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UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF Institut für Neuropathologie Direktor: Prof. Dr. med. Markus Glatzel Untersuchungen zum Epidermal Growth Factor Receptor – Status in Ependymomen: Vergleich von immunhistochemischen Färbungen und Floureszenz-in-situ-Hybridisierung Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg. vorgelegt von: Larissa Kolevatova aus Berdjansk/Ukraine Hamburg 2011

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UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF

Institut für Neuropathologie

Direktor: Prof. Dr. med. Markus Glatzel

Untersuchungen zum Epidermal Growth Factor Receptor – Status

in Ependymomen: Vergleich von immunhistochemischen

Färbungen und Floureszenz-in-situ-Hybridisierung

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.

vorgelegt von:

Larissa Kolevatova

aus Berdjansk/Ukraine

Hamburg 2011

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Angenommen von der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am: 13.09.2011 Veröffentlicht mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg. Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. M. Glatzel Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in: Prof. Dr. G. Sauter Prüfungsausschuss, dritte/r Gutachter/in: PD Dr. G. Thomalla

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INHALTSVERZEICHNIS

1 FRAGESTELLUNG................................................................................................... 1 4

2 EINLEITUNG............................................................................................................ 2

2.1 Grundlagen zu Ependymomen ............................................................................. 2

2.2 Immunhistochemische Routinediagnostik............................................................. 3

2.3 Genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen...................................................... 4

2.4 Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor .............................................................. 4

3 MATERIAL UND METHODEN .................................................................................. 6

3.1 Tumorkollektiv....................................................................................................... 6

3.2 Tissue-Microarray-Herstellung .............................................................................. 6

3.3 Immunhistochemische Färbungen ........................................................................ 7

3.3.1 EGFR......................................................................................................... 7

3.3.2 Mib-1.......................................................................................................... 8

3.3.3 p53............................................................................................................. 9

3.4 Floureszenz-in-situ-Hybridisierung........................................................................ 9

3.5 Statistische Analyse............................................................................................ 10

3.6 Isolierung von DNA und RNA.............................................................................. 11

3.7 EGFR-Mutationsanalyse..................................................................................... 12

4 ERGEBNISSE ........................................................................................................ 14

4.1 Demographische Charakteristik der Kohorte ...................................................... 14

4.2 Kontrolle des TMA mittels Mib-1 und p53 ........................................................... 15

4.3 Expression von EGFR......................................................................................... 16

4.4 EGFR-Genstatus-Analyse................................................................................... 16

4.5 Vergleich von immunhistochemischer EGFR-Expression und FISH................... 19

4.6 Nachweis einer EGFR-Mutation.......................................................................... 20

5 DISKUSSION ......................................................................................................... 21

6 ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................... 24

7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................................................ 25

8 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................... 27

9 DANKSAGUNG...................................................................................................... 31

10 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG....................................................................... 32

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1 FRAGESTELLUNG Ependymome sind vom Ependym ausgehende gliale Neoplasien ektodermalen

Ursprungs. Pathogenese und prognostische Faktoren von Ependymomen sind noch

nicht ausreichend geklärt. Man hat herausgefunden, dass der epidermale

Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) eine entscheidende Rolle in der Progression von

Gliomen, insbesondere Glioblastomen, spielt. (Sjostrom et al. 2010) In Anlehnung

dazu wollten wir den EGFR-Status bei Ependymomen untersuchen. Wir wollten

herausfinden, ob Ependymome EGFR vermehrt exprimieren, und welche Methode

am besten geeignet ist, den EGFR-Status zu ermitteln. Bis anhin wird er durch

semiquantitative Messung von immunhistochemischen Färbungen bestimmt. Diese

Methode ist zwar kostengünstig, jedoch auch anfällig für Störfaktoren. Deshalb

wollen wir zusätzlich zur immunhistochemischen Analyse auch den Genstatus des

EGFR-Gens mittels Floureszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) untersuchen. Für In-

situ-Analysen ist ein Tissue-Microarray (TMA) sehr nützlich, weil damit alle Proben

simultan mit einem Reagenz untersucht werden können. Damit bringt der TMA einen

hohen Grad an Standardisierung auf, die eine wichtige Rolle in der Analyse der

Proteinexpression oder des Genstatus spielt. Ferner wollten wir untersuchen, ob eine

EGFR-Expression mit einer Mutation im EGFR-Gen einhergeht.

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2 EINLEITUNG

2.1 Grundlagen zu Ependymomen Ependymome sind neuroektodermale, vom Ependym der Ventrikel, des

Zentralkanals des Rückenmarks und Filum terminale ausgehende Tumoren.

(Massimino et al. 2009) Ependymome machen rund 2-9 % aller neuroepithelialer

Tumoren aus. Im Rückenmark lokalisierte Ependymome stellen die häufigste

neuroepitheliale Neoplasie der Erwachsenen dar. Spinale Ependymome haben eine

günstige Prognose. (Mendrzyk et al. 2006) Ependymome werden nach der

Weltgesundheitsorganisation (WHO) in drei Grade unterteilt. Diese Klassifikation

beruht auf der Annahme einer Entdifferenzierung, deren einzelne Stufen den

Malignitätsgraden entsprechen. (Louis et al. 2007) WHO-Grad I Ependymome sind

gutartig und langsam wachsend. Sie kommen überwiegend im Conus-Cauda-Filum-

terminale–Bereich vor. WHO-Grad II Ependymome sind langsam wachsende,

differenzierte und gut begrenzte Tumore im Bereich der inneren Hirnkammern oder

des Rückenmarks. Typisches histologisches Merkmal sind perivaskuläre

Pseudorosetten. WHO-Grad III Ependymome sind schnell wachsend mit deutlichen

Zeichen der Malignität: erhöhte Zelldichte und Mitoserate, Kernpolymorphie,

invasives Wachstum, Gefässproliferation, Nekrosen. Histopathologisch unterscheidet

man myxopapilläre Ependymome und Subependymome (beide WHO-Grad I),

zelluläre, papilläre, klarzellige, tanyzytische (WHO-Grad II) und anaplastische

Ependymome (WHO-Grad III). (Louis et al. 2007) Mikroskopisch imponiert ein

heterogenes Bild mit dem Kriterium der perivaskulären Pseudorosettenbildung, die

jedoch in manchen Unterformen fehlen kann. (Burger et al. 2002) Daneben gehören

zum „klassischen Erscheinungsbild“ auch die echten Rosetten mit Orientierung der

Tumorzellen um ein virtuelles Zentrum. (Burger et al. 2002)

Klinisch stehen Hirndrucksymptome durch Liquorabflussstörungen im Vordergrund.

(Kleihues et al. 2004) Operation und Bestrahlung sind die wesentlichen

therapeutischen Optionen. (Timmermann et al. 2000) Da eine vollständige Resektion

insbesondere im IV. Ventrikel selten gelingt, ist die Prognose insgesamt ungünstig.

(Kleihues et al. 2004) Prognostische Faktoren wurden in Studien untersucht und

beschränken sich auf den WHO Grad und das Ausmass der chirurgischen

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Resektion. (Rodriguez et al. 2009) Somit besteht Bedarf nach neuen

Prognosefaktoren und therapeutischen Optionen. (Green et al. 2009)

2.2 Immunhistochemische Routinediagnostik

Mit steigender Entdifferenzierung verlieren Ependymome ihr „klassisches“

Erscheinungsbild, sodass die Diagnose mittels immunhistochemischer Marker

bestätigt werden muss. (Burger et al. 2002) Zum Einsatz kommen das epitheliale

Membranantigen (EMA), welches an der Zelloberfläche der meisten epithelialen

Zellen exprimiert wird, und saures Gliafaserprotein (GFAP), ein Intermediärfilament,

welches vor allem in Astrozyten vorkommt. Dem Lumen zugewandte Zelloberflächen

der echten Rosetten stellen sich EMA-positiv dar. (Burger et al. 2002) GFAP-positiv

sind die Zellfortsätze, die die Tumorzellen der perivaskulären Pseudorosetten

umgeben. (Burger et al. 2002)

Zur Einschätzung der Zellproliferation bestimmt man die Expression von Ki-67, ein

nukleäres Protein, welches in Phasen G1 (Gap), S (Synthese), G2 (Gap) und M

(Mitose) des Zellzyklus exprimiert wird. Bei teilungsfähigen Zellen wird der Eintritt in

den Zellzyklus (G1-Phase) durch äussere Faktoren induziert, anschliessend kommt

es zur Verdoppelung der DNA (S-Phase) und Vorbereitung (G2-Phase) auf die

Mitose (M-Phase). Damit stellt Ki-67 einen Marker für Zellproliferation dar, die

Detektion erfolgt mithilfe des monoklonalen Antikörpers Mib-1. Zur besseren

Vergleichbarkeit wird der Mib-1-Proliferationsindex (Mib-1 LI) bestimmt. Er variiert in

unterschiedlichen Arealen innerhalb eines Tumors. (Burger et al. 2002)

Üblicherweise zeigen WHO-Grad III Ependymome einen höheren Mib-1 LI als WHO-

Grad II Ependymome. (Burger et al. 2002)

Der Zellzyklus wird durch zahlreiche Faktoren reguliert, hier spielt der

Tumorsuppressor p53 eine Schlüsselrolle. Seine Inaktivierung oder Mutation im p53-

Gen können zum unkontrollierten Wachstum und Tumorentwicklung führen. (Böcker

et al. 2004) Immunreaktivität ist sehr wahrscheinlich anzutreffen in WHO-Grad III

Ependymomen. (Burger et al. 2002)

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2.3 Genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen

Zahlreiche genetische Auffälligkeiten bei Ependymomen konnten mittels

Hybridisierungsmethoden aufgedeckt werden. Eine Studie untersuchte 26

Ependymome und fand eine 22q–Monosomie in 36 % der Fälle. Ferner fanden sie

amplifiziertes N-MYC in zwei spinalen Ependymomen. (Scheil et al. 2001) Bei MYC

handelt es sich um eine Familie der Transkriptionsfaktoren, welche die mRNA-

Synthese regulieren. Desweiteren fand eine Gruppe eine Deletion der

Chromosomen 17 und 22 bei Ependymomen. Dieser wurde eine entscheidende

Rolle in der Pathogenese der Ependymome zugeschrieben, nämlich in der

Inaktivierung der Tumorsuppressorgene. (Kramer et al. 1998) Ein wichtiger Vertreter

der Tumorsuppressorgene ist TP53, welches auf dem Chromosomenort 17p13

lokalisiert ist und für den Transkriptionsfaktor p53 kodiert, welches bei irreparablen

DNA-Schäden die Apoptose induziert. (Böcker et al. 2004) Bei spinalen

Ependymomen konnte häufig eine Mutation im Neurofibromatose-Typ-2-Gen (NF2)

beobachtet werden. (Kleihues et al. 2004) Eine andere Studie untersuchte die

Genamplifikation in Ependymomen. Sie fand eine 0,34 Mb grosse Region am

Chromosomenort 7p11.2, welcher den Genlocus von EGFR beinhaltet, hoch

amplifiziert in einem und diskret amplifiziert in 24 von 68 Ependymomen. (Mendrzyk

et al. 2006) Eine andere Studie untersuchte vier Ependymome mittels CISH

(chromogenic in-situ hybridization) und konnte keine EGFR-Amplifikation feststellen.

(Marquez et al. 2004)

2.4 Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor EGFR ist ein transmembraner

Tyrosinkinase-Rezeptor für verschiedene Wachstumsfaktoren. Die Bindung eines

Liganden an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors führt zu seiner Dimerisierung.

Dadurch kommt es zur Konformationsänderung des intrazellulären Teilabschnitts und

Aktivierung der Tyrosinkinase. Es kommt zur Phosphorylierung von intrazellulären

Substratproteinen, die eine intrazelluläre Signalkaskade (Ras, Raf, MAP-Kinase) in

Gang setzen. (Zatloukal et al. 2004) Das Ergebnis ist Zellwachstum und Zellteilung.

Daraus ist ersichtlich, dass EGFR eine ausschlaggebende Rolle bei der

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Krebsentstehung spielt. (Girard et al. 2009) Amplifikationen im EGFR-Gen auf

Chromosom 7 oder Mutationen der für die Tyrosinkinase kodierenden Domäne sind

die Ursachen für eine gesteigerte Signalübertragung. (Ladanyi et al 2008) Die am

häufigsten bei Gliomen beschriebene EGFR-Alteration ist die Deletion der Exons 2-7,

die ein verändertes EGFR-Protein (EGFR variant III, EGFRvIII) zur Folge hat.

(Jeuken et al. 2009) Die Signalübertragung durch Rezeptoren mit Tyrosinkinase

kann auch pharmakologisch beeinflusst werden. Eine Therapie mit Tyrosinkinase-

Inhibitoren konnte erfolgreich bei kolorektalen und Lungenkarzinomen eingesetzt

werden. (Halatsch et al. 2006, Francoual et al. 2006) Deshalb wird die Identifikation

von EGFR in Tumorzellen eine zunehmende Rolle in der neuropathologischen

Diagnostik spielen.

Die Korrelation zwischen EGFR-Expression aus immunhistochemischer

Untersuchung und EGFR-Genstatus ermittelt mit FISH wurde bisher noch nicht

systematisch untersucht bei Epedymomen. Eine Gruppe fand eine diskrete

Amplifikation in der Chromosomenregion 7p11.2, die den Genlokus für EGFR

beinhaltet, in 24 von 68 Ependymomen und eine hohe Amplifikation bei einem

Ependymom. (Mendrzyk et al. 2006)

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3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Tumorkollektiv

Es wurden 55 Tumorproben untersucht, die aus dem Archiv des Instituts für

Neuropathologie stammen. Das Gewebe stammt von Biopsien, die zwischen den

Jahren 1991 und 2007 am Institut für Neuropathologie untersucht wurden. Alle

Diagnosen entsprechend den Kriterien der WHO-Klassifikation wurden gemeinsam

mit einem Neuropathologen bestätigt. (Louis et al. 2004) Davon entsprachen 40

Tumorproben dem WHO-Grad II Ependymom und 15 wurden als WHO-Grad III

Ependymome klassifiziert. Für alle Analysen wurden die Patientendaten

anonymisiert.

3.2 Tissue-Microarray-Herstellung Die von Forschern des Instituts für Pathologie in Basel und des National Human

Genome Research Institutes in Bethesda, USA (Olli Kallioniemi, Juha Kononen,

Guido Sauter) entwickelte Gewebearray-Technik macht es erstmals möglich, eine

standardisierte Untersuchung sämtlicher Tumorproben unter Verwendung eines

Protokolls und gleicher Antikörper durchzuführen. Mit diesem Verfahren kann eine

optimale Vergleichbarkeit der Daten erzielt werden. Für unsere Studie erfolgte die

TMA-Herstellung anhand des bereits veröffentlichten Protokolls. (Dancau et al. 2010)

Auf Basis der mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbten Schnitte wurde die den Tumor

am besten repräsentierende Region ausgewählt. Das entsprechende Areal wurde

auf dem zugehörigen Paraffinblock markiert. Ein Gewebezylinder von 0,6 mm

Durchmesser wurde aus der zuvor markierten Region ausgestanzt und in einem

Empfängerblock aus Paraffin platziert. Zuvor wurden dafür im Empfängerblock

Löcher in einem Abstand von 0,8 mm vorgefertigt. Nach Komplettierung des

Tumorarrays wurden 3 µm dünne Schnitte mit dem Mikrotom für anstehende In-situ-

Analysen angefertigt.

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3.3 Immunhistochemische Färbungen

Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurde eine standardisierte indirekte

Immunperoxidase-Methode verwendet. Dabei bindet ein unkonjugierter Primär-

Antikörper an das Antigen. Anschliessend wird ein zweiter enzymgekoppelter

Antikörper, der gegen das Fc-Fragment des Primär-Antikörpers gerichtet ist,

aufgetragen. Es folgt die Substrat-Chromogen-Reaktion. Ein Enzym wird eingesetzt,

das farblose Vorstufen von Chromogen in farbige Enzymprodukte umwandelt. Als

Enzym wird eine Meerrettich-Peroxidase (HRP), als Chromogen 3.3’-

Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) verwendet. Die endogene Peroxidase

wurde durch Inkubation des TMA in 3%igem Wasserstoffperoxid inaktiviert. Die

Kernfärbung erfolgte mit Hämalaun mit anschliessender Spülung unter Wasser. Bei

denen im Folgenden erwähnten Puffern handelte es sich um TBS- und TRIS-Puffer.

3.3.1 EGFR Für die immunhistochemische Färbung von EGFR wurden zwei verschiedene

Antikörper verwendet: EGFRpharmDX-Kit (Verdünnung 1:200, Dako, Glostrup,

Dänemark) und clone 31G7 (Verdünnung 1:300, Zymed Laboratories, San

Francisco, CA, USA). Die Vorgehensweise entsprach dem Protokoll der Hersteller.

Nach EGFRpharmDX-Kit-Vorgaben wurde der Objektträger zur Entparaffinierung für

5 Minuten (min) in einem Xylolbad inkubiert, die überschüssige Flüssigkeit abgeklopft

und für 3 min in reines Ethanol und danach für dieselbe Zeitdauer in 95%igen

Ethanol getaucht. Anschliessend erfolgte eine Rehydrierung in Wasser für 5 min. Der

TMA wurde mit Proteiniase K für 5 min vorbehandelt und anschliessend für 5 min im

Wasserbad gespült. Danach wurde der TMA ausreichend mit Antikörper bedeckt und

in der Feuchtigkeitskammer für 30 min inkubiert. Anschliessend erfolgte eine

Spülung und Waschung im Pufferbad für 5 min. Der sekundäre Antikörper wurde

dazu gegeben und der TMA erneut für 30 min in der Feuchigkeitskammer inkubiert

und im Anschluss wie bereits erwähnt gespült. Danach wurde DAB für eine

Einwirkzeit von 10 min dazu gegeben. Im Anschluss wurde der TMA wenige Minuten

im Wasserbad gespült und mit Deckgläschen versehen.

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Für den Färbevorgang mit dem Antikörper von Zymed wurde der TMA zur

Entparaffinierung zuerst für 1 Stunde (h) in Xylol und anschliessend in absteigender

Alkoholreihe (100%–, 96%–, 80%iger Ethanol) bis Aqua dest. getaucht. Daran

schloss sich eine fünfminütige Pufferwaschung und Vorbehandlung mit dem Autoklav

für 5 min an. Nach wiederholter Waschung ließ man den TMA für 10 min in 3%igem

Wasserstoffperoxid inkubieren. Im Anschluss wurde der TMA erneut mit Puffer

gespült. Schliesslich wurde der primäre Antikörper dazu gegeben, den man für 2 h

bei 30 °C einwirken ließ. Danach wurde der TMA für 5 min im Puffer gewaschen und

anschliessend mit der Polymer-HRP für 30 min bei 30 °C inkubiert. Es schloss sich

zunächst eine zweimalige Spülung für je 5 min mit Puffer und dann mit Wasser an,

bevor das Chromogen hinzu gegeben wurde. Der TMA wurde mit DAB für 10 min

inkubiert und anschliessend mit Wasser und in aufsteigender Alkoholreihe (80%–,

96%–, 100%iger Ethanol) bis Xylol gespült, bevor er mit einem Deckgläschen

versorgt wurde.

Die Auswertung erfolgte semiquantitativ entsprechend eines weit gebräuchlichen

vierstufigen Scores mit (0): keine Membranfärbung; (1+): schwache, unvollständige

Membranfärbung; (2+): schwache bis mäßige vollständige Membranfärbung in

> 10 % der Tumorzellen; (3+): starke vollständige Membranfärbung in > 10 % der

Tumorzellen. Ein Score von 0 und 1+ wurde demnach als negative EGFR-

Expression, die Scores 2+ und 3+ als positive EGFR-Expression gewertet.

3.3.2 Mib-1

Für die Evaluierung des Proliferationsindex wurde der Antikörper für das

Proliferationsantigen Ki-67 (clone SP6, Kaninchen monoklonal, Verdünnung 1:50,

Neo Markers, Fremont, CA, USA) nach etabliertem Protokoll eingesetzt. Der TMA

wurde zunächst in einer Pufferlösung mit pH 2,5 und danach in der Mikrowelle für

20 min vorbehandelt. Nach Abkühlung wurde der TMA für 5 min im Puffer

gewaschen. Danach folgte die Inkubation in 3%igem Wasserstoffperoxid für 15 min.

Der Überschuss wurde zweimalig für je 5 min im Puffer gespült. Anschliessend

wurde der TMA mit im Puffer verdünntem Ziegenserum (1:10) für die Dauer von

30 min inkubiert. Danach wurde der primäre Antikörper, Mib-1, aufgetragen und für

2 h belassen, anschliessend wurde wieder im Puffer für 20 min gewaschen. Der

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sekundäre Antikörper, ein biotinkonjugiertes Ziege-Anti-Maus-Ig, wurde in einer

Verdünnung mit Puffer von 1:60 unter Zugabe von 20 µm Human-IgG dazu gegeben

und für 40 min belassen. Anschliessend wurde der TMA für 10 min gewaschen. Im

nächsten Schritt folgte die Zugabe von Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex.

Nach 40 min wurde der TMA im Puffer erneut für 10 min gewaschen. Dann wurde

das Chromogen zugefügt und für die Dauer von 10 min belassen. Darauf folgte ein

zehnminütiger Waschvorgang mit Wasser.

Zur Bestimmung des Proliferationsindex (Mib-1 LI) wurden mindestens 200 Zellkerne

pro Gewebsstanze gezählt, wobei positiv gefärbte Zellen zu nicht gefärbten in

Verhältnis gesetzt wurden.

3.3.3 P53

Für die Markierung des p53 wurde folgender Antikörper verwendet: clone 318-6-11,

Kaninchen monoklonal, Verdünnung 1:200, Dako, Glostrup, Dänemark. Der TMA

wurde 20 min in der Mikrowelle unter Zugabe von 10 mM Zitrat und Pufferlösung

deparaffinisiert und rehydriert. Anschliessend wurde der primäre Antikörper dazu

gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach wurde der TMA mit Puffer

gespült und anschliessend mit Peroxidase für 90 min bei 4 °C inkubiert. Im nächsten

Schritt wurde der TMA erneut mit Puffer gespült. Dann wurde DAB dazu gegeben

und für 30 min belassen. Nach dem Färbevorgang wurde der Rest mit Wasser

abgewaschen.

Analog der Bestimmung des Proliferationsindex wurden mindestens 200 Zellkerne

pro Gewebestanze gezählt und die Ratio positiv markiert zu nicht markiert gebildet.

3.4 Floureszenz-in-situ-Hybridisierung Für die FISH kamen folgende Sonden zum Einsatz: für das EGFR-Gen als

Zielsequenz eine Spectrum-Orange–Sonde für die Region 7p12 und eine

Centromersonde Spectrum-Green für die Region 7p11.1-q11.1 als Referenz

(Abbott/Vysis, Inc., Downers Grove, IL, USA). Vor der eigentlichen Hybridisierung

wurde der TMA entsprechend des FISH Kit-Protokolls (Abbott/Vysis, Downers Grove,

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IL, USA) vorbehandelt. Zunächst wurde der TMA bei 56 °C über Nacht im

Brutschrank inkubiert. Zur Entparaffinierung wurde der TMA für 30 min in Xylol und

anschliessend 10 min in 96%igen Ethanol getaucht. Nach dreiminütiger Trocknung

auf der Heizplatte wurde das Pretreatment-Reagenz (Vysis, Downers Grove, IL,

USA) aufgetragen und bei 80 °C für 15 min inkubiert. Danach wurde der TMA mit

Wasser gespült. Im nächsten Schritt wurde Proteaselösung dazugegeben und bei

37 °C für 150 min belassen. Im Anschluss darauf erfolgte wieder eine Spülung mit

Wasser. Darauf wurde der TMA in aufsteigender Alkoholreihe (70%–, 80%–, 96%iger

Ethanol) jeweils 2 min gewaschen und anschliessend für 3 min auf der Heizplatte bei

48 °C getrocknet. Im nächsten Schritt wurde 10 µl DNA-Sonde auf das Gewebe

pipettiert, mit Deckgläschen versehen und mit Rubberzement versiegelt. Die Sonde

ist spezifisch für eine 300 kb lange Sequenz, welche das EGFR-Gen enthält. Die

Centromersonden (centromere enumeration probe, CEP) sind spezifisch für

hochrepetititve Sequenzen im Bereich der Centromeren. Im nächsten Schritt wurde

der TMA zunächst für 5 min bei 72 °C und anschliessend über Nacht bei 37 °C im

Hybrite-Gerät inkubiert. Am nächsten Tag wurden Kleber und Deckgläschen

vorsichtig entfernt und der TMA ins Wasserbad für 2 min bei 72 °C gestellt. Danach

wurde im Dunkeln für 15 min luftgetrocknet. Im nächsten Schritt wurde zur

Gegenfärbung 10 µl 4′,6-Diamino-2-Phenylindol (DAPI) auf den TMA pipettiert und

dieser mit Deckgläschen versehen.

Die Auswertung erfolgte manuell. Als Amplifikation wurde das Vorliegen von

> 2 EGFR-Gensignalen als Centromersignale (EGFR/CEP7-Ratio > 2) in mindestens

10 % der Tumorzellkerne definiert. Zugewinne wurden definiert als Vorliegen von

mehr EGFR– als CEP7-Signale in mindestens 50 % der Tumorzellkerne, wobei die

Definition der Amplifikation nicht erreicht wurde (1 < EGFR/CEP7-Ratio < 2). Ein

Normalbefund wurde dann angenommen, wenn keine der zwei oben genannten

Definitionen erfüllt wurde (EGFR/CEP7-Ratio ≤ 1).

3.5 Statistische Analysen

Für die Untersuchung der Beziehung zwischen immunhistochemisch

nachgewiesenem EGFR, dem EGFR-Genstatus ermittelt durch FISH und dem WHO-

Grad wurde der χ2-Test durchgeführt.

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3.6 Isolierung von DNA und RNA

Die DNA-Extraktion erfolgte aus Paraffinmaterial. Dazu wurden vom Paraffinblock

drei bis fünf Scheiben von 8 µm Dicke mit einer sterilen Klinge geschnitten und in ein

2 ml Eppendorfgefäss gegeben. Nach Zugabe von 1 ml n-Oktan wurde das Gemisch

für 10 min bei 65 °C inkubiert. Anschliessend wurde die Suspension 5 min bei

14000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment mit

1 ml Ethanol gemischt und anschliessend für 1 min bei 14000 U/min zentrifugiert.

Auch dieser Überstand wurde verworfen und die Zentrifugation des Sediments unter

Zugabe von Ethanol wiederholt. Im Anschluss wurde das Gemisch 10 min bei 37 °C

getrocknet. Als nächstes wurde die Suspension in 100 µl Puffer und 10 µl

Proteinase K gelöst und das Ganze 24 h bei 50 °C inkubiert. Danach gab man 50 µl

Puffer und 5 µl Proteinase K dazu. Ausserdem wurde 450 µl Cleanmix binding

solution (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) und 50 µl Cleanmix high capacity

purification resin (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) hinzugefügt. Daraufhin wurde

das Untersuchungsmaterial in ein steriles 2 ml Eppendorfgefäss mit Filter umgefüllt

und 30 Sekunden (sec) bei 14000 U/min zentrifugiert. Das Filtrat wurde verworfen,

250 µl Cleanmix washing solution (Clean-Mix-Kit, Talent, Triest, Italien) auf den Filter

gegeben und erneut 30 sec zentrifugiert. Dann wurde dieser Schritt wiederholt. Das

Filtrat wurde erneut verworfen. Als nächstes wurde 500 µl 80%igen Alkohol auf den

Filter gegeben und erneut zentrifugiert. Im Anschluss wurde der Filter vorsichtig

herausgenommen und in ein steriles 2 ml Eppendorfgefäss gesteckt. Es wurden

50 µl Wasser auf 65-70 °C erhitzt und die DNA damit für 1 min eluiert und

anschliessend zentrifugiert. Nach Entfernen des Filters wurde die Konzentration der

DNA im Photometer bei 260 nm bestimmt.

Für die RNA-Isolierung wurden vom Paraffinblock Scheiben von 10 µm Dicke

geschnitten und in ein 2 ml Eppendorftube gegeben. Zur Entparaffinierung wurde

1 ml Xylol auf die Proben gegeben und das Ganze 10 sec auf dem Vortex

durchmischt. Das Gemisch wurde dann 2 min bei maximaler Umdrehungszahl

zentrifugiert und der Xylolüberstand anschliessend abpipettiert. Nach erneuter

Xylolzugabe und Zentrifugation wurden diese Schritte wiederholt. Nach Zugabe von

1 ml Ethanol wurde die Probe 2 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen

und die Zentrifugation nach erneuter Ethanolzugabe wiederholt. Danach wurde die

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12

Probe bei 37 °C im Thermoblock mit offenem Deckel getrocknet, bis kein

Ethanolrückstand mehr vorhanden war. Dann wurde die Probe in 150 µl PKD-Puffer

(Qiagen, Venlo, Niederlande) aufgenommen. Im nächsten Schritt wurde der Tube

kurz in Stickstoff getaucht, sodass der Boden gefroren war, und anschliessend mit

Eppendorf-Pistille zermörsert. Nach Zugabe von 10 µl Proteinase K wurde die Probe

bei 55 °C im Wasserbad über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Gemisch

für 15 min bei 80 °C im Thermoblock belassen. Im letzten Schritt wurden die Proben

zusammen mit DNase in den QIAcube (Qiagen, Venlo, Niederlande) gegeben. Im

Anschluss wurde die gewonnene RNA-Menge photometrisch vermessen.

3.7 EGFR-Mutationsanalyse Für die EGFR-Sequenzierung wurde die zuvor aus dem in Paraffin eingebettetem

Material isolierte DNA verwand. Die Exons 18, 19, 20 und 21, welche die

Tyrosinkinase-Domäne des EGFR kodieren, wurden zunächst mittels Polymerase-

Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) nach gängigem Protokoll

amplifiziert. (Schlomm et al. 2007, Lynch et al. 2004) Folgende Primer fanden

Verwendung:

Exon 18: 5′-CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC-3′

3′-GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC-5′

Exon 19: 5′-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3′

3′-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-5′

Exon 20: 5′-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3′

3′-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-5′

Exon 21: 5′-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3′

3′-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-5′

Die Temperatur für Primerhybridisierung lag bei 58 °C. Im nächsten Schritt wurden

2 µl des Reaktionsgemisches unter Verwendung folgender Primer amplifiziert:

Exon 18: 5′-CAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC-3′

3′-CCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG-5′

Exon 19: 5′-CCTTAGGTGCGGCTCCACAGC-3′

3′-CATTTAGGATGTGGAGATGAGC-5′

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Exon 20: 5′-GAAACTCAAGATCGCATTCATGC-3′

3′-GCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG-5′

Exon 21: 5′-CAGCCATAAGTCCTCGACGTGG-3′

3′-CATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC-5′

Im Anschluss wurde die aufgereinigte DNA mithilfe des ABI BigDye Terminator Kit

v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert und mit ABI PRISM

3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) genetisch ausgewertet.

Für die Untersuchung von EGFRvIII wurde die zuvor isolierte RNA einer Echtzeit-

Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (real-time RT-PCR) unterzogen.

Folgende Primer über der Deletion wurden verwand:

3′-GGGCTCTGGAGGAAAAGAAA-5′

3′-TCCTCCATCTCATAGCTGTCG-5′

Zu diesem Zweck wurden 10 µl RNA mit 10 µl Mastermix, hergestellt entsprechend

dem High-capacity archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), für die

cDNA-Synthese eingesetzt. Die real-time RT-PCR erfolgte im Bio-Rad Cycler (Bio-

Rad, Hercules, CA, USA) nach Herstellerangaben.

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4 ERGEBNISSE

4.1 Demographische Charakteristik der Kohorte

Tabelle 1 gibt einen Überblick über die demographischen Daten der untersuchten

Patienten. In Kürze, von den untersuchten 55 Ependymomen wurden 40 als WHO-

Grad II und 15 als WHO-Grad III Ependymome klassifiziert. Das Geschlechter-

verhältnis männlich zu weiblich betrug 6:5 in der Gruppe der WHO-Grad II

Ependymome und 3:2 unter den WHO-Grad III Ependymomen. Das Patientenalter

zum Diagnosezeitpunkt reichte von 2 bis 79 Jahren, der mittlere Wert lag bei 45

Jahren unter den WHO-Grad II und 26 Jahren unter den WHO-Grad III

Ependymomen. Von den 40 WHO-Grad II Ependymomen waren 11 (27,5 %)

intrakraniellen und 29 (72,5 %) intramedullären Ursprungs. Zwischen den 15 WHO-

Grad III Ependymomen wiesen 9 (60,0 %) eine intrakranielle und 6 (40,0 %) eine

Lokalisation im Rückenmark auf.

Tabelle 1. Demographische Charakteristik der Stichprobe.

Anzahl der Fälle (%)

WHO Grad II

WHO Grad III

Durchschnittsalter (st) 45 (21.0) 26 (17.4)

männlich : weiblich 6 : 5 3 : 2

supratentoriell 0 6 (40.0) infratentoriell 11 (27.5) 3 (20.0)

zervikal 12 (30.0) 5 (33.3) zerviko-thorakal 5 (12.5) 0

thorakal 7 (17.5) 0 lumbosakral 1 (2.5) 1 (6.7)

Tumor Lokalisation

Conus-Cauda-Region 4 (10.0) 0

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4.2 Kontrolle des TMA mittels Mib-1 und p53

Wie bereits erwähnt, wurden die zu untersuchenden Tumorproben in einem TMA

zusammengestellt. Dieses Format erlaubt die simultane immunhistochemische

Untersuchung und den direkten Vergleich der Ergebnisse. Da ein kleines Areal

repräsentativ für den Tumor ausgewählt wird, sind Fehler bei der Probenauswahl

nicht auszuschliessen. Zur Kontrolle eignet sich die Gegenüberstellung der

Proliferationsindices des Gewebeschnittes vom Spenderparaffinblock und der daraus

entnommenen Gewebestanze auf dem TMA (Tabelle 2). Innerhalb der WHO-Grad II

Ependymome auf dem TMA betrug der Mib-1-Proliferationsindex im mittel 1,80 %

(Standardabweichung st 4,71) verglichen mit 2,85 % (st 6,45) auf den her-

kömmlichen Gewebeschnitten. Unter den WHO-Grad III Ependymomen lag dem

Mittelwert von 11,99 % (st 16,68) für die Gewebestanzen der mittlere Mib-1 LI von

25,55 % (st 15,38) für die Gewebeschnitte gegenüber.

Ergänzend haben wir den p53 LI für den TMA ermittelt. Innerhalb der WHO-Grad II

Ependymome lag der mittlere Wert bei 9,48 (st 14,15), während er für WHO-Grad III

Ependymome 16,06 (st 17,40) betrug.

Tabelle 2. Ergebnisse der Mib-1– und p53-Färbungen.

analysiert Intervall Mittelwert(st)

Mib-1 TMA 55 0 – 63.3 4.58 (11.29)

WHO-Grad II 40 0 – 21.2 1.80 (4.71)

WHO-Grad III 15 0 – 63.3 11.99 (18.69)

Mib-1 Gewebeschnitt 55 0 – 42.0 7.16 (11.36)

WHO-Grad II 40 0 – 33.5 2.85 (6.45)

WHO-Grad III 15 0 – 42.0 25.55 (15.38)

p53 TMA 54 0 – 45.0 11.31 (15.24)

WHO-Grad II 39 0 – 44.0 9.48 (14.15)

WHO-Grad III 15 0 – 45.0 16.06 (17.40)

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4.3 Expression von EGFR

Erhebliche Unterschiede fanden sich in der Anzahl der EGFR-exprimierenden

Tumoren abhängig vom eingesetzten Antikörper. Insgesamt konnte in 33/55 (60 %)

Tumoren eine EGFR-Expression mit dem Antikörper von Dako nachgewiesen

werden, dagegen nur in 16/55 (30 %) Fällen mit dem Antikörper von Zymed. Im

Detail wurde eine Überexpression (Score 2+ oder 3+) von EGFR in 23 (57,5 %)

Ependymomen WHO-Grad II und 10 (66,7 %) Ependymomen WHO-Grad III mit dem

Antikörper von Dako nachgewiesen. Mit dem Antikörper von Zymed war EGFR

nachweisbar in 9 (23,1 %) Ependymomen WHO-Grad II und 7 (46,7 %)

Ependymomen WHO-Grad III. Hinsichtlich der Tumorlokalisation konnte eine

Überexpression von EGFR in 4/11 (36,4 %) intrakraniellen und 19/29 (65,5 %)

intramedullären WHO-Grad II sowie in 8/9 (88,9 %) intrakraniellen und 2/6 (33,3 %)

intramedullären WHO-Grad III Ependymomen mit dem Antikörper von Dako

nachgewiesen werden. Mit dem Antikörper von Zymed zeigten 2/11 (18,2 %)

zerebrale und 7/29 (24,1 %) spinale WHO-Grad II Ependymome sowie 5/9 (55,6 %)

zerebrale und 2/6 (33,3 %) spinale WHO-Grad III Ependymome eine Überexpression

von EGFR.

Die unterschiedlichen Stufen der EGFR-Expression mit Antikörpern von Dako und

Zymed zeigt Abbildung 1.

4.4 EGFR-Genstatus-Analyse

FISH konnte erfolgreich durchgeführt werden in 54 Fällen. In 3 (5,5 %) Fällen konnte

eine EGFR-Amplifikation nachgewiesen werden, davon war 1 (2,5 %) Ependymom

WHO-Grad II und 2 (13,3 %) Ependymome WHO-Grad III. (Tabelle 3) Dabei

handelte es sich um zwei spinale und einen zerebralen Tumor. In einem WHO-Grad

III Ependymom handelte es sich um eine starke Amplifikation mit mehr als 20 EGFR-

Gensignalen pro Zellkern. Ein Zugewinn vom EGFR-Gen wurde beobachtet in 7

(17,5 %) WHO-Grad II und 2 (13,3 %) WHO-Grad III Ependymomen. (Tabelle 3) Eine

Chromosom 7-Polysomie, das heisst das Vorhandensein von mehr als 3 Signalen für

EGFR und CEP 7 pro Zellkern, konnte in 25 (62,5 %) WHO-Grad II und 7 (46,7 %)

WHO-Grad III Ependymomen nachgewiesen werden. (Tabelle 3)

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Abbildung 1. Immunohistochemische Färbung und FISH zum EGFR-Nachweis in

Ependymomen. A Repräsentative Fälle von Ependymomen mit unterschiedlichen

EGFR-Scores (0 bis 3+) unter Verwendung der Antikörper von Dako und Zymed.

Maßstabsbalken entspricht 50 µm. B Repräsentative Fälle mit normalem und

aplifiziertem EGFR-Gen, dabei entspricht rotes Signal dem EGFR-Gen und grünes

dem Centromer von Chromosom 7.

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Tabelle 3. Ergebnisse der Immunohistochemie und FISH. (Zeichenerklärung: n.a. : nicht analysiert; ex20: Exon 20; wt: Wildtyp)

EGFR IHC SCORE FALL NR.

WHO GRAD

TUMOR LOKALISATION Zymed Dako

EGFR FISH EGFR Exon 18-

21

EGFRvIII

1 II intrakraniell 0 0 3 n.a. n.a. 2 II spinal 0 0 3 n.a. n.a. 3 II intrakraniell 0 2+ Zugewinn n.a. n.a. 4 II spinal 0 0 3 n.a. n.a. 5 II spinal 2+ 2+ Zugewinn n.a. n.a. 6 II spinal 1+ 3+ 4 – 5 silent ex20 n.a. 7 II spinal 1+ 2+ 3 – 5 n.a. n.a. 8 II spinal 1+ 2+ 4 n.a. n.a. 9 II spinal 1+ 3+ 3 wt n.a. 10 II intrakraniell 1+ 1+ 2 n.a. n.a. 11 II spinal 0 1+ Zugewinn n.a. n.a. 12 II intrakraniell 3+ 0 2 n.a. n.a. 13 II spinal 0 2+ 3 – 4 n.a. n.a. 14 II spinal 0 2+ 3 n.a. n.a. 15 II intrakraniell 0 0 2 n.a. n.a. 16 II spinal 0 2+ Zugewinn n.a. n.a. 17 II intrakraniell 1+ 3+ 3 silent ex20 n.a. 18 II spinal 0 1+ 4 – 5 n.a. n.a. 19 II spinal 2+ 3+ 2 wt n.a. 20 II spinal 1+ 3+ 3 – 4 n.a. n.a. 21 II spinal 1+ 2+ 3 – 4 n.a. n.a. 22 II spinal 3+ 3+ Zugewinn silent ex20 n.a. 23 II spinal 0 2+ 3 n.a. n.a. 24 II spinal 0 0 3 n.a. n.a. 25 II intrakraniell 0 2+ 3 n.a. n.a. 26 II spinal n.a. 0 n.a. n.a. n.a. 27 II intrakraniell 1+ 1+ 2 n.a. n.a. 28 II spinal 2+ 3+ Amplifikation silent ex20 wt 29 II intrakraniell 0 0 2 n.a. n.a. 30 II spinal 0 0 Zugewinn n.a. n.a. 31 II spinal 1+ 2+ 3 n.a. n.a. 32 II spinal 0 2+ 3 – 4 n.a. n.a. 33 II spinal 0 0 Zugewinn n.a. wt 34 II spinal 3+ 3+ 5 n.a. wt 35 II spinal 1+ 1+ 3 – 4 n.a. n.a. 36 II spinal 3+ 3+ 3 – 4 n.a. n.a. 37 II spinal 1+ 1+ 3 n.a. wt 38 II intrakraniell 0 2+ 3 n.a. n.a. 39 II intrakraniell 3+ 1+ 3 n.a. n.a. 40 II spinal 3+ 3+ 4 wt n.a. 41 III spinal 1+ 0 Zugewinn n.a. n.a. 42 III intrakraniell 1+ 2+ 3 – 4 n.a. n.a. 43 III spinal 2+ 2+ 3 n.a. n.a. 44 III spinal 0 1+ Amplifikation silent ex20 wt 45 III intrakraniell 1+ 3+ 3 n.a. n.a. 46 III spinal 1+ 1+ 2 n.a. n.a. 47 III spinal 3+ 3+ 3 – 4 silent ex20 n.a. 48 III intrakraniell 3+ 3+ 3 silent ex20 n.a. 49 III intrakraniell 0 1+ 2 n.a. n.a. 50 III intrakraniell 3+ 2+ Zugewinn n.a. n.a. 51 III intrakraniell 3+ 3+ Amplifikation S768I

wt 52 III intrakraniell 1+ 2+ 2 n.a. n.a. 53 III intrakraniell 3+ 3+ 3 – 4 silent ex20 n.a. 54 III spinal 0 0 2 n.a. wt 55 III intrakraniell 3+ 3+ 3 - 4 n.a. wt

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4.5 Vergleich von immunhistochemischer EGFR-Expression und

FISH Von den drei Fällen mit amplifiziertem EGFR-Gen zeigten zwei Ependymome eine

starke EGFR-Expression unter beiden Antikörpern. Unter den 32 Fällen mit

Chromosom-7-Polysomie ohne Amplifikation zeigten 23 (71,9 %) Ependymome eine

Überexpression von EGFR mit dem Antikörper von Dako und 7 (21,9 %) mit dem

Antikörper von Zymed. Innerhalb der 10 Ependymome, die weder eine Amplifikation

noch eine Polysomie aufwiesen, waren 2 (20 %) positiv für EGFR mit beiden

Antikörpern.

Die Korrelation zwischen der immunhistochemisch ermittelten EGFR-Expression und

dem EGFR-Genstatus ermittelt mit FISH war statistisch nicht signifikant. (Tabelle 4)

Es gab ebenfalls keine statistisch signifikante Korrelation zwischen der EGFR-

Expression bzw. dem EGFR-Genstatus und dem WHO-Grad. (Tabelle 4)

Tabelle 4. Korrelation der EGFR-Expression mit dem WHO Grad der Ependymome.

EGFR IHC Zymed Dako

WHO Grad EGFR FISH Anzahl n

Negativ (n)

Positiv (n)

Negativ (n)

Positiv (n)

II normal 31 25 6 13 18 Zugewinn 7 5 2 3 4 Amplifiziert 1 0 1 0 1 III normal 11 6 5 3 8 Zugewinn 2 1 1 1 1 Amplifiziert 2 1 1 1 1 χ2, p= 0.293 0.144 0.915 0.18 0.733

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4.6 Nachweis einer EGFR-Mutation

Wir sequenzierten die Exons 18-21 des EGFR-Gens in denjenigen Tumoren, die

eine Amplifikation oder eine eindeutige Überexpression von EGFR aufwiesen (n=13).

Davon fand sich bei einem Tumor mit stark amplifiziertem EGFR und kräftiger EGFR-

Expression mit Antikörpern von Dako und Zymed eine Punktmutation in Exon 20

(Codon 768, AGC→ATC, Ser→Ile). (Paez et al. 2004) Bei dem Patienten handelte es

sich um eine zum Diagnosezeitpunkt 61-jährige Frau mit einem supratentoriellen,

anaplastischen (WHO-Grad III) Ependymom. (Abbildung 2)

Ferner wurde im Exon 20 eine silent mutation (Codon 787, CAG→CAA, Gln→Gln) in

8 (61,5 %) Fällen beobachtet.

Unter 8 repräsentativ ausgewählten Ependymomen, darunter auch diejenigen mit

amplifiziertem EGFR-Gen, wurde nach der Mutation EGFRvIII gefahndet, die in

keinem dieser Ependymome nachgewiesen werden konnte.

Abbildung 2. Morphologie des anaplastischen Ependymoms mit EGFR S768I

Mutation. Zu sehen sind repräsentative Ausschnitte mit A HE; B GFAP; C Mib-1; D EGFR-Expression mit dem Antikörper von Dako und E Zymed; F FISH. Die

Tumorzellen sind hoch polymorph, jedoch sind die architektonischen und

immunhistologischen Charakteristika eines Ependymoms erhalten. EGFR ist stark

exprimiert (D, E) und amplifiziert (F). Maßstabsbalken beträgt 50 µm.

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5 DISKUSSION

Die Liganden-gesteuerte Aktivierung von EGFR, eines transmembranen

Tyrosinkinase-Rezeptors, setzt Signalkaskaden in Gang, welche das Zellwachstum

stimulieren und die Zellmotilität steigern. (Kari et al. 2003) EGFR ist überexprimiert,

mutiert oder amplifiziert in einer Vielzahl von Neoplasien. (Ciardiello et al. 2008) Für

Kolon- und Lungenkarzinome ist der EGFR-Status ein guter Parameter für die

Prognose und für das Ansprechen einer gezielten anti-EGFR-Therapie. (Janku et al.

2010) Für eine Subgruppe von Gliomen, nämlich für gewisse Glioblastome, kommt

EGFR eine wichtige Rolle für die Vorhersage des klinischen Verlaufs zu, doch haben

klinische Studien zur Untersuchung einer EGFR-gezielten Therapie enttäuschende

Ergebnisse zutage gebracht. (Huang et al. 2009, Felsberg et al. 2009, Thaker et al.

2009)

Der EGFR-Signalweg spielt eine Rolle bei Ependymomen und EGFR-

Überexpression wurde als unabhängiger prognostischer Faktor für ihre maligne

Entwicklung identifiziert. (Yi et al. 2009, Mendrzyk et al. 2006) Tatsächlich ist die

EGFR-Überexpression der einzige signifikante Vorhersageparameter für eine

schlechte Prognose bei Patienten mit intrakraniellen WHO-Grad II Ependymomen

und liefert damit wertvolle Information für Risikoeinschätzung und Behandlung.

(Massimino et al. 2009, Senetta et al. 2011)

In der vorliegenden Studie verglichen wir die immunhistochemisch gemessene

Proteinexpression mit dem EGFR-Genstatus. Wir stellten eine EGFR-

Überexpression bei der Mehrzahl der Tumoren fest, dennoch fanden wir nur

gelegentlich eine EGFR-Genamplifikation. Von 33 Ependymomen mit stark

exprimiertem EGFR unter Einsatz des Antikörpers von Dako zeigten 16 eine starke

EGFR-Expression mit dem Antikörper von Zymed und nur 2 eine Amplifikation.

Zusätzlich beobachteten wir eine EGFR-Amplifikation in einem Tumor ohne

markante EGFR-Expression in der Immunhistochemie. Wir konnten nicht den

Nachweis von EGFRvIII in ausgewählten Tumoren erbringen, welches häufig in

Glioblastomen vorzufinden ist. (Jeuken et al. 2009) Unsere Ergebnisse bezüglich der

EGFR-Amplifikation stehen im Einklang mit einer vorangehenden Studie, die einen

Zugewinn von 7p11.2, einer EGFR-enthaltenden genomischen Region, in einer

Teilmenge von Ependymomen beobachtet hat. (Mendrzyk et al. 2006) Jedoch

stützen sie nicht die Resultate einer Arbeit, die eine Stichprobe von 4 Ependymomen

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einer CISH unterzog und keine EGFR-Amplifikation festgestellt hat. (Marquez et al.

2004) Die Diskrepanz zwischen EGFR-Genamplifikation und EGFR-Expression in

Ependymomen ist unerwartet, als sowohl balancierte Polysomie wie auch EGFR-

Amplifikation mit der immunhistochemisch ermittelten EGFR-Expression in anderen

Gliomen wie Astrozytomen zu korrelieren scheinen. (Marquez et al. 2004, Libermann

et al. 1985, Schober et al. 1995) Weil der Zusammenhang zwischen der EGFR-

Genamplifikation und EGFR-Expression uneinheitlich in anderen Neoplasien zu sein

scheint, insbesondere bei Plattenepithelkarzinomen, Kopf-Hals-Tumoren und

hepatozellulären Karzinomen als nicht korrelierend, jedoch eine gute Korrelation für

Adenokarzinome der Lunge beschrieben worden ist, könnten zellspezifische

Mechanismen dafür verantwortlich sein. (Buckley et al. 2008, Kearsley et al. 1991, Li

et al. 2008) In Fällen mit immunhistochemisch ermittelt starker EGFR-Expression bei

Abwesenheit von EGFR-Amplifikation oder Zugewinn wären andere ursächliche

Mechanismen wie erhöhtes Ligandenangebot, rezeptoraktivierende Mutationen oder

Heterodimerisation mit anderen transmembranen Tyrosinkinasen wie HER2 denkbar.

(Buckley et al. 2008)

Da wir ein gehäuftes Vorkommen von EGFR-Überexpression und das

Vorhandensein von EGFR-Amplifikation in unserer Stichprobe beobachtet haben,

würde man in EGFR – analog zu Astrozytomen – eine wichtige Rolle in der

Tumorprogression der Ependymome vermuten. Wir vermuten ein vermehrtes

Auftreten von EGFR-Genamplifikationen unter Ependymomen WHO-Grad III

(13,3 %) im Vergleich zu WHO Grad II (2,5 %), jedoch erreichte diese Korrelation

keine statistische Signifikanz. Die Korrelation zwischen immunhistochemisch

nachgewiesener EGFR-Expression und dem WHO-Grad ist schwach und vom

verwendeten Antikörper abhängig. Das deutet darauf hin, dass die Analyse der

EGFR-Genkopien mittels FISH oder die Kombination aus FISH und Immunhistologie

mehr klinisch relevante Ergebnisse einbringen als die Immunhistochemie allein. Die

Diskrepanz zwischen den Antikörpern von Dako und Zymed ist beschrieben worden.

(Buckley et al. 2007) Im Gegensatz zur Studie von Buckley et al., wo mehr positive

Ergebnisse mit dem Antikörper von Zymed ermittelt worden sind, befindet unsere

Datenlage den Antikörper von Dako sensitiver im Vergleich zu Zymed.

Mutationen im EGFR-Gen sind bei Glioblastomen beschrieben worden, die häufigste

unter ihnen ist EGFRvIII. (Fukushima et al. 2006) Bisher wurden keine EGFR-

Mutationen bei Ependymomen beobachtet. Wir analysierten sowohl die

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Tyrosinkinase-Domäne des EGFR als auch das Vorhandensein von EGFRvIII und

berichten zum ersten Mal von einer Missense-Mutation in Exon 20 (Codon 768,

AGC→ATC, Ser→Ile) des EGFR-Gens in einem anaplastischen Ependymom.

Fukushima et al. konnten die identische Mutation in einem primären Glioblastom

nachweisen. Im Gegensatz zu unserem Patienten, bei dem zusätzlich eine EGFR-

Amplifikation vorlag, wurde dies nicht von Fukushima et al. untersucht. (Fukushima

et al. 2006) Es wäre interessant herauszufinden, ob die Genamplifikation der

Mutation vorausgeht, wie es im Falle von EGFRvIII bei Glioblastomen angenommen

wird. (Frederick et al. 2000)

Alle In-situ-Analysen führten wir auf einem TMA aus. Unser Gewebearray bestand

aus zwei repräsentativen Gewebestanzen von jedem Tumor. Wie bereits publiziert,

fanden wir eine gute Konkordanz zwischen großen histologischen Schnitten und dem

TMA, wie aus der deutlichen Diskriminierung der Wachstumsfraktion zwischen WHO-

Grad II und WHO-Grad III Ependymomen auf großen Gewebeschnitten verglichen

mit den Gewebestanzen hervorging. (Simon et al. 2003)

Abschliessend konnten wir die Wichtigkeit des EGF-Rezeptors in Ependymomen

untermauern, indem wir gezeigt haben, dass 1) EGFR in der Mehrzahl der

Ependymome überexprimiert wird, 2) eine EGFR-Genamplifikation bei

Ependymomen vorliegen kann, und 3) mutiertes EGFR einer Entstehung von

Ependymomen zugrunde liegen kann. Wir fanden keine Korrelation zwischen

amplifiziertem EGFR-Gen und exprimiertem EGFR. Weitere Untersuchungen sind

nötig, um klinische und molekulare Einzelheiten in der Rolle von EGFR und

Pathophysiologie der Ependymome aufzuklären.

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6 ZUSAMMENFASSUNG

Die Pathogenese von Ependymomen und prognostische Faktoren sind unzureichend

verstanden. Es konnte gezeigt werden, dass dem EGF-Rezeptor eine wichtige Rolle

in der Entwicklung von Gliomen zukommt.

In vorliegender Studie untersuchten wir die immunhistologische Expression und

Genstatus mittels FISH von EGFR, die Wachstumsfraktion entsprechend Mib-1 und

die Expression von p53 in 40 WHO-Grad II und 15 WHO-Grad III Ependymomen.

Alle Tumorproben wurden in ein TMA-Format überführt, das EGFR-Gen wurde

sequenziert und die Ergebnisse miteinander verglichen.

Wir fanden ein immunhistochemisch überexprimiertes EGFR in 30-60 % der

Tumoren, in Abhängigkeit vom verwendeten Antikörper. Das EGFR-Gen war

amplifiziert in 5,5 % der Ependymome. Ausserdem fanden wir eine Missense-

Mutation in Exon 20 (S768I) in der Tyrosinkinase-Domäne des EGFR-Gens. Die

EGFR-Expression korrelierte nicht mit der Amplifikation.

Daraus folgern wir, dass die immunhistochemisch ermittelte EGFR-Expression häufig

bei Ependymomen auftritt. Es gibt einen schwachen Zusammenhang zwischen

amplifiziertem EGFR und seiner Expression. EGFR-Mutationen können in

ausgewählten Ependymomen vorhanden sein.

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7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

CA California

cDNA Copy-DNA

CEP centromere enumeration probe

CISH chromogenic in-situ hybridization

DAB 3.3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid

DAPI 4′,6-Diamino-2-Phenylindol

DNA Desoxyribonukleinsäure

EGFR epidermal growth factor receptor

EMA epitheliales Membranantigen

FISH Floureszenz-in-situ-Hybridisierung

Glu Glutaminsäure

HE Hämatoxylin-Eosin

HER2 human epidermal growth factor receptor

HRP horseredish peroxidase

Ig Immunglobulin

IL Illinois

Ile Isoleucin

kb Kilobasen

LI labeling index

MAP-Kinase mitogen-aktivierte Proteinkinase

Mb Megabasen

mM millimolar

mRNA Messenger-RNA

MYC avian myelocytomatosis virus

NF2 Neurofibromatose Typ 2

PCR plymerase chain reaction

PKD proteinase K digest

pH pondus hydrogenii (negativer dekadischer Logarithmus der

Wasserstoffionenkonzentration)

Raf rat fibrosarcoma

Ras rat sarcoma

RNA Ribonukleinsäure

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RT-PCR reverse transcriptase PCR

Ser Serin

st Standardabweichung

TBS Tris-buffered saline

TMA tissue microarray

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

WHO world health organization

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9 DANKSAGUNG

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Personen bedanken, die diese Arbeit

ermöglicht und zu ihrem Gelingen maßgeblich beigetragen haben.

Mein ganz besonderer Dank gilt dem Direktor des Instituts für Neuropathologie und

meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med. Markus Glatzel, der mir die Gelegenheit

zu dieser Arbeit erst gegeben hat. Ich danke ihm insbesondere für die sehr gute

fachkundige und persönliche Betreuung, mit der ich stets sehr zufrieden war. Er hat

den Schaffungsprozess mit hilfreichen Ratschlägen, Anregungen und viel

Enthusiasmus begleitet.

Weiterhin danke ich den Herren Dr. med. Christian Bernreuther und Dr. med. Jakob

Matschke für die hilfreiche Unterstützung beim Mikroskopieren und bei der

Literaturrecherche. Ich bedanke mich für die kompetente Unterstützung bei

komplizierten Fragestellungen.

Martin Haberkorn und seinem Laborteam der Neuropathologie danke ich für die

technische Mithilfe bei der Anfertigung von histologischen Gewebeschnitten und

immunhistochemischen Färbungen. Herrn S. Eghtessadi danke ich für die Hilfe bei

der FISH und Frau A. Blaszczyk-Wewer für die Unterstützung bei der

Sequenzierung.

Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich während des Studiums stets nicht

nur finanziell, sondern auch emotional, unterstützt haben.

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11 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe

verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt

und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen

einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des

benutzten Werkes kenntlich gemacht habe.

Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an

einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um

Zulassung zur Promotion beworben habe.

Unterschrift: ......................................................................