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Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan- Formgedächtnislegierungen Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt in der Chirurgische Forschung der Chirurgischen Klinik und Poliklinik der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil Universitätsklinik Bochum vorgelegt von Denise Bogdanski aus Gelsenkirchen Bochum 2005

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Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am

Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt in der Chirurgische Forschung der

Chirurgischen Klinik und Poliklinik der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken

Bergmannsheil Universitätsklinik Bochum

vorgelegt von Denise Bogdanski

aus

Gelsenkirchen

Bochum 2005

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Tag der mündlichen Prüfung: 22.12.05 1. Gutachter Prof. Dr. M. Köller

2. Gutachter Prof. Dr. K. P. Hoffmann

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Inhaltsverzeichnis

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1 EINLEITUNG .............................................................................................. 1

1.1 Implantat-Biomaterialien....................................................................... 1 1.1.1 Metalle und Metall-Legierungen ..................................................................3 1.1.2 Polymere .....................................................................................................3 1.1.3 Keramiken ...................................................................................................3

1.2 Biokompatibilität ................................................................................... 4 1.2.1 Biologische Beurteilung von Medizinprodukten: DIN EN ISO 10993 ..........6

1.3 Biofunktionalität .................................................................................... 8

1.4 Nickel-Titan Formgedächtnislegierungen ........................................... 9 1.4.1 Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen als Implantatmaterial................11 1.4.2 NiTi-Biokompatibilität.................................................................................12 1.4.3 Nickelfreisetzung aus NiTi .........................................................................13

1.5 Nickel Toxizität .................................................................................... 15 1.5.1 Nickel-Allergie ...........................................................................................15

1.6 Optimierung der Biokompatibilität von NiTi durch Beschichtung.. 16 1.6.1 Calciumphosphat-Schicht aus wässriger übersättigter Lösung.................17

1.7 Vergleichende Zell-Reaktions-Analysen ........................................... 19 1.7.1 Leukozyten ................................................................................................19 1.7.2 Osteoblasten .............................................................................................20 1.7.3 Cytokine ....................................................................................................21 1.7.4 Adhäsionsmoleküle ...................................................................................22 1.7.5 Chemotaxis ...............................................................................................24 1.7.6 Apoptose ...................................................................................................25

1.8 Fragestellung....................................................................................... 25

2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 27

2.1 Materialien............................................................................................ 27 2.1.1 Reagenzien/Puffer.....................................................................................27 2.1.2 Verbrauchsmaterial ...................................................................................28 2.1.3 Cytokine (Standards).................................................................................29 2.1.4 Antikörper ..................................................................................................29 2.1.5 Assays.......................................................................................................29 2.1.6 Zelllinien ....................................................................................................30 2.1.7 Metalle.......................................................................................................30 2.1.8 Software ....................................................................................................30 2.1.9 Geräte .......................................................................................................31

I

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Inhaltsverzeichnis

2.2 Gradientenwerkstoff............................................................................ 32

2.3 Metallprobekörper ............................................................................... 34

2.4 Calciumphosphat-Beschichtung........................................................ 34

2.5 Zellkultur .............................................................................................. 35 2.5.1 Kultivierung von Osteoblasten-Zelllinien und Fibroblasten........................35 2.5.2 Subkultivierung und Ernte der Zellen ........................................................35 2.5.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen............................................................36

2.6 Isolierung humaner Leukozyten ........................................................ 36

2.7 Isolierung humaner Thrombozyten.................................................... 38

2.8 Zelladhärenz-Analysen ....................................................................... 38 2.8.1 Inkubation von Osteoblasten mit Metallprobekörpern ...............................38 2.8.2 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf Calciumphosphat-beschichteten

und unbeschichteten Probekörpern...........................................................38 2.8.3 Leukozytenadhärenz an Calciumphosphat-beschichteten und unbe-

schichteten Metallprobekörpern ................................................................39 2.8.4 Fluoreszenzmikroskopische Vital-Färbung mit Calcein-AM und Propi-

diumjodid ...................................................................................................39

2.9 Mikroskopie ......................................................................................... 40 2.9.1 Durchlichtmikroskopie ...............................................................................40 2.9.2 Fluoreszenzmikroskopie............................................................................41 2.9.3 Rasterelektronenmikroskopie....................................................................41

2.10 Quantitative Bildanalytik..................................................................... 42

2.11 Zell-Proliferationsanalyse durch Fluoreszenzmarkierung............... 42

2.12 Zell-Proliferationsanalyse durch ein colorimetrisches Verfahren... 43

2.13 Cytotoxizitäts-Analyse ........................................................................ 44

2.14 Gewinnung konditionierter Medien von Leukozyten........................ 45

2.15 Durchflußcytometrie ........................................................................... 46

2.16 Funktionsassays ................................................................................. 48 2.16.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array ......................................................48 2.16.2 Quantifizierung freigesetzter Cytokine.......................................................50 2.16.3 Chemotaxis-Bioassay................................................................................52 2.16.4 Expression von Adhäsionsmolekülen........................................................53 2.16.5 DNA-Fragmentierung (Apoptose)..............................................................54

II

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Inhaltsverzeichnis

2.17 Analyse der Nickelfreisetzung ........................................................... 55

2.18 Einfluß von NiCl2 auf Zellaktivierung................................................. 55

2.19 Statistik ................................................................................................ 56

3 ERGEBNISSE .......................................................................................... 57

3.1 Gradientenwerkstoff............................................................................ 57

3.2 Analyse der Osteoblastenproliferation durch quantitative digitale Bildanalytik .......................................................................................... 59

3.3 Quantifizierung der Osteoblastenproliferation durch ein colori-metrisches Verfahren.......................................................................... 63

3.4 Bestimmung der Cytotoxizität durch Quantifizierung der LDH-Aktivität ................................................................................................ 64

3.5 Apoptose.............................................................................................. 65

3.6 Zelladhäsion ........................................................................................ 71 3.6.1 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf beschichteten und unbeschich-

teten Probekörpern....................................................................................71 3.6.2 Adhärenz von Granulozyten auf beschichteten und unbeschichteten

Probekörpern.............................................................................................73 3.6.3 Adhärenz von Lymphozyten/Monozyten auf beschichteten und unbe-

schichteten Probekörpern..........................................................................75 3.6.4 Adhärenz von Thrombozyten auf beschichteten und unbeschichteten

Probekörpern.............................................................................................76

3.7 Funktionsassays ................................................................................. 77 3.7.1 Expression von Adhäsionsmolekülen........................................................77 3.7.2 Chemotaxis-Bioassay................................................................................80

3.8 Analyse der Cytokinfreisetzung......................................................... 82 3.8.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array ......................................................82 3.8.2 Cytokinquantifizierung von Leukozyten durch ELISA................................83

3.9 Analyse der Nickelfreisetzung aus NiTi-Probekörpern .................... 85

3.10 Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel(II)-Chlorid .............. 87

3.11 Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel(II)-Chlorid nach Zellstimulation ..................................................................................... 88

4 DISKUSSION............................................................................................ 91

III

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Inhaltsverzeichnis

4.1 Bewertung der Biokompatibilität ....................................................... 91

4.2 Gradientenwerkstoffe zur ersten schnellen Analyse der Biokom-patibilität............................................................................................... 92

4.3 Zelladhäsion als ein Parameter der Biokompatibilität ..................... 94

4.4 Zellproliferation als Kriterium für Biokompatibilität......................... 96

4.5 Die Bedeutung einer Cytokinfreisetzung für die Beurteilung von Biokompatibilität ................................................................................. 99

4.6 Der Einsatz konditionierter Medien zur Beurteilung der Biokom-patibilität ............................................................................................ 101

4.6.1 Die Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen durch kondi-tionierte Medien.......................................................................................103

4.6.2 Konditionierte Medien und Apoptose.......................................................104

4.7 Nickel-Freisetzung aus NiTi.............................................................. 105

4.8 Nickelallergie ..................................................................................... 110

5 ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................... 112

6. SUMMARY ............................................................................................. 115

7 LITERATURVERZEICHNIS.................................................................... 118

ERKLÄRUNG ................................................................................................ 128

CURRICULUM VITAE ................................................................................... 129

EIGENE PUBLIKATIONEN ........................................................................... 130

DANKSAGUNG............................................................................................. 131

IV

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Verwendete Abkürzungen

Verwendete Abkürzungen

AM Acetoxymethylester

BSA Bovines Serumalbumin

BMP bone morphogenetic protein

CaP Calciumphosphat

CD cluster of differentiation

CGF colonic growth factor

Co-Cr Kobalt-Chrom

CSF colony stimulating factor

ConA Concanavalin A

DMSO Dimethyl-Sulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

Zellkulturen

ECACC Europäische Sammlung von Zellkulturen

ECL enhanced chemiluminescence

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EDX Energie-dispersive Röntgenspektroskopie

ELISA enzyme linked immunosorbent assay

FACS fluorescence activated cell sorter

FCS fötales Kälberserum

FSC forward scatter

FGF fibroblast growth factor

FGL Formgedächtnislegierung

FITC Fluoreszeinisothiozyanat

GM-CSF granulocyte colony stimulating factor

HAP Hydroxylapatit

HRP horse radish peroxidase

ICAM intercellular adhesion molecule

IFN Interferon

IL Interleukin

KM konditionierte Medien

LDH Lactat-Dehydrogenase

LECAM L-Selektin, CD62L

V

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Verwendete Abkürzungen

LPS Lipopolysaccharid

MG-63 Osteosarkoma-Zellen

MTT Methyltetrazolium

MCP Makrophagen Chemoattraktorprotein

MFI mittlere Fluoreszenz-Intensitäten

NiTi Nickel –Titan

Ni Nickel

mRNA messenger-Ribonukleinsäure

PE Phycoerythrin

PerCP Peridin Chlorophyll

PBMC periphere mononukleäre Zellen

PBS Phosphate Buffered Saline

PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten

PMT Photomultiplier

ppm parts per million

Ras Rat sarkoma (Protein der kleinen G-Protein-Gruppe)

REM Rasterelektronenmikroskopie

SAOS-2 Osteosarkoma-Zellen

SCS supersaturated calcium phosphate solution

SFB Sonderforschungsbereich

SSC sideward scatter

STAT signal transducers and activators of transcription

Tab. Tabelle

TdT terminale Desoxyadenylattransferase

Ti Titan

Ti6Al4V Titan-Aluminium-Vanadium-Legierung

TGF transforming growth factor

TMB Tetramethylbenzidin

TNF Tumornekrosefaktor

TUNEL terminale desoxyribosyl-transferase mediated dUTP nick

end labeling

TSST-1 toxic shock syndrome toxin-1

XRD Röntgenpulverdiffraktometrie

VI

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Einleitung

1 Einleitung

Künstliche Implantate sind heute unersetzliche medizinische Gewebs-

substitute. Sie ermöglichen es dem Patienten, nach Unfall, Krankheit oder de-

generativer, schmerzhafter Funktionseinschränkung wieder eine höhere Le-

bensqualität zu erreichen. So unterstützen Implantate z.B. geschädigte Hartge-

webe (Knochen) oder Weichteilgewebe (z.B. Gefäße) und übernehmen

bestimmte Funktionen.

Die zunehmende Anzahl unterschiedlicher Implantatmaterialien in der moder-

nen Medizin bei stetigen Neuentwicklungen von innovativen Biomaterialien (z.B.

poröse Metalle, poröse Calciumphosphat- oder Carbonat-Verbindungen, nano-

strukturierte Oberflächen) erfordert eine schnelle und auch präoperative Ana-

lyse hinsichtlich der Biokompatibilität und gegebenenfalls des individuellen Al-

lergisierungspotentials.

1.1 Implantat-Biomaterialien

Das National Institute of Health definierte den Begriff „Biomaterial“ als:

„Jede von einem Arzneimittel zu unterscheidende Substanz oder Kombination von Substanzen natürlichen oder synthe-tischen Ursprungs, die für unlimitierte Zeit als Ganzes oder als Teil des menschlichen Körpers verwendet werden kann, um ein Gewebe, ein Organ oder eine Funktion des menschlichen Körpers zu behandeln, zu vermehren oder zu ersetzen“ (1987).

Biomaterialien sind damit Werkstoffe, die im direkten Kontakt mit dem Organis-

mus stehen. Sie dürfen keine unerwünschte Wirkung auf den Organismus aus-

üben, sie sollen vom Körper mindestens toleriert bzw. im günstigsten Fall wie

körpereigenes Material akzeptiert werden.

An Biomaterialien werden unterschiedliche Ansprüche gestellt. Zum einen wird

eine hohe mechanische Belastbarkeit, Verschleißarmut und Langlebigkeit wie

z.B. bei Hüft- oder Gelenkprothesen gefordert. Zum anderen sind im Bereich

der Knochenrekonstruktion resorbierbare Implantate wünschenswert. Einerseits

werden also inerte, passive Implantatmaterialien benötigt, andererseits aber

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Einleitung

auch aktivierende Werkstoffe, die mit dem Organismus in Wechselwirkung tre-

ten und aktiv die körpereigene Regeneration induzieren und fördern. Die Vor-

aussetzung ist jedoch die Charakterisierung und das Verständnis der Zusam-

menhänge der Wechselwirkungen zwischen dem Biomaterial und dem Orga-

nismus bzw. Gewebe.

Bezüglich der biologischen Verträglichkeit können Biomaterialien folgenderma-

ßen eingeteilt werden:

Einteilung Definition

Biotolerante Materialien werden vom umliegenden Gewebe als fremd er-

kannt, mit einer Bindegewebsschicht umschlossen

aber nicht abgestoßen.

Bioinerte Materialien gehen beim Kontakt mit dem umliegenden Gewebe

keine chemischen Bindungen ein.

Bioaktive Materialien sind zu chemischen und biologischen Wechselwir-

kungen mit dem Gewebe wie z.B. Knochen

befähigt.

Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Beurteilung von Implantat-Biomaterialien

stellt die Verweildauer des Implantats im Organismus dar. Ultrakurzzeitimplan-

tate sind Implantate, die nur kurz mit dem Körper in Kontakt kommen, z.B. chir-

urgische Instrumente bei einer Operation. Unter Kurzzeitimplantate versteht

man Implantate, die nach einer vorhersehbaren Zeit wieder aus dem Körper

entfernt werden wie z.B. Osteosyntheseplatten, die zur Behandlung von Kno-

chenfrakturen eingesetzt werden. Dauer- oder Permanentimplantate sollten

derart konzipiert werden, dass sie für die Restlebensdauer des Patienten im

Körper verbleiben können.

Je nach Anforderung kommt heute eine sehr große Zahl verschiedenster Mate-

rialien zum klinischen Einsatz. Dabei können drei Hauptklassen an Materialien

unterschieden werden: Metalle bzw. Metall-Legierungen, Polymere (synthetisch

und natürlich), Keramiken und Verbundwerkstoffe dieser Materialien.

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Einleitung

1.1.1 Metalle und Metall-Legierungen

Metalle sind die am meisten verwendeten Werkstoffe in der Medizin und

finden hauptsächlich zwei Anwendungsgebiete. Zum einen werden sie bei Pro-

thesen wie Knie-, Hüft- oder Schulterprothesen eingesetzt. Zum anderen kom-

men sie als Hilfsmittel zur Fixierung von Strukturen als Schrauben, Osteo-

syntheseplatten, Drähte, Marknägel und Stents zum Einsatz. Die drei häu-

figsten verwendeten Implantatmetalle sind: rostfreier Stahl, Kobalt-Chrom-Le-

gierungen und Titan bzw. Titanlegierungen. Die mechanischen Eigenschaften

wie Stabilität, Elastizität und eine gute Verformbarkeit (Duktilität) machen Me-

talle zu besonders geeigneten Implantatmaterialien. Nachteilig ist allerdings die

mögliche Entstehung von Korrosion und damit die mögliche Sensibilisierung

gegen freiwerdende Metallionen wie z.B. Nickel- oder Kobaltionen.

1.1.2 Polymere

Polymere sind langkettige Moleküle, die aus vielen gleichen oder ähnlichen

Einheiten (Monomeren) bestehen. Der Vorteil von Polymeren ist durch eine ge-

zielte Synthese, Modifizierung oder Mischung maßgeschneiderte Eigenschaften

für das jeweilige Einsatzgebiet zu schaffen. Allerdings reichen die mecha-

nischen Eigenschaften nicht an die von Metallen heran. Polymere werden z.B.

als Knochenzement, Implantate (Kunststoffauskleidung der künstlichen Gelenk-

pfanne) oder Zahnfüllmaterial eingesetzt. Als natürliches Polymer wird vor allem

Kollagen vom Typ I in Medizinprodukten eingesetzt. Als Quellen dienen vorwie-

gend Rinderhaut oder -sehnen.

1.1.3 Keramiken

Die Keramiken werden im Wesentlichen in zwei Gruppen unterteilt: die

Hartkeramiken (z.B. Gelenkköpfe und –pfannen), bei denen die guten mecha-

nischen Eigenschaften im Vordergrund stehen und die meist auf Calciumphos-

phatbasis bestehenden biodegradierbaren Keramiken (z.B. Implantatbeschich-

tungen). Diese Keramiken werden vor allem in der Unfallchirurgie und Orthopä-

die eingesetzt, hier steht eine gute Interaktion mit dem umgebenden Gewebe

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Einleitung

im Vordergrund. Im Vergleich zu Metallen und Polymeren zeigen Keramiken

eine hohe Sprödigkeit und eine daraus resultierende aufwändige Verarbeitung.

Der Vorteil allerdings liegt bei der ungewöhnlich hohen Härte dieses Materials.

Abb. 1. Implantat-Biomaterialien. A) System aus einem Polymer zur Stabilisierung von Kno-

chenfragmenten im Gesichtsbereich (verändert nach Wintermantel et al. 1999), B) Keramikhüft-

köpfe (Isp GmbH), C) Hüftpfanne (ESKA GmbH) und D) kombiniertes-Implantat (Hüften-

doprothese, Ceraver)

1.2 Biokompatibilität

Biomaterialien für Medizinprodukte mit Anwendungen im menschlichen

Körper erfordern eine vollständige Integration in den Organismus und eine opti-

mierte Interaktion mit dem entsprechenden Gewebe am Anwendungsort. Ob ein

Werkstoff eine ausreichende Biokompatibilität besitzt, hängt unter anderem von

dem vorgesehenen Einsatzort und der Einsatzdauer ab. Materialien, die in Kon-

takt mit Blutbestandteilen und Gefäßen kommen, müssen eine hohe Hämo-

kompatibilität aufweisen. Werden sie im Kontakt mit Weich- oder Hartgewebe

4

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Einleitung

eingesetzt, ist eine entsprechende Gewebeverträglichkeit erforderlich. Beson-

dere Anforderungen müssen an Biomaterialien gestellt werden, die in Biohy-

bridsystemen eingesetzt werden, wo sie in Kontakt mit sowohl Blut bzw.

Plasma als auch Gewebezellen kommen. Die Biokompatibilität eines Materials

sollte nicht gleichgesetzt werden mit der “biologischen Verträglichkeit”, deren

einziges Merkmal der toxische bzw. schädigende Effekt auf biologische Sys-

teme ist. Eine Analyse auf mögliche Cytotoxizität sollte daher bei allen Materi-

alien als eine Basisuntersuchung voran gehen, um die Grundtauglichkeit als

Biomaterial festzustellen. Gegenwärtige Implantatentwicklungen machen jedoch

weiterführende Analysen notwendig. Die Biokompatibilität wurde von Williams

(2003) in Abhängigkeit von der Implantatanwendung hier speziell für Langzeit-

implantate wie folgt neu definiert:

Die Biokompatibilität eines Medizinproduktes für die Langzeit-anwendung bezieht sich auf die Fähigkeit des Produktes die vorgesehene Funktion mit dem erwünschten Grad der Integra-tion in den Organismus auszuführen, ohne in diesem jegliche unerwünschten lokalen oder systemischen Effekte auszulö-sen.

In dieser Definition werden die aktiven Wechselwirkungen zwischen Biomaterial

und Organismus betont und dass ein bestimmtes Material für bestimmte An-

wendungen geeignet ist, für andere Anwendungen hingegen nicht.

Nach dem heutigen Stand der Biomaterialforschung existiert kein universeller,

standardisierbarer Test zur Objektivierung der Biokompatibilität. Die typische

Situation nach Implantation von Biomaterialien ist eine inflammatorische Reak-

tion (Fremdkörperreaktion), wobei Ausprägung und Dauer individuell starke Un-

terschiede aufweisen. Bisherige Methoden zur Analyse der Biokompatibilität be-

ruhen oft auf Cytotoxizitäts- bzw. Proliferationsanalysen bestimmter Testzell-

linien (z.B. Mausfibroblasten oder Osteoblastenzelllinien) in Anlehnung an die

DIN EN ISO 10993 (Biologische Beurteilung von Medizinprodukten, 2003). Der-

artige Zelllinien und Analysen reichen jedoch als Testsysteme nicht immer aus,

um Informationen über die Biokompatibilität in einer differenzierteren Zell- und

Gewebeumgebung ermitteln zu können. Daher ist es sinnvoll, neben den Cyto-

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Einleitung

toxizitäts- bzw. Proliferationsanalysen auch funktionelle Analysen mit Hilfe im-

munologischer Methoden zur Testung der Biofunktionalität heranzuziehen. Mit

den Möglichkeiten der modernen zellbiologischen und immunologischen Ana-

lytik können neue Biomaterialen vor dem tierexperimentellen Einsatz bzw. vor

der klinischen Erprobung genauer charakterisiert werden, und eine patienten-

spezifische in vitro Diagnostik könnte ggf. das mögliche Risikopotential z.B. hin-

sichtlich allergischer Reaktionen vermindern.

1.2.1 Biologische Beurteilung von Medizinprodukten: DIN EN ISO 10993

Eine fachgerechte biologische Beurteilung ist Voraussetzung dafür, dass

Medizinprodukte sicher und ohne unerwünschte Nebenwirkungen eingesetzt

werden können. Die DIN EN ISO 10993 (harmonisierte, europäische Norm

2003) gibt den Rahmen vor, innerhalb dessen eine biologische Beurteilung ge-

plant werden soll, um die Anzahl und Belastung von Versuchstieren zu minimie-

ren. Sie beschreibt die allgemeinen Grundsätze, die für die biologische Beur-

teilung von Medizinprodukten gelten. Sie enthält eine Einteilung von Medizin-

produkten nach Kontaktdauer (Tab. 1) und Applikationsort (Tab. 2), sowie eine

Auswahl geeigneter Prüfverfahren.

Tab. 1. Einteilung von Medizinprodukten nach der Kontaktdauer (Quelle: DIN EN ISO 10993).

Kontaktdauer Beschreibung

Kurzzeitig Medizinprodukte, deren einmalige oder mehrfache Anwendung oder

Kontaktdauer wahrscheinlich bis zu 24 Stunden dauert

Längerer Medizinprodukte, deren einmalige, mehrfache oder Langzeitanwendung

oder Kontaktdauer wahrscheinlich mehr als 24 Stunden, aber nicht län-

ger als 30 Tage dauert

Dauernd Medizinprodukte, deren einmalige, mehrfache oder Langzeitanwendung

oder Kontaktdauer mehr als 30 Tage dauert

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Einleitung

Tab. 2. Einteilung von Medizinprodukten nach der Art des Körperkontaktes (DIN EN ISO

10993).

Körperkontakt Körperoberfläche/ Applikationsort

Beschreibung

Gewebe, Knochen

Medizinprodukte, die hpts. mit Knochen in

Kontakt kommen, z.B. Knochenzemente,

orthopädische Nägel

Medizinprodukte, die hpts. mit Gewebe und

Gewebeflüssigkeiten in Kontakt kommen,

z.B. Sehnenersatz

Implantierbare Me-dizinprodukte

Blut Medizinprodukte, die hpts. mit Blut in Kon-

takt kommen, z.B. Herzklappen

Die in dieser Arbeit verwendeten Probekörper werden demnach als implan-

tierbare Medizinprodukte mit den Applikationsorten Gewebe und Knochen ein-

geteilt. Die Kontaktdauer wird als Dauerkontakt d.h. eine einmalige, mehrfache

oder Langzeitanwendung oder Kontaktdauer mit mehr als 30 Tagen eingestuft.

In den Tab. 3 und 4 sind die jeweiligen Prüfverfahren dargestellt, die für diese

Implantate vorgeschlagen werden.

Tab. 3. Prüfungen für dauerimplantierbare Medizinprodukte zur grundlegenden Beurteilung, die

in Erwägung gezogen werden müssen (DIN EN ISO 10993).

Einteilung Biologischer Effekt

Körper-kontakt

Kontaktdauer A-kurzzeitig

(≤ 24 h) B-länger (> 24 h

bis 30 Tage) C-dauernd (> 30

Tage)

Cyt

otox

izitä

t

Sen

sibi

lisie

rung

Irrita

tion

oder

intra

kuta

ne

Rea

ktiv

ität

Syst

emis

che

Toxi

zitä

t (a

kute

)

Sub

chro

nisc

he T

oxiz

ität

(Sub

akut

e)

Gen

toxi

zitä

t

Impl

anta

tion

Häm

okom

patib

ilitä

t

A X X X B X X X X X X X Gewebe/

Knochen C X X X X X X X A X X X X X X X B X X X X X X X X Blut

C X X X X X X X X

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Einleitung

Tab. 4. Prüfungen für dauerimplantierbare Medizinprodukte zur zusätzlichen Beurteilung, die in

Erwägung gezogen werden müssen (DIN EN ISO 10993).

Einteilung Biologischer Effekt

Körper-kontakt

Kontaktdauer A-kurzzeitig

(≤ 24 h) B-länger (> 24 h

bis 30 Tage) C-dauernd (> 30

Tage)

Chronische Toxizität

Kanzero-genität

Reproduktions- und Entwicklungs-

toxizität

Biode- gradation

A B Gewebe/

Knochen C X X A B Blut

C X X

Allerdings wird aufgrund der Vielfalt von Medizinprodukten darauf hingewiesen,

das nicht mit jedem Medizinprodukt alle in der jeweiligen Kategorie aufgeführten

Prüfungen durchzuführen sind (DIN EN ISO 10993-1). Für eine biologische Be-

urteilung werden folgende Prüfverfahren empfohlen: Cytotoxizität, Sensibili-

sierung, Gentoxizität, Implantation und für eine zusätzliche Beurteilung chro-

nische Toxizität und Kanzerogenität. Für jedes Prüfverfahren werden Anlei-

tungen zu den entsprechenden Prüfmethoden und z.B. Kontrollmaterialien ge-

geben.

1.3 Biofunktionalität

Die Biofunktionalisierung steht bei der Entwicklung von Biomaterialien

derzeit im Vordergrund, d.h. das Material soll z.B. durch besondere Oberflächen

(definierte Rauhigkeiten) oder durch Beschichtungen aktiv sein Umfeld beein-

flussen z.B. zu einem verbesserten Einwachsverhalten führen. Beispielsweise

lässt sich reines Titan sehr gut ohne adverse Reaktionen in den Körper, speziell

in den Knochen, einbringen, jedoch entsteht keine mechanische Anbindung an

den Knochen. Um eine mechanische Verankerung zu erreichen wird die Titan-

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Einleitung

oberfläche funktionalisiert, indem sie aufgeraut wird. Durch die Beschichtung

von Metallimplantaten z.B. mit Calciumphosphaten oder osteogenen Wachs-

tumsfaktoren (z.B. Bone Morphogenic Proteins, BMPs) wird eine Funktionalisie-

rung erreicht, die zu einer besseren Integration in das umgebende Gewebe

führt.

1.4 Nickel-Titan Formgedächtnislegierungen

Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen (NiTi-FGL) gehören zu einer

Familie von intermetallischen Materialien die auch „shape memory alloys“ ge-

nannt werden. Sie enthalten annähernd eine gleiche Menge aus Nickel (50 at%)

und Titan. Für den klinischen Einsatz sind sie besonders interessant, da sie für

ein Metall ungewöhnliche mechanische Eigenschaften aufweisen, dass sind

zwei Formgedächtniseffekte: der so genannte Einwegeffekt und die Pseu-

doelastizität. Der Einwegeffekt beruht auf dem „thermischen Erinnerungsver-

mögen“ des NiTi, nach einer Verformung des Ausgangszustandes behält das

NiTi seinen verformten Zustand solange bei, bis es erhitzt wird und dann wieder

in seine Ausgangsform zurückkehrt (Abb. 2 und 3).

Abb. 2. Büroklammer aus NiTi-FGL. A) Büroklammer im Ausgangszustand, B) mechanisch

verformte Büroklammer, C-E) verformte Büroklammer wird in ca. 90°C heißes Wasser getaucht

und kehrt wieder in den Ausgangszustand F) zurück.

9

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Einleitung

Verformung

Entlastung

Pseudoelastizität (konstante Temperatur)

Verformung

Erwärmen

Einwegeffekt

Austenit

Austenit

Martensit

Martensit

Abb. 3. Schematische Darstellung der martensitischen Umwandlung bei den Formgedächtnis-

effekten (Pseudoelastizität und Einwegeffekt). Verändert nach Memory Metalle GmbH.

Die Pseudoelastizität beruht auf dem „mechanischen Erinnerungsvermögen“,

dabei kehrt das NiTi auch nach starker Verformung durch eine äußere Belas-

tung, bei Entlastung wieder in seine Ausgangsform zurück (Lipscomb et al.

1996, Yahia et al. 2000) (Abb. 2 und 3). Im Gegensatz zu nicht pseudoelas-

tischen Metallen findet hier keine elastische Dehnung aufgrund des Ausein-

anderrückens von Atomen statt. So wird eine Elastizität konventioneller Metalle

um das 20-fache übertroffen. Bei beiden Formgedächtniseffekten ist die physi-

kalische Ursache, die so genannte martensitische Umwandlung (Abb. 3). NiTi

kann in zwei verschiedenen temperaturabhängigen Kristallstrukturen (Phasen),

„Martensit“ (Tieftemperaturphase) und „Austenit“ (Hochtemperaturphase) exis-

tieren. Beim Einwegeffekt wandelt sich die Tieftemperaturphase durch Erwär-

mung in die Hochtemperaturphase um, da die thermodynamische Stabilität von

der Temperatur abhängig ist, d.h. bei tiefen Temperaturen ist der Martensit sta-

10

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Einleitung

biler und bei hohen der Austenit. Bei der Pseudoelastizität entsteht bei einer

konstanten Temperatur durch Belastung aus dem Austenit der Martensit, da die

thermodynamische Stabilität der Phasen auch durch die mechanische Belas-

tung bestimmt wird. In einem bestimmten Temperaturbereich begünstigt also

eine mechanische Belastung den Martensit gegenüber dem Austenit, der wie-

derum ohne Belastung in diesem Temperaturbereich stabiler wäre. Die marten-

sitische Umwandlung kann als Scherprozess dargestellt werden, bei dem sich

alle Atome gleichzeitig von einer Ausgangsposition z.B. im Hochtemperaturbe-

reich in eine Endposition im Tieftemperaturbereich verschieben, ohne dabei

Nachbaratome zu ändern. Die Transitionstemperatur (Temperatur des Phasen-

überganges) und die mechanischen Eigenschaften sind abhängig von der Ni-

ckel-Titan-Zusammensetzung, den metallurgischen Behandlungen und können

so je nach Anwendung variiert werden.

1.4.1 Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen als Implantatmaterial

Die Anwendungsgebiete der NiTi-Materialien im medizinischen Bereich

haben sich seit den frühen 1970-er Jahren ständig vergrößert. In Deutschland

werden sie klinisch als intravaskuläre Stents, als orthodontische Drähte, als

Klammern in der Fußchirurgie und als sogenannte Mikro-Coils zum Verschluss

von Aneurysmen im Gehirn (Nattrass et al. 1998, Schneevoigt et al. 1999,

Ryhänen 1999) eingesetzt. Im Vergleich zu den chirurgischen Edelstählen wird

allerdings der hohe Nickelanteil des Materials problematisch gesehen, da ad-

verse Gewebereaktionen sowie Sensibilisierungen befürchtet werden. Der Ein-

satz von NiTi-FGL in der Medizin wird deswegen in Deutschland kontrovers dis-

kutiert (Bogdanski et al. 2002, Menne 1994, Riepe et al. 2002).

Gerade aufgrund der ausgezeichneten mechanischen Eigenschaften sollen

NiTi-FGL weitere Anwendungen im klinischen Bereich finden, z.B. als poröse

Biomaterialien. Poröse Metalle haben im Vergleich zu kompakten Metallen die

Vorteile, dass sie leichter sind und ein besseres Einwachsverhalten des umge-

benden Gewebes zeigen. Zusätzlicher Vorteil von pörosen NiTi-FGL ist die gute

Implantat-Knochen-Verbindung, sie führt zu geringerem Knochenabrieb als es

von anderen Materialien bekannt ist. Derzeit befindet sich u.a. ein neues Im-

plantat in klinischer Erprobung, bei der ein porös strukturiertes Metallimplantat

11

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Einleitung

(Nitinol, Actipore®, Biorthex Inc.) mit interkonnektierendem Porensystem als

Platzhalter in das ausgeräumte Bandscheibensegment platziert wird. Eine

Weiterführung dieser Entwicklung könnte die Nutzung von porösem NiTi als

Träger von bioaktiven Substanzen oder Stammzellen sein.

1.4.2 NiTi-Biokompatibilität

Beim Vergleich der Biokompatibilitäts-Analysen von NiTi-FGL werden

widersprüchliche Resultate in der Literatur beschrieben. Wataha et al. (1997)

konnten zeigen, dass NiTi eine gesteigerte Sekretion von IL-1β bei Monozyten

und die entsprechende IL-1β-Konzentration bei Endothelzellen eine Induktion

der Expression von ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) verursachte.

Das NiTi besitzt demnach ein Risiko zur Förderung einer inflammatorischen

Reaktion des Organismus. Shabalovskaya (2002) zeigte, dass NiTi keinen Ein-

fluss auf die Proliferation von humanen Lymphozyten hat. Auch Rocher et al.

(2004) stellten für NiTi eine mit Titan vergleichbare gute Cytokompatibilität von

humanen Zelllinien fest. NiTi-Stents mit unterschiedlicher Oberflächenbehand-

lung zeigten eine gute Zellproliferation von humanen Fibroblasten und in vivo

ein gutes Einwachsverhalten im Kaninchenmuskel (Trepanier et al. 1998). Im

Gegensatz dazu konnten Plant et al. (2005) bei humanen Endothelzellen aus

Nabelschnurvenen (HUVEC) eine Zunahme des oxidativen Stresses und einen

Verlust von VE-Cadherin und F-actin nach NiTi-Oberflächenbehandlung (Oxi-

dation durch Hitzebehandlung bei 300°C und 400°C) feststellen. PBMC

(peripheral blood mononuclear cells) treten vermehrt im Implantatlager im Fall

einer Immunreaktion oder einer Typ IV Allergie auf. Ryhänen et al. (1998)

konnten keinen Unterschied in der PBMC-Zellzahl zwischen den unterschied-

lichen Materialien (rostfreier Stahl, Titan-Aluminium-Vanadium-Legierung) mes-

sen. Im Cytotoxizitätstest (MTT, Methyltetrazolium) und Cytokompatibili-

tätstestungen konnten keine Biokompatibilitätsveränderungen von NiTi im Ver-

gleich zu reinem Titan oder 316L Edelstahl festgestellt werden (Armitage et al.

2003). Im Vergleich zu Kontrollansätzen ohne Testmaterial zeigte NiTi in der

Kokultur mit humanen Osteoblasten und Fibroblasten eine gleich hohe Prolife-

rationsrate, d.h. NiTi wird in vitro von Osteoblasten und Fibroblasten gut toleriert

(Ryhänen et al. 2000). In Anlehnung an die DIN EN ISO 10993 konnten eben-

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Einleitung

falls keine cytotoxische, allergische oder gentoxische Aktivität von NiTi be-

obachtet werden (Wever et al. 1997), so dass auf eine gute Kurzzeit-Biokompa-

tibilität geschlossen wurde. Sowohl die Überstände als auch die Korrosionspro-

dukte von NiTi-Stent-Drähten nach Anlegen eines Potentials von +1 Volt

(6 Stunden, 37°C) zeigten einen potentiell toxischen Effekt auf glatte Gefäß-

muskelzellen, speziell wenn die Nickelkonzentration 9 µg/ml überstieg (Shih et

al. 2000).

1.4.3 Nickelfreisetzung aus NiTi

Durch Korrosion im Organismus können Metallionen aus Implantaten

herausgelöst werden. Die Korrosionsresistenz eines Implantatmetalls ist cha-

rakterisiert durch die Bildung von Oxidschichten an der Oberfläche. Die Ober-

fläche von NiTi besteht zumeist aus einer Titandioxidschicht und nur im ge-

ringen Umfang aus Nickeloxiden (Shabalovskaya et al. 1996). Die Freisetzung

von Nickel aus NiTi ist proportional zur Nickelkonzentration an der Oberfläche,

die Nickelkonzentration wiederum ist stark abhängig von der Oberflächenbe-

handlung (z.B. Polieren, Ätzen) (Shabalovskaya 2002). Deshalb existieren in

der Literatur sehr unterschiedliche Angaben zur Nickelfreisetzung aus NiTi, je-

der Autor verwendet unterschiedliche Probengrößen und -geometrien und

Oberflächenbehandlungen. In der Tab. 5 sind die wichtigsten Referenzen zur

Nickelfreisetzung dargestellt. Im Vergleich zu rostfreiem Stahl und Co-Cr-Legie-

rungen findet bei NiTi innerhalb der ersten Tage nach Eintauchen in eine Lö-

sung eine erhöhte Nickel-Freisetzung statt (6-11ng/L). Nach einigen Tagen

stimmt sie mit der Nickel-Freisetzung von rostfreiem Stahl und Co-Cr-Legie-

rungen überein und sinkt dann bis unter die Nachweisgrenze ab

(Shabalovskaya 2002). Ryhänen et al. (1997) analysierten die Nickelfreisetzung

von NiTi im Zellkulturmedium aus der Kokultur von NiTi mit humanen Osteo-

blasten und Fibroblasten. Sie stellten eine anfänglichen Nickelfreisetzung von

125-87 µg/L fest, im Gegensatz dazu konnte bei Edelstahl eine Nickelfreiset-

zung von 7 µg/L gemessen werden. Die Nickelfreisetzung von NiTi verminderte

sich allerdings nach zwei Tagen auf 23-5 µg/L (Edelstahl 11-1 µg/L). Weitere

Untersuchungen zur Nickelfreisetzung im künstlichen Speichel mit elektrother-

mischer Atomabsorptionsspektrometrie zeigten, dass aus NiTi-Drähten sig-

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Einleitung

nifikant mehr Nickel freigesetzt wird, als aus rostfreiem Stahl (Jia et al. 1999).

Wever et al. (1998) konnte stellten fest, dass eine Immersion von NiTi in

künstlicher Körperflüssigkeit (Hank´Solution) eine Reduzierung der Nickel-

Freisetzung von anfänglich 14.5 x 10 -7 µg/cm2 x s nach 10 Tagen unter die

Nachweisgrenze verursachte. NiTi setzte nach 3 Tagen in Kokultur mit

Epithelzellen 0,081 ± 0,006 mg/L und nach 6 Tagen 0,176 ± 0,008 mg/L

Nickelionen frei. Im Vergleich dazu setzt reines Nickel nach 3 Tagen Kokultur

mit Epithelzellen 6,500 ± 0,037 mg/L und nach 6 Tagen 11,364 ± 0,034 mg/L

Nickelionen frei (Rocher et al. 2004). Durch das Anlegen eines Potentials von

+1 Volt an NiTi-Drähten wird nach 6 Stunden bei 37°C mehr Nickel freigesetzt

(208 ± 12 mg/L) als bei einfacher Immersion für 24 Stunden bei 37 °C (0,95 ±

0,23 mg/L) (Shih et al. 2000). Die Nickelfreisetzung von orthodontischen

Drähten in künstlichem Speichel wird im Vergleich zu unbelasteten Proben (1,4

- 1,6 µg/L) während einer mechanischer Belastung (1mm/min, 24 Stunden,

38°C ± 0,2 °C) erhöht (2,3 µg/L) (Jia et al. 1999).

Tab. 5. Wichtigsten Referenzen zur Nickelfreisetzung aus NiTi.

Material Nickelfreisetzung Referenz

Plättchen mit 12 and 15 mm Durchmesser und 1,2 mm Höhe

81 ± 6 µg/L nach 3 Tagen, 176 ± 8 µg/L

nach 6 Tagen

Rocher et al. 2004

Plättchen (1cm2), unterschiedliche Oberflächen-Behandlungen

6-11 µg/L (je nach Oberflächen Behandlung)

Shabalovskaya 2002

Plättchen 6 x 7 mm 125 –87 µg/L initial, nach 2 Tagen 23-5 µg/L

Ryhänen et al. 1997

orthodontische–Drähte (80 mm), mit einer Oberfläche von

17,5 mm2

1,4 µg/L nach 24 h Jia et al. 1999

zyklierte orthodontische–Drähte (80 mm), mit einer Oberfläche von

17,5 mm2

2,3 µg/L 24 h zykliert

(1mm/min, 38°C) Jia et al. 1999

Drähte

Immersion ohne angelegtes Potential (24 h 37°C): 0,95 ±

0,23 mg/L Korrosives Medium (1,0 V

Potential, 6h 37 °C): 208 ± 12 mg/L

Shih et al. 2000

14

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Einleitung

1.5 Nickel Toxizität

Die Nickelaufnahme über die Nahrung liegt bei ca. 0,15 mg Nickel/Tag

und im Trinkwasser befinden sich zwischen 0,001 und 0,01 mg Nickel/L. Die

Toxizität eines Metalls innerhalb des Körpers ist von der Konzentration der frei-

gesetzten Metallionen und der Toxizität dieser Ionen abhängig. Nickel gehört zu

den essentiellen Spurenelementen. Ein Nickelmangel verursacht z.B. eine ver-

minderte Aktivität verschiedener Enzyme und Muskeldegeneration. Auf der an-

deren Seite können hohe Nickelkonzentrationen gesundheitsschädliche Effekte,

allergische Reaktionen oder sogar Karzinome verursachen. Nickel und seine

anorganischen Verbindungen gelten eher als mindergiftig, allerdings sind die

organischen Nickelverbindungen z.T. hochgiftig. Ni2+ gelangt über das Mg2+

Transportsystem über die Zellmembran in das Zellinnere.

1.5.1 Nickel-Allergie

Nickel ist der Hauptverursacher der sogenannten allergischen Kontakt-

dermatitis. Manche Schätzungen gehen davon aus, dass ein Fünftel aller Men-

schen überempfindlich auf Nickel reagieren. In den meisten Fällen werden

diese allergischen Reaktionen durch nickelhaltigen Schmuck, z. B. Ohrstecker

oder Piercing, Clips, Ringe oder Halsketten ausgelöst. Schon geringste Nickel-

freisetzungen können bei sensibilisierten Menschen eine Nickelallergie auslö-

sen. Die Kontaktdermatitis ist eine zellvermittelte Reaktion vom Spättyp (Typ-

IV-Reaktion nach Coombs und Gell) (Tab. 6), die eine spezifische Sensibilisie-

rung auf einen Stoff (Kontaktallergen) voraussetzt. Nickel als niedermolekulare

Substanz gehört zu den Kontaktallergenen (Haptene), die erst nach Bindung an

Proteine zu vollständigen Allergenen (Hapten-carrier-Komplex) werden. Das

Allergen wird von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, wodurch diese

aktiviert werden. Die aktivierten antigenpräsentierenden Zellen wandern zu den

lokalen Lymphknoten und präsentieren das Antigen zirkulierenden T-Lympho-

zyten. Unter dem Einfluss weiterer kostimulatorischer Signale wandeln sich

T-Zellen in reife Effektor- oder Memoryzellen um. Diese Zellen verlassen den

Lymphknoten und breiten sich im Körper aus. Nach abgeschlossener Sensibili-

sierungsphase führt ein wiederholter Kontakt des Allergens mit den antigen-

15

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Einleitung

sensibilisierten T-Zellen zu einer Freisetzung verschiedener Cytokine und Me-

diatoren (IL-1β , IL-1α, IL-6, IL-7, TNF-α, GM-CSF). Sie führen zur Aktivierung

von Makrophagen und mononukleären Zellen, sowie deren Wanderung an den

Ort der Antigenbelastung. Dies führt zu inflammatorischen Prozessen im Kör-

pergewebe oder in den Organen. Insbesondere die Schleimhäute von Augen,

Darm, Nase und Bronchien und die Haut neigen zu heftigen Reaktionen. Die

Symptome treten aber nicht sofort, sondern erst 12 bis 72 Stunden nach dem

Allergenkontakt auf, deswegen wird dieser Allergietyp auch Spättyp genannt.

Tab 6. Einteilung der Allergietypen nach Coombs und Gell (Janeway 2002).

Pathogenese

Dauer bis zum

Auftreten der Sym-

ptome

Krankheitsbilder (Beispiele) Antikörper Allergene

Typ I

die allergische

Sofortreaktion

IgE-Bildung und IgE-vermittelte Mediatorfrei- setzung (u.a.

Histamin)

< 30 Minuten

Heuschnupfen, Binde-

hautentzündung, Nesselsucht (Urtikaria),

Gastroenteritis, allergisches

Asthma, Anaphylaxie

(Schock)

IgE-vermittelt

z.B. Pollen, Milben,

Tierhaare, Schimmelpilze, Nahrungsmittel, Insektengifte, Arzneimittel

Typ II zellzerstörende (cytotoxische)

Antikörper in Minuten

z.B. Transfusions-

und Transplantations-

reaktionen, Autoim-

munreaktionen

Cytotoxische Antikörper

der Klassen IgG, IgM

-

Typ III Zirkulierende Immunkomplexe 3-8 Stunden

Exogen Allergische

Alveolitis, z.B. Farmerlunge,

Vogelhalterlunge

hauptsächlich durch IgG vermittelt

z.B. Schimmelpilze, Bakterien (ther-

mophile Aktinomyzeten)

Typ IV die

verzögerte Reaktion

durch sensibili-sierte Lympho-

zyten

24-48 Stunden

z.B. Kontaktekzem, Arzneimittel-Exanthem

keine (zellvermittelt)

Kontaktallergene (z.B. Nickel)

1.6 Optimierung der Biokompatibilität von NiTi durch Beschichtung

Um mögliche Nickel-Freisetzungen von NiTi zu verhindern und das An-

wachs- und Einwachsverhalten zu verbessern, kommen Beschichtungen in Be-

tracht. Als Beschichtungen können biologisch aktive Peptide und Bindungs-

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Einleitung

proteine bzw. Einzelsequenzen, Keramiken und Polymerfilme verwendet wer-

den. Entsprechend ihrer Anwendung z.B. als Knochenimplantat, können so

Materialien wie NiTi mit bioaktiven Substanzen beschichtet werden.

In den letzten zwanzig Jahren kam es zu einem gesteigerten Interesse an

Hydroxylapatiten (HAP, Ca10(PO4)6(OH)2) und verwandte Calciumphosphate

(CaP) in den Bereichen Biomaterialien und Biomineralisation. Das Interesse in

der Verwendung von HAP als Biomaterial hat mehrere Gründe: Einerseits weist

es eine hohe chemische Ähnlichkeit zu Apatit auf, ein natürliches Mineral, wel-

ches ein Hauptbestandteil der anorganischen Komponenten in Knochen und

Zähnen ist. Der Hauptbestandteil ist Karbonatapatit, ein Hydroxylapatit mit ei-

nem Karbongehalt von 4% bis 6%. Andererseits findet ein Prozess nach der

Implantation von HAP statt, den man als „spontaneous interfacial osteointegra-

tion“ bezeichnet, d.h. es entsteht eine knöcherne Verbindung zwischen Im-

plantat und Wirtsknochen.

Die Beschichtung von Metallimplantaten mit Calciumphosphat verbessert den

Kontakt von Knochen zum Implantat und führt zu einer stabilen Verbindung

(Willmann 1999, Dorozhkin et al. 2002). So lösen die beschichteten Implantate

keine adversen Antworten des Körpers aus, und die Calciumphosphate verbes-

sern stattdessen die Biokompatibilität und die Langzeit-Beständigkeit des Im-

plantates. Das Plasmaspray-Verfahren ist die Standardmethode für das be-

schichten von Metallimplantaten mit Calciumphosphat. Calciumphosphat-Pulver

wird durch Gasdruck versprüht und anschließend bis zur Schmelze erhitzt.

Beim Auftreffen auf die zu beschichtende Oberfläche kühlt das Calciumphos-

phat wieder ab und erstarrt zu einer einheitlichen Schicht. Zum Einsatz kommen

Plasmaspray-beschichtete Implantate in der Medizin als zementfreie Hüft-

schäfte und -pfannen sowie bei Zahnimplantaten.

1.6.1 Calciumphosphat-Schicht aus wässriger übersättigter Lösung

Die in dieser Arbeit verwendete Calciumphosphatschicht (Choi et al.

2003) ist im Gegensatz zum Plasmaspray-Verfahren eine Beschichtung aus

einer wässrigen übersättigten Calciumphosphatlösung (supersaturated calcium

phosphate solution, SCS), die bei Raumtemperatur stattfindet. Die Beschich-

tung des NiTi wurde unter Leitung von Herrn Prof. Epple am Institut für anorga-

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Einleitung

nische Chemie der Universität Duisburg-Essen durchgeführt. Die Calciumphos-

phatschicht soll neben den bereits erwähnten Vorteilen als Nickelbarriere und

biomimetisches Implantat-Interface dienen und somit das An- und Einwachs-

verhalten von Knochenimplantaten aus NiTi verbessern, d.h. die Biokompatibili-

tät und Biofunktionalität der NiTi-Formgedächtnislegierung erhöhen. Im Ver-

gleich zum Plasmaspray-Verfahren ist durch die Beschichtung aus wässriger

Lösung ggf. sogar eine Integration von bioaktiven Substanzen wie Wachs-

tumsfaktoren und Antibiotika sowie eine Beschichtung innerer Oberflächen (z.B.

poröse Materialien) möglich (Choi et al. 2003).

Die Beschichtung von NiTi mit Calciumphosphat erfordert eine Vorbehandlung

des Metalls. Zunächst werden die Metallplättchen mit einem organischen Lö-

sungsmittel (z.B. Ethanol) gereinigt und anschließend wird die NiTi-Oberfläche

mit Wasserstoffperoxid und Kaliumhydroxid angeätzt. Nach dem Ätzvorgang

erfolgt die Kristallisation durch Immersion in übersättigter wässriger Calcium-

phosphatlösung. Nach einer Immersion von 24h entsteht eine ca. 10 µm dicke

Schicht. Die Beschichtung der Probekörper mit Calciumphosphat zeigt eine

Morphologie mit typischen plättchenförmigen Kristallen (Abb. 4 A).

Abb. 4. Calciumphosphatschicht aus wässriger Lösung. A) einfache Immersion, B) doppelte

Immersion C) Ansicht von oben.

Bei der Calciumphosphatschicht handelt es sich um eine Mischphase aus Octa-

calciumphosphat und Hydroxylapatit (Choi et al. 2003). Durch eine zweite Im-

mersion wird eine verbesserte Stabilität der Beschichtung durch Quervernet-

zung erreicht (Abb. 4 B). Durch die Beschichtung aus wässriger übersättigter

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Einleitung

Lösung ist eine NiTi-Oberfläche entstanden, mit einer ähnlichen Zusammenset-

zung wie die mineralische Phase von Knochen, die sich für den Einsatz im

Knochenimplantat-Bereich eignen könnte.

1.7 Vergleichende Zell-Reaktions-Analysen

Wie bereits im Abs. 1.2.1. beschrieben verlangt die Norm DIN EN ISO

10993 definierte Analyseverfahren (Tab. 3 und 4) zur biologischen Bewertung

von Medizinprodukten. Diese Verfahren reichen jedoch für eine intensivere Be-

urteilung der Biofunktionalität und Biokompatibilität eines Implantatmaterials

nicht immer aus. Es bieten sich deshalb weiterführende Untersuchungen an wie

die biologische Analysemethode der Werkstoffe in Blut- und Zellkulturen. Aus

diesem Grund kamen in dieser Arbeit humane Leukozyten und Osteoblasten

zum Einsatz. Sie sollten zeigen, wie der Organismus auf unterschiedliche Mate-

rialien und Oberflächen reagiert. Diese Analysen orientierten sich an der kli-

nischen Relevanz, d.h. sie bezogen sich auf ein konkretes Implantat oder den

Einsatzort eines solchen. Der Knochenaufbau differiert stark im Vergleich zu

Muskeln oder etwa intravasalen Gewebe, so dass die entsprechenden Implan-

tate individuell für ihren Einsatzort und ihre Funktion im Körper gestaltet und

analysiert werden müssen.

1.7.1 Leukozyten

Die ersten Zellen, die i. a. mit einem Implantat in Kontakt treten, sind

Leukozyten (Eriksson et al. 2001). Dementsprechend liegt der experimentelle

Ansatz dieser Dissertation bei der Analyse der Interaktion von Leukozyten mit

dem Calciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten NiTi-Implantatmate-

rial.

Hauptaufgabe der Leukozyten ist die Abwehr von Krankheitserregern, um den

Körper vor Infektionen zu schützen. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei Ent-

zündungen, bakteriellen und parasitären Infektionen sowie bei allergischen Re-

aktionen und Autoimmunerkrankungen. Die Leukozyten setzen sich aus ver-

schiedenen Subpopulationen zusammen: im wesentlichen Granulozyten, Lym-

phozyten und Monozyten.

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Einleitung

Die neutrophilen Granulozyten sind mit 50 bis 80 Prozent die zahlenmäßig

stärkste Gruppe der Leukozyten. Sie sind die wichtigsten Funktionsträger im

unspezifischen Abwehrsystem des Blutes. Neutrophile Granulozyten bleiben

durchschnittlich nur sechs bis acht Stunden im Blutkreislauf. Beim Beginn von

Infektionen nehmen die neutrophilen Granulozyten im Blut besonders rasch zu,

um Bakterien und Gewebetrümmer zu phagozytieren.

Der Anteil der Lymphozyten beträgt zwischen 25 und 40 Prozent der Gesamt-

leukozyten beim gesunden Menschen. Davon befinden sich beim Erwachsenen

jedoch nur vier Prozent im Blutkreislauf. Rund 95 Prozent der im Knochenmark

und in den lymphatischen Organen (Thymus, Milz, Mandeln, den Peyerschen

Plaques und Lymphknoten) gebildeten Lymphozyten sind auch dort gespei-

chert. Bei Bedarf können sie in die Blutbahn abgegeben werden.

Mit 8 bis 12 Prozent sind die Monozyten die zahlenmäßig kleinste Gruppe der

Leukozyten. Unter diesen stellen sie jedoch mit einem Durchmesser von 12-20

µm die größten Zellen dar. Außerdem sind sie unter den Leukozyten am besten

in der Lage, Bakterien und Gewebetrümmer durch Phagozytose unschädlich zu

machen. Monozyten bleiben zwei bis drei Tage im peripheren Blut. Gemeinsam

mit den basophilen Granulozyten vermitteln und fördern sie allergische Reakti-

onen. Eine Erhöhung der Monozytenzahl findet sich regelmäßig auf dem Höhe-

punkt einer Infektion, der "monozytären Abwehrphase".

1.7.2 Osteoblasten

Die Analyse der Interaktion eines Implantatmaterials für den Einsatz im

bzw. am Knochen mit Osteoblasten ist eine Voraussetzung, da sie als Indika-

torzellen für das Knochenwachstum dienen.

Im Knochengewebe findet man drei Zellpopulationen Osteoblasten, Osteozyten

und Osteoklasten. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Morphologie und

Funktion, im Falle der Osteoklasten auch bezüglich der Herkunft. Die Osteo-

klasten dienen der Knochenresorption, sie sind mobile Zellen und stammen von

hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks ab.

Die Osteoblasten sind als knochenbildende Zellen mesenchymalen Ursprungs.

Sie produzieren die aus Osteoid und Kollagenfasern (Typ I) bestehende Inter-

zellularsubstanz des Knochengewebes und veranlassen deren Mineralisation.

20

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Einleitung

Bei fortschreitender Knochenbildung sind die Osteoblasten von mineralisierter

Matrix umgeben und werden dann Osteozyten genannt.

1.7.3 Cytokine

An der Regulation der interzellulären Kommunikation sowohl der Osteo-

blasten als auch der Leukozyten sind Wachstumsfaktoren und Cytokine im ho-

hen Maße beteiligt. Bei der Zellaktivierung kommt es zur Veränderung des

Cytokin-Expressionsmusters und der Konzentrationen, so dass Cytokine als ge-

eignete Parameter der Zellaktivierung dienen.

Cytokine sind hormonähnliche regulatorische Mediatoren. Sie wirken auf unter-

schiedliche Zelltypen und werden von vielen verschiedenen Zellen gebildet. In

der Regel werden sie nach Stimulierung produziert und sind in sehr geringen

Konzentrationen (pg bis ng) aktiv. Es handelt sich in der Regel um einfache

Polypeptide (5-100 kDa). Cytokine sind an der Regulierung der Ontogenese,

der Gewebereparatur, der Immunabwehr, der Entzündung, der Kontraktilität in

Herz und Gefäßen, der Aufrechterhaltung der Körperprozesse und der Apo-

ptose beteiligt. Die Funktion der Cytokine schließt zahlreiche Effekte auf die

Zellen des Immunsystems und die Regulierung entzündlicher Prozesse ein.

Mittlerweile sind eine große Zahl verschiedener Cytokine identifiziert worden.

Es gibt derzeit verschiedene Ansätze zur Klassifizierung der Cytokine. Teils

werden Cytokine nach ihrer Funktion, ihrer Struktur oder nach den Cytokinre-

zeptoren eingeteilt. Aus der Beschreibung der Funktion ergibt sich die her-

kömmliche Einteilung nach Interferonen (IFN), Interleukinen (IL-1 bis IL-23),

Tumornekrosefaktoren (TNF), Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF), Wachs-

tumsfaktoren (z.B. FGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF), Chemo-

kinen (z.B. MCP-1) und Virokinen (z.B. CGF). Allerdings zeigte sich, dass die

meisten Cytokine neben ihrer Haupteigenschaft auch weitere Funktionen ha-

ben.

Cytokine binden an hochaffine Rezeptoren und wirken in der Regel lokal. Sie

können auf die produzierende Zelle oder Zellen des gleichen Typs in autokriner

Weise wirken. Teils können sie auch auf andere Zelltypen in parakriner Weise

wirken. Beeinflussen sie Zellen in unmittelbarer Nähe, d.h. ist ein Zellkontakt

vorhanden, handelt es sich um einen juxtakrinen Effekt. Werden Cytokine mit

21

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Einleitung

dem Blut oder Gewebeflüssigkeiten transportiert, können sie auch auf weiter

entfernt liegende Zellen in endokriner Weise wirken.

Die Cytokinfunktionen werden durch die Interaktion mit den entsprechenden

hochaffinen Rezeptoren, den darauf folgenden Signaltransduktionswegen und

der anschließenden Genaktivierung bestimmt. Ein Drittel der bekannten Cyto-

kine z.B. IL-6 vermitteln ihre Wirkung über intrazelluläre Janus-Kinasen (Jak)

und/oder sogenannte STAT-(signal transducers and activators of transcription)

Faktoren. Weitere Cytokin-Rezeptor-Signaltransduktionswege können über G-

Proteine (z.B. Ras) und NF-кB zur biologischen Funktion führen.

Grundlegende Interaktionsmöglichkeiten von Cytokinen sind z.B. der synergis-

tische Effekt, bei dem in Gegenwart von mehreren Cytokinen eine stärkere Re-

aktion erreicht wird, als wenn nur eines der Cytokine vorhanden wäre. Beim

antagonistischen Wirkprinzip können bestimmte Cytokine die Produktion

anderer Cytokine oder Proteine blockieren. Weitere Interaktionsmöglichkeiten

sind: Stimulierung der Rezeptorexpression, Kompetition am Rezeptor, Bindung

an lösliche Rezeptoren, Herabregulation der Rezeptorexpression, redundante

Funktionen und pleiotrope Wirkung.

Der Knochenstoffwechsel unterliegt dem modulierenden Einfluss diverser, sys-

temisch wie lokal wirksamer Cytokine. Die Differenzierung und Proliferation von

Osteoblasten wird durch TGF-β stimuliert, zudem hemmt es auch die Wirkung

von Cytokinen wie IL-1, IL-6 und TNF-α. Die Knochenresorption wird von den

Cytokine wie IL-1, IL-6 sowie TNF-α beeinflusst. Diese Faktoren, meist von

Monozyten oder Granulozyten gebildet, aktivieren über verschiedene Me-

chanismen die Osteoklasten.

1.7.4 Adhäsionsmoleküle

Die adhäsiven Interaktionen von Zellen sind essentiell für die Prolifera-

tion, Differenzierung und viele andere Funktion der Zellen. Auch bei der zel-

lulären Kommunikation, wie sie bei zahlreichen physiologischen Prozessen

stattfindet, spielt die Zelladhäsion eine wesentliche Rolle. In physiologischen

Situationen wird unter Zelladhäsion der spezifische, Rezeptor-vermittelte Kon-

takt zwischen Zellen oder zwischen Zellen und der sie umgebenden extrazel-

lulären Matrix verstanden. Diese Interaktionen besitzen einerseits eine mecha-

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Einleitung

nische Funktion, die für die Elastizität und Zugfestigkeit, also für Gewebeinte-

grität und die Zellwanderung von Bedeutung sind. Zum anderen wirken die Ad-

häsionsrezeptoren auch als Signaltransmitter. Durch Adhäsion werden intra-

zelluläre Prozesse induziert, die zur Umstrukturierung des Cytoskeletts und zur

Induktion von Signalkaskaden führen können. Diese intrazellulären Vorgänge

können ihrerseits Affinität, Expressionsmuster und Spezifität des Rezeptors

beeinflussen.

Bei den Adhäsionsmolekülen handelt es sich um eine heterogene Gruppe von

Molekülen, die auf den Oberflächen der Zellen exprimiert werden. Dabei sind

einige der Adhäsionsmoleküle permanent vorhanden, bei anderen hingegen ist

die vorherige Aktivierung der Zelle durch entsprechende Mediatoren notwendig.

Bei den Adhäsionsmolekülen handelt es sich um transmembranäre Glykopro-

teine, die sich Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten in vier Großfamilien einteilen

lassen: die Cadherine, die Selektine, die Integrine und die Familie der Im-

munglobulin-Superfamilie.

Mitglieder der Cadherinfamilie sind Adhäsionsmoleküle, die in spezialisierten

Membranbereichen, wie der Zonula adherens und den Desmosomen von Epi-

thelzellen, lokalisiert sind. Die Familie der Selektine, bestehend aus den drei

Mitgliedern der L-(Leukozyten), P-(Plättchen) und E-(Endothel)–Selektine, wer-

den auf Endothelzellen und verschiedenen Blutzellen exprimiert. Während ent-

zündlicher Prozesse initiieren Selektine die Interaktion von Leukozyten mit En-

dothelzellen, das "Rollen", dem das Auswandern der Zellen aus dem Blut ins

Gewebe folgt. Die Zelladhäsionsmoleküle der Immunglobulinfamilie besitzen

eine oder mehrere Immunglobulin-Domänen. Die vierte Familie der Adhäsions-

moleküle stellen die Integrine dar, welche auf praktisch allen Zellen exprimiert

und bereits früh während der Embryonalentwicklung benötigt werden. Sie sind

beteiligt an Zellwachstum, Differenzierung, Immunantworten, Wundheilung aber

auch an pathologischen Prozessen wie der Tumorentstehung. Integrine binden

andere membranständige Adhäsionsrezeptoren auf benachbarten Zellen. Die

Funktion der Adhäsionsmoleküle zu definieren und in einzelne Klassen einzu-

teilen hat sich als sehr schwierig herausgestellt. Bei jeder Wechselwirkung zwi-

schen Endothel und zirkulierenden Leukozyten sind mehrere verschiedene

Paare Adhäsionsmoleküle beteiligt. Es ist also nicht möglich, einem Adhäsi-

onsmolekül eine bestimmte Zellbewegung zuzuordnen. Interzelluläre Adhäsi-

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Einleitung

onsmoleküle (ICAM) gehören zur Immunglobulin-Superfamilie. Sie spielen eine

wichtige Rolle bei immunologischen Vorgängen wie z.B. der Adhäsion von Leu-

kozyten an ein aktiviertes Endothel während der Chemotaxis. Eine Vielzahl von

vaskulären Zelladhäsionsmolekülen auf den Leukozyten sowie auf den Endo-

thelzellen vermittelt und kontrolliert die Adhäsion der Blutzellen an die Gefäß-

wand. Dadurch findet eine Steuerung der Leukozytenmigration in Entzün-

dungsherde statt. Dieser Prozess läuft in einer Kaskade von hintereinander ge-

schalteten molekularen Interaktionen ab. Zunächst vermitteln die Selektine, das

"Andocken" und "Rollen" der Leukozyten auf der Endotheloberfläche. Dies führt

zur Verlangsamung der Leukozyten und ermöglicht den Kontakt mit Signalstof-

fen auf der Endotheloberfläche, wie z. B. den Chemokinen. Diese stimulieren

die Aktivierung von Integrinen auf der Leukozytenoberfläche, die dann die effi-

ziente Bindung dieser Zellen an die Endotheloberfläche vermitteln. Als Ligan-

den der Integrine fungieren Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie. Die nun

stabil adhärierenden Leukozyten können sich gezielt fortbewegen und schließ-

lich aktiv durch die Endothelzellschicht hindurchwandern. Die Änderung der

Expression von Adhäsionsmolekülen wie z.B. das LECAM-1 korrelieren direkt

mit der Aktivierung von neutrophilen Granulozyten nach Chemotaxinbindung.

Das interzelluläre ICAM-1 ist das bisher am besten untersuchte Adhäsionsmo-

lekül. ICAM-1 kann im Bereich von Entzündungen auf den Endothelzellen

nachgewiesen werden.

1.7.5 Chemotaxis Die Chemotaxis ist der einleitende Schritt eines mehrschrittigen multifaktoriellen

Prozesses der Phagozytose. Die quantitative Analyse der neutrophilen Granu-

lozyten, die entlang eines Konzentrationsgradienten des konditionierten Medi-

ums wandern, sowie die Änderung der Expressionsdichte eines Adhäsionsmo-

leküls, sind immunologische Funktionsuntersuchungen, die eine Analyse der

biologischen Aktivität von löslichen Faktoren ermöglichen. Eine weitere Mög-

lichkeit die Biofunktionalität von Biomaterialien zu analysieren, ist die Bewer-

tung des Einflusses von löslichen Faktoren auf die Apoptose von Zellen.

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Einleitung

1.7.6 Apoptose

In der Entwicklung des Körpers und z.B. während der kontinuierlichen

Epithelbildung (z.B. Darmepithel), werden nicht nur Zellen neu gebildet, son-

dern sie gehen aufgrund des genetischen Bauplans auch gezielt zugrunde. Im

erwachsenen Organismus besteht ein Gleichgewicht zwischen Neubildung von

Zellen und kontrolliertem Verlust. Dies lässt sich besonders gut bei den Zellen

des Immunsystems beobachten. Hier entstehen ständig mehr Zellen als benö-

tigt, so dass die überschüssigen Zellen reguliert abgebaut werden. Dieser Vor-

gang folgt einem genetisch kontrollierten Programm, weshalb man auch vom

programmierten Zelltod oder auch von der Apoptose spricht. Dabei führen Ab-

schnürungen der Plasmamembran zu einer Verkleinerung des Zellvolumens,

und durch endonukleolytische Spaltung des Chromatins entstehen nukleoso-

male Fragmente. Die Apoptose erfolgt auch bei polymorphkernigen neutro-

philen Leukozyten (PMN), auch bei denen die mit Biomaterialien interagieren.

Physiologisch ist aus der inflammatorischen Sicht, die Apoptose ein Schlüssel-

prozess bei der Eliminierung der neutrophilen Leukozyten. Eine Änderung der

Zu- bzw. Abnahme der Apoptose beeinflusst die Funktionalität der PMN, wie

z.B. die Abwehr- oder Gewebsreaktionen.

1.8 Fragestellung

Formgedächtnislegierungen (FGL) auf der Basis von Nickel und Titan

(NiTi) zeigen für den klinischen Einsatz ungewöhnliche Eigenschaften (Form-

gedächtniseffekt und Pseudoelastizität). NiTi-FGL finden bereits als ortho-

dontische Drähte oder Klammern in der Fußchirurgie Verwendung. Jedoch sind

die medizinischen Anwendungen mit den bisherigen Entwicklungen als medizi-

nisches Implantat oder Instrument noch nicht ausgeschöpft. Die potentiellen

neuen Einsatzgebiete und Weiterentwicklungen der NiTi-FGL verlangen eine

prinzipielle und zielgerichtete Analyse der Biokompatibilität dieser Legierung.

Ziel dieser Arbeit war es, die Biokompatibilität und Biofunktionalität von Calci-

umphosphat-beschichteten und unbeschichteten NiTi-FGL zu analysieren.

Dazu wurden in vitro Assays etabliert, die es ermöglichen, eine genauere Pro-

gnose einer in vivo Implantat-Gewebe-Reaktion zu geben, als bisherige Ver-

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Einleitung

fahren (Cytotoxizität, Proliferation) das erlauben. Bei der Interaktion von unter-

schiedlichen Zellpopulationen mit den verschiedenen NiTi-Oberflächen sollten

diverse Parameter gemessen werden: die Zelladhärenz und die Zellprolifera-

tion. Weitergehend wurde die Zellaktivierung und Freisetzung löslicher Faktoren

(Cytokine) analysiert. Die biologische Gesamtaktivität der freigesetzten Fak-

toren, wurde als konditioniertes Medium in Funktionsassays analysiert. In der

Zellkultur wurden primäre humane Osteoblasten, humane osteoblastenartige

Osteosarkoma-Zelllinien, isolierte polymorphkernige neutrophile Granulozyten

(PMN), periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) und Thrombozyten mit den

Calciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten Probekörpern kokultiviert.

Als weitere Kontrolle dienten Zellen, die keinen Kontakt mit dem Implantatma-

terial hatten.

Neben der Zellkultur wurden folgende Methoden eingesetzt: Durchlicht-, Fluo-

reszenz- und Rasterelektronenmikroskopie, quantitative Bildanalyse, Cytotoxi-

zitätstest, Durchflußcytometrie (FACS), Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay

(ELISA), Protein-Array (Dot-Blot), mRNA Microarray, Chemotaxis- und Phago-

zytose-Bioassay, die Analyse der Expression von Adhäsionsmolekülen und der

Apoptose (DNA-Fragmentierung, FACS).

Diese Dissertation wurde im Rahmen des Sonderforschungsbereiches (SFB)

459 Formgedächtnistechnik (Grundlagen, Konstruktion, Fertigung) erstellt. Im

SFB 459 arbeitet eine interdisziplinäre Gruppe aus Ingenieurwissenschaftlern,

Naturwissenschaftlern und Medizinern.

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Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Reagenzien/Puffer

Reagenzien/Puffer Firma

Calcein-AM Calbiochem, Schwalbach

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

DNAse I Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

EDTA Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Einfriermedium (Cell Culture Freezing Medium)-DMSO Invitrogen, Karlsruhe

FACS™ Lyselösung (Lysing Solution) BD-Biosciences, Heidelberg

fötales Kälberserum (FCS) Invitrogen, Karlsruhe

Glutaraldehyd Sigma-Aldrich, Taufkirchen

HEPES, 20 mM Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Histopaque (1077, 1119) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Hyperfilm ECL, 18 x2 4 cm Amersham Biosciences, Freiburg

Natriumchlorid Lösung, 0,9% Delta Select GmbH, Pfullingen

Nickel(II)-Chlorid Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Phosphatpuffer (Phosphate Buffered Saline, PBS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Propidiumjodid Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA

Phosphorsäure, 1M Sigma-Aldrich, Taufkirchen

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Material und Methoden

Streptavidin, Meerettich-Peroxidase-gekoppelt Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Tetramethylbenzidin Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Tris-Puffer (Trizma®) Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Triton® X-100 Promega GmbH, Mannheim

Trypan-Blau Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Türksche Lösung Fluka BioChemika, Taufkirchen

Tween®-20 Sigma-Aldrich, Taufkirchen

Zellkulturmedium RPMI1640 Invitrogen, Karlsruhe 2.1.2 Verbrauchsmaterial

Material Firma

96 Mikrotiterplatte, MaxiSorp® Nunc, Roskilde, Dänemark

S-Monovette® K3E, 9 ml Sarstedt, Nümbrecht

S-Monovette® LH, 3,5 ml Sarstedt, Nümbrecht

Polystyrol Rundbodenröhrchen (Falcon) BD Biosciences, Heidelberg

Serologische Einmalpipetten Omnilab, Münster

Zellkulturplatten, 6- und 24-Well (Falcon) BD Biosciences, Heidelberg

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Material und Methoden

2.1.3 Cytokine (Standards)

Für den ELISA wurden für die Erstellung der Standardkurven rekombinante

humane Cytokine der Firma R & D Systems, Wiesbaden, eingesetzt: IL-1ra

(280-RA-010) , IL-2 (202-IL-010), IL-6 (206-IL-010), IL-8 (208-IL), IL-10 (217-IL),

TNF-α (210-TA), IFN-γ (285-IF).

2.1.4 Antikörper

Für den ELISA wurden monoklonale und biotinylierte Antikörper gegen

IL-1ra, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α und IFN-γ der Firma R & D Systems,

Wiesbaden, eingesetzt. In der Durchflußcytometrie wurden Antikörper gegen

CD11b, Cd62, CD62L und ICAM-1 der Firma BD-Biosciences, Heidelberg,

verwendet.

2.1.5 Assays

Name Firma

Cytokine Array III Firma RayBiotech Inc., Norcross, USA

Cytotoxizitäts-Assay (CytoTox 96 non- radioactive Cytotoxicity Assay) Promega GmbH, Mannheim

EZ4U (Easy for you) Biomedica Gesellschaft mbH, Wien

Fluorescein-FragELTM Oncogene Research Products, Boston, MA, USA

MIGRATEST™ Chemotaxis-Bioassay Orpegen Pharma, Heidelberg

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Material und Methoden

2.1.6 Zelllinien

Zellen Firma

Fibroblasten, murine (Swiss 3T3), ATCC: CCL-92

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig

MG-63 (osteoblastenartige Osteosarkoma-Zellen) ECACC, Salisbury, England

SAOS-2 (osteoblastenartige Osteosarkoma-Zellen)

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig

2.1.7 Metalle

Metall Firma

Nickel Goodfellow, Bad Nauheim

NiTi Memory Metalle GmbH, Weil am Rhein

Titan-Aluminium-Vanadium (Ti6AL4V) Goodfellow, Bad Nauheim

Titan Goodfellow, Bad Nauheim 2.1.8 Software

Programm Firma

Bildanalyseprogramm analySIS® 3.1 und 3.2 Soft Imaging System, Münster

CELLQuestTM 1.2.2 BD-Biosciences, Heidelberg

Photoshop 5.0 Adobe, Unterschleißheim

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Material und Methoden

2.1.9 Geräte

Gerät Firma

Biofuge-Pico Eppendorf, Hamburg

Color View II Soft Imaging System, Münster

Curix 160, Röntgenfilmentwickler Agfa, Köln

Digitalkamera Camedia C3030 Olympus, Hamburg

Digitalkamera D1x Nikon, Düsseldorf

Durchflußcytometer, FACSCalibur™ BD-Biosciences, Heidelberg

Fluoreszenzmikroskop BX61 Olympus, Hamburg

Inversionsmikroskop CK2 Olympus, Hamburg

Labortiefkühltruhe 6383 GFL, Burgwedel

LEO Gemini 1530 LEO, Oberkochen

Lichtmikroskop Olympus CK2 Olympus, Hamburg

Megafuge 1.0R Kendro-Heraeus, Hanau

Mikroplatten-Reader (MRX Revelation) Dynex Technologies, Denkendorf

Mikroplatten-Wascher AM-60 Dynex Technologies, Denkendorf

Rotationsplattform VSR23 Grant Instruments, Cambridge, Großbritannien

Schüttler IKA KS 260 basic IKA-Werke, Staufen

Sicherheitswerkbank HeraSafe, HS15 Kendro-Heraeus, Hanau

Kathodenzerstäubungsanlage, Edwards Sputter Coater S150B Edwards, West Sussex, England

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Material und Methoden

2.2 Gradientenwerkstoff

Der gradierte Probekörper (Abb. 5) wurde über pulvermetallurgische Ver-

fahren aus gemischten Element-Pulvern vom Lehrstuhl Werkstoffsynthese und -

herstellungsverfahren des Forschungszentrums Jülich (Prof. Stöver) hergestellt.

Insgesamt wurden zehn unterschiedliche Pulvermischungen verwendet, dabei

wurde der Bereich Ni:Ti-Verhältnis von 90:10 (at%) über Abstufungen von 10 at%

bis zu reinem Titan abgedeckt (Tab. 7). Jede Mischung wurde in einem Taumel-

mischer Typ TC2 (WAB, Basel, Schweiz) für 24 h homogenisiert. Die Verdichtung

erfolgte über heißisostatisches Pressen (HIP). Dazu wurden die Pulver in einem

ersten Schritt uniaxial vorverdichtet. Die entstandenen Pellets erreichten eine

Dichte von etwa 65 % der theoretischen Dichte. Zehn dieser Pellets, jedes mit ei-

nem anderen Mischungsverhältnis für Nickel und Titan, wurden in zylindrische

Stahlkapseln gefüllt, die anschließend unter Vakuum verschweißt wurden. Nach

dem HIP-Prozess (1065 °C, 195 Mpa, 5 h) wurde das Kapselmaterial durch Ab-

drehen entfernt und die Proben mittels Funkenerosion in Stücke von 32 x 10 x 1,5

mm geteilt. Das Vorhandensein verschiedener intermetallischer Phasen und der

quasi-kontinuierliche Übergang in der elementaren Zusammensetzung der Gra-

dientenabschnitte wurde durch kristallographische Analyse und energie-

dispersive Röntgenspektroskopie bestimmt. Die für Zellkulturtests vorgesehenen

Proben wurden einseitig poliert. Die Breite der Segmente mit unterschiedlichen

Ni:Ti-Verhältnissen betrugen etwa 3 mm.

Abb. 5. Ni-NiTi-Ti gradierter Probekörper (32 x 10 x 1.5 mm). Zusammensetzung der einzelnen

Segmente siehe Tab. 7.

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Material und Methoden

Tab. 7. Gradierung des Probekörpers.

Segment at % A 90 Ni : 10 Ti

B 80 Ni : 20 Ti

C 70 Ni : 30 Ti

D 60 Ni : 40 Ti

E 50 Ni : 50 Ti

F 40 Ni : 60 Ti

G 30 Ni : 70 Ti

H 20 Ni : 80 Ti

I 10 Ni : 90 Ti

J 0 Ni : 100 Ti

Jeweils ein autoklavierter (Dampfsterilisation, 121°C, 20 Minuten) Ni-NiTi-Ti-gra-

dierter Probekörper wurde in ein Kompartiment (9,6 cm2) einer 6-Loch Zellkultur-

platte (Falcon, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankreich) gebracht. Anschlie-

ßend wurden 5 ml Zellsuspension (MG-63 oder SAOS-2 jeweils 4000 Zellen/ml

RPMI1640 Zellkulturmedium) zugefügt und für 3-4 Tage in Kultur genommen, da-

bei wurde täglich das Zellkulturmedium durch frisches vorgewärmtes (37°C)

RPMI1640 Zellkulturmedium ersetzt.

Nach Erreichen der Zellkonfluenz wurde die Zellproliferation in unmittelbarer

Nähe unterschiedlicher Probekörperbereiche mittels Inversionsmikroskop (CK2,

Olympus, Hamburg) und Digitalkamera (Camedia C3030, Olympus) dokumen-

tiert. Anschließend wurde der Probekörper vorsichtig entfernt und die Zellen

wurden zweifach mit Phosphatpuffer (Phosphate Buffered Saline, PBS, Sigma-

Aldrich, Taufkirchen) gewaschen und danach mit 1 ml Türkscher Lösung (Fluka

BioChemika, Taufkirchen) für 5 min bei Raumtemperatur gefärbt. Die Färbe-

lösung wurde dann durch zweifaches Waschen mit PBS entfernt und die ge-

färbten Zellen sowie die jeweiligen gradierten Probekörper wurden einzeln unter

gleichen optischen Bedingungen digital photographiert (Nikon D1x). Alle Auf-

nahmen wurden mit einem Bildananalyseprogramm (analySIS® 3.1, Soft Ima-

ging System, Münster) bearbeitet. Anschließend wurden die Bilder der Probe-

körper mit den Zellbildern in der jeweiligen ursprünglichen Lage digital zusam-

mengeführt (Photoshop 5.0 Software, Adobe, Unterschleißheim).

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Material und Methoden

2.3 Metallprobekörper

Bleche aus superelastischem NiTi (Memory Metalle GmbH, Weil am

Rhein) wurden in kleine Quadrate (8 mm x 8 mm x 0.1 mm3) geschnitten. Als

Kontrollmaterialien wurden reines Titan (Goodfellow, Bad Nauheim) und Titan-

Aluminium-Vanadium-Legierung (Ti6Al4V, Goodfellow, Bad Nauheim) sog.

Chirurgenstahl mit den gleichen Abmessungen eingesetzt. Es handelt sich um

Metalle, die bereits als Implantatmaterialien etabliert sind, d.h. ihre Biokompati-

bilität wurde untersucht, und sie werden bereits in der Unfallchirurgie und Ortho-

pädie eingesetzt. Anschließend wurden die Probekörper für jeweils 10 min in

Aceton, Ethanol und fließendem destilliertem Wasser gewaschen.

2.4 Calciumphosphat-Beschichtung

Ein Teil der Metallplättchen wurde für die Beschichtung mit Calcium-

phosphat aus wässriger Lösung verwendet. Diese werden im weiteren Verlauf

dieser Arbeit auch als beschichtete Probekörper bezeichnet. Vor der Beschich-

tung mit Calciumphosphat ist eine Vorbehandlung der Metallprobekörper erforder-

lich. Dazu wurden die Metallplättchen für 60 min in 30% H2O2 gekocht und unter

fließendem destillierten Wasser gespült. Für eine bessere Anheftung und Kris-

tallisation wurden die Metalloberflächen angeätzt, dazu wurden sie bei 120 °C

für 30 min in 4 M KOH getaucht und anschließend in fließendem Wasser ge-

spült. Nach dem Ätzvorgang erfolgt die Kristallisation durch Immersion in über-

sättigter wässriger Calciumphosphatlösung bei 20°C. Für die Immersionslösung

wurden folgende Ionenkonzentrationen verwendet: 1,8 mM K+; 3,0 mM Ca2+;

1,8 mM H2PO-4; 6,0 mM NO-

3. Nach einer Immersion von 24h entsteht eine ca.

10 µm dicke Calciumphosphatschicht. Zur Erhöhung der Stabilität wird nach

dem Trocknen eine zweite Immersion durchgeführt. Die Oberfläche der NiTi-

Probekörper wurde vor und nach Immersion in Calciumphosphat-Lösung mittels

Rasterelektronenmikroskopie (REM) und energiedispersiver Röntgenspektro-

skopie (EDX), sowie Röntgenpulverdiffraktometer (XRD) analysiert (Choi et al.

2003). Bei der Calciumphosphatschicht handelt es sich um eine Mischphase

aus Octacalciumphosphat und Hydroxylapatit. Durch Kalzifizierung aus wäss-

riger Lösung ist eine Beschichtung mit einer ähnlichen Zusammensetzung wie

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Material und Methoden

die mineralische Phase von Knochen entstanden, die sich für den Einsatz als

Knochenimplantat eignen könnte.

2.5 Zellkultur

Alle Schritte der Zellkultur fanden unter sterilen Bedingungen statt, d.h.

die Arbeiten wurden unter einer Sicherheitswerkbank (HeraSafe, HS15,

Kendro-Heraeus, Hanau) durchgeführt.

2.5.1 Kultivierung von Osteoblasten-Zelllinien und Fibroblasten

Humane osteoblastenartige Osteosarkoma-Zellen MG-63 wurden von der

Europäischen Sammlung von Zellkulturen (ECACC, Salisbury, Großbritannien)

bezogen. Humane osteoblastenartige Osteosarkoma-Zellen SAOS-2 und murine

Fibroblasten (Swiss 3T3) stammten aus der Deutschen Sammlung von Mikroorga-

nismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig). MG-63, SAOS-2 und 3T3 wurden

in 75 cm2 Zellkulturflaschen (Falcon, BD Biosciences) unter Zellkulturbedingungen

(37°C, 5% CO2, wassergesättigte Atmosphäre) kultiviert. Als Zellkulturmedium

wurde RPMI1640 (Invitrogen, Karlsruhe) supplementiert mit L-Glutamin (4 mM),

Na-Bicarbonat (2.0 g l-1), 10% inaktiviertes fötales Kälberserum (FCS, Invitrogen)

und 20 mM HEPES (Sigma-Aldrich) eingesetzt. MG-63, SAOS-2 und 3T3 wurden entsprechend der Proliferationskinetik alle 4-7

Tage subkultiviert.

2.5.2 Subkultivierung und Ernte der Zellen

Die adhärent wachsenden Zellen wurden vor Erreichen der Konfluenz

von den Zellkulturflaschen abgelöst und in geringerer Dichte erneut ausgesät

(Passagieren). Hierzu wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und nach zwei-

fachem Waschen mit PBS erfolgte eine 2 minütige Inkubation mit 0.2 ml/cm2

Trypsin-EDTA-Lösung (0.25% Trypsin; 0.1% EDTA, Sigma-Aldrich) bei 37°C. Die

Zellen wurden unter dem Durchlichtmikroskop betrachtet, nach dem Abrunden

der Zellen konnten diese durch leichtes Klopfen gegen die Zellkulturflasche,

sog. „Shake off“-Verfahren, von dem Zellkulturflaschen-Boden gelöst werden.

Die entstandene Zellsuspension wurde anschließend zweimal mit dem supple-

35

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Material und Methoden

mentierten Zellkulturmedium gewaschen. Die Zellen wurden in frischem Zellkul-

turmedium resuspendiert und in der jeweils gewünschten Verdünnung auf neue

Flaschen verteilt. Für den Einsatz in den entsprechenden Experimenten wurde

die Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt und die erforderliche

Anzahl an Zellen ausgesät.

2.5.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen

Konfluent wachsende Zellen wurden wie oben beschrieben von der Zell-

kulturflasche abgelöst und gewaschen. Das Pellet wurde nach dem Waschen

resuspendiert und in 1 ml Einfriermedium (Cell Culture Freezing Medium-

DMSO, Invitrogen, Karlsruhe) aufgenommen. Die Zellen wurden anschließend

für 3 Stunden in einer Labortiefkühltruhe (GFL, Burgwedel) auf -80 °C abgekühlt

und schließlich in flüssigem Stickstoff (-196°C) gelagert.

Das Auftauen der Zellen erfolgte bei Raumtemperatur. Die Zellen im Einfrier-

medium wurden im FCS-supplementierten Zellkulturmedium gewaschen. An-

schließend wurde das Pellet im FCS-supplementierten Zellkulturmedium aufge-

nommen und zur weiteren Kultivierung in Zellkulturflaschen gegeben.

2.6 Isolierung humaner Leukozyten

Die Isolierung der Leukozyten erfolgte aus EDTA-antikoaguliertem Blut

(9 ml Monovette® K3H, Sarstedt, Nümbrecht) von gesunden freiwilligen Spen-

dern. Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) und periphere mono-

nukleäre Zellen (PBMC) wurden über einen diskontinuierlichen 2-Stufen Ficoll-

Gradienten gewonnen (Köller et al. 2001). Zunächst wurde das EDTA-antiko-

agulierte Blut zu gleichen Teilen mit 0,9% Natriumchloridlösung (Delta Select

GmbH, Pfullingen) verdünnt. In einem 50 ml Falcon-Röhrchen (BD-Biosciences,

Heidelberg) wurde 10 ml Polysaccharose/Natrium-Diatrizoat mit einer Dichte

von 1,077 g/ml (Histopaque 1077, Sigma-Aldrich) über 10 ml Histopaque mit

einer Dichte von 1,119 g/ml (Histopaque 1119, Sigma-Aldrich) geschichtet. Zwi-

schen den beiden Lösungen musste eine klare scharfe Abgrenzung zu erken-

nen sein. Auf das Histopaque 1077 wurde anschließend vorsichtig 20 ml des

verdünnten antikoagulierten Bluts pipettiert (Abb. 6). Die Röhrchen wurden bei

36

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Material und Methoden

700g und bei Raumtemperatur für 30 min zentrifugiert (Megafuge 1.0R, Kendro-

Heraeus, Hanau). Nach der Zentrifugation war eine deutliche Auftrennung der

Blutbestandteile in drei Schichten zu erkennen (Abb. 6). Das obere zellfreie

Plasma wurde abpipettiert und verworfen, aufeinander folgend konnten im An-

schluss die PBMC und PMN abpipettiert werden. Die jeweiligen Histopaque-

Zwischenschichten wurden verworfen. Die Leukozytenfraktionen wurden jeweils

in neue 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und mit PBS bis auf 40 ml aufgefüllt.

Die Röhrchen wurden anschließend bei 200g für 15 min und 4°C zentrifugiert.

Der zellfreie Überstand wurde verworfen und das Zellpellet vorsichtig re-

suspendiert. Die PBMC-Fraktion wurde mit 20 ml PBS aufgefüllt und bis zum

nächsten Waschschritt auf Eis gelagert. Die kontaminierenden Erythrozyten in

der PMN-Fraktion wurden durch hypotone Lyse entfernt. Dazu wurden die PMN

mit 5 ml 0,3% Natriumchloridlösung für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Der physiologische osmotische Druck wurde anschließend durch Zugabe von

5 ml 1,5% NaCl-Lösung wieder hergestellt, und die PMN-Suspension wurde mit

PBS auf 20 ml aufgefüllt. Die auf Eis gelagerten PBMC und PMN wurden bei

200g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde wieder

verworfen und das Zellpellet resuspendiert. Im Anschluss wurden die Zellen

nach Färbung mit Türkscher-Lösung (Fluka BioChemika) gezählt und die Viabi-

lität durch den Trypan-Blau (Sigma-Aldrich) Ausschluss-Test gemessen. Die

Zellen wurden mit RPMI1640 Zellkulturmedium auf 1x106 Zellen/ml eingestellt.

Diese Zellseparierung führt zu ≥ 95% reinen und vitalen PMN bzw. PBMC.

20 ml

10 ml

10 ml

700 xg RT30 min

VenösesBlut

1:1 inNaCl

Histopaque1077

Histopaque1119

Abb. 6. Leukozytenisolierung aus EDTA-antikoaguliertem Blut (modifiziert nach Köller).

37

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Material und Methoden

2.7 Isolierung humaner Thrombozyten

Die Isolierung der Thrombozyten erfolgte aus EDTA-antikoaguliertem

Blut von gesunden Freiwilligen über die Herstellung eines Thrombozyten-

reichen Plasmas (Platelet-rich Plasma, PRP). Das EDTA-antikoagulierte Blut

wurde zu gleichen Teilen mit PBS (versetzt mit 1,5% EDTA) verdünnt und bei

200g für 30 Minuten bei 24°C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand

(PRP) abgenommen und nochmals bei 1285g für 20 Minuten bei 24°C zentrifu-

giert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde mit 2 ml PBS/EDTA

vorsichtig resuspendiert und ein weiteres Mal bei 1285g für 20 Minuten bei

24°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und um das noch enthaltene

EDTA heraus zu waschen, wurde das Pellet mit 5 ml supplementiertem

RPMI1640 gewaschen. Anschließend wurde das Pellet vorsichtig mit supple-

mentiertem RPMI1640 resuspendiert und zu einer Zellkonzentration von 2 x 108

Zellen/ml supplementierten RPMI1640 verdünnt.

2.8 Zelladhärenz-Analysen 2.8.1 Inkubation von Osteoblasten mit Metallprobekörpern

Nach dem Ernten der Zellen (MG-63, SAOS-2) (s. Abs. 2.5.2) wurde die

Zellzahl auf 4000 Zellen/ml supplementiertes RPMI1640 eingestellt. Je 1 ml der

Zellsuspension wurde zu einem Metallprobekörper (NiTi Calciumphosphat-be-

schichtet oder unbeschichtet und Titan unbeschichtet) in einer 24-Well-Zellkul-

turplatte gegeben. Als Kontrolle wurden Zellen ohne Metallprobekörper inkubiert

und zusätzlich wurde bei jedem Versuch als Kontrollmaterial Titan eingesetzt.

Die Zellen wurden mit dem Metallprobekörper für 3-4 Tage kultiviert. Die adhä-

renten Zellen auf den Probekörpern wurden fluoreszenz- und rasterelektronen-

mikroskopisch weiteruntersucht (s. Abs. 2.13.2 und 2.13.3).

2.8.2 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf Calciumphosphat-

beschichteten und unbeschichteten Probekörpern

Beschichtete und unbeschichtete NiTi-Probekörper wurden mit je 1 ml

heparinisiertem peripherem Blut von gesunden Freiwilligen in 24-Well-Zellkul-

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Material und Methoden

turplatten auf einer Rotationsplattform (VSR23, Grant Instruments, Cambridge,

Großbritannien) unter Zellkulturbedingungen (37°C, wassergesättigter Atmos-

phäre, 5% CO2) kokultiviert. Nach 2 Stunden Inkubation wurden die adhärenten

Zellen auf den Probekörper für die fluoreszenzmikroskopische Analyse mit

Calcein-AM und Propidiumjodid (s. Abs. 2.8.4) gefärbt. Zusätzlich wurden Pro-

ben für die rasterelektronenmikroskopischen Analysen vorbereitet (s. Abs.

2.13.3).

2.8.3 Leukozytenadhärenz an Calciumphosphat-beschichteten und

unbeschichteten Metallprobekörpern

Wie im Abs. 2.6 und 2.7. beschrieben wurden die isolierten PMN oder

PBMC auf 1x106 Zellen/ml und Thrombozyten auf 2 x 108 Zellen/ml supple-

mentiertes RPMI1640 eingestellt. Anschließend wurde 1ml der jeweiligen Zell-

suspension auf einen Metallprobekörper (NiTi beschichtet oder unbeschichtet)

in eine Kavität einer 24-Well-Zellkulturplatte gegeben. Als Kontrolle wurden

Zellen in Kavitäten ohne Metallprobekörper pipettiert. Die Zellen wurden mit den

Probekörpern für 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen kokultiviert und im

Anschluß erfolgte die Analyse der Zelladhärenz mittels der Calcein-AM-Färbung

(s. Abs. 2.8.4) und der Fluoreszenzmikroskopie (s. Abs. 2.13.3).

2.8.4 Fluoreszenzmikroskopische Vital-Färbung mit Calcein-AM und Propidiumjodid

Das Prinzip der Calcein-AM-(Calcein-Acetoxymethylester)-Färbung ist, dass

spezifisch nur die vitalen Zellen durch Calcein-AM (Calbiochem, Schwalbach)

angefärbt werden, während sich avitale Zellen mit Propidiumjodid (50 µg/ml,

Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA) anfärben lassen. 1 mg Calcein-AM

wurde in 100 µl DMSO (Dimethyl-Sulfoxide, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) gelöst

und anschließend 1,1 ml FCS hinzugegeben. Diese Lösung wurde in 40 µl portio-

niert und bei –80°C gelagert. Nach dem Auftauen wurden je 40 µl der Calcein-

AM Lösung mit 2 ml RPMI1640 versetzt. Das Calcein-AM liegt in einer nicht

fluoreszierenden Ester-gebunden Form vor. Nach der Aufnahme des Calcein-

AM über die Zellmembran wird es von cytoplasmatischen Esterasen hydro-

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Material und Methoden

lysiert. In diesem Zustand fluoresziert Calcein bei einer Anregung von 494 nm

mit einem Emissionsmaximum von 517 nm, so dass die Fluoreszenz nur mit

lebenden Zellen einhergeht. Durch die Hydrolyse wird das Calcein-AM Zell-

membran-impermeabel, eine Elution des Farbstoffes ist somit ausgeschlossen.

Das Propidiumjodid hingegen kann nur die Zellmembran passieren, wenn diese

Defekte aufweist. Es interkaliert in die DNA und fluoresziert bei einer Anregung

von 493 nm mit einem Emissionsmaximum von 630 nm.

Zur Analyse der Zelladhärenz wurden die Zellen (Leukozyten, Thrombozyten,

Osteoblasten) mit den Probekörpern kokultiviert (s. Abs. 2.8). Die Probekörper

wurden vorsichtig in neue Kavitäten einer 24-Well-Zellkulturplatte überführt. An-

schließend wurde dreimal kurz mit RPMI1640 gewaschen, um unspezifische

Esterasen aus dem FCS zu entfernen. Das RPMI1640 wurde abgesaugt und

die Zellen wurden mit 14 µg/ml Calcein-AM in RPMI1640 für 30 min unter Zell-

kultur-Bedingungen (37°C, 5% CO2, wassergesättigte Atmosphäre) gefärbt. Die

Calcein-AM Lösung wurde im Anschluss abgesaugt, und die Probekörper wurden

zweimal kurz mit RPMI1640 gewaschen. Danach wurde mit Propidiumjodid in

RPMI1640 gelöst für 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur gefärbt. Nach der

Propidiumjodid-Färbung wurden die Probekörper noch zweimal kurz mit

RPMI1640 gewaschen und anschließend in frisches RPMI1640 bis zur Analyse

gelagert. Im Anschluss wurden die adhärenten Zellen auf den Probekörpern mit

dem Fluoreszenzmikroskop BX61 von Olympus (Hamburg) analysiert (s. Abs.

2.9.2).

2.9 Mikroskopie 2.9.1 Durchlichtmikroskopie

Lichtmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem Olympus CK2

(Olympus, Hamburg) gemacht. Die digitale Weiterbearbeitung erfolgte mit der

Software analySIS® 3.2 (Soft imaging System, Münster).

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Material und Methoden

2.9.2 Fluoreszenzmikroskopie

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem Olympus

BX61 und einer digitalen Kamera Color View II (Soft Imaging System, Münster)

erstellt. Digitale Bilder wurden mit der Software analySIS® 3.2 bearbeitet.

2.9.3 Rasterelektronenmikroskopie

Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden an der Fakultät

für Maschinenbau (Institut für Werkstoffe) der Ruhr-Universität Bochum, mit

einem LEO Gemini 1530 der Firma LEO in Oberkochen erstellt. Für die Ras-

terelektronenmikroskopie wurden die Calciumphosphat-beschichteten und un-

beschichteten NiTi-Probekörper im Anschluss an die Kokultivierung z.B. mit

Leukozyten (s. Abs. 2.8.3) vorsichtig in eine neue Kavität einer 24-Well-Zellkul-

turplatte überführt. Danach wurden sie zweimal für je 5 Minuten bei

Raumtemperatur mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Fixierung der

Zellen mit 3,7% Glutaraldehyd (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in PBS für 15 Mi-

nuten. Nach zweifachem Waschen mit PBS für jeweils 5 Minuten, wurden die

Zellen mittels einer aufsteigenden Ethanolreihe (40%, 60%, 80%, 96-98%, je 5

Minuten) entwässert. Das 96-98% Ethanol wurde im Anschluss abpipettiert und

die Zellen wurden für 24 Stunden bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Bei Ana-

lysen von biologischen Proben im Hochvakuum-Rasterelektronenmikroskop

stellt sich das Problem, dass Zellen elektrische Isolatoren sind und daher den

Probenstrom, den der Elektronenstrahl erzeugt, nicht ableiten können. Das Er-

gebnis sind elektrische Aufladungen auf der zu analysierenden Probe, die sich

als ein Wechsel dunkler und überblendenderer Bildartefakte auswirken. Des-

halb müssen nicht leitende Proben künstlich leitfähig gemacht werden. In einer

Kathodenzerstäubungsanlage (Edwards Sputter Coater S150B) wurden die

Probekörper und Zellen mit einer dünnen elektrischen Leitschicht aus Gold

überzogen.

41

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Material und Methoden

2.10 Quantitative Bildanalytik

Für die Quantifizierung der Zelladhärenz auf den verschiedenen Probe-

körpern wurde das Programm analySIS® 3.2 (Soft Imaging System, Münster)

eingesetzt. Die Zellen wurden wie oben beschrieben mit den Probekörpern ko-

kultiviert und mit Calcein-AM und Propidiumjodid angefärbt. Anschließend er-

folgte als Grundlage für die quantitative digitale Bildanalytik der Zelladhärenz

die Fotografie der Probekörperoberflächen. Die Aufnahmen erfolgten an drei

definierten Punkten der Probekörperoberfläche. Die Punkte befanden sich auf

einer festgelegten Diagonale, die durch kontrollierte Mikrometerschrauben-Be-

tätigung angesteuert wurden. Dieses Schema wurde für alle Probekörper ver-

wendet. Die quantitative Bildanalytik ist eine Flächenauswertung von einzelnen

Grauwertbereichen. Dazu werden die Fluoreszenzbilder (Abb. 7 A) der Probe-

körperoberflächen in Schwarzweißbilder (Abb. 7 B) umgewandelt. Für die fluo-

reszierenden Zellen, deren Fläche summiert werden soll, wird ein Grauwertbe-

reich definiert (Abb. 7 C), in dem alle Flächen gemessen werden sollen. Dazu

wurde ein Schwellenwert bestimmt, oberhalb dessen alle Grauwerte gemessen

wurden. Dieser Schwellenwert wurde für alle Flächenmessungen beibehalten.

Anschließend erfolgte die Flächenmessung der adhärenten Zellen, dabei wurde

der prozentuale Flächenanteil der gefärbten Zellen am Gesamtbild berechnet.

2.11 Zell-Proliferationsanalyse durch Fluoreszenzmarkierung

Die Proliferationsanalyse über Fluoreszenzmarkierung wurde jeweils mit

den Zelllinien MG-63 und SAOS-2 durchgeführt. Die Osteoblasten wurden aus

den Zellkulturflaschen geerntet (s. Abs. 2.5.2) und die Zellzahl wurde auf

4000 Zellen/ml supplementiertes RPMI1640 eingestellt. In eine 24-Well-Zell-

kulturplatte wurden im Siebenfach-Ansatz Calciumphosphat-beschichtete und

unbeschichtete NiTi- sowie Titanprobekörper gegeben. Anschließend wurde

vorsichtig je 1 ml der Osteoblastensuspension zu den Probekörpern gegeben.

An den folgenden sieben Tagen wurde jeweils pro Tag ein Probekörper (NiTi

beschichtet und unbeschichtet, Titan) entnommen und anschließend die adhä-

renten Osteoblasten mit Calcein-AM (s. Abs. 2.8.4) markiert. Die mit Osteo-

42

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Material und Methoden

blasten bewachsenen Probekörperoberflächen wurden mit der digitalen

Bildanalytik quantifiziert.

digitale Aufnahme von Calein-AM markierten MG-63 auf NiTi

Umwandlung in ein Schwarzweißbild

Festsetzung des Grauwertbereiches für die Flächenmessung

Berechnung des prozentualen Flächenanteils (gelb) der adhärenten Zellen am Gesamtbild

C)

A)

B)

Abb. 7. Schema der quantitativen Bildanalytik mit analySIS® 3.2.

2.12 Zell-Proliferationsanalyse durch ein colorimetrisches Verfahren

Die Zellproliferation wurde mit einem colorimetrischen Assay (EZ4U, Bio-

medica, Gesellschaft mbH, Wien) gemessen. Die Methode beruht auf der Fä-

higkeit lebender Zellen, farblose Tetrazoliumsalze in intensiv gefärbte Forma-

zanderivate umwandeln zu können. Diese Reduktionsreaktion erfordert intakte

Mitochondrien, die bereits innerhalb weniger Minuten nach dem Absterben der

Zelle inaktiv werden.

43

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Material und Methoden

Die Zellproliferation von MG-63 und SAOS-2 wurde jeweils im Dreifachansatz in

Zellkulturplatten (24-Well) nach 4 Tagen Kokultur mit Calciumphosphat-be-

schichtetem und unbeschichtetem NiTi und Titan analysiert. Als Kontrolle wurde

die Osteoblastenproliferation ohne Probekörper gemessen. Die Osteoblasten

wurden aus den Zellkulturflaschen geerntet (s. Abs. 2.5.2) und die Zellzahl

wurde auf 4000 Zellen/ml supplementiertes RPMI1640 eingestellt und anschlie-

ßend je 1 ml der Osteoblastensuspension auf jeden Probekörper gegeben.

Nach vier Tagen Kokultur wurde der Zellüberstand abgenommen und um Zellen

und Partikel zu entfernen, bei 2000g für 2 Minuten bei Raumtemperatur zentri-

fugiert und anschließend für weitere Analysen (z.B. Cytokinfreisetzung) bei

–80°C eingefroren. Zu den Ansätzen wurde 400 µl frisches RPMI1640 und 40 µl

der Farbstofflösung hinzugefügt und anschließend wurde für drei Stunden bei

37°C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das Zellkulturmedium

durch leichtes Klopfen an den Seiten der 24-Well-Zellkulturplatte gut gemischt.

Anschließend wurden je 100 µl des angefärbten Zellkulturmediums als 5-fach

Ansatz auf eine 96-Well Mikrotiterplatte überführt und die Absorption im Mikro-

platten-Reader (MRX Revelation, Dynex Technologies, Denkendorf) bei 450 nm

gemessen.

2.13 Cytotoxizitäts-Analyse

Ein möglicher cytotoxischer Einfluss der Calciumphosphat-beschichteten

und unbeschichteten NiTi-Probekörper auf Leukozyten wurde anhand eines

Cytotoxizitäts-Assay (CytoTox 96, Non-radioactive Cytotoxicity Assay, Promega

GmbH, Mannheim) bestimmt. Es handelt sich um einen colorimetrischen Test

zur Quantifizierung von Zelltod und Zelllyse basierend auf der Messung der

Lactat-Dehydrogenase-(LDH)-Aktivität. LDH ist ein cytoplasmatisches Enzym,

das von geschädigten Zellen in den Zellkulturüberstand freigesetzt wird. Ein

Anstieg der LDH-Aktivität im Zellkulturüberstand korreliert mit der Zunahme von

avitalen Zellen während der Inkubation. Das Prinzip des Assays beruht im

ersten Schritt auf der Umwandlung von Lactat zu Pyruvat, dabei wird NAD+ zu

NADH/H+ reduziert. Im zweiten Schritt wird durch die Diaphorase H/H+ von

NADH/H+ auf das Tetrazoliumsalz (gelb) transferiert und es entsteht Formazan

(rot). Formazan wird colorimetrisch bestimmt, die Anzahl avitaler Zellen ist dann

44

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Material und Methoden

direkt proportional zur gebildeten Formazanmenge. Die Leukozyten wurden wie

im Abs. 2.8.3 beschrieben mit den Metallprobekörpern kokultiviert, anschlie-

ßend wurde der Zellüberstand für die Cytotoxizitäts-Analyse gewonnen. Die

maximale LDH Freisetzung aus den eingesetzten Zellen wurde durch die Zu-

gabe von 0,9 % Triton® X-100 (Promega GmbH, Mannheim) erreicht. Dieser

Wert wurde als 100% LDH-Freisetzung festgesetzt. Je 50 µl des Zell-

überstandes wurden im Dreifachansatz auf eine 96-Well Mikrotiterplatte über-

führt und mit 50 µl der Substrat-Lösung (Laktat) vermengt. Nach 30 Minuten

Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 50 µl/Kavität 1M Essig-

säure gestoppt. Die Lichtabsorption wurde bei 490 nm im 96-Well Mikro-

titerplatten Reader (MRX Revelation) gemessen.

2.14 Gewinnung konditionierter Medien von Leukozyten

Konditionierte Überstände (KM) wurden durch Kokultivierung von isolierten

PMN oder PBMC (1x106 Zellen/ml supplementiertes RPMI1640) mit beschich-

teten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern gewonnen. Die Zellen wurden

wie im Abs. 2.6 beschrieben isoliert und mit den Probekörpern für 24 Stunden

unter Zellkulturbedingungen (37°C, 5% CO2, wassergesättigte Atmosphäre) in

24-Well-Zellkulturplatten kokultiviert. Innerhalb einer Zellkulturperiode von 24

Stunden werden die meisten der jeweiligen zellspezifischen Cytokine von den

aktivierten Leukozyten gebildet. Nach der Kokultivierung wurden die konditio-

nierten Medien abgenommen. Um Zellen und Partikel zu entfernen wurden die

konditionierten Medien anschließend bei 2000g für 2 Minuten bei Raumtempe-

ratur zentrifugiert (Biofuge-Pico, Eppendorf, Hamburg) und unmittelbar in den

Funktionsassay (Apoptose-Assay, Chemotaxis-Bioassay) eingesetzt. In den

Assays wurden jeweils 500 µl konditioniertes Medium mit 500 µl PMN (2x106

Zellen in supplementiertem RPMI1640) kokultiviert. Zusätzlich wurde in den

konditionierten Medien der Gehalt an pro- und anti-inflammatorischen Media-

toren mittels ELISA bestimmt (s. Abs. 2.16.1).

45

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Material und Methoden

2.15 Durchflußcytometrie

Die Expression von Adhäsionsmolekülen, DNA-Fragmentierung und

Chemotaxis von Leukozyten wurden in der vorliegenden Arbeit anhand durch-

flußcytometrischer Analysen untersucht. Die Messungen erfolgten an einem

FACSCalibur™ Durchflußcytometer (BD-Biosciences, Heidelberg). Einerseits

ermöglicht die Durchflußcytometrie die Analyse und Charakterisierung einzelner

Zellen aufgrund ihrer lichtstreuenden Eigenschaften und andererseits durch

Fluoreszenzmarkierung. Im Durchflußcytometer sind die Zellen in Suspension

in einem dünnen Flüssigkeitsstrahl wie Perlen einer Perlenkette aneinanderge-

reiht („hydrodynamische Fokussierung“). Dadurch ist es möglich, dass einzelne

Zellen hintereinander einen Laserstrahl passieren. Physikalische Zelleigen-

schaften wie Größe und Granularität bestimmen dann die charakteristische

Streuung des Laserlichtes. Die Streuung entlang des Laserlichtstrahls in Vor-

wärtsrichtung (forward scatter, FSC) gibt Auskunft über die Größe der Zelle,

d.h. je größer die Zelle, desto größer ist die Streuung im FSC. Desweiteren er-

folgt eine von der Granularität abhängige Streuung im rechten Winkel zum ein-

fallenden Licht. Diese Seitwärtsstreuung (sideward scatter, SSC) ist umso hö-

her, je größer die Granularität einer Zelle ist.

In der Durchflußcytometrie kann die Expression von zellulären Oberflächenanti-

genen durch Immunfluoreszenz analysiert werden. Hierzu werden Zellen mit

Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpern gegen bestimmte Oberflä-

chenantigene (cluster of differentiation, CD) eingesetzt. Die Fluorochrome wer-

den vom monochromatischen Laserlicht angeregt, d.h. ihre Elektronen werden

auf ein höheres Energieniveau gehoben. Beim verwendeten Durchflußcytome-

ter diente als Lichtquelle ein Argonlaser mit einer Emissionslinie von 488nm.

Beim Zurückfallen der Elektronen auf ihr ursprüngliches Energieniveau emittie-

ren sie Lichtenergie, die als Fluoreszenz sichtbar wird. Durch den Energiever-

lust während des Strahlungsüberganges besitzt das energieärmere emittierte

Licht stets eine größere Wellenlänge als das energiereichere absorbierte Licht.

Die Absorption des Lichts ist abhängig vom Laser, der Licht einer bestimmten

Wellenlänge emittiert und vom Fluorochrom, dessen Absorptionsspektrum im

selben Wellenlängenbereich liegen muss. Die Antikörper gekoppelten Fluoro-

chrome wie z.B. Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE)

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Material und Methoden

werden bei der gleichen Wellenlänge (488 nm) vom Argon-Laser zur Emission

von Lichtimpulsen angeregt. Der Emissionsbereich von FITC (Grünfluoreszenz)

liegt zwischen 500 - 570 nm und der von PE (Rotfluoreszenz) reicht von 570 -

600 nm. Die gewonnenen Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften werden

von speziellen Detektoren erfasst und verstärkt (sog. „Photomultiplier“, PMT).

Die Vorteile der Durchflußcytometrie liegen in der Möglichkeit mehrere ver-

schiedene Parameter einer Zelle simultan zu erfassen. So lassen sich Zellen

mit genau definierten Eigenschaften von anderen Zellen abgrenzen und identifi-

zieren. Zusätzlich können innerhalb von sehr kurzen Analysezeiträumen (Mi-

nuten) mehrere Tausend Zellen erfasst werden.

Die Antikörper wurden in den Konzentrationen nach Herstellerangaben einge-

setzt. Es wurden nur direkt-markierte monoklonale Antikörper der Firma Becton-

Dickison GmbH (Heidelberg) verwendet. Als Isotypenkontrollen wurden direkt-

markierte monoklonale Antikörper des gleichen Isotypes eingesetzt, die gegen

ein nicht humanes Antigen gerichtet waren. Die Isotypenkontrollen und Antikör-

per wurden immer in den gleichen Konzentrationen verwendet. Trotz unter-

schiedlicher Emissionsmaxima und Einsatz von selektiven Emissionsfiltern

überschneiden sich die Emissionsspektren der Fluorochrome teilweise. Durch

eine elektronische Kompensation wurden die Überschneidungs-Bereiche von

FITC und PE bzw. PE und PerCP (Peridin Chlorophyll) in den jeweiligen Meß-

bereichen der Einzelfluoreszenzen vom Messsignal abgezogen. Die Kompen-

sation wurde durch eine automatische Kompensationsroutine (FACSCompTM

2.0, Becton-Dickinsion) durchgeführt. Die Fluoreszenz-Daten wurden mit der

Software CELLQuestTM 1.2.2 (BD-Biosciences) analysiert. Für jede Analyse

wurden i.a. 10000 Zellen gemessen und die angegebenen Fluoreszenzwerte

sind als mittlere Fluoreszenz-Intensitäten (MFI) dargestellt. Die Eigenschaften

der Zelle konnten anschließend graphisch dargestellt werden. Alle Lösungen für

die Durchflußcytometrie wurden von BD-Biosciences bezogen.

47

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Material und Methoden

2.16 Funktionsassays

2.16.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array

Die Analyse der freigesetzten Cytokine von PBMC, die mit unbeschich-

teten und beschichteten NiTi-Probekörper kokultiviert wurden (konditionierte

Medien), wurde zusätzlich mit einem Cytokin-Array (Human Cytokine Array III)

der Firma RayBiotech Inc. (Norcross, USA) durchgeführt.

Der Vorteil dieses Arrays liegt in der schnellen Analyse des jeweiligen Cyto-

kinprofils eingesetzter Zellen. Durch eine parallele punktförmige Anordnung der

spezifischen Antikörper auf einer Nitrozellulosemembran konnten gleichzeitig

42 Cytokine gemessen werden (Abb. 8).

Bis zur Verwendung wurden die Membranen bei 4°C gelagert. Alle Inkubationen

wurden unter vorsichtigem Schütteln (Drehzahl 100/min; IKA KS 260 basic,

IKA-Werke, Staufen) und bei Raumtemperatur durchgeführt. Für die Cytokin-

analyse wurden die Membranen mit der Antiköper-beschichteten Seite nach

oben in speziell dafür vorgesehene 8-Well Multischalen gegeben. Anschließend

wurden die Membranen mit 2 ml des Blockierungs-Puffers benetzt und für 30

Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde der

Blockierungs-Puffer abgesaugt, 1 ml des konditionierten Überstandes wurde auf

die Membran gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die

konditionierten Überstände der PBMC wurden wie im Abs. 2.14 beschrieben

gewonnen. Anschließend folgten drei Waschschritte für je 5 Minuten mit je 2 ml

des Waschpuffers I bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei Waschschritten für je

5 Minuten mit 2 ml des Waschpuffers II bei Raumtemperatur. Der Waschpuffer

wurde anschließend vorsichtig abgesaugt und die Membran mit dem bio-

tinylierten Antikörper für 2 Stunden unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Da-

nach folgte, wie oben beschrieben, das Waschen der Membran. Der Waschpuf-

fer wurde abgesaugt und die Membran wurde mit 2 ml des HRP konjugierten

Streptavidin für 60 Minuten inkubiert. Vor der Detektion wurde die Membran wie

oben beschrieben gewaschen. 1 ml des Detektionspuffers (Luminol und Was-

serstoffperoxid) wurde auf die Membran gegeben und für 5 Minuten inkubiert.

Anschließend konnte die Membran vorsichtig aus der Kavität entnommen wer-

den und für einige Sekunden von beiden Seiten mit einem fusselfreien Papier-

48

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Material und Methoden

tuch angetrocknet. Die Membran wurde dann in eine durchsichtige Folie (han-

delsübliche Frischhaltefolie) gepackt, so dass keine Luftblasen zwischen der

Folie und der Membran entstanden. Die HRP katalysiert unter alkalischen Be-

dingungen die Oxidation von Luminol, dadurch erreicht Luminol einen ange-

regten Zustand und emittiert Licht. Diese unter enzymatischer Umsetzung des

Luminol auftretende verstärkte Chemolumineszenz (ECL, Enhanced Chemi-

luminescence) im Bereich der gebundenen Immunkomplexe wurde durch Ex-

position von ECL-Filmen (Hyperfilm ECL, Code RPN 2103K, Amersham

Biosciences, Freiburg) in einer Autoradiographiekassette bei Raumtemperatur

für 15 Minuten detektiert. Anschließend wurden die ECL-Filme mit einem Rönt-

genfilmentwickler (Curix 160, Agfa, Köln) entwickelt. Die Röntgenfilme wurden

anschließend eingescannt und digital bearbeitet.

Pos Pos Neg Neg ENA-78 GCSF GM-CSF GRO GRO-α I-309 IL-1α IL-1b

Pos Pos Neg Neg ENA-78 GCSF GM-CSF GRO GRO-α I-309 IL-1α IL-1b

IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IFN-γ

IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IFN-γ

MCP-1 MCP-2 MCP-3 MCSF MDC MIG MIP-1δ RANTES SCF SDF-1 TARC TGF-ß1

MCP-1 MCP-2 MCP-3 MCSF MDC MIG MIP-1δ RANTES SCF SDF-1 TARC TGF-ß1

TNF-α TNF-β EGF IGF-I Ang OSM Tpo VEGF PDGF-β Leptin Neg Pos

TNF-α TNF-β EGF IGF-I Ang OSM Tpo VEGF PDGF-β Leptin Neg Pos

Abb. 8. Schematische Anordnung der Kontrollen und der Antikörper gegen die verschiedenen

Mediatoren auf der Membran. (ENA-78: Epithelial Neutrophil-Activating Protein-78; GCSF:

Granulocyte Colony Stimulating Factor; GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating

Factor; GRO: Growth Regulated Oncogene; GRO-α: Growth Regulated Oncogene-alpha; I-309:

T-Lymphocyte secreted protein; IL: Interleukin; IFN-γ: Interferon-gamma; MCP: Monocyte

Chemotactic Proteins; MCSF: Macrophage Colony Stimulating Factor; MDC: Macrophage De-

rived Chemokin; MIG: Monokine Induced by gamma Interferon; MIP-1δ: Makrophage Inflam-

matory Protein; RANTES: Regulated on Activation Normal T-Cell Expressed and Secreted ;

SCF: Stem Cell Factor; SDF-1: Stromacell Derived Factor; TARC: Thymus and Activation

Regulated Chemokin; TGF-β1: Transforming Growth Factor; TNF-α: Tumor Necrosis Factor;

EGF: Epidermal Growth Factor; IGF-I: Insulin Like Growth Factor; Ang: Angiopoietin, OSM:

Oncostatin M; Tpo: Thrombopoietin; VEGF: Vascular Endothelial Cell Growth Factor; PDGF-β:

Platelet Derived Growth Factor)

49

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Material und Methoden

2.16.2 Quantifizierung freigesetzter Cytokine

Die Cytokinfreisetzung von Leukozyten wurde mittels „Sandwich“ ELISA

(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) gemessen. Die Zellkulturüberstände

wurden wie im Abs. 2.14 beschrieben gewonnen und bis zur Messung bei

–80°C gelagert. Beim ELISA-Verfahren wird aus einem Proteingemisch (z.B.

Zellkulturüberstand) ein Protein spezifisch detektiert und quantifiziert. Dazu

wurden Antikörper eingesetzt, die gegen verschiedene Epitope des gleichen

Proteins gerichtet waren. Beim sogenannten „Capture“ Antikörper oder auch

primären Antikörper handelt es sich im Allgemeinen um einen monoklonalen

Maus-Antikörper der an die Oberfläche der Kavitäten einer 96-Mikrotiterplatte

(MaxiSorp™, Nunc, Roskilde, Dänemark) gebunden wurde. Als zweiter oder

auch „Detektion“-Antikörper wurden polyklonale biotinylierte Ziegen-Antikörper

eingesetzt. Als Standard wurde das jeweilige rekombinante humane Cytokin

verwendet. Die Antikörper und die Standards wurden bei der Firma R & D Sys-

tems (Wiesbaden) bezogen (Tab. 8). Im gesamten Verfahren wurden stets Vo-

lumina von 100 µl eingesetzt. Ausnahmen bildeten der Blockierungs-Puffer

(PBS mit 1% Rinderserumalbumin-(BSA), Sigma-Adrich) und der Waschpuffer

(PBS Tween 0,05%, Sigma-Adrich); hier wurden 200µl eingesetzt. Die primären

Antikörper wurden mit PBS, die polyklonalen Antikörper mit Tris-Puffer (20 mM

Trizma® basisch; 150 mM NaCl; 0,1 % BSA, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) und

die rekombinanten Cytokine (Standards) mit 0,1 % BSA in PBS verdünnt (Tab.

8). Der primäre Antikörper wurde auf die Mikrotiterplatte aufgetragen und bei

Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Anschließend wurde dreimal mit Wasch-

puffer gewaschen (AM-60 Platten Wascher, Dynex Technologies, Denkendorf).

Der Blockierungs-Puffer wurde aufgetragen und für 30 Minuten bei Raumtem-

peratur unter ständigem Schütteln bei 200 U/min (Schüttler, IKA KS 260 basic,

IKA Werke, Staufen) inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen folgte das

Auftragen der Zellkulturüberstände, der Standards und die Inkubation für

2 Stunden unter permanentem Schütteln bei Raumtemperatur. Danach wurde

dreimal gewaschen und der zweite biotinylierte Antikörper pipettiert (2 Stunden,

Schüttler). Anschließend erfolgte nach dreifachem Waschen die Inkubation mit

Meerrettich-Peroxidase (Horse radish peroxidase, HRP) konjugiertem Strept-

avidin (25 µg/ml PBS) für 20 Minuten auf dem Schüttler. Es folgte dreimaliges

50

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Material und Methoden

Waschen und die Entwicklung der Mikrotiterplatte mit 3,3´; 5,5´-Tetramethyl-

benzidin (TMB, Sigma-Aldrich). Die Reaktion wurde durch Zusatz von 1 M

Phosphorsäure (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) gestoppt. Anschließend erfolgt die

photometrische Messung mit einem ELISA-Reader bei 450 nm. Sensitivität der

Immunoassays siehe Tab. 8.

Tab. 8. Konzentrationen der eingesetzten Antikörper.

Antikörper Konzentration ELISA-Sensitivität

Monoklonaler Anti-human IL-1ra Antikörper,

MAB 280 (Capture) 10 µg/ml 25 pg/ml

Biotinylierter Anti-human IL-1ra Antikörper,

BAF 280 (Detection) 100 ng/ml

Monoklonaler Anti-human IL-2 Antikörper,

MAB 602 (Capture) 4 µg/ml 10 pg/ml

Biotinylierter Anti-human IL-2 Antikörper,

BAF 202 (Detection) 12,5 ng/ml

Monoklonaler Anti-human IL-6 Antikörper,

MAB 206 (Capture) 4 µg/ml 10 pg/ml

Biotinylierter Anti-human IL-6 Antikörper,

BAF 206 (Detection) 25 ng/ml

Monoklonaler Anti-human IL-8/CXCL8 Antikörper,

MAB 208 (Capture) 4µg/ml 10 pg/ml

Biotinylierter Anti-human IL-8/CXCL8 Antikörper,

BAF 208 (Detection)

20 ng/ml

Monoklonaler Anti-human IL-10 Antikörper,

MAB 217 (Capture) 4 µg/ml 6,3 pg/ml

Biotinylierter Anti-human IL-10 Antikörper,

BAF 217 (Detection) 500 ng/ml

Monoklonaler Anti-human TNF-α Antikörper,

MAB 610 (Capture) 4 µg/ml 10 pg/ml

Biotinylierter Anti-human TNF-α Antikörper,

BAF 210 (Detection) 200 ng/ml

Monoklonaler Anti-human IFN-γ Antikörper,

MAB 285 (Capture) 3 µg/ml 10 pg/ml

Biotinylierter Anti-human IFN-γ Antikörper,

BAF 285 (Detection) 150 ng/ml

51

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Material und Methoden

2.16.3 Chemotaxis-Bioassay

Die Phagozytose von Mikroorganismen durch Granulozyten und Mono-

zyten ist einer der wichtigsten Mechanismen der unspezifischen Infektabwehr.

Der Phagozytoseprozess kann in mehrere Hauptphasen eingeteilt werden: ein

erster Schritt stellt die Chemotaxis dar. Dabei handelt es sich um die Migration

der Phagozyten entlang eines Konzentrationsgradienten chemotaktisch aktiver

Stoffe. Weitere Phasen sind die Adhäsion, Phagozytose und intrazelluläre

Bakterizidie.

Durch einen Bioassay (Migratest®, Orpegen Pharma, Heidelberg) erfolgte die

quantitative Bestimmung der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten mittels

Durchflußcytometrie. Der Test ermöglichte eine quantitative Bestimmung durch

eine Membran gewanderter neutrophiler Granulozyten, sowie die Änderung der

Expressionsdichte des Zelladhäsionsmoleküls LECAM-1 (L-Selektin, CD62L).

Die Leukozyten wurden durch Spontansedimentation über ein Leukozyten-

Trennmedium (Dextransedimentation) aus heparinisiertem Vollblut isoliert.

Dazu wurde das Blut (1 ml) vorsichtig über 1 ml Trennmedium gegeben und für

40 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Die Leukozyten befanden sich nach

der Trennung in der oberen Phase des Gradienten. Diese wurde vorsichtig ab-

pipettiert und anschließend davon 100 µl pro Ansatz in die obere Kammer eines

Zwei-Kammer-Systems (24-Well-Zellkulturplatten mit Zellkultureinsätze, Orpe-

gen Pharma, Heidelberg) gegeben. Die obere Kammer war durch eine Nylon-

membran mit 3 µm Poren von der unteren Kammer getrennt. Konditioniertes

Medium (s. Abs. 2.14), in dem die chemotaktische Aktivität enthalten war,

wurde in die untere Kammer gegeben. Das Volumen (350 µl) des konditionier-

ten Mediums wurde so gewählt, dass der Zellkultureinsatz mit der Membran in

das konditionierte Medium eintauchte. Als Positiv-Kontrolle wurde Interleukin-8

(IL-8), ein chemotaktisch-aktives Cytokin eingesetzt. Als Negativ-Kontrolle

wurde Phosphatpuffer verwendet. Die Zellmigration erfolgte im Wasserbad bei

37°C für 30 Minuten. Nach dieser Inkubation wurden die gewanderten Zellen

aus der unteren Kammer in 5 ml Probenröhrchen (Polystyrol Rundbodenröhr-

chen, Falcon, Becton Dickinson, Heidelberg) überführt und auf Eis gelagert.

Anschließend erfolgte die Markierung mit dem anti-LECAM-1-FITC Antikörper.

Dazu wurden 20 µl des Antikörper-/Zählreagens (enthielt Antikörper und Zähl-

52

Page 63: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Material und Methoden

partikel) zu jeder Probe gegeben, gut gemischt und für 10 Minuten auf Eis im

Dunkeln inkubiert. Kurz vor der durchflußzytometrischen Messung wird ein spe-

zieller DNA-Farbstoff („Vital DNA STAINING SOLUTION“) zur Vitalfärbung der

Zellen zugegeben. Anschließend erfolgte die durchflußcytometrische Analyse.

In der Durchflußcytometrie wurden folgende Parameter analysiert: Erstens

wurde die Anzahl der neutrophilen Granulozyten gemessen, die durch die

Membran gewandert waren. Zweitens wurde die Expressionsintensität von

LECAM-1 auf den migrierten Zellen gemessen. Die Erniedrigung der Expres-

sion dieses Zelladhäsionsmoleküls korreliert direkt mit der Aktivierung von

neutrophilen Granulozyten nach Bindung von chemotaktisch-aktiven Substan-

zen. Als LECAM-1-Kontrolle wurden unstimulierte Leukozyten verwendet. Bei

der Auswertung der LECAM-1-Expression wurde anhand der LECAM-1-Kon-

trolle im FL1-Histogramm ein Marker so gesetzt, daß weniger als ca. 15% der

Zellen positiv waren. Anschließend wurde im Testansatz der Prozentsatz an

aktivierten Granulozyten mit verminderter LECAM-1 Expression bestimmt.

2.16.4 Expression von Adhäsionsmolekülen

Zur Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen wurden konditio-

nierte Medien (s. Abs. 2.14) eingesetzt. PMN und PBMC wurden wie im Abs.

2.6 beschrieben frisch isoliert, die Zellen wurden auf 2x106 Zellen/ml supple-

mentiertes RPMI1640 verdünnt. Zu 500 µl PMN- bzw. PBMC-Suspension

wurde 500 µl konditioniertes Medium in eine Kavität einer 24-Well-Zellkultur-

platte gegeben und anschließend für 2 Stunden (PMN) bzw. 24 Stunden

(PBMC) unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Die Expression von Adhäsions-

molekülen (CD11b und CD62 auf PMN, ICAM-1 auf PBMC) wurde mittels

Durchflußcytometrie (FACScan™) bestimmt.

Im Anschluß an die Koinkubation von Leukozyten und konditionierten Medien

wurden die Zellen vorsichtig vom Boden der Kavitäten gelöst und anschließend

wurde die Zellsuspension bei 200g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 10 µl des fluoreszenzmar-

kierten Antikörpers (BD-Biosciences, Heidelberg) resuspendiert und für 30 Mi-

nuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Fixierung der Zellen wurde

1,5% Formaldehyd, enthalten in der FACS™-Lyselösung (FACS™-Lysing So-

53

Page 64: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Material und Methoden

lution BD-Biosciences, Heidelberg), verwendet. Zu jedem Ansatz wurden 1 ml

dieser FACS™-Lyselösung gegeben. Im Anschluss erfolgte erneut eine Zentri-

fugation bei 200g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Der Überstand wurde

verworfen und das Pellet mit 2 ml PBS resuspendiert und erneut bei 200g für 5

Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und

das Pellet in 500 µl PBS resuspendiert und im direkten Anschluss wurde die

Zellsuspension im Durchflußcytometer (FACS™Calibur, BD-Biosciences,

Heidelberg) analysiert.

2.16.5 DNA-Fragmentierung (Apoptose)

Die gewonnenen konditionierten Medien (Abs. 2.14) wurden im DNA-

Fragmentierungs-Assay eingesetzt. Zu 500 µl PMN-Suspension (2 x 106 Zel-

len/ml supplementiertes RPMI1640) wurde 500 µl konditionierter Überstand

gegeben und für 24 Stunden kokultiviert. In diesem Zeitraum erfolgt bei nicht

aktivierten PMN die Apoptose.

Die Apoptose wurde zellmorphologisch mittels Durchlichtmikroskopie und Ras-

terelektronenmikroskopie betrachtet. Auf der molekularen Ebene wurde sie über

die DNA-Fragmentierung mittels Durchflußcytometrie analysiert.

Im DNA-Fragmentation Assay (Fluorescein-FragELTM, Oncogene Research

Products, Boston, MA, USA) katalysiert die terminale Desoxyadenylat-

transferase (TdT) die Bindung von Fluorescein-markierten Desoxynukleotiden

an freie 3´-OH Enden. Diese DNA-Einzelstrangbrüche entstehen während der

Apoptose. Anhand der Strangbrüche lassen sich apoptotische Zellen identifizie-

ren. Diese Methode wird auch als TUNEL-Test (Terminale Desoxyribosyl-

Transferase mediated dUTP Nick End Labeling) bezeichnet. Die Sensitivität

dieser Methode ist hoch: prinzipiell kann damit jede einzelne apoptotische Zelle

identifiziert werden.

Als Negativ-Kontrolle wurde eine frisch isolierte PMN-Fraktion verwendet. Als

Positiv-Kontrolle wurden PMNs mit 1 µg/ml DNAse I (Roche Diagnostics GmbH,

Mannheim) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, um DNA-Strangbrüche zu

induzieren (Köller et al. 1997). Die Fluoreszenzintensität, die proportional zur

Apoptose ist, wurde in der Durchflußcytometrie (FACSCalibur™, BD-

54

Page 65: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Material und Methoden

Biosciences, Heidelberg) gemessen. Die Fluoreszenz-Daten wurden mit der

Software CELLQuestTM 1.2.2 (BD-Biosciences) analysiert.

2.17 Analyse der Nickelfreisetzung

Die Freisetzung von Nickel aus NiTi ist proportional zur Nickelkonzentra-

tion an der Oberfläche, die Nickelkonzentration wiederum ist stark abhängig von

der Oberflächenbehandlung (z.B. Polieren, Ätzen).

Die Nickelfreisetzung von Calciumphosphat-beschichtetem, unbeschichtetem

und angeätztem NiTi in PBS wurde in einem Zeitraum von einer bis zu acht

Wochen analysiert. Die Metallprobekörper wurden jeweils in eine Kavität einer

24-Well-Zellkulturplatte gegeben und anschließend wurden 2 ml Phosphatpuffer

pH 7,4 hinzugegeben. Die Zellkulturplatte wurde auf einer Rotationsplattform

(Grant Instruments) bei 200 U/min im Wärmeschrank (37°C, 5% CO2, wasser-

gesättigte Atmosphäre) vorsichtig geschüttelt. Im Abstand von 7 Tagen wurden

je Metallprobekörper 75 µl Phosphatpuffer entnommen und bis zur Analyse bei

–20°C gelagert. Zusätzlich wurde die Nickelfreisetzung in Blutplasma, gewon-

nen aus humanem Vollblut analysiert. 300 µl Blutplasma wurde jeweils mit dem

Calciumphosphat-beschichteten, unbeschichteten oder angeätzten NiTi für drei

Tage kokultiviert (s.o). Die Probenabnahme (75 µl) erfolgte nach 1, 2 und 3

Tagen. Die Nickelmessung wurde in der Abteilung für Hygiene, Sozial- und

Umweltmedizin (Prof. Wilhelm) der Ruhr-Universität Bochum mit der Graphit-

rohr-Atomabsorptions-Spektroskopie durchgeführt.

2.18 Einfluß von NiCl2 auf Zellaktivierung

Welchen möglichen Einfluss die Nickelfreisetzung aus NiTi-Probekörpern auf

die Cytokinfreisetzung von PBMC hat, wurde durch die Zugabe von NiCl2 (Ni-

ckel(II)-Chlorid, Sigma-Aldrich) in verschiedenen Konzentrationen analysiert.

Wie im Abs. 2.6 beschrieben wurden PBMC (1x106 Zellen/ml supplementiertes

RPMI1640) isoliert. Je 1 ml der Zellsuspension wurde in eine Kavität einer 24-

Well-Zellkulturplatte gegeben und NiCl2 (gelöst in PBS) in folgenden Endkon-

zentrationen hinzugegeben: 24 mg/ml, 2,4 mg/ml, 240 µg/ml, 24 µg/ml und

2,4 µg/ml. Im Kontrollansatz wurden nur PBMC ohne NiCl2 eingesetzt.

55

Page 66: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Material und Methoden

Zusätzlich wurden diese Analysen mit stimulierten PBMC durchgeführt. Da-

durch wurden inflammatorische Bedingungen experimentell durch Stimulation

der Zellen simuliert. Zu den PBMC (1x106 Zellen/ml supplementiertes

RPMI1640) und den verschiedenen NiCl2-Konzentrationen wurden Lipopoly-

saccharid (1 µg/ml), Concanavalin A (ConA, 4 µg/ml) oder Toxic Shock Syn-

drome Toxin-1 (TSST-1; 0,01 µg/ml) hinzugegeben. Nach 24 Stunden wurden

die Zellüberstände abgenommen. Um Zellen und Partikel zu entfernen, wurden

die Zellüberstände anschließend bei 2000g für 2 Minuten bei Raumtemperatur

zentrifugiert und bis zur Analyse der Cytokinfreisetzung bei –80°C gelagert.

2.19 Statistik

Von allen Zellkulturexperimenten wurden mindestens drei unabhängige

Analysereihen durchgeführt. Als Ergebnis wurde der arithmetische Mittelwert

sowie die Standardabweichung der gesamten Stichprobe (auf der Grundlage

aller Ergebnisse aus allen Experimentreihen) bestimmt.

Die Stichproben wurden mit dem Kolmogorov-Smirnow-Test auf Normalver-

teilung getestet. Bei den Vergleichen zwischen zwei Stichproben wurde der

zweiseitige Student-T-Test angewendet. Der Unterschied wurde als signifikant

bewertet, wenn die berechnete Irrtumswahrscheinlichkeit p<0,05 war. Die Be-

rechnung der Mittelwerte, Standardabweichung und die T-Tests wurden mit

Microsoft Excel durchgeführt.

56

Page 67: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

3 Ergebnisse

Die Analyse der biologischen Verträglichkeit von Implantatmaterialien

erfordert einen hohen Aufwand in zellbiologischen in vitro-Untersuchungen und

tierexperimentellen Studien. Der Einsatz von Screening-Methoden zu Beginn

der Biokompatibilitätsanalysen haben den Vorteil eines schnellen Überblicks

über eine große Probenanzahl. So können bereits in einem frühen Stadium der

Analysen nach vergleichbaren geringen Aufwendungen, ungeeignete Materi-

alien von weiterführenden kosten- und zeitaufwändigen Untersuchungen aus-

geschlossen werden.

3.1 Gradientenwerkstoff

Die Verwendung von Werkstoffen in der Zellkultur mit einer stufenweisen

Reduzierung der Nickelkonzentration von 0 at% (reines Titan) zu 90 at% Nickel

und 10 at% Titan erlaubt eine schnelle und parallele Analyse von zellbiolo-

gischen Reaktionen auf unterschiedliche Legierungen. Aus diesen Gründen

wurde in Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl Werkstoffsynthese und -herstel-

lungsverfahren des Forschungszentrums Jülich ein Gradientenwerkstoff konzi-

piert und pulvermetallurgisch hergestellt. Dieser Gradient wies folgende

Charakteristika auf: Graduierung von 100 at% Titan in 10 at% Schritten nach

90 at% Nickel und 10 at% Titan (Tab. 7), mit den Dimensionen 32x10x1.5 mm.

Dieser NiTi-Werkstoff wurde zur Analyse der Biokompatibilität der einzelnen

Komponenten mit verschiedenen Zelllinien (MG-63, SAOS-2, Swiss 3T3) kokul-

tiviert.

B) A)

Abb. 9. Gradientenwerkstoff in Kokultur mit A) MG-63 und B) SAOS-2. Zusammensetzungen

der einzelnen Segmente (A-J) siehe Tab. 7. (Zellfärbung: Türksche-Lösung).

57

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Ergebnisse

Die Untersuchungen zeigten für alle eingesetzten Zelllinien hinsichtlich Zellpro-

liferation und -adhäsion eine gute Biokompatibilität des Gradientenwerkstoffes

von der reinen Titanseite (Abb. 9 und 10 C, Segment J), bis zu einem Titanan-

teil von 50 at% (Abb. 9 und 10 B, Segment E).

A)

B)

C)

Abb. 10. Lichtmikroskopische Aufnahmen vom Gradientenwerkstoff in Kokultur mit MG-63. Zell-

morphologien an den verschiedenen Segmenten. Schwarze Pfeile zeigen MG-63-Morpholo-

gien, heller Pfeil zeigt unbewachsenen Bereich am Werkstoff.

58

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Ergebnisse

Dort konnten zelltypische Monolayer mit direktem Kontakt zur Werkstoffoberflä-

che ohne Anzeichen einer Zellschädigung beobachtet werden. Der zuneh-

mende Nickelanteil in den Segmenten D-A führte zu cytotoxischen Effekten.

Diese zeigten sich als Abrunden der Zellen einschließlich der Ablösung des

Zellmonolayers bis hin zu zellfreien Zonen am Ni-terminalen Ende des Probe-

körpers. Dieser cytotoxische Effekt konnte ab einem Nickelanteil von 60% fest-

gestellt werden (Abb. 10 B, Segment D). Die bereits klinisch eingesetzte NiTi-

Formgedächtnislegierung, bestehend aus 50 at% Nickel und 50 at% Titan, be-

findet sich in der Mitte des Gradientenwerkstoffes (Abb. 9, Segment E). Dort

konnte weder eine Abnahme der Zelladhäsion an die NiTi-Oberfläche noch eine

Hemmung der Zellproliferation analysiert werden (Abb. 10 B).

Bei dem in Abb. 9 B deutlich erkennbaren zellfreien Bereich unter den Seg-

menten E-J des Gradientenwerkstoffes handelt es sich um ein Artefakt. Dieses

entstand beim Entfernen des Gradientenwerkstoffes aus der Kavität vor dem

Anfärben der Zellen. Dabei wurden vom Gradientenwerkstoff die Zellen nach

unten geschoben. Dies ist auch deutlich an dem verdickten Zellrasen in diesem

Bereich zu erkennen.

3.2 Analyse der Osteoblastenproliferation durch quantitative digitale Bildanalytik

Die Untersuchung der Zellproliferation ermöglicht die Analyse eines

möglichen cytotoxischen Einflusses des Implantatmaterials und die Betrachtung

der Zell-Implantatinteraktion. Durch den Einsatz von Osteoblasten werden auch

Rückschlüsse auf die Biokompatibilität im Knochenbereich möglich.

Die Osteoblasten (MG63, SAOS-2) wurden 7 Tage auf den Probekörpern (NiTi

beschichtet und unbeschichtet, Titan) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen

mit Calcein-AM markiert und die Proliferation mittels digitaler Flächenauswer-

tung quantifiziert. Wie die Abb. 11 und 12 zeigen, erfolgte auf den unbeschich-

teten NiTi-Probekörpern sowie auf Titan eine deutliche Proliferation ab dem

3. Tag Zellkultur von MG-63 und SAOS-2. Im Gegensatz dazu konnte keine

Proliferation der Zellen auf den Calciumphosphat-beschichteten NiTi-

Probekörpern beobachtet werden.

59

Page 70: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

Abb. 11. Fluoreszenzanalyse der SAOS-2-Proliferation auf A) Calciumphosphat-beschichtetes

NiTi, B) unbeschichtetes NiTi, C) Titan.

Abb. 12. Fluoreszenzanalyse der MG-63-Proliferation auf A) Calciumphosphat-beschichtetes

NiTi, B) unbeschichtetes NiTi, C) Titan.

60

Page 71: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

Die Abbildungen 13 und 14 fassen die Daten der Proliferationsexperimente zu-

sammen. Im Vergleich zu unbeschichteten Probekörpern konnte eine signifikant

verminderte (p≤ 0.05) SAOS-2-Proliferation auf der Calciumphosphatschicht ab

Tag 3 Zellkultur gemessen werden (Abb. 11 und 14 A).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2

Fläc

he (%

) bed

eckt

mit

SAO

S-2A)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2

Fläc

he (%

) bed

eckt

mit

SAO

S-2B)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2

Fläc

he (%

) bed

eckt

mit

SAO

S-2C)

Abb. 13. Digitale Flächenauswertung der S

beschichtet, B) unbeschichtetes NiTi, C) Ti

NiTi unbeschichtet und Titan).

*

3T

3

3

AOS-2

tan (n=

*

4age

4Tage

4Tage

-Prolife

3), * p

*

5

5

5

ration

≤ 0,05

*

6

6

6

auf A)

NiTi b

*

7

7

7

NiTi-Calciumphosphat-

eschichtet im Vergleich zu

61

Page 72: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 2

Fläc

he (%

) bew

achs

en m

it M

G-6

3A)

05

101520253035404550

1 2

Fläc

he (%

) bew

achs

en m

it M

G-6

3B)

05

101520253035404550

1 2

Fläc

he (%

) bew

achs

en m

it M

G-6

3C)

Abb. 14. Digitale Flächenauswertung der M

beschichtet, B) unbeschichtetes NiTi, C) T

NiTi unbeschichtet und Titan).

*

3

3

3

G-63-

itan (n

*

4

Tage

4

Tage

4

Tage

Prolife

=3), * p

*

5

5

5

ration a

≤ 0,05

*

6

6

6

uf A) N

NiTi be

*

7

7

7

iTi-Calciumphosphat-

schichtet im Vergleich zu

62

Page 73: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

Die Osteoblasten auf den unbeschichteten Probekörpern hatten bereits nach

7 Tagen von der Gesamtfläche bis zu 65 ± 3,6% (n=3) bewachsen, wohingegen

auf den beschichteten Probekörpern am 7 Tag nur 3,7 ± 1,1 % (n=3) der Ge-

samtfläche bewachsen war. Ein ähnliches Proliferationsverhalten konnte auch

mit der MG-63 Zelllinie gezeigt werden (Abb. 12 und 14 A). Im Gegensatz zu

den unbeschichteten Probekörpern zeigte sich ab dem dritten Tag der Zellkultur

eine verminderte Zellproliferation auf beschichtetem NiTi. Nach 7 Tagen Zell-

kultur auf den beschichteten Probekörpern wurde von den Zellen lediglich

1,3 ± 0,2 % (n=3) der Gesamtfläche bewachsen. Auf den unbeschichteten

Probekörpern hingegen zeigten die Osteoblasten nach 7 Tagen Zellkultur eine

bewachsene Fläche von 41,1 ± 0,4 % (n=3.).

3.3 Quantifizierung der Osteoblastenproliferation durch ein colorimetrisches Verfahren

Zusätzlich wurde die Zellproliferation mit einem colorimetrischen Verfah-

ren quantifiziert (s. Abs. 2.12). Osteoblasten (SAOS-2, MG-63) wurden wie be-

schrieben (s. Abs. 2.8.1) mit den Probekörpern (NiTi beschichtet, unbeschich-

tet; Ti6Al4V beschichtet, unbeschichtet; Titan beschichtet, unbeschichtet; Ni-

ckel) für 4 Tage in Kultur genommen. Als Kontrolle dienten Osteoblasten, die

ohne Probekörper nur mit Medium allein inkubiert wurden. Anschließend er-

folgte die Analyse der Zellproliferation. Die Ergebnisse der photometrischen

Osteoblasten-Proliferationsanalyse zeigten keinen Unterschied sowohl zwi-

schen den eingesetzten Metallen (NiTi, Ti6AL4V, Titan) als auch zwischen Cal-

ciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten Probekörpern. Eine signifi-

kant verminderte Proliferation konnte auf den Nickel-Probekörpern festgestellt

werden (Abb. 15).

63

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Ergebnisse

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Kontrolle NiTi+CaP NiTi Ti6AL4V +CaP

Ti6AL4V Titan +CaP Titan N

Abs

orpt

ion

(OD

450

nm

) in

%

A)

0

20

40

60

80

100

120

Kontrolle NiTi+CaP NiTi Ti6AL4V +CaP

Ti6AL4V Titan +CaP Titan N

Abs

orpt

ion

(OD

450

nm

) in

%

B)

Abb. 15. Zellproliferationstest von A) MG-63 und B) SAOS-2 nach 4 Tagen K

verschiedenen Probekörpern (n=4, * p ≤ 0,05 zur Kontrolle und Calciumphosp

tetem und unbeschichtetem NiTi, Ti6Al4V und Titan). Als Kontrollen dienten A

Probekörper.

3.4 Bestimmung der Cytotoxizität durch Quantifizierung dAktivität

Als Maß für cytotoxische Einflüsse der Metallprobekö

LDH-Freisetzung von PBMC und PMN in Kokultur mit Calciu

schichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern gemessen.

Nach 24 Stunden Kokultur der PBMC und PMN mit bes

unbeschichteten NiTi-Probekörpern konnte zwischen den Zellen

der Kontrollansätze ohne Metallprobekörper und den Z

Metallprobekörpern (beschichtet, unbeschichtet) kein signifikan

in der LDH-Freisetzung gemessen werden (Abb. 16; n=4). E

*

ickel

*

ickel

okultur auf den

hat-beschich-

nsätze ohne

er LDH-

rper wurde die

mphosphat-be-

chichteten und

(PBMC, PMN)

ellen auf den

ter Unterschied

benfalls konnte

64

Page 75: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

kein Unterschied in der LDH-Freisetzung der Zellen (PMN und PBMC) auf den

beschichteten und unbeschichteten Probekörpern festgestellt werden (Abb. 16).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

PBMC Kontro

lle

PBMC NiTi u

nbes

chich

tet

PBMC NiTi b

esch

ichtet

PMN Kontro

lle

PMN NiTi u

nbes

chich

tet

PMN NiTi b

esch

ichtet

Lich

tabs

orpt

ion

(OD

490

nm

)

Abb. 16. LDH Freisetzung in Kontrollansätzen ohne NiTi-Probekörper und nach Kokultur von

PBMC oder PMN mit Calciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern

(n=4).

3.5 Apoptose

Die Apoptose ist ein physiologischer Prozess während der Zellentwick-

lung, der Regulation der Zelldifferenzierung und Zellzahl, der zum Zelltod führt.

Auch bei der Eliminierung der PMN aus Entzündungsherden spielt die Apop-

tose eine Schlüsselrolle. Die Regulation der PMN-Apoptose erfolgt u.a. durch

extrazelluläre Signale (z.B. Cytokine). Veränderungen im apoptotischen Ver-

halten von PMN in Kokultur mit Biomaterialien wie z.B. beschichtetem und un-

beschichtetem NiTi zeigen, welchen Einfluss diese Materialien auf die Funktio-

nalität der PMN haben. Dadurch können auch Rückschlüsse auf ein mögliches

Implantatversagen geschlossen werden. Das Apotoseverhalten von PMN wurde

nach der Adhärenz an Calciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten

NiTi-Probekörpern analysiert. Zusätzlich wurde die Freisetzung von apoptose-

regulierenden Signalen nach der Zell-Implantat-Interaktion gemessen.

65

Page 76: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

Die rasterelektronmikroskopischen Analysen zeigten, dass die Zellmorpholo-

gien von adhärenten PMN auf beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probe-

körpern sich deutlich unterschieden (Abb. 17). Während bei der Mehrzahl der

Zellen auf der unbeschichteten NiTi-Oberfläche die typische runde Morphologie

apoptotischer PMN festgestellt werden konnte (Abb. 17 A), bildeten die Mehr-

zahl der Zellen auf der Calciumphosphat-beschichteten Oberfläche Pseudopo-

dien, typisch für aktive, nicht apoptotische PMN (Abb. 17 B). Offensichtlich

führte die Aktivierung der PMN auf den beschichteten Probekörpern zu einer

Inhibition der Apoptose.

Abb. 17. Rasterelektronmikroskopische Aufnahmen von PMN kokultiviert mit A) unbeschich-

tetem NiTi und B) beschichtetem NiTi.

Eine mit diesen Zellmorphologien übereinstimmende Beobachtung konnte auch

lichtmikroskopisch an Zellen gemacht werden, die sich neben den jeweiligen

Probekörpern am Boden der Zellkulturplatte befanden (Abb. 18). Anhand dieser

66

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Ergebnisse

Beobachtungen wurde folgende Hypothese aufgestellt: Bei der Vermittlung der

Apoptoseinhibition der Zellen auf beschichteten Probekörpern spielen lösliche

Mediatoren eine Rolle. Die Synthese und Freisetzung der Mediatoren wird

durch die Zell-Oberflächen-Interaktion induziert.

Abb. 18. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von PMN im direkten Kontakt mit A)

unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi. Schwarzer Pfeil Erythrozyt, weiße Pfeile

PMN, * unbeschichteter NiTi-Probekörper, ** Calciumphosphat-beschichteter NiTi-Probekörper.

Um diese Schlussfolgerung experimentell zu belegen, wurden sogenannte kon-

ditionierte Medien (KM) eingesetzt. Diese wurden durch die Kokultivierung von

PMN mit unbeschichteten (KM-PMN) und beschichteten (KM+PMN) Probekör-

pern gewonnen. Es wurden zusätzlich KM aus der Kokultur von PBMC mit den

entsprechenden NiTi-Probekörpern eingesetzt (KM-PBMC, KM+PBMC), da

67

Page 78: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

auch Faktoren von PBMC zur Modulation der PMN auf Implantatoberflächen

beitragen können.

Die Anwesenheit von KM-PMN und KM-PBMC führten zur Apoptose von frisch

isolierten PMN. Dies ist deutlich an der typischen abgerundeten Morphologie

der Zellen zu erkennen (Abb. 19 A). Eine abgerundete Zellmorphologie konnte

auch bei Zellen beobachtet werden, die mit KM von Kontrollen d.h. Zellen, die

ohne NiTi-Probekörper nur mit Medium allein inkubiert wurden. Im Gegensatz

dazu induzierten beide KM+PMN und KM+PBMC eine Inhibition der Apoptose,

was deutlich an den abgeflachten ausgebreiteten Zellen zu erkennen ist (Abb.

19 B).

Abb. 19. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von PMN ohne Probekörperkontakt,

kokultiviert mit konditioniertem Medium von A) PBMC und unbeschichtetem NiTi (weißer Pfeil:

Erythrozyt, schwarzer Pfeil: Granulozyt) und B) PBMC mit beschichtetem NiTi (schwarzer Pfeil:

Granulozyt).

68

Page 79: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

Die Fragmentierung der DNA während der Apoptose ist ein charakteristisches

biochemisches Merkmal für apoptotische Prozesse und führt sowohl zu dop-

pelsträngigen DNA-Fragmenten mit geringem Molekulargewicht, als auch zu

Einzelstrangbrüchen (Nicks). Im TUNEL-Test (Terminale Desoxyribosyl-Trans-

ferase mediated dUTP Nick End Labeling) wurden freie 3´OH-Enden an DNA-

Strangbrüchen durch Bindung mit FITC-dUTP mit Hilfe der terminalen Desoxy-

adenylattransferase (TdT) markiert. Der TUNEL-Test zeigte mit den

morphologischen Beobachtungen übereinstimmende Ergebnisse.

Abb. 20 zeigt beispielhaft die DNA-Fragmentierung von PMN direkt nach der

Zellisolation und nach 24 Stunden Inkubation im Zellkulturmedium. Direkt nach

der Isolation der PMN konnten keine DNA-Strangbrüche gemessen werden. Im

Gegensatz dazu stieg die Anzahl der DNA-Strangbrüche der PMN nach 24

Stunden Zellkultur.

DNA-Strang Brüche

Zellz

ahl

Abb. 20. Repräsentative FACS-Analyse des Apoptoseverhaltens isolierter PMN. Direkt nach

Iso-lation (grün) und nach 24-stündiger Inkubation in RPMI1640 Zellmedium (rot).

Das Apoptoseverhalten nach 24 Stunden Kokultur von PMN mit beschichteten

und unbeschichteten NiTi-Probekörpern ist in Abb. 21 dargestellt. Die Kokultur

mit unbeschichteten NiTi-Probekörpern führte zur Apoptose der PMN. Im Ge-

gensatz dazu ergab die Kokultur von PMN mit Calciumphosphat-beschichteten

NiTi-Probekörpern keine Apoptose.

69

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Ergebnisse

Zellz

ahl

DNA-Strang Brüche

Abb. 21. Repräsentative FACS-Analyse des Apoptoseverhaltens isolierter PMN. Nach 24-stün-

diger Kokultur mit beschichtetem NiTi (orange) und unbeschichtetem NiTi (blau).

PMN, die mit KM-PMN kokultiviert wurden, zeigten ausgeprägte DNA-Strang-

brüche (Abb. 22). In unabhängigen Versuchen (n=3) mit Zellen von verschie-

denen Spendern konnte bei 74,4 ± 3,2 % der eingesetzten PMN DNA-Strang-

brüche festgestellt werden. Im Vergleich dazu wurden weniger PMN (34,7 ±

13,1 %, p<0,05) mit DNA-Strangbrüchen gemessen, nachdem die Zellen in Ge-

genwart von KM+PMN kultiviert wurden (Abb. 22).

Zellz

ahl

DNA-Strang Brüche

Abb. 22. Repräsentative FACS-Analyse des Apoptoseverhaltens isolierter PMN. PMN nach 24

stündiger Kokultur mit KM-PMN (grün) und KM+PMN (rot).

70

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Ergebnisse

3.6 Zelladhäsion

3.6.1 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf beschichteten und unbeschichteten Probekörpern

Die Analyse der Adhäsion von Leukozyten an Biomaterialien erlaubt

Rückschlüsse über Interaktion der Zellen mit dem jeweiligen Material. Die Ad-

häsion von Zellen spielt bei zahlreichen physiologischen Prozessen (z.B. Diffe-

renzierung) eine wichtige Rolle. Die Interaktion von Leukozyten mit unbe-

schichteten und beschichteten NiTi-Probekörpern wurde zusätzlich auch in

Zelladhäsions-Assays unter Verwendung von Vollblut untersucht. Calcium-

phosphat-beschichtete und unbeschichtete NiTi-Probekörper wurden für 2 Stun-

den mit heparinisiertem Vollblut inkubiert. Nach vorsichtigem Waschen in

RPMI1640 wurden die adhärenten Zellen fluoreszenz- und rasterelektronenmi-

kroskopisch analysiert (s. Abs. 2.13.2 und 2.13.3).

Durch die sehr hohe Anzahl von Erythrozyten im Vollblut konnte auf den be-

schichteten und unbeschichteten Probekörpern mittels Rasterelektronenmikro-

skopie keine eindeutige Aussage zur Zelladhäsion der Leukozyten auf den ver-

schiedenen Probekörpern gemacht werden. Wie in Abb. 23 zu sehen ist, über-

decken die Erythrozyten die adhärenten Leukozyten.

Abb. 23. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Vollblut nach 2 h Ko-

kultur mit A) unbeschichtetem und B) beschichtetem NiTi.

71

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Ergebnisse

Aus diesem Grund wurden die Leukozyten zusätzlich mit Calcein-AM markiert.

Bei der Fluoreszenzfärbung wurden die Erythrozyten unter den angegebenen

Versuchsbedingungen nicht mit Calcein-AM oder Propidiumjodid markiert, so

dass hier ein Vergleich der Leukozytenadhärenz auf den verschiedenen Probe-

körpern möglich war. Wie in Abb. 24 zu erkennen ist, ergab sich kein signifi-

kanter Unterschied in der Vollblut-Leukozyten-Adhärenz zwischen den unter-

suchten Probekörpern. Allerdings ist ein deutlicher Unterschied in der Aggre-

gatbildung zu erkennen. In der Abb. 24 B des Calciumphosphat-beschichteten

NiTi-Probekörpers befinden sich deutlich mehr Aggregate als auf dem unbe-

schichteten NiTi-Probekörper (Abb. 24 A). Die Differenzierung zwischen vitalen

und avitalen Zellen durch die Kombination von Calcein-AM und Propidiumjodid

zeigte eine kleine nicht signifikante Zunahme der avitalen Zellen auf den Calci-

umphosphat-beschichteten Oberflächen (Abb. 25 A). Die Flächenauswertung

für die mit Propidiumjodid markierten Leukozyten auf den Probekörpern ergab

eine signifikante (p<0,05) Zunahme von 0,03 ± 0,01 % für unbeschichtete Pro-

bekörper (n=3), auf 0,47 ± 0,27 % für beschichtete Probekörper (n=3) (Abb. 25).

Abb. 24. Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Vollblut nach 2 h Kokultur

mit A) unbeschichtetem und B) beschichtetem NiTi. Vitale Zellen sind grün (Calcein-AM-Fär-

bung), avitale Zellen sind rot dargestellt (Propidiumjodid-Färbung).

72

Page 83: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

0

5

10

15

20

25

30

35

40

NiTi beschichtet NiTi unbeschichtet

Fläc

he (%

) adh

ären

tes

Zelle

n

A)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

NiTi beschichtet NiTi unbeschichtet

Fläc

he (%

) adh

ären

tes

Zelle

n

B) *

Abb. 25. Quantitative Bildanalytik von Vollblut nach 2 h Kokultur mit beschichtetem und unbe-

schichtetem NiTi. A) vitale Zellen (Calcein-AM-Färbung), B) avitale Zellen (Propidiumjodid-Fär-

bung). * p< 0,05 zur Kontrolle unbeschichtetem NiTi).

3.6.2 Adhärenz von Granulozyten auf beschichteten und unbeschichteten Probekörpern

Blutzellen gehören zu den ersten Zellen, die mit einem Implantat in Kon-

takt kommen. Aufgrund der Zell-Implantat-Interaktion kommt es zu einer Frei-

setzung von vielen Mediatoren. Die Zellen können nach der Interaktion mit

Fremdmaterial mit einem breiten Spektrum an Antworten reagieren. Diese kön-

nen auch zu einer Entzündung führen und damit ein Implantatversagen verur-

sachen. Durch die Zell-Implantat-interaktion findet unter anderem eine ver-

73

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Ergebnisse

stärkte Rekrutierung von Leukozyten aus den umgebenden Gefäßen statt. Gra-

nulozyten wandern entlang eines Konzentrationsgradienten einer chemischen

Substanz wie z.B. IL-8 (Diapedese) durch Endothelwände zum Ort der Verlet-

zung bzw. Infektion. Der Einsatz von isolierten Leukozyten, als Modell für die

Diapedese, ermöglicht die Bestimmung der Leukozytenreaktion in der Implan-

tatumgebung.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Vollblut-Assays, konnte eine signifikante

Zunahme (p<0.01) der Granulozyten-Adhärenz auf den Calciumphosphat-be-

schichteten NiTi-Probekörpern im Vergleich zu den unbeschichteten NiTi-Pro-

bekörpern gemessen werden (Abb. 26). In Übereinstimmung mit dem Vollblut-

Assay konnte ebenfalls eine Zunahme der avitalen Zellen auf den Calcium-

phosphat-beschichteten Probekörpern analysiert werden (Abb. 26). Darüber

hinaus konnte konform zu den Apoptose-Assays (s. Abs. 3.6) eine veränderte

Zellmorphologie der Granulozyten auf den beschichteten Probekörpern festge-

stellt werden. Die Granulozyten auf den unbeschichteten Probekörpern zeigten

die typische abgerundete Morphologie von apoptotischen Zellen (Abb. 26 A,

Kästchen oben rechts). Auf den beschichteten Probeköpern waren vorwiegend

ausgebreitete, abgeflachte, Pseudopodien-bildende PMN (Abb. 26 B, Kästchen

oben rechts) zu erkennen.

Abb. 26. Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von PMN kokultiviert mit A)

unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi. Kästchen oben rechts stellen Vergröße-

rungen einzelner Zellen dar. Calcein-AM- (grün) und Propidiumjodid- (rot) Färbung

Diese Ergebnisse wurden auch in den rasterelektronenmikroskopischen Ana-

lysen bestätigt (Abb. 27). Hier ist deutlich zu erkennen, dass auf unbeschich-

teten NiTi-Probekörpern die abgerundeten Zellen dominieren (Abb. 27 A,

74

Page 85: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

schwarzer Pfeil), während auf den beschichteten NiTi-Probekörpern mehrheit-

lich die ausgebreiteten, abgeflachten Zellen zu beobachten sind (Abb. 27 B,

weißer Pfeil).

Abb. 27. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von PMN kokultiviert mit A)

unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi. Pfeile stellen die unterschiedlichen Zellmor-

phologien dar; schwarz: apoptotische Zelle,; weiß: aktivierter Leukozyt.

3.6.3 Adhärenz von Lymphozyten/Monozyten auf beschichteten und

unbeschichteten Probekörpern

Neben der Granulozyten-Adhärenz findet eine Adhärenz von Lympho-

zyten/Monozyten statt. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Granulozyten-

Adhärenz, konnte kein eindeutiger Unterschied zwischen der Lympho-

zyten/Monozyten-Adhärenz auf den Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Pro-

bekörpern und unbeschichteten NiTi-Probekörpern festgestellt werden (Abb.

28). Neben Lymphozyten und Monozyten befinden sich auch Thrombozyten in

der Lymphozyten/Monozyten-Fraktion. Die Zunahme Thrombozyten-Adhärenz

auf den beschichteten Probekörpern dominierte die jeweilige Adhärenz der

Lymphozyten/Monozyten Die rasterelektronenmikroskopischen Analysen der

Lymphozyten/Monozyten-Fraktion zeigten eine deutlich unterschiedliche Zell-

morphologie auf den beschichteten im Vergleich zu den unbeschichteten NiTi-

Probekörpern (Abb. 29). Die Zellen auf den unbeschichteten Probekörpern wa-

ren abgerundet, im Gegensatz dazu konnte auf den beschichteten Probekör-

pern eine vorwiegend ausgebreitete und abgeflachte Zellmorphologie festge-

stellt werden.

75

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Ergebnisse

Abb. 28. Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von PBMC kokultiviert mit A)

unbeschichtetem NiTi, Pfeil: Thrombozytenring um Lymphozyten bzw Monozyten und B) be-

schichtetem NiTi, großer Pfeil: Lymphozyt, kleiner Pfeil: Thrombozyten. Calcein-AM- (grün) und

Propidiumjodid- (rot) Färbung

Abb. 29. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von PBMC kokultiviert mit

A) unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi, vergrößerte PBMC im Kästchen oben

rechts.

3.6.4 Adhärenz von Thrombozyten auf beschichteten und unbeschich-teten Probekörpern

In Übereinstimmung mit den Beobachtungen bei der PBMC-Adhärenz

konnte im Vergleich zu unbeschichteten NiTi-Probekörpern eine deutliche Zu-

nahme der Thrombozyten-Adhärenz auf den beschichteten NiTi-Probekörpern

beobachtet werden (Abb. 30).

76

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Ergebnisse

Abb. 30. Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Thrombozyten kokultiviert

mit A) unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi, kleine Pfeile: kontaminierender Leuko-

zyt, große Pfeile: Thrombozyten. Calcein-AM- (grün) und Propidiumjodid- (rot) Färbung

3.7 Funktionsassays

3.7.1 Expression von Adhäsionsmolekülen

Die Migration von Leukozyten aus den Blutgefäßen in das Gewebe ist

ein wichtiger physiologischer Vorgang. Er spielt eine entscheidende Rolle bei

der Bekämpfung von Krankheitserregern, sowie bei der Wundheilung und Ge-

websregeneration. Die Prozesse der Zellmigration sind komplex reguliert. Die

Zellmigration wird u.a. von löslichen Faktoren und Adhäsionsmolekülen, die auf

dem Endothel und auf der Zelloberfläche der Leukozyten exprimiert werden,

gesteuert. Schon unter normalen physiologischen Bedingungen verlässt ein

kleiner Teil der Leukozyten das Gefäßsystem und wandert ins Gewebe aus. Bei

inflammatorischen Signalen im Gewebe kann die Migration der Leukozyten um

ein Vielfaches verstärkt werden. Eine Aktivierung der Leukozyten führt dazu,

dass die Expression von Adhäsionsmolekülen moduliert i.a. erhöht wird. Auf-

grund der wichtigen Rolle, die Adhäsionsmoleküle bei der Leukozyten-Migration

einnehmen, sind die Adhäsionsmoleküle auch dazu geeignet, Rückschlüsse auf

den Aktivierungszustand der Zelle zu schließen. Dabei wurden als Modell für

die Migration konditionierte Medien, gewonnen aus der Kokultur von PMN mit

beschichteten (KM+PMN) und unbeschichteten Medien (KM-PMN), zur Modu-

lation der Adhäsionsmoleküle eingesetzt. Der Einsatz von konditionierten Me-

dien simuliert den in vivo-Prozess der Zellaktivierung und der nachfolgenden

Rekrutierung von Leukozyten zum Entzündungsherd.

77

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Ergebnisse

L-Selektin (CD62L, LECAM-1) ist ein charakteristisches Adhäsionsmolekül auf

Leukozyten. Während der Migration wird das Leukozytenrolling (langsames

Vorbeirollen am Gefäßendothel) und der erste lockere Kontakt mit dem Ge-

fäßendothel durch Selektine vermittelt. L-Selektin wird von den meisten Leuko-

zyten konstitutionell exprimiert. Eine verminderte Expression des L-Selektins

korreliert direkt mit der Aktivierung der PMN, so dass auf eine mögliche Aktivie-

rung der PMN durch die Probekörper (beschichtet, unbeschichtet) geschlossen

werden kann. Aufgrund der sehr kostenintensiven Analyse der Expression von

Adhäsionsmolekülen konnten hier keine große Anzahl von Versuchs-

durchführungen erfolgen. Jedoch wurden die durchgeführten Analysen als rele-

vant für die Beurteilung der Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Formge-

dächtnislegierung betrachtet, so dass auch die Ergebnisse in diese Arbeit in-

tegriert wurden.

Die Kokultivierung von PMN mit KM+PMN (mittlere Fluoreszenzintensität,

Meanfluorescence: MFL 631 ± 408, n=2) führte im Vergleich zur Kontrolle (MFL

1470 ± 390, n=2), zu einer (bis zu 5-fach) verminderten L-Selektin-Expression

(Abb. 31). Zwischen dem KM der Kontrolle (MFL 1470 ± 390, n=2) und KM-

PMN (MFL 1364 ± 50, n=2) konnte kein Unterschied in der L-Selektin-Expres-

sion festgestellt werden.

Zellz

ahl

101

102 103

104101

0Fluoreszenzintensität

020

4080

100

6012

0Ze

llzah

l

Abb. 31. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der L-Selektin-Expression von PMN

nach Kokultur mit KM+PMN (roter Graph; MFL: 342), KM-PMN (grüner Graph; MFL: 1399) und

KM vom Kontrollansatz (schwarzer Graph; MFL: 1746).

78

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Ergebnisse

Das Zelladhäsionsmolekül CD11b (Mac-1) gehört zur Integrin-Familie und wird

insbesondere auf Monozyten und neutrophilen Granulozyten exprimiert. CD11b

bestimmt im wesentlichen die Zelladhäsion und ist bei der Rekrutierung von

Leukozyten aus den Blutgefäßen zum Ort der Verletzung bzw. Infektion rele-

vant. Da die Expression von CD11b durch Aktivierung der Leukozyten gestei-

gert werden kann, wird es auch als Granulozyten-Aktivitätsmarker verwendet

(Mickelson et. al 1996).

Die Analysen von PMN, die für 2 Stunden mit KM+PMN kokultiviert wurden,

zeigten im Vergleich zur Kontrolle eine um das 4-fache erhöhte Expression von

CD11b (Abb. 32). Wurden PMN mit KM von Kontrollansätzen inkubiert, konnte

nur eine CD11b-Spontanfreisetzung beobachtet werden.

101102 10

31041010

Fluoreszenzintensität

020

4080

100

6012

0Ze

llzah

l

Abb. 32. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der CD11b-Expression von PMN nach

Kokultur mit KM+PMN (roter Graph; MFL: 1755), KM-PMN (grüner Graph; MFL: 703) und KM

vom Kontrollansatz (schwarzer Graph; MFL: 432).

Das Zelladhäsionsmolekül ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1; CD54)

gehört zur Familie der Immunglobulin-Superfamilie.

Die Expression des ICAM-1 wird u.a. bei aktivierten PBMC hochreguliert, so

dass bei einer erhöhten Expression auf einen aktivierenden Einfluss des kondi-

tionierten Mediums geschlossen werden kann. Im Vergleich zur Kontrolle

(PBMC, die mit KM von Kontrollansätzen inkubiert wurden), konnte eine 4-fach

erhöhte Expression bei PBMC, die mit KM+PMN inkubiert wurden gemessen

79

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Ergebnisse

werden (Abb. 33). Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität (MFL) erhöhte

sich z.B. von 360 bei PMN, die mit KM-PMN inkubiert wurden, auf 1425 bei

PMN, die mit KM+PMN inkubiert wurden (Abb. 33). Zwischen dem KM der

Kontrolle (MFL 337) und KM-PMN (MFL 360) konnte kein Unterschied in der

ICAM-1-Expression festgestellt werden.

101

102 10

310

4101

0

05

1020

2515

30

Fluoreszenzintensität

Zellz

ahl

Abb. 33. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der ICAM-1-Expression von PBMC in

Kokultur mit KM+PMN (roter Graph; MFL: 1425), mit KM-PMN (grüner Graph; MFL: 360) und

KM vom Kontrollansatz (schwarzer Graph; MFL: 337).

3.7.2 Chemotaxis-Bioassay

Die Chemotaxis ist die Wanderung von Zellen entlang eines Konzentra-

tionsgradienten von chemotaktisch-aktiven Stoffen. Sie ist der initiale Schritt

beim Phagozytoseprozess, der in mehrere Hauptphasen eingeteilt werden

kann: Chemotaxis, Adhärenz von opsonisierten Fremdpartikeln (z.B. Mikro-

organismen) an die Phagozytenoberfläche, Phagozytose und intrazelluläre Eli-

minierung durch sauerstoffabhängige und sauerstoffunabhängige Mechanis-

men. Die Phagozytose wird von den PMN und Monozyten durchgeführt und ist

einer der wichtigsten Abwehrmechanismen des Körpers gegen eine Vielzahl

von bakteriellen Infektionen. Die Analyse des chemotaktischen Potentials kon-

ditionierter Medien unterschiedlicher Herkunft (beschichtet, unbeschichtet), er-

möglicht eine Beurteilung der Gewebsmodulation durch die eingesetzten Pro-

80

Page 91: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

bekörper auch hinsichtlich des PMN-Aktivierungspotentials. Die durchflußcyto-

metrischen Analysen zeigten eine signifikant (p<0,05) erhöhte Chemotaxis der

PMN, die mit KM+PMN inkubiert wurden (Abb. 34). KM+PMN induzierte z.B. die

Migration von 1658 PMN durch die Membran. Auf der anderen Seite konnte das

KM-PMN lediglich die Migration von 632 PMN induzieren. Zusätzlich zur gestei-

gerten Migration konnte eine veränderte Zellgröße gemessen werden. PMN, die

mit KM+PMN inkubiert wurden, zeigten eine erhöhte Streuung im Vorwärts-

Streulicht (FSC). Der FSC ist das Maß für die Zellgröße, d.h. die PMN, die mit

KM+PMN inkubiert wurden, sind vergleichsweise zu den PMN, die mit KM-PMN

inkubiert wurden, größer. Dies lässt sich auf den Aktivitätszustand der PMN

zurückführen. Aufgrund der erhöhten Durchwanderungsrate der PMN, die mit

KM+PMN inkubiert wurden, kann davon ausgegangen werden, dass die Zellen

durch das KM+PMN chemotaktisch aktiviert wurden. Aufgrund des erhöhten

Aktivitätszustandes hat sich die Zellmorphologie verändert d.h. die Zellen sind

vergrößert.

200 400 600 800 1000

200

400

600

800

1000

Seitwärtsstreulicht (SSC)

Vorw

ärts

stre

ulic

ht (F

CS

)

200 400 600 800 1000

Seitwärtsstreulicht (SSC)

200

400

600

800

1000

Vorw

ärts

stre

ulic

ht (F

CS)

B) A)

Abb. 34. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der PMN-Migration gegen konditio-

nierte Medien. A) KM+PMN (1658 migrierte PMN), B) KM-PMN (662 migrierte PMN). Grüne

Punkte stellen einzelne gewanderte PMN und rote Punkte die Zählpartikel (s. Abs. 2.16.2) dar.

Parallel zur Analyse des chemotaktischen Potentials (Anzahl migrierter Zellen)

der konditionierten Medien (KM-PMN und KM+PMN), wurde die Expression des

Zelladhäsionsmoleküls L-Selektin bei den migrierten PMN gemessen. Die Ver-

minderung der L-Selektin (CD62L)-Expression korreliert mit der Aktivierung der

PMN. Die Analyse der L-Selektin (CD62L)-Expression zeigte eine verminderte

Expression bei den PMN, die mit KM+PMN inkubiert wurden. Die durchschnitt-

81

Page 92: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

liche Fluoreszenzintensität (Meanfluorescence, MFI) verringerte sich z.B. von

244 bei PMN, die mit KM-PMN inkubiert wurden, auf 171 bei PMN, die mit

KM+PMN inkubiert wurden (Abb. 35). Da L-Selektin konstitutiv auf PMN expri-

miert wird, korreliert eine Verminderung der L-Selektin-Expression mit der Akti-

vierung der PMN.

05

1015

20C

ount

s

0 101 102 103 104FL1-HeightFluoreszenzintensität

Zellz

ahl

0

510

1520

Cou

nts

0 101 102 103 104FL1-HeightFluoreszenzintensität

Zellz

ahl

A) B)

Abb. 35. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der L-Selektin-Expression von PMN

nach Kokultur mit A) KM+PMN (MFI: 171) und B) KM-PMN (MFI: 244).

3.8 Analyse der Cytokinfreisetzung

3.8.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array

Neben der Zelladhäsion und der Expression von Adhäsionsmolekülen ist

die Freisetzung von löslichen Mediatoren ein weiterer wichtiger Parameter für

die Zellaktivierung. Es gibt eine Vielzahl an löslichen Mediatoren, die für eine

Zellaktivierung verantwortlich sein können. Deswegen wurde zuerst die Analyse

des Cytokinprofils durchgeführt. Der Einsatz eines Protein-Arrays erlaubt dabei

eine schnelle Analyse des Cytokinprofils in den Zellkulturüberständen aus der

Kokultur von Leukozyten mit Probekörpern. Im Zellüberstand der PBMC, die mit

unbeschichteten NiTi-Probekörpern kokultiviert wurden, dominierte ein

deutliches Signal für IL-8 (Abb. 36 A). Ein weniger intensives Signal konnte für

MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) detektiert werden. Im Gegensatz

zu den Zellüberständen der unbeschichteten Proben wurde ein zusätzliches

Signal bei IL-6 in Zellüberständen der beschichteten Proben gemessen (Abb.

82

Page 93: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

36 B). Dies deutet auf eine aktivierende Wirkung der Calciumphosphat-

beschichteten NiTi-Probekörper auf die PBMC-Fraktion hin.

Abb. 36. Entwickelter Röntgenfilm nach der Inkubation der Array-Membran mit konditionierten

Überständen. A) KM-PBMC, B) KM+PBMC.

3.8.2 Cytokinquantifizierung von Leukozyten durch ELISA

Die Ergebnisse des Cytokinnachweises mittels Protein-Array haben ein

unterschiedliches Cytokinprofil in den Zellkulturüberständen von Calciumphos-

phat-beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern gezeigt. Aus die-

sem Grund wurden die Cytokine zusätzlich über ELISA analysiert und quantifi-

ziert.

Bei der Analyse der Cytokine in konditionierten Medien bzw. Zellüberständen

von PBMC ohne Probekörperkontakt (Kontrollen) konnten keine erhöhte Frei-

setzung von IL-1ra (92,2 ± 72,8 pg/ml), IL-6 (67,2 ± 3,0 pg/ml), IL-8 (12,3 ± 1,1

pg/ml), TNF-α (4,4 ± 1,3 pg/ml), GM-CSF (0,7 ± 0,9 pg/ml) oder IFN-γ (11,6 ±

4,6 pg/ml) nachgewiesen werden (Abb. 37 A). PBMC, die mit unbeschichteten

Probekörpern für 24 Stunden kokultiviert wurden, zeigten im Vergleich zur Kon-

trolle eine signifikant (p < 0,05) gesteigerte IL-1ra (652,6 ± 518,6 pg/ml), IL-6

(2441,9 ± 73,7 pg/ml) und IL-8 (317,2 ± 197,1 pg/ml) Freisetzung. Die Analyse

der Zellüberstände von beschichteten Probekörpern ergab dann einen weiteren

signifikanten (p < 0,05) Anstieg in der Freisetzung von IL-1ra (1584,3 ± 961,5

pg/ml), IL-6 (7892,6 ± 140,3 pg/ml), IL-8 (867,0 ± 82,1pg/ml), TNF-α (638,8 ±

26,0 pg/ml), GM-CSF (713,3 ± 260,2 pg/ml) und IFN-γ (10,8 ± 2,0 pg/ml) im

Vergleich zu unbeschichteten Proben (Abb. 37 A).

83

Page 94: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

Die Cytokinfreisetzung der PMN in den Kontrollansätzen zeigten keine signifi-

kant erhöhten Werte für IL-6 (12,9 ± 7,7 pg/ml), IL-8 (149,1 ± 69,4 pg/ml), TNF-

α (1,7 ± 0,6 pg/ml) und GM-CSF (0,7 ± 0,8 pg/ml). Allerdings konnte eine

erhöhte Freisetzung von IL-8 (260,9 ± 127,5 pg/ml) der PMN auf

unbeschichteten Probekörpern gemessen werden. Die Konzentrationen von IL-

6 (15,2 ± 7,8 pg/ml), TNF-α (1,6 ± 0,4 pg/ml) und GM-CSF (0,1 ± 0,1 pg/ml)

blieben im Bereich der Kontrollen. In den Zellkulturüberständen der

beschichteten Probekörper wurden im Vergleich zur Kontrolle signifikant

(p < 0,05) erhöhte Cytokinkonzentrationen festgestellt. Folgende Konzen-

trationen wurden gemessen: IL-6 (262,2 ± 151,5 pg/ml), IL-8 (2736,9 ± 556,1

pg/ml), TNF-α (89,0 ± 9,9 pg/ml) und GM-CSF (50,6 ± 6,7 pg/ml) (Abb. 37 B).

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

Kontrolle NiTi unbeschichtet NiTi Calciumphosphat-beschichtet

pg/m

l

IL-1raIL-2IL-6IL-8IL-10TNF-α GM-CSFIFN-γ

* A)

* *

* * * * *

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Kontrolle NiTi unbeschichtet NiTi Calciumphosphat-beschichtet

pg/m

l

IL-8IL-6TNF-α GM-CSF

*

B)

* * *

Abb. 37. Cytokinfreisetzung durch Leukozyten nach der Kokultur mit Calciumphosphat-

beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern und Kontrollen (=spontane Cytokin-

freisetzung) . A) PBMC (n=16), B) PMN (n=16). * p < 0,05 zur Kontrolle.

84

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Ergebnisse

3.9 Analyse der Nickelfreisetzung aus NiTi-Probekörpern

Eine mögliche Freisetzung von Nickel aus NiTi könnte einen negativen

Effekt auf die Funktionalität der das Implantatlager umgebenden Zellen haben.

Die Nickelfreisetzung ist abhängig von der Oberflächenbehandlung des NiTi-

Materials sowie vom umgebenden Medium. Die freigesetzte Nickelmenge aus

Calciumphosphat-beschichteten, unbeschichteten und geätzten NiTi-Probekör-

pern wurde in Pufferlösung pH 7,4 in einem Zeitraum von 1 bis 56 Tage ana-

lysiert. Da für eine bessere Anheftung und Kristallisation der Calciumphosphat-

schicht die NiTi-Oberflächen angeätzt wurden (s. Abs. 2.4) und dies Auswir-

kungen auf eine mögliche Nickelfreisetzung haben kann (Shabalovskaya 2002),

wurde zusätzlich die Nickelfreisetzung aus angeätzten, unbeschichteten NiTi-

Probekörpern analysiert. Zusätzlich wurde die Nickelfreisetzung im Blutplasma

innerhalb von 3 Tagen gemessen.

Die Fragestellung dieser Arbeit lag nicht im Bereich der Nickelallergieinduzie-

rung durch nickelhaltige Implantate. Aus diesen Gründen wurden die Analysen

der Nickelfreisetzung nur beispielhaft durchgeführt. Dennoch tragen die Ergeb-

nisse zur Feststellung der Biokompatibilität von NiTi-Formgedächtnislegie-

rungen bei und können als Pilotexperiment für weitere Arbeiten hinsichtlich der

Nickelallergie durch NiTi-Implantate dienen.

Wie anhand der Abb. 38 und 39 deutlich wird, konnte eine erhöhte Nickelfrei-

setzung der Probekörper (beschichtet, unbeschichtet, geätzt) im Plasma im

Vergleich zur Phosphat-Pufferlösung gemessen werden. Im Plasma wurde z.B.

am dritten Tag aus geätztem NiTi 14,1 µg/ml Nickel freigesetzt, im Gegensatz

dazu wurde im Puffer am dritten Tag 4,7 µg/ml Nickel freigesetzt.

Desweiteren zeigt die Abb. 38 einen deutlichen Unterschied in der Nickelfrei-

setzung der eingesetzten Metallprobekörper im Plasma. Im Vergleich zum be-

schichteten (1. Tag: 8,4 µg/ml, 2. Tag 7,8 µg/ml, 3. Tag 7,3 µg/ml) und geätzten

(1. Tag: 16 µg/ml, 2. Tag 14 µg/ml, 3. Tag 14,1 µg/ml) NiTi, konnte beim unbe-

schichten NiTi (1. Tag: 0,2 µg/ml, 2. Tag 0,2 µg/ml, 3. Tag 0,1 µg/ml) nur eine

geringe Nickelfreisetzung gemessen werden.

Auch die Nickelfreisetzung im Puffer zeigte, dass aus geätztem und beschich-

tetem NiTi mehr Nickel freigesetzt wird, als aus unbeschichtetem NiTi (Abb. 39).

Die freigesetzte Nickelmenge aus geätztem NiTi lag zwischen 4,7 µg/ml (3.

85

Page 96: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

Tag) und 8,1 µg/ml (6. Woche) und aus beschichtetem NiTi zwischen 1,2 µg/ml

(3. Tag) und 2,9 µg/ml (8. Woche). Im Vergleich dazu konnte bei unbe-

schichtetem NiTi eine Nickelfreisetzung zwischen 0,04 µg/ml (1. Woche) und

0,06 µg/ml (7. Woche) gemessen werden.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 2 3

Tage

Nic

kel m

g/L

Abb. 38. Nickelfreisetzung aus Metallprobekörpern im Plasma. Blaue Balken geätztes NiTi, rote

Balken Calciumphosphat-beschichtetes NiTi, grüne Balken unbeschichtetes NiTi.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

3 .Tag 1 .Woche

2 .Woche

3 .Woche

4 .Woche

5 .Woche

6 .Woche

7 .Woche

8 .Woche

Nic

kel m

g/L

Abb. 39. Nickelfreisetzung aus Metallprobekörpern im Phosphatpuffer pH 7,4. Blaue Balken

geätztes NiTi, rote Balken Calciumphosphat-beschichtetes NiTi, grüne Balken unbeschichtetes

NiTi.

86

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Ergebnisse

3.10 Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel(II)-Chlorid

Die Nickel-Freisetzungsanalysen haben gezeigt, dass im Vergleich zum

unbeschichteten NiTi aus Calciumphosphat-beschichtetem und geätztem NiTi

mehr Nickelionen freigesetzt werden, das könnte einen möglichen Einfluss auf

die Cytokinsynthese haben.

Welchen Einfluss die Nickelfreisetzung aus den Calciumphosphat-be-

schichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern auf die Cytokinfreisetzung

von PBMC hat, wurde durch die Zugabe von Nickel(II)-Chlorid (NiCl2) in ver-

schiedenen Konzentrationen analysiert. Die entsprechenden NiCl2-Konzentra-

tionen wurden anhand der Ergebnisse der NickelfreisetzungsAnalysen (s. Abs.

3.10) gewählt. 1x106 PBMC/ml wurden mit 0 mg/L, 24 mg/L, 2,4 mg/L, 240

µg/L, 24 µg/L und 2,4 µg/L NiCl2 für 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen

kokultiviert. Anschließend wurde die Cytokinfreisetzung im Zellkulturüberstand

mittels ELISA analysiert und quantifiziert. Im Vergleich zur Kontrolle (100%)

zeigte sich ein signifikanter Unterschied in der Freisetzung von IL-1ra (359,1 ±

186,8 %) und IL-6 (246,2 ± 99,3 %) bei 24 mg/ml NiCl2. Bei der Analyse der IL-

8-Freisetzung (102,8 ± 25,6 %) konnte kein Unterschied zwischen den ver-

schiedenen NiCl2-Konzentrationen gemessen werden (Abb. 40).

0

100

200

300

400

500

600

0 mg/L 24 mg/L 2,4 mg/L 240 µg/L 24 µg/L 2,4 µg/L

Nickel-Chlorid

% F

reis

etzu

ng

IL-1raIL-6IL-8

Abb. 40. PBMC Cytokinfreisetzung nach 24 Stunden in Anwesenheit von NiCl2 (n=3). * p < 0,05.

Die Cytokinkonzentration (IL-1ra, IL-6, IL-8) in der Kontrolle wurde als 100% angesetzt.

*

*

87

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Ergebnisse

3.11 Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel(II)-Chlorid nach Zellstimulation

Da eine Modulation der Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel-

Chlorid beobachtet werden konnte (Wataha et al. 2004), wurde zusätzlich der

Einfluss der Nickelfreisetzung aus NiTi-Probekörpern auf die Cytokinfreisetzung

von stimulierten PBMC analysiert. Als Zell-stimulierende Faktoren wurden Lipo-

polysaccharid (LPS), Concanavalin A (ConA) und Toxic-shock-syndrome To-

xin 1 (TSST-1) eingesetzt. Die NiCl2-Konzentrationen wurden nach den Ergeb-

nissen der Nickelfreisetzungs-Analysen (s. Abs. 3.10) gewählt. Die höchste Ni-

ckelkonzentration (24 mg/l NiCl2) und die TSST-1 oder ConA Stimulation führte

im Vergleich zur Kontrolle zu einer signifikant erhöhten IL-1ra-Freisetzung bei

PBMC (Abb. 41). Eine LPS-Stimulation bei der gleichen NiCl2-Konzentration

zeigte keine erhöhte IL-1ra-Freisetzung. Die Analysen der IL-6, IL-8 und TNF-α

Freisetzungen der PBMC in Kokultur mit den niedrigeren NiCl2-Konzentrationen

und zusätzlicher Stimulation führten im Vergleich zu den Kontrollansätzen zu

keiner signifikant veränderten Cytokinfreisetzung (Abb. 42-44).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Kontrolle 24 mg/l 2,4 mg/l 240 µg/l 24 µg/l 2,4 µg/l

Nickel-Chlorid

% F

reis

etzu

ng IL

-1ra

IL-1ra LPS

IL-1ra ConA

IL-1ra TSST

*

*

Abb. 41. Freisetzung von IL-1ra aus PBMC in Anwesenheit von unterschiedlichen Nickelkon-

zentrationen nach Zellstimulation mit LPS, ConA und TSST-1. Die IL-1ra-Konzentration in der

Kontrolle wurde als 100% angesetzt. (n=3). * p < 0,05.

88

Page 99: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Ergebnisse

0

50

100

150

200

250

300

Kontrolle 24 mg/l 2,4 mg/l 240 µg/l 24 µg/l 2,4 µg/lNickel-Chlorid

% F

reis

etzu

ng IL

-6IL-6 LPS

IL-6 ConA

IL-6 TSST

Abb. 42. Freisetzung von IL-6 aus PBMC in Anwesenheit von unterschiedlichen Nickelkonzen-

trationen nach Zellstimulation mit LPS, ConA und TSST-1. Die IL-6-Konzentration in der Kon-

trolle wurde als 100% angesetzt. (n=3).

0

50

100

150

200

250

300

Kontrolle 24 mg/l 2,4 mg/l 240 µg/l 24 µg/l 2,4 µg/l

Nickel-Chlorid

% F

reis

etzu

ng IL

-8

IL-8 LPS

IL-8 ConA

IL-8 TSST

Abb. 43. Freisetzung von IL-8 aus PBMC in Anwesenheit von unterschiedlichen Nickelkonzen-

trationen nach Zellstimulation mit LPS, ConA und TSST-1. Die IL-8-Konzentration in der Kon-

trolle wurde als 100% angesetzt. (n=3).

89

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Ergebnisse

0

50

100

150

200

250

300

Kontrolle 24 mg/l 2,4 mg/l 240 µg/l 24 µg/l 2,4 µg/l

Nickel-Chlorid

% F

reis

etzu

ng T

NF-α

TNF-α LPS

TNF-α ConA

TNF-α TSST

Abb. 44. Freisetzung von TNF-α aus PBMC in Anwesenheit von unterschiedlichen Nickelkon-

zentrationen nach Zellstimulation mit LPS, ConA und TSST-1. Die TNF-α -Konzentration in der

Kontrolle wurde als 100% angesetzt. (n=3).

90

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Diskussion

4 Diskussion

Anhand der NiTi-Formgedächtnislegierung wurden in dieser Arbeit in

vitro Biokompatibilitäts-Assays etabliert, die im Vergleich zu den Richtlinien der

DIN EN ISO 10993 eine verbesserte Prognose einer in vivo Implantat-Zell-Re-

aktion ermöglichen. Es konnten durch Analyse der Mediatorfreisetzung Aus-

sagen über eine selektive Aktivierung von Leukozyten an NiTi-Oberflächen ge-

macht werden. Neben der Mediatoranalyse wurden Zellkulturüberstände in

speziellen Funktionsassays (Chemotaxis, Expression von Adhäsionsmolekülen)

eingesetzt. Dabei konnte die biologische Gesamtaktivität der freigesetzten

Faktoren genutzt werden und so ein genaueres Bild über mögliche Implantat-

Zell-Reaktion in vivo gewonnen werden.

4.1 Bewertung der Biokompatibilität

Die Biokompatibilität von Implantatmaterialien wird von vielen verschie-

denen Parametern beeinflusst. Nach Implantation eines Biomaterials in den

Körper spielen bei der Gewebe-Implantat-Reaktion zelluläre und humorale

Faktoren wie Chemotaxine, Wachstumsfaktoren, Komplement, Cytokine, Hor-

mone, Enzyme, Adhäsionsmoleküle neben vielen anderen Faktoren eine wich-

tige Rolle.

Die Biokompatibilität eines Materials ist die Fähigkeit, bei einem speziellen Ein-

satz eine angemessene Reaktion des umgebenden Gewebes hervorzurufen

(European Society for Biomaterials, 1986). Für Knochenimplantat-Materialien

bedeutet dies z.B. eine gute Zelladhäsion, -proliferation sowie die Induktion von

Faktoren, die die Knochenbildung fördern. Eine vergleichende Analyse der Bio-

kompatibilität von Biomaterialien erfordern einheitliche standardisierte Metho-

den, wie sie in der DIN EN ISO 10993 beschrieben sind. Obwohl diese Richtli-

nien immer wieder an die neuen wissenschaftlichen Erkenntnisse angepasst

werden, findet eine biologische Beurteilung von Biomaterialien für den medizi-

nischen Einsatz oft nach cytotoxischen Gesichtspunkten statt. Folgende Prüf-

verfahren werden empfohlen: Cytotoxizität, Sensibilisierung, Gentoxizität und

lokale pathogene Effekte im lebendem Gewebe durch das Einbringen des Bio-

materials im Tiermodell, wodurch eine zusätzliche Beurteilung der chronischen

Toxizität und Kanzerogenität ermöglicht wird. Die Analyse der Cytotoxizität und

91

Page 102: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

Gentoxizität erfolgt in vitro durch den Einsatz von Zellkulturtechniken. Bei der

Untersuchung des Sensibilisierungspotentials handelt es sich im wesentlichen

um dermatologische Prüfverfahren mittels Tierversuche (Haut, Schleimhaut,

Augen) zur Einschätzung möglicher Schäden durch den Kontakt mit dem Mate-

rial selbst oder aus dem Material austretende Substanzen. Auch die lokalen

pathogenen Effekte im Gewebe, chronische Toxizität und Kanzerogenität wer-

den durch tierexperimentelle Reihenversuche ermittelt.

Die Biokompatibilität eines Biomaterials bedeutet nicht nur das Ausbleiben einer

zelltoxischen Reaktion, sondern schließt auch die Biofunktionalität eines Mate-

rials ein.

Die in dieser Arbeit entwickelten Testsysteme sollen jedoch weiterführende in

vitro Analysen ermöglichen, um Vorhersagen über eine in vivo Zell-Implantat-

Reaktion zu ermöglichen. Dabei wurden nicht nur konditionierte Medien aus der

Immersion vom Biomaterial in Lösung (z.B. Zellkulturmedium ohne Serum), wie

es die DIN EN ISO 10993 empfiehlt, eingesetzt, sondern in vivo nahe konditio-

nierte Medien aus der Kokultur von Leukozyten mit NiTi-Probekörpern verwen-

det.

In der Literatur finden sich eine Anzahl von Publikationen zur Biokompatibilität

von NiTi. Die Biokompatibilität von NiTi wurde dabei durch Zellkultur mit

Fibroblasten, Endothelzellen oder Osteoblasten analysiert. In den meisten chir-

urgischen Situationen sind jedoch Leukozyten die ersten Zellen, die in Kontakt

mit einem Implantat kommen (Eriksson et al. 2001). Aus diesem Grund ist es

sinnvoll, Leukozyten zur Analyse der Biokompatibilität einzusetzen. Wenn Bio-

materialien Anwendung im Knochen finden, sollten humane Osteoblasten in die

Analysen einbezogen werden. Deshalb wurden in dieser Arbeit Leukozytenfrak-

tionen und humane Osteoblasten zur Analyse der Biokompatibilität von NiTi als

Knochenimplantatmaterial verwendet.

4.2 Gradientenwerkstoffe zur ersten schnellen Analyse der

Biokompatibilität

Mit Hilfe des für diese Arbeit entwickelten Gradienten-Werkstoffes konnte

gezeigt werden, dass die NiTi-Formgedächtnislegierung mit einem Nickelanteil

bis zu 50 at% unter den vorhandenen experimentellen Bedingungen keinen

cytotoxischen Effekt auf humane Osteoblasten hatte. Weiterhin zeigten die Zell-

92

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Diskussion

kulturexperimente auch für die Kompartimente 100 at% - 50 at% Titan eine gute

Zelladhärenz und Proliferation. Die fehlende Biokompatibilität im Bereich der

nickelreichen Legierung lässt sich wahrscheinlich auf die gesteigerte Freiset-

zung von Nickelionen zurückführen. Es ist möglich, dass die titanarmen Legie-

rungen keine oder nur langsam eine Titandioxid-Schicht an der Oberfläche bil-

den (Passivierung), so dass hier unter dem Einfluss des Zellkulturmediums lo-

kale Korrosion und somit eine vermehrte Nickelionen-Freisetzung stattfinden

kann. Wenn auch NiTi-Formgedächtnis-Implantate viel länger im Gewebe ver-

weilen und die Diffusionskinetik von Nickel im Gewebe wahrscheinlich eine an-

dere ist, kann das entwickelte Experimentalmodell in frühen Entwicklungspha-

sen von Implantat-Materialien von großem Nutzen sein. Damit können bereits

frühzeitig bestimmte Materialien von weiterführenden Biokompatibilitätsuntersu-

chungen z.B. über Tierversuche ausgeschlossen werden. Die Verwendung

eines Gradientwerkstoffes macht es möglich, parallel verschiedene Legie-

rungen oder Komposite mit unterschiedlicher Zusammensetzung zu ana-

lysieren. Sie erlaubt damit eine Beurteilung der Biokompatibilität in vitro und

prinzipiell auch in vivo. Der experimentelle Einsatz eines Gradientenwerkstoffes

im Tiermodell wurde bereits von Watari et al. (2000) berichtet. Die Ergebnisse

sind mit denen dieser Arbeit vergleichbar. Die in vivo Analysen von Watari et al.

(2000) mit einem Gradientenwerkstoff mit den Abstufungen von reinem Titan zu

reinem Kobalt im subkutanen Weichgewebe von Ratten haben gezeigt, dass

mit ansteigender Kobaltkonzentration sich um das Implantat eine immer stärker

ausgeprägte bindegewebige Schicht bildete. Elementanalysen zeigten eine ver-

stärkte Kobaltionen-Freisetzung in den kobaltreichen Kompartimenten, eine

Titan Freisetzung konnte nicht gemessen werden.

Mit Hilfe eines Gradientenwerkstoffes und zellbiologischen Cytotoxizitäts-Ana-

lysemethoden kann relativ schnell zwischen biokompatiblen und nicht biokom-

patiblen Werkstoffen unterschieden werden. Es handelt sich also um ein Aus-

schluss- und Screeningverfahren, das erste Aussagen über ein Material ermög-

licht. Schwieriger wird es jedoch, in einem Gradientenwerkstoff verschiedene

biokompatible Materialien zu vergleichen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen,

dass sich NiTi, reines Titan und die graduellen Abstufungen dazwischen sich

von der zellbiologischen Reaktion nicht unterscheiden. Bei der Fragestellung,

93

Page 104: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

ob reines Titan oder NiTi biokompatibler bzw. erwünschte zellbiologische Reak-

tionen hervorruft, kann keine eindeutige Antwort gegeben werden.

Allerdings stehen dem hier entwickelten Experimentalmodell die Analyse wei-

terer Parameter offen, z.B. ist es möglich, die zellbiologischen Reaktion auf ver-

schiedene Material-Rauhigkeiten zu analysieren. Durch die Verwendung von

einem Material mit einem Rauhigkeitsgradienten könnten zellbiologische Reak-

tionen direkt an der Oberfläche analysiert werden.

4.3 Zelladhäsion als ein Parameter der Biokompatibilität

Die Zelladhäsion ist ein früher und zentraler Vorgang der Zellinteraktion

mit einem Biomaterial. Bei zahlreichen physiologischen Prozessen (z.B. Prolife-

ration und Differenzierung) spielt sie eine wichtige Rolle und ist somit eine we-

sentliche Voraussetzung für die Gewebeintegration z.B. bei Knochenim-

plantaten. Durch Zelladhäsionsanalysen lassen sich u.a. toxische Zell-Implan-

tat-Reaktion analysieren, die einen wesentlichen Aspekt von Biokompatibilitäts-

analysen bilden. Die Betrachtung der Zelladhäsion und damit auch die Beurtei-

lung der Biokompatibilität eines Materials ist abhängig vom Einsatzort bzw. von

der Anwendung eines Implantates. Die Zelladhärenz an ein Biomaterial bedeu-

tet für einen vaskulären Stent auf Dauer das Versagen des Implantates. In die-

ser Arbeit stand die Biokompatibilität hinsichtlich orthopädischer Implantate im

Vordergrund und dabei stellt die Zelladhäsion eine unerlässliche Voraussetzung

für eine Gewebsintegration des Implantates dar.

In der Literatur finden sich zur Adhäsion von Zellen an NiTi nur wenige Unter-

suchungen. Analysen mit osteoblasten-ähnlichen Osteosarkoma-Zellen (ROS-

17) von Ratten auf NiTi zeigten eine gute Adhäsion dieser Zellen an NiTi

(Kapanen et al. 2002). Übereinstimmend mit diesen Resultaten zeigten die Er-

gebnisse dieser Arbeit sowohl mit humanen osteoblasten-ähnlichen Osteosar-

komazellen (MG-63, SAOS-2) als auch mit frisch isolierten humanen Leuko-

zyten (Lymphozyten, Granulozyten, Thrombozyten) ebenfalls gute Adhärenz

auf NiTi-Oberflächen. Waren die NiTi-Probekörper zusätzlich mit Calciumphos-

phat-beschichtet konnte eine erhöhte Leukozytenadhärenz im Vergleich zu un-

beschichtetem NiTi festgestellt werden. Wie die rasterelektronenmikrosko-

pischen Analysen dann klar demonstrierten (Abb. 45), lagen die PMN und

94

Page 105: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

PBMC auf der Calciumphosphatschicht und damit kann die gemessene erhöhte

Adhärenz aufgrund einer Oberflächenvergrößerung durch Calciumphosphat-

kristalle ausgeschlossen werden.

Abb. 45. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Granulozyten auf der

Calciumphosphatschicht in Aufsicht.

Dennoch hat die Oberflächentopographie der Calciumphosphatschicht offen-

sichtlich einen wesentlichen Effekt auf die Leukozytenadhärenz. Makrophagen

zeigen eine erhöhte Zelladhäsion auf rauheren Titanoberflächen (Takebe et al.

2003). Sogar die Nanostruktur der Oberfläche hat einen Einfluss auf die Zellak-

tivität. Karlsson et al. (2004) berichteten, dass sich in Abhängigkeit von der Po-

rengröße im Nanobereich eines Aluminium-Substrates der Aktivitätszustand

und die damit verbundene Morphologie von PMN verändert. Neben der Ober-

flächentopographie bzw. Rauhigkeit scheinen Materialeigenschaften wie die

Benetzbarkeit eine signifikante Rolle zu spielen. Dabei zeigten hydrophobe

Materialien wie z.B. Polyethylen eine im Vergleich zu hydrophilen Materialien

z.B. Polystyrol erhöhte Adhäsion der PMN (Otto et al. 2003). Auch in vivo Ana-

lysen von hydrophoben und hydrophilen Biomaterialien zeigten z.B. nach 14

Tagen Implantation in Rattenrückenhaut eine erhöhte Makrophagenadhäsion

am hydrophoben Biomaterial (Brodbeck et al. 2002). Dabei scheint die Präab-

sorption von Proteinen (z.B. Fibrinogen) an die Oberflächen eine wesentliche

Rolle zu spielen. Die Proteine dienen als Liganden für proteinspezifische Re-

95

Page 106: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

zeptoren an der Monozytenoberfläche. Weiterhin zeigten die Zelladhäsions-

analysen dieser Arbeit keinen toxischen Effekt der NiTi-Probeköper auf Leuko-

zyten und osteoblasten-ähnliche Zellen. Bei der Zell-Implantat-Interaktion

kommt es zu einer Freisetzung von vielen Faktoren. Dadurch findet unter

anderem eine verstärkte Zellproliferation statt. Der Einsatz von osteoblasten-

ähnlichen Zellen, als Modell für das Knochenwachstum, ermöglicht eine Ana-

lyse der Langzeit-Zell-Implantat-Interaktion.

4.4 Zellproliferation als Kriterium für Biokompatibilität

Die Analyse der Zellproliferation dient wesentlich zur Beurteilung von

Langzeit-Effekten des NiTi auf z.B. osteoblastenähnliche Zellen. Sie stellt somit

ein geeignetes Modell der Osteointegration und Toxizität eines Biomaterials

dar.

In der Literatur finden sich zahlreiche Publikationen zur Zellproliferation auf

NiTi. Bei der Kultivierung von humanen Lymphozyten auf NiTi konnte nach 72

Stunden und unter Stimulation mit Concanavalin A kein Unterschied zu Titan

und Kontrollen ohne Metallprobekörper in der Zellproliferation festgestellt wer-

den (Shabalovskaya 2002). Auch die Kultivierung über einen gleichen Zeitraum

mit anderen Zellen wie humanen embryonalen Zelllinien (L132, HEPM) auf NiTi,

Titan und Ti6AL4V ergaben keinen Unterschied in der Zellproliferation auf den

verschiedenen Metallen (Rocher et al. 2004). Trepanier et al. (1999) wiesen

nach, dass auch nach unterschiedlicher Oberflächenbehandlung (elektrolytisch-

poliert, hitze-behandelt, passiviert) von NiTi-Stents und anschließender Kultivie-

rung mit humanen Fibroblasten kein Unterschied in der Zellproliferation nach 10

Tagen festgestellt werden konnte. Ebenfalls eine gute Proliferation von huma-

nen Fibroblasten und Osteoblasten auf NiTi im Vergleich zu Kontrollen ohne

Metall, Titan und Edelstahl wurden von Ryhänen et al. (1997) beschrieben. Die

in der vorliegenden Arbeit beschriebene Zellproliferation von humanen osteo-

blasten-ähnlichen Zellen (MG-63, SAOS-2) auf NiTi-Probekörper im Vergleich

zu Titan korrelieren zu den in der Literatur beschriebenen Analysen. Im Gegen-

satz dazu zeigten die osteoblasten-ähnlichen Zellen eine verminderte Zellproli-

feration auf Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern im Vergleich zu

unbeschichtetem NiTi und Titan. Alliot-Licht et al. (1991) berichteten, dass

Osteoblasten in der Gegenwart von Hydroxylapatit Calciumphosphatpartikel

96

Page 107: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

phagozytieren. Die damit verbundene veränderte intrazelluläre Calciumhomö-

ostase führt dann zur Hemmung der DNA-Synthese und zur reduzierten

Zellproliferation. Desweiteren werden Osteoblastenproliferation, Differenzie-

rung, Matrixsynthese und Wachstumsfaktorenbildung von der Oberflächenmor-

phologie beeinflusst (Bächle et al. 2004, Kieswetter et al. 1996). Auch Dunn et

al. (1982) und Desai et al. (2000) haben festgestellt, dass die Substrat-Topo-

graphie die Zellmorphologie und das Zellverhalten beeinflussen kann. Dabei

haben die jeweilige Gestalt wie z.B. Grate, Riefen, Spitzen, Löcher, Spiralen

und deren Dimension sowie die jeweilige Verteilung einen signifikanten Einfluss

auf das Zellverhalten (Tan et al. 2000, Flemming et al. 1999, Curtis et al. 1998,

Clark et al. 1987). So ist es möglich, dass neben der Calciumphosphatpartikel-

Aufnahme die Oberflächenmorphologie aufgrund der scharfkantigen Calcium-

phosphat-Plättchen (Abb. 46) im Vergleich zum glatten unbeschichteten NiTi

eine Osteoblastenproliferation verhinderte.

Abb. 46. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Calciumphosphat-

schicht aus Lösung in Aufsicht.

Im Vergleich zum klassischen colorimetrischen Verfahren (s. Abs. 3.4) hat sich

die Zell-Proliferationsanalyse über Fluoreszenzmarkierung und anschließender

Quantifizierung mit der digitalen Bildanalytik (s.Abs.3.3) als eine sensitivere

Methode herausgestellt. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmarkierung konnte unter

gleichen Versuchsbedingungen mit dem colorimetrischen Verfahren kein Unter-

97

Page 108: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

schied in der Osteoblastenproliferation (MG-63, SAOS-2) auf den verschie-

denen Metallprobekörpern (NiTi beschichtet und unbeschichtet, Titan be-

schichtet und unbeschichtet, Ti6AL4V beschichtet und unbeschichtet) festge-

stellt werden. Lediglich auf den als cytotoxisch eingestuften Nickelprobekörpern

konnte eine signifikant verminderte Zellproliferation gemessen werden. Es ist

anzunehmen, dass die Umsetzungskapazität der vitalen Osteoblasten von

Tetrazoliumsalze in Formazanderivate den Anteil an avitalen Osteoblasten auf

den verschiedenen Metallprobekörpern überlagerte und so kein Unterschied der

Zellproliferation festgestellt werden konnte.

Ein ähnliches Ergebnis zeigte sich auch bei der Beurteilung des cytotoxischen

Effektes von beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörper auf Leuko-

zyten. Im Vergleich zur klassischen Methode der Analyse der Cytotoxizität

durch LDH-Quantifizierung (s. Abs. 3.5) stellten sich die Fluoreszenzmarkierung

(vitale vs. avital Markierung) und die Analyse des Apoptoseverhaltens als sen-

sitiver heraus. Die LDH-Quantifizierung im Zellkulturüberstand aus der Kokultur

von Leukozyten mit beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern

zeigten keinen Unterschied im cytotoxischen Einfluss von beschichteten und

unbeschichteten NiTi-Probekörpern auf Leukozytenfraktionen (PBMC, PMN).

Im Gegensatz dazu konnte unter gleichen Versuchsbedingungen durch Fluo-

reszenzmarkierung (s. Abs. 3.7.1) und Analyse der Apoptose (s. Abs. 3.6) eine

erhöhte Anzahl von apoptotischen und avitalen Leukozyten auf beschichteten

NiTi-Probekörpern festgestellt werden. Die Untersuchungen der Apoptose und

die Fluoreszenzmarkierung stellen eine direkte Analysemethode dar, d.h. die

Analyse findet auf der Ebene der Zelle statt, während es sich bei der LDH-

Quantifizierung um eine indirekte Methode handelt. Dort wird die LDH-Aktivität

im Zellkulturüberstand gemessen, die dann proportional zu den avitalen Zellen

ist. Dabei hat das im RPMI1640 enthaltene Phenolrot (OD490: 0,04 ± 0,001) ei-

nen geringen Einfluss auf die Messungen. Jedoch zeigte sich, dass die LDH-

Aktivität des FCS (OD490: 0,54 ± 0,01) einen entscheidenen Einfluss auf die

Messungen hatte. Die LDH-Aktivität des FCS überlagerte die LDH-Freisetzung

aus avitalen Zellen, so dass kein Unterschied im cytotoxischen Einfluss der be-

schichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörper gemessen werden konnte.

Durch die Fluoreszenzmarkierung der Zellen wird nicht nur eine Quantifizierung

der Zellen auf dem Biomaterial ermöglicht, sondern auch deren morphologische

98

Page 109: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

Betrachtung. Dies ist mit der Durchlichtmikroskopie aufgrund der Lichtundurch-

lässigkeit des Materials nicht möglich. Die Auflichtmikroskopie würde hier eine

Möglichkeit bieten, allerdings ist die klare Abgrenzung der Zellen gegenein-

ander aufgrund ihrer Transparenz sehr aufwendig. Dennoch zeigen sich

Schwächen der Methode bei der Analyse der Proliferation auf Biomaterialien,

die große Unebenheiten wie z.B. bei porösen Materialien aufweisen. Dort kön-

nen die in unterschiedlichen Fokusebenen liegenden Zellen nicht vollständig

erfasst werden und eine Auswertung wird ungenau.

Die Beurteilung der Biokompatibilität durch die Zellproliferation stellt ein geeig-

netes Modell der Gewebsintegration dar. Die Bedeutung liegt vor allem in der

Analyse der Langzeit-Cytotoxizität des Implantatmaterials. Um ein vollständiges

Bild der Langzeit-Zell-Implantat-Interaktion zu erhalten, kommen weiterführende

Analysen der Zelldifferenzierung auf NiTi in Betracht. Dazu kommen immun-

histochemische Untersuchungen von geeigneten Markern der Knochendifferen-

zierung wie z.B. Osteopontin in Betracht.

Die Zellproliferation und Cytotoxizität sind wichtige jedoch nur die ersten

Schritte in der Biokompatibilitätsanalyse. Die Biomaterial-Zell-Interaktion erfolgt

u.a. über biochemische Faktoren z.B. Cytokine oder Chemokine. Welchen

Einfluss das Biomaterial auf die Mediatorenfreisetzung hat, stellt dann einen

weiteren Schritt in der Beurteilung der Biokompatibilität dar.

4.5 Die Bedeutung einer Cytokinfreisetzung für die Beurteilung von Biokompatibilität

Ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit war die Analyse von freigesetzten

Cytokinen in der Interaktion von Leukozyten und NiTi. Die Bedeutung dieser

Analysen liegt vor allem in einer Beurteilung von lokalen Reaktionen in unmit-

telbarer Implantatnähe. Nach einer Zelladhärenz (s. Abs. 3.7) kommt es zu

mehr oder weniger starken Zellaktivierungen. Ein messbares Korrelat derartiger

Zellaktivierungen ist die Freisetzung von Cytokinen. Hierbei können neben der

Quantität einzelner Cytokine ebenfalls zelltypische Cytokinmuster erfasst wer-

den. Diese ermöglichen eine Aussage zu spezifischen Aktivierungen der jewei-

ligen Leukozytensubpopulationen. So setzen etwa die lymphoiden Zellen IL-2

und die myeloiden Leukozyten im wesentlichen IL-8 oder IL-1ra (Thomson

99

Page 110: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

1998) frei. Die Auswertung der Cytokinmuster ergab für die Interaktionen mit

Metallprobekörpern im wesentlichen eine Aktivierung der myeloiden Zellen, d.h.

von neutrophilen Granulozyten und Monozyten. Diese Zellen setzen offensicht-

lich als erste Zelltypen regulatorische Signalmoleküle frei, deren Art und Aus-

maß dann für weitere Gewebsreaktionen relevant sind.

Die Daten dieser Arbeit zeigten, dass die Anwesenheit von unbeschichtetem

NiTi bereits zu einer erhöhten Freisetzung von IL-1ra, IL-6 und IL-8 bei PBMC

und IL-6 bei PMN führte (Abb. 37). Dieses ist wahrscheinlich durch spezifische

Oberflächenreaktionen mit dem Metall zu erklären wie, z.B. Aktivierung der

Zellen an Ecken und Kanten bzw. an im Vergleich zur Plastikoberfläche der

Zellkulturplatte rauheren Strukturen (Kapanen et al. 2002). Die Steigerung der

Cytokinsynthese induziert durch NiTi war signifikant gegenüber der Kontrolle

aber nicht signifikant anders im Vergleich zu Titan oder Ti6Al4V. Diese Ergeb-

nisse sprechen eher für unspezifische, nicht von der Metalllegierung abhängige

Zellaktivierungen. Im Gegensatz dazu führte die Interaktion von Leukozyten mit

Calciumphosphat-beschichteten Proben zu einer signifikanten Steigerung der

Freisetzung von IL-1ra, IL-6, IL-8, TNF-α und GM-CSF (s. Abs. 3.9.2). Dafür

sind im wesentlichen zwei Faktoren verantwortlich: erstens eine erhöhte Zellad-

härenz (Abb. 26-30) und zweitens eine verstärkte Zellaktivierung (Abb. 31-37).

Einer der Gründe für eine intensivere Zellaktivierung ist die extrem rauhe Ober-

fläche der Calciumphosphatbeschichtung (Abb. 46). Brodbeck et al. (2003) be-

richteten ebenfalls, dass die Rauhigkeit einer Biomaterialoberfläche zur Cyto-

kinfreisetzung korreliert.

Die biologischen Prozesse, die zu einer starken Aktivierung von Myeloiden führt

sind u.a. einer sog. „frustrierten Phagozytose“ zuzuordnen (Cordier et al 1981).

Neben einer hohen Freisetzung von Cytokinen kommt es dabei auch zur Frei-

setzung lysosomaler Enzyme und reaktiven Sauerstoffradikalen (Cadroy et al.

2000).

Die Bedeutung einer moderaten (NiTi) versus einer hohen (NiTi Calciumphos-

phat-beschichtet) Cytokinfreisetzung in vitro für eine in vivo Situation ist nur ab-

schätzbar und muss anhand von in vivo-Modellen überprüft werden. Es ist aber

beschrieben, dass eine Vielzahl von Cytokinen (z.B. IL-6, IL-8 etc.) für Wund-

heilungsprozesse und Gewebsumbau eine wichtige regulatorische Rolle haben

(Horowitz et al. 1998). Ausmaß und auch der zeitliche Verlauf von Mediatoren-

100

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Diskussion

generierung bestimmt dann weiterhin das Schicksal von Implantateinheilungen.

Die in vitro Ergebnisse dieser Arbeit fordern dringend eine in vivo Biokompatibi-

litätsüberprüfung der Calciumphosphatschicht, wobei dann sogar mit profunden

Entzündungsreaktionen gerechnet werden kann.

Auch diese Schlussfolgerungen unterstreichen nochmals die Ausweitung von

Biokompatibilitätstestungen über die Vorgaben der DIN EN ISO 10993 hinaus.

In diesem Zusammenhang ist es wenig überraschend, dass es kaum Daten in

der Literatur zur Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von NiTi gibt. Wataha et al.

(1997) zeigten, dass die Kokultur einer Monozyten-Zellinie (THP-1) mit NiTi für

72 Stunden im Vergleich zu Edelstahl und Titan eine gesteigerte Sekretion von

IL-1β verursachte. Die Analyse von TNF-α zeigte keinen Unterschied in der Ex-

pression bei der Kokultur von NiTi im Vergleich zu Edelstahl und Titan.

Im Gegensatz zu Wataha et al. (1997) wurde in dieser Arbeit ein umfas-

senderes Cytokinspektrum erfasst, dass allerdings auch noch kein vollständiges

Bild geben kann, da hauptsächlich Leitcytokine für Leukozytenpopulationen

ausgewählt wurden und andere Faktoren wie z.B. der TGF-β-Familie oder an-

giogenetische Wachstumsfaktoren wie VEGF nicht eingeschlossen waren.

Prinzipiell ist es sinnvoll in Zukunft Screening-Analysen für das Cytokinmonito-

ring zuerst einzusetzen. Auch in dieser Arbeit wurde ein Protein-Array zum

Screening verwendet, wobei sich aber zeigte, dass zumindest der verwendete

Array in seiner Sensitivität den herkömmlichen ELISA-Systemen unterlegen

war. Insbesondere zeigte sich auch in der Quantifizierbarkeit deutliche Mängel,

so dass auch weiterhin eine Quantifizierung von Cytokinen auf Proteinebene im

Rahmen von Biokompatibilitätsstudien auch durch ELISA durchgeführt werden

sollte. Natürlich ist auch das Erfassen selektiver Cytokinmuster nur ein Mosaik-

stein im Bild Biokompatibilität. Die Bedeutung derartiger Analysen für Biokom-

patibilitätsanalysen zeigten aber auch die erzielten Ergebnisse zu den „konditi-

onierten Medien“.

4.6 Der Einsatz konditionierter Medien zur Beurteilung der

Biokompatibilität

Ein relevanter Ansatz in dieser Arbeit war die Bewertung der Biokompa-

tibilität eines Materials bzw. Implantates durch den Einsatz konditionierter Me-

dien in Funktionsassays. Für die Biokompatibilitätsanalysen ist ein Funktions-

101

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Diskussion

assay im Sinne einer biologischen Aktivitätsmessung die Methode der Wahl,

zumal diese nicht nur die Konzentration eines Faktors bestimmt, sondern die

Gesamtwirkung der gebildeten löslichen Faktoren einschließlich eventueller

synergistischer oder supprimierender Effekte wiederspiegelt. Auch in der DIN

EN ISO 10993 wird der Einsatz konditionierter Medien empfohlen, allerdings

werden diese lediglich durch die Immersion bei 37°C vom Biomaterial in Lösung

(z.B. Zellkulturmedium ohne Serum) hergestellt. Bei den konditionierten Medien

in dieser Arbeit handelt es sich um Zellkulturüberstände aus der Kokultur von

Leukozyten und beschichtetem bzw. unbeschichtetem NiTi. Als Kontrollansätze

wurden konditionierte Medien aus der Kultur von Leukozyten ohne NiTi-

Probekörper verwendet. Die Überführung frisch isolierter Leukozyten in

konditionierte Medien bedeutet für die Beurteilung der Biokompatibilität eine

gewisse Simulation einer in vivo Situation, die ein implantatnahes Mikromilieu

nachstellt. Im Gegensatz zur Analyse der Cytokinfreisetzung kann hier neben

der Zellaktivierung aufgrund der Anwesenheit aller gebildeten löslichen bioak-

tiven Faktoren eine bessere Beurteilung der biologischen Gesamtaktivität statt-

finden. Beim Zusammenspiel der parallel vorhandenen verschiedenen löslichen

Faktoren wird dann die biologische Nettowirkung sichtbar. Dies bedeutet, dass

ggf. die Produktion einzelner löslicher Mediatoren stimuliert wird, die Produktion

anderer herunterreguliert, oder die biologische Aktivitäten verschiedener Medi-

atoren durch Antagonisten oder Rezeptorregulation moduliert wird. In der Lite-

ratur finden sich zum Einsatz derartiger konditionierter Medien zur Biokompati-

bilitätsanalyse von NiTi noch keine Untersuchungen.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass konditionierte Medien von NiTi im

Vergleich zu konditionierten Medien aus Kontrollinkubationen zu keiner verän-

derten Apoptose, Expression von Adhäsionsmolekülen oder Chemotaxis bei

Leukozyten führte. Im Vergleich dazu induzierten konditionierte Medien aus der

Kokultur von Leukozyten und Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekör-

pern eine Verringerung der Apoptose, Veränderung der Expression von Adhä-

sionsmolekülen und Erhöhung der Chemotaxis von Leukozyten. Dies zeigt die

zellaktivierende Wirkung der Mediatoren in den konditionierten Medien, die von

PMN und PBMC gebildet wurden. Diese Ergebnisse unterstreichen nicht nur die

Ergebnisse der Cytokinfreisetzung sondern demonstrieren deutlich die Netto-

wirkung der löslichen Mediatoren. Die Bedeutung einer verzögerten Apoptose,

102

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Diskussion

veränderten Expression von Adhäsionsmolekülen und einer erhöhten Chemo-

taxis für die Biokompatibilität eines Implantates kann abschließend nur in in vivo

Untersuchungen beantwortet werden. Allerdings wird die PMN-Akkumulation

als eine Hauptkomponente in der Pathogenese der inflammatorischen Gewe-

beverletzung angesehen (Kirkpatrick et al. 1997).

4.6.1 Die Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen durch konditionierte Medien

Als eine Reaktion auf inflammatorische Reize gehen Endothelzellen und Leu-

kozyten Bindungen ein, die durch die Expression von Adhäsionsmolekülen an

ihren Zelloberflächen vermittelt werden. Die Aktivierung von Leukozyten führt

dazu, dass die Expression von bestimmten Adhäsionsmolekülen wie z.B. ICAM-

1 und CD11b erhöht und von anderen LECAM-1 herunterreguliert wird. Die Än-

derung der Expression von LECAM-1 korreliert direkt mit der Aktivierung von

neutrophilen Granulozyten nach Chemotaxinbindung. Die Monozytenaktivierung

durch die Kokultur mit einem löslichen Mediator (IL-1β) konnte von Wataha et

al. (1997) gezeigt werden. Dabei induzierte IL-1β eine erhöhte ICAM-1-Expres-

sion der Monozyten. Im Vergleich zu dieser Arbeit wurde allerdings ein anderes

Versuchsmodell von Wataha et al. (1997) verwendet. Sie analysierten die di-

rekte Induzierung der Adhäsionsmolekülexpression durch lediglich einen ein-

zigen löslichen Mediator.

In physiologischen Situationen erfolgt, nach Stimulierung der Expression von

Adhäsionsmolekülen, die PMN-Akkumulation im Entzündungsherd. Die Zellre-

krutierung ist ein Resultat der Aktivierung bestimmter Zelltypen. Dabei handelt

es sich um einen Amplifizierungsmechanismus, der auch adverse Konse-

quenzen auf die Biomaterialintegration haben kann. PMN und PBMC können

durch die Interaktion mit einem Implantatmaterial aktiviert werden, dies führt zur

Freisetzung von Chemokinen wie z.B. Interleukin-8. Der entstandene chemo-

taktische Gradient wird von anderen Zellen registriert und verursacht eine Wan-

derung der Zellen entlang des Gradienten. Obwohl dieser Vorgang eine phy-

siologische Reaktion auf eine Verletzung ist, kann dieser Prozess auch durch

eine permanente Leukozytenaktivierung z.B. an der Implantatoberfläche auf-

recht gehalten werden. Wie durch Analyse der Cytokinfreisetzung gezeigt wer-

103

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Diskussion

den konnte, findet eine gesteigerte Interleukin-8 Freisetzung der Leukozyten auf

Calciumphosphat-beschichtetem NiTi statt. Im Chemotaxisassay werden die

frisch isolierten PMN z.B. durch IL-8 in konditionierten Medien chemotaktisch-

aktiviert. Bei den durchgewanderten PMN, die mit konditionierten Medien aus

der Kokultur von NiTi oder Kontrollansätzen inkubiert wurden, handelt es sich

nicht um chemotaktisch-aktivierte Zellen. Aufgrund der LECAM-Expression und

Zellgröße kann davon ausgegangen werden, dass es sich um eine spontane

und zufällige Migration der Zellen handelt.

4.6.2 Konditionierte Medien und Apoptose

Desweiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass konditionierte Medien

von Leukozyten und Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern Apop-

tose-supprimierende Aktivitäten auf frisch isolierte PMN übertrugen. Unter den

löslichen Mediatoren sind einige bereits bekannt dafür, dass sie die Apoptose

unterdrücken können. Unter ihnen sind das GM-CSF, IL-6 und das IL-8 (Lee et

al. 1993, Chello et al. 2002, Leuenroth et al. 1998). Im Gegensatz dazu gehört

TNF-α zu den Mediatoren, die eine Apoptose bei PMN induzieren (Maianski et

al. 2003). Neben den zellulären Faktoren wie z.B. die Signaltransduktion aus-

gelöst durch Adhäsionsmoleküle wird der Zeitrahmen der PMN-Apoptose vom

jeweiligen Zusammenspiel von pro- und antiapoptotischen Faktoren im Mikro-

milieu der Zellen bestimmt. Offensichtlich spielt die Apoptose durch die Redu-

zierung der PMN-Aktivität eine wesentliche Rolle bei der Behebung von akuten

Entzündungen. Von Kobayashi et al. 2003 wurde beschrieben, dass PMN die

proinflammatorischen Signale auf der Ebene der Genexpression während der

Apoptose herabregulieren. Eine verzögerte Apoptose der PMN, wie auf den

calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern, stellt nicht nur einen wich-

tigen Abwehrmechanismus dar, der die lokale Phagozytenaktivität aufrecht hält,

sondern kann auch die Freisetzung der für eine Wundheilung essentiellen

PMN-Signale verlängern. Die Rolle einer Prolongation der PMN-Lebensdauer

für die Gewebsintegration eines Implantates ist noch nicht vollständig geklärt.

Eine anhaltende PMN-Aktivität sorgt zum einen für eine erhöhte lokale Infekt-

abwehr und zum anderen zu anhaltenden Entzündungssignalen.

104

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Diskussion

Durch die Fokussierung auf Analysen mit Leukozyten, können die hier ge-

zeigten Ergebnisse sicherlich kein vollständiges Bild der Biokompatibilität von

NiTi geben. Weitere Untersuchungen mit Zellpopulationen, die Knochenim-

plantate umgeben wie z.B. Muskelzellen und Fibroblasten, sollten bei Biokom-

patibilitätsstudien zusätzlich in Betracht gezogen werden. Trotzdem zeigen ge-

rade die Ergebnisse in dieser Arbeit hinsichtlich der biomimetischen Calcium-

phosphatschicht die Notwenigkeit einer Erweiterung der Biokompatibilitäts-

Analysen der DIN EN ISO 10993 auf Funktionsassays.

Zusammenfassend zeigt sich die Beschichtung mit Calciumphosphat aus Lö-

sung unter den hier dargestellten Versuchsbedingungen als ungeeignet für den

Einsatz als Biomaterial. Die Analyse der Biokompatibilität und Funktionalität

durch die Parameter Zelladhäsion, -proliferation, Mediatorfreisetzung und Funk-

tionalität zeigten deutlich eine verstärkte Zellaktivierung im Vergleich zu unbe-

schichtetem NiTi. Das endgültige Ausmaß einer Entzündungsreaktion im Orga-

nismus kann allerdings nur durch tierexperimentelle Analysen in einem geeig-

neten Tiermodell beurteilt werden. Im Gegensatz dazu zeigen die Ergebnisse

dieser Arbeit übereinstimmend mit den Daten aus anderen Publikationen auch

bei Verwendung von unterschiedlichen Zelltypen und verschiedenen Analyse-

methoden eine gute in vitro Biokompatibilität der unbeschichteten NiTi-Legie-

rung. Das medizinisch relevante Problem von nickelhaltigen Implantaten wie

NiTi, ist jedoch die mögliche Nickelallergie. In der Literatur ist die Sensibilisie-

rung gegen Nickel aus Implantaten beschrieben (Hayashi et al. 1999, Kanerva

et al 2001). Die Analyse der Nickelfreisetzung ist somit ein weiterer Schritt der

Biokompatibilitätsanalytik von NiTi.

4.7 Nickel-Freisetzung aus NiTi

Nickel gehört zu den Spurenelementen und ein Mangel an Nickel kann

zur Reduktion der Aktivität von verschiedenen Enzymen, Muskeldegeneration,

Gewichtsreduktion und Wachstumshemmung führen. Auf der anderen Seite

können hohe Nickelmengen toxische Effekte, kanzerogene und allergische Re-

aktionen hervorrufen (Ryhänen 2000). Durch Korrosion im Organismus können

Ionen aus Metallimplantaten herausgelöst werden. Die Korrosionsresistenz ei-

nes Metalls und die Toxizität der Metallkomponenten gehören zu den Haupt-

105

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Diskussion

faktoren, die die Biokompatibilität eines Metallimplantates bestimmen. Die lo-

kale Akkumulation von Metallionen am Implantationsort führt zu adversen Ef-

fekten bei zellulären Mechanismen (Wataha et al. 1994). Davon sind auch in-

flammatorische Zellen betroffen, was zu einer veränderten inflammatorischen

Reaktion führen kann (Haynes et al. 1993). Zunehmende inflammatorische Sig-

nale am Implantat können zu einer lokalen Gewebsdegeneration, eine mögliche

Knochenresorption und somit zum Versagen des Implantates führen (Lewis et

al. 2003).

Die Nickel-Titan-Struktur der NiTi-Legierung besteht aus einem festen Kristall-

gitter mit hohen Bindungskräften zwischen den einzelnen Atomen, d.h. für die

Atome ist es äußerst schwierig, diesen Verbund zu verlassen (Es-Souni et al.

2005). Die Oberflächeneigenschaften von NiTi sind charakterisiert durch die

Tatsache, dass Titan schneller oxidiert als Nickel und somit eine korrosionsre-

sistente Titandioxidschicht gebildet wird und nur im geringen Umfang Nickeloxid

in der Oberfläche enthalten ist. Die Biokompatibilität wird somit hauptsächlich

von der NiTi-Oberfläche beeinflusst.

In der Literatur finden sich zahlreiche Publikationen zur Nickelfreisetzung aus

NiTi, sie ist unter statischen Bedingungen äußerst gering (Rocher et al. 2004,

Jia et al. 1999). Ryhänen et al. (1997) haben im Zellkulturmedium aus der Ko-

kultur mit humanen Fibroblasten und Osteoblasten bei NiTi in den ersten beiden

Tagen eine erhöhte Freisetzung von Nickel im Vergleich zu Edelstahl und Titan

beschrieben. Allerdings verminderte sich die Nickelfreisetzung von NiTi und

zeigte dann ab dem 3. Tag Zellkultur eine ähnliche Nickelfreisetzung wie Edel-

stahl und Titan. Auch elektrolytisch polierte NiTi-Stents zeigten nach einigen

Tagen in künstlicher Körperflüssigkeit (Hanks Solution) keinen Unterschied in

der Nickelfreisetzung im Vergleich zu Edelstahl-Stents (Thierry et al. 2000).

Wever et al. (1998) konnten zeigen, dass eine Immersion von NiTi in Hanks

Solution eine Reduzierung der Nickel-Freisetzung nach 10 Tagen unter die

Nachweisgrenze verursachte. Verantwortlich dafür ist ihrer Meinung nach die

Bildung einer Hydroxylapatit-Schicht an der NiTi-Oberfläche durch die Hanks

Solution.

Die Nickelfreisetzung aus NiTi ist proportional zum Nickelanteil in der Oberflä-

che, und dieser ist abhängig von der Oberflächenbehandlung (Shabalovskaya

2002). Wird NiTi durch Wasserdampf autoklaviert, enthält es an der Oberfläche

106

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Diskussion

nur 0-2 at% Nickel. Da die Passivierung der Oberfläche von NiTi durch die Oxi-

dierung im Wasserdampf gefördert wird. Wird dahingegen NiTi chemisch geätzt

mit 30% Wasserstoffperoxid, befindet sich 27 at% Nickel an der Oberfläche.

Das Wasserstoffperoxid verursacht eine Abtragung von Oberflächenmaterial

wie z.B. Titiandioxid, so das die schützende Passivierung verloren geht. Im

Vergleich zu NiTi, dass chemisch geätzt wurde, konnte eine Reduzierung der

Nickelfreisetzung aus Wasserdampf behandeltem NiTi festgestellt werden

(Shabalovskaya 2002).

Die in dieser Arbeit analysierten Nickelfreisetzungen zeigten bei unbeschich-

tetem NiTi eine im Vergleich zu Calciumphosphat-beschichteten und geätzten

NiTi-Probekörpern deutlich niedrigere Nickelmengen. Im Gegensatz zu den

Analysen von Ryhänen et al. (1997) war die Nickelfreisetzung über den Analy-

senzeitraum (8 Wochen) konstant. Dieser Unterschied könnte auf unterschied-

liche Oberflächenparameter der eingesetzten NiTi-Probekörper zurückgeführt

werden. Desweiteren wurde in dieser Arbeit ein anderes Experimentalmodell

verwendet. Die Nickelfreisetzungen wurde im Puffer oder Blutplasma unter Zell-

kulturbedingungen, allerdings ohne Kokultivierung von Zellen analysiert. Von

Ryhänen et al. (1997) wurden die Nickelfreisetzungen in Proben aus der Ko-

kultur der Metalle mit Zellen gewonnen. Aus der Literatur ist bekannt, dass Zel-

len Nickelionen anreichern (Wataha et al. 2000). Es ist möglich, dass die Zellen

den Zellkulturüberständen das Nickel entziehen, so dass in den Überständen

immer weniger Nickel gemessen werden konnte. Die erhöhte Nickelfreisetzung

der Calciumphosphat-beschichteten Probekörper lässt sich mit großer Wahr-

scheinlichkeit auf das Ätzverfahren während der Beschichtung zurückführen.

Dies zeigte die erhöhte Nickelfreisetzung der geätzten unbeschichteten NiTi-

Probekörper. Durch das Ätzverfahren wird die Titandioxidschicht der NiTi-Pro-

bekörper zerstört, so dass sich zum einen mehr Nickel an der Oberfläche befin-

det und zum anderen eine verstärkte Korrosion möglich ist. Zusätzlich entsteht

durch das Ätzverfahren eine vergrößerte Oberfläche (Abb. 47) (Shabalovskaya

1996, Es-Souni et al. 2005).

107

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Diskussion

Abb. 47. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer geätzten NiTi-Ober-

fläche.

Neben der Beschaffenheit der Materialoberfläche wird die Nickelfreisetzung von

weiteren Faktoren bestimmt. Das umgebende Medium, dass durch den pH-

Wert, die Temperatur und die chemische Zusammensetzung charakterisiert

wird, trägt wesentlich zur Menge an freigesetztem Nickel bei (Es-Souni et al

2005).

Dies zeigten auch die in dieser Arbeit durchgeführten Nickelfreisetzungsanaly-

sen in unterschiedlichen flüssigen Medien (Puffer, Blutplasma). Im Vergleich

zum Puffer mit pH 7,4 konnte im Plasma nach 3 Tagen Inkubationszeit bei 37°C

eine höhere Nickelfreisetzung analysiert werden. Diese Ergebnisse stimmen mit

dem Abschlussbericht der LGC (Laboratory of the Government Chemist,

London, England) vom 31. März 2003 überein. Dort wurden die Risiken der

Nickel-Sensibilisierung beim Menschen durch Ohrstecker beschrieben. Die

Nickelfreisetzungs-Analysen von Ohrsteckermaterialien im Blutplasma und

künstlichem Schweiß zeigten, dass im Vergleich zum künstlichen Schweiß im

Plasma die doppelte Menge an Nickelionen freigesetzt wurden.

Die erhöhte Nickelfreisetzung von NiTi im Blutplasma kann auf eine erhöhte

Konzentration an chemischen Komponenten (z.B. Chorid-, Fluorid- und Sau-

erstoffionen) zurückgeführt werden, da diese zu einer verstärkten Korrosion füh-

ren (Es-Souni et al 2005). Fluoridionen sind aggressive Ionen, die die schüt-

zende Titandioxidschicht von Titan und Titanlegierungen durch die Bildung von

108

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Diskussion

Titanfluorid-Molekülen zerstören können (Shim et al. 2005). Dies bedeutet je

nach Oberflächenbeschaffenheit und umgebendem Medium eines NiTi-Im-

plantates ein erhöhtes Risiko der Nickelfreisetzung am Implantationsort. Die

Langzeit-Einwirkung von Nickelionen in geringen nicht toxischen Konzentra-

tionen wurde von Wataha et al. (2000) untersucht. 1-10% der bekannten cyto-

toxischen Nickelkonzentration (subletale Konzentration, definiert als 50%

mitrochondriale SDH Aktivität) wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen mit

einer humanen Monozyten-Zelllinie kokultiviert. In Abhängigkeit der subletalen

Nickelkonzentrationen konnte eine Reduzierung der Zellproliferation analysiert

werden. Der Effekt von Nickel in geringen Dosen über die Zeit ist kumulativ, d.h.

die Anzahl der avitalen Zellen bei gleicher Nickelkonzentration wird im Laufe

der Zeit immer größer. Für andere Metallionen wie z.B. Kupfer konnte dies nicht

gezeigt werden. Im Gegensatz zu anderen Metallionen wird Nickel mit der

Expositionszeit im Zellkern akkumuliert und führt sehr wahrscheinlich aus

diesem Grund zu einer kumulativen Reduktion der Zellproliferation und

Zellviabilität.

In weiteren Untersuchungen konnten Wataha et al. (2004) zeigen, dass

sublethale Nickelkonzentrationen (10, 30, 50, 90 µM) bei Monozyten nach 66

Stunden Kokultur und anschließender 6-stündiger Zellstimulation (LPS) eine

vermehrte Freisetzung von Cytokinen (IL-1β, TNF-α, IL-6) verursachen. Die

eingesetzte Nickelionenkonzentration korrelierte mit der Cytokinfreisetzung. Im

Vergleich zu Wataha et al. (2004) konnte in dieser Arbeit eine signifikant er-

höhte IL-1ra und IL-6 und Freisetzung nach Nickelchlorid-Zugabe (100 µM) bei

unstimulierten PBMC gemessen werden. Die Stimulation mit LPS, ConA und

TSST-1 führte zu keiner erhöhten Freisetzung. Eine gesteigerte TNF-α Bildung

konnte im Gegensatz zu den Ergebnissen von Wataha et al. (2004) bei keiner

Nickelkonzentration und auch nicht durch Zellstimulation analysiert werden. Die

voneinander abweichenden Ergebnisse lassen sich möglicherweise auf die un-

terschiedlichen Versuchsmodelle zurückführen. Bei Wataha et al. (2004) wur-

den humane Zelllinien für 72 Stunden mit dem Nickel kokultiviert und die Zell-

stimulation fand erst in den letzten 6 Stunden statt. Da eine Zellstimulation erst

nach 24 Stunden zu einer messbaren veränderten Cytokinsynthese führt, wur-

den in dieser Arbeit humane PBMC parallel zur Nickel-Kokultur für 24 Stunden

stimuliert.

109

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Diskussion

Zusammenfassend bedeutet die Nickelfreisetzung aus NiTi unter den darge-

stellten Versuchsbedingungen (mechanisch unbeansprucht, definierte Oberflä-

chenparameter) kein Risikofaktor. Auch Es-Souni et al. 2005 beschreibt nach

dem Vergleich der Literatur eine gute Biokompatibilität für NiTi mit definierten

Oberflächenparametern für Normal-Proband. Allerdings zeigen Analysen an

mechanisch belasteten orthodontischen NiTi-Drähten, dass im Vergleich zu un-

belasteten NiTi-Drähten eine erhöhte Nickelfreisetzung stattfindet (Jia et

al.1999). Auch Es-Souni et al. (2005) räumen eine mögliche Gefahr für nickel-

sensitive Allergiker ein. Weitere Untersuchungen zeigen, dass durch das Anle-

gung einer elektrischen Spannung an NiTi-Proben, als Modell für die Korrosion

im Organismus, im Vergleich zu unbelasteten NiTi-Proben vermehrt Nickel frei-

gesetzt wird (Shih et al. 2000). Die Überstände aus den Nickelfreisetzungsana-

lysen zeigten nach der Kokultur mit Rattenmuskelzellen eine Inhibition der

Zellproliferation. Diese Nickelfreisetzung ist neben der cytotoxischen Reaktion

besonders von Bedeutung bei einer potentiellen Induktion von allergischen Re-

aktionen. Das allergische Potential der Nickelfreisetzung aus NiTi wird zusätz-

lich durch die natürliche Affinität von Nickel zu im Blutplasma enthaltenen Al-

bumin verstärkt. Nickel-gesättigtes Serumalbumin induziert und aktiviert stärker

Nickel-spezfische T-Zellen als Nickelsalze in gleicher Konzentration (Thierse et

al. 2004).

4.8 Nickelallergie

Der hohe Nickelgehalt von NiTi ist unter korrosiven Bedingungen und

unter mechanischer Belastung ein entscheidender Ausgangspunkt für eine po-

tentielle Nickelfreisetzung. Bereits sehr geringe Nickelkonzentrationen

(0,5 mg/L) reichen aus, um bei hoch sensitiven Individuen allergisch-bedingte

Reaktionen zu induzieren (Menne 1994). Die Schwellenwerte für cytotoxische

Reaktionen, hervorgerufen durch Nickelionen, liegen um ein Vielfaches höher

(über 10 mg/L) (Shih et al. 2000).

Nickel ist weltweit das häufigste Kontaktallergen, 12% der Bevölkerung zeigen

positive Reaktionen auf Nickel (Thomas 2003), wobei Frauen häufiger (20-30%)

betroffen sind als Männer (3-5%) (Artik et al. 2004, Mathelier-Fusade et al.

2001). Bei der Sensibilisierung wird vor allem dem in Modeschmuck enthal-

110

Page 121: Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität ... · Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen

Diskussion

tenen Nickel eine bedeutsame Rolle zugeschrieben. Häufig werden Individuen

erst durch das Stechen von Ohrlöchern auf Nickel sensibilisiert. Nielsen et al.

(1993) konnte in einer Studie zeigen, dass eine Prävalenz eines allergischen

Kontaktekzems bei Individuen mit gestochen Ohrlöchern bei 14,8% und bei

Kontrollpersonen ohne Ohrlöcher bei 1,8% lag.

Im Hinblick auf allergische Reaktionen gegenüber Metallimplantaten stehen

Spättyp (Typ IV) Reaktionen im Vordergrund. Im Gegensatz zu Hypersensibili-

tätsreaktionen vom Soforttyp, die durch Antikörper verursacht werden, liegt bei

den Typ IV Reaktionen die Aktivierung antigenspezifischer T-Lymphozyten

zugrunde.

Wever et al. (1997) konnten anhand von Sensibilisierungs-Analysen (Epikutan-

test) nach DIN EN ISO 10993 an Meerschweinchen mit NiTi-Extrakten, keine

Induktion einer allergischer Reaktionen feststellen. Untersuchungen zur Entste-

hung der Nickelallergie an Mäusen zeigen jedoch, dass um eine Sensibilisie-

rung zu induzieren, bestimmte Voraussetzungen wie Gewebsverletzungen vor-

liegen müssen. Dabei werden durch Phagozyten reaktive Sauerstoffradikale

gebildet, die als Alarm-Signale dienen (Artik et al. 1999). Diese Vorausset-

zungen sind nach dem Einbringen von Implantaten durch das Operations-

trauma gegeben.

111

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Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es, zellbiologische Testsysteme zu entwickeln, die

eine verbesserte und in vivo-nahe Beurteilung von Biokompatibilität und Bio-

funktionalität neu entwickelter Implantatmaterialien ermöglichen. Dies wurde am

praktischen Beispiel einer sogenannten Formgedächtnislegierung auf der Basis

von Nickel und Titan (NiTi) durchgeführt. NiTi zeigt für den klinischen Einsatz

ungewöhnliche Eigenschaften und eröffnet damit viele neue Perspektiven auch

in der Chirurgie. Zu diesen Eigenschaften gehört der Formgedächtniseffekt, d.h.

die Fähigkeit zur "Erinnerung" an eine ursprüngliche Geometrie durch

kurzzeitiges Erwärmen und die Pseudoelastizität, eine für ein Metall extreme

Biegsamkeit. Diese Effekte werden bereits klinisch bei Zahnspangen, für

Klammern in der Fußchirurgie, für endovaskuläre Stents und für Katheter in der

minimalinvasiven Chirurgie genutzt. Problematisch ist jedoch der im Vergleich

zu chirurgischen Edelstählen hohe Nickelanteil von 50 at%, der möglicherweise

adverse Gewebereaktionen sowie allergische Sensibilisierungen hervorrufen

kann.

Zur Beurteilung der Biokompatibilität wurde in dieser Arbeit mit isolierten Leu-

kozytenfraktionen (Granulo-, Lympho-, Thrombozyten) gearbeitet, da Leuko-

zyten zu den ersten Zellen zählen, die in unmittelbaren Kontakt mit Implantat-

oberflächen kommen. Zusätzlich wurde die Zell-Implantat-Interaktion von osteo-

blastenartigen Osteosarkoma-Zelllinien (MG-63, SAOS-2) untersucht, da

Osteoblasten besonders als Modellzellen für Knochenwachstum geeignet sind.

In dieser Arbeit konnte ein Screeningverfahren etabliert werden, mit dem es

möglich ist, schnell und parallel die Biokompatibilität von Materialeigenschaften

wie z.B. unterschiedliche Nickel-Titan-Legierungen zu analysieren. Dazu wur-

den Osteoblasten und ein Gradientenwerkstoff mit einer stufenweisen Reduzie-

rung der Nickelkonzentration von 0 at% (reines Titan) über 50 at% (NiTi) zu

90 at% Nickel und 10 at% Titan zur Analyse der zellbiologischen Reaktion ein-

gesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass sich NiTi, reines Titan und die graduellen

Abstufungen dazwischen sich von der zellbiologischen Reaktion nicht unter-

scheiden. Es konnte eine gute Zelladhärenz und kein zytotoxischer Effekt für

NiTi festgestellt werden.

112

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Zusammenfassung

Um die Biokompatibilität und Biofunktionalität der NiTi-Formgedächtnislegierung

zu erhöhen, wurde sie mit einer Calciumphosphatschicht aus wässriger Lösung

beschichtet. Dieses biomimetische Implantat-Interface sollte das An- und Ein-

wachsverhalten als Knochenimplantate verbessern und als Barriere für diffun-

dierende Nickelionen dienen.

In zellbiologischen Analysen wurden die Zell-Implantat-Interaktion von Osteo-

blasten und Leukozyten in Kokultur mit Calciumphosphat-beschichteten oder

unbeschichteten NiTi-Probekörpern bestimmt. Als Kontrolle dienten Zellen, die

keinen Kontakt mit dem Implantatmaterial hatten. Während der Interaktion der

verschiedenen Zellpopulationen mit den beschichteten und unbeschichteten

NiTi-Probekörpern wurde unterschiedliche Parameter analysiert: Zelladhärenz,

Zellproliferation, Zellaktivierung und Freisetzung biochemischer Mediatoren.

Beim letzten spielen Cytokine eine wesentliche Rolle, sie haben bei einer Viel-

zahl von immunologischen Reaktionen regulatorische Funktionen. Für die Be-

urteilung der biologischen Gesamtaktivität und damit einer in vivo-nahen Situa-

tion wurden konditionierte Medien (Zellkulturmedium aus der Kokultur von Leu-

kozyten und beschichtetem oder unbeschichtetem NiTi) als ein Implantat-nahes

Mikromilieu, in speziellen Bioassays (Chemotaxis, Expression von Adhä-

sionsmolekülen) eingesetzt.

Im Vergleich zu Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern konnte auf

unbeschichtetem NiTi eine erhöhte Osteoblastenproliferation (MG-63, SAOS-2)

festgestellt werden. Die Analyse der Leukozytenadhärenz ergab eine im Ver-

gleich zum unbeschichteten NiTi vermehrte Adhärenz an der Calciumphosphat-

schicht. In immunologisch-biochemischen Untersuchungen konnten erstmals

durch die Analyse eines zelltypischen Cytokinmusters Aussagen über eine se-

lektive Aktivierung von Leukozyten an NiTi-Oberflächen gemacht werden. Die

Ergebnisse zeigten eine signifikant höhere Cytokinfreisetzung (IL-1ra, IL-6, IL-8,

TNF-α, GM-CSF) an Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern. Die

Analyse der Gesamtwirkung der gebildeten löslichen Faktoren durch den Ein-

satz konditionierter Medien in Bioassays ergab für unbeschichtetes NiTi keine

signifikanten Unterschiede im Vergleich zu Kontrollansätzen. Im Gegensatz

dazu führten konditionierte Medien von Leuko-zyten und Calciumphosphat-be-

schichtetem NiTi bei frisch isolierten Granulozyten zu einer Inhibition der

Apoptose und zu einer erhöhten Chemotaxis. Die Analyse des Potentials kondi-

113

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Zusammenfassung

tionierter Medien der Calciumphosphatschicht die Expression von Adhäsions-

molekülen bei frisch isolierten Leukozyten zu beeinflussen, zeigte eine Induk-

tion der erhöhten Expression von ICAM-1 und CD11b sowie die Reduzierung

der L-Selektin-Expression. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse in dieser

Arbeit eine höhere Aktivierung der Leukozyten durch die Calciumphosphat-

schicht im Gegensatz zu unbeschichtetem NiTi.

Die in dieser Arbeit etablierten in vitro Biokompatibilitäts-Assays ermöglichen

ggf. eine verbesserte Prognose einer in vivo Implantat-Zell-Reaktion als es die

Richtlinien der DIN EN ISO 10993 bisher vorschreiben. Neben der Mediator-

analyse konnte die biologische Gesamtaktivität (d.h. Nettowirkung synergisti-

scher oder supprimierender Effekte) löslicher Faktoren analysiert werden. Diese

Bioassay-Analysen können als Reporter-Systeme einer in vivo-nahen Situation

z.B. für die Entwicklung von neuen biomimetischen Implantaten genutzt wer-

den. Auch wenn Zellkulturversuche nicht direkt die in vivo-Zellreaktion und eine

Implantat-Gewebe-Umgebung simulieren, können jedoch die Effekte von Bio-

materialien auf Leukozyten und Osteoblasten mit den in dieser Arbeit

etablierten Methoden komplexer analysiert werden.

114

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Summary

6. Summary

The goal of this work was the development of cell based test systems

that allow a more complete evaluation of biocompatibility and biofunctionality

new implant materials in an in vivo-like environment. The research was

conducted with shape-memory alloys (SMA) made from nickel and titanium

(NiTi-SMA). NiTi exhibits properties that open up a whole variety of new

perspectives for it´s clinical use especially for applications in surgery. The ability

of NiTi to return to a predictable previously memorised shape after external

changes in temperature and it´s pseudoelasticity, i. e. an unusal range of

deformability, are the most remarkable properties. NiTi-SMA where already

utilized for clinical applications like braces, clamps in foot-surgery, endovascular

stents and for catheters in minimal-invasive surgery. Yet the high nickel content

of 50 at% remains problematic, since the nickel release may lead to adverse

effects such as tissue-reactions and allergic sensibilization.

To evaluate biocompatibility of NiTi-SMA isolated leukocyte-fractions (PBMC,

-peripheral blood mononuclear cells, PMN, -polymorphonuclear neutrophil

granulocytes, platelets) where used, because these are often the first cells to

get into close contact with an implant surface. Additionally osteoblast-like

osteosarcoma cells (MG-63, SAOS-2) where employed to study cell implant

interactions, since these cells are commonly used as cell models for bone

ingrowth.

As part of this work a biocompatibility screening method was developed, which

allowed a fast and parallel screening of material properties such as different

nickel-titanium-alloys. For that purpose osteoblasts and a graded metal sample

with a stepwise reduction of the nickel content from 0 at% (pure titanium) over

50 at% (NiTi) to 90 at% nickel and 10 at% titanium were used to evaluate the

cell biological reaction. The results show, that NiTi, pure titanium and the

graduations between these two alloys do not differ regarding the potential to

cause cell biological reactions. In these cases good cell adhesion and no

cytotoxic effects could be observed for NiTi.

To enhance biocompatibility and biofunctionality of the NiTi-SMA test samples

were coated with calcium phosphate by dipping in oversaturated calcium

phosphate aqueous solution. The resulting biomimetic implant interface is

115

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Summary

meant to improve the adhesion and the incorporation in bone implants and to

provide a barrier for possible nickel ions release.

Cell implant interactions were investigated with osteoblasts and leukocytes

cocultured with calcium phosphate coated and non coated NiTi samples. Cells

that did not have any contact with the implant material were used as control.

The focus of these tests was on the following parameters: cell adhesion, cell

proliferation, cell activation and release of biochemical mediators. For the latter,

cytokines were of major interest, since these are involved in the regulation of a

variety of immunological responses. In order to evaluate the overall biological

activity and to create an in vivo like situation conditioned media (cell culture

media from cocultures of leukocytes with coated and non coated NiTi), which

represent an implant-related microenvironment, were used in specific bioassays

(i.e. phagocytosis, chemotaxis and expression of adhesion molecules).

MG-63 and SAOS-2 showed an increased proliferation on non coated NiTi

samples compared to the calcium phosphate coated NiTi. Leukocyte adhesion

was increased when NiTi samples were coated with calcium phosphate

(compared to non coated NiTi). By analyzing the cell specific cytokine pattern

conclusions about the selective activation of leukocytes on NiTi surfaces could

be drawn. A significant increased cytokine secretion (IL-1ra, IL-6, IL-8, TNF-α,

GM-CSF) was observed for calcium phosphate coated NiTi sample. Analysis of

the overall effects of soluble factors using conditioned media in bioassays did

not show any significant differences for non coated NiTi compared to controls.

In contrast, inhibition of apoptosis and enhanced chemotaxis could be observed

when freshly isolated granulocytes were treated with conditioned media

obtained by interaction of leukocytes with coated NiTi. An increased expression

of ICAM-1 and CD11b along with a decrease of L-Selektin expression could be

observed when freshly isolated leukocytes were treated with conditioned media

of coated NiTi. The results show that the calcium phosphate coating of NiTi

leads to an increased activation of leukocytes.

The biocompatibility assays presented in this work could provide better tools for

an improved prognosis of in vivo implant/cell reactions than those required by

the guidelines of the DIN EN ISO 10993. Apart from the mediator-analysis the

biological overall activity of soluble factors (i.e. the net-effect of synergistic and

suppressing factors) could be analyzed as well. These bioassays can be

116

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Summary

employed as reporter systems that mimic an in vivo-like environment, thus

aiding in the development of new biomimetic implants.

Even though cell culture experiments may not be able to mimic an in vivo cell

reaction to the full extend, the results demonstrate that the methods established

in this work give a more complex overview of the effects of biomaterials on

leukocytes and osteoblasts.

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Erklärung

ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner

anderen Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen

Hilfsmittel verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten

Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten

enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen

wurde.

Bochum, den

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Curriculum Vitae

Curriculum Vitae

Denise Bogdanski, geboren 20.09.1974 in Gelsenkirchen, unverheiratet, keine Kinder seit August 2001 Promotion in der Chirurgischen Forschung der BG-

Kliniken Bergmannsheil Bochum, im Rahmen des Sonderforschungsbereich Formgedächtnislegierungen (459) der Ruhr-Universität Bochum

02.2001-07.2001 Wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Tierphysiologie

an der Ruhr-Universität Bochum

Hochschulbildung/ Qualifizierung 10.1994 − 01.2001 Studium der Biologie Abschluß: Diplom

Thema der Diplomarbeit: Die Mineralisierung des Achsenskeletts bei Xiphophorus helleri

Schulausbildung

08.1981− 05.1994 Grundschule und Gesamtschule in Gelsenkirchen Abschluß: Allgemeine Hochschulreife

Arbeitstätigkeiten/ Praktika 07.1994 − 09.1994 Praktikum bei herbert dahm datensysteme im Bereich

Rechnungswesen, Personalwesen, Elektronische Datenverarbeitung

10.1997− 01.2001 Studentische Hilfskraft am Lehrstuhl für Tierphysiologie

in der Arbeitsgruppe für Vergleichende Endokrinologie (u.a. Tätigkeiten in der Zucht von X. helleri)

02.1998 − 06.1999 Mitarbeit an der Entwicklung und Erstellung einer CD-

Rom über die mikroskopische Anatomie der Wirbeltiere bei der Firma bioscop

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Eigene Publikationen

Eigene Publikationen Bogdanski D., Köller M., Müller D., Muhr G., Brahm M., Buchkremer A., Stöver

D., Choi J., Epple M., Easy assessment of the biocompatibility of nitinol

by in-vitro cell culture experiments on a functionally graded Ni-NiTi-Ti

material. Biomaterials 23 (2002) 4549-4555.

Bogdanski D., Köller M., Bram M., Stöver D., Buchkremer H.P., Choi J., Epple

M., Muhr G., Schnelle Analyse der Biokompatibilität mittels gradierter

Probekörper am Beispiel von Ni-NiTi-Ti, Biomedizinische Technik 47

Suppl.1 (2002) 500-502.

Choi J., Bogdanski D., Köller M, Müller D, Esenwein SA, Muhr G, Epple M.,

Calcium phosphate coating on nickel-titanium shape memory alloys.

Coating procedure and adherence of leukocytes and platelets.

Biomaterials 24 (2003) 3689-3696.

Bogdanski D., Epple M., Esenwein SA., Muhr G., Petzoldt V., Prymak O.,

Weinert K., Köller M., Biocompatibility of calcium phosphate-coated and

of geometrically structured Nickel-Titanium (NiTi) by in-vitro testing

methods. Materials Science and Engineering A 378 (2004) 527–531

Bogdanski D., Esenwein SA., Prymak O., Epple M., Muhr G., Köller M.,

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Danksagung

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. M. Köller für die Themenstellung und

für die wissenschaftliche Unterstützung sowie für die Möglichkeit, meine Arbei-

ten zu publizieren und auf Fachkongressen zu präsentieren.

Ebenfalls herzlichen Dank an Herrn Prof. Dr. Hoffmann für seine freundliche

Bereitschaft zur Übernahme des Zweitgutachtens.

Herzlichen Dank gilt Herrn Prof. M. Epple, Institut für anorganische Chemie der

Universität Duisburg-Essen, für die Bereitstellung der beschichteten NiTi-

Probekörper.

Herzlicher Dank gilt den Mitarbeiterinnen der Chirurgischen Forschung Frau

Peter, Frau Zimmermann, Simone Höhler-Wefers und Vanessa Kroll die stets

bereit waren Hilfestellung zu leisten und nicht zuletzt zu einem sehr ange-

nehmen Arbeitsklima beitrugen.

Tanja Schlüter, sie stand mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite und hatte im-

mer ein offenes Ohr für mich, herzlichen Dank!

Schließlich gilt mein besonderer Dank meinen Eltern, Sandra, Silke und Dirk,

die mich ständig motivierten und unterstützten.

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