Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · PDF...

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  • Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am

    Beispiel von Nickel-Titan- Formgedächtnislegierungen

    Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

    der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum

    angefertigt in der Chirurgische Forschung der

    Chirurgischen Klinik und Poliklinik der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken

    Bergmannsheil Universitätsklinik Bochum

    vorgelegt von Denise Bogdanski

    aus

    Gelsenkirchen

    Bochum 2005

  • Tag der mündlichen Prüfung: 22.12.05 1. Gutachter Prof. Dr. M. Köller

    2. Gutachter Prof. Dr. K. P. Hoffmann

  • Meiner Familie

  • Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis

    1 EINLEITUNG .............................................................................................. 1

    1.1 Implantat-Biomaterialien....................................................................... 1 1.1.1 Metalle und Metall-Legierungen ..................................................................3 1.1.2 Polymere .....................................................................................................3 1.1.3 Keramiken ...................................................................................................3

    1.2 Biokompatibilität ................................................................................... 4 1.2.1 Biologische Beurteilung von Medizinprodukten: DIN EN ISO 10993 ..........6

    1.3 Biofunktionalität .................................................................................... 8

    1.4 Nickel-Titan Formgedächtnislegierungen ........................................... 9 1.4.1 Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen als Implantatmaterial................11 1.4.2 NiTi-Biokompatibilität.................................................................................12 1.4.3 Nickelfreisetzung aus NiTi .........................................................................13

    1.5 Nickel Toxizität .................................................................................... 15 1.5.1 Nickel-Allergie ...........................................................................................15

    1.6 Optimierung der Biokompatibilität von NiTi durch Beschichtung.. 16 1.6.1 Calciumphosphat-Schicht aus wässriger übersättigter Lösung.................17

    1.7 Vergleichende Zell-Reaktions-Analysen ........................................... 19 1.7.1 Leukozyten ................................................................................................19 1.7.2 Osteoblasten .............................................................................................20 1.7.3 Cytokine ....................................................................................................21 1.7.4 Adhäsionsmoleküle ...................................................................................22 1.7.5 Chemotaxis ...............................................................................................24 1.7.6 Apoptose ...................................................................................................25

    1.8 Fragestellung....................................................................................... 25

    2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 27

    2.1 Materialien............................................................................................ 27 2.1.1 Reagenzien/Puffer.....................................................................................27 2.1.2 Verbrauchsmaterial ...................................................................................28 2.1.3 Cytokine (Standards).................................................................................29 2.1.4 Antikörper ..................................................................................................29 2.1.5 Assays.......................................................................................................29 2.1.6 Zelllinien ....................................................................................................30 2.1.7 Metalle.......................................................................................................30 2.1.8 Software ....................................................................................................30 2.1.9 Geräte .......................................................................................................31

    I

  • Inhaltsverzeichnis

    2.2 Gradientenwerkstoff............................................................................ 32

    2.3 Metallprobekörper ............................................................................... 34

    2.4 Calciumphosphat-Beschichtung........................................................ 34

    2.5 Zellkultur .............................................................................................. 35 2.5.1 Kultivierung von Osteoblasten-Zelllinien und Fibroblasten........................35 2.5.2 Subkultivierung und Ernte der Zellen ........................................................35 2.5.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen............................................................36

    2.6 Isolierung humaner Leukozyten ........................................................ 36

    2.7 Isolierung humaner Thrombozyten.................................................... 38

    2.8 Zelladhärenz-Analysen ....................................................................... 38 2.8.1 Inkubation von Osteoblasten mit Metallprobekörpern ...............................38 2.8.2 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf Calciumphosphat-beschichteten

    und unbeschichteten Probekörpern...........................................................38 2.8.3 Leukozytenadhärenz an Calciumphosphat-beschichteten und unbe-

    schichteten Metallprobekörpern ................................................................39 2.8.4 Fluoreszenzmikroskopische Vital-Färbung mit Calcein-AM und Propi-

    diumjodid ...................................................................................................39

    2.9 Mikroskopie ......................................................................................... 40 2.9.1 Durchlichtmikroskopie ...............................................................................40 2.9.2 Fluoreszenzmikroskopie............................................................................41 2.9.3 Rasterelektronenmikroskopie....................................................................41

    2.10 Quantitative Bildanalytik..................................................................... 42

    2.11 Zell-Proliferationsanalyse durch Fluoreszenzmarkierung............... 42

    2.12 Zell-Proliferationsanalyse durch ein colorimetrisches Verfahren... 43

    2.13 Cytotoxizitäts-Analyse ........................................................................ 44

    2.14 Gewinnung konditionierter Medien von Leukozyten........................ 45

    2.15 Durchflußcytometrie ........................................................................... 46

    2.16 Funktionsassays ................................................................................. 48 2.16.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array ......................................................48 2.16.2 Quantifizierung freigesetzter Cytokine.......................................................50 2.16.3 Chemotaxis-Bioassay................................................................................52 2.16.4 Expression von Adhäsionsmolekülen........................................................53 2.16.5 DNA-Fragmentierung (Apoptose)..............................................................54

    II

  • Inhaltsverzeichnis

    2.17 Analyse der Nickelfreisetzung ........................................................... 55

    2.18 Einfluß von NiCl2 auf Zellaktivierung................................................. 55

    2.19 Statistik ................................................................................................ 56

    3 ERGEBNISSE .......................................................................................... 57

    3.1 Gradientenwerkstoff............................................................................ 57

    3.2 Analyse der Osteoblastenproliferation durch quantitative digitale Bildanalytik .......................................................................................... 59

    3.3 Quantifizierung der Osteoblastenproliferation durch ein colori- metrisches Verfahren.......................................................................... 63

    3.4 Bestimmung der Cytotoxizität durch Quantifizierung der LDH- Aktivität ................................................................................................ 64

    3.5 Apoptose.............................................................................................. 65

    3.6 Zelladhäsion ........................................................................................ 71 3.6.1 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf beschichteten und unbeschich-

    teten Probekörpern....................................................................................71 3.6.2 Adhärenz von Granulozyten auf besch