Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am

Beispiel von Nickel-Titan- Formgedächtnislegierungen

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt in der Chirurgische Forschung der

Chirurgischen Klinik und Poliklinik der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken

Bergmannsheil Universitätsklinik Bochum

vorgelegt von Denise Bogdanski

aus

Gelsenkirchen

Bochum 2005

Tag der mündlichen Prüfung: 22.12.05 1. Gutachter Prof. Dr. M. Köller

2. Gutachter Prof. Dr. K. P. Hoffmann

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG .............................................................................................. 1

1.1 Implantat-Biomaterialien....................................................................... 1 1.1.1 Metalle und Metall-Legierungen ..................................................................3 1.1.2 Polymere .....................................................................................................3 1.1.3 Keramiken ...................................................................................................3

1.2 Biokompatibilität ................................................................................... 4 1.2.1 Biologische Beurteilung von Medizinprodukten: DIN EN ISO 10993 ..........6

1.3 Biofunktionalität .................................................................................... 8

1.4 Nickel-Titan Formgedächtnislegierungen ........................................... 9 1.4.1 Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen als Implantatmaterial................11 1.4.2 NiTi-Biokompatibilität.................................................................................12 1.4.3 Nickelfreisetzung aus NiTi .........................................................................13

1.5 Nickel Toxizität .................................................................................... 15 1.5.1 Nickel-Allergie ...........................................................................................15

1.6 Optimierung der Biokompatibilität von NiTi durch Beschichtung.. 16 1.6.1 Calciumphosphat-Schicht aus wässriger übersättigter Lösung.................17

1.7 Vergleichende Zell-Reaktions-Analysen ........................................... 19 1.7.1 Leukozyten ................................................................................................19 1.7.2 Osteoblasten .............................................................................................20 1.7.3 Cytokine ....................................................................................................21 1.7.4 Adhäsionsmoleküle ...................................................................................22 1.7.5 Chemotaxis ...............................................................................................24 1.7.6 Apoptose ...................................................................................................25

1.8 Fragestellung....................................................................................... 25

2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 27

2.1 Materialien............................................................................................ 27 2.1.1 Reagenzien/Puffer.....................................................................................27 2.1.2 Verbrauchsmaterial ...................................................................................28 2.1.3 Cytokine (Standards).................................................................................29 2.1.4 Antikörper ..................................................................................................29 2.1.5 Assays.......................................................................................................29 2.1.6 Zelllinien ....................................................................................................30 2.1.7 Metalle.......................................................................................................30 2.1.8 Software ....................................................................................................30 2.1.9 Geräte .......................................................................................................31

I

Inhaltsverzeichnis

2.2 Gradientenwerkstoff............................................................................ 32

2.3 Metallprobekörper ............................................................................... 34

2.4 Calciumphosphat-Beschichtung........................................................ 34

2.5 Zellkultur .............................................................................................. 35 2.5.1 Kultivierung von Osteoblasten-Zelllinien und Fibroblasten........................35 2.5.2 Subkultivierung und Ernte der Zellen ........................................................35 2.5.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen............................................................36

2.6 Isolierung humaner Leukozyten ........................................................ 36

2.7 Isolierung humaner Thrombozyten.................................................... 38

2.8 Zelladhärenz-Analysen ....................................................................... 38 2.8.1 Inkubation von Osteoblasten mit Metallprobekörpern ...............................38 2.8.2 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf Calciumphosphat-beschichteten

und unbeschichteten Probekörpern...........................................................38 2.8.3 Leukozytenadhärenz an Calciumphosphat-beschichteten und unbe-

schichteten Metallprobekörpern ................................................................39 2.8.4 Fluoreszenzmikroskopische Vital-Färbung mit Calcein-AM und Propi-

diumjodid ...................................................................................................39

2.9 Mikroskopie ......................................................................................... 40 2.9.1 Durchlichtmikroskopie ...............................................................................40 2.9.2 Fluoreszenzmikroskopie............................................................................41 2.9.3 Rasterelektronenmikroskopie....................................................................41

2.10 Quantitative Bildanalytik..................................................................... 42

2.11 Zell-Proliferationsanalyse durch Fluoreszenzmarkierung............... 42

2.12 Zell-Proliferationsanalyse durch ein colorimetrisches Verfahren... 43

2.13 Cytotoxizitäts-Analyse ........................................................................ 44

2.14 Gewinnung konditionierter Medien von Leukozyten........................ 45

2.15 Durchflußcytometrie ........................................................................... 46

2.16 Funktionsassays ................................................................................. 48 2.16.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array ......................................................48 2.16.2 Quantifizierung freigesetzter Cytokine.......................................................50 2.16.3 Chemotaxis-Bioassay................................................................................52 2.16.4 Expression von Adhäsionsmolekülen........................................................53 2.16.5 DNA-Fragmentierung (Apoptose)..............................................................54

II

Inhaltsverzeichnis

2.17 Analyse der Nickelfreisetzung ........................................................... 55

2.18 Einfluß von NiCl2 auf Zellaktivierung................................................. 55

2.19 Statistik ................................................................................................ 56

3 ERGEBNISSE .......................................................................................... 57

3.1 Gradientenwerkstoff............................................................................ 57

3.2 Analyse der Osteoblastenproliferation durch quantitative digitale Bildanalytik .......................................................................................... 59

3.3 Quantifizierung der Osteoblastenproliferation durch ein colori- metrisches Verfahren.......................................................................... 63

3.4 Bestimmung der Cytotoxizität durch Quantifizierung der LDH- Aktivität ................................................................................................ 64

3.5 Apoptose.............................................................................................. 65

3.6 Zelladhäsion ........................................................................................ 71 3.6.1 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf beschichteten und unbeschich-

teten Probekörpern....................................................................................71 3.6.2 Adhärenz von Granulozyten auf besch