Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes ... fileAus dem Institut für Pharmakologie,...

Aus dem

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes

Dexamethason hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Maren Irina Milewski aus Münster

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann

1. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Universitätsprofessor Dr. Dr. h. c. E. Deegen

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2006

Ein Tag wie dieser,

eine Stunde wie jene,

ein Moment wie immer

und doch ein guter Augenblick zu sagen:

Dank all denen, die mich stetig unterstützten

Abkürzungsverzeichnis


® eingetragenes Warenzeichen

°C Grad Celsius

% Prozent

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µm Mikrometer

µmol Mikromol

a Fehlerwahrscheinlichkeit

A2 Arzneistoffmenge im peripheren Kompartiment

Abb. Abbildung

ACTH Adrenocorticotropes Hormon

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization

AUC Area under the curve

AUC e.v. Gesamtfläche unter der Plasmakonzentrationskurve nach extravasaler

Applikation

AUC i.v. Gesamtfläche unter der Plasmakonzentrationskurve nach intravenöser

Applikation

AUC Standard Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve des Standardpräparates

AUC Test Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve des Testpräparates

ß Hybridkonstante

bzw beziehungsweise

C chemisches Symbol für Kohlenstoff

C Wirkstoffkonzentration

C(Grenze) Wirkstoffkonzentration des Grenzwertes

C0 Anfangskonzentration eines Arzneistoffes im Plasma

ca. circa

CBG Cortisol binding globulin

CI Chemische Ionisation

CL Clearance

CLNR extrarenale Clearance

CLR renale Clearance


cm Zentimeter

C(max) maximale Wirkstoffkonzentration

CRF Corticotropin-Releasing-Faktor

CRH Corticotropin-releasing hormone

Css Steady-State-Konzentration

D im Körper vorhandenen Gesamtarzneistoffmenge

dc/dt Eliminationsrate, ausgeschiedene Wirkstoffmenge pro Zeit

DIN Deutsche Industrie Norm

DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen

d.h. das heißt

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleinsäure

DSB Deutscher Sportbund e.V.

e.V. eingetragener Verein

EHSLC European Horserace Scientific Liaison Committee

EI Elektronen-Stoß-Ionisation (electron impact)

ELISA Enzym-linked Immunosorbent Assey

EPC effektive Plasmakonzentration

ESI Elektrospray-Ionisation

et al et alii

f Freiheitsgrade der linearen Kalibration

f absolute Bioverfügbarkeit

FAL Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft, Mariensee

FN Federation Equestre International

f r relative Bioverfügbarkeit

g Gramm

h Stunde

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HQC High Qualitiy Control Standard

HVT Hauptverband für Traber-Zucht und –Rennen e.V.

i.m. intramuskulär

i.v. intravenös

IPC irrelevante Plasmakonzentration

IS interner Standard


IUC irrelevante Urinkonzentration

k12 Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere

Kompartiment

k13 Eliminationsgeschwindigkeitskonstante für das zentrale Kompartiment

k 21 Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale

Kompartiment

ke Eliminationskonstante

kel Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

kg Kilogramm

KGW Kilogramm Körpergewicht

Konz. Konzentration

l Liter

LC-MS Liquid Chromatographie mit angeschlossenem Massenspektrometer

ln natürlicher Logarithmus

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantification

LPO Leistungsprüfungsordnung

LQC Lower quality Control Standard

m/z Masse zu Ladung Verhältnis

MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation

max maximal

MeOH Methanol

mg Milligramm

min Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

mmol Millimol

mol Mol

MQC Midrange Quality Control Standard

MRM Multi Reaction Monitoring

mRNA messenger Ribonucleinsäure

MS Massenspektrometrie

MS/MS Tandem–Massenspektrometer

MW Mittelwert


n Anzahl der Proben

n.g. nicht gemessen

n.n. nicht nachweisbar

NADA Nationale Anti Doping Agentur

ng Nanogramm

NG Nachweisgrenze

nm Nanometer

Nr. Nummer

NRHA National Reining Horse Association

pg Picogramm

pH-Wert negativ dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration

PK/PD Pharmakokinetik-Pharmakodynamik-Modell

prä appl. prä applikationem

Qx Summe der Abweichungsquadrate

R ² Regressionskoeffizient

RE relativer Fehler

rpm Umdrehungen pro Minute

s² Varianz

sb Zwischenpräzision

sec Sekunde

Std Stunde

sw Wiederholpräzision

sxo Reststandardabweichung

t 0,5 Halbwertszeit

t A Ausscheidungszeit

t A(Grenze) Ausscheidungszeit bis zum Erreichen eines Grenzwertes

t f, a vorgegebener Tabellenwert

Tab. Tabelle

TBME tertiär Butylmethylether

TINV (α; f ) t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen des Freiheitsgrades (f) sowie

der Fehlerwahrscheinlichkeit (α)

u.a. und andere

UV Ultraviolett

V1 Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment


V2 Verteilungsvolumen im peripheren Kompartiment

VB Vertrauensbereich (Konfidenzinterval)

VB0 Vertrauensbereich (Konfidenzinterval) für den Merkmalswert Null

Vd Verteilungsvolumen

Vdß Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady-State

Vss Verteilungsvolumen im Steady-State

X Mittelwert

z. B. zum Beispiel

ZNS Zentralnervensystem

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis


I. Einleitung 15

II. Literaturübersicht 16

1. Definition des Dopings 16

2. Formen des Dopings 16

3. Verdachtssymptome für Doping 17

4. Angaben zum European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC) 18

5. Pharmakokinetik und Pharmakodynamik 20

5.1. Pharmakokinetik 20

5.2. Pharmakodynamik 28

6. Glucocorticoide 30

6.1. Physiologie und Sekretion von Glucocorticoiden 30

6.2. Cortisol 31

6.3. Herstellung synthetischer Glucocorticoide 32

6.4. Dexamethason 33

6.5. Pharmakokinetik synthetischer Glucocorticoide 34

6.6. Pharmakodynamische Wirkung von Glucocorticoiden 36

6.7. Glucocorticoidester 40

6.7.1. Einteilung der Glucocorticoidester 40

6.7.2. Dexamethason-21-isonicotinat 41

7. Dexamethason als Dopingsubstanz 43

8. Prinzip der HPLC als Analyseverfahren 44

III. Material und Methoden 48

1. Versuchsaufbau 48

1.1. Testsubstanzen 48

1.2. Versuchstiere 49

Inhaltsverzeichnis

1.3. Versuchsablauf 50

1.3.1. Vorversuch 50

1.3.2. Hauptversuch 50

1.4. Probenaufbereitung und Probenlagerung 53

2. Aufbereitung der Plasma- und Urinproben 54

3. Methodenentwicklung 54

3.1. Chemikalien 54

3.2. Herstellung von Standardlösungen 55

3.3. Wahl und Herstellung des internen Standards 56

3.4. Entwicklung der angewandten Methoden 56

3.5. Chromatographie/HPLC 57

3.6. Hydrolyseversuche Urin 58

3.7. Bewertung der Methodenentwicklung 59

4. Methodenvalidierung 60

4.1. Selektivität 60

4.2. Linearität 61

4.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze 62

4.4. Richtigkeit 63

4.5. Präzision 64

4.6. Stabilität 65

4.7. Wiederfindung 66

5. Aufbereitung der Plasma- und Urinproben des Hauptversuches 67

5.1. Aufarbeitung Plasmaproben (mit täglichen Kalibrationskurven) 67

5.2. Aufarbeitung Urinproben (mit täglichen Kalibrationskurven) 68

6. Messung von Cortisol, Glucose und Kreatinin 69

6.1. Messung von Cortisol 69

6.2. Messung von Glucose 70

6.3. Messung von Kreatinin 70

7. Statistische Auswertung 71

IV. Ergebnisse 72

1. Ergebnisse der Analysemethoden 72

1.1. Massenspektrum von Dexamethason 72

1.2. Massenspektrum von Fluocortolon 73

Inhaltsverzeichnis

2. Validierung der Analysemethoden 73

2.1. Selektivität 73

2.2. Linearität 75

2.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze 77

2.4. Richtigkeit 77

2.5. Präzision 78

2.6. Stabilität 79

2.7. Wiederfindung 81

3. Überprüfung der Urinaufarbeitung 82

4. Plasma- und Urinkonzentrationen von Dexamethason 83

4.1. Plasmakonzentrationen von Dexamethason 83

4.1.1. Plasmakonzentrationen von Dexamethason nach

Voren® Suspension-Applikation 83

4.1.2. Plasmakonzentrationen von Dexamethason nach

Voren®-Depot-Applikation 85

4.2. Urinkonzentrationen von Dexamethason 87

4.2.1. Urinkonzentrationen von Dexamethason nach


4.2.2. Urinkonzentrationen von Dexamethason nach


5. Plasmakonzentrationen von Cortisol und Glucose 90

5.1. Plasmakonzentrationen von Cortisol 90

5.1.1. Plasmakonzentrationen von Cortisol nach


5.1.2. Plasmakonzentrationen von Cortisol nach


5.2. Plasmakonzentrationen von Glucose 93

V. Diskussion 96

1. Eignung der gewählten Analysemethoden 96

2. Plasma- und Urinkonzentrationen von Dexamethason 98

2.1. Plasmakonzentrationen 98

2.2. Urinkonzentrationen 103

2.3. Pharmakokinetische Berechnungen 106

Inhaltsverzeichnis

3. Beeinflussung des Cortisolspiegels durch Dexamethason 108

4. Beeinflussung des Glucosespiegels durch Dexamethason 112

5. Vergleichende Bewertung der erzielten Ergebnisse 113

6. Bewertung der Ergebnisse bezüglich ihrer Dopingrelevanz 115

VI. Zusammenfassung 123

VII. Summary 125

VIII. Literaturverzeichnis 127

IX. Tabellenverzeichnis 146

X. Abbildungsverzeichnis 151

XI. Anhang 156

Einleitung

15

I. Einleitung

In den letzten Jahren findet das Thema Doping im Pferdesport gesteigerte Beachtung. Dies

bedeutet, dass speziell im Bereich therapeutisch eingesetzter Medikamente bei Sport– und

Rennpferden eine Verbesserung des Kenntnisstandes und des Datenmaterials bezüglich

Pharmakokinetik, Nachweisdauer und Eliminationszeiten der verwendeten Arzneistoffe

erzielt werden muss, um positive Dopingbefunde nach einer notwendigen

Arzneimittelapplikation zu vermeiden.

Die Relevanz der hier beschriebenen Studie zeigt sich darin, dass sowohl der Kenntnisstand

als auch verfügbare Daten über den Wirkstoff Dexamethason, ein vielfach eingesetztes

Glucocorticoid, bezüglich der oben erwähnten Gesichtspunkte unzureichend und lückenhaft

sind. Praktisch tätige Tierärzte können insbesondere bei der Behandlung von Sportpferden

nicht mit eindeutiger Sicherheit eine Aussage darüber machen, wann ein Sportpferd nach

vorheriger Verabreichung eines Medikamentes, in diesem Fall Dexamethason, wieder in

einem Wettkampf eingesetzt werden darf. Den Tierärzten müssen geeignete Daten und

Informationen über die Nachweiszeiten eines Wirkstoffes und seiner Abbauprodukte zur

Verfügung gestellt werden, damit eine tierärztliche Betreuung nicht gegen die bestehenden

Dopingreglementierungen der einzelnen Pferdesportverbände verstößt. Dopingrichtlinien im

Pferdesport sollen einen fairen Wettkampf gewährleisten, das Wohlergehen des Pferdes

schützen und die Pferdezucht vor einem Wertverlust bewahren. Auch fordern das

Tierschutzgesetz, sowie auch die erwähnten Dopingreglementierungen, dass zum Turnier-

oder Rennzeitpunkt keine leistungsbeeinflussenden und damit dopingrelevanten Substanzen

nachgewiesen werden dürfen.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Ausscheidungsverhalten von Dexamethason an Pferden

untersucht werden. Plasma- und Urinproben der an der Studie beteiligten Pferde wurden

gewonnen, und anschließend im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule in

Köln mit einer vorher entwickelten Methode untersucht. Neben der Bestimmung der

Dexamethasonkonzentrationen wurden auch die Konzentrationen von Cortisol und Glucose

erfasst, um die Wirkung von Dexamethason auf diese Parameter genauer zu untersuchen.

Mit Hilfe dieser Untersuchungen sollte zum einen geprüft werden, ob Aussagen zu

Ausscheidungszeiten beziehungsweise Absetzfristen für den Arzneistoff Dexamethason

gemacht werden können, zum anderen sollte am Beispiel von Dexamethason versucht

werden, einen Ansatz für ein mögliches Lösungsmodell für die Stoffgruppe der

Glucocorticoide hinsichtlich ihrer Dopingproblematik zu bieten.

Literaturübersicht

16

II. Literaturübersicht

1. Definition des Dopings

Nach UNGEMACH (1985) ist Doping als die Verabreichung eines jeden Mittels an Mensch

oder Tier definiert, das geeignet ist, die aktuelle und natürliche Leistungsbereitschaft, in

diesem Falle eines Pferdes, zum Rennzeitpunkt zu verändern. Eine Verabreichung eines

solchen Mittels ist verboten. Ebenfalls verboten ist die Verabreichung von Mitteln, welche

den Nachweis verbotener Substanzen beeinträchtigen können (KLUGE, 2002). KLUGE

(2002) verdeutlicht weiterhin, dass ein Pferd als gedopt zu bezeichnen ist, wenn bei den

Dopingkontrollen eine beliebige Menge einer verbotenen Substanz oder einer ihrer

Metaboliten im Gewebe oder in den Körperflüssigkeiten nachgewiesen wird. Insbesondere

sind die in den Dopinglisten der einzelnen Pferdesportverbände aufgeführten Substanzen

verboten, die ihre pharmakologischen Wirkungen direkt oder indirekt als Haupt- oder

Nebenwirkung entfalten (KLUGE, 2002). Zu erwähnen sind hier vor allem die Angaben der

Deutschen Reiterlichen Vereinigung (FN) in der Leistungsprüfungsordnung (LPO), dem

Regelwerk für den Deutschen Turniersport in der Fassung vom 1. Januar 2004, die

Rennordnung des Direktoriums für Vollblutzucht des Jahres 2002, sowie die Satzung und

Ordnung des Hauptverbandes für Traber-Zucht und -Rennen e.V. (HVT), welche am

01.02.2003 ihre Gültigkeit erlangte. Eine detaillierte Ausführung und vergleichende

Gegenüberstellung dieser soeben erwähnten Regelwerke erfolgte bereits durch HAMMER

(2004).

2. Formen des Dopings

Die unerlaubte Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit kann im

Pferdesport unter verschiedenen Zielsetzungen erfolgen. UNGEMACH u. NÜRNBERGER

(1999) treffen folgende Einteilung:

1. Doping auf Sieg (akute, chronische, paradoxe Form)

2. Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit

3. Doping mit körpereigenen Substanzen

4. Physikalisches Doping

Literaturübersicht

17

5. Doping auf Niederlage

6. unabsichtliches Doping

7. Maßnahmen zur Erschwerung des Dopingnachweises

Die unter Punkt eins bis vier erwähnten Formen werden laut UNGEMACH u.

NÜRNBERGER (1999) auch als positives Doping zusammengefasst, Doping auf Niederlage

ist dagegen negatives Doping. Neben diesen beiden am häufigsten vorkommenden

Dopingarten finden sich auch Fälle von unabsichtlichem Doping sowie die Anwendung von

Maßnahmen, die den Dopingnachweis erschweren. Fälle von unbeabsichtigtem Doping

beruhen meist auf der Unkenntnis über die Pharmakologie bzw. die Pharmakokinetik eines

verabreichten Stoffes (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Als Maßnahmen zur

Erschwerung des Dopingnachweises werden Mittel eingesetzt, die die Diurese steigern

(SCHOENE, 1996).

Der in dieser Arbeit zu untersuchende Wirkstoff Dexamethason fällt nach beabsichtigter

Applikation aufgrund seiner pharmakologischen Eigenschaften unter den Gesichtspunkt

„Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit“. Jedoch sind aufgrund von

unzureichender Kenntnisse bezüglich Pharmakokinetik, Nachweisdauer und

Eliminationszeiten von Dexamethason auch Fälle von „unabsichtlichem Doping“ zu finden.

3. Verdachtssymptome für Doping

Bei Pferdesportveranstaltungen, Pferderennen und Turnieren erfolgt die Auswahl der zu

beprobenden Pferde für die in den Reglementierungen der jeweiligen Verbände

vorgeschriebenen Dopingkontrollen nach dem Zufallsprinzip oder auf begründeten Verdacht.

Die Kontrollen erfolgen durch den zuständigen Turnier- oder Rennbahntierarzt.

UNGEMACH u. NÜRNBERGER (1999) fassen in Tabelle 1 klinisch feststellbare Symptome

bzw. Anzeichen dafür, ob ein Pferd gedopt ist, und die jeweils mögliche ursächliche

Manipulation zusammen.

Literaturübersicht

18

Klinische Symptome Mögliche Manipulation Lokale Schwellungen, Einstichstellen, Schweißflecken

Injektion

Unkontrollierte Reaktionen, Unruhe, Übererregbarkeit

Psychoanaleptika

Zwangsbewegungen Weckamine Ängstlichkeit, Schnauben Apomorphin Sedation Ataraktika, Neuroleptika Ganganomalien Opioide Hyperthermie Weckamine Hypothermie Neuroleptika erhöhte Puls- und Atemfrequenz Psychoanaleptika Salivationshemmung Weckamine Hemmung der Schweißsekretion Opioide Penisvorfall Neuroleptika Mydriasis Weckamine, Opioide Harnverhalten Opioide, Neuroleptika Hengstigkeit bei Stuten Anabolika sprunghafte Formverbesserung Analgetika, Glucocorticoide Außenseitersieg, fehlende Ermüdung Psychoanaleptika, Opioide Tabelle 1: klinische Verdachtssymptome und mögliche Manipulation für Doping bei Pferden

(nach UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999)

4. Angaben zum European Horserace Scientific Liaison Committee (EHSLC)

Wie von der INTERNATIONAL FEDERATION OF HORSERACING AUTHORITIES

(2005) dargelegt, lässt sich die Entwicklung sowie die Zielsetzung des EHSLC wie folgt kurz

beschreiben:

Im Jahr 1991 diskutierten Rennsportvereinigungen aus Frankreich, Großbritannien und Irland

eine Strategie, um potentiellen Problemen im Hinblick auf den Gebrauch von verbotenen

Substanzen entgegen treten zu können. Sie entschieden sich für eine Verbesserung von

Kooperation und Zusammenarbeit bezüglich der Dopingproblematik im Pferdesport.

Aus dieser Idee heraus wurde 1992 das European Horserace Scientific Liaison Committee

(EHSLC) gegründet. 1999 traten auch Deutschland und Italien dem EHSLC bei.

Ziele des EHSLC sind es, das technische Vorgehen und die Vorschriften von

Dopingkontrollen zu harmonisieren, die Zusammenarbeit der beteiligten Nationen im

Hinblick auf Vermeidung von Dopingfällen zu verbessern, sowie ein länderübergreifendes

Forum zum Informationsaustausch zu schaffen. Meinungen und Sichtweisen bezüglich

Dopingkontrollen sollen vereinheitlicht werden, so dass ein gemeinsamer Standpunkt

Literaturübersicht

19

repräsentiert werden kann (EHSLC, 1997). Übergeordnete Absicht ist es, eine einheitliche

Basis zu schaffen, so dass jedes Pferd, in welchem dieser fünf Länder es auch immer an den

Start geht, samt seiner Belange in der gleichen Art und Weise behandelt wird (EHSLC, 1997).

Vertreter der zum EHSLC gehörigen Nationen sowie die Laboratorien des Jockey Clubs

Hongkong und des Jockey Clubs von Südafrika befassen sich mit genau dieser Thematik.

Hierzulande wird durch Zusammenarbeit des European Horserace Scientific Liaison

Committee (EHSLC) und der Deutschen Reiterlichen Vereinigung (FN) ein Schritt in diese

Richtung ermöglicht. Mittels einheitlich aufgebauter pharmakologischer Studien soll,

ergänzend zu den bisher üblichen Untersuchungen auf Vorhandensein von dopingrelevanten

Substanzen, versucht werden, pharmakologische Effekte von therapeutisch eingesetzten

Substanzen zu kontrollieren. Diese Kontrolle erfolgt in Form von Festlegung einer Grenze, ab

der die untersuchte Substanz keine Wirkung mehr hat. Ein geeignetes Modell zur

pharmakologischen und pharmakokinetischen Bewertung eines Wirkstoffes wurde von

TOUTAIN u. LASSOURD (2002) vorgeschlagen. Dieses Pharmakokinetik-

Pharmakodynamik-Modell (PK/PD-Modell) basiert auf der Berechnung einer effektiven

Plasmakonzentration (EPC) eines Stoffes. Mittels Umrechnung der effektiven

Plasmakonzentration wird eine ineffektive und somit irrelevante Plasmakonzentration (IPC)

bestimmt. Die Umrechnung erfolgt mit Hilfe eines Sicherheitsfaktors. Dieser

Sicherheitsfaktor von 500 ergibt sich aus einem Faktor 50, der EPC in IPC umrechnet,

multipliziert mit einem Faktor 10, welcher die individuellen Unterschiede des Einzeltiers mit

einbezieht. Aus der so errechneten irrelevanten Plasmakonzentration wird wiederum eine

irrelevante Urinkonzentration (IUC) abgeleitet. Dieses PK/PD-Modell wurde bereits für

verschiedene pharmakokinetische Studien bei Pferden angewandt (TOUTAIN u.

LASSOURD, 2003).

Pharmakokinetische Berechnungen nach dem PK/PD-Modell von TOUTAIN u. LASSOURD

(2002) sind im Falle der in dieser Studie behandelten Glucocorticoide nicht möglich, da ihre

Wirkung, wie später noch detailliert beschrieben, erst „zeitversetzt“ eintritt.

Literaturübersicht

20

5. Pharmakokinetik und Pharmakodynamik

5.1. Pharmakokinetik

Die Pharmakokinetik beschäftigt sich mit den Einflüssen des Organismus auf das Pharmakon

(DOST, 1968). Sie beschreibt Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und Ausscheidung

eines Pharmakons in Abhängigkeit von der Zeit. Nach KOCH u. RITSCHEL (1986) fallen

unter den Gesichtspunkt der Invasion, und somit des Eindringens des Pharmakons in den

Organismus, die Begriffe der Liberation, der Resorption und der Distribution, während die

Evasion bzw. die Ausscheidung des Pharmakons mittels der Begriffe der Metabolisierung und

der Elimination beschrieben wird.

Die Invasion beginnt demnach mit der Liberation, der Freisetzung des Wirkstoffes aus der

Arzneiform, welche im Wesentlichen durch die galenische Zubereitung bestimmt ist. Nach

erfolgter Freisetzung schließt sich, im Falle von nicht intravasaler Applikation, die Resorption

des Wirkstoffes in die Blut- oder Lymphbahn an. Ausmaß und Geschwindigkeit der

Resorption hängen von der Liberationsgeschwindigkeit des Wirkstoffes, der Applikationsart,

den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Arzneistoffes, der Stoffkonzentration am

Applikationsort sowie vom physiologischen Zustand des Patienten ab (KOCH u. RITSCHEL,

1986).

Nach PFEIFER et al. (1984) sind bei der Resorption durch die Biomembranen des

Organismus mehrere Transportmechanismen zu betrachten. Die passive Diffusion, eine reine

Lipiddiffusion, Diffusion bzw. Filtration durch Poren, der Carrier-vermittelte Transport, auch

aktiver Transport oder erleichterte Diffusion genannt, und der vesikuläre Transport mittels

Zytopempsis. Bezüglich der Resorptionsgeschwindigkeit unterscheidet man zwischen einem

Prozess 0. Ordnung und einem Prozess 1. Ordnung (KOCH u. RITSCHEL, 1986). Bei einer

Resorption 0. Ordnung wird eine konstante Menge des Pharmakons pro Zeiteinheit resorbiert.

Dies ist zum Beispiel bei Inhalationsnarkotika im Steady-State der Fall. Hingegen wird bei

einer Resorption 1. Ordnung pro Zeiteinheit nur eine bestimmte Fraktion des sich an der

Applikationsstelle befindlichen Pharmakons aufgenommen, z.B. bei oraler, subkutaner oder

intramuskulärer Applikationen. Abbildung 1 verdeutlicht die Formen der Resorptionskinetik.

Literaturübersicht

21

Zeit

Kon

zent

ratio

n

Zeit

Kon

zent

ratio

n

Abb. 1: Resorptionskinetik 0. Ordnung (links), Resorptionskinetik 1. Ordnung (rechts)

KOCH u. RITSCHEL (1986) definieren den Begriff der Bioverfügbarkeit als den Anteil eines

Arzneistoffes, der in den Blutkreislauf gelangt. Eine vollständige Bioverfügbarkeit liegt nach

intravenöser Applikation vor. Nach oraler und somit extravasaler Verabreichung beträgt die

Bioverfügbarkeit weniger als 100 % (FICHTL et al., 1996). Die Berechnung der

Bioverfügbarkeit erfolgt mit Hilfe der Fläche unterhalb der Plasmakonzentrationskurve (Area

Under the Curve, AUC), welche proportional zur Menge des Arzneistoffes ist.

Nach KOCH u. RITSCHEL (1986) vergleicht man die Fläche unter der Kurve des

Plasmakonzentrationsverlaufs (AUC) nach extravasaler (z.B. oraler) Applikation mit der

AUC nach intravenöser Applikation, um die absolute Bioverfügbarkeit (f) eines Arzneimittels

zu ermitteln.

f = i.v.e.v.

AUCAUC

f = absolute Bioverfügbarkeit

AUC e.v.= Gesamtfläche unter der Plasmakonzentrationskurve nach extravasaler Applikation

AUC i.v.= Gesamtfläche unter der Plasmakonzentrationskurve nach intravenöser Applikation

Die relative Bioverfügbarkeit (f r) ergibt sich aus dem Vergleich von zwei verschiedenen

Arzneimittelformulierungen bei identischer Applikationsart:

f r = Standard

Test

AUCAUC

f r = relative Bioverfügbarkeit

AUC Test = Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve des Testpräparates

AUC Standard = Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve des Standardpräparates

Literaturübersicht

22

Nach DOST (1968) erstreckt sich die Verteilung des Pharmakons auf das Plasma, den

Extrazellularraum, den Extra- und Intrazellularraum und auf die Anreicherung in bestimmten

Geweben. Stoffeigenschaften wie Lipophilie, Molekülgrösse, Plasma- und

Gewebsproteinbindung beeinflussen die Verteilung. Maßgebende Faktoren von Seiten des

Organismus sind die Organdurchblutung, die Durchlässigkeit von Membranen sowie die pH-

Wert-Verhältnisse der Gewebe.

Das Verteilungsvolumen beschreibt, in welchem Volumen sich ein Wirkstoff bei einer

gemessenen Konzentration verteilen würde. Es ist eine fiktive Größe und wird deswegen auch

als „scheinbares“ Verteilungsvolumen bezeichnet (GLADTKE u. VON HATTINGBERG,

1977). Mit Hilfe des Verteilungsvolumen (Vd), einem Proportionalitätsfaktor zwischen der im

Körper vorhandenen Arzneistoffmenge (D) und der Anfangskonzentration im Plasma (C0),

wird die Verteilung des Arzneistoffes auf die Körperkompartimente direkt nach der

Arzneimittelapplikation beschrieben (KOCH u. RITSCHEL, 1986).

Vd [l/kg] = ]/[]/[

lmgCkgmgD

�

Vd = Verteilungsvolumen

D = im Körper vorhandenen Arzneistoffmenge

C0 = Anfangskonzentration eines Arzneistoffes im Plasma

Wird eine definierte Menge eines Wirkstoffs intravenös appliziert, befindet sich die

verabreichte Dosis im Blut. Das initiale Verteilungsvolumen (Vd) ist also gering, bei einem

geringen Quotienten aus der Gesamtmenge (D) und einer initial hohen Plasmakonzentration

(C0).

Im weiteren Verlauf findet eine Verteilung des Wirkstoffes vom Blut in andere Gewebe statt,

was demzufolge auch zu einer Änderung des Quotienten Vd führt. Dieser wird größer. Nun ist

nur noch ein Teil der applizierten Gesamtmenge des Wirkstoffes im Plasma zu finden, so dass

das Verteilungsvolumen in der Verteilungsphase entsprechend größer ist als in der

Initialphase (FICHTL et al., 1996). Ein Vd > 1 [l/kg] kann für eine Anreicherung des

Pharmakons in bestimmten Geweben sprechen. Nach abgeschlossener Verteilung des

Pharmakons wird für kurze Zeit ein konstantes Verhältnis zwischen Gesamtmenge und

Plasmakonzentration erreicht. Dieser Gleichgewichtszustand zwischen Input und Output wird

auch als Steady-State (Vss) bezeichnet (KOCH u. RITSCHEL, 1986). Die Geschwindigkeit

Literaturübersicht

23

dieser Gleichgewichtseinstellung wird, wie später noch erklärt, durch

Geschwindigkeitskonstanten (k12 und k21) bestimmt, und nach folgender Formel berechnet:

Vss [l/kg] = )1(21

12

kk+

Vss = Verteilungsvolumen im Steady-State

k 12 = Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment

k 21 = Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment

Während der Elimination des Wirkstoffes aus dem zentralen Kompartiment kommt es dort zu

einer Abnahme der Konzentration. Der entstandene Konzentrationsgradient zwischen

peripherem und zentralem Raum bewirkt eine Diffusion des Wirkstoffes aus dem peripheren

in den zentralen Raum. Dieser Zustand wird auch als Pseudo-Steady-State bezeichnet

(DERENDORF et al., 2002), in welchem sich der Organismus wie ein Ein-Kompartiment-

Modell verhält. Der Plasmaspiegel fällt linear ab, was mit der Hybridkonstanten (ß)

beschrieben werden kann.

Das entsprechende scheinbare Verteilungsvolumens (Vdß) kann als Quotient aus Clearance

(CL) und der Hybridkonstanten (ß) beschrieben werden (DERENDORF et al., 2002):

Vdß [l/kg] = β

CL

Vdß = Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady-State

CL = Clearance

ß = Hybridkonstante

Im Rahmen der Metabolisierungsprozesse kommt es zum durch chemischen Umbau der

Ausgangsstoffe zur Verbesserung der Exkretionsfähigkeit, zum anderen zur Inaktivierung

oder Aktivierung von Ausgangsstoffen. Diese von FAIGLE (1981) beschriebenen Vorgänge

erfolgen als Phase 1-Reaktionen und Phase 2-Reaktionen. In der Phase 1-Reaktion kommt es

durch Oxidation, Reduktion und Hydrolyse zu Veränderungen am Molekül, so dass das

Molekül zu einer stärker polaren Verbindung wird (FAIGLE, 1981). Die Phase 2-Reaktion

dagegen vermittelt eine Konjugation bzw. eine Kopplung von Muttersubstanzen und den in

Phase 1-Reaktion entstandenen Verbindungen an Glucuronsäure, Schwefelsäure,

Carbonsäuren, Aminosäuren und Glutathion, wodurch eine verbesserte renale und biliäre

Literaturübersicht

24

Ausscheidung der nun unwirksamen Kopplungsprodukte erreicht wird. Diese Phase 1- und

Phase 2-Reaktionen finden hauptsächlich in der Leber statt.

Laut KOCH u. RITSCHEL (1986) gibt es mehrere Eliminationswege, z.B. den renalen, den

biliären, den intestinalen, den pulmonalen Weg sowie die Elimination über Speichel,

Schweiß, Milch und Eier. Die Elimination aus dem Organismus kann, ebenso wie die

Resorption, nach einem Prozess 0. Ordnung oder einem Prozess 1. Ordnung verlaufen

(KOCH u. RITSCHEL, 1986). Bei einer Elimination 0. Ordnung wird pro Zeiteinheit dieselbe

Menge eines Wirkstoffes eliminiert. Prozesse 1. Ordnung sind die Regel. Hierbei handelt es

sich um eine konzentrationsabhängige Elimination. Abbildung 2 stellt die beiden Arten der

Eliminationskinetik gegenüber.

Zeit

Kon

zent

ratio

n

Zeit

Kon

zent

ratio

n

Abb. 2: Eliminationskinetik 0. Ordnung (links), Eliminationskinetik 1. Ordnung (rechts)

Ein zentraler Begriff, der die Elimination beschreibt, ist die Clearance (CL). Sie beschreibt

die Fähigkeit eines Organismus einen Wirkstoff zu eliminieren (RETTING, 1981). Nach

DERENDORF et al. (2002) entspricht die totale Clearance dem Volumen einer

Körperflüssigkeit, welches vom Wirkstoff befreit wird. Der Quotient aus der Eliminationsrate

(dc/dt), welche die ausgeschiedene Wirkstoffmenge pro Zeit beschreibt, und der

Wirkstoffkonzentration (C) gibt an, welche Menge Plasma pro Minute von einer Substanz

vollständig befreit wird.

CL [ml/min] = ]/[

min]/[/mlmgC

mgdd tc

CL = Clearance

dc/dt =Eliminationsrate, ausgeschiedene Wirkstoffmenge pro Zeit

C = Wirkstoffkonzentration

Literaturübersicht

25

Die Eliminationsleistung wird, wie bereits erwähnt, hauptsächlich durch die Nieren und die

Leber geleistet. Man unterscheidet zwischen der renalen und der hepatischen Clearance

(FICHTL et al., 1996). Nach SAMS (1992) gibt die hepatische Clearance Aufschluss über die

Verstoffwechslung und Exkretion lipophiler Substanzen, wohingegen die renale Clearance für

die Elimination von hydrophilen Stoffen steht.

Die totale Clearance (CL) ergibt sich durch Summierung der renalen Clearance (CLR) und der

extrarenalen Clearance (CLNR), welche sich wiederum aus der hepatischen Clearance und der

Clearance aller anderen an der Elimination beteiligten Organe zusammensetzt.

Im Zuge der Elimination sei auch ein weiterer wichtiger Begriff erklärt, der die Ausscheidung

eines Pharmakons mitbestimmt, nämlich die Halbwertszeit (t 0,5) Als Halbwertszeit wird die

Zeit bezeichnet, nach der sich die Konzentration eines Pharmakons um die Hälfte ihres

ursprünglichen Ausgangswertes verringert hat (DERENDORF et al., 2002). Nach FREY

(2002) ist die Halbwertszeit eines Stoffes im Organismus proportional zum

Verteilungsvolumen (Vd) und umgekehrt proportional zur Clearance (CL), wobei

Verteilungsvolumen und Clearance voneinander unabhängige Parameter sind. Es besteht

folgende Beziehung:

t 0,5 [h] ~ CLVd

t 0,5 = Halbwertszeit

Vd = Verteilungsvolumen

CL = Clearance

Laut DERENDORF et al. (2002) ist eine Veränderung der Halbwertszeit auf eine

Veränderung der Clearance oder des Verteilungsvolumens zurückzuführen.

Weiterhin lässt sich die Halbwertszeit auch über die Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

(kel) ableiten. Die Eliminationsgeschwindigkeitskonstante (kel) beschreibt das Verhältnis

zwischen dem natürlichen Logarithmus von 2 und der Halbwertszeit (t 0,5):

k el = 5,0t2ln ⇒ t 0,5 [h] =

elk2ln

t 0,5 = Halbwertszeit

ln 2 = 0,693

k el = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

Literaturübersicht

26

Neben der Halbwertszeit ist weiterhin die Ausscheidungszeit (tA) von Interesse. Sie beschreibt

die Zeit, die vergeht, um einen Wirkstoff bis zu einem gewissen Grenzwert aus dem

Organismus zu eliminieren. Mittels folgender Gestzmäßigkeit kann die Ausscheidungszeit bis

zum Erreichen eines Grenzwertes (t A(Grenze)) beschrieben werden (KIETZMANN, 1983):

t A(Grenze) [h] = e

)((max)

klnln GrenzeCC −

t A(Grenze) = Ausscheidungszeit bis zum Erreichen eines Grenzwertes

ln C(max) = natürlicher Logarithmus der maximalen Wirkstoffkonzentration

ln C(Grenze) = natürlicher Logarithmus der Wirkstoffkonzentration des Grenzwertes

k e = Eliminationskonstante

Zum Verständnis des zeitlichen Verlaufs der Konzentrationen eines Pharmakons in Blut,

Plasma und Exkreten bedient man sich so genannter „Kompartiment-Modelle“ (FICHTL et

al., 1996). Die Kompartimente stellen allerdings nur eine vereinfachte Form der

physiologischen Abläufe dar, sie haben keine direkte physiologische Entsprechung. Nach

KOCH u. RITSCHEL (1986) sind Kompartimente die verschiedenen Verteilungsräume des

tierischen Organismus, z.B. der extrazelluläre Raum, das gesamte Körperwasser (extrazellulär

und intrazellulär) und der intravavsale Raum. Arzneimittel können sich im einfachsten Fall

auf ein einziges dieser Kompartimente, in anderen Fällen jedoch auf zwei oder mehrere

Kompartimente verteilen. Die pharmakokinetischen Modelle lassen sich durch die oben

beschriebenen mathematischen Parameter der Halbwertszeit, der Clearance, des

Verteilungsvolumens und der Bioverfügbarkeit beschreiben (FICHTL et al., 1996).

a) Offenes-1-Kompartiment-Modell (intravenöse Injektion)

Bei diesem vereinfachten Modell wird der gesamte Körper als ein Verteilungsraum

angesehen. Eine injizierte Dosis (D) verteilt sich unmittelbar im gesamten

Verteilungsvolumen (Vd). Aus dem Kompartiment wird das Pharmakon nach einer

Kinetik 1. Ordnung eliminiert. Die Geschwindigkeit der Elimination wird mit Hilfe

der oben bereits erwähnten Geschwindigkeitskonstanten (kel) beschrieben, welche das

Verhältnis zwischen dem natürlichen Logarithmus von 2 und der Halbwertszeit (t 0,5)

darstellt.

Literaturübersicht

27

b) Offenes-1-Kompartiment-Modell (intravenöse Infusion)

Per Dauerinfusion gelangt eine konstante Menge eines Pharmakons pro Zeiteinheit in

das Kompartiment. In diesem Fall liegt eine Invasion des Arzneimittels nach einer

Kinetik 0. Ordnung vor. Die Elimination läuft nach einer Kinetik 1. Ordnung ab, so

dass sich eine Steady-State-Konzentration (Css) einstellt. Die Geschwindigkeit zur

Einstellung dieses Steady-State hängt von der Eliminationsgeschwindigkeitskonstante

(kel) ab.

c) Offenes-1-Kompartiment-Modell (extravasale Applikation)

Bei einer extravasalen Applikation, d.h. bei einer oralen, intramuskulären oder

subkutanen Applikation, ergibt sich die Konzentration des Pharmakons im

Kompartiment aus der gleichzeitig ablaufenden Resorption (Kinetik 1. Ordnung) und

Elimination (Kinetik 1. Ordnung). An- und Abflutung des Wirkstoffes überlagern sich

bei dieser Modellvorstellung.

d) Mehrfachkompartiment- Modelle

Aus dem zentralen Kompartiment verteilt sich das Pharmakon mit unterschiedlicher

Konzentration in die anderen Kompartimente. Der Übertritt des Pharmakons vom

zentralen ins periphere bzw. vom peripheren ins zentrale Kompartiment wird durch

die Geschwindigkeitskonstanten (k12 und k21) verdeutlicht. Die Elimination wird

wiederum mittels der Eliminationsgeschwindigkeitskonstanten (kel bzw. k13)

beschrieben. Dabei unterliegen die Hin- und Rückverteilung zwischen den

Kompartimenten sowie die Elimination aus dem zentralen Kompartiment einer

Kinetik 1. Ordnung. Auch bei diesen Mehrfachkompartiment-Modellen unterscheidet

man zwischen intravasaler und extravasaler Applikation.

Abbildung 3 zeigt die Verhältnisse nach intravasaler Applikation.

Literaturübersicht

28

Abb. 3: schematische Darstellung einer intravasalen Applikation im Zwei-Kompartiment-

Modell ( nach KOCH u. RITSCHEL, 1986)

1 = zentrales Kompartiment

2 = peripheres Kompartiment

C = Wirkstoffkonzentration im Blut

V1 = Verteilungsvolumen im zentralen Kompartiment

V2 = Verteilungsvolumen im peripheren Kompartiment

k 12 = Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom zentralen ins periphere Kompartiment

k 21 = Geschwindigkeitskonstante, Übertritt vom peripheren ins zentrale Kompartiment

k13 = Eliminationsgeschwindigkeitskonstante für das zentrale Kompartiment

A2 = Arzneistoffmenge im peripheren Kompartiment

5.2. Pharmakodynamik

Die Pharmakodynamik beschreibt die Einflüsse des Pharmakons auf den Organismus (PÖCH

u. JUAN, 1985). Die Pharmakodynamik wird durch die Konzentration des Arzneistoffes, die

Ansprechbarkeit von Rezeptoren auf das Arzneimittel sowie durch die nicht rezeptor-

vermittelten Wirkungen des Arzneistoffes bestimmt (FREY, 2002).

Um die Wirkung eines Pharmakons in einer bestimmten Dosierung bestimmen zu können,

trägt man die Zahlenwerte gemessener Wirkungen gegen die zugehörigen Dosen auf und

erhält eine Dosis-Wirkung-Beziehung (SCHELER, 1980). Für die meisten Pharmaka lässt

sich eine Dosis-Wirkung-Beziehung erstellen, wobei bei zunehmender Dosis eine

zunehmende Wirkung festgestellt werden kann. Im mittleren Bereich der Dosis-Wirkung-

Kurve stellt sich meist ein annähernd linear verlaufender Kurvenabschnitt dar. Dieser ist laut

FREY (2002) der therapeutisch interessante Konzentrationsbereich, denn hier besteht eine

nahezu logarithmische Abhängigkeit von Dosis und Wirkung. Nach PÖCH u. JUAN (1990)

kann aus einer Dosis-Wirkung-Beziehung die für bestimmte Wirkungen erforderliche Dosis,

das Ausmaß der Wirkung und die eigentliche Dosis-Wirkung-Beziehung entnommen werden.

Literaturübersicht

29

Die Wirkung der meisten Arzneimittel wird, wie bereits erwähnt, über Rezeptoren vermittelt

(PÖCH u. JUAN, 1990). Durch eine reversible, selten durch eine irreversible Bindung des

Pharmakons an den Rezeptor, entsteht ein Rezeptor-Wirkstoff-Komplex. Rezeptor-Wirkstoff-

Komplexe können verschiedener Natur sein und somit unterschiedliche Wirkungen auslösen

(FREY, 2002). Anhand der Lokalisation der Rezeptoren an der Effektorzelle lassen sich

membranständige Rezeptoren, zytoplasmatische Rezeptoren und Kernrezeptoren

unterscheiden, anhand der Rezeptorart die Klasse-1-Rezeptoren und die Klasse-2-Rezeptoren.

Klasse-1-Rezeptoren, auch schnelle Rezeptoren genannt, sind aus mehreren Untereinheiten

bestehende Makromoleküle, die ihre Wirkung durch Öffnung oder Schließen von

spannungsabhängigen Ionenkanälen vermitteln. Klasse-2-Rezeptoren hingegen sind langsame

Rezeptoren, die ihrerseits Second-Messenger-Systeme aktivieren oder hemmen und somit

eine indirekte Wirkung vermitteln. Bei dem für Steroidhormone typischen, und in Kapitel

II.6.5. näher beschriebenen Weg über zytoplasmatische Rezeptoren bindet der entstandene

Rezeptor-Wirkstoff-Komplex an kernständige DNA und greift somit in die Proteinsynthese

der Zelle ein. Die daraus resultierenden Wirkungen sind aber meist der Zahl der tatsächlich

besetzten Rezeptoren nicht proportional. Maximale Wirkungen werden oft schon ausgelöst,

wenn nur ein Teil der Rezeptoren durch Moleküle des Pharmakons besetzt ist (FRIMMER,

1986).

Die Wirkung am Rezeptor kann durch die Begriffe Affinität und der intrinsischen Aktivität

beschrieben werden. Die Affinität bezeichnet die Anzahl der besetzten Rezeptoren (FREY,

2002), die dem Pharmakon innewohnende Wirkung am einzelnen Rezeptor wird auch als

intrinsische Aktivität bezeichnet (FRIMMER, 1986). Mit Hilfe dieser Begriffe der Affinität

und der intrinsischen Aktivität lässt sich nun das mögliche Verhalten eines Pharmakons an

einem Rezeptor veranschaulichen. An der Efffektorzelle kann ein Pharmakon als Agonist,

partieller Antagonist und Vollantagonist fungieren (FRIMMER, 1986). Agonisten haben

meist eine hohe intrinsische Aktivität und auch eine günstige Affinität zum Rezeptor.

Antagonisten hemmen umso stärker, je größer ihre Affinität zum Rezeptor bei fehlender

intrinsischer Aktivität ist. Sie verdrängen Agonisten vom Rezeptor, ohne selbst wirksam zu

sein. Partielle Antagonisten stellen einen fließenden Übergang zwischen Agonisten und

Antagonisten dar. Sie besitzen lediglich eine geringe intrinsische Aktivität.

Nach FREY (2002) ist eine Reihe von Arzneimittelwirkungen nicht durch einen Rezeptor

vermittelt, sondern Folge direkter physikalischer oder auch chemischer Einwirkungen auf die

Literaturübersicht

30

physiologischen Vorgänge im Körper. So wirken beispielsweise osmotische Diuretika,

Abführmittel, Antacida und auch Desinfektionsmittel ohne eine vorherige Rezeptorbindung.

6. Glucocorticoide

6.1. Physiologie und Sekretion von Glucocorticoiden

In den Nebennieren werden verschiedene Hormone gebildet. Über 50 Steroide werden

synthetisiert, wovon nur einige biologische Effekte zeigen (MAC HARG et al., 1985). Nach

ihrer biologischen Wirkung lassen sie sich in drei Hormonklassen einteilen:

a. Glucocorticoide

b. Mineralocorticoide

c. Androgene

Die Mineralocorticoide und die Glucocorticoide werden zu der übergeordneten Gruppe der

Corticosteroide zusammengefasst (SCHIMMER u. PARKER 2001; THUN u. SCHWARTZ-

PORSCHE, 1992).

Die Glucocorticoide werden überwiegend in der Zona fasciculata, die Mineralocorticoide in

der Zona glomerulosa und die Androgene in der Zona reticularis der Nebennierenrinde

gebildet (FICHTL et al., 2001). Sie werden ohne vorherige Speicherung ins Blut abgegeben.

Alle Glucocorticoide sind Derivate des aus 21 C-Atomen bestehenden Pregnan (LUTZ,

1988), das aus Cholesterol gebildet wird. Das Grundgerüst des Cholesterols ist ein Steran,

welches aus drei miteinander kondensierten sechsgliedrigen Ringen und einem fünfgliedrigen

Rind besteht.

Nach MUNCK et al. (1984) wird die Sekretion der Glucocorticoide durch das aus dem

Hypophysenvorderlappen stammende Adrenocorticotrope Hormon (ACTH) stimuliert,

welches wiederum durch den aus dem Hypothalamus freigesetzten Corticotropin-Releasing-

Faktor (CRF) kontrolliert wird. Steigende Blutkonzentrationen von körpereigenen oder

exogenen Glucocorticoiden sowie Stress greifen durch negative Rückkopplung in diesen

Regelkreis ein (SENDELBECK u. YATES, 1970). Ein erhöhter Glucocorticoidspiegel hemmt

die Freisetzung von CRF. Der Stimulus zur ACTH-Ausschüttung fällt somit weg, was

folglich die Synthese von endogenem Cortisol verhindert.

Literaturübersicht

31

6.2. Cortisol

Cortisol ist auch unter dem Synonym Hydrocortison bekannt. Der chemische Name ist

11,17,21-Trihydroxy-,(11beta)-pregn-4-ene-3,20-dione, die Summenformel lautet C21H30O5

und ergibt die in Abbildung 4 dargestellte Strukturformel. Die Molekularmasse beträgt 362,47

g/mol, der Schmelzpunkt liegt bei 217-220 °C (MERCK INDEX, 2001).

Abb. 4: Strukturformel Cortisol

Das Cortisol ist beim Pferd der Hauptvertreter der endogenen Glucocorticoide. Insgesamt

gesehen repräsentiert Cortisol beim Pferd 90 % der zirkulierenden Corticoide (IRVINE et al.,

1988; COVALESKY et al., 1992). Als weitere endogene Glucocorticoide kommen Cortison

und Corticosteron in unterschiedlichen Anteilen vor. Das Verhältnis von Cortisol zu

Corticosteron liegt nach IRVINE et al. (1988) bei 7:1. Laut UNGEMACH (2002) ist Cortison

pharmakologisch inaktiv, womit dessen Wirkungsvoraussetzung eine intakte Leberfunktion

ist, da Cortison in der Leber zu den physiologisch aktiven Formen Cortisol und Corticosteron

umgesetzt wird (KLAUS u. HAPKE, 1996). Diese Umwandlung erfolgt rasch, bei einer

Halbwertszeit des unveränderten Cortisons von ca. 30 Minuten. In der Konzentration von 10 -

10 bis 10 -7 mol/l ist Cortisol physiologisch wirksam (MUNCK, 1968).

Die Cortisolsekretion erfolgt pulsatil im circadianen Rhythmus (FICHTL et al., 2001).

Zwischen 3 und 10 Uhr steigt die Cortisolkonzentration im Blut steil an. Im Laufe des

Nachmittags ist ein beginnender Abfall ist zu beobachten, welcher zwischen Mitternacht und

3 Uhr seinen Tiefpunkt erreicht. LANE (1986) fand beim Pferd tageszeitliche Schwankungen

von 30 bis 57 ng/ml Plasma, GYLSTROFF u. HEGNER (1983) von ca. 40 bis 80 ng/ml

Plasma. Bei Pferden kann, in Abhängigkeit von Tageszeit und Belastung, eine

O

CH3

CH3

HO OH

CO CH2OH

Literaturübersicht

32

Cortisolkonzentration von 25 bis 65 ng/ml Plasma als normal angesehen werden (KLAUS u.

HAPKE, 1996).

Im Plasma ist Cortisol zu mehr als 90 % an verschiedene Proteine gebunden. Davon sind etwa

75 % an Transcortin, ein spezifisches Corticosteroid-bindendes Globulin (CBG) gebunden,

weitere 15 % sind unspezifisch an Albumin gebunden. Lediglich 10 % des Cortisols

zirkulieren frei. Nach BALLARD (1979) ist nur freies, nicht proteingebundenes Cortisol

physiologisch wirksam.

Nach UNGEMACH (2002) kann beim Pferd von einem Verteilungsvolumen von 0,3 l/kg

ausgegangen werden. Als weitere pharmakologische Eigenschaft des Cortisols ist die

Eliminationshalbwertszeit von 78-96 Minuten zu nennen, wobei die Cortisolmetaboliten zu

mehr als 99 % als Glucuronide über die Nieren ausgeschieden werden und nur zu etwa 0,5 %

als freies Cortisol im Urin erscheinen (FICHTL et al., 2001).

Mit der Entwicklung von synthetischen Glucocorticoiden hat Cortisol als Arzneimittel an

Bedeutung verloren und ist heute als Tierarzneimittel nur noch zur äußeren Anwendung auf

dem Markt (UNGEMACH, 2002).

6.3. Herstellung synthetischer Glucocorticoide

Cortisol und Cortison dienen bei der Herstellung neuer Glucocorticoide als Ausgangssubstanz

(FICHTL et al., 2001). Bereits kleine chemische Modifikationen am Grundgerüst des

Cortisols können Absorptionsrate, Wirkungsbeginn und Wirkpotenz wesentlich beeinflussen

(SCHIMMER u. PARKER, 2001). Durch Einführung einer zweiten Doppelbindung im ersten

Ring zwischen dem C-1-Atom und dem C-2-Atom entstanden aus Cortisol und Cortison

Prednisolon und Prednison, die ersten synthetischen Glucocorticoide (FICHTL et al., 2001).

Die meisten synthetischen Glucocorticoide leiten sich von Prednisolon ab.

Die Struktur und die Seitenketten des Glucocorticoidgrundgerüstes haben ebenfalls einen

Einfluss auf die Stärke der entzündungshemmenden, sowie der mineralocorticoiden Wirkung

und auf die Wirkungsdauer nach Erreichen des Wirkortes (UNGEMACH, 2003; FERGUSON

u. HOENIG, 2001). So konnten durch Einführung von Halogenatomen, Methylgruppen sowie

durch Hydroxylierung bzw. Dehydrogenierung mit Bildung neuer Doppelbindungen weitere

synthetische Glucocorticoide hergestellt werden. Doppelbindungen potenzieren die

glucocorticoide Wirkung, Methylierung verringert die mineralocorticoide Wirkung und eine

Halogenierung verlängert die Wirkdauer. Somit zeigen synthetische Glucocorticoide

gegenüber den natürlichen Glucocorticoiden eine deutliche Steigerung der glucocorticoiden

Literaturübersicht

33

Wirkung und zugleich eine Verringerung der unerwünschten mineralocorticoiden Wirkung

(THUN u. SCHWARTZ-PORSCHE, 1992; NEUMANN et al., 1998). Speziell durch die

Synthese von Glucocorticoiden, die ein Fluor- (Dexamethason) oder Chloratom

(Beclomethason) am C-9-Atom tragen kommt es nicht nur zur Erhöhung der Affinität zum

Glucocorticoidrezeptor, und somit zu Verbindungen mit ausgeprägter

entzündungshemmender Wirkung und sehr geringer Natriumretention, sondern auch zur

Verlangsamung der Metabolisierung, was eine dementsprechend längere Wirkdauer zur Folge

hat. Als weitere halogenierte Glucocorticoide sind Betamethason, Fluticason, Flumethason

und Triamcinolon zu nennen (HOGGER, 2003; THUN u. SCHWARTZ-PORSCHE, 1992).

6.4. Dexamethason

Dexamethason (9α-Fluor-16α-metylprednisolon) zählt zur Gruppe der synthetischen

Glucocorticoide. Die zugehörige Summenformel lautet C22H29FO5, die Molekularmasse liegt

bei 392,45 g/mol und der Schmelzpunkt ist mit 262-264 °C angegeben. Der freie Wirkstoff ist

bei 25 °C in Wasser, jedoch schlecht in Alkohol löslich (MERCK INDEX, 2001).

O

OH OH

O OH

F

Abb. 5: Strukturformel Dexamethason

Dexamethason (Abbildung 5) gehört durch die Fluorierung am C-9-Atom und weitere

Substituierung am C-16-Atom zu der Gruppe der fluorierten Glucocorticoide, welche sich

durch starke antiallergische, antiinflammatorische und immunsuppressive Wirkung

auszeichnen. Die Wirkstärke von Cortisol wird bis zu 40fach übertroffen, wobei die

mineralocorticoide Wirkung zu vernachlässigen ist (UNGEMACH, 2002).

Dexamethason ist in der Veterinärmedizin ein therapeutisch häufig eingesetzter Wirkstoff aus

der Gruppe der Glucocorticoide (KLAUS u. HAPKE, 1996). Tierarzneimittel enthalten

Dexamethason in freier oder auch verschiedenartig veresterter Form, zur oralen, intravenösen,

intramuskulären und topischen Anwendung, in galenischer Kurzzeit- oder auch

Literaturübersicht

34

Depotformulierung (UNGEMACH, 2002). Neben Tabletten, die lediglich bei Hund und Katze

angewandt werden, gibt es verschiedene Injektionspräparate für Groß- und Kleintiere in Form

von wässrigen Lösungen, wässrigen Suspensionen und Kristallsuspensionen. Tabletten

enthalten Dexamethason in freier Form oder als Dexamethason-21-acetat. Die wässrigen

Lösungen enthalten meist gut wasserlösliche und leicht spaltbare Ester (z.B. Dexamethason-

21-isonicotinat, Dexamethason-21-dinatriumphosphat oder Trioxaundecanoat) während die

wässrigen Suspensionen anstelle von Estern (z.B. Dexamethason-21-isonicotinat,

Dexamethason-21-phenylpropionat) auch Dexamethason in freier Form enthalten können. Die

ebenfalls zu den wässrigen Suspensionen gehörende Formulierung der Kristallsuspension

besteht meist aus Dexamethasonestern (Dexamethason-21-acetat, Dexamethason-21-

isonicotinat). Bei jeder Form der Verabreichung ist jedoch eine systemische Wirkung möglich

(KLAUS u. HAPKE, 1996)

6.5. Pharmakokinetik synthetischer Glucocorticoide

Die Applikation der exogenen Glucocorticoide kann über unterschiedliche Wege stattfinden

(UNGEMACH, 2002). Wie für jeden Wirkstoff ist die Kinetik post applikationem vom

Präparat, von der Applikationsart und von der Spezies abhängig (UNGEMACH, 2002). Im

Allgemeinen sind Glucocorticoide sehr lipophile Wirkstoffe und werden unabhängig von der

Applikationsart gut resorbiert (BEHREND u. GRECO, 1995). Bei oraler Applikation von

freien, unveresterten Glucocorticoiden ist die Resorption nahezu vollständig und schnell. Die

Bioverfügbarkeit liegt beim Menschen nach oraler Applikation für alle therapeutisch

wichtigen Glucocorticoide bei über 80 % (HOGGER, 2003). Beim Pferd wurde nach oraler

Applikation von 10 mg Dexamethason an drei aufeinander folgenden Tagen lediglich eine

durchschnittliche Bioverfügbarkeit von 60 % ± 19 % festgestellt (CUNNINGHAM et al.,

1996). Nach intramuskulärer Injektion werden freie Glucocorticoid-Alkohole sowie

wasserlösliche Ester gut resorbiert, im Gegensatz zu schwerlöslichen oder in Depots

vorliegenden Estern. Die Resorption von Esterverbindungen dauert Wochen bis Monate.

Angaben zur Bioverfügbarkeit nach intravenöser und intramuskulärer Verabreichung von

Glucocorticoidestern beim Pferd sind lückenhaft. Auch bei lokaler Verabreichung von

synthetischen Glucocorticoiden auf Haut, Schleimhäuten oder Gelenken findet eine

substanzielle Resorption mit anzunehmender systemischer Wirkung statt. Die systemische

Wirkung von dermal verabreichtem Dexamethason bewiesen ALLERSMEIER et al. (2005).

Sie zeigten, dass eine topische Applikation von Glucocorticoiden bei Pferden zu einer

Literaturübersicht

35

substanziellen Wirkstoffresorption und zu systemischen Effekten mittels Eingriff in die

Aktivität der Hypopyhsen-Nebennierenrinden-Achse führt.

Nach Applikation und Anflutung im Organismus werden die Glucocorticoidverbindungen

durch Gewebeesterasen gespalten. Die nun pharmakologisch wirksamen Moleküle gelangen

dann in die Blutzirkulation (COPPOC, 1984; FERGUSON u. HOENIG, 2001). Laut

UNGEMACH (2002) sind die synthetischen Glucocorticoide je nach Wirkstärke bis zu 80 %

an Plasmaproteine gebunden. Die Plasmaproteinbindung von Dexamethason beträgt 80 %

(PEETS et al., 1969; BARTH et al., 1994). Exemplarisch für den Menschen aufgeführt

beläuft sich die Plasmaproteinbindung von Prednisolon auf 75 %, die von Dexamethason auf

70 %. Ein Teil der synthetischen Glucocorticoide, mit Ausnahme des Prednisolons, ist locker

an Transcortin, das spezifische Transportprotein für Cortisol gebunden, der überwiegende

Anteil, etwa 60 %, ist jedoch unspezifisch an Albumin gebunden. Ein Rest zirkuliert frei

(FICHTL et al., 2001).

Auf dem Blutweg verteilen sich die Glucocorticoide in alle Gewebe und passieren die Blut-

Hirn- und die Plazentaschranke. Nach peroraler Gabe von Dexamethason werden ca. 20 % der

gemessenen Plasmakonzentration im Liquor gemessen (HOGGER, 2003). Kleine Mengen

gelangen sogar in die Milch (UNGEMACH, 2002). Das Verteilungsvolumen synthetischer

Glucocorticoide beläuft sich beim Hund und Rind auf 1,2 l/kg (TOUTAIN et al., 1982).

TOUTAIN et al. (1984) gibt das Verteilungsvolumen von Dexamethason beim Pferd mit 906-

965 ml/kg an. Ähnliche Werte wurden nach der oralen Applikation von 10 mg Dexamethason

gemessen (CUNNINGHAM et al., 1996).

In der Leber werden exogene Glucocorticoide, wenn auch etwas langsamer als endogene

Glucocorticoide, metabolisch inaktiviert. Zur Inaktivierung der Steroidhormone kommt es vor

allem durch Reduktion der Doppelbindungen und Ketogruppen. Durch Kopplung an polare

Moleküle, wie Glucuronid, sowie zu geringen Teilen auch an Sulfat, verlieren die Steroide

ihre Aktivität und werden wasserlöslich gemacht (KOOLMAN, 1994). Diese so

resultierenden Ester werden, neben einem sehr geringen freien und unveränderten Anteil,

hauptsächlich renal ausgeschieden (KAISER u. KLEY, 1997). Die Beteiligung des entero-

hepatischen Kreislaufs an der Ausscheidung ist nach UNGEMACH (2002) gering.

Bedingt durch die unterschiedliche chemische Struktur der verschiedenen synthetischen

Glucocorticoide sind die Metabolisierung und somit auch die Halbwertszeit unterschiedlich.

Stellvertretend ist die Halbwertszeit von Prednisolon mit ca. 100 Minuten und die

Halbwertszeit von Dexamethason mit 180-200 Minuten für die Spezies Pferd angegeben.

Literaturübersicht

36

6.6. Pharmakodynamische Wirkung von Glucocorticoiden

Steroidhormone bzw. Glucocorticoide beeinflussen praktisch alle Zellen eines

Säugetierorganismus (UMLAND et al., 2002; MCDONALD u. LANGSTON, 1995). Ihre

pharmakodynamische Wirkung vermitteln die Glucocorticoide zum überwiegenden Teil über

Rezeptormechanismen. Laut GUSTAFSSON et al. (1987) sind Glucocorticoidrezeptoren im

Zytoplasma diverser Zellarten lokalisiert. Nach VOIGT u. FEHM (1981) und FERGUSON u.

HOENIG (2001) befinden sich diese Rezeptoren hauptsächlich in Muskulatur, Fettgewebe,

Haut, Leber und lymphatischen Gewebe. Steroidhormonrezeptoren bestehen aus einer

Polypeptidkette und weisen charakteristische Domänen auf (DNA-Domäne,

Hormonbindungsdomäne, regularorische Domäne und Hinge-Region) (EVANS, 1988). Über

einen Proteinkomplex bestehend aus den Hitze-Schock-Proteinen hsp90 und hsp70

(Chaperone) sowie aus Cochaperonen (Immunophilin FKBP51), aus Dynein und aus weiteren

Proteinen ist der Glucocorticoidrezeptor im Zytoplasma gebunden (PRATT, 1998;

DEFRANCO u. CSERMELY, 2000; CROXTALL et al., 2000). Glucocorticoide diffundieren

als lipophile Hormone in die Zielzelle (LUTZ, 1988) und binden im Zytoplasma der

Zielzellen an diese Rezeptoren (LAPOINTE u. BAXTER, 1989). Die Bindung der

Glucocorticoide an den Rezeptor erfolgt in der Hormonbindungsdomäne (GUSTAFSSON et

al., 1987) und es kommt zur Bildung von Rezeptorkomplexen. Durch diese Bindung in der

Hormonbindungsdomäne ist der Glucocorticoidrezeptor maskiert und inaktiv. Es kommt

jedoch im Zuge der Bindung des Glucocorticoids an den Rezeptor zu einer Aktivierung bzw.

Hyperphosphorylierung des Rezeptors, indem das Immunophilin FKBP51 gegen FKBP52

ausgetauscht und das Transportproteins Dynein aktiviert wird. Eine Translokation des nun

aktivierten Rezeptorkomplexes in den Kern schließt sich an (DAVIES et al., 2002). Im

Zellkern interagiert die DNA-Domöne mit spezifischen DNA-Sequenzen der regulatorischen

Region (Promoter-Region) beeinflussbarer Gene (ROUSSEAU, 1984). Folge ist eine

gesteigerte Exprimierung spezifischer mRNA und somit der Synthese von korrespondieren

Proteinen (DANON u. ASSOULINE, 1978). Es werden vermehrt katabole Enzyme, Enzyme

für die Gluconeogenese und Hemmproteine gebildet (BATEMAN, 1989).

Anhand dieses vorgeschalteten Reaktionsgeschehens sind die erst nach einer Latenz

einsetzenden Glucocorticoideffekte zu erklären. Auch kann noch eine glucocorticoide

Wirkung bestehen, wenn sich keine Glucocorticoid-Rezeptor-Komplexe mehr im Zellkern

befinden (GUSTAFSSON et al., 1987). Aufgrund der von der Elimination unabhängigen

Persistenz von Glucocorticoid-Rezeptor-Komplexen in den Kernen der Zielzellen kommt es

Literaturübersicht

37

zu einer weiter bestehenden Wirkung der Glucocorticoide auch noch nach deren

Verschwinden aus der Blutbahn. Die Halbwertszeit der biologischen Wirkung ist deutlich

länger im Gegensatz zur Eliminationshalbwertszeit (UNGEMACH, 2002).

Nach HAYNES u. MURAD (1985) sind Glucocorticoide nicht nur, wie der Name bereits

sagt, an der Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels beteiligt. Sie nehmen auch beim Fett-

und Eiweißstoffwechsel eine zentrale Rolle ein und wirken auf den Wasser- und

Elektrolythaushalt. Auch beeinflussen sie den Organismus in Stresssituationen. Weiterhin

haben sie antiinflammatorische bzw. antiphlogistische, immunsuppressive und antiexsudative

Eigenschaften.

Glucocorticoide regulieren den Metabolismus von Proteinen, sie wirken katabol. Sie fördern

in praktisch allen Zellen, exklusive der Leberzellen, den Proteinabbau. Die durch den Abbau

von Proteinen frei gewordenen Aminosäuren werden zur Gluconeogenese eingesetzt

(MUNCK u. GUYRE, 1989). Die neu gebildete Glucose wird zum Teil in Form von

Glykogen als Energiereserve in der Leber gespeichert. Nach KUSCHINSKY et al. (1993)

hemmen Glucocorticoide weiterhin die Glucoseverwertung in der Peripherie. Hier fördert

Cortisol zusätzlich die Bereitstellung von Aminosäuren für die Gluconeogenese (REILY u.

FORD, 1974). Insgesamt ist der Glucoseumsatz gesteigert, die Glucosetoleranz und die

Insulinempfindlichkeit nehmen ab.

Der Eingriff der Glucocorticoide in den Fettstoffwechsel ist durch eine gesteigerte

lipolytische Wirkung von Katecholaminen und lipolytischen Enzymen zu erklären.

Gleichzeitig wird die Fettsäuresynthese in der Leber gehemmt (MÖSTL, 2000). Hohe Dosen

an Glucocorticoiden bewirken aus diesen Gründen eine Umverteilung des Fettgewebes. Es

kommt zu Fettverlust an den Extremitäten und Fettzunahme an Stamm, Nacken und Gesicht,

somit zur Stammfettsucht (MAJO-SMITH et al., 1989; UNGEMACH, 2002).

Natürliche und synthetische Glucocorticoide haben auf den Wasser- und Elektrolythaushalt

einen, in Abhängigkeit des jeweiligen Stoffes, geringgradigen mineralocorticoiden Effekt

(FICHTL et al., 2001; HARVEY et al., 2002). Die Natriumretention und die

Natriumresorption sind erhöht, was ein vergrößertes Extrazellularvolumen mit darauf

folgender indirekter Blutdruckerhöhung zur Folge hat (MÖSTL, 2000). Cortisol steigert die

tubuläre Filtration und hemmt die Wasserdurchlässigkeit der distalen Tubuli. GRISHAN u.

MENEELY (1982) ergänzen in diesem Zusammenhang die durch Glucocorticoide gehemmte

Resorption von Calcium aus dem Darm. Zusätzlich kommt es zu einer vermehrten

Ausscheidung von Calcium und Phosphat über die Nieren (BLAHOS et al., 1986; HARVEY

Literaturübersicht

38

et al., 2002). Hypokaliämie und metabolische Alkalose sind die Folge. Auch beeinflussen

Glucocorticoide durch den Abbau von Knochensubstanz den Calciumstoffwechsel (KAISER

u. KLEY, 1997).

Einen Einfluss auf das Entzündungsgeschehen besitzen Glucocorticoide, indem sie über eine

Hemmung der Proteinbiosynthese weniger entzündungsfördernde Substanzen (Zytokine und

Interleukine) und Enzyme des Entzündungsgeschehens (Cyclooxygenase-1, Cyclooxygenase-

2, u.a.) bilden und sezernieren. Durch die Cyclooxygenasehemmung wird die

Prostaglandinsynthese rasch blockiert (MASFERRER et al., 1992). Zusätzlich erfolgt ein

Eingriff in die Arachidonsäurekaskade. RUZICKA (1984) beschreibt diesen Eingriff in die

Arachidonsäurekaskade als Hemmung der Phospholipase A2 durch das Hemmprotein

Lipocortin. Lipocortin inhibiert die Phospholipase A2 und hemmt damit die Synthese von

Leukotrienen, Hydroxyfettsäuren, Prostacyclin, Prostaglandin E2 und Thromboxan A2.

Katabole Enzyme und Hemmproteine, wie das Lipocortin, werden im Zuge der zuvor

beschriebenen Geninteraktion gebildet (UNGEMACH, 2002). Durch Hemmung der

Prostaglandinsynthese sind auch die von WILLIAMS u. PECK (1977) beschrieben

gefäßerweiternden und exsudativen Eigenschaften der Prostaglandine verringert. Mittels

gestärkter Integrität von Zell- und Plasmamembranen und durch stabilisierte Membranen der

Lysosomen kommt es zu einer reduzierten Ausschüttung von Entzündungszellen (MELBY,

1977). Durch Normalisierung der erhöhten Membranpermeabilität wird auch einer Migration

von Leukozyten, Makrophagen und Mastzellen ins Gewebe entgegengewirkt (FREY, 2002).

Die antiproliferative Wirkung wird durch gehemmte DNA-Synthese und Zellteilung und

durch die durch verlangsamten Erythrozytenabbau bedingte Zunahme von Erythrozytenzahl

und Haemoglobinkonzentration vermittelt. Nach DURANT et al. (1986) führt die

antiproliferative Wirkung zu gehemmten Fibroblastenwachstum, verringerter

Kollagensynthese sowie zu einer verringerten Vaskularisation im Gewebe.

Die immunsuppresive Wirkung der Glucocorticoide wird durch eine verhinderte Bindung von

Immunglobulinen an ihren Rezeptor (MERK u. BICKERS, 1992) sowie durch eine gehemmte

Komplement-Reaktion bedingt (FICHTL et al., 2001). Nach UNGEMACH (2002) kommt es

durch Glucocorticoide weiterhin zu einer gehemmten Differenzierung von T-Lymphozyten,

zu charakteristischen Veränderungen des weißen Blutbildes in Form von Eosinopenie, zu

einem Abfall von T-Lymphozyten, zu regressiven Veränderungen des lymphatischen

Gewebes, sowie zu einer Lymphozytopenie, beruhend auf einer Sequestrierung der T-

Lymphozyten in Milz und Lunge. Die zelluläre Abwehr ist somit unterdrückt (MERK u.

BICKERS, 1992).

Literaturübersicht

39

An besonders beeinflussten Organsystemen sind das kardiovaskuläre und das

Zentralnervensystem (ZNS) zu nennen. Glucocorticoide wirken positiv inotrop, erhöhen die

Ansprechbarkeit der Mikrozirkulation auf Noradrenalin und verbessern dadurch die lokale

Durchblutung (FREY, 2002). Direkte Effekte am ZNS sind mittels gesteigerter Erregbarkeit,

verminderter Reizschwelle und Veränderungen im Elektroenzephalogramm zu

charakterisieren (FICHTL et al., 2001).

Nebenwirkungen der Glucocorticoide lassen sich laut FREY (2002) aus ihren

pharmakodynamischen Wirkungen ableiten und resultieren aus einem Einfluss von übermäßig

stark erhöhten Glucocorticoiddosen. Grundsätzlich gilt, dass eine kurzfristige, auch hoch

dosierte Anwendung gut verträglich ist. Jedoch ist jede längerfristig andauernde

Glucocorticoidverabreichung, die nicht einer indizierten Hormonsubstitution gilt, mit einem

Risiko für den Patienten behaftet.

Die Einsatzmöglichkeiten der Glucocorticoide in der Veterinärmedizin sind vielseitig.

FICHTL et al. (2001) stellen einige wichtige Indikationsgebiete unterteilt nach systemischer

und lokaler Anwendung gegenüber. Bei den erwähnten Erkrankungen ist die Gruppe der

Glucocorticoide jedoch nicht als erstes und einziges Mittel der Wahl anzusehen. Auch können

Krankheiten bei denen eine systemische Applikation indiziert ist ebenfalls lokal behandelt

werden. Beim Pferd finden die systemische Anwendung von Glucocorticoiden vorzugsweise

bei rheumatischen und andere entzündlichen Gewebserkrankungen, bei allergischen

Erkrankungen, bei Haut-, Lungen- und Augenerkrankungen sowie zur hormonellen

Substitution endokriner Erkrankungen Anwendung. Im Rahmen der lokalen Anwendung ist

der Einsatz bei Haut-, Augen-, Gelenks- und Atemwegserkrankungen zu nennen. Der Einsatz

der synthetischen Glucocorticoide zur Behandlung entzündlicher Schmerzen des

Bewegungsapparates und der damit verbundenen Lahmheiten steht in der tiermedizinischen

Praxis im Vordergrund, was laut FRIEDRICH et al. (1990) durch die starke antiphlogistische

Wirkungskomponente der Glucocorticoide zu begründen ist. Diese Substanzen bewirken

somit eine Milderung der Entzündung, die die Gebrauchsfähigkeit des Pferdes kurzweilig

wiederherstellt. Eine kausale Therapie ist jedoch hierdurch nicht gegeben (KLAUS u.

HAPKE, 1996).

Literaturübersicht

40

6.7. Glucocorticoidester

6.7.1. Einteilung der Glucocorticoidester

Durch Veresterung am C-17- oder C-21-Atom mit kurzkettigen Fettsäuren wie z.B. Acetat,

Propionat und Butyrat, entstehen Glucocorticoidester. Die Veresterung bestimmt zum einen

die Wasser- und Lipidlöslichkeit des jeweiligen Stoffes (FERGUSON u. HOENIG, 2001),

zum anderen bestimmt die Art des Esters in einem Arzneistoff dessen mögliche

Applikationsart, d.h. die Möglichkeit einer intravenösen, intramuskulären oder subkutanen

Applikation (COPPOC, 1984). Weiterhin beeinflusst die Art des Esters wesentlich die

Freisetzungsgeschwindigkeit des Präparates aus subkutanen oder intramuskulären Depots. Sie

hat somit Einfluss auf die Wirkungs- und Ausscheidungsdauer des Präparates. Es wird

innerhalb der Glucocorticoidester zwischen zwei Hauptgruppen unterschieden:

1) Wässrige Injektionslösungen gut löslicher, also leicht spaltbarer und schnell zum

Wirkungsmaximum führender Glucocorticoidester

2) Langsam resorbierbare Kristallsuspensionen und wässrige Suspensionen schlecht

löslicher Ester mit Depotwirkung

Zur Gruppe der gut löslichen Ester gehören nach BEHREND u. GRECO (1995),

FERGUSON u. HOENIG (2001) und UNGEMACH (2003) Succinat-, Hemisuccinat- und

Phosphatester. Auch der Isonicotinatester ist grundsätzlich dieser Gruppe zuzurechnen. Liegt

der Isonicotinatester als wässrige Suspension eines gut löslichen Esters, und nicht als

Kristallsuspension vor, eignet er sich insbesondere zur intravenösen Injektion, wird aber auch

nach intramuskulärer Injektion schnell resorbiert (UNGEMACH, 2002).

Zur Gruppe der langsam löslichen Ester gehören zum einen die Kristallsuspensionen, zum

anderen die öligen Suspensionen schlecht löslicher Ester. Die Zubereitung als

Kristallsuspension stellt eine mögliche Formulierung des Dexamethason-21-isonicotinatesters

dar. Kristallsuspensionen haben eine spezifische galenische Formulierung und werden aus

ihren Depots nur langsam freigesetzt (KLAUS u. HAPKE, 1996). Weiterhin zählt man

Acetat-, Diacetat- und Tebutatester zu den schwerlöslichen Estern. Schwerlösliche

Glucocorticoidester zeichnen sich durch eine langsame Absorptionsrate und damit durch eine

lange Wirkungszeit aus (BEHREND u. GRECO, 1995). Aufgrund dieser Eigenschaften

werden sie als Depotpräparat eingesetzt (UNGEMACH, 1992; COPPOC, 1984).

Literaturübersicht

41

6.7.2. Dexamethason-21-isonicotinat

Dexamethason-21-isonicotinat (Abbildung 6) trägt den chemischen Namen Pyridin-4-

carbonsäure-(dexamethason-21)-ester. Die Summenformel ist mit C28H32FNO6, die

Molekülmasse mit 478,56 g/mol und die Schmelztemperatur mit 250-252 °C angegeben

(PHARMAZEUTISCHE STOFFLISTE, 1998).

N

OO

O

OH OH

O

F

Abb. 6: Strukturformel Dexamethason-21-isonicotinat

Der Dexamethason-21-isonicotinatester stellt eine der möglichen Esterformulierungen des

Dexamethasons dar. Der Isonicotinatester von Dexamethason als wirksamer Bestandteil in

Voren®-Formulierungen wurde bereits in mehreren Studien getestet (interner Bericht

Boehringer Ingelheim).

Sowohl im Fall von Voren® Suspension als auch im Fall von Voren®-Depot handelt es sich

um Suspensionen mit makrokristalliner Aufbereitung (Kristallsuspensionen). Die kristallinen

Partikel haben in diesen beiden Präparaten eine unterschiedliche Größe. Bei der Voren®

Suspension-Formulierung beläuft sich die Partikelgröße auf < 12 µm, in der Formulierung als

Voren®-Depot sind 70 % der suspendierten Partikel zwischen 12 und 32 µm groß (interner

Bericht Boehringer Ingelheim). Über diese zu variierende Partikelgröße des

Dexamethasonesters kann nach dem internen Bericht Boehringer Ingelheim das

pharmakologische Verhalten der beiden genannten Präparate beeinflusst werden.

Der in Voren®-Depot und Voren® Suspension enthaltene Dexamethason-21-isonicotinatester

ist langsamer löslich als Dexamethason (interner Bericht Boehringer Ingelheim; BEHREND

u. GRECO, 1995). Corticoidester unterliegen im Organismus einer raschen Spaltung

Literaturübersicht

42

(ENGELHARDT, 1963). Die Spaltung des Dexamethason-21-isonicotinats in Dexamethason

und Isonicotinsäure erfolgt durch unspezifische Esterasen, deren Vorkommen und Aktivität

speziesabhängig stark variieren (WEISENBERGER, 1972). Bei der Ratte sind nach 10

Minuten bereits 90 % des Esters hydrolysiert und beim Kaninchen sogar 99 % des Esters. Im

Humanserum liegt die Halbwertszeit des Esters bei 90-100 Minuten. Exakte Angaben zu den

Esteraseaktivitäten anderer Tierarten sind ungenau und lückenhaft. Nach TOUTAIN et al.

(1984) kommt es beim Pferd nach intravenöser wie auch nach intramuskulärer Applikation zu

einer schnellen und vollständigen Hydrolyse, sodass von einer vollständigen systemischen

Verfügbarkeit von Dexamethason nach einer Injektion als Dexamethason-21-isonicotinat

ausgegangen werden kann. Dexamethason ist nach der Hydrolyse, wie bereits in Kapitel

II.6.5. detaillierter beschrieben, im Plasma bis zu 80 % an Protein gebunden.

Die pharmakologischen Parameter des Verteilungsvolumens, der Halbwertszeit und der

Clearance wurden für freies Dexamethason sowie für den Dexamethason-21-isonicotinatester

verglichen (interner Bericht Boehringer Ingelheim). Nach intravenöser Applikation von

Dexamethason und Dexamethason-21-isonicotinat ergibt sich für die Spezies Pferd ein

vergleichbares Verteilungsvolumen von 0,96 l/kg (Dexamethason) bzw. 0,91 l/kg

(Dexamethason-21-isonicotinat) an, während UNGEMACH (2002) für Dexamethason ein

Verteilungsvolumen von etwa 1,2 l/kg erwähnt.

Auch der zeitliche Verlauf der Blutplasmakonzentration von Dexamethason und

Dexamethason-21-isonicotinatester ist vergleichbar (interner Bericht Boehringer Ingelheim).

Beim Pferd liegt die Halbwertszeit für beide Präparate nach intravenöser Applikation von

0,05 mg/kg KGW bei jeweils 0,9 Stunden. Laut UNGEMACH (2002) liegt beim Pferd die

Halbwertszeit für freies Dexamethason sowie für leicht spaltbare, wasserlösliche Ester bei

180-200 Minuten. TOUTAIN et al. (1984) verweisen auf eine Plasmahalbwertszeit für

Dexamethason von ca. 53 Minuten.

Die Metabolisierung von Dexamethason erfolgt, wie bereits in Kapitel II.6.5. erwähnt,

überwiegend in der Leber. Nach UNGEMACH (2002) werden insbesondere fluorierte

Verbindungen, wie auch das Dexamethason, im Vergleich zu anderen synthetischen

Glucocorticoiden sehr langsam abgebaut. Beim Pferd beträgt die totale Clearance von

Dexamethason 0,77 l/h/kg, die von Dexamethason-21-isonicotinat 0,74 l/h/kg (interner

Bericht Boehringer Ingelheim).

Im Gegensatz zum unveresterten Präparat führen die C-21-Ester zu einem veränderten

pharmakologischen Verhalten. Es kommt zu einem verspäteten Wirkungseintritt und einer

länger anhaltenden Wirkung der Esterverbindungen (interner Bericht Boehringer Ingelheim).

Literaturübersicht

43

Speziell bei Kristallsuspensionen ist der Wirkungseintritt verzögert (interner Bericht

Boehringer Ingelheim) und die Wirkdauer deutlich verlängert. Auch UNGEMACH (2002)

erwähnt eine erst nach 24 Stunden eintretende pharmakologische Wirkung nach einer

intramuskulären Verabreichung von Kristallsuspensionen. Die lange Cortisolsuppression

unterstreicht die lang anhaltende Wirkung eines kristallinen Depotpräparates (interner Bericht

Boehringer Ingelheim).

7. Dexamethason als Dopingsubstanz

Wie in Kapitel II.2. bereits erwähnt, ist die dopingrelevante Wirkung von Dexamethason

unter dem Gesichtspunkt „Doping zur Wiederherstellung der normalen Leistungsfähigkeit“

einzuordnen. Neben den Glucocorticoiden zählen auch nichtsteroidale Antiphlogistika,

Lokalanästhetika und Dimethylsulfoxid (DMSO) zu dieser Gruppe.

Diese Form des Dopings spielt bei der medikamentösen Schmerzausschaltung bei

Sportpferden besonders im Bereich des Bewegungsapparates eine immer größer werdende

Rolle (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Bei der Anwendung von Glucocorticoiden

zur Behandlung entzündlicher Prozesse des Bewegungsapparates führt die oben bereits

detailliert beschriebene antiexsudative, abschwellende und konsekutiv analgetische Wirkung

zu einer raschen, jedoch rein symptomatischen Besserung. Die somit wiederhergestellte

Beweglichkeit und der Wegfall des Schmerzes ermöglichen den Einsatz eines erkrankten

Pferdes beim Wettkampf, jedoch mit der Gefahr, den Krankheitsprozess durch Überbelastung

zu verschlimmern.

Nach den in Deutschland derzeitig gültigen, und bereits erwähnten, Dopingreglementierungen

besteht zum Zeitpunkt des Rennens oder Wettkampfes kein Unterschied zwischen Therapie

und Doping. Jeder Nachweis eines in den Dopinglisten verbotenen Arzneimittels gilt als

„Doping positiv“ und das gedopte Pferd ist von der Teilnahme am Wettkampf auszuschließen.

Die Jahresstatistik 2004 der Nationalen Anti Doping Agentur (NADA) stellt die Ergebnisse

der im akkreditierten Laboratorium des Instituts für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln untersuchten Dopingproben vor.

Im Bereich des Pferdesports wurden im Jahr 2004 in den, dem Deutschen Sportbund e.V.

(DSB) angehörigen Pferdsportvereinen insgesamt 416 Wettkampfkontrollen und 12

Trainingskontrollen durchgeführt. Sieben dieser im Auftrag der Deutschen Reiterlichen

Literaturübersicht

44

Vereinigung untersuchten Wettkampfkontrollen erwiesen sich als positiv. Die

Wettkampfkontrollen in anderen deutschen Pferdesportverbänden (Direktorium für

Vollblutzucht und Rennen (DIR), National Reining Horse Association (NRHA), Verband der

Züchter des Arabischen Pferdes) beliefen sich auf 814, von denen 8 Proben positiv waren. In

all diesen Analysen wurde in keinem Fall Dexamethason nachgewiesen. In den Analysen, die

im Auftrag von ausländischen und internationalen Verbänden durchgeführt wurden, wurde bei

283 Wettkampf- und einer Trainingskontrolle ein positiver Fall von Dexamethason gefunden.

Auch die Jahresstatistiken der Jahre 2002 und 2003 lassen einen positiven Dopingbefund

aufgrund von Dexamethasonapplikation nur jeweils einmalig erkennen. Wiederum bei den im

Auftrag ausländischer und internationaler Verbände untersuchten Dopingproben.

In den Jahren 1999 und 2000 wurden im Auftrag der FN insgesamt 1237 Dopingproben

analysiert. Von 31 positiven Proben waren drei Proben aufgrund des Vorhandenseins von

Dexamethason positiv.

Doping positive Proben durch andere Wirkstoffe aus der Gruppe der Glucocorticoide wurden

ebenfalls in einzelnen Fällen gefunden.

8. Prinzip der HPLC als Analyseverfahren

Unter der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) versteht man eine automatische

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie in Säulen (SCHWEDT, 1986). Es handelt sich um

ein chromatographisches Trennverfahren, bestehend aus Pumpe, Trennsäule, Einspritzsystem

und Detektor (LINDSAY, 1987). Die zu untersuchende Substanz wird zwischen einer

mobilen und einer stationären Phase verteilt (SCHWEDT, 1996). Die Probenaufgabe erfolgt

mit Hilfe eines Einspritzsystems, das die zu untersuchende Substanz direkt in die mobile

Phase injiziert und diese dann durch Weiterleitung des Elutionsstrom zur Trennsäule

transportiert (SCHWEDT, 1986). Die zu trennende Substanz wird zusammen mit einem

flüssigen Laufmittel mit Hilfe einer Pumpe durch eine Trennsäule gepumpt. Das Innere der

Trennsäule wird durch einen dichten Verband poröser Teilchen gebildet, um ein hohes

Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zu erhalten (UNGER et al., 1995). Der 5 bis 30 cm

langen Trennsäule ist eine Vorsäule vorgeschaltet, die zur Abspaltung von Verunreinigungen

dient. Reagiert ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der stationären

Phase, verbleibt er relativ lange in der Säule. Reagiert er hingegen schwach mit der

stationären Phase, verlässt er die Säule früher (LINDSAY, 1987).

Literaturübersicht

45

Ihre Anwendung findet die HPLC zur Analyse von sehr flüchtigen, stark polaren, ionischen,

thermisch instabilen und leicht zersetzlichen Substanzen, sowie zur Analyse von Substanzen

mit hohen Molmassen (UNGER et al., 1995).

Es werden zwei Methoden der HPLC unterschieden:

1. Normal Phase-HPLC

2. Reversed Phase-HPLC

Die Reversed Phase-HPLC ist in der Praxis die Methode der Wahl und wird bei 70 % aller

HPLC-Trennungen eingesetzt. Auch kam sie in dieser Studie zur Anwendung. Bei dieser

Methode wird eine unpolare stationäre Phase eingesetzt. Das bei der Normal Phase-HPLC als

stationäre Phase dienende polare Silikagel wird bei der Reversed Phase-HPLC vorbereitend

mit einer unpolaren Schicht aus Alkenen überzogen, wodurch die Polarität umgekehrt wird.

Als mobile Phase werden meist Mischungen aus Wasser oder Puffer mit Acetonitril,

Tetrahydrofuran oder Methanol eingesetzt (SCHWEDT, 1996).

Die Darstellung der Ergebnisse der Stofftrennung erfolgt in Form eines Chromatogrammes,

indem die mobile Phase nach dem Verlassen der Säule durch den Detektor geführt wird

(SCWEDT, 1996). Je nach Stärke der Wechselwirkung der Bestandteile der untersuchten

Substanz mit der Säule erscheinen unterschiedliche Substanzen zu verschiedenen

Retentionszeiten am Ende der Säule, wo sie mit Hilfe von Detektoren sichtbar gemacht

werden (SCWEDT, 1986).

Es stehen folgende Detektoren zur Verfügung:

• UV-Detektor

• Lichtstreudetektor

• Fluoreszenzdetektor

• Brechungsindexdetektor

• Massenspektrometer

• Leitfähigkeitsdetektor

• Elektrochemischer Detektor

In dieser Studie erfolgte die Detektion mit Hilfe eines Massenspektrometers (MS), so dass

nachfolgend nur auf dieses Detektorsystem eingegangen wird.

Literaturübersicht

46

Die Massenspektrometrie ist ein Analyseverfahren zur Massentrennung und –messung von

Ionen (SEIBL, 1970). Neben der Bestimmung der Häufigkeit, mit der geladene Moleküle und

deren Massenfragmente auftreten, werden auch die Struktur und die Zusammensetzung von

Verbindungen und Gemischen bestimmt. Auch sind der qualitative sowie der quantitative

Nachweis sehr kleiner Substanzmengen möglich.

Ein Massnspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, einem Analysator und einem Detektor

(LEHMANN, 1996). Die Ionenquelle erzeugt aus der zu untersuchenden Probe einen Strahl

gasförmiger Ionen, der Analysator trennt diese nach Masse und Ladung auf und der Detektor

bildet das Massenspektrum ab. Die in einer Zeiteinheit gebildeten Ionen bezeichnet man als

Ionenströme, die Summe der Ionenströme als Gesamt- oder Totalionenstrom

(BUDZIKIEWICZ, 1998).

Nach LEHMANN (1996) stehen in der analytischen Praxis folgende Ionisationsquellen zur

Verfügung:

1. Elektronen-Stoß-Ionisation (EI, electron impact)

2. Chemische Ionisation (CI)

3. Elektrospray-Ionisation (ESI)

4. Chemische Ionisation unter Atmosphärendruck (APCI, Atmospheric Pressure

Chemical Ionization)

5. Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation (MALDI, Matrix-Assisted Laser

Desorption/Ionization)

An dieser Stelle soll jedoch nur die in dieser Studie verwendete, unter Punkt vier genannte

Form der chemischen Ionisation näher erläutert werden.

Bei der chemischen Ionisation unter Atmosphärendruck wird das aus der HPLC-Säule

austretende Eluat unter atmosphärischem Druck über eine beheizte Kapillare weitergeleitet

und in eine geheizte und unter Vakuum stehende Verdampfungskammer gesprüht. In dieser

Verdampfungskammer befindet sich eine Glühkathode, an welcher die nun gasförmigen

Moleküle ionisiert und anschließend über eine kleine Öffnung in der Verdampfungskammer

an das Massenspektrum zur Analyse weitergeleitet werden (LEHMANN, 1996).

Das Massenspektrometer wird hier in Form einer Reihenschaltung oder Kopplung zweier

Massenspektrometer genutzt, auch Tandem–Massenspektrometer (MS/MS) genannt. Ziel ist

es, die im Massenspektrometer getrennten Ionen zu fragmentieren und die Fragmente erneut

mittels Massenspektrometrie zu untersuchen (LEHMANN, 1996). Zwischen den zwei

Literaturübersicht

47

Analysatoren wird eine so genannte Kollisionszelle (Stoßkammer) eingebaut, so dass die

Ionen durch Kollision mit Gasatomen angeregt werden und daraufhin sehr spezifisch in

leichtere Ionen zerfallen.

Nach LEHMANN (1996) handelt es sich bei den Tandem-Massenspektrometern um

Quadrupol-Massenpektrometer. Im ersten Analysatorquadrupol werden die durch die

Ionenquelle produzierten Ionen aufgereinigt, d.h. Bestandteile, die nicht zum Analyten

gehören, werden isoliert. Die ins zweite Quadrupol, die Kollisionszelle, gelangenden Ionen

werden angeregt, und im dritten Quadrupol erfolgt die Analyse der entstandenen Ionen. Durch

die Produktionenanalyse wird auf die Struktur der im ersten Quadrupol isolierten Ionen

zurückgeschlossen. Es können alle Produktionen bestimmt werden, aber auch nur ein oder

zwei Fragmentionen, so dass sehr empfindlich und selektiv quantifiziert werden kann

(LEHMANN, 1996). Im Fall der Fragmentionen spricht man laut auch von MRM (Multi

Reaction Monitoring).

Die entstandenen Fragmentionen werden zur abschließenden Analyse an einen Detekor,

welcher sich der Säule direkt anschließt, weitergeleitet. Das Detektionssystem macht das

chromatographische Konzentrationsprofil sichtbar (SCHWEDT, 1986). Das entstandene

Signal ist proportional zur Menge der gemessenen Substanz und wird in Abhängigkeit von der

Zeit in Form eines Peaks aufgezeichnet. Das Chromatogramm stellt die Retentionszeit des

Peaks sowie seine Höhe und Fläche dar. Die Retentionszeit entspricht der Zeitspanne von der

Probenaufgabe bis zum Durchbruch des Maximums des Peaks. Durch Vergleich der

Flächenwerte von Substanz und internem Standard kann auf die Konzentration der Probe

geschlossen werden.

Die beschriebene kollisions-induzierte Dissoziation mit anschließender HPLC-Messung

gekoppelt mit einer Tandem-Massenspektrometrie ist für Corticosteroide im Allgemeinen,

aber auch Dexamethason im speziellen, gebräuchlich und in der Literatur beschrieben

(ANTIGNAC et al, 2000).

Material und Methoden

48

III. Material und Methoden

1. Versuchsaufbau

Bei dem durchgeführten Versuch handelt es sich um eine pharmakokinetische Studie an

insgesamt zwölf Pferden. Nach Applikation von zwei verschiedenen Dexamethasonpräparaten

an je sechs Pferden wurden Blut- und Urinproben dieser Pferde gewonnen. Anschließend

wurden diese Proben im Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln

aufgearbeitet.

1.1. Testsubstanzen

In der Studie wurden die Substanzen Voren® Suspension und Voren®-Depot der Firma

Boehringer Ingelheim verwendet.

Voren® Suspension : Wirkstoff : Dexamethason-21-isonicotinat (1 mg/ml)

Bestandteile: 1,35 mg Methyl (4-hydroxybenzoat)

0,15 mg Propyl (4-hydroxybenzoat)

Natriumchlorid

Polysorbat 80

Wasser für Injektionszwecke

Chargennummer: S20564

Voren®-Depot : Wirkstoff : Dexamethason-21-isonicotinat (3 mg/ml)

Bestandteile: 1,35 mg Methyl (4-hydroxybenzoat)

0,15 mg Propyl (4-hydroxybenzoat)

Natriumchlorid

Polysorbat 80

Wasser für Injektionszwecke


49

Chargennummer: S20605

Beide Präparate wurden in dieser durchgeführten Arbeit einmalig und in der vom Hersteller

empfohlenen Dosierung eingesetzt.

1.2. Versuchstiere

Die Versuchspferde wurden vom Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für

Landwirtschaft (FAL) in Mariensee gehalten und untergebracht. Als Stall diente ein großer

Boxenlaufstall mit einzelnen Futterplätzen. Über Tag bewegten sich die Pferde auf einem

angrenzenden Paddock, über Nacht hatten sie Auslauf auf einer Weide. Die Fütterung bestand

aus Grassilage bzw. Gras, jeweils zur freien Verfügung. Wasser stand in Form einer

Selbsttränke ebenfalls ad libitum zur Verfügung.

Die Tiere bildeten eine homogene Gruppe von Wallachen (zehn Wallache der Rasse

Warmblut, zwei Wallache der Rasse Englisches Vollblut) im Alter von sechs bis elf Jahren.

Alter, Geschlecht und Rasse der Tiere sind Tabelle 2 zu entnehmen.

Pferd [Nr.]

Alter [Jahre]

Geschlecht Rasse

1 9 Wallach Warmblut 2 9 Wallach Warmblut 3 9 Wallach Warmblut 4 9 Wallach Vollblut 5 10 Wallach Warmblut 6 6 Wallach Vollblut 7 10 Wallach Warmblut 8 11 Wallach Warmblut 9 8 Wallach Warmblut 10 10 Wallach Warmblut 11 9 Wallach Warmblut 12 9 Wallach Warmblut

Tabelle 2: Alter, Geschlecht und Rasse der Versuchspferde

Zu Versuchsbeginn sowie während des gesamten Versuchsablaufes erwiesen sich alle Tiere

als klinisch gesund. Die Nierengesundheit der Pferde wurde mittels Überprüfung der

Kreatininkonzentrationen im Plasma gezeigt. In den Tabellen 29-40 im Anhang sind die

ermittelten Kreatininwerte jedes einzelnen Pferdes aufgeführt.


50

1.3. Versuchsablauf

Der praktische Teil der Studie, die Phase der Probenentnahme, gliederte sich in einen

Vorversuch und einen anschließenden Hauptversuch.

1.3.1. Vorversuch

Der pro Testsubstanz an einem Pferd pro Tiergruppe (Pferd 5 und Pferd 12) durchgeführte

Vorversuch diente zur Abschätzung der zu erwartenden Dexamethasonkonzentrationen in den

gewonnenen Blut- und Urinproben, zur Überprüfung des Probenentnahmeschemas, sowie zur

Entwicklung eines geeigneten Analyseverfahrens für Dexamethason. Der Versuchsaufbau ist

in Kapitel III.1.3.2. näher beschrieben.

1.3.2. Hauptversuch

In diesen Teil des Versuchs waren alle zwölf Versuchspferde beteiligt. Die Gruppe wurde

geteilt. Sechs der Pferde dienten der Untersuchung von Voren® Suspension, die anderen

sechs der von Voren®-Depot.

Direkt vor Beginn dieser Versuchsphase wurden alle Pferde mit Hilfe einer digitalen

Viehwaage gewogen, um die Dosierung der Präparate genau auf das Körpergewicht der

einzelnen Tiere abstimmen zu können. Die Dosierung von Voren® Suspension betrug 0,02

mg/kg Körpergewicht Dexamethason-21-isonicotinat, was einer Arzneimittelmenge von 2 ml

pro 100 kg Körpergewicht entspricht. Voren® Suspension wurde den sechs Pferden der ersten

Gruppe einmalig intravenös verabreicht. Voren®-Depot wurde in einer Konzentration von

0,06 mg/kg Körpergewicht Dexamethason-21-isonicotinat dosiert, was ebenfalls einer

Arzneimittelmenge von 2 ml pro 100 kg Körpergewicht entspricht. Voren®-Depot wurde den

sechs Pferden der zweiten Gruppe einmalig intramuskulär appliziert.

Umgerechnet auf das Körpergewicht ergeben sich für die eingesetzten Pferde die den

nachfolgenden Tabellen 3 und 4 zu entnehmenden Arzneimittelmengen:


51

Pferd [Nr.]

Testsubstanz Gewicht [kg]

Wirkstoffmenge[mg]

Arzneimittelmenge [ml]

1 Voren® Suspension i.v. 666 13,32 13,32 2 Voren® Suspension i.v. 630 12,60 12,60 3 Voren® Suspension i.v. 606 12,12 12,12 4 Voren® Suspension i.v. 450 9,00 9,00 5 Voren® Suspension i.v. 644 12,88 12,88 6 Voren® Suspension i.v. 566 11,32 11,32

Tabelle 3: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 1 und verabreichte Menge an Voren®

Suspension (Dosierung: 0,02 mg/kg Körpergewicht)

Pferd [Nr.]

Testsubstanz Gewicht [kg]

Wirkstoffmenge[mg]

Arzneimittelmenge [ml]

7 Voren®-Depot i.m. 602 36,12 12,04 8 Voren®-Depot i.m. 586 35,16 11,72 9 Voren®-Depot i.m. 598 35,88 11,96 10 Voren®-Depot i.m. 630 37,80 12,60 11 Voren®-Depot i.m. 634 38,04 12,68 12 Voren®-Depot i.m. 644 38,64 12,88

Tabelle 4: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 2 und verabreichte Menge an Voren®-

Depot (Dosierung: 0,06 mg/kg Körpergewicht)

Eine halbe Stunde vor Applikation der Testsubstanz wurde von allen Pferden eine Urinprobe

gewonnen, welche als Leer–Urinprobe diente. Auch wurde eine Leer–Blutprobe pro Pferd

entnommen, nachdem bei jedem Pferd ein Venenverweilkather gelegt wurde. Der Katheter

(Vygonüle S®) wurde jedem Pferd nach vorheriger Rasur und Desinfektion der betreffenden

Stelle in die Vena jugularis sinister gelegt und dort mit nicht resorbierbarem Faden (Filovet

Bengen®) fixiert.

Voren® Suspension wurde den sechs Tieren der ersten Gruppe verabreicht, indem jedem

dieser Pferde ein Verweilkatheter nach dem oben bereits beschriebenen Verfahren in die Vena

jugularis dextra gelegt wurde. Durch diesen Katheter wurde die jeweils errechnete

Arzneimittelmenge mittels Einmalspritzen streng intravenös appliziert. Die Spritze wurde

nach der Applikation dreimal durch Aspiration von Vollblut gespült, um Medikamentenreste

in der Spritze zu vermeiden. Direkt nach der Applikation wurde der Katheter wieder entfernt

und die Einstichstelle mit einer antiseptischen Salbe (Vet-Sept Salbe®) behandelt.

Die Applikation von Voren®-Depot erfolgte bei den sechs Tieren der zweiten Gruppe, nach

vorheriger Desinfektion der Einstichstelle, intramuskulär in die lange Sitzbeinmuskulatur der

linken Hintergliedmaße. Zu diesem Zweck wurden Einmalkanülen und -spritzen verwendet.


52

Vor Injektion der berechneten Stoffmenge aus den Einmalspritzen wurde im Gewebe

asperiert, um zu gewährleisten, dass kein Gefäß beim Einstich getroffen wurde. Nach

vollzogener Applikation der Präparate wurde nun in festgelegten Zeitabständen, wie sie

Tabelle 5 zeigen, Blut– und Urinproben entnommen. Die Proben wurden reproduzierbar zur

gleichen Tageszeit entnommen, um eine Vergleichbarkeit der Probenergebnisse zu

gewährleisten.

Die Blutproben wurden in vier, jeweils 9 ml fassenden, mit Lithium–Heparin beschichteten

Monovetten® (Sarstedt) aufgefangen. Zwölf Stunden nach Versuchsbeginn wurden die

Verweilkatheter in der linken Jugularvene entfernt und an der Einstichstelle ebenfalls mit

antiseptischer Salbe (Vet-Sept Salbe®) behandelt. Die weiteren Blutproben wurden durch

Punktion der Vena jugularis mittels einer Einmalkanüle entnommen.

Die Pferde waren darauf konditioniert, bei Betreten des mit Stroh eingestreuten Laufstalles

Urin abzusetzen. Die Urinproben wurden in Form von Spontanharnproben gewonnen und mit

Hilfe eines Hartplastikbechers, in welchen ein Einmalplastikbecher eingesetzt wurde,

aufgefangen. Der Hartplastikbecher war am Ende eines ca. 50 cm langen Stabes befestigt.


53

Voren®-Depot Voren® Suspension Blut Urin Blut Urin Proben-Nr.: Zeit [Std] Zeit [Std] Proben-Nr.: Zeit [Std] Zeit [Std]

1 -0,25 -0,5 1 -0,25 -0,5 2 1 2 2 0,25 1 3 2,25 5 3 0,5 2 4 3 7 4 1,25 5 5 4 12 5 2,25 7 6 6 48 6 3 12 7 8 72 7 4 24,5 8 12,25 96 8 6 36 9 23,50 120 9 8 48,5 10 48,25 144 10 10 72,5 11 72,25 168 11 12,25 96,5 12 96,25 192 12 24,25 120,5 13 120,25 216 13 48,25 144,5 14 144,25 240 14 72,25 168,5 15 168,25 288 15 96,25 192,5 16 192,25 336 16 120,25 216,5 17 216,25 384 17 144,25 240,5 18 240,25 432 18 168,25 264,5 19 264,25 480 19 216,25 312,5 20 312,25 552 20 264,25 384,5 21 360,25 624 21 312,25 456,5 22 408,25 696 22 360,25 528,5 23 456,25 768 24 840 25 912

Tabelle 5: Entnahmezeitpunkte von Blut– und Urinproben im Hauptversuch

1.4. Probenaufbereitung und Probenlagerung

Das zum jeweiligen Entnahmezeitpunkt mit Monovetten® entnommene Vollblut wurde direkt

zentrifugiert (1000 Umdrehungen pro Minute, 15 Minuten). Anschließend wurde das den

Überstand der jeweiligen Probe darstellende Plasma mittels steriler Einmalkanülen und 20 ml

Einmalspritzen in ein 16 ml fassendes Glasgefäß mit Kunststoffschraubdeckel überführt. Pro

Probe wurden weiterhin jeweils drei Eppendorfgefässe mit je 1,5 ml Plasma befüllt. Die

Plasmaproben wurden bis zur Aufarbeitung bei -20 °C gelagert.

Die in Einwegplastikbechern aufgefangenen Urinproben wurden umgehend in jeweils einen

100 ml fassenden Urinbecher aus Kunststoff mit Schraubverschluss umgefüllt. Bis zur

Analyse wurden diese Proben bei ebenfalls -20 °C aufbewahrt.


54

2. Aufarbeitung der Plasma- und Urinproben

Die bei -20 °C gelagerten Blut– und Urinproben des Vorversuchs wurden mit den in Kapitel

III.5.1. und III.5.2. beschriebenen Analysemethoden im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln aufgearbeitet. Die gemessenen Dexamethasonkonzentrationen dienten

zur Abschätzung der Anreicherung sowie Abflutung von Dexamethason in Blut und Urin. Auf

diese Konzentrationsbereiche bezogen wurden die Analysemethoden abgestimmt und

validiert, um den gesamten ermittelten Konzentrationsbereich in Blut und Urin abdecken zu

können.

3. Methodenentwicklung

Diese Versuchsphase diente dem Ziel, eine geeignete Analysemethode einschließlich

Aufarbeitung der gesammelten Blut– und Urinproben zum Nachweis von Dexamethason zu

entwickeln.

3.1. Chemikalien

Die zur Analyse der Blut– und Urinproben benötigten Gegenstände und Chemikalien standen

im Institut für Biochemie der Sporthochschule in Köln zur Verfügung oder wurden durch

dieses bereitgestellt.

Tabelle 6 sind die Chemikalien sowie der jeweilige Hersteller zu entnehmen.


55

Chemikalie Herstellung durch: Acetronitril J.T.Baker, Deventer, Holland Ammoniumacetat Merck KGaA, Darmstadt Bidestilliertes Wasser (Milli-Q-Wasser) Institut für Biochemie, Köln ß-Glucuronidase von Escherichia coli Roche Diagnostics GmbH,

Mannheim ß-Glucuronidase/Arylsulfatase von Helix pomatia

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Destilliertes Wasser Institut für Biochemie, Köln D5-Androsteron-glucuronid-Lösung (1000 µg/ml)

Institut für Biochemie, Köln

Dexamethason Firma Sigma Dexamethason-21-isonicotinat Pharmakologie, Tierärztliche

Hochschule Hannover Essigsäure (100 %) Merck KGaA, Darmstadt Fluocortolon-Stammlösung (1000 µg/ml) Institut für Biochemie, Köln Kalilauge (10 N) Institut für Biochemie, Köln Kaliumcarbonat KMF Laborchemie GmbH,

Lohmar L-Cystein SERVA Electrophoresis GmbH,

Heidelberg Methanol, vor Gebrauch destilliert Institut für Biochemie, Köln Natrium-Acetat-Puffer (4 mol/l) Institut für Biochemie, Köln Natriumhydrogencarbonat KMF Laborchemie GmbH,

Lohmar n–Pentan Merck KGaA, Darmstadt Phophatpuffer (0,8 mol/l) Institut für Biochemie, Köln Salzsäure (10 N) Merck KGaA, Darmstadt tertiär Butanol Merck KGaA, Darmstadt tertiär Butylmethylether (TBME), vor Gebrauch destilliert

KMF Laborchemie GmbH, Lohmar

Tabelle 6: verwendete Chemikalien

3.2. Herstellung von Standardlösungen

Zur Quantifizierung des Dexamethasongehaltes wird gegen einen Referenzstandard

verglichen. Zur Herstellung des Dexamethasonstandards wurden 10 mg Dexamethason

(Firma Sigma) in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben eingewogen und dieser bis zur

Markierung des Kolbens mit destilliertem Methanol aufgefüllt. Der Inhalt wurde gut

durchmischt. Der so entstandene Referenzstandard hatte eine Konzentration von 1 mg/ml.

Aus dieser Lösung wurden durch anschließende Verdünnungsschritte mit wiederum Methanol

weitere Dexamethasonstandards mit den Konzentrationen 10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,1µg/ml und


56

0,01 µg/ml hergestellt. Die Referenzstandards wurden über den gesamten Zeitraum der

Probenaufarbeitung bei -20 °C aufbewahrt.

3.3. Wahl und Herstellung des internen Standards

Aufgrund seiner großen strukturellen Ähnlichkeit, seiner Stoffgruppenzugehörigkeit, seines

chemischen Verhaltens und seiner reproduzierbaren Ergebnisse in wiederholten

Kalibrierungen im Vergleich zum Dexamethason wurde Fluocortolon (6α-Fluoro-16α-methyl-

1-dehydrocorticosteron) als interner Standard gewählt.

Zur Herstellung des internen Standards wurden 10 µl einer 1000 µg/ml Fluocortolon-

Stammlösung in einen 10 ml fassenden Erlenmeyerkolben vorgelegt und bis zur Markierung

des Kolbens mit destilliertem Methanol aufgefüllt, und der Inhalt durchmischt. Der

entstandene Standard hatte eine Konzentration an Fluocortolon von 1 µg/ml.

Dem internen Standard, welcher den aufzuarbeitenden Urinproben zugesetzt wurde, wurde,

bei gleicher Fluocortolonkonzentration, zusätzlich noch 250 µl einer 1000 µg/ml D5-

Androsteron-glucuronid-Lösung zusetzt. Diese sollte als Hydrolysemarker dienen. Ein

Hydrolysemarker zeigt als Indikator die Vollständigkeit einer abgelaufenen Hydrolyse. In

dieser Studie wurden mittels Hydrolyse die an Dexamethason gebundenen Glucuronide

abgespalten und die Gesamtfraktion an Dexamethason frei. Die Vollständigkeit dieser

abgelaufenen Hydrolyse wurde, wie in Kapitel IV.3. gezeigt, durch das eingesetzte D5-

Androsteron-glucuronid-Lösung überprüft. Die internen Standards wurden ebenfalls bei -20

°C gelagert.

3.4. Entwicklung der angewandten Methoden

Im Rahmen der Routinediagnostik besteht im Institut für Biochemie der Sporthochschule in

Köln eine Analysemethode zum Nachweis von Glucocorticosteroiden im Pferdeplasma und –

urin. Diese Methode wurde auf die Detektion von Dexamethason abgestimmt.

Die Leer-Plasmaproben und die Leer-Urinproben wurden jeweils mit einer vorher

festgelegten Menge Dexamethason sowie einer definierten Menge internem Standard versetzt,

so dass Kalibrationsreihen beider Matrices entstanden. Diese wurden nach den bestehenden

Analysemethoden aufgearbeitet und anschließend mit der in Kapitel III.3.5. beschriebenen

Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)-Methode gemessen.


57

Die gemessenen Dexamethasonkonzentrationen lagen im Blut jedoch deutlich unter den zuvor

zugegebenen Dexamethasonkonzentrationen. Aufgrund dieser Konzentrationsunterschiede

mussten Veränderungen an der Methode vorgenommen werden. Die eingesetzte

Plasmamenge sowie die Menge des zum Anlösen der bearbeiten Plasmaprobe verwendeten

Methanols wurden verdoppelt. Die eingesetzte Urinmenge blieb gleich. Jedoch wurde bei der

Aufarbeitung der Urinproben die Menge des Extraktionsmittels (tertiär Butylmethylether) um

1 ml verringert.

3.5. Chromatographie/HPLC

Zur Probenmessung wurde die nachfolgend beschriebene Kombination eines Hochleistungs-

Flüssigchromatographen und eines Massenspektrometers (HPLC/MS/MS) genutzt.

HPLC:

Gerät: HP Series 1100 Liquid Chromatograph (Waldbronn, Germany)

Säule: Merck LiChroCART®RP 18 endcapped 55x4 mm

Eluent: A: H2O, 4 mmol Ammoniumacetat /l, 0,1 ml Essigsäure (100 %)/l; ph: 3,5

B: Acetonitril

Gradient:

Tabelle 7: Gradientenbedingungen

Injektionsvolumen: 20 µl

Run Time: 9 min

Post Time: 3, 5 min

Schritt Zeit [min] Flussrate [µl/min] Eluent A(%) Eluent B(%)1 0,10 500 90 10 2 8,00 500 10 90 3 9,00 500 10 90 4 9,01 500 90 10 5 12,51 500 90 10


58

Massenspektrometer:

Gerät: Perkin Elmer Sciex API 2000 Triple-Quadrupol-Massenspekrometer (Foster City,

California, USA)

Interface Temperature: 475°C

Ionenquelle: APCI

Ionisationseinstellung: positiv

Aquisitionseinstellung: MRM

Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10E-5 torr

Kollisionsenergie: optimiert für jedes Ionenprodukt

3.6. Hydrolyseversuche Urin

Um in den Urinproben die Gesamtmenge an Dexamethason, d.h. sowohl das frei vorliegende

Dexamethason als auch den glucuronidiert vorliegenden Anteil an Dexamethason zu erfassen,

wurden der eigentlichen Analysemethode versuchsweise verschiedene Hydrolysen

vorgeschaltet. Dazu wurden Urinproben mit einer vorher ermittelten

Dexamethasonkonzentration verwendet.

Da wenige Erfahrungswerte vorlagen, welche Form der Hydrolyse zu diesem Zweck am

effektivsten ist, wurden drei Hydrolysearten getestet.

1) Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli

Es wurden 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard versetzt.

Durch Zugabe von 1,5 ml Phosphat-Puffer (0,8 mol/l) wurde der Urin auf einen ph-Wert von

7 eingestellt. Es folgte die Zugabe von 70 µl ß-Glucuronidase von Escherichia coli und

anschließende Inkubation für eine Stunde bei 50 °C im Wasserbad. Nach Ablauf der

vorgesehenen Inkubationszeit wurden die Proben nach der in Kapitel III.5.2. beschriebenen

Analysemethode aufgearbeitet.

2) Hydrolyse mit ß-Glucuronidase /Arylsulfatase von Helix pomatia

Es wurden wiederum 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard

versetzt. Durch Zugabe von 0,4 ml Natrium-Acetat-Puffer (4 mol/l) wurde der Urin auf einen


59

ph-Wert von 5,2 eingestellt. Es folgte die Zugabe von 50 µl ß-Glucuronidase/Arylsulfatase

von Helix pomatia und anschließende Inkubation für zwei Stunden bei 50 °C im Wasserbad.

Nach Ablauf der vorgesehenen Inkubationszeit wurden die Proben nach der in Kapitel III.5.2.

beschriebenen Analysemethode aufgearbeitet.

3) Saure Hydrolyse

Nochmals wurden 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe mit 50 µl internem Standard

versetzt. Es folgte die Zugabe von 0,5 ml Salzsäure (10 N) und ca. 100 mg L-Cystein. Nach

Ablauf der vorgesehenen Inkubationszeit von einer Stunde bei 100 °C im Heizblock wurden

0,5 ml Kalilauge (10 N) zugegeben. Anschließend wurden die Proben nach der in Kapitel

III.5.2. beschriebenen Analysemethode aufgearbeitet.

Die Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli und ß-Glucuronidase von Helix

pomatia erwiesen sich beide als effektiv. Die zuvor ermittelten Dexamethasonkonzentrationen

der Proben wurden überschritten. Die saure Hydrolyse erbrachte einen geringen Anstieg der

Dexamethasonkonzentration und wurde somit bei weiteren Hydrolyseversuchen außer Acht

gelassen.

In einem weiteren Schritt wurde die Hydrolysedauer verlängert. Die Hydrolysen mit ß-

Glucuronidase von Escherichia coli bzw. Helix pomatia wurden wiederholt und die

Probenansätze bei 37 °C über Nacht für 14 Stunden im Wasserbad inkubiert. In beiden Fällen

wurde eine Erhöhung der Dexamethasonausbeute von 200 % bis knapp 300 % erzielt. In den

Probenansätzen der Hydrolyse mit Helix pomatia schwankte der Hydrolysemarker sehr stark,

obwohl dieser nach abgelaufener und anzunehmend vollständiger Hydrolyse reproduzierbar

gleich bleiben sollte. Dieses Kriterium wurde in den Probenansätzen der Hydrolyse mit ß-

Glucuronidase von Escherichia coli besser erfüllt.

Anhand dieser Erkenntnisse wurde die Hydrolyse mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli

als Hydrolyse der Wahl festgelegt.

3.7. Bewertung der Methodenentwicklung

Mit den Erkenntnissen aus den Vorarbeiten zur Methodenentwicklung konnte gezeigt werden,

dass die Methoden eine eindeutige und reproduzierbare Darstellung der zu untersuchenden


60

Substanzen im Chromatogramm erbrachten. Sie wurden als geeignet angesehen, so dass sie

zur Aufarbeitung der Vorversuchsproben sowie der Hauptversuchsproben verwendet wurden.

Weiterhin konnte eine Entscheidung bezüglich der Entnahmezeiten der Blut– und Urinproben

getroffen werden. Da Dexamethason in den letzten entnommenen Proben des Vorversuchs

noch deutlich nachzuweisen war, wurde der Probenentnahmezeitraum des nachfolgenden

Hauptversuches für Blut bei Voren® Suspension um acht Tage, bei Voren®-Depot um neun

Tage verlängert. Der Entnahmezeitraum für die Urinproben verlängerte sich bei Voren®

Suspension um dreizehn Tage, bei Voren®-Depot um wiederum neun Tage.

4. Methodenvalidierung

Vor Aufarbeitung und Messung der Hauptversuchsproben sollte mittels Methodenvalidierung

gezeigt werden, dass die entwickelten Analysemethoden geeignet waren, und sowohl sichere

als auch reproduzierbare pharmakokinetische Daten für den Wirkstoff Dexamethason

lieferten. Für die Validierung wurden Leer-Plasma- und Leer-Urinproben sowie tagesaktuelle

Kalibrationskurven mit mindestens fünf Kalibrationspunkten nach den in Kapitel III.5.1. und

III.5.2. beschriebenen Analysemethoden aufgearbeitet.

Die nachfolgend beschriebenen Kriterien galten in dieser Studie als Validierungsparameter.

4.1. Selektivität

Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode, verschiedene nebeneinander vorliegende und zu

bestimmende Komponenten ohne gegenseitige Störung zu erfassen und sie somit eindeutig zu

identifizieren (KROMIDAS, 1999). Man versteht darunter auch das Maß für die Güte der

Trenntechnik einer HPLC–Methode. Sie ist gekennzeichnet durch eine ausreichende

Trennung der zu analysierenden Substanz von allen denkbaren Störsubstanzen inklusive der

Matrix, was sich im Chromatogramm anhand der unterschiedlichen Retentionszeiten der

Peaks darstellt.

Um die Selektivität der gewählten HPLC-Methode abzusichern, wurden Leer–Plasmaproben

und Leer-Urinproben von sechs Pferden an den in Tabelle 8 aufgezeigten Kalibrationspunkten

aufgearbeitet und analysiert.


61

Leer-Matrix Konzentrationspunkte der Kalibrationskurve [ng/ml]

Plasma 0,1 / 0,25 / 0,5 / 1 / 1,5 / 2 / 5 Urin 0,5 / 1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 / 20 / 50 Tabelle 8: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur

Bestimmung der Selektivität

4.2. Linearität

Mit dem Begriff der Linearität wird in der Analytik die Korrelation zwischen Signal des

Detektors und Konzentration des Analyten verbunden. Diese Korrelation wird durch eine

Kalibrierfunktion, die sich als eine Gerade darstellen sollte, beschrieben. Linearität ist somit

die Fähigkeit einer Methode, innerhalb eines gegebenen Konzentrationsbereiches Ergebnisse

zu liefern, die der Konzentration des Analyten direkt proportional sind (KROMIDAS, 1999).

Die Überprüfung der Linearität erfolgte an sechs Leermatrixproben für Plasma und Urin.

Diese wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des Analyten versetzt und zwar so, dass

sie den gesamten Messbereich abdeckten, äquidistant waren und aus zwei Wiederholungen

eines jeden Messpunktes bestanden (DIN 38402, 1986). Messpunkte unterhalb der

Nachweisgrenze und Leermatrixwerte dürfen nicht zu der Kalibrationskurve hinzugerechnet

werden (DIN 32645, 1994). Die nach diesen Kriterien dotierten Leermatrixproben der

Kalibrationsreihe wurden an drei aufeinander folgenden Tagen jeweils aufgearbeitet und

gemessen.

Die Kalibrationspunkte wurden wie folgt festgelegt (Tabelle 9):

Leer-Matrix Konzentrationspunkte der

Kalibrationskurve [ng/ml] Plasma 0,1 / 0,25 / 0,5 / 1 / 1,5 / 2 / 3 / 4 Urin 0,5 / 1 / 2,5 / 5 / 7,5 / 10 /15 / 20 / 25 Tabelle 9: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur

Bestimmung der Linearität

Die nach der chromatographischen Messung erhaltenen Rohdaten werden gegen die

Konzentration der einzelnen Kalibrationspunkte aufgetragen, graphisch dargestellt und

standardmäßig visuell auf Ausreißer und Linearität untersucht.


62

4.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze

Die Nachweisgrenze (= Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) ist die niedrigste

Konzentration eines Analyten, bei der das Messignal ein vom Leerwert unterscheidbares

Instrumentensignal liefert.

In dieser Studie erfolgte die Bestimmung der Nachweisgrenze anhand der

Kalibrierkurvenmethode, einer indirekten Methode nach DIN 32645 (1994). Hierbei wird

zunächst aus den Residuen der linearen Regression die Reststandardabweichung sxo aus der

Summe der Abweichungsquadrate Qx der Freiheitsgraden der linearen Kalibration f errechnet.

sxo = f

Qx

sxo = Reststandardabweichung

Qx = Summe der Abweichungsquadrate

f = Freiheitsgrade der linearen Kalibration

Mittels dieser Standardabweichung sxo und dem errechneten Mittelwert X aller

Kalibrationskonzentrationen wird dann das Konfidenzintervall (Vertrauensbereich, VB) für

den Merkmalswert Null (VB0) errechnet, wobei eine t-Verteilung für eine vorgesehene

Fehlerwahrscheinlichkeit α angenommen wird.

VB0 = sxo · t f, α · 1²1 ++QxX

n

VB0 = Vertrauensbereich (Konfidenzinterval) für den Merkmalswert Null

sxo = Reststandardabweichung

t f, a = ein vorgegebener Tabellenwert

X = Mittelwert

Qx = Summe der Abweichungsquadrate

n = Anzahl der Proben

Der Term t f, a ist ein vorgegebener Tabellenwert oder kann alternativ mit Hilfe der unten

aufgeführten Formel berechnet werden:


63

t f, α = TINV (α; f )

TINV (α; f ) = t-Wert der t-Verteilung unter den Bedingungen des Freiheitsgrades (f) sowie der

Fehlerwahrscheinlichkeit (α)

Über die Steigung α der linearen Regressionsgeraden kann die Nachweisgrenze (NG) mit

einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α folgendermaßen errechnet werden:

NG = α

οVB

NG = Nachweisgrenze

VB0 = Vertrauensbereich (Konfidenzinterval) für den Merkmalswert Null

a = Fehlerwahrscheinlichkeit

Nach DIN 32645 (1994) beschreibt die Bestimmungsgrenze die kleinste quantifizierbare

Menge eines Analyten und wird somit auch als Quantifizierungsgrenze (= limit of

quantification, LOQ) bezeichnet. Es ist die Menge des Analyten, die mit einer vorgegeben

Richtigkeit und Präzision quantitativ erfasst werden kann. Dieser Punkt entspricht dem

niedrigsten Kalibrationspunkt bei einer Reproduzierbarkeit von ≤ 20 % und einer

Messgenauigkeit von 100 ± 20 % für diesen Punkt. Der relative Fehler ist kleiner oder gleich

20 % (EHSLC, 2002).

Zur Bestimmung der Quantifizierungsgrenze wurden fünf Proben aus dem gewünschten

Kalibrationsbereich an drei aufeinander folgenden Tagen aufgearbeitet und

chromatographisch gemessen.

4.4. Richtigkeit

Die Richtigkeit ist das Maß der Übereinstimmung zwischen einem ermittelten und einem

erwarteten Referenzwert. Man bezieht sich demnach auf diesen Referenzwert, der als

fehlerfrei und richtig gilt.

In dieser Studie wurde die Richtigkeit überprüft, indem jeweils fünf Leer-Matrixproben für

Plasma und Urin mit einer niedrigen (low qualitiy control standard, LQC), einer mittleren

(midrange quality control standard, MQC) und einer hohen (high quality control standard,


64

HQC) Kalibrationskonzentration des zu analysierenden Stoffes dotiert wurden. Anschließend

wurden die Probenansätze an drei aufeinander folgenden Tagen aufgearbeitet und

chromatographisch gemessen (EHSLC, 2002). Die ermittelten Ergebnisse sollten für den

mittleren und den hohen Kalibrationspunkt nicht mehr als 15 %, für den niedrigsten

Kalibrationspunkt nicht mehr als 20 % vom Referenzwert abweichen.

Die relative Abweichung wird auch als relativer Fehler (RE) bezeichnet.

Um die relative Abweichung des ermittelten vom erwarteten Referenzwert zu bestimmen,

werden die mittlere berechnete Konzentration (A) und die theoretische Konzentration (B)

nach folgender Formel in Beziehung gesetzt:

RE % = [(A-B)/B·x·100)]

4.5. Präzision

Die Präzision ist das Maß für die Übereinstimmung unabhängiger Analysenergebnisse

untereinander oder einfach ausgedrückt das Maß für die Streuung von Analysenergebnissen.

Als Streuungsmaß, und damit als Präzisionsmaß, wird die Standardabweichung s verwendet.

Weiterhin unterscheidet man die Wiederholpräzision sw (= intraday reproducibility oder

Tagespräzision) von der Zwischenpräzision sb (= interday reproducibility).

Die Wiederholpräzision beschreibt die Präzision der Tagesserien, somit eine Aufarbeitung

unter Wiederholbedingungen, mit demselben Verfahren, identischen Proben, im selben Labor,

durch denselben Bearbeiter und mit derselben Geräteausrüstung.

Die Zwischenpräzision dient der Ermittlung der Präzision zwischen den Tagesserien.

Zur Bestimmung der beiden genannten Formen der Präzision wurden, wie auch bei

Ermittlung der Richtigkeit, an drei aufeinander folgenden Tagen jeweils fünf Leer-

Matrixproben für Plasma und Urin mit einer niedrigen (LQC), einer mittleren (MQC) und

einer hohen (HQC) Kalibrationskonzentration des zu analysierenden Stoffes dotiert und

anschließend aufgearbeitet und chromatographisch gemessen.

Nach Vorgaben des EHSLC (EHSLC, 2002) dürfen die Präzisionen relativ zum gemessenen

Mittelwert von diesem nicht mehr als 15 % für den hohen und den mittleren

Kalibrationspunkt bzw. nicht mehr als 20 % für den niedrigen Kalibrationspunkt abweichen.

Die Wiederholpräzision und die Zwischenpräzision errechnen sich wie folgt (HERBOLD u.

SCHMITT, 2000):


65

sw = ∑

∑ ⋅Tagesserie

TagesserieTagesserie

fsf ²)(

sb = Tage

gesamtTagesserie

fXX∑ − )²(

sb = Zwischenpräzision

sw = Wiederholpräzision

f = Freiheitsgrad

s² = Varianz

X = errechneter Mittelwert

4.6. Stabilität

Ein Analyt in einer Kontrollprobe gilt unter den Aufbewahrungsbedingungen für einen

definierten Zeitraum so lange als stabil, wie die Gehaltsdifferenz einen bestimmten, vorher

festgelegten Schwellenwert nicht überschreitet (KROMIDAS, 1999).

Die Substanzstabilität muss über den gesamten Zeitraum zwischen Probenentnahme und

Quantifizierung gewährleistet sein und auch gezeigt werden.

Zur Ermittlung der Stabilität wurden für Plasma und Urin jeweils zwölf hohe, zwölf mittlere

und zwölf niedrige Kalibrationsaliquots durch Zugabe des Referenzstandards hergestellt. Pro

Konzentrationspunkt und Matrix wurden sechs Proben direkt aufgearbeitet,

chromatographisch gemessen und anhand einer aktuellen Kalibrierung quantifiziert. Die

weiteren sechs Proben je Konzentration und Matrix wurden unter identischen Bedingungen

wie die Messproben gelagert.

Nach Vorschrift des EHSLC (EHSLC, 2002) wurden diese tiefgefrorenen und für 164 Tage

zurückgestellten Plasmaproben, sowie die für 155 Tage zurückgestellten Urinproben

zusammen mit den letzten zu messenden Proben des Hauptversuches ebenfalls aufgearbeitet,

chromatographisch gemessen und anhand einer aktuellen Kalibrierung quantifiziert.

Die aliquotierten Probenansätze des Stabilitätstestes hatten die in Tabelle 10 aufgeführten

Konzentrationen:


66

Probenansatz Konzentration pro ml Probe [ng/ml] Plasma 0,25 / 1 / 3 Urin 1 / 5 / 15

Tabelle 10: Dexamethasonkonzentrationen in den einzelnen Probenansätzen zur Bestimmung

der Stabilität

Die Mittelwerte eines jeden Kalibrationspunktes beider Gruppen wurden unter Anwendung

des t-Tests verglichen.

4.7. Wiederfindung

Die Wiederfindung oder die Wiederfindungsrate ist das Verhältnis des unter

Wiederholbedingungen gemessenen Mittelwerts zum richtigen Wert des Analyten in einer

Probe (KROMIDAS, 1999). Mit Hilfe der Wiederfindungsrate kann die gesamte Methode,

genauer gesagt ihre Extraktionseffektivität, bewertet werden. Eine hohe Wiederfindungsrate

bedeutet, dass während sämtlicher Schritte der Analysemethode keine nennenswerten

Substanzverluste zu verzeichnen sind.

In dieser Studie erfolgte die Bestimmung der Wiederfindung in Anlehnung an die DIN EN

ISO/IEC 17025 (2005).

Die Wiederfindung wird anhand von realistischen, also im Kalibrationsbereich liegenden

Konzentrationen bestimmt. Zwölf Plasmaproben und zwölf Urinproben wurden aufgearbeitet.

In den Proben 1 bis 6 jeder Matrix wurde die Substanz, hier Dexamethason–

Referenzstandard, zu Beginn der Aufarbeitung zugesetzt. Dies ergab für die Plasmaproben

eine Konzentration von 2,5 ng/ml. Die Urinproben wiesen eine Konzentration von 10 ng/ml

auf. Der interne Standard (Fluocortolon) wurde erst im letzten Schritt der Aufarbeitung, also

zum Anlösen der am Rotationsverdampfer eingeengten Probe, zugesetzt. Die Proben wurden

nun chromatographisch gemessen.

Die Proben 7 bis 12 jeder Matrix wurden ohne vorherige Zugabe von Dexamethason-

Referenzstandard oder internem Standard aufgearbeitet. Erst zum Anlösen der eingedampften

Probe wurden Referenzstandard und interner Standard zugegeben. Die sich anschließende

Berechnung der Wiederfindung des Analyten erfolgt nach:


67

Wiederfindung (Analyt) (%) = 100127Proben61Proben

Standards)internendesreaAnalyten/Ades(Area

Standards)internendesreaAnalyten/Ades(Area ⋅−−

MWMW

MW = Mittelwert

Zusätzlich wurde auch die Wiederfindungsrate des internen Standards (IS) bestimmt.

Pro Matrix wurden sechs weitere Proben aufgearbeitet. In den Probenansätzen 13 bis 18 jeder

Matrix wurde der interne Standard zu Beginn der Aufarbeitung zugegeben, der

Dexamethason-Referenzstandard wurde erst zum Anlösen der eingedampften Proben

hinzugefügt. Es folgten nun ebenfalls die chromatographische Messung und abschließende

Berechnung nach folgender Formel:

Wiederfindung (IS) (%) = 100127Proben1813Proben

Analyten)desAreaStandards/internendes(Area

Analyten)desAreaStandards/internendes(Area ⋅−−

MWMW

MW = Mittelwert

5. Aufarbeitung der Plasma- und Urinproben des Hauptversuches

5.1. Aufarbeitung der Plasmaproben (mit täglichen Kalibrationskurven)

Wie auch für jede Probenaufarbeitung der Validierung wurden bei der Aufarbeitung der

Plasmaproben des Hauptversuches tägliche Kalibrationskurven mit mindestens fünf

Kalibrationspunkten erstellt, über welche die Proben anschließend quantifiziert werden

konnten. Die gewählten Kalibrationspunkte deckten den gesamten Arbeitsbereich ab und

richteten sich nach den erwarteten Konzentrationen der Plasmaproben (Tabelle 8 in Kapitel

III.4.1.).

Zur Aufarbeitung der Plasmaproben wurden 2 ml der jeweiligen Plasmaprobe in einem

Reagenzglas vorgelegt. Dann wurden 50 µl des internen Standards zugegeben, so dass eine

Fluocortolonkonzentration von 25 ng/ml Plasma erreicht wurde. Es erfolgte eine Zugabe von

100 µl einer 5%igen wässrigen Kaliumcarbonat-Lösung und von 500 µl tertiär Butanol. Die

Zugabe von Kaliumcarbonat-Lösung dient der Einstellung des pH-Wertes auf ph 9,6. Der

Lösungsvermittler tertiär Butanol bewirkt eine partielle Fällung der Plasmaproteine und


68

Blutfette. Die Plasmaprobe wird somit klarer, und die Phasentrennung zwischen der Ether-

und der Plasmaphase wird verbessert.

Anschließend wurde die Probe auf dem Vortexschüttler für fünf Sekunden durchmischt.

Durch Hinzufügen von 8 ml tertiär Butylmethylether und weiterer Durchmischung der Probe

für zehn Minuten auf dem Schüttler erfolgte die Extraktion.

Die sich im Reagenzglas als Überstand darstellende Etherphase wurde nun mit Hilfe einer

Pasteurpipette in ein neues Reagenzglas überführt und am Rotationsverdampfer bei ca. 50 °C

eingeengt. Der trockene Rückstand wurde mit 2 ml destilliertem Methanol und 100 µl Milli-

Q-Wasser angelöst und fünf Sekunden mittels Vortexschüttler durchmischt. Eine Zugabe von

5 ml n-Pentan folgte direkt. Hieran schloss sich eine weitere Durchmischung für fünf

Minuten, wiederum auf dem Schüttler, an. Der Überstand der Probe, in diesem Falle nun die

n-Pentanphase darstellend, wurde verworfen und die verbleibende methanolische Phase

wurde mittels Rotationsverdampfer bei 50 °C zur Trockene eingeengt. Abschließend wurde

der Rückstand der Probe mit 100 µl destilliertem Methanol angelöst und per Pasteurpipette in

ein HPLC-Messgefäß mit Mikroeinsatz überführt.

Die sich anschließende Messung erfolgte nach den in Kapitel III.3.5. beschriebenen

Einstellungen des Chromatographen.

Die gesamte Aufarbeitungsmethode findet sich schematisch dargestellt in Abbildung 30 im

Anhang.

5.2. Aufarbeitung der Urinproben (mit täglichen Kalibrationskurven)

Auch bei der Aufarbeitung der Urinproben des Hauptversuches wurden tagesaktuelle

Kalibrationskurven mit fünf Kalibrationspunkten zur anschließenden Quantifizierung erstellt.

Die gewählten Kalibrationspunkte deckten auch hier den erwarteten Konzentrationsbereich ab

(Tabelle 8 in Kapitel III.4.1.).

In ein Reagenzglas wurden 5 ml der zu untersuchenden Urinprobe pipettiert. Die Zugabe von

50 µl des internen Standards, der in dieser Aufarbeitung neben Fluocortolon noch den

Hydrolysemarker D5-Androsteron-glucuronid enthielt, ergab pro ml der Probe eine

Konzentration von 10 ng Fluocortolon/ml und 2500 ng D5-Androsteron-glucuronid/ml. Durch

Zugabe von 1,5 ml Phosphat-Puffer (0,8 mol/l) wurde der pH-Wert der Probe auf 7

eingestellt, was mittels Alkalit-Papier geprüft wurde. Die Probe wurde durchmischt und

anschließend mit 70 µl ß-Glucoronidase von Eschericha coli versetzt.


69

Die Proben wurden über Nacht (14 Stunden) in einem auf 37 °C temperierten Wasserbad

inkubiert.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der pH-Wert der Probe durch Zugabe von ca. 2 g

Kaliumcarbonat/Natriumhydrogencarbonat-Gemisch auf pH 9,6 eingestellt. 6 ml tertiär

Butylmethylether wurden hinzugefügt und die Probe wurde für fünfzehn Minuten mittels

Schüttler durchmischt. Nach einem Zentrifugationsvorgang (zehn Minuten bei 1000

Umdrehungen pro Minute) wurde die organische Phase der Probe, der Überstand, mit Hilfe

einer Pasteurpipette in ein neues Reagenzglas überführt. Der verbleibende Rest wurde

verworfen. Mittels Rotationsverdampfer wurde die organische Phase bei 50 °C bis zur

Trockene eingeengt. Dieser eingeengte Rückstand wurde mit 100 µl destilliertem Methanol

angelöst, mittels Pasteurpipette in ein HPLC-Messgefäß mit Mikroeinsatz überführt und

chromatographisch gemessen.

Abbildung 31 im Anhang stellt die soeben beschriebene Methode nochmals schematisch dar.

6. Messung von Cortisol, Glucose und Kreatinin

6.1. Messung von Cortisol

Dieser Teil der Laborarbeit erfolgte im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und

Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

Die Cortisolkonzentrationen wurden in allen entnommenen Blutproben der zwölf Pferde

bestimmt.

Die Bestimmung der Cortisolkonzentrationen der Plasmaproben erfolgte mittels eines Enzym-

gekoppelten Immunnachweises (Enzym-linked Immunosorbent Assay, Elisa). Hierbei

handelte es sich um einen spezifischen Cortisol-Elisa der Firma IBL Hamburg. Die

Nachweisgrenze dieses Testsystems liegt bei 2,5 ng/ml Probe.

Grundlage dieses Verfahrens ist eine kompetitive Antigen-Antikörper-Reaktion, was eine

rasche Untersuchung und auch Quantifizierung eines Antigens in einer Probe erlaubt

(LEHNINGER, 2001). Die Oberfläche der Vertiefungen der Mikrotiterplatte, einer 96-Loch-

Polysterol-Platte, ist mit monoklonalen Antikörpern bedeckt, welche gegen die

Cortisolmoleküle in der jeweiligen Probe gerichtet sind. Zusätzlich zur Probe wurde ein

Cortisol-Peroxidase-Konjugat in die Vertiefungen gegeben, welches mit dem zu

bestimmenden Cortisol um die Bindungsstellen an den monoklonalen Antikörpern


70

konkurriert. Nach einer Inkubationszeit von 60 Minuten wurde das ungebundene Konjugat

herausgewaschen, um weitere Bindungen zu verhindern. Dann erfolgte die Zugabe einer

Enzym-Substratlösung, welche die entstandenen Antigen-Antikörper-Komplexe sichtbar

machen sollte. 15 Minuten nach Zugebe dieser Enzym-Substratlösung wurde die

enzymatische Reaktion angehalten, und nach Ablauf von weiteren 10 Minuten photometrisch

bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.

Neben den Proben wurde zusätzlich eine Cortisol-Standardreihe (0 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml,

100 ng/ml, 200 ng/ml, 400 ng/ml, 800 ng/ml) aufgearbeitet. Die ermittelten Extinktionen der

Kalibrationspunkte wurden gegen ihre Konzentration graphisch aufgetragen. Durch

Rückrechnung über die Regressionsgleichung der erhaltenen Kalibrierfunktion konnten die

Cortisolkonzentrationen der Plasmaproben berechnet und quantifiziert werden. Die

ermittelten Cortisolkonzentrationen wurden gegen die Entnahmezeit aufgetragen und

graphisch dargestellt.

6.2. Messung von Glucose

Die Bestimmung von Glucose erfolgte mittels enzymatischer Bestimmung durch die Klinik

für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der Stiftung

Tierärztliche Hochschule Hannover. Alle Plasmaproben jedes Pferdes wurden untersucht. Die

vor Applikation der Dexamethason-21-isonicotinat-präparate entnommenen Plasmaproben

dienten als Kontrolle des Glucoseausgangswertes jedes Pferdes.

6.3. Messung von Kreatinin

Kreatinin wird im Wesentlichen glomerulär filtriert und ermöglicht hauptsächlich Aussagen

über das Glomerulumsystem (KRAFT u. DÜRR, 1999). Zur Überprüfung der

Nierengesundheit der an der Studie beteiligten Pferde wurden die Kreatininwerte von drei

Plasmaproben pro Pferd bestimmt. Die Bestimmung erfolgte ebenfalls durch die Klinik für

kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der Stiftung

Tierärztliche Hochschule Hannover.


71

7. Statistische Auswertung

Nach KRAFT u. DÜRR (1999) für beide Tiergruppen mittels der vor der Dexamethason-21-

isonicotinat-Applikation entnommen Leerplasmaproben ein Normalbereich für Cortisol

errechnet. Dieser Referenzbereich wurde als ein nichtparametischer Referenzbereich in Form

eines 95%-Perzentil-Intervalls dargestellt, welcher einseitig definiert war. Es wurde nur die

Untergrenze festgelegt. Diese Art von Referenzbereich ist von der Verteilung der Messwerte

unabhängig und kommt biologisch-medizinischen Verhältnissen am nächsten.

Die statistische Auswertung der ermittelten Cortisolkonzentrationen erfolgte mit dem

Statistikprogramm SigmaStat (Jandel Cooperation). Die Cortisoleinzelwerte aller Pferde

wurden berücksichtigt. Der Cortisolausgangswert wurde mit den Cortisolwerten jedes

Entnahmezeitpunktes verglichen. Es wurde der Mann-Whitney-U-Test als nichtparametischer

Test verwendet.

Im Rahmen der Bewertung der statistischen Ergebnisse wurde ein p-Wert von < 0,05 als

signifikant (95 %), von < 0,01 als hochsignifikant (99 %) und von < 0,001 als

höchstsignifikant (99,9 %) angesehen.

Pharmakokinetischen Berechnungen konnten aufgrund der sehr niedrigen

Plasmakonzentrationen an Dexamethason nicht durchgeführt werden.

Ergebnisse

72

IV. Ergebnisse

1. Ergebnisse der Analysemethoden

1.1. Massenspektrum von Dexamethason

Abbildung 7 zeigt das Fragmentationsverhalten des Analyten Dexamethason im

Massenspektrum sowie seine Strukturformel. Die charakteristischen Ionenübergänge und

entstandenen Hauptfragmente werden bei m/z 392,9 und m/z 373,1 registriert. Die

Retentionszeit von Dexamethason beträgt nach der beschriebenen Einstellung der HPLC 6,56

Minuten.

Abb. 7: Massenspektrum und Strukturformel von Dexamethason

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

392.9

120.9

91.1

373.1147.1

355.1 77.1

115.1 237.1

337.1 128.1 107.1

319.1 170.9104.9 278.9131.1 95.1 79.1

158.9 309.1 239.1172.9117.1 262.9103.1 223.1 301.1151.9 65.1 325.1 225.1181.1 261.197.1 198.9168.9 83.1 272.9

O

OH OH

O OH

F

Ergebnisse

73

1.2. Massenspektrum von Fluocortolon

Der interne Standard Fluocortolon zeigt bei den angegebenen Gerätebedingungen ein

typisches Fragmentationsverhalten mit charakteristischen Ionen bei m/z 377,1 und m/z 303,3.

Abbildung 8 ist weiterhin die Strukturformel des Moleküls zu entnehmen. Die Retentionszeit

von Fluocortolon beträgt 7,06 Minuten.

Abb. 8: Massenspektrum und Strukturformel von Fluocortolon

2. Validierung der Analysemethoden

2.1. Selektivität

Um die Selektivität der Analysemethode zu zeigen, wurden Chromatogramme von

Leermatrixproben sowie Chromatogramme von mit Dexamethason bzw. Fluocortolon

dotierten Plasma- und Urinproben überprüft. Anhand zufrieden stellender

chromatographischer Auflösung der Peaks und ausreichenden Abständen zwischen den

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

171.1

377.1

120.9

303.3

90.9

128.1 321.3

77.1 147.1

339.3 115.1

191.1107.1 138.9 165.1 359.3279.183.1 261.1197.1101.1 235.1117.1 159.165.1 288.1211.1 247.1 293.3 69.1 179.1 232.997.1 357.3163.1 110.9

O

OH

O OH

F

Ergebnisse

74

einzelnen Substanzpeaks stellte sich Dexamethason nach einer Retentionszeit 6,56 Minuten

dar. Die Retentionszeit von Fluocortolon belief sich auf 7,06 Minuten.

In den Abbildungen 9, 10 und 11 sind sowohl die substanzspezifischen Peaks für

Dexamethason und Fluocortolon zu den jeweiligen Retentionszeiten in Plasma und Urin als

auch die Leermatrixproben für Plasma und Urin dargestellt.

Abb. 9: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer

Leerplasmaprobe (links) und einer mit 5 ng/ml Dexamethason dotierten Plasmaprobe (rechts)

zum Zeitpunkt der Retention von Dexamethason (6,56 Minuten)

Abb. 10: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer Leerurinprobe

(links) und einer mit 50 ng/ml Dexamethason dotierten Urinprobe (rechts) zum Zeitpunkt der

Retention von Dexamethason (6,56 Minuten)

Ergebnisse

75

Abb. 11: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer mit 25 ng/ml

Fluocortolon (interner Standard) dotierten Leerplasmaprobe (links) und einer mit 10 ng/ml

Fluocortolon (interner Standard) dotierten Leerurinprobe (rechts) zum Zeitpunkt der

Retention von Fluocortolon (7,06 Minuten)

2.2. Linearität

Die Kalibrationskurven für Plasma und Urin wurden, wie in Kapitel III.4.2. beschrieben, an

drei Tagen aufgearbeitet. Im Plasma wurde die Kalibrationskurve in einen unteren (0,1 bis 1

ng/ml) und einen oberen (1 bis 4 ng/ml) Kalibrationsbereich eingeteilt. Im Urin erstreckte sich

der Kalibrationsbereich von 0,5 bis 25 ng/ml. Nach der Messung wurden diese

Kalibrationskurven für Plasma und Urin wie folgt ausgewertet:

Die erhaltenen Quotienten der Flächen von Dexamethason und Fluocortolon für Plasma und

Urin wurden gegen die erwarteten Konzentrationspunkte der Kalibration graphisch

aufgetragen. Abbildungen 12, 13 und 14 stellen beispielhaft die Kalibrationskurven für

Plasma und Urin dar. Visuell wurde jeweils eine Linearität festgestellt. Zur weiteren Analyse

wurde ein lineares Regressionsmodell angewandt. Die Kalibrationsgleichung (y = ax + b)

wurde nach dem Prinzip der kleinsten Abweichungsquadrate aus den ermittelten Quotienten

relativ zu den erwarteten Konzentrationen errechnet (DIN 32645, 1994). Die

Kalibrationsgleichungen und auch die dazugehörigen Korrelationskoeffizienten (R²) werden

in den graphischen Darstellungen angegeben.

Ergebnisse

76

y = 0,0905x + 0,0036R2 = 0,99

0,000,020,040,060,080,100,12

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2Konzentration Dexamethason [ng/ml]

Quo

tient

aus

Flä

che

Dex

amet

haso

n/Fl

äche

Flu

ocor

tolo

n

Abb. 12: Kalibrationskurve des unteren Kalibrationsbereiches für Dexamethason im Plasma

inklusive Geradengleichung und Korrelationskoeffizient

y = 0,0988x + 0,0072R2 = 0,99

0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,45

0 1 2 3 4 5Konzentration Dexamethason [ng/ml]

Quo

tient

aus

Flä

che

D

exam

etha

son/

Fläc

he

Fluo

cort

olon

Abb. 13: Kalibrationskurve des oberen Kalibrationsbereiches für Dexamethason im Plasma


Ergebnisse

77

y = 0,2556x - 0,0209R2 = 0,99

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

0 5 10 15 20 25 30

Konzentration Dexamethason [ng/ml]

Quo

tient

aus

Flä

che

Dex

amet

haso

n/Fl

äche

Flu

ocor

tolo

n

Abb. 14: Kalibrationskurve für Dexamethason im Urin inklusive Geradengleichung und

Korrelationskoeffizient

2.3. Nachweis- und Quantifizierungsgrenze

Für die in dieser Studie entwickelten und beschriebenen Aufarbeitungs- und

Chromatographiemethoden wurden anhand der in Kapitel III.4.3. dargestellten

Kalibrationsfunktion Nachweis– und Quantifizierungsgrenzen für Dexamethason in equinem

Plasma und Urin berechnet. Die ermittelten Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen für

Dexamethason sind Tabelle 11 zu entnehmen.

Matrix Nachweisgrenze [ng/ml] Quantifizierungsgrenze

[ng/ml] Plasma 0,12 0,25

Urin 0,67 1,00 Tabelle 11: Nachweis- und Quantifizierungsgrenze für Dexamethason in Plasma und Urin

2.4. Richtigkeit

Als Ergebnis der Prüfung auf Richtigkeit zwischen der ermittelten und der erwarteten

Konzentration ist hier der relative Fehler (RE) in Prozent angegeben.

Die relativen Fehler der an drei verschiedenen Tagen aufgearbeiteten Plasma- und Urinproben

im niedrigen, mittleren und hohen Kalibrationsbereich sind in den sich anschließenden

Tabellen 12 und 13 aufgeführt.

Ergebnisse

78

Konzentration [ng/ml]

Tag 1 Mittelwert

Tag 1 RE (%)

Tag 2 Mittelwert

Tag 2 RE (%)

Tag 3 Mittelwert

Tag 3 RE (%)

0,25 0,23 7,25 0,30 18,58 0,23 9,62 1 0,96 4,48 1,11 11,47 1,03 3,32 3 2,81 6,32 3,37 12,37 2,65 11,65

Tabelle 12: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit von

Dexamethason im Plasma

Konzentration

[ng/ml] Tag 1

Mittelwert Tag 1

RE (%) Tag 2

MittelwertTag 2

RE (%) Tag 3

Mittelwert Tag 3

RE (%) 1 0,96 4,09 1,16 16,41 1,10 10,13 5 4,53 9,41 4,88 2,31 4,73 5,42 15 13,57 9,51 14,19 5,41 14,06 6,24


Dexamethason im Urin

Alle Ergebnisse liegen im Rahmen der erlaubten Abweichung des theoretischen vom

ermittelten Wert, d.h. innerhalb einer Abweichung von 20 % im unteren und einer

Abweichung von 15 % im mittleren und hohen Kalibrationsbereich.

2.5. Präzision

Wie in Kapitel III.4.5. beschrieben, wurden die Wiederholpräzision sw (= intraday

reproducibility oder Tagespräzision) sowie die Zwischenpräzision sb (= interday

reproducibility) für Plasma und Urin ermittelt.

Die ermittelten Ergebnisdaten sind in den Tabellen 14 und 15 zusammengestellt:

Konzentration

[ng/ml] Intraday Präzision absolut

Intraday Präzision (%)

Interday Präzision absolut

Interday Präzision (%)

0,25 0,03 14,00 0,04 16,15 1 0,09 8,82 0,08 7,88 3 0,28 9,59 0,38 13,01

Tabelle 14: Intraday Präzision und Interday Präzision im Plasma

Ergebnisse

79


Intraday Präzision absolut

Intraday Präzision (%)

Interday Präzision absolut

Interday Präzision (%)

1 0,08 7,05 0,11 9,74 5 0,55 11,58 0,18 3,78 15 1,70 12,21 0,33 2,36

Tabelle 15: Intraday Präzision und Interday Präzision im Urin

Die vorgeschriebenen Richtwerte einer erlaubten Abweichung (20 % im unteren

Kalibrationsbereich, 15 % im mittleren und hohen Kalibrationsbereich) werden in Plasma und

Urin nicht überschritten.

2.6. Stabilität

Die Prüfung der Stabilität des Analyten Dexamethason erfolgte, wie bereits in Kapitel III.4.6.

beschrieben, in zwei Aufarbeitungs- und Messdurchgängen.

In den nachfolgenden Tabellen 16 bis 21 sind die an Tag 0 und an Tag X (Tag X belief sich

bei den Plasmaproben auf 164 Tage, für die Urinproben auf 155 Tage) ermittelten Ergebnisse

aufgeführt und gegenübergestellt. An Tag 0 wurden die Proben angesetzt und direkt

aufgearbeitet. An Tag X wurden die an Tag 0 angesetzten, jedoch bis zu diesem Tag

zurückgestellten und tiefgefrorenen Proben aufgearbeitet.


Anzahl der gemessenen

Proben

Mittelwert der gemessenen

Konzentrationen[ng/ml]

Standardab- weichung (%)

Variations- koeffizient (%)

0,25 6 0,28 0,04 16,08 1 6 1,07 0,10 8,98 3 6 2,94 0,09 3,17

Tabelle 16: gemessene Mittelwerte, Standardabweichung und Variationskoeffizient zur

Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Plasmaproben an Tag 0

Ergebnisse

80



Proben





0,25 6 0,22 0,02 10,85 1 6 0,85 0,09 11,07 3 6 2,34 0,12 5,27



Konzentration

[ng/ml] Mittelwert der

gemessenen Konzentrationen

[ng/ml] Tag 0


Konzentrationen[ng/ml] Tag 164

Abweichung (%)

Stabilität (95%)

0,25 0,28 0,22 -21,83 anzunehmen 1 1,07 0,85 -21,07 anzunehmen 3 2,94 2,33 -20,68 anzunehmen

Tabelle 18: gemessene Mittelwerte, prozentuale Abweichung und Bewertung der Stabilität

von Dexamethason in den Plasmaproben



Proben





1 6 0,97 0,08 8,14 5 6 4,52 0,13 2,78 15 6 13,39 0,58 4,36


Bestimmung der Stabilität von Dexamethason in den Urinproben an Tag 0

Konzentration

[ng/ml] Anzahl der gemessenen

Proben





1 6 0,58 0,24 40,53 5 6 4,36 0,43 9,95 15 6 13,61 1,20 8,82



Ergebnisse

81






Abweichung (%)

Stabilität (95%)

1 0,97 0,58 -39,51 anzunehmen 5 4,52 4,36 - 3,53 anzunehmen 15 13,39 13,61 - 1,59 anzunehmen


von Dexamethason in den Urinproben

Anhand dieser Ergebnisse und der errechneten anzunehmenden Stabilität in allen drei

Konzentationsbereichen beider Matrices wird deutlich, dass Dexamethason mit einer

Wahrscheinlichkeit von > 95 % stabil ist.

2.7. Wiederfindung

Im Rahmen der Prüfung der Wiederfindungsrate für Dexamethason konnte nach dem in

Kapitel III.4.7. beschriebenen Vorgehen die Wiederfindung für Dexamethason in Plasma und

Urin ermittelt werden. Zusätzlich wurde die Wiederfindung des internen Standards

Fluocortolon für Plasma und Urin überprüft. Die Tabellen 22 und 23 zeigen die ermittelten

Ergebnisse.

Matrix Anzahl der

Proben mittlere

Wiederfindung x (%)

Plasma 12 78,51 Urin 12 77,43

Tabelle 22: Wiederfindungsrate von Dexamethason in Plasma und Urin

Matrix Anzahl der

Proben mittlere

Wiederfindung x (%)

Plasma 12 79,35 Urin 12 78,28

Tabelle 23: Wiederfindungsrate von Fluocortolon in Plasma und Urin

Ergebnisse

82

3. Überprüfung der Urinaufarbeitung

Zur Überprüfung des Aufarbeitungsvorganges wurde allen Urinproben zu Beginn der Analyse

D5-Androsteron-glucuronid als Hydrolysemarker zugesetzt. Diese Zugabe erfolgte mit dem

Ziel, die Vollständigkeit der ablaufenden Hydrolyse mittels der Abspaltung der Konjugate

von D5-Androsteron-glucuronid zu kontrollieren. Die Auswertung der entstandenen

Signalpeaks erfolgte optisch. Abbildung 15 stellt exemplarisch ein Chromatogramm von D5-

Androsteron-glucuronid im Urin ohne Hydrolyse bzw. nach abgelaufener Hydrolyse dar.

Bei allen auszuwertenden Proben war ein deutliches und reproduzierbares Signal zu ermitteln.

Die Hydrolyse der Urinproben war als vollständig zu beurteilen.

Abb. 15: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit von D5-

Androsteron-glucuronid im Urin ohne Hydrolyse (links) bzw. nach Hydrolyse (rechts) zum

Zeitpunkt der Retention von D5-Androsteron-glucuronid (8,9 Minuten)

Ergebnisse

83

4. Plasma- und Urinkonzentrationen von Dexamethason

4.1. Plasmakonzentrationen von Dexamethason

4.1.1. Plasmakonzentrationen von Dexamethason nach Voren® Suspension-Applikation

Nach der Voren® Suspension-Applikation wurden nach 3 bis 24,25 Stunden maximale

Dexamethasonplasmakonzentrationen zwischen 0,4 ng/ml und 1,3 ng/ml erreicht. Nach 48,25

Stunden kam es bei den Pferden 2, 3 und 6 der intravenös behandelten Tiergruppe zum

Unterschreiten der Quantifizierungsgrenze. Pferd 1 und 5 folgten nach 72,25 Stunden, Pferd 4

nach 120,25 Stunden. Die Nachweisgrenze war bei Pferd 3 bereits nach 48,25 Stunden

erreicht, bei den Tieren 2, 5 und 6 nach 72,25 Stunden. Jedoch war bei Pferd 2 in den Proben

nach 144,25, 264,25 und 360,25 Stunden nochmals ein Signal detektierbar. Pferd 1 war nach

96,25 Stunden und Pferd 4 nach 216,25 Stunden unterhalb der Nachweisgrenze.

Abbildung 16 stellt die Konzentrationsverläufe von Dexamethason im Plasma der einmalig

mit Voren® Suspension intravenös behandelten sechs Pferde dar. Die Abbildungen 17 und 18

zeigen des Weiteren die gemittelten Dexamethasonkonzentrationen vor und nach Erreichen

der Quantifizierungsgrenze sowie eine vergrößerte Darstellung der ersten 80 Stunden nach

Applikation. Der Unterschied zwischen quantifizierbaren Werten (Werte > LOQ) und nicht

quantifizierbaren Werten (Werte < LOQ, aber > LOD) wird in den Abbildungen 16-20

graphisch hervorgehoben. Werte unterhalb der Nachweisgrenze sind zur Vervollständigung

des Konzentrationsverlaufes an Dexamethason gezeigt und stellen lediglich die mittels

HPLC/MS/MS ermittelten restlichen Spuren des Analyten dar. Den Tabellen 29-34 im

Anhang sind die gemessenen Plasmakonzentrationen an Dexamethason jedes Pferdes dieser

Gruppe zu entnehmen.

Ergebnisse

84

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 60 120 180 240 300 360Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son

[ng/

ml]

Pferd 1Pferd 2Pferd 3Pferd 4Pferd 5Pferd 6LOQLOD

Abb. 16: Plasmakonzentrationsverläufe (Werte unterhalb der Quantifizierungsgrenze sind

nicht zu exakt quantifizieren), Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von

Dexamethason bei sechs Pferden nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg

KGW Voren® Suspension

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 100 200 300 400Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son[

ng/m

l]

Abb. 17: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf vor (─♦─) und nach (··♦··) Erreichen der

Quanitfizierungsgrenze, Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von

Dexamethason nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®

Suspension bei sechs Pferden

Ergebnisse

85

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 20 40 60 80Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son

[ng/

ml]




Suspension bei sechs Pferden in den ersten 80 Stunden nach der Behandlung

4.1.2. Plasmakonzentrationen von Dexamethason nach Voren®-Depot-Applikation

Nach der Voren®-Depot-Applikation lagen die Plasmakonzentrationen an Dexamethason in

den ersten 12,25 bis 72,25 Stunden meist unter 0,3 ng/ml, Einzelwerte erreichten 0,3 ng/ml.

Somit war der Dexamethasongehalt nur in einzelnen Proben zu quantifizieren. Lediglich bei

Pferd 1 und Pferd 2 wurden Maximalwerte mit 1,0 ng/ml nach 312,25 Stunden (Pferd 1) bzw.

0,6 ng/ml nach 192,25 Stunden (Pferd 2) erreicht. Im Mittel lagen die Dexamethasonwerte

nach 23,5 Stunden unterhalb der Quantifizierungsgrenze. Nach 192,25 Stunden war Pferd 1

unter der Nachweisgrenze. Pferd 2 gelangte nach 216,25 Stunden, Pferd 3 nach 360,25

Stunden und Pferd 4 nach 240,25 Stunden zur Nachweisgrenze. Die Pferde 5 und 6 folgten

nach 192,25 bzw. 120,25 Stunden, mit jedoch wiederkehrenden Signalen nach 408,25 bzw.

216,25 und 264,25 Stunden.

Die Abbildungen 19 und 20 zeigen die gemittelten Dexamethasonkonzentrationen sowie eine

vergrößerte Darstellung der ersten 80 Stunden nach einmaliger intramuskulärer Applikation

von Voren®-Depot. Auf eine gemeinsame Übersichtsdarstellung der

Plasmakonzentrationsverläufe der sechs Pferde dieser Gruppe wurde aufgrund von

mangelnder Übersichtlichkeit verzichtet. In den Tabellen 35-40 im Anhang sind die

gemessenen Plasmakonzentrationen an Dexamethason jedes Pferdes dieser Gruppe

aufgeführt.

Ergebnisse

86

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 100 200 300 400 500Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son

[ng/

ml]

Abb. 19: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (··♦··), Quantifizierungsgrenze (——) und

Nachweisgrenze (−−) von Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von

0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 20 40 60 80Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son

[ng/

ml]



0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden in den ersten 80 Stunden nach der

Behandlung

Ergebnisse

87

4.2. Urinkonzentrationen von Dexamethason

4.2.1. Urinkonzentrationen von Dexamethason nach Voren® Suspension-Applikation

Abbildung 21 zeigt den gemittelten Konzentrationsverlauf von Dexamethason im Urin von

den mit Voren® Suspension behandelten Tieren. Die gemessenen

Dexamethasonkonzentrationen bewegten sich zwischen 26,0 ng/ml und 65,4 ng/ml. Den

Maximalwert an Dexamethason erreichte Pferd 6 bereits nach 2 Stunden, Pferd 3 nach 7

Stunden und die übrigen vier Tiere nach 12 Stunden. Die Pferde 1 und 3 unterschritten die

Quantifizierungsgrenze nach 96,5 Stunden, die Pferde 5 und 6 nach 120,25 Stunden und die

Pferde 2 und 4 nach 144,25 Stunden. Unterhalb der Nacheisgrenze befanden sich die Pferde 3,

5 sowie 6 nach 120,25 Stunden, Pferde 1 und 4 nach 144,25 Stunden und Pferd 2 nach 168,5

Stunden. Nochmals zu detektierende Signale stellten sich bei Pferd 2 nach 216,25, 384,25

sowie nach 456,25 Stunden dar.

Die Abbildung 22 stellt, analog zu der Graphik des Plasmakonzentrationsverlaufes, eine

Ausschnittsvergrößerung der ersten 200 Stunden nach Applikation dar. Die Tabellen 41-43 im

Anhang beinhalten die gemessenen Urinkonzentrationen an Dexamethason jedes Pferdes

dieser Tiergruppe.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

0 100 200 300 400 500 600Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son

[ng/

ml]

Abb. 21: gemittelter Urinkonzentrationsverlauf (─♦─) und Quantifizierungsgrenze (——) von



Ergebnisse

88

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

0 50 100 150 200Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son

[ng/

ml]




4.2.2. Urinkonzentrationen von Dexamethason nach Voren®-Depot-Applikation

Abbildung 23 stellt die entsprechenden Verhältnisse für die mit Voren®-Depot behandelten

Tiere dar. Die Maximalkonzentrationen lagen zwischen 7,3 ng/ml und 22,4 ng/ml, sie waren

nach 7 Stunden bis 12 Stunden erreicht. Jedes Pferd zeigte, wenn auch zu unterschiedlichen

Zeitpunkten, nach den anfänglich hohen Dexamethasonkonzentrationen einen einzigen rapide

abfallenden Wert bis zum Unterschreiten der Nachweisgrenze (Pferde 1 bis 5) bzw. bis zum

Unterschreiten der Quantifizierungsgrenze (Pferd 6). Dieser niedrige Konzentrationspunkt

erschien bei Pferd 5 nach bereits 48 Stunden, bei Pferd 3 nach 96 Stunden, bei Pferd 6

nach144 Stunden, bei Pferd 2 nach 192 Stunden, bei Pferd 1 nach 288 Stunden und letztlich

bei Pferd 4 nach 336 Stunden. Nach diesem punktuellen Konzentrationsabfall stieg die

Dexamethasonkonzentrationen bei allen 6 Tieren wieder auf Werte an, welche sich um die

Quantifizierungs- und Nachweisgrenze bewegten. Bis zum Erreichen der Quantifizierungs-

und Nachweisgrenze waren somit weiterhin deutlich zu detektierende und quantifizierbare

Signale darstellbar.

Die Unterschreitung der Quantifizierungsgrenze hatte bei Pferd 5 nach bereits 240 Stunden

stattgefunden, bei Pferd 2 nach 480 Stunden, bei den Pferden 1 und 3 nach 552 Stunden sowie

bei den Pferden 4 und 6 dieser Gruppe nach 624 Stunden. Bei den Pferden 1, 2 und 3 war

nach 552 Stunden auch die Nachweisgrenze unterschritten. Bei den Pferden 4, 5 und 6 waren

die Nachweisgrenzen zeitgleich mit den angegebenen Quantifizierungsgrenzen erreicht. Bei

Ergebnisse

89

den Pferden 5 und 6 war jedoch noch ein einmaliges Signal in der Probe nach 912 Stunden zu

ermitteln.

Die Abbildung 24 stellt eine Ausschnittsvergrößerung der ersten 200 Stunden nach

Applikation dar. Die gemessenen Urinkonzentrationen an Dexamethason jedes Pferdes dieser

Tiergruppe sind in den Tabellen 44-46 im Anhang zusammengestellt.

0,02,04,06,08,0

10,012,014,016,018,020,0

0 200 400 600 800 1000Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son

[ng/

ml]


Dexamethason nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-

Depot bei sechs Pferden

0,02,04,06,08,0

10,012,014,016,018,020,0

0 50 100 150 200Stunden

Kon

z. D

exam

etha

son

[ng/

ml]



Depot bei sechs Pferden in den ersten 200 Stunden nach der Behandlung

Ergebnisse

90

5. Plasmakonzentrationen von Cortisol und Glucose

5.1. Plasmakonzentrationen von Cortisol

5.1.1. Plasmakonzentrationen von Cortisol nach Voren® Suspension-Applikation

Die ermittelte Untergrenze des Cortisolreferenzbereiches lag für Voren® Suspension bei 39,4

ng/ml. Die Blutcortisolspiegel der behandelten Tiere lagen im Mittel, nach einem in den

ersten Proben beobachteten geringen Anstieg, nach 2,25 Stunden hochsignifikant unter dem

zuvor bestimmten Schwellenwert (p < 0,01). Abweichend erreichte Pferd 6 den

Schwellenwert nach 1,25 Stunden, Pferd 3 nach 3 Stunden. Der maximal supprimierte Wert

war im Mittel bei einer hochsignifikanten Abweichung (p < 0,01) nach 48,25 Stunden

erreicht. Pferd 3 und 5 zeigten je nach 24,25 und 48,25 Stunden, Pferd 4 zwischen 8 und

72,25 Stunden Werte die unterhalb der Testnachweisgrenze lagen, und somit nicht mehr zu

detektieren waren.

Nach 144,25 Stunden hatten sich die gemittelten Cortisolwerte den Ausgangswerten wieder

weitestgehend angeglichen. Es war keine statistische Abweichung mehr festzustellen (p >

0,05). Abweichend fielen nochmals Pferd 3 und Pferd 5 auf. Der Cortisolwert von Pferd 3 war

bereits nach 96,25 Stunden wieder im Referenzbereich, der von Pferd 5 erst nach 216,25

Stunden. Wiederholte, jedoch nicht signifikant erniedrigte Cortisolspiegel zeigten sich in den

Plasmaproben nach 168,25 und 360,25 Stunden (Pferd 3), sowie nach 312,25 und 360,25

Stunden (Pferd 5).

In Abbildungen 25 und 26 werden die gemittelten Cortisolkonzentrationen der sechs mit

Voren® Suspension behandelten Pferde im Gesamtverlauf und in den ersten 25 Stunden

dargestellt. In den Tabellen 29-34 im Anhang sind die genauen Zahlenwerte der gemessenen

Cortisolkonzentrationen tabellarisch dargestellt.

Ergebnisse

91

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 100 200 300 400Stunden

Kon

z. C

ortis

ol [n

g/m

l]

Abb. 25: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und untere Grenze des 95%-

Perzentil-Intervalls (──) von Hydrocortisol nach einmaliger intravenöser Applikation von

0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension bei sechs Pferden

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 5 10 15 20 25Stunden

Kon

z. C

ortis

ol [n

g/m

l]



0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension bei sechs Pferden in den ersten 25 Stunden nach der

Behandlung

5.1.2. Plasmakonzentrationen von Cortisol nach Voren®-Depot-Applikation

Die Untergrenze der Cortisolreferenzbereiches lag für die Pferde der Voren®-Depot-Gruppe

bei 38,1 ng/ml. Nach der Verabreichung von Voren®-Depot war der geringe anfängliche

Anstieg der Cortisolwerte bei den Tieren dieser Gruppe ebenfalls zu beobachten. Die

Ergebnisse

92

Schwelle des Referenzbereiches war im Mittel nach 6 Stunden signifikant unterschritten (p <

0,05). Der Cortisolspiegel von Pferd 1 lag bereits nach 2,25 Stunden, der von Pferd 6 nach 3

Stunden, der von Pferd 4 nach 4 Stunden und der von Pferd 5 nach 8 Stunden unterhalb des

Schwellenwertes. Nach 72,25 Stunden war der Cortsiolwert maximal und hochsignifikant

supprimiert (p < 0,01). Eine Erniedrigung der Cortisolwerte bis unterhalb der Nachweisgrenze

zeigte nur Pferd 4 zwischen 96,25 und 168,25 Stunden.

Nach 216,25 Stunden lagen die Werte im Mittel wieder im Normbereich, ohne erkennbare

statistische Abweichung (p > 0,05). Wiederholte Erniedrigungen waren nach 264,25 Stunden

(p < 0,05), 360,25 Stunden (p < 0,05) und 408,25 Stunden (p < 0,05) zu erkennen. Nach

456,25 Stunden lag der Cortisolwert wieder median im Referenzbereich (p > 0,05). Pferd 5

war bereits nach 192,25 Stunden zurück im Referenzbereich, Pferde 2 und 3 nach 312,25

Stunden. Wiederholtes Absinken der Cortisolwerte war bei Pferd 2 und 6 zu beobachten, sehr

geringfügig bei Pferd 2 nach 360,25 und 408,25 Stunden und deutlicher bei Pferd 6 nach

264,25, 360,25 und 408,25 Stunden. Die Cortisolwerte der Pferde 1 und 4 reihten sich im

Verlauf der Probenentnahme nicht bzw. nur annäherungsweise in den vorher festgelegten

Referenzbereich ein. Der Cortisolwert von Pferd 1 lag mit 37,84 ng/ml nach 456,25 Stunden

nur knapp unterhalb des Schwellenwertes. Pferd 4 hingegen hatte zu diesem Zeitpunkt einen

Cortisolwert von 25,98 ng/ml.

Die Abbildungen 27 und 28 stellen die gemittelten Cortisolkonzentrationen der sechs mit

Voren®-Depot behandelten Pferde im Gesamtverlauf und in den ersten 25 Stunden

dargestellt. In den Tabellen 35-40 im Anhang sind die genauen Zahlenwerte der gemessenen

Cortisolkonzentrationen tabellarisch aufgeführt.

Ergebnisse

93

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

0 100 200 300 400 500

Stunden

Kon

z. C

ortis

ol [n

g/m

l]

Abb. 27: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und unterer Grenze des 95%-

Perzentil-Intervalls (──) von Cortisol nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06

mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

0 5 10 15 20 25Stunden

Kon

z. C

ortis

ol [n

g/m

l]



mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden in den ersten 25 Stunden nach der

Behandlung

5.2. Plasmakonzentrationen von Glucose

Der von der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische

Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover angegebene Referenzbereich für

Ergebnisse

94

Blutglucose in equinem Serum oder Plasma von 4,0 bis 7,0 mmol/l war nur in wenigen

Einzelwerten überschritten.

Die Pferde 4, 5 und 6 der mit Voren® Suspension behandelten Tiergruppe zeigten nach 8, 10

bzw. 24,25 Stunden einen deutlich erhöhten Einzelwert. Eine tendenzielle Erhöhung bis zum

Erreichen dieses erhöhten Einzelwertes und eine sich anschließende Erniedrigung des

Blutzuckerspiegels innerhalb des Referenzbereiches waren angedeutet. Den Pferden 1, 2 und

3 dieser Gruppe waren physiologische Werte zuzuordnen.

Bei den mit Voren®-Depot behandelten Pferden lagen alle Werte im Referenzbereich. Es war

keine signifikante Erhöhung zu messen.

Tabelle 24 und 25 zeigen die gemittelten Glucosekonzentrationen der mit Voren® Suspension

bzw. Voren®-Depot behandelten Pferde.

Die Einzelwerte jedes Pferdes sind in den Tabellen 29-40 im Anhang aufgeführt.

Proben-Nr.: Entnahmezeitpunkt

(Stunden) gemittelte

Glucosekonzentrationim Plasma [mmol/l]

Standardabweichung[%]

1 0 4,9 0,3 2 0,25 5,2 0,5 3 0,5 4,9 0,5 4 1,25 4,7 0,4 5 2,25 4,9 0,4 6 3 5,2 0,6 7 4 5,1 0,6 8 6 5,4 0,4 9 8 6,1 1,5 10 10 5,5 1,4 11 12,25 5,0 0,3 12 24,25 5,6 1,5 13 48,25 5,3 0,3 14 72,25 4,9 0,2 15 96,25 4,6 0,2 16 120,25 5,0 0,4 17 144,25 4,6 0,2 18 168,25 4,7 0,2 19 216,25 4,7 0,2 20 264,25 4,7 0,3 21 312,25 5,0 0,4 22 360,25 4,7 0,1

Tabelle 24: Probennummer, Entnahmezeitpunkt und gemittelte Plasmakonzentrationen von

Glucose nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®


Ergebnisse

95

Proben-Nr.: Entnahmezeitpunkt (Stunden)

gemittelte Glucosekonzentration

im Plasma [mmol/l]

Standardabweichung [%]

1 0 4,8 0,1 2 1 4,7 0,2 3 2,25 5,0 0,6 4 3 5,2 0,5 5 4 5,1 0,5 6 6 5,0 0,5 7 8 5,4 1,1 8 12,25 4,5 1,1 9 23,5 5,2 0,8 10 48,25 5,1 0,4 11 72,25 5,2 0,4 12 96,25 5,4 0,7 13 120,25 5,4 0,5 14 144,25 4,9 0,3 15 168,25 5,3 0,8 16 192,25 5,0 0,4 17 216,25 4,9 0,3 18 240,25 5,0 0,4 19 264,25 5,5 0,6 20 312,25 5,0 0,6 21 360,25 5,0 0,5 22 408,25 5,5 0,7 23 456,25 5,3 0,3

Tabelle 25 : Probennummer, Entnahmezeitpunkt und gemittelte Plasmakonzentrationen von

Glucose nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot

bei sechs Pferden

Diskussion

96

V. Diskussion

Ziel der durchgeführten Arbeit war es, mittels einer pharmakologischen Studie an zwölf

Pferden und anschließender quantitativer Analyse von Plasma- und Urinproben eine Aussage

über das Ausscheidungsverhalten von Dexamethason nach einmaliger intravenöser bzw.

einmaliger intramuskulärer Injektion von Dexamethason-21-isonicotinat machen zu können.

Anhand der gewonnenen Erkenntnisse sollte geprüft werden, ob konkrete Aussagen über

Nachweisfristen und Ausscheidungszeiten für Dexamethason in equinem Plasma und Urin

gemacht werden können, und welche Schlussfolgerungen und Konsequenzen sich für diesen

Wirkstoff im Hinblick auf seine Applikation vor Pferdeleistungsprüfungen ergeben.

Die angewandten Analysemethoden, die der Bestimmung der Dexamethasonkonzentrationen

in den Plasma- und Urinproben dienten, wurden mit einer Messung mittels HPLC/MS/MS

kombiniert und im Vorfeld der Probenaufbereitung entwickelt, optimiert und validiert.

Neben den Dexamethasonkonzentrationen in Plasma und Urin wurden als weitere Parameter

der Blutcortisol- und der Blutglucosespiegel jedes Tieres bestimmt.

1. Eignung der gewählten Analysemethoden

Die Grundlagen der in dieser Arbeit angewandten Analysemethoden waren als

Routinemethoden zum Nachweis von Glucocorticosteroiden in equinem Plasma bzw. Urin im

Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln bereits etabliert. Durch die

beschriebenen Vorversuche und Veränderungen der Methoden wurden diese auf die

Detektion von Dexamethason abgestimmt. Es konnte nachfolgend auf das Vorhandensein von

Dexamethason, jedoch nicht seiner Metaboliten, geprüft werden. Als interner Standard wurde

das dem Dexamethason verwandte und ebenfalls synthetische Glucocorticoid Fluocortolon

gewählt. Die Analysemethoden für Plasma und Urin ergaben sich aus einem

Aufarbeitungsgang und anschließender Messung mittels HPLC/MS/MS. Sowohl die

Aufarbeitung der Plasmaproben als auch die Aufarbeitung der Urinproben basierten auf einer

Flüssigextraktion. In beiden Fällen fungierte tertiär Butylmethylether als Lösungsmittel. Um

die Ausbeute an Dexamethason möglichst vollständig zu gestalten, d.h. sowohl das frei

vorliegende Dexamethason als auch den glucuronidiert vorliegenden Anteil an Dexamethason

(KOOLMAN, 1994) zu erfassen wurde der Flüssigextraktion der Urinproben eine Hydrolyse

Diskussion

97

mit ß-Glucuronidase von Escherichia coli vorgeschaltet. Die Vollständigkeit der Hydrolyse

wurde mit Hilfe des eingesetzten Hydrolysemarkers D5-Androsteron-glucuronid geprüft und

gezeigt.

Um die Eignung der in dieser Studie entwickelten Analysemethoden zu beweisen, wurde

sowohl die analytische Methode für Plasma als auch die analytische Methode für Urin einer

Validierung nach den Vorgaben des EHSLC (2002) unterzogen. Die Validierung beinhaltete

die Parameter Selektivität, Linearität, Richtigkeit, Präzision, Etablierung von Nachweis- und

Quantifizierungsgrenze, Wiederfindung und Stabilität.

Die Selektivität der Analysemethoden zeigte sich darin, dass eine ausreichende Trennung der

zu analysierenden Substanz von allen denkbaren Störsubstanzen inklusive der Matrix und

auch vom internen Standard gegeben war. Die Linearität wurde anhand von

Kalibrationsreihen überprüft. Es konnte für alle Kalibrationskurven ein Bestimmtheitsmaß der

linearen Regression von R² > 0,99 erzielt werden. Die Validierungsparameter Richtigkeit und

Präzision wurden an drei Messtagen geprüft. Die Ergebnisse lagen im Rahmen der erlaubten

Abweichung des theoretischen vom ermittelten Wert. Richtigkeit und Präzision waren somit

gezeigt. Die Quantifizierungsgrenze belief sich auf 0,25 ng/ml für Plasma und 1 ng/ml für

Urin. Die Nachweisgrenze für Dexamethason lag im Plasma bei 0,12 ng/ml, im Urin bei 0,67

ng/ml. Die Wiederfindungsrate für Dexamethason im Plasma belief sich auf 78,51 %, die für

Urin auf 77,43 %. Die Wiederfindungsraten für den internen Standard Fluocortolon stellten

sich mit 79,35 % im Plasma und 78,28 % im Urin ähnlich dar. Die Analysemethoden für

Plasma und Urin waren sowohl im Hinblick auf den Analyten als auch im Hinblick auf den

internen Standard vergleichbar gut. Die ermittelten Substanzverluste von ca. 20 % sind bei

einem für die Wiederfindung theoretischen Idealwert von 100 % zu tolerieren (KROMIDAS,

1999). Auch ist laut KROMIDAS (1999) in dieser Studie eine Vergleichbarkeit von Analyt

und internem Standard gegeben. Sowohl der Analyt Dexamethason als auch der interne

Standard Fluocortolon verzeichneten einen identischen Substanzverlust, so dass eine

rechnerische Korrektur entfiel. Somit war auch der interne Standard Fluocortolon als geeignet

anzusehen. Zur Überprüfung der Stabilität des Analyten Dexamethason in den Matrices

Plasma und Urin wurden mit Dexamethason dotierte Plasma- und Urinproben bei -20 °C

tiefgefroren. Die Lagerungsdauer der Stabilitäts- und der Hauptversuchsproben belief sich bei

den Plasmaproben auf 164 Tage, bei den Urinproben auf 155 Tage. Es konnte gezeigt werden,

dass der Analyt über diesen Zeitraum in beiden Matrices stabil war.

Diskussion

98

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass jeder einzelne Validierungsparameter die Vorgaben

des EHSLC (2002) erfüllt hat. Mittels der durchgeführten Validierung konnte gezeigt werden,

dass die entwickelten Analysemethoden für Plasma und Urin jeweils sehr zufrieden stellende

Extraktionsausbeuten, eine hohe Präzision und eine hohe Reproduzierbarkeit aufwiesen, und

sich durch überschaubare und einfache Aufarbeitungsgänge auszeichneten. Die Methoden

eignen sich somit für die Routinediagnostik von Dexamethason sowohl in Plasma als auch in

Urin.

Weiterhin führen die in dieser Studie entwickelten und validierten Analysemethoden im

Vergleich zu früheren Studien zu sensitiveren Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen.

ALVINERIE u. TOUTAIN (1982) beschrieben eine HPLC-Methode mit einer Sensitivität

von 2 ng/ml zur Detektion von Dexamethason im Plasma von Hunden. In der Studie von

TOUTAIN et al. (1984) lag die Nachweisgrenze der verwendeten HPLC-Methode für

Dexamethason in equinem Plasma und Urin bei 2-3 ng/ml. VINE et al. (1992) ermittelten

unter Verwendung eines Gaschromatographen kombiniert mit einem

Tandemmassenspekrometer eine Nachweisgrenze für Dexamethason in equinem Urin von 1

ng/ml. GRIPPA et al. (2000) erarbeiteten mittels Umkehr-Phase-HPLC und gleichzeitiger

Bestimmung von Cortisol, Dexamethason, Indomethacin, Phenylbutazon und

Oxyphenbutazon im Plasma von Pferden eine Nachweis- sowie eine Quantifizierungsgrenze

für Dexamethason von 0,25 µg/ml. TANG et al. (2001) verwendeten eine Methode aus

Flüssigchromatographie und Massenspektroskopie (LC-MS) zur Detektion von

dreiundzwanzig Corticosteroiden (inklusive Dexamethason) in equinem Urin bei einer

jeweiligen Sensitivitätsgrenze von 5 ng/ml. Die in dieser Studie erarbeiteten Nachweisgrenzen

für Dexamethason im Plasma von 0,12 ng/ml und im Urin von 0,67 ng/ml ermöglichen

hingegen eine Detektion noch geringerer Dexamethasonkonzentrationen. Diese Grenzen

ermöglichen somit einen immer genaueren und längeren Substanznachweis, was positiv für

die derzeitige Dopinganalytik zu werten ist.

2. Plasma- und Urinkonzentrationen von Dexamethason

2.1. Plasmakonzentrationen

Die erreichten Maximalkonzentrationen von Dexamethason lagen bei den sechs mit Voren®

Suspension behandelten Pferden zwischen 0,4 ng/ml und 1,3 ng/ml. Durch die Voren®-

Diskussion

99

Depot-Applikation wurde bei sechs Pferden eine maximale Dexamethasonkonzentration

zwischen 0,3 ng/ml und 1,0 ng/ml erreicht. Diese wurden bei der erst genannten Gruppe nach

3 bis 24,25 Stunden erreicht, bei vier Tieren der zweiten Gruppe nach 12,25 bis 72,25

Stunden. Lediglich bei Pferd 1 und Pferd 2 der zweiten Gruppe entsprach dieser genannte

Maximalwert den erst nach 192,25 bzw. 360,25 Stunden auftretenden Einzelwerten. Dass es

sich bei diesen spät erreichten Dexamethasonmaximalwerten um Messfehler handeln könnte,

wurde durch wiederholtes Aufarbeiten und Messen dieser Proben ausgeschlossen.

Bei beiden Tiergruppen waren deutliche zeitliche Schwankungen bis zum Unterschreiten der

Quantifizierungs- und der Nachweisgrenze zu beobachten. Im Mittel war die

Quantifizierungsgrenze nach der Voren® Suspension-Applikation nach 72,25 Stunden

unterschritten, nach der Voren®-Depot-Applikation nach 23,5 Stunden. Die Nachweisgrenze

wurde bei dem erst genannten Präparat ebenfalls nach 72,25 Stunden post applikationem

erreicht, beim zweit genannten Arzneistoff nach 168,25 Stunden. Jedoch zeigten sich nach

vorherigem Unterschreiten der etablierten Nachweisgrenze bei einem Pferd der Voren®

Suspension-Gruppe sowie bei drei Pferden der Voren®-Depot-Gruppe nochmals

wiederkehrende und deutlich nachweisbare Signale.

Die Schwankungen in den Dexamethasonplasmakonzentrationen und in der Zeit bis zum

Erreichen der erwähnten Grenzen sind durch die individuell unterschiedliche Metabolisierung

des Stoffes durch die einzelnen Pferde zu erklären. Die schon während Resorption und

Metabolisierung einsetzende Elimination eines Stoffes (DOST, 1968) kann dazu führen, dass

nicht die gesamte resorbierte Wirkstoffmenge unverändert im Blut erscheint (GRAMATTE,

2002). Die wiederkehrenden Peaks bei einigen Tieren sind vor allem durch die als

Depotpräparat formulierte Galenik der beiden verabreichten Präparate zu erklären. Das in

beiden Fällen als Suspension vorliegende Präparat besitzt eine makrokristalline Aufbereitung.

Aus diesen kristallinen Partikeln werden die wirksamen Bestandteile nur langsam und

schrittweise freigesetzt, sie werden somit auch schrittweise resorbiert und erscheinen anteilig

im Blutkreislauf. Eben diese Formulierung als Kristallsuspension begründet den Depoteffekt

der Präparate (interner Bericht Boehringer Ingelheim).

Des Weiteren waren die im Plasma erreichten nur sehr niedrigen Maximalkonzentrationen an

Dexamethason auffällig. Sowohl nach intravenöser Applikation von Voren® Suspension als

auch nach intramuskulärer Verabreichung von Voren®-Depot, in der vom Hersteller

empfohlenen Dosierung, wurden nur Werte bis knapp oberhalb von 1,0 ng Dexamethason pro

ml Plasma erzielt. Bei der Verabreichung von Voren®-Depot in der Dosierung von 0,06

mg/kg Körpergewicht Dexamethason-21-isonicotinat und einem durchschnittlichen

Diskussion

100

Körpergewicht der Pferde der Voren®-Depot-Gruppe von 615,6 kg beträgt die intramuskulär

applizierte Wirkstoffmenge an Dexamethason-21-isonicotinat 36,9 mg. Die Ermittlung der

daraus resultierenden niedrigen Dexamethasonwerte im Plasma war überraschend. Diese nach

intramuskulärer Verabreichung von Dexamethason-21-isonicotinat erreichten niedrigen

Plasmakonzentrationen an Dexamethason wurden jedoch bereits von SEAWRIGHT et al.

(1979) und TOUTAIN et al. (1984) beobachtet und beschrieben. SEAWRIGHT et al. (1979)

zeigten mittels Radioimmunoassey bei zwei Pferden, dass ein Plasmakonzentrationsspiegel an

Dexamethason nach intramuskulärer Verabreichung von Dexamethason-21-isonicotinat in

den entnommenen Plasmaproben nicht bzw. nur in zwei Einzelproben (nach 65 und 75

Stunden) des einen Pferdes detektierbar war. In der Studie von TOUTAIN et al. (1984)

konnten mittels HPLC-Methode und einer Nachweisgrenze von 2 bis 3 ng/ml nur sehr

niedrige bis nicht detektierbare Dexamethasonkonzentrationen im Plasma festgestellt werden.

TOUTAIN et al. (1984) verweisen darauf, dass dieses beobachtete Phänomen der niedrigen

bis nicht detektierbaren Plasmakonzentrationen an Dexamethason nach Verabreichung von

Dexamethason-21-isonicotinat das Resultat einer lediglich anteiligen Resorption der

verabreichten Dosis sein muss. Die im Vergleich zur applizierten Dosis nur anteilige

Resorption könnte durch die Tatsache begründet sein, dass die konstante Resorptionsrate

kleiner ist als die konstante Eliminationsrate. Es wird somit weniger resorbiert, als eigentlich

eliminiert werden könnte. Dies deutet darauf hin, dass die Elimination des Wirkstoffes durch

seine Resorptionsrate limitiert wird, d.h. die Resorptionsrate kontrolliert die Eliminationsrate.

Weiterhin kann das Fehlen von deutlich detektierbaren und somit quantifizierbaren

Dexamethasonkonzentrationen nach Voren®-Depot-Applikation durch eine langsame und nur

schrittweise Resorption des Wirkstoffes an der Injektionsstelle begründet sein (interner

Bericht Boehringer Ingelheim). Die Begründungsansätze nach TOUTAIN et al. (1984) und

dem internen Bericht von Boehringer Ingelheim werden auch in dieser Studie als Erklärung

der niedrigen Plasmakonzentrationen an Dexamethason nach intramuskulärer Applikation von

Dexamethason-21-isonicotinat herangezogen.

Auf die niedrigen Dexamethasonkonzentrationen nach der intravenösen Applikation können

diese Erklärungen jedoch nicht übertragen werden, da eine Resorption nach intravasaler

Applikation entfällt. Laut Hersteller ist Voren® Suspension zur intramuskulären Applikation

vorgesehen. In dieser Studie wurde es jedoch intravenös verabreicht. Mittels einer

intravenösen Verabreichung sollte zum einen erreicht werden, dass die Anzahl an Faktoren,

welche die durchgeführte Ausscheidungsstudie beeinflussen könnten, möglichst gering

gehalten werden, zum anderen sollten praxisnahe Bedingungen erstellt werden, da Voren®

Diskussion

101

Suspension bis vor kurzem auch zur intravenösen Applikation zugelassen war und in der

tierärztlichen Praxis mittels intravasaler Verabreichung die wesentlich größere

Dopingrelevanz besitzt. Bei der Durchführung dieser Arbeit wurde die nach unbeabsichtigter

paravenöser Verabreichung des Arzneistoffes mögliche Resorption durch Applikation mittels

Braunülen, deren Sitz mehrmals kontrolliert und als korrekt intravenös befunden wurde,

ausgeschlossen. Es konnte von einer streng intravenösen Applikation ausgegangen werden.

Bei der Verabreichung von Voren® Suspension in der Dosierung 0,02 mg/kg Körpergewicht

Dexamethason-21-isonicotinat, einem durchschnittlichen Körpergewicht der Pferde der

Voren® Suspension-Gruppe von 593,6 kg, und einem anzunehmenden Blutvolumen eines

Pferdes von 6-10 % (gemittelt 8 %) des Körpergewichtes (TAYLOR u. HILLYER, 2001)

wären nach intravenöser Applikation von Voren® Suspension (applizierte Wirkstoffmenge:

11,87 mg/593,6 kg KGW) theoretische anfängliche Plasmakonzentration von ca. 250 ng

Dexamethason pro ml Plasma zu erwarten gewesen. Die gemessenen

Dexamethasonkonzentrationen lagen jedoch nur knapp oberhalb von 1,0 ng Dexamethason

pro ml Plasma. Es ist anzunehmen, dass die niedrigen Dexamethasonkonzentrationen nach

intravenöser Applikation durch zwei wesentliche Aspekte begründet sind. Als ein Grund kann

die zu spät durchgeführte Kontrolle des Plasmaspiegels an Dexamethason angesehen werden.

Die erste Plasmaprobe wurde erst nach Ablauf von einer Viertelstunde post applikationem

entnommen, sodass die nach intravenös applizierter Dosis erwartete Anfangskonzentration

von Dexamethason durch schnelle Abflutung des Medikamentes und Umverteilung in andere

Gewebe nicht bestimmt werden konnte. Die in dieser Studie nach Ablauf von 15 Minuten

entnommene Plasmaprobe scheint somit keine repräsentative Aussage über einen initialen

Wirkstoffspiegel zu machen. Um eine exakte Bestimmung der Konzentrationsverhältnisse an

Dexamethason machen zu können, hätten demnach schon vor Ablauf von 15 Minuten

engmaschige Kontrollen des Plasmaspiegels an Dexamethason durchgeführt werden müssen.

Eine weitere anzunehmende Begründung für die niedrigen Dexamethasonkonzentrationen

beruht auf der Galenik des Präparates. Es handelt sich bei dem Arzneistoff Voren®

Suspension, wie oben bereits erwähnt, um ein kristallines Depotpräparat, welches sich durch

langsame und schrittweise Freisetzung des Wirkstoffes auszeichnet (interner Bericht

Boehringer Ingelheim). Bedingt durch diese schrittweise Freisetzung des Wirkstoffes aus

seiner kristallinen Formulierung erscheinen als Folge, und im Vergleich zur applizierten

Wirkstoffgesamtmenge, nur anteilige Dexamethasonkonzentrationen im Plasma, so dass

weniger Dexamethason gemessen werden kann, als eigentlich verabreicht wurde.

Diskussion

102

Nach den Ergebnissen dieser Arbeit zu urteilen, kommt es somit sowohl nach intravenöser als

auch nach intramuskulärer Verabreichung der kristallinen Dexamethason-21-isonicotinat-

Suspensionen zu vergleichbaren Ergebnissen. Dabei scheint die Galenik des Präparates

deutlichen Einfluss auf die Wirkpotenz des jeweiligen Präparates zu haben. Dies zeigt sich

auch in der Studie von TOUTAIN et al. (1984). In dieser Studie lag Dexamethason-21-

isonicotinat als Lösung vor, und nicht, wie in dieser Arbeit, als Kristallsuspension. Die

Lösung wurde außerdem in einer Dosierung von 0,6 mg/kg Körpergewicht appliziert,

verglichen mit der in dieser Studie verabreichten Dosis von 0,02 mg/kg Körpergewicht. So

wurden bei TOUTAIN et al. (1984) zum einen durch die Galenik des Arzneistoffes, zum

anderen durch die höhere Dosierung deutlich höhere Dexamethasonplasmakonzentrationen

beobachtet als in dieser Studie.

Die Erklärung, dass die ermittelten niedrigen Dexamethasonkonzentrationen für die

Depotwirkung der Präparate und nicht für mangelnde systemische Verfügbarkeit des

Präparates post applikationem sprechen, kann belegt werden. Nach ENGELHARDT (1963)

erfolgt die Spaltung des Dexamethason-21-isonicotinats in Dexamethason und Isonicotinsäure

direkt, so dass von einer totalen systemischen Verfügbarkeit von Dexamethason nach einer

Injektion als Dexamethason-21-isonicotinat ausgegangen werden kann (TOUTAIN et al.,

1984). Die hydrolytische Spaltung wird durch unspezifische Esterasen vermittelt, deren

Vorkommen und Aktivität speziesabhängig stark variiert (WEISENBERGER, 1972). Diese

Esterasen sind im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten zu finden (PELZER, 1975). Bei

der Ratte sind nach 10 Minuten bereits 90 % des Esters hydrolysiert und beim Kaninchen

sogar 99 % des Esters. Im Humanserum liegt die Halbwertszeit des Esters bei 90-100 Minuten

(WEISENBERGER, 1972). Exakte Angaben zu den Esteraseaktivitäten anderer Tierarten sind

ungenau und lückenhaft. Im Rahmen der damaligen Arbeit verwiesen TOUTAIN et al. (1984)

auf eine Plasmahalbwertszeit von intravenös appliziertem Dexamethason von ca. 53 Minuten.

Diese ist beim Pferd signifikant kürzer als bei anderen Spezies, was auf einen aktiveren

Metabolisierungsprozess in der Leber zurückzuführen ist. Sie beträgt 119 bis 136 Minuten bei

Hunden (TOUTAIN et al., 1983), 142 bis 201 Minuten beim Menschen (TSUEI et al., 1979)

und 291 bis 335 Minuten bei Kühen (TOUTAIN et al., 1982). UNGEMACH (2002) gibt die

Halbwertszeit für freies Dexamethason sowie für leicht spaltbare, wasserlösliche Ester beim

Pferd mit 180-200 Minuten an. Hingegen beschreiben CUNNINGHAM et al. (1996) nach

oraler Gabe von Dexamethason eine Halbwertszeit von 4,36 ± 1,34 Stunden. Die

Metabolisierung von Glucocorticoiddepotpräparaten dauert Wochen bis Monate

(UNGEMACH, 2002). Der deutliche Unterschied in den Halbwertszeiten von freiem

Diskussion

103

Dexamethason, wasserlöslichen Estern und Depotformulierungen bestärkt nochmals den

erwähnten Unterschied zwischen einer Dexamethason-21-isonicotinat-Lösung und einer

Dexamethason-21-isonicotinat-Kristallsuspension.

2.2. Urinkonzentrationen

Die Höchstkonzentrationen an Dexamethason waren bei der Voren® Suspension-Tiergruppe

innerhalb eines Zeitraumes von 2 bis 12 Stunden erreicht und beliefen sich auf 26,0 ng/ml bis

65,4 ng/ml. Bei der Voren®-Depot-Tiergruppe wurden innerhalb von 7 bis 12 Stunden die

Höchstwerte von 7,3 ng/ml bis 22,4 ng/ml erreicht.

Im Mittel war die Quantifizierungsgrenze nach der Voren® Suspension-Applikation nach

120,5 Stunden unterschritten. Nach der Voren®-Depot-Applikation war diese Grenze

erstmals nach Ablauf von 288 Stunden, und nach einem wiederkehrend quantifizierbaren

Signal nach 432 Stunden, letztendlich also nach 480 Stunden unterschritten. Die

Nachweisgrenze unterschritten die mit Voren® Suspension behandelten Tiere

durchschnittlich nach 144,5 Stunden post applikationem, nach Applikation von Voren®-

Depot war diese Grenze nach 552 Stunden erreicht. Nach Unterscheiten der Nachweisgrenze

bei der Voren® Suspension-Gruppe stellten sich lediglich bei Pferd 2 nochmals zu

detektierende Signale nach 216,25, 384,25 sowie 456,25 Stunden dar. Bei den Tieren der

Voren®-Depot-Gruppe zeigten die Pferde 5 und 6 nach Ablauf von 912 Stunden nochmals

ein Signal nach bereits vorherigem Unterschreiten der Nachweisgrenze.

In der bereits zitierten Studie von SEAWRIGHT et al. (1979) konnten nach intramuskulärer

Verabreichung von Dexamethason-21-isonicotinat vergleichbare Ergebnisse erzielt werden.

So wurden Dexamethasonmaximalwerte zwischen 25 und 35 ng/ml erreicht und die

deutlichste Dexamethasonausscheidung fand in den ersten 12 bis 36 Stunden statt. Die

Nachweisbarkeit von Dexamethason im Urin bis zu 5 Tagen post applikationem war jedoch

kürzer als in dieser Studie, was vermutlich auf eine weniger sensible Nachweisgrenze

zurückzuführen ist. Laut SEAWRIGHT et al. (1979) werden die in ihrer Studie ermittelten

Maximalkonzentrationen in der Praxis ebenfalls beobachtet. In als positiv befundenen

Urindopingproben wird meist nicht mehr als 20 ng/ml Dexamethason gefunden, jedoch

vergesellschaftet mit einem deutlich erniedrigten Cortisolspiegel.

Ähnliche Studien, die sich, wie diese durchgeführte Arbeit, mit der intravenösen Gabe von

Dexamethason-21-isonicotinat als Depotpräparat beschäftigen konnten nicht gefunden

Diskussion

104

werden, sodass den hier ermittelten Urinkonzentrationen an Dexamethason keine

Erfahrungswerte zum Vergleich zugeordnet werden konnten.

Bei den einzelnen Tieren dieser Studie sind sowohl die Schwankungen der

Dexamethasonkonzentrationen im Urin als auch die zeitlichen Schwankungen bis zum

Erreichen der Quantifizierungs- und Nachweisgrenze zum einen durch die in Kapitel V.2.1.1.

bereits erwähnte und für jedes Einzeltier individuelle Metabolisierungsfähigkeit begründet,

zum anderen durch die Galenik der verabreichten Präparate.

Einfluss auf die Metabolsierung haben laut GRAMATTE (2002) mehrere endogene

Parameter. Auch nach SAMS (1992) wird die Urinkonzentration eines Wirkstoffes durch eine

Reihe physiologischer Faktoren beeinflusst und spiegelt nur in seltenen Fällen die

Plasmakonzentrationsverläufe wieder. Eine variierende Harnmenge infolge unterschiedlicher

Flüssigkeitsaufnahme und individueller körperlicher Belastung (SAMS, 1992), die

Beeinflussung der Ausscheidungsrate durch den Harn-pH-Wert (GRAMATTE, 2002) und

auch eine erhöhte Clearance infolge vermehrter Urinproduktion (GRAMATTE, 2002) stellen

einige dieser physiologischen Faktoren dar. Die Möglichkeit einer gestörten

Harnausscheidung infolge krankhafter Veränderungen der Nieren konnte bei den

Versuchstieren dieser Studie mittels Kontrolle der Kreatininwerte ausgeschlossen werden.

Anzumerken ist an dieser Stelle jedoch, dass die in dieser Studie beobachteten Schwankungen

der Dexamethasonkonzentrationen zum Teil durch die Art der Urinentnahme begründet sein

könnten. Da es sich um Spontanharngewinnung der Pferde handelte, wurde nur jeweils ein

Teil des Mittelstrahlurins, nicht aber die Gesamturinmenge aufgefangen. Für eine exakte

Beurteilung wäre es erforderlich die kumulative Gesamtmenge an Urin über die Dauer des

Ausscheidungsversuchs zu sammeln und zu untersuchen. So wäre eine Ermittlung der

Ausscheidungsrate (ausgeschiedene Menge pro Zeiteinheit) möglich gewesen (DYKE u.

SAMS, 1994). Die praktische Durchführung dieser Technik der Urinentnahme wäre jedoch

über die Länge der Versuchsphase schwer durchführbar gewesen. Durch die hier angewandte

Art der Probenentnahme könnte auch der bei den mit Voren®-Depot behandelten Tieren

beobachtete, einmalige starke Konzentrationsabfall an Dexamethason vor Erreichen des LOQ

begründet sein. Da dieser Konzentrationsabfall jedoch kein Einzelfall war, sondern sich

reproduzierbar bei allen sechs Pferden dieser Gruppe beobachten ließ, muss von einem

absinkenden Wirkstoffspiegel des Dexamethasons und daraufhin folgender wiederholter

Wirkstofffreisetzung aus den intramuskulären Depots ausgegangen werden.

Diskussion

105

Auch im Rahmen der untersuchten Urinproben konnte somit der gewünschte und auch

eingetretene Depoteffekt des Dexamethason-21-isonicotinats nach Verabreichung von sowohl

Voren® Suspension als auch von Voren®-Depot gezeigt werden. So kam es auch nach

vorherigen nicht mehr messbaren Signalen wieder zu deutlich quantifizierbaren

Konzentrationserhöhungen, was für eine stattgefundene schrittweise Freisetzung des

Wirkstoffes aus der mikrokristallinen Struktur bzw. aus den Depots spricht (interner Bericht

Boehringer Ingelheim). Neben dieser schrittweisen Wirkstofffreisetzung verlängert sich auch

die Wirkdauer der Präparate. Auch CHAPMANN et al. (1977) arbeiteten den Aspekt der

langen Wirkdauer eines Depotpräparates heraus, indem sie zeigten, dass ein

Dexamethasonester in Form von Dexamethason-21-isonicotinat eine längere

Ausscheidungsdauer hat als die lösliche Form eines Glucocorticoidesters- oder alkohols.

Einen zeitlichen Überblick bzw. eine Angabe darüber, wie viel Dexamethason renal

ausgeschieden wird, gibt der pharmakokinetische Parameter der renalen Clearance. Die renale

Clearance konnte, wie in Kapitel V.2.3. beschrieben, in dieser Studie nicht bestimmt werden.

Deswegen sind an dieser Stelle stellvertretend die ermittelten Clearancewerte anderer Studien

angeführt. Nach einer intravenösen Verabreichung von 10 mg Dexamethason an acht Pferden

wurde eine Clearance von 0,479 ± 0,064 l/kg/h bestimmt (CUNNINGHAM et al., 1996). Die

von TOUTAIN et al. (1984) errechnete renale Clearance für Dexamethason liegt beim Pferd

mit 12 bis 13 ml/min/kg signifikant höher als bei anderen Spezies. Sie beträgt 3 bis 4

ml/min/kg beim Menschen (TSUEI et al., 1979), 6,4 ml/min/kg bei Hunden (TOUTAIN et al.,

1983) und 2,4 bis 2,6 ml/min/kg bei Kühen (TOUTAIN et al., 1982). Weiterhin stellt der

renal ausgeschiedene Anteil an Dexamethason laut TOUTAIN et al. (1984) lediglich 6-9 %

der verabreichten Dosis dar. Die Beobachtung, dass lediglich ein Teil der verabreichten Dosis

renal eliminiert wird, konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Ausgehend vom

gemittelten Körpergewicht der Pferde der Voren® Suspension-Gruppe (593,6 kg KGW)

sowie der Voren®-Depot-Gruppe (615,6 kg KGW) und der Annahme eines Blutvolumens

beim Pferd von 6-10 % (gemittelt 8 %) des Körpergewichtes (TAYLOR u. HILLYER, 2001),

wurde die nach Verabreichung der Medikamente im Körper vorhandene Arzneistoffmenge

mit der Menge an renal eliminiertem Dexamethason verglichen. Die renale Exkretion betrug

bei den Pferden der Voren® Suspension-Gruppe 8-24 % der verabreichten Dosis, bei den

Tieren der Voren®-Depot-Gruppe lediglich 1,07-2,67 % der applizierten Arzneistoffmenge.

Die lediglich anteilige Exkretion von Dexamethason belegt nochmals die in Kapitel V.2.1.

erwähnten Erklärungsansätze. So wird die Elimination, wie es besonders nach der Voren®-

Diskussion

106

Depot-Applikation deutlich wird, zum einen durch die Resorptionsrate limitiert, da es zu einer

langsamen Resorption des Wirkstoffes aus dem Depot an der Injektionsstelle kommt (interner

Bericht Boehringer Ingelheim). Zum anderen kommt es durch die als kristallines

Depotpräparat formulierte Galenik zu einer langsamen und schrittweisen Freisetzung des

Wirkstoffes (interner Bericht Boehringer Ingelheim), und somit als Konsequenz auch zur

schrittweisen Elimination der jeweiligen freigesetzten Wirkstoffmenge.

In dieser Studie wurden die Biotransformation und das Ausscheidungsverhalten einzelner

Metaboliten von Dexamethason nicht detailliert untersucht. Lediglich die Gesamtmenge an

ausgeschiedenem reinem Dexamethason wurde bestimmt. Einen Überblick über

Metabolisierung und Exkretionsverhalten von Dexamethason beim Pferd geben DUMASIA et

al. (1986). Sie erarbeiteten in einer Studie mit Hilfe von radioaktiv markiertem

Dexamethason, dass 40-50 % der an Dexamethason gebundenen Radioaktivität in den ersten

24 Stunden renal ausgeschieden werden. Weitere 10 % folgen in den nächsten drei Tagen. Die

ausgeschiedene Radioaktivität war zum größten Teil (26-36 %) in der Fraktion des

unkonjugierten Dexamethasons zu finden, 8-13 % lagen konjugiert vor und ca. 5 % waren

nicht extrahierbar. Metaboliten kamen in Form von unverändertem Dexamethason, 17-

Oxodexamethason, 11-Dehydrodexamethason, 20-Dihydrodexamethason, 6-

Hydroxydexamethason und 6-Hydroxy-17-oxodexamethason vor. Diese Metaboliten machten

aufsummiert 60 % der Radioaktivität im Urin aus. Über 25 % der Radioaktivität waren an

polare Metaboliten gebunden und blieben unidentifiziert. Laut SKRABALAK u. MAYLIN

(1982) ist 9-fluoro-16a-methyl-6ß-,11ß,16ß-trihydroxy-1,4-androstadien-3,17-dion der

Hauptmetabolit im Pferdeurin.

2.3. Pharmakokinetische Berechnungen

Durch eine mathematische Beschreibung von Konzentrationsverläufen lässt sich die

Verstoffwechselung von in den Organismus verbrachten Arzneimitteln darstellen. Da die

Pharmakokinetik ihre Daten vorwiegend aus der Kreislaufflüssigkeit, dem Blut bezieht

(GLADTKE u. VON HATTINGBERG, 1977), sind aussagekräftige Plasmakonzentrationen

des zu untersuchenden Arzneistoffes die Grundlage einer Kinetikberechnung. In dieser Studie

konnten jedoch sowohl nach Applikation von Voren® Suspension als auch von Voren®-

Depot nur sehr niedrige Plasmakonzentrationen an Dexamethason ermittelt werden. Für

kinetische Berechnungen geeignete Werte lagen mit nur wenigen Werten oberhalb der

Quantifizierungsgrenze. Die meisten Werte bewegten sich zwischen Quantifizierungs- und

Diskussion

107

Nachweisgrenze. So konnte nur bei wenigen Werten oberhalb des LOQ der Plasmagehalt an

Dexamethason genau quantifiziert werden. Werte zwischen dem LOQ und dem LOD konnten

lediglich nachgewiesen, nicht aber mengenmäßig bestimmt werden. Diese Differenzierung

zwischen quantifizierbaren und nicht quantifizierbaren Werten wurde in den Abbildungen 16-

20 optisch hervorgehoben. Pharmakokinetische Berechnungen bezüglich Halbwertszeit,

Verteilungsvolumen und Clearance konnten somit mit gängigen pharmakokinetischen

Computerprogrammen nicht vorgenommen werden.

Betrachtet man zum Beispiel die Halbwertszeit, so ist deren Ermittlung sowohl aufgrund ihrer

Definition als auch aufgrund ihrer Berechnungsmöglichkeiten in dieser Studie nicht möglich.

Die Halbwertszeit ist eindeutig für einen zeitlich bestimmten exponentiellen Verlauf der

Arzneimittelkonzentration und nicht für ihren Gesamtverlauf definiert. Dieser exponentielle

Verlauf, bzw. der Verlauf einer Geraden nach halblogarithmischer Darstellung muss sich

mindestens über drei Punkte erstrecken, um für eine Bestimmung der Halbwertszeit

auswertbar zu sein (GLADTKE u. VON HATTINGBERG, 1977). In Praxi werden laut

GLADTKE u. VON HATTINGBERG (1977) einer solchen Kurve vier bis sechs Punkte

zugrunde gelegt, was der Kontrolle und der Beseitigung unsystematischer Analysen- und

Versuchsfehler dient. Das Vorhandensein von nur einem über dem LOQ liegenden und somit

verwendbaren Wert bei der Voren®-Depot-Gruppe macht eine Bestimmung der

Halbwertszeit dieses Stoffes nicht möglich. Bei der Voren® Suspension-Gruppe lagen im

Mittel 12 Werte oberhalb des LOQ. Diese schwankten jedoch stark und nur zwei Messwerte

erfüllten die oben genannten Bedingungen eines exponentiellen Verlaufs. Einer dieser zwei

Messpunkte war zudem deckungsgleich mit der Quantifizierungsgrenze, so dass auch in

diesem Falle aufgrund mangelnder verwertbarer Daten auf die Berechnung der Halbwertszeit

verzichtet werden musste.

Ein weiterer wichtiger pharmakokinetischer Parameter ist das Verteilungsvolumen. Eine

Berechnung des Verteilungsvolumens, ist, wie in Kapitel II.5.1. erwähnt, nur nach

intravenöser Applikation eines Arzneistoffes möglich. Eine eventuelle Berechnung innerhalb

der mit Voren®-Depot behandelten Tiergruppe schließt sich somit aus. Bei den mit Voren®

Suspension behandelten Tieren wäre eine Berechnung des Verteilungsvolumens aufgrund der

intravasalen Verabreichung grundsätzlich möglich. Jedoch setzt das Verteilungsvolumen die

intravenös applizierte Dosis und die daraufhin erreichte Anfangskonzentration des

Wirkstoffes ins Verhältnis. Da die erste Plasmaprobe nach der intravasalen Verabreichung

von Voren® Suspension aber erst nach Ablauf von einer Viertelstunde entnommen wurde,

war eine repräsentative Aussage über die Anfangskonzentration von Dexamethason durch

Diskussion

108

schnelle Abflutung des Medikamentes nicht zu erwarten, so dass auf eine Berechnung

verzichtet werden musste.

Die Bestimmung der Clearance erfolgt, wie auch in Kapitel II.5.1. beschrieben, entweder über

den Quotienten aus Eliminationsrate und Wirkstoffkonzentration, oder mittels

Verteilungsvolumen und Halbwertszeit. Da aber die für beide Rechenansätze notwendigen

Daten nicht ermittelt werden konnten, war auch die Bestimmung dieses Parameters nicht

durchführbar.

Pharmakokinetische Berechnungen nach dem PK/PD-Modell von TOUTAIN und

LASSOURD (2002) sind im Falle von Dexamethason, und somit von Glucocorticoiden

allgemein, nicht möglich. Dieses Modell kann nur bei Stoffen Anwendung finden, deren

biologische Halbwertszeit der Eliminationshalbwertszeit entspricht. Bei Glucocorticoiden

hingegen kommt es, wie bereits beschrieben, zu einer deutlich längeren biologischen

Wirkung, d.h. zu einer weiter bestehenden Wirkung bei gleichzeitig fehlender

Nachweisbarkeit des entsprechenden Glucocorticoids im Plasma.

3. Beeinflussung des Cortisolspiegels durch Dexamethason

In dieser Studie dienten die Plasmaproben jedes Pferdes als zu untersuchende Matrix, um den

Cortisolspiegel zu ermitteln. Abgestimmt auf den bestehenden circadianen Rhythmus der

Plasmacortisolausschüttung wurden alle Plasmaproben, exklusive der engmaschigen Proben

in den ersten 36 Stunden, morgens zur gleichen Uhrzeit entnommen, um eine

Vergleichbarkeit der Werte durch Umgehung der circadianen Schwankungen zu

gewährleisten.

Der basale Ausgangswert an Plasmacortisol, bestimmt kurz vor der Dexamethason-21-

isonicotinat-Applikation, wurde für beide Tiergruppen ermittelt. Der nichtparametrische

Referenzbereich war einseitig definiert, es wurde also nur die Untergrenze festgelegt. Diese

lag bei der erst genannten Gruppe bei 39,4 ng/ml, bei der zweiten genannten Tiergruppe bei

38,1 ng/ml. Sowohl der basale Mittelwert als auch der untere Schwellenwert für Cortisol

waren bei beiden Gruppen vergleichbar und stimmten recht genau mit von GYLSTROFF u.

HEGNER (1983), LANE (1986) und KLAUS u. HAPKE (1996) ermittelten Werten überein.

LANE (1986) fand tageszeitliche Schwankungen des Cortisols zwischen 30 bis 57 ng/ml

Plasma, GYLSTROFF u. HEGNER (1983) fanden Schwankungen zwischen 40 bis 80 ng/ml

Diskussion

109

Plasma. KLAUS u. HAPKE (1996) sehen eine Cortisolkonzentration von 25 bis 65 ng/ml

Plasma, in Abhängigkeit von Tageszeit und Belastung, als normal an.

In dieser Studie war, sowohl nach der intravenösen als auch nach der intramuskulären

Verabreichung von Dexamethason-21-isonicotinat, bei allen Pferden ein geringer, jedoch

statistisch nicht signifikanter Anstieg des Blutcortisolspiegels zu verzeichnen. Bei der

Voren® Suspension-Gruppe war dieser Anstieg innerhalb der ersten halben Stunde nach der

intravenösen Behandlung sichtbar, bei der Voren®-Depot-Gruppe innerhalb der ersten Stunde

nach der intramuskulären Applikation. Auch TOUTAIN et al. (1984) ermittelten nach

intravenöser Verabreichung einer Dexamethason-21-isonicotinat-Lösung einen Anstieg des

Cortisolspiegels in der ersten halben Stunde nach der Applikation, während sie eine

vergleichbare Cortisolwerterhöhung nach intramuskulärer Applikation von Dexamethason-

21-isonicotinat-Lösung nicht feststellen konnten.

Der Anstieg der Cortisolkonzentration ist vermutlich auf den Stress durch die Platzierung des

Venenverweilkatheters und die sich anschließende Blutentnahme zurückzuführen. Nach

FICHTL et al. (2001) nimmt in Stresssituationen die Frequenz und die Höhe der

Corticoidsekretionsspitzen zu. Im Gegensatz zu dieser stressbedingten Cortisolwerterhöhung,

wie sie bei der Platzierung eines Verweilkatheters deutlich wurde, konnte gezeigt werden,

dass die einfache Punktion von Venen zur Blutentnahme keinen Effekt auf den

Plasmacortisolspiegel hat. Auch TOUTAIN et al. (1984) beobachteten dieses Phänomen und

stellten die in dieser Arbeit bestätigte These einer „stressfreien Blutentnahme durch

Venenpunktion“ auf.

Die Cortisolwerte der mit Voren® Suspension behandelten Tiere lagen nach Ablauf von 2,25

Stunden unterhalb des Cortisolschwellenwertes, die der mit Voren®-Depot behandelten

Pferde nach 6 Stunden. Der maximale Suppressionswert war im Mittel bei der Voren®

Suspension-Gruppe nach 48,25 Stunden, bei der Voren®-Depot-Gruppe nach 72,25 Stunden

erreicht. Beide Zeitpunkte liegen somit hinter dem von SLONE et al. (1981) ermittelten

maximalen Suppressionszeitpunkt von 12 Stunden nach intramuskulärer Applikation von

reinem Dexamethason.

Der Cortisolausgangsbereich war bei den Tieren der Voren® Suspension-Gruppe nach 144,25

Stunden, bei den Tieren der Voren®-Depot-Gruppe nach 216,25 Stunden wieder erreicht.

Anders ausgedrückt hielt die Cortisolsuppression nach der Voren® Suspension-Applikation

über 6 Tage bzw. nach der Voren®-Depot-Applikation über 9 Tage an. Dieser Zeitraum war

signifikant länger als der von TOUTAIN et al. (1984) beschriebene Suppressionseffekt über 3

Diskussion

110

Tage nach intravenöser und auch länger als die Suppressionsdauer über 4 Tage nach

intramuskulärer Gabe einer Dexamethason-21-isonicotinat-Lösung. Auch konnte die von

SEAWRIGHT et al. (1979) beobachtete rasche Erholung der Cortisolwerte in dieser Studie

nicht bestätigt werden. Sie ermittelten in ihrer damaligen Studie 60 Stunden post

applikationem und nach vorheriger Cortisolsuppression Cortisolwerte von 30 bis 40 ng pro ml

Plasma. Selbst Studien aktuelleren Datums präsentieren eine schnellere Erholung des

Blutcortisolspiegels. SOMA et al. (2005) beschreiben eine Cortisolsuppression über nur 4

Tage nach intravenöser Injektion einer Voren®-Lösung. Nach FREY (2002) beläuft sich der

suppressive Effekt von wässrigen Kristallsuspensionen sogar auf bis zu mehrere Wochen.

Diese Angabe wurde durch die sich in dieser Studie nochmals zeigende Cortisolsuppression

nach 264,25 Stunden (11 Tage), 360,25 Stunden (15 Tage) und 408,25 Stunden (17 Tage) bei

dem intramuskulär verabreichten Arzneistoff Voren®-Depot bestärkt.

Der Zeitpunkt bis zum Unterschreiten des Cortisolschwellenwertes, die Dauer der

Cortisolsuppression und auch das Wiedereinreihen in den Referenzbereich dauerte bei den

intramuskulär behandelten Tieren deutlich länger als bei den intravenös behandelten Tieren.

Dies ist auf die Tatsache der stattgefundenen Resorption nach intramuskulärer Applikation

vor Beginn des Wirkungseintritts zurückzuführen. Weiterhin war aus den Cortisolwerten der

einzelnen Tiere ersichtlich, dass die Cortisolsuppression nach intravenöser Gabe von Voren®

Suspension stärker war als nach intramuskulärer Verabreichung von Voren®-Depot. Auch

war die Cortisolsuppression innerhalb der Voren® Suspension-Gruppe vergleichbar stark

ausgeprägt. Es war hier bei drei Pferden eine Suppression bis unterhalb der

Testnachweisgrenze zu erkennen. Eine vergleichbar starke Suppression zeigte aus der

Voren®-Depot-Gruppe lediglich ein Pferd, dessen Cortisolspiegel sich im Laufe des

kontrollierten Zeitraumes auch nicht wieder in den Referenzbereich einreihte. Das Absinken

des Cortisolspiegels bis zu einem nicht detektierbaren Wert geht konform mit dem von

HOFFSIS et al. (1970) u. EILER et al. (1979) dokumentierten suppressiven Effekt von

Dexamethason auf die Nebenniere des Pferdes.

Die kürzere, aber deutlichere und bei den sechs Einzeltieren vergleichbar stark ausgeprägte

Cortisolsuppression nach intravenöser Behandlung im Vergleich zur intramuskulären

Verabreichung kann durch den schneller eintretenden Eingriff in die Regulation der

Nebennnierenfunktion verstanden werden. Laut FICHTL et al. (2001) gehört die

Cortisolsuppression zu den ohne Latenz einsetzenden Glucocorticoideffekten. Die erste Phase

der negativen Rückkopplung erfolgt, durch Hemmung der Sekretion von Corticotropin-

Diskussion

111

releasing hormone (CRH) und ACTH, direkt beim Anfluten des Glucocorticoids. Auch nach

einmaliger Gabe kommt es zur sofortigen Suppression der endogenen Cortisolsekretion. Eine

im weiteren Verlauf anhaltende Suppression wird durch die Hemmung der Synthese von

ACTH begründet. Steigende Blutspiegel von körpereigenem oder auch exogen zugeführten

synthetischen Glucocorticoiden hemmen den hypothalamisch-hypophysären Regelkreis

(FREY, 2002). Diese hormonelle Regulation reagiert, wie in dieser Studie verdeutlicht, selbst

bei niedrigen Konzentrationen an synthetischen Glucocorticoiden sehr sensibel. Eine

ausgeprägte Cortisolsuppression bei zeitgleich niedrigen Plasmakonzentrationen an

Dexamethason wurde auch von TOUTAIN et al. (1984) beobachtet, und führte zu der bereits

erwähnten Schlussfolgerung, dass es, gemessen an der starken Cortisolsuppression, lediglich

zu einer anteiligen Resorption der verabreichten Dosis des Glucocorticoids kommt.

Die in dieser Studie trotz niedriger Dexamethasonkonzentrationen ermittelte ausgeprägte

Cortisolsuppression zeigt die Wirksamkeit der Präparate. Eine nachgewiesene Senkung des

endogenen Glucocorticoidspiegels belegt die Wirkung des verabreichten synthetischen

Präparates auf die Steuerungsmechanismen der Cortisolkonzentration im Sinne einer

negativen Rückkopplung auf die ACTH-Ausschüttung im Hypophysenvorderlappen

(TOUTAIN et al., 1984). Das verabreichte Dexamethason-21-isonicotinat hat sowohl in Form

von Voren®-Depot als auch in Form von Voren® Suspension die Produktion von

körpereigenem Cortisol durch die Nebennieren gehemmt.

Abbildung 29 stellt das Gesagte noch einmal graphisch gegenüber.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

0 50 100 150 200 250 300 350 4000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

0 100 200 300 400 5000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Abb. 29: gemittelte Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─♦─) und Cortisol (---)

nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension (links)

bzw. nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot

(rechts) bei jeweils sechs Pferden (x-Achse: Zeit [Stunden]; y-Achse (links): Konzentration

Cortisol [ng/ml]; y-Achse (rechts): Konzentration Dexamethason [ng/ml])

Diskussion

112

4. Beeinflussung des Glucosespiegels durch Dexamethason

Eine nach einer Glucocorticoidbehandlung erwartete Erhöhung der Blutzuckerwerte war in

dieser Studie nicht eindeutig ersichtlich. Der physiologische Referenzbereich in equinem

Serum oder Plasma für Blutglucose von 4,0 bis 7,0 mmol/l wurde bei den zwölf Pferden

beider Gruppen nur in wenigen Einzelwerten überschritten. Nach einem anfänglich

tendenziellen Anstieg des Glucosespiegels zeigten Pferd 4, 5 und 6 der mit Voren®

Suspension behandelten Tiergruppe mit 8,6 mmol/l, 8,8 mmol/l bzw. 7,5 mmol/l je einen

deutlich erhöhten Einzelwert. Die Werte der übrigen Tiere sowohl dieser Tiergruppe als auch

der gesamten Voren®-Depot-Gruppe bewegten sich gleich bleibend im erwähnten

Referenzbereich.

SLONE et al. (1981) ermittelten ähnliche Ergebnisse. Nach intramuskulärer Applikation von

Dexamethason reihte sich hier der in den ersten 12 Stunden leicht erhöhte

Plasmaglucosespiegel innerhalb von zwei bis sieben Tagen post applikationem in ein dem

Referenzbereich entsprechendes Plateau ein. Auch LANE (1986) erzielte nach intravenöser

Applikation von Voren®-Lösung in einer zu dieser Studie adäquaten Dosierung eine nur

geringgradige Erhöhung der Glucosewerte nach 4, 8, 12 und 24 Stunden.

Anders als bei der Cortisolsuppression gehört der gluconeogenetische Effekt der

Glucocorticoide nicht zu den sofort eintretenden Wirkungen. Er wird, wie bereits beschrieben,

durch einen Wirkmechanismus über intrazelluläre Glucocorticoidrezeptoren vermittelt. Diese

Effekte setzten erst nach einer gewissen Latenz ein (FICHTL et al., 2001). Diese Wirklatenz

war auch in dieser Studie zu erkennen, und zwar daran, dass die oben erwähnten erhöhten

Einzelwerte erst nach 8 (Pferd 5), 10 (Pferd 6) bzw. 24,25 (Pferd 4) Stunden auftraten.

Laut FICHTL et al. (2001) steigt die Glucosekonzentration im Plasma erst nach längerer

Anwendung von Glucocorticoiden an. Eine stärkere Erhöhung des Blutglucosespiegels wäre

somit erst nach weiteren Applikationen eines Glucocorticoids zu erwarten. In dieser Studie

wurde das Dexamethason-21-isonicotinat sowohl in Form von Voren® Suspension als auch in

Form von Voren®-Depot jedoch nur einmalig appliziert, da beide Präparate aufgrund ihres

Depoteffektes laut Hersteller nur zur einmaligen Verabreichung vorgesehen sind. Auch

UNGEMACH (2002) rät aufgrund der langen Wirkdauer von Depotpräparaten nur zu einer

einmaligen Verabreichung. Nach MACDONALD (2000) sollten schlechtlösliche Ester nicht

für eine Langzeittherapie in Form von mehrmaliger Applikation eingesetzt werden.

Diskussion

113

In der dieser Studie sehr ähnlichen Arbeit von TOUTAIN et al. (1984) wurde der

Blutglucosespiegel nach Verabreichung von Glucocorticoiden bei Pferden nicht überprüft.

Auch in den von ihnen durchgeführten Studien an Hunden und Rindern wurde dieser

blutchemische Parameter außer Acht gelassen. Eine Untersuchung der Blutglucosewerte

wurde in den Versuchen von ALLERSMEIER et al. (2005) durchgeführt. Jedoch konnte nach

dermaler Applikation von Dexamethason, und erwiesenen systemischen Effekten, keine

Erhöhung des physiologischen Blutglucosespiegels festgestellt werden. Bei anderen Tierarten

hat eine einmalige Verabreichung von Glucocorticoiden einen erwiesenen stärkeren Effekt

auf die Gluconeogenese im Vergleich zum Pferd. Bei Kühen kann schon die einmalige

Verabreichung eines Glucocorticoids und eine daraus resultierende Erhöhung des

Blutglucosespiegels einer Ketose vorbeugen, oder diese in anfänglichen Stadien therapieren

(KEGL, 1992). Auch BRAUN et al. (1970) beobachteten nach einer

Dexamethasonapplikation bei Kühen einen deutlichen Blutglucoseanstieg bei gleichzeitigem

Absinken von Ketonkörpern im Blut und Rückgang der Milchproduktion. Im Vergleich zu

anderen synthetischen Glucocorticoiden erwies sich Dexamethason in der damaligen Studie

als eines der potentesten Mittel.

5. Vergleichende Bewertung der erzielten Ergebnisse

Parallel zum Glucocorticoidplasmaanstieg zeigt sich die einsetzende Cortisolsuppression

(FICHTL et al., 2001). Die nach dieser These erwarteten erniedrigten Cortisolwerte nach

Erhöhung des Dexamethasonspiegels im Plasma konnten sowohl bei den mit Voren®

Suspension als auch bei den mit Voren®-Depot behandelten Tieren eindeutig gezeigt werden.

In den Abbildungen 32-43 im Anhang und in der Abbildung 29 in Kapitel V.3. sind die

Parameter der Dexamethasonkonzentration und der Cortisolkonzentration im Plasma für jedes

einzelne Pferd bzw. gemittelt graphisch gegenübergestellt.

Aufgrund der gezeigten sofort einsetzenden Cortisolsuppression nach einer

Glucocorticoidgabe, wurde die Korrelation zwischen der Plasmakonzentration an

Dexamethason und Cortisol genauer untersucht. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf

deren Verhältnis an den Zeitpunkten nahe der Quantifizierungs- und der Nachweisgrenze

gelegt.

Der untere Grenzwert des Cortisolreferenzbereiches war schon vor Erreichen des maximalen

Plasmadexamethasonwertes bei allen Pferden unterschritten. Nach dem erreichten

Maximalwert an Dexamethason prägte sich die Cortisolsuppression am deutlichsten aus.

Diskussion

114

Lediglich bei zwei Pferden der Voren®-Depot-Gruppe war der maximale Dexamethasonwert

erst spät, d.h. nach 312,25 bzw. 192,25 Stunden erreicht. Als Folge dieser relativ späten

Erhöhung der Plasmakonzentration an Dexamethason war bei Pferd 1 das Nicht-Wieder-

Einreihen des Cortisolwerts in den Referenzbereich zu sehen. Bei Pferd 2 konnten als Folge,

nach vorherigem Erreichen des Cortisolreferenzbereiches, nochmals erniedrigte Werte

gemessen werden. Bei diesen zwei Tieren schien ein direkter zeitlicher Zusammenhang

zwischen der Dexamethasonkonzentration und dem Cortisolspiegel zu bestehen. Dieser

zeitliche Zusammenhang konnte jedoch bei den wiederholt erniedrigten Cortisolwerten der

übrigen Pferde nicht gezeigt werden. Nach vorherigem Einreihen in den Referenzbereich

korrelierten die erneut erniedrigten Cortisolwerte dieser Pferde nicht mit zeitgleich erhöhten

Plasmakonzentrationen an Dexamethason. Die Plasmakonzentrationen an Dexamethason

waren zu diesen Zeitpunkten bereits unterhalb der Nachweisgrenze. Die gezeigte

Cortisolsuppression bzw. die weiter bestehende Wirkung des Glucocorticoids bei fehlender

Nachweisbarkeit von Dexamethason im Plasma kann durch die Persistenz von

Glucocorticoid-Rezeptor-Komplexen in den Kernen der Zielzellen erklärt werden

(GUSTAFSSON et al., 1987).

Eine vergleichende Betrachtung der Dexamethasonspiegel im Urin und der Cortisolwerte im

Plasma war nur bedingt möglich, da die Urinproben über einen deutlich längeren Zeitraum

entnommen und gemessen wurden als die Plasmaproben. Sowohl bei der Voren®

Suspension-Gruppe als auch bei der Voren®-Depot-Gruppe war der Schwellenwert an

Cortisol noch vor Erreichen des maximalen Dexamethasonwertes im Urin unterschritten. Der

maximal erniedrigte Plasmacortisolwert lag zeitlich gesehen auch in der Matrix Urin hinter

dem ermittelten Dexamethasonmaximalwert. Wiederholt erniedrigte Plasmacortisolspiegel

waren nicht mit nochmals signifikant erhöhten Dexamethasonkonzentrationen im Urin

deckungsgleich. Diese erniedrigten Cortisolspiegel traten zeitgleich mit Dexamethasonwerten

auf, die im Fall von Voren®-Depot nur knapp oberhalb der Quantifizierungsgrenze, im Fall

von Voren® Suspension sogar unterhalb der Nachweisgrenze lagen.

Zusammenfassend lässt sich somit, trotz des bestehenden funktionalen Zusammenhanges

zwischen Dexamethason und Cortisol, weder für die Matrix Blut noch für die Matrix Urin

eine direkte konzentrationsabhängige bzw. zeitliche Regelmäßigkeit ableiten.

Weiterhin konnte kein zeitlicher Zusammenhang bzw. eine direkte Korrelation zwischen den

an den jeweiligen Entnahmezeitpunkten ermittelten Dexamethasonwerten in Plasma und Urin

beobachtet werden. Eine sowohl zum gleichen Zeitpunkt auftretende als auch vergleichbar

Diskussion

115

stark ausgeprägte Konzentration eines Wirkstoffes in Plasma und Urin ist nach SAMS (1992)

auch nicht zu erwarten.

6. Bewertung der Ergebnisse bezüglich ihrer Dopingrelevanz

Glucocorticoide erlangen unter dem Gesichtspunkt „Doping zur Wiederherstellung der

normalen Leistungsfähigkeit“ oder als „unabsichtliches Doping“ ihre Bedeutung im

Pferdesport (UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999). Insbesondere schmerzhafte und

entzündliche Prozesse des Bewegungsapparates können mit ihrer Hilfe maskiert werden.

Derzeit gilt jeder Nachweis einer verbotenen Substanz, bzw. in diesem Fall von

Glucocorticoiden, als positives Dopingergebnis gewertet („Null-Lösung“). Jeder oberhalb

einer festgesetzten Nachweisgrenze liegende Wert gilt als „Doping positiv“. Werte unterhalb

der Nachweisgrenze gelten als „Doping negativ“. Zu diesen über der Nachweis- oder der

Quantifizierungsgrenze von Dexamethason liegenden Werten sind auch die wiederholt

detektierbaren Signale nach vorherigem Unterschreiten dieser Grenzen zu zählen. Eine

erwiesenermaßen erhöhte Glucocorticoidkonzentration ist, auch Wochen nach der

Applikation und bei gleichzeitig fehlender Cortisolsuppression, als „Doping positiv“ zu

werten. Diese zurzeit gültige Regelung ist streng und schränkt, gerade bei Sportpferden, den

therapeutischen Einsatz speziell von Depot-Glucocorticoidpräparaten stark ein. Dies kann

einer therapeutisch indizierten Verabreichung eines solchen Präparates und einem

gewünschten Therapieerfolg entgegenstehen. Auch wird nicht berücksichtigt, dass die Menge

der vorliegenden Substanz bereits vollkommen wirkungslos sein kann, so dass das Pferd in

seiner Leistung nicht mehr beeinflusst wird. Die Notwendigkeit dieser strikten

Reglementierung zeigt sich jedoch darin, dass ein die Dopingprobe untersuchendes Labor

nicht unterscheiden kann, ob das Glucocorticoid erst vor kurzem verabreicht wurde, oder ob

es sich um eine eventuelle Restkonzentrationen eines Glucocorticoids nach einer länger

zurückliegenden Glucocorticoidtherapie handelt. Eine Entscheidung über den eventuell lang

oder kurz zurückliegenden Applikationszeitpunkt allein anhand der

Glucocorticoidkonzentration zu treffen, erweist sich folglich als nicht möglich. Erst anhand

einer Gegenüberstellung von Glucocorticoidkonzentration und Cortisolspiegel könnte der

Applikationszeitpunkt eingegrenzt werden.

Diskussion

116

Vergleichbar mit der festgesetzten Nachweisgrenze für synthetische Glucocorticoide gelten

auch für Cortisol Grenzwerte. UNGEMACH u. NÜRNBERGER (1999) stellen den

Grenzwert der Reiterlichen Vereinigung mit < 1 µg Cortisol /ml Urin und den des DIR mit

mindestens 20-30 ng Cortisol/ml Blut gegenüber. Letztgenannter Grenzwert wird in dieser

Arbeit als Vergleichswert herangezogen. Es handelt sich hierbei um einen Grenzwert, der

einen Mindestgehalt angibt, und nicht, wie bei Grenzwerten üblich, einen nicht zu

überschreitenden Höchstwert. Das Unterschreiten dieses Mindestgehaltes an Cortisol ist

demnach als Doping anzusehen. Um im Falle einer bestehenden Cortisolsuppression bei

gleichzeitig fehlender Glucocorticoidnachweisbarkeit über „Doping positiv“ oder „negativ“

zu entscheiden, wäre es vorab notwendig, einen einheitlichen und eventuell später national

bzw. international anerkannten unteren Schwellenwert für Cortisol zu definieren. Ein solcher

Schwellenwert müsste circadiane Rhythmik, Geschlechtsunterschiede, Belastung, Stress und

weitere den Cortisolspiegel beeinflussende Parameter berücksichtigen. Ansonsten wäre

BEYER (1998) zuzustimmen, die das routinemäßig durchgeführte Cortisolscreening in Harn

oder Blut und somit auch die dopingrelevante Aussage des Screeningtests aufgrund von

erheblichen individuellen Schwankungen in Frage stellt. Ein erniedrigter Cortisolspiegel

allein wäre demnach kein sicherer Hinweis auf das Vorhandensein von Glucocorticoiden im

Organismus.

Der vom DIR angegebene Mindestgehalt an Cortisol von 20-30 ng/ml Blut deckt sich mit den

Ergebnissen dieser Studie. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt und auch statistisch abgesichert

werden, dass ein Cortisolwert von 31,87 ng/ml Blut als signifikant erniedrigt anzusehen ist.

Die Festlegung der Untergrenze für den Blutcortisolspiegel nach Applikation von

Dexamethason bei mindestens 30 ng/ml erscheint somit realistisch und ist ein weiterhin noch

zu diskutierender und zu prüfender Vorschlag.

Für andere therapeutisch eingesetzte Glucocorticoide müsste ein solcher Schwellenwert

ebenfalls substanzbezogen festgelegt werden.

Aus den Ergebnissen dieser Studie zeigt sich weiterhin, dass nach der Applikation beider

Präparate die Nachweisgrenze für Dexamethason im Plasma unterschritten ist, noch bevor der

Plasmacortisolspiegel wieder im Referenzbereich liegt. Die Cortisolsuppression bzw. die

biologische Wirkung des Dexamethasons überdauert somit dessen Nachweisbarkeit im

Plasma. Betrachtet man nun die Matrix Urin, so ist das Ende der Plasmacortisolsuppression

im Fall von Voren® Suspension zeitgleich mit dem Unterschreiten der Nachweisgrenze für

Dexamethason im Urin erreicht. Im Fall von Voren®-Depot ist die Plasmacortisolsuppression

Diskussion

117

noch vor Erreichen der Quantifizierungsgrenze für Dexamethason im Urin beendet. Somit

wird deutlich, dass die Ergebnisse der Urinproben eine Aussage über einen längeren Zeitraum

ermöglichen als die Plasmaproben. In Bezug auf die Gruppe der Glucocorticoide, und speziell

Dexamethason, ist es, wie diese Studie zeigt, aufgrund der langen Nachweisbarkeit des

Glucocorticoids im Urin, in jedem Falle notwendig eine Urinprobe zu untersuchen. Dies

impliziert, dass, wie es in der Praxis bereits üblich ist, die Urinprobe die bevorzugte

Probenmatrix für Dopingkontrollen ist. Bei einem Verdacht auf Vorhandensein von

Glucocorticoiden sollte als Konsequenz somit immer eine Urinprobe entnommen werden,

unabhängig von einer gerade bei Urinproben aufwendigeren Entnahmeprozedur und dem

oftmals limitierenden Faktor Zeit. Auch die Entnahme einer Blutprobe ist bei einem Verdacht

hinsichtlich einer Anwendung von Glucocorticoiden ratsam, um den durch die

Glucocorticoidgabe eventuell beeinflussten Cortisolspiegel zu kontrollieren. Da ein

eventueller Verdacht nicht immer so explizit in Richtung eines Einsatzes von

Glucocorticoiden geäußert werden kann, muss überlegt werden, ob Dopingkontrollen im

Allgemeinen beide Matrices, d.h. Blut und Urin, standardmäßig mit einbeziehen sollten.

Für die Stoffklasse der Glucocorticoide ist es nicht möglich, mit Hilfe des von TOUTAIN u.

LASSOURD (2002) vorgestellten Modells eine Aussage über deren Dopingrelevanz zu

machen. So sollte in dieser Studie am Beispiel von Dexamethason versucht werden, den

Ansatz eines möglichen Lösungsmodells für die Gruppe der Glucocorticoide zu erarbeiten.

Dieser Lösungsvorschlag, der sich speziell mit der Problematik von unklaren und strittigen

Dopingfällen beschäftigt, soll somit versuchen, die bestehende Grauzone zwischen „Doping

positiven“ und „Doping negativen“ Fällen zu lichten. Ein solcher Ansatz könnte eine

Alternative zu den derzeit gültigen Dopingreglementierungen darstellen.

Die Parameter der Glucocorticoidkonzentration und des Cortisolspiegels werden bislang

getrennt betrachtet. TOUTAIN et al. (1984) gehen jedoch davon aus, dass eine klinische

Wirkung der Glucocorticoide zu erwarten ist, wenn die pharmakodynamische Wirkung

anhand der Cortisolsuppression belegt werden kann. Es kann auch bei einer fehlenden

Nachweisbarkeit der Substanz noch eine biologische Wirkung bestehen, was für die Gruppe

der Glucocorticoide charakteristisch ist (UNGEMACH, 2002). Auch erwähnen UNGEMACH

u. NÜRNBERGER (1999), dass der nach Applikation von Glucocorticoiden auftretende

Abfall der Blutcortisolkonzentration ein Hinweis auf eine unerlaubte Medikation sein kann.

Diskussion

118

Wie aus dem bisher gesagten deutlich wird, sollte neben der eigentlich interessierenden

Dexamethasonkonzentration der durch Glucocorticoide beeinflussbare Parameter des

Cortisolspiegels in die Entwicklung eines etwaigen Modells mit einbezogen werden.

Um eine zu prüfende und zu diskutierende Grundlage für die bei Dopingkontrollen ermittelten

Ergebnisdaten zu schaffen, müssen theoretisch mehrere Konstellationen eines Ergebnisses

beachtet werden (Tabelle 26):

Ergebnis-

Nr. Dexamethasonkonzentration Blutcortisolwert

I. Dexamethasonkonzentration in Plasma und Urin unter dem LOD

Blutcortisolwert im Referenzbereich

II. Dexamethasonkonzentration in Plasma und Urin unter dem LOD

Blutcortisolwert gleich dem Schwellenwert

III. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin gleich dem LOD


IV. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin über dem LOD, aber unter dem LOQ


V. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin über dem LOQ


VI. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin über dem LOQ

Blutcortisolwert unter Schwellenwert

VII. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin über dem LOD, aber unter dem LOQ


VIII Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin gleich dem LOD


IV. Dexamethasonkonzentration in Plasma und/oder Urin unter dem LOD


Tabelle 26: theoretische Konstellationen an Ergebnissen von Dopingkontrollen

Die in Tabelle 26 zusammengestellten Konstellationen an Ergebnissen von Dopingkontrollen

wurden in dieser Studie exemplarisch ermittelt, in unterschiedliche „Dopinggrade“ (Grad 1

bis 5) zusammengefasst und im Folgenden hinsichtlich ihrer Dopingrelevanz beurteilt. Die

Zusammenstellung der Gradeinteilungen berücksichtigt speziell die Konstellationen von

Ergebnisdaten in unklaren oder zweifelhaften Dopingfällen. So wurden die unterschiedlichen

Stufen des Dopinggrades anhand des Auftretens von Dexamethasonkonzentrationen in Blut

und/oder Urin, anhand eventuellen zeitgleich veränderten Cortisolkonzentrationen, somit nach

der Ausprägung der pharmakodynamischen Wirkung, und anhand der Höhe der

Glucocorticoid- und der Cortisolkonzentrationen eingeteilt.

Unter paralleler Betrachtung eines bestehenden Cortisolschwellenwertes, dem Vorliegen von

sowohl Blut als auch Urin als zu untersuchende Matrices und dem Vorliegen von in

Diskussion

119

unterschiedliche Dopinggrade eingeteilten Ergebnissen kann ein mögliches Lösungsmodell

für die Gruppe der Glucocorticoide, am Beispiel von Dexamethason, formuliert werden:

• Unter „Dopinggrad 1“ fallen Dexamethasonkonzentrationen, die in Plasma und/oder

Urin über dem LOQ liegen, bei einem gleichzeitig innerhalb des Referenzbereiches

liegenden Blutcortisolwert. Der Dexamethasongehalt ist eindeutig zu quantifizieren.

Der Cortisolgehalt ist jedoch nicht erniedrigt. Es ist anzunehmen, dass die

Verabreichung des Glucocorticoids sehr kurzfristig vor dem Wettkampf stattfand, da

eine pharmakodynamische Wirkung auf den Cortisolspiegel noch nicht eingetreten ist.

Das Ergebnis der Dopingkontrolle ist in diesem Fall als „Doping positiv“ zu bewerten.

• „Dopinggrad 2“ beinhaltet Dexamethasonkonzentrationen in Plasma und/oder Urin,

die über dem LOQ liegen, bei einem gleichzeitig unter dem Schwellenwert liegenden

Blutcortisolwert. Der erhöhte Dexamethasongehalt ist eindeutig zu quantifizieren. Der

Cortisolgehalt ist erwiesenermaßen erniedrigt und die pharmakodynamische Wirkung

auf den Cortisolspiegel ist gezeigt. Die Verabreichung des Glucocorticoids scheint

wettkampfnah stattgefunden zu haben. Ein solcher Fall ist ebenfalls als „Doping

positiv“ einzustufen.

• „Dopinggrad 3“ umfasst zum einen Dexamethasonkonzentrationen, die im Plasma

unter dem LOQ, aber im Urin gleich oder über dem LOD bzw. LOQ liegen und mit

einem Blutcortisolwert unterhalb des Schwellenwertes vergesellschaftet sind, zum

anderen Dexamethasonkonzentrationen, die im Plasma unter dem LOD, aber im Urin

gleich oder über dem LOD bzw. LOQ liegen und gleichzeitig mit einem

Blutcortisolwert unterhalb des Schwellenwertes auftreten. Der Dexamethasongehalt

im Urin ist bei den beiden angeführten Ergebniskonstellationen eindeutig zu

quantifizieren. Jedoch ist im ersten Fall keine Quantifizierung bzw. im zweiten Fall

keine Nachweisbarkeit des Glucocorticoids im Blut mehr möglich. Der Cortisolgehalt

ist wiederum in beiden Fällen erwiesenermaßen erniedrigt und die

pharmakodynamische Wirkung auf den Cortisolspiegel ist gezeigt. Anzunehmend

kann von einer wettkampfnahen Verabreichung eines kurzwirksamen Glucocorticoids

oder einer wettkampffernen Verabreichung eines langwirksamen Glucocorticoids

(evtl. eines Glucocorticoidesters) ausgegangen werden. Beide Ergebniskonstellationen

sind als „Doping positiv“ zu bewerten.

Diskussion

120

• „Dopinggrad 4“ fasst Ergebnisse von Dopingkontrollen zusammen, bei denen sich die

Dexamethasonkonzentrationen im Plasma unter dem LOD, im Urin gleich oder über

dem LOD, aber unter dem LOQ bewegen, bei einem innerhalb des Referenzbereiches

liegenden Blutcortisolwert. In diesem Fall ist der Dexamethasongehalt weder im Blut

noch im Urin eindeutig zu quantifizieren. Es besteht keine Nachweisbarkeit des

Glucocorticoids mehr im Blut, jedoch im Urin. Der Cortisolgehalt ist nicht erniedrigt.

Es kann von einer wettkampffernen Verabreichung des Glucocorticoids ausgegangen

werden, da die pharmakodynamische Wirkung auf den Cortisolspiegel nicht mehr

gezeigt ist. Die fehlende Quantifizierbarkeit des Glucocorticoids im Urin, sowie eine

fehlende pharmakodynamische Wirkung auf den Cortisolspiegel schließen eine noch

bestehende Wirksamkeit des Glucocorticoids aus. Das beprobte Pferd sollte als

“Doping auffällig“ gelten, nach einer angenommen länger zurückliegenden Therapie

mit Glucocorticoiden.

• Unter „Dopinggrad 5“ sind Dexamethasonkonzentrationen einzustufen, die im Plasma

und Urin unter dem LOD liegen und gleichzeitig einen dem Schwellenwert

entsprechenden Blutcortisolwert aufweisen. Das Glucocorticoid Dexamethason ist

weder im Plasma noch im Urin nachzuweisen, so dass kein Verdacht hinsichtlich einer

Glucocorticoidapplikation geäußert werden kann. Der Cortisolwert ist zwar erniedrigt,

er liegt jedoch an der Untergrenze des festgelegten Referenzbereiches. Die

Erniedrigung des Cortisolwertes ist vermutlich durch circadiane Rhythmik,

Geschlechtsunterschiede, Belastung, Stress oder weitere den Cortisolspiegel

beeinflussende Parameter begründet. Ein solches Ergebnis einer Dopingprobe ist

demnach als „Doping negativ“ zu bewerten.

Die in dieser Studie erarbeiteten, und in dem dargestellten Lösungsmodell integrierten

Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen sind einerseits sehr genau und sensibel, so dass

schon kleinste Mengen an Dexamethason detektiert werden können. Andererseits limitieren

diese Grenzen, wie oben bereits erwähnt, den Einsatz von mit Glucocorticoiden behandelten

Pferden im Wettkampf. In diesem Zusammenhang kommt die Frage von Karenzzeiten und

Absetzfristen auf. Eine von CUNNINGHAM et al. (1996) festgelegte Karenzzeit, welche der

Zeit bis zum Unterschreiten der Quantifizierungsgrenze im Plasma entspricht, wird als sehr

unsicher beurteilt und als nicht ratsam betrachtet. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, reicht

Diskussion

121

diese Zeitspanne nicht aus, um das Glucocorticoid Dexamethason aus dem Organismus zu

eliminieren. Auch ist in der Studie von CUNNINGHAM et al. (1996) eine im Hinblick auf

eine interindividuelle Variabilität der Pferde als sinnvoll erachtete Sicherheitsspanne nicht mit

einkalkuliert. Eine solche Sicherheitsspanne sollte einen zeitlichen Rahmen setzten, innerhalb

dessen ein Wirkstoff bei jedem Pferd ausgeschieden bzw. wirkungslos ist.

Auch in dieser Studie ist eine Empfehlung für Karenzzeiten sowie für Absetzfristen aufgrund

der erwähnten interindividuellen Variabilität der Pferde kaum möglich. Aufgrund der

gezeigten interindividuellen Schwankungen der erreichten Dexamethasonkonzentrationen in

Blut und Urin, der unterschiedlichen Zeiten bis zum Erreichen der Quantifizierungs- und

Nachweisgrenze, der verschieden stark ausgeprägten Cortisolsuppression, der nur sehr

eingeschränkt möglichen pharmakokinetischen Berechnungen und natürlich auch aufgrund

der sehr geringen Anzahl an Versuchspferden können die Ergebnisse nicht auf die

Gesamtpopulation an Pferden übertragen werden. Eine definitive Aussage darüber, wie lange

die Substanz Dexamethason in der Spezies Pferd nachgewiesen werden kann, kann damit

nicht getroffen werden. Die ermittelten Ausscheidungszeiten bis zum Erreichen der

Nachweisgrenzen und die Dauer der Cortisolsuppression können als ein Anhaltspunkt, nicht

aber als eine verbindliche Aussage für den Einsatz von Voren® Suspension und Voren®-

Depot vor einem Turnier oder Wettkampf angesehen werden.

Als Alternative zu den nicht verbindlich zu ermittelnden Ausscheidungs- und Karenzzeiten

bietet das in dieser Arbeit entwickelte und oben vorgeschlagene Modell für den Wirkstoff

Dexamethason konkrete dopingrelevante Rahmenbedingungen. Um die Bedingungen eines

„Doping negativen“ Ergebnisses zu erfüllen, muss der Dexamethasongehalt unter der

Nachweisgrenze liegen, d.h. im Plasma unter 0,12 ng/ml, im Urin unter 0,67 ng/ml.

Gleichzeitig darf sich der Blutcortisolspiegel nicht unterhalb des Schwellenwertes von 30

ng/ml bewegen. Als „Doping positiv“ sind die folgenden Ergebnisse einzustufen. Eindeutig

„positiv“ sind zum einen Dexamethasonwerte, die in Plasma über 0,25 ng/ml und im Urin

über 1 ng/ml, d.h. über der Quantifizierungsgrenze liegen. Zum anderen Dexamethasonwerte

in Plasma und Urin, die unterhalb der Quantifizierungsgrenze liegen, aber die

Nachweisgrenze von 0,12 ng/ml bzw. 0,67 ng/ml überschreiten und mit einem Cortisolwert

von weniger als 30 ng/ml vergesellschaftet sind. Der Fall eines “Doping auffälligen“

Ergebnisses ist bei zwischen 0,67 ng/ml und 1 ng/ml liegenden Dexamethasonwerten im Urin

und einem Cortisolspiegel von über 30 ng/ml gegeben.

Diese Ergebnisse wurden anhand der intravenösen Applikation von Voren® Suspension und

der intramuskulären Applikation von Voren®-Depot erarbeitet, so dass weiterhin zu prüfen

Diskussion

122

bleibt, ob diese Angaben auf andere Dexamethasonpräparate und auf andere

Applikationsarten zu übertragen sind.

Zusammenfassung

123

VI. Zusammenfassung

Maren Milewski (2006)

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes Dexamethason hinsichtlich der

Dopingrelevanz beim Pferd

Ziel der durchgeführten Arbeit war es, mittels einer pharmakologischen Studie an zwölf

Pferden und sich anschließender Analyse von Plasma- und Urinproben eine Aussage darüber

machen zu können, wie lange das Glucocorticoid Dexamethason nach einmaliger intravenöser

und einmaliger intramuskulärer Applikation von Dexamethason-21-isonicotinat nachgewiesen

und quantifiziert werden kann. Geeignete Analysemethoden für Plasma und Urin kombiniert

mit einer HPLC/MS/MS-Methode wurden im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln im Vorfeld entwickelt und validiert. Als interner Standard diente

Fluocortolon. Die Validierung beinhaltete die Parameter Selektivität, Linearität, Richtigkeit,

Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die Quantifizierungsgrenze lag im Plasma bei 0,25

ng/ml und im Urin bei 1 ng/ml. Die Nachweisgrenze belief sich im Plasma auf 0,12 ng/ml, im

Urin auf 0,67 ng/ml.

In dieser Studie wurde Dexamethason-21-isonicotinat in Form von Voren® Suspension sechs

Pferden einmalig intravenös in einer Dosierung von 0,02 mg /kg Körpergewicht verabreicht,

weitere sechs Pferde wurden einmalig intramuskulär mit Dexamethason-21-isonicotinat in

Form von Voren®-Depot in einer Dosierung von 0,06 mg/kg Körpergewicht behandelt. Nach

Applikation von Voren® Suspension war die Nachweisgrenze im Plasma nach 72,25 Stunden

unterschritten, im Urin nach 144,5 Stunden. Die Nachweisgrenze wurde nach der Voren®-

Depot-Behandlung im Plasma nach 168,25 Stunden und im Urin nach 552 Stunden erreicht.

Neben der Bestimmung der Dexamethasonkonzentrationen in Plasma und Urin wurden

weiterhin die Cortisol- und die Glucosekonzentrationen im Plasma ermittelt, um den

Glucocorticoideinfluss auf diese Parameter beurteilen zu können. Eine signifikante Erhöhung

des Blutglucosespiegel der einzelnen Pferde konnte nicht gezeigt werden. Die

Cortisolsuppression hielt nach der intravenösen Verabreichung von Voren® Suspension im

Mittel über 6 Tage an, nach der Voren®-Depot-Applikation wurde ein gemittelter

suppressiver Effekt über 9 Tagen beobachtet. Die biologische Wirkung des Glucocorticoids

Zusammenfassung

124

Dexamethason wurde somit mit Hilfe der Cortisolkonzentration gezeigt. Die anhand der

Cortisolsuppression bemessene und angegebene Dauer der Dexamethasonwirkung kann

jedoch lediglich als ein Anhaltspunkt, nicht als Garantie, für den erneuten Einsatz eines mit

Dexamethsaon-21-isonicotinat behandelten Tieres in einem Wettkampf angesehen werden.

Pharmakokinetische Berechnungen bezüglich Halbwertszeit, Verteilungsvolumen und

Clearance konnten aufgrund der nur sehr niedrigen Plasmakonzentrationen an Dexamethason

nicht durchgeführt werden. Auch die pharmakokinetischen Berechnungen nach dem PK/PD-

Modell von TOUTAIN und LASSOURD (2002) sind im Falle von Dexamethason bzw. von

Glucocorticoiden nicht möglich, da dieses Modell nur bei Stoffen Anwendung finden kann,

deren biologische Halbwertszeit der Eliminationshalbwertszeit entspricht.

Eine generelle und für den Einzelfall Sicherheit bietende Aussage bezüglich der

Ausscheidungszeit für Dexamethason war in dieser Studie aufgrund der eingeschränkten

Möglichkeit der pharmakokinetischen Berechnung, sowie aufgrund der begrenzten Tierzahl,

mit weiterhin interindividuellen Unterschieden, nicht möglich. Alternativ wurde anhand von

paralleler Betrachtung und Gegenüberstellung der ermittelten Dexamethasonkonzentrationen

in Plasma und Urin und des Cortisolspiegels versucht, einen Ansatz eines möglichen

Lösungsmodells für die Gruppe der Glucocorticoide zu erarbeiten.

Summary

125

VII. Summary

Maren Milewski (2006)

Pharmacokinetic investigation of the drug dexamethasone with respect to its relevance in

horse-doping

It was the objective of this survey to give a stated view about how long the glucocorticoid

dexamathasone can be detected and quantified after a single intravenous and a single

intramuscular administration of dexamethasone-21-isonicotinate. This could be achieved by

means of a pharmacological study on twelve horses and the following analysis of plasma and

urine samples. A suitable method for the analysis of plasma and urine combined with

measurement by HPLC/MS/MS was developed and validated at the institute of Biochemistry

at the Deutsche Sporthochschule in Cologne before. Fluocortolon was chosen as the internal

standard. The validation contained the criteria selectivity, linearity, accuracy, precision,

stability and recovery. The limit of quantification in plasma was fixed at 0,25 ng/ml and 1

ng/ml in urine. The limit of detection was fixed at 0,12 ng/ml in plasma and 0,67 ng/ml in

urine.

In the present study dexamethasone-21-isonicotinate, as Voren® Suspension, was

administered intravenously to six horses at a singular dosage rate of 0,02 mg/kg body weight,

dexamethasone-21-isonicotinate in form of Voren®-Depot was administered intramuscularly

to another six horses in a singular dosage of 0,06 mg/kg body weight. After the administration

of Voren® Suspension the limit of detection in plasma was reached after 72,25 hours and in

urine after 144,25 hours. The limit of detection after administration of Voren®-Depot was

reached in plasma after 168,25 hours and in urine after 552 hours. Besides qualifying the

concentration of dexamethasone in plasma and urine samples the concentration of

hydrocortisone and glucose in plasma was determined with the intention to evaluate the effect

of glucocorticoid on these parameters. A significant increase in blood glucose could not be

shown. The average duration of suppressive effect after the application of Voren® Suspension

longs for 6 days and after the application of Voren®-Depot for 9 days. The biological effect

of the glucocorticoid dexamethasone could therefore be shown. The duration of the

glucocorticoid effects calculated on the basis of the suppressive effect of hydrocortisone can

Summary

126

merely be regarded as an indication but not as an assurance for starting a horse in a

competition which was administrated with dexamethasone-21-isonicotinate.

Pharmacological calculations regarding plasma half-life-time, volume of distribution and

clearance could not be made because of very low concentrations of dexamethasone in plasma.

Furthermore it was not possible to make pharmacokinetic calculations with the

pharmacokinetic-pharmacodynamic model of TOUTAIN and LASSOURD (2002) for the

drug dexamethasone. This model can only be used for drugs whose biological half-life-time is

in accordance with its half-life-time of elimination.

In this study a definite and in each particular case certainty providing statement concerning

the excretion times of dexamethasone could not be given because of the limited possibility of

pharmacological calculations and the too small number of probands with also interindividual

variability. As an alternative we tried to develop a basic model of resolution for the group of

glucocorticoids by parallel contemplation of the hydrocortisone level and the determined

concentrations of dexamethasone.

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127

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Tabellenverzeichnis

146

IX. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: klinische Verdachtssymptome und mögliche Manipulation für Doping bei Pferden

(nach UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999)

Tabelle 2: Alter, Geschlecht und Rasse der Versuchspferde

Tabelle 3: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 1 und verabreichte Menge an Voren®

Suspension (Dosierung: 0,02 mg/kg Körpergewicht)

Tabelle 4: Gewicht der Versuchspferde der Gruppe 2 und verabreichte Menge an Voren®-

Depot (Dosierung: 0,06 mg/kg Körpergewicht)

Tabelle 5: Entnahmezeitpunkte von Blut– und Urinproben im Hauptversuch

Tabelle 6: verwendete Chemikalien

Tabelle 7: Gradientenbedingungen

Tabelle 8: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur

Bestimmung der Selektivität

Tabelle 9: Dexamethasonkonzentrationen an den einzelnen Kalibrationspunkten zur

Bestimmung der Linearität

Tabelle 10: Dexamethasonkonzentrationen in den einzelnen Probenansätzen zur Bestimmung

der Stabilität

Tabelle 11: Nachweis- und Quantifizierungsgrenze für Dexamethason in Plasma und Urin


Dexamethason im Plasma

Tabellenverzeichnis

147


Dexamethason im Urin

Tabelle 14: Intraday Präzision und Interday Präzision im Plasma

Tabelle 15: Intraday Präzision und Interday Präzision im Urin






von Dexamethason in den Plasmaproben






von Dexamethason in den Urinproben

Tabelle 22: Wiederfindungsrate von Dexamethason in Plasma und Urin

Tabelle 23: Wiederfindungsrate von Fluocortolon in Plasma und Urin

Tabelle 24: Probennummer, Entnahmezeitpunkt und gemittelte Plasmakonzentrationen von

Glucose nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren®


Tabellenverzeichnis

148

Tabelle 25 : Probennummer, Entnahmezeitpunkt und gemittelte Plasmakonzentrationen von

Glucose nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot

bei sechs Pferden

Tabelle 26: theoretische Konstellationen an Ergebnissen von Dopingkontrollen

Tabelle 27: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Plasmaproben, ermittelte

Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 1 der Voren®

Suspension-Gruppe



Suspension-Gruppe



Suspension-Gruppe



Suspension-Gruppe



Suspension-Gruppe



Suspension-Gruppe


Konzentrationen an Dexamethason, Cortisol, Glucose und Kreatinin von Pferd 1 der Voren®-

Depot-Gruppe

Tabellenverzeichnis

149



Depot-Gruppe



Depot-Gruppe



Depot-Gruppe



Depot-Gruppe



Depot-Gruppe

Tabelle 39: Probennummer, Entnahmezeitpunkte der Urinproben und ermittelte

Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 1 und 2 der Voren® Suspension-Gruppe






Konzentrationen an Dexamethason von Pferden 1 und 2 der Voren®-Depot-Gruppe



Tabellenverzeichnis

150



Abbildungsverzeichnis

151

X. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Resorptionskinetik 0. Ordnung (links), Resorptionskinetik 1. Ordnung (rechts)

Abb. 2: Eliminationskinetik 0. Ordnung (links), Eliminationskinetik 1. Ordnung (rechts)

Abb. 3: schematische Darstellung einer intravasalen Applikation im Zwei-Kompartiment-

Modell

Abb. 4: Strukturformel Cortisol

Abb. 5: Strukturformel Dexamethason

Abb. 6: Strukturformel Dexamethason-21-isonicotinat

Abb. 7: Massenspektrum und Strukturformel von Dexamethason

Abb. 8: Massenspektrum und Strukturformel von Fluocortolon

Abb. 9: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer

Leerplasmaprobe (links) und einer mit 5 ng/ml Dexamethason dotierten Plasmaprobe (rechts)

zum Zeitpunkt der Retention von Dexamethason (6,56 Minuten)

Abb. 10: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer Leerurinprobe

(links) und einer mit 50 ng/ml Dexamethason dotierten Urinprobe (rechts) zum Zeitpunkt der

Retention von Dexamethason (6,56 Minuten)

Abb. 11: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit einer mit 25 ng/ml

Fluocortolon (interner Standard) dotierten Leerplasmaprobe (links) und einer mit 10 ng/ml

Fluocortolon (interner Standard) dotierten Leerurinprobe (rechts) zum Zeitpunkt der

Retention von Fluocortolon (7,06 Minuten)


152

Abb. 12: Kalibrationskurve des unteren Kalibrationsbereiches für Dexamethason im Plasma


Abb. 13: Kalibrationskurve des oberen Kalibrationsbereiches für Dexamethason im Plasma


Abb. 14: Kalibrationskurve für Dexamethason im Urin inklusive Geradengleichung und

Korrelationskoeffizient

Abb. 15: HPLC/MS/MS-Chromatogramm mit integrierter Retentionszeit von D5-

Androsteron-glucuronid im Urin ohne Hydrolyse (links) bzw. nach Hydrolyse (rechts) zum

Zeitpunkt der Retention von D5-Androsteron-glucuronid (8,9 Minuten)

Abb. 16: Plasmakonzentrationsverläufe (Werte unterhalb der Quantifizierungsgrenze sind

nicht zu exakt quantifizieren), Quantifizierungsgrenze (──) und Nachweisgrenze (−−) von

Dexamethason bei sechs Pferden nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg

KGW Voren® Suspension











0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden




153

0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden in den ersten 80 Stunden nach der

Behandlung









Depot bei sechs Pferden



Depot bei sechs Pferden in den ersten 200 Stunden nach der Behandlung



0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension bei sechs Pferden



0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension bei sechs Pferden in den ersten 25 Stunden nach der

Behandlung

Abb. 27: gemittelter Plasmakonzentrationsverlauf (─♦─) und unterer Grenze des 95%-


mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden




154

mg/kg KGW Voren®-Depot bei sechs Pferden in den ersten 25 Stunden nach der

Behandlung

Abb. 29: gemittelte Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─♦─) und Cortisol (---)

nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension (links)

bzw. nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot

(rechts) bei jeweils sechs Pferden (x-Achse: Zeit [Stunden]; y-Achse (links): Konzentration

Cortisol [ng/ml]; y-Achse (rechts): Konzentration Dexamethason [ng/ml])

Abb. 30: Schema der Aufarbeitung von Plasmaproben von Pferden zur Bestimmung von

Dexamethason

Abb. 31: Schema der Aufarbeitung von Urinproben von Pferden zur Bestimmung von

Dexamethason

Abb. 32: Plasmakonzentrationsverläufe von Dexamethason (─•─) und Cortisol (---) bei Pferd

1 nach einmaliger intravenöser Applikation von 0,02 mg/kg KGW Voren® Suspension












155


1 nach einmaliger intramuskulärer Applikation von 0,06 mg/kg KGW Voren®-Depot











Anhang

156

XI. Anhang

Probenvorbereitung

↓

2 ml Plasma im Reagenzglas

↓

+ 25 ng Fluocortolon (interner Standard)

(50 µl einer methanolischen Lösung, die 1 µg/ml Fluocortolon enthält)

↓

+ 100 µl wässrige K2CO3–Lösung (5 %) + 500 ml tertiär Butanol, 5 sec schütteln (Vortex)

↓

+ 8 ml tertiär Butylmethylether, 10 min schütteln ↓

Etherphase in ein neues Reagenzglas überführen, am Rotationsverdampfer zur Trockene einengen

↓

trockener Rückstand: + 2 ml MeOH, 5 sec schütteln (Vortex)

+ 100 µl Milli-Q-H2O, 5 sec schütteln (Vortex) + 5 ml n-Pentan 5 min schütteln

↓

n-Pentanphase verwerfen und methanolische Phase am Rotationsverdampfer zur Trockene einengen

in 100 µl MeOH anlösen und in HPLC-Messgefäß mit Mikroeinsatz überführen

Abb. 30: Schema der Aufarbeitung von Plasmaproben von Pferden zur Bestimmung von

Dexamethason

Anhang

157

Probenvorbereitung

↓

5 ml Urin im Reagenzglas

↓

+ 25 ng Fluocortolon, 2500 ng D5-Androsteron-glucuronid /ml (interner Standard) (50 µl einer methanolischen Lösung, die 1 µg/ml Fluocortolon und 250 µg/ml D5-

Androsteron-glucuronid enthält)

↓

+ 1,5 ml Phosphat-Puffer (0,8 molar); bis ph 7 ↓

+ 70 µl ß-Glucoronidase von Escherichia coli ↓

Hydrolyse über Nacht (14 Stunden) bei 37 °C im Wasserbad ↓

+ ca. 1,5 g NaHCO3/K2CO3 (2:1; g: g)

30 sec schütteln (Vortex) ↓

+ 6 ml tertiär Butymethyllether, 15 min schütteln 10 min zentrifugieren bei 1800 rpm

↓

Etherphase in ein neues Reagenzglas überführen (Pasteurpipette), am Rotationsverdampfer zur Trockene

einengen ↓

in 100 µl MeOH anlösen und in HPLC-Messgefäß mit Mikroeinsatz überführen (Pasteurpipette)

Abb. 31: Schema der Aufarbeitung von Urinproben von Pferden zur Bestimmung von

Dexamethason

Anhang

158

0

0,2

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Anhang

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Anhang

160

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0 100 200 300 400Stunden

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Anhang

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0,0

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Anhang

162

0,0

0,2

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0 100 200 300 400 500Stunden

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Anhang

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0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 100 200 300 400 500Stunden

Kon

z. D

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0 100 200 300 400 500Stunden

Kon

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Kon

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l]



Anhang

164

Proben-Nr.

Entnahme- zeitpunkt (Stunden)

Dexamethason-konzentration

im Plasma [ng/ml]

Cortisol- konzentration

im Plasma [ng/ml]

Glucose- konzentration

im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 66,5 5,1 75 2 0,25 0,7 97,3 5,1 3 0,5 0,9 83,9 4,8 4 1,25 0,9 64,0 4,7 5 2,25 1,0 36,1 5,4 6 3 1,0 22,8 5,3 7 4 1,2 17,2 5,1 8 6 1,1 10,4 5,9 9 8 1,3 6,9 5,8 10 10 1,2 7,8 5,0 11 12,25 1,1 5,3 5,3 12 24,25 0,9 8,0 5,0 13 48,25 0,3 4,7 5,7 14 72,25 0,2 4,2 4,5 15 96,25 n.n. 2,9 4,6 16 120,25 n.n. 13,6 4,9 17 144,25 n.n. 69,1 4,6 18 168,25 n.n. 112,5 4,6 80 19 216,25 n.n. 60,3 4,5 20 264,25 n.n. 70,7 4,6 21 312,25 n.n. 40,5 4,9 22 360,25 n.n. 44,3 4,8 78



Suspension-Gruppe

Anhang

165

Proben-

Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 81,9 5,2 73 2 0,25 0,4 87,3 5,3 3 0,5 0,6 87,3 5,0 4 1,25 0,6 57,2 5,3 5 2,25 0,7 38,2 4,8 6 3 0,6 23,9 5,1 7 4 0,6 18,7 5,0 8 6 0,7 6,9 5,6 9 8 0,8 3,9 4,9 10 10 0,7 3,6 4,8 11 12,25 0,6 n.n. 4,6 12 24,25 0,5 n.n. 5,2 13 48,25 0,3 3,2 5,5 14 72,25 n.n. n.n. 5,2 15 96,25 n.n. 8,8 4,8 16 120,25 n.n. 28,5 4,8 17 144,25 n.n. 62,3 5,1 18 168,25 n.n. 79,4 5,0 83 19 216,25 n.n. 71,5 4,6 20 264,25 0,2 70,9 4,7 21 312,25 n.n. 88,7 5,7 22 360,25 n.n. 73,7 4,7 83



Suspension-Gruppe

Anhang

166

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 75,8 4,7 97 2 0,25 0,2 108,4 4,6 3 0,5 0,2 105,2 4,2 4 1,25 0,2 69,3 4,6 5 2,25 0,3 43,3 4,4 6 3 0,3 29,4 6,3 7 4 0,4 25,2 6,2 8 6 0,4 15,1 5,4 9 8 0,4 6,7 4,6 10 10 0,4 5,2 3,6 11 12,25 0,4 34,4 5,4 12 24,25 0,3 n.n. 5,3 13 48,25 n.n. n.n. 4,9 14 72,25 n.n. 14,2 5,1 15 96,25 n.n. 39,6 4,4 16 120,25 n.n. 52,9 5,3 17 144,25 n.n. 65,0 4,5 18 168,25 n.n. 27,6 4,8 99 19 216,25 n.n. 43,8 4,9 20 264,25 n.n. 48,7 5,3 21 312,25 n.n. 49,8 4,7 22 360,25 n.n. 35,2 4,9 100



Suspension-Gruppe

Anhang

167

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 52,7 5,3 85 2 0,25 0,2 69,9 5,6 3 0,5 0,3 73,4 5,3 4 1,25 0,4 44,4 5,2 5 2,25 0,4 25,1 5,4 6 3 0,4 9,5 5,1 7 4 0,5 7,7 5,5 8 6 0,4 n.n. 5,4 9 8 0,5 n.n. 5,6 10 10 0,5 n.n. 5,4 11 12,25 0,4 n.n. 4,9 12 24,25 1,1 n.n. 8,6 13 48,25 0,3 n.n. 5,1 14 72,25 n.n. n.n. 4,8 15 96,25 0,3 n.n. 4,7 16 120,25 n.n. 25,4 5,6 17 144,25 n.n. 51,7 4,7 18 168,25 0,2 55,3 4,9 100 19 216,25 n.n. 47,0 4,9 20 264,25 n.n. 57,2 4,7 21 312,25 n.n. 92,7 4,8 22 360,25 n.n. 74,6 4,8 72



Suspension-Gruppe

Anhang

168

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 35,2 4,5 64 2 0,25 0,3 42,4 5,8 3 0,5 0,6 70,7 5,6 4 1,25 0,5 54,1 4,2 5 2,25 0,8 31,1 4,5 6 3 1,0 22,4 4,6 7 4 0,7 11,8 4,5 8 6 0,4 4,9 5,2 9 8 0,7 n.n. 8,8 10 10 0,5 n.n. 6,9 11 12,25 0,3 n.n. 5,1 12 24,25 0,6 n.n. 4,9 13 48,25 0,3 n.n. 4,9 14 72,25 n.n. n.n. 4,8 15 96,25 n.n. 4,6 4,4 16 120,25 n.n. 28,7 4,6 17 144,25 n.n. 30,4 4,3 18 168,25 n.n. 33,6 4,4 67 19 216,25 n.n. 43,4 4,6 20 264,25 n.n. 48,0 4,8 21 312,25 n.n. 38,1 5,0 22 360,25 n.n. 27,9 4,7 59



Suspension-Gruppe

Anhang

169

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 52,0 4,7 69 2 0,25 0,4 48,7 4,7 3 0,5 0,6 44,6 4,8 4 1,25 0,6 28,5 4,5 5 2,25 0,6 17,5 4,7 6 3 0,7 18,8 4,9 7 4 0,8 12,0 4,5 8 6 0,8 9,0 4,8 9 8 0,6 4,8 6,7 10 10 0,5 3,8 7,5 11 12,25 0,6 3,9 4,8 12 24,25 0,5 4,0 4,8 13 48,25 0,2 3,6 5,4 14 72,25 n.n. 5,6 4,9 15 96,25 n.n. 9,1 4,7 16 120,25 n.n. 17,1 4,6 17 144,25 n.n. 50,2 4,7 18 168,25 n.n. 51,5 4,8 74 19 216,25 n.n. 66,4 4,5 20 264,25 n.n. 78,3 4,5 21 312,25 n.n. 47,8 5,2 22 360,25 n.n. 69,7 4,5 97



Suspension-Gruppe

Anhang

170

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 36,8 4,7 107 2 1 0,2 44,6 4,9 3 2,25 n.n. 25,0 4,5 4 3 n.n. 16,1 4,8 5 4 n.n. 14,7 4,8 6 6 n.n. 32,8 5,0 7 8 0,2 11,6 5,0 8 12,25 0,2 8,3 4,9 9 23,5 0,2 5,2 4,7 10 48,25 0,2 3,8 4,8 11 72,25 n.n. 3,9 4,5 12 96,25 n.n. 5,9 4,8 13 120,25 n.n. 13,2 5,1 14 144,25 n.n. 12,7 4,8 15 168,25 n.n. 28,1 4,4 16 192,25 n.n. 20,2 4,6 17 216,25 n.n. 24,6 4,4 94 18 240,25 n.n. n.g. 4,4 19 264,25 n.n. 35,2 5,2 20 312,25 1,0 31,2 4,6 21 360,25 n.n. 23,8 4,6 22 408,25 n.n. 24,4 4,7 23 456,25 n.n. 37,8 4,9 86



Depot-Gruppe

Anhang

171

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 42,1 4,7 83 2 1 n.n. 61,3 4,3 3 2,25 n.n. 51,1 5,8 4 3 n.n. 59,3 5,8 5 4 0,2 62,6 5,8 6 6 0,2 17,9 5,9 7 8 0,2 6,6 3,8 8 12,25 0,2 1,1 2,8 9 23,5 0,2 6,6 4,6 10 48,25 0,2 5,1 5,1 11 72,25 n.n. 4,1 5,2 12 96,25 n.n. 3,6 5,1 13 120,25 n.n. 8,0 5,3 14 144,25 n.n. 13,9 5,5 15 168,25 n.n. 14,9 5,0 16 192,25 0,6 19,7 5,6 17 216,25 n.n. 31,5 5,1 66 18 240,25 n.n. n.g. 5,0 19 264,25 n.n. 33,0 5,9 20 312,25 n.n. 39,4 4,8 21 360,25 n.n. 34,9 4,9 22 408,25 n.n. 38,0 5,9 23 456,25 n.n. 61,7 5,3 97



Depot-Gruppe

Anhang

172

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 44,8 4,9 48 2 1 0,2 64,1 4,7 3 2,25 0,2 45,0 4,8 4 3 n.n. 68,9 4,5 5 4 n.n. 48,4 5,0 6 6 0,2 25,9 4,5 7 8 0,2 32,1 4,5 8 12,25 0,2 9,1 3,8 9 23,5 0,2 19,1 4,7 10 48,25 0,2 9,5 5,6 11 72,25 0,2 4,5 5,3 12 96,25 n.n. 12,0 5,0 13 120,25 n.n. 19,5 5,2 14 144,25 n.n. 28,4 4,8 15 168,25 n.n. 39,7 5,1 16 192,25 n.n. 25,5 5,3 17 216,25 n.n. 38,7 4,5 62 18 240,25 n.n. n.g. 4,8 19 264,25 n.n. 36,3 4,4 20 312,25 n.n. 39,3 4,2 21 360,25 n.n. 52,1 4,3 22 408,25 n.n. 52,9 4,6 23 456,25 n.n. 60,1 5,1 76



Depot-Gruppe

Anhang

173

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 87,6 4,9 86 2 1 n.n. 43,2 5,0 3 2,25 n.n. 51,3 4,7 4 3 n.n. 42,5 5,1 5 4 0,2 25,6 5,0 6 6 0,2 12,5 5,0 7 8 0,2 9,3 6,1 8 12,25 0,3 2,7 4,9 9 23,5 0,3 n.n. 5,0 10 48,25 0,2 n.n. 5,7 11 72,25 0,2 n.n. 5,3 12 96,25 0,2 n.n. 5,4 13 120,25 n.n. n.n. 5,5 14 144,25 0,2 n.n. 4,9 15 168,25 n.n. n.n. 5,2 16 192,25 n.n. n.n. 4,8 17 216,25 n.n. 3,7 4,9 86 18 240,25 n.n. n.g. 5,0 19 264,25 n.n. 4,6 5,7 20 312,25 n.n. 8,3 5,5 21 360,25 n.n. 7,6 5,7 22 408,25 n.n. 13,0 5,7 23 456,25 n.n. 26,0 5,3 86



Depot-Gruppe

Anhang

174

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 83,9 4,9 86 2 1 0,2 83,6 4,9 3 2,25 0,3 91,0 4,7 4 3 0,3 73,5 5,4 5 4 0,2 53,9 5,4 6 6 0,2 52,3 5,0 7 8 0,2 23,6 6,3 8 12,25 0,2 30,1 5,1 9 23,5 0,2 15,2 5,8 10 48,25 n.n. 24,6 4,9 11 72,25 0,3 15,0 5,1 12 96,25 0,2 16,8 5,5 13 120,25 n.n. 27,5 5,0 14 144,25 0,2 36,8 4,8 15 168,25 0,2 27,8 5,2 16 192,25 n.n. 45,7 5,0 17 216,25 n.n. 68,3 4,9 84 18 240,25 n.n. n.g. 5,4 19 264,25 n.n. 38,1 5,9 20 312,25 n.n. 61,3 5,6 21 360,25 n.n. 47,3 5,4 22 408,25 n.n. 44,3 5,8 23 456,25 n.n. 83,6 5,6 71



Depot-Gruppe

Anhang

175

Proben-



im Plasma [ng/ml]


im Plasma [ng/ml]


im Plasma [mmol/l]

Kreatinin- wert

im Plasma [µmol/l]

1 0 n.n. 63,3 4,9 71 2 1 n.n. 91,0 4,6 3 2,25 n.n. 53,1 5,7 4 3 n.n. 35,6 5,5 5 4 0,2 26,2 4,4 6 6 n.n. 38,1 4,6 7 8 0,2 17,3 6,6 8 12,25 0,3 8,9 5,8 9 23,5 0,2 2,9 6,7 10 48,25 0,2 3,6 4,8 11 72,25 n.n. 4,4 5,6 12 96,25 n.n. 5,2 6,6 13 120,25 n.n. 13,3 6,3 14 144,25 n.n. 10,1 4,8 15 168,25 n.n. 18,0 6,8 16 192,25 n.n. 32,5 5,0 17 216,25 n.n. 62,3 5,3 76 18 240,25 n.n. n.g. 5,6 19 264,25 n.n. 27,8 6,0 20 312,25 n.n. 56,9 5,5 21 360,25 n.n. 32,9 4,8 22 408,25 n.n. 18,2 6,3 23 456,25 n.n. 30,8 5,8 71



Depot-Gruppe

Anhang

176

Pferd 1 Pferd 2

Proben-Nr. Entnahme- zeitpunkt (Stunden)


im Urin [ng/ml]

Proben-Nr.



im Urin [ng/ml]

1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 1 1,0 2 1 4,6 3 2 10,6 3 2 22,8 4 5 6,4 4 5 30,3 5 7 43,8 5 7 40,5 6 12 45,2 6 12 50,3 7 24,5 2,3 7 24,5 8,2 8 36 8,4 8 36 10,4 9 48,5 3,0 9 48,5 5,0 10 72,5 2,2 10 72,5 4,8 11 96,5 0,8 11 96,5 2,0 12 120,5 1,0 12 120,5 1,0 13 144,5 n.n. 13 144,5 0,8 14 168,5 n.n. 14 168,5 n.n. 15 192,5 n.n. 15 192,5 n.n. 16 216,5 n.n. 16 216,5 0,8 17 240,5 n.n. 17 240,5 n.n. 18 264,5 n.n. 18 264,5 n.n. 19 312,5 n.n. 19 312,5 n.n. 20 384,5 n.n. 20 384,5 0,7 21 456,5 n.n. 21 456,5 0,9 22 528,5 n.n. 22 528,5 n.n.



Anhang

177

Pferd 3 Pferd 4



im Urin [ng/ml]

Proben-Nr.



im Urin [ng/ml]

1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 1 2,4 2 1 5,8 3 2 10,2 3 2 12,4 4 5 15,2 4 5 24,1 5 7 26,0 5 7 32,7 6 12 16,8 6 12 40,7 7 24,5 10,7 7 24,5 10,4 8 36 5,1 8 36 6,7 9 48,5 4,2 9 48,5 5,8 10 72,5 1,2 10 72,5 2,4 11 96,5 1,0 11 96,5 1,1 12 120,5 n.n. 12 120,5 1,2 13 144,5 n.n. 13 144,5 n.n. 14 168,5 n.n. 14 168,5 n.n. 15 192,5 n.n. 15 192,5 n.n. 16 216,5 n.n. 16 216,5 n.n. 17 240,5 n.n. 17 240,5 n.n. 18 264,5 n.n. 18 264,5 n.n. 19 312,5 n.n. 19 312,5 n.n. 20 384,5 n.n. 20 384,5 n.n. 21 456,5 n.n. 21 456,5 n.n. 22 528,5 n.n. 22 528,5 n.n.



Anhang

178

Pferd 5 Pferd 6



im Urin [ng/ml]

Proben-Nr.



im Urin [ng/ml]

1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 1 n.n. 2 1 16,0 3 2 6,8 3 2 36,6 4 5 7,0 4 5 33,9 5 7 11,8 5 7 6,6 6 12 65,4 6 12 16,6 7 24,5 22,7 7 24,5 14,7 8 36 9,8 8 36 5,7 9 48,5 6,9 9 48,5 2,5 10 72,5 3,4 10 72,5 4,9 11 96,5 1,1 11 96,5 1,1 12 120,5 n.n. 12 120,5 n.n. 13 144,5 n.n. 13 144,5 n.n. 14 168,5 n.n. 14 168,5 n.n. 15 192,5 n.n. 15 192,5 n.n. 16 216,5 n.n. 16 216,5 n.n. 17 240,5 n.n. 17 240,5 n.n. 18 264,5 n.n. 18 264,5 n.n. 19 312,5 n.n. 19 312,5 n.n. 20 384,5 n.n. 20 384,5 n.n. 21 456,5 n.n. 21 456,5 n.n. 22 528,5 n.n. 22 528,5 n.n.



Anhang

179

Pferd 1 Pferd 2



im Urin [ng/ml]

Proben-Nr.



im Urin [ng/ml]

1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 2 2,0 2 2 n.n. 3 5 8,6 3 5 8,0 4 7 17,7 4 7 8,2 5 12 16,9 5 12 5,9 6 48 7,9 6 48 2,3 7 72 4,7 7 72 2,0 8 96 4,9 8 96 3,3 9 120 2,6 9 120 1,2 10 144 2,5 10 144 1,7 11 168 1,7 11 168 1,7 12 192 2,7 12 192 n.n. 13 216 2,3 13 216 1,8 14 240 2,6 14 240 2,7 15 288 n.n. 15 288 1,7 16 336 0,9 16 336 1,2 17 384 n.n. 17 384 1,0 18 432 1,6 18 432 1,4 19 480 1,4 19 480 0,9 20 552 n.n. 20 552 n.n. 21 624 n.n. 21 624 n.n. 22 696 n.n. 22 696 n.n. 23 768 n.n. 23 768 n.n. 23 840 n.n. 24 840 n.n. 25 912 n.n. 25 912 n.n.



Anhang

180

Pferd 3 Pferd 4



im Urin [ng/ml]

Proben-Nr.



im Urin [ng/ml]

1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 2 n.n. 2 2 2,1 3 5 1,5 3 5 12,4 4 7 4,9 4 7 20,1 5 12 8,4 5 12 22,4 6 48 4,6 6 48 9,3 7 72 3,2 7 72 3,1 8 96 0,6 8 96 4,0 9 120 1,6 9 120 3,7 10 144 n.n. 10 144 2,4 11 168 n.n. 11 168 3,4 12 192 0,7 12 192 1,8 13 216 2,7 13 216 3,9 14 240 1,8 14 240 2,2 15 288 1,2 15 288 1,3 16 336 n.n. 16 336 n.n. 17 384 n.n. 17 384 1,0 18 432 1,4 18 432 0,9 19 480 1,1 19 480 0,8 20 552 n.n. 20 552 1,3 21 624 n.n. 21 624 n.n. 22 696 n.n. 22 696 n.n. 23 768 n.n. 23 768 n.n. 23 840 n.n. 24 840 n.n. 25 912 n.n. 25 912 n.n.



Anhang

181

Pferd 5 Pferd 6 Proben-Nr. Entnahme-

zeitpunkt (Stunden)


im Urin [ng/ml]

Proben-Nr.



im Urin [ng/ml]

1 0 n.n. 1 0 n.n. 2 2 1,4 2 2 0,8 3 5 2,9 3 5 4,3 4 7 1,8 4 7 3,6 5 12 7,3 5 12 7,1 6 48 0,5 6 48 2,7 7 72 1,8 7 72 2,9 8 96 n.n. 8 96 2,1 9 120 n.n. 9 120 1,3 10 144 2,0 10 144 0,9 11 168 0,9 11 168 1,5 12 192 n.n. 12 192 0,7 13 216 1,5 13 216 1,6 14 240 n.n. 14 240 1,0 15 288 n.n. 15 288 1,0 16 336 n.n. 16 336 n.n. 17 384 n.n. 17 384 1,2 18 432 n.n. 18 432 n.n. 19 480 n.n. 19 480 n.n. 20 552 n.n. 20 552 1,2 21 624 n.n. 21 624 n.n. 22 696 n.n. 22 696 n.n. 23 768 n.n. 23 768 n.n. 23 840 n.n. 24 840 n.n. 25 912 0,9 25 912 0,8



Danksagung

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann gilt mein ganz besonderer Dank für das Überlassen

dieses sehr interessanten und ausgesprochen aktuellen Themas. Dank auch für freundliche

und hilfreiche Unterstützung seinerseits zu jeder Zeit sowie für die Hilfestellung bei

Problemen und Fragen während der Anfertigung dieser Arbeit.

Einen weiteren Dank richte ich an die Reiterliche Vereinigung (FN) e.V. in Warendorf, vor

allem an Dr. Michael Düe, für die freundliche Unterstützung und Organisation.

Mein Dank gilt weiterhin Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorf der FAL Mariensee für die

freundliche Unterstützung und das großzügig gewährte Bereitstellen der Versuchspferde des

Instituts für Tierzucht.

Mein besonderer Dank gebührt Prof. Dr. W. Schänzer und insbesondere Dr. Marc Machnik

aus dem Institut für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln für die umfassende und

stets freundliche Unterstützung bei der gesamten Laborarbeit sowie bei der Erarbeitung und

Entwicklung der Analysemethoden. An dieser Stelle ein ganz besonderer Dank speziell an

Michael Bredehöft für den arbeitstechnischen Grundstock der entwickelten Analysemethoden

durch kompetente, bereitwillige, sehr umfassende und immer geduldige Einarbeitung in

Labor, Datenverarbeitung und zusammen mit Sven Gudat für die Einarbeitung an der HPLC.

Des weiteren der Firma Boehringer Ingelheim ein herzliches Dankeschön, besonders Herrn

Dr. A. Fenner, für das Interesse an dieser Studie und die Bereitstellung der Medikamente.

Speziell bei Herrn Jonny Meier und auch bei Herrn Heinrich Waßmann möchte ich mich ganz

herzlich bedanken für Ihren immer sehr freundlichen, stets verlässlichen und zeitintensiven

Einsatz bei unserer praktischen Arbeit im Pferdestall. Ohne Ihre Hilfe wäre so einiges nicht

realisierbar gewesen. Meinen Dank hiermit auch den weiteren helfenden Händen in dieser

Versuchsphase.

Großer Dank auch an Herrn Dr. Frank Niedorf aus dem Institut für Pharmakologie,

Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover für seine Hilfe

Danksagung

im Rahmen der Methodenvalidierung. Danke auch an Dr. Michael Brown, Dr. Wolfgang

Bäumer und Herrn Hans-Herbert Bohr für ihre selbstverständliche Hilfe.

Auch ein Dankeschön an die Klinik für Pferde der Stiftung Tierärztliche Hochschule

Hannover und die Klinik für kleine Klauentiere Klauentiere und forensische Medizin und

Ambulatorische Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover für die geleistete

Hilfe.

Danke auch an alle weiteren Mitarbeiter des Instituts für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln, die während der Laborarbeit nicht nur mit Rat und Tat zur Seite

standen, sondern die Monate in Köln zu einer schönen Zeit gemacht haben.

Bei meinen Mitdoktorandinnen Sophie und Simone bedanke ich mich für die tolle

Zusammenarbeit und die neben der Arbeit auch sehr schöne gemeinsame Zeit, an die ich mich

immer sehr gern erinnern werde.

Einen aber ganz besonderen Dank richte ich an meine Familie, besonders an meine Mutter,

ohne deren Unterstützung in vielerlei Hinsicht die Anfertigung dieser Arbeit nicht möglich

gewesen wäre.

Danke meiner Kölner Ersatzfamilie für all das, was das Ganze mehr zur „Familie“ als zum

„Ersatz“ gemacht hat.

Gebührender Dank an meinen Bruder, der mir bei computertechnischen Fragen rund um diese

Arbeit eine mehr als große Hilfe war.

Tausend Dank an Ina für die geduldige, rettende und meine „Computersünden“ ausgleichende

Hilfe beim Formatieren.

Lieben lieben Dank an Patricia für die große moralische und auch praktische Unterstützung,

samt investierter Zeit und positiv anregender Kritik.

Danke meinen Mitbewohnerinnen, Freunden und Bekannten, die mich in dieser Zeit begleitet

haben, für mich da waren und helfend zur Seite standen.

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Arzneistoffes ... fileAus dem Institut für Pharmakologie,...

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