Ultrafiltration und Ultrazentrifugation zur Konzentrierung von … · 2014-10-07 · Büttner C,...
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Ultrafiltration und Ultrazentrifugation zur Konzentrierung von Pflanzenviren in Nährlösung Janina Vincenz, Martina Bandte, Carmen Büttner Humboldt-Universität zu Berlin, Fachgebiet Phytomedizin, D-14195 Berlin Danksagung: Die Arbeiten wurden finanziell durch die BLE (Förderkennzeichen: 28-1-55.026-11) unterstützt. Das Pepino mosaic virus (PepMV, Genus Potexvirus) wurde in Europa erstmals 1999 in Gewächshaustomaten nachgewiesen und konnte sich auf Grund seiner leichten mechanischen Übertragbarkeit schnell in den Beständen ausbreiten. Die substratlose Kultivierung mit rezirkulieren- den Nährlösungen trägt zur Ausbreitung des Erregers bei (Schwarz et al., 2010). Der Nachweis des Erregers in Pflanzenmaterial erfolgt mit Hilfe einer RT-PCR oder eines ELISA. Nachfolgend wird die Ultrafiltration und Ultrazentrifugation zur Konzen- trierung von Pflanzenviren in Nährlösung mit dem Ziel der Unter- schreitung der Nachweisgrenze serologischer Testverfahren vorgestellt und diskutiert. Material & Methoden Ergebnisse & Diskussion Zusammenfassung Einleitung Tomatenpflanzen (Solanum lycopersicum L.) der Sorten Hildares und Hoffmann´s Rentita wurden unter Gewächshausbedingungen in Hydrokultur und Nutrient Film Technic (NFT) kultiviert (Abb. 2). Die PepMV-infizierten Tomatenpflanzen wurden durch mechanische Inokulation hergestellt und im Wechsel mit nicht-virusinfizierten Tomatenpflanzen in den Versuch eingestellt. Die Nährlösung als auch die Pflanzen wurden regelmäßig beprobt. Die Konzentration der Viruspartikeln erfolgte aus den Nährlösungen mit Hilfe einer Tangentialflussfiltration (TFF, Abb. 3) unter Verwendung einer Polyethersulfon (PES) Membran mit einer Porengröße von 10 kD (Biomax®, Millipore). Es wurden jeweils 1/10 bzw. 1/20 des Nährlösungsvolumens als Probenumfang gewählt. Das Retentat der TFF wurde einer Ultrazentrifugation für 120 Minuten bei 30.000 rpm in einem Ti70-Rotor (Beckman-Coulter GmbH) bei 4°C unterzogen. Der Nachweis von PepMV wurde mit Hilfe des DAS-ELISA unter Verwendung spezifischer Antikörper (AS-1022, DMSZ, Braunschweig, Germany) vorgenommen. Die gemeinsame Kultivierung gesunder und infizierter Pflanzen in einem Hydrokulturgefäß führte zu einer sehr schnellen Übertragung des PepMV über die Nährlösung. Bereits sieben Tage nach Versuchsaufbau waren alle Pflanzen infiziert (Abb. 4). Der Nachweis konnte dabei sowohl in Wurzel- als auch Blattmaterial erfolgen. Wie zu erwarten stiegen die Extinktionswerte und damit der Virustiter im Probenmaterial mit zunehmender Kulturdauer. Wasserproben mit einem Volumen von 1 Liter wurden 14 und 21 Tage nach Versuchsaufbau entnommen und einer Ultrafiltration unterzogen. Erwartungsgemäß konnte PepMV nur im ultrafiltrierten Retentat (mit von der Membran zurückgehaltene Partikeln), nicht aber im ultrafil- trierten Permeat (mit den die Membran passierten Partikeln) nachgewiesen werden (Abb. 4). Auch in Proben aus den Nährlösungstanks der mit NFT kultivierten Tomaten war PepMV nachzuweisen (Abb. 5). Die Proben wurden 14, 21 und 28 Tage nach dem Versuchsaufbau entnommen und umfassen jeweils 10 Liter. In allen ultrazentrifugierten Retentaten der Tangential- flussfiltration konnte PepMV nachgewiesen werden; in den ultra- zentrifugierten Permeaten hingegen waren erwartungsgemäß keine Erreger nachzuweisen. Die Extinktionswerte der Proben aus den Nährlösungstanks waren deutlich niedriger als diejenigen aus den Hydrokulturgefäßen. Diese sind ursächlich auf die unterschiedlichen Volumina der Proben (im Verhältnis zum Behältervolumen) und die Anzahl der infizierten Pflanzen bezogen auf Volumen der Nährlösung zurückzuführen. Das Pepino mosaic virus wird durch die Nährlösung übertragen und breitet sich über die Wurzel systemisch in der Pflanze aus. Mit Hilfe einer Tangentialflussfiltration (TFF) und anschließender Ultrazentrifugation können Viruspartikel aus der Nährlösung in einem solchen Umfang konzentriert werden, dass ein Nachweis des PepMV mit dem für die Routinetestung etablierten DAS-ELISA erfolgen kann. Um die Ausbreitung von PepMV im Bestand zu minimieren, ist insbesondere beim Auftreten von Pflanzen mit virusverdächtigen Symptomen eine Untersuchung der rezirkulierenden Nährlösung vorzunehmen. Zur Bewässerung eingesetztes Oberflächenwasser sollte regelmäßig auf eine Kontamination mit pflanzenschädigen- den Viren geprüft werden. Literatur Schwarz D, Beuch U, Bandte M, Fakhro A, Büttner C, Obermeier C, 2010: Spread and interaction of Pepino mosaic virus (PepMV) and Pythium aphanidermatum in a closed nutrient solution recirculation system: effects on tomato growth and yield. Plant Pathology, 59, 443-452. Büttner C, Bandte M, Pettitt TR, 2014: Filtration and centrifugation for detection of plant pathogens in irrigation water(eds. Hong C., Moorman GW., Wohanka W., Büttner C.: Biology, detection and management of plant pathogens in irrigation water), APS Press, in press. b Abb. 3: Apparatur zur Vor- und Ultrafiltration von Nährlösung a) Vorratskanister (Retentat, Ausgangslösung) b) Kanister (Permeat) c) Vorfilter (Millipore Opticap® XL 5 Capsule, Porengröße 10 μm) d) Förderpumpe (Fa. Masterflex ®) e) Pellicon Filterhalter mit Ultrafiltrationskassette (Fa. Millipore) (b) (c) (d) (e) (a) Abb. 2: Versuchsdesign zur Übertragung von Pepino mosaic virus (PepMV) mit der Nährlösung bei Nutzung der Nährfilm- technik (A) und der Hydrokultur (B) PepMV-infizierte Pflanze nicht PepMV-infizierte Pflanze Wurzelsperre Vorratstank mit Nährlösung pH 6,2 bis 6,5 A B Abb. 1: Pepino mosaic virus (PepMV) a) Farbveränderungen an Tomatenfrüchten der Sorte „Hildares“. Diese treten an etwa 5 bis 10 % der Früchte PepMV-infizierter Pflanzen auf. b) Fadenförmiges Partikel mit einer Länge von etwa 500 nm a) b) Abb. 4: Mittelwert der Extinktionswerte (E 405 ) der Tomatenpflanzen- und Wasserproben im DAS-ELISA zum Nachweis von Pepino mosaic virus (PepMV) 7, 14 bzw. 21 Tage nach Einstellen der Pflanzen in die Hydrokultur; rote Linie: Grenzwert (cut-off value) links: Blatt- und Wurzelproben der Tomatenpflanzen rechts: Wasserproben nach Ultrafiltration (Permeat und Retentat) Abb. 5: Mittelwert der Extinktionswerte (E 405 ) der Tomatenpflanzen- und Wasserproben im DAS-ELISA zum Nachweis von Pepino mosaic virus (PepMV) 14, 21, 28 Tage bzw. 42 Tage nach Einstellen der Pflanzen in die Fließrinnen und Anwendung der Nutrient Film Technic; rote Linie: Grenzwert (cut-off value) links: Blattproben der Tomatenpflanzen rechts: Wasserproben nach Ultrazentrifugation der ultrafiltrierten Wasserproben (Permeat und Retentat) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Puffer positiv negativ 7. Tag 14.Tag 21. Tag 7.Tag 14.Tag 21. Tag Extinktion bei 405 nm 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Puffer positiv negativ 14. Tag 14. Tag 21. Tag 21. Tag Extinktion bei 405 nm 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Puffer positiv negativ 14. Tag 14. Tag 21.Tag 21. Tag 28. Tag 28. Tag Extinktion bei 405 nm Puffer positive Kontrolle (N. benthamiana) negative Kontrolle (S. lycopersicon) Blattproben Wurzelproben Puffer positive Kontrolle (N. benthamiana) negative Kontrolle (S. lycopersicon) Permeat Retentat 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Puffer positiv negativ 14. Tag 42. Tag Extinktionswert bei 405 nm Puffer positive Kontrolle (N. benthamiana) negative Kontrolle (S. lycopersicon) Blattproben Puffer positive Kontrolle (N. benthamiana) negative Kontrolle (S. lycopersicon) Permeat Retentat
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Ultrafiltration und Ultrazentrifugation zur Konzentrierung
von Pflanzenviren in Nährlösung
Janina Vincenz, Martina Bandte, Carmen Büttner Humboldt-Universität zu Berlin, Fachgebiet Phytomedizin, D-14195 Berlin
Danksagung: Die Arbeiten wurden finanziell durch die BLE (Förderkennzeichen: 28-1-55.026-11) unterstützt.
Das Pepino mosaic virus (PepMV, Genus Potexvirus) wurde in Europa
erstmals 1999 in Gewächshaustomaten nachgewiesen und konnte sich
auf Grund seiner leichten mechanischen Übertragbarkeit schnell in den
Beständen ausbreiten. Die substratlose Kultivierung mit rezirkulieren-
den Nährlösungen trägt zur Ausbreitung des Erregers bei (Schwarz et
al., 2010). Der Nachweis des Erregers in Pflanzenmaterial erfolgt mit
Hilfe einer RT-PCR oder eines ELISA.
Nachfolgend wird die Ultrafiltration und Ultrazentrifugation zur Konzen-
trierung von Pflanzenviren in Nährlösung mit dem Ziel der Unter-
schreitung der Nachweisgrenze serologischer Testverfahren vorgestellt
und diskutiert.
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Tomatenpflanzen (Solanum lycopersicum L.) der Sorten Hildares und
Hoffmann´s Rentita wurden unter Gewächshausbedingungen in
Hydrokultur und Nutrient Film Technic (NFT) kultiviert (Abb. 2). Die
PepMV-infizierten Tomatenpflanzen wurden durch mechanische
Inokulation hergestellt und im Wechsel mit nicht-virusinfizierten
Tomatenpflanzen in den Versuch eingestellt. Die Nährlösung als auch
die Pflanzen wurden regelmäßig beprobt.
Die Konzentration der Viruspartikeln erfolgte aus den Nährlösungen mit
Hilfe einer Tangentialflussfiltration (TFF, Abb. 3) unter Verwendung einer
Polyethersulfon (PES) Membran mit einer Porengröße von 10 kD
(Biomax®, Millipore). Es wurden jeweils 1/10 bzw. 1/20 des
Nährlösungsvolumens als Probenumfang gewählt. Das Retentat der
TFF wurde einer Ultrazentrifugation für 120 Minuten bei 30.000 rpm in
einem Ti70-Rotor (Beckman-Coulter GmbH) bei 4°C unterzogen.
Der Nachweis von PepMV wurde mit Hilfe des DAS-ELISA unter
Verwendung spezifischer Antikörper (AS-1022, DMSZ, Braunschweig,
Germany) vorgenommen.
Die gemeinsame Kultivierung gesunder und infizierter Pflanzen in
einem Hydrokulturgefäß führte zu einer sehr schnellen Übertragung des
PepMV über die Nährlösung. Bereits sieben Tage nach Versuchsaufbau
waren alle Pflanzen infiziert (Abb. 4). Der Nachweis konnte dabei
sowohl in Wurzel- als auch Blattmaterial erfolgen. Wie zu erwarten
stiegen die Extinktionswerte und damit der Virustiter im Probenmaterial
mit zunehmender Kulturdauer.
Wasserproben mit einem Volumen von 1 Liter wurden 14 und 21 Tage
nach Versuchsaufbau entnommen und einer Ultrafiltration unterzogen.
Erwartungsgemäß konnte PepMV nur im ultrafiltrierten Retentat (mit
von der Membran zurückgehaltene Partikeln), nicht aber im ultrafil-
trierten Permeat (mit den die Membran passierten Partikeln)
nachgewiesen werden (Abb. 4).
Auch in Proben aus den Nährlösungstanks der mit NFT kultivierten
Tomaten war PepMV nachzuweisen (Abb. 5). Die Proben wurden 14,
21 und 28 Tage nach dem Versuchsaufbau entnommen und umfassen
jeweils 10 Liter. In allen ultrazentrifugierten Retentaten der Tangential-
flussfiltration konnte PepMV nachgewiesen werden; in den ultra-
zentrifugierten Permeaten hingegen waren erwartungsgemäß keine
Erreger nachzuweisen. Die Extinktionswerte der Proben aus den
Nährlösungstanks waren deutlich niedriger als diejenigen aus den
Hydrokulturgefäßen. Diese sind ursächlich auf die unterschiedlichen
Volumina der Proben (im Verhältnis zum Behältervolumen) und die
Anzahl der infizierten Pflanzen bezogen auf Volumen der Nährlösung
zurückzuführen.
Das Pepino mosaic virus wird durch die Nährlösung übertragen
und breitet sich über die Wurzel systemisch in der Pflanze aus.
Mit Hilfe einer Tangentialflussfiltration (TFF) und anschließender
Ultrazentrifugation können Viruspartikel aus der Nährlösung in
einem solchen Umfang konzentriert werden, dass ein Nachweis
des PepMV mit dem für die Routinetestung etablierten DAS-ELISA
erfolgen kann.
Um die Ausbreitung von PepMV im Bestand zu minimieren, ist
insbesondere beim Auftreten von Pflanzen mit virusverdächtigen
Symptomen eine Untersuchung der rezirkulierenden Nährlösung
vorzunehmen. Zur Bewässerung eingesetztes Oberflächenwasser
sollte regelmäßig auf eine Kontamination mit pflanzenschädigen-
den Viren geprüft werden.
Literatur Schwarz D, Beuch U, Bandte M, Fakhro A, Büttner C, Obermeier C, 2010: Spread and interaction of Pepino mosaic virus (PepMV) and Pythium aphanidermatum
in a closed nutrient solution recirculation system: effects on tomato growth and yield. Plant Pathology, 59, 443-452.
Büttner C, Bandte M, Pettitt TR, 2014: Filtration and centrifugation for detection of plant pathogens in irrigation water(eds. Hong C., Moorman GW., Wohanka W.,
Büttner C.: Biology, detection and management of plant pathogens in irrigation water), APS Press, in press.
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Abb. 3: Apparatur zur Vor- und Ultrafiltration von Nährlösung
a) Vorratskanister (Retentat, Ausgangslösung)
b) Kanister (Permeat)
c) Vorfilter (Millipore Opticap® XL 5 Capsule, Porengröße 10 µm)
d) Förderpumpe (Fa. Masterflex ®)
e) Pellicon Filterhalter mit Ultrafiltrationskassette (Fa. Millipore)
(b)
(c) (d) (e)
(a)
Abb. 2: Versuchsdesign zur Übertragung von Pepino mosaic
virus (PepMV) mit der Nährlösung bei Nutzung der Nährfilm-
technik (A) und der Hydrokultur (B)
PepMV-infizierte Pflanze
nicht PepMV-infizierte Pflanze
Wurzelsperre
Vorratstank mit Nährlösung
pH 6,2 bis 6,5
A
B
Abb. 1: Pepino mosaic virus (PepMV)
a) Farbveränderungen an Tomatenfrüchten der Sorte „Hildares“.
Diese treten an etwa 5 bis 10 % der Früchte PepMV-infizierter
Pflanzen auf.
b) Fadenförmiges Partikel mit einer Länge von etwa 500 nm
a) b)
Abb. 4: Mittelwert der Extinktionswerte (E405) der Tomatenpflanzen- und Wasserproben im DAS-ELISA zum Nachweis von Pepino
mosaic virus (PepMV) 7, 14 bzw. 21 Tage nach Einstellen der Pflanzen in die Hydrokultur; rote Linie: Grenzwert (cut-off value)
links: Blatt- und Wurzelproben der Tomatenpflanzen
rechts: Wasserproben nach Ultrafiltration (Permeat und Retentat)
Abb. 5: Mittelwert der Extinktionswerte (E405) der Tomatenpflanzen- und Wasserproben im DAS-ELISA zum Nachweis von Pepino
mosaic virus (PepMV) 14, 21, 28 Tage bzw. 42 Tage nach Einstellen der Pflanzen in die Fließrinnen und Anwendung der Nutrient
Film Technic; rote Linie: Grenzwert (cut-off value)
links: Blattproben der Tomatenpflanzen
rechts: Wasserproben nach Ultrazentrifugation der ultrafiltrierten Wasserproben (Permeat und Retentat)
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405
nm
Puffer positive Kontrolle
(N. benthamiana)
negative Kontrolle
(S. lycopersicon)
Blattproben Wurzelproben Puffer positive Kontrolle
(N. benthamiana) negative Kontrolle
(S. lycopersicon)
Permeat Retentat
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Puffer positive Kontrolle
(N. benthamiana)
negative Kontrolle
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Blattproben Puffer positive Kontrolle
(N. benthamiana) negative Kontrolle
(S. lycopersicon)
Permeat Retentat
![정밀여과 (Micro Filtration)chungam.co.kr/eng/upload/정밀여과.pdf · [첨부Filter Housing 종류] 1.여과의종류 1).Micro filtration (정밀,미세여과) 2).Ultrafiltration](https://static.fdokument.com/doc/165x107/5e58cf0d8346104bfa524381/ee-micro-filtration-eepdf-efilter-housing-e.jpg)
