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Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Thomas Delong aus Erlangen

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Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen

Funktion des

Fettsäuresynthase-Komplexes in

Saccharomyces cerevisiae

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Thomas Delong

aus Erlangen

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Als Dissertation genehmigt

von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der

Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 17. Mai 2006

Vorsitzender der Promotionskomission: Prof. Dr. D.-P. Häder

Erstberichterstatter: Prof. Dr. E. Schweizer

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. B. Rautenstrauss

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Für meine geliebte Frau Carol Anne

und unseren Sohn Joshua Joseph

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Danksagungen

Herrn Prof. Dr. E. Schweizer danke ich für die Überlassung des interessanten Themas und für

die umfassende und stets freundliche Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit.

Ich danke Prof. Dr. G. Keller vom Lehrstuhl für Mathematik und Stochastik für seinen

wertvollen Rat bei der Behandlung der in dieser Arbeit enthaltenen stochastischen Fragen.

Allen Mitarbeitern des Lehrstuhls danke ich für die gute Zusammenarbeit und stete

Hilfsbereitschaft.

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INHALT I

Inhaltsverzeichnis Seite

VERZEICHNIS DER TABELLEN V

VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN VI

VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN IX

ZUSAMMENFASSUNG 1

SUMMARY 2

1 EINLEITUNG 3

2 ERGEBNISSE 16

2.1 Herstellung hexamerer FAS-Mischkomplexe mit unterschiedlichen

Anteilen an Phosphopantethein-haltigen Untereinheiten

16

2.1.1 Hintergrund 16

2.1.2 Herstellung eines Phosphopantethein-freien FAS-Komplexes 17

2.1.3 Vorversuche zur Spaltung und anschließenden Reassoziation des

hexameren FAS-Komplexes

20

2.1.3.1 Ermittlung der maximal möglichen Menge (NH4)2SO4 bei der

Ausfällung von DMMA-dissoziierter FAS

21

2.1.3.2 Ermittlung der Mindestmenge DMMA, welche für die Dissoziation

des FAS-Komplexes benötigt wird

22

2.1.3.3 Ermittlung der geringsten für eine vollständige Reaktivierung

notwendigen Enzymmenge

24

2.1.3.4 Ermittlung der zur maximalen Reaktivierung von DMMA-

behandelter FAS notwendigen Zeit

26

2.1.4 Herstellung von hybriden Mischkomplexen aus Phosphopantethein-

freien und Phosphopantethein-haltigen FAS-Komplexen und

Vermessung der Aktivitäten dieser Mischkomplexe

28

2.1.5 Modellrechnung zur Aktivität von partiell phosphopantetheinylierten

FAS-Mischkomplexen bei Vorliegen einer Halbseiten-Aktivität

34

2.2 Untersuchungen ausgewählter Aspekte der Synthese überlanger

Fettsäuren in Hefe

41

2.2.1 Hintergrund 41

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INHALT II

2.2.2 Identifizierung der mit einer Membranfraktion der Mutante ∆ybr159w

gebildeten Elongaseprodukte

48

2.2.3 FAS-freie Membranfraktionen 50

2.3 Drosselung der FAS-Aktivität in vivo und ihre physiologischen Folgen 57

2.3.1 Hintergrund 57

2.3.2 Drosseln der FAS-Aktivität durch kontrollierten Zusatz von Cerulenin

zu intakten Zellen

57

2.3.3 Isolierung von Hefe-Mutanten mit reduzierter FAS-Aktivität 60

2.3.3.1 Charakterisierung von FAS-Mutanten mit verringertem Wachstum

auf fettsäurefreiem Medium

60

2.3.3.2 Bestimmung der FAS-Aktivität in FAS-Mutanten mit verringertem

Wachstum auf Fettsäure-freiem Medium

63

2.3.3.2.1 Optimierung des radiometrischen FAS-Tests 63

2.3.3.2.1.1 Optimierung der zum Radio-FAS-Test eingesetzten

Proteinmenge

63

2.3.3.2.1.2 Festlegung der für den Radio-FAS-Test optimalen

Reaktionszeit

64

2.3.3.2.2 Messung der spezifischen Aktivität von gereinigter

Fettsäuresynthase aus den in Abb. 36 aufgeführten Mutanten

65

2.3.3.3 Untersuchungen an der Mutante fas1-268 67

2.3.3.3.1 Untersuchung der Stabilität des FAS-Proteins der Mutante fas1-

268 während der Aufreinigung des FAS-Komplexes

67

2.3.3.3.2 Gaschromatische Untersuchung des Fettsäuremusters in den

Lipiden der Mutante fas1-268

69

2.3.3.3.3 Untersuchung der in vitro FAS-Produkte im Rohextrakt der

Mutante fas1-268 und des Wildtyps BY4742

72

2.3.3.3.4 Messung der Fettacyl-CoA Spiegel im Zellextrakt von

Hefezellen

74

3 DISKUSSION 78

4 MATERIAL UND METHODEN 86

4.1 Material 86

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INHALT III

4.1.1 Arbeitsgeräte 86

4.1.2 Sonstiges Arbeitsmaterial 87

4.1.3 Chemikalien 87

4.1.3.1 Allgemeine Chemikalien und Lösungsmittel 87

4.1.3.2 Spezielle Chemikalien und Lösungsmittel 87

4.1.4 Kultur-Medien 88

4.1.4.1 Nährmedien für Hefe 88

4.1.4.2 Nährmedien für E.coli 89

4.2 Organismen 89

4.2.1 E. coli 89

4.2.2 S. cerevisiae 89

4.3 Biochemische Methoden 90

4.3.1 Kultivierung von Mikroorganismen 90

4.3.1.1 Anzucht von E. coli-Zellen 90

4.3.1.2 Anzucht von Hefezellen 90

4.3.1.3 Zelldichte-Bestimmung von Flüssigkulturen 90

4.3.2 Transformation von S. cerevisiae und E. coli-Zellen 90

4.3.2.1 CaCl2-Methode zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 90

4.3.2.2 Transformation von CaCl2-behandelten E. coli-Zellen mit Plasmid-

DNA

91

4.3.2.3 Hefetransformation nach der modifizierten Lithiumacetat-Methode 91

4.3.3 Arbeiten mit DNA 92

4.3.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem „QIAprepSpin Plasmid Kit“

(Quiagen)

92

4.3.3.2 Restriktionsendonuclease-Spaltung von DNA 92

4.3.3.3 Analytische Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten 93

4.3.4 FAS Enzymreinigung aus Hefe 93

4.3.4.1 Zellaufschluß 93

4.3.4.2 Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Sedimentation in der

Ultrazentrifuge

93

4.3.4.3 Saccharose-Dichtegradient-Zentrifugation 94

4.3.5 FAS Aktivitätsmessungen [LYN3] 95

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INHALT IV

4.3.5.1 FAS-Gesamtreaktion 95

4.3.5.2 β-Ketoacyl-Reduktase-Reaktion 95

4.3.5.3 Auswertung 96

4.3.5.4 Radioaktiver FAS-Test 96

4.3.6 Dissoziation und Reassoziation von Hefe-FAS nach der DMMA-

Methode [WER2, MIT]

97

4.3.7 Elongase Aktivitätstest 98

4.3.8 Gaschromatographische Analyse von Fettsäuremethylestern 98

4.3.9 „Reversed-Phase“-HPLC Analyse von Fettsäure-Gemischen 99

4.3.10 Isolierung von FAS-freien Hefemembranen 100

4.3.11 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen [BOL] 101

4.3.12 Proteintransfer auf PVDF-Membranen und Immundetektion 102

4.3.12.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen 102

4.3.12.2 Nachweis von ProteinA-markierter Proteine mit Peroxidase-

Antiperoxidase (PAP)-Antikörpern

102

4.3.12.3 „Enhanced Chemoluminescense“ (ECL)-Methode 102

4.3.13 Zellaufschluss von S.cerevisiae 103

4.3.14 In vivo Mutagenese mit Ethylmethansulfat [ADA] 103

4.3.15 Isolierung und Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern der Hefe 104

4.3.15.1 Isolierung nach Mancha et al. [MAN] 104

4.3.15.2 Isolierung nach Maningo et al. [MAG] 105

4.3.15.3 Isolierung nach Rosendal et al. [ROS] 106

4.3.15.4 Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern durch RP-HPLC 107

4.3.16 Proteinbestimmung nach Bradford [BRA] 107

4.4 Chemische Methoden 108

4.4.1 Synthese von Stearoylchlorid 108

4.4.2 Synthese von 3-Oxoeicosansäuremethylester 109

5 LITERATURVERZEICHNIS 110

LEBENSLAUF 114

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INHALT V Verzeichnis der Tabellen

Seite

Tab. 1: Reinigung von Pantethein-haltiger und Pantethein-freier FAS aus Wildtyp bzw. SC1260 / YCp2MM-Transformierten Zellen.

19

Tab. 2: Ausfällung von BSA durch steigende (NH4)2SO4-Konzentrationen. 22Tab. 3: Optimierte Versuchsparameter für die Herstellung hybrider FAS-

Mischkomplexe . 27

Tab. 4: Zur Dissoziation / Reassoziation eingesetzte Mischungen aus Phosphopantethein (PA)-haltiger Wildtyp-FAS und Phosphopantethein-freier Mutanten-FAS.

28

Tab. 5: Abhängigkeit der FAS-Gesamtaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzymkomplexes.

30

Tab. 6: Abhängigkeit der FAS β-Keto-ReduktaseTeilaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzymkomplexes.

31

Tab. 7: Tab. 7: Relativer Anteil bestimmter Mischkomplex-Typen im Reassoziations-Gemisch aus phosphopantetheinylierter ( ) und nicht- phosphopantetheinylierter ( ) FAS.

35

Tab. 8: Berechnung der Nachbarschafts-unabhängigen (A) und Nachbarschafts-abhängigen (B) Halbseitenaktivität für die verschiedenen Anordnungsmöglichkeiten pantetheinylierter (●) und nicht- pantetheinylierter (○) α-Untereinheiten im hexameren FAS-Komplex.

38

Tab. 9 Berechnung der Aktivität von partiell pantetheinylierten Mischkomplexen unter der Annahme, dass eine Vollseiten-Aktivität (VS), eine gemäß Tab. 8 undifferenzierte, d.h. Nachbarschafts-unabhängige Halbseiten-Aktivität (HS) oder eine gemäß Tab. 8 differenzierte Halbseiten-Aktivität (vHS) besteht.

39

Tab. 10: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in langkettige Fettsäuren mit Acetyl-CoA als Startsubstrat durch die löslichen (Überstand) und die partikulären (Niederschlag) FAS Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe

53

Tab. 11: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in überlange Fettsäuren (in Abwesenheit von Cerulenin) mit Stearoyl-CoA als Startsubstrat durch die löslichen (Überstand) und die partikulären (Niederschlag) Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe

54

Tab. 12: Tab. 12: Spezifische FAS-Aktivitäten des gereinigten FAS Komplexes (optischer Test) und des Rohextraktes (radiometrischer Test) von Wildtyp Hefe und von verschiedenen Mutanten

66

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INHALT VI Verzeichnis der Abbildungen

Seite

Abb. 1: Reaktionsmechanismus und Teilaktivitäten der Fettsäuresynthase 5

Abb. 2: Anordnung der Teilenzym-Domänen in den zwei bekannten Varianten

von Typ I Fettsäuresynthasen

6

Abb. 3: Übertragung des Phosphopantethein-Restes von Coenzym A auf apo FAS 8

Abb. 4: Modell des FAS-Komplexes der Hefe 9

Abb. 5: Hypothetische Halbseiten- (B) bzw. Vollseiten- (A) Aktivität eines (αβ)2-

Dimeren des FAS-Komplexes in Hefe

10

Abb. 6: Intragene Komplementation zweier unterschiedlich defekten FAS-

Mutanten nach dem Halbseiten-Modell in Abb. 5B

11

Abb. 7: Beispiele für die verschiedenen Arten von Fettacyl-CoA bedürftigen

Reaktionen der Hefe.

13

Abb. 8: Schematische Darstellung der geplanten FAS Dissoziations-

/Reassoziations-Experimente

16

Abb. 9: Überprüfung des Phänotyps von YCp2MM-transformierten SC1260

Zellen

18

Abb. 10: Abschließende Rohrzucker-Gradienten Zentrifugation der gereinigten

YCp2MM-FAS

19

Abb. 11: Protein-Acylierung mit DMMA 20

Abb. 12: FAS Inaktivierungskinetik mit unterschiedlichen Mengen DMMA 23

Abb. 13: Reaktivierung der FAS-Gesamtaktivität (A) und der β-Keto-

ReduktaseTeilaktivität (B) nach DMMA-Behandlung

25

Abb. 14: FAS Reaktivierungskinetik nach DMMA-Behandlung 27

Abb. 15: Relative spezifische FAS-Gesamtaktivitäten bei FAS-Komplexen

unterschiedlichen Phosphopantethein-Gehaltes

30

Abb. 16: Relative spezifische β-Ketoreduktaseaktivitäten bei FAS-Komplexen

unterschiedlichen Phosphopantethein-Gehaltes

31

Abb. 17: Abhängigkeit der restituierten FAS-Aktivität vom Anteil

pantetheinylierter FAS-Untereinheiten im Gemisch

33

Abb. 18: Theoretische Gesamtaktivität von FAS-Mischkomplexen bei Annahme

von Vollseiten-Aktivität (●), genereller Halbseiten-Aktivität ohne

Nachbarschafts-Effekte (●) und spezieller Halbseiten-Aktivität mit

obligatorischer Nachbarschaftsbeziehung (●).

36

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INHALT VII Abb. 19: Verschiedene Möglichkeiten der relativen Anordnungen einer

unterschiedlichen Zahl phosphopantetheinylierter ( ) und nicht-

phosphopantetheinylierter ( ) α-Untereinheiten zueinander im Hexamer

in einem einfachen zweidimensionalen Modell

37

Abb. 20: Irreversible Hemmung der FAS-Kondensationsreaktion durch Cerulenin 42

Abb. 21: Reaktionsprodukte des Enzymsystems Elongase bei Verwendung von

Membranpräparationen aus Wildtyp- (A) und ∆ybr159w-Mutanten-Zellen

(B) nach p-Bromphenacylierung und Auftrennung mittels Radio-HPLC

43

Abb. 22: Derivatisierung von Fettsäuren zu p-Bromphenacylestern 44

Abb. 23: Elongation von Stearoyl-CoA in der Mutante ∆ybr169w und mögliche

Reaktionsprodukte

45

Abb. 24: Bildung von Diketiden durch aufeinander folgende Kondensation von

Stearoyl-CoA mit 2 Molekülen Malonyl-CoA

46

Abb. 25: Syntheseweg des 3-Oxoeicosansäuremethylesters gemäß Milton et al.

[MIL]

47

Abb. 26: FAB-Massenspektrum des 3-Oxoeicosansäuremethylesters 47

Abb. 27: 1H-NMR Spektrum des 3-Oxoeicosansäuremethylesters 48

Abb. 28: Vergleichende RP-HPLC Analyse der von der Mutante ∆ybr159w

synthetisierten Zwischenprodukte mit dem synthetischen 3-

Oxoeicosansäuremethylester

49

Abb. 29: Nachweis von Membran-gebundener Fettsäuresynthase in einer

gereinigten Zellmembran-Fraktion aus Hefe

52

Abb. 30: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in Fettsäuren mit Acetyl-CoA als

Startsubstrat durch die löslichen (Ü, gelb) und die partikulären (N, braun)

FAS Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von

Wildtyp Hefe

53

Abb. 31: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in überlange Fettsäuren (in Abwesenheit

von Cerulenin) mit Stearoyl-CoA als Startsubstrat durch die lösliche (Ü,

gelb) und die partikuläre (N, braun) Fraktionen der in Abb. 29

dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe

55

Abb. 32: Wachstumskinetik von Wildtyp Hefe in Gegenwart unterschiedlicher

Ceruleninkonzentrationen

58

Abb. 33: Anteil lebender Zellen in mit und ohne Cerulenin gewachsenen

Hefekulturen

59

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INHALT VIII Abb. 34: Wachstum verschiedener fas-Mutanten und des Wildtyps auf Fettsäure-

haltigem (YPD+FS) und Fettsäure-freiem (YPD) Vollmedium

61

Abb. 35: Wachstumskinetiken von Wildtyp-Hefe und verschiedenen fas-Mutanten

in Fettsäure-haltigem (A, YPD+FS) und Fettsäure-freiem (B, YPD)

Medium

62

Abb. 36: Proteinabhängigkeit des Einbaus von [2]-14C-Malonyl-CoA in langkettige

Fettsäuren

64

Abb. 37: Zeitabhängigkeit des Einbaus von [2]-14C-Malonyl-CoA in langkettige

Fettsäuren

65

Abb. 38: Gesamtaktivität (A) und spezifische Aktivität (B) von FAS-Präparationen

aus Wildtyp Hefe ( ) und aus der Mutante fas1-268 ( ) während der

Aufreinigung

68

Abb. 39: GC-Analyse der aus Wildtyp-Hefe (A) und aus der Mutante fas1-268 (B)

gewonnenen Fettsäure-Methylester

70

Abb. 40: Zusammensetzung der in den Lipiden von Wildtyp ( ) und fas1-268 ( )

Zellen enthaltenen Fettsäuren

71

Abb. 41: Radio-HPLC Analyse der in vitro Fettsäuresynthese-Produkte von

Rohextrakten aus Wildtyp (A) und fas1-268 (B) Zellen

73

Abb. 42: Auftrennung von Palmitoyl-CoA, Margaroyl-CoA und Stearoyl-CoA

durch RP-HPLC

75

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INHALT VIII

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen a / α Paarungstyp ACP Acyl Carrier Protein AC Acetyl-Transferase APS Ammoniumpersulfat AT Acyl-Transferase BSA Rinderserumalbumin 14C Kohlenstoffisotop 14 CoA, CoASH Coenzym A Ci Curie cpm Impulse pro Minute Da Dalton DH Dehydratase DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DMMA Dimethylmaleinsäureanhydrid DTT Dithiothreitol E Extinktion ECL Enhanced Chemoluminescence EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme-linked immuno-sorbant assay EMS Ethylmethansulfonat ER Enoyl-Reduktase EUROSCARF European Saccharomyces cerevisiae archive for functional analysis FAS Fettsäuresynthase KR Ketoacyl-Reduktase KS Ketoacyl-Synthase MPT Malonyl/Palmitoyl Transferase NADPH Nicotinsäureamid-adenin-dinukleotid-phosphat, reduziert OD Optische Dichte PAA Polyacrylamid PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PPT Phosphopantethein-Transferase RP-HPLC Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography SDS Dodecylsulfat-Natriumsalz TBE Tris/Borat/EDTA TCA Trichloressigsäure TE Thioesterase TEMED N,N,N’,N’-Tetramethyldiamin thr Threonin Tris Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan U Die Einheit „U“ eines jeden Enzyms ist diejenige Enzymmenge, welche die

Umwandlung von 1 µMol Substrat pro Minute unter definierten Bedingungen katalysiert.

ura Uracil UpM Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolettes Licht VLCFA Überlange Fettsäuren WT Wildtyp YPD Komplettmedium (Fettsäure-frei) YPDFS Komplettmedium (Fettsäure-haltig)

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1

Zusammenfassung Thema dieser Arbeit waren verschiedene enzymchemische und physiologische Aspekte der Fettsäurebiosynthese in Saccharomyces cerevisiae. Dabei wurden zum einen die funktionellen Wechselbeziehungen zwischen den sechs Phosphopantethein-Resten innerhalb des hexameren (α6β6) Fettsäuresynthase-Komplexes der Hefe geklärt. Zum anderen sollten seit kurzem vorliegende genetische Befunde zur Identität des Fettsäureelongase-Gens YBR159w durch biochemische Studien untermauert und die eventuelle Beteiligung der Fettsäuresynthase an der Bildung überlanger Fettsäuren untersucht werden. Ein weiteres Ziel war es, Hefe-Mutanten mit einer verminderten Fettsäuresynthase Aktivität herzustellen, um mit ihnen die Folgen eines Absinkens des zellulären Acyl-CoA Spiegels zu überprüfen. Im Einzelnen wurden die folgenden Ergebnisse erzielt: 1. Es wurden zwei unterschiedliche Varianten des Fettsäuresynthase-Komplexes isoliert, in denen einmal die 6

Phosphopantethein-Reste des hexameren Enzyms vollzählig enthalten waren, während sie im anderen Fall vollständig fehlten. Durch reversible Dissoziation und Reassoziation von definierten Gemischen beider Komplexe wurden FAS-Mischkomplexe mit unterschiedlichen Anteilen an Phosphopantethein-haltigen und Phosphopantethein-freien α-Untereinheiten hergestellt. Beim Vergleich von spezifischer FAS-Aktivität und molarem Phosphopantethein-Gehalt stellte sich heraus, dass die FAS-Gesamtaktivität eines hybriden Mischkomplexes direkt proportional zu seinem Pantetheinylierungsgrad war. Dieser Befund spricht für die funktionelle Eigenständigkeit jedes einzelnen der 6 Phosphopantethein-Reste im Komplex und macht früher diskutierte kooperative Wechselbeziehungen zwischen den Resten unwahrscheinlich. Eine Halbseitenaktivität von Hefe-FAS konnte somit zugunsten einer Vollseitenaktivität ausgeschlossen werden.

2. Die Funktion des vor kurzem identifizierten Gens YBR159w im Rahmen der Synthese überlanger Fettsäuren sollte durch Charakterisierung des vor dem Reaktionsblock angehäuften Zwischenproduktes näher untersucht werden. Das vermutete Fettsäureelongase-Zwischenprodukt 3-Oxoeicosansäure wurde in Form seines Methylesters chemisch hergestellt und als Referenz zur Identifizierung der in vitro von der Mutante ∆ybr159w synthetisierten Intermediate eingesetzt. Das Chromatographie-Verhalten der derivatisierten Referenzsubstanz war nahezu, aber nicht vollständig identisch mit dem des in der Mutante akkumulierten Zwischenprodukts. Mögliche Ursachen hierfür im Zusammenhang mit der Instabilität der 3-Ketosäure und verschiedene denkbare Folgereaktionen im rohen Zellextrakt werden diskutiert.

3. Es wurde der Frage nachgegangen, ob in Hefezellen die Fettsäuresynthase eventuell noch eine Nebenfunktion als Fettsäure-Elongase hat. In diesem Zusammenhang wurde versucht, S.cerevisiae Zellmembranen frei von anhaftender Fettsäuresynthase herzustellen. Dabei zeigte sich, dass selbst nach intensivem Waschen mit Detergens-haltigem Puffer noch eine beträchtliche Menge FAS-Protein fest mit der Membran verhaftet war und sich von ihr nicht ablösen ließ. Die Membranfraktion besaß dennoch keine nachweisbare de novo FAS-Aktivität. Die Elongase-Aktivität der Membranen sank bei dem Waschprozess auf einen, letztlich konstanten, Wert von 5-10 Prozent der ursprünglichen Aktivität ab. Ob diese Inaktivierung durch Enzymdenaturierung oder durch die Entfernung eines löslichen Cofaktors bedingt war, wurde nicht geklärt.

4. Es wurden fas-Mutanten mit deutlich eingeschränkter, aber nicht vollständig verlorener Fähigkeit zur eigenständigen de novo Fettsäuresynthese untersucht. Es war geplant, anhand des in solchen Mutanten abgesenkten Palmitoyl-CoA Spiegels zellphysiologisch besonders kritische Palmitoylierungsreaktionen zu identifizieren. Bei einigen der untersuchten Mutanten wurde eine gute Korrelation zwischen dem bei Fettsäuremangel reduzierten Wachstum und der im Zellextrakt und auch im gereinigten FAS-Komplex noch vorhandenen FAS-Aktivität festgestellt. Bei einer einzelnen Mutante, fas1-268, war eine solche Korrelation nicht gegeben, da sie trotz niedriger Aktivität der gereinigten FAS und sehr schlechtem Wachstum in fettsäurefreiem Medium noch eine hohe FAS-Aktivität im Rohextrakt aufwies. Die Möglichkeit des spezifischen Defekts einer bisher nicht bekannten Palmitoylierungsaktivität des FAS-Komplexes wird diskutiert.

5. Die ungewöhnlich hohe FAS-Aktivität im Rohextrakt der Mutante fas1-268 wurde im Hinblick auf die Inaktivität des gereinigten Komplexes näher untersucht. Es wurde gezeigt, dass das fas1-268 FAS-Protein offensichtlich metastabil ist, indem es zunächst in noch aktiver Form synthetisiert wird und danach in der Zelle seine Aktivität rasch verliert. Die Mutante fas1-268 synthetisiert einen ungewöhnlich hohen Anteil überlanger 26:0 Fettsäure. Diese Eigenschaft lässt sich einesteils mit dem bekannten Enzymdefekt der Mutante (Palmitoyl-Transferase negativ) im Sinne einer verzögerten Ablösung und somit begünstigten Weiterverlängerung der FAS-Produkte interpretieren. Zum anderen dürfte die Elongase bei der Konkurrenz um das gemeinsame Substrat Malonyl-CoA von der Inaktivierung der Fettsäuresynthase in der Mutante profitieren.

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2

Summary Various enzyme chemical and physiological aspects of fatty acid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae were investigated. One purpose was to investigate the correlation between the six different phoshopantetheine residues in the hexameric (α6β6)fatty acid synthase complex in yeast. Another purpose was to biochemically investigate the putative function of the recently identified fatty acid elongase gene YBR159w and to study the possible involvement of fatty acid synthase in the formation of very long chain fatty acids. Another goal was to create yeast mutants with reduced fatty acid synthase activity levels and to investigate the effect of decreased acyl-CoA levels on critical cellular palmitoylation reactions. In detail, the following results were obtained: 1. Two types of fatty acid synthase complexes were isolated, on which the first type included all of the six

phoshopantetheine residues of the hexameric enzyme while the second contained none. By reversible dissociation and reassociation of defined mixtures of both complex types, hybrid FAS complexes with different proportions of phoshopantetheine-containing and phoshopantetheine-free α-subunits were produced. Comparison of specific FAS activities and molar phoshopantetheine concentrations showed that the activity of hybrid FAS-complexes was directly proportional to their degree of pantetheinylation. This finding strongy supports the functional autonomy of each of the six phoshopantetheine residues and therefore, makes any cooperative interaction between them unlikely. It is concluded that yeast FAS exhibits full-site, rather than half-of-the-sites reactivity.

2. The function of the recently identified gene YBR159w in fatty acid elongation was investigated by characterisation of the intermediates accumulated in ∆ybr159w mutants. The putative fatty acid elongation intermediate 3-oxoeicosanoic acid was chemically synthesised and used as a reference to identify the in vitro products of the ketoreductase mutant ∆ybr159w. The elution characteristics of the reference substance in RP-HPLC chromatography was almost, but not completely identical with that of intermediates accumulated in the mutant. Possible reasons for these differences are discussed in connection with the instability of 3-Ketoacids in the crude cell extract.

3. It was investigated whether yeast fatty acid synthase possibly exhibits an additional function as a fatty acid elongating system. An attempt was made to isolate S. cerevisiae cell membranes free from adherent fatty acid synthase. It was found that even after repeated washings with a detergent-containing buffer, a noticeable amount of FAS protein was still tightly connected to the membrane fraction. Nevertheless, the membrane fraction had no detectable de novo FAS activity. During the washing process, the elongase activity of the membranes decreased to a low but finally constant level of 5-10 percent of its original activity. Whether this deactivation was caused by enzyme denaturation or by the removal of a soluble cofactor has not been studied further.

4. FAS mutants with a distinctly reduced, but not completely absent ability for independent de novo fatty acid synthesis were investigated. The decreased palmitoyl-CoA levels in these mutants were expected to be useful in identifying the most critical cellular palmitoylation reactions. In most of the investigated mutants, the reduced growth rates in fatty acid deficient medium were perfectly correlated to the FAS activity in the cell extracts as well as to that of the purified FAS enzymes. However, in a single mutant, fas1-268, this correlation was absent. The low FAS activity of the purified enzyme and the poor growth in fatty acid free medium contrasted to an almost wildtype-like FAS-activity in the cell extract. Based on these characteristics a specific defect of a so far unidentified palmitoylation activity of yeast FAS is discussed.

5. The high FAS activity in crude cell extract of the mutant fas1-268 being in contrast to the inactivity of the isolated mutant FAS was investigated in more detail. It was shown that the fas1-268 FAS protein is apparently metastabile. While being active in statu nascendi, it continuously looses activity during enzyme purification. Mutant fas1-268 produced an unusually high proportion of the 26:0 very long chain fatty acid. On the one hand, this characteristic may be explained by the known palmitoyl transferase defect of the mutant. On the other hand, fatty acid elongases might also benefit from the inactivation of the FAS complex which usually competes for the common substrate malonyl-CoA.

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EINLEITUNG 3

1 Einleitung

Die de novo Biosynthese langkettiger Fettsäuren aus Acetyl-Coenzym A ist eine elementare

biochemische Leistung fast aller Organismen und Zellen. Das Enzymsystem, welches diese

Leistung erbringt, ist die so genannte Fettsäuresynthase (FAS). Das FAS-Enzymsystem

katalysiert den Reaktionsablauf der Fettsäure-Biosynthese in mehreren aufeinander

folgenden, biochemisch gut untersuchten Schritten. Die Einzelheiten dieser Reaktionsfolge

wurden von Lynen [LYN1, LYN2], Vagelos [VAG1, VAG2] und Wakil [TOO] entschlüsselt

und sind in dem in Abb. 1 gezeigten Reaktionsschema zusammengefasst. Die biologischen

Aufgaben von Fettsäuren für die Struktur und Funktion lebender Zellen sind äußerst

vielfältig. Mengenmäßig am bedeutsamsten ist ihr Vorkommen in den Phospholipiden der

meisten biologischen Membranen und in den Triacylglyceriden der Speicherfette. Daneben

üben sie aber auch als Seitenketten von Coenzymen (z.B. Liponsäure), als Bestandteil von

Sekundärmetaboliten (z.B. Norsorolinsäure [WOL]), als kovalente Anheftungen spezieller

eukaryotischer Proteine (z.B. Palmitoylierung von Ras [DIE]) und als eukaryotische „second

messenger“ Moleküle (z.B. Diacylglycerin als Aktivator der Proteinkinase C [OLI]), wichtige

biologische Funktionen aus. Sie spielen demnach nicht nur Schlüsselrollen bei der zellulären

Energiespeicherung und bei der Stabilität und Dynamik biologischer Membranen, sondern

wirken auch als Regulatoren des zellulären Metabolismus und der Zellphysiologie.

Obwohl ausgeprägte Unterschiede in der molekularen Struktur der FAS-Enzyme

unterschiedlicher Organismen existieren, ist doch der Reaktionsmechanismus der Synthese

von Fettsäuren aus Acetyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A in sämtlichen biologischen

Systemen grundsätzlich derselbe. Bei diesem Prozess werden mehrere aufeinander folgende

Zyklen einer stets gleich bleibenden Reaktionssequenz in Kombination mit einer speziellen

Anfangs- und Endreaktion durchlaufen. Die einzelnen Reaktionsschritte der

Fettsäurebiosynthese werden von den folgenden Teilenzymen des FAS-Multienzymsystems

katalysiert: Acetyl-Transferase (AC); Malonyl-Transferase (MT); Ketoacyl-Synthase (KS);

Ketoacyl-Reduktase (KR); Dehydratase (DH); Enoyl-Reduktase (ER) und Thioesterase (TE)

bzw. Palmitoyl-Transferase (PT). In Abhängigkeit von dem jeweiligen FAS-System können

die drei Acyl-Transferasen außer als Acetyl-, Malonyl- und Palmitoyl-Transferasen auch als

Malonyl/Palmitoyl-Transferasen (MPT bei Pilzen) oder als Acetyl/Malonyl-Transacylase

Mischenzyme (AT bei Tieren) auftreten [SCH]. Die Reaktionsweise der einzelnen

Page 18: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 4

Teilenzyme im Gesamtprozess der Fettsäuresynthese ist in Abb. 1 dargestellt. Im Einzelnen

spielt sich der Reaktionsablauf wie folgt ab:

Die de novo Biosynthese von Fettsäuren beginnt damit, dass eine Acetylrest von Coenzym A

auf eine spezielle OH-Bindungsstelle des Acetyl-Transferase-Teilenzyms (1) übertragen wird.

Von dort wird der Acylrest an eine funktionelle Cystein-Thiolgruppe im aktiven Zentrum des

Ketoacylsynthase-Teilenzyms (3) abgegeben. Gleichzeitig wird vom zweiten Startsubstrat

Malonyl-Coenzym A der Malonylrest durch das Teilenzym Malonyl-Transferase (2) auf die

terminale SH-Gruppe (SHC) des Phosphopantetheinarms der Acyl-Carrier-Protein-

Komponente im FAS-System übertragen. Die Ketoacyl-Synthase (3) katalysiert nun, unter

Freisetzung von CO2, die Übertragung des Acetylrestes auf den decarboxylierten Malonylrest.

Somit entsteht ein als Phosphopantethein-Thioester enzymgebundenes 3-Oxocarbonsäure-

Intermediat. Anschließend wird der 3-Oxoacyl-Thioester durch das Teilenzym Ketoacyl-

Reduktase (4) unter Verbrauch von NADPH zum 3-Hydroxyacyl-Thioester reduziert. Dieses

Intermediat wird dann, durch das Dehydratase-Teilenzym (5), unter Freisetzung von Wasser

in ein enzymgebundenes 2,3-Transenoat umgewandelt. Das Enoyl-Reduktase-Teilenzym (6)

sorgt schließlich unter Verwendung von NADPH für die abschließende Reduktion des Enoats

zu einer um zwei Kohlenstoffatome verlängerten, vollständig gesättigten Fettsäure. Dieses

immer noch enzymgebundene Reaktionsprodukt wird nun, solange es noch nicht die

Endlänge von 16-18 Kohlenstoffatomen erreicht hat, auf die Cystein-Thiolgruppe der

Ketoacyl-Synthase zurück übertragen und so in einen weiteren Verlängerungszyklus

eingespeist. Am Ende von insgesamt sieben derartigen Elongationszyklen wird die

entstandene langkettige Fettsäure entweder durch eine Palmitoyl-Transferase (8;

Mikroorgansimen) mit Coenzym A thiolytisch oder durch eine Thioesterase (7; Tiere) mit

Wasser hydrolytisch abgespalten.

Bisher sind zwei hinsichtlich ihrer molekularen Struktur unterschiedliche Typen von FAS-

Systemen bekannt. Beim einen Typ (Typ II), der überwiegend in Bakterien und in den

Organellen von Eukaryonten auftritt, werden die verschiedenen enzymatischen Teilaktivitäten

diskreten Einzelenzymen zugeschrieben, von denen jedes durch ein eigenes spezielles Gen

kodiert wird. Im Gegensatz dazu sind beim zweiten FAS-Typ (Typ I) die katalytischen

Zentren der verschiedenen Teilenzym-Aktivitäten entweder auf einer einzigen,

zusammenhängenden (Typ Ib) oder auf zwei, ebenfalls multifunktionellen Polypeptidketten

(Typ Ia) lokalisiert. Dieses Organisationsprinzip ist schematisch in Abb. 2 dargestellt.

Page 19: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 5

Abb. 1: Reaktionsmechanismus und Teilaktivitäten der Fettsäuresynthase.

Die enzymatischen Teilaktivitäten sind nummeriert (1-8, s. auch im Text) und mit blauen Kästchen hinterlegt.

Die Startsubstrate Acetyl-CoA (rot) und Malonyl-CoA (blau) und die entsprechenden Atomsymbole werden

einschließlich bis zur Ketoacyl-Synthase-Reaktion farblich hervorgehoben. Der Phosphopantethein-Rest wird

durch die Kurzschreibweise Pan-S dargestellt. Die funktionelle Cystein-Thiolgruppe des Ketoacyl-Synthase-

Teilenzyms wird durch die Kurzschreibweise Cys-S dargestellt.

Page 20: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 6

AC ER DH KR PPTPPTKSMPT ACP Typ Ia S. cerevisiae (α6β6)

Typ Ib Corynebakterien (α6)

β α

α

KS AT DH ER KR ACP TE Typ Ib Säugetiere (α2)

α

AC ER DH MPT ACP KR KS

Abb. 2: Anordnung der Teilenzym-Domänen in den zwei bekannten Varianten von Typ I

Fettsäuresynthasen.

Die Pfeile kennzeichnen zusammenhängende Leserahmen auf DNA-Ebene (Aminosäuresequenz in

Pfeilrichtung) bzw. Polypeptidsequenzen. Die farbliche Unterteilung der Proteinketten in einzelne funktionelle

Domänen ist nicht skaliert, entspricht aber in der relativen Reihenfolge der Domänen den experimentellen

Befunden [SCH]. PPT ist das Kürzel für die Phosphopantethein-Transferase. Die übrigen Abkürzungen sind in

Abb. 1 beschrieben.

Fettsäuresynthasen des Typs I treten - mit Ausnahme der höheren Pflanzen -

charakteristischerweise im Cytoplasma aller Eukaryonten [LYN2, RAN, SCH1] auf.

Zusätzlich werden sie bei Prokaryonten auch noch in der Familie der Coryne- und

Mycobakterien gefunden [BLO]. Wie bereits erwähnt und ebenfalls in Abb. 2 verdeutlicht ist,

können Typ I FAS-Enzyme unter Berücksichtigung der Anordnung ihrer katalytischen

Domänen und der stöchiometrische Zusammensetzung ihrer Untereinheiten auch noch in die

zwei Subtypen Ia und Ib unterteilt werden. Hinsichtlich ihrer Quartärstruktur kennzeichnet die

mikrobiellen Typ I Fettsäuresynthasen eine hexamere Zusammensetzung α6β6 bei Pilzen bzw.

α6 bei Coryne- und Mycobakterien. Die Domänenreihenfolge innerhalb der α- bzw. αβ-

Protomere folgt hierbei dem in Abb. 2 gezeigten Schema der Typ Ia-Synthasen. Im Gegensatz

dazu sind tierische Typ I Fettsäuresynthasen Dimere und zeigen die in Abb. 2 für Typ Ib-

Synthasen skizzierte Domänen-Reihenfolge. Als eine Besonderheit mit bisher noch

unbekannter funktioneller Bedeutung wurden vereinzelt auch auf DNA-Ebene Fusionen von

2-3 kompletten FAS-Genen des Typs Ib beobachtet [COL, SIR2, ZHU].

Die Fettsäuresynthase ist in der Regel ein cytosolisches Haushaltsenzym. In der vielfältig

substrukturierten Eukaryonten-Zelle findet sich neben der cytosolischen FAS jedoch auch

Page 21: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 7

noch eine zweite, mitochondrielle Fettsäuresynthase mit spezieller Bedeutung für den

Energiestoffwechsel dieser Organelle [BRO, SHI]. Gelegentlich beobachteten, zusätzlichen

FAS-Varianten in bestimmten Organismen kommt dort gewöhnlich eine spezielle Bedeutung

im Sekundärstoffwechsel dieser Zellen zu [FER1, FER2, FIT].

Die Fettsäuresynthase (FAS) in S. cerevisiae besteht aus zwei verschiedenen Protein-

Untereinheiten, α und β. Beide Untereinheiten sind mit 226 (α) bzw. 207 (β) kDa von

vergleichbarer Größe. Der intakte FAS-Komplex ist ein (αβ)6 Hexameres bzw. α6β6

Heterododecameres. Die α-Untereinheit enthält die aktiven Zentren der Ac(et)yltransferase

(AC), Enoyl-Reduktase (ER), Dehydratase (DH) und Malonyl-/Palmitoyl-Transacylase

(MPT). Die β-Untereinheit enthält neben der Acyl-Carrier-Protein-Domäne (ACP) die aktiven

Zentren der Ketoacyl-Reduktase (KR), der Ketoacyl-Synthase (KS) und der

Phosphopantethein-Transferase (PPT) (vgl. Abb. 2).

Im Gegensatz zu allen anderen bekannten FAS-Systemen verfügt der FAS-Komplex in Hefe

und anderen Pilzen über eine eigene, interne Phosphopantethein-Transferase [FIC], welche

mit den drei übrigen aktiven Zentren der α-Untereinheit dieses Typ Ia FAS-Proteins fusioniert

ist (vgl. Abb. 2). Die Aufgabe der Phosphopantethein-Transferase (PPT) besteht darin, die im

ACP-Bereich der α-Kette verankerte prosthetische Gruppe Phosphopantethein

posttranslationell von Coenzym A auf die Hydroxylgruppe eines spezifischen Serinrestes

(Ser180) der apo ACP-Domäne zu übertragen (vgl. Abb. 3). Die terminale SH-Gruppe von

enzymgebundenem Phosphopantethein stellt eine der beiden bekannten reaktiven

Thiolgruppen des FAS-Komplexes dar. Sie wird, im Gegensatz zu der im aktiven Zentrum

der Ketoacyl-Synthase gelegenen „peripheren“ SH-Gruppe (SHP) als „zentrale“ Thiolgruppe

bezeichnet (SHC). Wie aus dem geschilderten Reaktionsablauf hervorgeht, spielt die

prosthetische Gruppe 4’-Phosphopantethein bei der Elongation der Fettsäuren durch das FAS-

System eine Schlüsselrolle. Aufgrund der Länge und Flexibilität dieses Armes nimmt man an,

dass die daran gebundenen Intermediate an den einzelnen Teilenzymen vorbeigeführt und

dabei deren katalytischen Zentren präsentiert werden. In allen Fettsäuresynthasen ist der

Kofaktor Phosphopantethein kovalent an die OH-Gruppe eines speziellen Serinrestes im sog.

Acyl-Carrier-Protein (ACP) gebunden. Während das Acyl-Carrier-Protein in E. coli (Typ II

FAS) das mengenmäßig bedeutsamste Einzelprotein der Zelle darstellt [ROC], steht den

verschiedenen Teilenzymen in Typ I FAS-Systemen nur eine einzige komplexinterne ACP-

Domäne zur Verfügung.

Page 22: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 8

+ O

HHH

H

Adenin

OH O

SHNN

OP

OP

OH

O

H

O

H

O

O OH

OHO

P OHO

OHapo-FAS ( )

3',5'-ADP PPT

PPTACP

SHC

holo-FAS ( )SH

PPTACP

OH

O

Abb. 3: Übertragung des Phosphopantethein-Restes von Coenzym A auf apo FAS.

Der Phosphopantethein-Rest (rot markiert) wird durch das Enzym Phosphopantethein-Transferase (PPT) von

Coenzym A auf einen spezifischen Serinrest des Acyl-Carrier-Protein (ACP) Bereichs im FAS-Komplex

übertragen.

Lynen et al. [LYN2] entwickelten das in Abb. 4 gezeigte Schema zum enzymgebundenen

Ablauf des Fettsäuresynthese-Prozesses an den beiden Thiolgruppen („periphere“ Cystein-

und „zentrale“ Pantethein SH-Gruppe) des Enzymproteins [AYL, ENG, KRE, LYN2, SCR,

SCH2, ZIE]. Im Einzelnen wird dabei der Acetatrest in drei aufeinander folgenden Schritten

von Coenzym A auf die „periphere“ Thiolgruppe (Cys-SHP) übertragen. An dieser

Übertragung sind eine spezielle Hydroxylgruppe (Ser-OHAc) der Ac(et)yltransferase (AC), die

„zentrale“ Thiolgruppe (SHC) als vorübergehende Acylierungsstellen und die „periphere“ SH-

Gruppe (Cys-SHP) als endgültige Acetyl-Bindestelle beteiligt (vgl. Abb. 4). Wie in Abb. 4 mit

dem gepunkteten Pfeil angedeutet ist, kann die Acetylgruppe grundsätzlich, wenn auch

deutlich weniger effizient, auch über die Malonyl-Transferase zur „zentralen“ und dann zur

„peripheren“ SH-Gruppe übertragen werden. In einem davon unabhängigen, zweistufigen

Transacylierungs-Prozess wird der Malonylrest von Coenzym A über eine spezielle

Hydroxylgruppe (Ser-OHMal) der Malonyl/Palmitoyl-Transacylase (MPT) auf die zentrale

Thiolgruppe (SHC) übertragen. Anschließend kondensieren, wie in Abb.1 dargestellt,

Page 23: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 9

enzymgebundenes Malonat und enzymgebundenes Acetat durch die katalytische Wirkung der

Ketoacyl-Synthase (KS) miteinander unter CO2-Abspaltung zu enzymgebundener β-

Ketosäure (vgl. Abb. 1).

KSKR

PPT

DHER

MPT

AC

ACP

SHC

HSC

HOMal

HOAcAcetyl-CoA

Malonyl-CoA

SHP

Abb. 4: Modell des FAS-Komplexes der Hefe.

Acetyl- und Malonyl-Bindungsstellen und Transacylierungsreaktionen des FAS-Komplexes in Hefe. Die

Untereinheiten α (grün) und β (rot) wurden durch unterschiedliche Farben und deren katalytische Zentren als

diskrete Proteindomänen gekennzeichnet. Der Phosphopantethein-Rest ist durch eine Zickzacklinie dargestellt.

Abkürzungen: Acetyl-Transferase (AC), Ketoacyl-Synthase (KS), Ketoacyl-Reduktase (KR),

Phosphopantethein-Transferase (PPT), Dehydratase (DH), Enoyl-Reduktase (ER), Malonyl/Palmitoyl-

Transferase (MPT), Acyl-Carrier-Protein (ACP).

Nach der Kondensationsreaktion befindet sich deren Produkt an der „zentralen“ Thiolgruppe

(SHC). Diese ist damit blockiert und kann mit einem neuen Malonylrest erst dann wieder

beladen werden, wenn das Intermediat von ihr abgespalten wurde. Dies erfolgt dadurch, dass

die „zentrale“ Thiolgruppe (SHC) sozusagen als „schwingender Arm“ fungiert und das an sie

gebundenen Intermediat an den verschiedenen katalytischen Zentren des FAS-Komplexes

vorbeischleust, bis es letztlich als gesättigter Acylrest wieder auf die „periphere“

Cysteingruppe (Cys-SHP) übertragen wird und damit die „zentrale“ SH-Gruppe (SHC) wieder

freigesetzt wird (vgl. Abb. 1). Damit wird sie wieder aufnahmefähig für einen neuen

Malonylrest, welcher für einen weiteren Elongationszyklus notwendig ist.

Biochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Reaktivität des FAS-Komplexes von

Hefe einer negativen Kooperativität unterliegt [SCU]. Dies bedeutet, dass sich weder Acetat

noch Malonat, selbst unter Sättigungsbedingungen, stöchiometrisch an alle vorhandenen

Page 24: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 10

Acetat- bzw. Malonat-Bindestellen des FAS-Komplexes binden. Stattdessen binden nur 2-3

statt 12 theoretisch mögliche Mole Malonat und 6-7 statt 24 mögliche Mole Acetat an 1 Mol

des hexameren FAS-Komplexes. Diese negative Kooperativität stellt wohl sicher, dass der

größte Teil der Bindungsstellen des Enzym-Oligomers für die Intermediate zur Verfügung

steht und nicht schon zu Beginn der Reaktion durch die Startsubstrate blockiert wird. Sie ist

daher günstig für den Reaktionsmechanismus und könnte einer der Gründe für die stets

oligomere Struktur des FAS-Komplexes sein. Weiterhin haben frühere Untersuchungen von

Lynen et al. [LYN3] gezeigt, dass sich an die 6 „peripheren“ SH-Gruppen des FAS-Hexamers

nur 3 Moleküle des SHP-Hemmstoffes Iodacetamid binden. Es erschien daher denkbar, dass

Hefe-FAS eine Halbseiten-Aktivität aufweist, bei der jeweils nur 3 von 6 (αβ)-Einheiten

gleichzeitig aktiv sind. Eine derartige Aktivität wäre dann gegeben, wenn für jeden

Reaktionszyklus nicht nur eine, sondern zwei (αβ)-Einheiten nötig wären. Im Gegensatz dazu

steht eine Vollseiten-Aktivität, bei der jede (αβ)-Einheit für sich alleine aktiv ist (vgl. Abb.

5).

A

B

Abb. 5: Hypothetische Halbseiten- (B) bzw. Vollseiten- (A) Aktivität eines (αβ)2-Dimeren des FAS-

Komplexes in Hefe.

Die individuellen α-Untereinheiten (rot) und die β-Untereinheiten (grün) arbeiten bei einer Vollseiten-Aktivität

vollständig unabhängig voneinander. Im Gegensatz dazu kooperieren bei einer Halbseiten-Aktivität zwei (αβ)–

Protomere (grau hinterlegt) miteinander in derselben Reaktionsfolge.

Page 25: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 11

Frühere genetische Versuche hatten gezeigt, dass eine defekte Domäne der β-Untereinheit

(gleiches gilt für α) durch die entsprechende intakte Domäne einer anderen β-Untereinheit

ersetzt werden kann, d.h. jede β-Untereinheit funktioniert nicht für sich alleine und

unabhängig von den anderen β-Untereinheiten, sondern alle β-Untereinheiten im Komplex

können miteinander kommunizieren [KUN, SCH3, WER2]. Dieser Zusammenhang soll durch

folgendes Beispiel erläutert werden: Die Diploide, die nach Kreuzung einer Enoylreduktase-

defekten FAS-Mutante mit einer Dehydratase-defekten FAS-Mutante entsteht, besitzt wieder

FAS-Aktivität, obwohl sie zwei für sich allein inaktive Arten von β-Untereinheiten besitzt

(Abb. 6).

A

B

Abb. 6: Intragene Komplementation zweier unterschiedlich defekten FAS-Mutanten nach dem

Halbseiten-Modell in Abb. 5B.

Werden die FAS-Untereinheiten einer Dehydratase-defekten Mutante (gelb hinterlegt) mit denen einer

Enoylreduktase-defekten Mutante (grau hinterlegt) in der diploiden Zelle zu einem Hybridkomplex gemischt, so

erlaubt nur das Halbseiten-Modell (B), nicht aber das Vollseiten-Modell (A) eine Wiederherstellung der FAS-

Aktivität.

Diese so genannte intragene Komplementation von defekten β-Untereinheiten (gleiches gilt

für die α-Untereinheiten) lässt sich unschwer dadurch erklären, dass die beiden Defekte durch

die in Abb. 6B für kooperierende (αβ)-Dimere gezeigte β1/β2 Wechselwirkung umgangen

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EINLEITUNG 12

werden. Allerdings bleibt dabei die Fragestellung offen, ob die offensichtliche

Wechselwirkung zwischen zwei gleichartigen Untereinheiten im FAS-Komplex die Folge

einer obligatorischen Halbseiten-Aktivität ist (vgl. Abb. 6B) oder ob sie neben der Vollseiten-

Aktivität nur eine weitere Möglichkeit des Komplex-internen Produkt Austauschs darstellt.

Die Problematik der Vollseiten- und Halbseiten-Aktivität im FAS-Komplex der Hefe war

eine der Fragen, die es in dieser Arbeit zu untersuchen galt. Um Aufschluss über die

Beteiligung des Phosphopantethein-Restes an einer möglichen Halbseiten-Aktivität zu

erhalten, sollten dabei FAS-Komplexe der Hefe gewonnen werden, die nicht vollständig

phosphopantetheinyliert waren. Anschließend sollten die FAS-Aktivitäten dieser nur teilweise

phosphopantetheinylierten FAS-Komplexe gemessen und mit der Anzahl der jeweils

vorhandenen Phosphopantethein-Reste korreliert werden.

Die Beendigung der FAS-Reaktionsfolge durch eine hydrolytische oder thiolytische

Terminationsreaktion (vgl. Abb. 1) ist hinsichtlich der Kettenlängen-Spezifität eine

individuelle Eigenschaft jedes einzelnen FAS-Systems. Durch diese Terminations-Reaktion

werden sowohl die Kettenlänge des FAS-Produktes als auch der Empfänger der jeweils

synthetisierten Fettsäuren bestimmt. In E. coli werden die langkettigen Fettsäuren

beispielsweise spezifisch durch eine Glycerinphosphat-Transacylase unter Umgehung einer

Acyl-CoA Zwischenstufe direkt vom Acyl-Carrier-Protein auf 3-Phosphoglycerat übertragen

[ROC]. Ferner können in bakteriellen FAS-Systemen kürzerkettige Intermediate für andere

Prozesse, wie z. B. die Liponsäure-Biosynthese, abgezweigt werden. Von einigen FAS-

Systemen weiß man, dass sie ihre Fettsäure-Endprodukte nicht auf Coenzym A oder Wasser,

sondern direkt an spezielle Zielproteine oder Metabolite abgeben [UEN]. In jedem Fall wird

der Abbruch des Elongationszyklus wahrscheinlich durch eine Verschiebung der relativen

Aktivitäten zweier FAS-intern miteinander um dasselbe Zwischenprodukt konkurrierender

Teilenzyme, der Ketoacyl-Synthase und der Fettacyl-Transferase bzw. –Hydrolase, bewirkt

[BLO, WON]. Die Endprodukte der Fettsäuresynthase dienen in mancherlei Weise auch als

Substrate für weiterführende zelluläre Prozesse. Die verschiedenen in Abb. 7 aufgeführten

Fettacylierungsreaktionen werden durch spezifische Transacylasen unter Verwendung von

Acyl-CoA als Substrat durchgeführt. Dabei dürften die einzelnen Transacylasen ihre

Michaelis Konstanten einerseits an die physiologischen Acyl-CoA Konzentrationen der Zelle

und anderseits an den Bedarf der Zelle für das jeweilige Acylierungsprodukt angepasst haben.

Mutationsbedingte Veränderungen von KM-Werten dieser Enzyme oder ein Absinken des

Page 27: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 13

intrazellulären Acyl-CoA Spiegels sollten zu eventuell differentiell ausgeprägten Defekten bei

den in Abb. 7 aufgeführten Zell-Leistungen führen.

Lysophosphatidat Phosphatidat

Triacylglyceride Phosphoglyceride

C

CH2OH

H

CH2OPO3

HO C

H2C

H

CH2OPO3

HO

O C R1

O

C

H2C

H

CH2OPO3

O

O C R1

O

C

O

R2

Acyl-CoA Acyl-CoA

A

C

Farnesyl

Palmitoyl-CoA

SH

Ras

C

Farnesyl

S

Palmitoyl

Ras

B

Serin Dehydrosphinganin Dihydrosphingosin Sphingosin

C

CH2OH

NH3+

COO-

HPalmitoyl-CoA C

CH2OH

NH3+

C

H

O

CH2

CH2

(CH2)12

CH3

C

CH2OH

NH3+

C

H

OH

CH2

CH2

(CH2)12

CH3

C

CH2OH

NH3+

C

H

OH

CH

CH

(CH2)12

CH3

C

Abb. 7: Beispiele für die verschiedenen Arten von Fettacyl-CoA bedürftigen Reaktionen der Hefe.

In der Abb. sind verschiedene Fettacyl-CoA bedürftige Reaktionen der Hefe dargestellt. Dazu gehören u. a. die

Fett-Acylierung von Glycerin (A), die Fett-Acylierung von Proteinen (B) und die Bildung von Sphingosin (C).

Daher war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit, den Einfluss einer verminderten FAS-Aktivität

in Hefe auf andere zelluläre Funktionen zu untersuchen. Dazu sollte die FAS-Aktivität in

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EINLEITUNG 14

Hefe soweit herabgesetzt werden, dass durch den dadurch abgesenkten Acyl-CoA Spiegel der

Zelle bestimmte Fettsäure-bedürftige Reaktionen nicht mehr ausreichend versorgt werden

konnten.

Obwohl die meisten Fettsäuresynthasen Acetyl-CoA als Startsubstrat verwenden und

Palmitin- bzw. Stearinsäure die Endprodukte bilden, existieren dennoch auch FAS-Systeme

mit andersartigen Start- und Endprodukten. So produzieren einige bakterielle Systeme

terminal verzweigte Fettsäuren aus verzweigten, kurzkettigen Fettsäure-Startern [KAN1,

KAN2]. Andere FAS-Systeme verwenden langkettige Fettsäure-CoAs anstelle von Acetyl-

CoA als Startsubstrat. Derartige Systeme werden gewöhnlich als Elongasen bezeichnet und

bilden Fettsäuren bzw. Fettsäurederivate bis zu einer Kettenlänge von 60 Kohlenstoffatomen.

Das Produktspektrum der FAS kann auch durch die Gegenwart oder unter dem Einfluss

bestimmter Proteine oder Metabolite verschoben werden. So entstehen z. B. mit Hefe-FAS in

Gegenwart des Acyl-CoA Bindeproteins (ACBP) hauptsächlich 14 – 18 C-Atome lange

Fettsäuren, während in Abwesenheit von ACBP vor allem 18 – 20 C-Atome lange Produkte

gebildet werden [LYN2].

In Eukaryonten-Zellen wird neben den vom cytosolischen FAS-Komplex gebildeten

langkettigen (C14 – C18) Fettsäuren zusätzlich noch eine geringe Menge (0,5 – 3%)

überlange Fettsäuren (VLCFA) mit einer Länge bis zu 26 C-Atomen synthetisiert. Überlange

Fettsäuren sind üblicherweise über eine Amidbindung an das Sphingosinrückgrat der

Sphingolipide gebunden [DIC]. Trotz ihres geringen Anteils an der Gesamtmenge zellulärer

Lipide sind überlange Fettsäuren aus noch nicht ganz geklärten Gründen für das Überleben

der Zellen notwendig [KOH, SCE]. Überlange Fettsäuren werden durch das bereits erwähnte

Elongase-System gebildet, welches langkettiges Acyl-CoA (z.B. Stearoyl-CoA) anstelle von

Acetyl-CoA als Starter verwendet. Ansonsten benötigt dieses membrangebundene FAS-

ähnliche Enzym-System ebenso wie herkömmliche FAS Malonyl-CoA und NADPH für den

Elongationsprozess [DIT, ROS]. Trotz großer Ähnlichkeit im Reaktionsmechanismus von

FAS und Elongase erscheint es vorerst auf Grund des bisher fehlenden Nachweises weiter

Pantethein-haltiger Zellproteine als eher zweifelhaft, dass das Elongationssystem ebenfalls

mit enzymgebundenem Phosphopantethein als prosthetischer Gruppe arbeitet. Auch ist die

Elongase – im Gegensatz zu allen übrigen bekannten FAS-Systemen – nicht empfindlich

gegenüber dem Hemmstoff Cerulenin [ROS]. Weitergehende Kenntnisse zur molekularen

Struktur der Elongase(n) in Hefe liegen bisher nicht vor. Es hat jedoch den Anschein, als ob

Page 29: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

EINLEITUNG 15

dieses membrangebundene Enzymsystem – anders als FAS – sich aus verschiedenen,

voneinander unhabhängigen Einzelenzymen zusammensetzt. Zwei der beteiligten Teil-

Enzyme, eine β-Ketoacyl-Reduktase und eine Enoyl-Reduktase, werden offenbar durch die

Gene YBR159w und TSC13 kodiert [BEA, HAN, KIM, ROS]. Die Rolle des Gens

YBR159w bei der Bildung überlanger Fettsäuren durch die Elongase-Systeme der Hefe war

eine weitere Fragestellung, die in dieser Arbeit behandelt wurde. Die Funktion von YBR159w

sollte dabei durch die chemische Synthese von Referenz-Substanzen zur Charakterisierung

der Elongations-Intermediate geklärt werden.

Page 30: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 16

2 Ergebnisse

2.1 Herstellung hexamerer FAS-Mischkomplexe mit unterschiedlichen

Anteilen an Phosphopantethein-haltigen Untereinheiten

2.1.1 Hintergrund

In einem ersten Teil der vorliegenden Arbeit sollte die funktionelle Wechselbeziehung

zwischen den sechs verschiedenen Phosphopantethein-Resten innerhalb des hexameren (α6β6)

FAS-Komplexes der Hefe untersucht werden. Experimentell sollte dabei so vorgegangen

werden, dass die Abhängigkeit der FAS-Gesamtaktivität von der Zahl der Phosphopantethein-

Reste im Komplex bestimmt wurde. Denkbar war dabei neben einer linearen Beziehung

zwischen beiden Größen (keine Kooperativität) unter Umständen auch eine nicht-lineare

Beziehung (z.B. positive Kooperativität).

+

DMMA Dissoziation

Reassoziation

A B C D E F G

Abb. 8: Schematische Darstellung der geplanten FAS Dissoziations-/Reassoziations-Experimente.

Phosphopantethein-haltige ( ) und Phosphopantethein-freie ( ) Untereinheiten der beiden Ausgangsenzyme

wurden durch DMMA-Behandlung voneinander getrennt und anschließend durchmischt. Bei der Reaggregation

intakter FAS aus dem Gemisch entstanden FAS-Komplexe (A-G) mit unterschiedlichen Anteilen an

Phosphopantethein-haltigen α-Untereinheiten (0-6).

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ERGEBNISSE 17

Um diese Frage zu klären, sollte ein vollkommen Phosphopantethein-freier FAS-Komplex

mit einer vollständig phosphopantetheinylierten FAS in unterschiedlichen stöchiometrischen

Verhältnissen vermischt und anschließend die beiden Arten von FAS-Komplex mittels

Dimethylmaleinsäureanhydrid (DMMA) in ihre einzelnen Untereinheiten dissoziiert werden.

Bei der anschließenden Reassoziation von Phosphopantethein-freien und Phosphopantethein-

haltigen Untereinheiten aus diesem Gemisch zu intakten hexameren Aggregaten sollten

Mischkomplexe mit unterschiedlichen Anteilen an Phosphopantethein-haltigen

Untereinheiten gebildet werden (vgl. Abb. 8).

2.1.2 Herstellung eines Phosphopantethein-freien FAS-Komplexes

Phosphopantethein-haltige FAS kann aus Wildtyp Hefezellen gewonnen werden. Zur

Herstellung von Phosphopantethein-freier FAS wurde in einer Hefemutante (SC1260), in der

das Gen für die Phosphopantethein-tragende FAS α-Untereinheit zuvor deletiert worden war

(∆fas2::LEU2) eine Plasmid-kodierte, mutierte α-Untereinheit exprimiert, welche die

Fähigkeit zur Phosphopantethein-Bindung verloren hatte. Dies war dadurch erreicht worden,

dass die im Wildtyp-Protein Phosphopantethein-bindende Aminosäure Ser180 in Untereinheit

α durch Glycin ersetzt worden war. Das entsprechende Plasmid YCp2MM war von Maria

Mittag in unserem Labor konstruiert worden [MIT]. Durch das Fehlen der Aminosäure

Ser180 kann der Phosphopantethein-Rest nicht mehr von Coenzym A auf die ACP-Domäne

des FAS-Komplexes übertragen werden (vgl. Abb. 3).

Die mit YCp2MM transformierten SC1260 Zellen wurden in fünf getrennten Ansätzen in

jeweils 20 l Uracil-freiem Selektivmedium (SCD-Ura+FS) angezüchtet. Nach jeder Anzucht

wurden die abgeernteten Hefezellen auf ihren Phänotyp hin überprüft und dabei sichergestellt,

dass die Zellen während der Anzucht (a) nicht revertiert (kein Wachstum auf Fettsäure-freiem

YPD-Medium!) und (b) nicht ihr Plasmid verloren hatten (Wachstum auf Uracil-freiem

Selektiv-Medium!). Es zeigt sich, dass nach jeder der fünf Kultivationen die geernteten Zellen

in der Tat noch den zu erwartenden Phänotyp aufwiesen. Das Ergebnis einer dieser

Überprüfungen ist stellvertretend für alle anderen in Abb. 9 gezeigt.

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ERGEBNISSE 18

SCD-Ura+FS

YPD

YPD+FS

Abb. 9: Überprüfung des Phänotyps von YCp2MM-transformierten SC1260 Zellen.

Ein Tropfen der zu untersuchenden Zellsuspension wurde mit steriler Pipette auf YPD Agar aufgesetzt. Nach

dem Eintrocknen der Flüssigkeit wurde sofort auf die beiden anderen angegebenen Medien überstempelt und alle

drei Platten fünf Tage bei 30°C inkubiert.

Sofort nach der Ernte wurden die abzentrifugierten Hefezellen durch Schütteln mit Glasperlen

aufgeschlossen und zwei aufeinander folgende (NH4)2SO4-Fraktionierungen (18,5 g

(NH4)2SO4 / 100 ml und 10,0 g (NH4)2SO4 / 100 ml) zur Anreicherung des FAS-Komplexes

durchgeführt (vgl. Material und Methoden). Das Sediment der zweiten Fraktionierung wurde

bei -20°C eingefroren. Die gesammelten, eingefrorenen Sedimente wurden zum Schluss

vereinigt, aufgetaut und mit ihnen die übliche FAS-Anreicherung wie in Material und

Methoden beschrieben durchgeführt. Die abschließende Rohrzucker-Gradienten

Zentrifugation der angereicherten FAS ergab das in Abb. 10 gezeigte Sedimentationsprofil.

Das aus den YCp2MM-Transformanten gereinigte Enzym war wie erwartet völlig inaktiv in

der FAS-Gesamtaktivität. Demgegenüber zeigte das Teilenzym β-Ketoacyl-Reduktase eine

spezifische Aktivität von 2901mU/mg, was 103% der entsprechenden Wildtyp-Aktivität

entsprach. Das so gewonnene hoch-reine und Phosphopantethein-freie FAS-Enzym (41,3 mg)

wurde in 30% (NH4)2SO4 ausgefällt und bei -20°C aufbewahrt.

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ERGEBNISSE 19

Abb. 10: Abschließende Rohrzucker-Gradienten Zentrifugation der gereinigten YCp2MM-FAS.

Der Rohrzuckergradient wurde nach der Zentrifugation in 1,5ml Fraktionen ausgetropft. Die Fraktionen wurden

bei 280 nm auf ihren Proteingehalt untersucht. Die gelb unterlegten Fraktionen enthielten das FAS-Protein und

wurden gesammelt.

In einem weiteren Versuch wurden 54,3 mg Phosphopantethein-haltige Wildtyp-FAS aus

600 g Reinzuchthefe (Firma Kitzmann) gereinigt. Diese FAS besaß eine spezifische

Gesamtaktivität von 1982 mU/mg. Das Teilenzym β-Ketoacyl-Reduktase besaß hier eine

spezifische Aktivität von 2803 mU/mg (Tab. 1).

Tab. 1: Reinigung von Pantethein-haltiger und Pantethein-freier FAS aus Wildtyp bzw. SC1260 /

YCp2MM-Transformierten Zellen.

spezifische Aktivitäten

FAS KR

Herkunft

Ausgangsmenge

Hefezellen

[g]

Ausbeute

reines Enzym

[mg] [mU/mg]

Wildtyp

600 g

54,3 mg

1982 mU/mg

2803 mU/mg

SC1250 /

Ycp2MM

490 g

41,3 mg

0 mU/mg

2901 mU/mg

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ERGEBNISSE 20

2.1.3 Vorversuche zur Spaltung und anschließenden Reassoziation des hexameren

FAS-Komplexes

Frühere Versuche von Knut Werkmeister [WER1] und Maria Mittag [MIT] an diesem Institut

hatten gezeigt, dass Hefe-FAS durch kontrollierte Acylierung mit Dimethylmaleinsäure-

Anhydrid (DMMA) reversibel in ihre Untereinheiten dissoziiert und aus diesen anschließend

wieder eine intakte und voll aktive FAS reassoziiert werden kann. Das Anhydrid acyliert

unter Ringöffnung mit einer seiner beiden Carboxylgruppen bestimmte freie Amino-,

Hydroxyl- bzw. Thiolgruppen des FAS-Komplexes. Die dabei freigesetzte zweite

Carboxylgruppe des geöffneten Anhydrids sorgt durch ihre negative Ladung für eine interne

Abstoßung der acylierten Protein-Untereinheiten, wodurch sich die Quarternärstruktur ebenso

wie Teilbereiche der Tertiärstruktur des FAS-Komplexes auflösen (vgl. Abb. 11).

OO O

CH3CH3

+ + H+

Enzym NH

O CH3

CH3

O

O-

NH2Enzym

Abb. 11: Protein-Acylierung mit DMMA.

Das Anhydrid acyliert bestimmte freie Amino-, Hydroxyl- und/oder Thiol-Gruppen des FAS-Komplexes. Die

bei der Ringöffnung gebildete freie Carboxylgruppe sorgt, aufgrund ihrer pH-bedingt negativen Ladung (gelb

hinterlegt), durch intra- und intermolekulare Abstoßungskräfte für eine Auflösung von Tertiär und Quarternär-

Struktur des Proteins.

Nach Literaturangaben kann DMMA-behandelte FAS durch Absenkung des pH-Wertes auf

pH 5,9, bei gleichzeitiger Stabilisierung durch Serumalbumin- und Ammoniumsulfat-Zusatz,

wieder deacyliert und renaturiert werden [WER2, MIT]. Die Nacharbeitung dieser Vorschrift

stieß im vorliegenden Fall zunächst auf unvorhergesehene Schwierigkeiten. Es wurden daher

alle Parameter des Reassoziierungsversuchs systematisch überprüft und gegebenenfalls

variiert und dabei nochmals optimiert. Folgende Überlegungen lagen diesen Optimierungs-

Experimenten zugrunde:

1. Ein Überschuss (NH4)2SO4 könnte zur Folge haben, dass bei der Ausfällung von FAS

auch noch das im Ansatz enthaltene BSA mit ausfällt. Dies würde dazu führen, dass

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ERGEBNISSE 21

die Bestimmung der FAS-Konzentration und folglich auch die Ermittlung der

spezifischen FAS-Aktivität nicht mehr genau möglich ist.

2. Eine Überdosierung von DMMA könnte zu einer übermäßigen Acylierung und damit

irreversiblen Deaktivierung des Enzyms führen. Als Folge davon würde sich die

Aktivität des FAS-Komplexes nicht oder nicht mehr vollständig regenerieren können.

3. Eine zu geringe Enzymkonzentration könnte zur Folge haben, dass die Reassoziations-

Dauer im Vergleich zur gleichzeitig ablaufenden spontanen Enzym-Inaktivierung zu

lang wird und damit die Aktivität des Komplexes nur teilweise wiederhergestellt

werden kann.

4. Eine zu kurze Reaktivierungsdauer führt umgekehrt ebenfalls zu einer nur

unvollständigen Reaktivierung des FAS-Komplexes. Daher musste auch die

Zeitspanne, welche zur maximalen Reaktivierung des FAS-Komplexes führt, ermittelt

werden.

Im folgenden Abschnitt wurde versucht, für alle genannten Parameter die optimalen

Bedingungen zu ermitteln.

2.1.3.1 Ermittlung der maximal möglichen Menge (NH4)2SO4 bei der Ausfällung

von DMMA-dissoziierter FAS

Um sicherzustellen, dass bei der (NH4)2SO4-Fällung von reassoziierter FAS kein BSA mit

ausgefällt wird, wurde, unter sonst gleichen Versuchsbedingungen, eine Fällungsreihe mit

BSA in Abwesenheit von FAS durchgeführt. Dabei wurden der BSA-Lösung steigende

Mengen (NH4)2SO4 zugesetzt und jedes Mal die im Fällungsüberstand noch vorhandene

Menge BSA ermittelt. Alle Versuchansätze enthielten, abgesehen von FAS, die üblichen im

Reassoziationsexperiment enthaltenden Zusätze: 500 µl Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 (300

mM), 300 µl BSA (10 mg/ml), 6 µl DMMA (100 mg/ml THF) und (NH4)2SO4-gesättigte

1 M Essigsäure (zugesetzt bis zum Erreichen von pH 5,9). Verschiedenen derartigen Ansätzen

wurden steigende Mengen von (NH4)2SO4-gesättigtem Kaliumphosphatpuffer pH 5,9 (300

mM) zugesetzt. Nach 5 min Stehen bei 4°C wurden die Proben zentrifugiert und die

Proteinkonzentrationen im Überstand ermittelt. Es zeigt sich, dass BSA unter diesen

Bedingungen erst ab einer (NH4)2SO4-Konzentration von 0,74 g/ml anfing auszufallen (vgl.

Tab. 2). Dies war erst bei Zusatz von >600 µl gesättigter (NH4)2SO4-Lösung zu der BSA-

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ERGEBNISSE 22

haltigen Probe der Fall, also bei wesentlich höheren als den im Reassoziations-Experiment

eingesetzten Konzentrationen.

Unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen der in vitro Reassoziation von DMMA-

behandelter Fettsäuresynthase (Tab. 2, Experiment 3) wurden somit die für eine BSA-

Ausfällung nötigen (NH4)2SO4-Konzentrationen nicht erreicht. Man kann daher sehr wohl

davon ausgehen, dass alles beim Reaktivierungsschritt ausgefällte Protein ausschließlich aus

FAS-Protein besteht. Die damit berechneten spezifischen Aktivitätswerte dürften somit

korrekt sein.

Tab. 2: Ausfällung von BSA durch steigende (NH4)2SO4-Konzentrationen.

In einer Lösung von 500 µl Kaliumphosphatpuffer (300 mM, pH 7,5) waren 3 mg BSA und 6 µl DMMA (100

mg/ml THF) enthalten. Die Probe wurde anschließend mit 1 M (NH4)2SO4-gesättigter Essigsäure auf pH 5,9

titriert. Anschließend wurden die angegebenen Mengen Kaliumphosphatpuffer (300 mM pH 5,9, gesättigt mit

(NH4)2SO4) dazugegeben. Nach Stehen für 5 min wurden die Proben abzentrifugiert (30 min, 4°C, 14000 Upm)

und der Proteingehalt des Überstandes durch den Bradford-Test bestimmt (vgl. Material und Methoden).

Experiment Nr.

1

2

3

4

5

6

Zusatz gesätt. (NH4)2SO4-Lösung

[µl]

0 200 400 600 800 1000

Gesamtvolumen [µl] 1356 1556 1756 1956 2156 2356

Proteinmenge im Überstand nach Zentrifugation

[µg]

2983 3092 3031 2990 2555 1951

2.1.3.2 Ermittlung der Mindestmenge DMMA, welche für die Dissoziation des

FAS-Komplexes benötigt wird

Um die für die FAS-Dissoziation optimale Menge DMMA (möglichst vollständige

Dissoziation, möglichst keine irreversible Denaturierung) zu ermitteln, wurden in zwei

getrennten Ansätzen einmal 5,0 mg FAS-Enzym mit 3 µl DMMA-Lösung (100 mg/ml) und

einmal 4,0 mg FAS-Enzym mit 6 µl DMMA-Lösung (100 mg/ml) behandelt. Die Abnahme

der FAS-Gesamtaktivität in beiden Reaktionsansätzen wurde durch Enzymtests nach

unterschiedlichen Inkubationszeiten zeitlich verfolgt.

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ERGEBNISSE 23

Aus Abb. 12 ist ersichtlich, dass unter den hier gewählten Bedingungen 3 µl DMMA-Lösung

(100 mg/ml THF) nicht ausreichten, um 5,0 mg FAS-Protein (gelöst in 0,5 ml

Kaliumphosphatpuffer) vollständig zu inaktivieren. Nach anfänglich raschem Absinken der

Aktivität verblieb nach ca. 10 min Inkubation eine Restaktivität von ca. 56 Prozent des

Ausgangswertes, die ab diesem Zeitpunkt nicht weiter abnahm. Da die Reaktion in wässrigem

Medium stattfand, kann davon ausgegangen werden, dass der Großteil des zugesetzten

Anhydrids so rasch hydrolysiert wurde, dass er für die Acylierung des Proteins nicht mehr zur

Verfügung stand. Demgegenüber war mit 6 µl zugesetztem DMMA eine vollständige

Inaktivierung des FAS-Enzyms möglich. Hier reichte die DMMA-Konzentration offenbar

aus, um trotz konkurrierender Hydrolyse das FAS-Protein letztlich vollständig zu

inaktivieren. Es wurden daher in allen weiteren Dissoziations-Versuchen jeweils 4,0 mg FAS-

Protein für 8 min mit 6 µl frisch angesetzter DMMA-Lösung inkubiert.

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20

Inkubationszeit mit DMMA [min]

FAS-

Ges

amta

ktiv

ität [

%] X

Abb. 12: FAS Inaktivierungskinetik mit unterschiedlichen Mengen DMMA.

In einem Volumen von jeweils 500 µl Kaliumphosphatpuffer (300 mM, pH 7,5) wurden zu 5,0 mg Wildtyp-

FAS 3 µl ( ) und zu 4,0 mg Wildtyp-FAS 6 µl ( ) DMMA-Lösung (100 mg/ml THF) zugegeben und nach

gründlicher Durchmischung auf Eis inkubiert. Zu den angegebenen Inkubationszeiten wurde mit 10 µl Proben

der beiden Ansätze die FAS-Gesamtaktivität im Standard Testansatz (vgl. Material und Methoden) gemessen.

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ERGEBNISSE 24

2.1.3.3 Ermittlung der geringsten für eine vollständige Reaktivierung notwendigen

Enzymmenge

Als nächstes wurde die für eine vollständige Reassoziation notwendige Mindestmenge an

FAS-Protein ermittelt. Ziel dieser Versuchsreihe war es zu erreichen, dass die Aktivität des

eingesetzten FAS-Enzyms nach Dissoziation und anschließender Reassoziation vollkommen

wiederhergestellt wird. Hierzu wurden vier Proben mit unterschiedlichen Mengen an

Wildtyp-FAS (1,4 – 5,0 mg / 0,5 ml Kaliumphosphatpuffer) jeweils für 8 min mit 6 µl

DMMA-Lösung denaturiert. Anschließend wurde das dissoziierte FAS-Protein entsprechend

der Standard-Versuchsvorschrift wieder reassoziiert. Die Gesamtaktivität der renaturierten

FAS und die Aktivität des Teilenzyms β-Ketoreduktase wurden bei allen Proben zunächst vor

der Dissoziation, dann unmittelbar nach der Dissoziation und schließlich 60 min bzw. 120

min nach Reaktivierungsbeginn vermessen. Die Ergebnisse dieser Messreihen sind in Abb. 13

dargestellt.

Man sieht, dass zur Rückgewinnung der ursprünglich eingesetzten Enzymaktivität eine

Proteinkonzentration von mindestens 4,0 mg pro 0,5 ml Ansatzvolumen nötig war. Niedrigere

Konzentrationen wie 1,4 oder 3,0 mg FAS führten selbst nach 120 min Reaktivierungsdauer

zu keiner vollständigen Wiederherstellung weder der Gesamtaktivität noch der β-

Ketoreduktase Aktivität. Je niedriger die Proteinkonzentration war, desto früher kam offenbar

auch der Reaktivierungsprozess zum Stillstand. Denkbar war auch, dass bei niedrigeren

Proteinkonzentrationen das ungünstigere Enzym/DMMA-Verhältnis einen höheren Anteil

irreversibel denaturiertem Protein erzeugte. Während der Reaktivierungsprozess mit 1,4 mg

FAS pro 0,5 ml Ansatzvolumen bereits nach 60 min beendet war, bedurfte es in den anderen

Fällen dafür mehr als 60 min.

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ERGEBNISSE 25

0

20

40

60

80

100

120

140

0 60 120

Reaktivierungszeit [min]

rest

ituie

rte

FAS-

Ges

amta

ktiv

ität

[% A

usga

ngsa

ktiv

ität]

Ausgangsaktivität

A

0

20

40

60

80

100

120

140

0 60 120

Reaktivierungszeit [min]

rest

ituie

rte

β-K

etor

eduk

tase

-Akt

ivitä

t [%

Aus

gang

sakt

ivitä

t]

Ausgangsaktivität

B

Abb. 13: Reaktivierung der FAS-Gesamtaktivität (A) und der β-KetoreduktaseTeilaktivität (B) nach

DMMA-Behandlung.

Für diesen Versuch wurden 1,4 mg ( ), 3,0 mg ( ), 4,0 mg ( ) und 5,0 mg ( ) Wildtyp-FAS, jeweils gelöst

in 0,5ml Kaliumphosphatpuffer (300mM, pH 5,9) eingesetzt. Alle Proben wurden für 8 min mit 6 µl DMMA

(100 mg/ml THF) inkubiert. Die restituierte FAS-Aktivität (A) und die restituierte Aktivität der β-Ketoreduktase

(B) wurden einmal vor DMMA-Zugabe (100%), unmittelbar nach der Dissoziation (0 min) sowie 60 min und

120 min danach vermessen. Die Aktivitäten wurden auf die Ausgangsaktivität vor DMMA-Zugabe bezogen.

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ERGEBNISSE 26

Interessanterweise führte der Versuchsansatz mit 5,0 mg FAS pro 0,5ml Ansatzvolumen zu

einer Rückgewinnung von mehr als der ursprünglich eingesetzten Enzymaktivität. Nach 120

min Reaktivierungsdauer wurden ca. 130% Prozent sowohl der ursprünglichen FAS- als auch

der ursprünglichen β-Ketoreduktase Aktivität gemessen. Die Reaktivierungskinetik deutet

darauf hin, dass evtl. sogar noch höhere Werte erreichbar gewesen wären. Eine grundsätzlich

ähnliche, wenn auch nicht ganz so ausgeprägte Tendenz zu höheren Reaktivierungswerten

zeigt das Experiment mit 4,0 mg FAS. Entsprechende Beobachtungen waren in früheren

Experimenten gelegentlich auch schon von anderen Mitarbeitern des Instituts gemacht

worden. Eine befriedigende Erklärung dieses Phänomens steht zurzeit noch aus.

Aufgrund der in Abb. 13 gezeigten Ergebnisse einerseits und im Interesse eines möglichst

sparsamen Umgangs mit dem verfügbaren Probenmaterial anderseits wurden in allen

künftigen Dissoziations-Versuchen jeweils 4,0 mg FAS-Protein pro Ansatz eingesetzt.

2.1.3.4 Ermittlung der zur maximalen Reaktivierung von DMMA-behandelter

FAS notwendigen Zeit

Als letztes wurde nach den vorausgegangenen Experimenten untersucht, welche

Reaktivierungszeit notwendig ist, um eine maximale Reaktivierung von 4,0 mg DMMA-

behandeltem FAS-Protein zu erhalten. Dazu wurden zunächst 4,0 mg FAS für 8 min mit 6 µl

DMMA-Lösung (100 mg/ml THF) dissoziiert und das Protein anschließend dem

standardisierten Reaktivierungsverfahren unterworfen. Dabei wurde die FAS-Gesamtaktivität

im Reaktionsansatz nach unterschiedlichen Reaktivierungszeiten vermessen.

Aus Abb. 14 wird deutlich, dass der Reaktivierungsprozess nach 240 min abgeschlossen war

und dabei ca. 120% der ursprünglich vorhandenen Enzymaktivität zurück gewonnen wurden.

Für den Hauptversuch wurde somit eine Reaktivierungszeit von 240 min festgelegt. Als

Ergebnis der geschilderten Versuche wurden somit die in Tab. 3 zusammengefassten

Bedingungen als optimal ermittelt.

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ERGEBNISSE 27

0

25

50

75

100

125

0 100 200 300 400 500

Reaktivierungszeit [min]

rest

ituie

rte

FAS-

Akt

ivitä

t [%

]

Abb. 14: FAS Reaktivierungskinetik nach DMMA-Behandlung.

4,0 mg FAS gelöst in 0,5ml Kaliumphosphatpuffer (300 mM, pH 7,5) wurden für 8 min mit 6 µl DMMA (100

mg/ml THF) dissoziiert. Anschließend wurden 8 µl Mercaptoethanol und 300 µl BSA (10 mg/ml)

dazugegeben. Die Lösung wurde langsam mit ca. 550 µl Essigsäure (1 M, ges. mit (NH4)2SO4) auf pH 5,9 titriert

und mit 500 µl Kaliumphosphatpuffer (pH 5,9, gesättigt mit (NH4)2SO4) versetzt. Der Niederschlag wurde für 30

min bei 4°C abzentrifugiert (14000Upm) und in 480 µl Reaktivierungspuffer (100 mM Kaliumphosphatpuffer

pH 7,5, 10 mM DTT, 20 µM FMN, 0,5mM EDTA) resuspendiert. Aus dieser Lösung wurde zu den

angegebenen Zeiten jeweils 10 µl entnommen und damit die FAS-Gesamtaktivität bestimmt. Die gemessenen

Werte wurden auf die Ausgangsaktivität bezogen.

Tab. 3: Optimierte Versuchsparameter für die Herstellung hybrider FAS-Mischkomplexe.

Parameter

optimaler Wert*

Menge DMMA 6 µl (100 mg/ml THF)

Inkubationszeit 8 min

(NH4)2SO4-Puffer 500 µl (gesättigt)

Reaktivierungsdauer 240 min

* Die Angaben gelten für 4,0 mg Hefe-FAS, gelöst in 500 µl 300 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5.

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ERGEBNISSE 28

2.1.4 Herstellung von hybriden Mischkomplexen aus Phosphopantethein-freien und

Phosphopantethein-haltigen FAS-Komplexen und Vermessung der Aktivitäten

dieser Mischkomplexe

Unter Verwendung der in Tab. 3 zusammengefassten, optimierten Versuchsparameter wurden

in der nächsten Versuchsreihe zwei unterschiedliche FAS-Proteine in verschiedenen

Mischungsverhältnissen im „Eintopfverfahren“ gemeinsam dissoziiert und anschließend zu

hybriden Mischkomplexen reassoziiert. Durch dieses Experiment sollten mögliche

Wechselwirkungen zwischen den sechs identischen Untereinheiten innerhalb eines FAS-

Komplexes ermittelt werden. Die erwähnten hybriden Mischkomplexe wurden aus

Phosphopantethein-haltiger Wildtyp-FAS und einer Phosphopantethein-freien Mutanten-FAS

(s.o.) hergestellt. Um in den reassoziierten Mischkomplexen unterschiedliche relative Anteile

von phosphopantetheinylierten und nicht-phosphopantetheinylierten Untereinheiten zu

erhalten, wurden die beiden FAS-Arten vor ihrer Dissoziation in unterschiedlichen

stöchiometrischen Mengen miteinander gemischt. Mit diesen Gemischen wurde dann der

Dissoziations- / Reassoziations-Prozess im „Eintopfverfahren“ durchgeführt.

Tab. 4: Zur Dissoziation / Reassoziation eingesetzte Mischungen aus Phosphopantethein (PA)-haltiger

Wildtyp-FAS und Phosphopantethein-freier Mutanten-FAS.

Jeder Veruchsansatz enthält 4,0 mg Gesamtprotein und wurde gemäß den in Tab.3 aufgeführten Bedingungen

behandelt.

Anteil im Gemisch

Experiment

Wildtyp-FAS Pantethein-

freie FAS

PA-Gehalt der

reassoziierten

FAS

[mg] [mg] [%]

1 4,0 0,0 100

2 3,3 0,7 83

3 2,7 1,3 67

4 2,0 2,0 50

5 1,3 2,7 33

6 0,7 3,3 17

7 0,0 4,0 0

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ERGEBNISSE 29

Die sieben in Tab. 4 aufgeführten FAS-Gemische wurden nach den in Tab. 3 angegebenen

Bedingungen dissoziiert und zu Mischkomplexen reassoziiert. Nach 240 min Renaturierung

wurden die restituierten Aktivitäten der FAS-Gesamtreaktion und der β-Ketoreduktase

Teilreaktion bestimmt. Die dabei ermittelten Werte sind in Tab. 5 und 6 sowie in Abb. 15 und

16 dargestellt.

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ERGEBNISSE 30

Tab. 5: Abhängigkeit der FAS-Gesamtaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzymkomplexes.

Zur Durchführung der Versuche vgl. Tab. 3 und 4.

spezifische FAS Gesamtaktivität

Anteil Pantetheinhaltiger

α-Untereinheiten im FAS-

Komplex [%]

Vor

Dissoziation

Nach

Dissoziation

nach 240 min

Reassoziation

[%] [mU/mg] [mU/mg] [mU/mg]

0 0 0 0

17 396 0 496

33 690 0 659

50 1101 0 1071

67 1453 22 1686

83 1705 36 2075

100 1982 36 2371

0

20

40

60

80

100

120

100 83 67 50 33 17 0

Anteil Phosphopantethein-haltiger α-Untereinheiten [%]

rela

tive

spez

ifisc

he

FAS-

Ges

amta

ktiv

ität [

%]

Abb. 15: Relative spezifische FAS-Gesamtaktivitäten von FAS-Komplexen unterschiedlichen

Phosphopantethein-Gehaltes.

Die gemessenen FAS Gesamtaktivitäten aus Tab. 5 wurden auf die Aktivität der gereinigten Wildtyp-FAS

(Phosphopantetheinylierungsgrad 100%) vor deren Dissoziation bezogen.

( ) vor der Zugabe von DMMA ( ) nach 8 min Dissoziation ( ) nach 240 min Reassoziation

Page 45: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 31

Tab. 6: Abhängigkeit der FAS β-Ketoreduktase Teilaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des

Enzymkomplexes.

Zur Durchführung der Versuche vgl. Tab.3 und 4.

spezifische β-Ketoreduktase-Aktivität

Anteil Pantethein-haltiger

α-Untereinheiten im FAS-

Komplex

Vor

Dissoziation

Nach

Dissoziation

nach 240 min

Reassoziation

[%] [mU/mg] [mU/mg] [mU/mg]

0 2901 828 3029

17 2847 747 3225

33 2992 624 3046

50 2775 636 3105

67 2735 447 3106

83 2724 425 3132

100 2803 334 2933

0

20

40

60

80

100

120

100 83 67 50 33 17 0

Anteil Phosphopantethein-haltiger α−Untereinheiten [%]

rela

tive

spez

ifisc

he

β-K

etor

eduk

tase

-Akt

ivitä

t [%

]

Abb. 16: Relative spezifische β-Ketoreduktase-Aktivitäten von FAS-Komplexen unterschiedlichen

Phosphopantethein-Gehaltes.

Die gemessenen β-Ketoreduktase-Aktivitäten aus Tab. 6 wurden auf die Aktivität der gereinigten Wildtyp-FAS

(Phosphopantetheinylierungsgrad 100%) vor deren Dissoziation bezogen.

( ) vor der Zugabe von DMMA ( ) nach 8 min Dissoziation ( ) nach 240 min Reassoziation

Page 46: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 32

Aus Abb. 16 wird deutlich, dass die spezifische β-Ketoreduktase-Aktivität des FAS-Enzyms

offensichtlich vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzyms unabhängig ist. Dies war bereits

aus der nahezu identischen Aktivität der beiden reinen Ausgangsenzyme, d.h. der

Phosphopantethein-freien und der vollständig phosphopantetheinylierten FAS ersichtlich (vgl.

Tab. 1). Insofern ist es auch nicht erstaunlich, dass sämtliche Mischkomplexe mit ihren

unterschiedlichen Anteilen Phosphopantethein-haltiger Untereinheiten ebenfalls praktisch

dieselbe, Wildtyp-artige β-Ketoreduktase-Aktivität aufweisen. Die prosthetische Gruppe wird

unter den hier gewählten Testbedingungen für die Reaktion offenbar nicht genutzt. Das

verwendete Modellsubstrat Acetessigsäureethylester wird wohl, ebenso wie dies bereits früher

schon für den Coenzym A Thioester der Acetessigsäure gezeigt worden war, im katalytischen

Zentrum der Reduktase als solcher eingelagert und dann direkt reduziert. Durch Zugabe von

DMMA und die dadurch bewirkte Dissoziation des Komplexes in unabhängige

Untereinheiten wurde die β-Ketoreduktase-Aktivität zwar drastisch auf 12 bis 30% ihrer

Ausgangsaktivität abgesenkt, aber bemerkenswerterweise geht diese FAS-Teilaktivität bei der

DMMA-Behandlung nicht vollständig verloren. Die begrenzte Aktivitätsabnahme spricht

dafür, dass entweder das aktive Zentrum der β-Ketoreduktase durch die Quarternärstruktur

des Komplexes stabilisiert wird, oder dass umgekehrt bei der DMMA-Behandlung neben der

Quarternärstruktur auch Teile der Tertiärstruktur aufgelöst werden. In Anbetracht der

nennenswerten dabei verbleibenden Restaktivität dürfte im letzteren Fall das β-

Ketoreduktase-Zentrum durch die DMMA-Behandlung zwar deformiert, aber nicht

vollständig zerstört worden sein. Die an die Dissoziation anschließende Wiederherstellung der

Komplexstruktur führte auch bei dem Teilenzym β-Ketoreduktase, ebenso wie dies bereits bei

der Gesamt-FAS Aktivität beobachtet worden war, zu einer über den Ausgangswert

hinausgehenden (ca. 110%) Rückgewinnung der ursprünglichen Enzymaktivität.

Aus Abb. 15 wird deutlich, dass die FAS-Gesamtaktivität der verschiedenen

Reaktionsansätze, d.h. der Gemische aus voll aktiver und zu 100% phosphopantetheinylierter

FAS mit einer völlig inaktiven, Phosphopantethein-freien Präparation, vor der DMMA-

Behandlung direkt proportional zum Anteil Phosphopantethein-haltiger Synthase im Gemisch

ist. Dieser Befund ist trivial und entspricht der Erwartung. Andererseits ist die Bewertung der

mit den restituierten Enzymen erhaltenen Ergebnisse etwas komplexer. Auf den ersten Blick

sieht es auch hier danach aus, als ob die Gesamtaktivitäten der restituierten Ansätze direkt

proportional zu ihrem relativen Gehalt an Phosphopantethein-haltiger FAS wären (vgl. Abb.

15 und 17).

Page 47: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 33

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

Anteil Phosphopantethein-haltiger α -Untereinheiten [%]

rela

tive

spez

ifisc

he

FAS-

Ges

amta

ktiv

ität [

%]

Abb. 17: Abhängigkeit der restituierten FAS-Aktivität vom Anteil pantetheinylierter FAS-Untereinheiten

im Gemisch.

Die FAS-Aktivitäten aus Tab. 5 wurden auf die Aktivität der reassoziierten Wildtyp-FAS

(Phosphopantetheinylierungsgrad 100%) bezogen. Als Vergleich zu der experimentell ermittelten

Ausgleichsgeraden ( ) aus den Werten ( ) in Abb. 15 ist auch der theoretische Aktivitätsverlauf aufgetragen

( ), der bei einer unabhängigen Funktionsweise der phosphopantetheinylierten FAS-Untereinheiten im

Gemisch zu erwarten wäre (Vollseiten-Aktivität).

Die in Abb. 17 experimentell ermittelte Abhängigkeit der FAS-Aktivität vom

Phosphopantetheingehalt des FAS-Gemisches erwies sich als praktisch deckungsgleich mit

der für eine Vollseiten-Aktivität zu erwartende Abhängigkeit. Demnach scheint es für die

Aktivität einer einzelnen pantetheinylierten Untereinheit des hexameren Komplexes irrelevant

zu sein, ob und wie viele der restlichen Untereinheiten ebenfalls pantetheinyliert sind.

Demzufolge würde jede phosphopantetheinylierte (αβ)-Einheit im hexameren (αβ)6-Komplex

denselben Beitrag zur FAS-Gesamtaktivität leisten, gleichgültig in welchem Umfeld von

pantetheinylierten oder nicht pantetheinylierten anderen Untereinheiten sie sich befindet.

Dieses Ergebnis widerspräche der Annahme einer Halbseiten-Aktivität, bei der nur doppelt

phosphopantetheinylierte, nicht jedoch einfach phosphopantetheinylierte (αβ)2-Dimere aktiv

wären. Um diese Interpretation der Ergebnisse aus Abb. 15 und 17 weiter abzusichern, wurde

alternativ zu den experimentellen Daten auch noch theoretisch berechnet, wie der

Kurvenverlauf in Abb. 17 aussehen müsste, falls tatsächlich eine Halbseiten-Aktivität

Page 48: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 34

vorläge. Bei einer derartigen Enzymcharakteristik wären nicht nur die Phosphopantethein-

freien, sondern auch alle nur einfach phosphopantetheinylierten (αβ)2-Paare inaktiv. Die

Berechnungen zu den Folgen einer derartigen Situation sind im nächsten Abschnitt

beschrieben.

Bei der Bewertung der in Tab. 5 und Abb. 15 gezeigten Ergebnissen soll auch noch darauf

hingewiesen werden, dass bei der Dissoziation des FAS-Komplexes mit DMMA die

Gesamtaktivität, anders als die des Teilenzyms β-Keto-Reduktase, praktisch vollständig

verschwindet. Dieses kann zum einen ausschließlich mit der Dissoziation der Untereinheiten

α und β, zum anderen aber auch mit zusätzlichen, weitergehenden Strukturänderungen des

FAS-Proteins, gegenüber denen bestimmte Teilenzyme unter Umständen besonders

empfindlich sind, zusammenhängen.

2.1.5 Modellrechnung zur Aktivität von partiell phosphopantetheinylierten FAS-

Mischkomplexen bei Vorliegen einer Halbseiten-Aktivität

Wildtyp-FAS ist ein Hexameres aus sechs jeweils einfach phosphopantetheinylierten (αβ)-

Protomeren. Umgekehrt ist die in dem Dissoziations-/Reassoziations-Experiment verwendete

Mutanten-FAS aus sechs nicht-phosphopantetheinylierten (αβ)-Protomeren aufgebaut.

Werden Phosphopantethein-haltige und Phosphopantethein-freie Monomere aus dem

Dissoziationsgemisch beider FAS-Komplexe nach den Gesetzen der Stochastik und ohne

spezielle Präferenzen wieder zu Hexameren zusammengefügt, so bilden sich in jedem Fall,

unabhängig vom relativen Anteil beider Monomer-Typen im Gemisch, alle sieben in Tab. 7

gezeigten Monomeren-Kombinationen (A-G). Lediglich der relative Anteil jeder einzelnen

der sieben Monomeren Kombinationen sollte in Abhängigkeit vom zahlenmäßigen Verhältnis

von pantetheinylierten und nicht-pantetheinylierten Untereinheiten im Gemisch variieren. Für

jeden der in dieser Arbeit hergestellten Mischkomplexe lässt sich der Anteil jeder einzelnen

der sieben in Tab. 7 gezeigten Kombinationen nach der Formel

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⋅

⋅⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

+⋅⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛

+=− !!

!611

1WSk

kk

ZWS

GA

berechnen, wobei k das Verhältnis zwischen eingesetzten Phosphopantethein-haltigen zu

Phosphopantethein-freien FAS-Komplexen ist und S bzw. W die Anzahl der

Page 49: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 35

Phosphopantethein-haltigen bzw. Phosphopantethein-freien Untereinheiten im Mischkomplex

darstellen. Führt man diese Berechnung für alle fünf in dieser Arbeit untersuchten Gemische

aus phosphopantetheinylierter und nicht-phosphopantetheinylierter FAS durch, so erhält man

die in Tab. 7 dargestellten Werte.

Tab. 7: Relativer Anteil bestimmter Mischkomplex-Typen im Reassoziations-Gemisch aus

phosphopantetheinylierter ( ) und nicht- phosphopantetheinylierter ( ) FAS.

Relativer Anteil bestimmter Mischkomplex-Typen

im Reassoziations-Gemisch [%]

A

B

C

D

E

F

G

:

Misch-

verhältnis

(1 + 5) 0,002 0,06 0,80 5,4 20,1 40,2 33,5

(2 + 4) 0,14 1,64 8,2 21,9 32,9 26,3 8,8

(3 + 3) 1,6 9,4 23,4 31,3 23,4 9,4 1,6

(4 + 2) 8,8 26,3 32,9 21,9 8,2 1,64 0,14

(5 + 1) 33,5 40,2 20,1 5,4 0,80 0,06 0,002

Die Verteilung der phosphopantetheinylierten und damit potentiell enzymatisch aktiven (αβ)-

Monomeren auf die sieben verschiedenen in Tab. 7 aufgeführten Mischkomplexe A-G ist für

die Berechnung der FAS-Gesamtaktivität der Gemische so lange nicht relevant, als die

Monomeren Vollseiten-Aktivität aufweisen und zur Funktion keinen zweiten, ebenfalls

phosphopantetheinylierten Partner brauchen. Für diesen einfachsten Fall gilt die in Abb. 17

und 18 (blaue Kurve) gezeigte Beziehung unabhängig von der Aufteilung der Monomeren auf

die sieben unterschiedlichen Mischkomplex-Typen. Gilt jedoch das Gesetz der Halbseiten-

Aktivität, dann wären die Komplexe F und G in Tab. 7 völlig inaktiv und die Komplexe D

und E besäßen beide 1/3 und die Komplex B und C beide 2/3 der vollen Wildtyp-Aktivität.

Berücksichtigt man diese Überlegung bei der Berechnung der zu erwartenden FAS-Aktivität

für die fünf verschiedenen Reassoziations-Mischungen gemäß Tab. 7, so ergibt sich die durch

die rote Kurve in Abb. 18 gezeigte Abhängigkeit.

Page 50: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 36

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6

Anteil Phosphopantethein-haltiger α -Untereinheiten im FAS-Mischkomplex

bere

chne

te F

AS-

Ges

amta

ktiv

ität [

%]

Abb. 18: Theoretische Gesamtaktivität von FAS-Mischkomplexen bei Annahme von Vollseiten-Aktivität

(●), genereller Halbseiten-Aktivität ohne Nachbarschafts-Effekte (●) und spezieller Halbseiten-Aktivität

mit obligatorischer Nachbarschaftsbeziehung (●).

Das erwähnte Halbseiten-Aktivitätsmodell kann noch weiter verfeinert werden, indem man

postuliert, dass nur unmittelbar benachbarte Phosphopantethein-haltige Monomere, aber keine

nicht-benachbarten Monomere im Hexameren miteinander wechselwirken können und dabei

Aktivität erzeugen. Wenn man der Einfachheit halber beim - sicher nicht realistischen –

zweidimensionalen Modell der Abb. 19 bleibt, so ergeben sich bereits hier eine Vielzahl

unterschiedlicher relativer Anordnungen der phosphopantetheinylierten Monomeren

zueinander im hexameren Komplex.

Page 51: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 37

Abb. 19: Verschiedene Möglichkeiten der relativen Anordnungen einer unterschiedlichen Zahl

phosphopantetheinylierter ( ) und nicht-phosphopantetheinylierter ( ) α-Untereinheiten zueinander im

Hexamer in einem einfachen zweidimensionalen Modell.

Page 52: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 38

Tab. 8: Berechnung der Nachbarschafts-unabhängigen (A) und Nachbarschafts-abhängigen (B)

Halbseitenaktivität für die verschiedenen Anordnungsmöglichkeiten pantetheinylierter (●) und nicht-

pantetheinylierter (○) α-Untereinheiten im hexameren FAS-Komplex.

In B werden die Positionen der Untereinheiten im Hexameren als festgelegt, in A als nicht festgelegt angesehen.

In A und B wurden jeweils nur gepaarte Pantethein-haltige Untereinheiten zur Aktivitätsberechnung

herangezogen.

A

B

Anteil

pantetheinylierter

α-Untereinheiten

im Hexameren

Undifferenzierte

Anordnungs

HS-

Aktivität

Differenzierte

Anordnungs-

Möglichkeiten

Anteil

vHS-

Aktivität

6/6

100%

100%

100%

5/6

66,7%

100%

66,7%

40%

66,7%

40%

33,3%

4/6

66,7%

20%

66,7%

30%

33,3%

60%

33,3%

3/6

33,3%

10%

0%

40%

33,3%

40%

0%

2/6

33,3%

20%

0%

1/6

0%

100%

0%

0/6

0%

100%

0%

Page 53: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 39

Tab. 9: Berechnung der Aktivität von partiell pantetheinylierten Mischkomplexen unter der Annahme,

dass eine Vollseiten-Aktivität (VS), eine gemäß Tab. 8 undifferenzierte, d.h. Nachbarschafts-unabhängige

Halbseiten-Aktivität (HS) oder eine gemäß Tab. 8 differenzierte Halbseiten-Aktivität (vHS) besteht.

Werte berechnet aus Tab. 7, 8 und Abb. 19.

Mögliche partiell pantetheinylierte FAS-Varianten

rel.

Gesamt-Aktivität

5 + 1

[%]

[%]

Anteil im Gemisch 33,5 40,2 20,1 5,4 0,8 0,06 0,002

VS-Aktivität 33,5 33,5 13,4 2,7 0,27 0,01 - 83,3

HS-Aktivität 33,5 26,8 13,4 1,8 0,27 - - 75,7

vHS-Aktivität 33,5 26,8 10,7 1,6 0,11 - - 72,7

4 + 2

Anteil im Gemisch 8,8 26,3 32,9 21,9 8,2 1,6 0,14

VS-Aktivität 8,8 21,9 21,9 11,0 2,7 0,27 - 66,7

HS-Aktivität 8,8 17,6 21,9 7,3 2,7 - - 58,4

vHS-Aktivität 8,8 17,6 17,6 6,6 1,1 - - 51,6

3 + 3

Anteil im Gemisch 1,6 9,4 23,4 31,3 23,4 9,4 1,6

VS-Aktivität 1,6 7,8 15,6 15,6 7,8 1,6 - 50,0

HS-Aktivität 1,6 6,3 15,6 10,4 7,8 - - 41,7

vHS-Aktivität 1,6 6,3 12,5 9,4 3,1 - - 32,9

2 + 4

Anteil im Gemisch 0,14 1,6 8,2 21,9 32,9 26,3 8,8

VS-Aktivität 0,14 1,4 5,5 11,0 11,0 4,4 - 33,3

HS-Aktivität 0,14 1,1 5,5 7,3 11,0 - - 25,0

vHS-Aktivität 0,14 1,1 4,4 6,6 4,4 - - 16,6

1 + 5

Anteil im Gemisch 0,002 0,06 0,8 5,4 20,1 40,2 33,5

VS-Aktivität 0,002 0,05 0,54 2,7 6,7 6,7 - 16,7

HS-Aktivität 0,002 0,04 0,54 1,8 6,7 - - 9,1

vHS-Aktivität 0,002 0,04 0,43 1,6 2,7 - - 4,8

Page 54: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 40

Bei der Überlegung, welche Ergebnisse zu erwarten wären, falls der restituierte FAS-

Komplex eine Halbseiten-Aktivität aufwiese, kann man von zwei grundsätzlich verschiedenen

Modellen ausgehen: im einen Fall bildet eine einzelne phosphopantetheinylierte α-

Untereinheit mit einer beliebigen zweiten, ebenfalls phosphopantetheinylierten α-Untereinheit

im Komplex ein aktives Dimer. Im zweiten Fall tut sie dies nur, falls die zweite Untereinheit

sich im Komplexgefüge in der richtigen geometrischen Position zu ihr befindet. In diesem

Fall würden sich also nur benachbarte, d.h. „vicinale“ Untereinheiten gegenseitig ergänzen. In

Abb. 19 wurden die verschiedenen Möglichkeiten der relativen Anordnungen einer

unterschiedlichen Zahl phosphopantetheinylierter α-Untereinheit zueinander in einem

einfachen zweidimensionalen hexameren Modell systematisch durchgespielt. Die sich daraus

ergebenden Häufigkeiten bestimmter Hexamerer mit fest gefügten Positionen wurden aus

Abb. 19 abgeleitet und sind in Tab. 8 aufgelistet. Unter Verwendung dieser und der in Tab. 7

enthaltenen Werte wurden in Tab. 9 die theoretisch erwarteten FAS-Aktivitäten berechnet, die

einmal bei Zugrundeliegen einer einfachen Halbseiten-Aktivität ohne bestimmte sterische

Voraussetzungen (HS) und zum anderen bei Vorliegen einer „vicinalen“ Halbseiten-Aktivität

(vHS), bei der nur die in Abb. 19 benachbarten α2-Paare aktiv sind, erhalten werden. Auch

der Fall, dass keine Halbseiten-Aktivität, sondern eine Vollseiten-Aktivität (VS) vorliegt,

wurde in Tab. 9 berechnet. Die errechneten Werte sind in Abb. 18 ebenfalls aufgetragen. Wie

man beim Vergleich von Abb. 17 mit Abb. 18 sieht, entsprechen die experimentell ermittelten

Werte in Abb. 17 am ehesten dem VS-Diagramm in Abb. 18. Dieser Befund sowie die klar

vom VS-Kurvenverlauf sich abhebenden HS- und vHS-Diagramme sprechen eindeutig gegen

das Vorliegen einer obligatorischen Halbseiten-Aktivität im FAS-Komplex der Hefe.

Page 55: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 41

2.2 Untersuchungen ausgewählter Aspekte der Synthese überlanger

Fettsäuren in Hefe

2.2.1 Hintergrund

Fettsäuren mit mehr als 18 C-Atomen Kettenlänge werden als „überlange“ Fettsäuren („very

long chain fatty acids“; VLCFA) bezeichnet. Sie gehören nicht zu den üblichen Bestandteilen

aller biologischen Membranen. Lediglich in der Plasmamembran von Eukaryontenzellen sind

sie, in meist sehr geringer Menge (1-3 Prozent), enthalten. Obwohl sie für die Lebensfähigkeit

dieser Zelle unentbehrlich sind, weiß man über ihre biologische Funktion erst wenig. Eine

Rolle bei wichtigen Signal-Weiterleitungsvorgängen erscheint wahrscheinlich.

Die Biosynthese überlanger Fettsäuren erfolgt in Hefe durch Verlängerung der langkettigen

Fettsäuren Palmitin- und Stearinsäure. Unter Verwendung von Malonyl-CoA als

Elongationsbaustein wird dabei nach einem Fettsäuresynthase-analogen Mechanismus in der

Hauptsache Cerotinsäure (26:0) gebildet [DIT]. Das beteiligte Enzymsystem, die Fettsäure-

Elongase, kann zwar anhand seiner Enzymaktivität nachgewiesen werden, wurde jedoch

molekular bisher weder isoliert noch charakterisiert. Immerhin konnten jedoch einzelne

Komponenten des Multienzymsystems Elongase vor kurzen auf indirektem Wege, d.h. mit

Hilfe spezifischer Deletionsmutationen, nachgewiesen werden. In unserem Labor war dies vor

allem das Teilenzym β-Ketoacyl-Reduktase, für dessen Synthese das Hefegen YBR159w

verantwortlich ist [ROS]. In dem hier vorliegenden Teil meiner Arbeit sollten die

vorhandenen genetischen Befunde zur Identität des Gens YBR159w durch biochemische

Studien untermauert werden.

Da Fettsäuresynthase und Elongase zwei analog arbeitende Enzymsysteme sind, ist es

schwierig, durch einen optischen in vitro Test zwischen beiden zu differenzieren. In beiden

Fällen wird Malonyl-CoA unter NADPH-Verbrauch in Fettsäuren eingebaut. Experimentell

wird diese Reaktion entweder im optischen Test anhand des NADPH-Verbrauchs gemessen,

oder aber es wird der Einbau von [2]-14C-markierter Malonsäure in radioaktiv markierte

Fettsäuren bestimmt. In erster Näherung kann die spezifische Elongase-Aktivität durch

radiogaschromatographische oder Radio-HPLC-Analyse der gebildeten Fettsäuren festgestellt

werden. Im Bereich von 16 – 20 C-Atome langen Fettsäuren überschneiden sich jedoch die

Aktivitäten beider Enzymsysteme, so dass hier auch mit diesem Test eine Diskriminierung

Page 56: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 42

schwierig ist. Es war daher außerordentlich hilfreich festzustellen, dass FAS und Elongase

sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Hemmstoff Cerulenin deutlich unterscheiden.

Während das Elongase Enzymsystem durch Cerulenin nicht erkennbar gehemmt wird, ist

dieses Reagens für praktisch alle Fettsäuresynthasen ein effizient und irreversibel wirkender

Inhibitor. Man geht davon aus, dass Cerulenin die β-Ketoacylsynthase-Reaktion der FAS

irreversibel dadurch blockiert, dass es sich unter Öffnung des Epoxidrings kovalent an den

Cysteinrest des katalytisch aktiven Zentrums („periphere“ SH-Gruppe) anlagert (vgl. Abb. 20)

NHOH

O

OHKSKR

PPT

DHER

MPT

AC

ACP

SS

O

CH2COO-

O

CH2COO-

+ CeruleninKS

KR

PPT

DHER

MPT

AC

ACP

SS

R

O

PPT

A B

Abb. 20: Irreversible Hemmung der FAS-Kondensationsreaktion durch Cerulenin.

Die „periphere“ SH-Gruppe (grün) im aktiven Zentrum der Ketoacyl-Synthase bindet normalerweise den zu

verlängernden Acylrest (A), reagiert jedoch in Gegenwart von Cerulenin mit dem sterisch ähnlichen Hemmstoff

(B).

Eine so modifizierte FAS ist nicht mehr in der Lage, den Acyl-Starter an die „periphere“ SH-

Gruppe anzulagern und somit die Schlüsselreaktion der Fettsäurebiosynthese durchzuführen.

Der Zusatz von Cerulenin zu einem in vitro Fettsäuresynthese-Ansatz bewirkt somit, dass nur

Elongase-Produkte, und keine FAS-Produkte mehr gebildet werden. Das Produktspektrum

eines derartigen Ansatzes mit Wildtyp-Elongase ist in Abb. 21A gezeigt. Bei Verwendung

von Stearoyl-CoA als Starter bilden sich dabei die überlangen Fettsäuren 20:0, 22:0, 24:0,

26:0. Bei der Radio-HPLC Analyse (Abb. 21A) werden diese Säuren in Form ihrer p-

Bromphenacyl-Derivate nachgewiesen und den entsprechenden Referenzverbindungen (Abb.

21C) zugewiesen. Während Hefezellen in vivo offensichtlich noch über ein zweites Elongase-

System verfügen, das beim Ausfall des Gens YBR159w das Überleben der Zelle sichert, fällt

bei dem geschilderten in vitro Test bei Verwendung eines ∆ybr159-Mutantenextraktes als

Enzymquelle die Verlängerungsreaktion komplett aus (Abb. 21B).

Page 57: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 43

0

400

800

0 10 20 30 40 50 60

Zeit [min]

Mal

onyl

-CoA

Ein

bau

X[c

pm]

A

0

200

400

0 10 20 30 40 50 60

Zeit [min]

Mal

onyl

-CoA

Ein

bau

X

[cpm

]

X

Y

B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

Zeit [min]

Abs

orpt

ion

[A25

4]

18:0 20:022:0

24:0 26:0

C

Abb. 21: Reaktionsprodukte des Enzymsystems Elongase bei Verwendung von Membranpräparationen

aus Wildtyp- (A) und ∆ybr159w-Mutanten-Zellen (B) nach p-Bromphenacylierung und Auftrennung

mittels Radio-HPLC.

Um eine Interferenz mit der zellulären FAS-Aktivität auszuschalten, wurden die Reaktionen in Gegenwart des

FAS-Inhibitors Cerulenin durchgeführt. Als Startsubstrat diente Stearoyl-CoA. Einzelheiten des Tests sind in

Material und Methoden aufgeführt. In C sind die p-bromphenacylierten Standard-Fettsäureester abgebildet.

Page 58: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 44

Sowohl die Ähnlichkeit der YBR159w-kodierten Proteinsequenz mit bekannten Keto-

Reduktase-Sequenzen als auch verschiedene Kontrollexperimente von Heidi Rössler und

Christoph Rieck in unserem Arbeitskreis hatten nahe gelegt, dass das Gen YBR159w für eine

Ketoreduktase-Aktivität kodiert [RÖS]. Demnach sollte mit Stearoyl-CoA als Starter der

Elongationsprozess nach der ersten Kondensation mit Malonyl-CoA und der Bildung von β-

Ketoeicosansäure blockiert werden. Tatsächlich werden in Abb. 21B anstelle der vier mit dem

Wildtyp-Enzym beobachteten überlangen Fettsäuren zwei kürzerkettige Reaktionsprodukte

von zunächst unbekannter chemischer Struktur nachgewiesen. In dieser Arbeit sollte durch

Synthese möglicher Reaktions-Zwischenprodukte als Referenzen die Identität dieser Produkte

ermittelt werden.

2.2.2 Identifizierung der mit einer Membranfraktion der Mutante ∆ybr159w

gebildeten Elongaseprodukte

Beim Enzymtest mit einer Elongase-haltigen Membranfraktion werden langkettige Acyl-CoA

Starter in Gegenwart von NADPH, [2]-14C-Malonyl-CoA zu überlangen Fettsäuren

verlängert. Die radioaktiv markierten Produkte werden nach der Synthese durch saure

Totalhydrolyse freigesetzt, mit Petrolether extrahiert und anschließend zu p-

Bromphenacylestern derivatisiert (vgl. Abb. 22). Diese können durch „Reversed Phase“

HPLC aufgetrennt und im Radio-Flußzellendetektor detektiert werden. Die vor der Hydrolyse

zugesetzten, nicht radioaktiven Standard-Fettsäuren können durch einen UV-

Flußzellendetektor erfasst werden.

Br C

O

CH2 Br R'3N R'3NH+Br+ + +Br C

O

CH2OOCRRCOOH

Abb. 22: Derivatisierung von Fettsäuren zu p-Bromphenacylestern.

Nachdem im Reaktionsansatz mit dem Startsubstrat Stearoyl-CoA und einer

Membranfraktion der ∆ybr159w-Mutante zwei nicht identifizierbare Verbindungen

entstanden waren, die im Wildtyp-Ansatz nicht auftraten und aufgrund ihres Laufverhaltens

keine verlängerten Fettsäuren sein konnten (Abb. 21B), musste es sich hierbei um

Zwischenprodukte der Stearinsäure-Elongation handeln. Bei Vorliegen eines Ketoacyl-

Page 59: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 45

Reduktase-Defektes in der Mutante kamen in Anbetracht des bekannten Syntheseweges von

Fettsäuren vor allem die in Abb. 23 gezeigten Substanzen 1 und 2 in Frage.

COOHH23C11

HOOC COOH+

H23C11

COOH

O

H23C11

O

CO2

Kondensation

Ketoreduktion YBR159w

H23C11

COOH

OH

Dehydratation

3

1 2

H23C11

COOH4

CO2

Abb. 23: Elongation von Stearoyl-CoA in der Mutante ∆ybr169w und mögliche Reaktionsprodukte.

Die Säuren sind der Übersichtlichkeit halber als freie Säuren und nicht als CoA-Derivate dargestellt.

Nach der Kondensation von Stearoyl-CoA mit Malonyl-CoA sollte in der Mutante ∆ybr159w

die anschließende Reduktion der gebildeten 3-Ketoeicosansäure (Verbindung 1) blockiert

sein. Durch evtl. unspezifische im Ansatz enthaltene Reduktase(n) könnte trotzdem in

geringem Umfang die Weiterreaktion zu der Verbindungen 3 stattfinden, was anschließend

wiederum die Bildung von 4 ermöglichen könnte. Die Reduktion von Verbindung 4 zur

gesättigten 20:0 Fettsäure findet gemäß Abb. 21B nicht statt. Eine unspezifische Reduktion

der gebildeten Ketosäure erschien möglich, da dem Ansatz die übliche Menge NADPH als

Reduktionsmittel zugesetzt worden war. Auf jeden Fall könnte unter den Bedingungen der

Page 60: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 46

Aufarbeitung des Reaktionsansatzes aber auch eine Decarboxylierung der 3-Ketosäure zum

entsprechenden Keton (Verbindung 2) stattfinden. Zur Überprüfung der in Abb. 23

skizzierten Reaktionen wurde daher in einem ersten Versuch dem Elongase-Testansatz der

Mutante ∆ybr159w kein NADPH zugesetzt. Als Folge davon verschwand die Verbindung X

in Abb. 21 aus dem Produktgemisch (vgl. Abb 28A). Demnach hatte es sich hier

möglicherweise um eine der beiden Verbindungen 3 oder 4 in Abb. 23 gehandelt. Die

verbliebene Verbindung sollte daher entweder die derivatisierte β-Ketosäure (Verbindung 1 in

Abb. 23) oder das daraus abgeleitete Keton (Verbindung 2 in Abb. 23) sein.

Theoretisch wäre es auch denkbar, dass die primär gebildete 3-Ketosäure eine weitere

Kondensationsreaktion mit Malonyl-CoA zu einer 3,5-Diketosäure (Verbindung 5 in Abb. 24)

eingegangen war und sich auch daraus wieder durch Decarboxylierung das entsprechende

Diketon gebildet hatte (Verbindung 6 in Abb. 24)

C17H35

O O

C17H35

O O O

C17H35

O O

Malonyl-CoA

CO2

5

6

Abb. 24: Bildung von Diketiden durch aufeinander folgende Kondensation von Stearoyl-CoA mit 2

Molekülen Malonyl-CoA.

Zur Farbgebung vgl. Abb. 22.

Um diesen verschiedenen denkbaren Reaktions-Möglichkeiten nachzugehen, wurde der 3-

Oxoeicosansäuremethylester synthetisch hergestellt und bei der Analyse der ∆ybr159w

Elongationsprodukte als Referenzsubstanz eingesetzt.

3-Oxoeicosansäuremethylester [MIL] wurde, wie im Detail in Material und Methoden

beschrieben, mit Hilfe der Acetessigesterreaktion gemäß Abb. 25 hergestellt. Dazu wurde

zunächst aus Stearinsäure das Stearoylchlorid hergestellt und dieses mit Acetessigester und

Page 61: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 47

Natrium in Benzol umgesetzt. Anschließend wurde das Acetessigester-Addukt mit

Natriummethanolat zerlegt und nach Ansäuern der entstandene 3-Oxoeicosansäuremethylester

mit Petrolether extrahiert, gewaschen und mehrfach in Petrolether umkristallisiert.

C

O

OHH31C15SO2, HCl

SOCl2C

O

ClH31C15

CH

O CH3

O

OH CH3

H2

(Na/Benzol) OCH3

HC

O CH3

O

Na+

C

O

H31C15 CH

O CH3

O

OCH3

NaCl

H3CO-

Na+

C

O

H31C15 CH

O

OCH3

-Na

+

Na+H

+

H3CC

O

OCH3

C

O

H31C15

O

OCH3

-

1/2

Abb. 25: Syntheseweg des 3-Oxoeicosansäuremethylesters gemäß Milton et al. [MIL].

Abb. 26: FAB-Massenspektrum des 3-Oxoeicosansäuremethylesters.

Das Signal bei 341m/z entspricht dem erwarteten [M+1]-Signal des 3-Oxoeicosansäure-methylesters.

Page 62: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 48

Abb. 27: 1H-NMR Spektrum des 3-Oxoeicosansäuremethylesters.

Interpretation der Signale: 0.88 (t, -CH3), 1.23 (m, -(CH2)16-), 1.56 (m, -CH2-CH2-CO-), 2.15 (t, -CH2-CO-, E-

Enolform), 2.32 (t, -CH2-CO-, Z-Enolform), 2.50 (t, -CH2-CO-, Ketoform), 3.42 (s, -CO-CH2-CO-, Ketoform),

3.70 (s, -COH=CH-COO-, Z-Enolform), 3.71 (s, -OCH3), 4.96 (s, -COH=CH-COO-, E-Enolform).

Das Produkt entstand mit einer Gesamtausbeute von 83%. Die Identität des 3-

Oxoeicosansäuremethylester wurde anschließend durch Massenspektrometrie (Abb. 26) und

FAB-1H-NMR (Abb. 27) verifiziert.

Der 3-Oxoeicosansäuremethylester wurde vor der Totalhydrolyse des Reaktionsansatzes der

Elongationsreaktion dem Ansatz zugesetzt um zu gewährleisten, dass die Referenzsubstanz

denselben Bedingungen ausgesetzt ist wie die Produkte der Elongationsreaktion. Somit

durchlaufen beide, Reaktionsprodukte und zugesetzter Standard, dieselben Reaktionsfolgen

von Esterhydrolyse und p-Bromphenacylierung. Abb. 28 zeigt zum einen, dass der

synthetische 3-Oxoeicosansäuremethylester-Standard nach Durchlaufen des Elongase

Reaktions- und Aufarbeitungsprozesses im HPLC-Chromatogramm aus einem Hauptsignal

(Signal S1) und einer Schulter (Signal S2) besteht und zum anderen, dass beide Substanzen

ein geringfügig zu längeren Laufzeiten hin verschobenes Laufverhalten im Vergleich zu dem

von der Mutante synthetisierten Produkt (Signal Y) aufweisen.

Page 63: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 49

0

200

400

0 10 20 30 40 50 60

Zeit [min]

Mal

onyl

-CoA

Ein

bau

X

[cpm

]Y

A

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30 40 50 60

Zeit [min]

Abs

orpt

ion

[A25

4]

S1

S2

B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

Zeit [min]

Abs

orpt

ion

[A25

4]

18:0 20:022:0

24:0 26:0

C

Abb. 28: Vergleichende RP-HPLC Analyse der von der Mutante ∆ybr159w synthetisierten

Zwischenprodukte mit dem synthetischen 3-Oxoeicosansäuremethylester.

In A ist das von der Mutante mit Stearoyl-CoA und Malonyl-CoA, aber ohne Reduktionsmittel (NADPH)

gebildete Elongationsprodukt gezeigt. In B ist das Laufverhalten von entsprechend derivatisiertem (p-

bromphenacyliertem) 3-Oxoeicosansäuremethylester gezeigt. In C sind die p-bromphenacylierten Standard-

Fettsäureester abgebildet.

Page 64: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 50

Die Tatsache, dass das von der Mutante ∆ybr159w gebildete Intermediat (Abb. 28A) in

beträchtlichem Umfang durch NADPH reduziert wurde (vgl. Abb. 28A und Abb. 21B) spricht

dafür, dass es sich um eine Ketoverbindung handelte. Da das Intermediat jedoch ein

unterschiedliches Chromatographie-Verhalten wie der synthetische Standard aufweist, kann

es sich bei dem Intermediat nicht um die 3-Oxoeicosansäure handeln. Es erscheint daher

wahrscheinlich, dass die zunächst entstandene, instabile β-Ketosäure aufgrund einer

fehlenden Ketoreduktase-Aktivität frei in der Lösung vorliegt und daher spontan zu einem

Methylketon decarboxyliert. In Gegenwart von NADPH kann anschließend das Methylketon

durch unspezifische Ketoreduktase-Aktivitäten zwar reduziert werden, eine weitere

Umsetzung durch Fettsäueelongasen wäre jedoch nicht möglich, da der entstehende Alkohol

über keine Carboxylgruppe mehr verfügt. Aus demselben Grund ist die p-

Bromphenacylierung des Ketons und damit der Nachweis der nicht-radioaktiven

Refereanzsubstanz im UV-Detektor nicht möglich. Die in Abb. 23 skizzierte Reaktionsweise

gilt daher als wahrscheinlich, konnte von mir aber nicht definitiv bewiesen werden.

2.2.3 FAS-freie Membranfraktionen

Versuche von Heidi Rössler und Christoph Rieck in unserem Labor hatten gezeigt, dass ein

Zellextrakt der Mutante ∆ybr159w zwar in vitro keine überlangen Fettsäuren mehr

synthetisiert, dass die Mutante jedoch in vivo diese Fähigkeit zur VLCFA-Synthese nicht

vollständig, sondern nur zu einem Teil eingebüßt hat. Dieser Befund sprach dafür, dass es in

Hefe noch ein zweites Enzymsystem gibt, welches zur Fettsäure-Elongation in der Lage ist.

Ein weiterer Befund war, dass die normalerweise durch externe Fettsäuren kompensierbare

Wachstums-Hemmung durch Cerulenin bei der Mutante ∆ybr159w zu einer durch externe

Fettsäuren nicht kompensierbaren Letalität führte. Einziger bisher bekannter Angriffspunkt

von Cerulenin in Hefezellen ist die Fettsäuresynthase. Eine mögliche Erklärung für die

geschilderten Befunde bestand somit darin, dass die Fettsäuresynthase in Hefe neben ihrer

eigentlichen Funktion der de novo Biosynthese von Palmitinsäure und Stearinsäure eventuell

auch noch in gewissem Umfang zur Verlängerung von Stearinsäure (18:0) zu Cerotinsäure

(26:0) in der Lage ist. Man könnte sich vorstellen, dass diese Nebenreaktion von einer

kleinen, Membran-gebundenen Subpopulation der in der Zelle vorhandenen FAS-Moleküle

durchgeführt wird. Der einfachste Versuch, die o.g. Hypothese zu bestätigen wäre der

Nachweis, dass erst mit einer ∆ybr159w/∆fas-Doppelmutation die Zelle die Fähigkeit zur

Fettsäure-Elongation völlig verliert. Dieser Versuch lässt sich jedoch in der Praxis nicht

Page 65: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 51

durchführen, da die genannte Doppelmutation offenbar letal ist. Alle Versuche, eine solche

Doppelmutation entweder durch gezielte in vitro Mutagenese oder durch klassische

Kreuzungsexperimente herzustellen, waren bisher erfolglos geblieben (Christoph Rieck,

unveröffentlichte Daten). Auch wenn diese Tatsache bereits ein gutes Indiz für die Richtigkeit

der obigen Annahme war, so sollte doch versucht werden, weitere und mehr direkte

experimentelle Beweise für die Beteiligung von FAS an der VLCFA-Synthese zu finden. In

der vorliegenden Arbeit wurde dies zunächst damit versucht, die Existenz einer fest in der

Membran verankerten FAS-Fraktion nachzuweisen. Die Bestimmung des Produktmusters und

der enzymatischen Aktivität dieser membrangebundenen FAS-Fraktion sollte dann

anschließend untersucht werden.

Fettsäuresynthase ist normalerweise ein lösliches, im Cytoplasma enthaltenes Enzym. Zur

Darstellung einer möglicherweise Membran-gebundenen FAS-Fraktion wurde die

Membranfraktion aus dem Zellextrakt von Wildtyp-Hefe durch differentielle Zentrifugation

isoliert. Das Sediment wurde mit Aufschlusspuffer insgesamt sechsmal gewaschen. In einem

Parallel-Versuch wurden die Membranen in entsprechender Weise mit einem

Aufschlusspuffer gewaschen, der einen 1%igen Zusatz des Detergents Triton X-100 enthielt.

Nach jedem Waschschritt wurde mittels Western-Blot-Analyse die jeweils abgelöste und die

mit der Membranfraktion verbunden gebliebenen FAS visualisiert. Aus Abb. 29 wird

deutlich, dass bei der Zentrifugation des Rohextraktes, wie erwartet, der größte Teil des FAS-

Komplexes im Überstand blieb. Auch nach dem ersten Waschen des Niederschlags konnte

noch eine beträchtliche Menge (ca. 50%) des zunächst Membran-gebundenen FAS-

Komplexes solubilisiert werden. Bereits nach dem zweiten Waschgang war jedoch nur noch

sehr wenig lösliche FAS im Überstand. Danach blieb der Anteil Membran-gebundener FAS

offensichtlich konstant und kein weiteres Enzym wurde mehr von der Membran abgelöst.

Auch der Zusatz des Detergents Triton X-100 hatte keinen Einfluss auf die Löslichkeit dieser

Membran-gebundenen FAS-Fraktion. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Hefe-FAS nicht

nur im Cytoplasma gelöst, sondern auch in einer fest an die Zellmembran gebundenen Form

vorkommt. Daraus ergibt sich die Frage, ob diese Membran-gebundene FAS-Fraktion evtl.

eine spezielle, von der de novo Biosynthese abweichende Funktion hat.

Page 66: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 52

FAS-

Stan

dard

RE

Ü N

1

Ü1 N1

2

Ü2 N2

3

Ü3 N3

4

Ü4 N4

5

Ü5 N5

6

Ü6 N6

A

B

Abb. 29: Nachweis von Membran-gebundener Fettsäuresynthase in einer gereinigten Zellmembran-

Fraktion aus Hefe.

Insgesamt wurden 5 g Wildtyphefe (BY4742) in 5 ml Aufschlusspuffer (50 mM Tris·HCl pH 7,4, 300 mM

Saccharose, 0,1 mM EDTA) suspendiert und durch Schütteln mit 5 g Glasperlen aufgeschlossen. Grobe

Zelltrümmer wurden durch kurze Zentrifugation (5 min bei 5000 g) getrennt. Anschließend wurde der Überstand

(Rohextrakt, RE) zur Auftrennung in partikuläre (N) und lösliche (Ü) Fraktion 30 min bei 20.000 g zentrifugiert.

Der dabei erhaltene Niederschlag wurde mit 5 ml Waschpuffer (50 mM Tris·HCl pH 7,4, 0,1 mM EDTA) einmal

ohne (A) und einmal mit (B) Zusatz von Triton X-100 gewaschen und wieder sedimentiert. Dieser Waschschritt

wurde, mit zwischengeschalteter Zentrifugation (30 min bei 20000 g), mehrfach wiederholt. Die Zahlen in der

Abbildung geben die verschiedenen aufeinander folgenden Waschschritte an. Nach jeder Zentrifugation wurde

mit spezifischem FAS-Antiserum eine Western-Blot-Analyse sowohl des Überstands (Ü) als auch des

Niederschlags (N) durchgeführt. Dazu wurde, mit Ausnahme des Rohextraktes (RE), jeweils ein gleiches

Volumen (5 µl) der verschiedenen Proben eingesetzt. Vom Rohextrakt wurde 1 µl eingesetzt.

Zur Klärung dieser Frage wurde zunächst die Aktivität der Membran-gebundenen FAS durch

den Einbau von radioaktiv markiertem [2]-14C-Malonyl-CoA in Fettsäuren untersucht. Abb.

30 zeigt, dass die FAS-Aktivität im Überstand des ersten Waschsschrittes sehr hoch ist. Die

Gesamt-FAS Aktivität des Niederschlags (Membranfraktion) ist dagegen relativ niedrig. Da

bei jedem Waschschritt der Niederschlag wieder in dem gleichen Volumen (5 ml) frischen

Puffers suspendiert wurde, sollte die Summe der Messwerte Nn und Ün dem Wert Nn-1

entsprechen. Wie Tab. 10 zeigt, ist dies auch im Rahmen der Messgenauigkeit in guter

Näherung der Fall.

Page 67: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 53

Tab. 10: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in langkettige Fettsäuren mit Acetyl-CoA als Startsubstrat durch

die löslichen (Überstand) und die partikulären (Niederschlag) FAS Fraktionen der in Abb. 29

dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe.

Einzelheiten der Testdurchführung vgl. Material und Methoden. Die aufgelisteten Messwerte wurden durch

Subtraktion eines Blindwertes (Ansatz ohne NADPH) korrigiert.

FAS-Aktivität

Waschschritt Überstand [cpm] Niederschlag [cpm]

Überstand +

Niederschlag [cpm]

Rohextrakt 14620 (±7,1%)

1 13354 (±7,2%) . 1329 (±7,6%) . 14683

2 1372 (±7,3%) . 201 (±8,9%) . 1572

3 248 (±6,6%) . 38 (±13 %) . 286

4 38 (±16% ) . 30 (±11 %) . 68

5 13 (±26% ) . 28 (±15 %) . 41

6 29 (±29% ) . 43 (±13 %) . 72

0

100

200

300

400

500

1 2 3 4 5 6

Waschschritt

Einb

au v

on M

alon

yl-C

oA in

Fet

tsäu

ren

[cpm

/µl]

Abb. 30: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in Fettsäuren mit Acetyl-CoA als Startsubstrat durch die löslichen

(Ü, gelb) und die partikulären (N, braun) FAS Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten

Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe.

Es wurden jeweils identische Volumina (30 µl) für einen radiometrischen FAS-Test eingesetzt (vgl. Material

und Methoden). Die Nummerierung der Waschschritte in Abb. 29 und Abb. 30 ist dieselbe.

Page 68: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 54

Aus dem Vergleich von Abb. 29 und Tab. 10 lässt sich schließen, dass die Membran-

gebundene FAS mit Acetyl-CoA als Starter keinen messbaren Einbau von Malonyl-CoA in

langkettige Fettsäuren durchführt und somit ihre eigentlichen FAS-Funktion – die Synthese

von Palmitinsäure und Stearinsäure aus Acetyl-CoA und Malonyl-CoA – nicht mehr

durchführt. Dies könnte bedeuten, dass die membrangebundene FAS-Subpopulation

tatsächlich eine von der löslichen FAS abweichende Funktion besitzt. Daher wurde als

nächstes die Elongase-Aktivität von membrangebundener FAS anhand des Einbaus von

radioaktivem [2]-14C-Malonyl-CoA in Stearoyl-CoA in Abwesenheit von Cerulenin

untersucht. Auch diese Versuche wurden systematisch mit den Membranfraktionen (N)

verschiedener, aufeinander folgender Waschschritte durchgeführt. Tab. 11 zeigt, dass nach

der Zentrifugation des Rohextraktes die Elongase-Aktivität im Niederschlag um den Faktor

13 höher war als im Überstand. Die Aktivität des Niederschlags ging jedoch durch weiteres

Waschen verloren und war bereits nach dem dritten Reinigungsschritt kaum noch

nachweisbar (s. Abb. 31).

Tab. 11: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in überlange Fettsäuren (in Abwesenheit von Cerulenin) mit

Stearoyl-CoA als Startsubstrat durch die löslichen (Überstand) und die partikulären (Niederschlag)

Fraktionen der in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe.

Einzelheiten der Testdurchführung vgl. Material und Methoden. Die aufgelisteten Messwerte wurden durch

Subtraktion eines Blindwertes (Ansatz ohne NADPH) korrigiert.

C18-CoA Elongase-Aktivität

Waschschritt Überstand [cpm] Niederschlag [cpm]

Überstand +

Niederschlag [cpm]

Rohextrakt 1147 (±6,5%)

1 101 (±13 %) . 1359 (±7,2%) . 1460

2 33 (±18 %) . 261 (±23 %) . 294

3 39 (±19 %) . 72 (±29 %) . 111

4 32 (±20 % ) . 22 (±30 %) . 53

5 36 (±25 % ) . 60 (±29 %) . 96

6 42 (±22 % ) . 33 (±29 %) . 75

Page 69: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 55

0

10

20

30

40

50

1 2 3 4 5 6

Waschschritt

Einb

au v

on M

alon

yl-C

oA

in V

LCFA

[cpm

/µl]

X

Abb. 31: Einbau von 14C-Malonyl-CoA in überlange Fettsäuren (in Abwesenheit von Cerulenin) mit

Stearoyl-CoA als Startsubstrat durch die lösliche (Ü, gelb) und die partikuläre (N, braun) Fraktionen der

in Abb. 29 dargestellten Zellfraktionierungen von Wildtyp Hefe.

Es wurden jeweils identische Volumina (30 µl) für den radiometrischen Elongase-Test (in Abwesenheit von

Cerulenin) mit Stearoyl-CoA als Startsubstrat eingesetzt (vgl. Material und Methoden). Die Nummerierung der

Waschschritte in Abb. 29 und Abb. 31 ist dieselbe.

Diese Abnahme ist erstaunlich, weil die Membran-gebundene Elongase durch die

Waschschritte eigentlich nicht entfernt werden sollte und man daher eine persistierende,

vergleichbar hohe und konstant bleibende Elongase-Aktivität in allen Membranfraktionen

erwartet hätte. Da dies jedoch nicht der Fall war, könnte das Ergebnis der in Abb. 31

gezeigten Versuchsreihe dafür sprechen, dass ein für die Elongase-Reaktion notwendiger

Cofaktor bei der Waschprozedur mehr und mehr von den Membranen abgelöst wurde. Trotz

der Verwendung von Stearoyl-CoA als Startsubstrat bleibt es jedoch auf Grund der

Abwesenheit von Cerulenin im Testansatz von Abb. 31 möglich, dass aufgrund der

Decaboxylierung von Malonyl-CoA zu Acetyl-CoA auch eine Acetyl-CoA abhängige FAS-

Aktivität an der Malonyl-CoA Inkorporation der verschiedenen Ansätze dieses Versuchs

beteiligt war. In diesem Fall wäre die abnehmende Malonyl-CoA Inkorporationsrate die Folge

eines zunächst hohen und dann zunehmend von den Membranen abgewaschenen Anteils an

FAS-Protein. Die schließlich verbleibende Restaktivität – und nicht die zunächst hohe

Aktivität von Fraktion 1 – würde dann die tatsächliche mit der Membran assoziierte

Page 70: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 56

Elongase-Aktivität darstellen. Auf Grund der geringen Enzymaktivität war es leider nicht

möglich, eine Produktanalyse der Elongasereaktion der gewaschenen Membranen

durchzuführen und damit die erwähnten Fragen zu klären. Die Beteiligung der

Fettsäuresynthase an der Bildung überlanger Fettsäuren erscheint somit auf Grund der

geschilderten Befunde weiterhin denkbar, kann aber mit ihnen nicht eindeutig bewiesen

werden.

Page 71: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 57

2.3 Drosselung der FAS-Aktivität in vivo und die physiologischen

Folgen dieser Inaktivierung

2.3.1 Hintergrund

Die Hauptaufgabe der Fettsäuresynthase in allen Organismen liegt zunächst darin, den Bedarf

der Zelle an Fettsäuren für die Membranbiosynthese zu decken. Außer zur Synthese von

Phospholipiden wird zelluläres Fettacyl-CoA aber auch zur Synthese von Triacylglycerid-

Speicherfetten, zur Acylierung bestimmter Membranproteine und, in Eukaryonten, auch zur

Synthese von Sphingolipiden benötigt (vgl. Abb. 7). Die meisten dieser Reaktionen sind für

das Überleben der Zelle unentbehrlich. Der FAS-Komplex der Hefe ist in der Lage, gesättigte

Fettsäuren bis zu einer Länge von 20 Kohlenstoffatomen zu bilden. Ein Ausfall der Fettsäure-

Biosynthese, sei es durch FAS-Hemmung oder Mutation, führt dazu, dass alle Fettsäure-

bedürftigen Reaktionen der Zelle nicht mehr ausgeführt werden können. Durch Aufnahme

externer langkettiger Fettsäuren kann allerdings in den meisten Fällen das Fehlen ihrer

zellulären Biosynthese ausgeglichen werden. Ziel der im Folgenden geschilderten Versuche

war es, Hefezellen mit reduzierter FAS-Aktivität herzustellen bzw. Hefe-Mutanten mit einem

erniedrigten Fettacyl-CoA Spiegel zu isolieren. Mit diesen Mutanten sollten dann die aus dem

Absinken des Acyl-CoA Spiegels resultierenden Auswirkungen auf die verschiedenen

Fettacylierungsreaktionen und auf die Zellphysiologie als ganzes untersucht werden.

2.3.2 Drosseln der FAS-Aktivität durch kontrollierten Zusatz von Cerulenin zu

intakten Zellen

In dieser Versuchsreihe sollte untersucht werden, inwieweit die FAS-Aktivität in vivo durch

Zugabe von Cerulenin kontrolliert gedrosselt werden kann. Dazu wurde die

Wachstumskinetik von Wildtyp Hefe (BY4742) in Gegenwart verschiedener

Ceruleninkonzentrationen verfolgt.

Page 72: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 58

0

1

2

3

4

-4 1 6 11 16

Zeit [h]

Zelld

icht

e [A

600]

X 0µM2µM4µM6µM8µM10µMCerulenin

Abb. 32: Wachstumskinetik von Wildtyp Hefe in Gegenwart unterschiedlicher Ceruleninkonzentrationen.

Die Zellen wurden zunächst bis zu einer Zelldichte (A600) von 1,0 in YPD-Medium wachsen gelassen.

Anschließend wurde die Kultur in 6 gleiche Ansätze aufgeteilt und jeder Ansatz mit frischem YPD-Medium

10fach verdünnt (Zeitpunkt -4 h). Nach 4 h Anwachsen bei 30°C wurden zu den Ansätzen die in der Abb.

angegebenen unterschiedlichen Mengen Cerulenin zugegeben und weiter bei 30°C inkubiert.

Aus Abb. 32 wird deutlich, dass das Zellwachstum unter den hier angewandten Bedingungen

durch 2 mM Cerulenin nicht erkennbar, durch 4 mM Cerulenin schwach, durch 6 mM

Cerulenin deutlich und durch ≥ 8 mM Cerulenin vollständig gehemmt wurde.

Um den physiologischen Status der Cerulenin-gehemmten Zellen festzustellen, d.h. um zu

klären, ob Cerulenin den Stoffwechsel nur reversibel verlangsamt oder ob es die Zellen

irreversibel abtötet, wurde der Anteil lebender Zellen in drei Kulturen mit unterschiedlichem

Cerulenin-Gehalt bestimmt.

Page 73: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 59

0

1

2

3

-4 -2 0 2 4 6

Zeit [h]

Zelld

icht

e [A

600]

x

0µM4µM10µM

Cerulenin

98%

98%

8%

0,4%

Abb. 33: Anteil lebender Zellen in mit und ohne Cerulenin gewachsenen Hefekulturen.

Die Zellen wurden zunächst bis zu einer Zelldichte (A600) von 1,0 in YPD-Medium wachsen gelassen.

Anschließend wurde die Kultur in 3 gleiche Ansätze aufgeteilt und jeder Ansatz mit frischem YPD-Medium

10fach verdünnt. Nach 4 h Anwachsen bei 30°C wurden zu den Ansätzen die in der Abb. angegebenen

unterschiedlichen Mengen Cerulenin zugegeben und weiter bei 30°C inkubiert. Zu den angegebenen

Zeitpunkten wurden den Kulturen Proben entnommen und in diesen mit einer Thoma-Zählkammer die

Gesamtzellenzahl und außerdem, nach geeigneter Verdünnung, der auf YPD-Agar auswachsende Anteil

lebender Zellen bestimmt.

Wie Abb. 33 zeigt, wurde eine Hefekultur zum Zeitpunkt Null in drei gleiche Teile geteilt,

zwei davon mit Cerulenin zu unterschiedlichen Endkonzentrationen versetzt und dann bei

30°C weiter wachsen gelassen. Das Zellwachstum wurde in regelmäßigen Zeitintervallen

verfolgt und nach 7 h mit allen 3 Kulturen eine Lebendzellzahl-Bestimmung durchgeführt.

Dabei ergab sich, dass die Cerulenin-freie Kultur nach 7 h Wachstum noch 98% lebende

Zellen, die Kultur mit 4 mM Cerulenin noch 8% und die mit 12 mM Cerulenin nur noch 0,4%

lebende Zellen enthielt. Die Bildung Cerulenin-resistenter Zellen wurde durch Überprüfung

des Phänotyps der auf YPD ausgestrichenen Zellen mittels Überstempeln auf Cerulenin-

haltige YPD Agarplatten ausgeschlossen (nicht gezeigt).

Der Wachstums-reduzierende Effekt subletaler Dosen von Cerulenin auf Hefekulturen scheint

somit auf der Abtötung eines Teils der Kultur und weniger auf einer Beeinflussung der

Teilungsrate der einzelnen Zelle zu beruhen. Dieser „Alles oder Nichts“-Effekt des

Page 74: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 60

Hemmstoffs auf die Zelle erscheint plausibel, wenn man bedenkt, dass Cerulenin im

Vergleich zur zellulären FAS-Konzentration in hohem molaren Überschuss vorliegt und

letztlich irreversibel an die Fettsäuresynthase bindet. Bei genügend langer Einwirkungszeit

reagieren selbst bei niedriger Cerulenin-Konzentration letztlich alle FAS-Moleküle der Zelle

mit dem Hemmstoff und die Zelle stirbt ab. Eine zeitliche Balance zwischen FAS-Hemmung,

FAS-Resynthese und Zellteilung könnte theoretisch zwar zu einer Hefekultur mit partiell

inaktivierter FAS-Population führen, geeignete Bedingungen sind jedoch in der Praxis kaum

beherrschbar und führen auch alsbald zum Auftreten und Überhandnehmen Cerulenin-

resistenter Mutanten. Es wurde daher ein anderer Weg eingeschlagen, um die zelluläre

Fettsäurebiosynthese kontrolliert zu drosseln.

2.3.3 Isolierung von Hefe-Mutanten mit reduzierter FAS-Aktivität

Auf der Suche nach Zellen mit reduzierter FAS-Aktivität sollten als nächstes FAS-Mutanten

isoliert werden, die in Abwesenheit von Fettsäuren langsamer wachsen als Wildtyp Hefe. Um

sicherzugehen, dass das langsame Wachstum nicht auf FAS-unabhängigen Mutationen

beruht, sollten diese Mutanten nur in Abwesenheit von Fettsäuren langsam wachsen, in

Gegenwart extern zugesetzter Fettsäuren jedoch wieder normal wachsen. Die genannten

Mutanten wären somit „leaky“ und enthielten eine Fettsäuresynthase, die nicht vollständig

inaktiv wäre, sondern eine für langsames Wachstum noch ausreichende Fettsäurebiosynthese-

Rate aufwiese. Das langsamere Wachstum wäre damit eine durch verringerte FAS-Aktivität

und die dadurch abgesenkte Verfügbarkeit an langkettigem Acyl-CoA in der Zelle bedingt.

Um derartige Mutanten zu finden, wurde neben einer von mir selbst durchgeführten EMS-

Mutagenese auch auf die bereits existierende, umfangreiche Sammlung von fas-Mutanten am

hiesigen Lehrstuhl zurückgegriffen.

2.3.3.1 Charakterisierung von FAS-Mutanten mit verringertem Wachstum auf

Fettsäure-freiem Medium

Bei der vergleichenden, semi-quantitativen Analyse des Wachstumsverhaltens von ca. 2000

verschiedenen S. cerevisiae Mutanten auf einerseits Fettsäure-freiem und andererseits

Fettsäure-haltigem YPD-Vollmedium wurden 6 Stämme identifiziert, die den ins Auge

gefassten Phänotyp aufwiesen. Das Wachstum der Mutanten auf den beiden Medien ist in

Abb. 34 dokumentiert.

Page 75: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 61

YPD+FS

YPD

WT fas1-268 fas2-385 fas2-438 fas2-469 fas-644 fas-1095

Abb. 34: Wachstum verschiedener fas-Mutanten und des Wildtyps auf Fettsäure-haltigem (YPD+FS) und

Fettsäure-freiem (YPD) Vollmedium.

Die einzelnen Stämme wurden zunächst auf YPD+FS Vollmedium 3 Tage bei 30°C anwachsen gelassen. Von

den gut gewachsenen Kulturen wurde dann eine Zahnstocherspitze voll Zellen entnommen und in sterilem

Wasser suspendiert. Aus dieser Suspension wurden je 5 µl Tropfen mit einer sterilen Pipette auf YPD und auf

YPD+FS Agar aufgetropft. Nach 3 Tagen Inkubation bei 30°C wurde das Zellwachstum dokumentiert.

Um das geänderte Wachstumsverhalten der Mutanten quantitativ besser erfassen zu können,

wurden anschließend mit den ausgewählten Stämmen Wachstumskinetiken in Fettsäure-freien

und Fettsäure-haltigen Flüssigmedien aufgenommen. Aus Abb. 35A wird deutlich, dass alle

Stämme in Fettsäure-haltigem YPD+FS-Medium gut wuchsen. Lediglich die maximal

erreichte Zelldichte unterschied sich von Stamm zu Stamm, was wahrscheinlich auf FAS-

unabhängige Eigenarten der einzelnen Stämme zurückzuführen war. Im Gegensatz dazu

wuchsen in Abwesenheit von Fettsäuren 4 der 6 untersuchten Mutanten so langsam, dass eine

Zunahme der Zelldichte im Beobachtungszeitraum (35h) nicht festgestellt wurde (vgl. Abb.

35B). Lediglich 2 Mutanten, fas2-469 und fas-1095 zeigten erkennbares Wachstum, das

jedoch deutlich langsamer war als das des Wildtyps. Bemerkenswerterweise war das

Wachstum der beiden Mutanten nicht nur durch eine im Vergleich zum Wildtyp geringere

Teilungsrate in der logarithmischen Phase, sondern auch durch eine niedrigere Zelldichte in

der stationären Phase gekennzeichnet. Ein Vergleich der Ergebnisse aus Abb. 34 und 35 ergab

die grundsätzliche Übereinstimmung des Wachstumsverhaltens der untersuchten Mutanten

auf Festmedium und in Flüssigmedium.

Page 76: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 62

0

1

2

3

4

5

6

7

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0

Zeit [h]

Zelld

icht

e [A

600]

X

A

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35

Zeit [h]

Zelld

icht

e [A

600]

X

469 644 268 1095 WT 385 438

B

Abb. 35: Wachstumskinetiken von Wildtyp-Hefe und verschiedenen fas-Mutanten in Fettsäure-haltigem

(A, YPD+FS) und Fettsäure-freiem (B, YPD) Medium.

Von den einzelnen Stämmen wurden zunächst Vorkulturen in YPD+FS Vollmedium für 12 h bei 30°C

angezüchtet. Proben der Vorulturen wurden dann mit sterilem Wasser auf eine Zelldichte von A600 = 0,1

verdünnt. Jeweils 10 ml der verdünnten Vorkulturen wurden abzentrifugiert und die sedimentierten Zellen erneut

mit 10 ml sterilem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden anschließend in 3,0 ml sterilem Wasser

resuspendiert und davon jeweils 1 ml in 200 ml Fettsäure-freies (A) bzw. Fettsäure-haltiges (B) Vollmedium

überführt und die beimpften Kulturen anschließend bei 30°C auf einem Schüttler wachsen gelassen.

Page 77: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 63

2.3.3.2 Bestimmung der FAS-Aktivität in fas-Mutanten mit verringertem

Wachstum auf Fettsäure-freiem Medium

Als nächstes sollte festgestellt werden, ob die reduzierten Wachstumsraten der in Abb. 35

untersuchten Mutanten mit entsprechend reduzierten zellulären FAS-Aktivitäten

einhergingen. Zur Untersuchung dieser Frage wurden zum einen die FAS-Enzyme einiger

Mutanten isoliert und die enzymatische Aktivität des gereinigten Enzymkomplexes im

optischen Test ermittelt. Zum anderen wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem die FAS-

Aktivität des Rohextraktes unmittelbar nach dem Zellaufschluss radiometrisch bestimmt

werden konnte. Dieses Verfahren hatte den Vorteil, dass nur eine geringe Menge Hefezellen

für den Test notwendig war und damit das zeitaufwendige und evtl. Denaturierungsvorgänge

begünstigende Reinigungsverfahren des FAS-Komplexes überflüssig wurde.

2.3.3.2.1 Optimierung des radiometrischen FAS-Tests

Um die FAS-Aktivität im Zellrohextrakt mit möglichst hoher Genauigkeit und

Empfindlichkeit bestimmen zu können, wurden in Vorversuchen die Bedingungen festgelegt,

unter denen der Einbau von [2]-14C-Malonyl-CoA in Fettsäuren zum einen möglichst hoch

und zum anderen immer noch proportional zur eingesetzten Enzymmenge und zur

Inkubationszeit war.

2.3.3.2.1.1 Optimierung der zum Radio-FAS-Test eingesetzten Proteinmenge

Hefezellen wurden durch Schütteln mit Glasperlen aufgeschlossen (s. Material und

Methoden). Die Protein-Konzentration im Zellextrakt wurde mit dem Bradford-Test

bestimmt. Anschließend wurden unterschiedliche Mengen des Zellextraktes zum

radiometrischen FAS-Test eingesetzt und unter ansonsten festgelegten Bedingungen der

Einbau von [2]-14C-Malonyl-CoA durchgeführt. Die Proben wurden nach dem Reaktionsstop

alkalisch hydrolysiert, dann angesäuert und die radioaktiv markierten Fettsäuren insgesamt

dreimal mit Petrolether ausgeschüttelt. Die Petrolether-Fraktionen wurden dreimal mit 1 M

Essigsäure gewaschen, im Stickstoffstrom eingeengt und im Scintillationszähler vermessen.

Page 78: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 64

0

5000

10000

15000

0 100 200 300 400 500

Zellextrakt [µg Protein]

Einb

au v

on M

alon

yl-C

oA

in la

ngke

ttige

Fet

tsäu

ren

[cpm

]

Abb. 36: Proteinabhängigkeit des Einbaus von [2]-14C-Malonyl-CoA in langkettige Fettsäuren.

Unterschiedliche Mengen des Rohextraktes (0, 50, 100, 250, 500 µg) von Wildtyp-Hefe (BY4742) wurden für

30 min bei 30°C in Gegenwart von 100 µl Cystein·HCl (0,1M), 100 µl KOH (0,1 M), 10 µl Glucose-6-Phosphat

(0,1 M), 20 µl NADP+ (10 mM), 10 µl Acetyl-Coenzym A (10 mM), 12,5 µl Glucose-6-Phosphat-

Dehydrogenase (0,8 mg/ml), 6 µl Malonyl-CoA (6 mM), 1,4 µl 14C-Malonyl-CoA (30000 cpm) und

Aufschlusspuffer (ad. 1000 µl, 50 mM Tris pH 7.3, 50 mM KCl, 1mM EDTA) inkubiert. Die Reaktion wurde

durch Zugabe von 2 ml methanolischer KOH (3 M) abgebrochen. Die Fettsäureester wurden für 5 h bei 95°C

hydrolysiert. Anschließend wurden die Proben mit Salzsäure (5 M) angesäuert. Die Fettsäuren wurden dreimal

mit Petrolether extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Essigsäure (1 M) gewaschen, im Luftstrom

eingeengt und im Scintillationszähler vermessen.

In Abb. 36 ist der Einbau von [2]-14C-Malonsäure in langkettige Fettsäuren in Abhängigkeit

von der eingesetzten Proteinmenge unter ansonsten gleich bleibenden Bedingungen

abgebildet. Man sieht, dass unter den gewählten Bedingungen der Malonsäure-Einbau bis zu

einer Proteinmenge von 100 µg direkt proportional zur eingesetzten Proteinmenge war. Daher

wurde für die weiteren Versuche eine Proteinmenge von 100 µg pro Ansatz festgelegt.

2.3.3.2.1.2 Festlegung der für den Radio-FAS-Test optimalen Reaktionszeit

Die optimale Reaktionszeit sollte im Interesse eines hohen Radioaktivitäts-Einbaus möglichst

lang, aber gleichzeitig noch so kurz sein, dass der Substratverbrauch während der Reaktion

die Substratsättigung des Enzyms nicht verringerte. Daher sollte im Untersuchungszeitraum

Page 79: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 65

auch der Einbau von [2]-14C-Malonsäure proportional zur Inkubationszeit sein. Entsprechend

dem vorhergehenden Versuch zur Ermittlung der optimalen Enzymmenge wurden hier die

Inkubationszeiten unter Konstanthaltung der übrigen Parameter variiert.

0

2000

4000

6000

8000

10000

0 10 20 30 40 50 60

Inkubationszeit [min]

Einb

au v

on M

alon

yl-C

oA

in la

ngke

ttige

Fet

tsäu

ren

[cpm

]

Abb. 37: Zeitabhängigkeit des Einbaus von [2]-14C-Malonyl-CoA in langkettige Fettsäuren.

100 µg Rohextrakt der Wildtyp-Hefe (BY4742) wurden unter den in Abb. 36 beschriebenen Bedingungen für die

angegebenen Zeiten bei 30°C inkubiert.

Abb. 37 zeigt, dass die Einbaurate bis zu einer Inkubationszeit von 30 min eine befriedigende

Linearität aufweist. Daher wurde für die weiteren Versuche eine Inkubationszeit von 30 min

festgelegt.

2.3.3.2.2 Messung der spezifischen Aktivität von gereinigter Fettsäuresynthase aus

den in Abb. 35 aufgeführten Mutanten

In einer ersten Versuchsreihe wurden der FAS-Komplex aus Wildtypzellen und aus den

Mutanten fas1-268, fas2-469 und fas-1095 entsprechend dem in Material und Methoden

beschriebenen Reinigungsprotokoll isoliert. Danach wurde die spezifische FAS-Aktivität der

gereinigten Enzyme mit Hilfe des üblichen optischen FAS-Tests bestimmt (Tab. 12). In einer

zweiten Versuchsreihe wurde die FAS-Aktivität nach dem Zellaufschluss direkt im

Rohextrakt mit dem radiometrischen Test bestimmt. Die dabei festgestellten und auf den

Page 80: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 66

Proteingehalt des Rohextraktes bezogenen Aktivitätswerte sind ebenfalls in Tab. 12

aufgeführt.

Tab. 12: Spezifische FAS-Aktivitäten des gereinigten FAS Komplexes (optischer Test) und des

Rohextraktes (radiometrischer Test) von Wildtyp Hefe und von verschiedenen Mutanten.

Einzelheiten der verwendeten Tests sind in Material und Methoden beschrieben. (n. gem. = nicht gemessen)

Enzym

FAS-Aktivitäten

Gereinigte FAS

[mU/mg]

Rohextrakt

[cpm/(min·mg)]

Wildtyp 1932 (100 %) 2173 (100 %)

fas1-268 29 (1,5 %) 1344 (61,8 %)

fas2-469 n. gem. 892 (41,0 %)

fas2-438 66 (3,4 %) 12 (0,6 %)

fas2-385 n. gem. 20 (0,9 %)

fas-644 n. gem. 108 (5,0%)

fas-1095 224 (11,6 %) 65 (3,0%)

Die spezifischen Aktivitäten der gereinigten Mutantenenzyme waren im Vergleich zum

Wildtypenzym alle sehr niedrig, was mit dem Wachstumsverhalten der Zellen in Fettsäure-

freiem Medium gut korrelierte. In Übereinstimmung mit ihrem deutlich messbaren,

schwachen Wachstum ohne Fettsäuren enthält die Mutante fas-469 ein FAS-Enzym, das noch

eine mittlere Restaktivität aufwies. Der relativ hohe Wert beim radiometrischen Test dieser

Mutante (ca. 42% des Wildtyps) stimmte somit mit dem vergleichsweise guten Restwachstum

der Mutanten in YPD-Medium überein. Anderseits zeigte die Mutante fas1-1095 in Abb. 35

ebenfalls ein schwaches, Fettsäure-unabhängiges Wachstum, enthielt aber ein FAS-Enzym

mit nur ca. 10% Restaktivität. Vergleicht man die Aktivitätswerte, die einmal mit dem

gereinigten Komplex und im anderen Fall mit dem Rohextrakt frisch aufgeschlossener Zellen

erhalten wurden miteinander, so beobachtet man bei der Mutante fas1-268 eine überraschende

Diskrepanz, was den prozentualen Abfall der FAS-Aktivität im Rohextrakt einerseits und

andererseits beim gereinigten Enzym betraf, beides Mal im Vergleich zu den entsprechenden

Werten des Wildtyps. Während bei den anderen untersuchten Mutanten die Aktivität von

Zellextrakt und gereinigtem Enzym auf prozentual vergleichbare Restwerte abgesunken

waren, war bei der Mutante fas1-268 die Aktivität der reinen FAS zwar auch auf den bei der

Mutante durchaus üblichen Wert von 1,5 Prozent der Aktivität von Wildtyp-FAS abgesunken,

Page 81: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 67

im Zellextrakt befanden sich jedoch noch über 60% der FAS-Aktivität von Wildtypzellen

(Tab. 12). Dieser hohe Wert stand im deutlichen Gegensatz zu der Tatsache, dass die Mutante

fas1-268 sich in ihrem Wachstumsverhalten (praktisch kein Wachstum auf Fettsäure-freiem

Medium) von den Mutanten ohne nennenswerte FAS-Aktivität nicht erkennbar unterschied

(vgl. Abb. 35).

Die einfachste Erklärung für die unterschiedlichen FAS-Aktivitäten der Mutante fas1-268 im

Rohextrakt und beim gereinigten Enzym bestand in der Annahme eines durch die Mutation

besonders labilisierten FAS-Proteins, das im Rohextrakt noch partiell aktiv war, diese

Aktivität jedoch während der Enzymreinigung durch zunehmende Denaturierung rasch verlor.

Diese Deutung sollte durch die im Folgenden beschriebenen Versuche untermauert werden.

2.3.3.3 Untersuchung an der Mutante fas1-268

2.3.3.3.1 Untersuchung der FAS-Aktivität der Mutante fas1-268 während der

Aufreinigung des FAS-Komplexes

Um die spezielle Labilität des FAS-Proteins der Mutante fas1-268 im Verlauf der

Enzymanreicherung zu überprüfen, wurde die Fettsäuresynthase aus Wildtyphefe (BY4742)

und aus der Mutante fas1-268 isoliert und die Akivitätsausbeuten für beide Enzyme auf jeder

Reinigungsstufe miteinander verglichen.

Die FAS-Aktivitäten beider Hefestämme wurden nach jedem Reinigungsschritt ermittelt. Für

beide Enzympräparationen wurde von der gleichen Zellmenge (380g) ausgegangen und alle

Reinigungsschritte wurden unter gleichartigen Bedingungen durchgeführt. Protein und

Enzymaktivitätstests wurden mit identischen Probenmengen durchgeführt. Die gemessenen

spezifischen und Gesamtaktivitäten beider Enzyme auf verschiedenen Stufen des

Reinigungsprozesses sind in Abb. 38 aufgeführt.

Page 82: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 68

0

20

40

60

80

100

1. AmmoniumsulfatFraktionierung

2. AmmoniumsulfatFraktionierung

Saccharose-Gradient

(Spitzenfraktion)

Ges

amta

ktiv

ität [

U]

A

0

50

100

150

200

1. AmmoniumsulfatFraktionierung

2. AmmoniumsulfatFraktionierung

Saccharose-Gradient

(Spitzenfraktion)

spez

ifisc

he A

ktiv

ität [

mU

//mg]

X

2000

29,5 %15,4 %

4,2 %

100 %

100 %

100 %

B

Abb. 38: Gesamtaktivität (A) und spezifische Aktivität (B) von FAS-Präparationen aus Wildtyp Hefe ( )

und aus der Mutante fas1-268 ( ) während der Aufreinigung.

Je 380g Wildtyp und fas1-268 Hefezellen wurden in 400ml Aufschlusspuffer suspendiert, durch Schütteln mit

Glasperlen aufgeschlossen und anschließend die FAS-Proteine nach dem in Material und Methoden

beschriebenen Verfahren angereichert. Aufgeführt sind jeweils die Fraktionen, welche bei der Anreicherung von

Wildtyp-FAS den FAS-Komplex enthalten. In A sind die gemessenen Gesamtaktivitäten abgebildet, während in

B die gemessenen spezifischen Aktivitäten angegeben sind. In B wurde zusätzlich die Mutanten-Aktivität jeder

Fraktion mit der entsprechenden Wildtyp-Aktivität verglichen.

Page 83: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 69

Man sieht, dass die spezifische Aktivität des Mutantenenzyms während der Aufreinigung im

Gegensatz zum Wildtypenzym (6fach vs. 44fach) kaum zunimmt (Abb. 38B).

Dementsprechend sinkt die FAS-Gesamtaktivität während der Reinigung beim Mutanten-

Enzym wesentlich rascher ab als beim Wildtyp-Enzym (Abb. 38A). Daraus geht hervor, dass

der mutierte FAS Komplex während der Aufreinigung in der Tat wesentlich rascher

inaktiviert wird als das Wildtyp-Enzym. Demnach handelt es sich bei dem Stamm fas1-268

um eine FAS-Mutante, bei der das Enzym weniger durch die Mutation als solche inaktiviert

wird, sondern vielmehr seine Inaktivierung vor allem dadurch erfährt, dass das Enzymprotein

sich verhältnismäßig rasch von der zunächst noch aktiven in eine inaktive Konformation

umlagert. Normalerweise falten sich mutierte Proteine gleich von Anfang an in der inaktiven

Struktur, oder aber die Umwandlung in aktive Folgestrukturen geht so rasch vonstatten, dass

sie sich der üblichen experimentellen Beobachtung entzieht.

2.3.3.3.2 Gaschromatische Untersuchung des Fettsäuremusters in den Lipiden der

Mutante fas1-268

Um Aufschluss über die Folgen einer gedrosselten Fettsäurebiosynthese-Rate auf die Lipid-

Zusammensetzung der Hefezelle zu gewinnen, wurde eine gaschromatographische Analyse

der in den fas1-268 Lipiden enthaltenen Fettsäuren durchgeführt. Dazu wurde die Mutante in

500 ml Fettsäure-freiem YPD Medium angezüchtet. Die in diesem Medium nur sehr schlecht

wachsende Kultur (vgl. Abb. 35) wurde für 24h bei 30°C wachsen gelassen. Die Zelldichte

nahm dabei von 0,8 auf 1,1 OD600 zu. Der als Kontrolle ebenfalls angezüchtete Wildtyp

wurde bei einer optischen Dichte von 1,3 OD600 geerntet. Die Zellen wurden dann durch

Zentrifugation geerntet und mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen. Für die Extraktion

der Fettsäuren wurden die Zellen lyophilisiert und mit methanolischer HCl (2M) für 5h bei

95°C hydrolysiert.

Page 84: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 70

Det

ekto

rsig

nal

5 10 15 20

Retentionszeit (min)

A

Det

ekto

rsig

nal

5 10 15 20

Retentionszeit (min)

B

Abb. 39: GC-Analyse der aus Wildtyp-Hefe (A) und aus der Mutante fas1-268 (B) gewonnenen Fettsäure-

Methylester.

Page 85: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 71

Die anschließende gaschromatographische Analyse der Fettsäure-Methylester ist in Abb. 39B

gezeigt. Als Vergleich diente eine Probe, die nach demselben Verfahren aus Wildtypzellen

(BY4742) gewonnen worden war (vgl. Abb. 39A).

0

10

20

30

40

50

60

12:0 14:0 16:0 + 16:1

18:0 + 18:1

26:0 26:OH

Ant

eil a

n G

esam

tfetts

äure

n [%

]

Abb. 40: Zusammensetzung der in den Lipiden von Wildtyp ( ) und fas1-268 ( ) Zellen enthaltenen

Fettsäuren.

Angaben in Prozent bezüglich der Summe aller abgebildeten Fettsäuren. Einzelheiten der Herstellung der

Fettsäuremethylester aus den Hefe-Lipiden sind in Material und Methoden beschrieben.

Beim Vergleich der Fettsäuremuster der beiden Stämme (Abb. 40) fällt auf, dass die Mutante

fas1-268 praktisch gleich viel 16:0- und Hydroxy-26:0-Fettsäuren bildet wie der Wildtyp. Im

Gegensatz dazu enthält sie wesentlich weniger 18:0-Fettsäuren als der Wildtyp. Solche

Schwankungen ebenso wie die beobachteten Variationen im Gehalt an 12:0 und 14:0-

Fettsäuren beobachtet man nicht selten bei unterschiedlichen Hefekulturen, ohne dass es

dadurch zu physiologischen Unterschieden kommt. Bemerkenswerter ist dagegen der

ungewöhnlich hohe Gehalt an der normalerweise seltenen überlangen Fettsäure 26:0. Mit

einem Anteil von etwa 15% an den Gesamtfettsäuren bildet die Mutante etwa siebenmal so

viel 26:0 Fettsäure wie der Wildtyp. Diese Steigerung des Gehalts an überlangen Fettsäuren

könnte entweder mit deren reduzierter Weiterverwertung oder aber mit einer gesteigerten

VLCFA-Synthese in der Mutante zusammenhängen. So könnte auf Grund der reduzierten

FAS-Aktivität in der Mutante die Elongase eventuell auf einen größeren Malonyl-CoA Pool

Page 86: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 72

zurückgreifen und folglich auch mehr überlange Fettsäuren bilden. Ein solcher

Zusammenhang würde bedeuten, dass die VLCFA-Synthese normalerweise durch das

Malonyl-CoA Angebot limitiert wird und die Fettsäuresynthase bei der Konkurrenz um

dasselbe Substrat in Wildtypzellen der effizientere Verwerter ist.

2.3.3.3.3 Untersuchung der in vitro FAS-Produkte im Rohextrakt der Mutante fas1-

268 und des Wildtyps BY4742

Der Rohextrakt der Mutante fas1-268 hatte im radiometrischen FAS-Test eine hohe

Einbaurate von [2]-14C-Malonyl-CoA in Petrolether-extrahierbare Fettsäuren aufgewiesen

(vgl. Tab. 12). Um festzustellen, ob es sich bei diesem Einbau um eine hohe Restaktivität der

fas1-268 Fettsäuresynthase handelte, die zur geringen Aktivität des gereinigten Enzyms im

Widerspruch stand, wurden die im Rohextrakt gebildeten Produkte mittels Radio-HPLC

Analyse untersucht. Die Befunde, dass die Mutante fas1-268 auf die Zufuhr exogener

Fettsäuren angewiesen war (vgl. Abb. 35A) und dass das gereinigte Enzym praktisch inaktiv

war, sprachen eigentlich gegen die Annahme einer effizienten Eigensynthese langkettiger

Fettsäuren im Zellextrakt der Mutante. Denkbar war auch, dass der starke Malonyl-CoA

Einbau auf eine erhöhte Elongase-Aktivität hindeutete, oder dass nicht die notwendigen

langkettigen, sondern vor allem physiologisch nutzlose mittel- oder kurzkettige Fettsäuren

synthetisiert wurden. Für die Analyse wurden Rohextrakte der Mutante fas1-268 und des

Wildtyps (BY4742) mit [2]-14C-Malonyl-CoA unter den Versuchsbedingungen des

radiometrischen FAS-Tests inkubiert. Die dabei gebildeten radioaktiv markierten Fettsäuren

wurden nach saurer Hydrolyse (2M methanolische HCl, 5h) der zellulären Lipide mit

Petrolether extrahiert und zu p-Bromphenacylestern derivatisiert. Anschließend wurden diese

Ester durch RP-HPLC aufgetrennt und mit Hilfe von Referenzverbindungen charakterisiert.

Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigt Abb. 41. Man sieht, dass mit dem Wildtyp-Extrakt –

wie für die FAS-Reaktion erwartet - vor allem die Produkte Palmitinsäure und Stearinsäure

gebildet werden (Abb. 41A). Auch mit dem Mutantenextrakt sind diese beiden Fettsäuren die

prominentesten Produkte. Als zusätzliche Produkte (ca. 40%) treten hier aber auch noch

niedrigere Homologe wie Myristinsäure, Laurinsäure und Caprinsäure in Erscheinung (Abb.

41B). Eine derartige Verschiebung des Produktspektrums zu kürzeren Kettenlängen ist bei der

Fettsäuresynthase bekannt in Fällen, bei denen entweder ein Überangebot an Acetyl-CoA

vorliegt (das dürfte hier unwahrscheinlich sein) oder das Aktivitätsverhältnis der FAS-

Page 87: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 73

Teilenzyme Palmitoyl-Transferase zu Ketoacyl-Synthase zugunsten des ersteren Teilenzyms

verschoben ist.

0

200

400

600

800

1000

20 30 40 50 60 70 80

Zeit [min]

Mal

onyl

-CoA

Ein

bau X

[cpm

]

A

0

200

400

600

800

1000

20 30 40 50 60 70 80

Zeit [min]

Mal

onyl

-CoA

Ein

bau X

[cpm

]

B

0

0,2

0,4

0,6

20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0

Zeit [min]

Abs

orpt

ion

[A25

4] X

X

10:0

12:014:0

16:0

18:0

C

Abb. 41: Radio-HPLC Analyse der in vitro Fettsäuresynthese-Produkte von Rohextrakten aus Wildtyp

(A) und fas1-268 (B) Zellen.

Die Auftrennung eines definierten Fettsäure p-Bromphenacylester Gemischs ist in (C) gezeigt. Einzelheiten zur

Probenvorbereitung und Durchführung der Analyse siehe Material und Methoden.

Page 88: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 74

Grundsätzlich wäre allerdings auch eine mutationsbedingte Aktivitäts-Erhöhung oder eine

Spezifitäts-Veränderung des Teilenzyms Palmitoyl-Transferase denkbar. Die Spezifitäts-

Veränderung könnte z.B. in der Umwandlung der Transesterase- in eine Hydrolase-Aktivität

oder in einer Verschiebung der Substratspezifität zu kürzeren Kettenlängen bestehen. Alle

genannten Effekte würden die Effizienz der Synthese von Palmitin- und Stearinsäure

beeinträchtigen und könnten somit den Defekt-Phänotyp der Mutante - zumindest im Prinzip -

erklären.

Die zuletzt genannten Überlegungen zu einer veränderten Rolle des Teilenzyms Palmitoyl-

Transferase werden durch frühere biochemische und genetische Befunde von A. Knobling

[KNO] gestützt. Danach ist in der Mutante fas1-268 die Schlußreaktion der Fettsäuresynthase,

die durch das Teilenzym Malonyl/Palmitoyl-Transferase katalysiert wird, defekt (nur noch

2% Wildtyp-Aktivität). Als Folge der Malonyltransferase-Inaktivierung könnte die

Ketoacylsynthase und damit die Kettenverlängerung gebremst werden.

Die in Abb. 41 gezeigten Befunde stehen im Einklang mit den Ergebnissen der

gaschromatographischen Analyse der in den fas1-268 Lipiden enthaltenen Fettsäuren. Auch

hier enthielten die Mutanten-Lipide einen höheren Anteil an Laurin- und Myristinsäure als die

entsprechenden Lipide des Wildtyps (vgl. Abb. 42).

2.3.3.3.4 Messung der Fettacyl-CoA Spiegels im Zellextrakt von Hefezellen

Der Ausfall der Palmitoyl-Transferase in der Mutante fas1-268 sollte zu einem Abfall des

zellulären Palmitoyl-CoA Spiegels führen. Palmitoyl-CoA ist das Substrat verschiedener

essentieller Fettacylierungsreaktionen in Hefe. Um den möglichen Effekt der fas1-268

Mutation auf diese Reaktionen abschätzen zu können, sollte in den im folgenden Abschnitt

beschriebenen Versuchen versucht werden, den Palmitoyl-CoA Spiegel in Wildtyp- und

Mutantenzellen zu bestimmen.

Die Auftrennung unterschiedlicher Fettacyl-CoA Thioester kann durch „Reversed Phase“-

HPLC an einer unpolaren Säule erfolgen [ROD]. Die von der Säule eluierten Fettacyl-CoA

Ester können aufgrund der in ihrem CoA-Teil enthaltenen Puringruppe im UV-

Flußzellendetektor bei 260 nm nachgewiesen werden. Da Hefe keine ungeradzahligen

Fettsäuren bildet, kann Margaroyl-CoA (17:0-CoA) als interner Standard für die spätere

Page 89: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 75

Quantifizierung der Ester bei der Auftrennung eingesetzt werden. Dieser Standard wird vor

der Extraktion dem jeweiligen Reaktionsansatz beigefügt. Dadurch wird sichergestellt, dass er

während der Extraktion den gleichen experimentellen Bedingungen ausgesetzt ist wie die in

vivo gebildeten Thioester. Dadurch wird es möglich, evtl. Verluste während der Aufarbeitung

bei der Berechnung zu berücksichtigen. Die RP-HPLC-Trennung eines definierten Gemischs

aus Palmitoyl-CoA, Margaroyl-CoA und Stearoyl-CoA ist in Abb. 42 dargestellt. Man sieht,

dass das angewandte Verfahren sowohl für die Auftrennung als auch für die Quantifizierung

langkettiger Fettacyl-CoA Ester geeignet ist.

0

0,2

0,4

0,6

20 30 40 50 60

Zeit[min]

A25

4

C16-CoA

C17-CoA

C18-CoA

Abb. 42: Auftrennung von Palmitoyl-CoA, Margaroyl-CoA und Stearoyl-CoA durch RP-HPLC.

Insgesamt wurden jeweils 10nmol Palmitoyl-, Maragaroyl- und Stearoyl-CoA aufgetragen und entsprechend den

Laufbedingungen (Material und Methoden) an einer Prontosil C18-SH 5 µm Säule (250 mm x 4,6 mm inkl.

Vorsäule, Fa. Bischoff) durch RP-HPLC aufgetrennt.

In der Literatur sind verschiedene Verfahren für die Extraktion von Fettacyl-CoA Estern aus

biologischem Material beschrieben [MAN, MAG, ROD]. In dieser Arbeit wurden davon die

folgenden Verfahren auf ihre Anwendbarkeit für ein Hefe-Zellextrakt näher untersucht.

1. Eine von Mancha et al. [MAN] beschriebene Methode zur quantitativen Analyse der

Fettacyl-CoA Zusammensetzung eines komplexen Lipid-Gemischs basiert darauf,

dass zunächst die freien Fettsäuren und unpolaren Lipide mittels Petrolether-

Page 90: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 76

Extraktion aus einer isopropanolhaltigen, wässrigen Lösung abgetrennt werden.

Danach wird fettacyliertes Acyl-Carrier-Protein in Gegenwart von Ammoniumsulfat

mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch ausgeschüttelt und schließlich die Fettacyl-

CoAs von anderen polareren Lipiden durch selektive Adsorption an neutralem

Kieselgel abgetrennt.

2. Eine weitere Methode zur quantitativen Analyse des Fettacyl-CoA Spiegels in

Kaninchen-Zellen (Nierenrinde) wurde von Maningo et al. [MAG] entwickelt. Hierbei

werden zunächst die Fettacyl-CoA Ester durch ein Choroform/Methanol-Gemisch

mehrmals extrahiert. Anschließend werden Chloroform und Kaliumphosphatpuffer

zugegeben und vermischt. Die obere, organische Phase, welche die Fettacyl-CoA

Ester enthält, wird anschließend mit Chloroform gewaschen. Die Methanol-haltige

Phase wird abschließend unter einem Stickstoffstrom eingeengt.

3. Eine dritte Methode zur quantitativen Analyse des Fettacyl-CoA-Spiegels in

Rattenleber wurde von Rosendal et al. [ROD] beschrieben. Hierbei werden zunächst

die Lipide durch eine Dreiphasenextraktion in einem Chloroform/Methanol/Wasser

Gemisch entfernt. Die langkettigen Fettacyl-CoA-Ester, welche sich hier im

Gegensatz zu dem von Maningo et al. [MAG] beschriebenen Verfahren in der

proteinhaltigen Interphase befinden, werden nach der Abtrennung von Ober- und

Unterphase durch ein Methanol / Ammoniumacetatpuffer-Gemisch extrahiert. Das

Extrakt wird mit der vorherigen, oberen Phase, welche die kurzkettigen Fettacyl-CoA-

Ester enthält, vereinigt und in einem Stickstoffstrom eingeengt.

In allen drei Fällen wurden bei der Nacharbeitung der obigen Verfahren vor dem

Zellaufschluss 10nmol Margaroyl-CoA als interner Standard den Hefezellen beigefügt.

Außerdem wurde die Zellaufschluss-Methode dem jeweiligen Aufschluss-Milieu

entsprechend variiert. Während der Glasperlenaufschluss von Hefezellen in wässrigem

Medium (Ansatz 1) nur eine relativ kurze Aufschlusszeit (5-10 min) benötigt, erforderte der

vollständige Aufschluss von Hefe in organischen Lösungsmitteln (Ansatz 2 und 3) eine

deutlich längere Zeit (30-60 min). Die Analyse der Extrakte nach allen geschilderten

Extraktionsverfahren, führte zu keinem Nachweis messbarer Mengen Acyl-CoA bei der RP-

HPLC Analyse. Selbst ein Signal für das als Standard zugesetzte Margaroyl-CoA konnte

nicht entdeckt werden. Auch eine veränderte Zellaufschlussmethode (Mikrodismembrator-

Page 91: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

ERGEBNISSE 77

Aufschluss tiefgefrorener Zellen) oder ein momentanes Abtöten von aus der Kultur

entnommenen Hefezellen durch Trifluoressigsäure bzw. Perchlorsäure (Verhinderung

enzymatischer Abbaureaktionen während der Aufarbeitung) führte zu keinen besseren

Ergebnissen. Die Versuche wurden daher an dieser Stelle abgebrochen und die Fragestellung

nicht weiter verfolgt.

Page 92: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

DISKUSSION 78

3 Diskussion

In einem ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde von mir untersucht, in wieweit die sechs

katalytischen Zentren des hexameren Fettsäuresynthase Komplexes der Hefe jeweils einzeln

und unabhängig nebeneinander aktiv sind. Die Frage war nicht trivial und eine Reihe früherer

Befunde aus unserem und anderen Laboratorien deuteten auf ein komplexes Problem hin. So

hatten Schuster et al. [SCU] beobachtet, dass einerseits zwar alle sechs Reaktionszentren des

(αβ)6 Hexameren am Reaktionsgeschehen des arbeitenden Komplexes gleichberechtigt

teilnehmen, anderseits aber nur 2-3 der 6 chemisch gleichartigen Substratbindestellen im nicht

arbeitenden Komplex mit den Substraten Acetat oder Malonat acylierbar waren. Auch der

Inhibitor Iodacetamid vermochte nach Befunden von Oesterhelt et al. [OES] nur 3 der 6

Ketosynthase-Zentren im Komplex zu alkylieren. Diese Daten sprachen dafür, dass während

des Reaktionsgeschehens die einzelnen Monomeren im (αβ)6 Hexameren konformationelle

Strukturänderungen erfahren, auf Grund derer sie für bestimmte Substrate oder

Reaktionszwischenprodukte entweder spezifisch zugänglich oder ihnen gegenüber speziell

abgeschirmt waren. Nachdem eine ähnliche sub-stöchiometrische Acylierung auch bei der

dimeren tierischen FAS beobachtet worden war (S. Smith, persönliche Mitteilung), erschien

es denkbar, dass hier eine generelle Reaktionsweise multimerer FAS-Komplexe deutlich

wurde. Auf der Grundlage der geschilderten Befunde wurde zunächst eine eventuelle

Halbseiten-Aktivität der FAS diskutiert, wonach das reaktive FAS-Enzym ein α2 oder (αβ)2

Dimeres ist, in dem sich zu jedem Zeitpunkt immer nur eines der beiden Monomeren in einer

aktiven und das andere in einer inaktiven Konformation befindet. Diese Hypothese konnte

durch die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse erstmals eindeutig widerlegt werden.

Zumindest für die Acyl-Carrier-Protein Domäne und die an ihr befestigte prosthetische

Gruppe, das Phosphopantethein, konnte von mir gezeigt werden, dass jede der 6

Phosphopantethein-Gruppen im Komplex zu jedem Zeitpunkt einen gleich großen Beitrag zur

Gesamtaktivität des Komplexes liefert. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit dem bereits

erwähnten Befund, dass im Fettsäuren synthetisierenden FAS Komplex alle 6

Reaktionszentren aktiv sind [SCU]. Auch für tierische FAS konnte vor kurzem gezeigt

werden, dass jede der beiden α-Untereinheiten in diesem dimeren für sich allein funktioniert

und in ihrem Reaktionsmechanismus nicht auf die Kooperation mit der zweiten α-

Untereinheit angewiesen sind. Die Dimeren-Bildung dürfte stattdessen eher eine passive

Struktur-stabilisierende Funktion haben [ZHA].

Page 93: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

DISKUSSION 79

Angesichts der autarken Funktionsweise jeder einzelnen FAS Untereinheit gilt es, deren

erstaunliche Fähigkeit zu erklären, selbst zwei weit auseinander liegende, an

entgegengesetzten Enden der multifunktionellen Kette befindliche Domänen miteinander in

Wechselwirkung zu bringen. Eine Antwort hierauf wird letztlich erst die dreidimensionale

Strukturanalyse des FAS-Komplexes und damit die Kenntnis der topologischen Anordnung

der acht verschiedenen Reaktionszentren in einer der 6 Elementarzellen des Komplexes

liefern. Bis vor kurzem schien dieses Ziel in Ermangelung röntgenographischer Strukturdaten

noch in weiter Ferne. S. Jenni et al. [JEN] gelang jedoch kürzlich mit Hilfe der „Vapour

Diffusion“ Technik die Herstellung von monoklinen FAS-Kristallen aus dem Pilz

Thermomyces lanuginosus. Im Gegensatz zur Bäckerhefe besitzt dieser mit Hefe verwandte

Organismus auf Grund seiner Thermostabilität ein FAS-Protein, das trotz grundsätzlich

gleichartiger Struktur wie Hefe-FAS offensichtlich stabiler ist und sich deshalb besser

kristallisieren lies. Die Kristalle eigneten sich zu einer Röntgenkristallstruktur-Analyse und

führten zur Berechnung der Grobstruktur des α6β6 FAS-Komplexes mit einer maximalen

Auflösung von 5Å. Obwohl diese Auflösung nicht ausreichte, um das FAS-Rückgrat über

seine ganze Länge verfolgen zu können, gelang es Jenni et al. dennoch, unter Verwendung der

bekannten dreidimensionalen Strukturen der homologen bakteriellen FAS Einzelenzyme die

meisten katalytischen Zentren innerhalb der dreidimensionalen FAS-Struktur zu lokalisieren.

Lediglich die Position des Acyl-Carrier-Proteins konnte nicht eindeutig festgelegt werden,

was sich wahrscheinlich auf die inhärente Beweglichkeit dieser Domäne zurückführen lässt.

Die jetzt vorliegenden röntgenographischen Daten erlauben ein wesentlich detaillierteres Bild

zur Architektur des hexameren FAS-Komplexes (vgl. Abb. 45A) als dies bisher auf Grund

von elektronenmikroskopischen Bildern möglich gewesen war. Nach diesen Berechnungen ist

der 2,6 MDa große α6β6 FAS-Komplex in zwei Reaktionskammern unterteilt, welche durch

eine zentrale „Radspeichen-Struktur“ voneinander getrennt sind. Jede dieser

halbkugelförmigen Reaktionskammern enthält drei der sechs kompletten Sätze an

katalytischen Domänen, die für den Reaktionszyklus der Fettsäurebiosynthese notwendig

sind. Die Autoren schreiben, dass in jeder der beiden Reaktionskammern drei unscharf

erkennbare interne Strukturen vorliegen, welche die ACP-Domänen darstellen könnten. Diese

Strukturen sind jeweils an einem zentralen Punkt zwischen einem Satz katalytischer Domänen

lokalisiert. Die Entfernungen von diesem Punkt aus zu den angrenzenden aktiven Zentren

liegen zwischen 50 und 70 Å (vgl. Abb. 45 B). Der Phosphopantethein-Rest ist daher mit

einer Länge von nur 18 Å zu kurz, um allein als „schwingender Arm“ die Acyl-Intermediate

zu den einzelnen aktiven Zentren zu transportieren. Statt dessen scheint es wahrscheinlich,

Page 94: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

DISKUSSION 80

dass die gesamte ACP-Domäne als „mobiler Träger“ zwischen den einzelnen katalytischen

Domänen hin und her wandert, während der Phosphopantethein-Rest als Lieferant der Acyl-

Intermediate diese in die hydrophoben Taschen der aktiven Zentren hineinreicht (vgl. Abb.

45C).

Abb. 45: Röntgenkristallstruktur eines α6β6 FAS Komplexes und schematischer Reaktionsweg des Acyl-

Carrier-Proteins zu den individuellen katalytischen Domänen [JEN].

(A) Betrachtung des hexameren FAS-Komplexes von außen. Die aktiven Zentren des FAS-Komplexes sind ins

Innere der Reaktionskammern gerichtet. Die verschiedenen Domänen sind durch unterschiedliche Farben

markiert. (B) Hier ist ein Satz der aktiven Zentren abgebildet, der für einen vollständigen Reaktionszyklus

notwendig ist. Um den Einblick in die Reaktionskammer zu gewährleisten, wurde ein Teil der vorderen

Kammer-Wand entfernt. Die Abstände zwischen dem mutmaßlichen Acyl-Carrier-Protein (grüne Punkte) und

den individuellen katalytischen Domänen sind durch rote Verbindungslinien dargestellt. (C) Der vom

Reaktionsmechanismus vorgezeichnete Weg des Acyl-Carrier-Proteins bei der Beförderung von Acyl-

Intermediaten zu den verschiedenen aktiven Zentren ist durch graue Verbindungslinien dargestellt.

A

B C

Page 95: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

DISKUSSION 81

Der Austausch von Substraten und Produkten zwischen den einzelnen Reaktionskammern und

der umgebenden Lösung findet wahrscheinlich durch passive Diffusion durch mehrere

Kammer-Öffnungen mit einem Durchmesser von bis zu 25 Å statt. Diese Öffnungen

ermöglichen die Diffusion von kleineren Molekülen, bilden jedoch eine Barriere für

Makromoleküle.

Größere konformationelle Veränderungen der Struktur, welche die Anordnung der

katalytischen Domänen untereinander beeinflussen, werden von den Autoren ausgeschlossen,

da der FAS-Komplex seine nicht-kristallographische Symmetrie bis zu einer Auflösung von 5

Å behält, und da die katalytischen Domänen in Bereichen mit hoher struktureller Dichte

vorliegen. Aufgrund der Strukturanalyse von Jenni et al. [JEN] sind keine Aussagen über die

strukturelle Grundlage der in anderem Zusammenhang feststellten, negativen Kooperativität

des Hefe FAS-Komplexes möglich. Auch die von Oesterhelt et al. [OES] beobachtete

partielle Besetzung von nur 3 der 6 „peripheren“ SH-Gruppen durch den Hemmstoff

Iodacetamid kann durch die Strukturanalyse nicht erklärt werden. Interessanterweise reicht

diese 50 prozentige Alkylierung aus für eine vollständige Inaktivierung der Über-Alles FAS-

Aktivität. Dies könnte eventuell bedeuten, dass zwei im Komplex dimerisierte

Ketoacylsynthase-Zentren geringfügige konformationelle Veränderungen erfahren und

dadurch stets nur eine der beiden peripheren SH-Gruppen zur Verfügung steht.

Die Autoren interpretieren die Kristallstruktur des FAS-Komplexes weiterhin in dem Sinne,

dass jede der drei ACP-Domänen innerhalb einer Reaktionskammer mehrere identische

katalytische Domänen dieser Kammer erreichen kann. Dies würde eine Erklärung für die von

Werkmeister et al. [WER2] beobachtete in vitro Komplementation zwischen unterschiedlich

mutierten FAS-Komplexen liefern. Die zweite diskutierbare Möglichkeit, dass nicht jede ACP

Domäne jedes aktive Zentrum in einer Reaktionskammer erreichen kann, sondern dass die

Intermediate unter den verschiedenen, jeweils fixierten ACP-Domänen weiter gereicht

werden, erscheint nach der in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnissen eher

unwahrscheinlich. In diesem Fall wäre eine einzige aktive, d.h. pantetheinylierte ACP-

Domäne im Zusammenwirken mit zwei nicht-pantetheinylierten ACP-Domänen in derselben

Reaktionskammer zur Erzeugung von FAS-Aktivität nicht ausreichend. Dies ist jedoch der

Fall.

Page 96: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

DISKUSSION 82

In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur funktionellen

Identität des Hefegens YBR159w durchgeführt. Die Funktion dieses am

Fettsäureelongationsprozess in Hefe beteiligten Gens hatte bisher nur indirekt auf Grund der

Sequenzähnlichkeit seines Produktes mit verschiedenen bekannten Ketoreduktasen

wahrscheinlich gemacht werden können. In unserem Labor hatte Heidi Rössler [RÖS] mittels

radiometrischer RP-HPLC Analyse gezeigt, dass die Elongase-haltige Membranfraktion einer

∆ybr159w-Mutante in Anwesenheit von [2]-14C-Malonyl-CoA und NADPH aus Stearoyl-

CoA keine überlangen, gesättigten Fettsäuren mehr bilden. Stattdessen wurden zwei zunächst

nicht identifizierbare Intermediate der Fettsäure-Elongation synthetisiert. In Abwesenheit des

Reduktionsmittels NADPH entstand nur noch eines der beiden Intermediate. Daraus ging

hervor, dass es sich hierbei wohl um die durch eine Ketoacyl-Synthase aus Stearoyl-CoA und

Malonyl-CoA gebildete 3-Oxoeicosansäure handeln dürfte. Die durch Reduktion mit NADPH

und einer unspezifischen Reduktase daraus gebildete Hydroxyverbindung kann in vitro nicht

zur Bildung von verlängerten, gesättigten Fettsäuren verwendet werden. Andernfalls hätte die

Mutation ∆ybr159w keinen Phänotyp. Der Grund für den kompletten Ausfall der Elongation

trotz teilweise erhaltener Ketoreduktion dürfte entweder darin liegen, dass es sich bei der

gebildeten Hydroxyverbindung nicht um das Elongase-Zwischenprodukt 3-

Hydroxyeicosansäure handelte, sondern eventuell um ein reduziertes Keton, oder aber dass

die Reduktion nach Ablösung der Intermediate aus dem Elongase-System statt findet, so dass

eine Fortsetzung des Prozesses nicht erfolgt. Für die zuerst genannte Möglichkeit könnte

sprechen, dass die von mir als Referenzsubstanz synthetisierte 3-Oxoeicosansäure sich beim

Vergleich mit der enzymchemisch synthetisierten Zwischenverbindung leider nicht als mit

dieser identisch erwies. Nichtsdestotrotz besitzen beide Substanzen ein sehr ähnliches

Elutionsverhalten bei der RP-HPLC Analyse. Während der Standard, auf Grund seiner

Detektierbarkeit bei 254 nm, mit Sicherheit über eine p-bromphenacylierte Carboxylgruppe

verfügt, kann dies für das durch die Membranfraktion gebildete Intermediat nicht festgestellt

werden. Es besteht daher die Möglichkeit, dass die zunächst gebildete 3-Oxoeicosansäure bei

fehlender Ketoreduktion – sei es auf Grund eines Fehlens von NADPH oder des Defekts der

Ketoreduktase Ybr159p – nicht zur 3-Hydroxyeicosansäure weiterreagiert, sondern auf andere

Weise chemisch modifiziert wurde. So wäre zum Beispiel die Decarboxylierung der 3-

Ketoeicosansäure zum entsprechenden Methylketon denkbar. Die Reduktion dieses

Methylketons durch eine unspezifische Ketoreduktase würde zu einem sekundären Alkohol

führen. Die Identität der im Test gebildeten Verbindung mit einer dieser Substanzen scheint

möglich, wurde von mir aber nicht untersucht. Entsprechende, aus der Referenzsubstanz

Page 97: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

DISKUSSION 83

gebildete Folgeprodukte bleiben unentdeckt, da sie weder radioaktiv noch p-bromphenacyliert

sind.

Eine partielle Kompensation des durch den YBR159w-Ausfall bedingten Elongase-Verlustes

war bereits früher mit der mutmaßlichen Elongase-Funktion einer membranständigen FAS-

Fraktion in Zusammenhang gebracht worden (C. Rieck, Dissertation). Die synthetische

Letalität von Elongase / FAS- Doppelmutanten und die durch den FAS-Inhibitor Cerulenin

induzierte Letalität von Elongasemutationen hatten für diese Annahme gesprochen. Um diese

hypothetische Beteiligung der Fettsäuresynthase an der Bildung überlanger Fettsäuren näher

zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit versucht, eine FAS-freie Membranfraktion durch

Waschen der Membranen herzustellen und sie auf ihren eventuellen Gehalt an FAS-Protein zu

untersuchen.. Dabei stellte sich in der Tat heraus, dass ein geringer aber konstanter Anteil des

FAS-Komplexes selbst nach zahlreichen Waschschritten fest an der Membran lokalisiert

bleibt und nicht davon abgewaschen werden kann. Diese membranständige Fettsäuresynthase

war jedoch in vitro inaktiv und weder in der Lage, aus Acetyl-CoA langkettige Fettsäuren

noch aus Stearoyl-CoA überlange Fettsäuren zu bilden. Die Frage einer Beteiligung der

membranständigen Fettsäuresynthase an der Bildung überlanger Fettsäuren blieb somit offen,

da das Enzym durch die Waschschritte und möglicherweise infolge Denaturierung durch das

zugesetzte Detergenz seine Aktivität verloren hatte.

Mit dem Ziel, zellphysiologisch kritische Palmitoylierungsreaktionen wie etwa die Protein-

Palmitoylierung auf diese Weise nachweisen und untersuchen zu können, wurde von mir in

einem dritten Teil der Arbeit versucht, die zelluläre FAS-Aktivität in vivo zu drosseln. Dabei

wurde zunächst untersucht, ob eine subletale FAS-Hemmung eventuell durch kontrollierten

Einsatz des spezifischen Hemmstoffs Cerulenin zu erreichen ist. In diesen Versuchen konnte

von mir zwar gezeigt werden, dass das Wachstum der Hefen durch variable Cerulenin

Konzentrationen unterschiedlich stark gehemmt wird. Die Cerulenin-abhängige

Wachstumsminderung war jedoch schlecht reproduzierbar, da sich der Hemmstoff einerseits

irreversibel an die Fettsäuresynthase bindet und andererseits seine Hemmwirkung in

wässrigem Medium rasch verliert. Der Hemmstoff war somit auf Grund seiner zeitlich

abnehmenden Verfügbarkeit nicht in der Lage, den zellulären FAS-Spiegel Dosis-abhängig in

reproduzierbarer Weise zu erniedrigen. Daher wurde in einer zweiten Versuchsreihe ein

anderer Ansatz gewählt, um Zellen mit einem erniedrigten FAS-Spiegel zu erhalten. Dabei

wurden fas-Mutanten untersucht, die in Fettsäure-freiem Medium ein reduziertes, aber noch

Page 98: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

DISKUSSION 84

erkennbares Wachstum aufwiesen, die anderseits aber in Gegenwart von Fettsäuren ein

uneingeschränktes, Wildtyp-artiges Wachstum zeigten. Die meisten der ca. 2000 von mir

überprüften fas-Mutanten zeigten in Fettsäure-freiem Medium keinerlei Wachstum. Lediglich

sechs Mutanten wurden identifiziert, die den geforderte „leaky“ Phänotyp besaßen. Durch

einen speziell entwickelten radiometrischen FAS-Test konnte die FAS-Aktivität sehr

empfindlich auch in den Rohextrakten der Mutanten gemessen werden. Daneben wurde mit

dem üblichen optischen Test auch die spezifische Aktivität der gereinigten FAS-Komplexe

der Mutanten untersucht. Mit nur einer Ausnahme ergab sich in allen Fällen eine gute

Übereinstimmung zwischen dem in vivo reduzierten Wachstum und der durch Mutation

verminderten FAS-Aktivität. Der Defekt war dabei in guter Übereinstimmung sowohl im

Zellextrakt als auch beim gereinigten FAS-Komplex messbar. Im Gegensatz zu diesen

Mutanten stand das Verhalten der Mutante fas1-268. Sie besaß, trotz eines kaum

nachweisbaren Wachstums in Fettsäure-freiem Medium, eine sehr hohe FAS-Aktivität im

Zellextrakt. Erst der gereinigte fas1-268 FAS-Komplex besaß dem Wachstumsverhalten

entsprechend keine Aktivität. Weiter konnte von mir gezeigt werden, dass die zunächst

beträchtliche FAS-Aktivität im Rohextrakt der Mutante fas1-268a auf Grund einer

ungewöhnlich hohen Labilität des mutierten FAS-Proteins während der Aufreinigung verloren

ging. Bemerkenswert bleibt bei dieser durchaus nicht ungewöhnlichen Mutanten-

Charakteristik allerdings, dass die hohe FAS-Aktivität im Rohextrakt in deutlichem

Widerspruch zu dem geringen Wachstum der Zellen in Fettsäure-freiem Medium steht. Es

kann spekuliert werden, ob eventuell eine bisher nicht bekannte Funktion von FAS,

unabhängig von der offensichtlich kaum betroffenen Fettsäurebiosynthese-Aktivität, selektiv

geschädigt ist. Denkbar wäre in diesem Zusammenhang eine Transferase-Aktivität, welche

die direkte Übertragung von Palmitoyl-Resten von Palmitoyl-FAS z.B. auf ein bestimmtes

Zielprotein durchführt. Derartige direkte Transacylierungen unter Umgehung einer Palmitoyl-

CoA Zwischenverbindung sind von anderen FAS-Systemen bekannt [WAT1, WAT2]. In

Einklang mit der Annahme eines derartigen Transacylase-Defektes steht der Befund von

Knobling et al. [KNO], dass die Mutante fas1-268 zu einer Mutantengruppe gehört, in der

speziell die Palmitoyl-Transacylase Teilaktivität durch Mutation geschädigt ist. Das in vivo

gebildete Fettsäuremuster der Mutante fas1-268 zeigte eine verstärkte Bildung sowohl der

kürzerkettigen Fettsäuren Laurin- und Myristinsäure als auch der überlangen Fettsäure

Cerotinsäure. Die verstärkte Bildung von Laurin- und Myristinsäure durch den FAS-Komplex

dürfte auf der ineffizienten Kettenverlängerung durch die Mutanten-FAS beruhen, wodurch es

zu einer vorzeitigen Abspaltung der „unfertigen“ kürzerkettigen Säuren kommt. Die Bildung

Page 99: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

DISKUSSION 85

der überlangen Fettsäure Cerotinsäure wird nicht durch FAS, sondern durch die Elongase

durchgeführt. Die Elongase konkurriert mit dem FAS-Komplex um den verfügbaren Malonyl-

CoA Pool und kann in der Mutante auf Grund deren reduzierter FAS-Aktivität wohl vermehrt

auf diesen Pool zurückgreifen. Die darüber hinaus mit dem Aktivitäts-reduzierten FAS-

Mutanten geplanten Versuche, wie etwa die Messung der zellulären Palmitoyl-CoA Spiegel

und eine eventuelle Beeinträchtigung der spezifischen Protein-Palmitoylierung konnten von

mir nicht mehr durchgeführt werden, da die Bestimmung des zellulären Fettacyl-CoA

Spiegels sich in meinen Händen unerwartet hartnäckig einer experimentellen Beherrschung

entzog.

Page 100: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 86

4 Material und Methoden

4.1 Material

4.1.1 Arbeitsgeräte

Autoklav A5; Fa. Webeco

Brutschränke VI 5050 EK und KKB 500, Fa. Heraeus Christ

Eismaschine Fa. Scotsman

Elektroblot Semi-Dry-Blotter, Fa. Labortechnik

Gaschromatograph HP-5890 mit HP-5 (crosslinked 5% Ph Me silicone,

0.2mm x 25 m); Fa. Hewlett-Packard (Agilent)

Gefriertrockner Alpha 1–2; Fa. Christ

Geltrockner SE 540, Fa. Hoefer

HPLC Anlage mit

Radiodetektor

Controller 2152, Pumpe 2150, Niederdruck Gradientenmischer

Ultragrad 11300, UV-Detektor Uvicord SD 2158; Fa.

Pharmacia-LKB

HPLC Säule Prontosil 120-5-C18-SH 5.0 µm (250x4.0mm inkl. Vorsäule);

Fa.Bischoff

Flussscintillationszähler Radiomatic 500TR mit Solarscint 400µl; Fa. Packard

Scintillationszähler Tri-Carb 1500; Fa. Packard

Elektrophoresekammer Proteingel: 45-1010-I; Fa. Peqlab

Präzisionspipetten Pipetman P20, P200, P1000, Fa. Gilson

Geltrockner SE 540; Fa.Hoefer

Magnetrührer Fa. Heidolph

Netzgerät EPS 500/400; Fa. Pharmacia-LKB

pH-Meter 511; Fa. Knick

Rolltrommel TC5; Fa. New Brunswick

Schüttler G25, G10; Fa. New Brunswick

Spektralphotometer Typ Ultraspec II und III, Fa LKB, Typ Ultraspec Plus, Fa.

Pharmacia, Typ 1101 M mit Kompensationsschreiber Typ 4412,

Fa. Eppendorf

Thermoblock Fa. Liebisch

Page 101: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 87

Vortex Fa. Heidolph

Waagen Typ 801 und 1518; Fa. Sartorius

Wasserbad Fa. Julabo

Tischzentrifuge Biofuge Pico; Fa. Heraeus

Zentrifuge Superspeed RC-5B; Fa. Sorvall

Ultrazentrifuge L7-55; Fa. Beckmann

Zentrifugenrotoren SW28, Ti45, Ti60, Ti45; Fa. Sorvall

4.1.2 Sonstiges Arbeitsmaterial

Chromatographiepapier 3 MM Papier; Fa. Whatman

Glasperlen Durchmesser 0.2 mm; Fa. Sigmund Lindner

Membranen Nitrocellulosemembran (NCV4/NCV2); Fa. Schleich & Schüll

Papierfilter Typ Nr.1; Fa. Whatman

GB004; Fa. Schleicher&Schüll

Pasteurpipetten Fa. Fortuna

Petrischalen Fa. Greiner

Röntgenfilme X-ray film/medical; Fa. Konica Minolta

Rundfilter Typ HA (Porendurchmesser 0.45 µm); Fa. Millipore

4.1.3 Chemikalien

4.1.3.1 Allgemeine Chemikalien und Lösungsmittel

Käufliche Chemikalien wurden, soweit nicht anders vermerkt ist, von Sigma-Aldrich bzw.

Merck bezogen und ohne weitere Vorbehandlung eingesetzt.

4.1.3.2 Spezielle Chemikalien und Lösungsmittel

Fa. Applichem Leupeptin, Pepstatin

Fa. Fluka PMSF, Coomassie Brilliant Blue, Gylcin, DMSO

Fa. Gibco-BRL Bactopepton, Trypton, Hefeextrakt, Yeast Nitrogen Base

Fa. Grünenthal Ampicillin

Fa. Qiagen QIAprep Spin Plasmid Kit, Qiagen Plasmid Kit

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MATERIAL UND METHODEN 88

Fa. Roth Rotiszint eco Plus, Acetonitril HPLC grade, Methanol HPLC-

Grade, Petrolether

Fa. Serva Ammoniumpersulfat, Tween 20, DTT

Fa. NEN [2-14C]-Malonyl-Coenzym A (56mCi/mmol)

Fa. Pierce p-Bromphenacylbromid

Fa. Otto Nordwald Agar-Agar

4.1.4 Kultur-Medien

Die Substanzen wurden in jeweils 1 l deionisiertem H2O gelöst und 40 min bei 120°C und 1

bar Überdruck autoklaviert.

4.1.4.1 Nährmedien für Hefe

YPD 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Glucose

YPDFS wie YPD, zusätzlich 10 g Tween 40, 0.3 g Butterhydrolysat

YPDFS+Cerulenin wie YPDFS, zusätzlich nach vollst. Erkalten 25 µM

Cerulenin (Stammlsg. 2.5mM in Ethanol, bei -20. lagern)

SCD 1.7 g Yeast Nitrogen Base, 5 g (NH4)2SO4, 20 Glucose,

50 ml (20x) AS-Mix

Zur Selektion von Transformanten diente das Medium ohne die jeweilige Aminosäure bzw.

Base im 20x AS-Mix.

AS-Mix (20x) AS-Mix (20x) 0,1 g Adenin, 0,2 g Arginin, 0,2 g Histidin, 0,2 g

Uracil, 0,2 g Tryptophan, 0,2 g Methionin, 0,3 g Isoleucin,

0,3 g Leucin, 0,3 g Threonin, 0,3 g Tyrosin, 0,3 g Serin,

0,3 g Valin, 0,5 g Phenylalanin

Die Aminosäuren und Basen wurden unter Erwärmen und Rühren in 500 ml MilliQ-Wasser

gelöst.

Page 103: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 89

4.1.4.2 Nährmedien für E. coli

SOC-Medium 20g Trypton, 5g Hefeextrakt, 0,6g NaCl, 0,2g KCl, 10ml 1M

MgSO4, 10ml 1M MgCl2, 10ml 2M Glucose

LB-Medium 10g Trypton, 5g Hefeextrakt, 10g NaCl, pH 7,5

4.2 Organismen

4.2.1 E. coli

DH5α supE44 hsdR17 (rk-mk+) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 ∆lacU169

(Ø80lacZM15)

4.2.2 S. cerevisiae

Stamm Genotyp Herkunft

BY4742 Mat α his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 Euroscarf Frankfurt

SC1260 Mat a ura3 leu2 his3 pra1 prb1 prc1 cps1

ABYS ∆fas2::LEU2 rho-

LS Biochemie

∆ybr159w MAT α his3 leu2 lys2 ura3

ybr159w::HIS5

LS Biochemie

fas1-268 X 2180-1A; Mat a LS Biochemie

fas2-385 X 2180-1A; Mat α LS Biochemie

fas2-438 X 2180-1A; Mat a LS Biochemie

fas2-469 X 2180-1A; Mat a LS Biochemie

fas-644 X 2180-1A; Mat a LS Biochemie

fas-1095 X 2180-1A; Mat α LS Biochemie

Page 104: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 90

4.3 Biochemische Methoden

4.3.1 Kultivierung von Mikroorganismen

4.3.1.1 Anzucht von E. coli-Zellen

E.coli-Zellen wurden auf Festmedium im Brutschrank bei 37°C angezogen. Flüssigkulturen

wuchsen bei 37°C in Reagenzgläsern (2–10 ml) auf einer Rolltrommel bzw. in

Erlenmeyerkolben (50–500 ml) auf einer Schüttelplattform.

4.3.1.2 Anzucht von Hefezellen

Das Wachstum von Hefezellen auf Festmedien erfolgte, soweit nicht anders angegeben, bei

30°C im Brutschrank. Flüssigkulturen wurden in Reagenzgläsern (2–8 ml) auf einer

Rolltrommel oder in Erlenmeyer- (30–3 000 ml) bzw. Fernbachkolben (400–1 000 ml)

unter Schütteln angezogen.

4.3.1.3 Zelldichte-Bestimmung von Flüssigkulturen

Die Zelldichte-Bestimmung von Hefe und E. coli-Kulturen erfolgte durch Messung der

Absorption im Spektralphotometer bei 600nm. Dabei entspricht ein Wert von A600 = 1,0 bei

E. coli einer Zelldichte von ca. 3·108 Zellen/ml und bei Hefe einer Zelldichte von ca. 2·107

Zellen/ml

4.3.2 Transformation von S. cerevisiae und E. coli-Zellen

4.3.2.1 CaCl2-Methode zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen

Lösungen ·

·

·

100mM MgCl2

100mM CaCl2

100mM CaCl2-Lösung, 15% (v/v) Glycerin

100ml LB-Medium wurde mit 1ml einer Übernachtkultur des E. coli-Stammes DH5α

beimpft. Die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von A600 = 0,5 angezogen und durch

Page 105: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 91

Zentrifugation (JA-14, 8000Upm, 4°C, 10 min) geerntet. Anschließend wurden die Zellen in

eiskalter MgCl2-Lösung resuspendiert, zentrifugiert (50ml Sarstadt-Röhrchen, 3000Upm,

4°C, 10 min), in CaCl2-Lösung resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Abschließend

wurden die Zellen erneut zentrifugiert (50ml Sarstadt-Röhrchen, 3000Upm, 4°C, 10 min) und

in eisgekühlter CaCl2-Lösung die zusätzlich 15% (v/v) Glycerin enthielt aufgenommen und je

100 µl in vorgekühlte, sterile Eppendorfgefäße aliquotiert. Die Zellen wurden bei -80°C

gelagert.

4.3.2.2 Transformation von CaCl2-behandelten E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA

Es wurden 100 µl der CaCl2-kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden die

Zellen mit etwa 1 µg DNA gemischt, 30 min zur Absorption des Plasmids auf Eis gehalten

und dann für 2 min einem „Hitzeschock“ bei 42°C ausgesetzt. Die Zellen wurden auf Eis

gekühlt und in 1 ml LB-Medium aufgenommen. Zur Regeneration (Expression der

Antibiotika-Resistenz) wurden die Zellen für 1h bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in

einer Eppendorf-Zentrifuge sedimentiert und in 200 µl LB-Medium resuspendiert. Die

Suspension wurde auf LB-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikazusatz ausplattiert und

bei 37°C über Nacht inkubiert.

4.3.2.3 Hefetransformation nach der modifizierten Lithiumacetat-Methode

Lösungen ·

·

·

LP-Mix: 40% Polyethylenglycol 4000, 0,1M Lithiumacetat, 10mM

Tris/HCl pH 7,5, 1mM EDTA

Carrier-DNA: auf 95°C erhitzt und geschert

TrE (10/1): 10mM Tris, 1mM EDTA pH 8,0

Der zu transformierende Hefestamm wurde über Nacht in einem geeigneten Medium bis zur

mittellogarithmischen Wachstumsphase kultiviert. 1,4ml der Kultur wurde in ein steriles

Eppendorfgefäß überführt und durch Zentrifugation sedimentiert. Das Sediment wurde durch

einen Rüttler kurz aufgelockert und anschließend wurden 10 µl Carrier-DNA-Lösung und ca.

2 µg der zu transformierenden DNA zugegeben. Nun wurden 500 µl LP-Mix und 55 µl

DMSO mit dem Ansatz vermischt und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 15

min Inkubation bei 42°C wurden 500 µl steriles TrE (10/1) zugegeben und die Zellen

abzentrifugiert (3000Upm, 2 min). Das Zellsediment wurde erneut in 1ml TrE (10/1)

Page 106: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 92

gewaschen und zentrifugiert (5000Upm, 2 min). Schließlich wurden die Zellen in 100 µl TrE

resuspendiert und auf einem geeigneten Selektivmedium ausplattiert.

4.3.3 Arbeiten mit DNA

4.3.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem „QIAprepSpin Plasmid Kit“ (Quiagen)

Lösungen Alle benötigten Lösungen sind im QIAprepSpin Plasmid Kit enthalten.

Die das entsprechende Plasmid enthaltenden E. coli-Zellen wurden über Nacht in 5ml

Antibiotikum-haltigem LB-Medium angezogen, in der Tischzentrifuge (13000Upm, 30s)

sedimentiert und in 250 µl Puffer P1 resuspendiert. Nach der Überführung in ein

Eppendorfgefäß wurden zuerst 250 µl Puffer P2 zugefügt und vorsichtig gemischt, dann

350 µl Puffer N3 zugegeben, wieder kurz gemischt und 10 min in der Tischzentrifuge

(13000Upm) abzentrifugiert. Der klare Überstand wurde auf eine QIAprep-Säule mit

Sammelgefäß gegeben und in der Tischzentrifuge (13000Upm, 30s) zentrifugiert.

Anschließend wurde die Säule zuerst mit 500 µl Puffer PB und dann mit 750 µl Puffer PE

gewaschen. Zur Entfernung der Waschpufferreste wurde die Säule nochmals zentrifugiert

(13000Upm, 60s) und dann in ein frisches Eppendorfgefäß gestellt. Die Plasmid-DNA wurde

eluiert, in dem man 50 µl H2O in die Mitte der Säule gab, diese 5 min stehen lies und dann in

der Tischzentrifugie zentrifugiert (13000Upm, 60s).

4.3.3.2 Restriktionsendonuclease-Spaltung von DNA

Lösungen ·

·

Puffer A, B, H, M, L: (Boehringer, Gibco)

Stop-Mix: 7 M Harnstoff, 40% Glycerin, 50 mM EDTA, 10 mM

Tris/HCL pH 8,0, 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylencyanol

Restriktionenzyme ermöglichen die Herstellung definierter DNA-Fragmente, die für den

Einbau in rekombinante Plasmide und deren Charakterisierung herangezogen werden können.

Plasmid-DNA wurde mit 1-2 U Restriktionsenzym pro 100 µg DNA in dem oben

aufgeführten Universalpuffer bei 37°C in einem Reaktionsvolumen von 15-80 µl für 2h

inkubiert. Zur Inaktivierung der Restriktionsenzyme wurden die Ansätze mit 100 µl Stop-

Mix versetzt.

Page 107: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 93

4.3.3.3 Analytische Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten

Lösungen ·

·

·

Agarose: Electrophoresis Grade (Gibco)

TBE-Puffer (1x): 89mM Tris, 89mM Borsäure, 2,5mM EDTA, pH 8,3

Ethidiumbromidlösung: 1% (w/v)

DNA-Restriktionsfragmente wurden durch eine Flachbett-Elektrophorese in 1% Agarosegel

aufgetrennt. Die Agarose wurde mit einem entsprechenden Volumen 1xTBE-Puffer versetzt,

erhitzt bis eine klare Lösung vorlag und sofort in die Gussform gefüllt. Die Elektrophorese

wurde bei 110V in 1xTBE durchgeführt. Anschließend wurde das Gel für 15 min in einer

Ethidiumbromidlösung gefärbt, wodurch die DNA-Banden bei 312nm sichtbar wurden. Durch

das Auftragen von Längenstandards konnte eine Größenbestimmung der DNA-Fragmente

erfolgen.

4.3.4 FAS Enzymreinigung aus Hefe

4.3.4.1 Zellaufschluß

Alle Arbeitsschritte wurden entweder im Kühlraum bei 4°C oder unter Eiskühlung

durchgeführt. Die gefrorenen Hefezellen wurden mit dem gleichen Volumen

Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 200 mM) aufgetaut und zu einer dickflüssigen homogenen

Suspension verrührt. Nach Zugabe von 2 mg/ml festen PMSF als Proteasehemmer kamen zur

Zellsuspension jeweils 1/3 Volumen Glasperlen, und das Gemisch wurde im

Glasperlenschüttler aufgeschlossen (8 x 30 sec mit Zwischenkühlung im Eisbad), das

Homogenat von den Glasperlen abdekantiert und Zellreste abzentrifugiert (8000 UpM, 15

min).

4.3.4.2 Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Sedimentation in der Ultrazentrifuge

Unter Rühren erfolgte die erste Ammoniumsulfat-Fällung (17,5 g / 100 ml) für 30 min. Die

ausgefallenen Proteine wurden abzentrifugiert (12000 UpM, 30 min) und der Protein-

Niederschlag verworfen. Der von der Fällung abdekantierte FAS-haltige Überstand wurde

einer zweiten Ammoniumsulfat-Fällung unterzogen (10,5 g / 100 ml) und wiederum

abzentrifugiert (12000 UpM, 60 min). Das Sediment dieser Fällung wurde in

Page 108: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 94

Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 200 mM) aufgenommen und mit Hilfe des Potter-

Homogenisators gelöst. Die trübe Lösung, bestehend aus dem FAS-Komplex und anderen

hochmolekularen Komponenten, wurden sedimentiert (38000 UpM, 8h).

Der Niederschlag wurde in Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 200 mM) aufgenommen, durch

Plümpern homogenisiert und die erste (17,5 g / 100 ml) und zweite (10,5 g / 100 ml)

Ammoniumsulfatfällung wie oben beschrieben wiederholt. Wiederum erfolgte die

Homogenisierung und Sedimentierung (38000 UpM, 8 h) des Niederschlags der zweiten

Fällung. Der entstanden Niederschlag wurde in 6-12 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 50

mM) aufgenommen und wenn nötig klarzentrifugiert (15000 Upm, 1h).

4.3.4.3 Saccharose-Dichtegradient-Zentrifugation

Zur weiteren Aufreinugung der Enzympräparation wurden jeweils 1/6 Volumen (max 1,5 ml)

der enthaltenen Enzymlösung auf die Oberfläche eines Rohrzuckergradienten (30 ml

Röhrchen) pipettiert (Gradient linear aufgebaut aus 10%iger und 30%iger Saccharose-

Lösung).

Die Auftrennung des Proteingemischs im Gradienten erfolgte durch Ultrazentrifugation

(25000 UpM, 15 h, SW27 Ausschwingroter). Nach Beendigung des Laufs konnte das FAS-

assoziierte Flavin mittels seitlicher Bestrahlung der Röhrchen mit UV-Licht zur Fluoreszenz

angeregt und sichtbar gemacht werden. Anschließend wurde eine 10 cm lange Injektionsnadel

1-2 mm über den Röhrchenboden eingeführt und die Lösung unter Verwendung einer

peristalltischen Pumpe in 1,5 ml Tropfen-Fraktionen ausgetropft.

Durch UV-Messung bei 280 nm wurden die proteinhaltingen Fraktionen bestimmt. Die FAS-

haltigen unter ihnen wurden vereinigt, mit Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 50mM) auf das

doppelte Volumen aufgefüllt und in de Ultrazentrifuge sedimentiert (38000 rpm, 8-10 h). Die

abzentrifugierte, gereinigte Fettsäuresynthase wurde in geringen Volumen

Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3, 50 mM) gelöst (ca. 1 ml), mit dem gleichen Volumen

Glycerin versetzt und bei -20°C gelagert. Eine andere und für die Stabilität der

Enzymaktivität bessere Aufbewahrungsmöglichkeit besteht darin, die vereinigten

proteinhaltigen Fraktionen einer Ammoniumsulfat-Totalfällung zu unterziehen (30 g / 100

ml). Die Proteinfällung wurde abzentifugiert (12000 rpm, 30 min) und mit einem Tropfen

Glycerin versetzt. Auch in dieser Form erfolgte die Lagerung der Fettsäuresynthase bei -20°C.

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MATERIAL UND METHODEN 95

4.3.5 FAS Aktivitätsmessungen [LYN3]

4.3.5.1 FAS-Gesamtreaktion

Lösungen ·

·

·

·

0,1M Kaliumphosphatpuffer pH 7,3

Acetyl-CoA (20 mg/ml)

Acetessigsäureethylester (purum)

100mM Cystein·HCl 100mM KOH; BSA (20 mg/ml); NADPH (30

mg/ml); Malonyl-CoA (20 mg/ml);

In eine 1ml Quarzküvette wurden (700 – X) µl Kaliumphosphatpuffer, 100 µl Cystein·HCl

und 100 µl KOH gegeben. Nach mehrmaligem Invertieren der Küvette wurden 50 µl BSA,

20 µl Acetyl-CoA, ca. 10 µl NADPH und X(10-50) µl der FAS-Enzymlösung beigegeben.

Anschließend wurde der Ansatz erneut mehrmals invertiert und die nicht-enzymatische

Extinktionsabnahme wurde für 2 min bei 366nm vermessen (Null-Linie). Anschließend wurde

die Küvette aus der Halterung des Photometers genommen und die FAS-Reaktion wurde

durch die Zugabe von 20 µl Malonyl-CoA initiiert. Die Küvette wurde noch mehrmals

invertiert und in die Photometerhalterung zurückgestellt. Der NADPH Verbrauch wurde für

2-15 min bei 366nm verfolgt.

4.3.5.2 β-Ketoacylreduktase Reaktion

In eine 1ml Quarzküvette wurden (720 – X) µl Kaliumphosphatpuffer, 100 µl Cystein·HCl

und 100 µl KOH gegeben. Nach mehrmaligem Invertieren der Küvette wurden 50 µl BSA,

ca. 10 µl NADPH und X(10-50) µl der FAS-Enzymlösung beigegeben. Anschließend wurde

der Ansatz erneut mehrmals invertiert und die nicht-enzymatische Extinktionsabnahme wurde

für 2 min bei 366nm vermessen (Null-Linie). Anschließend wurde die Küvette aus der

Halterung des Photometers genommen und die FAS-Reaktion wurde durch die Zugabe von

20 µl Acetessigester initiiert. Die Küvette wurde noch mehrmals invertiert und in die

Photometerhalterung zurückgestellt. Der NADPH Verbrauch wurde für 2-15 min bei 366nm

verfolgt.

Page 110: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 96

4.3.5.3 Auswertung

Die spezifische FAS-Aktivität wurde wie folgt berechnet:

[]366]/[Pr

][Prmin]/[

][2

1000]/[.

366

366

nmbeiNADPHvonntskoeffizieExtinktionmolarermlmgntrationoteinkonzeC

mlnobenvolumeVEMinuteprosänderungExtinktionE

mlnTestvolumeVCV

EVmgmUAktivitätspez

P

P

T

PP

T

====∆=

⋅⋅⋅∆⋅⋅

=

ε

ε

Anmerkung: Bei der Berechnung der spezifischen FAS-Aktivität nach Lynen tritt im Nenner

der Faktor 2 auf, da pro Synthesezyklus 2 Äquivalente NADPH verbraucht werden.

4.3.5.4 Radioaktiver FAS-Test

Lösungen ·

·

·

·

·

Aufschlusspuffer: 50 mM Tris pH 7.3, 50 mM KCl, 1 mM EDTA

[2]-14C- Malonyl-Coenzym A: 30000 cpm

Stearin- und Palmitinsäure: gesättigt in Petrolether

methanolische KOH: 6 M; Essigsäure: 3 M

Cystein·HCl: 100 mM; KOH: 100 mM; Glucose-6-Phosphat: 100 mM;

NADPH: 100 mM; Acetyl-Coenzym A: 10 mM; Malonyl-Coenzym A:

6mM; BSA: 10 mg/ml; Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase: 0,8 mg/ml

Die bis zur OD600 = 1.0 angewachsene Hefe wurde geerntet und mit Aufschlusspuffer wie in

mit Glasperlen aufgeschlossen. Der Gesamtproteingehalt des Zellrohextraktes wurde mit dem

Bradford-Test bestimmt. 100 µg Zellextrakt in 676 µl Aufschlusspuffer wurden in einem 1.5

ml Eppendorf-Gefäß mit 100 µl Cystein-HCl, 100 µl KOH, 10 µl Glucose-6-Phosphat, 20 µl

NADPH, 20 µl Acetyl-CoA und 12.5 µl Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase vermischt. 10 µl

nicht-radioaktives Malonyl-CoA wurden mit 30000 cpm [2]-14C-Malonyl-CoA vermengt.

Durch Zugabe des Malonyl-CoA Gemischs wurde die FAS-Reaktion gestartet und die

Enzymlösung bei 30°C für 30 min inkubiert. Anschließend wurde die Lösung in ein

Glasröhrchen mit Teflondeckel überführt und die Enzymreaktion mit 2 ml 6M HCl in

Methanol gestoppt. Gebildete Fettsäuren wurden in Gegenwart von 20µl Stearin- und

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MATERIAL UND METHODEN 97

Palmitinsäure (ges. in Petroether) durch Hydrolyse bei 95°C für 5 h von kovalent gebundenen

Phosphoglyceriden und Proteinen freigesetzt und durch 3-maliges Auschütteln mit Petrolether

extrahiert. Die Extrakte wurden in einem neuen Glasröhrchen mit Teflondeckel gesammelt

und, um nicht eingebautes radioaktives Malonyl-CoA zu entfernen, einmal mit 3 N Essigsäure

gewaschen. Die organische Phase (oben) wurde möglichst vollständig abgesaugt und in ein

Szintillations-Zählgefäß gefüllt. Die Petroletherfraktion wird 3-malig mit 2 ml 3 M Essigsäure

gewaschen und anschließend unter stetem Stickstoff-Einstrom eingedampft. Der Rückstand

wird in 5 ml Szintillationscocktail (Rotiszint Eco Plus, Fa. Roth) aufgenommen. Die

Radioaktivität wurde im Szintillationszähler vermessen. Alternativ zu dem beschriebenen

Verfahren werden für die Auftrennung der Fettsäuren durch die RP-HPLC insgesamt 100000

cpm [2]-14C- Malonyl-Coenzym A eingesetzt.

4.3.6 Dissoziation und Reassoziation von Hefe-FAS nach der DMMA-Methode

[WER, MIT]

Lösungen ·

·

·

·

·

Spaltpuffer: 300mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5

DMMA: Dimethylmaleinsäureanhydrid in THF (100 mg/ml)

BSA: 10 mg/ml

Titrationslösung: 100mM Essigsäure gesättigt mit (NH4)2SO4

(NH4)2SO4-Puffer: 300mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,9 ges. mit

(NH4)2SO4

Reaktivierungspuffer: 100mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5, 10mM DTT,

20 µM FMN, 0,5mM EDTA

In einem 2 ml Eppendorfgefäß wurden 4 mg FAS in 500 µl Spaltpuffer gelöst. Die FAS- und

die Ketoreduktase-Aktivität werden mit jeweils 10 µl des Ansatzes vermessen. Unter

Eiskühlung wird die FAS nun durch Zugabe von 6 µl DMMA-Lösung für 8 min dissoziiert.

Nun werden 8 µl Mercaptoethanol zugegeben und kurz durchmischt. Anschließend wird die

FAS-Aktivität und die Ketoreduktase-Aktivität mit jeweils 10 µl des Ansatzes erneut

vermessen. Nun werden 300 µl BSA zugegeben. Der Ansatz wird langsam (ca. 5 min), unter

ständigem Rühren und pH-Kontrolle mit einer Mini-Elektrode mit jeweils 50 µl Portionen

mit der Titrationslösung auf pH 5,9 titriert. Nun werden 500 µl (NH4)2SO4-Puffer zugegeben

und die entstandene Trübung für 30 min bei 4°C an einer Tischzentrifuge abzentrifugiert

(4°C, 14000 UpM). Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag wird in 460 µl

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MATERIAL UND METHODEN 98

Reaktivierungspuffer gelöst und für 5 min gerührt. Die FAS- und die Ketoreduktase-Aktivität

werden mit jeweils 10 µl des Ansatzes nach 240 min vermessen.

4.3.7 Elongase Aktivitätstest

Lösungen ·

·

·

·

Aufschlusspuffer: 50mM Tris-Cl (pH 7.4), 50mM KCl, 10% Glycerin, 2

ml 0.5M EDTA

[2]-14C-Malonyl-CoA: 100000 cpm

methanolische HCl: 6M

Acyl-CoA: 1mM; Malonyl-CoA: 5mM; BSA: 5 mg/ml; Cerulenin: 1mM;

NADPH: 4 mg/ml; DTT: 3 mg/ml

Die bis zur OD600 von 1.0 angewachsene Hefe wurde geerntet und mit dem Aufschlusspuffer

mit Glasperlen aufgeschlossen. Die Membranfraktion wurde durch Ultrazentrifugation

(100000g, 1h, 4°C) sedimentiert und in möglichst wenig Aufschlusspuffer mit einem Potter-

Elvejhem Homogenisator resuspendiert. Der Gesamtproteingehalt der so gewonnenen

Membranfraktion wurde mit dem Bradford-Test bestimmt. 500 µg Gesamtprotein wurden in

einem 1.5 ml Eppendorf-Gefäß mit 20 µl Acyl-CoA, 20 µl NADPH, 10 µl DTT 10 µl BSA

und 10 µl Cerulenin vermischt. Die Elongasereaktion wurde mit einem Gemisch aus 2 µl

nicht-radioaktivem Malonyl-CoA und radioaktivem Malonyl-CoA (insgesamt 100000 cpm)

gestartet. Die Enzymreaktion fand bei 30°C für 1 h statt. Anschließend wurde die Lösung in

ein Glasröhrchen mit Teflondeckel überführt und die Enzymreaktion mit 2 ml 6 M HCl in

Methanol gestoppt. Gebildete Fettsäuren wurden durch Hydrolyse bei 95°C für 5 h

freigesetzt. Vor dem Extrahieren der Fettsäuren durch 3-maliges Ausschütteln mit Petrolether

wurden diese mit 10 µl einer gesättigten Fettsäurestandardlösung, bestehend aus Fettsäuren

der Kettenlängen C14–C26 versetzt. Die Extrakte wurden in neuen Glasröhrchen mit

Teflondeckel gesammelt und der Petrolether mit Stickstoff verblasen. Die Proben wurden

dann mit p-Bromphenacylbromid derivatisiert und mittels Radio-HPLC untersucht.

4.3.8 Gaschromatographische Analyse von Fettsäuremethylestern

Lösungen ·

·

·

Chloroform/Methanol: (2:1)

methanolische HCl: 83% (v/v) Methanol, 17% (v/v) HCl konz.

NaCl: gesättigt

Page 113: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 99

50 ml Hefekultur wurde bis zur spätlogarithmischen Phase (OD600 = 2–3) angezogen.

Geernte Zellen wurden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und in der

Gefriertrocknungsanlage Alpha 1–2 (Fa. Christ) vollständig lyophilisiert. Die pulverisierten

Zellextrakte wurden in Glasröhrchen mit Teflondeckel überführt. Zur Hydrolyse und

Methylierung der Fettsäuren wurden 2 ml 6M methanolische HCl zugegeben und die Extrakte

durch starkes Schütteln (Vortex) gelöst. Die Glasröhrchen wurden mit Teflondeckeln fest

zugeschraubt und die Lösungen bei 95°C über Nacht inkubiert. Die gebildeteten Fettsäure-

Methylester wurden 3 Mal mit Petrolether augeschüttelt und die Extrakte in neuen

Glasröhrchen gesammelt. Der Petrolether wurde durch im Stickstoff-Strom eingedampft und

der Rückstand in 20 µl Petrolether aufgenommen. Jeweils 1 µl der Proben wurden für die

gaschromatographische Analyse verwendet. Als stationäre Phase diente eine HP-5

Kapillarsäule (unpolar, 0.2mmx 25 m). Die Substrattrennung erfolgte in 25 min unter

folgenden Bedingungen:

Injektionstemperatur: 280°C

Ofentemperatur: 100°C auf 280°C bei 10 °C/min

Ausglühen: 280°C für 6 min

Trägergas: Helium

Die Fettsäure-Methylester wurden mit einem Flammenionisationsdetektor, der durch ein

Wasserstoff-Sauerstoff-Gemisch gezündet wurde, bei 300°C nachgewiesen.

4.3.9 „Reversed-Phase“-HPLC Analyse von Fettsäure-Gemischen

Lösungen ·

·

·

·

·

Puffer A: Methanol:Acetonitril:Isopropanol = 10:3:1

Puffer B: (Puffer A : Wasser) = 1:1

Dimethylformamid (DMF)

p-Bromophenacylbromid;

N,N-Diisopropylethylamin

Bevor die aus dem Reaktionsansatz extrahierten Fettsäuren mittels Radio-HPLC aufgetrennt

und im Radio- bzw. UV-Detektor analysiert werden konnten, wurden sie zu p-

Bromophenacylester derivatisiert. Aufgrund des dabei eingeführten aromatischen Rings

konnten sie anschließend als p-Bromophenacylester optisch bei 254 nm detektiert werden.

Dazu wurden in Glasröhrchen mit Teflondeckel die getrockneten Fettsäuren mit 80 µl

Page 114: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 100

Dimethylformamid, 10 µl p-Bromophenacylbromid und 10 µl N,N-Diisopropylethylamin

versetzt und für 1 h bei 65°C im Heizblock erhitzt. Diese Lösung wurde direkt in die HPLC

injiziert. Die Fettsäuren wurden üuber eine Prontosil 120-5-C18-SH 5.0 µm (250 x 4.0mm

inkl. Vorsäule) RP-HPLC Säule der Fa. Bischoff (Leonberg) nach folgenden Bedingungen

aufgetrennt:

Gradient: 0–15 min 92% A, 8% B ! 100% A, 0% B

15–50 min 100% A, 0% B

50–55 min 100% A, 0% B ! 92% A, 8% B

55–64 min 92% A, 8% B

Flussrate: 0,6 ml/min

Die Radioaktivität wurde durch eine Solarscint (400µl) Feststoff-Flusszelle mit dem

Radiodetektor Radiomatic 500TR (Fa. Packard) gemessen und zusammen mit den

Massenpeaks durch das Analyseprogramm „Flow-Analyzer“ der Firma Packard ausgewertet.

4.3.10 Isolierung von FAS-freien Hefemembranen

Lösungen ·

·

·

Aufschlusspuffer: 50mM Tris·HCl pH 7,4, 300mM Saccharose, 0,1mM

EDTA

Waschpuffer: 50mM Tris·HCl pH 7,4, 0,1mM EDTA

Waschpuffer mit Triton X-100: Waschpuffer, 1% Triton X-100

In YPD Vollmedium gewachsene Hefezellen wurden in der späten logarithmischen Phase

durch Zentrifugation geerntet und dreimal in destilliertem Wasser gewaschen. Pro 1g Hefe

wurden dann 1 ml Aufschlußpuffer, 1g Glasperlen, 1 µl Leupeptin, 1 µl Pepstatin und 5 µl

Phenylmethansulfonylfluorid zugegeben. Anschließend wurden die Zellen insgesamt 5 Mal

im Braun Zellhomogenisator für jeweils 15 sec aufgeschlossen und zwischendurch jeweils 1

min im Eisbad gekühlt. Das Zellhomogenisat wurde für 10 min zentrifugiert (Rotor: Heraeus

8179, 3200Upm) und dabei von groben Zelltrümmern und nicht aufgeschlossenen Zellen

befreit. Der Überstand (Rohextrakt) wurde mit Aufschlußpuffer auf 5 ml aufgefüllt und für 30

min bei 20000xg zentrifugiert. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde in 5ml Waschpuffer

homogenisiert und für 30 min auf Eis gestellt. Anschließend wurde die Suspension erneut für

30 min bei 20000xg zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde insgesamt 6 Mal wiederholt.

Page 115: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 101

4.3.11 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen [BOL]

Lösungen ·

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·

·

·

Tris/Glycin Laufpuffer: 250mM Tris·HCl, 1,92M Glycin, 1% SDS, pH 8,3

Acrylamidlösung: 30% Acrylamid, 0,8% Methylenbisacrylamid in H2O

Lower-Tris (4x): 1,5M Tris·HCl, 0,4% SDS, pH 8,8

Upper-Tris (4x): 0,5M Tris·HCl, 0,4% SDS, pH 6,8

TEMED

Ammoniumpersulfat: 10%ige Lösung

Probenpuffer (5x): 60mM Tris·HCl pH 6,8, 25% Glycerin, 2% SDS,

20mM DTT, 0,1% Bromphenolblau

Die gelelektrophoretische Untersuchung von Zellrohextrakten und gereinigten

Enzympräparationen erfolgte in vertikalen Polyacrylamid-Flachgelen (10 x 10 cm) von 1mm

Dicke.

Trenngel 5% Sammelgel 3%

H2O 2,8ml 1,54ml

Lower-Tris (4x) 1,25ml

Upper-Tris (4x) 625 µl

30% PAA 0,83ml 250 µl

10% APS 150 µl 125 µl

TEMED 10 µl 10 µl

Der Ansatz für das Trenngel wurde zusammenpipettiert, zügig in die Gelkassette gegossen

und mit Isopropanol überschichtet. Nach der Polymerisation wurde der Alkohol abgegossen

und der Sammelgel-Ansatz über das Trenngel gefüllt. Zu den Proteinproben wurde 1/5

Probenpuffer gegeben. Die Proben wurden für 5 min auf 97°C erhitzt. Die Elektrophorese

erfolgt bei 160V für ca. 200 min in 1x Tris/Glycin-Laufpuffer.

Page 116: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 102

4.3.12.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen und Immundetektion

4.3.12.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen

Lösungen · Transferpuffer: 28mM Tris, 39mM Glycin, 0,04% SDS

Der Transfer elektrophoretisch aufgetrennter Proteine auf eine Nitrozellulose-Membrann

erfolgte im sogenannten „Semi-dry“-Verfahren unter Verwendung des „Nova-Blot“-Gerätes

der Firma Pharmacia/LKB. Fünf Lagen Whatman-3M-Papier in Gelgröße wurden in

Transferpuffer getränkt und auf die gewässerte Graphitanode geschichtet. Darauf wurde die

Membran und auf diese wiederum das Proteingel luftblasenfrei aufgelegt. Fünf weitere Lagen

in Transferpuffer getränktes Whatman-3M-Papier und die gewässerte Graphitkathode wurde

aufgelegt. Der Transfer erfolgte für 90 min bei einer Stromstärke von 0,8mA/cm2 Gelfläche.

4.3.12.2

Nachweis von ProteinA-markierter Proteine mit Peroxidase-

Antiperoxidase (PAP)-Antikörpern

Lösungen ·

·

·

TBS (10x): 0,1 M Tris·HCl, 1,5 M NaCl, pH 8,0

0.05% Tween20 in TBS

3% Magermilch in TBS

Die mit TBS-Milchlösung blockierte PVDF Membran wurde zweimal in MilliQ unter

Schwenken gewaschen und in 10 ml einer frischen TBS-Milchläsung mit PAP-Antikörpern in

der Verdünnung 1:5000 für 1 h bei Raumtemperatur unter leichter Bewegung inkubiert.

Anschließend wurde die Membran erneut zweimal mit MilliQ gewaschen und für 3–5 min in

10 ml TBS-0.05% Tween 20 geschüttelt. Danach wurde rasch 4–5 Mal in MilliQ gespült und

die Färbereaktion nach der ECL-Methode (s.u.) durchgeführt.

4.3.12.3 „Enhanced Chemoluminescense“ (ECL)-Methode

Lösungen ·

·

ECL1: 10 ml 100mM Tris-Cl (pH 8.5), 44 µl Kumarsäure,100 µl 250mM

Luminol

ECL2 (10 ml 100mM Tris-Cl, 6 µl H2O2)

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MATERIAL UND METHODEN 103

Die in MilliQ gewaschene PVDF-Membran wurde in einer unmittelbar zuvor hergestellten

Mischung der Lösungen ECL1 und ECL2 für 1 min bei Raumtemperatur inkubiert und

anschließend in einer Röntgenfilmkassette zwischen transparenten Küchenfolien

eingeschlagen. So schnell wie möglich wurden dann in der Dunkelkammer Röntgenfilme

durch Auflegen auf die Membran unterschiedlich lange exponiert (5 sec bis 5 min) und in

einer Entwicklermaschine entwickelt. Anschließend wurden die fixierten Filme nochmals

mit Wasser gewaschen und getrocknet.

4.3.13 Zellaufschluss von S.cerevisiae

Lösungen ·

·

Aufschlusspuffer: abhängig von der nachfolgenden Aufarbeitung des

Zellextraktes (wird entsprechend angegeben)

Proteaseinhibitoren: PMSF 7 mg/ml in Isopropanol, Leupeptin

0.5 mg/ml, Pepstatin A 0.68 mg/ml in Methanol

Fertig angewachsene Zellkulturen wurden durch Zentrifugation (3500 UpM, 5 min, 4°C)

geerntet, mit 50 ml MilliQ-Wasser gewaschen und nach der erneuten Zentrifugation für

mindestens 1 h bei −80°C eingefroren. Kurz vor dem Aufschluss wurde eine für den Versuch

ausreichende Menge an Zellen aufgetaut und mit der gleichen Menge Aufschlusspuffer

versetzt. Die Proteaseinhibitoren wurden in den Konzentrationen PMSF 5 µl, Leupeptin 1 µl,

Pepstatin A 1 µl pro ml Zellsuspension zugegeben. Der Aufschluss erfolgte mit dem gleichen

Volumen Glasperlen in einem speziellen Schüttelgerät mit Zwischenkühlung im Eis-Wasser

Bad für jeweils 6x 30 sec. Der Überstand wurde in einem JA14-Becher abdekantiert und die

verbliebenen Glasperlen mit mind. 1 Volumen Aufschlusspuffer nachgewaschen. Die

vereinigten Zellextrakte wurden durch Zentrifugation (4 000 UpM, 10 min, 4.) von groben

Zelltrümmern befreit und das geklärte Zell-Lysat in ein neues Gefäß gefüllt.

4.3.14 In vivo Mutagenese mit Ethylmethansulfat [ADA]

Lösungen ·

·

·

Mutagenesepuffer: 0,1M Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,0

EMS: Ethylmethansulfat;

Natriumthiosulfat: 5%

Page 118: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 104

Für die in vivo Mutagenese wurden Hefe-Zellen in YPD-Medium bei 30°C zur frühen

stationäre Phase (1,3 x 108 Zellen/ml) hochgezogen. Die Zellen wurden geerntet, zweimal in

sterilem Wasser gewaschen und in 1ml sterilem Mutagenesepuffer resuspendiert. Die exakte

Zelldichte wurde mittels einer Thoma Zählkammer bestimmt. Die Suspension wurde halbiert.

Zu der einen Hälfte wurden 15 µl EMS zugegeben, die andere diente als nicht-mutagenisierte

Kontrolle, um später die Überlebensrate zu bestimmen. Beide Gefäße wurden 3h bei 30°C

inkubiert. Die Zellen wurden anschließend abzentrifugiert, in sterilem Wasser aufgenommen,

in ein frisches Gefäß überführt und dann zweimal mit Natriumthiosulfat gewaschen. Die

mutagenisierten Zellen wurden in 500 µl Wasser aufgenommen und in geeigneter

Verdünnung auf YPDFS-Platten ausplattiert, so dass pro Platte 100-200 überlebende

anwuchsen. Der Verdünnungsfaktor wurde durch Vorversuche bestimmt. Von den nicht-

mutagenisierten Kontrollzellen wurde eine vergleichbare Menge ausgebracht. Die Platten

wurden fünf Tage bei 30°C inkubiert und danach die Zahl der angewachsenen Kolonien

bestimmt bzw. die mutierte Kultur auf Selektiv-Nährböden weiter bearbeitet.

4.3.15 Isolierung und Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern der Hefe

4.3.15.1 Isolierung nach Mancha et al. [MAN]

Lösungen ·

·

·

·

·

Aufschlußpuffer: Isopropanol / 50mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,2 (1:1,

v/v), BSA (1 mg/ml), MgCl2 (5mM), Essigsäure 12,5 µl/ml; Petrolether:

gesättigt mit 50% wässrigem Isopropanol

(NH4)2SO4: gesättigte, wässrige Lösung

Extraktionslösung: Chloroform / Methanol (1:2, v/v)

Waschpuffer: Methanol / 20mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,0 (1:1, v/v)

Margaroyl-CoA: 1mM

Der zu untersuchende Hefestamm YPD Vollmedium bis zur mittellogarithmischen

Wachstumsphase kultiviert, geerntet und in destilliertem Wasser gewaschen. In einem

verschließbaren Glasröhrchen wurden pro Gramm Hefe 1 ml Aufschlußpuffer gegeben.

Anschließend wurden 1 g Glasperlen und 10 µl Margaroyl-CoA dazugegeben. Die Zellen

wurden insgesamt 10-20 Mal für 30 sec durch starkes Schütteln (Vortex) aufgeschlossen.

Zwischendurch wurden die Proben für 1 min auf Eis gekühlt. Nach dem vollständigen

Aufschluß der Zellen wurden pro Milliliter ursprünglich zugesetztem Aufschlußpuffer 1

Page 119: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 105

weiterer ml Aufschlußpuffer dazugegeben. Die Proben wurden dreimal mit Petrolether

ausgeschüttelt. Anschließend wurden noch pro Milliliter ursprünglich beigesetztem

Aufschlußpuffer 50 µl (NH4)2SO4-Lösung und 8 ml Extraktionslösung (Chloroform /

Methanol (1:2, v/v)) langsam (3-5 min) unter Schütteln dazugegeben. Die Lösung wurde für

20 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend für 10 min klarzentrifugiert.

Der Überstand wurde über eine Glassäule (0,6 x 30cm), welche 0.75g neutrales

Aluminiumoxid enthielt gegossen. Anschließend wurde das Gel zunächst mit 15 ml

Extraktionslösung (Chloroform / Methanol (1:2, v/v)) und dann mit 10 ml Diethylether

gespült, im Stickstoffstrom getrocknet und in ein Glasröhrchen überführt. Das getrocknete

Gel wurde in 5 ml Waschpuffer (Methanol / 20mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,0 (1:1, v/v))

aufgenommen und für 30 min bei 4°C durchmischt. Abschließend wurde das Aluminiumoxid

durch Zentrifugation sedimentiert. Der Überstand wurde abdekantiert, über eine mit

Glaswolle gefüllte Pasteurpipette filtriert und im Vakuum eingeengt.

4.3.15.2 Isolierung nach Maningo et al. [MAG]

Lösungen ·

·

·

Aufschlußpuffer: Chloroform / Methanol (1:2, v/v)

Kaliumphosphatpuffer: 10 mM, pH 5,3

Margaroyl-CoA: 1 mM

Die Hefe wurde bis zur mittellogarithmischen Wachstumsphase gezüchtet, durch

Zentrifugation geerntet und in destilliertem Wasser gewaschen. In ein

Glasperlenaufschlußgefäß wurden 4g Hefe, 4ml Aufschlußpuffer, 4g Glasperlen und 10 µl

Margaroyl-CoA gegeben. Das Gemisch wurde in 20-30 Intervallen für jeweils 15 sec

aufgeschlossen und zwischenzeitlich jeweils für 1 min auf Eis gekühlt. Die Suspension wurde

in ein Glasröhrchen überführt. Die im Aufschlußgefäß zurückgebliebenden Zellen wurden mit

2ml Aufschlußpuffer zweimal gespült und auch in das Glasröhrchen überführt. Die

Suspension wurde für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein weiteres Glasröhrchen

überführt, mit 2,1 ml Kaliumphosphatpuffer und 2,1 ml Chloroform vermischt, für 1 min am

Schüttler durchmischt und für 10 min zentrifugiert. Die chloroformhaltige Phase (unten)

wurde entfernt. Anschließend wurde die methanolische Phase erneut mit 2,1 ml Chloroform

gewaschen. Abschließend wurde das Methanol im Stickstoffstrom entfernt.

Page 120: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 106

4.3.15.3 Isolierung nach Rosendal et al. [ROS]

Lösungen ·

·

·

·

·

·

Perchlorsäure: 6,6 M bzw. 10 mM

BSA: 3 mg/ml - frei von Fettsäuren

Chloroform

Methanol

Extraktionspuffer: 2 ml Isopropanol, 2 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer

pH 7,2, 50 µl Eisessig, 80 µl BSA (50 mg/ml)

Margaroyl-CoA: 1 mM

Das Wachstum der Hefezellen wurde durch Zugabe von 10% eisgekühlter 6,6 M

Perchlorsäure (6,6M) zu 100 ml einer Zellsuspension (OD600 = 1,0) gestoppt. Die Zellen

wurden bei 4°C abzentrifugiert, in 5 ml 10 mM Perchlorsäure resuspendiert und in

Glasröhrchen überführt. Die Zellen wurden erneut abzentrifugiert. Zu den Zellen wurden

10 µl 1 mM Margaroyl-CoA, 100 µl BSA, Wasser (ad 800 µl) und 1g Säure-gewaschenen

Glasperlen gegeben. Anschließend wurden 3ml Chloroform/Methanol (2:1) dazugegeben und

die Zellen insgesamt 60mal in 30 Sekunden Intervallen (zwischen den Intervallen 1 min auf

Eis kühlen) durch starkes Schütteln (Vortex) aufgeschlossen. Nach dem Zellaufschluß wurden

1ml Chloroform und 1ml Wasser zugemischt und für 10 min bei 4500 Upm (4°C)

zentrifugiert (Heraeus Multifuge 3 S-R). Die obere Phase wurde nun vorsichtig mit einer

Glaspipette entfernt. Gleichzeitig wurde das Glasröhrchen gedreht, so dass die Interphase an

der Glaswand hängen blieb. Danach wurde auch die untere Phase vorsichtig mit einer

Glaspipette entfernt. Die Interphase wurde im Stickstoffstrom getrocknet und die Glasperlen

wurden entfernt. Zu der getrockneten Interphase wurden 200 µl Extraktionspuffer und 0,1g

Glasperlen gegeben. Die Probe wurde 10 mal in 30 Sekunden Intervallen (zwischen den

Intervallen 1 min auf Eis kühlen) stark geschüttelt (Vortex) und für 20 min auf Eis stehen

gelassen. Anschließend wurde die Probe für 10 min bei 4500 Upm (4°C) zentrifugiert

(Heraeus Multifuge 3 S-R). Der Überstand wurde in ein Glasröhrchen überführt, im Vakuum

(Speedvac) getrocknet, in 100 ml Extraktionspuffer resuspendiert und direkt auf die HPLC-

Säule aufgetragen (vgl. 4.3.15.4).

Page 121: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 107

4.3.15.4 Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern durch RP-HPLC

Lösungen ·

·

Puffer A: 20% (v/v) Acetonitril, 80% Kaliumphosphatpuffer (25mM, pH

5,3)

Puffer B: 70% (v/v) Acetonitril, 25% Kaliumphosphatpuffer (25mM, pH

5,3)

Die oben hergestellte Lösung wurde direkt auf die Säule aufgetragen. Zur Auftrennung der

Acyl-CoA-Ester wurde eine Prontosil C18-SH 5 µm (250mm x 4,6mm inkl. Vorsäule, Fa.

Bischoff) RP-HPLC-Säule unter den folgenden Bedingungen verwendet:

Flußrate: 0,5ml/min

0-5 min: 80% Puffer A; 5-15 min: 80% Puffer A - 50% Puffer A; 15-20: min 50% Puffer A;

20-50 min: 50% Puffer A - 0% Puffer A; 50-55 min: 0% Puffer A; 55-60 min: 0% Puffer A -

85% Puffer A; 60-65 min: 85%Puffer A

4.3.16 Proteinbestimmung nach Bradford [BRA]

Lösungen ·

·

Bradford Stammlösung: 100ml Ethanol (95%), 200ml ortho-

Phosphorsäure (88%), 350 mg Coomassie Brilliant Blue G-250

Bradford Arbeitslösung: 15ml Ethanol, 30ml ortho-Phosphorsäure (88%),

30ml Stammlösung, ad 500ml aq. dest.

BSA: 1,0 mg/ml

Zunächst wurde mit einer BSA-Lösung bekannter Konzentration eine BSA-Eichkurve mit 5

Meßpunkten (2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 µg/ml entsprechend 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 der BSA-

Lösung ad 100 µl H2O) hergestellt. Die Proteinprobe wurde –gegebenenfalls verdünnt- in

unterschiedlichen Mengen (2 - 100 µl ad 100 µl H2O) eingesetzt, so dass jeweils 2,5 –

12,5 µg Protein in den Proben enthalten waren. Zu allen Ansätzen wurde zügig 1ml Bradford

Arbeitslösung gegeben, kurz durchgemischt und nach 5 min (spätestens nach 30 min) die

Extinktion bei 595nm vermessen. Aus den Messwerten wurde das arithmetische Mittel

gebildet.

Page 122: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 108

4.4 Chemische Methoden

4.4.1 Synthese von Stearoylchlorid

Ein Zweihals-Reaktionskolben wurde mit einem Rückflußkühler und

einem Tropftrichter ausgestattet. In den Kolben wurden 142g

Stearinsäure gegeben. Über einen Zeitraum von 40 min wurden

langsam 44ml Thionylchlorid zugegeben. Der Kolben wurde im

Wasserbad für 30 min unter dem Rückflußkühler erhitzt.

4.4.2 Synthese von 3-Oxoeicosansäuremethylester

Diese Verbindung wurde durch die

Acetessigesterreaktion hergestellt. Eine Lösung aus 13,6

g Acetessigsäureethylester, 2,0 g gepulvertem Natrium

und 100 ml wasserfreiem Benzol wurde für 2h unter dem

Rückflußkühler erhitzt. Diese Lösung wurde im Eisbad

abgekühlt und 0,08 Mole Stearoylchlorid wurden unter Rühren innerhalb von 15 min

dazugegeben. Die Lösung wurde für 15 min unter dem Rückflußkühler erhitzt, abgekühlt und

dann 50 g zertrümmertes Eis dazugegeben. Die Lösung wurde in Gegenwart des Farbstoffes

Kongo Rot mit 5%iger Schwefelsäure bis zum Umschlagspunkt angesäuert. Anschließend

wurden 70ml Ethanol dazugegeben und die zwei Phasen voneinander getrennt. Die

benzolhaltige Phase wurde insgesamt dreimal mit 10% Ethanol gewaschen und dann über

Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum

entfernt.

Eine Natriummethanolat Lösung wurde hergestellt, indem 2,1 g Natrium in 63 ml abs.

Methanol unter Rühren gelöst wurden. Diese Lösung wurde zu dem eingeengten Rückstand

gegeben und für 8 h bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Lösung wurden dann 30 g

zertrümmertes Eis gegeben und dann in Gegenwart des Farbstoffes Kongo Rot mit 10%iger

Schwefelsäure bis zum Umschlagspunkt angesäuert. Der 3-Oxoeicosansäuremethylester

wurde mit Petrolether extrahiert. Die vereinten Petroletherfraktionen wurden mit Wasser

gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Rotationsverdampfer

unter Vakuum entfernt. Das Produkt wurde insgesamt dreimal in Petrolether umkristallisiert.

H33C16

O

Cl

H33C16

O O

O

Page 123: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

MATERIAL UND METHODEN 109

Ausbeute: 83%

Schmelzpunkt: 52-54°C 1H-NMR Spektrum (CDCl3): 0.88 (t, -CH3), 1.23 (m, -(CH2)16-), 1.56 (m, -CH2-CH2-CO-),

2.15 (t, -CH2-CO-, E-Enolform), 2.32 (t, -CH2-CO-, Z-Enolform), 2.50 (t, -CH2-CO-,

Ketoform), 3.42 (s, -CO-CH2-CO-, Ketoform), 3.70 (s, -COH=CH-COO-, Z-Enolform), 3.71

(s, -OCH3), 4.96 (s, -COH=CH-COO-, E-Enolform).

Massenspektrum: m/z 341 (M+1)

Page 124: Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ......Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen Funktion des Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae

LITERATURVERZEICHNIS 110

5 Literaturverzeichnis

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Lebenslauf Personalien

Vor- und Zuname: Thomas Delong

Geburtstag: 04.11.1974

Geburtsort: Erlangen

Familienstand: verheiratet, 1 Kind

Schulbildung

09/1981 - 07/1985 Grundschule Büchenbach, Erlangen

09/1985 - 12/1991 Christian-Ernst-Gymnasium, Erlangen

01/1992 - 06/1992 San-Ramon-Valley-Highschool in Danville, Kalifornien USA

09/1992 - 06/1993 Mercer-Island-Highschool auf Mercer Island, Washington USA

Abschluss: „Highschool Diploma“

09/1993 - 06/1995 Seattle University in Seattle, Washington USA

Abschluss: „Associate of Arts“

09/1993 - 06/1995 Anerkennung des „Associates of Arts“ als deutsche

Hochschulzugangsberechtigung durch die Bezirksregierung

Düsseldorf.

Studium

10/1995 - 05/2000 Eberhard-Karls-Universität Tübingen

Diplomstudiengang Chemie

05/2000 - 07/2002 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen

Diplomstudiengang Chemie

Abschluss: Dipl.-Chem. Univ.

08 / 2002 - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen

Dissertation am Lehrstuhl für Biochemie: Untersuchungen zur

Reaktionsweise und physiologischen Funktion des

Fettsäuresynthase-Komplexes in Saccharomyces cerevisiae