu verhindern und programmierten Zelltod von HSCs, vermittelt

über die Inhibierung von pro-MMP Aktivierung, und MMP Aktivität zu hemmen [Yo

2000], [Mur 2002]. TIMP-1 ist signifikant assoziiert mit der Fibrogenese in der Lunge

[Ru 2003], [Se 2000], den Nieren [Joh 2002], [Hor 2002] und im Pankreas [Ph 2003],

[Is 1998]. Deshalb stellt TIMP-1 ein zentrales Molekül in der Gewebsfibrose dar [Hem

2007].

TIMP-2 wird von Myofibroblasten in der Leber von Ratten, aktivierten HSCs und

Kupfferzellen exprimiert [Kni 1999]. Bei chronisch toxischer Leberschädigung scheint

die Bedeutung für die Fibrogenese von TIMP-2 auf die frühen Stadien beschränkt zu

sein, und zwar dann, wenn ein vorübergehender Anstieg von TIMP-2 MMP-2 aktiviert

und darauf ein perizellulärer Abbau der normalen Lebermatrix folgt. Die Notwendigkeit

der Aktivierung von MMP-2 durch TIMP-2 wurde in Studien an Mäusen, die kein

TIMP-2 bilden konnten, gezeigt. Diese Mäuse waren phänotypisch normal, funktions-

fähig und fertil, waren aber nicht fähig, MMP-2 zu aktivieren. TIMP-2 ist demnach für

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eine normale Entwicklung durchaus verzichtbar, für die MMP-2-Aktivierung in Mäusen

hingegen ist TIMP-2 essentiell [Wa 2000].

2.4.3 Hyaluronsäure

Die Hyaluronsäure (HA) ist ein Glykosaminoglykan mit hohem Molekulargewicht [Geo

2004], welches von ECM-produzierenden Zellen, Mesenchymzellen einschließlich akti-

vierter HSCs synthetisiert wird. Es zirkuliert durch das lymphatische System und ist

diffus im Bindegewebe verteilt [Geo 2004]. Die zirkulierende Menge an HA dürfte nicht

nur das Stadium der Erkrankung reflektieren, sondern auch den ECM-Metabolismus

und die inflammatorische Aktivität innerhalb der Leber [Gu 2008]. HA spielt eine struk-

turelle Rolle in der Bindegewebsmatrix und ist in Zell-Zell-Interaktionen involviert. HA

hat eine Halbwertszeit im Plasma von fünf bis sechs Minuten. In hohen Konzentratio-

nen kommt sie in der Synovialis vor. Ihre Rolle besteht darin, Wasser zu binden und

das Gelenk gleitfähig zu machen. Die Leber scheidet zusammen mit der Niere einen

Großteil von HA aus. HA wird aus der Zirkulation durch die Bindung an das Adhä-

sionsmolekül CD44, welches sich an sinusoidalen Endothelzellen befindet, entfernt und

nachfolgend in die Hepatozyten aufgenommen. Wenn es zu einer Fibrose kommt, ver-

dicken sich die sinusoidalen Endothelzellen und sind so weniger permeabel für HA,

weshalb die Reinigung von HA vermindert ist, wodurch HA im Serum ansteigt. Fibrose

stimuliert außerdem die Mesenchymalzellen, wodurch noch mehr HA produziert wird

[Har 2006].

In einer klinischen Studie, in der sich zufällig ausgewählte Kinder einer Leberbiopsie

unterzogen haben, hat sich gezeigt, dass HA ein Marker von Fibrose darstellt [Har

2006]. Auch andere Studien haben gezeigt, dass HA sowohl bei Erwachsenen, als

auch bei Kindern einen interessanten Marker darstellt, welcher einer der besten Prä-

diktoren für Leberfibrose ist [Gu 2008], [No 2010], [LeeC 2013].

2.4.4 Prokollagen III

Das Prokollagen III (PIIIP=PIIINP) ist ein aminoterminales Propeptid des Typ III Kolla-

gens, ein Spaltprodukt während der Umwandlung von Prokollagen III in Kollagen III [Ri

1988], welches einen Teil der bei Leberfibrose von HSCs hergestellten ECM, die im

Disséraum abgelagert wird, ausmacht [Ben 1990], [Ta 2001], [Sm 1988]. PIIINP wird

vom Typ-III-Kollagen-Precursormolekül Prokollagen III während der Bildung und des

Wachstums von Kollagenfibrillen abgespalten [Fes 1978], [Ti 1981]. Weil dieses Pro-

peptid leicht gelöst werden kann und im Serum vorkommt, wird davon ausgegangen,

dass die PIIINP Serumwerte die Synthese von PIIINP widerspiegeln [Ben 1990]. Somit

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kann die Höhe des PIIINP im Serum gemessen werden und eine Aussage über eine

mögliche Fibrose liefern.

Einige Studien [Cho 1998], [Rohd 1983] haben gezeigt, dass PIIINP bei Fibro-

se/Zirrhose der Leber erhöht ist und ebenfalls einen Leberfibrose-Marker darstellt.

2.4.5 YKL-40

YKL-40 gehört zur Familie 18 der Glykohydrolasen [Ha 1993], [Ren 1998] und ist ein

Wachstumsfaktor von Bindegewebszellen und Endothelzellen [Mal 1999], [Ce 2001],

[Re 2002]. Der Name YKL-40 leitet sich zum einen ab vom molekularen Gewicht des

Proteins (40 kDa) und den drei Aminosäuren am Aminoterminus (Tyrosin, Lysin und

Leucin) [Jo 1992]. Das Gen dieses Proteins wurde identifiziert, lokalisiert auf dem

Chromosom 1 q31-q32 [Reh 1997] und die Struktur des Proteins ist beschrieben wor-

den [Moh 2003]. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass YKL-40 ein Wachstumsfaktor von

Fibroblasten [Re 2002], Chondrozyten und Synovialzellen [Ce 2001] und ein potenter

Migrationsfaktor für Endothelzellen [Mal 1999] ist. Hämodynamische Studien zeigten,

dass YKL-40 vom Hepato-Splanchnikusgebiet freigesetzt wird. In immunhistochemi-

schen Studien von Leberbiopsien wurde festgestellt, dass in Arealen mit Fibrose, ins-

besondere in Bereichen mit beginnender Fibrose, eine positive Färbung für YKL-40

auftritt [Jo 1997], [Jo 2000]. Es wird angenommen, dass YKL-40 von HSCs sezerniert

wird [Jo 2000], welche als wesentliche Effektorzellen in der Fibrogenese der Leber

gelten [Fri 1993], [Fri 1999]. YKL-40 kann von Makrophagen [Ren 1998], und aktivier-

ten Neutrophilen [Vo 1998] sezerniert werden.

Zusammenfassend lässt sich an dieser Stelle festhalten, dass im Serum von Patienten

mit Leberfibrose und alkoholischer Zirrhose sowie anderen Lebererkrankungen erhöhte

Werte von diesen verschiedenen Markern zu verzeichnen sind [Nø 2003], [Ben 1990],

[Jo 2000], [Jo 1997], [Ob 1997], [Tr 1992], [Tra 2000], [Ben 1987], [Sh 1992], [Sti

2001], [Ra 2011]. Des Weiteren gibt es Marker, die eine Zellapoptose anzeigen, z.B.

M30 und M65. Caspasen werden während dieses Vorganges aktiviert und spalten ver-

schiedene Substrate einschließlich Cytokeratin-18 (CK-18) [Leer 1999], [Fi 2003]. CK-

18 in seiner voll ausgeprägten Moleküllänge kann von Caspase 6, 3 und 7 gespalten

werden und es entstehen 2 Molekülfragmente mit etwa 30 kDa und 45 kDa Molekular-

gewicht. Das 30-kDa-Fragment kann von einem spezifischen Antikörper, M30, detek-

tiert werden, während ein anderer Antikörper, M65, beide Fragmente zusammen detek-

tieren kann [Schu 2004], [Cau 1997], [KuN 1997].

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2.4.6 M30

M30, ein monoklonaler Antikörper detektiert CK18Asp396 Neo-Epitop [She 2012], wel-

ches aus der Spaltung von CK-18 entstanden ist [Leer 1999], [Jok 2012]. Dieses Neo-

Epitop ist ein Fragment, welches von CK-18 während der Zellapoptose durch Caspa-

sen abgespalten wird, ein Hauptintermediärfilament Protein in Hepatozyten. Der

Nachweis von M30-Werten im Serum spiegelt den Grad der hepatozellulären Apoptose

wider und erlaubt speziell den Nachweis der Apoptose von Epithelzellen mit Hilfe eines

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) [Jok 2012]. Im Grunde zeigt der M30-

ELISA die Messung der Menge der laufenden Apoptose an [Alt 2015].

Joka et al. demonstrierten für verschiedene Lebererkrankungen erhöhte M30-Werte im

Lebergewebe unter Verwendung des M30-ELISAs [Jok 2012]. Bei Patienten mit ver-

schiedenen akuten und chronischen Lebererkrankungen wurden zudem erhöhte Se-

rumwerte für Fragmente von CK-18, die durch Caspasen hergestellt werden, nachge-

wiesen [Ban 2000], [Ban 2001], [Sei 2005], [Kr 2005], [Vol 2008], [Gie 2011], [Vol

2006]. Diese Ergebnisse deuten an, dass man Fragmente von CK-18 als einen poten-

tiellen Fibrose-Biomarker nutzen kann. Für die Entwicklung und Progression einer Le-

berfibrose wurden sowohl Apoptose als auch Nekrosevorgänge verantwortlich gemacht

[Meha 2010].

2.4.7 M65

M65 detektiert sowohl durch Caspasen gespaltenes, als auch ungespaltenes CK-18.

Daher kann M65 als Marker für den Gesamtzelltod einschließlich Apoptose und Nekro-

se verwendet werden. Auch dieser Wert wird mit Hilfe eines ELISA bestimmt [Jok

2012], [Alt 2015].

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3. Material und Methoden

3.1 Patienten

In der dieser Arbeit zugrundeliegenden Single-Center-Studie im Medizinischen Zent-

rum für Innere Medizin, Schwerpunkt Gastroenterologie des Universitätsklinikums Gie-

ßen wurden im Zeitraum von Juni 2009 bis Dezember 2010 fortlaufend 75 pädiatrische

Mukoviszidosepatienten prospektiv untersucht. Die Diagnose Mukoviszidose war vorab

bei diesen Patienten mit Hilfe des Schweißtestes gestellt und später mit genetischen

Tests bestätigt worden. Alle Patienten wurden gemäß der „European and U.S. Guide-

lines“ behandelt [Fa 2008], [Cast 2009], [Noa 1999]. Nachdem andere Ursachen für

eine chronische Lebererkrankung ausgeschlossen worden waren, wurde die Diagnose

der CF-assoziierten Lebererkrankung gemäß der neusten Leitlinien [De 2011] gestellt,

wenn mindestens zwei der folgenden Bedingungen in mindestens zwei aufeinander

folgenden Untersuchungen innerhalb eines Jahres vorlagen:

1. Hepatomegalie (Leberspanne mehr als 2 cm unter dem Rippenbogen in der

Medioclavicularlinie) bestätigt mittels Sonographie,

2. Zwei pathologische Leberenzymwerte (ALT, AST, γGT größer als die Ober-

grenze des Normalwertes),

3. Über die Hepatomegalie hinaus andere pathologische Auffälligkeiten der Leber

in der Sonographie.

Die sonographische Darstellung der Leber wurde in fünf Kategorien klassifiziert: normal

(US1); homogen hyperechogen (US2); heterogen (US3); nodulär (US4); Auftreten ei-

ner portalen Hypertension (US5) [Pat 1999], [De 2011].

Des Weiteren wurde im Rahmen der Studie zur Diagnosefindung einer Leberbeteili-

gung auch das Vorhandensein einer Therapie mit Ursofalk einbezogen.

33 von 75 Patienten, das entspricht 44 % der Patientenkohorte, trugen die Mutation

∆F508 homozygot. Weitere 28 Patienten, 37 % der Patientenkohorte, waren heterozy-

got für diese Mutation. Dies bedeutet, dass die Mutation ∆F508 bei 61 von 75, d.h.

81 %, Patienten dieses Patientenkollektivs nachweisbar war.

Bei den Patienten wurden regulär alle drei Monate routinemäßig folgende Untersu-

chungen durchgeführt: die Anamnese und körperliche Untersuchung des Patienten,

eine Lungenfunktionsprüfung, wenn möglich eine Sputumprobe. Einmal jährlich erfolg-

te darüber hinaus eine Blutentnahme.

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Das Serum wurde am Tag der Blutentnahme abzentrifugiert und für die spätere Be-

stimmung von Serummarkern (TIMP-2, YKL-40, Hyaluronsäure und Prokollagen-III) bei

-80° C gelagert. Des Weiteren wurden MMP-1,-2,-8,-9 und -13 und TIMP-1 aus den

Serumproben bestimmt.

3.1.1 Aufklärung der Patienten

Alle Patienten und deren Erziehungsberechtigte wurden über die Studie informiert und

gaben ihr schriftliches Einverständnis zur Durchführung dieser Erhebung. Bei pädiatri-

schen Patienten unter 16 Jahren gaben die Erziehungsberechtigten ihre schriftliche

Zustimmung an der Teilnahme zur Studie. Das Ethikvotum der zuständigen Kommis-

sion wurde vor Beginn der Studie eingeholt (Ethikvotum AZ 75/09 siehe Anhang).

3.1.2 Besonderheiten bei pädiatrischen Patienten

Da pädiatrische Patienten die Studienpopulation bildeten, gab es einige Besonderhei-

ten zu beachten. Je nach Alter des Patienten war dessen Mitarbeit bei der Untersu-

chung eingeschränkt. So konnten z.B. bestimmte Atemmanöver nicht explizit umge-

setzt werden. Weiterhin bedingt die Tatsache, dass pädiatrische Patienten engere In-

terkostalräume als Erwachsene aufweisen, eine schwierigere Durchführung der tran-

sienten Elastographie. Um dem zu begegnen, wurde im Rahmen der Untersuchung

eine speziell für pädiatrische Patienten (Gewicht bis zu 15 kg) entwickelte Ultraschall-

sonde verwendet.

Darüber hinaus wurden für diese Studie auch eine Analyse des Blutes durchgeführt

und verschiedene Serummarker bestimmt. Letzteres war zum Teil nicht durchführbar,

da in der Regel jährlich nur eine Blutentnahme bei den Patienten erfolgte. Dies ist darin

begründet, dass bei pädiatrischen Patienten sehr strenge Maßstäbe für schmerzhafte

Diagnostikverfahren wie Blutentnahmen gelten.

3.2 Geräte und Materialien

Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen wurden folgende Geräte und Materia-

lien verwendet.

3.2.1 Geräte

- Eismaschine AF-10 Fa. Scotsman, Vernon Hills/USA

- Gefrierschrank (-80°C) Fa. Sanyo-Biomedical, Bad Nenndorf

- Analysenwaage Mod. FA 1500-2 Fa. Faust, Schaffhausen/Schweiz

- Centrifuge GS-6 KR Fa. Beckman

- Centrifuge Mikro 200 R Fa. Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen

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- pH-Meter G32 Fa. Metrohn-Herisau, Schweiz

- Pipetten Typ Research Fa. Eppendorf, Hamburg

- Pipetten Typ Pipetman Fa. Gilson, Middleton/USA

- Multipette Fa. Slamed Ing. GmbH Laboratory

Instruments, Frankfurt am Main

- Multipette® Plus Fa. Eppendorf, Hamburg

- Pipetboy Comfort Fa. Integra Biosciences GmbH, Fernwald

- Thermomixer 5436 Fa. Eppendorf, Hamburg

- Thermomixer Comfort Fa. Eppendorf, Hamburg

- Vortex Mixer Fa. Janke & Kunkel KG, Staufen i.

Breisgau

- IKA-Combimag-RCO Fa. Janke & Kunkel KG, Staufen i.

Breisgau

- Nikon Coolpix 5400 Fa. Nikon, Japan

- Perfusor Spritze Fa. Braun, Melsungen

- Filtriergerät Fa. NUNC, Wiesbaden

- ELISA Reader Fusion Fa. Packard BioScience, Meriden/USA

3.2.2 Chemikalien und Reagenzien

- Bovines Serumalbumin (BSA) Fa. PAA Laboratories GmbH, Pasching

- Tween 20 pure Fa. Serva Elektrophoresis GmbH, Heidel-

berg

- Substrate Reagent Pack Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Streptavidin-HRP Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Schwefelsäure (H2SO4) Fa. Roche Diagnostics, Mannheim

- Natriumchlorid (NaCl) Fa. Merck, Darmstadt

- Kaliumchlorid (KCl) Fa. Merck, Darmstadt

- Kaliumdihydrogenphosphat Fa. Merck, Darmstadt

(KH2PO4)

- Natriumdihydrogenphosphat Fa. Merck, Darmstadt

(NaH2PO4)

- Aqua dest Interne Ionenaustauscheranlage der Fa.

Millipore Corporation Massachusetts/USA

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- PBS (10fache Konzentration)

hergestellt aus: 80 g NaCl

2 g KCl

2 g KH2PO4

11,5 g NaH2PO4

aufgelöst in ca. 900 ml Aqua dest und da-

nach auf 1 l aufgefüllt

- PBS (einfache Konzentration): 100 ml PBS (10fache Konzentration) auf-

gelöst in 900 ml Aqua dest; pH-Wert auf

7,4 eingestellt

3.2.3 Verbrauchsmaterialien

- Mikrotiterplatten Maxisorb Fa. NUNC GmbH & Co. KG, Wies-

baden

- Serologische Pipetten (5ml,10ml) Fa. Greiner bio-one, Frickenhausen

- Pipettenspitzen Fa. Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

- Reagiergefäße Fa. Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

- Mikrozentrifugengefäße Fa. VWR™, Darmstadt

- Reaktionsgefäße Falcon (15ml, 50 ml) Fa. Becton Dickinson Labware,

Franklin Lakes/USA

- Millipore Express Plus Membrane 0,22 µm Fa. Millipore Corporation, Massa-

chusetts/USA

3.2.4. kommerzielle ELISA-Kits

- Human pro-MMP-1 Immunoassay Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Human pro-MMP-2 Immunoassay Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Human pro-MMP-9 Immunoassay Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Human pro-MMP-8 Immunoassay Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Human pro-MMP-13 Immunoassay Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Human pro-MMP-9/TIMP-1 Immunoassay Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Human TIMP-1 ELISA Kit Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- Human TIMP-2 ELISA Kit Fa. R&D Systems, Minneapolis/USA

- MicroVue YKL-40 EIA Kit Fa. Quidel® Corporation, San Diego/

USA

- Human Procollagen III ELISA Kit Fa. Uscn Life Science, Wuhan/China

- Hyaluronic Acid ELISA Kit Fa. TECOmedical AG, Sissach/

Schweiz

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- M30-Apoptosense ELISA Fa. Peviva, Bromma/Schweden

- M65 ELISA Fa. Peviva, Bromma/Schweden

3.3 Methoden

3.3.1 Transiente Elastographie (TE)

Die Lebersteifigkeit mit Hilfe der TE wurde unter Nutzung desselben FibroScan®

(Echosens, Paris, Frankreich) Gerätes bei allen Patienten untersucht. Die nicht-

invasiven Messungen wurden von einem erfahrenen Untersucher geblindet zu dem

klinischen Status der Patienten am rechten Leberlappen durch einen Interkostalraum

mit einer Tiefe von 25 bis 65 mm von der Hautoberfläche durchgeführt. Bei Kindern,

die ein Gewicht unter 15 kg aufwiesen, wurde die S-Ultraschallsonde, entwickelt für

Lebersteifigkeitsmessungen bei Kindern, genutzt. Für jeden Patienten wurde der Le-

bersteifigkeitswert als Median von zehn erfolgreichen Messungen berechnet. Die TE

wurde als valide betrachtet, wenn zehn erfolgreiche Messungen mit einer Erfolgsrate

≥ 60% und ein Interquartilbereich ≤ 30% vom Median erreicht wurden. Die Ergebnisse

wurden in Kilopascal (kPa) ausgegeben. Die Untersuchungszeit belief sich auf rund

fünf Minuten pro Patient.

Abb. 4: Schematische Darstellung der transienten Elastographie (modifiziert nach Cas-tera et al. Journal of Hepatology 2008) [Ca(1)2008].

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3.3.2 Klinische Routinelaborparameter

Einige klinische Laborparameter wurden im Rahmen der Routinebehandlung der in die

Studie eingeschlossenen Patienten im Zentrallaboratorium des Universitätsklinikums

Gießen (Direktor Prof. Katz, Prof. Renz) bestimmt. Es wurden folgende Parameter er-

mittelt: Hämoglobin, Thrombozytenzahl, Quick, INR, Gesamtprotein, Albumin, Gesamt-

bilirubin, Cholinesterase, GPT, γGT, CRP und Ferritin.

3.3.3 Bestimmung von Biomarkern zum Nachweis einer Leberfibrose mittels ELISA

In den gewonnenen Serumproben des Patientenkollektivs wurden bestimmte Marker,

die eine Fibrose in der Leber anzeigen können, gemessen wie TIMP-2, YKL-40, Hya-

luronsäure und Prokollagen-III. Des Weiteren wurden auch MMP-1,-2,-8,-9 und -13,

TIMP-1, MMP-9/TIMP-1-Komplex, M30 und M65 in den Serumproben getestet. Diese

Messungen wurden mittels ELISA durchgeführt. Es wurden Verdünnungen des Serums

von 1:200 für TIMP-1 und TIMP-2, 1:13 für PIIIP, 1:1 für HA und unverdünnt für YKL-40

verwendet. Weiterhin wurde Serumverdünnungen von 1:5 für MMP-1, 1:10 für MMP-2

und MMP-13, 1:50 für MMP-8, 1:1000 für MMP-9 und 1:20 für MMP-9/TIMP-1 Komplex

angewendet. Bei M30 und M65 wurde das Serum ebenfalls unverdünnt verwendet.

Es wurden in dieser Studie zwei verschiedene ELISA-Prinzipien angewandt.

3.3.3.1 Der Sandwich-ELISA

Beim Sandwich-ELISA wurde zuerst ein so genannter „Fangantikörper“ (capture anti-

body) an eine feste Phase (Mikrotiterplatte) gebunden. Darauf folgte die Zugabe des zu

untersuchenden Antigens. Nach einer Inkubationszeit von zwei Stunden wurde unge-

bundenes Antigen durch Waschen mit einem Waschpuffer entfernt und es blieb nur

das an den Antikörper gebundene Antigen zurück. Danach wurde ein Detektionsanti-

körper (detection antibody) hinzugefügt. Dieser hat ebenfalls an das Antigen gebun-

den, es entstand ein Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex und vervollständigte somit

das Sandwich. Antikörper, die nicht gebunden, also überschüssig waren, wurden durch

Waschschritte entfernt. An den Detektionsantikörper war ein Enzym gebunden. Meis-

tens handelte es sich um die Meerettich-Peroxidase. Andere Enzyme wie Alkalische

Phosphatase oder seltener Glucoseoxidase wurden ebenfalls verwendet. Es wurde ein

zum Enzym passendes chromogenes Substrat zugegeben, welches vom Enzym zu

einem Reaktionsprodukt umgesetzt wurde. Dessen Nachweis konnte im Anschluss

durch Farbumschlag, Fluoreszenz oder Chemilumineszenz erfolgen. Für quantitative

Nachweise wurde photometrisch die optische Extinktion gemessen und mit einer Kalib-

rierungskurve abgeglichen. Eine andere Möglichkeit der Durchführung dieses ELISA

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bestand darin, die Kombination eines ungekoppelten Detektionsantikörpers und eines

zusätzlichen sekundären Antikörpers, an den ein Enzym gebunden war, zu verwenden

[ana 2012], [ant 2012], [En 1971], [Go 2003].

Abb. 5: Das Prinzip des Sandwich-ELISA (nach http://www.uscnk.de/typo3temp/

pics/77e704ecc5.jpg) (letzter Zugriff: 19.10.2015) [us 2015] (mit freundlicher Genehmi-

gung von Dr. Chris Sun – cloud-clone.com)

3.3.3.2 Kompetitiver ELISA

Bei dieser Form des ELISA wird ein markiertes Kompetitor-Antigen verwendet, welches

eine synthetische Verbindung darstellt, die dem zu untersuchenden Antigen strukturell

ähnlich ist und sich auch an den Antikörper binden kann. Zuvor wird ein unmarkierter

Antikörper an eine feste Phase (Mikrotiterplatte) gebunden. Dann wird das zu untersu-

chende Antigen zugegeben und inkubiert. Wenn sich die Reaktion dann im Gleichge-

wicht befindet, wird das Kompetitor-Antigen zugegeben und tritt nun mit dem zu unter-

suchenden Antigen in Konkurrenz um einen Bindungsplatz am Antikörper. Das Signal

ist indirekt proportional zur Konzentration des zu untersuchenden Antigens [ana 2012],

[ant 2012], [En 1971], [Go 2003].

3.3.4 Ethikvotum

Die Studie wurde entsprechend der Helsinki Erklärung von 1975 ausgeführt. Die Studie

wurde von der zuständigen Ethikkommission der Justus-Liebig-Universität Gießen

überprüft und genehmigt (AZ 75/09) (siehe Anhang).

3.3.5 Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit dem Programm SPSS 19.0 (IBM, Armonk, NY

2010) durchgeführt. Die Normalverteilung wurde mittels des Kolmogorov-Smirnow-

Tests [Ja 2013] überprüft und mit Hilfe von Histogrammen visualisiert. Aufgrund der

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fehlenden Normalverteilung wurden Unterschiede zwischen TE-Werten und Serum-

markern mittels Mann-Whitney-U-Test für unverbundene Stichproben gemessen [We

2008]. Die Expression der Serummarker wird in Box-and-Whisker-Plots gezeigt. Die

oberste und unterste Grenze der Box repräsentieren jeweils die 75. und die 25.

Perzentile. Die Linie zeigt den Medianwert, die Fehlerbalken repräsentieren Maximum

und Minimum. Werte, die 1,5-3fach Interquartilbereich von der Box abweichen, wurden

als Ausreißer definiert (o). Signifikante Unterschiede sind hervorgehoben (*p<0,05,

**p<0,01).

Die diagnostischen Leistungen von TE und Fibrose-Biomarkern wurden mit Hilfe von

Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurven gemessen [We 2008]. Die ROC-

Kurve stellt eine Aufzeichnung der Sensitivität gegen (1-Spezifität) für alle möglichen

Cut-off-Werte für die Vorhersage der Fibrosestadien dar. Der am häufigsten genutzte

Index der Genauigkeit ist die Fläche unter der ROC-Kurve (area under the ROC curve

– AUROC) mit Werten dicht an 1,0, die eine hohe diagnostische Genauigkeit anzeigen.

Basierend auf ROC-Analysen wurden optimale Cut-off-Werte für TE und Fibrose-

Biomarker gewählt, um die Summe von Sensitivität und Spezifität zu maximieren und

positive und negative Vorhersagewerte für diese Cut-off-Werte zu berechnen.

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4. Ergebnisse und Auswertung

4.1 Patientencharakteristika

Bei 30 pädiatrischen Patienten (40%) wurde anhand der mittels Untersuchung, Labor

und Sonographie erfassten Kriterien eine CFLD diagnostiziert. Patienten mit einer

CFLD hatten signifikant höhere Werte von GPT und γGT und eine erniedrigte Pro-

thrombinzeit verglichen mit den Patienten, die keine CFLD aufwiesen (Tabelle 1). Des

Weiteren wurde festgestellt, dass eine größere Anzahl von Mädchen im vorliegenden

Patientenkollektiv eine Leberbeteiligung entwickelt hatte, als Jungen (Abb. 6). Bei den

übrigen klinischen Daten konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden.

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Tabelle (1)

Demographische und klinische Daten der Kohorte der pädiatrischen Patienten mit CF.

Kinder mit Mukoviszidose (n=75) Charakteristik Keine CFLD (n=45) CFLD (n=30) Demographische und klinische Daten männlich (n/%) 27/60% 9/30% Alter (Jahren) Mittelwert (Median)+- SD

10,9 (11) +-4,9

10,6 (11,5) +-4,3

BMI SDS Mittelwert (Median) +- SD

-0,60 (-0,59) +-1,1

-0,62 (-0,54) +-0,99

Pankreasinsuffizienz (n) Exokrin Exo- und Endokrin

38 0

28 1

Lebersonographie US1 US2 US3 US4 US5

27 15 3 0 0

10 11 2 6 1

Biochemie Alanin Aminotransferase (U/l) Mittelwert (Median) ±SD Bereich γ-Glutamyl Transpeptidase (U/l) Mittelwert (Median) ±SD Bereich Bilirubin (mg/dl) Mittelwert (Median) ±SD Bereich Gesamtprotein (g/l) Mittelwert (Median) Bereich Albumin (g/dl) Mittelwert (Median) ±SD Bereich Prothrombinzeit (%) Mittelwert (Median) ±SD Bereich Thrombozytenzahl (*103/mm3) Mittelwert (Median) ±SD Bereich Hämoglobinwert (g/dl) Mittelwert (Median) ±SD Bereich INR Mittelwert (Median) ±SD Bereich Cholinesterase (U/l) Mittelwert (Median) Bereich C-reaktives Protein (mg/l) Mittelwert (Median) Bereich Ferritin (mg/l) Mittelwert (Median) Bereich

24 (22) ±10,4 10-60 15,6 (13) ±9,4 7-47 0,35 (0,3) ±0,23 0,1-0,9 73,5 (73,0) ±5,3 65-88 4,5 (4,5) ±0,34 4,1-4,8 91 (90) ±11,2 68-114 354 (333) ±104 241-757 13,7 (13,9) ±1,2 9,6-15,9 1,04 (1,1) ±0,19 0,9-1,3 10016,9 (9953,0) ±2188,1 3045-13630 4,0 (0,0) ±9,3 0,0-58,1 28,1 (24,0) ±10,8 16-56

42,4 (33) ±23*

16-88 34,8 (20) ±42*

6-164 0,58 (0,4) ±0,46 0,2-1,8 76,6 (75,0) ±6,5 68-91 4,3 (4,4) ±0,29 3,5-4,8 83 (80) ±12,6* 59-108 305 (285) ±102 71-475 13,5 (13,4) ±1,1 10,2-16 1,1 (1,1) ±0,1 0,9-1,4 10093,3 (9847,0) ±2725,4 3539-14894 2,5 (0,0) ±3,9 0,0-13,7 26,3 (24,0) ±8,1 16-45

CFLD, Leberbeteiligung (cystic fibrosis associated liver disease); BMI SDS, Bodymassindex Wert der Standardabweichung. * signifikant unterschiedlich, p<0,05.

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Häufigkeit der CF-assoziierten Leberbeteiligung (CFLD) in Abhängigkeit vom Ge-

schlecht

Abb. 6: Häufigkeit der CF-assoziierten Leberbeteiligung (CFLD) in Abhängigkeit vom Geschlecht. Weibliche Mukoviszidosepatienten zeigten eine signifikant häufigere Le-berbeteiligung, als männliche Mukoviszidosepatienten (p*=0,011).

Es konnte somit demographisch festgestellt werden, dass Mädchen signifikant häufiger

im vorliegenden Patientenkollektiv an Leberbeteiligung litten, als Jungen.

Danach wurden die Ergebnisse der TE im vorliegenden Patientenkollektiv untersucht.

4.2 Erhöhte Lebersteifigkeit bei pädiatrischen CF-Patienten mit Leberbeteiligung

Die Lebersteifigkeit, die mit Hilfe der TE-Messungen ermittelt wurde, bewegte sich

beim vorliegenden Patientenkollektiv in einer Spanne von 3 kPa bis 48 kPa. Bei Kin-

dern mit CFLD war die Lebersteifigkeit signifikant erhöht (Abb. 7, n=75; CFLD: 9,6 kPa

vs. keine CFLD: 4,7 kPa, p=0,01.)

٭

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Lebersteifigkeit bei Patienten mit Mukoviszidose und damit assoziierter Leberbeteili-

gung

Abb. 7: Lebersteifigkeit bei Patienten mit Mukoviszidose und damit assoziierter Leber-beteiligung. Die Patienten mit einer Leberbeteiligung zeigten eine signifikant erhöhte Lebersteifigkeit (CFLD: 9,6 kPa vs. keine CFLD: 4,7 kPa, p=0,01). Der signifikante Un-terschied wurde hervorgehoben (*p < 0,05). Fehlerbalken: 95 % Konvidenzinterval, O Mittelwert der Lebersteifigkeit. Im Anschluss haben wir Serum des vorliegenden Patientenkollektivs untersucht. Es

wurden sowohl Patienten mit und ohne Leberbeteiligung untersucht. Bei einigen Fibro-

se-Biomarkern konnten Tendenzen festgestellt werden, andere hatten im vorliegenden

Kollektiv keinen Einfluss auf die Leberbeteiligung.

4.3 Expression von Fibrose-Biomarkern bei CF-Patienten mit Leberbeteiligung

Serum für eine Fibrose-Biomarkeranalyse war bei 29 Kindern mit CF verfügbar. Hier-

von hatten 11 Patienten eine CFLD und 18 Patienten keine CFLD.

YKL-40 zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen Individuen mit CFLD und

solchen ohne CFLD (Abb. 8A, CFLD: 59,2 ng/ml vs. keine CFLD: 50,4 ng/ml, p=0,412).

Kinder mit CFLD zeigten eine Tendenz zur erhöhten TIMP-2 Expression verglichen mit

Kindern ohne CFLD (Abb. 8B). Jedoch erreichte diese Erhöhung keine statistische

Signifikanz (CFLD: 149 pg/ml vs. keine CFLD: 133,5 pg/ml, p=0,084). TIMP-1 zeigte

keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten mit und ohne CFLD (Abb. 8C).

HA war nicht signifikant unterschiedlich zwischen Patienten mit und ohne CFLD

٭

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(Abb. 9, CFLD: 26,6 ng/ml vs. keine CFLD: 17,5 ng/ml, p=0,642). PIIIP und MMP-9

blieben in der vorliegenden Patientenkohorte unverändert, sowohl bei Patienten mit als

auch ohne CFLD (Abb. 10A und B).

A Expression von YKL-40

B Expression von TIMP-2

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C Expression von TIMP-1

Abb. 8: Expression von YKL-40 (A), TIMP-2 (B) und TIMP-1 (C) bei Patienten mit Mu-koviszidose und damit assoziierter Leberbeteiligung. Die YKL-40- und die TIMP-1-Expression zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten mit CFLD (n=11) und Patienten ohne CFLD (n=18). TIMP-2 war tendenziell erhöht bei Kin-dern mit CFLD, allerdings erreichte die Erhöhung dieses Wertes nicht den Wert der statistischen Signifikanz. Expression von Hyaluronsäure

Abb. 9: Expression von Hyaluronsäure (HA) im Serum von Mukoviszidosepatienten mit assoziierter Leberbeteiligung (CFLD). HA zeigte den Trend zur Erhöhung bei Mukovis-zidosepatienten mit einer CFLD (n=11) im Vergleich zu Mukoviszidosepatienten ohne CFLD (n=18). Allerdings erreichte diese Erhöhung keine statistische Signifikanz.

Seite 49 von 131

A Expression von Procollagen III

B Expression von Matrixmetalloproteinase-9

Abb. 10: Expression von Procollagen III (PIIIP) (A) und der Matrixmetalloproteinase 9 (MMP-9) (B) im Serum von Mukoviszidosepatienten mit assoziierter Leberbeteiligung (CFLD). PIIIP und MMP-9 blieben in der vorliegenden Patientenkohorte unverändert sowohl bei Patienten mit CFLD (n=11) als auch ohne CFLD (n=18). Außerdem wurden noch weitere mögliche Fibrose-Biomarker untersucht und evaluiert:

MMP-1, -2, -8 und -13, M30 und M65.

Seite 50 von 131

A Expression von Matrixmetalloproteinase-1

B Expression von Matrixmetalloproteinase-2

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C Expression von Matrixmetalloproteinase-8

D Expression von Matrixmetalloproteinase-13

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E Expression von M30

F Expression von M65

Abb. 11: Expression von Matrixmetalloproteinase-1 (MMP-1) (A) der Matrix-metalloproteinase-2 (MMP-2) (B), der Matrixmetalloproteinase-8 (MMP-8) (C), der Mat-rixmetalloproteinase-13 (MMP-13) (D), M30 (E) und M65 (F) im Serum von Mukoviszi-dosepatienten mit assoziierter Leberbeteiligung (CFLD). Bei all diesen Fibrose-Biomarkern konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden.

Seite 53 von 131

Auch bei den potentiellen Biomarkern MMP-1, -2, -8, -13, M30 und M65 konnte kein

statistisch signifikanter Unterschied zwischen pädiatrischen Mukoviszidosepatienten

mit assoziierter Leberbeteiligung (CFLD) und solchen ohne assoziierte Leberbeteili-

gung ermittelt werden (Abb. 11).

Weiterhin wurde der diagnostische Wert der TE bestimmt um festzustellen, ab wel-

chem Wert in der TE in kPa man von einer Leberbeteiligung ausgehen kann. Außer-

dem wurde der optimale Wert für TIMP-2 bestimmt. Die diagnostische Aussagekraft

konnte durch Kombination der beiden Komponenten verbessert werden.

4.4 Diagnostische Aussagekraft von TE und Fibrose-Biomarkern zur Feststellung einer

Leberbeteiligung bei CF

Um den diagnostischen Wert der TE und der Fibrose-Biomarker im Serum für die Fest-

stellung einer CFLD direkt zu vergleichen, wurde ihre diagnostische Genauigkeit unter

Nutzung von ROC-Kurven bestimmt.

Die höchste diagnostische Genauigkeit wurde für TIMP-2 (AUROC: 0,697) und TE

(AUROC: 0,683) (Tabelle 2, Abb. 12) berechnet. Ein Cut-off-Wert von 5,5 kPa war bei

TE optimal für die Diagnose einer CFLD (Tabelle 3). Betrachtet man die Biomarker

zum Nachweis einer CFLD, hatte TIMP-2 einen optimalen Cut-off-Wert von 139 pg/ml

(Tabelle 3). Zudem verbesserten sich die diagnostische Sensitivität und der negative

prädiktive Wert der TE an diesem Cut-off-Wert erheblich, wenn dieser mit dem ent-

sprechenden Fibrose-Biomarker für die Diagnose einer CFLD kombiniert wurde (Tabel-

le 3).

Tabelle 2

Diagnostische Genauigkeit der TE und der Fibrose-Biomarker für die Feststellung einer

Leberbeteiligung bei pädiatrischen Mukoviszidosepatienten (n=75).

ROC-Analyse

AUROC 95% CI p-Wert

Transiente Elastographie

YKL-40

HA

TIMP-1

TIMP-2

0,683

0,596

0,556

0,500

0,697

0,557-0,810

0,370-0,822

0,307-0,804

0,244-0,756

0,503-0,891

0,007

0,393

0,621

1,000

0,080

95% CI: 95% Konfidenzintervall

Seite 54 von 131

A

B

Abb. 12: Diagnostische Aussagekraft der transienten Elastographie (A+B) und experi-menteller Fibrose-Biomarker (B) für den Nachweis einer Mukoviszidose assoziierten Lebererkrankung (CFLD). Die höchste diagnostische Aussagekraft für den Nachweis einer CFLD wurde für TIMP-2 (AUROC: 0,697) und für die transiente Elastographie (TE, Fibroscan: AUROC: 0,683) berechnet.

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Tabelle 3

Diagnostische Leistungsfähigkeit der transienten Elastographie und der Fibrose-Bio-

marker für den Nachweis einer Leberbeteiligung bei Mukoviszidosepatienten (CFLD).

Diagnostische Leistungsfähigkeit Cut-off

Sensitivität (%)

Spezifität (%)

PPW (%)

NPW (%)

TE 5,5 kPa 53,3 (34,6-71,2)

77,8 (62,5-88,3)

61,5 (40,7-79,1)

71,4 (56,5-83)

TIMP-2 139 pg/ml 72,7 (39,3-92,7)

72,2 (46,4-89,3)

61,5 (32,3-84,9)

81,3 (53,7-95)

TE+ TIMP-2

5,5 kPa 139 pg/ml

95,2 (74,1-99,8)

47,8 (27,4-68,9)

62,5 (43,7-78,3)

91,7 (59,8-96)

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5. Diskussion

Die CFLD, eine relevante Leberbeteiligung bei Zystischer Fibrose, hat je nach Studie

eine kumulative Inzidenz von 27 % bis 35 % [Co 2002], [Li 1999]. Annähernd 5-10 %

der Kinder mit CFLD entwickeln eine fortgeschrittene Fibrose und Zirrhose während

der ersten Dekade ihres Lebens. Anschließend entwickeln die meisten dieser Fraktion

während der zweiten Lebensdekade eine portale Hypertension (PHT) und die damit

verbundenen Komplikationen [Co 2002], [Li 1999]. Unter den gegebenen Umständen

werden dringend nicht-invasive diagnostische Tests für den Nachweis einer CFLD be-

nötigt. Bezug nehmend auf die speziellen Anforderungen bei Kindern, sollten diese

Tests ein schnelles aber präzises Screening in der täglichen Praxis ermöglichen und

eine kosteneffektive longitudinale Verlaufskontrolle berücksichtigen. Die momentan

angewandten Screeningmethoden weisen gravierende Limitationen auf wie geringe

Sensitivität (Leberenzyme, Ultraschall), Invasivität und Stichprobenfehler (Leberbiop-

sie), Exposition durch Röntgenstrahlung (CT) und/oder hohe Kosten (MRI, ARFI) [Co

2006].

Innerhalb unserer Studie wurden vergleichsweise der diagnostische Wert der TE und

eine Gruppe von experimentellen Fibrose-Biomarkern in einer der größten bisher

publizierten Kohorten von pädiatrischen CF-Patienten analysiert. Die Ergebnisse der

Studie zeigen, dass

(a) die Lebersteifigkeit bei Kindern mit CFLD im Vergleich zu CF-Patienten, die

keine CFLD haben, erhöht ist,

(b) die TE eine hohe diagnostische Genauigkeit für das Vorliegen einer CFLD hat,

(c) die diagnostische Sensitivität erhöht werden kann, wenn die TE mit Fibrose-

Biomarkern zur Diagnose einer CFLD kombiniert wird.

Es wurden insgesamt 75 pädiatrische CF-Patienten, mit einem maximalen Alter von 18

Jahren untersucht. Damit handelt es sich um eine der bisher größten publizierten Stu-

dien an einer pädiatrischen Kohorte mit CF [Ra 2012]. Malbrunot-Wagner et al. unter-

suchten ein Jahr zuvor 18 Kinder mittels TE unter anderem mit der Fragestellung des

Vorhandenseins von Ösophagusvarizen [Malb 2011]. Witters et al. untersuchten insge-

samt 66 CF-Patienten mit Hilfe der TE, darunter waren allerdings 10 Patienten, die

älter als 18 Jahre waren [Wit 2009]. Andere Studien schlossen zum Teil erwachsene

Patienten mit ein oder untersuchten pädiatrische Patienten mit unterschiedlichen chro-

nischen Lebererkrankungen. Menten et al. evaluierten z.B. 68 pädiatrische CF-

Patienten, aber auch erwachsene Patienten und verglichen diese mit einer Kontroll-

Seite 57 von 131

gruppe von 31 Kindern [Me 2010]. Breton et al. untersuchten 20 CF-Kinder und weitere

52 Kinder mit anderen chronischen Lebererkrankungen [Bre 2009]. De Lédinghen et al.

untersuchten zwar 116 Kinder allerdings mit unterschiedlichen Lebererkrankungen

darunter nur 42 CF-Kinder [Lé 2007]. Neuere Studien evaluierten ein altersgemischtes

Klientel, zum Beispiel 106 CF-Patienten im Alter ab 12 Jahren bis zum Erwachsenenal-

ter (41 Jahre) [Fr 2013] oder 174 CF-Patienten im Alter zwischen 6 und 24 Jahren [Ci

2014].

5.1 Transiente hepatische Elastographie

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie, bei denen eine erhöhte Lebersteifigkeit bei

Patienten mit einer CFLD festgestellt wurde, bestätigen die Ergebnisse anderer Stu-

dien und geben darüber hinaus neue Erkenntnisse in Bezug auf die Höhe des Cut-off-

Wertes für die TE. Bei 72 pädiatrischen Patienten, darunter 20 Patienten mit CF, zeig-

ten Breton et al., dass Patienten mit einer Lebererkrankung signifikant erhöhte Fibro-

Scan®-Werte (im Mittel +- 8,9 kPa, mit portaler Hypertension +-26,5 kPa, ohne portale

Hypertension 6,45 kPa) aufwiesen [Bre 2009]. Weiterhin hatten in einer Studie von

Menten et al. CF-Patienten mit einem hohen Ultraschall Score, der hinweisend auf eine

CFLD ist, eine signifikant höhere Lebersteifigkeit verglichen zu Patienten mit einem

niedrigen sonographischen Score [Me 2010]. Somit ist naheliegend, dass die TE als

Verlaufskontrolle bei Lebererkrankungen von Patienten mit CF genutzt werden könnte

[Me 2010]. Außerdem demonstrierten Witters et al., dass CF-Patienten, Kinder und

Erwachsene, mit CFLD eine erhöhte mittlere Lebersteifigkeit (8,8 kPa) verglichen mit

Individuen ohne CFLD (5 kPa) [Wit 2009] aufwiesen. 2012 wurde eine Studie veröffent-

licht, in der Erwachsene mit einer CFLD höhere Werte in der TE aufwiesen als Patien-

ten ohne CFLD [Kar 2012]. Verglichen mit den Ergebnissen von Witters und Kollegen,

fanden wir ähnliche Werte in unserem Patientenkollektiv mit einer mittleren Leberstei-

figkeit von 9,6 kPa bei CF-Patienten mit CFLD gegenüber CF-Patienten ohne CFLD

mit einer mittleren Lebersteifigkeit von 4,7 kPa [Ra 2012]. Vergleichbare Werte werden

auch bei Rath et al. 2013 beschrieben. Hier wurde eine mittlere Lebersteifigkeit bei

CFLD-Patienten von 9,95 kPa gemessen und bei Patienten ohne CFLD eine Leberstei-

figkeit von 4,3 kPa [Ra 2013].

In der vorliegenden Studie wurde die größte Passgenauigkeit für die TE bei einem Cut-

off-Wert von 5,5 kPa mit einer Sensitivität von 53,3 % und einer Spezifität von 77,8 %

erzielt. Kombiniert man die TE mit dem Fibrosemarker TIMP-2 so erhält man eine sig-

nifikant höhere Sensitivität von 95,2 %. Somit kann durch die Kombination von TE und

TIMP-2 die Sensitivität deutlich verbessert werden. Legt man den bereits etablierten

Seite 58 von 131

Cut-off-Wert von 7 kPa zugrunde, wird eine Sensitivität von 26,7-30 % und eine Spezi-

fität von 91,1-93,3 % gemessen. Auch Ciucă et al. verwendeten einen Cut-off-Wert von

5 kPa [Ci 2014], während in anderen Studien bei Friedrich-Rust et al. ein optimaler

Cut-off-Wert von 7,1 kPa gemessen wurde [Fr 2013]. In einer weiteren Studie an er-

wachsenen Patienten wurde ein Cut-off-Wert von 6,8 kPa [Ki 2013] verwendet. Ähnli-

che Cut-off-Werte wurden auch bei Rath et al. 2013 (6,3 kPa) [Ra 2013] und bei Karlas

et al. (5,9 kPa) ermittelt [Kar 2012]. Insgesamt zeigen die bisher publizierten Studien

vergleichbare Cut-off-Werte zu unseren eigenen Ergebnissen.

Eine aktuelle Arbeit aus dem Jahr 2016 konnte in einer Follow-up-Studie über einen

Zeitraum von 6 Jahren retrospektiv zeigen, dass die TE ein geeignetes Instrument zur

Messung einer Leberbeteiligung bei CF darstellt [Va 2016]. In dieser Studie wurden

150 CF-Patienten eingeschlossen im Alter von 9-24 Jahren. 20 dieser Patienten hatten

bei der ersten TE-Messung bereits eine CFLD, während 5 weitere Patienten im Laufe

des Follow-ups eine CFLD entwickelten. Im Falle einer CFLD wurde im Median ein

Wert von 14 kPa (8,7-32,2 kPa) gefunden, vs. ohne CFLD 5,3 kPa (4,9-5,7 kPa). Das

Ergebnis einer TE von >6,8 kPa zeigte eine Sensitivität von 91,5 % und eine Spezifität

von 91,7 % für die Vorhersage des Vorliegens einer CFLD [Va 2016]. Diese Resultate

bestätigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie.

5.2 Fibrosemarker im Serum

Seit vielen Jahren wird nach geeigneten Biomarkern, die eine Leberfibrose frühzeitig

anzeigen können, gesucht. Einige dieser Marker wie Hyaluronsäure, PIIINP, MMP-2,

MMP-9 und TIMP-1 [Ben 1992], [Oh 2001], wurden als mögliche Fibrose-Biomarker

diskutiert. Bis jetzt werden diese allerdings nicht in der klinischen Routinediagnostik

eingesetzt. YKL-40 könnte in Zukunft einer der Marker sein, welcher potentiell die Le-

berbiopsie als Goldstandard ersetzen kann [Oh 2001]. In der vorliegenden Studie wur-

den diese und weitere Marker auf ihre Aussagekraft hin überprüft. Diese sogenannten

Klasse-I-Marker, die sich pathophysiologisch vom Metabolismus der ECM ableiten,

stellen vielversprechende Fibrosemarker dar [Gar 2009]. Generell kann man sagen,

dass ideale Fibrosemarker eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweisen, einfach

anwendbar und messbar sind sowie kostengünstig, genau und gut reproduzierbar im

Rahmen einer Verlaufskontrolle sein sollten [Sc 2008]. Anders als bei speziellen diag-

nostischen Verfahren wie der TE, die meist nur größeren Kliniken und Zentren vorbe-

halten ist, sind Fibrose-Biomarker im Serum einfacher verfügbar und erfüllen somit die

aufgeführten Kriterien als vielversprechende Möglichkeit der Messung einer potentiel-

Seite 59 von 131

len Leberfibrose [Ra 2013]. Daher haben wir mögliche Kandidaten als Fibrose-

Biomarker identifiziert und quantifiziert.

5.2.1 Die Marker MMPs und TIMPs

MMPs und TIMPs als spezifische MMP-Inhibitoren spielen eine zentrale Rolle sowohl

in der hepatischen Fibrogenese als auch in der hepatischen Fibrolyse. Es wurde ge-

zeigt, dass TIMPs sowohl im Serum als auch im Lebergewebe eine entscheidende

Rolle in der hepatischen Fibrogenese spielen [Da 2008], [Con 2009], [Rama 2009],

[Mor 2011]. Man nimmt an, dass TIMPs vor allem über Hemmung des Abbaus der

ECM und eine nachfolgende Akkumulation von fibrotischem Gewebe wirken [Hem

2007]. Die gesteigerte Expression von TIMP-1 und TIMP-2 konnte in Rattenmodellen

mit Leberschädigung [Roe 1997] und in einigen Lebererkrankungen beim Menschen

nachgewiesen werden [Beny 1996]. Bei HCV Patienten korreliert TIMP-1 mRNA mit

dem Grad der Leberfibrose [Ya 1999] und HCV selbst ist in der Lage die TIMP-1 Ex-

pression zu stimulieren [Lic 2003]. Darüber hinaus sind TIMP-2 Proteine im Serum und

die TIMP-2 mRNA Expression in der Leber bei Patienten mit HCV ebenfalls erhöht [Lic

2003], [Bok 2000]. Das Hauptaugenmerk einer Studie von Lichtinghagen und Kollegen

lag auf dem Nachweis von einer MMP-Expression im Serum und den Hepatozyten. Die

Expression von TIMP-1 und -2 wurde zum Vergleich mit heran gezogen und es konnte

gezeigt werden, dass zirkulierendes TIMP-1 zusammen mit den mRNA-Werten von

MMP-2, -7 und -14 stark korreliert (R=0,5-0,8) und damit ein Akkumulation von fibroti-

schem Gewebe verstärkt [Lic 2003]. Außerdem konnte gezeigt werden, dass ein Aus-

schluss von Patienten mit Zirrhose diese Korrelation verschlechtert [Lic 2003]. Es wur-

de in zahlreichen weiteren Studien nachgewiesen, dass TIMP-1 bei Leberfibrose hoch-

reguliert wird [Ir 1992], [Ir 1996]. Böker et al. wiesen nach, dass TIMP-1 erst spät im

Fibroseprozess ansteigt und dass es nur eine schwache Korrelation zwischen der Akti-

vität der Fibroproliferation und hepatischem oder zirkulierendem TIMP-1 gibt [Bok

2000]. Die Werte von zirkulierendem TIMP-1 waren im Mittel nicht signifikant unter-

schiedlich zu den Daten der Kontrollpersonen, Patienten mit Hepatitis C und Patienten

mit Zirrhose. Patienten mit Zirrhose hatten aber zum Teil sehr hohe TIMP-1-Werte [Bok

2000]. Damit wurde in dieser Studie gezeigt, dass TIMP-1 erst bei fortgeschrittener

Fibrose ansteigt [Bok 2000]. Auch Rath et al. zeigten, dass bei erwachsenen CF-

Patienten TIMP-1 eine wichtige Rolle spielt. Patienten ohne CFLD zeigten niedrigere

Werte von TIMP-1 im Serum, Patienten mit CFLD zeigten etwas höhere TIMP-1 Werte

im Serum und die Patienten, die zusätzlich eine PHT aufwiesen, zeigten die höchsten

TIMP-1 Spiegel [Ra 2012]. Da sich in unserem Patientenkollektiv nur ein Kind befand,

welches eine PHT und eine Leberzirrhose aufwies, war eine entsprechende Untertei-

Seite 60 von 131

lung in die einzelnen Gruppen nicht sinnvoll. Damit ist zudem erklärbar, dass in unse-

rem Patientenkollektiv keine signifikante Erhöhung von TIMP-1 festgestellt wurde. Das

Krankheitsbild CF ist sehr heterogen, sodass die Schwere der Erkrankung individuell

differiert. Es müssten Kinder mit schwerer Beeinträchtigung der Leber und Progression

der Lebererkrankung in die Studie eingeschlossen werden um gegebenenfalls wie im

Erwachsenenkollektiv einen signifikanten Anstieg von TIMP-1 zu detektieren.

In der vorliegenden Studie wurden tendenziell erhöhte TIMP-2 Werte im Serum bei

Kindern mit CFLD im Vergleich zu denen ohne CFLD gemessen. Diese Werte erreich-

ten allerdings keine statistische Signifikanz. Dennoch haben wir eine hohe diagnosti-

sche Genauigkeit für TIMP-2 im Hinblick auf den Nachweis einer CFLD bei pädiatri-

schen CF-Patienten ermittelt. Die statistische Signifikanz wurde wahrscheinlich auf-

grund der Größe der Stichprobe (29 pädiatrische Patienten) sowie der großen interin-

dividuellen Standardabweichung nicht erreicht. Würde man das vorliegende Patienten-

kollektiv (n=75) über einen längeren Zeitraum untersuchen und dadurch eine höhere

Anzahl an Serumproben gewinnen können, wäre die Ausgangslage für TIMP-2 als

Biomarker besser.

In der Studie Rath et al. wurden signifikant erhöhte TIMP-2 Werte im Serum bei Er-

wachsenen mit CFLD und PHT im Vergleich zu Patienten mit CFLD und denen ohne

Lebererkrankung gemessen [Ra 2012]. Ferner wies TIMP-2 eine hohe diagnostische

Genauigkeit für die Feststellung einer PHT bei erwachsenen Patienten auf. Dass diese

Ergebnisse bei pädiatrischen Patienten nicht statistisch relevant waren, war darin be-

gründet, dass im vorliegenden Studienkollektiv ausschließlich ein Kind an einer PHT

litt. Außerdem haben Kinder noch nicht so lange gelebt wie Erwachsene. Somit könnte

sich allein durch den längeren Verlauf der Erkrankung bei Erwachsenen eine Leber-

fibrose, -zirrhose entwickeln einschließlich der damit verbundenen Komplikationen wie

z. B. der PHT. Durch die fortgeschrittene Lebererkrankung könnten dann auch Biomar-

ker wie TIMP-2 signifikant ansteigen. Unsere Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass TIMP-2

signifikant höher ist bei Patienten mit Fibrose im Stadium F3 bzw. F4, als bei Patienten

mit Fibrose im Stadium F0-F1 bzw. bei Kontrollpersonen [Ra 2011]. Dies zeigt, dass

erst bei fortgeschrittener Fibrose der TIMP-2-Wert sehr stark ansteigt. Zudem hat un-

sere Arbeitsgruppe gezeigt, dass TIMP-2 progredient mit dem Fibrosestadium ansteigt

[Ra 2011]. Also je höher das Fibrosestadium, desto höher der TIMP-2-Wert. Dies konn-

ten auch Liang und Kollegen in ihrer Studie belegen [Lia 2012]. Sie berechneten für

eine signifikante Leberfibrose (Stadium F2-F4) einen AUROC von 0,899 [Lia 2012].

Damit wurde klar gezeigt, dass TIMP-2 erst bei fortgeschrittener Fibrose ansteigt.

Seite 61 von 131

5.2.2 Der Marker YKL-40

Neben der TE wurden in den letzten Jahren mehrere potentiell leistungsfähige quanti-

tative Fibrose-Biomarker im Serum identifiziert. Dazu gehört unter anderem YKL-40.

YKL-40 gehört zur Familie der Chitinasen, trägt zum Umbau des Gewebes und zum

Abbau von ECM bei und YKL-40-Serumwerte korrelieren linear zur Progressionsrate

der hepatischen Fibrose bei HCV und HCV mit begleitender Schistosomiasis (Bilharzi-

ose) [Kam 2006]. Durch unsere Arbeitsgruppe wurden bereits erhöhte Serumkonzen-

trationen dieses Markers bei alkoholischer Lebererkrankung und bei durch HCV her-

vorgerufener Leberfibrose beschrieben [Ra 2011]. Die Höhe des YKL-40 im Serum

korreliert gut mit den hepatischen YKL-40 mRNA Werten, ein Hinweis darauf, dass die

Serumwerte innerhalb der Leber den Umbau der ECM widerspiegeln. Auch die Pro-

gressionsrate der Fibrose korreliert linear mit der serologischen Expression von YKL-

40 [Ra 2011]. In dieser früheren Studie konnten wir zeigen, dass YKL-40 eine höhere

diagnostische Genauigkeit bietet, als die TE für die Erkennung einer signifikanten und

fortgeschrittenen Fibrose bei Patienten mit HCV [Ra 2011]. Die Serumkonzentrationen

von YKL-40 sind bei den meisten Patienten mit moderater bis schwerer Leberfibrose

oder -zirrhose erhöht - unabhängig von der Ätiologie der Lebererkrankung - und kön-

nen somit Informationen zum aktuellen Stand der Fibrogenese in der Leber geben [Jo

2006].

Bei der vorliegenden ausschließlich pädiatrischen Studienpopulation konnte keine sig-

nifikant erhöhte YKL-40 Expression festgestellt werden. Fasst man Erwachsene und

Kinder unserer Mukoviszidosezentren zusammen, konnte man eine signifikant höhere

Expression von YKL-40 bei Patienten mit CFLD verglichen zu denen, die keine CFLD

hatten, feststellen [Ra 2012]. Weiterhin wies YKL-40 (AUROC 0,668) die höchste diag-

nostische Genauigkeit in der Gesamtpopulation der Patienten für die Diagnose einer

CFLD unter allen getesteten Fibrose-Biomarkern im Serum auf mit einem AUROC ver-

gleichbar zu dem bei der TE (AUROC: 0,681) [Ra 2012]. Obwohl YKL-40 nicht sehr

sensitiv ist, weist es eine hohe Spezifität für die Diagnose CFLD auf und in Kombina-

tion mit der TE war die diagnostische Genauigkeit für die CFLD erheblich gestiegen

verglichen zu dem jeweiligen Einzeltestverfahren [Ra 2012]. Somit stellt YKL-40 einen

vielversprechenden Fibrose-Biomarker dar, der weiter evaluiert werden sollte. Auf-

grund unserer Beobachtungen könnte man spekulieren, dass die YKL-40-Serumwerte

bei Patienten mit CFLD die Akkumulation von ECM in der Leber widerspiegeln und

dass seine Bestimmung dazu beitragen kann, fragwürdige hepatische Fibrosebefunde

gezielt zu verifizieren [Ra 2012].

Seite 62 von 131

Eine aktuelle Studie zeigt, dass in den USA für die Vorhersage eine Leberfibrose YKL-

40 keinen Vorhersagewert bei Kindern und jungen Erwachsenen hatte. In dieser Studie

wurden Patienten mit unterschiedlichen Lebererkrankungen eingeschlossen [LeeC

2013]. Es konnte hingegen in China gezeigt werden, dass YKL-40 für ein Screening

geeignet scheint, da der Marker schon in frühen Stadien und bei subklinischer Krank-

heit detektierbar ist [Tao 2014]. Somit sind Studien zu YKL-40 nicht kongruent und die

geeigneten Bedingungen bzw. die Einsetzbarkeit als Fibrosemarker muss noch genau-

er identifiziert werden.

Unsere Studie ist eine der ersten Studien, die YKL-40 bei Kindern in großer Anzahl

getestet hat und die YKL-40 im Zusammenhang der Leberbeteiligung bei CF unter-

sucht hat.

YKL-40 wurde bereits bei der CF-assoziierten Lungenerkrankung getestet und zeigte

sich dort erhöht. In die betreffende Studie wurden auch pädiatrische Patienten einge-

schlossen. Fazit der Studie war, dass YKL-40 als potentieller Biomarker für die

Lungenbeteiligung bei CF herangezogen werden kann [Hec 2011]. In dieser Studie

wurden ältere Patienten eingeschlossen (mittleres Alter 22 Jahre) [Hec 2011]. Es wur-

den insgesamt 338 CF-Patienten einbezogen. Von 59 CF-Patienten wurde Serum und

Sputum gewonnen und dies wurde zur Messung von YKL-40 verwendet [Hec 2011]. In

der hier vorliegenden Studie wurde YKL-40 in 29 Serumproben von pädiatrischen CF-

Patienten gemessen [Ra 2012]. Bei Hector et al. wurden die Serumproben bzw.

Sputumproben mit gesunden Individuen verglichen [Hec 2011]. In der vorliegenden

Studie wurden ausschließlich CF-Patienten untersucht und es wurden lediglich Patien-

ten mit und ohne CFLD verglichen [Ra 2012]. Unsere neuesten Daten zeigten eben-

falls eine Erhöhung von YKL-40 bei CF-Patienten mit moderater bis schwerer Lungen-

beteiligung [Ra 2014]. Wir belegten zudem an anderer Stelle, dass CF-Patienten mit

schwererer Lungenbeteiligung älter waren, als Patienten mit nur milder Lungenbeteili-

gung. Außerdem wurde gezeigt, dass YKL-40 signifikant erst bei moderater bis schwe-

rer Lungenbeteiligung ansteigt [Ra 2014]. In der hier vorliegenden Studie wurde auf-

grund einer anderen Zielsetzung und Fragestellung keine Unterteilung der Lungenbe-

teiligung vorgenommen und das Ausmaß der Lungenbeteiligung nicht quantifiziert [Ra

2012].

YKL-40 spielt auch bei anderen Erkrankungen eine große Rolle. Zum einen kann YKL-

40 als Akut-Phase-Protein bei Pneumonien, die durch Streptokokken hervorgerufen

wurden, detektiert werden. Bei diesen Patienten ist die Serumkonzentration von YKL-

Seite 63 von 131

40 acht- bis zehnfach höher als bei Gesunden [Jo 2006]. Zum anderen zeigten sich

auch bei rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis und Spondylitis ankylosans erhöhte YKL-

40-Werte in der Synovialflüssigkeit und im Serum. YKL-40 spielt ebenfalls bei Erkran-

kungen mit chronischer Entzündung wie Riesenzellarteriitis, chronisch entzündlichen

Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa, Morbus Crohn), Sarkoidose und systemischer

Sklerose eine Rolle [Jo 2006]. Auch bei Patienten nach Herztransplantation scheint

YKL-40 von Bedeutung zu sein [Jo 2006]. Außerdem wird YKL-40 bei Patienten mit

Tumorerkrankungen erhöht exprimiert. Es wird diskutiert, YKL-40 als Tumormarker und

als Ziel für antikarzinomatöse Therapie zu nutzen [Jo 2006]. YKL-40 könnte darüber

hinaus eine wichtige Rolle bei der Initiierung einer allergischen Entzündung spielen und

als Akut-Phase-Biomarker für Erkrankungen mit Fibrose von Nutzen sein [Tao 2014].

5.2.3 Weitere Fibrose-Biomarker

Es wurden in unserer Studie noch folgende weitere Fibrose-Biomarker evaluiert wie

verschiedene MMPs, HA, PIIIP, M30 und M65.

Auch MMP-2 ist am Auf- und Umbau der ECM beteiligt und stellt deshalb einen poten-

tiell interessanten Marker zur Erkennung einer Leberfibrose dar. MMP-2 ist ein autokri-

ner Proliferations- und Migrationsfaktor für HSCs [Ik 1999], [Beny 1999]. Dieser Marker

war in der vorliegenden Studie nicht signifikant erhöht, was am quantitativen Umfang

des Studienkollektivs gelegen haben könnte. In früheren Studien von Benten und Oh

wurde MMP-2 als Fibrosemarker vorgeschlagen, wird aber in der klinischen Routine

nicht verwendet. MMP-2 allein hat keine große Aussagekraft als Fibrose-Biomarker,

genauso wie weitere MMPs und TIMPs. Wenn man allerdings mehrere Marker parallel

untersucht, ist durchaus eine tendenzielle Aussagekraft zu finden [Ben 1992], [Oh

2001]. MMP-2 wird nicht leberspezifisch sezerniert, sodass eine Serumerhöhung von

MMP-2 nicht unbedingt durch eine Leberschädigung hervorgerufen sein muss [Ben

1992], [Oh 2001]. Leroy et al. demonstrierten in ihrer Studie ebenfalls keine signifikante

Erhöhung der MMP-2 Werte im Serum von HCV-Patienten [Ler 2004]. In einer anderen

Studie konnte ausschließlich eine signifikante Erhöhung der MMP-2 Werte bei Patien-

ten mit Leberzirrhose bei chronischer Hepatitis C gefunden werden und auch nur bei

dieser Patientengruppe existierte eine hohe Spezifität und Sensitivität in der diagnosti-

schen Aussagekraft [El 2003]. Es wurde mit der histologischen Diagnose der HCV-

Hepatitis verglichen.

Die vorliegende Studie ist eine der ersten Studien, die MMP-2 bei CF mit Leberbeteili-

gung und bei pädiatrischen Patienten untersucht hat. Bisher wurden die MMP-2 Ex-

Seite 64 von 131

pressionen ausschließlich im Zusammenhang mit pulmonalen Exazerbationen bei er-

wachsenen CF-Patienten evaluiert. In dieser Studie zeigte sich eine Verminderung von

MMP-2 bei pulmonaler Exazerbation [Ro 2009]. Somit kann MMP-2 als Marker für wei-

tere Untersuchungen durchaus heran gezogen und evaluiert werden.

MMP-9 (Gelatinase B) wird von Kupfferzellen in Primärkultur [Kni 1999], von IL-1β- und

TNF-α-stimulierten Hepatozyten [Gia 2006], IL-1α-stimulierten HSCs [Han 2004] und

bei toxisch (Alkohol- oder Tetrachlorkohlenstoff- (CCl4)) induzierter Leberschädigung

[Ro 2006] synthetisiert. Allerdings zeigte das Ergebnis der vorliegenden Studie keine

signifikante Erhöhung von MMP-9 im Serum. Im Fall der CF geht es nicht um eine toxi-

sche Leberschädigung bzw. Hepatozytenschädigung durch ein Agens, sondern es geht

vielmehr um die Leberschädigung durch einen fehlerhaften Kanal in den Gallen-

gangsepithelien und die konsekutive Cholestase bzw. Anhäufung toxischer Gallenbe-

standteile. Auch MMP-9 ist nicht leberspezifisch, sodass hier eine Ungenauigkeit vor-

liegt, da MMP-9 ebenfalls in anderen Teilen des Organismus sezerniert wird.

MMP-13 ist in der Lage das umgebende Gewebe abzubauen, damit sich im Anschluss

neu synthetisierte ECM etablieren kann [Hem 2007]. Sowohl MMP-1, als auch MMP-13

gehören zu den Kollagenasen, deren Schlüsselmerkmal es ist, Kollagen Typ I, II und III

zu spalten, essentielle Elemente der ECM [Par 2004]. MMP-13 ist eine interstitielle

Kollagenase und hochspezifische Protease, die fähig ist, unlösliches fibrilläres Typ I

Kollagen abzubauen. Dies weist darauf hin, dass MMP-13 eine wichtige Rolle in der

Leberfibrogenese spielt. Außerdem wird MMP-13 mRNA Expression in narben-

assoziierten Makrophagen in der Leber während spontaner Regression der Leberfibro-

se induziert [Fal 2007]. Im experimentellen Modell konnten Endo et al. feststellen, dass

MMP-13 auch über die Induktion von MMP-2 und -9 die spontane Regression der Le-

berzirrhose in Ratten mit zuvor induzierter Leberzirrhose beschleunigt [End 2011]. So-

mit konnte gezeigt werden, dass MMP-13 eine herausragende Rolle im Regressions-

prozess der Leberfibrose spielt [End 2011].

Benyon et al. konnten belegen, dass HSCs in der frühen Phase der Leberschädigung

vorübergehend MMP-3, MMP-13 und Uroplasminogen-Aktivator exprimieren. Außer-

dem konnte gezeigt werden, dass dies zu einem deutlichen Anstieg der Expression

von TIMP-1 führt. Dieser bewirkt weiter, dass es zu einer ausgeprägten globalen

Hemmung des Abbaus von fibrillärem Kollagen in der Leber durch die Kollagenasen

MMP-1/MMP-13 kommt [Beny 2001]. Die Aktivierung des Proenzyms oder die Inakti-

vierung von MMP-1 kann bei steigender TIMP-1-Expression inhibiert werden, wie auch

Seite 65 von 131

schon Benyon et al. berichteten [Beny 2001], indem TIMP-1 TIMP-1/MMP-1-Komplexe

ausbildet. TIMP-1 hemmt unter anderem MMP-1 [Mura 1997]. Prystupa et al. konnten

zeigen, dass bei alkoholischer Leberzirrhose MMP-13 erhöht ist und damit ein guter Fi-

brosemarker bei dieser Erkrankung sein kann [Pr 2015]. In der genannten Studie wur-

den allerdings nur erwachsene Patienten mit Leberzirrhose untersucht. Daher lässt

sich der Unterschied zur vorliegenden Studie, in der Kinder untersucht wurden, zumin-

dest teilweise erklären. Im Studienkollektiv lag nahezu noch keine Leberfibrose vor.

MMP-13 spielt darüber hinaus eine Rolle in der Entwicklung einer idiopathischen

Lungenfibrose [Nk 2013]. Daher könnte eine mögliche Erhöhung dieses Markers neben

MMP-1 ebenfalls von Bedeutung für die Diagnostik einer Leberfibrose/-zirrhose, aber

auch für andere Erkrankungen, sein [Pr 2015], [Nk 2013].

In einigen Studien konnte bisher festgestellt werden, dass HA bei Lebererkrankungen

eine Rolle spielt [Wya 2002] [Leb 2011]. Somit wurde HA auch in unserer Studie als

potentieller Fibrose-Biomarker untersucht. Wyatt et al. demonstrierten, dass die HA-

Konzentrationen als potentieller Fibrose-Biomarker bei Kindern mit klinischem oder

ultrasonographischem Nachweis einer Lebererkrankung bei Individuen höher war, die

eine stärkere Leberschädigung aufwiesen [Wya 2002]. Lebensztejn et al. zeigten eben-

falls eine signifikante Erhöhung von HA bei pädiatrischen Patienten mit nichtalkoholi-

scher Fettlebererkrankung (NAFLD) [Leb 2011].

In der vorliegenden Studie konnte die Erhöhung von HA nicht bestätigt werden. Die

HA-Konzentrationen blieben unverändert bei den Kindern, bei denen eine CFLD fest-

gestellt wurde verglichen zu denen, bei denen keine CFLD festgestellt wurde. Es konn-

te nur eine Tendenz zur Erhöhung von HA bei Kindern mit CFLD festgestellt werden,

ohne Signifikanz. Dies könnte daran liegen, dass die Leberschädigung beim vorliegen-

den Kollektiv mit einem mittleren Alter von 11 Jahren noch nicht in so hohem Ausmaße

vorhanden war. Außerdem könnte die Größe der Serum-Stichprobe (n=29) ein weiterer

Grund für dieses Ergebnis gewesen sein. Größere Stichproben sollten im Langzeitver-

lauf untersucht werden.

Leroy et al. [Ler 2004] zeigten, dass bei Patienten mit HCV sowohl PIIINP (Anzeichen

für Fibrogenese) erhöht, als auch MMP-1 (Anzeichen für Fibrolyse) verringert waren.

Bei Leroy et al. wurde festgestellt, dass weitere Fibrose-Biomarker signifikant erhöht

waren (z.B. TIMP-1, -2, MMP-2 und -9). Das untersuchte Patientenkollektiv setzte sich

aus 194 erwachsenen Patienten mit chronischer HCV-Infektion und 194 erwachsenen

Kontrollpersonen zusammen. Diese Personen waren im Mittel 43 Jahre alt. [Ler 2004].

Seite 66 von 131

In der vorliegenden Untersuchung wurden pädiatrische CF-Patienten bis zu einem Al-

ter von 18 Jahren untersucht. Es wurden demnach völlig unterschiedliche Studienkol-

lektive untersucht. Außerdem evaluierten Leroy et al. eine größere Anzahl von Patien-

ten, die bereits an schwerer Leberfibrose oder Leberzirrhose litten. Dadurch ist erklär-

bar, dass PIIINP, TIMP-1 und TIMP-2, MMP-2 und -9 stärker angestiegen waren [Ler

2004]. In der vorliegenden Untersuchung war nur ein Kind an Leberzirrhose mit porta-

ler Hypertension erkrankt.

PIIIP und MMP-1 wurden von uns ebenfalls untersucht. Es konnte kein signifikanter

Unterschied zwischen der Patientengruppe mit einer CFLD und der Gruppe ohne

CFLD festgestellt werden. Auch hier könnte die kleine Stichprobengröße (n=29) ur-

sächlich sein. Es ist möglich, dass aufgrund der unterschiedlichen Ursachen der Leber-

fibrose verschiedene Marker unterschiedlich verändert sein können und den Vorgang

der Fibrogenese verschieden beeinflussen. Bei HCV sind Viren die Ursache, bei CFLD

sind es genetische Ursachen, die zu einer Veränderung des Sekretes in den Gallen-

gängen führen.

M30 und M65 stellen potentielle Fibrose-Biomarker dar. M30 stellt ein Fragment von

CK-18 dar. Joka et al. demonstrierten für verschiedene Lebererkrankungen erhöhte

M30-Werte im Lebergewebe unter Verwendung des M30-ELISAs, die durch Caspasen

in Hepatozyten bei Patienten mit verschiedenen akuten und chronischen Lebererkran-

kungen entstehen [Jok 2012]. Diese Caspaseaktivität spiegelt Apoptose wieder. Wei-

terhin verwendeten sie M65 als Marker für den Gesamtzelltod, Nekrose und Apoptose.

Joka et al. konnte nachweisen, dass M65-Werte signifikant zwischen den Fibrosestadi-

en unterscheiden konnten und auch M30 und M65 konnten mit hoher Spezifität und

Sensitivität relevante sowie fortgeschrittene Fibrosestadien nachweisen [Jok 2012].

Lebensztejn et al. demonstrierten, dass das Fragment CK-18 (M30), ein Apoptosemar-

ker, bei Kindern mit diagnostizierter Fibrose bei NAFLD höher war, als bei Kindern mit

NAFLD ohne Fibrose. Außerdem wurde eine signifikante Korrelation mit dem Fibrose-

status von CK-18 (M30) ermittelt (r=0,32, p=0,023 [Leb 2011].

Canbay et al. legten ebenfalls dar, dass die CK-18-Bestimmung im Serum sowohl M30,

als auch M65, einen guten Nachweis einer akuten und chronischen Leberschädigung

geben kann und diese schon frühzeitig anzeigt, auch bei Patienten mit im Normbereich

liegenden Leberwerten [Can 2014]. Außerdem kann diese Bestimmung über die Aktivi-

tät der Krankheit und die Schwere der Leberschädigung Aufschluss geben [Can 2014].

Seite 67 von 131

Es wurde aufgezeigt, dass M30- und M65-Werte im Serum nach Ansprechen auf eine

antivirale Therapie bei HBV-Patienten sanken [Far 2011]. Darüber hinaus wurde eben-

so nachgewiesen, dass diese Zelltodmarker M30 und M65 bei akutem Leberversagen

für die Diagnose sehr hilfreich sein können insbesondere im Hinblick auf den Krank-

heitsverlauf [Can 2014].

In der vorliegenden Studie konnten keine signifikanten Werte dieser beiden Marker

festgestellt werden. Dies könnte darin begründet sein, dass bei CF-Patienten keine

Apoptose der Hepatozyten stattfindet, denn bei CF liegt die Ursache der Leberschädi-

gung in den Gallengangsepithelien und nicht in den Hepatozyten.

5.3 Kombinierte diagnostische Ansätze

Eine Kombination von TIMP-2 mit der TE führte bereits zu einer erhöhten diagnosti-

schen Sensitivität und einem gesteigerten negativen prädiktiven Wert für die Diagnose

einer CFLD bei Kindern [Ra 2012]. Wir konnten somit erstmals TIMP-2 als potentiell

leistungsfähigen Fibrose-Biomarker für die Diagnose einer CFLD identifizieren. Bio-

marker sind von besonderer Relevanz, da die Messungen der Lebersteifigkeit mit Hilfe

der TE noch nicht weit verbreitet und aufgrund der erheblichen Anschaffungskosten

meist auf größere Kliniken und Zentren begrenzt ist. Wir haben darauf aufbauend

durch Überprüfung weiterer Marker demonstriert, dass durch die Kombination der TE

mit TIMP-4 und Endoglin die diagnostische Genauigkeit verbessert werden und damit

die Sensitivität und der negative prädiktive Wert gesteigert werden können [Ra 2013].

In einer neueren Studie wurden Micro-RNAs mit den Ergebnissen der Leberbiopsie bei

CFLD verglichen [Coo 2015]. Diese könnten ebenfalls in Kombination mit der TE un-

tersucht und damit überprüft werden, ob die diagnostische Genauigkeit der TE in Kom-

bination mit Micro-RNAs weiter gesteigert werden kann.

In Zukunft könnten mittels Proteomanalyse oder -Genomics weitere Marker identifiziert

werden, die in Kombination mit der TE verwendet und die diagnostische Aussagekraft

und Genauigkeit weiter verbessern werden.

5.4 Limitationen der Studie

Eine mögliche Einschränkung der vorliegenden Studie könnte darin begründet sein,

dass keine histopathologischen Untersuchungen der CFLD im vorliegenden Patienten-

kollektiv vorlagen. Jedoch wird die Leberbiopsie bei CFLD aufgrund der fokalen Natur

der CFLD kontrovers diskutiert und stellt gerade bei Kindern keine Routineuntersu-

chung dar [Deb 2011], [So 1999].

Seite 68 von 131

5.4.1 Die Leberbiopsie vs. Ultraschall (Standard) vs. TE

Dennoch zeigten Berichte neueren Datums, die die Dual-Pass-Biopsie zur Reduktion

von Stichprobenfehlern genutzt haben, dass die Leberhistologie die Entwicklung einer

klinisch signifikanten Lebererkrankung bei Kindern vorhersagen kann [Lew 2011]. Bei

der Dual-Pass-Biopsie werden die Proben durch eine perkutane ultraschallgestützte

Biopsie aus dem rechten Leberlappen von verschiedenen Stellen entnommen und da-

nach direkt mit 10%-igem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet [Lew 2011]. Er-

gebnisse einer retrospektiven Analyse legen nahe, dass eine signifikante Assoziation

für die Vorhersage einer Fibrose oder Zirrhose auf der Basis von Ultraschall festgestellt

werden kann, wohingegen normale oder ungeklärte Ultraschallbefunde nicht mit der

Leberhistologie korrelieren [Mue 2008]. Es konnte also gezeigt werden, dass auffällige

Ultraschallbefunde mit der Leberhistologie korrelierten [Mue 2008].

Konträr zu Mueller-Abt et al. liefern Daten einer großen prospektiv untersuchten Kohor-

te von Kindern mit CF den Beweis, dass Ultraschallbefunde, die eine Leberbeteiligung

anzeigen im Allgemeinen anderen Manifestationen einer Lebererkrankung vorausge-

hen, und dass Ultraschallbefunde daher als ein früher Hinweis auf Lebererkrankungen

eine wichtige Rolle für die Diagnose einer CFLD bzw. PHT spielen könnten [Len 2003].

Angesichts der oben dargestellten Betrachtungen und der Tatsache, dass eine immer

größer werdende Zahl von Studien, die eine enge Beziehung zwischen dem Grad der

hepatischen Fibrose und der Lebersteifigkeit postulieren, existiert, könnte man argu-

mentieren, dass die Entnahme von Leberbiopsien nicht unbedingt notwendig ist. Es

überwiegt eher für die derzeitige Studie das erhöhte Risiko bei der Entnahme von Le-

berbiopsien speziell vor dem Hintergrund, dass Kinder in die Studie eingeschlossen

wurden. Die zweifelhafte zusätzliche diagnostische Information, die die Histologie bie-

tet, wiegt dieses erhöhte Risiko nicht auf. Daher kann auf die Leberbiopsie verzichtet

werden.

5.4.2 Die Herangehensweise bei Studien innerhalb und außerhalb Europas

Bisher existiert noch keine Studie, die TE und Leberbiopsie bei pädiatrischen CF-

Patienten mit CFLD vs. ohne CFLD vergleicht. Ähnliche Studien, die bei Kindern vor-

genommen wurden und die TE untersuchten, stammen nahezu alle aus Europa (Belgi-

en und Frankreich) [Malb 2011], [Wit 2009], [Me 2010], [Bre 2009]. Von diesen genann-

ten Studien führten ausschließlich Breton et al. von insgesamt 72 Kindern 14 Leber-

biopsien bei Notwendigkeit durch [Bre 2009]. Breton et al. untersuchten aber nicht nur

Kinder mit CF (20 Patienten), sondern auch Kinder mit anderen Lebererkrankungen

[Bre 2009]. De Lédinghen et al. untersuchten ebenfalls nicht nur Kinder mit CF, son-

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dern auch mit anderen Lebererkrankungen. Bei letztgenannter Studie wurden wenn

notwendig Leberbiopsien durchgeführt, insgesamt 33 Biopsien bei einem Studienkol-

lektiv von 116 Kindern [Lé 2007].

Es wurden einige Patientenkohorten mit Erwachsenen und Kindern untersucht [Ci

2014], [Fr 2013]. Diese Studien stammen aus Europa (Rumänien und Deutschland).

Hierbei wurden ebenfalls nahezu keine Leberbiopsien durchgeführt (bei Ciucă et al.

erfolgten zwei Leberbiopsien bei sehr fragwürdigen Befunden). Bei diesen Studien

wurde argumentiert, dass mit einer Leberbiopsie nicht immer eine klare Aussage ge-

troffen werden kann [Wit 2009], [Me 2010], [Ci 2014]. Infolge der initial fokalen Verän-

derungen bei der CFLD kann es bei der Leberbiopsie zu einem erheblichen Stichpro-

benfehler und aufgrund der fleckförmigen Verteilung der Läsionen in der Leber zur Un-

terschätzung der Schwere und Ausdehnung der CFLD oder sogar zu falsch negativen

Resultaten kommen [Br 2001], [Leeu 2014]. Die Prozedur der Leberbiopsie trägt Risi-

ken wie Blutungen und Infektionen oder auch einen Pneumothorax, der zwar nicht die

häufigste Komplikation darstellt, aber im Zusammenhang mit CF besonders gefürchtet

wird [Po 1997], [Br 2001], [Ca 2010], [Str 2010]. Die Durchführung einer Leberbiopsie

ist daher ein ethisches Problem und kann Kindern bei dieser unsicheren Aussagekraft

nicht zugemutet werden.

Bei Kindern müssen bei einer Leberbiopsie spezielle Betrachtungen vorgenommen

werden [Ov 2012]. Wegen häufig fehlender Patientenkooperation kann diese Untersu-

chung meist nur in Allgemeinanästhesie erfolgen und es dürfen nur spezielle Biop-

sienadeln je nach Körpergröße des Patienten verwendet werden [Ov 2012]. Dies

macht die Leberbiopsie bei Kindern teuer und komplizierter [Ov 2012]. Bei der Stan-

dardleberbiopsie wird nur 1/50000-tel der Leber untersucht. Dadurch ist das Risiko

eines Stichprobenfehlers hoch und kann bis zu 20-30 % betragen, gerade bei pädiatri-

schen Patienten mit PBC oder CFLD, da bei diesen Erkrankungen zunächst fokale

Veränderungen in der Leber auftreten und diese in einem so kleinen Biopsievolumen

falsch dargestellt werden können [Ov 2012]. Die Bedeutung der Leberbiopsie bleibt bei

Kindern umstritten, weil zahlreiche Lebererkrankungen selten sind und die Pathogene-

se vielfach nicht verstanden ist [Ov 2012]. Es wird ebenfalls immer mehr daran gear-

beitet nicht-invasive Verfahren zu entwickeln, die eine Lebererkrankung diagnostizieren

können [Ov 2012]. Dazu gehören Serumtests, Enzymanalysen, die Sequenzierung von

DNA und herkömmliche Bildgebungstechniken [Ov 2012]. Außerdem werden neue

bildgebende Verfahren entwickelt. Dies lässt vermuten, dass man von der invasiven

Methode der Leberbiopsie Abstand nehmen möchte [Ov 2012]. Auch andere Studien

Seite 70 von 131

sind zu dem Schluss gekommen, dass eine Leberbiopsie nicht routinemäßig eingesetzt

werden sollte bzw. muss, da eine gute Korrelation zwischen der TE und dem Fibrose-

grad der Leber immer häufiger postuliert wird [Fr 2008], [Bre 2009], [Me 2010]. Das

Risiko eines Stichprobenfehlers ist relativ hoch [Br 2001], [Leeu 2014] und mit der Le-

berbiopsie kann nicht in jedem Fall eine klare Aussage getroffen werden [Wit 2009],

[Me 2010], [Ci 2014].

In den USA und Australien wurden Studien mit Kindern durchgeführt und bei nahezu

allen Patienten eine Leberbiopsie entnommen [Coo 2015], [Leu(2) 2015]. Bei diesen

Studien wurde allerdings keine TE zum Vergleich durchgeführt, sondern Micro-RNAs

mit einem weiteren Ultraschallverfahren (ARFI) verglichen [Coo 2015], [Leu(2) 2015].

Die Arbeiten aus Übersee umfassen in beiden Fällen die Biopsie. Dies stellt einen

fragwürdigen ethischen Aspekt dar, wie weiter oben erklärt.

Ferner wäre es wünschenswert, eine höhere Anzahl an Serumproben von Kindern zur

Expressionsanalyse von Fibrose-Biomarkern einzuschließen. Jedoch repräsentiert das

Abnehmen von Blut ein invasives Verfahren bei Kindern und wird nur dann vorgenom-

men, wenn es unausweichlich ist. Daher musste die serologische Analyse auf 29 Kin-

der begrenzt werden. Diese Anzahl war dennoch groß genug, valide statistische Be-

rechnungen durchzuführen.

5.4.3 Limitationen der TE

Obwohl das Probenvolumen in der TE annähernd 100-fach größer ist als das einer

Leberbiopsie [Gom 2006], können trotzdem Stichprobenfehler vorkommen und zur

Heterogenität der Ergebnisse in der vorliegenden Studie beigetragen haben. Bei sehr

schlanken Patienten mit engen Interkostalräumen ist die TE-Messung nur sehr schwer

möglich [Pra 2013] und bei Patienten mit Aszites kommt es zu unsicheren Wert- bzw.

Fehlmessungen [Fou 2006]. Es wurde eine XL-Probe für übergewichtige Patienten

entwickelt, bei dieser sind die Schwellenwerte aber niedriger als bei der Standard M-

Probe [My 2012].

Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die TE-Werte 1,3-3 mal höher sind im Stadium der

akuten Entzündung und/oder bei moderater ALT-Erhöhung bei Virushepatitis [Tap

2012]. Diese TE-Werte normalisieren sich dann mit der Normalisierung der Laborwer-

tauffälligkeiten (Abfall der Aminotransferasen) nach akuter Exazerbation bei chroni-

scher Hepatitis. Daher kann es sein, dass eine viral begründete ALT-Erhöhung die

Ergebnisse der TE beeinflusst [Ca(1) 2008].

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Andere Einschränkungen für die akkurate Messung der Lebersteifigkeit schließen si-

nusoidale Stauung [Lebr 2008], extrahepatische Cholestase [Mil 2008], das Alter [Ket

2007] und die Verfettung der Leber (kontroverse Meinungen) [Fra 2007], [Kim 2007]

mit ein.

5.5 Prävalenz und Inzidenz der CFLD in den verschiedenen Studien

In der vorliegenden Studienkohorte wurde ein hoher Prozentsatz von pädiatrischen

Patienten mit CFLD (40 %) beobachtet. In der Literatur variiert die Prävalenz der CFLD

stark zwischen den einzelnen Studien und liegt zwischen 2 % und 68 % bei Kindern

und Adoleszenten [Co 2002], [Li 1999], [Sco 1991], [La 2004]. Auch in Autopsiestudien

zeigte sich eine recht hohe Inzidenz von unter anderem 42 % bei Maurage et al. [Mau

1989]. In der genannten Studie wurden 38 Autopsien von CF-Patienten untersucht. Bei

zehn der vorgenommenen Autopsien zeigte sich eine fokale biliäre Zirrhose und bei

sechs Patienten eine multilobuläre Zirrhose [Mau 1989]. Die Inzidenz der CFLD ist so-

mit ähnlich der in der hier untersuchten Patientenkohorte, wobei in unserer Patienten-

kohorte nur ein CF-Patient eine Leberzirrhose aufwies. Maurage et al. fanden heraus,

dass bei Patienten, die einen Mekoniumileus hatten, das Risiko an einer CFLD zu er-

kranken, höher war [Mau 1989]. Andere Studien (siehe unten) konnten dies bestätigen.

Wir haben diesen Punkt aufgrund der nicht zur Verfügung stehenden neonatologischen

Befunde nicht untersucht.

5.5.1 Prävalenz der CFLD in Abhängigkeit vom Alter und Geschlecht in einzelnen Stu-

dien

Scott-Jupp et al. fanden in ihrer Studie, in der sie 1100 CF-Patienten untersuchten,

eine Prävalenz der CFLD von 4,2 %, wobei das Alter eine Rolle spielt. Die Prävalenz

stellte sich in dieser Studie mit dem Alter progressiv wachsend dar. Während Kinder im

Alter zwischen 0 und 5 Jahren lediglich eine Prävalenz von 0,3 % aufwiesen, stieg die

Prävalenz bis zu 8,7 % im Alter von 16-20 Jahren an um danach bei Patienten über 20

Jahren wieder auf 4,1 % abzufallen [Sco 1991]. Des Weiteren fand diese Arbeitsgrup-

pe heraus, dass das mittlere Alter des Ausbruchs der Lebererkrankung bei 9,8 Jahren

(Median 10,5 Jahren) lag [Sco 1991]. Außerdem wurde festgestellt, dass das Auftreten

einer CFLD einen Peak in der Pubertät hat und dass männliche Patienten häufiger von

der CFLD betroffen sind [Sco 1991].

In der vorliegenden Studie konnte nicht belegt werden, dass männliche Patienten häu-

figer betroffen sind, als weibliche. Im untersuchten Studienkollektiv waren sogar mehr

weibliche (p=0,011), als männliche CF-Patienten von der CFLD betroffen.

Seite 72 von 131

Lindblad et al. untersuchten 124 Patienten über im Median acht Jahre regelmäßig und

teilten die Patienten wie folgt ein: eine Gruppe ohne Leberbeteiligung, eine zweite

Gruppe mit Laborauffälligkeiten, die auf eine Leberbeteiligung hindeuten und eine

Gruppe mit multilobulärer Zirrhose [Li 1999]. Hier wurde eine Leberbeteiligung bei 21-

34 % der Patienten gefunden (zweite und dritte Gruppe zusammengefasst), wobei im

Alter von 20-25 Jahren die Leberbeteiligung noch auf 34-43 % angestiegen ist [Li

1999]. Bei der Erstdiagnose einer CFLD bestand im Median eine Leberbeteiligung von

35 % bei einem Alter von 12 Jahren (Median) [Li 1999]. Das bedeutet, dass wie auch

schon bei Scott-Jupp und Kollegen gezeigt, die meisten Patienten die Leberbeteiligung

vor dem 18. Lebensjahr entwickeln und somit auch hier bei Lindblad et al. ein Peak des

Ausbruchs einer CFLD vor oder während der Pubertät aufzuweisen war [Sco 1991], [Li

1999]. 31 Patienten des gesamten Studienkollektivs waren <18 Jahre alt [Li 1999].

Während der Beobachtungszeit starben 15 Patienten und es wurde von drei dieser

verstorbenen Patienten eine Autopsie durchgeführt, bei der man eine geringe Leber-

fibrose feststellen konnte [Li 1999]. Bei dieser Arbeitsgruppe wurde also eine höhere

Prävalenz festgestellt als bei Scott-Jupp et al. Diese höhere Prävalenz korreliert mit

unseren Daten bei denen 40 % der CF-Patienten eine CFLD aufwiesen [Ra 2012].

5.5.2 Herangehensweisen bei der Diagnosefindung CFLD im Vergleich

Diese unterschiedlichen Ergebnisse der CFLD Prävalenz kommen dadurch zustande,

dass bisher keine einheitlichen Kriterien für die Diagnose einer CFLD existieren bzw.

festgelegt wurden. In den Studien variieren die Kriterien sehr stark. Bei Scott-Jupp et

al. bestanden die Kriterien aus der Anamnese, aus einer abdominalen Untersuchung

durch erfahrene Ärzte zur Feststellung einer ggf. vorliegenden Hepato- oder Spleno-

megalie und aus einer Laboruntersuchung um Veränderungen der Leberenzyme fest-

zustellen [Sco 1991]. Radiologische und Ultraschallkriterien wurden erst hinzugezogen,

wenn eine symptomatische biliäre Erkrankung wie z.B. eine Kolik vorlag [Sco 1991].

Bei Lindblad et al. wurden als Kriterien zwar ebenfalls das Labor, ein Leberfunktions-

test (biochemische Lebererkrankung genannt) und auch die abdominelle Untersuchung

zur Feststellung einer Hepato- bzw. Splenomegalie herangezogen, aber auch die Ul-

traschalluntersuchungen und zum Teil Leberbiopsien. Die Patienteneinteilung nach der

Ultraschalluntersuchung erfolgte in zwei Gruppen, normal und pathologisch (Hyper-

echogenität und/oder irreguläre Echogenität) [Li 1999]. Eine zweite Gruppe von Patien-

ten mit klinischer Lebererkrankung wie multilobulärer Zirrhose mit Hepato- und Sple-

nomegalie, mit ggf. Ösophagusvarizen, Hypersplenismus und biopsiebeweisender Zir-

rhose wurde definiert [Li 1999]. Bei Linblad und Kollegen konnte kein Zusammenhang

der Diagnose CFLD mit dem Genotyp festgestellt werden. Es wurde lediglich festge-

Seite 73 von 131

stellt, dass eine hohe Anzahl der Patienten mit multilobulärer Zirrhose homozygot für

∆F508 waren. Ein Zusammenhang mit dem Geschlecht konnte prinzipiell nicht festge-

stellt werden. Eine hohe Anzahl von Frauen wies jedoch eine multilobuläre Zirrhose auf

[Li 1999]. In unserer Studie wurde ebenfalls eine höhere Anzahl von weiblichen Patien-

ten mit CFLD gefunden (siehe Ergebnisse).

Colombo et al. untersuchten 177 CF-Patienten ohne CFLD prospektiv über einen Zeit-

raum von 14 Jahren [Co 2002]. Diese Patientenkohorte wurde alle drei Monate unter-

sucht, es wurde eine klinische Untersuchung, eine Untersuchung der Entwicklung und

eine Laboruntersuchung durchgeführt [Co 2002]. Jährlich erfolgten bei diesen Patien-

ten ein Röntgen-Thorax, ein Lungenfunktionstest, Sputumkulturen und eine Ultra-

schalluntersuchung des Abdomens [Co 2002]. In dieser Studie wurden folgende Krite-

rien für eine CFLD definiert. Zwei dieser mussten an zwei aufeinanderfolgenden Unter-

suchungen mit Abstand von einem Jahr vorliegen [Co 2002]. Das erste Kriterium wurde

als klinische Hepatomegalie (vergrößerte Leberspanne und härtere Konsistenz, der

Leberrand war mehr als 2 cm unter dem Rippenbogen in der Medioklavikularlinie tast-

bar), die mit Ultraschall verifiziert wurde, definiert. Das zweite Kriterium bestand in er-

höhten Leberenzymen wie der AST, ALT und γGT (es mussten zwei dieser erhöht

sein) und das dritte Kriterium stellten Ultraschallunregelmäßigkeiten dar wie heteroge-

ne Echogenität, knotige Veränderungen, irreguläre Leberränder oder Splenomegalie

[Co 2002]. Aus verschiedenen Gründen wurden Biopsien bei elf Patienten durchge-

führt. Bei diesen zeigten sich Zirrhose und schwere Leberfibrose in der Biopsie [Co

2002]. Während des Beobachtungszeitraums entwickelten 48 der 177 Patienten eine

CFLD, entsprechend einer Inzidenz von 27 % [Co 2002]. Das mediane Alter bei der

Diagnose war sieben Jahre und die Inzidenz bei CF-Patienten mit Mekoniumileus,

männlichen Patienten und Patienten mit schwerer Mutation (mit Pankreasinsuffizienz,

Mekoniumileus und das vollständige Fehlen der CFTR-Funktion) war erhöht [Co 2002].

Verglichen zu den anderen beiden Studien [Sco 1991] und [Li 1999] zeigte sich in

dieser Studie kein Peak des Auftretens einer CFLD in der Pubertät [Co 2002]. In unse-

rem Patientenkollektiv zeigte sich kein Unterschied im Alter der Diagnosestellung einer

CFLD, Median für CFLD 11,5 Jahre vs. ohne CFLD 11 Jahre. Die Diagnosekriterien für

eine CFLD nach Debray et al. 2011 wurden auch von uns angewandt [De 2011].

Lamireau et al. untersuchten die Prävalenz der CFLD, indem sie 241 vorwiegend pädi-

atrische CF-Patienten ohne CFLD über einen Zeitraum von ca. zehn Jahren beobach-

teten. Genauso wie bei Colombo et al. wurden die Patienten alle drei Monate mittels

klinischer Untersuchung, Untersuchung der Entwicklung, des Sputums, des Labors

(u.a. Leberenzyme und Gerinnungsparameter) und Lungenfunktionstest evaluiert [La

Seite 74 von 131

2004], [Co 2002]. Es wurden jährlich Röntgen-Thorax und abdomineller Ultraschall

durchgeführt [La 2004], [Co 2002]. Die Kriterien, die einer Diagnose einer CFLD zu-

grunde gelegt wurden, sind ähnlich. In zwei aufeinanderfolgenden Untersuchungen, die

ausschließlich sechs Monate auseinanderliegen dürfen, muss eine Bedingung der fol-

genden präsent sein: klinische Hepatomegalie, Erhöhung des Leberenzyms ALT

und/oder Ultraschallabnormitäten und/oder Zeichen einer portalen Hypertension [Co

2002], [La 2004]. 85 der untersuchten Patienten entwickelten im medianen Alter von

drei Jahren eine CFLD, das bedeutet eine mittlere Prävalenz von 35 % [La 2004]. Ge-

nauso zeigte sich eine gesteigerte Prävalenz bei männlichen Patienten (Tendenz, kei-

ne statistische Signifikanz) und bei Patienten mit Mekoniumileus [Co 2002], [La 2004].

Nur bei Lamrieau et al. zeigte sich darüber hinaus eine gesteigerte Prävalenz bei Pati-

enten mit Pankreasinsuffizienz [La 2004]. Es konnte in dieser Studie ebenfalls kein

Peak des Auftretens einer CFLD in der Pubertät festgestellt werden, sondern die Ent-

wicklung der CFLD fand hauptsächlich in der ersten Lebensdekade statt. Es zeigte sich

im Alter von zwei Jahren eine Prävalenz von 18 %, im Alter von fünf Jahren eine Prä-

valenz von 29 % und ab einem Alter von zwölf Jahren eine Prävalenz von 41 %, die

dann im weiteren Verlauf stabil blieb [La 2004]. In unserer Patientenkohorte konnte das

gesteigerte Auftreten einer CFLD bei Pankreasinsuffizienz nicht bestätigt werden. 38

Patienten von 45 Patienten der Gruppe ohne CFLD hatten eine Pankreasinsuffizienz

und 28 von 30 Patienten mit CFLD hatten eine Pankreasinsuffizienz [Ra 2012].

Sowohl Colombo et al., als auch Lamrieau et al. begannen 1990 bei Patienten mit

CFLD mit der Behandlung durch UDCA. Beide Studien konnten keine Aussage über

die Effektivität der Therapie machen.

Es konnte eindrucksvoll belegt werden, dass verschiedene Studien verschiedene Krite-

rien zur Diagnose verwendet hatten und somit eine große Diskrepanz der Prävalenz

zwischen den einzelnen Studien vorlag. Es besteht grundsätzlich die Gefahr, dass das

Vorkommen einer CFLD über- bzw. unterschätzt wird, je nachdem, welche Kriterien für

die Diagnose CFLD definiert werden.

Die hohe Prozentzahl von CFLD in unserer Studie könnte darüber hinaus Ausdruck

einer verzerrten Auswahl sein, da Patienten mit einer zum Teil schon bekannten CFLD

eine höhere Bereitschaft aufweisen, an Studien teilzunehmen, die neue diagnostische

Anwendungen für ihr Krankheitsbild, die CFLD, evaluieren. Dieser Eindruck konnte

weitestgehend bestätigt werden.

Seite 75 von 131

5.6 Ausblick

Seit einiger Zeit wird nach geeigneten nicht-invasiven Methoden zur Erkennung einer

Leberbeteiligung bei Mukoviszidosepatienten gesucht. Gerade bei Kindern sollte da-

rauf besonders Wert gelegt werden. Sowohl bildgebende Verfahren, als auch Serum-

marker wurden und werden evaluiert.

Seit 2009 wurde die transiente Elastographie, die bereits zur Erkennung anderer Le-

bererkrankungen zuverlässig eingesetzt wurde, zur Diagnostik einer CFLD erprobt und

erste vielversprechende Ergebnisse wurden publiziert [Wit 2009].

Weitere darauf folgende Studien konnten bestätigen, dass erhöhte TE-Werte eine

CFLD anzeigen [Me 2010], [Bre 2009], [Ci 2014], [Kit 2013], [Va 2016]. Auch die vor-

liegende Studie bekräftigt diese Resultate [Ra 2012].

Zurzeit werden weitere bildgebende nicht-invasive Verfahren evaluiert wie die Acoustic

Radiation Force Impulse Elastographie (ARFI) sowie Realtime Gewebe Elastographie

(RT-E) [Kar 2012], [Man 2012], [Mon 2012], [Fr 2013], [Sta 2014]. Bei diesen Verfahren

handelt es sich um ultraschallbasierte Verfahren, die sowohl quantitativ, als auch quali-

tativ die Elastizität von Geweben darstellen.

In der vorliegenden Studie wurde zum ersten Mal eine große Anzahl von möglichen

Fibrose-Biomarkern, die eine CFLD anzeigen und deren diagnostische Genauigkeit,

erforscht. Es konnte gezeigt werden, dass TIMP-2 eine hohe diagnostische Aussage-

kraft für das Vorliegen einer CFLD aufweist. Zusätzlich konnte die diagnostische Aus-

sagekraft gesteigert werden, wenn man die Messwerte der TE mit diesem Fibrose-

Biomarker kombinierte.

Inzwischen hat man weitere neuere potentielle Fibrose-Biomarker identifiziert, die eine

CFLD anzeigen können. Dazu gehören vor allem Micro-RNAs (miR) wie miR-122, miR-

21 und miR-25. Diese werden ebenfalls im Serum gemessen [Coo 2015]. Außerdem

wurden noch zwei weitere mögliche Fibrose-Biomarker beschrieben. Sowohl TIMP-4

als auch Endoglin sind erhöht bei Patienten mit CFLD und können im Zusammenhang

mit der TE die Sensitivität für die nicht-invasive Diagnose einer CFLD steigern [Ra

2013]. Somit konnte gezeigt werden, dass die diagnostische Aussagekraft durch die

Kombination der TE mit einem Fibrose-Biomarker gesteigert werden kann. In Zukunft

sollte dementsprechend zur Diagnostik einer CFLD die Kombination von TE und Fibro-

se-Biomarker herangezogen werden um eine möglichst hohe Sicherheit in der Diag-

nostik zu erreichen.

Seite 76 von 131

Der Evaluierung weiterer Fibrose-Biomarker sollte weiterhin große Bedeutung zukom-

men, da es sich hierbei um eine recht einfache nicht-invasive Methode zur Erkennung

einer CFLD handelt.

Externe Faktoren wie die Einnahme verschiedener Medikamente zur Behandlung der

CF sowie die Therapie mit UDCA könnten darüber hinaus einen Einfluss auf die

Messwerte der TE und die Expression der Fibrose-Biomarker haben. Dies sollte in

Studien evaluiert werden.

Letztendlich wäre es wünschenswert eine Studie an einem großen multizentrischen

Studienkollektiv über einen längeren Zeitraum durchzuführen.

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6. Schlussfolgerungen

Die vorliegende Erhebung ist die erste Studie, die die diagnostische Genauigkeit der

TE mit einer Gruppe von experimentellen Fibrose-Biomarkern für den Nachweis einer

CFLD in einer der weltweit größten Kohorten von pädiatrischen CF-Patienten evaluiert

hat. YKL-40 wurde bei pädiatrischen CF-Patienten bisher im Zusammenhang mit Le-

berbeteiligung bei CF nicht systematisch untersucht.

Unsere Ergebnisse belegen, dass Kinder mit CFLD eine höhere Lebersteifigkeit auf-

weisen als jene, die keine CFLD haben (CFLD: 9,6 kPa vs. keine CFLD: 4,7 kPa,

p=0,01). Zusätzlich konnte demonstriert werden, dass die TE eine hohe diagnostische

Genauigkeit für die Feststellung einer CFLD bei Kindern aufweist (AUROC: 0,683,

p=0,007). Die vorliegenden Daten liefern den ersten Nachweis, dass TIMP-2 eine hohe

diagnostische Genauigkeit für eine CFLD aufweist (AUROC: 0,697, p=0,080), und dass

die Kombination von TIMP-2 mit der TE besser geeignet ist eine CFLD nachzuweisen,

als der jeweils einzelne Test (Sensitivität 95,2 %, Spezifität 47,8 %, PPW 62,5 %, NPW

91,7 %).

Es sollten prospektive Multicenter-Studien und Langzeitstudien mit Kindern durchge-

führt werden, um das Ergebnis zu verifizieren und die TE im Langzeitverlauf zu evalu-

ieren. Außerdem sollten auch potentielle neue Fibrosemarker untersucht werden. Ziel

ist hier die Identifikation neuer Marker mit spezifischer diagnostischer Aussagekraft für

die Leberbeteiligung bei Kindern und Erwachsenen. Ein weiteres Ziel dieser Studien ist

es, dass die Leberbiopsie, die zurzeit noch den Goldstandard darstellt, nur in seltenen

Fällen oder bei strittigen Befunden durchgeführt werden muss.

Auch die TE sollte im Langzeitverlauf sowie bei anderen Lebererkrankungen getestet

werden, um deren Leistungsfähigkeit in real life Studien zu überprüfen. Darüber hinaus

sollte die TE mit neuen Untersuchungsverfahren wie z.B. ARFI verglichen werden um

die technischen Möglichkeiten der nicht-invasiven Diagnostik auszudehnen.

Seite 78 von 131

7. Zusammenfassung

Die Mukoviszidose, auch zystische Fibrose (CF) genannt, ist die häufigste autosomal-

rezessive Erkrankung in der kaukasischen Bevölkerung. Sie beruht auf einem Gende-

fekt im CFTR-Gen und damit auf der Expression eines fehlerhaften CFTR-Kanals in

allen exokrinen Drüsen. Etwa 18-37 % aller CF-Patienten entwickeln eine Leberbeteili-

gung (CFLD), welche zu einer periportalen Fibrose bis hin zu einer fokalen biliären und

weiter zu einer multilobulären Zirrhose führen kann. Bisher mangelte es an sensitiven

nicht-invasiven Methoden zur Diagnose einer CFLD.

Das Ziel dieser prospektiven Studie war es, die diagnostische Aussagekraft der TE und

einzelner Fibrose-Biomarker wie z.B. TIMP-2 und YKL-40 zur Feststellung einer CFLD

zu prüfen. Bei allen 75 pädiatrischen Patienten, aus denen das Studienkollektiv (Alter:

2-18 Jahre) bestand, wurde die TE zur Ermittlung der Lebersteifigkeit in Kilopascal

(kPa) durchgeführt. Darüber hinaus wurden bei 29 Patienten Fibrose-Biomarker im

Serum, u.a. HA, YKL-40, TIMP-2 und MMP-1, -2, -8, -9 und -13, TIMP-1, MMP-9/TIMP-

1-Komplex mittels ELISA bestimmt und analysiert.

Die Ergebnisse belegen, dass Kinder mit CFLD eine höhere Lebersteifigkeit aufweisen,

als Patienten, die keine CFLD haben (CFLD: 9,6 kPa vs. keine CFLD: 4,7 kPa). Zu-

sätzlich wurde gezeigt, dass die TE eine hohe diagnostische Genauigkeit für die Fest-

stellung einer CFLD bei Kindern aufweist (AUROC 0,683). Die vorliegenden Daten

liefern den Beweis, dass TIMP-2 eine hohe diagnostische Genauigkeit für den Nach-

weis einer CFLD aufweist (AUROC 0,697), und dass die Kombination von diesem

Biomarker mit der TE noch besser geeignet ist eine CFLD nachzuweisen, als jeder

einzelne Test (Sensitivität 95,2 %, negativer prädiktiver Wert 91,7 %).

Unsere Erhebung ist die erste Studie, die die diagnostische Genauigkeit der TE in

Kombination mit einer Gruppe von experimentellen Fibrose-Biomarkern für den Nach-

weis einer CFLD in einer der größten bisher publizierten Kohorten von CF-Patienten

evaluiert hat. Die TE stellt somit ein valides Messverfahren zur frühzeitigen Diagnostik

einer CFLD bei Kindern dar. Weiterhin kann TIMP-2 als vielversprechender Fibrose-

Biomarker im Serum für die Diagnose einer CFLD bei Kindern angesehen werden.

In weiteren Studien sollte beurteilt werden, ob die TE zur Verlaufskontrolle geeignet ist.

Die TE und die ermittelten Fibrose-Biomarker sollten in großen Studienkollektiven mit

pädiatrischen Mukoviszidosepatienten im Langzeitverlauf evaluiert werden.

Seite 79 von 131

8. Summary

Mucoviscidosis, also known as cystic fibrosis (CF), is the most common autosomal-

recessive disorder in the Caucasian population. This disease is based on a genetic

defect in the CFTR-Gene and thereby on the expression defective CFTR-Channel in all

exocrine glands. About 18-37 % of all CF-patients develop a liver involvement (CFLD),

which can cause periportal fibrosis. To end up, it might come to a progression to focal

biliary cirrhosis in further progress and at the end to multilobular cirrhosis. So far, sensi-

tive non-invasive methods for diagnosis of CFLD are lacking.

Aim of this prospective study was to evaluate the diagnostic accuracy of TE and

specific fibrosis biomarkers such as TIMP-2 or YKL-40 for assessment of CFLD. To

every one of the 75 pediatric patients, in which the study collective consists (age: 2-18

years), measurement of liver stiffness in kilopascal (kPa) were performed. In addition,

fibrosis biomarkers of 29 patients were analysed in serum including HA, YKL-40, TIMP-

2 and MMP-1, -2, -8, -9 and -13, TIMP-1 and also MMP-9/TIMP-1-complex by use of

ELISA.

The results provide the evidence, that liver stiffness measured by TE is higher in chil-

dren with CFLD, compared to those without (CFLD: 9.6 kPa vs. no CFLD: 4.7 kPa).

Furthermore, the study shows, that TE exhibit a high diagnostic accuracy for assess-

ment of CFLD in children (AUROC 0,683). Finally, the current data provide the first

evidence, that TIMP-2 exhibit a high diagnostic accuracy as proof of CFLD (AUROC

0,697), and that the combination of this biomarker with TE is in addition better adapted

for proof of CFLD as only every single test (sensitivity 95,2 %, negative predictive value

91,7 %).

The current investigation is the first study, which evaluates the diagnostic accuracy of

TE compared to a group of experimental fibrosis biomarkers for evidence of CFLD in

one of the largest cohorts of CF-patients, which is published so far. Thus, TE demon-

strates a valid measurement method of early diagnosis of CFLD in children. Further-

more, TIMP-2 could be considered as a promising serumbiomarker of fibrosis for diag-

nosis of CFLD in children.

In further studies should be evaluated, if TE is suitable for follow up. TE and measured

fibrosis-biomarkers should be evaluated in long term follow up in a larger cohort of pe-

diatric CF-patients.

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9. Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

ALT Alanin-Aminotransferase

AP alkalische Phosphatase

APRI aspartate aminotransferase to platelet ratio index – Aspartat-

Aminotransferase/Thrombozyten Ratio Index

ARFI akustische Stärkestrahlungsimpuls-Bildgebung

AST Aspartat-Aminotransferase

AUROC area under the ROC curve – Gebiet unter der ROC-Kurve

bzw. beziehungsweise

cAB capture antibody – „Fangantikörper“

cAMP cyclic adenosinmonophosphate – zyklisches Adenosinmonophosphat

CF cystic fibrosis – zystische Fibrose = Mukoviszidose

CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

CFLD cystic fibrosis associated liver disease – Leberbeteiligung bei Muko-

viszidosepatienten

CK-18 Cytokeratin-18

Cl- Chloridionen

cm Zentimeter

dAB detection antibody – „Detektionsantikörper“

d.h. das heißt

dl Deziliter

DNA Desoxy Ribonuclein Acid – Desoxyribonukleinsäure

ECM Extracellular Matrix – extrazelluläre Matrix

EGF Endothelial Growth Factor

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

engl. englisch

FBC focal biliary cirrhosis – fokale biliäre Zirrhose

Ggf. gegebenenfalls

H+ Wasserstoffion

HCO3- Bikarbonationen

HCV Hepatitis C Virus

HRP Horseradish peroxidase – Meerettichperoxidase

HSC Hepatic stellate cell – hepatische Sternzelle

IL-1β Interleukin-1β

IQR Interquartilrange – Interquartilbereich

Seite 81 von 131

kB Kilobasen

kDa Kilodalton

kg Kilogramm

kPa Kilopascal

lat. lateinisch

MBC multilobular biliary cirrhosis – multilobuläre biliäre Zirrhose

miR Micro-RNA

ml Milliliter

MMP Matrix Metalloproteinase

MRI Magnetresonance Imaging – Magnetresonanz Bildgebung

MT-1 MMP membrane transient-1 Matrix Metalloproteinase – membranständige

Matrix Metalloproteinase

mVal/l Millival pro Liter

Na+ Natriumionen

NAFLD non-alcoholic fatty liver disease – nichtalkoholische Fettlebererkrankung

norUDCA norUrsodesoxycholsäure

NPW negativer prädiktiver Wert

PHT portale Hypertension

PPV positiver prädikitiver Wert

RNA Ribonuclein Acid – Ribonukleinsäure

ROC receiver operating characteristic

SD Standard Deviation – Standardabweichung

TGF-ß Transforming Growth Faktor ß

TIMP tissue inhibitor of Metalloproteinases – Inhibitor der Metalloproteinasen

TNF-α Tumor Nekrose Faktor-α

UDCA Ursodesoxycholsäure

US Ultrasound – Ultraschall

USA United States of America – Vereinigte Staaten von Amerika

z.B. zum Beispiel

γGT γ-Glutamyltransferase

µl Mykroliter

Seite 82 von 131

10. Darstellungsverzeichnis

10.1 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Der CFTR-Kanal (nach http://pflege-und-medizin.de/Atmung/ Mucoviszi-

dose/muc.jpg) (letzter Zugriff 19.10.2015) [pf 2015] (mit freundlicher Ge-

nehmigung von PD Dr. Volker Schmieden) (Seite 3)

Abbildung 2: Aufbau des Gerätes der transienten Elastographie (FibroScan®, Echo-

sens, Paris, Frankreich) (modifiziert nach http://www.medizin2.uk-

wuerzburg.de/typo3temp/pics/4dbbed2632.jpg) (letzter Zugriff

22.10.2012) [med 2012] (Seite 26)

Abbildung 3: Ultraschallsonde des Gerätes (modifiziert nach http://www.medizin2.uk-

wuerzburg.de/uploads/pics/fibro1.jpg) (letzter Zugriff 22.10.2012) [med

2012] (Seite 26)

Abbildung 4: Schematische Darstellung der transienten Elastographie (modifiziert

nach Castera et al. Journal of Hepatology 2008) [Ca(1)2008] (Seite 39)

Abbildung 5: Das Prinzip des Sandwich-ELISA (nach http://www.uscnk.de/typo3temp/

pics/77e704ecc5.jpg) (mit freundlicher Genehmigung von Dr. Chris Sun

– cloud-clone.com) (letzter Zugriff 19.10.2015) [us 2015] (Seite 41)

Abbildung 6: Häufigkeit der CF-assoziierten Leberbeteiligung (CFLD) in Abhängigkeit

vom Geschlecht. Weibliche Mukoviszidosepatienten zeigen eine signifi-

kant häufigere Leberbeteiligung, als männliche Mukoviszidosepatienten

(p*=0,011). (Seite 45)

Abbildung 7: Lebersteifigkeit bei Patienten mit Mukoviszidose und damit assoziierter

Leberbeteiligung. Die Patienten mit einer Leberbeteiligung zeigten eine

signifikant er-höhte Lebersteifigkeit (CFLD: 9,6 kPa vs. keine CFLD: 4,7

kPa, p=0,01). Der signifikante Unterschied wurde hervorgehoben (*p <

0,05). Fehlerbalken: 95% Konvidenzinterval, O Mittelwert der Leberstei-

figkeit. (Seite 46)

Abbildung 8: Expression von YKL-40 (A), TIMP-2 (B) und TIMP-1 (C) bei Patienten

mit Mukoviszidose und damit assoziierter Leberbeteiligung. Die YKL-40-

Seite 83 von 131

und die TIMP-1-Expression zeigte keine signifikanten Unterschiede zwi-

schen Patienten mit CFLD und Patienten ohne CFLD.

TIMP-2 war erhöht bei Kindern mit CFLD, allerdings erreichte die Erhö-

hung dieses Wertes nicht den Wert der statistischen Signifikanz. (Seite

47-48)

Abbildung 9: Expression von Hyaluronsäure (HA) im Serum von Mukoviszidosepa-

tienten mit assoziierter Leberbeteiligung (CFLD). HA zeigte den Trend

zur Erhöhung bei Mukoviszidosepatienten mit einer CFLD im Vergleich

zu Mukoviszidosepatienten ohne CFLD. Allerdings erreichte diese Er-

höhung keine statistische Signifikanz. (Seite 48)

Abbildung 10: Expression von Procollagen III (PIIIP) (A) und der Matrixmetalloproteina-

se 9 (MMP-9) (B) im Serum von Mukoviszidosepatienten mit assoziierter

Leberbeteiligung (CFLD). PIIIP und MMP-9 bleiben in der vor-liegenden

Patientenkohorte unverändert, sowohl bei Patienten mit CFLD, als auch

ohne CFLD. (Seite 49)

Abbildung 11: Expression von Matrixmetalloproteinase 1 (MMP-1) (A) Matrix-

metalloproteinase 2 (MMP-2) (B), Matrixmetalloproteinase 8 (MMP-8)

(C), Matrixmetalloproteinase 13 (MMP-13) (D), M30 (E) und M65 (F) im

Serum von Mukoviszidosepatienten mit assoziierter Leberbeteiligung

(CFLD). Bei all diesen Fibrose-Biomarkern konnte kein signifikanter Un-

terschied festgestellt werden. (Seite 50-52)

Abbildung 12: Diagnostische Aussagekraft der transienten Elastographie (A+B) und

einiger experimenteller Fibrose-Biomarker (B) für den Nachweis einer

Mukoviszidose assoziierten Lebererkrankung (CFLD). Die höchste diag-

nostische Aussagekraft für den Nachweis einer CFLD wurde für TIMP-2

(AUROC: 0,728) und für die transiente Elastographie (TE, Fibroscan:

AUROC: 0,676) berechnet. (Seite 54)

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10.2 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Demographische und klinische Daten der Kohorte der pädiatrischen

Mukoviszidosepatienten. (Seite 44)

Tabelle 2: Diagnostische Genauigkeit der transienten Elastographie und der Fibrose-

Biomarker für die Feststellung einer Leberbeteiligung bei pädiatrischen

Mukoviszidosepatienten (n=75). (Seite 53)

Tabelle 3: Diagnostische Leistungsfähigkeit der transienten Elastographie und der

Fibrose-Biomarker für den Nachweis einer Leberbeteiligung bei Mukoviszi-

dosepatienten (CFLD). (Seite 55)

Seite 85 von 131

11. Literaturverzeichnis

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[Ye 2008] YESHUA H, OREN R: Non-invasive assessment of liver fibrosis. Ann Trans-

plant 2008; 13(2): 5-11.

[Yo 2000] YOSHIJI H, KURIYAMA S, MIYAMOTO Y et al: Tissue inhibitor of metallo-

proteinase-1 promotes liver fibrosis development in a transgenic mouse model. Hepa-

tology 2000; 32(6): 1248-1254.

Seite 120 von 131

[Zi 2000] ZIELENSKI J: Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Respiration 2000;

67(2): 117-133.

[Zi 1999] ZIELENSKI J, COREY M, ROZMAHEL R, MARKIEWICZ D, AZNAREZ I,

CASALS T, LARRIBA S, MERCIER B, CUTTING GR, KREBSOVA A, MACEK M JR,

LANGFELDER-SCHWIND E, MARSHALL BC, DECELIE-GERMANA J, CLAUSTRES

M, PALACIO A, BAL J, NOWAKOWSKA A, FEREC C, ESTIVILL X, DURIE P, TSUI

LC: Detection of a cystic fibrosis modifier locus for meconium ileus on human chromo-

some 19q13. Nat Genet 1999; 22(2): 128-129.

Seite 121 von 131

12. Publikationsverzeichnis

Teile der vorliegenden Dissertationsschrift wurden in folgenden Arbeiten veröffentlicht:

Originalarbeiten:

Rath T, Menendez KM, Kügler M, Hage L, Wenzel C, Schulz R, Graf J, Nährlich

L, Roeb E, Roderfeld M. TIMP-1/-2 and transient elastography allow non invasive

diagnosis of cystic fibrosis associated liver disease. Dig Liv Dis 2012 Sep; 44(9); 780-

787.

Rath T, Hage L, Kügler M, Menendez Menendez K, Zachoval R, Naehrlich L, Schulz

R, Roderfeld M, Roeb E. Serum proteome profiling identifies novel and powerful mar-

kers of cystic fibrosis liver disease. PLoS One. 2013; 8(3): e58955.

Rath T, Zwaschka L, Hage L, Kügler M, Menendez K, Naehrlich L, Schulz R, Roder-

feld M, Roeb E. Identification of neutrophil activation markers in CF patients as novel

surrogate markers of CF lung disease. PLoS One. 2014; 9(12): e115847.

Abstractveröffentlichungen:

Kügler M, Menendez Menendez K, Roderfeld M, Rath T, Schulz R, Geidel Ch, Nähr-

lich L, Tschuschner A, Weiß M, Roeb E. Früherkennung der Leberbeteiligung bei Mu-

koviszidosepatienten mittels transienter Elastographie und Fibrose-Biomarkern. Jah-

restagung der Deutschen Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten

(DGVS) 2011, Leipzig. Z Gastroenterol 2011; 49 - P395

Kügler M, Menendez K, Rath T, Schulz R, Geidel Ch, Nährlich L, Tschuschner A,

Weiß M, Roderfeld M, Roeb E. TIMP-2, ein Serum-Marker für portale Hypertension bei

Mukoviszidosepatienten. Tagung der Deutschen Arbeitsgemeinschaft zum Studium der

Leber (GASL) 2012, Hamburg. Z Gastroenterol 2012; 50 - P3_21

Kügler M, Menendez Menendez K, Rath T, Schulz R, Geidel Ch, Nährlich L,

Tschuschner A, Weiß M, Roderfeld M, Roeb E. Portale Hypertension korreliert mit Fib-

rose-Biomarkern bei Patienten mit Zystischer Fibrose. Kongress der Mitteldeutschen

Gesellschaft für Gastroenterologie (MGG) 2012, Jena. Der Gastroenterologe Volume

7, Issue 2 March 2012 p 168

Seite 122 von 131

Kügler M, Menendez M, Rath T, Schulz R, Geidel C, Nährlich L, Roderfeld M, Roeb E.

Transiente Elastografie und Serummarker ermöglichen die Diagnose einer Leberbetei-

ligung bei pädiatrischen Mukoviszidosepatienten. Jahrestagung der Deutschen Gesell-

schaft für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten (DGVS) 2013, Nürnberg. Z Gas-

troenterol 2013; 51 - K301

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13. Anhang

13.1 Einwilligungserklärung der Patienten zur Teilnahme an der Studie

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13.2 Patienteninformation

UNIVERSITÄTSKLINIKUM GIESSEN UND MARBURG

Patienteninformation zur Studie : „Früherkennung und Verlauf der Leberbeteiligung bei Mukoviszidose-Patienten mittels Elastographie (Fibroscan®)“ Liebe Patienten und Eltern! Im Rahmen unserer Doktorarbeit möchten wir Dich / Sie bitten, dass Du / Ihr Kind an der oben genannten Studie teilnimm(s)t. Die Studie hat zum Ziel, die mögliche Leber-beteiligung bei Mukoviszidose-Patienten genauer zu untersuchen. Im Verlauf der Mukoviszidose kann es bei ca. 10- 15% der Patienten zu bindegewebi-gen Veränderungen der Leber (zunächst Fibrosierung, später sog. Zirrhose) kommen. Im frühen Krankheitsstadium der Fibrosierung sind von den Patienten in der Regel kei-ne Symptome bemerkbar. Je fortgeschrittener die Fibrose jedoch ist, desto eher kann es zur Zirrhose und den damit verbundenen Komplikationen kommen. Ziel der Studie ist es, mit einem neuartigen Untersuchungsgerät – dem Fibroscan® – Veränderungen der Leber frühzeitiger als bisher möglich, zu erkennen. Die Ergebnisse werden nur von Leberspezialisten interpretiert, denen die Erkrankung Ihres Kindes und deren klinischer Rahmen bekannt sind. Darüber hinaus wäre es von Nutzen, wenn man Ihrem Kind eine geringe Menge Blut (4-5 ml) entnehmen könnte, welches ebenfalls für die Studie benötigt wird. Eine Blut-entnahme wird allerdings nur im Rahmen der jährlichen Kontroll-Blutentnahmen durch-geführt, so dass kein extra „Piks“ erfolgen wird - außer ggf. bei jugendlichen Patienten, die dies selbst wünschen. Im Blut sollen Leberwerte (u. a. Enzyme) gemessen werden, deren Bestimmung sonst in der Routineblutuntersuchung so nicht erfolgt. Diese sollen dann mit den Ergebnissen der Fibroscan®-Untersuchung in Zusammenhang gebracht werden. Ziel ist, hierbei einen Marker zu entwickeln, der in Zukunft bereits frühzeitig eine beginnende Fibrosierung der Leber anzeigt. Die Untersuchung mittels Fibroscan® ist schmerzlos und schnell durchführbar. Sie gleicht in ihrem Untersuchungsablauf einer Sonographie (Ultraschall). Dabei kommt es zu keinerlei Strahlenbelastung. Selbstverständlich ist Dein / Ihr Einverständnis zur Teilnahme an dieser Studie freiwil-lig; Du kannst / Sie können Ihre Einwilligung jederzeit widerrufen, ohne dass Dir / Ihnen hieraus Nachteile entstehen. Sollten weitere Fragen auftreten, so wird Dir / Ihnen Ihr behandelnder Arzt diese gern beantworten. Wir danken für Ihre Mitarbeit. Katrin Menéndez Marion Kügler Prof. Dr. E. Roeb Dr. Ch. Geidel (Doktorandin) (Doktorandin) (Leiterin Gastroenterologie (Komm. Leiter der

Betreuerin der Doktorarbeit) CF-Ambulanz)

Seite 125 von 131

13.3 Ethikvotum

Seite 126 von 131

13.4 Urkunde zur Durchführung der TE

Seite 127 von 131

13.5 Durchführung des ELISA exemplarisch für TIMP-1

Herstellung der einzelnen Reagenzien jeweils pro Mikrotiterplatte:

- Capture Antibody (cAB):

1. Aliquot á 62,5 μl cAB in 10,96 ml PBS lösen,

2. Mikrotiterplatte mit dieser Lösung vorbeschichten, indem man 100 μl pro

Well invers pipettiert,

3. über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.

- Wash Buffer:

1. 0,05 % Tween in PBS lösen, d. h. 1 ml Tween 20 pure in 2 l PBS lösen,

2. Lösung steril mit Steritopfilter filtrieren.

- Reagent Diluent:

1. 1 % BSA in PBS, d. h. 3 g BSA in 297 ml PBS lösen,

2. Lösung steril mit Steritopfilter filtrieren.

- Proben:

1. auf Trockeneis vorsortieren,

2. Proben 1:200 verdünnen,

3. 5 µl der jeweiligen Probe mit 995 µl Reagent Diluent verdünnen.

- Standard:

1. 3 Aliquots á 20 µl,

2. 60 µl Standard in 540 µl Reagent Diluent lösen 600 µl – Standard G,

3. in 6 Eppendorff-Gefäße je 250 µl Reagent Diluent vorgeben (Standard

A-F),

4. als Leerwert 500 µl Reagent Diluent vorgeben,

5. aus Standard G 250 µl in Eppendorff-Gefäß für Standard F weiter pipet-

tieren, danach vermischen,

6. aus Standard F 250 µl in Eppendorff-Gefäß für Standard E weiter pipet-

tieren, danach vermischen,

7. dies analog für Standard A-D,

8. Standard A-G ist nun eine Verdünnungsreihe, wobei in Standard G die

höchste Konzentration an Standard ist und in Standard A die niedrigste

Konzentration des Standards; Blank ist frei von Standard.

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- Detection Antibody (dAB):

o Aus einem Aliquot á 62,5 µl dAB 9 µl herauspipettieren und in 10,94 ml

Reagent Diluent lösen.

- Streptavidin-HRP:

1. 1:200 verdünnen,

2. 55 µl Streptavidin-HRP in 10,95 ml Reagent Diluent lösen.

- Substrat Solution:

1. 1:1 Mix aus Duo-Set-Kit,

2. 5,5 ml Color Reagent A (H2O2) mit Color Reagent B (Tetramethylbenzi-

din) vermischen,

3. vor direktem Licht schützen.

- Stoplösung:

o 2 ml Schwefelsäure (H2SO4)

Durchführung der ELISA-Prozedur:

Ein Tag bevor der ELISA gemessen wurde, musste die benötigte Anzahl von Mikroti-

terplatten vorbeschichtet werden. Hierzu verwendete man die hergestellte cAB-Lösung.

In jedes Well der Mikrotiterplatte wurden 100 µl dieser Lösung pipettiert. Dies wurde

mit einer Multipette durchgeführt. Um möglichst genau zu arbeiten, war es notwendig,

invers zu pipettieren. Die vorbeschichtete Platte inkubierte über Nacht bei Raumtempe-

ratur.

Am Tag der ELISA-Messung wurde die Platte drei Mal mit dem hergestellten Wasch-

puffer gewaschen um die nichtgebundenen Anteile zu entfernen. Am Ende des

Waschens wurde die Platte trocken geklopft. Danach wird Blockierlösung, Reagent

Diluent, in jedes Well zugegeben, in dem 150 µl Reagent Diluent in jedes Well der Plat-

te pipettiert wurden. Anschließend folgte eine mindestens einstündige Inkubation bei

Raumtemperatur, gefolgt von einer Wiederholung des o. g. Waschschrittes. Dann war

die Platte fertig für das Auftragen der Serumproben.

In der Zwischenzeit tauten die Serumproben der Patienten auf Eis auf und sind 1:200

verdünnt worden. Darüber hinaus ist ebenfalls die Verdünnungsreihe des Standards

hergestellt worden, von der zuerst jeweils 100 µl zur Kontrolle aufgetragen wurden.

Danach pipettierte man 100 µl der verdünnten Serumproben der Patienten auf die

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Mikrotiterplatte. Sowohl die Standards als auch die Serumproben wurden jeweils dop-

pelt aufgetragen um ein möglichst genaues Ergebnis zu erlangen. Hierzu wurde ein

Mittelwert aus beiden Messungen gebildet. Es folgte eine weitere Inkubationszeit. Die

Platte wurde mit einer klebenden Folie abgedeckt und bei Raumtemperatur zwei Stun-

den inkubiert.

Danach wurden alle nicht gebundenen Teile entfernt und es folgte ein weiterer Wasch-

schritt. Diesmal wurde die Platte vier Mal mit dem hergestellten Waschpuffer gewa-

schen und danach trocken geklopft.

Als nächster Schritt schloss sich das Auftragen von 100 µl der hergestellten dAB-

Lösung in jedes Well der Platte an. Dies konnte wieder mit der Multipette und inversem

Pipettieren durchgeführt werden. Die Platte wurde dann erneut mit einer klebenden

Folie abgedeckt und wiederum zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Es folgte das erneute Entfernen aller nicht gebundenen Anteile und ein erneuter

Waschschritt wie oben beschrieben.

Nun gab man 100 µl der hergestellten Streptavidin-HRP-Lösung mit der Multipette in

jedes Well, deckte erneut mit klebender Folie ab und inkubierte die Platte weitere 20

Minuten bei Raumtemperatur.

Es folgte ein weiterer Waschschritt wie oben erklärt.

Im nächsten Schritt wurden 100 µl der hergestellten Substratlösung in jedes Well der

Mikrotiterplatte pipettiert und die Platte danach 20 Minuten inkubiert, wobei vermieden

werden sollte, sie direktem Licht auszusetzen.

Zum Schluss wurden in jedes Well der Platte 50 µl Stoplösung gegeben, gefolgt von

einem vorsichtigen Klopfen, seitlich an die Platte, um zu mischen.

Danach wurde die Platte mittels eines ELISA-Readers gelesen und die optische Dichte

der einzelnen Wells bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Bei einer Re-

ferenzwellenlänge von 540 nm oder 570 nm wurde die Platte zwecks Frage der Korrek-

tur der Werte noch einmal gemessen.

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14. Erklärung zur Dissertation

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne unzulässige

Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Alle

Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nicht veröffentlichten

Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen,

sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Disserta-

tion erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Pra-

xis, wie sie in der "Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter

wissenschaftlicher Praxis" niedergelegt sind, eingehalten sowie ethische, datenschutz-

rechtliche und tierschutzrechtliche Grundsätze befolgt. Ich versichere, dass Dritte von

mir weder unmittelbar noch mittelbar eine geldwerte Leistung für Arbeiten erhalten ha-

ben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, oder

habe diese nachstehend spezifiziert. Die vorgelegte Arbeit wurde weder im Inland noch

im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum

Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt. Alles aus

anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit

verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kennt-

lich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt oder indirekt an

der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. Mit der Überprüfung meiner

Arbeit durch eine Plagiatserkennungssoftware bzw. ein internetbasiertes Softwarepro-

gramm erkläre ich mich einverstanden.

Gießen, im August 2016

Marion Uta Kügler

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15. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Entstehung die-

ser Arbeit unterstützten.

Zuallererst möchte ich mich bei meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. Elke Roeb bedan-

ken, die mir mit Rat und Tat bei allen Problemen und Fragen zur Seite gestanden hat.

Ich möchte ihr auch für die Überlassung des Themas, ihr entgegengebrachtes Vertrau-

en und für ihre wertvollen Anregungen danken.

Weiterhin gilt mein besonderer Dank an alle Mukoviszidosepatienten, die sich für die

Studie zur Verfügung gestellt und damit diese Arbeit erst möglich gemacht haben. Mein

Dank gilt weiterhin auch dem Mukoviszidoseförderverein, insbesondere Prof. Dr. Lin-

demann.

Außerdem bedanke ich mich ganz herzlich bei Martin Roderfeld, dem Laborleiter der

Gastroenterologie Arbeitsgruppe Prof. Dr. Roeb und dem gesamten Laborteam insbe-

sondere Annette Tschuschner und Michaela Weiß (ehem. Teammitglied) für die gute

Zusammenarbeit und Unterstützung bei der Durchführung der Serumprobenanalysen.

Darüber hinaus möchte ich mich auch bei dem Team der Ambulanz in der Kinderklinik

bedanken und bei Frau Seeger, der Sekretärin von Frau Prof. Dr. Roeb, für die gute

Zusammenarbeit.

Des Weiteren gilt mein Dank meiner Mit-Doktorandin Dr. med. Katrin Menendéz Men-

endéz, mit der ich gemeinsam Patienten für die Studie rekrutiert und die Laboruntersu-

chungen durchgeführt habe. Weiterhin gilt mein ganz besonderer Dank Herrn Dr. med.

Timo Rath, ohne den ich dieses Thema für die Doktorarbeit nie bekommen hätte und

für seine umfangreiche Unterstützung bei der statistischen Datenaufarbeitung.

Zu Beginn wurde eine statistische Beratung durchgeführt. Da möchte ich dem Statis-

tikteam vor allem Herrn Dr. Bödecker ebenfalls für die fachkundige Beratung danken.

Zuletzt möchte ich mich noch bei meinen Eltern und meinem Verlobten bedanken, die

mich genauso in der Zeit der Entstehung der Doktorarbeit immer unterstützt und mich

stets motiviert haben.