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Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Reinhard Marre EINSATZ MOLEKULARER METHODEN ZUR IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG GRAM-NEGATIVER NONFERMENTATIVER STÄBCHENBAKTERIEN VON MUKOVISZIDOSEPATIENTEN DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Juliane Köthe geb. in Düsseldorf 2005

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Universität Ulm

Institut für Mikrobiologie und Immunologie

Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene

Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Reinhard Marre

EINSATZ MOLEKULARER METHODEN

ZUR IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG

GRAM-NEGATIVER NONFERMENTATIVER STÄBCHENBAKTERIEN

VON MUKOVISZIDOSEPATIENTEN

DISSERTATION

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm

vorgelegt von

Juliane Köthe

geb. in Düsseldorf

2005

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Amtierender Dekan: Prof. Dr.med. Klaus-Michael Debatin

1. Berichterstatter: Prof. Dr. N. Wellinghausen

2. Berichterstatter: PD Dr. O. Sommerburg

Tag der Promotion: 12.07.07

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Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis .……………………………...………………………………….….. I

1.Einleitung ............................................................................................................................... 1

1.1. Mukoviszidose ............................................................................................................... 1

1.2. Erregerspektrum pulmonaler Infektionen bei Mukoviszidose ....................................... 5

1.3. Mikrobiologische Diagnostik ....................................................................................... 10

1.4. Zielsetzung der Arbeit .................................................................................................. 14

2. Material .............................................................................................................................. 15

2.1. Chemikalien und Reagenzien....................................................................................... 15

2.2. Primer ........................................................................................................................... 17

2.3. Bakterienstämme.......................................................................................................... 17

2.4. Laborbedarf .................................................................................................................. 18

2.5. Kits ............................................................................................................................... 18

2.6. Geräte ........................................................................................................................... 19

2.7. Software ....................................................................................................................... 20

3. Methodik ............................................................................................................................ 21

3.1. Bakterienisolate von Mukoviszidosepatienten............................................................. 21

3.2. Bakterienkultur............................................................................................................. 22

3.3. Beurteilung der Morphologie der Bakterien ................................................................ 22

3.3.1. Koloniemorphologie.............................................................................................. 22

3.3.2. Prüfung des Wachstumsverhaltens bei 42 °C ....................................................... 22

3.4. Biochemische Identifizierung der Bakterien................................................................ 23

3.4.1. Oxidase-Test.......................................................................................................... 23

3.4.2. Api 20 NE.............................................................................................................. 24

3.5. Resistenztestung ........................................................................................................... 25

3.6. Molekularbiologische Identifizierung der Bakterien ................................................... 26

3.6.1. Isolierung von bakterieller DNA........................................................................... 27

3.6.2. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ..................................................................... 28

3.6.3. Agarosegelelektrophorese ..................................................................................... 29

3.6.4. DNA-Sequenzierung ............................................................................................. 30

3.6.5. Sequenzierung des RecA-Gens von Burkholderia cepacia Komplex ................... 34

3.7. Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)............................................................................... 35

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4. Ergebnisse .......................................................................................................................... 38

4.1. Identifizierung der Bakterienisolate .............................................................................. 38

4.1.1. Konventionelle Identifizierung der Bakterien....................................................... 39

4.1.2. Molekularbiologische Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung .... 41

4.1.3. Vergleich von konventioneller und molekularbiologischer Identifizierung ......... 42

4.2. Betrachtung ausgewählter Spezies ............................................................................... 46

4.2.1. Comamonas testosteroni und Pseudomonas alcaligenes ...................................... 47

4.2.2. Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi .................................... 47

4.2.3. Inquilinus limosus ................................................................................................. 50

4.3. Verlaufsbeurteilung und molekulare Erregertypisierung ............................................. 51

4.3.1. Achromobacter xylosoxidans ................................................................................ 51

4.3.2. Burkholderia cepacia Komplex ............................................................................ 55

4.3.3. Pseudomonas aeruginosa...................................................................................... 58

5. Diskussion .......................................................................................................................... 62

5.1. Identifizierung der Bakterienisolate ............................................................................. 62

5.2. Betrachtung ausgewählter Spezies ............................................................................... 68

5.3. Verlaufsbeurteilung und molekulare Erregertypisierung ............................................. 71

5.4. Ausblick ....................................................................................................................... 76

6. Zusammenfassung............................................................................................................. 78

7. Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 79

8. Danksagung........................................................................................................................ 93

9. Lebenslauf .......................................................................................................................... 94

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Abkürzungsverzeichnis I

Abkürzungsverzeichnis:

A. Achromobacter

Abb. Abbildung

ADH Arginindihydrolase

ATCC American Type Culture Collection

Aqua bidest. Aqua bidestilliert

B. Burkholderia

bp Basenpaare

BSA Bovines Seum Albumin

ca. circa

CF Zystische Fibrose, Mukoviszidose

CFBP Collection Française de Bactéries Phytopathogènes

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator

CFU Colony Forming Units, Kolonie-bildende Einheiten

DIN EN ISO Deutsche Industrienorm Europäische Norm

International Organisation for Standardisation

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynukleosidtriphosphate

DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen

DTT Dithiotreitol

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure

Fa. Firma

FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung

ggf. gegebenenfalls

GLU Glucose

HCl Salzsäure

HHD Hemmhof-Durchmesser

H2O2 Wasserstoffperoxid

IAM Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo

J. Jahre

Kap. Kapitel

kb Kilobasen

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Abkürzungsverzeichnis II

kbp Kilobasenpaare

LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent

MgCl2 Magnesiumchlorid

Na Natrium

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxid

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

Nr. Nummer

P. Pseudomonas

PCR Polymerase-Ketten-Reaktion

PFGE Pulsfeldgelelektrophorese

RecA Recombination A

rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

SDS Sodiumdodecylsulfat

s. siehe

sog. sogenannte, sogenanntes

sp./spp. Spezies (Singular/Plural)

ssp. Subspezies

s.u. siehe unten

Tab. Tabelle

TBE Tris-Borat-EDTA

TE Tris-EDTA

TMPD Tetramethyl-p-phenylendiamin-Dichlorid

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U/min Umdrehungen pro Minute

URE Urease

UV Ultraviolett

Für sämtliche physikalische Einheiten wurden die international anerkannten Abkürzungen

verwendet.

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Einleitung 1

1.Einleitung

1.1. Mukoviszidose

Die Geschichte der Mukoviszidose oder zystischen Fibrose (CF) lässt sich sehr lange

zurückverfolgen. Bereits im 17. Jahrhundert war bekannt, dass Neugeborene, deren Haut

beim Küssen salzig schmeckt, früh versterben. Auch andere anekdotische Schilderungen

typischer Mukoviszidose-Symptome sind aus dem Mittelalter überliefert. Aus modernen

Mutationsfrequenzanalysen schließt man heute, dass erste Mutationen bereits 40000 v.

Chr. auftraten (25). Heutzutage ist die Mukoviszidose mit einer Häufigkeit von 1:2000

Lebendgeborenen die häufigste erbliche Stoffwechselerkrankung in Deutschland (101). Sie

wird autosomal-rezessiv vererbt, wobei heterozygote Merkmalträger nicht erkranken. Die

Häufigkeit der heterozygoten, gesunden Merkmalträger beträgt in Europa 1:20 bis 1:30

(122).

Genetik

Die Erkrankung wird durch Mutationen in einem bestimmten Gen ausgelöst. Die

Entdeckung und Lokalisation dieses Zystische Fibrose (CF)-Gens im Jahre 1989 war ein

bedeutender Fortschritt im Kenntnissstand über Mukoviszidose (10; 48; 78) und lässt

seither auf Ansätze kausaler Therapien hoffen. Der Gendefekt des CF-Gens liegt bei 70 %

der betroffenen Mitteleuropäer in der Mutation ∆F508 auf dem langen Arm des

Chromosoms 7 (41). Diese Mutation führt zur Deletion der Aminosäure Phenylalanin.

Insgesamt sind über 1300 weitere Mutationen im CF-Gen bekannt, welche allesamt zu

einem defekten Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR)-Protein führen. Dieses

entspricht funktionell einem Ionenkanal für den Transport von Chlorid- und Bicarbonat-

Ionen in der Zellmembran sekretorischer Drüsen. Zudem werden dem CFTR-Protein in der

Literatur kontrovers diskutierte weitere Funktionen, wie z. B. die Regulation des

Membranlipidstoffwechsels, die Regulation des intrazellulären Membrantransports, die

Regulation der Aktivität anderer Ionenkanäle und die Bindung von Pseudomonas

aeruginosa und anderen Bakterien, zugeschrieben (122).

Pathophysiologie

Als Resultat der verminderten Chloridpermeabilität der Zellmembranen ergibt sich eine

pathologische Zusammensetzung der Sekrete verschiedener exokriner Drüsen und Organe,

wie Lunge, Bauchspeicheldrüse, Darm, Leber und Gallenwege (89). Die zähflüssigen,

hyperviskösen Sekrete führen zur Sekretretention und zur Obstruktion der Drüsen-

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Einleitung 2

ausführungsgänge der entsprechenden Organe. Infolgedessen zeigt sich die Mukoviszidose

als Multiorgankrankheit mit einem breiten Symptomkomplex (100).

Klinisches Bild der Mukoviszidose

Das Krankheitsbild der Mukoviszidose erstreckt sich von sehr milder Symptomatik bis hin

zu schweren Verläufen. Betroffene Neugeborene fallen in ca. 10 % der Fälle bei der

Geburt durch Mekoniumileus auf (10; 74). Das typische Erscheinungsbild der Muko-

viszidose ist eine Kombination von Symptomen aus den beiden hauptsächlich betroffenen

Organsystemen, der Lunge und dem Gastrointestinaltrakt. Es manifestiert sich zum Teil

jedoch erst nach Monaten bis Jahren (74; 100).

Die gastrointestinale Symptomatik ist gekennzeichnet durch übelriechende, voluminöse

Fettstühle, Bauchschmerzen, Blähungen und ein aufgetriebenes Abdomen. Langfristig

führt die chronische Maldigestion und Malabsorption zu Gedeihstörungen und

Entwicklungsverzögerung mit Minderwuchs und Gewichtsverlust.

Die pulmonale Symptomatik geht mit Dyspnoe und quälendem Husten, der anfangs

häufig mit Keuchhusten verwechselt wird, einher (100). Der hochvisköse Schleim führt

durch verstärkte Haftung an den Bronchialwänden zu einer verminderten Selbstreinigungs-

funktion der Alveolen durch die Zilien (mukoziliäre Clearance) und senkt die Effizienz der

Hustenclearance (47). Dadurch kommt es zur Obstruktion der kleineren Atemwege durch

angestauten Schleim (Mukostase) und zu chronischen Entzündungen, die eine Zerstörung

der Bronchien mit Umbau des Lungengewebes nach sich ziehen. Aus der fortschreitenden

Destruktion der Bronchien resultiert ein Stabilitätsverlust der Bronchialwände, der einen

Bronchialkollaps begünstigt. Zusätzlich leiden Mukoviszidose-Patienten gehäuft unter

Infektionen des Respirationstraktes. Rezidivierende bakterielle Bronchitiden und

Pneumonien führen zum Untergang körpereigener Leukozyten und Epithelzellen und somit

zur DNA-Freisetzung aus den Zellkernen dieser Zellen. Außerdem kommt es zu einer

verstärkten Produktion von Elastase aus neutrophilen Granulozyten. Der steigende DNA-

Gehalt und die vermehrte Elastase bedingen eine Steigerung der ohnehin schon erhöhten

Viskoelastizität der respiratorischen Sekrete (47). Dies ist für eine zusätzliche Steigerung

des Infektionsrisikos verantwortlich. Letztendlich führt dieser Circulus vitiosus von

Sekretretention, Infektion und Lungenschädigung zu einer respiratorischen Insuffizienz mit

pulmonaler Hypertonie und Rechtsherzdekompensation. Dies ist die Hauptursache der

verminderten Lebenserwartung von Mukoviszidose-Patienten. Häufige bakterielle Erreger

der pulmonalen Infektionen sind u.a. Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae,

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Einleitung 3

Stenotrophomas maltophilia, B. cepacia Komplex und P. aeruginosa (s. u.), wobei

insbesondere P. aeruginosa und der B. cepacia Komplex mit einer starken

Beeinträchtigung der Lungenfunktion einhergehen.

Diagnostik

Die Diagnose Mukoviszidose wird meist schon früh durch das klinische Bild der Kinder

gestellt. Ausschlaggebend ist hierbei die typische Kombination von gastrointestinaler und

pulmonaler Symptomatik sowie der Gedeihstörung. Der diagnostische Standardtest ist der

Schweißtest (Iontophorese) (100). Bei den an Mukoviszidose erkrankten Personen steigt

der Natrium- und Chloridgehalt nach Pilocarpin-Stimulation auf über 60 mval pro Liter

Schweiß an (74; 78; 100), wobei der Bestimmung des Chloridgehaltes aus dem

gewonnenen Schweiß eine verlässlichere Aussagekraft zugesprochen wird. Hierbei sind

Werte ab 30 mval/l bereits grenzwertig und Werte ab 40 mval/l bereits positiv.

Interessanterweise korreliert die Höhe der Elektrolyte nicht mit Schwere oder Prognose der

Erkrankung. Bei positivem Schweißtest erfolgt die Diagnosesicherung, falls möglich,

durch den genetischen Nachweis der CF-Mutation (41). Eine weitere Nachweismethode,

jedoch funktioneller Art, stellt die Stimulation der Chloridsekretion aus

Rektumschleimhaut-Biopsaten in der Ussing-Kammer dar (52; 83).

Therapie

Die Therapie der Mukoviszidose orientiert sich am Grad der Organbeteiligung.

Pankreasinsuffiziente Patienten (ca. 90% aller Patienten) müssen die fehlenden Enzyme

substituieren. Gleichzeitig werden fettlösliche Vitamine verabreicht, um entsprechenden

Mangelsituationen vorzubeugen. In Abhängigkeit vom Grad der Maldigestion weisen eine

Reihe von Patienten eine Gedeihstörung auf. Bei diesen gehört auch eine spezielle

hochkalorische Ernährung zur Basistherapie.

Bei den meisten Mukoviszidosepatienten ist jedoch die Lungenbeteiligung

lebenslimitierend. Um hier vorzubeugen, wird in Deutschland empfohlen, mehrmals

tägliche Inhalationen mit Mukolytika (NaCl 0,9% oder höher) durchzuführen. Auch

bronchodilatatorische Medikamente (β2-Sympathomimetika und Anticholinergika) sind

Teil der medikamentösen Behandlung der pulmonalen Symptomatik bei Mukoviszidose-

patienten (41). In jedem Fall besitzt die Physiotherapie einen großen Stellenwert im

komplexen, zeitaufwändigen Behandlungsprogramm von Mukoviszidosepatienten. Ziele

der Physiotherapie sind die Sekretmobilisation und -drainage sowie die Kräftigung der

Atemmuskulatur. Hierbei werden sowohl passive Techniken wie z. B. bestimmte

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Einleitung 4

Lagerungen als auch aktive Techniken wie z. B. Vibrationen oder bestimmte Husten-

techniken angewandt (47; 106).

Zur Therapie der bakteriellen Infektionen des Respirationstraktes ist eine gezielte

antibiotische Behandlung notwendig. Die Wahl des geeigneten Antibiotikums erfolgt

entsprechend dem Antibiogramm des Erregers. Bei chronischen Infektionen, z. B. mit

Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia Komplex, werden antibiotische

Intervalltherapien durchgeführt. Gewöhnlich werden dabei Kombinationstherapien aus

zwei oder drei Antibiotika bevorzugt (78).

Um bakterielle Infektionen rechtzeitig erkennen und behandeln zu können, sollten sich die

Patienten kontinuierlich in Spezialambulanzen für Mukoviszidose betreuen lassen. Hier

wird routinemäßig alle acht bis zwölf Wochen, bei akuten Infekten oder respiratorischer

Verschlechterung eine Untersuchung des Sputums oder eines Rachenabstrichs zum

Nachweis pathogener Bakterien und Pilze durchgeführt.

Die einzige kausale Therapie der Mukoviszidose ist die Gentherapie. Als sogenannte

Vektoren, d. h. als Transportmittel für das gesunde Gen in die Epithelzellen der

Atemwege, eignen sich beispielsweise Adenoviren oder Lentiviren, aber auch nicht-virale

Genfähren (10). Die ersten klinischen Studien zur Gentherapie wurden vier Jahre nach der

Entdeckung des CFTR-Gens 1989 begonnen (48). Trotz anfangs ermutigender Ergebnisse

beim ersten Versuch des Gentransfers in Nasenepithelzellen mittels Adenoviren zeigte sich

der Gentransfer bei wiederholter Anwendung in den unteren Atemwegen wirkungslos

(48; 59). Neben allgemeinen Problemen des Transfers von Genmaterial in Zellen der

Lunge kommt speziell bei CF-Patienten folgendes Problem erschwerend hinzu: sowohl der

zähe Schleim als auch die chronischen Entzündungen und die Kolonisation mit Bakterien

stellen zusätzliche Barrieren für die Genfähren dar (43). Es wurden zahlreiche Studien

sowohl am Tiermodell als auch an Patienten durchgeführt, aber bislang blieb der erhoffte

Erfolg aus.

Prognose

Die Prognose und der klinische Verlauf der Erkrankung werden wesentlich durch

pulmonale Infektionen bestimmt (s.u.). In den letzten Jahren konnten die Lebenserwartung

und die Lebensqualität von Mukoviszidosepatienten kontinuierlich gesteigert werden. Dies

lässt sich sowohl auf gute Betreuungskonzepte in Mukoviszidose-Ambulanzen als auch auf

neue Kenntnisse über intensivierte Therapiemöglichkeiten sowie die Verwendung

optimierter Antibiotika zurückführen.

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Einleitung 5

Abb. 1: Altersentwicklung der verstorbenen Mukoviszidosepatienten von 1968 bis 1995, nach Elborn et

al. (34), S. 883

Gemäß Abb. 1 starben im Jahr 1968 die Mehrheit mukoviszidosekranker Kinder, bevor sie

das Schulalter erreichten. Im Jahr 1996 lag die mittlere Überlebenszeit bereits bei 30

Jahren. Für heute geborene Kinder wird eine Lebenserwartung von 45 - 50 Jahren pro-

gnostiziert (26).

1.2. Erregerspektrum pulmonaler Infektionen bei Mukoviszidose

Die chronischen bakteriellen Lungeninfektionen und die daraus resultierende pulmonale

Insuffizienz sind bei 95 % der Mukoviszidosepatienten die Haupttodesursache (22; 67).

Verursacher chronischer bakterieller Infektionen sind insbesondere Staphylococcus aureus,

Haemophilus influenzae, P. aeruginosa und B. cepacia Komplex (67; 78; 89). Die

Häufigkeitsverteilung dieser Erreger korreliert dabei mit dem Alter der Patienten

(s. Abb. 2) (41). Infektionen mit Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae

werden oft bereits im Säuglings- und Kleinkindalter erworben. Ab dem Schulkindalter

steigt die Besiedlungsrate mit P. aeruginosa stark an. B. cepacia Komplex wird am

häufigsten bei erwachsenen Patienten isoliert. In Bezug auf die Verschlechterung der

pulmonalen Funktion spielen P. aeruginosa und B. cepacia Komplex die bedeutendste

Rolle (22; 35; 41; 51; 68; 123). Eine Infektion mit P. aerginosa gilt als wichtigster

Risikofaktor für Erkrankung und Tod von Mukoviszidosepatienten (54).

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Einleitung 6

Abb. 2: Altersspezifische Prävalenz von verschiedenen Erregern bei Lungeninfektionen von

Mukoviszidosepatienten aus den USA, nach Gibson et. al (41) , S. 925

Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa ist ein gram-negatives, Oxidase-positives Stäbchenbakterium (61). Es gehört

zur Gruppe der Nonfermenter, d. h. es ist nicht in der Lage, Glukose zur

Energiegewinnung zu fermentieren. Charakteristische Merkmale von P. aeruginosa sind

ein aromatischer Lindenblütengeruch, ein metallischer Glanz und die Bildung von blau-

grünen bis gelbgrünen Pigmenten, die durch Pyocyanin und Fluorescein entstehen (64).

P. aeruginosa kommt in der Umwelt ubiquitär in feuchtem Milieu vor. Potentielle

Infektionsquellen für den Menschen sind u. a. Aerosole aus Wasserhähnen, Waschbecken,

Toiletten, Duschen, Klimaanlagen und Inhalationsgeräten (61). Aufgrund dieses weit

verbreiteten Vorkommens infizieren sich die meisten Mukoviszidosepatienten im Laufe

ihres Lebens mit P. aeruginosa (41). Durch dessen Neigung zu Adhäsion und Kolonisation

auf vorgeschädigter Schleimhaut persistiert P. aeruginosa nach Erstinfektion meist in der

Lunge. In der USA sind 81 % aller 26- bis 30-jährigen Patienten mit P. aeruginosa

infiziert (22).

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Einleitung 7

Zahlreiche Studien zeigen, dass eine chronische Infektion mit P. aeruginosa mit einer

signifikanten Verschlechterung des klinischen Zustandes und einer Beeinträchtigung der

Lebensqualität des Patienten einhergeht (41; 102). Bei Kosorok et al. (68) konnte der

Erwerb von P. aeruginosa mit einem sukzessiven Abfall der Lungenfunktion assoziiert

werden und in einer Studie von Emerson et al. (35) war das Risiko, in den nächsten acht

Jahren zu versterben, bei Patienten mit positivem P. aeruginosa-Nachweis 2,6-fach höher

als bei Patienten ohne P. aeruginosa-Besiedlung.

Daher hat der Nachweis von P. aeruginosa in respiratorischen Proben von Mukoviszidose-

patienten großen Einfluß auf Therapie und Prognose der Erkrankung. Bereits bei

Erstnachweis von P. aeruginosa ist ein Eradikationsversuch mit Antibiotika indiziert. Eine

kürzlich publizierte randomisierte Doppelblindstudie von Gibson et al. (42) zeigt, dass mit

einer inhalativen Therapie mit Tobramycin (zwei mal täglich 300 mg über 28 Tage) eine

deutliche Reduktion der P. aeruginosa-Dichte erzielt werden kann. Diese inhalative

Therapie hat auch in der Mukoviszidose-Ambulanz Ulm die früher durchgeführte

intravenöse Therapie teilweise ersetzt. Bei chronischer Pseudomonas-Infektion sollte zwei

bis drei Mal pro Jahr eine intensive Antibiotikatherapie durchgeführt werden,

beispielsweise abwechselnd mit inhalativem Colistin und Tobramycin für je 28 Tage.

Die initiale Infektion mit P. aeruginosa erfolgt meist mit einem einzelnen Stamm aus der

Umwelt (12). Übertragungen dieser P. aeruginosa-Stämme auf andere Mukoviszidose-

patienten wurden nur selten und meist unter Verwandten oder sozial eng verbundenen

Patienten beschrieben (41; 111). Im Rahmen einer chronischen Infektion kann der initial

erworbene P. aeruginosa seinen Phänotyp ändern und eine mukoide Variante entwickeln

(41). Diese ist gekennzeichnet durch die Bildung einer extrazellulären Schleimkapsel aus

Polysacchariden und Alginat, die sowohl die Persistenz von P. aeruginosa als auch seine

Resistenz gegenüber Antiobiotika verstärkt. Weiterhin treten bei Mukoviszidosepatienten

oft atypische P. aeruginosa-Stämme mit Verlust der Pigmentproduktion oder Ausbildung

sehr kleiner Kolonien auf (97). Bei chronischer Besiedlung mit P. aeruginosa kann es bei

den Patienten im Laufe der Zeit auch zum Erwerb weiterer unterschiedlicher P. aeruginosa

Stämme kommen, so dass in einem Patienten oft eine große Anzahl an unterschiedlichen

genotypischen Varianten von P. aeruginosa nachweisbar ist (12). Ob es sich bei

chronischen Infektionen mit P. aeruginosa um mehrere Stämme handelt und ob

Übertragungen des Erregers zwischen Patienten stattgefunden haben, kann durch eine

molekulare Erregertypisierung, z. B. mittels der Pulsfeldgelelektrophorese, geklärt werden.

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Einleitung 8

Burkholderia cepacia Komplex

Die Spezies des B.cepacia Komplex sind wie P. aeruginosa gram-negative, Oxidase-

positive, nonfermentative Stäbchenbakterien, die ubiquitär in der Umwelt vorkommen und

ursprünglich als Phytopathogene bekannt wurden (19). Bei den Infektionsquellen handelt

es sich analog zu P. aeruginosa um Feuchtbiotope und Wasserreservoire verschiedenster

Art. Eine chronische Besiedlung mit Spezies des B. cepacia Komplexes findet sich bei bis

zu 13 % der Patienten, scheint jedoch große regionale Unterschiede aufzuweisen. In

München lag die Besiedlungrate von 1987-1997 bei 7,1 % (5), in Vancouver in Kanada

von 1981-1998 bei 13 % (82).

Der B. cepacia Komplex beinhaltet mindestens neun Spezies, die früher als Genomovare

bezeichnet wurden und die sich aufgrund ihrer engen genetischen Verwandschaft nur

schwierig differenzieren lassen (17; 51; 79; 125; 126). Sie zeigen jedoch Variationen in der

Nukleotidsequenz des RecA-Gens, das für ein Protein kodiert, welches für die Reparatur

und die Rekombination der DNA essentiell ist (80). Anhand der Sequenzierung des

RecA-Gens kann die genaue Identifikation der Genomovare des B. cepacia Komplexes

erfolgen (80).

B. cenocepacia, früher als B. cepacia Genomovar III bezeichnet, geht mit einer

signifikanten Verschlechterung der klinischen Situation des Mukoviszidosepatienten

einher. Es verursacht unter allen Spezies des B. cepacia Komplex am häufigsten das sog.

Cepacia-Syndrom, das durch hohes Fieber, Bakteriämie sowie eine schnell progrediente

Verschlechterung der Lungenfunktion der betroffenen Patienten gekennzeichnet ist

(57; 58; 86). Infektionen mit B. cenocepacia sind durch die höchste Mortalitätsrate unter

allen Spezies des B. cepacia Komplex gekennzeichnet (73; 79; 82) und besitzen die

schlechteste Prognose aller Infektionen durch Spezies des B. cepacia Komplexes (47; 123).

B. multivorans, früher als B. cepacia Genomovar II bezeichnet, gehört zusammen mit

B. cenocepacia zu den beiden häufigsten Spezies innerhalb des B. cepacia Komplex (99).

Es wird in Deutschland häufig isoliert (19; 22) und ist nach einigen aktuellen Studien für

mehr als 50 % der Infektionen mit B. cepacia Komplex verantwortlich (9; 76; 82).

Die weiteren Arten des B. cepacia Komplexes, wie B. stabilis (ehemals Genomovar IV),

B. vietnamensis (Genomovar V), B. dolosa (Genomovar VI), B. ambifaria (Genomovar

VII), B. anthina (Genomovar VIII) oder B. pyrrocinia (Genomovar IX) kommen nur sehr

selten bei Mukoviszidosepatienten vor (9; 99). Über ihre klinische Bedeutung ist wenig

bekannt.

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Einleitung 9

Infektionsübertragungen auf andere Patienten und sogar kleinräumige Epidemien unter

Mukoviszidosepatienten, beispielsweise bei Besuch gemeinsamer Freizeitaktivitäten, sind

bei Infektionen mit B. cepacia Komplex beschrieben (19; 32; 45; 81; 88; 108; 134). Diese

Übertragungen scheinen aber bei B. multivorans seltener als bei B. cenocepacia

vorzukommen (5; 50; 82). Um andere Patienten vor Ansteckung zu schützen, ist bei

Nachweis von Arten des B. cepacia Komplexes eine Isolierung des Patienten von anderen

Mukoviszidosepatienten indiziert (58; 75). Die erforderlichen Maßnahmen sind leider

meist auch mit einer beträchtlichen sozialen Isolierung der betroffenen Patienten

verbunden.

In der Regel weisen die chronisch mit Erregern des B. cepacia Komplex besiedelten

Patienten nur einen einzigen Stamm des Erregers auf. Es ließ sich jedoch in vorher-

gehenden Studien mittels molekularen Methoden der Erregertypisierung nachweisen, dass

es in seltenen Fällen im Verlauf einer chronischen Infektion zum sogenannten „Strain

Replacement“ kommt (6). Dabei handelt es sich um einen Wechsel von dem initial

infektionsauslösenden Stamm auf einen anderen Stamm derselben Spezies oder auf eine

andere Spezies des B. cepacia Komplexes (6; 82). Neben dem sogenannten Strain

Replacement wurden auch simultane Koinfektionen unterschiedlicher Stämme von

B. cenocepacia beobachtet (45; 82). Koinfektionen wurden bei chronischen

B. multivorans-Infektionen bislang nur vermutet, jedoch nicht nachgewiesen (6). Insgesamt

sind Daten über die molekulare Epidemiologie von B. multivorans noch rar. Eine

eindeutige Identifizierung der Spezies bei jedem Erregernachweis stellt sicher, dass

Phänomene des Strain Replacement bei chronischen Infektionen, wie z. B. ein möglicher

Erwerb von B. cenocepacia bei bestehender B. multivorans-Infektion, nicht übersehen

werden. Die exakte mikrobiologische Diagnostik ist somit Voraussetzung für eine optimale

Therapie der Patienten.

Bei Nachweis einer Spezies des B. cepacia Komplexes ist ein Eradikationsversuch des

Erregers indiziert. Allerdings lässt sich B. cepacia nur schwer eradizieren (7), und selbst

eine intravenöse Antibiotika-Therapie zeigt nur bei 50 % der Patienten Erfolg (47). Eine

therapeutische Herausforderung bei Infektionen mit Burkholderien liegt, ebenso wie bei

Pseudomonaden, in der steigenden Resistenz gegenüber Antibiotika.

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Einleitung 10

Weitere gram-negative bakterielle Erreger bei Mukoviszidose

Neben den oben beschriebenen Erregern finden sich bei Mukoviszidosepatienten häufiger

Infektionen durch die gram-negativen, nonfermentativen Stäbchenbakterien

Achromobacter xylosoxidans und Stenotrophomonas maltophilia (41). Auch Infektionen

durch atypische Mykobakterien, insbesondere Mycobacterium abscessus und

Mycobacterium avium Komplex, wurden beschrieben und können sich als chronische

Infektion manifestieren (36; 49; 91; 96). Die pathogenetische Bedeutung dieser Bakterien

ist jedoch bislang nicht ausreichend geklärt (45; 78; 89; 101). Dies ist auch auf die

Tatsache zurückzuführen, dass die Identifizierung einiger Arten, z. B. A. xylosoxidans, mit

konventionellen Methoden schwierig ist und Fehlidentifizierungen vorkommen ((65; 87;

113; 124), siehe auch unten).

In neueren Studien, in denen molekularbiologische Methoden zur Identifizierung von

Bakterien angewandt wurden, wurden vermehrt seltene oder zuvor noch nicht beschriebene

Bakterienspezies und -gattungen, wie z. B. Pandoraea species, Ralstonia species,

Bordetella species (z. B. B. bronchiseptica, B. holmesii), Comamonas testosteroni,

Agrobacterium radiobacter, Inquilinus limosus etc., bei Mukoviszidosepatienten

nachgewiesen (16; 18; 20; 21; 87; 128; 131). Dies zeigt, dass die Vielfalt der Bakterien,

die den Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten besiedeln können, noch nicht

vollständig bekannt ist. Daten zur Epidemiologie dieser seltenen oder erst kürzlich

entdeckten Bakterien bei Mukoviszidosepatienten fehlen weitestgehend. Auch die

klinische Bedeutung einer Infektion oder Kolonisation mit diesen Erregern bei

Mukoviszidosepatienten sowie der Einfluss dieser Spezies auf andere Bakterien im

Respirationstrakt der Patienten konnten bislang nicht hinreichend geklärt werden. Das

bakterielle Keimspektrum von Mukoviszidosepatienten unterliegt einer stetigen

Veränderung, die sowohl auf die kontinuierlich steigende Lebenserwartung der Patienten

als auch auf den optimierten Gebrauch von neueren, effektiveren Antibiotika und die

daraus resultierende Erregerselektion zurückzuführen sein könnte.

1.3. Mikrobiologische Diagnostik

In der Mukoviszidose-Ambulanz der Universitäts-Kinderklinik Ulm werden im Rahmen

der regelmäßigen Betreuung ein- bis zweimal pro Quartal und zusätzlich bei akuten

Infekten und respiratorischer Verschlechterung Sputumproben zum Nachweis pathogener

Erreger entnommen. Die Sputumproben werden in der Abteilung für Medizinische

Mikrobiologie und Hygiene, einem nach DIN EN ISO 15189 akkreditierten Labor, mittels

standardisierter diagnostischer Verfahren mikrobiologisch untersucht.

Page 17: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Einleitung 11

1.3.1. Konventionelle bakteriologische Diagnostik

Die konventionelle bakteriologische Diagnostik beruht auf der Anzucht einer Reinkultur

von Bakterien aus klinischen Untersuchungsmaterialien und deren anschließender

Identifizierung. Bei respiratorischen Sekreten von Mukoviszidosepatienten erfolgt die

Materialanlage auf verschiedenen Universal- und Selektiv-Nährböden. Die Bakterien-

isolate werden aufgrund ihres Wachstumsverhaltens auf den Nährmedien und ihren

morphologischen und biochemischen Merkmale identifiziert.

P. aeruginosa lässt sich anhand seiner charakteristischen Eigenschaften (s. Kap. 3.3.) gut

identifizieren. Bei Mukoviszidosepatienten hingegen wird der Nachweis oft durch

veränderte phänotypische Varianten, wie z. B. Stämme mit Verlust der Pigmentproduktion

oder nur langsam wachsende Stämme, erschwert (97). In solchen Fällen werden, genau wie

für die Identifizierung anderer gram-negativer, nonfermentativer Stäbchenbakterien,

kommerzielle biochemische Verfahren, wie z. B. der Api 20 NE der Fa. BioMérieux,

eingesetzt. Der Api 20 NE, der in der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und

Hygiene routinemäßig verwendet wird, prüft das Vorhandensein verschiedener

Enzymreaktionen, die Produktion bestimmter Stoffwechselendprodukte und die Fähigkeit

zum Abbau von diversen Zuckern. In einer Studie von van Pelt et al. (124), in der

verschiedene kommerzielle Identifizierungsmethoden für B. cepacia und P. aeruginosa aus

Proben von Mukoviszidosepatienten verglichen wurden, war der Api 20 NE den anderen

Methoden überlegen. Doch auch bei dieser Identifizierungsmethode traten in einem

signifikanten Prozentsatz Fehlidentifizierungen von Nonfermentern oder Versagen der

Identifizierung von Burkholderia gladioli und Ralstonia pickettii auf (87; 124).

Neben ihrer relativ hohen Ungenauigkeit weisen die konventionellen Methoden der

Identifizierung einen hohen Zeitbedarf auf (101). Dieser wird bedingt durch eine sehr

langsame Wachstumskinetik einiger Bakterien oder die Hemmung des Wachstums der

Erreger durch eine antibiotische Vorbehandlung des Patienten.

Aufgrund der hohen Fehlerrate phänotypischer Identifizierungen und aufgrund der

Tatsache, dass bei Mukoviszidosepatienten oft Stämme mit atypischem Erscheinungsbild

auftreten, sind die routinemäßig angewendeten, konventionellen Identifizierungsmethoden

bei der Erregerdiagnostik in respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten nicht in

jedem Fall ausreichend für den Nachweis und die Identifizierung pathogener Bakterien

(65; 110). Sie bergen insbesondere das Risiko, dass pathogenetisch wichtige Bakterien, wie

P. aeruginosa und Arten des B. cepacia Komplex, übersehen werden.

Page 18: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Einleitung 12

1.3.2. Molekularbiologische Diagnostik

In den letzten zwei Jahrzehnten gelang eine stetige Weiterentwicklung molekular-

biologischer Nachweis- und Identifizierungsverfahren für bakterielle Infektionserreger. Im

Gegensatz zu den konventionellen Identifizierungsstrategien werden die Erreger bei

Anwendung molekularbiologischer Methoden anhand spezifischer Gene identifziert. Dabei

umgehen molekularbiologische Verfahren das Problem der Variabilität der Phänotypen

und ermöglichen somit häufig eine zuverlässigere Identifizierung der Bakterien (113).

Eine noch junge Methode mit bedeutendem Stellenwert in der molekularbiologischen

Diagnostik ist die DNA-Sequenzierung, mit der die Basensequenz von Nukleinsäure-

abschnitten, z. B. charakteristischen bakteriellen Genen, bestimmt wird (56). Mit Hilfe

moderner Sequenziergeräte ist diese Methode heutzutage weitgehend automatisierbar. Für

die Identifizierung von Bakterien wird meist das 16S rRNA-Gen eingesetzt, welches für

die kleine Untereinheit der ribosomalen RNA der Bakterien kodiert. Es eignet sich sehr gut

zur Identifizierung von Bakterien, da es im Genom aller Bakterien in mehrfacher

Kopienzahl vorkommt. Neben konstanten oder universellen Bereichen, die für die

Primerbindung verwendet werden, besitzt es auch variable Abschnitte, in denen sich die

meisten Bakterienarten unterscheiden (s. Abb. 3). Für die Identifizierung von gram-

negativen, nonfermentativen Stäbchen ist das 16S rRNA-Gen sehr gut geeignet (38; 119).

Abb. 3: Schematische Struktur des 16S rRNA-Gen. U kennzeichnet die universellen, nicht variablen

Regionen , aus Gray et al. (46), S. 5840

Page 19: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Einleitung 13

Bislang bekannte DNA-Sequenzen stehen über das Internet in Datenbanken (z. B.

GenBank-Datenbank des National Center for Biotechnology Information,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST) zur Verfügung. Die Identifizierung eines

unbekannten Bakteriums erfolgt anhand des Homologie-Vergleichs zwischen einer

sequenzierten 16S rRNA-Gen-Sequenz und allen vorhandenen Sequenzen der Datenbank

(2; 8; 120).

Mittels molekularbiologischer Methoden gelang die Entdeckung zahlreicher neuer

Bakterien-Spezies (3; 98; 103; 130), die sich mit den üblichen Kulturverfahren bislang

nicht anzüchten ließen. Auch bei Mukoviszidosepatienten wurde in neueren Studien, die

molekularbiologische Methoden zur Identifizierung ungewöhnlicher Bakterien anwandten,

das Vorkommen von seltenen oder zuvor noch gar nicht bei Mukoviszidosepatienten

nachgewiesenen Bakterien, wie z. B. Pandoraea species, Ralstonia species, Bordetella

bronchiseptica, Comamonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter, Inquilinus limosus,

beschrieben (11; 16; 18; 20; 21; 128; 131). Die Neuentdeckung solcher Erreger zeigt, dass

die Vielfalt der Bakterien des Respirationstraktes von Mukoviszidosepatienten

wahrscheinlich deutlich größer ist als heutzutage angenommen. Insbesondere auf dem

Gebiet der konventionell schwierig zu identifizierenden gram-negativen, nonfermentativen

Stäbchenbakterien, zu denen auch alle oben erwähnten Bakterienarten und –gattungen

zählen, sind durch die molekulare Diagnostik neue Erkenntisse zu erwarten. Es ist davon

auszugehen, dass das Keimspektrum der Lungeninfektionen bei Mukoviszidose durch die

moderne mikrobiologische Diagnostik insgesamt noch eine wesentliche Erweiterung

erfahren wird (47).

Page 20: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Einleitung 14

1.4. Zielsetzung der Arbeit

Chronische Lungeninfektionen stellen die häufigste Todesursache bei Mukoviszidose-

patienten dar. Zu den bedeutsamsten Erregern dieser Infektionen gehören P. aeruginosa

und B. cepacia Komplex, aber auch andere, gram-negative, nonfermentative Stäbchen-

bakterien wie z. B. Comamonas testosteroni, P. alcaligenes, Achromobacter xylosoxidans

und Ralstonia spp. werden regelmäßig in respiratorischen Proben von Mukoviszidose-

patienten nachgewiesen. Allerdings bereitet die Identifizierung dieser Bakterien mittels

konventionellen biochemischen Methoden häufig Schwierigkeiten. Eine korrekte

Identifizierung ist jedoch die notwendige Voraussetzung sowohl für die Erhebung

zuverlässiger epidemiologischer Daten und die Beurteilung der klinischen Relevanz dieser

Bakterien als auch für die adäquate Therapie des Patienten. Für die zuverlässige

Identifizierung von Bakterien stehen heutzutage moderne molekularbiologische Methoden,

wie die Sequenzierung des hochvariablen 16S rRNA-Gens, zur Verfügung.

Ziel des ersten Teils dieser Arbeit ist daher, mittels des Verfahrens der Gen-Sequen-

zierung eine eindeutige Identifizierung von konventionell schwierig zu differenzierenden

gram-negativen Stäbchenbakterien von Mukoviszidosepatienten zu ermöglichen. Dazu soll

die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung bei allen gram-negativen, Oxidase-positiven

nonfermentativen Stäbchenbakterien, die im Rahmen der Routinediagnostik der Abteilung

für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene im Jahr 2003 aus respiratorischen Proben

von Mukoviszidosepatienten der Universitäts-Kinderklinik Ulm isoliert wurden und mittels

konventionellen Methoden nicht eindeutig identifiziert werden konnten, durchgeführt

werden. Die Ergebnisse der molekularen Identifizierung sollen anschließend mit denen der

konventionellen Diagnostik verglichen werden, um Aussagen über die Zuverlässigkeit der

konventionellen Identifizierungsmethoden treffen zu können.

Basierend auf den Ergebnissen der molekularen Identifizierung sollen im zweiten Teil der

Arbeit einige ausgewählte, in der Routinediagnostik häufiger nachgewiesene Spezies, wie

z. B. Comamonas testosteroni, P. alcaligenes und Ochrobactrum anthropi, in Hinblick auf

ihre Epidemiologie sowie auf ihre klinische Bedeutung genauer betrachtet werden.

Im dritten Teil der Arbeit soll eine molekulare Erregertypisierung mittels Pulsfeldgel-

elektrophorese von allen Bakterienspezies erfolgen, die bei denselben Patienten an

mehreren Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen wurden. Hierdurch sollen Erreger-

persistenzen von Reinfektionen unterschieden sowie mögliche Erregerübertragungen

zwischen den Patienten nachgewiesen werden.

Page 21: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Material 15

2. Material

2.1. Chemikalien und Reagenzien

Alle Chemikalien und Reagenzien wurden in der Qualität „p.A.“ (pro Analysi) oder „für

die Molekularbiologie“ von den nachfolgend aufgeführten Firmen bezogen.

Reagenzien : Bezugsquelle:

Aqua bidest., steril

Blue Dextran EDTA

Borsäure

Bromphenolblau

BSA

Antibiotika-Testplättchen

DNA Polymerisation Mix 20mM (dNTP)

EDTA

Ethanol 100 %

Ethanol 70 %

Ethidiumbromid

HiDi Formamide

GRAMS Kristallviolettlösung

Glycerin

HCl

H2O2, 30 %

James-Reagenz

Karbolfuchsinlösung

Lugol`sche Lösung

MgCl2

Na-Acetat, 3 M, pH 5,2

NaCl-Lösung, 0,9 %

NaOH

NIT 1 und 2 Reagenz

Paraffinöl (Mineralöl)

Sarkosyl

Seakem GTG Agarose

Klinikumsapotheke, Ulm

Applied Biosystems, Darmstadt

Sigma, St.Louis, MO, USA

Merck, Darmstadt

New England BioLabs, Frankfurt am Main

Becton Dickinson GmbH, Heidelberg

Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA

Riedel-de Haën AG, Seelze

Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz

Merck, Darmstadt

Applied Biosystems, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

BioMérieux, Nürtingen

Merck, Darmstadt

Klinikapotheke Ulm

Sigma, St.Louis, MO, USA

Boehringer, Mannheim

Braun, Melsungen

BioMérieux, Nürtingen

Merck, Darmstadt

BioMérieux, Nürtingen

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Sigma, St. Louis, MO, USA

Bio-Rad, München

Page 22: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Material 16

SDS

Seal Plaque Agarose

TMPD-Pulver

Tris

Trisbase

Triton

Tween 20

Xylencyanol

Zinkpulver

100 bp-Ladder 100 µg, 1 µg/µl

FMC Bio-Products, Rockland ME, USA

FMC Bio-Products, Rockland ME, USA

Sigma, St.Louis, MO, USA

Sigma, St.Louis, MO, USA

Sigma, St.Louis, MO, USA

Sigma, St.Louis, MO, USA

Sigma, St.Louis, MO, USA

BioMérieux, Nürtingen

Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA

Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA

Enzyme : Bezugsquelle:

AmpliTaq DNA Polymerase Applied Biosystems, Darmstadt

(5 Units/µl) mit 10 x Puffer

Proteinase K Merck, Darmstadt

Restriktionsendonuklease New England BioLabs, Frankfurt am Main

(SpeI 10,000 Units/ml)

mit 10x Restriktonspuffer (NEB-2)

TaqPolymerase mit Q-Solution Qiagen, Hilden

mit 10 x Puffer

Nährmedien : Bezugsquelle:

CASO-Agar ohne Blut Fa. Heipha, Eppelheim

Kochblut-Agar Fa. Heipha, Eppelheim

MacConkey-Agar Fa. Heipha, Eppelheim

Müller-Hinton-Agar Fa. Heipha, Eppelheim

Burkholderia cepacia-Selektivagar BC-Agar; Fa. MAST Diagnostika, GB

Puffer: Zusammensetzung:

CSB-Puffer 10 ml 1M TRIS pH 8,0; 20 ml 0,5 M EDTA

pH 8,0; 70 ml steriles Aqua bidest.

Ladepuffer 0,25 g Bromphenolblau; 0,25 g Xylencyanol;

0,2 ml 0,5 M EDTA; 50 ml 100 % Glycerin;

4 ml 1 M Tris-HCl pH 8,0–8,2;

Page 23: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Material 17

5 ml 10 % SDS

Lysis-Puffer 1 % Triton x 100; 0,5 % Tween 20;

10 mM Tris-HCL pH 8,0; 1 mM EDTA

(alle Reagenzien von Sigma, St.Louis, USA)

NEB-2-Puffer (1x) 50 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl;

10 mM MgCl2; 1 mM DTT

(New England BioLabs, Frankurt am Main)

Tris borate-EDTA-Puffer TBE-Puffer; Fluka, Buchs

Tris-EDTA-Puffer TE-Puffer; Sigma, St.Louis, USA

10 x Restriktionspuffer MBI Fermentas, St.Leon-Rot

5 x Sequencing Puffer Applied Biosystems, Darmstadt

2.2. Primer

Alle Primer wurden von Thermo Electron GmbH, Ulm bezogen.

16s for 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’ (Position 8 – 27)

16s rev 5’-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T -3’ (Position 1492-1510)

1111 rev 5’-TTG CGC TCG TTG CGG GAC T -3’ (Position 1111-1093)

821 rev 5’-CAT CGT TTA CGG CGT GGA C -3’ (Position 821-803)

536 rev 5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG G -3’ (Position 536-518)

Alle Positionen beziehen sich auf das E. coli 16S rRNA-Gen, GenBank Nr. J01859.

BCR1 5’-TGA CCG CCG AGA AGA GCAA -3’ (Position 2-20)

BCR2 5’-CTC TTC TTC GTC CAT CGC CTC -3’ (Position 1044-1024)

BCR4 5’-GCG CAG CGC CTG CGA CAT -3’ (Position 528-511)

Alle Positionen beziehen sich auf das B. multivorans ATCC 17616 RecA-Gen,

GenBank Nr. U70431.

2.3. Bakterienstämme (Kontrollstämme):

Burkholderia cepacia Genomovar I ATCC 25416

Burkholderia cepacia Genomovar IIIa V 153520 (Patientenisolat)

Burkholderia multivorans DSM 13243

Escherichia coli ATCC 25922

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Page 24: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Material 18

2.4. Laborbedarf

Laborbedarf und Verbrauchsmaterial: Bezugsquelle:

Duran Glasflasche, 250 ml Schott, Mainz

Einmalimpfösen 10 µl blau Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen

Einmalhandschuhe Kimberly-Clark, Roswell, USA

Einmal-Skalpell, Präzisa P.J. Dahlhausen & Co.GmbH, Köln

Eppendorf-Reaktionsgefäße 0,5 ml, 1,5 ml Eppendorf, Rösrath

Falcon-Röhrchen 50 ml Becton Dickinson GmbH, Heidelberg

Gestopfte Pipettenspitzen 10 µl, 100µl, 1000 µl Sarstedt, Nümbrecht

Klebeband Tesa, Hamburg

Küvetten 1,5 ml, 2,5 ml Brand GmbH, Wertheim

Nitrilhandschuhe Ansell Medical, München

Objektträger Menzel GmbH&CoKG, Braunschweig

Pipetten 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl Eppendorf, Rösrath

Psipetten (sterile Einwegpipetten) BioMérieux, Nürtingen

Reaktionsgefäße 0,5 ml und 1,5 ml Eppendorf, Rösrath

Septa für 0,5 ml Reaktionsgefäße Applied Biosystems, Darmstadt

sterile Wattestäbchen Greiner Labortechnik , Frickenhausen

Stripette 5 ml, 10 ml Corning Incorporated, New York, USA

sterile 4 ml Röhrchen Greiner Labortechnik, Frickenhausen

2.5. Kits

Das QIAamp DNA Mini Kit von der Fa. Qiagen aus Hilden wurde zur DNA-Isolierung

verwendet. Das Kit enthält:

- Proteinase K (17,85 mg/ml)

- AE-Puffer

- AL-Puffer

- ATL-Puffer

- AW 1 u 2 Puffer

Das QIAquick PCR Purification Kit von Fa. Qiagen aus Hilden wurde zur Aufreinigung

der DNA verwendet. Das Kit enthält:

- Puffer PB

- Puffer PE

Page 25: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Material 19

- Puffer EB

- QIAquick Spin Colums (Säulchen)

- 2ml Reaktionsgefäße

BigDye Terminator Cycle Sequenzing Ready Reaction Kit Version 1.1 von Fa. Applied

BioSystems aus Darmstadt wurde für die Sequenzierreaktion verwendet. Das Kit enthält:

- Terminator Premix mit A-,C-,G-,T-DyeDeoxy-Terminatoren

- dNTP-Mischung aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP

- AmpliTaq DNA-Polymerase

- Puffer (TRIS-HCl (pH 9,0), MgCl2)

- wärmestabile Pyrophosphatase

Der Api 20 NE von Fa. BioMérieux aus Nürtingen wurde zur biochemischen

Differenzierung von Nonfermentern verwendet. Der Api 20 NE enthält:

- Teststreifen

- Inkubationswanne

- Auswertungsblatt

- AUX-Medium

Das BBL DrySlide Oxidase Testkit wurde für den Oxidase-Test verwendet.

Es enthält einen gebrauchsfertigen Einmalobjektträger mit vier Reaktionsflächen.

2.6. Geräte

Geräte: Bezugsquelle:

Abi Prism 310 Genetic Analyser Applied Biosystems, Darmstadt

Bunsenbrenner IBS IntegraBiosciences, Chur, Schweiz

CHEF-DR III Gerät Bio-Rad, München

Disposable Plug Mold (50 well) Bio-Rad, München

Elektrophorese-Spannungsgerät ST 606 T Life Technologies GmbH, Eggenstein

Färbebank Werkstatt der Universität Ulm

Gefrierschrank Liebherr, Ochsenhausen

Gel Elektrophorese Apparatur Horizon Life Technologies GmbH, Eggenstein

Gel-Kamm, 14-er Life Technologies GmbH, Eggenstein

Kämme (15 und 30 well) Bio-Rad, München

Kombinationskamm-Halter Bio-Rad, München

Page 26: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Material 20

Kühlblock zum Pipettieren Eppendorf, Rösrath

Kühlschrank Liebherr, Ochsenhausen

Lichtmikroskop Olympus, Hamburg

Mikrowelle Moulinex, Ecully, Frankreich

PFGE-Geldokumentationssystem (Gel Doc) Bio-Rad, München

Pipettierhilfe Pipetboy IBS IntegraBiosciences, Chur, Schweiz

Raumluft-Brutschrank, 30 °C Heraeus, Osterode

Raumluft-Brutschrank, 36 °C Heraeus, Osterode

Raumluft-Brutschrank, 42 °C Heraeus, Osterode

Spekol mit Deuterium Lampe (Ultraspec III) Pharmacia Biotech, Freiburg

Standard Gießstand Bio-Rad, München

Thermocycler Touch Down Abott Laboratories, IL, USA

Thermomixer 5436 Eppendorf, Rösrath

Transilluminator Bachofer, Reutlingen

Videobildkopierer P68E mit Bildschirm Mitsubishi Electric Corporation, Tokyo

Videodokumentationssystem CF 8/1 DX KAPPA Messtechnik GmbH, Gleichen

Vortexer RS1 M. Zipperer GmbH, Staufen

Waage Sartorius Basic plus Sartorius, Nümbrecht

Wasserbad Köttermann,Uetze-Häningsen

Zentrifuge miniSpin Eppendorf, Rösrath

Zentrifuge 5417 Eppendorf, Rösrath

2.7. Software

Programm: Bezugsquelle:

APIlab Auswertungssoftware für Api 20 NE BioMérieux, Nürtingen

BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST)

Ridom TraceEdit 1,0 (Auswertungsprogramm) Ridom GmbH, Würzburg

Page 27: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 21

3. Methodik

3.1. Bakterienisolate von Mukoviszidosepatienten

Bei den in dieser Studie untersuchten Bakterienisolaten handelte es sich um gram-negative,

Oxidase-positive, nonfermentative Stäbchenbakterien von Mukoviszidosepatienten, die im

Rahmen der konventionellen mikrobiologischen Diagnostik der Abteilung für

Medizinische Mikrobiologie und Hygiene nicht eindeutig identifizierbar waren.

Insgesamt wurden im Studienzeitraum vom 01.01.2003 - 31.12.2003 im Rahmen der

mikrobiologischen Routinediagnostik 407 Isolate von gram-negativen, Oxidase-positiven,

nonfermentativen Stäbchenbakterien von 88 Mukoviszidosepatienten nachgewiesen.

Davon konnten 317 Isolate zweifelsfrei identifiziert werden (s.u.). Die verbleibenden 90

Isolate, die mit konventionellen Identfizierungsmethoden nicht eindeutig identifiziert

werden konnten, wurden in die vorliegende Studie aufgenommen. Alle Isolate stammen

aus respiratorischen Sekreten von Mukoviszidosepatienten (n=25), die in der

Mukoviszidose-Ambulanz der Universitäts-Kinderklinik in Ulm betreut werden. Das Alter

der Patienten variierte zwischen 2 und 40 Jahren, das Durchschnittsalter betrug 21,6 Jahre.

Die Identifizierung der gram-negativen, Oxidase-positiven, nonfermentativen

Stäbchenbakterien erfolgte in der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene,

einem nach DIN EN ISO 15189 akkreditierten Labor, gemäß mikrobiologischer Standard-

methoden. Dabei wurden die Isolate zuerst auf die Ausprägung morphologischer

Merkmale wie z. B. grüne Pigmentbildung oder schleimige Kolonien untersucht. Weiterhin

wurde das Wachstum bei 42 °C, das Wachstum auf MacConkey-Agar und die antimikro-

bielle Empfindlichkeit gegenüber Colistin geprüft. Ein Großteil der Isolate ließ sich bereits

anhand dieser Kriterien als P. aeruginosa identifizieren. Bei den übrigen Isolaten wurde

der Api 20 NE durchgeführt. Nur bei ausgezeichneter, sehr guter oder guter Identifizierung

als P. aeruginosa im Api 20 NE wurde das Identifizierungsergebnis anerkannt.

Alle anderen Isolate, die weder anhand typischer morphologischer Kriterien noch anhand

eindeutiger biochemischer Ergebnisse eindeutig als P. aeruginosa identifiziert werden

konnten, wurden in die Studie eingeschlossen und mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung

identifiziert. Bei diesen Isolaten wurde zunächst die Beurteilung der Morphologie (s. Ab-

schnitt 3.3.) und, wenn erforderlich, die biochemische Identifizierung (s. Abschnitt 3.4.)

wiederholt, um zuverlässige Ergebnisse für den Vergleich der verschiedenen

Identifizierungsmethoden zu erhalten.

Page 28: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 22

3.2. Bakterienkultur

Die Bakterienstämme wurden nach Isolierung aus den Patientenmaterialien in Microbank-

Röhrchen bei - 20 °C gelagert. Als Nährmedium für die primäre Anzucht der Bakterien-

stämme aus den Microbank-Röhrchen wurden Blutagarplatten verwendet, die bei 36 °C

unter Raumluft bebrütet wurden. Nach 24 - 48 h Bebrütung wurden von einzelnen

Kolonien dieser Stämme sowohl auf MacConkey-Agar als auch auf Kochblut-Agar

Subkulturen angelegt. Diese wurden erneut 24 - 48 h bei 36 °C unter Raumluft bis zur

weiteren Verwendung bebrütet, um für die morphologische Beurteilung und die weitere

Verarbeitung ausreichend bewachsene Reinkulturen zu erhalten.

3.3. Beurteilung der Morphologie der Bakterien

3.3.1. Koloniemorphologie

Es erfolgte eine morphologische Beurteilung aller Isolate sowohl auf MacConkey-Agar als

auch auf Kochblutagar in Bezug auf die folgenden Kriterien:

a) Form und Größe der Kolonien

b) Farbe der Kolonien

c) Ausprägung mukoider Kolonien

d) Geruch

e) Hämolyseverhalten auf Blutagar

f) Vorhandensein eines metallischen Glanzes

Insbesondere wurde dabei geprüft, ob das Isolat typische morphologische Eigenschaften

von P. aeruginosa aufweist. Dieser zeigt auf Blutagar meist eine Hämolyse. Neben einem

aromatischen Lindenblütengeruch und einem metallischen Glanz ist die Bildung von

blaugrünen bis gelbgrünen Pigmenten, die durch Pyocyanin und Fluorescein entstehen, für

ihn charakteristisch. Ein weiteres Merkmal ist das Wachstum bei 42 °C auf Müller-Hinton-

Agar. Bei Mukoviszidosepatienten findet sich häufig eine mukoide Variante, die durch die

Bildung einer extrazellulären Schleimkapsel aus Polysacchariden und Alginat

gekennzeichnet ist.

3.3.2. Prüfung des Wachstumsverhaltens bei 42 °C

Zur Beurteilung der Temperaturansprüche wurden alle Isolate auf Müller-Hinton-Agar

subkultiviert und für 18 - 24 h bei 42 °C unter Raumluft bebrütet.

Page 29: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 23

3.3.3. Gram-Färbung

Anhand der Gram-Färbung werden Bakterien in gram-negative und gram-positive

Bakterien eingeteilt. Die Färbung wurde eingesetzt, um die Klassifizierung der in dieser

Studie eingeschlossenen Bakterien als gram-negative Stäbchenbakterien zu bestätigen.

Zur Durchführung der Gram-Färbung wurden einige Kolonien der zu untersuchenden

Bakterien von einer zwei Tage alten Subkultur auf Kochblut-Agar in einem Tropfen

physiologischer NaCl-Lösung auf einem Objektträger suspendiert. Das luftgetrocknete

Präparat wurde durch dreimaliges Ziehen durch die Flamme eines Bunsenbrenners

hitzefixiert und folgendermaßen gefärbt:

- vollständiges Überschichten des Objektträgers mit GRAMS Kristallviolettlösung,

90 sek. einwirken lassen, danach abgießen

- Objektträger mit Lugol’scher Lösung abspülen und komplett mit Lugol’scher

Lösung bedecken, 90 sek. einwirken lassen, danach abgießen

- mit 95 % Ethanol zur Entfärbung abspülen, bis alle Farbreste entfernt sind

- unter fließendem Leitungswasser vorsichtig waschen

- Auftropfen von Karbolfuchsinlösung, 60 sek. färben

- mit Leitungswasser abspülen, lufttrocknen lassen

Anschließend Betrachtung unter dem Lichtmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung.

Gram-negative Bakterien erscheinen rot, gram-positive Bakterien blau.

3.4. Biochemische Identifizierung der Bakterien

3.4.1. Oxidase-Test

Der Oxidase-Test prüft, ob ein Bakterium Cyctochrom C in seiner Atmungskette enthält

und somit zur Oxidation von Cytochrom C durch molekularen Sauerstoff fähig ist. Im

Oxidase-Test wird das oxidierte Cytochrom C durch das Reagenz TMPD (Tetramethyl-p-

phenylendiamin-Dichlorid) reduziert. Dabei kommt es zum Farbumschlag des Reagenz

von farblos nach violett. Der Nachweis dieses Cytochromoxidase-Systems erlaubt eine

Einordnung der Isolate in Oxidase-positive und Oxidase-negative Bakterien.

Alle wichtigen humanpathogenen Pseudomonaden sind Oxidase-positiv. Der Oxidase-

Nachweis ist sowohl mit einer Trockenoxidase als auch einer Flüssigoxidase möglich.

Durchführung des Trockenoxidase-Tests:

- 1 Kolonie einer 18 - 24 h bebrüteten Reinkultur mit einer Impföse entnehmen und

auf das Testplättchen auftragen

Page 30: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 24

- im positiven Fall zeigt das farblose Reagenz innerhalb von 20 sek. während der

ablaufenden Oxidasereaktion einen Farbumschlag nach violett

Anmerkung:

- bei mukoiden Isolaten kann aufgrund der Schleimkapsel eine verzögerte Oxidase-

reaktion auftreten

Bei fraglichem Ausfall des Trockenoxidase-Test wurde der Flüssigoxidase-Test

durchgeführt:

- 1 % ige wässrige TMPD-Lösung auf eine oder mehrere Kolonien auftropfen

- innerhalb von 20 sek. die Entwicklung einer dunkelvioletten Verfärbung der

Kolonie beurteilen

3.4.2. Api 20 NE

Der Api 20 NE (Fa. BioMérieux) ist ein kommerziell erhältlicher, biochemischer Test zur

Identifizierung von gram-negativen, nonfermentativen Bakterien. Er identifiziert die

Bakterien anhand ihrer charakteristischen Stoffwechseleigenschaften, wie z. B. diversen

enzymatischen Reaktionen, und der Fähigkeit, verschiedene Zucker abzubauen (sog.

Assimilationsreaktionen).

Abb. 4: Api 20 NE der Firma BioMérieux. Dieser kommerziell erhältliche Test identifiziert Bakterien mittels

charakteristischer Stoffwechseleigenschaften. Die Röhrchen auf der linken Hälfte der Abbildung testen

verschiedene enzymatische Reaktionen, die Röhrchen auf der rechten Hälfte die Assimilationsreaktionen.

Durchführung des Api 20 NE:

- mit einigen Kolonien einer 18-24 h bebrüteten Reinkultur in 2 ml 0,85 % iger

NaCl-Lösung eine Suspension nach McFarland-Standard 0,5 herstellen

- die Röhrchen des Api 20 NE Teststreifen von NO3 bis PNPG (enzymatische

Reaktionen) mit der Psipette möglichst blasenbildungsfrei befüllen

- acht Tropfen der Suspension in eine Ampulle AUX-Medium pipettieren

- Beimpfung der Röhrchen und Becher der Assimilationsreaktionen, bis der anfangs

konkave Überstand in einen konvexen übergeht

- Reaktionen GLU, ADH und URE mit Paraffinöl überschichten, um einen Sauer-

stoffabschluss zu gewährleisten

Page 31: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 25

- Teststreifen in einer Inkubationswanne, die mit 5 ml Aqua bidest. befeuchtet wird,

für 24 h bei 30 °C unter Raumluft inkubieren

- zur Reinheitskontrolle der verwendeten Kultur mit der Suspension zusätzlich eine

MacConkey-Agarplatte mit einem Dreiösenausstrich beimpfen, um eventuelle

Kontaminationen anhand des Mischwachstums auf dem Agar erkennen zu können

Die Ablesung des Api 20 NE erfolgt sowohl nach 24 h als auch nach 48 h, sowie in

Einzelfällen erneut nach 72 h, entsprechend den Vorgaben des Herstellers. Bei der

Ablesung wird die Farbe der Lösungen in den einzelnen Röhrchen der Enzymreaktionen

bzw. die Trübung in den Röhrchen der Assimilationsreaktionen beurteilt.

Die Auswertung des Api 20 NE erfolgte mit Hilfe der APIlab-Software. Die Software

schlägt dabei vor, welche Spezies am ehesten zu dem jeweiligen Api-Ergebnis passt. Dabei

verwendet der Api folgende Kriterien:

- Prozentwert („% id.“): Dieser gibt die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung im

Vergleich mit allen Taxa der Datenbasis an

- T-Wert („T“): Er liegt zwischen 0 und 1 und gibt den typischen Charakter des Stammes

innerhalb eines Taxons an. Hohe T-Werte sprechen für ein typisches biochemisches

Verhalten des Isolates und somit für eine gute Identifizierung

- Widersprechende Reaktionen: hier wird die absolute Anzahl der Reaktionen

angegeben, die dem typischen Taxon widersprechen

Zusätzlich beurteilt die Software die Identifikationsgüte mit folgenden Bewertungen:

„ausgezeichnete Identifizierung“, „sehr gute Identifizierung“, „gute Identifizierung“,

„akzeptierbare Identifizierung“, „geringe Selektivität“, „unzuverlässige Identifizierung“,

„zweifelhaftes Profil“ und „unakzeptierbares Profil“.

3.5. Resistenztestung

Die Resistenztestung der Bakterien wurde mit der Agardiffusionstestmethode im Rahmen

der Routinediagnostik durchgeführt. Sie dient der in vitro Sensitivitätsbestimmung von

Bakterien gegenüber bestimmten Antibiotika. Die Empfindlichkeit des Bakteriums lässt

sich aufgrund des Durchmessers der Hemmzone um die mit Antibiotika beschichteten

Testplättchen als „sensibel“, „intermediär empfindlich“ oder „resistent“ gegenüber einem

bestimmten Antibiotikum einstufen. Die Durchführung des Agardiffusionstests erfolgte

gemäß der Standardmethode der NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory

Standards, USA):

Page 32: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 26

- Bakterienkolonien von einer 18-24 h bebrüteten Reinkultur mit einer sterilen Öse

entnehmen und in 5 ml 0,9 % iger NaCl –Lösung suspendieren, bis eine Trübung von

0,5 McFarland entsteht

- mit dieser Suspension eine Müller-Hinton-Agarplatte beimpfen

- Antibiotika-Testplättchen mit speziellem Applikator auf der Agarplatte positionieren

- 10-15 min. Vordiffusion bei RT, dann für 18-24 h bei 36 °C unter Raumluft bebrüten

Die Auswertung erfolgt durch Ausmessen des Hemmhof-Durchmessers, der sich um das

Antibiotikum-Plättchen ergibt, und Beurteilung des erhaltenen Werts nach den in Tab. 1

aufgelisteten Grenzwerten (NCCLS, Version M100-S11).

Tab. 1: Auswertung der Resistenztestung mittels HHD (Hemmhof-Durchmesser)

Die dargestellten Grenzwerte für die Größe des Hemmhof-Durchmessers entsprechen den Vorgaben des

NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA) und dienen der Bestimmung der in

vitro Sensitivität verschiedener Antibiotika.

Antibiotikum Konzentration

pro Plättchen (µg)

Resistent

(HHD in mm)

Sensibel

(HHD in mm)

Colistin 10 < 11 ≥ 11

Gentamicin 10 ≤ 12 ≥ 15

Netilmicin 30 ≤ 12 ≥ 15

Piperacillin/Tazobactam 100 / 10 ≤ 17 ≥ 18

Cefotaxim 30 ≤ 14 ≥ 23

Ciprofloxacin 5 ≤ 15 ≥ 21

Ceftazidim 30 ≤ 14 ≥ 18

Imipenem 10 ≤ 13 ≥ 16

Amikacin 30 ≤ 14 ≥ 17

Meropenem 10 ≤ 13 ≥ 16

Tobramycin 10 ≤ 12 ≥ 15

Fosfomycin 200 < 10 ≥ 11

Levofloxacin 5 ≤ 13 ≥ 17

3.6. Molekularbiologische Identifizierung der Bakterien

Molekularbiologische Methoden stellen heutzutage wertvolle Techniken für die

Identifizierung von Bakterien dar, insbesondere für Bakterien, die sich durch morpho-

logische und biochemische Kriterien nicht eindeutig differenzieren lassen. In der

Page 33: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 27

vorliegenden Arbeit kamen sowohl PCR-Methoden als auch die DNA-Sequenzierung zum

Einsatz. Für die Sequenzierung wurde das 16S rRNA-Gen verwendet. Die PCR ist

Bestandteil der DNA-Sequenzierung und wurde außerdem für die Identifizierung von den

Species des B. cepacia Komplexes angewendet. Zielgen war hierbei das RecA-Gen.

Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden bei allen Verfahren der molekular-

biologischen Identifizierung von Bakterien Einmalhandschuhe getragen und gestopfte

Pipettenspitzen, die Kontaminationen durch Aerosole verhindern, verwendet.

3.6.1. Isolierung von bakterieller DNA

Es wurde die gesamte genomische DNA aus dem zu untersuchenden Bakterium isoliert.

Um möglichst reine DNA-Präparationen zu erhalten, wurde die DNA-Isolierung anfangs

mit dem QIAamp DNA Mini Kit der Fa. Qiagen durchgeführt. Dabei werden die Zellen

mit Proteinase K enzymatisch lysiert. Die DNA adsorbiert in Anwesenheit hoher Salz-

konzentrationen an eine Silikat-Gel-Membran im Säulchen, während übrige Zell-

bestandteile diese Membran passieren. In zwei Waschschritten, in denen Zelltrümmer,

Proteine und sonstige bakterielle Bestandteile, die den Ablauf der PCR inhibieren können,

entfernt werden, wird die DNA mit AE-Puffer von der Membran eluiert.

DNA-Isolierung mit dem Qiagen-Kit:

- eine Impföse Bakterien einer 24-48 h alten Subkultur entnehmen, diese in 1 ml PBS

homogenisieren und 10 min. bei 13400 U/min zentrifugieren

- Pellet in 160 µl ATL-Puffer resuspendieren, 20 µl Proteinase K zugeben; vortexen

- mind. 1 h bei 56 °C im Thermomixer inkubieren, dabei schütteln

- Zugabe von 200 µl 96 % Ethanol und vortexen

- Probe auf ein QIAmp-Säulchen geben und 1 min. bei 8000 U/min zentrifugieren

- nach Zugabe von 500 µl AW-1 Puffer erneut 1 min. bei 8000 U/min und nach

Zugabe von 500 µl AW-2 Puffer 3 min. bei 13400 zentrifugieren

- zur DNA-Elution 50 µl AE-Puffer auf die in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß

gesetzte Säule geben, 1 min. bei RT inkubieren, 1 min. bei 8000 U/min

zentrifugieren

- Wiederholung des letzten Arbeitsschrittes mit weiteren 50 µl AE-Puffer

- das Eluat enthält nun die isolierte DNA

Im Verlauf der Arbeit stellte sich heraus, dass mit der wesentlich weniger zeitaufwendigen

Methode des „Kochens“ der Bakterien in speziellem Lysispuffer (Pufferzusammensetzung

siehe 2.1.) ebenso gute DNA-Präparationen gewonnen werden konnten.

Page 34: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 28

DNA-Isolierung mit Lysis-Puffer:

- von einer 24-48 h alten Subkultur eine Impföse Bakterien entnehmen, diese in

500 µl Lysispuffer suspendieren und 10 min. bei 95 °C im Heizblock aufkochen

- 5 min. bei 13400 U/min zentrifugieren

- den Überstand in ein Reaktionsgefäß überführen, dieser enthält die isolierte DNA

Konzentrationsbestimmung der präparierten DNA:

- Nach Herstellung einer Verdünnung von 1:25 aus 10 µl Eluat und 240 µl

Aqua bidest. wurde eine Extinktionsmessung der DNA im Photometer mit der

Deuterium Lampe bei 260 und 280 nm durchgeführt. Die Reinheit der DNA lässt

sich durch Berechnung des Verhältnisses der Absorption bei 260 nm (A260) und bei

280 nm (A280) bestimmen. Bei reiner DNA liegt dieses Verhältnis A260 / A280

zwischen 1,7 und 1,9.

3.6.2. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die PCR ist eine Methode, mit der DNA-Fragmente von bis zu 10 kbp mit Hilfe einer

thermostabilen Taq-Polymerase (aus dem Bakterium Thermus aquaticus) vervielfältigt

werden können. Die PCR läuft in einer Wiederholung bestimmter Zyklen (ca. 30 Stück)

ab, in denen die Anzahl der DNA-Stücke jeweils verdoppelt wird und somit logarithmisch

ansteigt. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten:

1. Denaturierung bei 96 °C: Durch Aufbrechen der Wasserstoffbrücken wird die

doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge getrennt.

2. Anlagerung (Annealing) der Primer, meist bei 50 °C: Zwei Oligonukleotid-Primer

bekannter Sequenz binden an spezifische DNA-Abschnitte (Annealing) und

begrenzen so von beiden Seiten das gewünschte Teilstück.

3. Elongation bei 60 °C: Durch die hitzestabile Taq-Polymerase wird ein komplemen-

tärer Strang in der Syntheserichtung 5’�3’ synthetisiert.

Nach dem letzten Zyklus wurde auf 4 °C abgekühlt und die Probe bis zur weiteren

Verarbeitung bei -20 °C aufbewahrt. Alle Reagenzien wurden für den Reaktionsansatz auf

Eis gelagert und im Kühlblock pipettiert, um ein unkontrolliertes, zu frühes Beginnen der

PCR und somit die Bildung unspezifischer Amplifikationsprodukte zu verhindern.

In der vorliegenden Arbeit wurden für die Amplifikation des 16S rRNA-Gens der

Bakterien Primer eingesetzt, die an die Basen 8-27 (Primer 16s for) und 1388-1406

(Primer 1406 rev) bzw. 1492–1510 (Primer 16s rev) des E. coli 16S rRNA-Gens (ATCC

Page 35: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 29

25922) binden und somit das gesamte 16S rRNA-Gen der Bakterien amplifizieren. Die

Amplifikation des 16S rRNA-Gens stellt die Voraussetzung für die Sequenzierung des

Gens dar.

Pipettierschema für die PCR (Mastermix für einen Ansatz):

- Primer 16s for (100 pmol/µl) 0,25 µl

- Primer 16s rev (100 pmol/µl) 0,25 µl

- dNTP 5 mM 1,3 µl

- 10 x PCR Puffer 10 µl

- Aqua bidest. 83,7 µl

- Taq-Polymerase (5 Units/µl) 0,5 µl (zuletzt zugeben)

In jeden Ansatz wurden 96 µl Mastermix pipettiert und 4 µl der isolierten DNA

zugegeben. Anschließend wurde das Eppendorf-Reaktionsgefäß kurz anzentrifugiert.

Bei jeder PCR wurden zur Qualitätskontrolle sowohl eine Positivkontrolle mit einem

definierten Kontrollstamm (E. coli ATCC 25922) als auch eine Negativkontrolle, bei der

anstelle der DNA Aqua bidest. zugeführt wurde, mitgeführt. Nur wenn die Kontrollen

einwandfrei ausfielen, wurden die untersuchten Proben ausgewertet.

Die PCR wurde im Thermocycler Touch Down in 25 Zyklen mit folgenden Schritten

durchgeführt:

1. Erhitzen auf 96 °C, 15 sek.

2. Temperatur 50 °C, 15 sek. 25 Zyklen

3. Temperatur 60 °C, 4 min.

3.6.3. Agarosegelelektrophorese

Zur Überprüfung der PCR-Produkte wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, in

der die Amplifikate der Größe nach aufgetrennt werden und somit die Größe der Produkte

bestimmt werden kann. Die PCR-Produkte wurden mit einer Ethidiumbromidfärbung unter

UV-Licht sichtbar gemacht und zur Dokumentation fotographiert.

Vorbereitung des DNA Längenstandard:

- 10 µl Längenstandard mit 10 µl Ladepuffer und 80 µl 1x TE-Puffer mischen

Durchführung der Agarosegelelektrophorese:

- 1 g Agarose in eine 250 ml Duran Flasche geben und mit 100 ml 1x TBE-Puffer in

der Mikrowelle durch Aufkochen lösen, dann auf 50 °C abkühlen lassen

Page 36: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 30

- 1,0 µg/ml Ethidiumbromid zugeben, dabei unbedingt Nitrilhandschuhe tragen!

- Lösung in die zuvor mit Gelkämmen bestückte Gelelektrophorese-Apparatur

gießen und ca. 20 min. aushärten lassen

- währenddessen die Flasche mit Wasser und 30 % H2O2 ausspülen und im

Sondermüllkanister für Ethidiumbromid entsorgen

- Gel in die mit 1x TBE-Puffer befüllte Elektrophoresekammer einlegen, so dass das

Gel vollständig bedeckt ist und die Gelkämme vorsichtig entfernen

- je 12 µl PCR-Produkt und 1,5 µl Ladepuffer (Herstellung siehe 2.1.) mischen

- diese Proben vorsichtig in die Geltaschen einbringen

- zusätzlich 13,5 µl DNA-Längenstandard in eine Tasche pipettieren

- elektrisches Feld anlegen und ca. 1 h bei 120 V auftrennen

- Gelbanden unter UV-Licht im Transilluminator sichtbar machen und zur

Dokumentation fotographieren

- die PCR-Produkte sollten die folgende Größe haben:

1396 bp (Primer 1406 rev), 1502 bp (Primer 1510)

3.6.4. DNA-Sequenzierung

3.6.4.1. Prinzip der Methode

Die DNA-Sequenzierung dient der Bestimmung der Nukleotidabfolge eines spezifischen

Gens. In dieser Arbeit wurde das 16S rRNA-Gen von Bakterien verwendet, welches für die

kleine Untereinheit der ribosomalen RNA der Bakterien kodiert. Dieses etwa 1,5 kb große

Gen eignet sich sehr gut zur Identifizierung von Bakterien, da es im Genom aller Bakterien

in mehrfacher Kopienzahl vorkommt und neben konstanten Bereichen, die für die Primer-

bindung benötigt werden, auch variable, artspezifische Abschnitte für die Identifizierung

besitzt.

Die DNA-Sequenzierung wurde nach der Methode des Kettenabbruchverfahrens nach

Sanger et al. (105), bei dem die Nukleotidabfolge anhand des Einbaus von Didesoxy-

nukleotiden (ddNTPs) bestimmt wird, durchgeführt. Nach der Denaturierung des DNA-

Doppelstranges werden während der Anlagerung der dNTPs an den Einzelstrang auch

verschiedenfarbig fluoreszierende ddNTPs eingebaut, die zum Kettenabbruch an der

entsprechenden Einbauposition führen. So entstehen unterschiedlich lange DNA-

Fragmente, die das Vorhandensein einer bestimmten Base an der entsprechenden Position

im Gen anzeigen.

Page 37: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 31

Die DNA-Sequenzierung gliedert sich in folgende Arbeitsschritte:

(1) Amplifikation des Zielgens mittels PCR

(2) Aufreinigung des PCR-Produktes

(3) Sequenzierreaktion

(4) Aufreinigung des Sequenzierproduktes

(5) Sequenzanalyse

(6) Auswertung der Sequenzierung

3.6.4.2. Amplifikation des Zielgens

Die Amplifikation des Zielgens erfolgte mittels PCR wie unter 3.6.2. beschrieben.

3.6.4.3. Aufreinigung des PCR-Produkts

Um überschüssige Primer und freie Nukleotide zu entfernen, wurden die PCR-Amplifikate

mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kit (Fa. Qiagen) aufgereinigt, welches sich für

die direkte Reinigung von doppel- und einsträngigen PCR-Produkten von 100 bp -10 kbp

Länge eignet. In diesem Verfahren können bis zu 10 µg DNA in Anwesenheit hoher Salz-

konzentrationen durch Absorption an eine Silikat-Gel-Membran aufgereinigt werden. Der

mitgelieferte PB-Puffer sorgt für ein effizientes Binden der DNA an diese spezielle

Membran. Kontaminationen passieren die Membran und werden im Waschvorgang mit

PE-Puffer gemeinsam mit den Salzen entfernt. Die DNA-Elution erfolgt in Anwesenheit

niedriger Salzkonzentrationen mittels EB-Puffer.

Durchführung der Aufreinigung der PCR-Produkte

- 440 µl PB-Puffer mit 88 µl des PCR Produktes versetzen und auf eine QIAquick-

Säule in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß geben

- 1 min. bei 13400 U/min zentrifugieren (dabei bindet die DNA an die Silikat-Gel-

Membran)

- 750 µl PE-Puffer zum Waschen und Entfernen von Salzen auf die Säule pipettieren

und nochmals 1 min. bei 13400 U/min zentrifugieren

- Eluat verwerfen und erneut 1 min. bei 13400 U/min zentrifugieren

- Säule aus dem Reaktionsgefäß nehmen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß setzen

- 50 µl EB-Puffer zur Elution der DNA auf die Säule geben

- 1 min. bei RT stehen lassen, anschließend 1 min. bei 13400 U zentrifugieren

Das gereinigte PCR Produkt befindet sich nun in dem 1,5 ml Reaktionsgefäß und kann

direkt im Sequenzierungsansatz eingesetzt werden.

Page 38: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 32

3.6.4.4. Sequenzierreaktion

Für die Sequenzierreaktion wurde das BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready

Reaction Kit der Fa. Applied Biosystems entsprechend des Protokolls des Herstellers

verwendet. Die Sequenzierreaktion wurde dabei mit folgenden Primern durchgeführt:

16s rev (entspricht 1510 rev), 1111 rev, 821 rev und 536 rev. Da je Primer ein Ansatz

hergestellt werden muss, benötigt man pro Isolat vier Ansätze.

Pipettierschema für Sequenzierungen eines Primer-Ansatzes:

- BigDye Terminator Ready Reaction Mix 4,0 µl

- Sequenzing-Puffer, 5x 4,0 µl

- Primer (10 pmol /µl) 1,5 µl

- Aqua bidest. 5,5 µl

Zu dem Ansatz 5,0 µl gereinigtes PCR-Produkt zugeben.

Im BigDye Terminator Cycle Sequenzing Ready Reaction Mix sind sowohl die dNTPs als

auch die zum Kettenabbruch führenden, Fluoreszein-markierten ddNTPs enthalten. Es

wurde während des Gebrauchs auf Eis gelagert, und der gesamte Reaktionsansatz wurde

im Kühlblock pipettiert.

Die Sequenzierreaktion stellt im Prinzip eine PCR dar. Sie wurde im Thermocycler Touch

Down mit folgenden Einstellungen durchgeführt.

1. Erhitzen auf 96 °C, 30 sek.

2. Temperatur 50 °C, 15 sek. 25 Zyklen

3. Temperatur 60 °C, 4 min.

Abschließend wurde auf 4 °C abgekühlt und die Probe wurde bis zur weiteren

Verwendung bei 2 - 8 °C bzw. -20 °C aufbewahrt.

3.6.4.5. Aufreinigung der Sequenzierprodukte

Um die Qualität der Sequenzierungsergebnisse zu optimieren, wurden nach der

Sequenzierreaktion nicht gewünschte Bestandteile des Sequenzieransatzes, wie z. B.

überschüssige dNTPs oder Primer, durch alkoholische Fällung entfernt.

Durchführung der Aufreinigung der Sequenzierprodukte:

- 250 µl 100 % iges Ethanol mit 10 µl 3 M Natriumacetat, pH 5,2, und 80 µl

Dextranblau mischen

- 20 µl des Sequenzierreaktionsproduktes zugeben und 10 min. bei RT inkubieren

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Methodik 33

- 30 min. bei 13400 U/min zentrifugieren

- nach Waschen durch Zugabe von 1000 µl 70 % igem Ethanol nochmals 5 min. bei

13400 U/min zentrifugieren

- Pellet 5 min. bei 37 °C trocknen lassen

- Pellet in 25 µl HiDi Formamid lösen und mit Hilfe einer Pipette resuspendieren

Die Probe kann direkt für die Sequenzanalyse in das Sequenziergerät eingesetzt werden.

3.6.4.6. Sequenzanalyse im Sequenziergerät

Die Sequenzanalyse erfolgte als automatisierte, computergestützte Bestimmung der

Nukleotidabfolge im Kapillarsequenziergerät ABI Prism 310. Das Sequenziergerät trennt

die fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente durch Kapillarelektrophorese auf und

detektiert die jeweiligen Nukleotide nach Aktivierung der Fluoreszenzmoleküle durch

einen Laser. Dabei transformiert das Sequenziergerät das Emissionsmuster in Chromato-

gramme, die anhand spezieller Software ausgewertet werden können und somit die

Nukleotidsequenz darlegen.

3.6.4.7. Auswertung von Sequenzierungen

Um für ein Isolat die vollständige DNA-Sequenz des 16S rRNA-Gens zu erhalten, müssen

die einzelnen Teilstücke der vier Primer in der richtigen Reihenfolge und an den passenden

Schnittstellen zusammengesetzt werden. Dies wurde mit Hilfe des Auswertungsprogramm

Trace Edit, Fa. Ridom, durchgeführt.

Die ermittelten Sequenzen wurden mit Hilfe des BLAST-Programmes der GenBank-

Datenbank des National Center for Biotechnology Information der USA (NCBI,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST) mit allen in der Datenbank enthaltenen

Sequenzen verglichen. Die Auswertung einer Sequenzierung gibt dabei einen Grad der

Homologie zwischen zwei DNA-Sequenzen an. Eine Homologie des 16S rRNA-Gens

größer 97 % zu einer Sequenz der Datenbank gilt als zuverlässige Identifizierung eines

Bakteriums. In dieser Arbeit wurde jedoch als Kriterium für eine eindeutige Identifizierung

der bakteriellen Spezies eine Homologie zur entsprechenden Spezies in der Gen-

Datenbank von ≥ 99 % definiert, um möglichst exakte Ergebnisse zu erhalten. Bei hohen

Anteilen von nicht identifizierten Basen oder Homologien von deutlich weniger als 97 %

wurden die Sequenzierungen wiederholt.

Page 40: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 34

Die Zuverlässigkeit der Identifizierung lässt sich außer an den Homologien anhand von

Bit-Scores und E-Values einschätzen. Der Bit-Score ist eine Punktzahl, die die Identität

zwischen zwei Sequenzen widerspiegelt. Ergänzend gibt der E-Value eine

Wahrscheinlichkeit an, mit der die Datenbank-Sequenz der eingegebenen Sequenz nur

zufällig ähnlich ist. Daher ist der Bit-Score umso signifikanter, je kleiner der E-Wert ist.

Der Bit-Score überstieg bei 90 % der identifizierten Sequenzen den Wert von 2500 bei

einem E-Value < 0,001.

Zusätzlich zur Identifizierung mit der GenBank wurden alle Sequenzen mit den bekannten

16S rRNA-Gen-Sequenzen der Typstämme der jeweils erhaltenen Spezies verglichen (in

Klammern die Stammnummer und die GenBank-Nummer):

- Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans (ATCC 9220, AF411021)

- Agrobacterium radiobacter (ATCC 19358, AJ389904)

- Burkholderia multivorans (LMG 13010, Y18703)

- Inquilinus limosus (LMG 20952, AJ 043374)

- Ochrobactrum anthropi (LMG 5140, AJ242580)

- Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145, AF094713)

- Pseudomonas alcaligenes (ATCC 14909, AF094721)

- Pseudomonas brassicacearum (CFBP 11706, AF100321)

- Pseudomonas putida (ATCC 12633, AF 094736)

- Pseudomonas synxantha (IAM 12356, D84025)

- Sphingomonas paucimobilis (ATCC 29837, U37337)

Auch hierbei wurde ab Homologien größer 99,0 % eine korrekte Identifizierung

angenommen.

3.6.5. Sequenzierung des RecA-Gens von Burkholderia cepacia Komplex

Der B. cepacia Komplex enthält neun sehr eng verwandte Spezies bzw. Genomovare, die

sich nur schwer differenzieren lassen. Zur exakten Unterscheidung der Genomovare des

B. cepacia Komplexes eignet sich die Sequenzierung spezifischer Regionen des 1043 bp

großen RecA-Gens, deren Nukleotidsequenzen in den unterschiedlichen Genomovaren

variieren (80; 87).

Diese Methode wurde für diejenigen Proben durchgeführt, die in der 16S rRNA-

Gen Sequenzierung als Mitglied des B. cepacia Komplex bestätigt wurden. Die

Vorgehensweise der RecA-Gen Sequenzierung erfolgte analog zur oben beschriebenen 16S

rRNA-Gen Sequenzierung. Die Amplifizierung des RecA-Gens erfolgte mit den Primern

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Methodik 35

BRC1 und BRC2, die Sequenzierung in zwei Ansätzen mit dem Primer BRC2 bzw. BRC4

(s. Kap. 2.2.). Für die PCR wurde Taq-Polymerase mit Q-Solution (Fa. Qiagen) verwendet,

um die Effektivität der PCR bei GC-reicher DNA zu erhöhen. Die Identifizierung des

RecA-Genomovars erfolgte anhand eines Gendatenbank-Vergleichs, der ebenfalls mit dem

BLAST-Programm, wie in 3.6.4.7. beschrieben, durchgeführt wurde.

3.7. Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

Bei allen Patienten, bei denen Bakterien derselben Spezies an mehreren Untersuchungs-

zeitpunkten isoliert und mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung bestätigt wurden, wurde

eine PFGE durchgeführt.

3.7.1. Prinzip der Methode

Die PFGE ist eine molekulargenetische Methode der Bakterientypisierung, mit der die

Zugehörigkeit von Bakterienisolaten gleicher Spezies zu bestimmten Stämmen

nachgewiesen werden kann. So wird beispielsweise die Aufdeckung von Koinfektionen

oder die Differenzierung zwischen persistierenden Infektionen und Eradikation mit

anschließender Reinfektion ermöglicht.

Nach Restriktion der chromosomalen DNA der Bakterien mit speziellen Restriktions-

enzymen werden die Restriktionsfragmente in einer Gelelektrophorese der Größe nach

aufgetrennt, wobei ein typisches Bandenmuster für jeden Bakterienstamm entsteht. Da bei

dieser Methode größere DNA-Fragmente als bei einer PCR aufgetrennt werden müssen,

wird die Gelelektrophorese in einem gepulsten elektrischen Feld durchgeführt. Dabei

ändert das elektrische Feld in bestimmten Zeitabständen seine Ausrichtung. Die Methode

gliedert sich in folgende Arbeitsschritte:

(1) Einbettung der Bakterien in Agarosegel-Blöckchen

(2) Isolierung der DNA der Bakterien

(3) Restriktion der DNA mittels spezifischer Restriktionsenzyme

(4) eigentliche Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

(5) Darstellung der Banden im Gel mittels Ethidiumbromid

(6) Auswertung der PFGE.

3.7.2. Einbettung der Bakterien in Agarosegel-Blöckchen

Zur Durchführung benötigt man eine Reinkultur der zu untersuchenden Bakterien auf einer

24-48 h bebrüteten Caso-Agarplatte ohne Blut.

Page 42: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 36

Durchführung der Methode:

- aus 10 ml 2 % iger Seal Plaque GTG Agarose und 500 µl 10 % iger SDS eine

2 % ige Agaroselösung herstellen und bei 56 °C warm halten

- im PS-Tube durch Homogenisieren von 10-20 Kolonien in 2 ml CSB-Puffer eine

Suspension mit einer Trübung von 0,65 McFarland herstellen, dann 490 µl dieser

Zellsuspension mit 10 µl Proteinase K und 500 µl 2 %iger Agaroselösung versetzen

- Gießen der Gel-Blöckchen in die vorbereitete Gel-Apparatur durch möglichst

blasenfreies Einfüllen und 30 min. erstarren lassen

3.7.3. Isolierung der DNA der Bakterien

- Die hart gewordene Gel-Blöckchen vorsichtig mit Hilfe eines Spatels aus dem

Gießstand herausdrücken und in je 5 ml TE-Puffer einlegen

- nach Abgießen des TE-Puffers 5 ml Lysepuffer und 25 µl Proteinase K zugegeben

- Blöckchen über Nacht bei 50 °C in einem Schüttelwasserbad inkubieren

- je 2 mal mit 10 ml 50 °C warmem Aqua bidest. bzw. TE-Puffer waschen

3.7.4. Restriktion der DNA

In den gewaschenen Agaroseblöckchen liegt die chromosomale DNA nun in einer für die

Restriktionsenzyme zugänglichen Form vor. Entsprechend den Empfehlungen von

Tenover et. al (121) wurde das Restriktionsenzym SpeI verwendet. Grundlage der PFGE

ist, dass epidemiologisch nicht verwandte Isolate individuelle Restriktionsfragmentmuster

zeigen, während verwandte Isolate identische oder nur minimal unterschiedliche Muster

aufweisen. Mittels SpeI enstehen bei P. aeruginosa und verwandten Spezies 20 - 25

Restriktionsfragmente in der Größe von 10 - 700 kb (121).

Durchführung der Restriktion:

- Agaroseblöckchen vorsichtig mit einem scharfen Skalpell auf die passende Größe

zuschneiden und in 300 µl TE-Puffer einlegen

- vorsichtiges Abpipettieren des Puffers

- Zugabe von 50 µl NEB-2-Puffer ohne Restriktionsenzym (1335 µl Aqua bidest. +

150 µl NEB-2 (10 x Restriktionspuffer) + 15 µl BSA (100 x))

- 15 min. bei 37 °C schütteln, danach Puffer abnehmen und verwerfen

- Zugabe von 50 µl NEB-2-Puffer mit Restriktionsenzym (1245 µl Aqua bidest. +

150 µl NEB-2 (10 x Restriktionspuffer) + 15 µl BSA (100 x) + 90 µl SpeI)

- 4 h bei 37 °C schütteln, danach Puffer abnehmen und verwerfen

- je 250 µl 0,5 x TBE-Puffer zugeben, um den Restriktionsverdau zu beenden

Page 43: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Methodik 37

3.7.5. Pulsfeldgelelektrophorese

- Gel-Gießform nach Anleitung des Herstellers zusammensetzen

- Blöckchen exakt auf die Zähne des Gieß-Kamms positionieren

- mit einem Tropfen bei 56° C flüssig gehaltener Agaroselösung (aus 1,75 g Seakem

GTG Agarose und 175 ml 0,5 x TBE-Puffer) fixieren

- Agarosegel ohne Blasenbildung in die Form gießen und 30 min. erstarren lassen

- das Gel für 1 h in der mit 2,5 l 0,5 x TBE-Puffer gefüllten Kammer äquilibrieren

Danach wurde der Lauf im CHEF-DR III Gerät mit folgenden Einstellungen gestartet:

Laufzeit: 23 h, Pulszeiten: 5 - 40 sek. Spannung: 6 V, Temperatur: 14 °C, Ampere: Start:

144, Ende: 172

3.7.6. Färbung und Auswertung der PFGE

Nach dem Gellauf wurde das Gel mit Ethidiumbromid (20 µl/400 ml H2O) gefärbt (dabei

Nitril-Handschuhe tragen!) und in Wasser abgespült. Zur Betrachtung des Gels wurde UV-

Licht verwendet und das entstandene Bild mithilfe des PFGE-Geldokumentationssystems

fotographisch dokumentiert. Die Interpretation der PFGE beruht auf Differenzen im

Bandenvergleich. Bakterien desselben Stammes haben ein identisches Bandenmuster in der

PFGE. Als nah verwandt gelten Isolate, die sich nur durch ein einziges genetisches

Ereignis wie beispielsweise eine Punktmutation, eine Deletion oder eine Insertion der

DNA unterscheiden, was im PFGE-Bild zu zwei bis drei unterschiedlichen Banden führt

(121). Daher betrachteten wir Isolate, die Abweichungen bei maximal drei Banden zeigten,

als einem Bakterienstamm zugehörig. Isolate, die im Bandenvergleich vier bis sechs

Differenzen aufweisen, unterscheiden sich in zwei Mutationen und sind als

möglicherweise verwandt betrachet, wohingegen Isolate mit mindestens sieben

unterschiedlichen Bandenpositionen als unterschiedliche Stämme bewertet wurden.

Page 44: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 38

4. Ergebnisse

4.1. Identifizierung der Bakterienisolate

Während des Studienzeitraumes vom 1.1.2003 bis zum 31.12.2003 wurden insgesamt 407

Isolate von gram-negativen, Oxidase-positiven, nonfermentativen Stäbchenbakterien aus

respiratorischen Proben von 82 Mukoviszidosepatienten der Mukoviszidose-Ambulanz der

Universitätskinderklinik Ulm nachgewiesen. Die Identifizierung der Bakterien erfolgte in

der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, in einem nach DIN EN ISO

15189 akkreditierten Labor, gemäß mikrobiologischer Standardmethoden (s. Kapitel 3).

Der Gang der Diagnostik folgte dabei einem Algorithmus, der sowohl Morphologie als

auch biochemische Merkmale der Bakterien berücksichtigt (s. Abb. 5).

Abb. 5: Identifizierungsverfahren für gram-negative, Oxidase-positive Stäbchenbakterien

mit Angabe der Anzahl n der jeweiligen, nach diesem Algorithmus identifzierten Isolate (P.= Pseudomonas)

Typische Morphologie grünes Pigment

Wachstum bei 42 °C Wachstum auf

MacConkey-Agar sensibel gegenüber Colistin

Typische Morphologie (mukoide Kolonien) Wachstum bei 42 °C

Wachstum auf MacConkey-Agar

sensibel gegenüber Colistin

Alle anderen

P. aeruginosa

(n = 143) Mukoider P. aeruginosa

(n = 156) API 20NE (n = 108)

ausgezeichnete, sehr gute oder gute Identifizierung als

P. aeruginosa im API Wachstum bei 42°C

und auf MacConkey Agar Colistin sensibel

Alle anderen

P. aeruginosa

(n = 18)

Aufnahme in die Studie zur 16S rRNA-Gen- Sequenzierung

(n = 90)

Page 45: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 39

Anhand dieses Algorithmus konnten 299 der 407 Isolate als P. aeruginosa oder als

mukoider P. aeruginosa identifiziert werden. Mit dem biochemischen Identifizierungs-

system Api 20 NE wurden 18 weitere Isolate als P. aeruginosa identifiziert (s. Abb. 5).

Darunter befanden sich zwei Proben mit der Bewertung „ausgezeichnete Identifizierung“,

12 Proben mit „sehr guter Identifizierung“ und vier Isolate mit „guter Identifizierung“ im

Api 20 NE.

Die verbleibenden 90 Isolate (22,2 % aller Isolate), die weder anhand typischer

morphologischer Kriterien noch anhand eindeutiger Ergebnisse des Api 20 NE als

P. aeruginosa identifiziert werden konnten, wurden in die vorliegende Studie

eingeschlossen und mittels molekularbiologischer Identifizierungsverfahren untersucht. Sie

stammen aus respiratorischen Sekreten von insgesamt 25 Mukoviszidosepatienten im Alter

von zwei bis 40 Jahren.

Um die Zugehörigkeit zur Studienpopulation zu sichern, wurde zunächst bei allen 90

Isolaten der Oxidase-Test wiederholt. Dieser fiel bei allen Isolaten positiv aus. Daraufhin

wurde von allen Proben ein Gram-Präparat angefertigt. Alle Isolate färbten sich gram-

negativ, aber bei zwei Isolaten handelte es sich nicht um gram-negative Stäbchen, sondern

um gram-negative Kokken. Diese beiden Isolate wurden daher aus der Studie

ausgeschlossen. Beide Stämme wurden später als Neisseria mucosa identifiziert. Somit

wurden in der vorliegenden Arbeit insgesamt 88 Isolate mit Hilfe der 16S rRNA-Gen-

Sequenzierung identifiziert.

Für diese 88 Isolate werden in den folgenden Abschnitten (4.1.1. bis 4.1.3.) zuerst die

Ergebnisse der konventionellen Identifizierung mittels API 20 NE und die Beurteilung der

Morphologie dargestellt. Anschließend werden die Ergebnisse der molekularbiologischen

Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung dargestellt. Zuletzt werden die

Ergebnisse der konventionellen Identifizierung mit denen der molekularbiologischen

Identifzierung verglichen.

4.1.1. Konventionelle Identifizierung der Bakterien

4.1.1.1. Biochemische Identifizierung mittels Api 20 NE

Der Api 20 NE ergab nur bei 47 % der Isolate (n=41) ein eindeutiges Ergebnis mit den

folgenden Bewertungen: „ausgezeichnete Identifizierung“ (n=7; 8 %), „sehr gute Identifi-

zierung“ (n=15; 17 %) und „gute Identifizierung“ (n=19; 22 %) (s. Tab.2). Dabei wurden

Page 46: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 40

mit dem Api folgende Spezies bestimmt: Agrobacterium radiobacter, Achromobacter

xylosoxidans, Burkholderia cepacia Komplex, Comamonas testosteroni/ Pseudomonas

alcaligenes, Ochrobactrum anthropi, Photobacterium damsela, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas spp., Psychrobacter phenylpyruvicus und Ralstonia pickettii.

Bei 11 Isolaten (13 %) ergab der Api 20 NE eine „akzeptierbare Identifizierung“ und bei

36 Isolaten (41 %) nicht akzeptable Bewertungen wie „geringe Selektivität“,

„unzuverlässige Identifizierung“, „zweifelhaftes Profil“ oder „unakzeptierbares Profil“.

Tab. 2: Ergebnisse des Api 20 NE:

Bakterienstämme Anzahl

Ausgezeichnete Identifizierung 7 Agrobacterium radiobacter 2 Achromobacter xylosoxidans 1 Burkholderia cepacia 2 Pseudomonas fluorescens 2

Sehr gute Identifizierung 15 Burkholderia cepacia 12

Comamonas testosteroni/Pseudomonas alcaligenes 1

Pseudomonas fluorescens 2

Gute Identifizierung 19 Achromobacter xylosoxidans 2

Comamonas testosteroni/Pseudomonas alcaligenes 6 Ochrobactrum anthropi 2 Photobacterium damsela 3 Pseudomonas species 1 Pseudomonas fluorescens 3 Psychrobacter phenylpyruvicus 1 Ralstonia pickettii 1

Akzeptierbare Identifizierung 11 Burkholderia cepacia 1

Comamonas testosteroni/Pseudomonas alcaligenes 3 Moraxella species 1 Moraxella lacunata 1 Oligella ureolytica 1 Pasteurella species 3 Pseudomonas fluorescens 1

geringe Selektivität 25 unzuverlässige Identifizierung 4 zweifelhaftes Profil 3 unakzeptierbares Profil 4

Page 47: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 41

4.1.1.2. Morphologische Beurteilung der Isolate

Aufgrund der besonderen Bedeutung von P. aeruginosa bei Mukoviszidosepatienten

wurden alle 88 Isolate auf das Vorhandensein von einigen für P. aeruginosa

charakteristischen Eigenschaften, wie z. B. das Wachstumsverhalten bei 42 °C, die

Anwesenheit von Hämolyse, Lindenblütenduft und metallischem Glanz, untersucht

(s. Tab. 3). Diese Eigenschaften sind für P. aeruginosa zwar charakteristisch, aber nicht

bei allen Stämmen vorhanden und bislang auch als nicht genügend spezifisch für eine

eindeutige Identifikation des Erregers berichtet.

Tab. 3: Prüfung der morphologischen Eigenschaften:

Eigenschaft Anzahl der Isolate (Prozent)

Wachstum bei 42 °C

Hämolyse

Metallischer Glanz

Lindenblütenduft

Metallischer Glanz + Lindenblütenduft

69 (78 %)

37 (42 %)

24 (27 %)

15 (17 %)

11 (13 %)

4.1.2. Molekularbiologische Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung

Mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung konnte bei 87 der 88 Isolate (99 %) eine genaue

Spezies bestimmt werden (s. Tab. 4). In einem Fall war die Identifizierung nur auf Genus-

Ebene möglich (Chryseobacterium spp.). Die Spezies- bzw. Genusbestimmung erfolgte

wie in Kapitel 3 beschrieben durch einen Homologievergleich der erhaltenen 16S rRNA-

Gen-Sequenz mit den Sequenzen der GenBank-Datenbank anhand des BLAST-

Algorithmus. Zusätzlich wurde von allen auf Spezies-Ebene identifizierten Sequenzen ein

Homologievergleich mit den jeweiligen Sequenzen der definierten Typstämme (s. Kap.

3.6.4.7) durchgeführt. Die bei der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung erhaltenen Sequenzen

wiesen bis auf zwei Ausnahmen eine Homologie von > 99 % zu den Sequenzen der

jeweiligen Typstämme auf. Die beiden Ausnahmen P. putida und P. aeruginosa wiesen

Homologien von 98,9 % bzw. 98,8 % auf.

Page 48: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 42

Tab. 4: Ergebnisse der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Bakterienstämme Anzahl %

Pseudomonas aeruginosa 52 59,1

Achromobacter xylosoxidans 16 18,2

Burkholderia cepacia Komplex 10 11,4

Agrobacterium radiobacter 2 2,3

Chryseobacterium species 1 1,1

Inquilinus limosus 1 1,1

Ochrobactrum anthropi 1 1,1

Pseudomonas alcaligenes 1 1,1

Pseudomonas brassicacearum 1 1,1

Pseudomonas putida 1 1,1

Pseudomonas synxantha 1 1,1

Sphingomonas paucimobilis 1 1,1

Bei 59 % aller Isolate (n=52) handelte es sich um P. aeruginosa. Da in die Studie

ursprünglich nur Isolate aufgenommen wurden, die mittels konventionellen Methoden im

Rahmen der Routinediagnostik nicht als P. aeruginosa identifiziert wurden, ist dieses

Ergebnis überraschend. Die große Anzahl der Fehlidentifizierungen von P. aeruginosa mit

routinediagnostischen Methoden ist sehr bedeutsam, zumal eine Infektion mit

P. aeruginosa mit einer schlechten Prognose und beträchtlichen therapeutischen

Konsequenzen für den Mukoviszidosepatienten einhergeht.

4.1.3. Vergleich von konventioneller und molekularbiologischer Identifizierung

Da sich das bei der Sequenzierung erhobene Artenspektrum deutlich von dem der

biochemischen Identifizierung unterscheidet, wurden im Folgenden die Ergebnisse beider

Methoden gegenüber gestellt. Wie man Tab. 5 entnehmen kann, wurde mit dem Api 20 NE

nur bei 15 der 88 untersuchten Isolate (17 %) die korrekte Bakterienspezies erkannt. Eine

relativ gute Übereinstimmung der Ergebnisse lag nur in der Gruppe mit der Bewertung

„ausgezeichnete Identifizierung“ vor. Sogar bei den Bewertungen „sehr gute“ und „gute

Identifizierung“ traten hohe Raten an Fehlidentifizierungen auf (67 % bzw. 84 %).

Page 49: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 43

Tab. 5: Vergleich der Api 20 NE-Ergebnisse mit den Sequenzierungsergebnissen

Api 20NE Anzahl 16S rRNA Sequenzierung Anzahl

Ausgezeichnete Identifizierung 7

Agrobacterium radiobacter 2 Agrobacterium radiobacter 2

Achromobacter xylosoxidans 1 Achromobacter xylosoxidans 1

Burkholderia cepacia Komplex 2 Burkholderia cepacia Komplex 2

Pseudomonas fluorescens 2 Pseudomonas synxantha 1

Pseudomonas brassicacearum 1

Sehr gute Identifizierung 15

Burkholderia cepacia Komplex 12 Burkholderia cepacia Komplex 5

Achromobacter xylosoxidans 7

Comamonas testosteroni /

Pseudomonas alcaligenes

1 Pseudomonas alcaligenes 1

Pseudomonas fluorescens 2 Achromobacter xylosoxidans 1

Pseudomonas putida 1

Gute Identifizierung 19

Achromobacter xylosoxidans 2 Achromobacter xylosoxidans 2

Comamonas testosteroni/

Pseudomonas alcaligenes

6 Pseudomonas aeruginosa 6

Ochrobactrum anthropi 2 Ochrobactrum anthropi 1

Achromobacter xylosoxidans 1

Photobacterium damsela 3 Pseudomonas aeruginosa 3

Pseudomonas species 1 Pseudomonas aeruginosa 1

Pseudomonas fluorescens 3 Pseudomonas aeruginosa 3

Psychrobacter phenylpyruvicus 1 Pseudomonas aeruginosa 1

Ralstonia pickettii 1 Pseudomonas aeruginosa 1

Akzeptierbare Identifizierung 11

Burkholderia cepacia Komplex 1 Burkholderia cepacia Komplex 1

Comamonas testosteroni/

Pseudomonas alcaligenes

3 Pseudomonas aeruginosa 3

Moraxella species 1 Pseudomonas aeruginosa 1

Moraxella lacunata 1 Pseudomonas aeruginosa 1

Oligella ureolytica 1 Pseudomonas aeruginosa 1

Pasteurella species 3 Pseudomonas aeruginosa 3

Pseudomonas fluorescens 1 Pseudomonas aeruginosa 1

Geringe Selektivität 25 Bestätigung des API Ergebnisses 2

Unzuverlässige Identifizierung 4 Bestätigung des API Ergebnisses 0

Zweifelhaftes Profil 3 Bestätigung des API Ergebnisses 0

Unakzeptierbares Profil 4 Bestätigung des API Ergebnisses 0

Page 50: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 44

Von sieben Isolaten, die im Api 20 NE „ausgezeichnet“ identifiziert wurden, konnten fünf

durch die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung bestätigt werden. Die anderen beiden im Api als

Pseudomonas fluorescens identifizierten Isolate wurden in der Sequenzierung jedoch als

Pseudomonas synxantha und Pseudomonas brassicacearum identifiziert. Da diese beiden

Arten allerdings nicht in der Datenbank des Api 20 NE enthalten sind, wäre eine korrekte

Identifizierung mit dem Api nicht möglich gewesen.

Von den 15 „sehr gut“ identifizierten Isolaten konnten mittels Sequenzierung nur fünf

Isolate (33,3 %) bestätigt werden. Bei diesen fünf Isolaten handelte es sich um B. cepacia

Komplex. Ein Pseudomonas alcaligenes wurde im Api zumindest „halb-richtig“ als

Pseudomonas alcaligenes oder Comamonas testosteroni identifiziert. Besonders häufig

kam in der Gruppe der „sehr gut“ identifizierten Isolate Achromobacter xylosoxidans vor

(n=8), welcher im Api in sieben Fällen als Burkholderia cepacia Komplex und einmal als

Pseudomonas fluorescens fehlidentifiziert wurde.

Bei Betrachtung der 19 im Api „gut“ identifizierten Stämme fällt auf, dass nur drei Isolate

korrekt identifiziert wurden (15,8 %): zwei Achromobacter xylosoxidans und ein

Ochrobactrum anthropi. 15 Pseudomonas aeruginosa Isolate wurden fälschlicherweise für

Comamonas testosteroni oder Pseudomonas alcaligenes, Photobacterium damsela,

Pseudomonas fluorescens, Psychrobacter phenylpyruvicus oder Ralstonia pickettii

gehalten.

Unter den Isolaten mit „akzeptierbarer“ Identifizierung im Api befand sich nur ein

einziger korrekt identifizierter Stamm. Es handelte sich um ein Isolat des B. cepacia

Komplexes.

Bei den 36 Isolaten mit nicht akzeptablen Api-Ergebnissen konnte die vom Api als am

ähnlichsten vorgeschlagene Spezies nur in zwei Fällen bestätigt werden. Unter den übrigen

Isolaten mit nicht akzeptierbaren Bewertungen befanden sich 27 Pseudomonas aeruginosa,

vier Achromobacter xylosoxidans und je ein Isolat von Burkholderia cepacia Komplex,

Chryseobacterium spp. und Inquilinus limosus.

Page 51: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 45

Abb. 6: Ergebnisse des Api 20 NE bzw. der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung mit Angabe der absoluten

Häufigkeit (Anzahl) der identifizierten Stämme. Die Abkürzung P. steht für Pseudomonas und spp. für

Spezies.

Bemerkenswert am Vergleich der beiden Identifizierungsmethoden ist insbesondere, wie

viele Isolate (n=52) des pathogenetisch so bedeutsamen Erregers P. aeruginosa mit den

konventionellen Identifizierungsverfahren der Routinediagnostik übersehen wurden

(s.Abb. 6). Daher wurde im Folgenden geprüft, in wieweit die oben beschriebenen

charakteristischen morphologische Eigenschaften für die Identifizierung von P. aeruginosa

geeignet sind (Tab. 6).

0 10 20 30 40 50 60

Sphingomonas paucimobilis

Ralstonia pickettii

Psychrobacter phenylpyruvicus

Pseudomonas synxantha

Pseudomonas spp.

Pseudomonas putida

Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas brassicacearum

Pseudomonas alcaligenes

Pseudomonas aeruginosa

Photobacterium damsela

Pasteurella spp.

Oligella ureolytica

Ochrobactrum anthropi

Moraxella spp.

Moraxella lacunata

Inquilinus limosus

Comamonas testosteroni or P. alcaligenes

Chryseobacterium spp.

Burkholderia cepacia Komplex

Agrobacterium radiobacter

Achromobacter xylosoxidans

Nicht identifiziert

16S rRNA Sequenzierung

Api 20NE

Page 52: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 46

Tab. 6: Betrachtung der P. aeruginosa - Isolate und der „Nicht - P. aeruginosa“-

Isolate in Bezug auf das Vorhandensein spezieller morphologischer Merkmale

(P. = Pseudomonas; n = Anzahl)

P. aeruginosa (n=52) Nicht-P. aeruginosa (n=36)

Wachstum bei 42 °C

Hämolyse

Metallischer Glanz

Lindenblütenduft

Metallischer Glanz +

Lindenblütenduft

51 (98 %) 18 (50 %)

36 (69 %) 1 (03 %)

24 (46 %) 0

15 (29 %) 0

11 (21 %) 0

Diese Daten zeigen, dass die Merkmale „metallischer Glanz“ und „Lindenblütenduft“ eine

100 % Spezifität für die Identifizierung von P. aeruginosa haben und sich somit gut zur

Diskrimination von P. aeruginosa gegenüber anderen gram-negativen Stäbchenbakterien

eignen. Die Sensitivität der Merkmale „metallischer Glanz“ und „Lindenblütenduft“ für

die Identifizierung von P. aeruginosa liegt jedoch nur bei 46 % bzw. 29 %.

4.2. Betrachtung ausgewählter Spezies

In neueren Studien, die molekularbiologische Methoden zur Isolierung und Identifizierung

ungewöhnlicher Bakterien aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten

anwandten, wurden vermehrt seltene oder zuvor noch nicht beschriebene Bakterienspezies

und –gattungen, wie z. B. Pandoraea species, Ralstonia species, Bordetella species (z. B.

B. bronchiseptica, B. holmesii), Comamonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter,

Inquilinus limosus etc., bei Mukoviszidosepatienten nachgewiesen. Die klinische

Bedeutung dieser seltenen oder erst kürzlich entdeckten Bakterien als Infektionserreger des

Respirationstraktes von Mukoviszidosepatienten konnte bislang noch nicht hinreichend

geklärt werden. Auch Daten zur Epidemiologie dieser Bakterien fehlen weitestgehend.

Desgleichen liegen auch noch keine Erkenntnisse über den Einfluß dieser seltenen Spezies

auf andere Bakterien im Respirationstrakt des Patienten vor.

Im Folgenden soll daher genauer auf die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen

Spezies Comamonas testosteroni, Pseudomonas alcaligenes, Agrobacterium radiobacter,

Ochrobactrum anthropi und Inquilinus limosus eingegangen werden.

Page 53: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 47

4.2.1. Comamonas testosteroni und Pseudomonas alcaligenes

Bei Comamonas testosteroni und P. alcaligenes handelt es sich um wenig pathogene

Bakterien, die zur Familie der Pseudomonadaceae gehören. Berichte über Infektionen mit

diesen Erregern sind selten. In der mikrobiologischen Routinediagnostik fiel auf, dass

diese Erreger in den letzten Jahren häufiger in respiratorischen Sekreten von

Mukoviszidosepatienten nachgewiesen wurden. Im Jahr 2003 erfolgte bei 15 Isolaten der

Nachweis von Comamonas testosteroni oder P. alcaligenes im Api 20 NE. Dabei erhielt

ein Isolat die Bewertung „sehr gute Identifizierung“, sechs Isolate „gute“ und drei

„akzeptierbare Identifizierung“. Die übrigen fünf Isolate konnten diesen Spezies nur mit

„geringer Selektivitat“ zugeordnet werden. Überraschenderweise wurde mit der 16S

rRNA-Gen-Sequenzierung nur einer der 15 vermeintlichen Comamonas testosteroni oder

P. alcaligenes-Stämme als P. alcaligenes bestätigt. Die anderen 14 Isolate wurden als P.

aeruginosa identifiziert. Comamonas testosteroni scheint somit bei den Patienten, die in

der Ulmer Mukoviszidose-Ambulanz betreut werden, nicht vorzukommen. Auf den

einmaligen Nachweis von P. alcaligenes bei einem Patienten wird unter 4.2.2. noch näher

eingegangen.

Anlässlich dieser hohen Rate an Fehlidentifizierungen muß das Ergebnis des Api 20 NE

bei Nachweis der Spezies Comamonas testosteroni oder P. alcaligenes hinterfragt und ge-

gebenenfalls durch molekularbiologische Methoden, wie die 16S rRNA-Gen-

Sequenzierung, abgesichert werden.

4.2.2. Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi

Diese beiden Spezies kommen häufig in der Umwelt vor, insbesondere in Erde und

Humus. Agrobacterium radiobacter ist der häufigste, humanpathogene Vertreter der

Gattung Agrobacterium. Ochrobactrum anthropi ist eng verwandt mit der Gattung

Achromobacter. Erkrankungen durch diese Erreger umfassen insbesondere Infektionen von

zentralen Kathetern oder anderen Fremdkörpern. Auch als Verursacher von

Lungeninfektionen bei Mukoviszidosepatienten wurde Agrobacterium radiobacter

vereinzelt beschrieben. Ochrobactrum anthropi wurde nach Literaturangaben noch nicht

im Zusammenhang mit Mukoviszidosepatienten beschrieben. Daher ist über die Bedeutung

von Ochrobactrum anthropi bei Mukoviszidosepatienten noch nichts bekannt. In der

vorliegenden Arbeit wurden Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi bei

zwei Patienten gefunden:

Page 54: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 48

Bei einem 18-jährigen Patienten (Patient AP) wurde Agrobacterium radiobacter im Juli

2003 ganz vereinzelt neben vereinzeltem Vorkommen von Stenotrophomonas maltophilia

und massenhaftem Vorkommen von Staphylococcus aureus nachgewiesen. Interessanter-

weise handelt es sich hierbei um denselben Patienten, bei dem P. alcaligenes im November

2003 detektiert wurde. Weder Agrobacterium radiobacter noch P. alcaligenes waren in der

Lage, in der Lunge des Patienten zu persistieren, da sie jeweils nur an einem einzigen

Zeitpunkt isoliert werden konnten.

Abb. 7 verdeutlicht, welche anderen pathogenen Erreger in respiratorischen Sekreten des

Patienten während des Studienzeitraumes nachgewiesen wurden. Es findet sich eine

chronische Besiedlung mit Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus und

Stenotrophomonas maltophilia.

Abb. 7: Sämtliche Bakteriennachweise aus respiratorischen Proben von Patient AP im Jahr 2003

Das Untersuchungsmaterial wurde semiquantitativ kulturell angelegt und die Nachweisraten der einzelnen Erreger mit

Punkten entsprechend ihrer Häufigkeit gekennzeichnet (ganz vereinzelt = 1, vereinzelt = 2, reichlich = 3, massenhaft =

4 ).

A.= Agrobacterium; H.= Haemophilus; P.= Pseudomonas; S. aureus = Staphylococcus aureus; S. maltophilia =

Stenotrophomas maltophilia

0

2

4

6

8

10

12

17.01.20

03

14.02.20

03

03.03.20

03

17.03.20

03

01.04.20

03

28.04.20

03

10.06.20

03

04.07.20

03

21.07.20

03

05.08.20

03

20.08.20

03

03.09.20

03

25.09.20

03

21.11.20

03

Unte rsuchungsze itpunkte

Su

mm

e d

er N

ach

wei

srat

en

A. radiobacter H. influenza P. aeruginosa muk oid

P. alcaligenes S. aureus S. maltophilia

S

um

me

der

Nac

hw

eisr

aten

Page 55: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 49

Bei einer 6-jährigen Patientin (Patient AO) wurden Agrobacterium radiobacter und

Ochrobactrum anthropi an demselben Untersuchungszeitpunkt im April 2003 vereinzelt

neben reichlichem Vorkommen von Haemophilus influenzae nachgewiesen. Weitere

Spezies, die im Verlauf des Studienzeitraumes bei dieser Patientin aus Sputumproben

isoliert wurden, beinhalten Staphylococcus aureus, Stenotrophomas maltophilia und

Pseudomonas putida (s. Abb. 8). Auch bei dieser Patientin erfolgte der Nachweis von

Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi nur einmalig.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

20.0

1.20

03

03.0

2.20

03

11.0

3.20

03

10.0

4.20

03

29.0

4.20

03

27.0

5.20

03

07.0

8.20

03

01.0

9.20

03

09.0

9.20

03

Untersuchungszeitpunkte

Su

mm

e d

er N

ach

wei

srat

en

A. radiobacter Chryseomonas luteola H. influenzae

Ochrobactrum anthropi P. putida S. aureus

S. maltophilia

Abb. 8: Sämtliche Bakteriennachweise aus respiratorischen Proben von Patient AO im Jahr 2003

Das Untersuchungsmaterial wurde semiquantitativ kulturell angelegt und die Nachweisraten der einzelnen Erreger mit

Punkten entsprechend ihrer Häufigkeit gekennzeichnet (ganz vereinzelt = 1, vereinzelt = 2, reichlich =3, massenhaft =

4 ). A.= Agrobacterium; H.= Haemophilus; P.= Pseudomonas; S. aureus = Staphylococcus aureus; S. maltophilia =

Stenotrophomas maltophilia

Aufgrund der bei beiden Patienten beobachteten chronischen Besiedlung mit mehreren

pathogenen, für eine Progression der Lungenveränderungen bei Mukoviszidose relevanten

Erregern, kann die klinische Bedeutung von Agrobacterium radiobacter und

Ochrobactrum anthropi wie auch Pseudomonas alcaligenes anhand dieser beiden

Patienten nicht näher beurteilt werden. Es wurde daher auf die Auswertung klinischer

Daten sowie Laborparameter verzichtet.

S

um

me

der

Nac

hw

eisr

aten

Page 56: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 50

4.2.3. Inquilinus limosus

Bei Inquilinus limosus handelt es sich um ein im Jahre 2002 neu entdecktes gram-

negatives Stäbchenbakterium, das nicht mit den Pseudomonadaceae verwandt ist. In der

Studie von Coenye et al., in der dieses Bakterium erstmals bei acht Patienten mit Muko-

viszidose beschrieben wurde, wurde der Name Inquilinus limosus vorgeschlagen, da die

Art charakteristische schleimige Kolonien bildet (limosus (Griechisch) = schleimig). Da

diese neue Spezies erst einmalig in der obigen Veröffentlichung beschrieben wurde, ist

ihre klinische Bedeutung noch unklar. Auch das natürliche Reservoir von Inquilinus

limosus ist noch nicht bekannt, jedoch lässt seine enge Verwandtschaft zu anderen

gramnegativen, nonfermentativen Stäbchenbakterien eine Verbreitung in der Umwelt

vermuten.

Abb. 9: Ausbildung mukoider Kolonien bei Inqulinus limosus, angezüchtet auf Blutagarplatten, nach

48 - 72 - stündiger Bebrütung

Unter den Bakterien der vorliegenden Arbeit wurde Inqulinus limosus erstmals in

Deutschland nachgewiesen. Der Erreger wurde vereinzelt aus einer Sputumprobe eines 17-

jährigen Patienten isoliert, der zudem mit Staphylococcus aureus, P. aeruginosa, inklusive

der mukoiden Variante von P. aeruginosa, und Haemophilus influenzae chronisch

besiedelt war. Der Nachweis des Inquilinus limosus erfolgte nach zweitägiger Inkubation

bei 36 °C und weiteren vier Tagen Inkubation bei Raumluft auf einem Selektivagar für B.

cepacia. Das Isolat zeichnete sich durch ausgeprägte Schleimbildung (s. Abb. 9) und

Fehlen von Pigmentbildung, metallischem Glanz und Lindenblütenduft aus. Von den

Pseudomonaden und den meisten anderen gram-negativen Bakterien lässt sich Inquilinus

limosus durch fehlendes Wachstum auf MacConkey-Agar unterscheiden. Im Api 20 NE

wurde das Isolat als Sphingomonas paucimobilis mit zweifelhaftem Profil fehlidentifiziert.

Die endgültige Identifizierung erfolgte mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung, bei der sich

Page 57: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 51

eine Homologie von 99,8 % zum 16S rRNA-Gen des Inquilinus limosus–Typstammes

LMG 20952T zeigte.

Der mit Inquilinus limosus infizierte Patient wurde auch über den Zeitraum dieser Studie

hinaus in der Mukoviszidose-Ambulanz weiter betreut und es wurden bis März 2005 vier

weitere Sputumproben untersucht. Der Inquilinus limosus-Stamm persistierte über 17

Monate trotz mehrfach durchgeführter Antibiotika-Therapien zur Pseudomonas

aeruginosa-Eradikation. Möglicherweise trägt die ausgeprägte Schleimbildung dieser

Spezies zur Persistenz und zur Resistenz gegenüber Antibiotika bei. Eine Beurteilung der

klinischen Relevanz des Erregers war, analog zu den oben beschriebenen Spezies,

aufgrund der chronischen Besiedlung mit anderen pathogenen Erregern nicht möglich.

4.3. Verlaufsbeurteilung und molekulare Erregertypisierung

Wenn bei einem Patienten an mindestens zwei verschiedenen Untersuchungszeitpunkten

mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung die gleiche Bakterienspezies nachgewiesen wurde,

wurde eine molekulare Typisierung der Erreger vorgenommen. Dies diente der Klärung

der Frage, ob es sich um eine persistierende Infektion oder um eine Reinfektion mit

derselben Spezies handelte. Bei Nachweis der gleichen Bakterienspezies bei verschiedenen

Patienten wurde zusätzlich untersucht, ob die Patienten mit einem identischen Stamm

inifiziert sind, das heißt, ob möglicherweise eine Übertragung des Erregers zwischen den

Patienten stattgefunden hat. Für die Erregertypisierung wurde die Pulsfeldgelelektro-

phorese (PFGE) angewandt. Es handelt sich hierbei um eine molekularbiologische

Methode, mit der die Zugehörigkeit von Bakterienisolaten gleicher Spezies zu bestimmten

Stämmen bzw. Klonen nachgewiesen werden kann.

Ein mehrfacher Nachweis derselben Bakterienspezies fand sich bei Achromobacter

xylosoxidans, Burkholderia cepacia Komplex und Pseudomonas aeruginosa. Diese Arten

werden daher im Folgenden näher beschrieben.

4.3.1. Achromobacter xylosoxidans

Achromobacter xylosoxidans ist ein wenig pathogenes Bakterium, das eng mit Bordetella

spp. verwandt ist. Es kommt ubiquitär in der Umwelt vor und wird nur selten als

Verursacher humaner Infektionen beschrieben. Bei Mukoviszidosepatienten kann

A. xylosoxidans hingegen persistierende Infektionen bzw. chronische Besiedlungen des

Respirationstraktes auslösen. Es wird vermutet, dass dies eine Rolle bei der

Verschlechterung der pulmonalen Funktion spielt. A. xylosoxidans besitzt zwei Subspezies

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Ergebnisse 52

(ssp. xylosoxidans und ssp. denitrificans), aber bislang wurde nur die Subspezies

xylosoxidans bei Mukoviszidosepatienten nachgewiesen. Zur molekularen Epidemiologie

einzelner Stämme bei chronischen Infektionen liegen bisher nur wenige Daten vor.

In der vorliegenden Arbeit fanden sich insgesamt 16 Isolate von A. xylosoxidans unter den

88 Isolaten der Studienpopulation (18 %). Diese 16 Proben stammen von vier Patienten, so

dass 4,9 % aller 82 Patienten der Mukoviszidose-Ambulanz innerhalb des einjährigen

Studienzeitraumes besiedelt waren.

Bei allen A. xylosoxidans Isolaten handelte es sich um die Subspezies xylosoxidans. Neben

der biochemischen Identifizierung (s. Kap. 4.1.3.) bereitete bei dieser Spezies auch die

molekulare Identifizierung Schwierigkeiten: Acht A. xylosoxidans Isolate wurden mit der

16S rRNA-Gen-Sequenzierung zunächst fälschlicherweise als Alcaligenes faecalis

identifiziert. Diese Fehlidentifizierung beruhte auf einer falschen Benennung der Sequenz

AJ509012 in der GenBank-Datenbank. Bei diesem GenBank-Eintrag handelte es sich um

eine 16S rRNA-Gen-Sequenz von A. xylosoxidans, die jedoch als Alcaligenes faecalis in

der Datenbank benannt ist. Durch Homologievergleiche dieser Sequenz mit den

16S rRNA-Gen-Sequenzen der Typstämme von Alcaligenes faecalis (ATCC 8750,

GenBank-Eintrag M22508) und Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans (ATCC

9220, GenBank-Eintrag AF411021) konnte der Fehler aufgeklärt werden. Der Datenbank-

fehler (AJ509012) hatte jedoch in der Routinediagnostik dazu geführt, dass drei Isolate

fälscherlicherweise als Alcaligenes faecalis befundet worden waren (s. auch unten).

Bei drei Patienten wurde A. xylosoxidans innerhalb des einjährigen Studienzeitraumes

mehr als einmal isoliert, so dass bei diesen Patienten Verlaufsbeurteilungen durchgeführt

werden konnten, die im Folgenden dargestellt werden.

Patient A1 ist ein 12-jähriger Patient, bei den fünf A. xylosoxidans Isolate von fünf

verschiedenen Zeitpunkten zwischen April und Oktober 2003 nachgewiesen wurden. Wie

man Abb. 10, A1 entnehmen kann, lag eine persistierende Infektion mit einem einzigen

Stamm vor.

Patient A2 ist ein 31-jähriger Patient, bei dem sechs A. xylosoxidans Isolate detektiert

wurden. Diese Proben stammen von drei verschiedenen Zeitpunkten zwischen Januar und

Oktober 2003. Auch bei diesem Patienten bestand eine persistierende Infektion mit einem

einzelnen Stamm (s. Abb 10, A2). Da dieser Stamm nicht mit demjenigen von Patient A1

identisch ist, hat keine Infektionsübertragung zwischen den beiden Patienten beim Kontakt

in der Mukoviszidose-Ambulanz stattgefunden.

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Ergebnisse 53

4 5 6 7 10 1 3 10

A 1 A 2

Abb. 10: Pulsfelsgelelektrophorese-Bilder der Alcaligenes xylosoxidans Stämme (links Patient A1,

rechts Patient A2). Die Entnahmezeitpunkte der Proben sind durch weiße Striche unterteilt. Die

entsprechenden Monate des Jahres 2003 stehen in Zahlen über der jeweiligen Spur.

Bei Patient A3 (16 J.) lagen drei A. xylosoxidans Isolate an drei verschiedenen

Zeitpunkten vor. Der Api 20 NE ergab drei unterschiedliche Ergebnisse für diese Isolate

und auch die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung, die bei den ersten beiden Isolaten bereits im

Rahmen der Routinediagnostik durchgeführt worden war, ergab beste Homologien für

unterschiedliche Gensequenzen (s. Tab. 7).

Tab. 7: Identifizierungsergebnisse der Isolate von Patient A3:

Ergebnis des

Api 20 NE

Ergebnis

auf Befund

Ergebnis der Sequenzierung

(Genbank-Nummer)

Isolat 1

(07.05.03)

Alcaligenes faecalis,

unzuverlässige Identifizierung

Pseudomonas

species

Uncultured ß-Proteobacterium

(AY 695723)

Isolat 2

(22.05.03)

Alcaligenes denitrificans,

geringe Selektivität

Pseudomonas

species

Alcaligenes faecalis

(AJ 509012)

Isolat 3

(10.07.03)

Pasteurella species,

geringe Selektivität

Alcaligenes

faecalis

Alcaligenes faecalis

(AJ 509012)

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Ergebnisse 54

Die Fehlidentifizierungen der Isolate zwei und drei als A. faecalis sind auf den zuvor

beschriebenen Fehler (s. S. 51) der Sequenz AJ 509012 in der Genbank-Datenbank

zurückführen. Dieser Genbank-Eintrag war fälschlicherweise als A. faecalis benannt

worden. In Wahrheit handelte es sich aber um einen Achromobacter xylosoxidans.

Erst in der Pulsfeldtypisierung stellt man überraschenderweise fest, dass es sich allen drei

Isolaten um den gleichen Stamm handelt (s. Abb. 11).

5 5 7

Abb. 11: Pulsfeldgelelektrophorese-Bild der Alcaligenes xylosoxidans Stämme von Patienten A3. Die

Entnahmezeitpunkte der Proben sind durch weiße Striche unterteilt. Die entsprechenden Monate des Jahres

2003 stehen in Zahlen über der jeweiligen Spur.

Bei Isolat drei fällt auf, dass eine Mutation vorliegt, die zu einem höher molekularen

Restriktionsfragment geführt hat. Dennoch ist dieses Isolat nach den Interpretationsricht-

linien der PFGE (s. Kap. 3.7.6.) als zugehörig zum gleichen Stamm zu betrachten.

Zusammenfassend läßt sich über die Verlaufuntersuchungen der Infektionen mit

A. xylosoxidans sagen, dass bei allen drei Patienten persistierende Infektionen mit einem

einzigen Stamm vorlagen. Dabei veranschaulichten die PFGE-Bilder, dass jeder der drei

Patienten seinen eigenen Stamm trug. Somit konnten bei diesen drei Patienten Infektions-

übertragungen beim Kontakt in der Mukoviszidose-Ambulanz ausgeschlossen werden.

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Ergebnisse 55

4.3.2. Burkholderia cepacia Komplex

Der B. cepacia Komplex enthält neun sehr eng verwandte Spezies, die früher als

Genomovare bezeichnet wurden und sich mit der Sequenzierung des 16S rRNA-Gens nur

schwer differenzieren lassen. Sie zeigen jedoch Variationen in der Nukleotidsequenz des

1043 bp großen RecA-Gens.

In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung zehn Isolate des

B. cepacia Komplexes detektiert (11,4 % der 88 Isolate), die in der weiteren Untersuchung

mittels RecA-Gen-Sequenzierung alle als B. multivorans identifiziert wurden. Die zehn

Isolate stammen von drei verschiedenen Patienten (B1 –B3).

4 1 8 10

B 1

B 2

Abb. 12:

B 1: Burkholderia mulivorans Stamm an einem Untersuchungszeitpunkt im April 2003 von Patient B1

B 2: Burkholderia mulivorans Stämme an drei Untersuchungszeitpunkten im Jahr 2003 von Patient B2

Die Untersuchungszeitpunkte sind durch weiße Striche unterteilt. Die Zahlen über den Spuren geben den

jeweiligen Monat aus dem Jahr 2003 an, in dem die Probe entnommen wurde.

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Ergebnisse 56

Patient B1 ist eine 17-jährige Patientin, bei der nur eine einzige Sputumprobe vorlag, so

dass keine Verlaufsuntersuchung durchgeführt werden konnte. Um jedoch einen Vergleich

ihres B. multivorans Stammes mit den Stämmen der anderen Patienten durchführen zu

können und dadurch Rückschlüsse auf Infektionsübertragungen zu ermöglichen, wurde

trotzdem eine PFGE dieses einzelnen Stammes durchgeführt (s. Abb. 12, B1). Es zeigte

sich, dass die B. multivorans Stämme der drei Patienten (B1-B3) nicht identisch sind.

Patient B2 ist eine 22-jährige Patientin, bei der innerhalb von zehn Monaten drei Isolate

von B. multivorans nachgewiesen wurden. Die PFGE zeigte, dass es sich bei allen 3

Isolaten um denselben Stamm handelt (s. Abb. 12, B2) und somit eine persistierende

Infektion mit einem B. multivorans-Stamm vorlag.

Patient B3 ist ein 28-jähriger Patient, bei dem an drei aufeinanderfolgenden

Untersuchungszeitpunkten innerhalb von fünf Monaten insgesamt sechs morphologisch

unterschiedliche Isolate nachgewiesen wurden. Die molekulare Erregertypisierung ergab,

dass es sich um drei unterschiedliche Stämme handelte (s. Abb. 13). Während eine

persistierende Infektion mit Stamm A vorlag, fand sich an zwei Zeitpunkten eine

temporäre Koinfektion mit zwei verschiedenen B. multivorans Stämmen (B und C).

M 7/03 8/03 11/03

A A B A C C

Abb. 13: Burkholderia multivorans Stämme von Patient B3 an drei Untersuchungszeitpunkten im Jahr

2003. Die Untersuchungszeitpunkte sind durch weiße Striche unterteilt. In der mit M bezeichneten Spur

wurde der Marker eingesetzt. Die unterschiedlichen Stämme wurden mit A, B und C benannt.

Page 63: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Ergebnisse 57

In Abb. 13 ist erkennbar, dass im Verlauf des Jahres 2003 Koinfektionen mit unter-

schiedlichen B. multivorans-Stämmen vorlagen. Diese Erkenntnis stellt ein bisher nur

vermutetes, aber zuvor noch nicht bewiesenes Detail der molekularen Epidemiologie von

B. multivorans dar. Die beiden koinfizierenden Stämme waren nicht in der Lage, den

persistierenden Stamm zu verdrängen. In der weiteren Verlaufsbeurteilung nach Ende des

Studienzeitraumes zeigte sich zudem, dass die chronische Infektion mit dem

persistierenden Stamm auch in den folgenden neun Monaten bestand.

Aufgrund dieser besonderen Beobachtung wurde im Folgenden geprüft, ob sich die

unterschiedlichen Stämme in Bezug auf ihre morphologischen Charakteristika, ihren sog.

Phänotyp oder ihre Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika, ihren sog. Resistenztyp,

unterscheiden lassen. Dafür wurde in Abhängigkeit von morphologischen Charakteristiken

wie Koloniefarbe, Wachstumsgeschwindigkeit, Schleimbildung und Adhärenz der

Kolonien u.s.w. jedem Isolat ein morphologischer Typ von A bis E zugeordnet. Basierend

auf den Ergebnissen der Empfindlichkeitsprüfung (s. Kap. 3.5.) wurde jedes Antibiogramm

einem sogenannten Resistenztyp zugeordnet. Ein Resistenztyp unterschied sich von einem

anderen in einer abweichenden Bewertung mindestens eines Antibiotikums als sensibel,

intermediär oder resistent. Die Abweichungen betrafen dabei folgende Substanzen:

Cefotaxim, Ciprofloxacin, Levofloxacin und Meropenem.

Der Vergleich der Phänotypen (Morphologischer Typ und Resistenztyp) mit den

Genotypen (PFGE-Typen) zeigt, dass keine Korrelationen zwischen Phänotyp und

Genotyp feststellbar ist (s. Tab. 8). Somit lassen morphologische Merkmale und

Ergebnisse der Empfindlichkeitsprüfung keine Rückschlüsse auf das Vorliegen eines

bestimmten Stammes bzw. PFGE-Typs zu.

Tab. 8 : Vergleich von Morphologischem Typ, Resistenz-Typ und Pulsfeldgelelektro-

phorese (PFGE) -Typ

Date Morphologischer Typ Resistenz-Typ PFGE-Typ

7/2003 A A A

8/2003 B B A

8/2003 A B B

11/2003 C C A

11/2003 D C C

11/2003 E C C

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Ergebnisse 58

4.3.3. Pseudomonas aeruginosa

Infektionen mit P. aeruginosa sind bei Mukoviszidosepatienten sehr häufig. Mit 52

Isolaten war P. aeruginosa auch die häufigste Spezies der vorliegenden Arbeit, obwohl nur

Isolate aufgenommen wurden, die mit konventionellen Methoden nicht als P. aeruginosa

identifiziert werden konnten. Die initiale Infektion mit P. aeruginosa geht häufig in eine

chronische Infektion über, in deren Verlauf es auch zum Erwerb zusätzlicher Stämme oder

deren Verlust kommen kann. Übertragungen des Erregers auf andere Patienten bei

gemeinsamen Aktivitäten oder beim Kontakt in einer Mukoviszidose-Ambulanz sind wohl

eher selten, wurden aber berichtet. Zur Erkennung solcher Übertragungen oder zu

Entdeckung zusätzlicher Stämme ist eine molekulare Erregertypsisierung notwendig. Diese

wurde in der vorliegenden Arbeit bei sechs Patienten (P1 bis P6), bei denen P. aeruginosa

innerhalb des einjährigen Studienzeitraumes mehrmals isoliert wurde, mittels PFGE

durchgeführt (s. Abb. 14 und 15). Bei Patient P5 konnte P. aeruginosa sogar 21 Mal an elf

verschiedenen Untersuchungszeitpunkten isoliert werden.

M 9 11 1 2 3 4 5 7 8 11 2 3 7 3 10 M

P1 P2 P3 P4

Abb. 14: Pulsfeldgelelektrophorese-Bilder der an mehreren Zeitpunkten nachgewiesenen Pseudomonas

aeruginosa Stämme der Patienten P1 bis P4. Die Entnahmezeitpunkte sind durch weiße Striche unterteilt. Die Zahlen über den Spuren sind die Monate des Jahres 2003, in denen die Proben entnommen wurden. In den äußeren, mit M bezeichneten Spuren wurde der Marker eingesetzt. Bei Patient P1 wurde eine Probe von 11/2003 in den beiden rechten äußeren Spuren des Patienten versehentlich doppelt aufgetragen. Daher sind fünf Gelbanden dargestellt, obwohl Pseudomonas aeruginosa nur an vier verschiedenen Zeitpunkten isoliert wurde.

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Ergebnisse 59

M 1 1 2 3 4 4 6 7 7 10 11 12 1 3 7 M

A B A C A A A B A A A A A A A A A A A A A

P5 P6

Abb. 15: Pulsfeldgelelektrophorese-Bilder der an mehreren Zeitpunkten nachgewiesenen Pseudomonas

aeruginosa Stämme der Patienten P5 und P6. Die Entnahmezeitpunkte sind durch weiße Striche unterteilt. Die Zahlen über den Spuren sind die Monate des Jahres 2003, in denen die Proben entnommen wurden. In den äußeren mit M bezeichneten Spuren wurde der Marker eingesetzt. Die verschiedenen Stämme des Patienten P5 wurden mit A, B und C markiert.

Patienten P1 (18 J.), P2 (32 J.), P3 (26 J.) und P6 (39 J.) weisen persistierende

Infektionen mit je einem einzelnen, identischen Stamm auf, welcher sich von den Stämmen

der anderen Patienten unterscheidet (s. Abb. 14 und 15).

Patient P4 (40 J.): P. aeruginosa wurde im Jahr 2003 sowohl im März als auch im

Oktober aus respiratorischen Proben isoliert. Die PFGE zeigt, dass es sich um zwei

verschiedene P. aeruginosa Stämme handelt. Folglich kam es nach der Infektion im März

zur Eradikation von P. aeruginosa und im Oktober zur Reinfektion mit einem anderen

Stamm derselben Spezies (s. Abb. 14).

Patient P5 (36 J.): bei dieser Patientin wurde P. aeruginosa an elf Untersuchungs-

zeitpunkten im Studienzeitraum isoliert. Im PFGE-Bild erkennt man insgesamt drei

unterschiedliche P. aeruginosa Stämme (s. Abb. 15). Stamm A ist Verursacher einer

persistierenden Infektion, die Stämme B und C verursachen kurzzeitige Koinfektionen.

Das zeitliche Auftreten der Stämme A, B und C ist in Tab. 9 dargestellt:

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Ergebnisse 60

Tab. 9: Infektionsverlauf bei Patient P5 mit drei verschiedenen Pseudomonas

aeruginosa Stämmen A, B und C. Es sind die Untersuchungszeitpunkte, an denen Sputumproben

gewonnen wurden, und die Nachweise der unterschiedlichen Pseudomonas aeruginosa Stämme A, B und C

am jeweiligen Datum dargestellt.

Datum 01.01.02 17.01.03 26.02.03 12.03.03 15.04.03 30.04.03 Bis Dez.03

Stamm A A A A A A A

Stamm - B - - B - -

Stamm - - C - - - -

Zusammenfassend zeigte sich bei den Verlaufuntersuchungen der mit P. aeruginosa

kolonisierten Patienten, dass jeder der Patienten einen eigenen Stamm trug. Damit konnten

bei diesen sechs Patienten Infektionsübertragungen beim Kontakt in der Mukoviszidose-

Ambulanz ausgeschlossen werden.

4.3.3.1. API 20NE Ergebnisse von persistierenden P. aeruginosa-Stämmen

Aufgrund der hohen Unzuverlässigkeit des Api 20 NE bei der Identifizierung der

P. aeruginosa Stämme dieser Studie, stellte sich die Frage, in wieweit die Api Ergebnisse

bei einem identischen, mehrmals nachgewiesenen Stamm voneinander abweichen.

Tatsächlich unterschieden sich die Api-Ergebnisse derselben Stämme an den unterschied-

lichen Untersuchungszeitpunkten beträchtlich. Nachfolgende Auflistung zeigt die Api

Ergebnisse von den fünf persistierenden Stämmen. Dabei wurden Ergebnisse mit nicht

akzeptablen Api-Bewertungen („geringe Selektivität“, „unzuverlässige Identifizierung“,

„zweifelhaftes Profil“ oder „unakzeptierbares Profil“) nicht berücksichtigt. In Klammern

ist jeweils die Anzahl der Isolate, bei denen das jeweilige Ergebnis auftrat, aufgeführt.

- Stamm 1 (gefunden an 11 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P5, Stamm A)

Gute Identifizierung: Comamonas testosteroni/P. alcaligenes (2)

Gute Identifizierung: P. fluorescens (2)

Akzeptierbare Identifizierung: Comamonas testosteroni/P. alcaligenes (3)

Akzeptierbare Identifizierung: Moraxella lacunata (1)

Akzeptierbare Identifizierung: Pasteurella spp. (1)

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Ergebnisse 61

- Stamm 2 (gefunden an 8 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P2)

Gute Identifizierung: Photobacterium damsela (2)

Gute Identifizierung: Psychrobacter phenylpyruvicus (1)

Akzeptierbare Identifizierung: Moraxella spp. (1)

Akzeptierbare Identifizierung: Oligella ureolytica (1)

- Stamm 3 (gefunden an 3 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P3)

Gute Identifizierung: Comamonas testosteroni/P. alcaligenes (2)

- Stamm 4 (gefunden an 2 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P6)

Gute Identifizierung: Comamonas testosteroni/P. alcaligenes (1)

Akzeptierbare Identifizierung: Pasteurella spp. (1)

- Stamm 5 (gefunden an 2 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P1)

Akzeptierbare Identifizierung: P. fluorescens (1)

Page 68: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 62

5. Diskussion

Chronische Infektionen der Lunge stellen die Hauptursache für den frühen Tod von

Mukoviszidosepatienten dar (22; 67). Als Auslöser der pulmonalen Infektionen kommen

verschiedene Bakterien und Pilze in Betracht, wobei die Häufigkeitsverteilung der Erreger

je nach Alter der Mukoviszidosepatienten unterschiedlich ist (41). Die häufigsten

pathogenen Bakterien umfassen Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae,

Staphylococcus aureus und die Spezies des Burkholderia cepacia Komplexes (41; 67; 78;

89). Sie alle, aber insbesondere P. aeruginosa und B. cepacia Komplex, gehen mit einer

progredienten Verschlechterung der Lungenfunktion einher. Neben den oben genannten

Spezies können jedoch auch seltenere Bakterien, wie z. B. andere gram-negative, Oxidase-

positive nonfermentative Stäbchenbakterien, Infektionen des Respirationstraktes verur-

sachen. Viele dieser Bakterien kommen ubiquitär in der Umwelt vor.

Die Identifizierung von Bakterien erfolgt im Rahmen der mikrobiologischen

Routinediagnostik in der Regel mit konventionellen biochemischen Verfahren, wie z. B.

der Prüfung spezieller Stoffwechseleigenschaften. Die Identifizierung vieler seltener

Spezies aus respiratorischen Proben von Mukivoszidose-Patienten, insbesondere aus der

Gruppe der gram-negativen, nonfermentativen Stäbchenbakterien, ist mit konventionellen

Methoden allerdings oft schwierig und mit einer hohen Rate an Fehlidentifizierungen

verbunden (65; 87; 110; 124). Dies ist unter anderem darauf zurückzuführen, dass bei

Mukoviszidosepatienten auch phänotypisch ungewöhnliche Varianten der Bakterien

auftreten (97; 113). Molekulare Methoden umgehen das Problem der phänotypischen

Variabilität und ermöglichen auch bei phänotypisch ungewöhnlichen Varianten eine

zuverlässige Identifizierung (113; 130). Die eindeutige Identifizierung aller obligat und

fakultativ pathogenen Bakterien in respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten ist

eine notwendige Voraussetzung für die Erhebung epidemiologischer Daten, für die

Beurteilung der klinischen Relevanz der Bakterien bei Mukoviszidosepatienten und

letztendlich für eine adäquate Therapie des Patienten.

5.1. Identifizierung der Bakterienisolate

In der vorliegenden Arbeit wurden daher alle gram-negativen, Oxidase-positiven,

nonfermentativen Stäbchenbakterien aus respiratorischen Proben von Mukoviszidose-

patienten (n=88), die im Jahr 2003 im Rahmen der mikrobiologischen Routinediagnostik

Page 69: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 63

mit konventionellen Identifizierungsmethoden nicht eindeutig identifiziert werden konnten,

mittels molekularbiologischer Methoden untersucht. Alle Isolate, die anhand typischer

Morphologie und charakteristischer Eigenschaften, wie Wachstum bei 42 °C, Wachstum

auf MacConkey-Agar, Sensibilität gegenüber Colistin und Bildung von grünem Pigment

(s. auch 3.3.), im Rahmen der Routinediagnostik eindeutig als P. aeruginosa identifiziert

wurden, wurden nicht in diese Studie aufgenommen.

Die routinemäßig durchgeführten Methoden der konventionellen Identifizierung

beinhalteten sowohl die morphologische Beurteilung der Isolate, wie Pigmentbildung,

Schleimbildung und Wachstumsverhalten, als auch die biochemische Identifizierung

mittels Api 20 NE. Der Api ist eine weit verbreitete, kommerziell erhältliche

Identifizierungsmethode (70; 104).

Für die eindeutige molekularbiologische Identifizierung der Bakterien wurde in dieser

Arbeit die Sequenzierung des 16S rRNA-Gens durchgeführt. Das 16S rRNA-Gen kodiert

für die kleine Untereinheit der ribosomalen RNA. Es ist im Genom aller Bakterien in

zumeist mehreren Kopien enthalten und besitzt sowohl konstante, universelle als auch

spezifische, variable Bereiche (s. Abb.3 in Kap. 1.3.2.). Anhand dieser von Spezies zu

Spezies variierenden Bereiche erfolgt die Differenzierung der Bakterien (119). Die DNA-

Sequenzierung gilt als sehr zuverlässige Methode zur Identifizierung und taxonomischen

Einteilung von Bakterien (29; 38; 44; 119). Sie eignet sich genauso für schnell wachsende

wie für anspruchsvolle, langsam wachsende Bakterien und liefert auch bei phänotypisch

ungewöhnlichen Varianten einer Spezies sehr zuverlässige Ergebnisse (40; 130). Ein

weiterer Vorteil der DNA-Sequenzierung liegt darin, dass die Interpretation der Ergebnisse

nach objektiven Kriterien erfolgt und nicht mit subjektiven Entscheidungen verbunden ist

(115; 119).

Die Ergebnisse der in dieser Arbeit durchgeführten molekularen Identifizierung mittels

16S rRNA-Gen-Sequenzierung erlauben eine retrospektive Beurteilung der Zuverlässigkeit

der konventionellen Identifizierung der Bakterien im Rahmen der Routinediagnostik. Der

Vergleich der beiden Identifizierungsmethoden (s. Tab. 5 in Abschnitt 4.1.3.) zeigte, dass

nur eine Minderheit (17 %) der 88 untersuchten Isolate mit dem Api 20 NE korrekt

identifiziert worden war. Nur in der Gruppe mit der Api-Bewertung „ausgezeichnete

Identifizierung“ lag eine gute Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen des Api 20 NE

und der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung vor. Sogar bei den Api-Bewertungen „sehr gute

Identifizierung“ und „gute Identifizierung“ traten hohe Raten an Fehlidentifizierungen auf

(67 % bzw. 84 %).

Page 70: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 64

Diese hohen Raten an Fehlidentifizierungen betrafen verschiedene Spezies. Bei genauer

Betrachtung fielen aber drei besonders häufige Fehler des Api 20 NE auf:

Der häufigste Fehler betraf die Fehlidentifizierung von P. aeruginosa. Insgesamt wurden

52 Isolate von P. aeruginosa im Api 20 NE nicht erkannt. Auf die Bedeutung dieses

signifikanten Ergebnises wird später ausführlich eingegangen.

Der zweite häufige Fehler betraf die Fehlidentifizierung von Achromobacter

xylosoxidans als Spezies des B. cepacia Komplexes. Dieser Fehler trat sogar in den vom

Api als zuverlässig bewerteten Kategorien auf: Sieben der zwölf in der Kategorie „sehr

gute Identifizierung“ als B. cepacia Komplex identifizierten Stämme wurden in der 16S

rRNA-Gen-Sequenzierung als A. xylosoxidans identifiziert. Die Beobachtung der häufigen

Verwechselungen von A. xylosoxidans mit Spezies des B. cepacia Komplex in der

vorliegenden Arbeit bestätigt eine frühere Veröffentlichung von McMenamin et al. (87).

Desgleichen betrafen auch in einer weiteren Studie die häufigsten Fehlidentifizierungen

des Api 20 NE die Identifizierung von A. xylosoxidans, P. aeruginosa, und Steno-

trophomas maltophilia als B. cepacia Komplex (38). Ferner betrug die Rate der mittels

phänotypischer Methoden, wie u. a. dem Api 20 NE, fehlidentifizierten A. xylosoxidans in

einer Studie aus dem Jahr 2001 11 %, wobei auch hier die A. xylosoxidans-Stämme als

P. aeruginosa, B. cepacia und Stenotrophomas maltophilia fehlidentifiziert wurden (104).

Diese mehrfach berichtete hohe Rate an Fehlidentifizierungen von A. xylosoxidans ist

besonders in Hinsicht auf seine Fähigkeit zur Verursachung chronischer Infektionen und

seine bislang noch unklare klinische Relevanz bedeutsam. Schließlich ist die korrekte

Identifizierung von A. xylosoxidans Voraussetzung, um dessen Bedeutung bei

Mukoviszidosepatienten endgültig klären zu können.

Der dritte auffällige Fehler betraf die falsche Identifizierung seltener Spezies

nonfermentativer Stäbchenbakterien. Gemäß den in der Routinediagnostik erhaltenen

Api-Ergebnissen bestand die Annahme, dass einige seltenere Bakterienspezies, wie

Comamonas testosteroni und P. alcaligenes, häufiger bei Mukoviszidosepatienten

nachweisbar sind als zumeist in der Literatur angenommen wird. Beispielsweise wurden 15

der 88 Isolate im Api 20 NE als C. testosteroni/P. alcaligenes identifiziert. Allerdings

stellte sich bei der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung heraus, dass 14 der 15 Isolate im Api

fehlidentifiziert wurden und es sich in Wahrheit um P. aeruginosa handelte. Auch andere

seltene Spezies, wie z. B. P. fluorescens, waren im Api mit zu großen Häufigkeiten

identifiziert worden. Somit können die fehlerhaften Api-Ergebnisse bei dieser Gruppe der

Page 71: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 65

schwierig zu identifizierenden, nonfermentativen Stäbchenbakterien zur Überschätzung der

Häufigkeit seltenerer Spezies führen (132). In einer Studie, in der drei verschiedene,

kommerzielle Identifizierungsmethoden für gram-negative Spezies verglichen wurden,

zeigte der Api mit 92 % korrekten Identifizierungen noch die besten Ergebnisse (70).

Ebenso wurde in einer Studie von van Pelt et al. (124) die Überlegenheit des Apis unter

den kommerziell erhältlichen Identifizierungsmethoden für die phänotypische

Identifizierung von B. cepacia und P. aeruginosa beschrieben. Dennoch traten auch hier in

einer bedeutenden Anzahl Fehlidentifizierungen insbesondere von den seltenen

Nonfermentern B. gladioli und Ralstonia pickettii, aber auch Fehlidentifizierungen von

A. xylosoxidans mit Spezies des B. cepacia Komplex, auf (124).

Der häufigste und bedeutsamste Fehler war die Fehlidentifizierung von 52 Isolaten von

P. aeruginosa (59 % aller untersuchten Isolate) als verschiedene andere Bakterienspezies.

Ein Übersehen von P. aeruginosa kann für den betroffenen Patienten gravierende Folgen

haben, da es zu einer inadäquaten Therapie bzw. zum Vorenthalten der Eradikations-

therapie, die bereits bei Erstnachweis von P. aeruginosa indiziert ist, kommen kann. Auch

bei Patienten, die bereits chronisch mit P. aeruginosa infiziert sind, kann eine

Fehlidentifizierung dieser Spezies im Krankheitsverlauf bedeutende therapeutische

Konsequenzen haben. Es wurde daher in dieser Arbeit geprüft, in wie weit sich die

biochemischen Identifizierungsergebnisse bei fünf persistierenden P. aeruginosa-Stämmen

unterscheiden. Dabei zeigte sich, dass der Api 20 NE bei demselben Stamm deutlich

unterschiedliche Ergebnisse lieferte. Ein identischer P. aeruginosa Stamm wurde mit bis

zu vier verschiedenen Spezies im Api verwechselt. Beispielsweise wurde P. aeruginosa

Stamm 1 im Studienzeitraum als Comamonas testosteroni/P. alcaligenes, P. fluorescens

und Moraxella lacunata fehlidentifiziert. P. aeruginosa Stamm 2 wurde als

Photobacterium damsela, Psychrobacter phenylpyruvicus, Moraxella spp. und Oligella

ureolytica fehlidentifiziert. Diese Daten bestätigen erneut die Unzulänglichkeiten des Api

20 NE, bzw. der biochemischen Methoden für die Identifizierung phänotypisch

ungewöhnlicher Varianten von P. aeruginosa.

Um ein Übersehen von P. aeruginosa im Rahmen der Routinediagnostik zu vermeiden,

wurde in dieser Arbeit geprüft, ob das Vorhandensein bestimmter morphologischer

Eigenschaften, wie Hämolyse auf Blutagar, metallischer Glanz und Lindenblütengeruch,

eine eindeutige Identifizierung von P. aeruginosa ermöglichen. Diese Eigenschaften gelten

zwar als typisch für P. aeruginosa, werden jedoch in der Literatur nicht als so

charakteristisch beschrieben, dass sie allein, z. B. bei nicht-pigmentierten Isolaten, eine

Page 72: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 66

Identifizierung als P. aeruginosa erlauben. Im Vergleich der morphologischen Kriterien

mit den Sequenzierungsergebnissen (s. Tab. 6) zeigte sich, dass ein Teil der P. aeruginosa

Isolate der vorliegenden Arbeit tatsächlich anhand der Merkmale metallischer Glanz und

Lindenblütengeruch korrekt identifizierbar gewesen wären. Diese Merkmale wiesen eine

100 % ige Spezifität für die Identifizierung von P. aeruginosa bei Sensitivitäten von 46 %

bzw. 29 % auf (s. Tab. 6). Beide Merkmale sollten daher in den diagnostischen Algo-

rithmus konventioneller Identifizierungsverfahren von P. aeruginosa integriert werden.

Die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung als molekulares Identifizierungsverfahren lieferte in

dieser Arbeit weitaus zuverlässigere Ergebnisse als die konventionelle Identifizierung. Es

konnten 99 % der Isolate auf Speziesebene identifiziert werden. Allerdings hat die

molekulare Diagnostik auch Limitierungen. Die Ergebnisse der Sequenzierung können nur

so gut sein, wie es die benutzte Datenbasis, die für die Auswertung der Sequenzen

verwendet wird, wie z. B. die GenBank, erlaubt. Diese Limitierung zeigte sich in dieser

Arbeit sehr deutlich: Mehrere Isolate der Spezies Achromobacter xylosoxidans wurden

zunächst im Rahmen der Routinediagnostik mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung als

Alcaligenes faecalis identifiziert (s. Kap. 4.3.1, Patient A3). Diese Fehlidentifizierung

beruhte auf einer falschen Benennung der Sequenz AJ509012 in der GenBank-Datenbank.

Bei diesem GenBank-Eintrag handelt es sich um eine 16S rRNA-Gen-Sequenz von

A. xylosoxidans, die jedoch als Alcaligenes faecalis in der Datenbank bezeichnet ist. Durch

Homologievergleiche dieser Sequenz mit den 16S rRNA-Gen-Sequenzen der Typstämme

von Alcaligenes faecalis (ATCC 8750, GenBank-Eintrag M22508) und Achromobacter

xylosoxidans ssp. xylosoxidans (ATCC 9220, GenBank-Eintrag AF411021) konnte der

Fehler aufgeklärt werden. Der Datenbankfehler hatte jedoch in der Routinediagnostik dazu

geführt, dass zwei Isolate fälschlicherweise als Alcaligenes faecalis befundet worden

waren (s. Tab. 7 in 4.3.1.).

Diese Fehlidentifizierungen von A. xylosoxidans als A. faecalis in der 16S rRNA-Gen-

Sequenzierung zeigen, dass auch bei einer an sich zuverlässigen Methode die

Identifizierungsergebnisse nicht ungeprüft übernommen werden sollten. Es bedarf in

zweifelhaften Fällen einer Überprüfung durch einen Homologievergleich mit

Referenzstamm-Sequenzen. Eine weitere Unsicherheit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung

als relativ neue molekulare Identifizierungsmethode liegt darin, dass noch keine endgültige

Klarheit darüber besteht, wie viel Prozent Homologie das 16S rRNA-Gen zu einem

Typstamm haben sollte, um eine eindeutige Spezieszugehörigkeit zu bestimmen. Die

Variabilität des 16S rRNA-Gens scheint sich innerhalb unterschiedlicher Bakterien-

Page 73: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 67

gattungen und –gruppen beträchtlich zu unterscheiden. Während früher von einer

Homologie > 97 % für die Speziesbestimmung ausgegangen wurde, sind heutzutage einige

Bakterien, wie z. B. Mykobakterien und Nokardien, bekannt, die sich in weniger als 0,5 %

ihres 16S rRNA-Gens unterscheiden (30; 39; 71; 114). Eine Homologie von > 99 % zum

Typstamm der jeweiligen Spezies wird jedoch bei den meisten Bakterien, insbesondere bei

gram-negtiven Stäbchenbakterien, als ausreichend für die Speziesidentifizierung angesehen

und daher auch in dieser Arbeit berücksichtigt.

Weitere Limitierungen der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung betreffen ihre im Vergleich zur

biochemischen Identifizierung hohen Kosten und einen beträchtlichen Arbeitsaufwand, für

den zudem besonders geschultes Personal erforderlich ist. Daher ist sie für einen breiten

Einsatz in der mikrobiologischen Routinediagnostik wenig geeignet.

Es wäre deshalb sinnvoll, eine einfache und schnelle, aber dennoch zuverlässige Methode

für die Routinediagnostik von P. aeruginosa zu entwickeln. Die molekularen Verfahren

der real-time Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und der Fluoreszenz in situ

Hybridisierung (FISH) wären hierfür geeignete Kandidaten, da sie einerseits einen

spezifischen Nachweis bestimmter Bakterien mittels spezieller Fluoreszenzsonden

ermöglichen und zum anderen, basierend auf nur einer Kolonie des Bakeriums, innerhalb

weniger Stunden Ergebnisse liefern können (130). Das Testprinzip der häufig verwendeten

real-time LightCycler PCR beruht auf einer klassischen PCR, bei der zusätzlich mit

Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonukleotide als spezifische Sonden eingesetzt werden.

In der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität Ulm wurde

bereits eine real-time LightCycler PCR für den Schnellnachweis der meisten klinisch

relevanten Bakterien aus positiven Blutkulturen von Wellinghausen et al. entwickelt und

evaluiert (133). Auch in anderen Studien wurde die real-time LightCycler PCR bereits

erfolgreich in der Diagnostik von verschiedenen bakteriellen Infektionserregern eingesetzt

(66; 85; 97). Die FISH eröffnet die Möglichkeit, Nukleinsäuren in Geweben, Zellen und

Chromosomen nachzuweisen (62). Dabei lassen sich die Nukleinsäuren direkt im

biologischen Präparat, also „in situ“, lokalisieren (117). Eine einsträngige DNA-Sonde, die

spezifisch an das Zielgen bzw. an die RNA bindet, wird mit Fluoreszenzfarbstoffen

gekoppelt. Die FISH wurde bereits zur Identifizierung von Bakterien in Sputumproben von

Mukoviszidosepatienten eingesetzt (53). Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit

wurden von Wellinghausen et al. sowohl eine real-time LightCycler-PCR als auch eine

neue FISH-Sonde zur molekularen Schnelldiagnostik von P. aeruginosa in dieser

Studienpopulation von Bakterien evaluiert (132). Beide Methoden zeigten eine sehr hohe

Page 74: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 68

Sensitivität und Spezifität für die Identifizierung von P. aeruginosa. Vorteilhafterweise

benötigt die FISH keine teure technische Ausrüstung und kann somit sogar in kleineren

Laboren als günstige Methode angewendet werden. Durch beide Schnelldiagnostik-

Methoden kann ein Übersehen und eine Fehlidentifizierung von P. aeruginosa vermieden

werden. Zudem können nicht nur für die Identifizierung von P. aeruginosa, sondern auch

für andere Bakterien aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten, wie z. B.

B. cepacia Komplex oder Haemophilus influenzae, neue molekulare Methoden der

Schnelldiagnostik erfolgreich verwendet werden (31; 53; 60).

5.2. Betrachtung ausgewählter Spezies

Mittels molekularbiologischer Methoden gelang in neueren Studien vermehrt die

Isolierung und Identifizierung ungewöhnlicher, gram-negativer, nonfermentativer

Bakterien aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten. Dabei wurden seltene

oder neu entdeckte Bakterienspezies und – gattungen, wie z. B. Pandoraea spp., Ralstonia

spp., Bordatella spp. (z. B. Bordetella bronchiseptica, Bordetella holmesii), Alcaligenes

xylosoxidans, Comamonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter, Inquilinus limosus

etc., nachgewiesen (11; 16-18; 21; 109; 128; 131). Ebenso wurden in der vorliegenden

Arbeit einige Spezies, die zu seltenen Genera gehören, isoliert. Daten zur Epidemiologie

dieser seltenen oder erst kürzlich entdeckten Bakterien bei Mukoviszidosepatienten fehlen

weitestgehend. Auch die klinische Bedeutung einer Infektion oder Kolonisation mit diesen

Erregern bei Mukoviszidosepatienten sowie der Einfluss dieser Spezies auf andere

Bakterien im Respirationstrakt der Patienten konnten bislang nicht hinreichend geklärt.

Die Ergebnisse der konventionellen Routinediagnostik hatten vermuten lassen, das

Comamonas testosteroni bzw. Pseudomonas alcaligenes häufige Erreger bei Mukoviszi-

dose darstellen, da sie 15 Mal bei acht Patienten im Api nachgewiesen worden waren. Die

molekulare Identifizierung ergab jedoch, dass nur ein einziger Pseudomonas alcaligenes

der 15 Isolate korrekt identifiziert worden war. Die anderen 14 Isolate waren in Wahrheit

P. aeruginosa. Somit scheint Comamonas testosteroni unter den Patienten der

Mukoviszidose-Ambulanz Ulm nicht vorzukommen. Die Prävalenz von P. alcaligenes

betrug aufgrund des einmaligen Nachweises im Jahr 2003 unter den Patienten der

Mukoviszidose-Ambulanz Ulm 1,1 %. Diese Prävalenzrate entspricht den Prävalenzen

anderer Studien. Beispielsweise betrug der Anteil von P. alcaligenes unter allen Isolaten

aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten in einer Studie von Klinger et al.

1,3 % (67).

Page 75: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 69

P. fluorescens wurde in der vorliegenden Arbeit nach den Ergebnissen der konventionellen

Diagnostik sieben Mal nachgewiesen, aber auch hier ergab die molekulare Identifizierung,

dass nur ein einziger P. fluorescens korrekt identifiziert worden war. P. fluorescens ist ein

wenig pathogenes, ubiquitär verbeitetes Stäbchenbakterium, das vor allem in feuchtem

Milieu vorkommt (64). Im Zusammenhang mit Infektionen des Respirationstraktes von

Mukoviszidosepatienten wurde es nur selten beschrieben (113; 119), was die erhobene

Prävalenz in dieser Arbeit bestätigt.

Bersonders hervorzuheben unter den seltenen nonfermentativen Stäbchenbakterien der

vorliegenden Arbeit ist Inquilinus limosus. Dieses Bakterium wurde 2002 erstmals von

Coenye et al. in respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten in den USA entdeckt

(16). Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde Inquilinus limosus erstmals bei

Mukoviszidosepatienten in Deutschland gefunden (131).

Inquilinus limosus gehört zu den α-Proteobakterien und ist nur fern verwandt mit

Burkholderien und Pseudomonaden (16). Der Name Inquilinus limosus lässt sich auf seine

ausgeprägte Schleimbildung (limosus = schleimig) zurückführen (s. Abb. 9 in 4.2.3.). In

der vorliegenden Studie wurde Inquilinus limosus aus einer respiratorischen Probe eines

17-jährigen Patienten isoliert. Der Patient befand sich derzeit in gutem klinischem Zustand

(131). Auch über den Zeitraum dieser Studie hinaus konnte Inquilinus limosus bei diesem

Patienten über viele Monate nachgewiesen werden, obwohl zwischenzeitlich Antibiotika-

Therapien durchgeführt wurden. Inquilinus limosus besitzt somit, wie Wellinghausen et al.

erstmals gezeigt hat, die Fähigkeit, im Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten zu

persistieren (131). Es ist anzunehmen, dass die Fähigkeit zur Persistenz u. a. auf dessen

charakteristische Schleimbildung zurückzuführen ist, denn die Produktion einer dicken

Schleimschicht kann generell als Schutzbarriere gegenüber Antibiotika dienen und die

Phagozytose erschweren (61). Neben dem Nachweis von Inquilinus limosus bei dem

Patienten der vorliegenden Arbeit wurde Inquilinus limosus von Wellinghausen et al. (131)

auch bei einer 14-jährigen Patientin der Mukoviszidoseambulanz der Universitätsklinik

Ulm, die nicht in diese Studie eingeschlossen war, isoliert (131). Da die Stämme beider

Patienten in der PFGE unterschiedliche Bandenmuster aufwiesen, konnte eine gegenseitige

Übertragung ausgeschlossen werden. Eine aktuelle Veröffentlichung berichtet vom

Nachweis von Inquilinus species bei fünf Patienten aus Frankreich (13). Bei einem

Patienten lag eine transiente Besiedelung mit einem nicht-mukoiden Stamm vor, bei den

vier anderen Patienten jeweils eine persistierende Infektion mit mukoiden Stämmen. Drei

dieser vier Patienten erhielten eine antibiotische Therapie mit Imipenem, welche jedoch

Page 76: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 70

trotz in vitro getesteter Empfindlichkeit gegenüber Imipenem Inquilinus nicht eradizieren

konnte (13). Somit belegt diese Publikation die Annahme, dass die Schleimproduktion eine

wesentliche Rolle bei der Persistenz und Antibiotikaresistenz von Inquilinus spielt.

Zwei weitere selten nachgewiesene Spezies gram-negativer Nonfermenter umfassen

Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi. Beide Spezies kommen häufig

in der Umwelt vor und verursachen in erster Linie Infektionen von zentralen Kathetern

oder anderen Fremdkörpern (33; 55; 107). Agrobacterium radiobacter wurde aber auch

selten aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten isoliert (16; 37). In einer

jüngeren Studie wurden z. B. vier Isolate von Agrobacterium radiobacter gefunden (16),

worunter sich zwei identische Isolate, die zum gleichen Zeitpunkten bei zwei verwandten

Mukoviszidosepatienten nachgewiesen wurden, befanden. Diese Daten deuten somit auf

eine stattgefundene Infektionsübertragung von Patient zu Patient hin. Ochrobactrum

anthropi wurde nach Literaturangaben bislang noch nicht aus respiratorischen Proben von

Mukoviszidosepatienten isoliert. Daher liegen keine Daten zur Epidemiologie sowie zur

klinischen Bedeutung dieser Spezies bei Mukoviszidosepatienten vor.

In der vorliegenden Arbeit wurden Agrobacterium radiobacter (n=2) und Ochrobactrum

anthropi (n=1) bei zwei Patienten nachgewiesen. Interessanterweise lag bei einem der

beiden Patienten eine Koinfektion mit Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum

anthropi vor (s. Abb. 8 in Kap. 4.2.2). Beide Spezies wurden bei diesem Patienten an

demselben Untersuchungszeitpunkt im April 2003 isoliert. Gleichzeitig lag außerdem eine

Kolonisation mit Haemophilus influenzae vor. Da keine weiteren Nachweise erfolgten,

besaßen weder Agrobacterium radiobacter noch Ochrobactrum anthropi die Fähigkeit, zu

persistieren. Bei dem anderen mit Agrobacterium radiobacter kolonisierten Patienten

(s. Abb. 7) wurde innerhalb des Studienzeitraumes eine Infektion mit einer weiteren

seltenen Spezies beobachtet: Pseudomonas alcaligenes. Auch bei diesem Patienten

wurden beide Spezies nur an einem einzigen Untersuchungszeitpunkt nachgewiesen:

Agrobacterium radiobacter im Juli, P. alcaligenes im November 2003. Beide waren nicht

in der Lage, persistierende Infektionen zu verursachen. Da sich die beiden mit

Agrobacterium radiobacter besiedelten Patienten zu unterschiedlichen Terminen in der

MukoviszidoseAmbulanz vorstellten und sie untereinaner keinen Kontakt hatten, wurde

eine gegenseitige Übertragung des Erregers bei diesen Patienten als sehr unwahrscheinlich

betrachtet. Aufgrund der Tatsache, dass bei beiden Patienten zusätzlich chronische

Infektionen mit anderen für eine Progression von Lungenveränderungen relevanten patho-

Page 77: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 71

genen Bakterien vorlagen, wie z. B. Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae,

konnte die klinische Bedeutung von Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum

anthropi wie auch P. alcaligenes bei diesen Patienten nicht näher beurteilt werden. Da

bislang jedoch keine bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren der Erreger bekannt sind, ist ihre

klinische Bedeutung wahrscheinlich gering.

5.3. Verlaufsbeurteilung und molekulare Erregertypisierung

In der vorliegenden Arbeit wurde eine molekulare Erregertypisierung mittels Pulsfeldgel-

elektrophorese bei allen Isolaten einer Spezies durchgeführt, die bei demselben Patienten

an mehreren aufeinanderfolgenden Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen wurden.

Damit sollte geprüft werden, ob es sich um persistierende Infektionen mit einem einzelnen

oder ggf. auch mehreren Stämmen oder um mögliche Reinfektionen handelte. Fernerhin

wurde durch den Vergleich der PFGE-Muster von Stämmen verschiedener Patienten

untersucht, ob bei mehreren Patienten derselben Bakterienstamm einer Spezies nachweis-

bar war. Dies ließe auf gegenseitige Infektionsübertragungen beim Kontakt in der

Mukoviszidose-Ambulanz schließen.

Ein mehrfacher Nachweis derselben Spezies fand sich bei den Spezies Achromobacter

xylosoxidans, B. cepacia Komplex und P. aeruginosa.

Die Taxonomie von Achromobacter xylosoxidans unterlag in den letzten 20 Jahren

einigen Änderungen. Nachdem dieser Erreger ursprünglich der Gattung Alcaligenes

zugeordnet wurde, wurde er 1998 in die Gattung Achromobacter eingeordnet (15; 77). Vor

allem bei erwachsenen Mukoviszidosepatienten wird A. xylosoxidans immer häufiger

nachgewiesen (77; 89; 104). Die Prävalenz von A. xylosoxidans zeigt jedoch regionale

Unterschiede. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 16 Proben als A. xylosoxidans

identifiziert, die von vier Patienten stammen. Somit waren 4,9 % Prozent der 82 Patienten

der Mukoviszidoseambulanz Ulm innerhalb des einjährigen Studienzeitraums mit A. xylos-

oxidans besiedelt. Bei Burns et al. (11) waren 52 von 595 Mukoviszidosepatienten aus 69

Mukoviszidose-Ambulanzen der USA mit A. xylosoxidans kolonisiert (8,7 %). Da

A. xylosoxidans die Fähigkeit zur Persistenz im Respirationstrakt von Mukoviszidose-

patienten aufweist (11; 90; 94), treten auch chronische Infektionen mit A. xylosoxidans auf.

Temporäre Infektionen scheinen jedoch häufiger zu sein, denn in einer Studie von Tan et

al. (118) bei 370 Mukoviszidosepatienten aus England betrug die Prävalenz von

chronischen Infektionen mit A. xylosoxidans nur 2,3 % verglichen mit ca. 10 % bei

temporären Infektionen.

Page 78: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 72

Im Studienzeitraum der vorliegenden Arbeit waren drei der vier mit A. xylosoxidans

kolonisierten Patienten chronisch infiziert. Die molekulare Erregertypisierung mittels

PFGE zeigte, dass die chronischen Infektionen jeweils nur durch einen einzigen

persistierenden A. xylosoxidans-Stamm ausgelöst wurden. Diese Beobachtung wird

bestätigt durch die Daten einer Studie von Krzewinski et al. (69), in der die Mehrheit von

92 untersuchten Patienten ebenfalls nur einen einzigen A. xylosoxidans-Stamm aufwiesen.

Koinfektionen mit einem zweiten A. xylosoxidans Stamm wurden nur selten und

vorübergehend beobachtet (69). Eine ebenfalls in dieser Arbeit beschriebene Übertragung

des Erregers zwischen verschiedenen Mukoviszidosepatienten, hauptsächlich zwischen

Verwandten oder Personen mit engem Kontakt (69), konnte in der vorliegenden Arbeit

nicht bestätigt werden, da sich die PFGE-Muster der individuellen Stämme deutlich

unterschieden.

Die Bedeutung einer chronischen Infektion der Lunge mit A. xylosoxidans für den

Mukoviszidosepatienten ist bislang noch unklar, da der Einfluss von A. xylosoxidans auf

die Progression der Lungenerkrankung von Mukoviszidosepatienten noch nicht vollständig

geklärt ist. Im Jahr 2002 wurde eine retrospektive Fall-Kontroll-Studie (118) durchgeführt,

die die Assoziation von chronischen Infektionen durch A. xylosoxidans mit Morbidität und

Mortalität der Mukoviszidosepatienten untersuchte. Dabei konnte keine Korrelation

zwischen chronischer Infektion und der Prognose der Patienten gefunden werden (118).

Diese Ergebnisse allein lassen jedoch noch keine endgültige Beurteilung der klinischen

Relevanz des Erregers zu.

Die Spezies des B. cepacia Komplexes zählen zu den bedeutsamsten Erregern bei

Mukoviszidosepatienten, da Infektionen durch diese Arten mit einer deutlich verschlech-

terten Prognose des Patienten einhergehen (1; 23; 51; 73). Schon 1984 wurde in einer der

ersten detaillierten Beschreibungen der klinischen Bedeutung einer Infektion mit

B. cepacia Komplex das häufig rasch progrediente sog. Cepacia-Syndrom beschrieben

(57). Die Häufigkeiten der Spezies innerhalb des B. cepacia Komplex weisen regionale

Unterschiede auf, wobei B. cenocepacia verschiedenen Studien zufolge die häufigste

Spezies des B. cepacia Komplexes bei Mukoviszidosepatienten ist (1; 23; 63; 84; 95; 112).

Die zweithäufig isolierte Spezies ist B. multivorans (9; 24; 76; 82; 99; 123). In der

vorliegenden Arbeit zeigte sich, dass alle Patienten, bei denen eine Spezies des B. cepacia

Komplexes nachgewiesen wurde, mit B. multivorans besiedelt waren. Dies bestätigt

Page 79: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 73

kürzlich publizierte Daten, die in Europäischen Mukoviszidose-Zentren einen höheren

Anteil von B. multivorans als in Amerikanischen Zentren fanden (9; 123).

Aufgrund der besonderen klinischen Bedeutung von B. cepacia Komplex, wurde die

molekulare Epidemiologie dieser Erregergruppe bereits recht gut untersucht.

Infektionsübertragungen von B. cepacia Komplex auf andere Mukoviszidosepatienten, die

sowohl in Kliniken als auch im Rahmen von Freizeitaktivitäten stattfanden (1; 19; 27; 32;

45; 81; 88; 93; 108; 134), sind mehrfach dokumentiert. Dabei wurden Übertragungen

durch direkten Kontakt nachgewiesen, aber auch Tröpfchenübertragungen sind

wahrscheinlich. In Sputumtröpfchen können Burkholderien auf Oberflächen wie z. B.

Latex oder insbesondere Polyvinylchlorid mehr als 24 Stunden überleben (28). Bei

Nachweis einer Spezies des B. cepacia Komplexes werden daher spezifische Maßnahmen

zur Infektionsverhütung empfohlen, um andere Patienten vor Ansteckung zu schützen

(58; 75). Diese Maßnahmen umfassen neben besonderen hygienischen Vorkehrungen in

Mukovsizidose-Ambulanzen und Klinken auch die Aufklärung der Patienten und Familien,

sowie eine Isolierung des infizierten Patienten von anderen Mukoviszidosepatienten.

Dadurch konnten Übertragungen erfolgreich verhindert werden (41; 45; 134), aber leider

sind die erforderlichen Maßnahmen meist mit einer beträchtlichen sozialen Isolierung der

betroffenen Patienten verbunden. Infektionsübertragung unter den mit B. multivorans

kolonisierten Patienten konnten in der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen werden, weil

bei jedem der drei mit B. multivorans infizierten Patienten unterschiedliche Stämme

nachweisbar waren.

Bezüglich der molekularen Epidemiologie von B. cenocepacia wurden bei Mukoviszidose-

patienten sowohl persistierende Infektionen mit einem einzigem Stamm beobachtet als

auch ein Wechsel des infizierenden Stammes auf einen anderen Stamm der gleichen

Spezies oder einer anderen Spezies des B. cepacia Komplexes, das sog. “Strain

replacement“ (82). Auch Koinfektionen mit verschiedenenen Stämmen traten in seltenen

Fällen auf (45; 82). Desgleichen wurden auch bei B. multivorans persistierende Infektionen

beobachet, hier jedoch meist nur mit einem einzigen Stamm (50). Koinfektionen mit

unterschiedlichen Stämmen an einem Untersuchungszeitupunkt wurden bei B. multivorans

noch nicht beschrieben. Insgesamt sind die Daten über die molekulare Epidemiologie von

B. multivorans noch spärlich.

In der vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur Epidemiologie von B. multi-

vorans gewonnen werden. Bei einem Patienten (B3) konnten erstmals Koinfektionen mit

zwei unterschiedlichen B. multivorans Stämme nachgewiesen werden (s. Abb. 13 in

Page 80: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 74

Kap. 4.3.2.). Bei diesem Patient lag eine persistierende B. multivorans-Infektion mit einem

Stamm vor, die an zwei unterschiedlichen Zeitpunkten von Koinfektionen mit zwei

verschiedenen Stämmen begleitet wurde. Die neu erworbenen Stämme waren nicht in der

Lage, den persistierenden Stamm zu verdrängen und verursachten daher nur kurzzeitige

Koinfektionen (129). Warum diese Stämme nicht in der Lage waren zu persistierten, ist

bislang ungeklärt. Beispielsweise könnten Interaktionen mit dem persistierenden Stamm

eine Rolle spielen oder der persistierende Stamm könnte sich von nur temporär

infizierenden Stämmen durch die Expression bestimmter, noch unbekannter

Pathogenitätsfaktoren unterscheiden. Möglicherweise spielt auch die von Chu et al.

beschriebene Persistenz von B. multivorans in Makrophagen der Lunge eine Rolle (14).

Ähnliche Beobachtungen in Bezug auf die molekulare Epidemiologie von B. multivorans

wurden von Bernhardt et al. im Jahre 2003 gemacht (6). In dessen Arbeit wurde ein

Wechsel von einem initial infektionsauslösenden Stamm auf einen anderen B. mulivorans-

Stamm und der anschließende Wiedererwerb des ursprünglichen Stammes beschrieben.

Dadurch wurde bereits vermutet, dass Koinfektionen verschiedener Stämme bei

chronischen B. multivorans-Infektionen stattfinden. Diese Vermutung konnte nun durch

den Patienten B3 der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Der Nachweis der Koinfektion

in dieer Arbeit wurde wahrscheinlich durch die folgenden beiden Unterschiede im

Studiendesign möglich: Das Entnahmeintervall der Proben betrug bei Bernhardt et. al

mindestens 6 Monate, während die Sputumproben in der vorliegenden Studie in deutlich

kleineren Intervallen entnommen wurden (ca. 3 Monate). Außerdem wurden in der

vorliegenden Arbeit alle phänotypisch unterschiedlichen Isolate untersucht, wohingegen

bei Bernhardt et al. (6) nur ein Isolat an jedem Untersuchungszeitpunkt in die

Untersuchung einbezogen wurde.

Es ist bekannt, dass bei B. multivorans auffällige phänotypische Variationen vorkommen

(72; 116). Zur Klärung der Frage, ob die Koinfektionen bei Patient B3 bereits anhand

unterschiedlicher Phänotypen hätten erkannt werden können, wurden die unterschiedlichen

morphologischen Typen und die Resistenztypen mit dem jeweiligen Genotyp verglichen

(s. Tab. 8 in Kap. 4.3.2.). Es lag jdoch keine Korrelation zwischen Phänotyp und Genotyp

der B. multivorans-Stämme des chronisch infizierten Patienten B3 vor. Folglich können

Koinfektionen durch die großen phänotypischen Variabilitäten, die auch innerhalb eines

Stammes auftreten, mittels morphologischen Merkmalen nicht erkannt werden. Ebenso

kann die Anwesenheit eines spezifischen Stammes nicht mit phänotypischen

Identifizierungsmethoden untersucht werden. Die Möglichkeit von Koinfektionen mit

Page 81: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Diskussion 75

unterschiedlichen Stämmen muss bei der Interpretation von Studien zur Epidemiologie und

zum klinischen Verlauf von B. cepacia Komplex berücksichtigt werden. Nur die

molekulare Erregeridentifizierung und -typisierung kann eindeutig Aufschluss über die Art

der infizierenden Spezies und die Frage einer persistierenden Infektion geben.

Die meisten Mukoviszidosepatienten infizieren sich im Laufe ihres Lebens mit

Pseudomonas aeruginosa (41). Durch dessen Neigung zu Adhäsion und Kolonisation auf

vorgeschädigter Schleimhaut persistiert P. aeruginosa nach Erstinfektion meist in der

Lunge (127). Zahlreiche Studien zeigen, dass eine chronische Infektion mit P. aeruginosa

mit einer signifikanten Verschlechterung des klinischen Zustandes und der Prognose des

Patienten einhergeht (35; 41; 68; 102). Mit 52 Isolaten war P. aeruginosa auch die am

häufigsten isolierte Spezies der vorliegenden Studie und diejenige Spezies, die für die

meisten persistierenden Infektionen verantwortlich war.

Die P. aeruginosa-Stämme werden in der Regel aus der Umwelt erworben, und die

Patienten sind meist mit einen eigenen Stamm infiziert (12; 41). Übertragungen von

P. aeruginosa-Stämmen auf andere Mukoviszidosepatienten wurden nur selten beschrie-

ben. Meist betreffen sie Verwandte oder Patienten mit engem Kontakt im Rahmen von

gemeinsamen Freizeitaktivitäten (41; 111). Allerdings wurde 2002 eine Arbeit veröffent-

licht (4), in der eine weite Verbreitung eines einzelnen P. aeruginosa Stammes in einer

pädiatrischen Mukoviszidose-Klinik beschrieben wurde. In dieser Studie waren 65 der 152

untersuchten Patienten, also 55 % der Patienten der Mukoviszidose-Klinik, mit demselben

Genotyp von P. aeruginosa infiziert (4). Möglicherweise handelt es sich in diesem Fall um

einen P. aeruginosa-Stamm mit stärkerer Virulenz als die meisten sporadischen Stämme.

Unter den Patienten der vorliegenden Studie konnten gegenseitige Übertragungen

ausgeschlossen werden, da die molekulare Erregrtypisierung mittels PFGE darlegte, dass

alle untersuchten Patienten mit unterschiedlichen Stämmen besiedelt waren.

Zusätzlich zu chronisch infizierenden Stämmen können Mukoviszidosepatienten im Laufe

ihres Lebens auch sporadisch weitere P. aeruginosa-Stämme erwerben (92). Diese

Beobachtung konnte in der vorliegenden Arbeit bei einer Patientin (P3) bestätigt werden,

bei der P. aeruginosa an elf Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen wurde: Während ein

Stamm persistierte, lagen temporäre Koinfektionen mit zwei weiteren Stämmen vor

(s. Kap. 4.3.3., Abb.15). Bei einem weiteren Patienten (P4) wurde P. aeruginosa an zwei

Untersuchungszeitpunkten im Abstand von acht Monaten isoliert. In der PFGE zeigte sich,

dass es sich um zwei unterschiedliche P. aeruginosa Stämme (s. Abb. 14) handelte.

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Diskussion 76

Folglich hat während des Studienzeitraums eine Eradikation des ersten P. aeruginosa-

Stammes und eine anschließende Reinfektion mit einem anderen Stamm derselben Spezies

stattgefunden. Insgesamt ist zu berücksichtigen, dass in diese Studie nur morphologisch

untypische P. aeruginosa eingegangen sind, während typische Isolate (Bildung von

grünem Pigment bzw. mukoide P. aeruginosa) aufgrund des Studien-Designs ausge-

schlossen wurden (s. Abb. 5, Kap. 4.1.). Somit beziehen sich die Auswertungen zur

molekularen Epidemiologie von P. aeruginosa nur auf eine Subpopulation aller bei den

Patienten nachgewiesenen Isolate und lassen keine abschließende Beurteilung zu.

5.4. Ausblick

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass molekulare Identifizierungsmethoden,

wie die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung, den konventionellen Verfahren bei der

Identifizierung von gram-negativen, Oxidase-positiven nonfermentativen Stäbchen-

bakterien von Mukoviszidosepatienten überlegen sind. Dennoch haben auch molekulare

Verfahren Limitierungen. Beispielsweise können in öffentlich zugänglichen Gen-Daten-

banken fehlerhafte Sequenzen enthalten sein und zu Fehlidentifizierungen führen. Die

Einführung von Qualitätskontrollmaßnahmen bei der Einstellung von Sequenzen in die

Datenbanken wäre daher sinnvoll und könnte die Qualität der Datenbanken verbessern.

Auch die Einrichtung von Datenbanken, die ausschließlich Sequenzen von definierten

Bakterienstämmen und Typstämmen beinhalteten, würde die Qualität der Identifizierung

von Bakterien mittels Gensequenzierung erheblich steigern. Dieses Konzept wurde bereits

in der Ridom-Datenbank der Fa. Ridom, die wie die GenBank frei im Internet zugänglich

ist, für Mykobakterien verwirklicht.

Für die Zukunft wäre es außerdem wünschenswert, einfach durchzuführende, preisgünstige

molekulare Schnellverfahren zu entwickeln. Denkbar wäre zum Beispiel eine Ausweitung

der FISH-Methode auf den Direktnachweis von Bakterien direkt in Sputumproben.

Erhebliches Potential hat auch die Entwicklung sog. DNA-Chips. DNA-Chips bestehen aus

einem festen Trägermaterial, auf dem einzelsträngige DNA-Fragmente bekannter Sequenz

als Gensonden in regelmäßigem Muster angeordnet sind. Diese Sonden können durch

Hybridisierung an spezifische Gensequenzen der Bakterien eine schnelle, zuverlässige

Identifizierung vieler verschiedener Bakterienspezies auf nur einem Chip ermöglichen.

Moderne molekulare Nachweisverfahren könnten auch dazu beitragen, weitere, bislang

noch unbekannte Bakterienspezies, die sich biochemisch nicht identifizieren lassen, bei

Mukoviszidosepatienten nachzuweisen. Wie der Nachweis von Inquilinus limosus in der

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Diskussion 77

vorliegenden Arbeit zeigt, ist die bakterielle Vielfalt der Erreger bei Mukoviszidose-

patienten noch längst nicht vollständig bekannt. Daher ist davon auszugehen, dass das

Spektrum von Infektionserregern des Respirationstraktes bei Mukoviszidosepatienten

durch die moderne mikrobiologische Diagnostik noch eine deutliche Erweiterung erfahren

wird.

Der zunehmende Einsatz molekularer Typisierungsverfahren bei der Beurteilung der

Epidemiologie einzelner Erreger kann zudem neue Einblicke in die Dynamik von

Bakterienpopulationen bei chronischen Infektionen sowie in die Aufdeckung von

Infektionsübertragungen, sowohl im Hospitalbereich als auch bei Freizeitaktivitäten oder

innerhalb von Familien, bieten.

Das hauptsächliche Potential der modernen mikrobiologischen Diagnostik liegt jedoch

darin, zu einer verbesserten Patientenversorgung, einer Erhöhung der Lebensqualität und

letztendlich zu einem längeren Überleben von Mukoviszidosepatienten beizutragen.

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Zusammenfassung 78

6. Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine molekulare Identifizierung aller biochemisch nicht

eindeutig zu differenzierenden gram-negativen Stäbchenbakterien aus respiratorischen

Sekreten von Mukoviszidose-Patienten aus dem Jahre 2003 mittels 16S rRNA-Gen-

Sequenzierung. Der Vergleich der biochemischen Identifizierungsmethode, dem kommer-

ziellen Testsystem Api 20 NE, mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung zeigte, dass nur

17 % der 88 untersuchten Oxidase-positiven, nonfermentativen Stäbchenbakterien in der

Routinediagnostik mit dem Api 20 NE korrekt identifiziert worden waren. Von besonderer

Bedeutung ist, dass es sich beim 52 der 88 Isolaten um Pseudomonas aeruginosa handelte,

die mit dem Api 20 NE fehlidentifiziert worden waren. Ein Übersehen von Pseudomonas

aeruginosa kann aufgrund der besonderen klinischen und prognostischen Bedeutung dieses

Erregers gravierende Folgen für den Patienten haben. Die Beurteilung der morpho-

logischen Merkmale „Metallischer Glanz“ und „Lindenblütenduft“ zeigte, dass diese

Merkmale eine 100 %ige Spezifität für die Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa

haben und somit eine wertvolle Ergänzung zur konventionellen Diagnostik darstellen.

Neben Pseudomonas aeruginosa erfolgte im Api eine häufige Fehlidentifizierung von

Achromobacter xylosoxidans und Burkholderia cepacia Komplex. Die 16S rRNA-Gen-

Sequenzierung führte auf der anderen Seite zum Nachweis einiger seltener oder erst

kürzlich beschriebener Spezies bei Mukoviszidose-Patienten. So konnte beispielsweise der

erst 2002 beschriebene Erreger Inquilinus limosus erstmals in Deutschland nachgewiesen

werden. Charakteristische Merkmale dieses Bakteriums sind eine ausgeprägte Schleim-

bildung und die Fähigkeit zur Pesistenz im Respirationstrakt von Mukoviszidose-Patienten.

Bei chronischen Infektionen mit Burkholderia multivorans, Pseudomonas aeruginosa und

Achromobacter xylosoxidans wurde anhand molekularer Typisierung mittels

Pulsfeldgelelektrophorese gezeigt, dass jeder Patient mit einem oder mehreren

individuellen Stämmen infiziert ist. Übertragungen der Erreger zwischen den Patienten

wurden ausgeschlossen. Es konnten jedoch mittels Pulsfeldgelelektrophorese erstmals

temporäre Koinfektionen mit unterschiedlichen Burkholderia multivorans-Stämmen bei

einem chronisch infizierten Patienten nachgewiesen werden.

Der Einsatz molekularer Methoden stellt einen wesentlichen Fortschritt bei der

Identifizierung und Charakterisierung gram-negativer, Oxidase-positiver nonfermentativer

Stäbchenbakterien bei Mukoviszidose-Patienten dar und kann somit zu einer Verbesserung

der Therapie und Prognose der Patienten beitragen.

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Page 99: Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie ...

Danksagung 93

8. Danksagung

Mein herzlichster Dank gilt Frau PD Dr. Nele Wellinghausen für ihre hervorragende

Betreuung, ihre stets zügigen Korrekturen und ihre außerordentlich große Bereitschaft,

meine unzähligen Fragen zu beantworten. Ihr kontinuierliches, uneingeschränktes Interesse

an meiner Arbeit und ihre zahlreichen Anregungen waren mir eine große Hilfe bei der

Erstellung dieser Arbeit. Ganz besonders danken möchte ich ihr aber für ihre geduldige,

herzliche und überaus freundliche Umgangsweise mit uns Studenten.

Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Reinhard Marre, dem ärztlichen Direktor der

Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität Ulm, dass ich diese

Arbeit unter hervorragenden Arbeitsbedingungen in seiner Abteilung anfertigen durfte.

Frau Beate Wirths danke ich besonders herzlich für die Einarbeitung in sämtliche

Versuche und für ihre freundliche Unterstützung bei der praktischen Durchführung dieser

Arbeit. Mit Ihrer Erfahrung und Kompetenz war sie mir stets eine große Hilfe. Auch Frau

Ulrike Simnacher danke ich herzlich, insbesondere für die Hilfe bei der Sequenzierung.

Bei Frau Angelika Mörike möchte ich mich für die ausgezeichnete Anleitung bei der

Durchführung der PFGE bedanken.

Auch allen anderen medizinisch-technischen Assistentinnen und Mitarbeitern der

Abteilung danke ich für die freundliche Aufnahme und ständige Hilfsbereitschaft.

Zu guter Letzt danke ich meinem Freund Maximilian Merz für seine stete Motivation und

Unterstützung, für die computertechnische Hilfe und nicht zu vergessen für sein großes

Interesse an meiner Arbeit. Ebenso herzlich danke ich meinen Eltern, die mir ein

sorgloses Studium ermöglichen und mich ebenfalls während der gesamten Zeit meiner

Dissertation mit Aufmunterungen und Korrekturlesen unterstützten.

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Lebenslauf 94

9. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Geburtsdatum und -ort: 16. Januar 1981 in Düsseldorf

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Eltern: Dr. Ulrich Köthe, Apotheker

Roswitha Köthe, Apothekerin

Geschwister: Alexander Köthe, Thomas Köthe

Ausbildung:

1987- 1991 Theodor-Heuss-Grundschule, Rutesheim

1991- 2000 Gymnasium Renningen, Abschluss: Abitur

seit WS 2000/ 2001 Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm

September 2002 Physikum

August 2003 1. Staatsexamen

seit September 2003 Doktorarbeit in der Abteilung Medizinische Mikrobiologie

und Hygiene (Universität Ulm) unter der Leitung von Frau

PD. Dr. Nele Wellinghausen; Thema: „Einsatz molekularer

Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung

gramnegativer nonfermentativer Stäbchenbakterien von

Mukoviszidosepatienten“

Weitere Tätigkeiten:

seit Oktober 2004 Aushilfstätigkeiten als Arzthelferin in der dermatologischen

Praxis Dr.Schwarz, Langenau

seit April 2004 wissenschaftliche Hilfskraft in der Abteilung allgemeine

Pharmakologie und Toxikologie der Universität Ulm als

Gruppenleiterin für „POL“ (Problemorientiertes Lernen)

10/2003 - 2/2004 wissenschaftliche Hilfskraft zur Betreuung von Studenten in

der Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der

Universität Ulm

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Im Zusammenhang mit dieser Dissertation entstanden folgende Veröffentlichungen:

Wellinghausen N, Köthe J, Wirths B, Sigge A und Poppert S: Superiority of molecular

techniques for identification of gram-negative, oxidase-positive rods, including

morphologically nontypical Pseudomonas aeruginosa, from patients with cystic fibrosis.

J. Clin. Microbiol. 43: 4070-4075 (2005)

Wellinghausen N und Köthe J: Evidence of coinfection with distinct strains of

Burkholderia multivorans in a Cystic Fibrosis patient. Infection (2006) (zur Publikation

angenommen)

Wellinghausen N, Köthe J, Wirths B, Sigge A und Poppert S: Superiority of molecular

techniques for identification of gram-negative, oxidase-positive rods, including

morphologically nontypical Pseudomonas aeruginosa from Cystic Fibrosis patients.

Poster auf dem 2. Gemeinsamen Kongress der DGHM und VAAM, Göttingen, 25.-

28.09.05, veröffentlicht in Biospektrum, S. 134, MUP002 (2005)