Untersuchung zweier ENU-induzierter mutanter Mauslinien ... · PDF file GMC „German...

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Transcript of Untersuchung zweier ENU-induzierter mutanter Mauslinien ... · PDF file GMC „German...

  • Aus dem Department für Veterinärwissenschaften

    der Tierärztlichen Fakultät

    der Ludwig-Maximilians-Universität München

    Arbeit angefertigt unter der Leitung von

    Univ.-Prof. Dr. Bernhard Aigner

    Untersuchung

    zweier ENU-induzierter mutanter Mauslinien

    mit Fokus auf eine Linie

    mit einer Punktmutation im Uromodulin-Gen

    Inaugural-Dissertation

    zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde

    der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität

    München

    von

    Petra Christine Prückl

    aus

    Ergoldsbach

    München 2011

  • Gedruckt mit Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät

    der Ludwig-Maximilians-Universität München

    Dekan: Univ.-Prof. Dr. Braun

    Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Aigner

    Korreferent: Priv.-Doz. Dr. Scholz

    Tag der Promotion: 12. Februar 2011

  • Meinen Eltern

    und meiner Oma

  • Inhaltsverzeichnis I

    INHALTSVERZEICHNIS

    I. EINLEITUNG ....................................................................................................... 1

    II. LITERATURÜBERSICHT .................................................................................. 2

    1. Strategien der Mausmutagenese .......................................................................... 2

    2. ENU-Mausmutagenese .......................................................................................... 3

    2.1. N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) als Mutagen ............................................................. 3

    2.2. Phänotyp-basierte ENU-Mausmutageneseprojekte ................................................. 3

    2.3. Ablauf von phänotyp-basierten ENU-Mutageneseprojekten .................................. 4

    2.3.1. Mutagenese .............................................................................................................. 4

    2.3.2. Phänotypuntersuchung ............................................................................................ 5

    2.3.3. Etablierung von mutanten Linien ............................................................................ 6

    2.3.4. Genotypuntersuchung .............................................................................................. 6

    3. ENU-induzierte Mausmodelle mit veränderter Nierenfunktion ....................... 7

    4. Uromodulin (Umod; Tamm-Horsfall Protein, THP) ....................................... 12

    4.1. Aufbau und Funktion der Niere ............................................................................. 12

    4.2. Gen, Expression und Struktur von UMOD ........................................................... 13

    4.3. Funktion des dicken aufsteigenden Schenkels der Henleschen Schleife (TALH) 15

    4.4. Eigenschaften und klinische Relevanz von Uromodulin ...................................... 16

    4.5. Uromodulin-assoziierte Nierenerkrankungen beim Menschen ............................. 18

    4.6. Uromodulin-mutante Mausmodelle ...................................................................... 20

    4.6.1. Knockout-Mäuse ................................................................................................... 20

    4.6.2. Umod A227T

    mutante Mauslinie ............................................................................... 23

    4.6.3. Transgene Mauslinie mit humanem mutantem UMOD (C148W) ........................ 26

    4.6.4. Tg UmodC147W

    transgene Mauslinie .......................................................................... 26

    III. MATERIAL UND METHODEN ....................................................................... 28

    1. Tiere und Tierzucht ............................................................................................. 28

    1.1. Tierhaltung ............................................................................................................ 28

    1.2. Tierversuch ............................................................................................................ 28

    1.3. Versuchstiere ......................................................................................................... 28

    1.4. Erhaltungszucht ..................................................................................................... 29

    1.5. Zucht für die Kopplungsanalyse ............................................................................ 29

    1.6. Zucht homozygot mutanter F2-Hybridtiere der Linie SMA002 ........................... 30

  • Inhaltsverzeichnis II

    1.7. Zucht eines kongenen Stammes für die Linie SMA002 ........................................ 31

    2. Methoden .............................................................................................................. 31

    2.1. Blut ........................................................................................................................ 31

    2.2. DNA ...................................................................................................................... 32

    2.3. RNA und cDNA-Synthese .................................................................................... 33

    2.4. PCR, RT-PCR und „Cycle-Sequencing”-Verfahren ............................................. 34

    2.5. Gelelektrophorese und Sequenzanalyse ................................................................ 38

    2.5.1. Agarosegelelektrophorese ..................................................................................... 38

    2.5.2. Sequenzanalyse von DNA-Fragmenten ................................................................ 38

    3. Kopplungsanalyse ................................................................................................ 38

    3.1. Grobkartierung der Linie HST001 ........................................................................ 39

    3.2. Feinkartierung der Linien HST001 und SMA002 ................................................. 40

    3.3. Untersuchung zum Auftreten von homozygoten Mutanten in der Linie

    SMA002 ................................................................................................................ 42

    4. Suche nach der ursächlichen Mutation ............................................................. 42

    4.1. HST001 ................................................................................................................. 42

    4.1.1. Kandidatengen ....................................................................................................... 42

    4.1.2. Sequenzanalyse ..................................................................................................... 42

    4.1.3. Allelspezifische PCR zur Genotypisierung ........................................................... 43

    4.2. SMA002 ................................................................................................................ 43

    4.2.1. Kandidatengene ..................................................................................................... 43

    4.2.2. Sequenzanalyse ..................................................................................................... 44

    4.2.2.1. Ntrk2 ...................................................................................................................... 44

    4.2.2.2. Agtpbp1Agt ........................................................................................................... 44

    5. Phänotypuntersuchung der Mauslinie HST001 ............................................... 45

    5.1. Klinisch-chemische Blutuntersuchung .................................................................. 46

    5.2. Hämatologie .......................................................................................................... 46

    5.3. Urin- und Nierenfunktionsuntersuchung ............................................................... 46

    5.4. Westernblot von Urinproben ................................................................................. 47

    5.5. Morphologische Untersuchung ............................................................................. 47

    5.6. Vergleich der Körpergewichtsentwicklung von Tieren aus Anpaarungen von

    heterozygoten Mutanten ........................................................................................ 48

    5.7. Weitere phänotypische Untersuchungen ............................................................... 48

  • Inhaltsverzeichnis III

    6. Statistik ................................................................................................................. 48

    IV. ERGEBNISSE ..................................................................................................... 49

    1. Mauslinie HST001 ............................................................................................... 49

    1.1. Ausgangspunkt der Arbeit ..................................................................................... 49

    1.2. Identifikation der ursächlichen Mutation .............................................................. 50

    1.2.1. Grobkartierung ...................................................................................................... 50

    1.2.2. Feinkartierung .................................