Universität Ulm Protokoll zu den Grundübungen ... · 1.3 Einteilung und Anwendungsbereiche der...

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Universität Ulm

Protokoll zu den Grundübungen Pflanzenphysiologie und Molekulare Botanik

Wintersemester 2011/2012

Versuch H2: Reportergenaktivität in transgenen Pflanzen

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Inhaltsverzeichnis:

1. Theorieteil 2

1.1 Historischer Abriss zur Biotechnologie 2

1.2 Gentechnologie 2

1.3 Einteilung und Anwendungsbereiche der Bio- und Gentechnologie 2

1.4 Diskussion: Vor-und Nachteile der Gentechnologie gegenüber der Biotechnologie 6

1.5 Der Einsatz von Tier- und Pflanzenzellen muss in der Gentechnik sinnvoll 7

gewählt werden

1.6 Gentransfer in Natur und Labor 8

1.6.1 Gentransfer in der Natur 8

1.6.2 Gentransfer im Labor: Methoden 10

1.7 Regulierende Einflüsse der Genaktivität 14

1.8 Nachweis und Regulation von Genaktivität 15

2. Durchführung 18

2.1 Qualtitativer Nachweis der Promotoraktivität im Gewebe durch in-situ-Färbung 18

2.2 Fluorimetrische Bestimmung der GUS-Aktivität (quantitativ) 18

3. Ergebnisse 20



4. Diskussion 23



5. Quellen 25

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1. Theorieteil

1.1 Historischer Abriss zur Biotechnologie

Bei der Biotechnologie handelt es sich um eine interdisziplinäre Wissenschaft, auf die

Menschen bereits seit Jahrtausenden zurückgreifen. Kennzeichnend hierfür ist die

Benutzung lebender Organismen oder biologisch synthetisierten Materials für

technische Anwendungen. Etablierte Einsatzfelder der Biotechnolgie sind

beispielsweise die Bier-oder Weinherstellung und die Verarbeitung von

Milchprodukten. Dabei wird auf Mikroorganismen wie z.B. der Bäckerhefe

(Saccharomyces cervisiae) oder Milchsäurebakterien zurückgegriffen.

1.2 Gentechnologie

Es bedarf einer strikten Abtrennung zwischen der Gentechnologie von der

Biotechnologie. Der Begriff Gentechnologie bezeichnet bestimmte Verfahren der

Biotechnologie, die Kentnisse aus der Molekularbiologie und/oder der Genetik

erfordern und mit dem Einbau in-vitro veränderter DNA in Organismen Hand in Hand

gehen. Gentechnologie beinhaltet also immer eine synthetische Veränderung oder

Neuzusammensetzung der DNA. Das bedeutet in der Praxis, dass bestimmte Gene

von Organismen, die eine bestimmte Stoffwechseleigenschaft, also ein Produkt oder

eine Fähigkeit aufweisen, entnommen werden und in andere Zellen eingefügt

werden. Ziel ist es, dass diese Eigenschaft dann von einem anderen

Wunschorganismus exprimiert wird. Es werden beispielsweise Enzyme wie

Chymosin oder Pepsin, die früher aus den Mägen junger Wiederkäuer entnommen

wurden, heute aber mithilfe von Mikroorganismen herstellen kann, verwendet.

1.3 Einteilung und Anwendungsbereiche der Bio- und

Gentechnologie

Beide Disziplinien werden nach Farben in ihre jeweiligen Anwendungsgebiete

separiert. Aufgrund der Ganzheit der Forschung, werden diese Grenzen mittlerweile

immer wieder durchbrochen. Im Folgenden wird die klassische Trennung betrachtet.

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Bei der Roten Bio-und Gentechnologie handelt es sich um diejenigen Bereiche, die

in der Medizin zur Anwendung kommen und die Gesundheit des Menschen zum Ziel

haben. Dazu gehört die Entwicklung verschiedener Impfstoffe, Therapeutika,

Modellorganismen, die zur Entwicklung neuer Therapeutika benötigt werden, die

Produktion von Wirkstoffen durch genetisch veränderte Organismen und die dazu

erforderlichen Plattformtechnologien. Ein Beispiel hierfür ist die Herstellung von

Arzneimitteln wie etwa Insulin, das heutzutage mithilfe von Mikroorganismen

hergestellt wird. Die dafür notwendigen Gene wurden einer menschlichen Pankreas

entnommen.

Braune Bio-und Gentechnologie befasst sich mit der Biotechnologie der Umwelt und

damit nicht zuletzt der Aufrechterhaltung von bestimmten Lebensräumen und der

Grauen Bio-und Gentechnologie werden Verfahren zur Beseitigung von anfallenden

Abfällen diskutiert.

Blaue Bio-und Gentechnologie sind bio-und gentechnologische

Anwendungsmethoden auf Lebewesen aus dem Meer. Dabei wird große Hoffnung in

tieflebende Bakterien, welchen man wirtschaftlich nutzbare Stoffwechselwege

zutraut, gesetzt.

Die Grüne Bio-und Gentechnologie befasst sich speziell mit Pflanzen um deren

Eigenschaften als Nutzpflanzen zu verbessern. Ferner werden pflanzliche Enzyme

und deren Wirkprinzipien genauer durchleuchtet.

In asiatischen Entwicklungsländern ist Vitamin A-Mangel weit verbreitet. Um dem

entgegen zu wirken hat ein Freiburger Forschungsteam Wildtyp-Reis dahingehend

transformiert, dass diese nun im Endosperm ausreichend Provitamin A (= �-Carotin)

synthetisieren kann, welches dann vom Menschen zu seinen aktiven Formen

umgewandelt werden kann. Es wurden hierzu zwei Gene fremder Arten übertragen.

Zum einen waren dies das Phytoensynthase-Gen der Narzisse (Narcissus

pseudonarcissus) und zum anderen das Caratindesaturase-Gen des Bakteriums

Erwinia uredovora. Abbildung 2 zeigt die erzielten Farbveränderungen.

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Abbildung 1: Golden Rice und Wildtyp-Reis

Quelle: http://www.gatesfoundation.org/agriculturaldevelopment/PublishingImages/golden-rice-hero.jpg. Stand: 17.12.11

Weiße Bio-und Gentechnologie befasst sich mit dem industriellen Bereich dieser

Technologien. Hierbei wird nach weiteren industriell nutzbaren Enzymen und

Stoffwechselwegen gesucht. Ferner werden optimierte Bioverfahrenstechniken

angestrebt.

Die Käseherstellung dient als Beispiel einer seit Jahrtausenden betriebenen

biotechnischen Anwendung, die im Zuge der Prozessoptimierung mithilfe von

gentechnologischen Verfahrensweisen verbessert wurde. Milcheiweiß wird mithilfe

der proteaseaktiven Enzyme Chymosin und Pepsin die die Milch eindicken, zum

Ausfallen gebracht. Früher wurden diese Enzyme aus den Mägen von Kälbern

entnommen. Heutzutage wird jedoch die Stoffwechselfähigkeit von besonders

modifiziertern Schimmelpilzen oder Hefen genutzt. Die Vorteile liegen auf der Hand.

Die Enzymgewinnung erfolgt unkomplizierter und die Verunreinigungen, mit denen

bei der Enzymentnahme aus den Kälbermägen gerechnet werden müssen, entfallen.

Abbildung 1 dient zur Veranschaulichung des gentechnischen Verfahrens.

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Abbildung 2: Chymosingewinnung. Quelle: http://www.gm.rt.schule-

bw.de/lehrer/schmid/gentechnik/bilder/folie24.gif. Stand: 17.12.11

Ein Beispiel aus der Pflanzenoptimierung ist die sogenannte Flavr-Savr-Tomate, die

in den 90er Jahren auf den Markt kam. Bei ihr wurde das Enzym Polygalacturonase

mittels RNA-Interferenz blockiert, wodurch der Abbau von Pektin, einem Stützprotein

der primären Zellwand, verhindert wurde und die Pflanze dadurch selbst nach langen

Transportwegen nicht matschig wurde. Aufgrund des faden Geschmacks ist der

Verkauf kurz darauf wieder eingestellt worden.

Die Firma Monsanto veröffentliche Ende des letzten Jahrhunderts die mit dem

Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens transformierte Pflanze Roundup Ready

Soja. Diese ist mit herbizidresistenten Genen ausgestattet. „Praktischerweise“

verkauft die Firma das passende Herbizid, nämlich Glyphosat, gleich mit. Es wurde

ein geringerer Schädlingsbefall der Pflanzen, um eine höhere Produktivität zu

erzielen, angestrebt.

Die gentechnisch veränderte Kartoffelsorte Amflora revolutionierte die Papier-, Textil-

und Klebstoffindustrie, indem sie die aufwendigen Trennungsverfahren der beiden

Stärkearten Amylose und Amylopektin weitgehend überflüssig machte. Der Grund

hierfür ist, dass mithilfe einer RNA-Interferenz die die Translation von Genen, die an

dem Aufbau der Amylose beteiligt sind, behindert werden und es nur noch zu einer

Translation von Amylopektin kommt.

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Zuletzt sei nicht außer Acht gelassen, dass es sich hier nur um Beispiele handelt. Die

Vielzahl moderner Verfahren ist kaum noch zu überschauen.

1.4 Diskussion: Vor-und Nachteile der Gentechnologi e gegenüber

der Biotechnologie

Die Gentechnik liefert praktische Verfahrensmethoden, die dem Wohle der

Menschheit dienen. Die Wissenschaft ist heutzutage soweit, dass Erbkrankheiten

gentherapeutisch behandelt werden können. Ferner können durch die

Pränataldiganostik werdende Mütter über den Zustand ihres Kindes aufgeklärt

werden und so frühzeitig über mögliche Krankheiten oder Behinderungen des Kindes

unterrichtet werden.

Durch die Gentechnik werden die genetischen Grenzen zwischen den Arten

weitgehend aufgehoben. Beispiele hierzu wurden in 1.3 bereits genannt. Als Folge

lässt sich eine immense Fülle neuer Organismen kreieren. All dies dient oft der

Optimierung von Bioprozessen und spart damit Kosten ein. Ein weiterer großer

Vorteil besteht darin, dass die gewünschten Produkte durch gezielte Expression von

Mikroorganismen viel weniger verunreinigt sind. Es kann oft auf aufwendige und

teure Reinigungsverfahren verzichtet werden. Letzten Endes kann durch

gentechnischen Einsatz also die Qualität vieler Lebensmittel und anderen Produkten

verbessert werden.

Gentechnologie ist oft forschungseffizienter und billiger als die dementsprechende

Biotechnologie. Durch in – vitro Rekombination gewünschter Merkmale entfällt das

Rückkreuzen, wie es nach den Mendel’schen Regeln notwendig wäre. Dadurch

entfallen das Heranreifen bestimmter Filialgenerationen und die erst dann mögliche

Überprüfung der Ergebnisse. Eine große Zeitersparnis wird möglich. Außerdem

können die gewünschten Merkmale gezielt in den Organismus geschleust werden,

wodurch sich die Spezifität erhöht und ungewollte Merkmalsexpression

unwahrscheinlich wird.

Wenn eine gentechnisch veränderte Pflanze allerdings nicht isoliert wird, so wird sie

unweigerlich ihr genetisches Material mit der Umwelt austauschen. Dies entspricht

einem vertikalen Gentransfer. Oft haben diese Pflanzen einen Selektionsvorteil. Sie

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sind resistent gegen Schädlinge oder vertragen schlechtes Wetter besser. Es wird

befürchtet, dass dies zu einer Einschränkung der genetischen Vielfalt führen kann.

Die physiologischen und phänotypischen Folgen eines transgenen Organismus

können nicht vorhergesagt werden. Es ist einfach noch viel zu wenig über die

komplizierten Wechselwirkungen innerhalb eines Organismus bekannt, um die

Folgen überblicken zu können. Schwerwiegende Wechselwirkungen innerhalb eines

Organismus und mit dessen Umwelt sind nicht ausgeschlossen. Es bleibt ferner die

Frage bestehen, welche Langzeitfolgen genetisch veränderte Lebewesen bewirken.

Transgene Pflanzen können ferner auch Nützlinge schädigen. Ein damit

zusammenhängender horizontaler Gentransfer lässt sich nicht ausschließen. Daher

sind die Fähigkeiten und Fertigkeiten der Gentechnik nach wie vor mit Vorsicht zu

genießen.

Ethnische Bedenken werden von den „Würdeträgern“ der Kirche und

Umweltschützern ausgesprochen, vor allem wenn es um Genanalyse und Forschung

beim Menschen geht. Es wird befürchtet, den Mensch irgendwann katalogisieren zu

können und dadurch in die Schöpfung, aus welcher Sicht auch immer, erheblich

einzugreifen. Es ist nicht auszuschließen, dass viele Menschen aus dem Instinkt

heraus Angst vor den neuen Techniken haben.

1.5 Der Einsatz von Tier-und Pflanzenzellen muss in der Gentechnik

sinnvoll gewählt werden

Wird mit Pflanzen gearbeitet, so kann aus deren Eigenschaft, dass alle Zellen

totipotent sind ein großer Nutzen gezogen werden. Totipotentz bedeutet, dass eine

Zelle auf alles Erbgut eines Organismus zugreifen kann und diesen prinzipiell

komplett regenerieren könnte. Bestimmte Pflanzen, denken wir an den

Modellorganismus Arabidopsis thaliana, haben eine kurze Generationszeit und

können viele Nachkommen zeugen. Außerdem sind sie billiger in der Haltung und

pflegeleichter wie z.B. ein Säugetier.

Ein Nachteil bei der gentechnischen Arbeit mit Pflanzen ist sicherlich die Zellwand,

die es zu durchdringen gilt. Pflanzen sind weniger zur Synthese bestimmter

Stoffwechselprodukte wie beispielweise Bakterien oder tierische Zellen geeignet, da

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sie oft nur geringe Produktmengen erzeugen. Es bleibt das ungeklärte Problem mit

Monokotyledonen, die mit dem häufig für transformierende Vorgänge verwendeten

Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens keine Transformation erfahren.

Nutzpflanzen wie Weizen, Reis und Mais müssen daher mithilfe anderer, weniger

effektiver Methoden behandelt werden. Aufgrund der Polyploidie der Pflanzenzellen

ist es nur schwer diese vollständig zu transformieren, da alle Chromosomensätze

gentechnisch verändert werden müssen. Besonders Kallusgewebe ist anfällig für

somaklonale Variation. Das bedeutet, dass sich der Genotyp einer Pflanze durch

häufige Fehler während der Replikation von selbst spontan abwandelt (Mutation).

1.6 Gentransfer in Natur und Labor

Hierbei handelt es sich um jegliche Übertragung von Genen zwischen Organismen.

Es wird eine Einteilung zwischen horizontalem und vertikalem Gentransfer

vorgeschlagen. Als horizontalen (= lateraler) Gentransfer wird eine Genübertragung

außerhalb der geschlechtlichen Fortpflanzung und über Artgrenzen hinweg

bezeichnet. Beim vertikalen Gentransfer wird von Genübertragung oder Weitergabe

an einen Nachkommen gesprochen.

1.6.1 Gentransfer in der Natur

Bei Prokaryoten sind uns 3 mögliche Arten des Gentransfers bekannt.

Als Konjugation wird die Übertragung von Genomteilen (DNA -Übertragung) einer

Spenderzelle (Donor mit �� − Faktor) auf eine Empfängerzelle (Rezipient mit

�� − ��) durch einen direkten Zellkontakt bezeichnet. Konjugation ist über die

Artgrenzen hinweg möglich. Diese kommt meist mithilfe des F-Pilus (F für Fertilität)

zustande. Die Stelle, von der aus der Transfer startet, heißt oriT-Squenz (origin of

replication Transfer). Abbildung 3 zeigt diesen Vorgang bei gram-negativen E. coli

Bakterien.

Abbildung 3: Konjugation bei

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f3/Konjugation

Als Transformation wird die

Organismus bezeichnet. Dabei wird

wurde das Genom des Wirtsorganismus

mithilfe von Rezeptoren selbst bestimmte DNA ins Cytosol aufnehmen.

ist der Begriff für eine Transformation

Als Transduktion wird der Gentransfer zwischen Bakterien und Viren, also auch de

indirekte, kontaktlose Austausch zweier Bakterien miteinander, sowie die Infektion

mit einem viralen Vektor

unterschieden. Virulente Phagen tun dies nicht. Da sie ihre eigene DNA nicht ins

Wirtsgenom einbauen, kann beim Ausschneiden selbiger keine Wirts

Phagenkopf gelangen.

Bei der allgemeinen Transduktion

Wirts-DNA im Phagenkopf.

homologer Stelle eingebaut.

Bei der speziellen Transduktion

Bakteriophage spezifische

Abbildung 3: Konjugation bei E. coli. Quelle:

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f3/Konjugation-ecoli.svg. Stand: 17.12.11

die nicht-virale Übertragung von freiliegender

Dabei wird Fremd-DNA ins Cytoplasma übertragen

wurde das Genom des Wirtsorganismus transformiert. Kompetente Zellen können

mithilfe von Rezeptoren selbst bestimmte DNA ins Cytosol aufnehmen.

Transformation bei Eukaryoten.

Gentransfer zwischen Bakterien und Viren, also auch de


mit einem viralen Vektor von Genen bezeichnet. Es wird zwischen 2 Arten

Virulente Phagen tun dies nicht. Da sie ihre eigene DNA nicht ins

Wirtsgenom einbauen, kann beim Ausschneiden selbiger keine Wirts

Transduktion befindet sich im lytischen Zyklus

DNA im Phagenkopf. Diese wird dann beim nächsten befallen

homologer Stelle eingebaut.

Transduktion schneidet im lytischen Zyklus ein temperenter

e Teile des Wirtsgenoms aus, die die Phagen

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. Stand: 17.12.11

virale Übertragung von freiliegender DNA auf einen

DNA ins Cytoplasma übertragen. Damit

. Kompetente Zellen können

mithilfe von Rezeptoren selbst bestimmte DNA ins Cytosol aufnehmen. Transfektion

Gentransfer zwischen Bakterien und Viren, also auch der


Es wird zwischen 2 Arten

Virulente Phagen tun dies nicht. Da sie ihre eigene DNA nicht ins

Wirtsgenom einbauen, kann beim Ausschneiden selbiger keine Wirts-DNA in den

m lytischen Zyklus ein Stück der

Diese wird dann beim nächsten befallenen Bakterium an

m lytischen Zyklus ein temperenter

, die die Phagen-DNA

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flankieren und baut diese zusammen mit seinem Erbgut in dessen Phagenkopf ein.

Bei erneutem Befall werden diese DNA-Segmente mit transferiert.

1.6.2 Gentransfer im Labor: Methoden

Im Folgenden werden gezielte gentechnische Methoden vorgestellt, die der

Übertragung spezifischer Genen dienen.

Bei den Techniken zum direkten Gentransfer handelt es sich um Verfahrensweisen,

bei denen das gewünschte Genmaterial unmittelbar in die Zelle eingeführt wird. Im

Folgenden werden einige Verfahren vorgestellt.

Bei der Mikroinjektion wird mit feinsten Glaskanülen das Genmaterial (freie DNA)

vorwiegend in tierische Zellen eingebracht (meist direkt in den Zellkern). Bei

pflanzlichen Zellen ist meist der Druck zu hoch, beim Einstechen würde der

Innendruck der Zelle zusammenbrechen und die Zelle dadurch sterben. Außerdem

ist dieses Verfahren sehr langwierig.

Abbildung 4: Mikroinjektion. Quelle: http://www.medizin.uni-

halle.de/zra/media/Bilder/Labor/mikroinjektion2_250.jpg. Stand: 17.12.11

Um eine Protoplastentransformation durchführen zu können, werden die Zellwände

durch Enzyme (Zellulasen und Pektinasen) entfernt. Als Folge liegt nur noch ein

membranumhüllter Protoplast vor. Um diese Zelle nun transformieren zu können,

muss dessen Membran dahingehend manipulieren werden, dass sie für Fremd-DNA

kompetent wird. Dies geschieht entweder im PEG-Bad (Polyethylenglycol) oder

mittels einer Calciumbehandlung (z.B. mit CaC��).

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Nach Entfernung der Zellwände zweier zu transformierender Zellen werden diese

entweder mit Calcium oder PEG zur Verschmelzung gebracht, es entsteht ein Cybrid.

DNA-Material aus den Zellkernen wird ausgetauscht. Das Verschmelzungsprodukt

der Kerne bezeichnet man als Hybrid. Dieses Verfahren wird als Protoplastenfusion

bezeichnet.

Aus einer sogenannten Particle Gun werden aus Wolfram oder Gold bestehende

Mikroprojektile, auf deren Oberfläche das Genmaterial aufgetragen wird, in Richtung

eines Zellverbands (Blätter, Kallus, embryonales Gewebe, etc.) mithilfe eines

Druckgradienten beschleunigt. Beim Aufprall auf die Zellwand wird diese

durchdrungen und beschädigt, aber die Zelle ist oft in der Lage, sich zu regenerieren.

Aus so transformierten Zellen kann eine ganze transgene Pflanze entstehen.

Bei der Elektroporation wird ein elektrisches Feld an die Zellen angelegt. Es sollte

darauf geachtet werden, dass die Zelllösung möglichst salzarm ist, da es sonst zu

Kurzschlüssen kommen kann. Nun werden sehr kurze, jedoch kräftige

Elektroschocks ausgelöst, die die Zellmembran kurzzeitig permeabel, oder auch

löchrig machen. Während dieser Zeit kann ein Makromolekül, wie etwa die DNA

durch die Membran eintreten.

Bei der Lipofektion verwendet man Vesikel, die aus einer unpolaren

Lipiddoppelschicht bestehen (sog. Liposomen, allg. Micellen). Diese können mit der

Zellmembran aufgrund ihrer elektrischen Beschaffenheit fusionieren und deren Inhalt

ins Cytosol absondern. Wird nun in so ein Vesikel DNA eingebracht, so kann diese in

die gewünschte Zelle wandern. Das technisch am Einfachsten umzusetzende

Verfahren funktioniert mithilfe von kationischen Lipidvesikeln, deren Eigenladung die

der negativ geladenen DNA aufhebt. Als Folge entsteht ein unpolarer Komplex, der

von der Zelle aufgenommen werden kann.

Der indirekte Gentransfer geschieht mithilfe sog. Vektoren (= DNA-Vehikel). Vektoren

sind Träger des gewünschten Genabschnitts, der zusammen mit dem Vektor in einen

Wirt eingebracht werden kann. Sie sind in der Lage, ihr Erbgut zu replizieren. Es

folgen Beispiele für Vektoren.

Bei den Plasmiden und Cosmiden handelt es sich um außerhalb des Zellkern

vorliegendes, relative kleines, ringförmiges Erbgut mit der Größe von 1 – 25 kBp. Oft

werden darauf Resistenzgene codiert. Aufgrund der Replikationsunabhängigkeit vom

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Zellkern können diese in vielfachen Kopien im Cytosol vorliegen. Diese beginnt am

ORI (origin of replication). Befindet sich das Plasmid in einem Bakterium, so kann

über Konjugation das Plasmid auf einen anderen Wirt übertragen werden. An

multiple cloning sites kann ein Plasmid mithilfe von Restriktionsenzymen geschnitten

werden und ein Wunschgen mit den passenden kohäsiven Enden (cohesive sites,

kurz: cos sites) kann eingefügt werden. Sind bei einem Plasmid kohäsive Enden

vorhanden, so spricht man von Cosmiden. Diese kohäsiven Enden sind

Einzelstrangüberhänge, die sich komplementär zum geschnittenen Plasmid verhalten

(inverted repeats). Mithilfe der „Klebeenzyme“ aus der Gruppe der Ligasen kommt es

zum Ringschluss und die Fremd-DNA, beispielsweise aus dem Phagen , wurde

eingebaut (Siehe hierzu auch Abbildung 5).

Abbildung 5: Cosmidsynthese. Quelle: http://www.biokurs.de/skripten/bilder/ligare.jpg. Stand: 17.12.11

YAC’s (yeast artificial chromosome) sind künstlich erzeugte Hefechromosomen. Da

sie eine Größe von 100-1000 kBp aufweisen, sind diese viel größer wie Vektoren.

Dadurch lassen sich größere Gene auf sie übertragen, was praktisch mit einigen

Schwierigkeiten verbunden ist. Ein weiterer Nachteil ist, dass bei den langen

Chromosomen es mit erhöhter Warscheinlichkeit zum Kettenabbruch kommt.

Als BAC (bacterial artificial chromosome) bezeichnet man künstlich erzeugte

Bakterienchromosomen. Analog zu den YAC’s handelt es sich hierbei um

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synthetische Bakterienplasmide, die aus dem single-copy F-Plasmid des Bakteriums

E. coli bestehen und bis zu 300 kBp’s groß sein können.

Auch Viren können als Vektoren für bestimmte Gene dienen und diese in Bakterien

einschleußen. Man spricht in diesem Zusammenhang von Phagenvektoren. Beim

Phagen liegt die maximale Vektorkapazität bei 25 kbp und ist damit deutlich

geringer wie bei den BAC’s und YAC’s.

Mithilfe des Bodenbakteriums Agrobakterium tumefaciens als Vektor kann DNA in

eine Zelle eingeführt werden. Dieses Bakterium befällt in der Natur oft verwundete

Wurzeln und wird von Phenolen angelockt, die von der Wunde abgesondert werden.

Als Folge des Befalls bilden sich an der Pflanze Wucherungen, sogenannte

Wurzelhalsgallen aus. Der Grund für die Bildung eines solchen Tumors liegt auf dem

Genom des Bakteriums. Agrobakterium tumefaciens besitzt ein Ti-Plasmid

(tumorinduzierendes Plasmid), welches die Information für tumorinduzierende Gene

enthält. Nach der Transformation bestimmter Abschnitte des Plasmids, der

sogenannten T-DNA (Transfer-DNA) über einen F-Pilus in die DNA einer Wirtszelle,

beginnt die Pflanze mit der Synthese von Bakterienproteinen mithilfe des Bauplans

aus deren Genen. Dazu zählen vir-Gene (Virulenzgene, die die phytopathogene

Virulenz festlegen), Gene für die Auxin-und Cytokininsynthese (Hormone, die die

Pflanze wachsen lassen und damit dem Bakterium mehr Opin bescheren) und Gene

für die Opinsynthese, von denen sich das Bakterium ernähren kann, indem es

zusätzlich Gene synthetisiert, die dem Opinkatabolismus dienen. Left Border und

Right Border grenzen die Gene für Auxin-, Cytokinin- und Opinsynthese ab. Teile des

Ti-Plasmids werden herausgeschnitten und zur Übertragung freigegeben. An

sogenannten ori-Stellen (origin of replication) wird die DNA-Replikation eingeleitet

(Abbildung 6).

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Abbildung 6: Ti-Plasmid. Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/89/Ti_Plasmid.jpg.

Stand: 17.12.11

Manipulativ werden Teile der T-DNA, wie etwa die Gene für die Hormonsynthese

herausgeschnitten und andere, gewünschte Gene eingebaut. Um diese DNA später

von anderen selektieren zu können, werden Selektionsmarker wie z.B.

Antibiotikaresistenzen hinter einem prokaryotischen Promotor mit eingebaut. Das nun

erhaltene Ti-Plasmid wird in Escherichia coli eingeführt und durch dessen Replikation

vermehrt. Nun wird das Antibiotikum der Resistenz hinzugegeben, wodurch nur

Zellen mit der Resistenz überleben. Nach Aufreinigung und Isolierung des Plasmids

wird dieses durch Transformation wieder in Agrobakterium tumefaciens eingeführt.

Wurde in diesem Bakterium bereits ein zweites Plasmid durch das eben

beschriebene Verfahren eingebracht, so spricht man von einem binären

Vektorsystem. Das erste beschriebene Plasmid ist für die Kodierung der T-DNA

verantwortlich und das Zweite Plasmid (Helferplasmid) enthält eine vir-Stelle, welche

für die Überführung der T-DNA essentiell ist. Binäre Vektoren sind einfacher in der

Handhabung. Zum einen sind sie stabiler, weil das gewünschte Gen auf einem

Vektor ohne vir-Region liegt und der Vektor damit um die vir-Region kürzer ist und

zum anderen weil bei dieser Technik weniger unerwünschtes Erbgut (Gene für die

Opinsynthese, sowie für die Wachstumshormone Cytokinin und Auxin) übertragen

wird. Nun kann eine Pflanze mit dem Bakterium infiziert werden. Damit es zur

gewünschten Genexpression kommt, muss in der Wunschsequenz ein

eukaryotischer Promotor eingebaut sein. Der Arbeitsfortschritt ist wieder mit einem

Antibiotikum, dessen Resistenz auf der T-DNA kodiert wurde, zu überprüfen. Hierbei

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handelt es sich um ein Antibiotikum, welches auch für Pflanzen toxisch ist (z.B. ein

Kanamcin)

1.7 Regulierende Einflüsse der Genaktivität

Promotoren sind Nukleotid-Sequenzen auf der DNA, die als essentieller

Genbestandteil deren Expression regulieren. Das am 5‘-Ende liegende Element

wechselwirkt mit Proteinen, die die Transkription starten (Transkriptionsfaktoren), da

sie RNA Polymerasen binden können. Auch weiter entfernte Basensequenzen

können am Promotor beteiligt sein. Diese werden unterschieden in Enhancer, die die

Genexpression fördern und Silencer, die diese hemmen (sog. cis-Elemente, weil sie

auf der DNA liegen).

Bei Prokaryoten findet man meistens die Abfolge TATA, die sogenannte TATA-Box

(Pribnow-Box), welche bei der -10-Region liegt (Upstream, Zahl gibt an, wie viele

Nukleotide vor dem Transkriptionsstart lokalisiert) und eine TTGACA-Box, welche bei

der -35-Region liegt. Je geringer die Sequenz von der Box-Sequenz abweicht desto

wahrscheinlicher ist eine Transkription, in der die -Untereinheit

(Transkriptionsfaktor) an die -10 Region und die -35 Region bindet.

Promotoren bei Eukaryoten sind wesentlich komplizierter und es kann sich ihnen nur

mit bioinformatischen Methoden angenähert werden. Der Kernpromotor (am

Transkriptionsstart liegend) erstreckt sich meist von -37 bis +32 und besteht oft aus

einer TATA-Box und weiteren Elementen. Der Proximale Promotor ist zwischen -50

und -200 lokalisiert und besteht aus weiteren Boxen wie etwa einer CAAT-Box, oder

eine GC-Box. Der Transkriptionsfaktor TFIID bindet direkt an die TATA-Box und

komplexiert bei Transkriptionsstart mit weiteren Faktoren.

Promotoren könne mithilfe bestimmter bindender Stoffe manipuliert werden, wodurch

die Polymerase nicht andocken kann und es zu keiner Transkription kommen kann.

1.8 Nachweis und Regulation von Genaktivität

Mithilfe von Reporter-oder Indikatorgenen kann die Expression eines anderen Gens

indirekt nachgewiesen werden. Meist handelt es sich bei diesen Genen um solche,

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deren Genprodukte sich leicht nachweisen lassen, sei es durch Fluorimetrie oder

einfache enzymatische Tests. Wird beispielsweise ein Fusionsprotein mit GFP (green

fluorescent protein) verwendet, so wird dieses hinter demselben Promotor postiert,

wird ein Ti-Plasmid genutzt, so werden Gene innerhalb derselben Border-Sequenz

der T-DNA eingebracht, wie das eigentlich eingebrachte Gen. Zur Kontrolle wird ein

Selektionsmarker außerhalb der Border-Sequenz angebracht, um den

Transformationserfolg überprüfen zu können. Reportergene eigenen sich auch oft

zur quantitativen Bestimmung. In Eukaryoten verwendet man oft das GUS-Gen (� –

Glucuronidase, v.a. bei Pflanzenzellen) oder das GFP-Gen (green fluorescent

protein, eines der wichtigsten Reportergene), da diese normalerweise in deren

Genom nicht vorkommen.

Das transkribierte � –Glucuronidase-Enzym hydrolysiert das Substrat X-Glucuronid

nach dessen Zugabe, welches daraufhin blaues Licht reflektiert, dessen Intensität

gemessen werden kann. Das X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3indolyl-�-D-Glucuronid), fällt

nach Reaktion mit dem Enzym (Spaltung einer glykosidischen Bindung) zu einem

schwer löslichen Indigofarbstoff aus. Um die Intensität messen zu können, muss die

Zelle aufgebrochen und damit getötet werden. Weitere in-vitro-Analysen sind

beispielsweise mit dem Substrat 4-Methylumbelliferyl-beta-D-Glucuronid möglich,

dass mit dem Enzym zum fluoreszierenden 4-Methylumbelliferon umgesetzt wird.

Biolumineszenz kann durch die Oxidation von Luciferinen mithilfe von Luciferasen,

welche oft als Reporterproteine eingesetzt werden, erzeugt werden. Der Vorteil liegt

darin, dass die Zelle je nach Toxizität des Luciferins hierbei nicht getötet werden

muss.

Das aus dem CAT-Gen transkribierten Enzym Chloramphenicol Acetyltransferase

dient zur Acetylierung eines radioaktiv markierten Substrats (Chloramphenicol). Der

quantitative Nachweis erfolgt mithilfe eins CAT-Assays (spezielle

Dünnschichtchromatographie).

Oft bringen Reportergene auch Selektionsmarker mit sich. Eine quantitative Analyse

entfällt, jedoch überleben nur die Zellen auf einer Nährlösung, die mit den

bestimmten Antibiotika angereichert wurde, die die Antibiotikaresistenzen aufweisen.

Die RNA-Interferenz (RNA-Silencing) dient der zielgerichteten Ausschaltung von

Genen. Trifft in einer Zelle mRNA auf eine passende antisense-mRNA, so lagern sich

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diese zu einer doppelsträngigen dsRNA zusammen. Diese ist dann funktionslos und

kann in dieser Gestalt nicht vom Ribosom translatiert werden. Das unerwünschte

Gen wurde stillgelegt. dsRNA wird von einem Dicer-Enzym (Hächsler-) zu kurzer (21-

26 bp langer) doppelsträngiger siRNA verdaut, welche nun mit einem

Enzymkomplex, den sogenannten RISC-Komplex (RNA induced silencing complex)

ausbilden. Hier wird die DNA zu einem Einzelstrang zersetzt und die im Komplex

verbleibende siRNA kann mit einer mRNA interagieren und diese schneiden. Gene

lassen sich also gezielt ausschalten, indem man eine künstlich hergestellte

komplementäre Nucleotidsequenz hinter einen geeigneten Promotor in das

Zellgenom einbringt. In der Natur dient dieses Verfahren zur Erkennung

doppelsträngiger Viren RNA. Der Wirkmechanismus wurde in Abbildung 6

dargestellt.

Abbildung 7: RNA- Interferenz. Quelle: http://www.biosicherheit.de/basisinfo/466.rna-interferenz-rnai-

junge-bahnbrechende-entdeckung.html. Stand 17.12.11

Wird von einem Gen zu viel RNA transkribiert, so kommt es zu keiner

Proteinsynthese. Es wird angenommen, dass eine Überrepräsentation eines Gens

eine unabhängige RNA-Polymerase-Aktivität (RNA-dependant RNA-polymerase,

kurz RdRP) startet, die die mRNA zu einer dsRNA synthetisiert. Als Folge wird die

dsRNA wieder in den Prozess der RNA-Interferenz eingeschleust. Dieser Prozess

wird als Co-Suppression bezeichnet. Er wurde zufällig entdeckt, als Forscher

versuchten in Petunien ein weiteres Gen für den Syntheseweg der Anthocyane

einzubauen, um diese noch intensiverer blau zu färben. Als Ergebnis erhielten sie

jedoch teilweise weiße Blüten.

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2. Durchführung

Grundsätzlich kann zur Durchführung das Praktikumsskript zu Rate gezogen werden.

Einige Details wurden jedoch in der Praxis verändert. Die Versuchsabwandlungen

werden in diesem Abschnitt wiedergegeben.

2.1 Qualtitativer Nachweis der Promotoraktivität im Gewebe durch

in-situ-Färbung

Es wurden die Farbmarkierungen mittels der Hydrolyse von MUG (4-Methyl-�-D-

umbelliferylglucuonid) durch das Enzym �-Galactosidase in Arabidopsis thaliana 4

verschiedener Genotypen miteinander verglichen.

Linie 1: Wildtyp (Negativkontrolle)

Linie 2: Promotor CaMV35S vor GUS-Leseraster (Positivkontrolle)

Linie 3: Promotor AtBCAT-1 vor GUS-Leseraster (zu bestimmende Linie)

Linie 4: Promotor AtBCAT-4 vor GUS-Leseraster (zu bestimmende Linie)

Von jeder der oben genannten Linien wurden Blüten, junge Blätter, Stengel und

Wurzel entnommen und auf eine 24-Well-Platte aufgetragen und zu jedem Loch

wurde 400 µl Reaktionslösung C (X- Gluc) gegeben. Aufgrund der Hydrolyse von X-

Glc (5-Brom-4-chlor-3indolyl-�-D-Glucuronid) mithlfe des Enzyms �-Galactosidase

beginnt dieses sich blau zu färben. Aufgrund der Tatsache, dass das Enzym bei

37°C sein Wirkoptimum entfaltet, wird die Well-Plat te in ein 37°C warmes Wasserbad

gelegt. Danach wurde Lösung C durch 400 µl 70%igen Ethanol ersetzt, wodurch sich

das Präparat entfärbte. Die Well-Platte wurde der nächsten Gruppe zur Verfügung

gestellt. Hier wurde die Well-Platte der vorherigen Gruppe betrachtet.

2.2 Fluorimetrische Bestimmung der GUS-Aktivität (q uantitativ)

Es wurden von jeder Linie ca. 100 mg Blattmaterial entnommen und in ein

Eppendorfgefäß gegeben und in flüssigen Stickstoff eingefroren, wodurch die Zellen

20

aufbrachen. Anschließend wurde das Blattmaterial zermörsert. In jedes

Eppendorfgefäß wurden 100 µl des Extraktionspuffers zugegeben und großzügig

gevortext. Danach wurde bei 13000 rpm 15 Minuten lang zentrifugiert, um grobe

Zellbestandteile, wie etwa Zellwandfragmente vom Zentrifugat abzutrennen. 12

weitere Eppendorfgefäßge wurden mit 1900 µL Stopplösung befüllt und wie folgt

beschriftet.

Abbildung 8: Beschriftung der Eppendorfgefäße

Vier weitere Eppendorfgefäße wurden mit je 400 µL der Reaktionslösung F (MUG)

befüllt und der Überstand der Zentrifugation zugegeben und bei 37 °C inkubiert.

Während der Inkubation wird das MUG in der Reaktion von den Enzymen aus dem

Blattmaterialzentrifugationsüberstand in Methylumbelliferon umgesetzt. Nach den

jeweiligen Inkubationszeiten wurden je 100 µL aus dem inkubierten Pflanzenmaterial

entnommen und zu den vorgelegten 1900 µL Stopplösung entsprechend der

Zeitreihe zugegeben. Diese Lösung sorgt für ein basisches Milieu, welches die

Enzymaktivität, dessen Optimum bei einem pH-Wert von 4-5 liegt, hemmt. Dann

wurde das Fluorimeter mit 10 mM Kalibrierlösung (enthält das blau fluoreszierende 4-

Methylumbelliferon) auf 100 % kalibriert und die jeweiligen Messungen in der

Quarzküvette auf Fluoreszenz untersucht.

+

-

P1

P4

P1

P4

P1

P4

P1

P4

P1

P4

21

3. Ergebnisse


in-situ-Färbung

Die bereits präparierte 24-Well Platte wurde mit einem Lichtmikroskop qualitativ

ausgewertet und die Ergebnisse wurden in Tabelle 1 eingetragen.

Tabelle 1: Ergebnisse zum qualitativen Nachweis der Promotoraktivität im Gewebe durch in- situ- Färbung (LW= Literaturwert)

Blüte

Blatt

Stengel

Wurzel

Wildtyp (Negativ-kontrolle)

-

- (LW)

-

- (LW)

-

- (LW)

-

- (LW)

CaMV35S/GUS

(Positiv-kontrolle)

+ (Teils blau)

+ (LW)

+ (vereinzelt)

+ (LW)

+ (Teils blau)

+ (LW)

+ (komplett)

+ (LW)

AtBCAT-1/GUS

+ (Pollen schwach blau)

+ (LW)

-

+ (LW)

+/- (minimal)

+ (LW)

-

- (LW)

AtBCAT-4/GUS

-

+ (LW)

+/- (vereinzelt)

+/- (LW)

+ (vereinzelt)

- (LW)

+ (vereinzelt)

+ (LW)

Die Fälle, in denen nicht das gewünschte Ergebnis erzielt wurde, wurden rot gefärbt

(3 von 16).

22


Mithilfe eines Fluorimeters wurde die Fluoreszenzaktivität der einzelnen Proben

bestimmt und in Tabelle 2 eingetragen.

Tabelle 2: Ergebnisse der fluorimetrischen Bestimmu ng der GUS-Aktivität (quantitativ)

relat. Fluoreszenz [%]

Einwaage

[mg]

2’

[%]

8’

[%]

15’

[%]

45’

[%]

75’

[%]

Negativkontrolle 103

65,1

Positivkontrolle 102

200

AtBCAT – 1 103

44,8

10,5

16,7

67,4

16,8

AtBCAT – 4

100

/

33,0

38,5

56,1

47,9

Ausgehend von diesen Werten konnte die Aktivität der �-Glucuronidase berechnet

werden. Die Ergebnisse hierzu wurden in Tabelle 3 eingetragen. Dazu wurde wie

folgt vorgegangen.

Das Fluorimeter wurde mit einer 10 mM Lösung auf 100 % kalibriert. Daher kann die

in der Probe enthaltene Konzentration wie folgt berechnet werden:

� =��

��%∙ 10

��

� (1)

Da die Proben AtBCAT-1 und AtBCAT-4 100-fach verdünnt wurden (Positivkontrolle

wurde zusätzlich nochmals 10-fach verdünnt, also insgesamt 1000-fach), muss, um

zur tatsächlichen Konzentration zu gelangen, mit dem entsprechenden Faktor

multipliziert werden:

��ü�� = ��ü�� ∙ ��ü�� (2)

Um die Enzymaktivität berechnen zu können, muss die Stoffmenge der Lösung

bestimmt werden, wobei V = 2 mL:

23

� = ∙ � (3)

Die Enzymaktivität errechnet sich nun aus der Stoffmenge durch Inkubationszeit.

Außerdem soll von Units (1 U = 1 µmol Produkt pro Minute) in katal umgerechnet

werden (1 U = 16,67 nkatal):

�� =�

�∙ 16,67 (4)

Schließlich wird zur Normierung durch die eingewogene Masse geteilt:

��

��=

��

�� (5)

Tabelle 3: Ergebnisse zur jeweiligen Aktivität der �-Glucuronidase

Enzymaktivität [nkat/mg]

Units

2’

[nkat/mg]

U

8’

[nkat/mg]

U

15’

[nkat/mg]

U

45’

[nkat/mg]

U

75’

[nkat/mg]

U

Negativkontrolle

28096,2

17,36

Positivkontrolle

8,7163

53,33

AtBCAT – 1

72,5064

448,00

4,2484

26,25

3,6037

22,27

4,8482

29,95

0,7250

4,48

AtBCAT – 4

/

/

13,7528

82,50

8,5572

51,33

4,1564

24,93

2,1293

12,77

Die in Tabelle 3 aufgetragenen Werte wurden nun in Diagramm 1 überführt. Zur

Überprüfung der Werte wurden Regressionsgeraden erstellt.

24

Diagramm 1: Grafische Auswertung der Enzymaktivität

Es wird sichtbar, dass beide eingezeichneten Regressionsgeraden streng monoton

fallen. Allerdings fällt die Gerade von AtBCAT–1 viel steiler wie die von AtBCAT–4.

4. Diskussion


in-situ-Färbung

Aus Tabelle 1 wurden die Ergebnisse ersichtlich. Positiv-und Negativkontrolle

hingegen entsprechen gänzlich den Erwartungen. Die Expression der Positivkontrolle

kam durch einen konstitutiven Promotor zustande, der gewebsunspezifische Aktivität

aufwies. Da die Negativkontrolle das zu exprimierende Gen �-Glucuronidase nicht

besitzt, konnte es zu keinem dementsprechenden Phänotyp (Blaufärbung) kommen.

Bei AtBCAT-1/GUS und AtBCAT-4/GUS wurde das Gen hinter 2 gewebespezifische

Promotoren kloniert, wodurch sich nur manche Pflanzenorgane färbten. AtBCAT-

1/GUS weißt keine Genexpression in den Blättern auf. Dies kann daran liegen, dass

zu alte Blätter getestet wurden, bei denen keine Genaktivität mehr stattfand. Die

Vorgänge in den Pflanzenzellen werden mit zunehmendem Alter langsamer. Die nur

minimale Genexpression im Stengel kann ein Hinweis darauf sein, dass es sich um

eine bereits ältere Pflanze gehandelt haben könnte. Es kam also zu einer

-10000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

0 10 20 30 40 50 60 70 80

En

zym

ak

tiv

itä

t p

ro M

ass

e [

nk

at/

g]

Zeit [min]

AtBCAT - 1

AtBCAT - 4

Linear (AtBCAT - 1)

Linear (AtBCAT - 4)

25

schwächeren Enzymaktivität in Blättern und Stängeln dieser Linie, wie eigentlich

erwartet wurde. Wie erwartet färbte sich das Blütengewebe blau ein. Die Wurzeln

färbten sich nicht. AtBCAT-4/GUS weißt Enzymaktivät im Stengel auf, wo eigentlich

keine sein sollte, wohingegen in der Blüte keine Enzymaktivität festgestellt werden

konnte. Dies kann darauf hin deuten, dass das Pflanzengewebe mit. einer anderen

Linie vertauscht worden ist. Teilweise erschien farbiges Gewebe unter dem

Mikroskop zu klein und wurde einfach übersehen. Bei Blättern und Wurzeln hingegen

kam es zu der erwarteten Blaufärbung.


Durch den Vergleich der Enzymaktivitäten konnte die Aktivität der Promotoren

miteinander verglichen werden. Der konstitutive Promotor der Positivkontrolle stellte

den Oberwert der Enzymaktivität dar. In der Negativkontrolle sollte eigentlich keine

Enzymaktivität zu beobachten gewesen sein, jedoch wurde ein relativ hoher Wert für

die Fluoreszenz gemessen. Das kann zwei Gründe haben.

Die Quarzküvette, die für alle Messungen verwendet wurde, war von den vorherigen

Lösungen verunreinigt. Wäre dies der Fall, so sind beinahe alle Messungen davon

betroffen.

Aufgrund des Alters des Fluorimeters ist es durchaus denkbar, dass es hier zu

erheblichen Messabweichungen aus technischen Gründen kam.

AtBCAT–1 und AtBCAT–4 zeigen geringere Enzymaktivität wie die Positivkontrolle,

wobei AtBCAT–1 der aktivere ist. Werden die beiden Regressionsgeraden

miteinander verglichen, so fällt auf, dass die Gerade von AtBCAT–1 viel steiler

verläuft, da das Substrat schneller mit dem Enzym interagiert, dadurch die

Substratkonzentration abnimmt. Bei Substratüberschuss bleibt das Enzym immer

besetzt. Bei AtBCAT–4 hingegen bleibt die Substratkonzentration und damit die

Enzymaktivität relativ gleich. Es wäre zu erwarten gewesen, dass die beiden

normierten Regressionsgeraden waagrecht verlaufen. Leider konnten die

Verdünnungsfaktoren der einzelnen Proben nicht mehr nachvollzogen werden.

Daher ist die Gesamtenzymaktivität der unverdünnten Proben unbekannt. Es wurde

26

immer wieder ein Teil aus den Proben entnommen. Dadurch kam es zu einer

Abnahme der Enzymmenge. Als Folge wurde weniger Umsatz erzielt.

5. Quellen

1) Stryer; Biochemie 6.Auflage 2007 Spektrum akademischer Verlag

2) Heß, Dieter; Pflanzenphysiologie, 10. Auflage, 1999, Ulmer Verlag

3) Skript zum Grundpraktikum Pflanzenphysiologie und molekulare Botanik WS

2011/12

4) Campbell, Neil A.; Biologie, 2. Korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Verlag

5) http://de.wikipedia.org/wiki/Transfektion

6) http://de.wikipedia.org/wiki/Biotechnologie

7) http://de.wikipedia.org/wiki/Gentechnologie

8) http://de.wikipedia.org/wiki/Bt-Mais#Bt-Mais

9) http://de.wikipedia.org/wiki/Flavr-Savr-Tomate

10) http://de.wikipedia.org/wiki/Golden_Rice

11) http://de.wikipedia.org/wiki/Konjugation_(Biologie)

12) http://de.wikipedia.org/wiki/Transduktion_(Genetik)

13) http://de.wikipedia.org/wiki/Transformation_(Genetik)

14) http://wiki.zum.de/images/a/ad/GAtechnischeEntwicklung.pdf

15) http://de.wikipedia.org/wiki/Transfektion

16) http://de.wikipedia.org/wiki/Protoplastenfusion

17) http://de.wikipedia.org/wiki/Elektroporation

18) http://de.wikipedia.org/wiki/Vektor_(Biologie)

19) http://de.wikipedia.org/wiki/Plasmid

27

20) http://de.wikipedia.org/wiki/Cosmid

21) http://de.wikipedia.org/wiki/YAC

22)http://de.wikipedia.org/wiki/Gr%C3%BCne_Gentechnik#Transformation_durch_Ag

robacterium_tumefaciens

23) http://de.wikipedia.org/wiki/Promotor_(Genetik)

24) http://de.wikipedia.org/wiki/Enhancer_(Genetik)

25) http://de.wikipedia.org/wiki/Gr%C3%BCn_fluoreszierendes_Protein

26) http://de.wikipedia.org/wiki/Cosuppression

27) http://en.wikipedia.org/wiki/RNA-dependent_RNA_polymerase

Universität Ulm Protokoll zu den Grundübungen ... · 1.3 Einteilung und Anwendungsbereiche der...

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