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  • Untersuchungen zur Funktion von

    AKT-Isoformen in murinen ErbB2-positiven

    Mammakarzinomzellen und humanen

    disseminierten Tumorzellen

    Dissertation

    zur Erlangung der Würde des Doktors der Naturwissenschaften

    des Fachbereichs Biologie, der Fakultät für Mathematik, Informatik

    und Naturwissenschaften, der Universität Hamburg

    vorgelegt von

    Nicole Grabinski

    aus Hamburg

    Hamburg 2011

  • Inhaltsverzeichnis

    Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

    1 Einleitung 3

    1.1 Das Mammakarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

    1.1.1 Karzinogenese und histologische Einteilung . . . . . . . . . . . . . 3

    1.1.2 Einteilung nach dem Rezeptorstatus . . . . . . . . . . . . . . . . 4

    1.1.3 Die ErbB-Rezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

    1.1.4 Balb-neuT: Ein Mausmodell für das ErbB2+-Mammakarzinom . . 8

    1.2 Disseminierung von Tumorzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

    1.2.1 Disseminierte Tumorzellen (DTC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

    1.2.2 Frühe Disseminierung und Tumorschlaf (tumor dormancy) . . . . 11

    1.2.3 DTC-Zelllinien als Modellsystem zur Analyse von DTC . . . . . . 13

    1.3 Der PI3K/AKT-Signalweg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

    1.3.1 Die Phosphoinositid-3-Kinasen (PI3K) . . . . . . . . . . . . . . . 14

    1.3.2 Die Proteinkinase B/AKT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

    1.3.3 Die Aktivierung des PI3K/AKT-Signalwegs . . . . . . . . . . . . 17

    1.3.4 Spezi�tät von AKT-Isoformen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

    1.3.5 Die Bedeutung des PI3K/AKT-Signalwegs beim Krebs . . . . . . 21

    1.4 Ziel der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

    2 Materialien und Methoden 25

    2.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

    2.1.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

    2.1.2 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

    2.1.3 Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

    2.1.4 Kits, Reagenzien und Marker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

    2.1.5 Antikörper für Western Blot, Immunpräzipitation und Färbungen 29

    2.1.6 Vektoren für die lentivirale Transduktion . . . . . . . . . . . . . . 29

    2.1.7 Primer für die quantitative PCR (qPCR) . . . . . . . . . . . . . . 30

    i

  • Inhaltsverzeichnis

    2.1.8 Pu�er und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

    2.1.9 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

    2.1.10 Zellkulturreagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

    2.1.11 Mausstämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

    2.1.12 Patientenmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

    2.1.13 Computerprogramme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

    2.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

    2.2.1 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

    2.2.2 Etablierung von Mammakarzinomzellen aus Balb-neuT-Tumoren . 37

    2.2.3 Stimulation und Behandlung von adhärenten Zellen . . . . . . . . 37

    2.2.4 Transfektion und lentivirale Transduktion adhärenter Zellen . . . 38

    2.2.5 Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

    2.2.6 Immunhistochemische (IHC)-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . 40

    2.2.7 Immun�uoreszenz (IF)-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

    2.2.8 RNA-Isolation und Konzentrationsbestimmung . . . . . . . . . . 41

    2.2.9 cDNA-Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

    2.2.10 Quantitative PCR (qPCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

    2.2.11 Herstellung von Proteinlysaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

    2.2.12 Protein-Konzentrationsbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

    2.2.13 Western-Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

    2.2.14 Immunpräzipitation der AKT-Isoformen . . . . . . . . . . . . . . 46

    2.2.15 AKT-Isoform-spezi�scher in vitro Kinaseassay . . . . . . . . . . . 48

    2.2.16 Zellvitalitätsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

    2.2.17 Proliferationsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

    2.2.18 Apoptoseassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

    2.2.19 Migrationsassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

    2.2.20 Mausexperimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

    2.2.21 Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

    3 Ergebnisse 53

    3.1 Untersuchungen zur Funktion von AKT-Isoformen beim ErbB2+-Mamma-

    karzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

    3.1.1 Aktivierung des ErbB2/PI3K/AKT-Signalwegs in transgenen Balb-

    neuT-Mammatumoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

    ii

  • Inhaltsverzeichnis

    3.1.2 Etablierung von murinen ErbB2+-Mammakarzinom-Zellkulturen

    aus transgenenen Balb-neuT-Mammatumoren . . . . . . . . . . . 57

    3.1.3 Tumorigenität der murinen ErbB2+-Mammakarzinomzellen (C4-

    Zellen) in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

    3.1.4 Aktivierung des ErbB2/AKT-Signalwegs in ErbB2+-C4-Zellen . . 61

    3.1.5 Aktivierung des AKT-Signalwegs in ErbB2+-C4-Zellen unter Wachs-

    tumsfaktorentzug und Inhibtion von HSP90 . . . . . . . . . . . . 62

    3.1.6 ShRNA-vermittelter knockdown der AKT-Isoformen in ErbB2+-

    C4-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

    3.1.7 Proliferation der C4-Zellen nach AKT-Isoform-spezi�schem-knock-

    down . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

    3.1.8 Expression und Aktivierung von ErbB2 und ErbB3 in C4-Zellen

    nach AKT-Isoform-spezi�schem-knockdown . . . . . . . . . . . . . 66

    3.1.9 Expression des Östrogenrezeptor α (ERα) in C4-Zellen nach AKT-

    Isoform-spezi�schem-knockdown . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

    3.1.10 E�ekte des Östrogenrezeptorantagonisten Tamoxifen auf das Wachs-

    tum von C4-Zellen nach AKT3-spezi�schem-knockdown . . . . . . 70

    3.1.11 Untersuchungen des PI3K/AKT-Signalwegs in humanen Mamma-

    karzinomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

    3.2 Untersuchungen zur Funktion von AKT-Isoformen in disseminierten Tu-

    morzellen (DTC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

    3.2.1 Aktivierung des AKT-Signalwegs in DTC-Zelllinien . . . . . . . . 75

    3.2.2 Aktivität der AKT-Isoformen in LC-M1- und H1299-Zellen . . . . 77

    3.2.3 Wachstumsfaktorabhängigkeit der Aktivierung des AKT-Signalwegs

    in LC-M1-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

    3.2.4 Proliferation und Apoptose der LC-M1-Zellen unter Wachstums-

    faktorentzug und Inhibition der PI3K . . . . . . . . . . . . . . . . 81

    3.2.5 ShRNA-vermittelter knockdown der AKT-Isoformen in LC-M1-

    Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

    3.2.6 Proliferation der LC-M1-Zellen nach AKT-Isoform-spezi�schem

    knockdown . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

    3.2.7 Apoptose der LC-M1-Zellen nach AKT-Isoform-spezi�schem knock-

    down . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

    iii

  • Inhaltsverzeichnis

    3.2.8 Migration der LC-M1-Zellen nach AKT-Isoform-spezi�schem knock-

    down . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

    3.2.9 Expression der u-PAR und u-PA mRNA-Menge in LC-M1-Zellen

    nach AKT-Isoform-spezi�schem knockdown . . . . . . . . . . . . . 86

    3.2.10 Expression von EGFR, ErbB2, ErbB3 und dem Östrogenrezeptor

    α in DTC-Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

    3.2.11 Stimulation von LC-M1- und H1299-Zellen mit dem epidermalen

    Wachstumsfaktor (EGF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

    3.2.12 Aktivitäten der AKT-Isoformen nach Stimulation mit EGF in LC-

    M1- und H1299-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

    3.2.13 Proliferation und Apoptose der AKT-Isoform-spezi�schen LC-M1-

    knockdown-Zellen nach EGF-Stimulation . . . . . . . . . . . . . . 92

    3.2.14 Expression der u-PAR mRNA-Menge nach EGF-Stimulation in

    LC-M1-Zellen nach AKT-Isoform-spezi�schem knockdown . . . . 93

    4 Diskussion 95

    4.1 Funktionen von AKT-Isoformen beim ErbB2+-Mammakarzinom . . . . . 95

    4.1.1 ErbB2+-Balb-neuT-Tumore und davon etablierte Mammakarzi-

    nomzellen (C4-Zellen) besitzen eine starke AKT3-Aktivität . . . . 96

    4.1.2 Das Hitzeschockprotein 90 (HSP90) reguliert die Stabilität und

    Aktivität von AKT1 und AKT2, aber nicht von AKT3 . . . . . . 99

    4.1.3 AKT-Isoformen haben einen unterschiedlichen Ein�uss auf die Pro-

    liferation der C4-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

    4.1.4 Der Verlust von AKT3 reduziert