UNIVERSITÄT HOHENHEIMInstitut für Lebensmittelwissenschaft und BiotechnologieFg. Lebensmittel tierischer Herkunft mit Forschungs- und Lehrmolkerei

Sichere und schonende thermische Behandlungvon Lebensmitteln:

Daten zur Sporeninaktivierung und deren Analyse bei m Designvon Prozessen

J. Hinrichs

Bacillus licheniformis Sporen

2

Der Weg des Lebensmittels

Thermische Behandlung(direkte Erhitzung)

Up-stream Processing

Rohstoffe

Verpacken

„Sicheres und haltbares“Endprodukt

Thermische Behandlung

Bild: Beispiele für die Inaktivierung von B. amyloliquefaciens HRSF 298 um 9 log aus unterschiedlichen Inaktivierungsexperimenten

Was sind die „richtigen“Daten zur Auslegung der thermischen Behandlung?

Inaktivieren pathogener und lebensmittelverderbende MOBakterien (Bacillus und Clostridien Sporen )Hefen, Schimmelpilze (Sporen)Viren, Prionen (134 °C, mind. 18 min)

Wesentliche Einflüsse

MO: Art, Spezies, Anzahl, Vorgeschichte etc.

Milieu: pH = f(ϑ), aw-Wert, Produktzusammensetzung, z. B. Zucker etc. Verfahren: Erhitzen, Bestrahlung, Filtrieren, Waschen, Hochdruck, Desinfektion etc.Parameter: Temperatur, Druck, Zeit, Konzentration etc.

Weitere EffekteInaktivierung von Enzyme (Haltbarkeit), Abbau von Allergenen, Verlust essentieller Inhaltsstoffe z. B. Vitamine Farb- und Aromaveränderung etc.

Zielkonflikt: mikrobiologisch sichere und haltbare Produkte und schonend behandelt?

steril

unsterilakzeptp

.=

p

VC

pV

CB

⋅=⋅

= 00 log1

log*

Behandlungseffekt B* bzw. notwenige Inaktivierung

Wahrscheinlichkeit p einer Unsterilität bzw. akzeptiertes Niveau

(1)

(2)

Welche Inaktivierungseffekt ist notwenig?

Beispiel:

Tabelle: B*-Werte für unterschiedliche Aus-gangssporenzahl C0 und Volumina bei konstantem p

Sporenzahl Nicht steril Volumen V in mL

C0 in KBE/mL p 10 103 106

101 10-4 6 8 11

102 10-4 7 9 12

104 10-4 9 11 14

106 10-4 11 13 16

Welche Inaktivierungseffekt ist notwenig?

Man benötigt also Inaktivierungseffekte für Sporen

von B*= 9 bis 12

oder sogar mehr, wobei dennoch ein Ausfallrisiko bleibt.

Wie bestimmt man die Inaktivierungsdaten?

Dampf

Kondensat

PT100

Proberöhrchen

1. Bakterien anzüchten – 2. Sporenbildung induzieren – 3. Ernte – 4. Ansetzen von Sporensuspensionen mit C0 > 106 KBE/mL

5. Inaktivierungs-experimente

6. Überlebende Sporen CE

7. Datenauswertung

Batch ErhitzerKühler

HeißhalterHeißhalter

Produkt

Konti.

Labordaten

Figure: Commonly observed types of survival curves: linear (A), linear with tailing (D), sigmoidal-like (F), linear with a preceding shoulder (H), biphasic (B), concave (C), biphasic with a shoulder (G), and convex (E). (Hinrichs & Atamer, 2010)

Labordaten

Table: Models for survival curves

Source: Xiong et al. / International Journal of Food Microbiology 46 (1999) 45 –55

Auswertung

Table: Models for survival curves (continued)

Source: Xiong et al. / International Journal of Food Microbiology 46 (1999) 45 –55

Weibull Peleg and Cole (1998)

Van Boekel (2002)

A, G, H

Auswertung

D- und z-Wert

Table 1: Summary of reported temperature-dependent kinetic data for inactivation of high thermal resistant spores-forming bacteria (data calculated and adapted from Horak, 1980; Behringer & Kessler, 1991; Kessler, 1996; Huem et al., 1998; Walstra et al., 1999) Bacteria Medium Temp.

ϑref

in °C

Dref-value

in min

zref-value

in K

Abs. Temp.

Tref* in K

Order

n

kref*

in s-1

EA

in KJ mol-1

Single strains

Bacillus cereus

Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis

Bacillus subtilis

Bacillus coagulans

Bacillus coagulans

Bacillus pumilus

Bac. stearothermophilus, spore

Bac. stearothermophilus, spore

Bac. stearothermophilus, spore

Bac. sporothermodurans J16B

Bac. sporothermodurans B93-20-12

Bac. sporothermodurans MB921

Clostridium sporogenes

Clostridium botulinum

Milk

Skim milk

Evap. skim milk 40% Dm

Coffee cream (15 % fat)

Milk

Skim milk

Evap. skim milk 40% Dm

Milk

Milk

Evap. skim milk 40% Dm

Coffee cream (15 % fat)

Skim milk

Skim milk

Skim milk

Milk (pH 7.0)

Milk (pH 7.0)

121

111

111

111

111

121

118

118

120

120

120

121

121

121

121

121

0.04

0.48

0.84

0.46

0.5

1.58

1.85

1.4

4.1

2.6

4.25

2.68

3.47

2.03

1.7

0.21

9.4-9.7

8

7.88

7.31

10.7

8.52

9.32

9.7

7.54

7.89

7.78

13.1

14.2

13.2

-

10

394

384

384

384

384

391

391

391

393

393

393

∞

∞

∞

-

394

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

9.6e-1

7.90e-2

4.56e-2

8.18e-2

7.7e-2

2.42e-2

2.07e-2

2.7e-2

9.37e-3

1.49e-2

9.02e-3

1.69e30

6.24e27

1.25e30

-

0.18

306-316

350

355

379

264

339

313

302

390

372

374

242

224

240

-

297

Evap. = evaporated

Hinrichs, J. & Rademacher, B.: In: Encyclopedia of Dairy Science, 2003

Beispiel: Geobacillus stearothermophilus

-8

-1010 20 30 40 50 60 70 80

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

Spo

renz

ahl L

og C

(in

KB

E/m

L)

Haltezeit bei = 120°C in minϑ

Probleme1. Extrapolation2. Auswertemodell3. Datenbasis z.B.

Fehler

D120°C = 4,1 min Laborexperiment

Extrapolationfür die Praxis

D120°C = 2,6 min

7≠ 1117 - 125B. sporothermodurans IC4

6100.39105≠ 12740.098100 - 109B. coagulans CCT 2467

37.83.5810013410.01198 - 115B. cereus 9818

50.151.9

104≠ 10.2590.020

96 - 104 B. pumilus

121

120

108

Tref(°C)

16

7.4

9.0

z (K)

180

400

309

EA (kJ/mol)

1

1

1

n (-)

24.20.55100 - 125B. flexus

42.360.016115 - 130Geobacillus stearothermophilus 12980

10.520.074102 - 111Bacillus subtilis 4524

SourceDref(min)

kref(1/s)

Temperaturerange (°C)

Species

Table: Thermal inactivation of Bacillus spores

1 Condón, S., Palop, A., Raso J., & Sala, F.J., 1996. Letters in Applied Microbiology 22, 149-152.2 Dogan Z., Weidendorfer, K., Müller-Merbac, M., Lembke, F., Hinrichs, J. 2009. LWT - Food Science and Technology 42, 81-86.3 González, I., López, M., Martínez, S., Bernardo, A., & González, J., 1999. International Journal of Food Microbiology 51, 81–84.4 Lopez, M., Gonzalez, I., Mazas, M., Gonzalez, J., Martin, R., & Bernardo, A., 1997. International Journal of Food Science Technology 32, 305–311.5 Ruiz, P., Ocio, M.J., Cardona, F., Fernandez, A., Rodrigo, M., & Martinez, A. 2002. Journal of Food Microbiology and Safety 67, 776-779.6 Pacheco,C.P., & Massaguer P.R., 2004. Journal of Food Process Engineering 27, 449–463.7 Periago, P.M., Zuijlen, A., Fernandez, P.S., Klapwijk, P.M., Steeg, P.F., Corradini, M.G., Peleg, M., 2004. International Journal of Food Microbiology 95, 205-218.

References:

Nicht log-lin Inaktivierungsverhalten

-8

-1010 20 30 40 50 60 70 80

-6

-4

-2

0

2

4

6

8S

pore

nzah

l Log

C (

in K

BE

/mL)

Haltezeit bei in minϑ

Extrapolation für die Praxis

Laborexperiment

Probleme1. Extrapolation2. Auswertemodell3. Datenbasis z.B.

Fehler

Probleme1.Extrapolation2.Auswertemodell3.Datenbasis z.B. Fehler

Kann man die Laborexperimente der Praxis annähern und damit die Datenbasis verbessern?

Source: Roberts & Greenwood (2003). Practicle Food Microbiology , 3rd Ed., UK.

Replicate 1

Replicate 2

Replicate 3

Sample

Replicate 1

Replicate 2

Replicate 3

Incubation 24h

Number of positive samples 2 2 1

10-1 10-2 10-3

Replicate 1

Replicate 2

Replicate 3

Sample

Replicate 1

Replicate 2

Replicate 3

Incubation 24h

Number of positive samples 2 2 1

10-1 10-2 10-3

Reading = 2,2,1from Table 1, MPN value =28MPN/mL (MPN value * 10) = 280

MPN value

Table 1: Most probable number(MPN): three tubes at each dilution

Reading = 2,2,1from Table 1, MPN value =28MPN/mL (MPN value * 10) = 280

MPN value

Table 1: Most probable number(MPN): three tubes at each dilution

MPN: Most probable number

7≠ 1117 - 125B. sporothermodurans IC4

6100.39105≠ 12740.098100 - 109B. coagulans CCT 2467

37.83.5810013410.01198 - 115B. cereus 9818

50.151.9

104≠ 10.2590.020

96 - 104 B. pumilus

121

120

108

Tref(°C)

16

7.4

9.0

z (K)

180

400

309

EA (kJ/mol)

1

1

1

n (-)

24.20.55100 - 125B. flexus

42.360.016115 - 130Geobacillus stearothermophilus 12980

10.520.074102 - 111Bacillus subtilis 4524

SourceDref(min)

kref(1/s)

Temperaturerange (°C)

Species

Table: Thermal inactivation of Bacillus spores

1 Condón, S., Palop, A., Raso J., & Sala, F.J., 1996. Letters in Applied Microbiology 22, 149-152.2 Dogan Z., Weidendorfer, K., Müller-Merbac, M., Lembke, F., Hinrichs, J. 2009. LWT - Food Science and Technology 42, 81-86.3 González, I., López, M., Martínez, S., Bernardo, A., & González, J., 1999. International Journal of Food Microbiology 51, 81–84.4 Lopez, M., Gonzalez, I., Mazas, M., Gonzalez, J., Martin, R., & Bernardo, A., 1997. International Journal of Food Science Technology 32, 305–311.5 Ruiz, P., Ocio, M.J., Cardona, F., Fernandez, A., Rodrigo, M., & Martinez, A. 2002. Journal of Food Microbiology and Safety 67, 776-779.6 Pacheco,C.P., & Massaguer P.R., 2004. Journal of Food Process Engineering 27, 449–463.7 Periago, P.M., Zuijlen, A., Fernandez, P.S., Klapwijk, P.M., Steeg, P.F., Corradini, M.G., Peleg, M., 2004. International Journal of Food Microbiology 95, 205-218.

References:

Experimenteller Temperaturbereich

Parameter: D- und z-Wert

F-Wert: SterilisationseffektF = n ⋅ Dϑz.B. 12 D-Konzept: F0 = 12 ⋅ D121°C = 2,5 min für

Cl. botulinum

Parameter: k, E a, n

B*-Wert: SterilisationseffektB* ≥ 1z.B. Inaktivierung von thermophilen Sporenbildnernum 9 log.

Temperatur-Zeit-Profil UHT-Erhitzung und Behandlungseffekt. Quelle: Kessler H.G., 2002

B* = 1,33

Konzepte für Auslegung/Überprüfung von Erhitzungspr ozessen

Dampf

Kondensat

Eiswasser

PT100

Produkt

Heating time in s

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Tem

pera

ture

h in

°C

0

20

40

60

80

100

120

140

Fig. 1. Recorded temperature-time profiles of two heating experiments carried out in tubes for batch inactivation of B. flexus. t0: start of the experiment with C0 (initial cell count); tholding: holding time (where the temperature, �holding, was constant at (�holding ± 2 K); tE: end of the treatment with CE (cell count after treatment)

t0, C0 tE1, CE1 tE2, CE2

tholding

Proberöhrchen

Experimentelle Inaktivierungsdaten-Batch

ErhitzerKühler

HeißhalterProdukt

Heating time in s

0 5 10 15 20 25

Tem

pera

ture

h i

n °C

0

20

40

60

80

100

120

140

Fig. 2. Temperature-time profile from one of the experiments conducted on the continuous system for the inactivation of B. stearothermophilus (dotted line represents the assumed temperature for estimation kinetic parameter). t0: start of the experiment with C0 (initial cell count); tholding: holding time; tE: end of the treatment with CE (cell count after treatment); •: temperature measurement and record of ϑ1,2,3,4

t0, C0 ϑϑϑϑ 1

tE, CE ϑϑϑϑ 4

ϑϑϑϑ 2 ϑϑϑϑ 3

tholding

Kontinuierliches System: KERSYS MEDIKER, hde Metallwerke Menden GmbH, Germany

Experimentelle Inaktivierungsdaten-Konti-System

Heating time in s

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Tem

pera

ture

h in

°C

0

20

40

60

80

100

120

140

Fig. 1. Recorded temperature-time profiles of two heating experiments carried out in tubes for batch inactivation of B. flexus. t0: start of the experiment with C0 (initial cell count); ϑholding: holding time (where the temperature, ϑholding, was constant at (ϑholding ± 2 K); tE: end of the treatment with CE (cell count after treatment)

t0, C0 tE1, CE1 tE2, CE2

tholding

Probleme: 1. Aufheiz- und Abkühlphase nicht berücksichtigt

2. Abgrenzen der Haltephase schwierig

2. Mitteln der Temperaturschwankungen

2. > 120°C kaum Messdaten zu gewinnen

Berechnung Inaktivierungsdaten

Ea in kJmol-10 200 400 600 800 1000

log

k ref

(k

ref i

n s-1

)

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

Fig. 3. Semi-logarithmic plot of the family of solutions of Eq. 4 for inactivation of B. flexus in the batch heating system for the applied temperature-time profile given in the small inserted graph (C0 = 3.9·107 cfu mL-1 ; CE = 8.0·103 cfu mL-1)

Heating time in s

0 20 40 60 80 100 120

Tem

pera

ture

h in

°C

20

40

60

80

100

120

Temperatur = f(t)

⋅

⋅−⋅−= t

TE

kCC aE

Rexpexp 0

0

Ea = f(k0)

für ein

Erhitzungs-

experiment

Inaktivierungsdaten / Neue Methodik I

Ea in kJmol-10 200 400 600 800 1000

log

k ref

(k

ref i

n s-1

)

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

Fig. 4. Semi-logarithmic plot of kref vs. Ea curves of four experiments done with B. flexus using the batch heating system. TP 1, TP 2, TP 3, TP 4, TP 5: Experiments with different temperature-time profile at the corresponding heating temperature and holding time.

Ea

kref

240 100 TP 4

125 101 TP 3

5 116 TP 2

60 108 TP 1

time in s

Temp. in °C

Exp

4 120 TP 5

Ermitteln von Eaund k:

Ea und k0 (bzw. kref ) müssen für alle Experimente gleich sein

→ Schnittpunkt der Kurven

Vorteil

1. Aufheiz- und Abkühlphase berücksichtigt

2. Abgrenzen der Haltephase entfällt

3. Mitteln Temperaturschwankungen entfällt

4. auch > 120°C Messdaten zu gewinnen

Inaktivierungsdaten / Neue Methodik II

-1.6

-1.2

-0.8

-0.4

0

0.4

0.8

1.2

0 100 200 300 400

-1.8

-1.6

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0 100 200

99%

99%

99%

99%

95%

95%

95%

95%

90%

90%

90%

90%

300 400 500

E in kJ/mol a

E in kJ/mol a

G. stearothermophilus

B. flexus

Batch system

Batch system

Conti. system

Conti. system

log

k(k

in s

)

ref

ref

-1lo

g k

(kin

s)

re

f re

f -1

Fig.: 90%, 95 % and 99 % confidence regions for

the parameters log kref at reference temperature

121°C and Ea for G. stearothermophilus and B.

flexus determined in the batch and the

continuous heating system. The curves represent

constant sum of square errors calculated by Eq.

(5).

Neue Methodik III

Source: Z. Dogan, K. Weidendorfer, M. Müller-Merbach, F.

Lembke & J Hinrichs. Evaluation of Batch and Continuous

Heating Systems to Determine Heat Inactivation Kinetics of

Bacillus Spores. J. of Applied Microbiology (2008).

→→→→ In den Experimenten verlief die Inaktivierung der Sporen im Konti-System schneller als im Batch-System!

Zusammenfassung

• Festlegen von Prozessparametern für Sterilität basiert auf Wahrscheinlichkeiten

• Strategie: Sicherheit erhöhen durch höhere Temperatur oder längere Haltezeit → negative Auswirkung für die Produktqualität

• Experimentelle Herangehensweise in Richtung Praxis optimieren, z.B. Sporulationsmedium, MPN

• Experimentellen Ansatz bereits mit Modell kombinieren.• Widersprüchen nachgehen, z.B. Batch, Konti. • Unsichere Daten führen zu unsicheren Modellen für die Extrapolation

Aber: „Besser ungefähr richtig, als haargenau falsch!“

Sichere und schonende thermische Behandlungvon Lebensmitteln:

Daten zur Sporeninaktivierung und deren Analyse beim Designvon Prozessen

UNIVERSITÄT HOHENHEIMInstitut für Lebensmittelwissenschaft und BiotechnologieFg. Lebensmittel tierischer Herkunft mit Forschungs- und Lehrmolkerei

Hinrichs │ eidner@uni-hohenheim.de │April 2010

Sept. 2009

DankPräsentierte Ergebnisse wurden im Rahmen verschiedener AiF-Forschungsvorhaben gewonnen (AiF-

FV 14339 N, 15886N, 16012 N). Die Arbeiten wurden und werden im „Programm zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF)“ vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (via AiF) über den Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.V. (FEI) gefördert.

Dank

Prof. S. Scherer, Dr. G. Lücking, Prof. M. Ehling-Schulz, Prof. K. Heller, Dr. Neve, Prof. A. Kuhn

Z. Atamer, Frau J. Hauger

Studenten: S. Bachmann, M. Witthuhn

und den vielen Firmen.