Untersuchung zur Pharmakokinetik des Stoffes ... · Narkotika, Stimulantien, Diuretika oder...

Aus dem

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Stoffes Tetrahydrogestrinon hinsichtlich der Dopingrelevanz beim Pferd

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines

Doktor der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Markus Gerlach

aus Duisburg

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung:

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Deegen

Tag der mündlichen Prüfung: 23. November 2005

Tanja & meiner Familie

in Liebe und Dankbarkeit

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abb. Abbildung APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation AUC Area under the curve b1 Geschwindigkeitskonstante der Elimination C Konzentration Cl Clearance Cmax(gem) maximale gemessene Plasmakonzentration DIR Direktorium für Vollblutzucht und Rennen EHSLC European Horserace Scientific Liason Committee EPC effektive Plasmakonzentration FEI Fédération Équestre International FN Fédération National, Deutsche Reiterliche Vereinigung

e. V., Warendorf g Gramm h Stunde HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HQC High Quality Control Standard HVT Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e.V. HWZ Halbwertszeit i. m. intramuskulär ISTD interner Standard i.v. intravenös kg Kilogramm KM Körpermasse l Liter ln natürlicher Logarithmus LOD Limit of detection LOQ Limit of quantification LPO Leistungsprüfungsordnung der FN LQC Lower Quality Control Standard µg Mikrogramm µl Mikroliter m Meter max. maximal mg Milligramm

min Minute ml Milliliter mm Millimeter mmol Millimol MM Molekülmasse MQC Midrange Quality Control Standard MRT Mean Residence Time, mittlere Verweildauer MS Massenspektrometrie m/z Quotient aus Masse und Ladung ng Nanogramm p. a. post applikationem PK/PD pharmakokinetisch/pharmakodynamisch QC Qualitätskontrolle R2 Regressionskoeffizient RE relativer Fehler, relative Abweichung RO Rennordnung des DIR S Standardabweichung SIM single ion monitoring t Zeit Tab. Tabelle tmax(gem) Zeitpunkt der max. gemessenen Plasmakonzentration

1 EINLEITUNG 1

2 LITERATURÜBERSICHT 2

2.1 Doping 2

2.1.1 Definition und Geschichtliches 2

2.1.2 Doping im Pferdesport 2

2.1.2.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände 4

2.1.2.2 Leistungsprüfungsordnung LPO 4

2.1.2.3 Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V. [DVR] 6

2.1.2.4 HVT Traberverband 6

2.1.3 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in BRD 7

2.2 Steroidhormone 7

2.3 Anabolika 8

2.4 „Designersteroide“ 9

2.4.1 Jüngere Geschichte 9

2.4.2 THG 11

2.4.2.1 Struktur 11

2.4.2.2 Herstellung 12

2.4.2.3 Wirkung THG 13

2.5 Pharmakokinetische Grundprinzipien 15

2.6 Analytik 20

2.6.1 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) 20

3 MATERIAL UND METHODE 24

3.1 Versuchsplanung 24

3.2 Versuchstiere 24

3.3 Vorbereitung des Versuches Versuchsdurchführung 26

3.3.1 Substanz und Dosierung 26

3.3.2 Applikation 27

3.3.3 Abnahme und Verarbeitung der Proben 27

3.4 Analytik 30

3.4.1 Methodenentwicklung 30

3.4.1.1 Standardlösungen und Chemikalien 30

3.4.1.2 Aufarbeitung der Plasmaproben 32

3.4.1.3 Aufarbeitung der Urinproben 33

3.4.1.4 HPLC/MS/MS 36

3.4.2 Validierung 37

3.4.2.1 Selektivität und Spezifität 37

3.4.2.2 Linearität 38

3.4.2.3 Nachweisgrenze (Limit of Detection = LOD) 38

3.4.2.4 Wiederfindung 39

3.4.2.5 Richtigkeit der Methode 39

3.4.2.6 Präzision 40

3.4.2.7 Stabilität 40

3.5 Pharmakokinetische Auswertung 41

4 ERGEBNISSE 42

4.1 Massenspektrometrische Bestimmung 42

4.1.1 THG 42

4.1.2 Gestrinon

4.2 Ergebnisse Validierung 43

4.2.1 Selektivität 43

4.2.2 Linearität 45

4.2.3 Nachweisgrenze (Limit of Detection = LOD) 46

4.2.4 Wiederfindung 47

4.2.5 Richtigkeit der Methode 47

4.2.6 Präzision 49

4.2.7 Stabilität 50

4.3 Ergebnisse zur Überprüfung der Urinaufarbeitung 52

4.4 Ergebnisse Variation Aufarbeitung 52

4.5 Ergebnisse Hauptversuch 53

4.5.1 Plasma 53

4.5.2 Pharmakokinetik von THG im Plasma 55

4.5.3 Urin 57

5 DISKUSSION 59

5.1 Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den Nachweis von Tetrahydrogestrinon in Plasma und Urin 60

5.2 Pharmakokinetik von THG 60

5.3 Bewertung der Ergebnisse 62

6 ZUSAMMENFASSUNG 64

7 SUMMARY 66

8 LITERATURVERZEICHNIS 68

9 ANHANG 76

1 Einleitung

- 1 -

1 EINLEITUNG

Doping ist ein Gebiet mit vielen Facetten. Aufgrund des komplexen Themas gibt es

viele Ansätze Doping zu definieren und zu klassifizieren. So regeln die

verschiedenen Sportverbände und auch Pferdesportverbände in ihren

Dopingbestimmungen, was unter den Bereich des Dopings fällt. Hier unterstreicht der

Umfang dieser Reglementarien die Komplexität der Thematik. Zusammenfassend

enthalten sie aber alle eine Grundaussage. Doping ist ethisch verwerflich und

rechtlich verboten. Als Dopingfall wird die nachgewiesene Anwendung von

Substanzen, die auf der Dopingliste stehen oder verwandte Substanzen definiert.

Ausgenommen sind einige wenige Therapeutika, für die Grenzwerte bestehen oder

ausgenommen sind.

Verschiedene Studien beschäftigten sich damit, den Wissensstand über

Ausscheidungszeiten und Nachweiszeiten von zugelassenem Arzneimittel zu

verbessern, Analysemethoden zu verfeinern oder Standards für Analysen

festzulegen.

Mit Tetrahydrogestrinon (THG) wurde eine Substanz gezielt für Dopingzwecke

hergestellt, die keine Zulassung als Therapeutikum hat und auch nie als solches

zugelassen werden sollte. Es war ein Ziel, einen Stoff zu synthetisieren, der in

Dopingnachweisverfahren schwer detektierbar ist. Mit Tetrahydrogestrinon wurde

das erste Designersteroid (THEWIS, 2005) entwickelt. Es wurden an Gestrinon vier

Wasserstoffatome angehängt und damit die Masse so verändert, dass ein Nachweis

mit bekannten Verfahren nicht mehr möglich war.

Ziel dieser Arbeit ist es, eine geeignete Nachweismethode für THG in den

Pferdematrices Plasma und Urin zu entwickeln und klinisch zu unterprüfen.

Literaturübersicht

- 2 -

1 LITERATURÜBERSICHT

1.1 Doping

1.1.1 Definition und Geschichtliches

Unter Doping versteht man nach UNGEMACH und NÜRNBERGER (1999), die

Verabreichung von Substanzen an Mensch und Tier mit dem Ziel einer

Beeinflussung der natürlichen und aktuellen Leistungsfähigkeit bei sportlichen

Wettkämpfen.

Der sprachliche Ursprung des Wortes „Doping“ stammt aus dem Niederländischen,

wo das Verb „doopen“ eintauchen, tauchen bedeutet (DEBACKERE, 1989). Über die

Kolonien der Niederländer gelangte der Begriff nach Südafrika und bezeichnete dort

einen hochprozentigen, dickflüssigen Likör (Dop), der von den Bantus in Südostafrika

als Stimulans bei religiösen Feierlichkeiten getrunken wurde (BERSCHNEIDER u.

RICHTER, 1980). Erst später wurde der Begriff auf andere stimulierende Getränke

ausgedehnt (PROKOP, 1965). In den amerikanischen Sprachgebrauch

übergegangen, beschrieb „to dope“ später das trickreiche Betäuben und

anschließende Ausrauben von Reisenden (BERSCHNEIDER u. RICHTER, 1980). Im

Jahre 1899 stand der Begriff des Doping erstmals in einem englischen Wörterbuch,

womit ein Gemisch aus Opium und Narkotika zur Verabreichung an Pferde

bezeichnet wurde (HERMLE, 1996). Damit hatte sich das Wort Doping im

internationalen Sprachgebrauch als Begriff für die missbräuchliche Einnahme von

Mitteln zur Leistungssteigerung durchgesetzt.

1.1.2 Doping im Pferdesport

Schon in der Antike war der Gebrauch von leistungssteigernden Mitteln bekannt. Aus

dem alten Rom ist bekannt, dass eine als „Hydromel“ bezeichnete wässrige

Honiglösung zur Verbesserung der Geschwindigkeit und Ausdauer bei Rennpferden

verabreicht wurde (MORGAN, 1957), was mit der Todesstrafe geahndet wurde.

Literaturübersicht

- 3 -

UNGEMACH (1985) beschreibt, dass schon 1881 in Preußen alkoholische Lösungen

an „feige“ Pferde verabreicht wurden. Erste Dopingkontrollen ordnete der

Australische Jockey Klub 1910 an. Die ersten Dopingreglementierungen wurden am

14. Juni 1666 in England verabschiedet. In dieser ersten „Anti-Doping-Bestimmung“

wurde die Anwendung anregender Stoffe bei Pferden verboten, wobei diese aber

nicht näher definiert wurden (CROISIER, 1948). Erst im 20. Jahrhundert wurde die

Bekämpfung von Doping stärker vorangetrieben, da die Wirkstoffanzahl

pharmakologischer Mittel stark zunahmen und somit auch die Möglichkeit zu dopen.

Dies machte eine Entwicklung geeigneter Analysemethoden unabdingbar

(UNGEMACH u. NÜRNBERGER, 1999).

Wie das Beispiel oben darlegt, wurden Pferden schon Mittel verabreicht, bevor sich

Menschen Dopingsubstanzen zu eigen machten. Aber auch in jüngerer

Vergangenheit bis heute ist Doping im Pferdesport ein internationales Problem. So

legte 1977 die internationale Konferenz der westlichen Pferdesportverbände in Rom

allgemein fest, dass alle Substanzen äußeren Ursprunges, auch wenn sie im Pferd

natürlicherweise vorkommen können, verboten sind, wenn sie zu den in einer

Dopingliste veröffentlichten unerlaubten Mitteln zu rechnen sind (UNGEMACH,

1985).

Auf einem Kongress in Kentucky 1994 wurden dann spezifische Fragestellungen zur

Analytik von Dopingproben im Bereich des Pferdesports diskutiert und speziell die

Zusammenarbeit aller Pferdesportverbände gefordert. Die Internationale Reiterliche

Vereinigung (FEI) stellt dabei einen internationalen Pferdesportverband dar, dem mit

Deutschland 111 Nationen angeschlossen sind (DÜE, 1998). So wird ausgeführt,

dass es „der Sinn aller FEI-Wettkämpfe ist, die Talente von Pferden und Reitern im

Vergleich unter gleichen Bedingungen und auf der Grundlage ihrer Fähigkeiten

durchzuführen. Der Gebrauch von verbotenen Substanzen kann die Leistung

beeinflussen oder ein vorliegendes Gesundheitsproblem überdecken und zusätzlich

das Ergebnis eines Wettkampfes verfälschen. Daher ist die Liste der verbotenen

Substanzen so zusammengesetzt worden, dass sie alle Kategorien

pharmakologischer Wirksamkeit umfasst“. Als verbotene Substanzen gelten die

Substanz selbst, aber auch Verwandte der Substanz. Damit ist praktisch jede

Anwendung von Arzneimitteln im Zusammenhang mit der Teilnahme am Wettkampf

nicht statthaft, unabhängig davon, ob dadurch eine Leistungsbeeinflussung möglich

ist oder nicht (KLAUS u. HAPKE, 1994). TOBIN et al. (1985) wiesen nach, dass

Literaturübersicht

- 4 -

durch Dopingkontrollen und Sanktionierung ein deutlicher Rückgang der positiven

Dopingfälle verzeichnet werden kann.

1.1.2.1 Bestimmungen der Pferdesportverbände

Die Dopingbestimmungen im Pferdesport dienen vor allem dazu, dem Tier bzw. dem

Tierschutz zu dienen. Grundlage hierfür ist § 3 des Tierschutzgesetzes. Die

Dopingreglementarien im Humanbereich basieren hingegen auf dem

Arzneimittelgesetz (AMG §6).

In Deutschland wird die Verabreichung von Substanzen über die

Leistungsprüfungsordnungen der drei großen deutschen Pferdesportverbände,

Deutsche Reiterliche Vereinigung e. V. [FN], Direktorium für Vollblutzucht und

Rennen e. V. [DVR] und Hauptverband für Traber-Zucht und -Rennen e. V. [HVT]

geregelt. Besonders seitens der FN wird eine möglichst große Übereinstimmung mit

den Bestimmungen der FEI angestrebt, aber auch DVR und HVT stimmen

hinsichtlich des generellen Verbots jeglicher körperfremder Substanzen mit der FN

überein. Nachfolgend werden Ausschnitte aus den Dopingbestimmungen der

einzelnen deutschen Pferdesportverbände dargestellt.

1.1.2.2 Leistungsprüfungsordnung LPO

Die entsprechenden Bestimmungen finden sich in der LPO der Deutschen

Reiterlichen Vereinigung e. V. (Stand 2004) im Abschnitt A VIII, §§ 66 – 67a.

So verbietet § 66 die Teilnahme von Pferden und Ponys nach zum Beispiel

Neurektomie, lokaler Schmerzausschaltung, implantiertem Tracheotubus oder

sonstigen Eingriffen beziehungsweise Manipulationen, die zur Beeinflussung der

Leistung, Leistungsfähigkeit oder Leistungsbereitschaft geeignet sind.

In § 67 werden Medikationskontrollen, Verfassungsprüfungen und Pferdekontrollen in

Prüfungen geregelt, wobei sich detaillierte Anweisungen zu deren Ablauf in den

Literaturübersicht

- 5 -

angehängten Durchführungsbestimmungen finden. Ebenfalls in den

Durchführungsbestimmungen geregelt ist die Ahndung bei Nachweis einer gemäß

§ 67a LPO verbotenen Substanz. Positiv getestete Teilnehmer werden disqualifiziert

und der Verstoß nach den Bestimmungen der Rechtsordnung der LPO geahndet.

Zusätzlich besteht die Möglichkeit, die Tat als Verstoß gegen das Tierschutzgesetz

der zuständigen Behörde zu melden.

§ 67a enthält die Liste der kontrollierten Substanzgruppen. Dabei wird zwischen

„Punkt 1 Dopingsubstanzen“ und „Punkt 2 Verbotene Arzneimittel“ unterschieden,

sowie unter Punkt 3 die Ausnahmen hiervon geregelt.

Hierbei werden Dopingsubstanzen als Substanzen bezeichnet, die geeignet sind, die

Leistung eines Pferdes/Ponys im Wettkampf zu beeinflussen. Dabei werden nicht

einzelne Arzneimittel, sondern Stoffgruppen wie zum Beispiel Sedativa und

Narkotika, Stimulantien, Diuretika oder Anabolika aufgeführt. Lediglich für einzelne

Substanzen, die auch körpereigen vorkommen, wie z.B. Testosteron, Nandrolon,

Theobromin und Cortisol gelten Grenzwerte.

Auch die verbotenen Arzneimittel sind nicht einzeln, sondern als Stoffgruppen

reglementiert. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die zwar als Arzneimittel

eingesetzt werden, jedoch im Wettkampf verboten sind (zum Beispiel solche mit

Wirkung auf das Herz-Kreislauf-System, auf das Atmungssystem, auf die Haut,

gegen Infektionserreger). Auch hier gelten für wenige Mittel, wie Salizylsäure, Arsen,

Dimethylsulfoxyd und verfügbares CO2 Grenzwerte.

Ausnahmen von oben genannten Bestimmungen bilden Substanzen zur Pflege und

Vorbeugung wie zum Beispiel Impfstoffe, die bis spätestens 14 Tage vor der Prüfung

appliziert werden, oder Insektenschutzmittel.

1.1.2.3 Direktorium für Vollblutzucht und Rennen e. V. [DVR]

Die entsprechenden Bestimmungen finden sich im Abschnitt XIV der Rennordnung

(RO) des Direktoriums für Vollblutzucht und Rennen (Stand Januar 2002) unter

Unerlaubte Mittel / Doping. Die Punkte 529 bis 561 regeln das allgemeine Verbot

der Anwendung unerlaubter Mittel, definieren Gruppen erlaubter und unerlaubter

Literaturübersicht

- 6 -

Mittel, Substanzen mit Grenzwerten, sowie die Entnahme, Vorbereitung und

Auswertung von Dopingproben. Im Unterschied zur LPO behält sich das Direktorium

vor, Kontrollen nicht nur während Prüfungen durchzuführen, sondern auch

Trainingsproben entnehmen zu lassen.

1.1.2.4 HVT Traberverband

Die Dopingbestimmungen dieses Pferdesportverbandes werden im Teil B II § 93 und

den Durchführungsbestimmungen zur Feststellung und Verhinderung von Doping

geregelt. Entsprechend der oben genannten Rennordnung darf ein Pferd von Beginn

bis zum Ende des Rennens keine gemäß der Dopingliste verbotenen Substanzen in

seinen Geweben, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen aufweisen.

Entgegen der LPO oder RO werden keine Grenzwerte (Grenzwerte siehe Punkt

2.1.7.1) für einzelne Mittel angegeben, so dass jeglicher Nachweis verbotener Stoffe

positiv berichtet wird. In den Durchführungsbestimmungen finden sich die Dopingliste

mit Verboten von Substanzen beziehungsweise Stoffgruppen (Diuretika, Herz-

Kreislaufwirksame Mittel, Substanzen, die auf das zentrale oder periphere

Nervensystem wirken usw.) und detaillierten Bestimmungen zur Entnahme, dem

Versand und Auswertung von Proben.

Allen drei Pferdesportverbänden ist in der Reglementierung des Dopings gemein,

dass hauptsächlich Stoffgruppen auf den Verbotslisten aufgeführt werden. Eine

Auflistung einzelner Stoffe oder sogar Warennamen wäre bei der Vielfalt der zur

Verfügung stehenden Medikamente nicht möglich und könnte niemals vollständig

sein.

1.1.3 Statistische Daten zu Dopingkontrollen in BRD

Seit Anfang der 1970er Jahre werden systematische Dopingkontrollen der großen

deutschen Pferdesportverbände durchgeführt. Die Auswahl der Pferde, von denen

Urin oder Blut auf das Vorhandensein verbotener Substanzen untersucht wird, erfolgt

nach dem Zufallsprinzip und aufgrund von Verdachtsfällen. Medikationskontrollen

führt der Galopp-, Trab-, Reit- und Fahrsport in Deutschland durch, wobei die FN

etwa 1000 Proben zur Untersuchung an Laboratorien sendet. Der Hauptanteil der

Literaturübersicht

- 7 -

Proben wird im Institut für Biochemie der deutschen Sporthochschule Köln analysiert.

Eine Übersicht über die Jahre 2000 bis 2004 gibt die nachfolgende Tabelle 1.

Jahr Anzahl der Proben Positiv getestete Proben (Anzahl)

Positiv getestete Proben (%)

2000 1718 36 2,01

2001 1635 16 0,98

2002 1526 22 1,44

2003 1241 11 0,88

2004 1601 21 1,31 Tabelle 1: Untersuchte Pferdeproben in den Jahren 2000 bis 2004 der Sporthochschule Köln

1.2 Steroidhormone

Zu den Steroidhormonen zählen die Glucocorticoide, Mineralocorticoide und die

Sexualhormone. Steroidhormone haben alle die gleiche Grundstruktur. Basis ist ein

trans verknüpftes Sterangerüst. Die Synthese erfolgt aus Cholesterin. Die für die

Arbeit interessante Gruppe sind die Sexualhormone. Eine Einteilung der

Sexualhormone erfolgt in drei Klassen. Die männlichen Sexualhormone werden als

Androgene, die weiblichen als Gestagene und Östrogene bezeichnet.

Estrogene sind Abkömmlinge des C18- Grundgerüst Estran und besitzen einen

aromatischen A-Ring. Die körpereigenen Estrogene sind Estradiol, Estron und

Estriol. Sie werden in den Granulosazellen der Ovarfollikel, in der Plazenta, in den

Nebennierenrinden und in den Hoden gebildet. Sie können aber auch durch

Aromatisierung von Androgenen im Fettgewebe entstehen. Bei Verabreichung rufen

sie beim weiblichen Tier Brunstsymptome hervor. Östrogen wirksame Stoffe gibt es

auch pflanzlichen Ursprungs: die Phytoöstrogene. Sie haben auch die Östrogene

Wirkung inne.

Gestagene, das natürliche Progesteron und synthetische Derivate, teilen sich, ihrer

chemischen Struktur nach in zwei Gruppen ein. Die Struktur von C21-Gestagenen,

die sich vom Progesteron ableiten, und die Gestagene, die sich von 19-Nor-

Testosteron ableiten. Sie sind für die Implantation und Entwicklung des Embryos

Literaturübersicht

- 8 -

verantwortlich. Die Bildung findet speziesabhängig im Corpus luteum und in der

Plazenta statt. Ihre Wirkung beruht hauptsächlich in dem Zusammenwirken mit

Östrogenen.

Bei den Androgenen ist Testosteron das wichtigste im Körper gebildete Hormon. Es

ist ein C19-Steroid und stammt zum überwiegendem Teil aus den Leydig´schen

Zwischenzellen des Hoden. Den Rest produziert die Nebennierenrinde. Weitere im

Organismus produzierte Androgene sind Androstendion und Dehydroepiandrosteron.

Sie sind etwa 5 - 10-fach geringer wirksam wie Testosteron. Die Wirkungen sind wie

folgt zusammenzufassen: Entwicklung und Funktion der männlichen

Geschlechtsorgane, Regulation der Spermienproduktion, Förderung des

Eiweißaufbaus und Hemmung der Gonadotropinfreisetzung (LÖSCHER, 2002).

1.3 Anabolika

Anabolika im engeren Sinne sind synthetische Abkömmlinge der Androgene, die eine

stärkere anabole Wirkung als androgene Wirkung hat. Sie leiten sich zum größten

Teil vom 19-Nor-Testosteron ab, aber auch andere Modifikationen des

Steroidgerüstes führen zu Hormonen mit anabolen Effekten. Im weiteren Sinne

zählen auch die körpereigene Stoffe, wie vor allem Testosteron dazu

(SCHÄNZER,1997). Eine entscheidende Frage bei dem Einsatz dieser Stoffe ist die

Wirksamkeit. Hierfür hat sich der Herschberg-Test durchgesetzt. Hierbei erfolgt die

biologische Überprüfung von Androgenen und Anabolika an infantilen, kastrierten

männlichen Ratten. Es werden die Massenzunahmen von Samenblase, Prostata und

musculus levator ani überprüft. Als Ausdruck der androgenen Komponente gilt die

Zunahme von Samenblase und Prostata, als Maß für die Anabolität die

Massenzunahme des musculus levator ani.

Nebenwirkungen von Anabolika treten hauptsächlich bei längerfristiger Einnahme

auf. Eine Veränderung des Blutbildes und des Blutdruckes kann jedoch schon bei

einmaliger Einnahme festgestellt werden. Bei einigen Präparaten kommt es zu

Herzrhythmusstörungen, starkem Schwitzen und Muskelzittern. Nach längerfristigem

Konsum von Sterioden kann es zu einer psychischen und physischen Abhängigkeit

kommen. Es können starke Stimmungsschwankungen, aggressive Tendenzen,

Depressionen und psychotische Phasen auftreten. Zu den Langzeitfolgen zählen

Schilddrüsenüberfunktion, Hautverunreinigungen, Veränderung des Skelett- und

Literaturübersicht

- 9 -

Bewegungsapparates und Wasseransammlung in Geweben. Bei einer längerfristigen

Einnahme erhöht sich das Herzinfarkt- und Schlaganfallrisiko. Die orale Einnahme

von Steroiden kann zu schweren Leberschädigungen führen. Weiter haben sie einen

starken Einfluss auf die Sexualität und die Geschlechtsmerkmale. So führt die

Einnahme von anabolen Sterioden beim Mann zu einer gestörten

Spermienproduktion, zu einer Atrophie der Hoden bis hin zur Unfruchtbarkeit. Bei

Frauen können anabole Steroide eine Veränderung des Menstruationszyklus, eine

Vergrößerung der Klitoris, starker Körperbehaarung und Bartwuchs, als auch einer

tiefen Stimme führen (DUCHAINE, 1989).

1.4 „Designersteroide“

1.4.1 Jüngere Geschichte

Neben der langen Geschichte des Dopings, ist auch der Missbrauch von

Steroidhormonen seit einiger Zeit bekannt. Seit den 60er Jahren wurde diese

Handhabung vom Internationalen Olympischen Komitee beobachtet, konnte aber erst

1974 verboten werden, da bis zu diesem Zeitpunkt kein ausreichend sicheres

Verfahren zum Nachweis zur Verfügung stand. Ab diesem Zeitpunkt war die

Anwendung von exogenen anabolen Steroiden verboten. Erste Kontrollen erfolgten

bei Wettkämpfen ab 1976 (SCHÄNZER, 1997). Die frühen Nachweismethoden für

exogene Steroide erfolgte in zwei Schritten. Dem Screening mittels

Radioimmunoassay und der Bestätigung mittels Gaschromatographie/

Massenspektrometrie. Dies erfolgte für die weit verbreiteten Steroide Nandrolon und

Methandienon. Erst nach 1980 wurde auch das Screening mittels

Gaschromatographie/ Massenspektrometrie durchgeführt, was es ermöglichte eine

große Anzahl an androgen anabolen Steroiden zu überprüfen, wie Medikamente, die

keine Zulassung im Humanbereich hatten, wie z.B. Boldenon. Boldenon ist ein

synthetisches Anabolikum, das in den USA zur Rindermast zugelassen ist. Der

Nachweis endogener Steroide, wie Testosteron und seiner Prohormone, erwies sich

als deutlich schwerer, da hier neben der eindeutigen Identifizierung, eine

Unterscheidung zwischen Körpersynthese und äußerlich zugeführt erfolgen musste.

Hierfür wurde seit 1983 die Überprüfung von dem Verhältnis von Testosteron zu

Literaturübersicht

- 10 -

Epitestosteron eingeführt. Ab einem Verhältnis von über 6:1 wurde eine weitere

Untersuchung zum Kohlenstoffisotopenverhältnis durchgeführt. Die Bestimmung

erfolgte per Kohlenstoffisotopen-Verhältnismassen-Spektrometrie. Das C13/C12

Isotopenverhältnis von äußerlich zugeführtem Testosteron unterscheidet sich

deutlich von dem körpereigenem Testosteron und dessen Metaboliten. Das liegt

daran, dass sie zum Teil aus pflanzlichen Vorläufern isoliert und verändert werden

(SCHÄNZER, 1997).

Die Entwicklung ab den 60er Jahren zeigt eine Entwicklung ganz deutlich: den

Wettlauf zwischen Doping und dessen Nachweis.

So wurden zwei Proben im August 2001 und März 2002 von Frauen kontrolliert und

im nachhinein positiv auf Norbolethon getestet. Bei Norbolethon handelt es sich um

ein 19-Nor-Steroid, dessen Synthese 1966 beschrieben wurde (BUZBY,1966).

Norbolethon wurde vor 30 Jahren in Studien bei Kleingewachsenen und

Untergewichtigen getestet (GREENBLATT,1964) und zeigte im Tierversuch eine

deutlich höhere anabole als androgene Wirkung. Aufgrund seiner Nebenwirkungen

wurde Norbolethon nie vermarktet und geriet in Vergessenheit. Ob ein Einsatz dieser

Substanz schon früher stattfand, ist nicht zu beweisen.

Am 1. Januar 2004 trat die neue Verbotsliste der World Anti Doping Association

(WADA) in Kraft. Hier werden zwei Substanzgruppen aufgeführt: die androgen

anabolen Steroide und andere anabole Wirkstoffe; worunter z.B. bestimmte

β-Mimetika fallen. Die Gruppe der anabolen Steroide wird in endogene und exogene

Steroide unterteilt. Es werden weiter Prohormone, die im Körper teilweise zu

anabolen Steroiden umgewandelt werden verboten.

1.4.2 THG

Bis zum Auffinden des sogenannten Designersteroides Tetrahydrogestrinon (THG)

war kein missbräuchlich eingesetztes Steroid bekannt, das nicht von Pharmafirmen

zum therapeutischen Einsatz entwickelt wurde. Ziel war es von Victor Conte ein

anabol wirksames Steroid zu entwickeln, das bei den Dopingkontrollen nicht auffällt.

Entwickler und Hersteller war das Balco Laboratorium in der Bay Area in Californien.

Literaturübersicht

- 11 -

Verantwortlich hierfür zeigte sich Victor Conte, wie die Neue Züricher Zeitung 2003

berichtete.

1.4.2.1 Struktur

Bei Tetrahydrogestrinon handelt es sich um ein C21-Steroid. Es handelt sich um eine

Substanz, die enge Verwandtschaft zu den Stoffen Trenbolon, Altrenogest und

Gestrinon zeigt. Sie basieren auf einem Sterangerüst.

Gestrinon THG

Altrenogest Trenbolon

Abbildung 1: Strukturformeln der Stoffe THG, Gestrinon, Altrenogest und Trenbolon

O

C CH

OHCH3CH2

O

OHCH3CH2

CH2 CH3

O

CH2CH

OH

CH2CH3

O

OHCH3

Literaturübersicht

- 12 -

1.4.2.2 Herstellung

Ausgangsmaterial für die Herstellung von Tetrahydrogestrinon ist Gestrinon.

Gestrinon hat unter dem Handelsnamen Nemestran eine Zulassung in der Schweiz

zur Endometriosebehandlung der Frau. Gestrinon ist ein 19-Nor-Steroid und wurde

ursprünglich zur oralen Empfangnisverhütung hergestellt. Es wirkt androgen,

antiöstrogen und antigestagen. Eine anabole Wirkung wird vermutet. Das

internationale Olympische Komitee hat Gestrinon deshalb auf die Liste der

verbotenen Substanzen gesetzt.

Tetrahydrogestrinon unterscheidet sich von Gestrinon um 4 Wasserstoffatome.

Diese werden unter Verwendung eines geeigneteten Katalysators an die

Ethinylgruppe an C17-Position des Steriodes addiert (CATLIN, 2004).

Abbildung 2: Herstellung von THG aus Gestrinon mit Strukturformeln

Literaturübersicht

- 13 -

1.4.2.3 Wirkung THG

Die Wirkung von THG ist in zwei verschiedenen Systemen kontrolliert worden. Eine

Australische Arbeitsgruppe hat die Wirkung von THG an einer Hefezelllinie überprüft

(DEATH et al, 2004). Hierfür bauten sie in eine Hefezelllinie Androgen-, Progesteron-

und Östrogenrezeptoren ein und überprüften die Bindung und Wirkung von THG.

THG musste hierfür eine Bindung mit einem Rezeptor eingehen und eine

Galaktosidaseaktivität induzieren, die eine Zuckerreaktion hervorruft. Diese

Zuckerreaktion wird in Form einer Verfärbung sichtbar, was beweisend für die

Bindung und Wirkung von THG ist. Die Wirkung von THG wurde mit den Stoffen

Nandrolon, Gestrinon und Trenbolon verglichen. Hier stellte sich THG als die

wirksamste Substanz im Vergleich heraus. THG zeigte in dieser Studie auch Aktivität

am Progesteron-Rezeptor. Diese Aktivität übertraf neben der Wirkung Gestrinon und

Trenbolon, sogar die des Progesterons. Zusammenfassend ist zu sagen, dass THG

in dieser Studie ein hochpotenter androgen und gestagen wirksamer Stoff ist. Es hat

keine Wirkung auf den Östrogenrezeptor gezeigt. Weiter war THG kein Antagonist zu

einem anderen Sexualsteroid. Bei keinem der Steriode wurde eine Zelltoxizität in der

Hefezellkultur beobachtet. Nach Einschätzung der Autoren muss THG in seiner

biologischen Wirkung mit denen des Gestrinons verglichen werden (DEATH et al,

2004). Zu den zu erwartenden Nebenwirkungen sollen beim Mann reduzierte

Spermiogenese, Hodenatrophie und Unfruchtbarkeit zählen. Bei der Frau seien

Vermännlichung, Stimmbruch und Zyklusstörungen zu erwarten.

LABRIE et al (2004) hat die Wirkung von THG am lebenden Organismus getestet.

Überprüft werden sollte in dieser Studie die Rezeptoraffinität, die Genregulation und

die anabole Wirkung. Für diese Studie wurden 11-12 Wochen alte männliche Mäuse

genommen und kastriert. Mäuse wurden für diese Studie gewählt, da sie nach

WATERSON (2002) in ihrem androgen genetischen Profil zu 99% dem menschlichen

Organismus entsprechen. Jede Gruppe hatte eine Größe von 10 Tieren. Sieben

Tage nach der Kastration wurden die Gruppen mit 0,1 mg oder 0,5 mg

Dihydrotestosteron bzw. THG pro Tier sub cutan behandelt. Die Mäuse wurden

anschließend unter Isoflurannarkose euthanasiert. Von den euthanasierten Tieren

wurden die Prostata, die Samenblase, sowie die M. gastrocnemius and M. levator ani

gewonnen.

Literaturübersicht

- 14 -

Bei der Rezeptoraffinität zeigte THG eine die stärksten Bindungseigenschaften an

den Androgenrezeptor. Die relative Bindungsfähigkeit von Dihydrotestosteron,

Testosteron und Methyltrienolon gegenüber THG betrugen 72, 58 bzw. 7 %.

Weiter wurde die Wirkung von THG und Dihydrotestosteron auf den M. levator ani als

androgen-sensiblen Muskel (BOISSONNEAULT, 1989) überprüft, der nach

EISENBERG (1950) als Muskelindikator für eine anabol-androgene Aktivität von

Steroiden gilt. Hier zeigten sich THG und Dihydrotestosteron gleich wirksam. Bei der

kastrierten Kontrollgruppe ging das Muskelgewicht um 26% zurück, wobei die

Ursprungsmasse bei der Gabe beider Substanzen unverändert blieb.

LABRIE et al. stellte als die eindruckvollste anabole Aktivität von THG heraus, dass

das Genexpressionsmuster, welches THG hervorruft, nahezu identisch dem des

Dihydrotestosteron ist. Dies war bei dem m. levator ani, dem m. gastrocnemius und

der Prostata über den gesamten Verlauf der Untersuchung der Fall.

1.5 Pharmakokinetische Grundprinzipien

Unter Pharmakokinetik versteht man die Lehre von der quantitativen

Auseinandersetzung zwischen Organismus und Pharmakon (GLADTKE u. von

HATTINGBERG, 1977). Als Teilgebiet der Pharmakologie befasst sie sich mit der

Wirkung des Organismus auf den Arzneistoff. Dabei wird die Konzentration einer

Substanz im Körper von den Faktoren Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und

Ausscheidung in Abhängigkeit von der Zeit beeinflusst (KOCH u. RITSCHEL, 1986).

Das Merkwort „LADME“ (siehe Abbildung 4) macht den Weg eines Arzneistoffes im

Organismus deutlich (KOCH u. RITSCHEL, 1986):

Invasion (Anfluten) Liberation (Freisetzung)

Absorption (Resorption)

Distribution (Verteilung)

Elimination (Abfluten) Metabolismus (Biotransformation)

Exkretion (Ausscheidung)

Abbildung 4: LADME – Das „Dogma der Pharmazie“ nach KOCH und RITSCHEL (1986)

Literaturübersicht

- 15 -

Danach lässt sich der Verlauf einer Arzneimittelkonzentrationskurve in die Invasion

und die Elimination einteilen. Die Anflutung des Arzneimittels beginnt mit der

Liberation, also der Freigabe des Wirkstoffes aus seiner galenischen Arzneiform und

Verteilung im resorptiven Kompartment. Es folgt die Aufnahme des Wirkstoffes durch

biologische Membranen in die Blutbahn oder die Resorption. Im Falle der

intravenösen Applikation entfällt dieser Schritt, da bereits der gesamte Stoff im Blut

vorliegt und verfügbar ist. Die Geschwindigkeit, mit der die Substanz im Blut

erscheint, hängt lediglich von der Applikationsgeschwindigkeit ab. Daher kann der

Vorgang der Resorption bei intravenöser Applikation aus den pharmakokinetischen

Berechnungen ausgeklammert werden (GLADTKE u. von HATTINGBERG, 1977). Im

Fall einer nicht intravasalen Applikation hängt die Resorption von der Liberations-

geschwindigkeit, der Applikationsform und -ort, den physikalisch-chemischen

Eigenschaften und der Stoffkonzentration am Applikationsort ab (KOCH u.

RITSCHEL, 1986). Auch die Distribution, also die weitere Verteilung der Substanz in

den Körperflüssigkeiten, wird von den substanzspezifischen Eigenschaften bestimmt.

Dazu gehören zum Beispiel die Molekülgröße, die Lipidlöslichkeit, der pH-Wert oder

die Bindung an Plasmaproteine. Nur der freie, ungebundene Teil des Wirkstoffes

kann bis zum Rezeptor und damit dem Ort seiner Wirkung permeieren, während der

an Plasmaproteine oder andere Blutbestandteile gebundene Anteil im Blutplasma

fixiert ist. Die Plasmaproteinbindung ist zwar reversibel, kann jedoch die Aktivität

eines Arzneistoffes deutlich beeinflussen. Weiterhin kann auch eine Bindung an

Gewebsproteine stattfinden. Eine Anreicherung im Fettgewebe ist ebenfalls möglich.

Diese Ablagerung ist ebenfalls temporär, kann sich aber verzögernd auf die

Ausscheidung, beziehungsweise verlängernd auf die Arzneimittelwirkung auswirken,

weil der Wirkstoff nicht durch die Ausscheidungsorgane filtriert werden kann. Der

Metabolisierung unterliegt ein großer Teil chemischen Verbindungen im Körper.

Schon beim Durchtritt durch die Darmschleimhaut und beim ersten Durchgang durch

die Leber werden viele Arzneistoffe in ihrer Struktur verändert und büßen ihre

Wirksamkeit teilweise oder völlig ein (englisch: first-pass-Effekt). Gleichzeitig stellt die

Metabolisierung die Vorbereitung des Pharmakons auf die Exkretion dar. Dabei

werden zum Beispiel aus lipophilen Substanzen gut wasserlösliche gebildet, um eine

bessere Ausscheidung über die Nieren (mit dem Urin) oder die Galle (mit den

Faeces) zu erreichen. Die Exkretion über Sekrete wie Speichel, Milch oder Schweiß,

Literaturübersicht

- 16 -

sowie die Ausatmungsluft, spielt zumeist nur eine untergeordnete Rolle bei der

Beseitigung eines Pharmakons aus dem Körper. Metabolisierung und Exkretion

werden unter dem Begriff der Elimination zusammengefasst, weil beide Vorgänge

Voraussetzung für die endgültige Entfernung von Arzneistoffen und Metaboliten aus

dem Körper sind (KOCH u. RITSCHEL, 1986).

Die Vorgänge der Invasion und der Elimination verlaufen nebeneinander. Der

zeitliche Verlauf der Konzentration eines Wirkstoffes, der durch die oben genannten

komplexen Verteilungs- und Eliminationsvorgänge im Körper beeinflusst wird, lässt

sich mathematisch unter Annahme sogenannter Kompartimente (imaginäre

Verteilungsräume) beschreiben (DYKE u. SAMS, 1994). Als Kompartimente

bezeichnet man Räume, die kinetisch einheitlich sind, wie zum Beispiel den Magen-

Darm-Trakt, das Blut oder bestimmte Gewebe (DOST, 1968). Es werden

verschiedene Kompartiment-Modelle für die pharmakokinetischen Berechnungen

beschrieben.

Beim Ein-Kompartiment-Modell wird der gesamte Organismus als einheitlicher

Verteilungsraum angesehen. Dabei stehen alle Organe und Gewebe mit dem

Blutkreislauf in direktem Gleichgewicht. Die Verteilung des Wirkstoffes in einem

solchen System erfolgt in einer vernachlässigbaren Zeit und die Ausscheidung folgt

einer Kinetik 1. Ordnung (GLADTKE u. von HATTINGBERG, 1977). Das bedeutet,

das konzentrationsabhängig pro Zeiteinheit ein konstanter prozentualer Anteil der

Stoffmenge transportiert wird (exponentieller Verlauf der Konzentrations-Zeit-Kurve).

Aus der Steigung der Geraden, nach logorhythmischer Transformation sind die

Eliminations-konstanten und die Halbwertszeit zu ermitteln.

Mehr-Kompartiment-Systeme stellen die Vorgänge im Körper anhand von

mindestens zwei Verteilungsräumen dar. Für viele Wirkstoffe ist das Zwei-Kompartiment-System für die Beschreibung der Kinetik am besten geeignet

(BAGGOT, 1978). Dabei verteilt sich der Wirkstoff zuerst in einem zentralen

Kompartiment, womit in der Regel das Plasma oder aufgrund ihrer starken Perfusion

mit dem Blut in Gleichgewicht stehende Gewebe wie Lunge, Leber oder Nieren

gemeint sind (BAGGOT, 1978). Von dort diffundiert das Arzneimittel in periphere

Räume, wie zum Beispiel Haut, Unterhaut, Muskulatur und Fettgewebe (KLOTZ,

1988). Da jedoch die Ausscheidung der Stoffe ausschließlich über das zentrale

Kompartiment stattfindet, erfolgt zeitgleich auch ein Austausch zurück von

peripherem zu zentralem Kompartiment. Stofftransporte in, aus und zwischen den

Literaturübersicht

- 17 -

verschiedenen Kompartimenten werden durch Geschwindigkeitskonstanten

beschrieben. Die Konzentrations-Zeit-Kurve eines Zwei-Kompartiment-Modells zeigt

in halblogarithmischer Darstellung einen biexponentiellen Verlauf. In der initialen

Verteilungsphase fällt die Konzentration im zentralen Kompartiment schnell ab und

geht nach Erreichen des Gleichgewichts in eine lineare Eliminationsphase über, die

durch einen flacheren Verlauf gekennzeichnet ist (DERENDORF et al., 2002).

Nach welchem Modell die Berechnung der pharmakokinetischen Parameter erfolgt,

hängt von den Messwerten ab. Zeigen diese in halblogarithmischer Darstellung über

einen genügend langen Zeitraum einen monoexponentiellen Verlauf, so ist das Ein-

Kompartiment-Modell anzuwenden. Ist der Verlauf jedoch biexponentiell, findet das

Zwei-Kompartiment-Modell Anwendung. Dabei sollten mindestens drei bis vier

Messpunkte pro Kurvenanteil vorhanden sein (KLOTZ, 1984).

Pharmakokinetische Parameter beschreiben den zeitlichen Verlauf eines

Arzneimittels im Organismus. Im Folgenden werden einige Parameter genauer

beschrieben, die im Zuge dieser Arbeit bestimmt wurden.

Die Clearance (Cl) ist ein hypothetisches Volumen der Kreislaufflüssigkeit, welches

pro Zeiteinheit durch die Funktion eines beziehungsweise aller Ausscheidungs-

organe von einem Arzneistoff befreit wird. Die totale Clearance ist also ein Maß für

die Eliminationsleistung des Organismus. Sie setzt sich Additiv aus den

Ausscheidungsraten der einzelnen beteiligten Organe zusammen (SAMS, 1992).

Solange keine Sättigung der Prozesse der Elimination vorliegt, verhält sich die

Clearance dosisunabhängig.

Als Halbwertszeit (HWZ) wird die Zeit bezeichnet, nach der die Konzentration um

die Hälfte ihres ursprünglichen Wertes abgenommen hat (DERENDORF et al., 2002).

Sie wird aus der Geschwindigkeitskonstanten, z.B. der Eliminationskonstanten

errechnet und ist für jeden Stoff charakteristisch, unabhängig von der verabreichten

Dosis. Sie ist ein wichtiger Parameter zur Berechnung von Dosierungsintervallen und

der Berechnung der Ausscheidungszeit. Im allgemeinen werden etwa 4

Halbwertszeiten benötigt, um einen Stoff zu etwa 94% aus dem Organismus

eliminiert zu haben (KAMERLING und OWENS, 1994).

Das Verteilungsvolumen (Vd) beschreibt als fiktive Größe das Flüssigkeitsvolumen,

das erforderlich wäre, um die gesamte im Körper befindliche Arzneistoffmenge in

gleicher Konzentration zu lösen, in der sie im Blut vorliegt. BAGGOT (1978)

Literaturübersicht

- 18 -

beschreibt das Verteilungsvolumen als einen pharmakokinetischen Term, der dazu

genutzt wird, die Dosis zu berechnen, die benötigt wird, um eine gewünschte

Plasmakonzentration zu erhalten. Es ist ein Maß für die Gewebegängigkeit eines

Arzneimittels. Die ist bei intravenöser Gabe initial gering, da sich die gesamte

Arzneimittelmenge in der Blutbahn befindet. Mit anschließender Verteilung in die

Körpergewebe vergrößert sich das Verteilungsvolumen. Wenn es dem Volumen des

Gesamtkörperwasser entspricht, heißt das, dass die Substanz intra- und extrazellulär

verteilt ist. SAMS (1996) stellte fest, dass Arzneimittel, die eine hohe

Plasmaproteinbindung eingehen, ein geringes Verteilungsvolumen haben.

Unter der Bioverfügbarkeit versteht man das Ausmaß und die Geschwindigkeit, mit

der der therapeutisch wirksame Bestandteil eines Arzneimittels in den systemischen

Kreislauf gelangt (DERENDORF et al., 2002). Diese beträgt bei intravasaler

Applikation 100 %, während nach zum Beispiel oraler Applikation die

Bioverfügbarkeit vermindert ist, da durch Darm- und Leberpassage nur noch ein Teil

der Dosis zur Verfügung steht (FICHTL et al., 2001). Zur Berechnung der

Bioverfügbarkeit wird die Fläche unter der Plasmakonzentrationskurve (AUC)

herangezogen. Zusammen sind die Bioverfügbarkeit, die maximale Konzentration

(Cmax) und der Zeitpunkt der maximalen Konzentration (tmax) bedeutende Größen, um

die Bioäquivalenz einer Arzneiform zu bestimmen.

1.6 Analytik

1.6.1 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Als Chromatographie bezeichnet man eine Stofftrennung durch Verteilung zwischen

einer ruhenden (stationären) Phase und einer sich bewegenden (mobilen) Phase, die

nicht miteinander mischbar sind. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ist eine

besonders schnelle und leistungsfähige Chromatographiemethode und trennt

innerhalb von Minuten einen umfassenden Bereich von Stoffgruppen (SCHWEDT,

1986). Dazu gehören stark polare und ionische Substanzen, Substanzen mit hoher

Molmasse sowie thermisch instabile und leicht zersetzliche Substanzen (UNGER et

al., 1995).

Es gibt verschiede Arten nach der die Flüssigkeitschromatographie arbeitet. Nach

dem Prinzip der Adsorptionschromatographie funktioniert die klassische Säulen-

Literaturübersicht

- 19 -

oder Dünnschichtchromatographie. Als stationäre Phase dient hier ein relativ polares

Material mit hoher spezifischer Oberfläche, meist Kieselgel oder ähnliches. Die

mobile Phase ist relativ apolar, z.B. Pentan. Die Trennung erfolgt durch

unterschiedliche Adsorbtion der verschiedenen Molekülsorten im Gemisch an der

stationären Phase. Polare Stoffe werden hierbei später eluiert als apolare. Bei der

Umkehrphasenchromatographie ist das Prinzip genau ungekehrt. Die stationäre

Phase ist sehr apolar und die mobile Phase ist polar, wie z.B. Wasser. Ein polares

Lösungsmittel eluiert hier langsamer. Bei der Chromatographie an chemisch

gebundene Phasen ist die stationäre Phase kovalent an das Trägermaterial

gebunden. Durch die geeignete Wahl der Reaktionspartner lässt sich eine Vielzahl

von stationären Phasen herstellen. Die oben genannte

Umkehrphasenchromatographie ist der wichtigste Spezialfall der Chromatographie

an chemisch gebundene Phasen.

Bei der Ionenaustauschchromatographie enthält die stationäre Phase eine

ionische Gruppe. Diese tritt mit den Probenmolekülen in Wechselwirkung. Diese

Methode ist z.B. für die Trennung von Stoffwechselprodukten und Aminosäuren

geeignet. Für die Trennung von Ionen starker Säuren und Basen wurde die

Ionenchromatographie entwickelt. Sie ist ein Spezialfall der

Ionenaustauschchromatographie. Eine weitere Form ist die Gelchromatographie.

Man unterteilt sie in Gelpermeationschromatographie, geeignet für organische

Lösungsmittel, und Gelfiltrationschromatographie für wässrige Lösungen. Diese Form

der Chromatographie trennt die Substanzen nach Molekülmasse. Die größten

Moleküle werden am schnellsten eluiert. Die Affinitätschromatographie basiert auf

einer hochspezifischen biochemischen Wechselwirkung. Die Bindung kommt hier zu

Stande, wenn räumliche und ladungsmäßige Voraussetzungen erfüllt sind. Dies ist

bei einer Antigen-Antikörperreation der Fall.

Jede HPLC-Apparatur besteht aus einer Serie von Bausteinen, die miteinander

gekoppelt sind. Ein sogenanntes chromatographisches System enthält folgende

Bausteine:

Die stationäre Phase wird von einer sogenannten „Säule“, als langgestrecktes

Trennbrett in einem Rohr gebildet. Das Innere der Trennsäule wird aus einem

stabilen und dichten Verband aus kleinen, porösen Teilchen gebildet (Säulenbett),

was eine große Oberfläche und hohe Druckstabilität garantiert (UNGER et al., 1995).

Die Trennsäule ist charakteristisch durch ihre Länge, ihren Innendurchmesser und

Literaturübersicht

- 20 -

durch den mittleren Teilchendurchmesser des Packungsmaterials. Sie besteht aus

einem Probenaufgabeteil, durch den auch die Zufuhr der mobilen Phase erfolgt, der

chromatographischen Trennstrecke und dem Säulenende, das in den Detektor

übergeht. Die Trennung der einzelnen Substanzen ist aufgrund ihrer

unterschiedlichen Polaritäten mit unterschiedlichen Sorptions- und Desorptions-

vorgängen auf der Säule möglich.

Die mobile Phase entspricht einem Lösungsmittelgemisch. Es wird infolge der

Schwerkraft oder mittels einer Pumpe unter Überdruck aus dem Fließmittelreservoir

in die Säule eingebracht. Möchte man ein Substanzgemisch mit verschiedenen

polaren Substanzen trennen, so verwendet man zur Trennung die Gradientenelution.

Bei dieser Arbeitsweise wird die Fließmittelstärke kontinuierlich erhöht und damit die

Empfindlichkeit der Detektion im hinteren Teil der Zeitachse erhöht (siehe Punkt

3.3.3.1).

Die Pumpe dient der Erzeugung eines konstanten und regelbaren Flusses des

Lösungsmittels. Für analytische Säulen werden Volumina von 0,5 bis 5 ml/min

angegeben.

Die Dosiervorrichtung oder das Einspritzsystem gibt reproduzierbar ein im Volumen

wählbares, definiertes Aliquot des zu trennenden Gemisches (Probe) aus dem

Probenröhrchen direkt in den Strom der mobilen Phase. So gelangen Probe und

Lösungsmittel über das Probenaufgabeende in die thermostatierte Säule und werden

durch sie hindurch geleitet (SCHWEDT, 1986).

Das Detektionssystem schließt sich der Säule direkt an und macht das

chromatographische Konzentrationsprofil sichtbar (SCHWEDT, 1986). Dabei ist das

Signal proportional zur Menge der Substanz und wird in Abhängigkeit zur Zeit in

Form eines Peaks aufgezeichnet. Das Chromatogramm zeigt die Retentionszeit der

Substanz sowie Höhe und Fläche des Peaks an. Die Retentionszeit entspricht der

Zeitspanne von der Injektion bis zum Durchbruch des Maximums des Peaks. Über

den Vergleich der Fläche der Substanz zur Fläche des internen Standards kann auf

die Konzentration der Probe geschlossen werden (MASSMANN, 2004).

In der vorliegenden Studie wurde das HPLC-System direkt mit einem Tandem-Massenspektrometer als Detektionssystem gekoppelt. Es ist sensibler und

spezifischer als alle anderen flüssigkeitschromatographischen Detektoren und dient

der Darstellung und Identifizierung von Substanzen. Die substanzspezifischen

Fragmentierungsmuster lassen Rückschlüsse auf die Strukturformeln der zu

Literaturübersicht

- 21 -

identifizierenden Substanzen zu, denn unter gleichbleibenden Bedingungen zerfällt

ein Molekül immer in die gleichen Fragmente. Das Massenspektrometer erzeugt

nach der Trennung der Substanzen im Flüssigkeitschromatographen einen Strahl

gasförmiger Ionen. Hierfür werden die Substanzmoleküle unter atmosphärischem

Druck in für die Substanz charakteristische Ionen zerlegt und von den Molekülen des

Lösungsmittels getrennt. Die in der Zeiteinheit gebildeten Mengen an Ionen

bezeichnet man als Ionenströme, die Summe der Ionenströme als Gesamt-

ionenstrom (BUDZIKIEWICZ, 1998).

In dieser Studie wurde als Ionisationsverfahren die chemische Ionisation unter

atmosphärischem Druck (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation)

verwendet. Dabei wird der aus der HPLC-Säule austretende flüssige Eluent bei einer

Temperatur von 350 bis 550°C in einer evakuierten Verdampfungskammer vernebelt.

An einer Glühkathode werden die gasförmigen Teilchen ionisiert und dem

Massenspektrometer zugeleitet. In dem verwendeten Triple-Quadrupole-

Massenspektrometer werden die Ionen dreimal hintereinander mittels

Beschleunigung im elektrischen Feld nach Masse und Ladung getrennt und durch

Kollision mit Stickstoffmolekülen in typische Fragmente zersprengt. Andere Ionen

werden aus dem Feld hinaus in die Umgebung abgeleitet, was eine Aufreinigung und

Konzentration der gesuchten Ionen bedeutet. Diese werden schließlich durch einen

Kollektorspalt in einen Detektor geleitet und dort entladen. Die Ströme führen zur

Aufzeichnung des Massenspektrums (BUDZIKIEWICZ, 1998). Dabei gibt das

Massenspektrum alle Ionen eines Substanzgemisches, das „single ion monitoring“

(SIM) hingegen nur das ausgewählte Spektrum eines Ions an.

Die Analytik erfolgte in der vorliegenden Studie mittels Hochdruck-Flüssigkeits-

chromatographie in Kombination mit einem Tandem-Massenspektrometer-System.

Material und Methode

- 22 -

2 MATERIAL UND METHODE

2.1 Versuchsplanung

Zur Untersuchung der Eliminationskinetik von Tetrahydrogestrinon (THG) im

Pferdeblut und -urin wurde die Substanz einmalig in einer Dosis von 0,025 µg/kg KM

oral appliziert. Die Dosis ist angelehnt an die therapeutische Dosis von Gestrinon,.

Die Studie teilte sich in einen Vorversuch und in einen Hauptversuch. Im Vorversuch

erfolgte an Blut- und Urinproben eines Pferdes die Entwicklung und Validierung der

Analysemethode. Im Hauptversuch wurde THG 10 Pferden appliziert. Während der

Dauer der Versuche wurden den Pferden in festgelegten Zeitabständen Blutproben

entnommen. Ebenfalls zeitlich kontrolliert wurde Spontanurin aufgefangen.

Die Plasma– und Urinproben wurden im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln aufgearbeitet. Mittels High-Performance-Liquid-

Chromatography/Tandem Mass Spectrometry (HPLC/MS/MS) wurden sie

labortechnisch untersucht und die Ergebnisse pharmakokinetischen Berechnungen

unterzogen.

2.2 Versuchstiere

Für die Versuche wurde eine Gruppe von 10 Wallachen im Alter von 5 bis 9 Jahren

verwendet. Es handelte sich dabei um 8 Warmblutpferde und 2 Vollblüter. Ihr

mittleres Gewicht betrug 591 kg. Pferd 2 wurde sowohl im Vorversuch als auch im

Hauptversuch eingesetzt, wobei zwischen diesen Versuchen ein zeitlicher Abstand

von 4 Monaten lag. Rasse, Alter und Gewicht der einzelnen Tiere sind in Tabelle 2

zusammengefasst.


- 23 -

Pferd Rasse Gewicht (kg) Alter (Jahre)

1 Warmblut

586 9

2 Warmblut

614 9

3 Warmblut

670 9

4 Vollblut

449 5

5 Warmblut

568 9

6 Warmblut

630 9

7 Warmblut

568 9

8 Warmblut

620 9

9 Warmblut

638 9

10 Vollblut

564 9

Tabelle 2: Rasse, Alter und Gewicht der Versuchstiere

Die Pferde waren im Institut für Tierzucht der Forschungsanstalt für Landwirtschaft

(FAL) in Mariensee in einem festen Herdenverband untergebracht. Die Gruppe

wurde in einem Laufstall auf Stroh mit unbegrenztem Zugang auf ein Paddock sowie

täglichem Weidegang gehalten. Morgens bekamen alle Tiere Hafer und Mineralfutter

in Einzelfressständen. Die Menge der Ration richtete sich nach dem Ernährungs- und

Trainingszustand des einzelnen Tieres. Tagsüber hatten alle Pferde ad libitum

Zugang zu Grassilage und Wasser.

Alle Tiere waren entwurmt und gegen Tetanus, Equines Herpesvirus und Influenza

geimpft. Vor Versuchsbeginn wurden die Pferde einer klinischen

Allgemeinuntersuchung unterzogen. Zusätzlich wurden der Ernährungszustand, das

Temperament und der klinische Gesamteindruck beurteilt. Alle Tiere waren klinisch

unauffällig. Um zu gewährleisten, dass es nicht zu Wechselwirkungen mit anderen

Medikamenten kommt, wurde sichergestellt, dass den Tieren ab 4 Wochen vor

Studienbeginn keine Medikamente mehr verabreicht worden waren.


- 24 -

2.3 Vorbereitung des Versuches

Im Zuge der Vorbereitung auf die Studie wurden alle Pferde darauf konditioniert, kurz

nach dem Betreten des mit Stroh eingestreuten Laufstalles Spontanurin abzusetzen.

Dabei macht man sich das Phänomen zunutze, dass Pferde meist spontan „stallen“,

sobald sie sich in mit Stroh eingestreuten Boxen befinden. Um dieses Verhalten zu

verstärken, wurden die Tiere zuerst über mehrere Stunden ausgesperrt, dann in den

Laufstall gelassen und für das Absetzen von Urin mit Futter belohnt. Im Laufe der

Konditionierung konnten die Tiere so trainiert werden, dass ein Urinabsatz zeitgenau

standfinden kann. Vor Beginn der Versuche wurde das Gewicht der Tiere mittels

einer Zurich Tru-Test AG 500 Viehwaage (Messbereich bis 2000 kg) ermittelt. Nach

der klinischen Allgemeinuntersuchung wurden den Pferden eine Braunüle MT®

(Braun, Melsungen) in die linke oder rechte Vena jugularis externa gelegt und mit

einem Mandrin Vasofix® (Braun, Melsungen) verschlossen.

Durch den Katheter in der Vena jugularis wurde vor der Applikation des THG mit fünf

Monovetten® (9 ml, Lithium heparinisiert, Sarstedt, Nümbrecht) eine Blutprobe von

45 ml entnommen. Zusätzlich wurde Spontanurin wurde aufgefangen. Beide Proben

dienten als Nullproben.

2.4 Versuchsdurchführung

2.4.1.1 Substanz und Dosierung

Die Substanz THG wurde von dem Institut für Biochemie der Sporthochschule Köln

hergestellt (Siehe Kapitel 2.4.2.2). Sie wurde in fester Form in einem verschlossenem

Gefäß übergeben. Als Lösungsmittel diente Myglyol 812.

Da es für den Einsatz von THG keine Daten zur Dosierung gibt, diente als

Berechnungsgrundlage Gestrinon, welches unter dem Handelsnamen Nemestran in

der Schweiz als Humanarzneimittel zur Endometriosebehandlung zugelassen ist.

Hieraus ergab sich bei der Umrechnung auf das metabolische Körpergewicht des

Pferdes eine Dosierung von 0,025 mg/kg KM. Hierbei wurde 1mg Gestrinon in 1ml

Myglyol in Lösung gebracht. Dies geschah immer unmittelbar vor der Eingabe nach

der Mengenangabe in Tabelle 3. Hierfür wurde zuerst die passend abgewogene

Trockensubstanz in etwas Lösungsmittel (ca 5ml) angelöst und anschließend


- 25 -

gleichmäßig auf die Gesamtmenge verteilt. Zur Applikation wurde die Lösung in eine

sterile Einmalspritze überführt.

Pferd Dosis Applikationsvolumen (ml) 1 14,7 2 15,4 3 16,8 4 11,2 5 14,2 6 15,5 7 14,2 8 15,5 9 16,0 10

0,025 mg/kg KM

14,1 Tabelle 3: Dosierung von THG

2.4.1.2 Applikation

Die Applikation von THG erfolgte oral. Hierbei wurde die Substanz tief auf den

Zungengrund oral eingebracht und das Abschlucken überprüft.

2.4.1.3 Abnahme und Verarbeitung der Proben

Über den Katheter in der linken Halsseite und ab Stunde 24 mittels Einmalkanülen

wurden den Pferden Blutproben von je 45 ml entnommen Hierbei wurden Lithium-

heparinisierte Monovetten® benutzt.

Die Probenentnahmezeitpunkte sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Basierend auf

den Ergebnissen des Vorversuches, unterscheiden sich die Probenzeitpunkte von

Vor- und Hauptversuch.

Da die Blutentnahme pro Probe insgesamt etwa 30 Sekunden in Anspruch nahm,

wurde 15 Sekunden vor der Probenentnahmezeit begonnen, so dass die

Gesamtprobe die Konzentration zum exakten Zeitpunkt enthält.

In einem Zeitraum von 2 bis maximal 15 Minuten nach der Entnahme wurden die mit

Vollblut gefüllten Monovetten® bei 2500 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten

zentrifugiert. Die Plasmafraktion wurde in Einmalspritzen (20 ml) mit aufgesetzter

Kanüle gepoolt und nach mehrmaligem Schwenken in je drei Glasröhrchen (8 ml,

Wheaton, Millvill) zu je 6 ml überführt. Um eine Verwechslung der Proben zu jedem

Zeitpunkt zu verhindern, waren die Monovetten® mit dem jeweiligen Pferdenamen


- 26 -

und der Probennummer beschriftet. Die Glasröhrchen zur Aufbewahrung des

Plasmas wurden mit Etiketten gekennzeichnet, die mit den entsprechenden

Codenummern bedruckt waren.

Nach der Überführung in die Plasmaröhrchen wurden alle Proben im Kühlschrank bei

8°C vorgekühlt, bevor sie am jeweiligen Versuchsabend in einen Kühlraum mit einer

Temperatur von –20°C verbracht wurden.

Probenentnahmezeitpunkte Plasma Vorversuch (Std.)

Probenentnahmezeitpunkte Plasma Hauptversuch (Std.)

0,25 0,25

0,5 0,5

1 1

2 1,5

3 2

4 3

5 4

6 6

8 8

10 12

12 24

24 36

48 48 Tabelle 4: Probenentnahmezeiten Vorversuch und Hauptversuch Blut

Für die Gewinnung von Spontanurin wurden die Pferde von der Stallgasse oder dem

Paddock mit Einzelhaltung in den Laufstall geführt.

Die Entnahmezeitpunkte im Vor- und Hauptversuch sind in Tabelle 5

zusammengefasst.


- 27 -

Probenentnahmezeitpunkte Urin Vorversuch (Std.)

Probenentnahmezeitpunkte Urin Hauptversuch (Std.)

4 3

8 6

12 9

24 12

36 24

48 48

72 72

96 96

120 120

144 144

168 192

192 240

240 288 Tabelle 5: Probenentnahmezeiten Vorversuch und Hauptversuch Urin

Für das Auffangen des Urins wurde eine Kunststoffhalterung verwendet, die an

einem etwa ein Meter langen Stiel befestigt war und in die für jede Probe ein

Einmalplastikbecher eingesetzt wurde. Dadurch konnte eine Kontamination der

Proben verhindert werden. Nach Durchmischen durch Schwenken wurden 100 ml

der Probe in ein etikettiertes Kunststoffgefäß überführt und verschlossen. Die

Urinbehälter wurden im Kühlschrank auf 8°C heruntergekühlt und am jeweiligen

Versuchsabend in einen Kühlraum mit –20°C eingelagert.

Der Transport der Plasma- und Urinproben in das Institut für Biochemie in Köln fand

in gefrorenem Zustand statt, wobei eine Temperatur von –15°C nicht überschritten

wurde.

Ergänzend wurden im Verlaufe der Probenzeitpunkte zu Zeitpunkt 0, 48, 144

Stunden Plasmaproben zur Bestimmung des Kreatininwertes entnommen, um die

Nierenfunktion zu überprüfen. Sie wurden entsprechend den übrigen Plasmaproben

aufgearbeitet und tiefgefroren. Die Analyse der Proben fanden in der Klinik für Pferde

der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover statt.


- 28 -

2.5 Analytik

2.5.1 Methodenentwicklung

Da für die Untersuchung von Pferdeproben auf THG kein Analyseverfahren zur

Verfügung stand, wurde im Rahmen dieser Studie eine Methode zur quantitativen

Bestimmung von THG in Pferdeplasma und -urin entwickelt. Dafür wurden die

Proben aus dem Vorversuch verwendet. Die Entwicklung und Validierung der

Methode sowie die Messung der Proben aus dem Vor- und Hauptversuch erfolgte mit

einem HPLC-System.

Zur Quantifizierung der Proben wurde mit einem HPLC/MS/MS-System (API 2000,

Perkin Elmer Sciex Instruments, gekoppelt mit einem Agilent Series 1100 Liquid

Chromatographen) gearbeitet.

2.5.1.1 Standardlösungen und Chemikalien

Für einen quantitativen Nachweis von THG in Plasma und Urin wurden Lösungen

von THG und Gestrinon in unterschiedlichen Konzentrationen benötigt. Dazu wurde

eine 0,01 ng/ml THG-Stammlösung in Methanol hergestellt. Weitere benötigte

Verdünnungen wurden 1:10 mit Methanol hergestellt. Diese hatten Konzentrationen

von 10 µg/ml und 1µg/ml. In gleicher Form wurde mit Gestrinon verfahren.

Abbildung 4: Strukturformel und Sollbruchstellen von Gestrinon und THG

O

C CH

OHCH3CH2262

241 O

OHCH3CH2

CH2 CH3

241

266


- 29 -

Ebenso sind die bei der Analyse verwendeten Chemikalien in der folgenden Tabelle

aufgeführt.

Substanz Hersteller

Tetrahydrogestrinon

Gestrinon

Institut für Biochemie, Köln

Aventis Pharma AG

Nortestoteronglucuronidat

D4-Androsteronsulfat



Aqua destilata

β-Glucuronidase von E.coli

Ethylacetat

Kaliumcarbonat

Kaliumhydroxidplätzchen

Methanol, destilliert

Natriumhydrogenphosphat

Natriumdihydrogenphosphat

N-Heptan

Phosphorpentoxid,

Schwefelsäure

Tertiär-Butylmethylether, destilliert


Boehringer Ingelheim, Ingelheim

KMF,

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Merck, Darmstadt

Kraemer&Martin, ST. Augustin

THG liegt im Körper überwiegend nicht frei vor. Ein Nachweis mittels LC/MS/MS

erfasst aber nur freies THG. Um die Gesamtfraktion von THG nachzuweisen, ist eine

Aufarbeitung nötig. Hierbei werden Sulfate und Glucuronide, die an THG gebunden

sind, abgespalten und die Gesamtfraktion frei. Um diese Arbeitsschritte (Solvolyse

und Hydrolyse) zu überprüfen, wurde bei der Aufarbeitung im Urin, ein

Standardgemisch aus Nortestoronglucuronidat und D4-Androsteronsulfat zugegeben.

Diese Substanzen zeigen nur nach erfolgreicher Aufarbeitung ein Signal im

LC/MS/MS und stehen somit als Indikator für den Erfolg der Aufarbeitung. Zur

Herstellung des Standardgemisches wurden 6,74 ng Nortestoteronglucoronid und

10,06 ng D4-Androsteronsulfat auf 10 ml Methanol aufgefüllt. Hiervon erfolgte eine

weitere Verdünnung von 1:20 mit Methanol. Die entstandene Lösung wurde als

Standardlösung verwendet und enthielt jeweils 50 µg/ml Nortestoronglucuronidat und

D4-Androsteronsulfat.


- 30 -

2.5.1.2 Aufarbeitung der Plasmaproben

5 ml Plasma werden in ein Zentrifugenschliffgas gegeben. Der interne Standard wird

hinzugegeben. Anschließend wird der pH-Wert auf 9,6 eingestellt. Dies geschieht

gemäß dem Aufarbeitungsschema Abbildung 5.

Die Extraktion der Steroidfraktion erfolgt mit 5ml TBM-Ether für fünf Minuten auf einem

Schüttler. Anschließend wird 5 Minuten bei 5619 g zentrifugiert und der Überstand, die

organischen Phase, in Spitzgläser überführt. Nach Evaporation in der Vakuumzentrifuge zum

Trocknen, erfolgt ein Anlösen und überführen der Substanz in Autosamplervials für die

Messung mittels LC/MS/MS.

5ml Pferdeplasma

Zugabe 50 µl interner Standard Gestrinon

auf pH 9, 6 einstellen mit einer Spatelspitze K2 CO3/NaHCO3

pH überprüfen mit Universalindikatorpapier

↓ Extraktion der Steroide mit 5 ml Tertiärmethylbutylether

Schütteln für 5 Minuten

Zentrifugieren für 5 Minuten bei 5619 g

↓

Dekantieren der organischen Phase in Spitzgläser

↓ Evaporation in der Vakuumzentrifuge zum Trocknen

↓ Anlösen mit 100 µl Methanol

Transfer in Autosamplervials

Messung mit LC/MS/MS

Abbildung 5: Prozedur zur Bestimmung THG im Pferdeplasma mittels LCMS/MS


- 31 -

2.5.1.3 Aufarbeitung der Urinproben

5 ml Urin werden in ein Zentrifugenschliffglas gegeben und interne

Standardgemische werden zugegeben. Hierbei handelt es sich um Gestrinon, D4-

Androsteronsulfat und Nortestoronglucoronidat. Zur Spaltung der

Glukuronidkonjugate wird eine enzymatische Spaltung durchgeführt. Es werden 1ml

Phosphatpuffer (0,8 mol/l) und 100 µl β-Glucuronidase (E.coli) zugegeben und der

Urin für 180 min bei 50 °C im Wasserbad erwärmt.

Durch Zentrifugation bei 5619 g wird Sediment, welches den Adsorber verstopfen

kann, abgetrennt. Der Überstand wird auf mit Methanol konditionierte und mit H2O

gewaschene C18-Chromabond-Säulen gegeben. Nach der Absorbtion und einem

Waschschritt mit 2 ml Wasser und 1,25 ml Methanol werden die Steroidsulfate und

die hydrolysierten Steroide mit 1,25 ml Methanol von der Säule in

Zentrifugenschliffgläser eluiert. Eine chemische Spaltung (Solvolyse) der Sulfate

erfolgt nach Zugabe von 5 ml eines Gemischs von Ethylacetat mit H2SO4 60 Minuten

bei 60 °C. Die Reaktion wird mit 0,75 ml 1 M KOH gestoppt und das Ethylacetat in

der Vakuumzentrifuge abgedampft. Die Extraktion der gespaltenen Steroide erfolgt

nach der Zugabe von 0,5 ml 1 M KOH gegen 5 ml TBM-Ether. Die Probe wird 5 min

geschüttelt und bei 4619 g 5 min zentrifugiert. Die Steroide enthaltende organische

Phase wird in Zentrifugenschliffgläser dekantiert und am Rotationsverdampfer (oder

der Vakuumzentrifuge) bis zur Trocknung eingeengt. Der eingetrocknete Rückstand

wird in 100µl Methanol gelöst, in Autosamplervials überführt und mittels LC/MS/MS

gemessen. Im folgenden ist das Aufarbeitungsschema aufgeführt.


- 32 -

5ml Pferdeurin pH überprüfen

Auf pH 6.8 einstellen mit 1 ml Phosphatpuffer 0.8 M (17.3 g Na2HPO4 und 8.8 g NaH2PO4 in 203.9 g H2O)

pH überprüfen

↓

Zugabe

Interner Standard Gestrinon 50 µg

+D4-AndrosteronSulfat 1000 ng + Nortestoronglucoronidat 1000 µg

↓

Zugabe

100 µl ß-Glucuronidase von E.coli

↓

50°C für 180 min oder 37 °C über Nacht, Abkühlen lassen

↓

Zentrifugieren für 6 min bei 5619 g Aufgabe des Überstandes auf gewaschene C18-Säule

(Konditionierung : 1,25 ml MeOH, Waschen etwa 1 ml H2O) Waschen mit 2 ml H2O (Unterdruck)

(Waschen mit 0,25 ml MeOH!) Waschen mit 1,25 ml n-Heptan (Unterdruck)

↓ Übernacht Exsikator mit Phosphorpentoxid

Elution mit 2 * 1 ml MeOH Freie, Glukuronide und Sulfate : kombiniertes Eluat

↓ Zugabe

5 ml EtOAc/H2SO4 (250 ml/200µg = 10 Tropfen) ↓

60 ° C 60 min chemische Spaltung (Solvolyse) ↓

Zugabe 0.75 ml KOH 1M

20 min Evaporation bis nahe Trockne (Vakuumzentrifuge)

↓ Zugabe

0.5 ml KOH 1M Extraktion der Steroide mit 5 ml TBM-Ether

Schütteln für 5 min und Zentrifugieren für 5 min bei 5619 g Dekantieren der organischen Phase

Evaporation zu Trocknen Anlösen mit 100µl MeOH

Transfer in Autosampler(spitz)vials Messung mit LC/MS/MS

Abbildung 6: Prozedur zur Bestimmung THG im Pferdeurin mittels LCMS/MS


- 33 -

Bei der Aufarbeitung des Urins wurde ein weiteres Aufarbeitungsschema getestet

und die Ergebnisse verglichen. Hierbei wurde die Extraktion der Steroide mit einer

weniger polaren Substanz, als TBM-Ether, durchgeführt. Als Substanz diente hier

N-Pentan. Hierfür wurde an einem Tag jeweils ein Kalibrationskurve mit den beiden

Substanzen durchgeführt. Die Aufarbeitung bezüglich der Hydrolyse und Solvolyse

wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.

2.5.1.4 HPLC/MS/MS

Bei der Messung der Proben wurde ein Flüssigkeitschromatograph verwendet. Es

handelt sich um einen API 2000 triple-Quadropole von Applied Biosystems,

gekoppelt an einen Agilent Series 1100 Liquid Chromatograph und Tandem-

Massenspektrometer mit folgenden Parametern: Flüssigkeitschromatograph:

Säule: Li Chro CART® 55 x 4 Purospher® STAR 18e, 3 µm

(Merck, Darmstadt)

Eluenten: A = 5 mM Ammoniumacetat in H2O + 0,1% Eisessig

B = Acetonitril

Gradienten: 15 % B → 100 % B in 4 min., 2min bei 100 % B

Reequilibrierung: 15 % B für 2,5 min.

Flussrate d. Gradienten: 500 µl/min.

Injektionsvolumen: 10 µl

Massenspektrometer:

Interface / Ionisierung: Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)

Interface Temperatur: 400°C

Polarität: positiv

Mess-Modus: Multiple Reaction Monitoring (MRM)


- 34 -

Kollisionsgas: Stickstoff (N2), 2,0 x 10e-5 torr aus einem Whatman 75 –

72 K 727 Stickstoffgenerator

Kollisionsenergie: optimiert für jedes Produkt

In Tabelle 6 sind alle Analyten einschließlich deren Molekulargewicht und der zur

Identifizierung ausgewählter Ionenübergänge dargestellt.

Analyt Massenzahl Ionenübergang

THG 312 313/241

Gestrinon 308 309/241

D4-Androsteron 294 295/259

Nortestoteron 274 275/109

Tabelle 6: Massen und Ionenübergänge der Analyten

2.5.2 Validierung

2.5.2.1 Selektivität und Spezifität

Als Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode beschrieben, bestimmte Substanzen

ohne gegenseitige Störung zu unterscheiden und eindeutig zu identifizieren. Sie ist

durch eine ausreichende Trennung des Analyten von coeluierenden Störpeaks im

Chromatogramm an der Retentionszeit des Analyten gekennzeichnet (DOLAN 2000).

Spezifität hingegen ist die Fähigkeit einer Methode Verbindungen ohne Störung oder

Verfälschung fremder, in der Probe vorkommender Substanzen, zu erfassen und sie

eindeutig zu identifizieren.

Zur Bestimmung der Spezifität und Selektivität wurden Chromatogramme von

Plasma- und Urinleerproben mit Proben, denen die Substanz zugesetzt war, in

Bezug auf Retentionszeiten und koeluierende Störpeaks, verglichen. Die

entsprechenden Abbildungen sind im Ergebnissteil dargestellt.


- 35 -

2.5.2.2 Linearität

Die Linearität ist die Fähigkeit einer Methode, Messergebnisse hervorzubringen, bei

denen die Abhängigkeit von der Konzentration der zu analysierenden Substanz

durch eine lineare Regression zu beschreiben ist.

Im Zuge der Überprüfung der Linearität wurden für Plasma und Urin an 3 Tagen

Kalibrierkurven erstellt, wobei jede Konzentration zweimal aufgearbeitet und

gemessen wurde. Für die Kalibrierkurven wurden jeweils mindestens 8

Leermatrixproben mit unterschiedlichen Konzentrationen von THG dotiert.

Die Kalibrationsreihe deckte jeweils den zu erwarteten Messbereich ab und hatte

äquidistante Abstände.

Zur Erstellung der Kalibrationskurven wurde in einem Diagramm die Peakfläche THG

zu interner Standard gegen die zu erwartete Konzentration aufgetragen.

Konzentrationen im Plasma (ng/ml) Konzentration im Urin (ng/ml) 0

0,5 1

2,5 5

7,5 10 15 20

0 2 5 10 20 30 40 50 80

Tabelle 7: Für Kalibrationskurven verwendete Konzentrationen von THG in Plasma und Urin

2.5.2.3 Nachweisgrenze (Limit of Detection = LOD)

Die Nachweisgrenze (Detektionsgrenze, limit of detection, LOD) stellt den niedrigsten

Messwert einer zu analysierenden Substanz dar, welche ein Instrumentensignal

erzeugt, das sich vom Leerwert unterscheidet.

Die Ermittlung der Nachweisgrenzen erfolgte anhand der Kalibrierkurvenmethode

nach DIN 32645. Hierbei wird aus den Residuen der linearen Regression zunächst

die Reststandardabweichung sx0 aus der Summe der Abweichungsquadrate Qx und

den Freiheitsgraden der linearen Kalibration f berechnet:

fQ

s xx =0


- 36 -

Mit Hilfe dieser Standardabweichung sx0 und dem Mittelwert X aller

Kalibrationskonzentrationen kann das Konfidenzintervall für den Merkmalswert Null

errechnet werden:

112

,00 ++⋅⋅=x

fx QX

ntsVB α

tf,α wurde aus statistischen Tabellen entnommen und errechnet:

);(, fTINVt f αα =

Mit Hilfe der Steigung a der linearen Regressionsgeraden wurde die Nachweisgrenze

(NG) mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α wie folgt errechnet werden:

α0VB

NG =

2.5.2.4 Wiederfindung

Die Wiederfindung gibt die Ausbeute nach allen Aufarbeitungsschritten in Prozent an,

d.h. der Prozentanteil der Substanz, der bei der Aufarbeitung nicht verloren geht.

Zur Bestimmung der Wiederfindung wurden jeweils für Plasma und Urin zweimal 6

Proben aufgearbeitet und gemessen.

Bei der ersten Sequenz mit 6 Proben wurde THG zu Beginn der Aufarbeitung hinzu

gegeben.

Bei der zweiten Sequenz wurde THG am Ende der Aufarbeitung nach der

Evaporation zugegeben. Der interne Standard wurde in beiden Sequenzen erst vor

der Derivatisierung zugegeben (DIN 17025). Die Berechnung der Wiederfindung (%)

erfolgte nach

MW (Area Analyt/Area interner Standard) Proben 1-6 *100 MW (Area Analyt/Area interner Standard) Proben 7-12

2.5.2.5 Richtigkeit der Methode

Die Richtigkeit ist die Übereinstimmung eines eruierten Wertes von einem als richtig

erachteten Wert.

Zur Bestimmung der Richtigkeit wurden für Plasma und Urin jeweils 5

Leermatrixproben mit einer niedrigen (LQC, Low Quality Control Standard), einer

mittleren (MQC Midrange Quality Control Standard ) und einer hohen Konzentration


- 37 -

HQC High Quality Control Standard) des Analyten versetzt. Die Konzentrationen von

THG im Plasma betrugen 2,5 / 5 / 10 ng/ml. Die Urinkonzentrationen lagen bei 10 /

30 / 50 ng/ml.

Die Proben wurden an 3 verschiedenen Tagen aufgearbeitet und gemessen und

anschließend anhand einer Kalibrationskurve quantifiziert. Dabei durften die Werte

nach der Rückrechnung mit der Kalibrationsgleichung (RE(%) = (A-B)/B x 100) m

niedrigen Konzentrationsbereich um höchstens 20%, im mittleren und hohen

Konzentrationsbereich um höchstens 15 % abweichen.

2.5.2.6 Präzision

Die Präzision beschreibt die Abweichung von Werten um einen Mittelwert. Als

Präzisionsmaß wird die Standardabweichung s und der Variationskoeffizient Vk

bezeichnet. Man unterscheidet Wiederholpräzision (intraday repeatability) und

Zwischenpräzision (interday reproducibility). Zur Bestimmung der Präzision wurden 5

LQCs, 5 MQCs und 5 HQCs für Plasma und Urin an 3 unterschiedlichen Tagen

aufgearbeitet, gemessen und chromatographisch quantifiziert. Nach HERBOLB und

SCHMITT (2000) wird die Präzision wie folgt berechnet:

∑∑ ⋅

=Tagesserie

TagesserieTagesseriew f

sfs

)( 2

Tage

gesamtTagesserie

b fXX

s ∑ −=

2)(

Die Abweichungen durften im mittleren und hohen Bereich nicht mehr als 15% und

im niedrigen Bereich nicht mehr als 20 % abweichen.

2.5.2.7 Stabilität

Um die Stabilität der Analyten in der jeweiligen Matrix für den gesamten Zeitraum des

Versuches, der Probenlagerung sowie der Analyse gewährleisten zu können, wurden

jeweils drei Konzentrationen (niedrig, mittel, hoch) durch Zusatz von Leerplasma-

und Leerurinproben mit Arbeitslösungen hergestellt. Am Tag der Herstellung sowie

nach 9 Wochen (Plasma) beziehungsweise nach 10 Wochen (Urin) wurden jeweils


- 38 -

eine Plasma- und Urinprobe der niedrigen, mittleren und hohen Konzentration

aufgearbeitet und zusammen mit einer entsprechenden Kalibrationskurve

quantifiziert. Die Konzentrationen von THG im Plasma betrugen 2,5 / 5 / 10 ng/ml.

Die Urinkonzentrationen lagen bei 10 / 30 / 50 ng/ml.

Die Proben werden unter denselben Bedingungen wie die Proben des

Ausscheidungsversuches bei –20°C gelagert.

2.5.3 Pharmakokinetische Auswertung

Bei jedem im Versuch behandelten Pferd wurde eine Auswertung der

Plasmakonzentrationen mit dem Computerprogramm WinNonLin 4.1 Pharsight

durchgeführt.

Die Datenberechnung erfolgte nach dem Ein-Kompartiment-Model. Die erhaltenen

pharmakinetischen Daten werden ausgewertet.

Ergebnisse

- 39 -

3 ERGEBNISSE

3.1 Massenspektrometrische Bestimmung

Nachfolgend sind die Massenspektren und Strukturformeln einschließlich der

Fragmentation von THG und dem internen Standard Gestrinon aufgeführt.

3.1.1 THG

Bei den unter Kapitel 3.5.1.5 angegebenen Gerätebedingungen, betrug die

Retentionszeit von THG 5,96 Minuten. Das Massenspektrum in Abbildung 7 zeigt

das typische Fragmentierungsverhalten, mit dem charakteristischen Ionen bei 313

und 241.Weiter ist dort die Strukturformel abgebildet.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%241.2

199.2

237.1159.1197.1213.1

266.1183.1 211.1

225.1169.2 313.2295.2157.1251.2135.1

131.1 141.1 255.1 265.2119.1 284.1105.191.1

m/z

Rel

ativ

eab

unda

nce

O

OH

(M+H)+

Abbildung 7: Produktionenspektrum, THG

Ergebnisse

- 40 -

3.1.2 Gestrinon

Unter den in Kapitel 3.5.1.5 angegebenen HPLC-Bedingungen lag die Retentionszeit

von Gestrinon bei 5,42 Minuten. Es wird mit den charakteristischen Ionen bei m/z

309 und 241 registriert. Abbildung 8 zeigt das Massenspektrum und die

Strukturformel.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%227.3

311.3

251.3

269.3225.3199.4 293.3237.3

212.4159.3 185.4 233.3

278.3265.3133.2107.1

O

OH

CH2 CH CH2(M+H)+

m/z 227

m/z

Rel

ativ

e ab

unda

nce

Abbildung 8: Produktionenspektrum, Gestrinon

3.2 Ergebnisse Validierung

3.2.1 Selektivität

Um die Spezifität der Methode für THG und Gestrinon zu überprüfen, wurden

Plasma- und Urinproben, denen die Substanzen zugesetzt waren, untersucht. Dabei

konnte festgestellt werden, dass die Analyten ohne Verfälschung durch

Matrixinhaltsstoffe (Spezifität) und ohne gegenseitige Störungen bei ausreichender

Trennung (Selektivität) erfasst werden. Unter den Messbedingungen waren die

Ergebnisse

- 41 -

Retentionszeiten über den gesamten Verlauf der Studie in einer Schwankungsbreite

von ≤ 2 % konstant.

Abbildung 9 und 10 zeigen Ausschnitte aus Chromatogrammen zum Zeitpunkt der

Retentionszeit von THG (als Beispiel einer Substanz im Plasma) bei 5,96 Minuten

sowie zur Retentionszeit von Gestrinon (als Beispiel einer Substanz im Urin) bei 5,42

Minuten und Leerwertmatrixproben im Vergleich.

Abbildung 9: HPLC/MS/MS-Chromatogramme ohne und mit 20 ng/ml THG

Abbildung 10:HPLC/MS/MS-Chromatogramme ohne und mit 10 ng/ml Gestrinon

Ergebnisse

- 42 -

3.2.2 Linearität

Plasma Die Linearität der Kalibrationskurven für THG im Plasma wurde im

Konzentrationsbereich von 0,5 bis 20 ng/ml an verschiedenen Tagen überprüft und

festgestellt. Dabei wurde die erwartete Konzentration des Analyten gegen den

Quotienten der Peakflächen von THG zu internem Standard Gestrinon aufgetragen.

Die Funktion wurde mit linearer Regression errechnet. Abbildung 11 zeigt beispielhaft

eine Kalibrationskurve, die Kalibrationsgleichung und den Korrelationskoeffizienten

(Bestimmtheitsmaß = R2) eines Messtages. Die Abweichungen der gemessenen von

der erwarteten Konzentration betrugen an allen Messtagen im Durchschnitt weniger

als 15 %, im Bereich der Quantifizierungsgrenze weniger als 20 %. Das

Bestimmtheitsmaß der linearen Regression (R2) lag bei allen Kalibrationskurven

oberhalb von 0.995.

y = 0,0164095021x - 0,0009056894R2 = 0,9985649730

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Konz in ng/ml

Quo

tient

313

/309

Abbildung 11: Kalibrationskurve THG in Plasma

Urin Die Linearität der Kalibrationskurven für THG im Urin wurde im

Konzentrationsbereich von 2 bis 80 ng/ml Urin an Kalibrationskurven an

Ergebnisse

- 43 -

verschiedenen Tagen überprüft und festgestellt. Dabei wurde die erwartete

Konzentration der Analyten gegen den Quotienten der Peakflächen von THG zum

internem Standard Gestrinon aufgetragen. Die Gerade wurde optisch auf Linearität

überprüft und anschließend die lineare Regression errechnet.

Abbildung 12 zeigt beispielhaft eine Kalibrationskurve, die Kalibrationsgleichung und

den Korrelationskoeffizienten von THG eines Messtages. Die Abweichungen der

gemessenen von der erwarteten Konzentration betrugen an allen Messtagen im

Durchschnitt weniger als 15 %, im Bereich der Quantifizierungsgrenze weniger als 20

%. Das Bestimmtheits-maß (R2) der Regression lag bei allen Kalibrationskurven von

THG oberhalb von 0.995.

y = 0,0146185044x + 0,0082685604R2 = 0,9973384197

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Konz in ng/ml

Quo

tient

313

/309

Abbildung12: Kalibrationskurve THG in Urin

Ergebnisse

- 44 -

3.2.3 Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze

Plasma

Die Nachweisgrenze von THG im Plasma wurde, wie in Kapitel 1,5,2,3 beschrieben,

nach der DIN 32645 ermittelt. Sie liegt bei der in der Studie verwendeten Methode

bei 0,4 ng/ml im Plasma. Die Bestimmungsgrenze bei 1,5 ng/ml.

Urin

Die Nachweisgrenze von THG im Urin beträgt bei der in der Studie verwendeten

Methode 5 ng/ml. Die Bestimmungsgrenze bei 15 ng/ml.

3.2.4 Wiederfindung

Die Wiederfindungsrate von THG im Plasma beziehungsweise Urin sind in Tabelle 8

dargestellt.

Matrix Anzahl der Proben mittlere Wiederfindungsrate (%)

Plasma 6 43,34

Urin 6 87,14

Tabelle 8: Mittlere Wiederfindungsraten in Plasma und Urin

3.2.5 Richtigkeit der Methode

Plasma

Die Ergebnisse zur Überprüfung der Richtigkeit der Analysemethode im Plasma sind

in Tabelle 9 angegeben. Dabei wurden jeweils die relative Abweichung (RE in %) der

Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages von den erwarteten

Konzentrationen bestimmt. Alle Ergebnisse liegen unterhalb der vorgegebenen

maximalen Abweichung von 15 %, beziehungsweise unterhalb 20 % an der Quanti-

fizierungsgrenze.

Ergebnisse

- 45 -

Tag Proben Erwartete Konzentrationen der QCs (ng/ml)

Mittelwert QCs (ng/ml)

Relative Abweichung RE (%)

5 2,5 2,2 10,3

5 5,0 5,1 1,4

1

5 10,0 9,8 2,3

5 2,5 2,8 13,4

5 5,0 5,6 12,4

2

5 10,0 10,6 6,2

5 2,5 2,5 0,6

5 5,0 5,4 8,1

3

5 10,0 10,4 3,8 Tabelle 9: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit für THG im Plasma

Urin

Die Ergebnisse zur Überprüfung der Richtigkeit im Urin sind in den Tabellen 10

angegeben. Auch hier wurden jeweils die relative Abweichung (RE in %) der

Mittelwerte der gemessenen Konzentrationen eines Tages von den erwarteten

Konzentrationen bestimmt. Alle Ergebnisse lagen unterhalb der vorgegebenen

maximalen Abweichung von 15 % beziehungsweise maximal 20 % an der

Quantifizierungsgrenze.

Ergebnisse

- 46 -

Tag Proben Erwartete Konzentrationen der QCs (ng/ml)

Mittelwert QCs (ng/ml)

Relative Abweichung RE (%)

5 10 11,2 11,9

5 30 29,8 0,7

1

5 50 46,4 7,2

5 10 9,8 2,1

5 30 32,6 8,8

2

5 50 46,3 7,4

5 10 9,8 1,7

5 30 29,8 0,7

3

5 50 51,8 3,6

Tabelle 10: Relative Abweichung (RE) zur Dokumentation der Richtigkeit für THG im Urin

3.2.6 Präzision

Plasma

Die Ergebnisse zur Bestimmung der Präzision der Methode für Plasma sind Tabelle

11 zu entnehmen. Die Wiederholpräzision und die Zwischenpräzision wurden wie

unter Punkt 3.5.2.6 beschrieben ermittelt. Die Werte liegen unterhalb der

vorgeschriebenen Abweichungen von nicht mehr als 15 %, an der Quantifi-

zierungsgrenze nicht mehr als 20 %, vom gemessenen Mittelwert.

Plasma Wiederholpräzision Zwischenpräzision

Erwartete Konzentration (ng/ml)

(Intraday repeatability) (%)

(Interday reproducibility) (%)

2,5 2,5 11,8

5 3,3 5,2

10 2,6 4,3

Tabelle 11: Wiederholpräzision und Zwischenpräzision der Methode für Plasma

Ergebnisse

- 47 -

Urin

Die Ergebnisse zur Bestimmung der Präzision der Methode für Urin sind den

Tabellen 12 zu entnehmen. Die Wiederholpräzision und die Zwischenpräzision

wurden wie unter Punkt 3.5.2.6 beschrieben ermittelt. Die Werte liegen unterhalb der

vorgeschriebenen Abweichungen von nicht mehr als 15 %, an der

Quantifizierungsgrenze nicht mehr als 20 %, vom gemessenen Mittelwert.

Urin Wiederholpräzision Zwischenpräzision


(Intraday repeatability) (%)

(Interday reproducibility) (%)

10 4,6 7,7

30 3,4 4,0

50 2,5 4,8 Tabelle 12: Wiederholpräzision und Zwischenpräzision der Methode für Urin

3.2.7 Stabilität

Plasma

Am Tag 1 sowie nach 9 Wochen wurden Plasmaproben, denen THG jeweils in einer

niedrigen, einer mittleren und einer hohen Konzentration zugegeben worden war,

aufgearbeitet und zusammen mit einer entsprechenden Kalibrationskurve

quantifiziert. Die Ergebnisse sind Tabelle 13 zu entnehmen.

.

Ergebnisse

- 48 -


Proben

Mittelwerte (ng/ml)

Standardabweichung Variationskoeffizient

Plasma Woche 1

2,5 5 2,5 0,1 4,0

5 5 5,5 0,2 4,0

10 5 10,3 0,2 2,0

Plasma Woche 9

2,5 5 2,2 0,1 2,6

5 5 5,1 0,1 2,3

10 5 9,8 0,4 4,0 Tabelle 13: Stabilitätsdaten für THG im Plasma in Woche 1 und Woche 9

Urin

Am Tag der Herstellung sowie nach 10 Wochen wurden Urinproben, denen THG

jeweils in einer niedrigen, einer mittleren und einer hohen Konzentration zugegeben

worden war, aufgearbeitet und zusammen mit einer entsprechenden

Kalibrationskurve quantifiziert. Die Tabelle 14 zeigt die Ergebnisse des

Stabilitätstests für THG im Urin.


Proben Mittelwerte (ng/ml)

Standardabweichung Variationskoeffizient

Urin Woche 0

10 5 11,4 0,5 4,4

30 5 29,5 1,2 4,2

50 5 46,2 1,2 2,6

Urin Woche 10

10 5 10,0 0,5 5,4

30 5 32,3 1,4 4,2

50 5 46,0 1,6 3,5 Tabelle 14: Stabilitätsdaten für THG in Urin in Woche 0 und Woche 10

Ergebnisse

- 49 -

3.3 Ergebnisse zur Überprüfung der Urinaufarbeitung

Zur Überprüfung der Aufarbeitungsprozedur Urin wurde die Abspaltung der

Konjugate von Nortestoteronglucuronidat und D4-Androsteronsulfat überprüft. Diese

Überprüfung erfolgte optisch anhand der Auswertung der Signale. Bei allen

ausgewerteten Proben war ein reproduzierbares, deutliches Signal zu erkennen.

3.4 Ergebnisse Variation Aufarbeitung

Bei der Variation der Aufarbeitung zur Extraktion der Steroide mittels N-Pentan kam

es zu keiner deutlichen Verringerung des Grundrauschen. Eine Extraktion der Stoffe

D4-Androsteronsulfat war mittels N-Pentan nicht möglich. Diese Auswertung erfolgte

optisch. Nachfolgend sind vergleichend die Chromatogramme der entsprechenden

Kalibrationspunkte bei 50 ng/ml THG bei der Extraktion mittels TBM-Ether und N-

Pentan dargestellt.

Abbildung13: THG in Urin mit 50 ng/ml nach Extraktion mit TBM-Ether und N-Pentan

Ergebnisse

- 50 -

Abbildung 14: D4-Androsteronsulfat in Urin nach Extraktion mit TBM-Ether und N-Pentan

3.5 Ergebnisse Hauptversuch

3.5.1 Plasma

In der Abbildung 14 sind die Konzentrationsverläufe des THG im Plasma dargestellt.

Es werden in der Hauptabbildung die Verläufe der Gruppe in den ersten 36 Stunden,

im kleineren Ausschnitt, die der ersten 12 Stunden dargestellt. Die maximalen

Konzentrationen lagen zwischen 1,5 und 4,7 ng/ml, durchschnittlich bei 2,97 ng/ml.

Diese maximalen Konzentrationen wurden nach 30 bis 90 Minuten erzielt. Im

Durchschnitt nach 57 Minuten. Ein Nachweis war bei 2 Pferden nach 6, bei weiteren

3 Pferden nach 8, und bei 5 Pferden nach 12 Stunden noch nachweisbar. Nach 24

Stunden waren alle Pferde unterhalb der Nachweisgrenze.

Erg

ebni

sse

- 5

1 -

012345

05

1015

2025

3035

4045

Zeit

nach

App

likat

ion

[h]

Konzentration [ng/ml]

Pfer

d 1

ng/m

lPf

erd

2 ng

/ml

Pfer

d3 n

g/m

lPf

erd4

ng/

ml

Pfer

d5 n

g/m

lPf

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ml

Pfer

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g/m

lPf

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ng/

ml

Pfer

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g/m

lPf

erd1

0 ng

/ml

012345

02

46

810

12

Abb

ildun

g 15

: Kon

zent

ratio

nsve

rlauf

TH

G im

Pla

sma

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ferd

e 1

bis

10 n

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025

mg/

kg K

M;

Der

Aus

schn

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den

Zei

traum

der

ers

ten

12 S

tund

en h

erau

s

Ergebnisse

- 52 -

3.5.2 Pharmakokinetik von THG im Plasma

Aufgrund des monoexponentialen Verlaufes erfolgte die Berechnung anhand des

Ein-Kompartment-Modelles. Basis für die Berechnungen waren die

Konzentrationswerte von Cmax bis zur Nachweisgrenze. In der nachfolgenden

Tabelle sind die Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (AUC = Area under

curve), die errechneten höchsten Konzentrationen (Cmax), die errechneten

Zeitpunkte der höchsten Konzentrationen (Tmax) angegeben. Weiter wird der Wert

für die Plasmamenge angegeben, der pro Minute von THG befreit wird. Dieser Wert

wird als Clearence bezeichnet. K_01 HL bezeichnet die Halbwertszeit für die

Anflutung von THG im Kompartiment, K_10 HL hingegen gibt die Halbswertszeit für

die Elimination von THG aus dem Kompartiment an.

Tabelle 15: Höchstkonzentrationen(Cmax), Zeitpunkt der Höchstkonzentrationen(Tmax), Area under

curve(AUC), Clearence und Halbwertszeiten der An- und Abflutung (K_01 HL; K_10 HL)

In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse der pharmakokinetischen

Berechnung für THG im Plasma für die Gruppe (n=10) als Mittelwert,

Standardabweichung und der Variationskoeffizient angegeben.

Parameter Cmax Tmax AUC Clearence K_01 HL K_10 HL

Einheit (ng/ml) (min) (ng/ml*h) (ml/kg) (h) (h)

Pferd 1 3,1 0,8 12,1 3,5 0,24 2,03

Pferd 2 3,3 0,8 11,3 3,6 0,22 1,78

Pferd 3 2,1 0,8 5,3 7,0 0,33 1,01

Pferd 4 1,9 0,8 5,6 9,9 0,27 1,41

Pferd 5 2,4 0,9 11,6 3,7 0,26 2,55

Pferd 6 1,1 1,8 9,9 4,0 0,51 4,56

Pferd 7 3,8 1,2 16,4 2,6 0,45 1,88

Pferd 8 2,4 0,8 14,1 2,9 0,16 3,49

Pferd 9 3,7 0,7 13,8 2,8 0,18 2,02

Pferd 10 3,2 1,2 10,5 4,2 0,83 2,03

Ergebnisse

- 53 -

Parameter Einheit Mittelwert Standardabweichung Variationskoeffizient

Cmax (ng/ml) 2,7 0,9

0,8

Tmax (min) 0,9 0,4 0,1

AUC (ng/ml*h) 11,1 3,5 12,3

Clearence (ml/kg) 4,4 2616,4 122,6

K_01 HL (h) 0,6 0,7 0,5

K_10 HL (h) 1,9 1,0 1,6

Tabelle 16 : Pharmakokinetische Daten mit Mittelwert, Standardabweichung und

Korrelationskoeffizient nach einmaliger oraler Gabe von 0,025mg/kg bei 10 Pferden

Die Ausscheidungszeit von THG aus dem Plasma bis zum Erreichen der

Quantifizierungs- bzw. Nachweisgrenze erfolgte anhand folgender Gleichungen

(KIETZMANN, 1983):

tA(LOQ) = e

max

kLOQ) ( C ln- C ln

tA(LOD) = e

max

kLOD) lnC(- C ln [h]

Nachfolgend sind die Ergebnisse der Berechnungen der Ausscheidungszeiten von

THG im Plasma bis zum Erreichen der Quantifizierungsgrenze (tA(LOQ)) und bis zum

Erreichen der Nachweisgrenze (tA(LOD)) am Tag der Behandlung (Tabelle 17) .

Para- meter

Pferd 1

Pferd 2

Pferd 3

Pferd 4

Pferd 5

Pferd 6

Pferd 7

Pferd 8

Pferd 9

Pferd 10

Mittel -

wert

S

tA (LOQ) (h)

2,1 2,0 0,5 0,5 1,7 2,0 2,5 1,0 2,6 2,2 1,7 0,7

tA (LOD) (h)

6,0 5,4 2,4 3,2 6,6 6,7 6,1 3,9 6,5 6,1 5,2 1,5

Tabelle 17: Ergebnisse der Berechnungen nach KIETZMANN (1983) von tA(LOD) und tA(LOD) von allen

zehn Tieren und im Mittel nach einmaliger oraler Verabreichung von THG in einer Dosis von 0,025

mg/kg Körpergewicht

Ergebnisse

- 54 -

3.5.3 Urin

Im folgenden werden die Ergebnisse nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg

THG im Urin vorgestellt. In Abbildung 16 werden die Verläufe der

Urinkonzentrationen von THG dargestellt. Die Abbildung zeigt den Verlauf in den

ersten 36 Stunden. Die maximalen Konzentrationen lagen zwischen 38 und 205

ng/ml, durchschnittlich bei 78 ng/ml. Diese maximalen Konzentrationen wurden nach

6 Stunden erzielt. Ein Nachweis war bei 8 Pferden nach 24 und bei weiteren 2

Pferden nach 36 Stunden noch möglich. Nach 48 Stunden waren alle Pferde

unterhalb der Nachweisgrenze.

Ergebnisse

- 55 -

Urinkonzentrationen von THG

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15 20 25 30 35

Zeit nach Applikation [h]

Kon

zent

ratio

n [n

g/m

l]

Pferd 1 ng/mlPferd 2 ng/mlPferd3 ng/mlPferd4 ng/mlPferd5 ng/mlPferd6 ng/mlPferd7 ng/mlPferd8 ng/mlPferd9 ng/mlPferd10 ng/ml

Abbildung 17: Konzentrationsverlauf THG im Urin der Pferde 1 bis 10 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM

Diskussion

- 56 -

4 DISKUSSION

Ziel dieser Arbeit war der Nachweis von Tetrahydrogestrinon nach einmaliger oraler

Gabe beim Pferd. Weiter sollte die Untersuchung Aufschluss über

pharmakokinetische und pharmakodynamische Parameter der Substanz in

Pferdeblut und -urin geben.

4.1 Eignung der Aufarbeitungs- und HPLC/MS/MS-Methode für den Nachweis von Tetrahydrogestrinon in Plasma und Urin

Vor Beginn dieser Studie stand im Institut für Biochemie der Deutschen

Sporthochschule Köln kein geeignetes Analyseverfahren zur quantitativen

Bestimmung von THG zur Verfügung. Es gab lediglich Erfahrungen zum qualitativen

Nachweis von THG, das in Pferdeurin zugegeben wurde. Da THG im Organismus

metabolisiert wird, war es notwendig die Methode an behandelten Pferden zu

überprüfen.Die in dieser Arbeit entwickelte Aufarbeitungsprozedur in Plasma und

Urin basiert auf einer Routinemethode zur Extraktion von Steroiden. Grundlage für

die Meßmethode von THG, war die Routinemeßmethode von THG aus dem

Humanbereich des Institutes für Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln.

Die Wiederfindungsraten von THG im Plasma und im Urin zeigen, dass die

Extraktionsprozeduren mit Verlusten verbunden ist. Die Ergebnisse der Validierung

belegen die Eignung der HPLC/MS/MS-Analysemethode für den Nachweis von THG.

Bei der Überprüfung der Selektivität konnten in Leermatrixproben keine Störpeaks zu

den Retentionszeiten der Analyten oder internen Standards ermittelt werden. Die

Linearität der Methode für THG wurde im Plasma über einen Konzentrationsbereich

von 2,5 bis 20 ng/ml überprüft. Für jede Kalibrationskurve konnte ein

Regressionskoeffizient von mehr als 0,98 eingehalten werden. Die Kriterien für

Richtigkeit und Präzision, eine Abweichung von 15 %, an der unteren Bestimmungs-

grenze von 20 %, nicht zu überschreiten, wurden an allen Messtagen, für alle

Substanzen erfüllt. Mit der angewandten Methode liegt die Nachweisgrenze für THG

im Plasma bei 1,5 ng/ml. Die Nachweisgrenze von THG im Urin beträgt bei der in der

Diskussion

- 57 -

Studie verwendeten Methode 15 ng/ml. Bisher liegen keine Vergleichsdaten zum

Nachweis von THG beim Tier vor. Die Stabilität von THG in den jeweiligen Matrices

wurde für den Zeitraum der Lagerung der Ausscheidungsproben bei identischen

Lagerbedingungen von –20°C überprüft. Die Stabilität der Plasmaproben wurde über

einen Zeitraum von 9 Wochen, die der Urinproben über 10 Wochen überprüft. Es

konnte gezeigt werden, dass THG in Plasma und Urin über diese Zeiträume stabil

und damit lagerfähig sind.

4.2 Pharmakokinetik von THG

Die Ermittlung der pharmakokinetischen Daten für THG im Plasma erfolgte an 10

Pferden. Die maximalen Konzentrationen wurden 1 h nach der Applikation

gemessen. Im Bezug auf den Zeitpunkt der Höchstkonzentration, zeigten sich

individuelle Schwankungen. Sie variierten von 30 bis 90 Minuten. Auch bei den

Höchstwerten gab es Schwankungen, die von 1,5 bis 4,7 ng/ml lagen.

Als Ursache für die Schwankungen der Höchstkonzentrationen könnte eine nicht

vollständige Aufnahme der Dosis vermutet werden. Dieses kann aufgrund der

Kontrolle des vollstandigen Abschluckens der tief oral eingebrachten Substanz aber

als unwahrscheinlich bewertet werden. Eine weitere Ursache kann in der

individuellen letzten Futteraufnahme liegen, da die Pferde freien Zugang zu Heu,

Stroh und Wasser hatten. Eine Kontrolle dieses Parameters war bei der

Gruppenhaltung nicht möglich.

Ein Nachweis von THG im Plasma war jedoch bei allen Pferden möglich. Der

Nachweis war bei 2 Pferden über 6 Stunden, bei 3 Pferden über 8 Stunden und bei

den restlichen 5 Pferden über 12 Stunden möglich.

Die Ermittlung der pharmakokinetischen Daten erfolgte anhand der Daten, die

oberhalb der Nachweisgrenze lagen. Hier war aufgrund der Datenlage nur eine

Berechnung im Ein-Kompartment-Modell möglich. Als Emiminationshalbwertszeit

Diskussion

- 58 -

wurde eine Zeit von durchschnittlich 1,9 Stunden errechnet. Die Clearence betrug im

Mittel 4,4 ml/kg Körpermasse.

Die Konzentrationen und die Ausscheidungszeiten von THG unterliegen starken

Schwankungen. So variieren die Höchstkonzentrationen zwischen 38 und 205 ng/ml.

Bei den Ausscheidungszeiten ist bei 8 Pferden bis 24 Stunden und bei 2 Pferden bis

36 Stunden ein Nachweis möglich. Der Zeitpunkt der Höchstkonzentration hingegen

lag bei 6 Stunden konstant. Die Konzentration von Pferd 9 war hier mit Abstand am

höchsten, obwohl die Konzentration bei diesem Pferd dieselbe war, wie bei allen

anderen. Entsprechend lag auch hier im Plasma die höchste Konzentration vor.

Die interindividuellen Unterschiede in der Ausscheidungszeit machen deutlich, dass

die Beurteilung des Ausscheidungsverhaltens einer Substanz anhand ihrer

Konzentration im Urin mit erheblichen Unsicherheiten verbunden ist. Hierfür ist vor

allem die unterschiedliche Harnproduktion der einzelnen Individuen verantwortlich zu

machen. Sie variiert aufgrund des Einflusses verschiedener physiologischer und

exogener Faktoren erheblich. Dazu gehören die Kapazität der Nierenleistung, das

Nahrungsangebot und die Wasseraufnahme, körperliche Belastung, Haltungs-

bedingungen und auch der Gesundheitszustand der Pferde (SAMS, 1992; DYKE u.

SAMS, 1994B). Zusätzlich können Änderungen des pH-Wertes in den sauren oder

basischen Bereich die Ausscheidung von Arzneimitteln erheblich beeinflussen (PICK,

1993). Alternativ wurde überlegt, den gesamten Urin aller Pferde über die Dauer der

Probennahme mittels Urinauffangschürzen zu sammeln. Aufgrund der schlechten

praktischen Durchführbarkeit und der erhöhten Belastung für die Tiere sowie die

Einschränkung der pharmakodynamischen Untersuchungen war auf diesen Ansatz

jedoch verzichtet worden.

TOBIN et al. (1982) berechnet die im Organismus befindliche Zahl an

Wirkstoffmolekülen und beschreibt, dass Substanzen allgemein über einen Zeitraum

von circa 66 Halbwertszeiten aus dem Organismus ausgeschieden werden, bevor

das letzte Molekül eliminiert ist. Im vorliegenden Fall entspräch das einer Dauer von

etwa 125 Stunden. Ein Nachweis über diesem Zeitraum ist nicht möglich, da bereits

zuvor die Nachweisgrenze unterschritten wird. Es sind also noch Moleküle im Körper,

nachdem ein Nachweis nicht mehr möglich ist.

Diskussion

- 59 -

Für Urin konnten die besten Ergebnisse nach der Aufarbeitung mit Hydrolyse und

Solvolyse erzielt werden. Hierbei stellte sich die Extraktion der Steroide mittels TBM-

Ether als die geeignete Methode heraus. Sie erhielt den Vorzug gegenüber

N-Pentan.

4.3 Bewertung der Ergebnisse

Eine illegale Verwendung von THG als Dopingmittel ist aufgrund der einfachen

Herstellung und der Verwendung dieser Substanz im Humanbereich durchaus

denkbar. Mit dieser Arbeit wurde eine geeignete Analysemethode für den Nachweis

von THG in Plasma und Urin entwickelt und validiert. Die Etablierung dieser Methode

in die internationale Routinediagnostik kann zum vereinheitlichten Nachweis von

THG in Dopingproben genutzt werden.

Bei der hier durchgeführten Studie sind die Nachweiszeiten als sehr kurz

einzustufen. So war bei keinem der Pferde ein Urinnachweis von THG nach 2 Tagen

möglich. Problematisch an dieser Aussage ist, dass aufgrund der relativ zur

Gesamtpopulation noch immer geringen Anzahl von Versuchstieren, die ermittelten

Daten nicht auf alle Pferde übertragen werden können. Es ist mit individuellen

Schwankungen zu rechnen, die die dieser Studie noch deutlich übertreffen können.

Die Dosierung von THG ist in dieser Studie der des Gestrinons angelehnt. Es ist aber

auch eine deutlich höhere Konzentration vorstellbar, da im Dopingbereich die

therapeutische Dosis um bis zum 12-fachen überschritten wird (DE MARRES, 1996).

Hier muss mit längeren Ausscheidungszeiten gerechnet werden. Weiter gibt es keine

Daten zur Dosierung von THG.

Da es bis zu diesem Zeitpunkt nur zwei Studien über die Wirkung von THG gibt, sind

Folgestudien zur Wirkung am Pferd hierzu anzuraten. Hier bleibt vor allem die

anabole Wirkung beim Pferd zu überprüfen. Nur so kann ein besserer Eindruck über

die leistungssteigernde Wirkung von THG bekommen werden. Es gibt ebenfalls

keine Erfahrungen über Nebenwirkungen und Langzeitschäden.

Genauso regen diese Ergebnisse dazu an, auch im Pferdesport über

Trainingskontrollen nachzudenken. Da so kurze Nachweiszeiten es ermöglichen, bis

kurz vor einem Wettkampf ein Präparat zu verabreichen, dem zum

Diskussion

- 60 -

Wettkampfzeitpunkt sehr wohl noch eine Wirkung zugerechnet werden muss, die

Substanz selber aber nicht mehr nachweisbar ist.

Da THG keine Zulassung als Medikament besitzt, sondern gezielt zu

Dopingzwecken synthetesiert wird, ist jeder positive Befund als Doping zu bewerten

und eine verbotene Medikation ist auszuschließen. Dies ist unabhängig von der

nachgewiesenen Konzentration.

Zusammenfassung

- 61 -

5 ZUSAMMENFASSUNG

Markus Gerlach (2005):

Untersuchung zur Pharmakokinetik des Stoffes Tetrahydrogestrinon hinsichtlich der

Dopingrelevanz beim Pferd

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer geeigneten

Analysemethode für THG in Pferdeplasma und –urinproben. Basierend hierauf sollte

das pharmakokinetische Verhalten von THG im Pferd untersucht werden.

Grundlage für die Entwicklung der Methode waren Vorarbeiten des Institut für

Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln. Hier wurde THG in mit THG

versetztem Blankurin nachgewiesen. Durch in einem Vorversuch gewonnene Proben

wurde die Routinemethode zum Nachweis speziell modifiziert.

Sowohl im Vor- als auch im Hauptversuch wurde Pferden THG in einer Dosierung

von 0,025 mg/kg KM einmalig oral verabreicht. Der Nachweis von THG im Plasma

erfolgte über eine Festphasenextraktion. Für die Detektion im Urin wurde eine

Aufarbeitung mit Solvolyse und Hydrolyse etabliert. Nach einer Einengung und

Anlösen der Proben in Methanol wurden die gewonnenen Proben mittels einer

HPLC/MS/MS-Methode gemessen und ausgewertet. Als interner Standard diente

Gestrinon.

Die Validierung der Methode umfasste die Parameter Selektivität und Spezifität,

Linearität, Richtigkeit, Präzision, Stabilität und Wiederfindung. Die

Bestimmungsgrenze lag im Plasma bei 1,5 ng/ml und im Urin bei 15 ng/ml.

Maximale Konzentrationen von THG im Plasma wurden durchschnittlich nach 57

Minuten a. ermittelt und lagen zwischen 1,5 und 4,7 ng/ml. THG erreichte seine

höchsten Konzentrationen von 38 bis 205 ng/ml im Urin 6 Stunden nach der

Applikation. Die Nachweisgrenze wurde im Plasma nach 12 Stunden, im Urin nach

36 Stunden unterschritten.

Zusammenfassung

- 62 -

Aufgrund der relativ zur Gasamtpopulation geringen Anzahl von Versuchstieren und

beachtenswerter interindividueller Variabilität ist keine auf die Gesamtpopulation

übertragbaren Aussage zu Ausscheidungszeiten zu treffen. Jeder Nachweis von

THG muss daher als positiver Dopingbefund betrachtet werden.

Aufgrund der kurzen Ausscheidungszeiten sind hier Trainingskontrollen anzuraten.

Summary

- 63 -

6 SUMMARY

Markus Gerlach (2005):

Investigation of pharmacocinetic mechanisms of tetrahydrogestrinon with respect to

ist relevance in horse-doping

The aim of this study was to develop and validate a suitabe method for the analysis

of THG in equine plasma and urinesamples. Based on this facts the pharmacocinetic

and pharmacodynamic parameters are examintanted.

The analytical method was based upon a study of the Institute of Biochemistry at the

Deutsche Sporthochschule in Cologne, which were specially modified for THG using

samples collected in a preliminary study. The horses in the preliminary experiment as

well as in the main experiment received THG in a dose of 0,025 mg/kg body weight

oral. The detection of detomidine in plasma was performed using a HPLC/MS/MS-

method after extraction. The preparartion includes an hydrolysis and solvolysis.

Following evaporation of the liquid volume these samples were prepared for analysis

in the HPLC/MS/MS. Gestrinon were used as internal standards.

The validation of the analytical method was performed on the parameters selectivity

and specitivity, linearity, accuracy, precision, stability and recovery. The limit of

quantification was 1,5 ng/ml in plasma, 15 ng/ml for THG in urin samples.

Maximum concentrations of THG in plasma were detected 57 minutes p. a. within the

range of 1,5 and 4,7 ng/ml plasma. THG in plasma samples was detectable for only

12 hours p. a..

Maximum concentrations of THG in urin were in a range between 38 and 208 ng/ml.

The maximum contratrations were detected after 6 hours. The concentration of THG

were below the limit of detection after 36 hours.

Due to the fact that every animal experiment has to compromise in the number of

animals included, therefore representing only a small part of the population, and with

Summary

- 64 -

regards to notable individual variation, no defined statement can be made for general

excretion times. Every detection of THG must be counted as a positive doping result

and should be punished according to the law.

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- 65 -

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Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.

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Anhang

- 73 -

8 ANHANG

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 10 20 30 40 50 60

Zeit in Std

Kon

z in

ng/

ml

Abbildung 17: Konzentrationsverlauf THG im Plasma des Pferdes 1 nach einmaliger oraler Gabe von 0,025 mg/kg KM

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Zeit in Stunden

Kon

z in

ng/

ml


Anhang

- 74 -

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60

Zeit in Std

Kon

z in

ng/

ml


0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40 50 60

Zeit in Std

Kon

z in

ng/

ml


Anhang

- 75 -

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 10 20 30 40 50 60

Zeit in tTd.

Kon

z. in

ng/

ml


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 2 4 6 8 10 12

Zeit in Std

Kon

z in

ng/

ml


Anhang

- 76 -

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 10 20 30 40 50 60

Zeit in Std

Kon

z in

ng/

ml


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60

Zeit in Std

Kon

z in

ng/

ml


Anhang

- 77 -

0

1

2

3

4

5

6

0 10 20 30 40 50 60

Zeit in Std

Kon

z in

ng/

ml


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 10 20 30 40 50 60

Zeit in Std

Kon

z in

ng/

ml


Anhang

- 78 -

Pferd Entnahmezeitpunkt in Stunden Kreatininwerte in Umol/l

0 122 44 133

1

144 113 0 117 44 114

2

144 117 0 103 44 111

3

144 113 0 128 44 133

4

144 127 0 128 44 125

5

144 141 0 100 44 100

6

144 128 0 127 44 111

7

144 132 0 117 44 112

8

144 125 0 124 44 128

9

144 121 0 124 44 111

10

144 122 Tabelle 17: Kreatininwerte der Pferde 1-10 nach einmaliger oraler Dosis von 0,025 mg/kg KM THG zum Zeitpunkt 0; 44; 144 Stunden

Danksagung

- 79 -

DANKSAGUNG

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Manfred Kietzmann für das Überlassen

des Themas, die stete Unterstützung und die außerordentlich gute Betreuung zu

jedem Zeitpunkt.

Herzlich bedanken möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Institutes für

Biochemie der Deutschen Sporthochschule Köln, wo insbesondere Herr Prof. Dr. W.

Schänzer, Dr. Marc Machnik, Dr. Mario Thevis, Herrn Opfermann und Sven Guddert

durch ihren fachlichen Beistand und die freundliche Aufnahme und Unterstützung im

Labor zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Mein Dank gilt weiterhin der Deutschen Reiterlichen Vereinigung e. V. in Warendorf,

im Besonderen Herrn Dr. Michael Düe für die Organisation der Versuchspferde und

die Finanzierung.

Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Dr. Franz Ellendorff der FAL Mariensee für die

freundliche und bereitwillige Überlassung der Versuchspferde und Einrichtungen der

FAL, sowie Herrn Jonny Meyer für seine unersetzliche Hilfe mit den Pferden und

Allem was dazugehörte.

Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern und meinen Großeltern, durch die ich große

Unterstützung in mein Studium, dieser Arbeit und unzählige andere Dinge in meinem

Leben erhalten habe. Dies alles wäre ohne Euch nicht möglich gewesen.

Für die liebevolle und moralische Unterstützung und besonders für die Tatsache,

dass Du mit mir in dieser stressigen Phase meines Lebens eine so tolle Partnerin

bist, möchte ich mich besonders herzlich bei Tanja bedanken.

Schließlich danke ich auch allen Freunden, Bekannten und Verwandten, die immer

an meiner Seite waren, auch wenn ich zeitlich sehr eingespannt war. An dieser Stelle

danke ich auch Inga für die gute und zuverlässige Zusammenarbeit.

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