Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen ... ... Untersuchungen zur Reaktionsweise und...

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  • Untersuchungen zur Reaktionsweise und physiologischen

    Funktion des

    Fettsäuresynthase-Komplexes in

    Saccharomyces cerevisiae

    Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

    der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

    zur

    Erlangung des Doktorgrades

    vorgelegt von

    Thomas Delong

    aus Erlangen

  • Als Dissertation genehmigt

    von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der

    Universität Erlangen-Nürnberg

    Tag der mündlichen Prüfung: 17. Mai 2006

    Vorsitzender der Promotionskomission: Prof. Dr. D.-P. Häder

    Erstberichterstatter: Prof. Dr. E. Schweizer

    Zweitberichterstatter: Prof. Dr. B. Rautenstrauss

  • Für meine geliebte Frau Carol Anne

    und unseren Sohn Joshua Joseph

  • Danksagungen

    Herrn Prof. Dr. E. Schweizer danke ich für die Überlassung des interessanten Themas und für

    die umfassende und stets freundliche Unterstützung bei der Durchführung dieser Arbeit.

    Ich danke Prof. Dr. G. Keller vom Lehrstuhl für Mathematik und Stochastik für seinen

    wertvollen Rat bei der Behandlung der in dieser Arbeit enthaltenen stochastischen Fragen.

    Allen Mitarbeitern des Lehrstuhls danke ich für die gute Zusammenarbeit und stete

    Hilfsbereitschaft.

  • INHALT I

    Inhaltsverzeichnis Seite

    VERZEICHNIS DER TABELLEN V

    VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN VI

    VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN IX

    ZUSAMMENFASSUNG 1

    SUMMARY 2

    1 EINLEITUNG 3

    2 ERGEBNISSE 16

    2.1 Herstellung hexamerer FAS-Mischkomplexe mit unterschiedlichen

    Anteilen an Phosphopantethein-haltigen Untereinheiten

    16

    2.1.1 Hintergrund 16

    2.1.2 Herstellung eines Phosphopantethein-freien FAS-Komplexes 17

    2.1.3 Vorversuche zur Spaltung und anschließenden Reassoziation des

    hexameren FAS-Komplexes

    20

    2.1.3.1 Ermittlung der maximal möglichen Menge (NH4)2SO4 bei der

    Ausfällung von DMMA-dissoziierter FAS

    21

    2.1.3.2 Ermittlung der Mindestmenge DMMA, welche für die Dissoziation

    des FAS-Komplexes benötigt wird

    22

    2.1.3.3 Ermittlung der geringsten für eine vollständige Reaktivierung

    notwendigen Enzymmenge

    24

    2.1.3.4 Ermittlung der zur maximalen Reaktivierung von DMMA-

    behandelter FAS notwendigen Zeit

    26

    2.1.4 Herstellung von hybriden Mischkomplexen aus Phosphopantethein-

    freien und Phosphopantethein-haltigen FAS-Komplexen und

    Vermessung der Aktivitäten dieser Mischkomplexe

    28

    2.1.5 Modellrechnung zur Aktivität von partiell phosphopantetheinylierten

    FAS-Mischkomplexen bei Vorliegen einer Halbseiten-Aktivität

    34

    2.2 Untersuchungen ausgewählter Aspekte der Synthese überlanger

    Fettsäuren in Hefe

    41

    2.2.1 Hintergrund 41

  • INHALT II

    2.2.2 Identifizierung der mit einer Membranfraktion der Mutante ∆ybr159w

    gebildeten Elongaseprodukte

    48

    2.2.3 FAS-freie Membranfraktionen 50

    2.3 Drosselung der FAS-Aktivität in vivo und ihre physiologischen Folgen 57

    2.3.1 Hintergrund 57

    2.3.2 Drosseln der FAS-Aktivität durch kontrollierten Zusatz von Cerulenin

    zu intakten Zellen

    57

    2.3.3 Isolierung von Hefe-Mutanten mit reduzierter FAS-Aktivität 60

    2.3.3.1 Charakterisierung von FAS-Mutanten mit verringertem Wachstum

    auf fettsäurefreiem Medium

    60

    2.3.3.2 Bestimmung der FAS-Aktivität in FAS-Mutanten mit verringertem

    Wachstum auf Fettsäure-freiem Medium

    63

    2.3.3.2.1 Optimierung des radiometrischen FAS-Tests 63

    2.3.3.2.1.1 Optimierung der zum Radio-FAS-Test eingesetzten

    Proteinmenge

    63

    2.3.3.2.1.2 Festlegung der für den Radio-FAS-Test optimalen

    Reaktionszeit

    64

    2.3.3.2.2 Messung der spezifischen Aktivität von gereinigter

    Fettsäuresynthase aus den in Abb. 36 aufgeführten Mutanten

    65

    2.3.3.3 Untersuchungen an der Mutante fas1-268 67

    2.3.3.3.1 Untersuchung der Stabilität des FAS-Proteins der Mutante fas1-

    268 während der Aufreinigung des FAS-Komplexes

    67

    2.3.3.3.2 Gaschromatische Untersuchung des Fettsäuremusters in den

    Lipiden der Mutante fas1-268

    69

    2.3.3.3.3 Untersuchung der in vitro FAS-Produkte im Rohextrakt der

    Mutante fas1-268 und des Wildtyps BY4742

    72

    2.3.3.3.4 Messung der Fettacyl-CoA Spiegel im Zellextrakt von

    Hefezellen

    74

    3 DISKUSSION 78

    4 MATERIAL UND METHODEN 86

    4.1 Material 86

  • INHALT III

    4.1.1 Arbeitsgeräte 86

    4.1.2 Sonstiges Arbeitsmaterial 87

    4.1.3 Chemikalien 87

    4.1.3.1 Allgemeine Chemikalien und Lösungsmittel 87

    4.1.3.2 Spezielle Chemikalien und Lösungsmittel 87

    4.1.4 Kultur-Medien 88

    4.1.4.1 Nährmedien für Hefe 88

    4.1.4.2 Nährmedien für E.coli 89

    4.2 Organismen 89

    4.2.1 E. coli 89

    4.2.2 S. cerevisiae 89

    4.3 Biochemische Methoden 90

    4.3.1 Kultivierung von Mikroorganismen 90

    4.3.1.1 Anzucht von E. coli-Zellen 90

    4.3.1.2 Anzucht von Hefezellen 90

    4.3.1.3 Zelldichte-Bestimmung von Flüssigkulturen 90

    4.3.2 Transformation von S. cerevisiae und E. coli-Zellen 90

    4.3.2.1 CaCl2-Methode zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 90

    4.3.2.2 Transformation von CaCl2-behandelten E. coli-Zellen mit Plasmid-

    DNA

    91

    4.3.2.3 Hefetransformation nach der modifizierten Lithiumacetat-Methode 91

    4.3.3 Arbeiten mit DNA 92

    4.3.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem „QIAprepSpin Plasmid Kit“

    (Quiagen)

    92

    4.3.3.2 Restriktionsendonuclease-Spaltung von DNA 92

    4.3.3.3 Analytische Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten 93

    4.3.4 FAS Enzymreinigung aus Hefe 93

    4.3.4.1 Zellaufschluß 93

    4.3.4.2 Ammoniumsulfat-Fraktionierung und Sedimentation in der

    Ultrazentrifuge

    93

    4.3.4.3 Saccharose-Dichtegradient-Zentrifugation 94

    4.3.5 FAS Aktivitätsmessungen [LYN3] 95

  • INHALT IV

    4.3.5.1 FAS-Gesamtreaktion 95

    4.3.5.2 β-Ketoacyl-Reduktase-Reaktion 95

    4.3.5.3 Auswertung 96

    4.3.5.4 Radioaktiver FAS-Test 96

    4.3.6 Dissoziation und Reassoziation von Hefe-FAS nach der DMMA-

    Methode [WER2, MIT]

    97

    4.3.7 Elongase Aktivitätstest 98

    4.3.8 Gaschromatographische Analyse von Fettsäuremethylestern 98

    4.3.9 „Reversed-Phase“-HPLC Analyse von Fettsäure-Gemischen 99

    4.3.10 Isolierung von FAS-freien Hefemembranen 100

    4.3.11 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen [BOL] 101

    4.3.12 Proteintransfer auf PVDF-Membranen und Immundetektion 102

    4.3.12.1 Proteintransfer auf PVDF-Membranen 102

    4.3.12.2 Nachweis von ProteinA-markierter Proteine mit Peroxidase-

    Antiperoxidase (PAP)-Antikörpern

    102

    4.3.12.3 „Enhanced Chemoluminescense“ (ECL)-Methode 102

    4.3.13 Zellaufschluss von S.cerevisiae 103

    4.3.14 In vivo Mutagenese mit Ethylmethansulfat [ADA] 103

    4.3.15 Isolierung und Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern der Hefe 104

    4.3.15.1 Isolierung nach Mancha et al. [MAN] 104

    4.3.15.2 Isolierung nach Maningo et al. [MAG] 105

    4.3.15.3 Isolierung nach Rosendal et al. [ROS] 106

    4.3.15.4 Auftrennung von Acyl-CoA-Thioestern durch RP-HPLC 107

    4.3.16 Proteinbestimmung nach Bradford [BRA] 107

    4.4 Chemische Methoden 108

    4.4.1 Synthese von Stearoylchlorid 108

    4.4.2 Synthese von 3-Oxoeicosansäuremethylester 109

    5 LITERATURVERZEICHNIS 110

    LEBENSLAUF 114

  • INHALT V Verzeichnis der Tabellen Seite

    Tab. 1: Reinigung von Pantethein-haltiger und Pantethein-freier FAS aus Wildtyp bzw. SC1260 / YCp2MM-Transformierten Zellen.

    19

    Tab. 2: Ausfällung von BSA durch steigende (NH4)2SO4-Konzentrationen. 22 Tab. 3: Optimierte Versuchsparameter für die Herstellung hybrider FAS-

    Mischkomplexe . 27

    Tab. 4: Zur Dissoziation / Reassoziation eingesetzte Mischungen aus Phosphopantethein (PA)-haltiger Wildtyp-FAS und Phosphopantethein- freier Mutanten-FAS.

    28

    Tab. 5: Abhängigkeit der FAS-Gesamtaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzymkomplexes.

    30

    Tab. 6: Abhängigkeit der FAS β-Keto-ReduktaseTeilaktivität vom Phosphopantethein-Gehalt des Enzymkomplexes.

    31

    Tab. 7: Tab. 7: Relativer Anteil bestimmter Mischkomplex-Typen im Reassoziations-Gemisch aus phosphopantetheinylierter ( ) und nicht- phosphopantetheinylierter ( ) FAS.

    35

    Tab. 8: Berechnung der Nachbarschafts-unabhängigen (A) und Nachbarschafts- abhängigen (B) Halbseitenaktivität für die verschiedenen Anordnungsmöglichkeiten pantetheinylierter (●) und nicht- pantetheinylierter (○) α-Untereinheiten im hexameren FAS-Komplex.

    38

    Tab. 9 Berechnung der Aktivität von partiell pantetheinylierten Mischkomplexen unter der Annahme, dass eine Vollseiten-Aktivität (VS), eine gemäß Tab. 8 undifferenzierte, d.h. Nachbarschafts-unabhängige Halbseiten-Aktivität (HS) oder eine gem