Untersuchungen zur Verteilung von Toxoplasma gondii ... · 2.1 Toxoplasma gondii ... potentielles...

Aus dem Institut für Parasitologie

der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Untersuchungen zur Verteilung von Toxoplasma gondii-Stadien

in Geweben von Puten nach experimenteller Infektion

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)

durch die Veterinärmedizinische Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von

Birte Zöller

aus Bremen

Leipzig, 2015

Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Dekan: Prof. Dr. Manfred Coenen

Betreuer: Prof. Dr. Arwid Daugschies

Gutachter: Prof. Dr. Arwid Daugschies, Institut für Parasitologie, Veterinärmedizinische

Fakultät der Universität Leipzig, Leipzig

Dr. Gereon Schares, Institut für Epidemiologie, Friedrich-Loeffler-Institut,

Greifswald - Insel Riems

Tag der Verteidigung: 01. September 2015

Meinen Eltern und meiner Schwester Imke.

Inhaltsverzeichnis

I

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ............................................................................................................................. 1

2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................................................... 3

2.1 Toxoplasma gondii ................................................................................................................... 3

2.1.1 Historische Übersicht und Taxonomie .................................................................................. 3

2.1.2 Vorkommen und Morphologie der Entwicklungsstadien ..................................................... 5

2.1.2.1 Tachyzoiten .................................................................................................................... 5

2.1.2.2 Bradyzoiten und Gewebezysten ..................................................................................... 5

2.1.2.3 Oozysten......................................................................................................................... 6

2.2 Lebenszyklus von Toxoplasma gondii .................................................................................... 7

2.2.1 Entwicklung im Zwischenwirt .............................................................................................. 7

2.2.2 Entwicklung im Endwirt Katze ............................................................................................. 7

2.3 Genetik ..................................................................................................................................... 9

2.4 Toxoplasma gondii als Zoonoseerreger ................................................................................. 9

2.4.1 Epidemiologische Bedeutung der Infektionswege und -quellen ........................................... 9

2.4.1.1 Tachyzoiten .................................................................................................................. 10

2.4.1.2 Gewebezysten (Bradyzoiten) ....................................................................................... 10

2.4.1.3 Oozysten....................................................................................................................... 12

2.4.2 Toxoplasmose des Menschen .............................................................................................. 13

2.4.2.1 Seroprävalenzen ........................................................................................................... 13

2.4.2.2 Klinische Symptomatik ................................................................................................ 14

2.4.2.2.1 Postnatale Infektion .................................................................................................. 14

2.4.2.2.2 Pränatale Infektion ................................................................................................... 14

2.4.2.2.3 Okuläre Toxoplasmose ............................................................................................. 15

2.5 Aviäre Toxoplasmose ............................................................................................................ 15

2.6 Toxoplasmose bei der Pute (Meleagris gallopavo) .............................................................. 16

2.6.1 Seroprävalenzen .................................................................................................................. 16

2.6.2 Klinisches Bild und pathologische Befunde ....................................................................... 17

2.6.3 Experimentelle Infektion ..................................................................................................... 18

Inhaltsverzeichnis

II

3 EIGENE WISSENSCHAFTLICHE ORIGINALARBEITEN............................................. 20

3.1 Ziele ........................................................................................................................................ 20

3.2 Allgemeiner Studienaufbau .................................................................................................. 20

3.3 Publikationen ......................................................................................................................... 24

3.3.1 Tissue tropism of Toxoplasma gondii in turkeys (Meleagris gallopavo) after parenteral ......

infection ............................................................................................................................... 24

3.3.2 Experimental Toxoplasma gondii oocyst infections in turkeys (Meleagris gallopavo) ...... 30

4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ........................................................................................ 36

4.1 Diskussion .............................................................................................................................. 36

4.1.1 Experimentelle Infektion ..................................................................................................... 38

4.2 Schlussfolgerungen und Ausblick ........................................................................................ 42

5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................... 45

6 SUMMARY ............................................................................................................................... 47

7 LITERATURVERZEICHNIS................................................................................................. 49

8 DANKSAGUNG ....................................................................................................................... 62

Verzeichnis der Abkürzungen

III


AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome

BfR Bundesinstitut für Risikobewertung

BLASTN Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide

BMELV Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz

bp Basenpaare

(base pairs)

ca. circa

DNA Desoxyribonukleinsäure

(Deoxyribonucleic Acid)

EFSA Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit

(European Food Safety Authority)

e.g. exempli gratia

ELISA Enzymgekoppelter Immunoadsorbtionstest

(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

et al. et alii

etc. et cetera

g Gramm

i.e. id est

IFAT Indirekter Fluoreszenz Antikörper Test

(Indirect Fluorescence Antibody Test)

IHAT Indirekter Hämagglutinationstest

(Indirect Hemagglutination Test)

i.m. intramuskulär

i.v. intravenös

IZKF Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung

KELA kinetischer Enzymgekoppelter Immunoadsorbtionstest

(Kinetic Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

kg Kilogramm

LAT Latex-Agglutinationstest

(Latex Agglutination Test)

LD100 Letale Dosis

LD50 Mittlere letale Dosis


IV

MAT Modifizierter Agglutinationstest

(Modified Agglutination Test)

µm Mikrometer

mg Milligramm

ml Milliliter

n Anzahl

no. number

(Nummer)

OT Okuläre Toxoplasmose

p Signifikanzwert

PCR Polymerase-Kettenreaktion

(Polymerase Chain Reaction)

p.i. post infectionem

RKI Robert Koch-Institut

T. gondii Toxoplasma gondii

USA Vereinigte Staaten von Amerika (United States of America)

z. B. zum Beispiel

Einleitung

1

1 Einleitung

Toxoplasma (T.) gondii ist ein weltweit vorkommender einzelliger Parasit. Im fakultativ

heteroxenen Lebenszyklus sind die Feliden alleinige Endwirte des Erregers. Als Zwischenwirte

können jedoch zahlreiche Säugetier- und Vogelarten dienen. Auch der Mensch ist im Sinne eines

Fehlwirtes für die Toxoplasmose empfänglich. Je nach Immunkompetenz des Wirtes und anderer

Einflussfaktoren kann eine Infektion schwerwiegende, mitunter tödlich verlaufende

Krankheitsbilder hervorrufen. Aufgrund der geringen Wirtsspezifität, des ubiquitär

opportunistischen Auftretens und pathogenen Potentials zählt T. gondii zu den bedeutendsten

parasitären Erregern in der Human- und Veterinärmedizin.

Die Infektion kann sowohl vertikal, durch diaplazentare Übertragung des Parasiten, als auch

horizontal über die Aufnahme exogener Dauerstadien (Oozysten), die mit dem Endwirtkot in die

Umwelt gelangen, erfolgen. Ein weiterer, insbesondere für den Menschen bedeutender, horizontaler

Infektionsweg besteht in der Aufnahme parasitärer Gewebestadien (Zysten) durch den Verzehr von

rohem oder ungenügend erhitztem Fleisch infizierter Zwischenwirte. Gewebezysten sind endogene

Dauerstadien, welche sich bereits wenige Tage nach einer T. gondii-Infektion entwickeln. Sie

variieren hinsichtlich ihrer Persistenz, Anzahl und Lokalisation je nach Wirtsspezies. Bei

landwirtschaftlichen Nutztieren konnten Gewebezysten am häufigsten im Fleisch von Schweinen

und kleinen Wiederkäuern (Schaf und Ziege), weniger häufig im Hühnerfleisch und nur selten im

Rindfleisch nachgewiesen werden (TENTER et al. 2000). Inwieweit hingegen Putenfleisch ein

potentielles Infektionsrisiko birgt und welche Bedeutung die Pute in der Epidemiologie der

humanen Toxoplasmose besitzt, ist bislang nicht ausreichend geklärt. Dabei ist bereits bekannt, dass

Truthühner generell für eine T. gondii-Infektion empfänglich sind und zum Teil hohe

Seroprävalenzen innerhalb einer Vogelpopulation auftreten können. Die Entwicklung von

Gewebezysten bei Puten ist allerdings nur vereinzelt untersucht worden. Dabei konnten infektiöse

Zysten in verschiedenen Geweben, darunter auch häufig in der Muskulatur, nachgewiesen werden

(DUBEY et al. 1993a, SEDLÁK et al. 2000).

Der Pro-Kopf-Verbrauch von Putenfleisch in Deutschland liegt bei ca. 5,7 kg pro Jahr (2012)

(BMELV 2013). Neben Fleischteilstücken und Innereien werden auch bereits verzehrfertige

Putenfleischerzeugnisse, wie frisch gereifte Rohwürste (z.B. Putenzwiebelmettwurst) und kurz

gereifte Rohpökelwaren (z.B. Putenlachsschinken) für den Verbraucher angeboten. In der Regel

unterliegen Rohwürste und kurz gereifte Rohpökelwaren bei ihrer Herstellung keinem adäquaten

Einleitung

2

Verfahren zur sicheren Abtötung potentiell vorhandener Toxoplasmen. Infolgedessen muss

insbesondere bei diesen Erzeugnissen eine potentielle Infektionsgefahr in Betracht gezogen werden

(TENTER und FEHLHABER 2002, BfR 2005, POTT et al. 2012).

Ausgehend vom derzeitigen Wissensstand lässt sich eine Verbrauchergefährdung durch den

Verzehr von zystenhaltigem Putenfleisch, beziehungsweise unzureichend thermisch behandelten

Putenfleischprodukten, nicht grundsätzlich ausschließen. Diese Ausgangsituation erforderte die

eingehendere Betrachtung der T. gondii-Infektion bei Puten, insbesondere hinsichtlich der

Dissemination und Persistenz von Dauerstadien in den essbaren Organen und der Muskulatur. Ziel

der vorliegenden Arbeit war es daher, ein reproduzierbares Infektionsmodell bei Puten für T. gondii

zu entwickeln und zu etablieren. Um die Verteilung und Persistenz von Gewebestadien zu

ermitteln, wurden Organe und Gewebe infizierter Tiere einzeln mittels der Polymerase-

Kettenreaktion (PCR) auf die Präsenz des Erregers untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss

ausgewählter Parameter (Infektionsstadium, Infektionsdosis, Applikationsmodus und

Untersuchungszeitpunkt) auf die Entwicklung parasitärer Gewebestadien betrachtet.

Die vorliegende Arbeit wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung im

Rahmen des TOXONET 01 unter dem Titel "Verbundprojekt: Etablierung einer Methode zum

Nachweis von Toxoplasma gondii bei der Pute und Studien zur Tenazität in Putenfleisch und -

fleischerzeugnissen" gefördert (Förderkennzeichen: 01KIO762).

Literaturübersicht

3

2 Literaturübersicht

2.1 Toxoplasma gondii

2.1.1 Historische Übersicht und Taxonomie

Eine erste detaillierte Beschreibung des Toxoplasmose–Erregers wurde im Jahr 1908 durch

NICOLLE und MANCEAUX (1908) veröffentlicht, die den Parasiten in einem Gundi

(Ctenodactylus gundi), einem nordafrikanischen Wüstennagetier, entdeckt hatten. In Anlehnung an

das Wirtstier und die Form des Einzellers, bezeichneten sie den Organismus Toxoplasma gondii

(Toxon = Bogen; plasma = Gebilde; gondii = von Ctenodactylus gundi) und führten die Gattung

Toxoplasma ein (NICOLLE und MANCEAUX 1909).

In den darauffolgenden Jahren wurden Toxoplasmen bei verschiedenen Tierarten sowie beim

Menschen entdeckt und entsprechend ihrer Wirtsherkunft benannt (TENTER et al. 2000). Die

Annahme, dass es sich dabei um verschiedene Spezies innerhalb der Gattung Toxoplasma handelte,

konnte jedoch 1939 durch SABIN (1939) widerlegt werden. Ebenfalls Ende der 30er Jahre wurde

erstmals über den tödlichen Verlauf einer T. gondii-Infektion eines Kindes berichtet und das

humanpathogene Potential des Erregers sowie die Möglichkeit einer kongenitalen Übertragung

erkannt (WOLF und. COWEN 1937, WOLF et al. 1939, WOLF et al. 1940, WOLF et al. 1941).

Mit Hilfe eines von SABIN und FELDMAN (1948) entwickelten serologischen Tests zum

Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper zeigte sich in anschließenden epidemiologischen

Studien, dass die Infektion sowohl bei Menschen als auch bei Haustieren wesentlich häufiger als

bisher angenommen vorkam (FERGUSON 2009). Die kongenitale Infektion als alleiniger

Übertragungsweg konnte allerdings nicht die weitläufige Verbreitung der Erkrankung erklären

(DUBEY 2008). Da bislang nur die endogenen Stadien des Parasiten (Tachyzoiten und

Gewebezysten) bekannt waren, vermuteten WEINMAN und CHANDLER (1954), dass

unzureichend erhitztes Fleisch möglicherweise eine Infektionsquelle sein könnte. Diese Hypothese

konnte einige Jahre später in einer experimentellen Studie durch DESMONTS et al. (1965) bestätigt

werden. Jedoch konnten weder die orale Aufnahme von ungarem zystenhaltigem Fleisch noch der

kongenitale Übertragungsweg die hohe Anzahl T. gondii-positiver Tiere und Menschen erklären,

die sich ausschließlich pflanzlich ernährten (DUBEY 2008). HUTCHISON (1965) fand schließlich

eine weitere infektiöse Form des Erregers im Kot von Katzen, isolierte sie, und zeigte zudem, dass

dieses parasitäre Stadium resistenter war als die bisher bekannten Entwicklungsstadien. Die

Entdeckung einer sexuellen Phase des Parasiten im Dünndarm der Katze und der daraus

Literaturübersicht

4

hervorgehenden Oozyste führte letztendlich zur vollständigen Aufklärung des Lebenszyklus von

T. gondii (HUTCHISON et al. 1969, FRENKEL et al. 1970, SHEFFIELD und MELTON 1970,

DUBEY et al. 1970a, DUBEY et al. 1970b, HUTCHISON et al. 1971).

Zeitgleich ergab sich durch die Entwicklung in der Elektronenmikroskopie die Möglichkeit,

vergleichende Studien zur Ultrastruktur verschiedener Parasiten durchzuführen (FERGUSON

2009). Dabei erkannte man einen Komplex spezifischer Organellen, den sogenannten

Apikalkomplex, bei T. gondii und anderen Parasiten, von denen man bisher angenommen hatte,

dass sie in keinem verwandtschaftlichen Verhältnis stehen würden (SCHOLTYSECK und

MEHLHORN 1970). Diese neuen Erkenntnisse erforderten eine Überarbeitung der Klassifikation

bei den Protozoen und führten zur Ernennung eines neuen Stammes namens Apicomplexa

(LEVINE et al. 1980). Innerhalb des Stammes Apicomplexa wird T. gondii in die Klasse der

Kokzidien eingeordnet und ist die einzige Art seiner Gattung (SCHNIEDER et al. 2006).

Klassifizierung (nach SCHNIEDER et al. 2006)

Stamm Apicomplexa

Klasse Coccidea

Unterklasse Eucoccidia

Ordnung Eimeriida

Familie Sarcocystidae

Gattung Toxoplasma

Art Toxoplasma gondii

Literaturübersicht

5

2.1.2 Vorkommen und Morphologie der Entwicklungsstadien

Im Lebenszyklus des obligat intrazellulären Parasiten können drei infektiöse Stadien (Tachyzoiten,

Bradyzoiten und sporulierte Oozysten) auftreten, die sich hinsichtlich ihrer Morphologie und

biologischen Eigenschaften voneinander unterscheiden (DUBEY et al. 1998).

2.1.2.1 Tachyzoiten

Tachyzoiten (tachy [griechisch] = schnell) sind halbmondförmige Zellen, ca. 2x6 µm groß und

besitzen einen zentral gelegenen Zellkern (DUBEY et al. 1998). Im Vorderende befindet sich der

Apikalkomplex, eine Gruppe spezifischer Organellen, die unter anderem bei der Anheftung und

Penetration der Wirtszelle eine essentielle Rolle spielen (DUBEY et al. 1998, KIM und WEISS

2008, BLADER und SAEIJ 2009). Tachyzoiten können aktiv in nahezu alle kernhaltigen Zellen

warmblütiger Tiere (Säugetiere und Vögel) und Menschen eindringen (DOBROWOLSKI und

SIBLEY 1996, DUBEY et al. 1998, BLADER und SAEIJ 2009). Unmittelbar nach der Zellinvasion

wird der Parasit von einer Vakuole (sogenannte Pseudozyste) umgeben und beginnt mit der für

dieses Stadium charakteristischen schnellen Vermehrung (DUBEY et al. 1998, BLADER und

SAEIJ 2009). Die Replikation erfolgt asexuell durch wiederholte Endodyogenie, einer Form der

Zweiteilung bei der aus einer Mutterzelle zwei Tochterzellen entstehen (SHEFFIELD u. MELTON

1968). Dieser Vorgang wiederholt sich bis die befallene Wirtzelle rupturiert und die freigesetzten

Tachyzoiten neue Zellen infizieren (DUBEY et al. 1998, MONTOYA und LIESENFELD 2004).

Tachyzoiten treten während der akuten Phase oder bei einer Reaktivierung der Infektion auf. Mit

Einsetzen der wirtseigenen Immunantwort differenzieren sie sich zu den Bradyzoiten (MONTOYA

und LIESENFELD 2004, KIM und WEISS 2008).

2.1.2.2 Bradyzoiten und Gewebezysten

Bradyzoiten (brady [griechisch] = langsam) repräsentieren das enzystierte Dauerstadium des

Parasiten, sind bogenförmig und besitzen einen exzentrischen Zellkern (DUBEY et al. 1998). Im

Gegensatz zu den Tachyzoiten teilen sie sich nur langsam durch wiederholte Endodyogenie

innerhalb einer dickwandigen Gewebezyste (FERGUSON und HUTCHISON 1987a, DUBEY et al.

1998, BOHNE et al. 1999). Diese Gewebezysten befinden sich im Zytoplasma der Wirtszelle und

können hinsichtlich Größe und Form je nach Gewebelokalisation und Anzahl enthaltener

Bradyzoiten variieren (DUBEY et al. 1998). Zum Beispiel nehmen Zysten im Gehirn eine kugelige

Form an und erreichen selten einen Durchmesser von 70 µm, während sie in der Muskulatur eher

Literaturübersicht

6

länglich sind und eine Größe von 100 µm erreichen können (DUBEY et al. 1998). Bereits 3 Tage

nach einer Infektion können sich Gewebezysten entwickeln (DUBEY und FRENKEL 1976). Sie

treten überwiegend in neuronalen und muskulären Geweben, seltener in viszeralen Organen auf

(DUBEY et al 1998, WEISS und KIM 2000). Diese endogene "Ruheform" des Parasiten persistiert

meist reaktionslos im Wirtsgewebe jahre-, vermutlich sogar lebenslang (FERGUSON und

HUTCHISON 1987b, BOHNE et al. 1999, MONTOYA und LIESENFELD 2004, KIM und

WEISS 2008). Beim Zerfall oder Rupturieren einer Gewebezyste differenzieren sich Bradyzoiten

wieder zu Tachyzoiten und es erfolgt eine Reaktivierung der latenten Toxoplasmose, einhergehend

mit einer erneuten Invasion weiterer Organe und Gewebe (TENTER et al. 2000, WEISS und KIM

2000).

2.1.2.3 Oozysten

Das exogene T. gondii-Stadium, die Oozyste, entsteht bei der sexuellen Vermehrung des Parasiten,

die ausschließlich im Darm der Endwirte (Feliden) stattfindet (MILLER et al. 1972, DUBEY

2009a). Oozysten sind rundlich und im unsporulierten Zustand ca. 10 bis 12 µm groß (DUBEY et

al. 1998). Das Innere wird fast vollständig durch den Sporonten ausgefüllt. Nach der Ausscheidung

mit dem Endwirtkot beginnt bei günstigen Umweltbedingungen die Sporulation innerhalb von 1 bis

5 Tagen (DUBEY et al. 1998). Dabei entwickeln sich in jeder Oozyste 2 ellipsoidale ca. 6 x 8 µm

große Sporozysten, die jeweils 4 Sporozoiten enthalten (DUBEY et al. 1970a, DUBEY et al. 1970b,

FERGUSON et al. 1979). Erst durch die Sporulation in der Außenwelt erlangt dieses

Erregerstadium seine Infektiosität.

Alle drei Stadien (Tachyzoiten, Bradyzoiten [Gewebezyste], Sporozoiten [Oozyste])sind sowohl für

den Zwischen- und als auch den Endwirt infektiös.

Literaturübersicht

7

2.2 Lebenszyklus von Toxoplasma gondii

Der Lebenszyklus von T. gondii ist fakultativ zweiwirtig. Der weltweit vorkommende Einzeller

besitzt die Fähigkeit nahezu alle warmblütigen Tiere sowie den Menschen zu infizieren (DUBEY et

al. 1998, TENTER et al. 2000, BLADER und SAEIJ 2009). Als Endwirt dienen ausschließlich

Mitglieder aus der Familie der Feliden, von denen der Hauskatze die größte epidemiologische

Bedeutung zukommt (MILLER et al. 1972, TENTER et al 2000, SCHARES et al.2008, ELMORE

et al. 2010). Lediglich im Endwirt ist eine sexuelle Vermehrung des Parasiten möglich (MILLER et

al. 1972, DUBEY 2009a). Die Übertragung des Parasiten kann sowohl vom Zwischenwirt auf den

Endwirt als auch umgekehrt erfolgen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit der

Erregerübertragung zwischen den Endwirten untereinander, sowie von Zwischenwirt zu

Zwischenwirt (TENTER et al. 2000).

2.2.1 Entwicklung im Zwischenwirt

Bei einer Infektion mit Gewebezysten oder Oozysten über die Nahrung oder aus der Umwelt wird

die Zysten- beziehungsweise Oozystenwand durch proteolytische Enzyme im Magen-Darm-Trakt

aufgelöst. Die dabei freigesetzten Bradyzoiten oder Sporozoiten penetrieren die Epithelzellen des

Darms und vermehren sich asexuell durch wiederholte Endodyogenie (DUBEY et al. 1998,

TENTER et al. 2000). Nach Ruptur infizierter Zellen gelangen die Parasiten zunächst in die lokalen

Lymphknoten und verbreiten sich dann auf lympho-hämatogenem Weg im gesamten Organismus.

In den infizierten Organen und Geweben replizieren sich die Tachyzoiten erneut durch rasche

intrazelluläre Endodyogenie. Mit dem Einsetzen der Immunantwort erfolgt die Umwandlung der

Tachyzoiten zu Bradyzoiten und persistierende Gewebezysten entstehen (DUBEY et al. 1998,

MONTOYA und LIESENFELD 2004, KIM und WEISS 2008). Im Rahmen anderer

Grunderkrankungen, die mit einer Immunsupprimierung einhergehen, kann eine Reaktivierung der

Toxoplasmose auftreten, die sich mitunter in Form von schwerwiegenden Erkrankungen

manifestiert (GROSS et al. 1996, GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004, KIM

und WEISS 2008).

2.2.2 Entwicklung im Endwirt Katze

Die Besonderheit der T. gondii-Infektion bei den Feliden liegt in der entero-epithelialen

Entwicklungsphase, die in der Ausscheidung exogener Dauerstadien (Oozysten) resultiert (DUBEY

et al. 1970b, DUBEY et al. 1970c, Dubey 2009a). Katzen können sich wie Zwischenwirte über die

Literaturübersicht

8

orale Aufnahme sporulierter Oozysten oder Gewebezysten infizieren (DUBEY und FRENKEL

1976, DUBEY 1996).

Nach der Aufnahme von Zysten, z. B. durch den Verzehr infizierter Nagetiere oder Vögel,

infizieren die nach der Magen-Darm-Passage frei gewordenen Bradyzoiten die Epithelzellen des

Dünndarms und leiten die Entwicklung zahlreicher T. gondii-Generationen ein (DUBEY und

FRENKEL 1972, DUBEY et al. 1998). Die ungeschlechtliche Vermehrung erfolgt initial als

Endodygenie und anschließend in Form wiederholter Endopolygenien. Die Endopolygenie ist eine

Sonderform der Merogonie, bei der aus einer Mutterzelle eine Vielzahl von Tochterzellen, auch als

Merozoiten bezeichnet, entstehen. In der darauffolgenden Phase, der Gamogonie, erfolgt die

Differenzierung der Merozoiten in die geschlechtlichen Makro- und Mikrogamonten, aus denen

schließlich die sessilen Makrogameten und die beweglichen Mikrogameten hervorgehen (DUBEY

und FRENKEL 1972, FREYRE et al. 1989). Nach der Befruchtung der Makrogameten durch die

Mikrogameten entstehen die Oozysten. Durch Ruptur infizierter Epithelzellen gelangen die

Oozysten in das Darmlumen und werden für 1 bis 21 Tage mit dem Kot ausgeschieden

(HEYDORN 1979). Während dieser Patenz können bis zu 1 Million Oozysten pro Gramm Kot

ausgeschieden werden. Analog zur Entwicklung im Zwischenwirt findet auch im Endwirt eine

extraintestinale Vermehrung mit Gewebszystenbildung statt, da ein Teil der Merozoiten über die

Lymph- und Blutgefäße im Körper disseminiert.

Bei einer Infektion mit Oozysten wird angenommen, dass die Sporozoiten erst zu Tachyzoiten

konvertieren und dann in den Körperkreislauf gelangen, um die extraintestinalen Gewebe zu

besiedeln (DUBEY et al 1998). Dort erfolgt die Transformation zu den Bradyzoiten in den

Gewebezysten. Durch Ruptur einer Gewebezyste können die Parasiten ins intestinale Epithel

zurückkehren und initiieren dort die Bildung der Oozysten. Im Gegensatz zur Bradyzoiten-

Infektion, bei der bereits nach 3 bis 10 Tagen Oozysten ausgeschieden werden, dauert die Präpatenz

bei einer Oozysten- Infektion mindestens 18 Tage (FREYRE et al. 1989, DUBEY 1996).

Nach einer überstandenen Infektion besteht keine lebenslange Immunität. Experimentell konnte ein

erneutes Ausscheiden von Oozysten durch eine Superinfektion, die ca. 6,5 Jahre nach der

Primärinfektion erfolgte, hervorgerufen werden (DUBEY 1995). Gelegentlich tritt ein sogenanntes

Reshedding von Oozysten ohne eine vorausgegangene Superinfektion auf. Die auslösenden

Faktoren dafür sind nicht eindeutig geklärt. Experimentell konnte dies durch eine Sekundärinfektion

Literaturübersicht

9

mit Isospora felis (CHESSUM 1972, DUBEY 1976) oder durch die Applikation von

Kortikosteroiden und die damit einhergehende Immunsuppression induziert werden (DUBEY und

FRENKEL 1974, LAPPIN et al. 1991).

2.3 Genetik

T. gondii-Stämme lassen sich drei klonalen Linien und sogenannten "atypischen" Stämmen

zuordnen (HOWE u. SIBLEY 1995, SIBLEY et al. 2009). Geographisch dominieren in

Nordamerika und Europa die Genotypen I, II und III, während in Südamerika neben den Genotypen

I und III auch häufig atypische Stämme vorherrschen (PEYRON et al. 2006). Die klonalen Linien

unterscheiden sich hinsichtlich der Wachstumsrate, der Virulenz im Mausmodell und der Fähigkeit

Zysten zu bilden. Bereits erforscht ist die unterschiedliche Virulenz der Genotypen I, II und III

(HOWE et al. 1996, MORDUE et al. 2001). Während Stämme des Genotyp I sich durch eine hohe

Virulenz (letale Dosis (LD100) ~1 Parasit) im Mausmodell auszeichnen, weisen Stämme der

Genotypen II und III eine deutlich geringere Virulenz (mittlere letale Dosis (LD50) ≥ 105) auf

(SIBLEY u. BOOTHROYD 1992, SIBLEY et al. 2009).

2.4 Toxoplasma gondii als Zoonoseerreger

2.4.1 Epidemiologische Bedeutung der Infektionswege und -quellen

Das ubiquitäre Auftreten von T. gondii bei Mensch und Tier ist, neben der geringen Wirtsspezifität,

auf eine Vielzahl von Übertragungswegen sowie die Überlebensfähigkeiten der einzelnen

Entwicklungsstadien zurückzuführen. Die Infektion des Menschen kann zum einen horizontal über

Oozysten, Gewebezysten, selten auch Tachyzoiten, zum anderen vertikal über Tachyzoiten erfolgen

(HILL und DUBEY 2002, MONTOYA und LIESENFELD 2004, PETERSEN et al. 2010).

Viele Faktoren, wie die Präsenz von Katzen, regionale Klimabedingungen, kulturell bedingte

Unterschiede der Zubereitungs- und Essgewohnheiten, sowie Hygienestandards beeinflussen das

Vorkommen und die Verbreitung des Parasiten und folglich auch die Infektionsmöglichkeiten für

den Menschen (TENTER et al. 2000, HILL und DUBEY 2002, KJILSTRA und JONGERT 2008,

PETERSEN et al. 2010). Diese Variablen erschweren die Bewertung der einzelnen T. gondii-

Stadien und Übertragungswege hinsichtlich ihrer epidemiologischen Bedeutung für die humane

Toxoplasmose. Zudem verläuft die Erkrankung beim Mensch überwiegend subklinisch oder

asymptomatisch, weshalb Infektionszeitpunkt und -weg in den meisten Fällen nicht mehr bestimmt

werden können (PETERSEN et al. 2010). Seroepidemiologische Studien zeigen jedoch, dass die

Literaturübersicht

10

Mehrheit humaner T. gondii-Infektionen durch eine horizontale T. gondii-Übertragung verursacht

wird (TENTER et al. 2000, TENTER 2009). Welcher relative Anteil dabei auf eine Oozysten-,

beziehungsweise Zysteninfektion entfällt, ist nicht bekannt (DUBEY et al. 2005, KIJLSTRA und

JONGERT 2008, JONES und DUBEY 2012, HILL und DUBEY 2013).

2.4.1.1 Tachyzoiten

Tachyzoiten sind von größter Bedeutung für den vertikalen Infektionsweg des Parasiten. Eine

diaplazentare Übertragung auf den Fetus bei einer Erstinfektion während der Schwangerschaft kann

in Abhängigkeit vom Infektionszeitpunkt zum Abort oder zu schwerwiegenden Schädigungen des

Ungeborenen führen (GROSS et al. 2001, LOPES et al. 2007).

Auch die horizontale Übertragung von Tachyzoiten ist möglich, wenngleich dieser Weg von

untergeordneter epidemiologischer Bedeutung ist (TENTER et al. 2000). So können Toxoplasmose

- bedingte Komplikationen bei Organtransplantationen auftreten, wobei diese sowohl durch

Tachyzoiten als auch durch Gewebezysten induziert sein können (McGREGOR et al. 1984,

BARCÁN et al. 2002, HILL und DUBEY 2002, DEROUIN und PELLOUX 2008). Eine akute

Toxoplasmose kann bei Transplantationspatienten einerseits durch die Übertragung eines Organs

von einem seropositiven Spender auf einen seronegativen Empfänger, andererseits durch die

Reaktivierung einer latenten Infektion in einem seropositiven Empfänger hervorgerufen werden

(HILL und DUBEY 2002, MONTOYA und LIESENFELD 2004, DEROUIN und PELLOUX

2008). Eine Tachyzoiten-Infektion über Bluttransfusionen ist ebenfalls möglich, jedoch äußerst

selten (DEROUIN und PELLOUX 2008).

Da Tachyzoiten auch in der Milch verschiedener Zwischenwirte, darunter Schaf, Ziege und Kuh,

auftreten können, ist ein Infektionsrisiko beim Verzehr von Rohmilch nicht auszuschließen

(FUSCO et al. 2007, JONES et al. 2009,TENTER 2009, HILL und DUBEY 2013). Fälle akuter

humaner Toxoplasmose sind bislang jedoch nur vereinzelt im Zusammenhang mit dem Konsum

frischer Ziegenmilch beschrieben worden (RIEMANN et al. 1975, SACKS et al. 1982, SKINNER

et al. 1990).

2.4.1.2 Gewebezysten (Bradyzoiten)

Die im Fleisch, in Fleischprodukten und Innereien infizierter Zwischenwirte enthaltenen T. gondii-

Zysten sind von entscheidender Bedeutung in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose

(TENTER et al. 2000, COOK et al. 2000, EFSA 2007, PETERSEN et al. 2010). Der Verzehr von

rohem oder unzureichend erhitztem Fleisch wird regelmäßig als ein bedeutender, mitunter sogar als

Literaturübersicht

11

wichtigster Risikofaktor für die T. gondii-Infektion des Menschen genannt (BUFFOLANO et al.

1996, KAPPERUD et al. 1996, BOBIC et al 1998, BARIL et al. 1999, COOK et al. 2000,

SPALDING et al. 2005, LÓPEZ-CASTILLO et al. 2005, KOLBEKOVA et al. 2007, BOBIC et al.

2007, JONES et al. 2009, MUNOZ-ZANZI et al. 2010). In einer länderübergreifenden europäischen

Fallkontrollstudie wurden zwischen 30% und 63% der Infektionen bei schwangeren Frauen auf den

Konsum von rohem oder geräuchertem, beziehungsweise gepökeltem Fleisch zurückgeführt

(COOK et al. 2000). Mehrfach sind Ausbrüche akuter humaner Toxoplasmose beschrieben, die mit

dem Verzehr von rohem oder halbgarem Fleisch assoziiert wurden (McDONALD et al. 1990,

ROBSON et al. 1995, CHOI et al. 1997, CARME et al. 2002). Darüber hinaus ist anzunehmen, dass

schon allein der häufige Umgang mit rohem Fleisch, wie dies bei Fleischern oder Jägern der Fall ist,

mit einem erhöhten Infektionsrisiko verbunden ist (McDONALD et al. 1990, DIAS et al. 2005,

JONES et al. 2009). Mangelnde Hygiene bei der Verarbeitung von Fleisch gilt ebenfalls als

Risikofaktor (KAPPERUD et al. 1996). So stellten KAPPERUD et al (1996) fest, dass Frauen, die

Küchenmesser nach der Zubereitung von rohem Fleisch selten abwaschen, einem erhöhtem

Infektionsrisiko ausgesetzt sind.

Welche Tierart, beziehungsweise Fleischsorte, als T. gondii-Infektionsquelle prädisponiert ist, wird

von unterschiedlichen Faktoren beeinflusst. Studien zur Seroprävalenz belegen, dass die T. gondii-

Infektion bei fleischliefernden Nutz- und Wildtieren weit verbreitet ist (ausführlich referiert in

TENTER et al. 2000). Insbesondere Weidetiere, wie Schafe, Ziegen und Rinder, oder auch Hühner

aus Freilandhaltungen weisen zum Teil hohe Prävalenzen auf (TENTER et al. 2000, DUBEY 2010,

TENTER 2009). Allerdings ist die Seropositivität der Tiere nicht zwangsläufig mit der Präsenz von

Gewebezysten verbunden (TENTER 2009, OPSTEEGH et al. 2011). Zum Beispiel korreliert bei

Schafen und Schweinen die T. gondii-Seroprävalenz stark mit der Zystenpräsenz, während es beim

Rind, trotz hoher Prävalenzen, bislang nur selten gelungen ist, Zysten nachzuweisen (OPSTEEGH

et al. 2011). Neben tierartspezifischen Unterschieden, ist die Prädisposition bestimmter

Fleischsorten als Infektionsquelle abhängig von den in der Bevölkerung vorherrschenden religiösen

und kulturellen Gegebenheiten sowie Präferenzen hinsichtlich bestimmter Tierarten und

Zubereitungsmethoden (COOK et al. 2000, KJILSTRA und JONGERT 2008, PETERSEN et al.

2010).

Fleisch und Fleischerzeugnisse werden für den menschlichen Genuss mit verschiedenen

lebensmitteltechnologischen Verfahren zubereitet beziehungsweise be- oder verarbeitet. Nicht alle

Literaturübersicht

12

Verfahrensprozesse sind gleichermaßen für die Abtötung infektiöser Gewebezysten geeignet. So

kann die Infektiosität im Fleisch enthaltener Zysten bei einer Lagerungstemperatur von -1bis -3,9°C

für bis zu 3 Wochen, bei -6,7°C für 11 Tage erhalten bleiben (KOTULA et al. 1991). Eine sichere

Inaktivierung des Erregers wird erst bei -12°C erreicht (KOTULA et al. 1991, JONES und DUBEY

2012). Die Erhitzung auf 67°C führt ebenfalls zur Abtötung von T. gondii-Zysten (DUBEY et al.

1990). Auch andere Verfahren, wie Salzen, Pökeln und Räuchern, können den Erreger inaktivieren.

Ihre Effizienz kann allerdings von verschiedenen Variablen, wie beispielsweise der Salz- oder

Pökelsalzkonzentration, Einwirkungszeit und Räuchertemperatur beeinflusst werden (MIE et al.

2008, TENTER 2009, JONES und DUBEY 2012). Folglich kann bei bestimmten

Fleischerzeugnissen, wie kurzgereiften Rohwürsten, die in ihrem Herstellungsprozess keinem

adäquaten Abtötungsverfahren unterzogen wurden, ein potentielles Infektionsrisiko nicht

ausgeschlossen werden (TENTER und FEHLHABER 2002, BfR 2005).

2.4.1.3 Oozysten

Da ausschließlich die Endwirte, Katzen und andere Feliden, Oozysten mit dem Kot ausscheiden,

sind sie für die Verbreitung des Parasiten von entscheidender Bedeutung (DUBEY 1995, TENTER

et al. 2000, HILL und DUBEY 2002, DABRITZ et al. 2007). Bereits die Aufnahme einer

Bradyzoite oder einer Gewebezyste reicht aus, um die Oozystenausscheidung bei der Katze zu

induzieren (DUBEY 1995, DUBEY 2001). Trotz der kurzen Patenzzeit von 2-3 Wochen, werden

nach einer Erstinfektion millionenfach Oozysten freigesetzt und gelangen in die Umwelt, wo sie

unter günstigen Bedingungen innerhalb weniger Tage sporulieren können (DUBEY und FRENKEL

1972, DUBEY 1995, DUBEY 2001). Durch Wind, Regen und Oberflächenwasser werden die

Oozysten weiter verbreitet und führen zur weitläufigen Kontamination der Umgebung (HILL und

DUBEY 2002, TENTER 2009, PETERSEN et al. 2010). Auch Invertebraten, wie Fliegen oder

Regenwürmer, können als Transportwirte zur Verbreitung des Parasitenstadiums beitragen (RUIZ

und FRENKEL 1980, HILL und DUBEY 2002). Sporulierte Oozysten besitzen eine hohe Tenazität

gegenüber Umwelteinflüssen und können beispielsweise in feuchter Erde über 18 Monate infektiös

bleiben (FRENKEL et al. 1975, DUBEY 1998).

Oozysten können zur Kontamination von Trinkwasser, Obst, Gemüse sowie der Umgebung führen

und stellen eine bedeutsame Infektionsquelle für den Menschen dar (KAPPERUD et al. 1996,

BOWIE et al. 1997, COOK et al. 2000, BAHIA- OLIVIERA et al. 2003). Mehrfach wird mit

Oozysten verunreinigtes Wasser als eine wichtige Infektionsquelle beschrieben (BAHIA-

OLIVIERA et al. 2003, ERTRUG et al. 2005, JONES et al. 2005, HEUKELBACH et al. 2007).

Literaturübersicht

13

Darüber hinaus konnten einige Studien einen Zusammenhang zwischen Toxoplasmose -

Ausbrüchen und verunreinigtem Trinkwasser herstellen (BOWIE et al. 1997, BAHIA-OLIVEIRA

et al. 2003, DUBEY 2004). Allgemein wird angenommen, dass, aufgrund der Wasser- oder

Bodenkontamination, der Verzehr von ungewaschenem, rohem Gemüse und Obst ein potentieller

Übertragungsweg sein kann (TENTER et al. 2000, KJILSTRA und JONGERT 2008).

Experimentell konnte gezeigt werden, dass mit Oozysten-gespikten Beeren eine T. gondii-

Übertragung auf Mäuse möglich ist (KNIEL et al. 2002). In einer Fall-Kontrollstudie aus Norwegen

konnte mit dem Verzehr von ungewaschenem Gemüse oder Obst ein erhöhtes Infektionsrisiko

assoziiert werden (KAPPERUD et al. 1996).

Schon allein der Kontakt mit kontaminierter Erde ist als Risikofaktor nicht zu unterschätzen

(COOK et al. 2000). In einer europäischen Studie wurden 6% bis 17% der Infektionen auf den

Kontakt mit Erde, zum Beispiel bei der Gartenarbeit zurückgeführt (COOK et al. 2000). Hingegen

ist der direkte tägliche Kontakt mit Katzen laut COOK et al. (2000) und KAPPERUD et al. (1996)

nicht zwingend mit einem erhöhten Infektionsrisiko verbunden.

2.4.2 Toxoplasmose des Menschen

2.4.2.1 Seroprävalenzen

Schätzungen zufolge ist ca. ein Drittel der Weltbevölkerung mit dem Erreger infiziert (ASPINALL

et al. 2002, HILL und DUBEY 2002, MONTOYA und LIESENFELD 2004, WEISS und DUBEY

2009). Die T. gondii-Seroprävalenz innerhalb der Bevölkerung variiert jedoch deutlich je nach

Kontinent, Land, Region und Personengruppe (TENTER et al. 2000, PAPPAS et al. 2009).

Prävalenzen in Lateinamerika sind im Allgemeinen höher als in Nordamerika und Ostasien

(PAPPAS et al. 2009). Deutliche Unterschiede zwischen den Ländern innerhalb eines Kontinents

sind auch in Europa ersichtlich. Beispielsweise ermittelten BIRGISDOTTIR et al. (2006) mit über

50% eine deutlich höhere Prävalenz für Estland als für Schweden (23%) oder Island (9,8%).

Generell ist in den letzten Jahrzehnten eine Abnahme der Seroprävalenz in einigen europäischen

Ländern sowie in Nordamerika zu verzeichnen (JONES et al. 2007, PAPPAS et al. 2009).

In Deutschland wird die durchschnittliche Durchseuchungsrate der Bevölkerung auf ca. 50%

geschätzt (RKI 2009). Für schwangere Frauen werden Prävalenzen zwischen 26% und 54%

angegeben (GROSS 2004). Die Seroprävalenz nimmt mit steigendem Lebensalter in Deutschland

um ca. 1% pro Lebensjahr zu und kann bei über Fünfzigjährigen bis zu 70% erreichen (GROSS

2004, RKI 2009).

Literaturübersicht

14

2.4.2.2 Klinische Symptomatik

2.4.2.2.1 Postnatale Infektion

Die T. gondii-Erstinfektion verläuft bei immunkompetenten Menschen in der Regel

asymptomatisch oder subklinisch (HILL und DUBEY 2002, MONTOYA und LIESENFELD

2004). In wenigen Fällen treten unspezifische, grippeähnliche Symptome, wie Abgeschlagenheit,

Fieber, Muskel- und Gliederschmerzen, auf (GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD

2004). Eine typische klinische Manifestation ist die Lymphadenitis, die überwiegend lokal im Kopf-

und Halsbereich vorkommt. In Einzelfällen kommt es zur generalisierten Lymphknotenschwellung.

Äußerst selten sind eine Myokarditis, Polymyositis, Pneumonitis, Hepatitis oder Enzephalitis zu

beobachten (GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004, RKI 2009).

Für Personen, bei denen aufgrund anderer Erkrankungen (AIDS) oder im Rahmen einer

Organtransplantation, eine Immunsuppression vorliegt, stellt die T. gondii-Infektion eine

lebensbedrohliche Gefahr dar (LIESENFELD et al. 1999, MELE et al. 2002, HAPPE et al. 2002,

MONTOYA und LIESENFELD 2004, DEROUIN und PELLOUX 2008). In den meisten Fällen ist

die schwere Form der Toxoplasmose auf die Reaktivierung einer latenten Infektion zurückzuführen

(PORTER et al. 1992, GROSS et al. 2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004). Klinisch

überwiegt das Bild einer Enzephalitis einhergehend mit Bewusstseinsstörungen und

Krampfanfällen. In Folge einer generalisierten Ausbreitung des Erregers können zudem

Retinochorioiditis, Pneumonitis oder ein Multiorganversagen auftreten (LIESENFELD et al. 1999,

RKI 2009).

2.4.2.2.2 Pränatale Infektion

Eine kongenitale Übertragung der Infektion erfolgt in der Regel nur bei der Erstinfektion einer

Schwangeren, wobei das fetale Infektionsrisiko und Krankheitsbild vom Graviditätsstadium der

Mutter zum Zeitpunkt der Infektion abhängig sind (GROSS et al. 2001, LOPES et al. 2007, RKI

2009). Während mit zunehmender Dauer der Schwangerschaft das Risiko der diaplazentaren

Übertragung steigt, nimmt der Schweregrad der Erkrankung beim Kind ab (DUNN et al. 1999,

MONTOYA und REMINGTON 2008). Infiziert sich eine werdende Mutter im ersten Trimenon, so

besteht ein geringes Risiko von ca. 14%, dass der Erreger übertragen wird. Eine derart frühe

Infektion führt meist zum Abort oder zu einer ausgeprägten Form der fetalen Toxoplasmose

(GROSS et al. 2001, LOPES et al. 2007). Eine Infektion im zweiten oder dritten Trimenon ist mit

Literaturübersicht

15

einem erhöhten Übertragungsrisiko von 29%, beziehungsweise 59%, verbunden und kann sich beim

Neugeboren unterschiedlich schwer manifestieren. Bei nur etwa 2% der Fälle findet sich die

klassische Trias (Hydrozephalus, Retinochorioiditis und zerebrale Kalzifikationen) (GROSS et al.

2001, MONTOYA und LIESENFELD 2004). Viele Neugeborene zeigen nach einer Spätinfektion

eher unspezifische Symptome, wie Fieber, Konvulsionen oder einen prolongierten Ikterus. Infizierte

Kinder, die bei der Geburt unauffällig waren, entwickeln klinische Manifestationen in Form von

Strabismus, Retinochorioiditis, Taubheit und mentale Retardierung erst viele Jahre später (FRIESE

et al. 1996, GROSS et al. 2001, LOPES et al. 2007).

2.4.2.2.3 Okuläre Toxoplasmose

Die okuläre Toxoplasmose (OT) manifestiert sich überwiegend als Retinochorioiditis mit einer

fokal nekrotisierenden Entzündung von Netz- und Aderhaut, die von den inneren Schichten der

Retina ausgeht. Sie kann uni- oder bilateral auftreten (BOSCH-DRIESSEN et al. 2002, PLEYER et

al. 2007). Die Symptome bei einer akuten OT reichen von verminderter Sehschärfe, "Flocken im

Gesichtsfeld" bis hin zu einem Sehverlust (PLEYER et al. 2007). Bislang wurde angenommen, dass

es sich bei der okulären Toxoplasmose um eine Spätmanifestation und Reaktivierung der

kongenitalen Infektion handelt. Neuere Untersuchungen zeigen jedoch, dass mindestens zwei

Drittel der OT auf postnatale Infektionen zurückzuführen sind (MONTOYA und REMINGTON

1996, GILBERT und STANFORD 2000, EFSA 2007).

2.5 Aviäre Toxoplasmose

Vögel sind grundsätzlich für die Infektion mit T. gondii empfänglich (TENTER 2009, DUBEY

2009b, BANGOURA et al. 2011). Weltweit konnten bei zahlreichen Wild-, Zoo- und Ziervögeln,

sowie beim Nutzgeflügel Antikörper nachgewiesen werden (ausführlich referiert in DUBEY 2002

und DUBEY 2009b). Die aviäre Toxoplasmose verläuft bei den meisten Vogelarten überwiegend

asymptomatisch oder subklinisch (DUBEY 2002). Jedoch kann die Infektion bei einigen

Vogelspezies (z. B.: Kanarienvögel und Tauben) zu schwerwiegenden Erkrankungen führen und

plötzliche Todesfälle verursachen (DUBEY 2002). Beispielsweise kann sich die Toxoplasmose bei

Kanarienvögeln in Form von Chorioretinitiden, welche mit einer Meningitis oder Enzephalitis

einhergehen manifestieren (VICKERS et al. 1992, LINDSAY et al. 1995, GIBBENS et al. 1997,

WILLIAMS et al. 2001). Auch Tauben scheinen empfindlicher auf eine T. gondii-Infektion zu

reagieren, als andere Vogelarten (BANGOURA et al. 2011). So wurde bereits mehrfach von

plötzlichen Todesfällen oder klinischen Symptomen, wie Koordinationsstörungen und Durchfall

Literaturübersicht

16

berichtet (HUBBARD et al. 1986, BIANCIFIORI et al. 1986). Bei Haushühnern hingegen werden

äußerst selten klinische Manifestationen beobachtet (BIANCIFIORI et al. 1986, KANETO et al.

1997, DUBEY 2010).

2.6 Toxoplasmose bei der Pute (Meleagris gallopavo)

Auch Puten sind für eine T. gondii-Infektion empfänglich und infizieren sich mit Oozysten aus der

Umwelt oder über kontaminierte Futtermittel. Ferner ist die Aufnahme parasitärer Gewebestadien

beim Verzehr beziehungsweise Bepicken kleiner infizierter Schadnager als ein weiterer

Übertragungsweg in Betracht zu ziehen.

2.6.1 Seroprävalenzen

Es existieren weltweit relativ wenige Daten zum Vorkommen der T. gondii-Infektion bei

Truthühnern. In den USA sind bislang lediglich bei Wildputen Seroprävalenzstudien durchgeführt

worden. QUIST et al. (1995) untersuchten 130 Wildputen aus verschiedenen Staaten der USA und

stellten eine Gesamtprävalenz von 10,0% (mittels MAT) fest. Der Anteil positiv getesteter Tiere

innerhalb der Bundesstaaten variierte regional zwischen 0.0% und 40,0% (QUIST et al. 1995).

Zuvor wurde bei Wildtieren in Alabama eine Prävalenz von 71,0% (n= 17; MAT) ermittelt,

wohingegen in Florida bei keiner der freilebenden Puten (n=20) Antikörper (IHAT) nachgewiesen

werden konnten (BURRIDGE et al. 1979, LINDSAY et al. 1994).

Für domestizierte Puten werden zum Teil auffällig hohe Seroprävalenzraten von 24,0% (n=25;

IHAT) im Iran und 76,63% (n=107; LAT) im Irak beschrieben (GHORBANI et al. 1990, BUTTY

E.T. 2009). In Ägypten werden Prävalenzwerte zwischen 29,4% (IHAT) und 59,5% (n=173; MAT)

angegeben (EL-MASSRY et al. 2000, HARFOUSH und TAHOON 2010). Die untersuchten Tiere

stammten überwiegend aus bäuerlichen Kleinbetrieben, präzise Angaben zu den

Haltungsbedingungen sind jedoch nicht publiziert. Zur Seroprävalenz bei Truthühnern im

europäischen Raum sind bisher nur Daten aus der Tschechischen Republik und Deutschland

verfügbar. Bei landesweiten Untersuchungen in der Tschechischen Republik testeten BÁRTOVÀ et

al. (2009) konventionell gehaltene Mastputen (n=60) mittels IFAT, konnten allerdings bei keinem

Tier Antikörper nachweisen. Ebenfalls negativ fiel der SF-Test bei einem Einzeltier in einem

kleinbäuerlichen Betrieb aus (LITERÁK und HEJLÍCEK 1993). Im Gegensatz dazu, ermittelten

KOETHE et al. (2011) bei Puten in Deutschland mit 18,4% (KELA) eine deutlich höhere

Seroprävalenz. Insgesamt wurden 1.913 Masttiere aus verschieden Betrieben mit reiner Stallhaltung

untersucht. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass der Anteil T. gondii-positiver Tiere nicht

Literaturübersicht

17

nur bei den verschiedenen Putenfarmen, sondern auch bei den einzelnen Mastperioden innerhalb

eines Betriebes stark variierte (KOETHE et al. 2011).

Bei dem Vergleich von Seroprävalenzdaten sind, neben Faktoren wie Anzahl, Alter und Herkunft

der Tiere, auch die jeweils gewählten diagnostischen Nachweisverfahren zu beachten, da sie sich

hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität deutlich unterscheiden. Für den T. gondii-

Antikörpernachweis bei Puten werden der LAT und IHAT als wenig geeignet, der SFT als gänzlich

ungeeignet angesehen. Als zuverlässige und sensitive Methoden sind sowohl der MAT als auch der

ELISA einzuschätzen (DUBEY et al. 1993a).

2.6.2 Klinisches Bild und pathologische Befunde

Es ist anzunehmen, dass die T. gondii-Infektion bei Truthühnern überwiegend klinisch inapparent

verläuft, da nur vereinzelt Krankheitserscheinungen oder Todesfälle beschrieben werden

(DROHBECK et al. 1953, DUBEY et al. 1993a, QUIST et al. 1995, SEDLÁK et al. 2000).

Erstmals beobachtete SCHULTE (1954) das Auftreten einer klinisch manifesten Toxoplasmose mit

letalem Ausgang bei Puten in einem Geflügelbestand. Die erkrankten Tiere (n=4) zeigten neben

unspezifischen Symptomen wie Apathie und Anorexie, neurologische Auffälligkeiten in Form von

Koordinations- und Bewegungsstörungen bis hin zum völligen Orientierungsverlust und verstarben

innerhalb von 14 bis 21 Tagen. Bei der Obduktion stellte SCHULTE (1954) pathologische

Veränderungen in Form einer herdförmigen, teilweise nekrotischen, Meningoenzephalitis mit

Beteiligung von Lymphozyten, Leukozyten und Plasmazellen fest und beschrieb zudem hochgradig

erweiterte und flüssigkeitsgefüllte Ventrikel (Hydrocephalus internus). Histologisch waren in den

Entzündungsgebieten zahlreiche im Gewebe frei liegende Tachyzoiten, in den unveränderten

Gehirnarealen auch Gewebezysten des Erregers erkennbar (SCHULTE 1954). In den USA wurden

2 Todesfälle bei wildlebenden Truthühnern auf eine systemische Toxoplasmose zurückgeführt

(HOWERTH und RODENROTH 1985, QUIST et al. 1995). Eine vorangegangene klinische

Symptomatik ist nicht bekannt. HOWERTH und RODENROTH (1985) diagnostizierten bei der

Sektion eine Splenomegalie, Pneumonie und Enteritis. In zahlreichen Organen (Milz, Lunge, Leber,

Niere, Nebenniere, Ösophagus, Drüsenmagen, Gehirn und Kolon) waren multifokale, teils

konfluierende, nicht-suppurative Nekrosen vorhanden. In den nekrotischen Bereichen und

angrenzenden Arealen fanden sich neben hochgradigen Infiltrationen mit Makrophagen und

Lymphozyten auch häufig Gefäßthrombosen. Tachyzoiten konnten sowohl intra- als auch

extrazellulär in den Entzündungsgebieten der oben genannten Organe nachgewiesen werden

(HOWERTH und RODENROTH 1985). Auch QUIST et al. (1995) stellten bei einem verstorbenen

Literaturübersicht

18

Wildtruthahn multifokale und konfluierende Nekroseherde in Leber, Niere, Milz, sowie im

Pankreas und Myokard fest. Intrazelluläre Tachyzoiten ließen sich immunhistochemisch in Leber,

Milz und Niere nachweisen. Neben T. gondii-assoziierten Organveränderungen, beschrieben

QUIST und ihre Mitarbeiter (1995) einen hochgradigen Nematodenbefall, sowie eine Dermatitis im

Kopfbereich. Sie vermuteten, dass der fatale Verlauf der Toxoplasmose durch eine

Immunsupprimierung des Tieres, infolge einer möglicherweise vorangegangenen

Geflügelpockeninfektion, begünstigt wurde (QUIST et al. 1995).

2.6.3 Experimentelle Infektion

Mehrere experimentelle Studien belegen, dass bei Puten nach einer T. gondii-Infektion in

verschiedenen Organen parasitäre Dauerstadien auftreten können (DROHBECK et al. 1953,

SIMITCH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a, SEDLÁK et al. 2000).

DROHBECK et al. (1953) untersuchten die Persistenz infektiöser Gewebezysten und Dauer der

Parasitämie bei Puten (n=22) nach einer intraperitonealen Applikation von Tachyzoiten. Es zeigte

sich, dass eine Parasitämie vereinzelt bis zu 18 Tage p.i. andauerte und infektiöse Gewebestadien

bis zu 9 Wochen p.i. persistierten (DROHBECK et al. 1953). SIMITCH und seine Mitarbeiter

(1965) erforschten, ob die Empfänglichkeit von Puten für eine T. gondii-Infektion durch das jeweils

applizierte Parasitenstadium beeinflusst wird. Dafür infizierten sie 6 Truthühner mit Tachyzoiten

und eine weitere Gruppe (n=12) mit Gewebezysten, die zuvor aus Mäusen generiert wurden. Leber,

Gehirn, Lunge und Milz wurden einzeln mikroskopisch untersucht und in gepoolter Form als

Homogenisat an Mäuse verfüttert. Im Mäuseversuch konnte bei allen zysteninfizierten Truthühnern,

aus der Gruppe der Tachyzoiten-infizierten Tiere lediglich bei einer Pute eine erfolgreiche Infektion

nachgewiesen werden. Eine histologische Darstellung des Erregers gelang bei 3 Tieren der

Tachyzoiten-infizierten Truthühner (SIMITCH et al.1965).

Eine weitere Studie zur experimentellen Toxoplasmose bei Puten erfolgte durch DUBEY et al.

(1993a), wobei, neben der Evaluierung serologischer Testmethoden, die Verteilung von T. gondii-

Zysten nach einer Oozysteninfektion im Fokus stand. Hierfür wurden den Tieren 7,

beziehungsweise 9 Wochen p.i. Gehirn, Brust- und Beinmuskel, sowie Leber und Herz entnommen

und diese einzeln oder gepoolt im Mäusefütterungsversuch auf das Vorhandensein von

Gewebezysten untersucht. Der Erreger konnte aus allen gepoolten Organproben (n= 9) isoliert

werden. Bei der Einzelorganuntersuchung gelang der positive T. gondii-Nachweis bei allen (5 /5)

Herzen. In 2 (von 5) beziehungsweise 4 (von 5) Proben der Brust- und Beinmuskulatur konnte der

Literaturübersicht

19

Erreger ebenfalls isoliert werden, während die Untersuchung von Leber und Gehirn negativ ausfiel.

SEDLÁK et al. (2000) beschreiben eine Isolationsrate von 20% bis 100% nach einer

Oozysteninfektion bei Puten. Wie bei DUBEY et al. (1993a) konnte der Erreger am häufigsten aus

dem Herzen (5/5) isoliert werden. Weitere im Mäusefütterungsversuch positiv getestete Organe

waren Gehirn (3/5), Leber (2/5), Muskulatur (2/5) und Milz (1/5) (SEDLÀK et al. 2000). In allen

experimentellen Studien traten bei den Puten keine klinische Symptome auf, die auf die T. gondii-

Infektion zurückführen sind (DROHBECK et al. 1953, SIMITCH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a,

SEDLÁK et al. 2000).

Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten

20

3 Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten

3.1 Ziele

Es sind bislang keine näheren Informationen zur Rolle der Pute und der aus ihr gewonnenen

Lebensmittel als Infektionsquelle für die Toxoplasmose des Menschen bekannt. Vor diesem

Hintergrund untersucht die vorliegende Arbeit verschiedene Aspekte der T. gondii-Infektion bei der

Pute mit folgenden Zielen:

1. Entwicklung und Etablierung eines reproduzierbaren Infektionsmodells bei der Pute

2. Ermittlung der Verteilung und Persistenz von T. gondii-Gewebestadien nach

experimenteller Tachyzoiteninfektion (Publikation 1)

3. Ermittlung der Verteilung und Persistenz von T. gondii-Gewebestadien nach

experimenteller Oozysteninfektion (Publikation 2)

4. Untersuchung und Vergleich verschiedener Parameter wie Infektionsstadium,

Infektionsdosis und Applikationsmodus hinsichtlich ihres Einflusses auf die

Ausbildung von Gewebestadien im Organismus der Pute (Publikation 2).

3.2 Allgemeiner Studienaufbau

Für alle Teilversuche der Studie wurden Puten der Rasse BUT (British United Turkey) Big 6 an Tag

1 nach dem Schlupf im Institut für Parasitologie der Universität Leipzig eingestallt und unter den

gleichen Bedingungen (Fütterung, Haltung, Pflege) gehalten. Der Gesundheitszustand der

Versuchstiere wurde täglich adspektorisch begutachtet. Direkt vor der Infektion und im Anschluss

wöchentlich wurden von jeder Pute Blutproben entnommen, um die Seronegativität zu

Versuchsbeginn und den Infektionserfolg zu verifizieren. Die serologische Untersuchung zum

Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper wurde mittels KELA (siehe KOETHE et al. 2011)

durchgeführt.

Nach einer Aufzuchtperiode von 4 bis 8 Wochen erfolgte die Infektion mit Tachyzoiten oder

Oozysten. Entsprechend der Versuchsgruppe wurden in unterschiedlich hohen Dosen T. gondii-

Tachyzoiten vom Stamm ME49 (LUNDE und JACOBS 1983) intravenös und/oder intramuskulär ,


21

beziehungsweise Oozysten vom Stamm ME49 (LUNDE und JACOBS 1983), DX (VAN DER

ZYPEN und PIEKARSKI 1967) oder Hannover 1 (WAGNER et al. 2009) oral verabreicht (siehe

Tabelle 1 und 2). Alle eingesetzten Stämme werden dem Genotyp II zugeordnet.

Je nach Gruppenzugehörigkeit wurden die Puten 6 bis 8 (früher Untersuchungszeitpunkt) oder 10

bis 12 Wochen (später Untersuchungszeitpunkt) nach der Infektion getötet. Bei der Sektion wurden

folgende Organe und Muskelproben entnommen: Brust-, Oberschenkel- und

Unterschenkelmuskulatur, Herz, Leber, Muskel- und Drüsenmagen, Lunge, Milz, Nieren, Darm,

Pankreas und Hoden (sofern vorhanden). Jedes einzelne Organ wurde im Ganzen mit Hilfe eines

Zerkleinerers (La Moulinette, Tefal Groupe SEB, Offenbach, Deutschland) homogenisiert. Bei den

Muskeln wurden Proben (insgesamt 300 g pro Muskel) von verschiedenen Lokalisationen

entnommen und ebenfalls getrennt homogenisiert. Für die anschließende DNA-Extraktion aus den

Homogenatproben wurde der QIAamp DNA Mini Kit® verwendet. Um einschätzen zu können, ob

während der Probenaufbereitung eine versehentliche Übertragung von T. gondii-DNA auftritt,

wurden beispielhaft In-Prozeß-Kontrollen durchgeführt. Hierfür wurde abwechselnd DNA aus

Organproben negativer Kontrolltiere und infizierter Puten extrahiert und anschließend dem PCR-

Verfahren zugeführt

Der Nachweis von T. gondii-DNA in den Gewebeproben erfolgte durch ein gelbasiertes PCR-

Verfahren. Zunächst wurde eine direkte PCR, basierend auf der Amplifikation eines 469bp-

Fragments des Toxoplasma B1-Gens (nach der Methode von JALAL et al. 2004) durchgeführt. Um

die Sensitivität zu erhöhen, erfolgte anschließend die nested PCR mit selbst designten Primern

(Länge Zielfragment: 375bp). Beide PCR-Verfahren wurden im iCycler® Thermal Cycler (Bio-

Rad, Hercules, CA, USA) durchgeführt. Für die Gelelektrophorese wurden ca. 12 µl von jedem

PCR-Produkt auf ein 1,5%-Agarosegel aufgetragen. Nach der Färbung des Gels erfolgte die

Sichtbarmachung der DNA-Banden durch ultraviolettes Licht. Eine Gewebeprobe wurde als

T. gondii-positiv bewertet, wenn in einer der beiden PCR-Techniken Banden erkennbar waren. Bei

jeder PCR diente T. gondii-DNA, die zuvor aus in vitro-generierten ME49 Tachyzoiten extrahiert

wurde, als Positivkontrolle, als Negativkontrolle wurde Wasser eingesetzt.

Zu Beginn der Studie wurde zusätzlich zur molekularbiologischen eine lichtmikroskopische

Untersuchung einzelner Organe in Form nativer Quetschpräparate (400fache Vergößerung) auf

T. gondii-Zysten durchgeführt.


22

Für die statistische Auswertung wurden aus den einzelnen Versuchsgruppen je nach

Infektionsstadium, Infektionsdosis (Dosiskategorien: niedrig, mittel, hoch) und

Untersuchungszeitpunkt p.i. (früh/spät) statistische Einheiten gebildet. Zudem wurden Organe, die

als Lebensmittel verwendet werden, als sogenannte essbare Organe zusammengefasst und gesondert

analysiert. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden als signifikant beurteilt, wenn der

ermittelte p-Wert kleiner als 0,05 war.

TABELLE 1: Studiendesign für die Infektion mit T. gondii-Tachyzoiten

Infektionsdosis

ME49

Tachyzoiten

Dosiskategorie

(i.v. Infektion) Infektionsroute

UZPa

Frühb (n)

c

UZP

Spätb (n)

1 x 106

Niedrig i.v. 4 8

5 x 106

Mittel i.v. - 4

7,5 x 106

Mittel i.v. 3 4

2 x 107

Hoch i.v. 3 4

3-maligd 1 x 10

7 - i.m. 3 -

1 x 107

je Route - i.v. und i.m. 3 -

Summe 16 20

Kontrollgruppe 3 5

aUZP: Untersuchungszeitpunkt

bFrüh: 6-8 Wo. p.i.; Spät: 10-12 Wo. p.i.

cn: Anzahl der Tiere

dInokulation mit 1,0 x 10

7 Tachyzoiten pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen


23

TABELLE 2: Studiendesign für die Infektion mit T. gondii-Oozysten

T. gondii-

Stamm

Infektionsdosis

(Oozysten pro

Tier)

Dosiskategorie

UZPa

Frühb (n)

c

UZP

Spätb (n)

Summe

ME49

5 x 105

mittel 3 4

25 1 x 10

7 hoch 4 4

3-maligd

5 x 105

mittel 6 4

DX 5 x 10

4 niedrig - 4

8 5 x 10

5 mittel - 4

Hannover1 5 x 105

mittel - 3 3

Summe 13 23 36

Kontrollgruppe - - 4 4

aUZP: Untersuchungszeitpunkt

bFrüh: 6-8 Wo. p.i.; Spät: 10-12 Wo. p.i.

cn: Anzahl der Tiere

dInokulation von 5 x 10

5 Oozysten pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen

Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten Parasitol Res. 2013;112:1841-7.

24

3.3 Publikationen

3.3.1 Tissue tropism of Toxoplasma gondii in turkeys (Meleagris gallopavo) after parental

infection

(Publikation 1)


25


26


27


28


29

Eigene wissenschaftliche Originalarbeiten Vet Parasitol. 2013;196:272-7.

30

3.3.2 Experimental Toxoplasma gondii oocyst infections in turkeys (Meleagris gallopavo)

(Publikation 2)


31


32


33


34


35

Übergreifende Diskussion

36

4 Übergreifende Diskussion

4.1 Diskussion

In der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose wird, neben der Aufnahme von Oozysten, die

horizontale Übertragung von T. gondii-Gewebezysten als einer der Hauptinfektionswege betrachtet

(TENTER et al. 2000, HILL und DUBEY 2002, PETERSEN et al. 2010, HILL und DUBEY 2013).

Viele Studien zur Risikobewertung bezeichnen den Verzehr von zystenhaltigem Fleisch im rohen

oder ungenügend erhitzten Zustand als bedeutende, teilweise sogar als wichtigste, Infektionsquelle

für den Menschen (BUFFOLANO et al. 1996, KAPPARUD et al. 1996, BARIL et al. 1999, COOK

et al. 2000, BOBIC et al. 2007, EFSA 2007, PETERSEN et al. 2010). Bereits der professionelle

Umgang mit rohem Fleisch (McDONALD et al. 1990, JONES und DUBEY 2012) sowie

hygienische Mängel bei der Fleischzubereitung (KAPPARUD et al. 1996) werden als

Risikofaktoren angesehen. Gewebezysten werden zwar bei allen natürlich infizierten Tieren

gebildet, variieren jedoch in ihrer Anzahl und Lokalisation je nach Wirtsspezies (TENTER et al.

2000, TENTER 2009). Entsprechend wird das vom Fleisch ausgehende Gefährdungspotential für

den Menschen für die verschiedenen lebensmittelliefernden Tiere als unterschiedlich hoch

eingestuft. Neben tierartspezifischen Unterschieden, sind religiöse und kulturelle Gegebenheiten,

sowie Zubereitungsmethoden weitere Faktoren, die bei der Risikobewertung der verschiedenen

Fleischsorten berücksichtigt werden müssen (COOK et al. 2000, KJILSTRA und JONGERT 2008,

PETERSEN et al. 2010).

Die Toxoplasmose der Pute und die Bedeutung von Putenfleischerzeugnissen als potentielle

Infektionsquelle für den Menschen sind in der bisher zugänglichen Literatur kaum betrachtet

worden. Seroprävalenzen wurden nur vereinzelt in wenigen Ländern ermittelt, beschreiben aber

zum Teil auffällig hohe Prävalenzen innerhalb einer Vogelpopulation (BURRIDGE et al. 1979,

LINDSAY et al. 1994, QUIST et al. 1995, GHORBANI et al. 1990, EL-MASSRY et al. 2000,

BUTTY E.T. 2009, BÁRTOVÀ et al. 2009, HARFOUSH und TAHOON 2010). In Deutschland

ermittelten KOETHE et al. (2011) bei Schlachtputen eine relativ hohe T. gondii -Seroprävalenz von

18,4%. Da es sich dabei um Tiere aus der konventionellen Masthaltung handelte, ist zu vermuten,

dass die Puten sich über Oozysten-kontaminiertes Futter oder Einstreu infiziert hatten. Auch die

Infektion mit Zysten durch den Verzehr oder das Bepicken kleiner infizierter Schadnager ist in

Erwägung zu ziehen. Anhand serologischer Daten kann jedoch nur ein Rückschluss auf den

Erregerkontakt, nicht jedoch auf die Zystenpräsenz und die damit verbundene potentielle


37

Infektionsgefahr für den Menschen gezogen werden. Die wenigen Untersuchungen zur

Toxoplasmose bei der Pute belegen allerdings, dass sowohl bei natürlich (SCHULTE 1954,

HOWERTH und RODENROTH 1985, QUIST et al. 1995) als auch experimentell (DROHBECK et

al. 1953, SIMTICH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a, SEDLÁK et al. 2000) infizierten Tieren

infektiöse Zysten in verschiedenen Geweben, darunter auch in der Muskulatur, auftreten können.

Eine Bewertung des Verbraucherrisikos ausgehend vom Putenfleisch, beziehungsweise

unzureichend thermisch behandelten Putenfleischprodukten, wie frisch gereifte Rohwürste oder

kurz gereifte Rohpökelwaren, ist anhand der bisher veröffentlichen Literatur nicht möglich. Das

Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, durch die Entwicklung eines T. gondii-

Infektionsmodells nähere Erkenntnisse zur Verteilung parasitärer Stadien in den Organen und der

Muskulatur der Pute zu erlangen und Ansatzpunkte für die Bewertung des Toxoplasmose-Risikos

für den Verbraucher zu gewinnen.

Für die Experimente wurden Puten entweder mit Tachyzoiten oder Oozysten in unterschiedlich

hohen Dosen infiziert. Als Infektionsstämme wurden ME49 (LUNDE und JACOBS 1983), DX

(VAN DER ZYPEN und PIEKARSKI 1967) und Hannover 1 (WAGNER et al. 2009) gewählt, die

dem Genotyp II zugeordnet werden. Typ II - Stämme sind sowohl in Europa (PEYRON et al. 2006,

SCHARES et al. 2008), als auch in Nordamerika (DUBEY und SU 2009) am häufigsten vertreten.

Zudem belegten vorherige Studien, das eine Infektion mit Typ II-Stämmen bei Puten eine

subklinische Toxoplasmose induzieren (DUBEY et al. 1993a, SEDLÀK et al 2000), während nach

Infektionen mit Typ I - Stämmen bei Hühnervögeln mit schwerwiegenden, zum Teil fatalen,

Krankheitsbildern zu rechnen ist (DUBEY et al. 1993b, DUBEY et al 1994, DUBEY et al.1995).

Für die Infektion mit Tachyzoiten wurden ausschließlich ME49 -Tachyzoiten eingesetzt. Die

Infektion mit Tachyzoiten entspricht zwar nicht dem natürlichen Infektionsweg, bietet hinsichtlich

der Handhabung allerdings einige Vorteile. Die Vermehrung in der Zellkultur erfolgt unter

standardisierten Bedingungen und ist wenig zeitaufwendig. Darüber hinaus sind im Vorfeld keine

zusätzlichen Tierversuche erforderlich, wie dies für die Gewinnung von Oozysten der Fall ist.

Um die Auswirkungen der Tachyzoiteninfektion mit denen einer natürlichen Infektion vergleichen

zu können, wurde ein Teil der Puten mit Oozysten infiziert. Neben der Aufnahme von Oozysten ist

auch die Infektion über Gewebezysten als natürlicher Infektionsweg bei Puten in Betracht zu


38

ziehen. In der vorliegenden Arbeit wurden Zysten als Infektionsmedium nicht berücksichtigt, da

eine Quantifizierung von Zysten in Mäusehirnen schwierig und ein standardisierbarer Parameter

kaum erreichbar ist, der aber für die Entwicklung eines Infektionsmodells notwendig wäre.

Zum Nachweis des Erregers in Gewebeproben gilt der Bioassay mit Mäusen oder Katzen als

Goldstandard. Allerdings sind diese Verfahren äußerst arbeits- und zeitintensiv und aus tierethischer

Sicht problematisch, wenn die Untersuchung einer größeren Anzahl von Proben beabsichtigt ist,

wie es in der vorliegenden Studie der Fall war. Als Alternative wurde ein PCR-basiertes Verfahren

eingesetzt. Die konventionelle PCR-Methode ist ein etabliertes und sensitives Verfahren zur

T. gondii - Detektion und bietet die Möglichkeit, viele Proben innerhalb kurzer Zeit zu überprüfen.

Im Vergleich zum Bioassay weist die PCR bei der Untersuchung von Fleischproben allerdings eine

geringere Sensitivität auf (GARCIA et al. 2006, OPSTEEGH et al. 2010). Im Bioassay mit Katzen

können nach vorheriger künstlicher Verdauung Fleischproben von bis zu 500 g verfüttert werden,

während für die PCR DNA aus maximal 50 mg Probenmaterial isoliert wird (OPSTEEGH et al.

2010). Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Erregerpräsenz im Tier erkannt wird, hängt von der

Probenmenge ab und ist deutlich geringer, wenn sie klein ist. Weitere Faktoren, die den sicheren

Zystennachweis mittels PCR erschweren sind die inhomogene Verteilung der Zysten und eine

geringe Zystendichte im untersuchten Gewebe. Zu beachten ist außerdem, dass mit Hilfe der in der

vorliegenden Studie eingesetzten PCR lediglich die DNA und damit die Präsenz von T. gondii

nachgewiesen wurde. Ein Beweis der Vitalität und damit Infektionsfähigkeit des Erregers ist aber

auf diesem Weg nicht möglich. Dazu wären Bioassays erforderlich gewesen, die aber aus den oben

bereits genannten Gründen nicht verfügbar waren.

4.1.1 Experimentelle Infektion

Während der Studie konnten ungeachtet der Infektionsdosis und des inokulierten Parasitenstadiums

bei keinem der Versuchstiere klinische Symptome einer Toxoplasmose beobachtet werden. Bei der

Sektion der Puten waren keine pathologisch-anatomischen Veränderungen an den Organen

erkennbar. Diese Beobachtungen stimmen mit den Erkenntnissen aus experimentellen Studien

anderer Autoren überein und unterstützen die Annahme, dass die T. gondii - Infektion bei der Pute

überwiegend subklinisch verläuft (DROHBECK et al. 1953, SIMITCH et al. 1965, DUBEY et al.

1993a, SEDLÁK et al. 2000). QUIST et al (1995) berichteten über die systemische Toxoplasmose

eines Wildtruthahns und vermuteten, dass der fatale Verlauf durch eine Immunsuppression des

Tieres, infolge einer möglicherweise vorangegangenen Geflügelpockeninfektion, begünstigt wurde.

In der vorliegenden Studie wurden die Puten in Kleingruppen unter weitgehend von Stress und von


39

Begleitinfektion freien Haltungsbedingungen gehalten. Inwieweit dies für den subklinischen

Verlauf bestimmend war, bleibt unklar. Es ist daher nicht auszuschließen, dass die in dieser Studie

eingesetzten Infektionsdosen unter Feldbedingungen zum Auftreten einer klinisch apparenten

Toxoplasmose führen würden. Bisher sind nur vereinzelt Fälle akuter Toxoplasmosen bei natürlich

infizierten Puten beschrieben wurden (SCHULTE 1954, HOWERTH und RODENROTH 1985,

QUIST et al. 1995). Allerdings ist es fraglich, inwiefern Toxoplasmose-bedingte Symptome oder

Todesfälle beispielsweise in großen Mastanlagen überhaupt als solche erkannt werden.

Anhand der zum Versuchsbeginn und im Anschluss wöchentlich entnommenen Blutproben konnte

bei allen infizierten Puten die serologische Konversion 6 bis 14 Tage nach der Infektion

nachgewiesen werden (siehe KOETHE et al. 2011). Ein direkter Nachweis des Befalls der Puten

konnte bei der PCR - Analyse der Organproben nicht für alle Tiere erzielt werden. In der Gruppe

der Tachyzoiten-infizierten Tiere (n=36), konnte bei 5, in der Gruppe der Oozysten-infizierten Tiere

(n=36) bei 4 Puten keine T. gondii-DNA nachgewiesen werden. Eine mögliche Erklärung für die

negativen Ergebnisse könnte die geringe Anzahl an Zysten im Gewebe sein. Schätzungen zufolge

ist in 100 g Fleisch mit lediglich einer Gewebezyste zu rechnen (HILL und DUBEY 2002). Neben

der geringen Zystendichte könnten eine inhomogene Verteilung der Zysten und die für die PCR -

Analyse eingesetzte sehr geringe Probenmenge zu falsch-negativen Ergebnissen geführt haben. Vor

diesem Hintergrund sind die vorliegenden Zahlen T. gondii - positiver Puten und Gewebeproben als

Minimalwerte zu betrachten und es kann von einer tatsächlich höheren Anzahl infizierter Organe

ausgegangen werden.

In der Literatur finden sich nur wenige Untersuchungsergebnisse zur T. gondii-Zystenbildung und -

verteilung bei der Pute. Eine Auswertung und der direkte Vergleich der bisherigen Erkenntnisse mit

den vorliegenden Ergebnissen werden durch die unterschiedlichen Studienbedingungen (Anzahl

untersuchter Tiere, Untersuchungsmethode, Infektionsmedium etc.) erschwert. Häufig wurden für

den Nachweis parasitärer Stadien die Organproben nicht einzeln sondern in gepoolter Form mittels

Bioassay untersucht (DROHBECK et al. 1953, SIMITCH et al. 1965, DUBEY et al. 1993a,

LITERÁK und HEJLÌCEK 1993). Zudem wurde nur eine geringe Auswahl von Organen beprobt.

Hingegen wurden in der eigenen Studie erstmals viele verschiedene Organe und Gewebe (n=14)

einzeln auf T. gondii-DNA getestet, um nähere Erkenntnisse zur Verteilung der Zysten zu gewinnen

und potentielle Zielorgane zu erfassen.


40

Bei der Betrachtung der Untersuchungsergebnisse aller Studiengruppen, fiel auf, dass jedes Organ

mindestens einmal positiv getestet wurde. Zudem konnten deutliche Schwankungen in der

Befallshäufigkeit der Organe sowohl zwischen den Tieren verschiedener Infektionsgruppen als auch

innerhalb einer Infektionsgruppe festgestellt werden. So variierte die Anzahl positiv getesteter

Organe bei den Tachyzoiten-infizierten Puten zwischen 0 und 7, bei den Oozysten-infizierten Puten

zwischen 0 und 9 Organe pro Tier.

Um den Einfluss der Infektionsdosis auf die Ausbildung von Gewebestadien im Organismus der

Pute zu untersuchen, wurden bei den Studiengruppen unterschiedlich hohe Infektionsdosen von

Tachyzoiten oder Oozysten appliziert. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich

der Anzahl T. gondii-positiver Puten oder positiver Organproben pro Tier festgestellt werden.

Allerdings konnte ein Zusammenhang zwischen der applizierten Dosis von Oozysten und der

Befallshäufigkeit des Gehirns beobachtet werden, da mit ansteigender Infektionsdosis die Anzahl

positiver Proben signifikant zunahm (p= 0,012).

Vorangegangene Studien konnten eine Persistenz infektiöser T. gondii-Zysten bei der Pute bis zu 9

Wochen p.i. nachweisen (DROHBECK et al. 1953, DUBEY et al 1993a). In der eigenen Studie

gelang der T. gondi-Nachweis bis 12 Wochen p.i.. Der späte Untersuchungszeitpunkt (12 Wo. p.i.)

wurde als Annäherung an die Mastdauer der konventionellen Mastputenhaltung gewählt. Bei dem

Vergleich der beiden Untersuchungszeitpunkte "früh" (6 bis 8 Wo. p.i.) und "spät" (10 bis 12 Wo.

p.i.) konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Anzahl positiver Puten oder Organe

beobachtet werden. Lediglich die Befallshäufigkeit des Brustmuskels nach der Infektion mit

Oozysten war signifikant höher zum frühen Untersuchungszeitpunkt mit 3 positiven von 13 Proben

während zum späten Untersuchungszeitpunkt bei keiner Brustmuskelprobe T. gondii-DNA

nachgewiesen werden konnte. Inwieweit die unterschiedliche Befallshäufigkeit des Brustmuskels

tatsächlich im Zusammenhang mit dem Untersuchungszeitpunkt steht, ist zweifelhaft. Durchaus

wahrscheinlicher ist dieses Ergebnis auf die bereits erwähnten limitierenden Faktoren der

Untersuchungsmethode zurückzuführen.

Durch die zu Beginn der Studie mitgeführten lichtmikroskopischen Untersuchungen nativer

Quetschpräparate konnte in insgesamt 3 Organen (2x Muskulatur und Leber), welche auch in der

PCR als T. gondii–positiv befundet wurden, das Vorhandensein von Zysten nachgewiesen werden.

Da die Nachweisrate von Zysten sich jedoch generell als sehr gering erwies, wurde aufgrund des


41

hohen Arbeitsaufwandes das lichtmikroskopische Screening in den darauffolgenden

Teilexperimenten nicht weiter durchgeführt.

Bei der vergleichenden Betrachtung der Ergebnisse aus der Gruppe der Tachyzoiten-infizierten

Tiere mit denen aus der Gruppe der Oozysten-infizierten Tiere waren keine signifikanten

Unterschiede bezüglich der Gesamtanzahl positiver Organe oder der Summe befallener essbarer

Organe festzustellen. Allerdings waren einzelne Organe, Brustmuskel und Leber, signifikant

häufiger positiv nach der Infektion mit Tachyzoiten als nach der Oozysteninfektion. Hingegen

wurde nach der Oozysteninfektion signifikant häufiger T. gondii-DNA im Gehirn nachgewiesen als

nach der Tachyzoiteninfektion. Interessanterweise konnten DUBEY et al. (1993a) bei der

Einzelorganuntersuchung nach einer Oozysteninfektion weder in der Leber noch im Gehirn Zysten

nachweisen. Dies könnte jedoch durch die geringe Anzahl an untersuchten Proben (n=5 je Organ)

begründet sein.

Anhand der vorliegenden Studie wird deutlich, dass T. gondii im gesamten Organismus der Pute

streut. Weder ein bestimmtes Verteilungsmuster noch ein definiertes Zielorgan waren erkennbar.

Allerdings zeigte sich, dass Muskelgewebe und andere essbare Organe zu den wesentlichen

Zielorganen zählen, ungeachtet des applizierten Infektionsmediums. Während nach der

Tachyzoiteninfektion am häufigsten Leber (43,3%), gefolgt von Brustmuskel (26,7%) und Herz

(20,0%) infiziert waren, konnte bei den Oozysten-infizierten Tieren der Erreger, abgesehen vom

Gehirn (47,2%), am häufigsten in der Oberschenkelmuskulatur (25,0%), gefolgt von Herz und

Unterschenkelmuskulatur (je 22, 2%) nachgewiesen werden. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene

und des Verbraucherschutzes bedeutet dies, dass im Fall einer T. gondii–Infektion regelmäßig

essbare Organe betroffen sind und ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch

infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann. Die für Deutschland ermittelte T. gondii-

Seroprävalenz von 18,4% bei Mastputen (KOETHE et al. 2011) deutet auf eine relativ weite

Verbreitung des Erregers hin. Seroprävalenzen für deutsche Puten aus ökologischer Haltung sind

bisher nicht veröffentlicht. Es ist zu vermuten, dass bei Tieren aus der Freilandhaltung aufgrund des

erhöhten Expositionsrisikos eine ebenso hohe, oder sogar eine höhere Prävalenz vorliegt, wie dies

bereits für Hühner beschrieben ist (DUBEY 2010). Da eine klinische Symptomatik eher selten

auftritt, gelangen T. gondii–positive Puten unerkannt in die Lebensmittelkette und zum

Verbraucher. Eine kürzlich veröffentlichte Studie von POTT et al. (2012) konnte belegen, das

Zysten in Putenrohwürsten bis 24 Stunden nach der Herstellung infektiös waren. Diese Autoren


42

weisen darauf hin, dass bestimmte Rohwurstsorten bereits nach sehr kurzer Reifezeit in den Handel

kommen und innerhalb von 12 bis 24 Stunden nach der Herstellung verzehrt werden können. Bei

küchenhygienischen Mängeln in der Zubereitung von Putenfleisch, oder wenn Fleischerzeugnisse,

wie zum Beispiel Rohwürste, keinem adäquatem Verfahren zur Abtötung des Erregers unterzogen

werden, kann es somit zu einer zoonotischen Übertragung kommen.

In den eigenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Infektionsdosis, der

Untersuchungszeitpunkt oder das Infektionsmedium (Tachyzoiten oder Oozysten) als variable

Parameter insgesamt keinen entscheidenden Einfluss auf die Gesamtanzahl T. gondii–positiver

Proben pro Tier oder auf die Verteilung im Schlachtkörper nehmen. Die beobachteten signifikanten

Unterschiede beziehen sich lediglich auf einzelne Organe. Allerdings ist es vorstellbar, dass bei

Verfügbarkeit einer sensitiveren Methode wie z.B. der sequence capture-PCR, oder einer deutlich

größeren Stichprobe solche Unterschiede in den Hintergrund treten würden. Für die eigene

Untersuchung waren die Möglichkeiten sowohl hinsichtlich Methode als auch Stichprobenumfang

begrenzt, so dass diese Frage derzeit offen bleiben muss.

Bezüglich des Infektionsmediums repräsentiert die Oozysteninfektion den natürlichen

Infektionsweg. Allerdings sind Oozysteninfektionen nicht immer verlässlich reproduzierbar, da

Oozystensuspensionen üblicherweise vor der Anwendung gelagert werden und das Alter der

Oozysten die Exzystierung im Intestinaltrakt beeinflussen kann (SINSKI und BEHNKE 2004).

Zudem erfordert die Gewinnung von Oozysten einen Tierversuch an Katzen, wie schon eingangs

erwähnt wurde. Da die Bildung und Verteilung von Gewebestadien im Organismus der Pute vom

Infektionsmedium weitgehend unabhängig ist, ist ein Infektionsmodell basierend auf der

artifiziellen parenteralen Applikation von Tachyzoiten der Oozysteninfektion vorzuziehen.

Der Einsatz der herkömmlichen PCR-Methode hat sich für die Untersuchung großvolumiger

Organproben als ungünstig erwiesen. Um dennoch keine Katzen- oder Mäusebioassays in Anspruch

nehmen zu müssen, wäre für zukünftige Untersuchungen zum Zystennachweis in den Organen der

Pute die magnetic capture-based PCR zu empfehlen, die den Nachweis von Toxoplasmen in

Fleischproben von bis zu 100 g ermöglicht (OPSTEEGH et al. 2010).

4.2 Schlussfolgerungen und Ausblick

Mit den vorgestellten konnte gezeigt werden, dass bei der Pute eine T. gondii-Empfänglichkeit

besteht und artifizieller Infektionen zum Befall diverser Gewebe mit dem Erreger führen. Die für


43

die experimentellen Infektionen gewählten Parasitenstadien, Tachyzoiten und Oozysten, erwiesen

sich als gleichermaßen geeignete Infektionsmedien und führten hinsichtlich der Verteilung des

Erregers im Körper der Pute zu vergleichbaren Ergebnissen. Da Tachyzoiten keine zusätzlichen

Tierversuche erfordern und sich wenig zeitaufwendig in der Zellkultur vermehren lassen, ist bei

zukünftigen Versuchen mit dem vorgestellten Infektionsmodell die parenterale Applikation von

Tachyzoiten einer Oozysteninfektion, für die infizierte Zwischenwirte an Katzen verfüttert werden

müssten, vorzuziehen.

Mit Hilfe der konventionellen PCR und anschließender nested PCR konnte nachgewiesen werden,

dass T. gondii sich heterogen im gesamten Organismus verteilt und bis zu 12 Wochen p.i.

persistieren kann. Neben der Heterogenität konnte mit 0-9 betroffenen Geweben pro Tier eine hohe

individuelle Variabilität bezüglich der Anzahl positiv getesteter Organe beobachtet werden.

Allerdings kann dieses Ergebnis durch die inhomogene Verteilung der Zysten und einer geringen

Zystendichte im untersuchten Gewebe zustande gekommen sein. Darüber hinaus erwies sich der

Einsatz einer konventionellen PCR für die Untersuchung großvolumiger Organproben, wie zum

Beispiel des Brustmuskels als nicht ideal, da nur eine geringe Probenmenge dem Verfahren

zugefügt werden kann. Bei weiterführenden Untersuchungen zur Zystenverteilung bei der Pute

könnte daher die, zum Zeitpunkt der Studie nicht verfügbare, magnetic capture-based PCR eine

gute Alternative darstellen.

Es konnte kein spezifischer Organtropismus des Erregers festgestellt werden. Es fiel aber auf, dass

T. gondii nach experimentellen Infektionen regelmäßig im Muskelgewebe und in anderen essbaren

Organen auftritt. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeutet dies,

dass im Fall einer T. gondii-Infektion ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch

infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann. Zukünftig sollte geklärt werden, ob es

sich bei den nachgewiesenen Parasiten um infektionstüchtige Erreger handelt und welchen Einfluss

die jeweiligen Verfahren zur Herstellung der Putenfleischprodukte auf den Parasiten besitzen und

ob sie zu einer Abtötung des Erregers führen. Somit könnte das Verbraucherrisiko bestimmt

werden.

Des Weiteren wäre zu klären, welche Auswirkungen eine Infektion mit T. gondii-Zysten, die neben

den Oozysten eine weitere natürliche Infektionsquelle darstellen können, bei der Pute hervorruft


44

und inwieweit Unterschiede hinsichtlich der Zystenverteilung im Vergleich zur

Tachyzoiteninfektion bestehen.

Zusammenfassung

45

5 Zusammenfassung

Birte Zöller

Untersuchungen zur Verteilung von Toxoplasma gondii-Stadien in Geweben bei Puten

nach experimenteller Infektion

Institut für Parasitologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Eingereicht im Dezember 2014

48 Seiten, 2 Tabellen, 164 Literaturangaben (ohne eigene Publikationen)

Schlüsselwörter: Toxoplasma gondii, Pute, Infektionsmodell, Gewebetropismus

Einleitung: Toxoplasma (T.) gondii zählt zu den häufigsten intrazellulären Parasiten weltweit.

Alleinige Endwirte im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus sind die Feliden. Als Zwischenwirte

können jedoch zahlreiche Säugetier- und Vogelarten dienen, in denen sich parasitäre Gewebezysten

entwickeln. Einer der Hauptübertragungswege auf den Menschen stellt der Verzehr von T. gondii-

haltigem Fleisch infizierter Nutztiere dar. Inwieweit Putenfleisch ein potentielles Infektionsrisiko

birgt und welche Bedeutung Puten in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose besitzen ist

nicht ausreichend geklärt.

Ziel der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein reproduzierbares

Infektionsmodell bei Puten für T. gondii zu entwickeln, um die Verteilung und Persistenz des

Parasiten im Gewebe zu ermitteln. Es wurden verschiedene Parameter, wie Infektionsstadium,

Infektionsdosis, Applikationsmodus und Untersuchungszeitpunkt hinsichtlich ihres Einflusses auf

die Entwicklung parasitärer Gewebestadien verglichen.

Material und Methoden: Insgesamt wurden 74 Puten nach einer Aufzuchtperiode von 4 bis 8

Wochen experimentell mit T. gondii-Tachyzoiten oder Oozysten infiziert. Je nach Versuchsgruppe

wurden Tachyzoiten vom Stamm ME49 intravenös und/oder intramuskulär appliziert oder Oozysten

vom Stamm ME49, DX oder Hannover 1 oral verabreicht. Die Verifikation der Infektion erfolgte

über den Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper mit Hilfe eines kinetischen ELISA. Drei bis

acht Puten jeder Versuchsgruppe wurden 6 bis 8 oder 10 bis 12 Wochen nach der Infektion getötet.

Von jedem Tier wurden folgende Gewebeproben entnommen: Brust-, Oberschenkel- und

Unterschenkelmuskulatur, Herz, Leber, Muskel- und Drüsenmagen, Gehirn, Lunge, Milz, Nieren,

Zusammenfassung

46

Darm, Pankreas und Hoden (sofern vorhanden). Die Organe wurden getrennt vollständig

homogenisiert. Bei den Muskeln wurden Proben von verschiedenen Lokalisationen entnommen und

ebenfalls einzeln homogenisiert. Der Nachweis von T. gondii-DNA in den Gewebeproben erfolgte

mittels konventioneller PCR, basierend auf der Amplifizierung eines 469 bp Fragments des B1-

Gens, und anschließender nested PCR (Länge Zielfragment: 375 bp). Zusätzlich wurden zu Beginn

der Studie lichtmikroskopische Untersuchungen einzelner Organe in Form nativer Quetschpräparate

(400fache Vergrößerung) auf T. gondii-Zysten durchgeführt.

Ergebnisse: Ungeachtet der Infektionsdosis und des inokulierten Parasitenstadiums konnten bei

keinem der Versuchstiere klinische Symptome einer Toxoplasmose beobachtet werden. Die

unterschiedlich hohen Infektionsdosen hatten im Allgemeinen keinen signifikanten Einfluss auf die

Anzahl positiv getesteter Puten oder Organproben. Lediglich die Anzahl positiver Gehirnproben

nahm mit ansteigender Oozystendosis signifikant zu. Bei der Betrachtung aller Versuchsgruppen

fiel auf, dass die Befallshäufigkeit der Organe sowohl zwischen den Tieren verschiedener

Infektionsgruppen als auch innerhalb einer Infektionsgruppe stark schwankte. So variierte die

Anzahl positiv getesteter Organe bei den Tachyzoiten-infizierten Puten zwischen 0 und 7, bei den

Oozysten-infizierten Puten zwischen 0 und 9 Organen pro Tier. Die Untersuchungsergebnisse

zeigen, dass sich T. gondii heterogen in der Pute verteilt und mindestens 12 Wochen persistieren

kann. Bezogen auf alle Versuchstiere gab es kein Organ, dass durchgängig negativ blieb. Nach der

Tachyzoiteninfektion waren am häufigsten Leber (43,3%), gefolgt von Brustmuskel (26,7%) und

Herz (20,0%) infiziert, während bei den Oozysten-infizierten Tieren der Erreger am häufigsten im

Gehirn (47,2%), gefolgt von Oberschenkelmuskulatur (25,0%) und Herz und

Unterschenkelmuskulatur (je 22,2%) nachgewiesen werden konnte.

Schlussfolgerungen: Tachyzoiten und Oozysten erwiesen sich als gleichermaßen geeignete

Infektionsmedien und führten hinsichtlich der systemischen Verteilung des Parasiten in der Pute zu

vergleichbaren Ergebnissen. Ein spezifischer Organtropismus des Erregers konnte nicht festgestellt

werden. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeuten die Ergebnisse,

dass im Fall einer T. gondii-Infektion ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch

infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann.

Summary

47

6 Summary

Birte Zöller

Studies on the dissemination of Toxoplasma gondii-stages in tissues of turkeys after

experimental infection

Institute of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig

Submitted in December 2014

48 pages, 2 tables, 164 references (without own publications)

Keywords: Toxoplasma gondii, turkey, infection model, tissue tropism

Introduction: Toxoplasma (T.) gondii is one of the most prevalent intracellular parasites worldwide.

Felidae are the only definitive hosts in the facultatively heteroxenous life cycle. However,

numerous mammal and bird species can act as intermediate hosts, in which parasitic tissue cysts

will develop. One of the main transmission routes for human beings is the consumption of

T. gondii-containing meat of infected livestock. The extent to which turkey meat involves a

potential risk of infection and the relevance of turkeys in the epidemiology of human toxoplasmosis

has not been clarified sufficiently.

Objective of the investigations: The aim of the present work was to develop a reproducible

T. gondii-infection model for turkeys to determine the dissemination and persistence of the parasite

in tissues. Different parameters as infectious stage, dose of infection, mode of application and time

point of examination were compared with regard to their influence on the development of parasitic

tissue cysts.

Material and methods: A total of 74 turkeys were experimentally infected after a rearing period of 4

to 8 weeks with T. gondii tachyzoites or oocysts. Depending on the test group tachyzoites of the

ME49 strain were applied intravenously and/or intramuscularly or oocysts of the strain ME49, DX

or Hannover I were inoculated orally. The verification of the infection was effected by the means of

the detection of T. gondii-specific antibodies by a kinetic ELISA. Three to eight turkeys of each test

group were killed 6 to 8 or 10 to 12 weeks after the infection. Of each animal the following tissue

samples were taken: breast muscle, thigh muscle, drumstick muscle, heart, liver, gizzard,

proventriculus, brain, lung, spleen, kidneys, intestine, pancreas and testicles (if present). The organs

Summary

48

in total were homogenized separately. Samples of muscles were taken from different locations and

homogenized separately likewise. T. gondii-DNA detection in tissue samples was conducted by

using a conventional PCR, based on the amplifying a 469 bp fragment of the B1 gene, followed up

by a nested PCR (length target fragment: 375 bp). Additionally light microscopy examinations for

T. gondii cysts were performed on single organs in form of native squash preparations (400 fold

magnification) at the beginning of the study.

Results: No clinical symptoms of toxoplasmosis were observed in any bird irrespective of the

infectious dose and the inoculated parasite stage. In general the different infectious doses had no

significant influence on the number of turkey tested positive or organ samples. Only the number of

positive brain samples increased significantly with an ascending dose of oocysts. Considering all

test groups it was apparent that the frequency of affected organs varied strongly between animals of

different test groups as well as within one test group. Thus the number of organs tested positive for

turkeys infected with tachyzoites ranged between 0 and 7 organs, for turkeys infected with oocysts

between 0 and 9 organs per animal. The study results demonstrate that T. gondii disseminates

heterogeneously in the turkey and may persist for at least 12 weeks. With reference to all study

animals there was no organ, which was consistently negative. After the tachyzoite infection, the

liver was the most frequent infested organ (43,3%), followed by the breast muscle (26,7%) and the

heart (20,0%), whereas of the oocyst infected animals the pathogen was detected most frequently in

the brain (47,2%), followed by the thigh muscle (25,0%) and the heart and drumstick muscle

(22.2% each).

Conclusions: Tachyzoites and oocysts turned out to be similarly suitable infectious mediums and

resulted in comparable findings concerning the systemic distribution of the parasite in the turkey. A

specific organotropism could not be determined. Concerning food safety and consumer protection

the results indicate that a potential risk of a human infection through infected turkey meat cannot be

ruled out.

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Danksagung

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8 Danksagung

Hiermit bedanke ich mich herzlich bei allen Personen, die zur Erstehung dieser Arbeit beigetragen

haben.

Allen voran danke ich Herrn Prof. Dr. Arwid Daugschies für die Überlassung des Themas, die mir

jederzeit gewährte Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit, für die hilfreichen Anregungen

und die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Ganz besonders möchte ich mich bei Fr. Dr. Berit Bangoura bedanken für ihre immer gewährte

Unterstützung, ihre Geduld und die schönen und lustigen Momente. Weiterhin bedanke ich mich

bei allen Kollegen des Instituts für Parasitologie für die gute Zusammenarbeit.

Nicht zuletzt danke ich all meinen Freunden, insbesondere Annika und Anne, von Herzen für den

Beistand während dieser Zeit, was sicherlich nicht immer einfach war.

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