Untersuchungsmethoden / Analysenverfahren

Chemische Untersuchungsmethoden- Titrimetrische

Verfahren- Gravimetrische Verfahren- Elektrische Verfahren

Physikalische Untersuchungsmethoden- Spektrometrische

Verfahren- chromatographische Verfahren

Biologische Untersuchungsmethoden- Bioteste mit Lebewesen- Enzymimmunoassays

Mikrobiologische Untersuchungsmethoden- Kolonienzahl- Bakterien-

und Pilzwachstum

Spektrometrische Analysenverfahren und zugehörige umweltrelevante Analysenparameter

UV/VIS-Spektrometrie

AnionenKationenFärbungOrganische VerbindungenDetektoren für die HPLC

Kohlenwasserstoffe, TensideDetektor für die GC (HPLC)Detektor für TOC-

und DOC-Messungen

Infrarot-Spektrometrie

Fluoreszenz-Spektrometrie

KationenOrganische VerbindungenDetektor für die HPLC

Emission-Spektrometrie

Flamme, Funken, BogenICPICP/MS

Metalle undNichtmetalle (S;P)

Atomabsorptions-Spektrometrie

FlammeGraphitrohrofenQuecksilber-Hydrid-SystemZeeman-AAS

Metalle undNichtmetalle

Bereiche des elektromagnetischen Spektrums

1021

1019 1017 1015

1013

1011

109

107

Frequenz v, Hz

10-11

10-9 10-7 10-5

10-3

10-1

101

103

1011

109

107

105

103

101

10-1 10-3

Wellenlänge ,cm

Wellenzahl v,cm-1

γ

-

Strahlen

Röntgenstrahlen

Ultraviolett

Sichtbar

Infrarot

Mikrowellen

Radiowellen

Funktionsprinzip der Spektrometrie

StrahlungTemperatur Messzelle Detektion

AuswertungDokumentationAnalysenprobe

Aufbau des Massenspektrometers

Probe

Beschleunigungs-platten

Einlaßsystem

Ionenquelle

Magnet

Trennsystem

Verstärkung/Registrierung

Massenspektrum

Massenspektrometrie

Messprinzip:- Analyt

wird in sich schnell bewegende ionisierende Gase überführt, an Handdes Masse-Ladungsverhältnisses detektiert

Geräte:- Vakuum Kollision der Ionen verhindern (bis 10-8

Pa)- verschiedene Ionisierungsarten (Elektronen, Hochspannung, Atome,

thermisches Plasma, Sekundärionenanregung)-

Einlasssystem, Ionenquelle, Trenn-

und Analysatorsystem, Detektor,Auswertesystem

Anwendung:- Strukturaufklärung von organischen Molekülen und Molmassenbestimmung- qualitative und quantitative Analyse anorganischer und organischer Bestandteile- Ermittlung von Isotopenverhältnissen- Struktur und Zusammensetzung von Oberflächen

Massenspektrometrie

ICP-MS

Funktionsprinzip:das Plasma ist ein im Hochfrequenzfeld ionisiertes Gas (Argon) und dientals Anregungsmedium für die eingesprühte flüssige oder gelöste Probe

System:Massenspektrometer(Quadrupol, Auflösung bis 0,5 Masseeinheiten)Interface(Ionenoptik, zwei Metallkegel mit Bohrungen 1 mm damit Ionen gebündelt das Massenspektrometer

erreichen)Plasma(Hochfrequenzgenerator)

Querschnitt durch den ICP-Brenner

6000 –

8000 K

Induktionsspule

Quarzrohr

PlasmaArgon

Aerosol Probe

Atomabsorptionsspektrometrie (AAS)

- gebräuchliches Verfahren zum quantitativen Nachweis von Metallen und Halbmetallen bis hin zum Ultraspurenbereich

- Prinzip:Atome können nur Licht ganz spezifischer Wellenlänge absorbieren bzw. emittieren

- mögliche Atomisierungsarten:Flamme, Graphitrohrofen, Hydridkaltdampftechnik

- Flamme z.B

Luft-Acetylen-Flamme (2145-2400 °C)Lachgas-Acetylen-Flamme (2650-2800°C)

- Graphitrohrtechnik:bis 3000°C im Argongasstrom, Verbesserung der NG um ca. 2 Größenordnungen, Analysenlösung 5-100µl

-

Hybridbildung durch NaBH4

(z.B. Sb, As, Se, Te, Bi, Sn, Pb, Ge, P)

Flammen-AAS

FlammeAbsorption

Monochromator

Photodetektorund Anzeige

ElektrodenloseEntladungslampe(EDL)Hohlkathoden-lampe

(HKL)Emission

Zerstäubung von Proben-und Kalibrierlösungen in der Flamme

Atomabsorptions-Spektroskopie

Chromatographie

Durchführung einer DC-Trennung

Gaschromatographie

Prinzip:

- Trennverfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Stoffgemischen

- Verteilung von Substanzen zwischen zwei nicht mischbaren Phasen(Konz. stationäre Phase/Konz. in Gasphase = K)

- Trägergase:Helium, Argon, Methan, Wasserstoff, Stickstoff

- Trennsäulen:in Umweltanalytik meist Dünnfilm-Trennkapillaren aus Quarzglas,polyamidummantelt, Länge 10-200 m, Durchmesser innen 0,1-0,5 mm,Oberfläche mit stationärer Flüssigkeit benetzt

- unterschiedliche Detektorsysteme-

Anwendung: z.B. Deponiegasbestimmung

Gaschromatographie in der Umweltanalytik

Proben-Dosierung

Manuell

Probenautomat

Adsorptionemittel

Edelstahlröhrchen

Trennsäule

DetektorWLD

FID

PND

ECD

PID

FPD

Hall-D

MS

Auswertung

GC-Detektoren und ihre Einsatzbereiche

Detektion

Kurz-

Substanzen

Empfind-form

lichkeit

Wärmeleitfähigkeits-

WLD ∗

Bodenluft

mittel-Detektor

∗

Deponiegase

mäßig∗

Biogase

Flammenionisations-

FID

∗

Kohlenwasserstoffe

gutDetektor

∗

Lösemittel∗

Benzol, Toluol, Xylol,ethylenbenzol

Phosphor-Stickstoff-

PND

∗

PflanzenbehandlungsmittelDetektor

∗

Nitrilotrieessigsäure

Elektroneneinfang-

ECD

∗

Leichtflüchtige halogenierte

sehrDetektor

Kohlenwasserstoffe

gut∗

Pflanzenbehandlungsmittel∗

Phenole

nach Derivatisierung∗

Schwerflüchtige halogenierteKohlenwasserstofe

∗

Polychlorierte Kohlenwasser-Stoffe

Photoionisations

PID

∗

aromatische Kohlenwasser-Detektor

Stoffe

Kombination von Gas-

FTIR

∗

KohlenwasserstoffeChromatographie mit FTIR

Kombination von Gas-

MS

∗

Dioxine, Furane

gutChromatographie mit

∗

Pflanzenbehandlungsmittel….-Spektrometer

∗

Polychlorierte Biphenyle, usw.

Kapillarelektrophorese

- neueste Technik elektrophoretischer

Verfahren (1979)- verknüpft Vorteile der elektrophoretischen

Trennmethoden mit den Möglichkeiten der einfachen direkten Quantifizierung und Automatisierung

- ermöglicht Auftrennung von Komponentengemischen über weitenMolekulargewichtsbereich (anorganischen Ionen bis hin zuBiopolymeren)

-

Ersatz oder Ergänzung der Ionenchromatographie (ideales Referenzverfahren)

- Nutzung in Kopplungstechniken (Massenspektrometrie)- Detektoren (Fluoreszenz, Leitfähigkeit, UV, MS)

Aufbau eines Kapillarelektrophoresesystems - Apparatur -

Zugabe

Kapillarelektrophorese Trennung von aromatischen Carbonsäuren

Bestimmung von Anionen in einem Flusswasser mit der Kapillarelektrophorese

UV/VIS-Spektrometrie

- beruht auf spezifischer Absorption elektromagnetischer Strahlungin den Wellenlängenbereichen:

∗ λ = 200 –

400 nm (ultravioletter Bereich, UV)∗ λ = 400 –

800 nm (sichtbarer Bereich, VIS)

- Strahlungsenergien 650 330 kJ/mol bzw. 330 –

160 kJ/mol

- Anregung von energiereichen Valenzelektronen (π

–

Elektronen vonDoppelbindungen, freie Elektronenpaare von Heteroatomen)

- Plank`scher

Gleichung eigentlich Linienspektrum, in der Praxis aber breite Banden, da sich durch Aufspaltung von Grund-

und Anregungs-niveaus

durch sich ändernde Rotation und Schwingung der Molekülenahe beieinander liegende Übergänge

UV/VIS-Spektrometrie

A

Bandenspektrum

-

charakteristische Daten(Amax.

= Absorption im Maximun, λmax.

= Wellenlänge des Maximums)

-

-kann zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der zugehörenden Substanzen herangezogen werden

λmax. λ

UV/VIS-Spektrometrie

Photometrische Kalibrierfunktion

A = Absorptionc = Konzentration A

Ax

cx

c (%)

UV/VIS-Spektrometer (schematischer Aufbau)

UV/VIS-Spektrometrie

A

Spalt SpaltPolychrom.Strahlung

Mono-chromator

Lichtquelle(D2 und/oder

Wolframlampe)

Meßküvette(Probe) Detektoren

Vergleichsküvette(Blindlösung)

Strahlungsteiler(50:50)

Anzeige-instrument

Registrierung- Schreiber- Plotter- Drucker- PC

MonochromatischeStrahlung

λmax. λ

UV/VIS-Spektrometrie

Einsatzbereiche in der Umweltanalytik

-Bestimmung von:AnionenKationenFärbungorganische Verbindungenenzymatische

Reaktionen

- Spektrometer

eignen sich auch als Detektoren für HPLC- hohe Bedienfreundlichkeit, niedrige Investitionskosten

Laserspektroskopische Methoden

∙

Während die herkömmliche UV-Vis-Spektroskopie

unter derVoraussetzung der Gültigkeit des Lambert-Beer`schen

Gesetzes die Absorption als Differenz aus austretendem zu eintretendemLichtstrahl bestimmt, nutzt die Laserspektroskopie direkteMethoden um die Absorption zu bestimmen.

∙

Das erhaltene Signal ist proportional zur eingestrahlten Lichtenergie,deshalb ist stets der Bezug zu dieser herzustellen.

-

Photoakustische Spektroskopie (LIPAS)-

Fluoreszenzspektroskopie (TRLFS)-

Thermal Lensing

Spektroskopie (TLS)-

(Multi Photon Absorption Spektroskopie)

Laserinduzierte Fluoreszenzspektroskopie

-„Absorbiertes Licht wird als Licht wieder ausgestrahlt.“-

Anregung der zu untersuchenden Uranverbindung mit einem Laserpuls

-

Detektion

des ausgesendeten Fluoreszenzlichtes unter einem Winkel von 90 °

zur Einstrahlungsrichtung.-

Zerlegung des Fluoreszenzlichtes in einem Monochromator, Detektion mit einem Diodenarray bzw. CCD-Kamera-

Für eine zeitaufgelöste Spektroskopie ist die Belichtungsdauer und der Zeitpunkt der Belichtung des Diodenarrays relativ zum Laserpuls einstellbar.(gatebarer

Bildverstärker –

Prinzip des Kameraverschlusses)

- Flureszenzspektren

können einer zeitaufgelösten Peakentfaltungunterzogen werden.

-unterschiedliche Spezies weisen neben unterschiedlichen Spektren

auchunterschiedliche Lebensdauern auf

Bestimmung mehrerer Spezies nebeneinander in einer Probe

Schema Laserspektroskopie Zeitaufgelöste Fluoreszenz/Photoakustik

Time-Resolved Laser-Induced Fluorescence Spectrum Mining Water Königstein

Verfahrensanwendung

- durch Anwendung von fluoreszierenden Organika

ist die indirekte Bestimmung von Metallionen möglich (Al, Li, Sn z.B.)niedrige Nachweisgrenzen pg/L, Störionen

sind zu berücksichtigen

- Pestizide, Aminosäuren, Nukleinsäuren haben oftmals selbst ausgeprägte Phosphoreszenz, die zur Bestimmung ausgenutzt wird

-

Messung erfolgt mit SEV (Sekundärelektronenvervielfacher)

Photoakustische Spektroskopie

-

"Absorbiertes Licht wird als Schallwelle wieder abgegeben."•

Aufnahme der Schallwelle durch ein an der Küvetteangebrachtes "Mikrofon" (piezokeram. Detektor) undUmwandlung in ein elektrisches Signal.

•

Da es sich bei der Schallwelle um eine auf den Laserpulsfolgende, gedämpfte Schwingung handelt, wird durch ein"Boxcar„-System

ein zeitliches Tor zur Messung nur derersten (intensivsten) Schwingungsamplitude gesetzt.

-

Durch Abstimmen des OPO-Lasersystems

über deninteressierenden Wellenlängenbereich lassen sich imPunktverfahren Absorptionsspektren aufnehmen,

-

Die maximal mögliche Wellenlängenauflösung desSpektrums wird dabei im wesentlichen durch die Bandbreitedes Laserpulses und die Abstimmgenauigkeit bestimmt.

Photoakustische Spektroskopie – Cell Design

Lichtquellen für PA/TLS-Spektroskopie

∙

Farbstofflaser (Dye)-

Nutzung organischer Farbstoffe als abstimmbares Medium-

in der Regel kanzerogen und mutagen-

methanolische

Lösungen-

begrenzte Haltbarkeit = speziell zu entsorgende Abfälle-

enger Abstimmbereich (~ 30…400 nm)-

tiefste erreichbare Wellenlänge 410 nm (mit Nd-YAG)

∙

Solid State Laser (OPO)-

Festkörperkristalle als abstimmbares Medium-

keine Abfallmengen-

theoretisch unbegrenzt nutzbar-

großer Abstimmbereich (~250 nm)

Jablonski-Termschema

Absorption Fluoreszenz Phosphoreszenz

interneKonversion

IntersystemCrossing

3210

S2

S0V=3V=2V=1V=0

S1 0

21

210

T2

0123 T1

Interne undexterneKonversion

Elektronenspins für den Singulett-und Triplettzustand

Singulett-Grundzustand

angeregterSingulett-zustand

angeregterTriplett-zustand

Fluoreszenz Phosphoreszenz

Röntgenabsorptionsspektroskopie

SE

PE

FS

AE

h·γ

M

L

K

Folgeprozesse der Absorptionvon Röntgenstrahlung (hγ):

PE: PhotoelektronFS: FluoreszenzstrahlungAE: AugerelektronenSE: SekundärelektronenK, L, M -

Schale

Synchrotron

- Elektronen-Synchrotron- Protonen-Synchrotron

- Teilchen laufen auf Kreisbahnen, sind vom Impuls unabhängig,Umlauffrequenz ändert sich ständig

- Elektronen-Beschleuniger∗

Geschwindigkeit praktisch Lichtgeschwindigkeit∗

erste Phase der Elektronenbeschleuniger ist ein vorgeschalteter

Beschleuniger(z.B. Betatron)

∗

weitere Beschleunigung erfolgt durch ein hochfrequentes

elektrisches Feld(Erhöhung der magnetischen Feldstärke bei konstanter Frequenz)

- Speicherringe:in diesen laufen die Teilchen im Magnetfeld um , bei Elektronen Energiezufuhr durchHochfrequenz-Beschleunigungssystem

Synchrotronstrahlung

(elektromagnetische Strahlung relativisitischer

Elektronen, die sich in einem Magnetfeld bewegen)

Eigenschaften:

-

sehr intensive, laserähnlich gebündelte Strahlung, die sich über den gesamten Spektralbereich von Infrarotbereich bis zum Röntgenstrahlungsbereich erstreckt

-

typische Energie der Elektronen im Speicherring: ca. 100 MeV

-

lineare Polarisation der Strahlung

-

gepulste Strahlung (Lichtblitze ca. 100 ps)

-

hohe Stabilität der Lichtquelle

Röntgenabsorptionsspektroskopie mittels Synchrotronstrahlung

Spektrum (allg.) Detektion

Röntgenabsorptionsmethoden

- Absorption von Röntgenstrahlung durch Atome ist energieanhängig

- bei bestimmten Energien treten Sprünge (Absorptionskanten) auf, die durch die Photoionisation innerer Elektronen bedingt sind

- bei genauer Untersuchung des kantennahen Bereiches ist charakteristischeStrukturierung zu erkennenXANES (X-ray Absorption Near Edge Structure)∗

Informationen zu:

BindungsernergienValenzzustände

- Strukturierung oberhalb der Kante (Bereich 50 eV

–

200 eV

oberhalb derPhotoionisationsschwelle), Rückstreuung der ElektronenEXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure)∗

Informationen zu:

NahordnungBindungsabständeKoordination

EXAFS-Strukturparameter der Uranylkomplexe Aliphatische Carbonsäuren und Huminsäuren

Modellkomplex von

Koordination

U-O äq

U-XUO22+ mit

von –COOH pH

R (Å) N Atom

R (Å)

Maleinsäure

mono

4,2 2,37 6 Malonsäure

mono/oxo

3,9 2,36 5

U 3,96Bernsteinsäure

bi

4,9 2,48 5 C 4,37Huminsäure mono 4,0 2,38 6

Identische

Strukturparameter

für

U-O axial: N=2, R=1,78 Å

As K-Kante XANES Spektren von Referenzproben

Röntgenabsorptionsspektroskopie (XANES, EXAFS)

-

monochromatische Röntgenstrahlung wird beim Durchgang durch Materie geschwächt

-

der lineare Absorptionskoeffizient nimmt mit zunehmender Energie ab, bis zu der Energie,

die ausreicht, um ein Elektron aus einer inneren Schale freizusetzen

-

starker Anstieg des Absorptionskoeffizienten, danach wieder Abfall

-

befinden sich Nachbaratome in der Umgebung des Absorberatoms sind feine Oszillationen

oberhalb der Kante sichtbar = Feinstruktur

-

Oszillationen hängen von Abstand, der Zahl und der Art der benachbarten Atome ab

Forderungen an moderne Speziationsmethoden

- Probe nicht verändern, in-situ

Bestimmung, vor-Ort-Bestimmung∗

sorgfältige Probennahme und Probenvorbereitung

- Messung bei sehr geringen Konzentrationen∗

10-5

bis 1010

mol/L

- Hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit∗

Senkung der Matrixeffekte

- Automatisierung und on-line

Datenauswertung∗

schnelle Bearbeitung von großen Probenzahlen

Kopplungstechniken zur Elementspeziesanalytik - Definition -

- Kopplungstechniken sind aus mehreren hintereinander geschaltetenanalytischen Methoden bestehende Systeme

- Methoden können auch unabhängig voneinander eingesetzt werden

- Synergieeffekt der Kopplung(Information größer als bei getrennter Methodenanwendung)

➙

System bestehend aus Trenn-

und Detektionsmodulen, die über ein Interface verbunden sind und die Analyte

in einem meist automatisierten, geschlossenen System bestimmen

Vorteile der Kopplungstechniken

∗

Verkürzung des Zeitbedarfs pro Bestimmung

∗

Verringerung des Arbeitsaufwandes

∗

Automatisierbarkeit

∗

Weitgehende Vermeidung von Kontaminationen durch Abschirmung dergetrennten Bestandteile von der Umgebungsluft und Gefäßoberflächen

∗

Vermeidung von Analytverlusten

durch Verwendung eines quasi-geschlossenen

Systems

∗

Reproduzierbarkeit durch identische Analysenbedingungen

∗

Vermeidung einer Zwischenlagerung nach Fraktionierung

∗

Änderung der Spezies oder der Bindungspartner durch oxidativen

oder mikrobiellen

Einfluss wird verringert

Trennmethoden zur Speziesanalytik können sein:

- Extraktion- Sequentielle Extraktion- Filtration- HPLC- GC- Elektrophorese

für Probenvorbereitung besonders wichtig:Einhaltung der nativen Bedingungen (pH, Redoxbedingungen, Ionenstärke

u.a.),auch kann Derivatisierung

notwendig sein,Methodenvergleich, Wiederfindungs-

und Spike-Experimente

Häufige Trennmodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse -

Methoden

Trennprinzip/Besonderheiten

Flüssigkeitschromatographie –

LC

GelpermeationschromatographieIonenaustauschchromatographieReversed-phase-ChromatographieIonenpaarchromatographie

Gaschromatographie –

GC

Säulen niedriger PolaritätSäulen hoher Polarität

Kapillarzonenelektrophorese

–CZE

QuarzkapillarenBeschichtete KapillarenGelgefüllte

Kapillaren

Anodic

Stripping

Voltammetry

–

ASV

Differential Pulse

Interfacemodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse -

Methoden

Technik

Flammen-Atomabsorptionsspektroskopie –

F-AAS

Pneumatischer Zerstäuber(Flammen-Atomfluoreszenzspektrometrie

–

F-AFS)

Hydraulische Hochdruckzerstäuber (HHPN)Kaltdampf-Atomabsorptionsspektrometrie

–

CV-AAS)

Fließinjektion (FIA)(Kaltdampf-Atomfluoreszenzspektrometrie

–

CV-AFS)elektrothermale Atomabsorptionsspektrometrie

On-stream

(Probengeber)-ET-AAS

Off-stream

(Fraktionssammler)Plasma-Atomemissionsspektrometrie

–

Plasma-AES

Pneumatischer ZerstäuberUltraschallzertäuberDirektinjektion (DIN)Hydraulische Hochdruckzerstäubung (HHPN)

Chemischer Reaktionsdetektor –

CRD

Continuous-flow

(CFA)Fließinjektion (FIA)

Organische Massenspektrometrie

–

MS

Particle-beamThermosprayElektrosüray

Fourier-Transformation-Infrarot

–

FT-IR

Flusszelle(Fourier-Raman-FT-Raman)Nuklearmagnetische Resonanzspektroskopie –

NMR

Flusszelle

Detektormodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse -

Methoden

Technik / Besonderheiten

Atomabsorptionsspektrometrie

–

AAS

Flamme (F)Hydrid (HD)Kaltdampf (CV)Elektrothermal (ET)

Atomfluoreszenzspektrometrie

–

AFS

Flamme (F)Hydrid (HD)

Plasma-Atomemissionsspektrometrie-

Induktiv gekoppeltes Plasma (ICP)Plasma-AES

Mikrowellenplasma (MIP, CPM)Gleichstromplasma (DCP)Wechselstromplasma (ACP)

Quadrupol-Massenspektrometrie

Induktivgekoppeltes Plasma (ICP)Quadrupol-MS

Mikrowelleninduziertes Plasma (MIP)Sektorfeld-Massenspektrometrie

Induktiv gekoppeltes Plasma (ICP)Chemischer Reaktionsdetektor –

CRD

Continuos-flow

(CFA)Fließinjektion (FIA)

Elementselektiv:

Detektormodule für Kopplungstechniken zur ESA - Elementspeziesanalyse -

Methoden

Technik / Besonderheiten

Massenspektrometrie

–MS

Particle-beam

(PB)Thermospray (TS)Elektrospray (ES)

Fourier-Transformation-Infrarot-

He-Cd-Te-Detektor / Durchflusszelle

Spektroskopie / Raman

–

FT-IR/Raman

Nuklearmagnetische Resonanz-

DurchflusszelleSpektroskopie –

NMR

Ultraviolett (UV)

–

Spektrometrie

mit

Polytetrafluorethylen (PTFE)-

oderDiodenarraytechnik

Polyetheretherketon (PEEK)-Kapillare,Durchflusszelle

Fluoreszenz

Polytetrafluorethylen (PTFE)-

oderPolyetheretherketon (PEEK)-

Kapillare,Durchflusszelle

Molekülselektiv:

Kopplung der HPLC mit plasmaspektrometrischen Multielementverfahren zur Elementspeziesanalyse

Spurenanalytische Bestimmung von sechs Arsenspezies mittels HPLC/Q-ICP-MS

1

2

3

4 5

6

0 4 8 min

1 –

Arsenocholin, 2 –

Arsenobetain, 3 –

As(III), 4 –

Dimethylarsinsäure

(DMAA),5 –

Monomethylarsonsäure

(MMAA), 6 –

As(V); je 5 g/laus Demesmay

et al. [4.65]

Biologische, mikrobiologische und biochemische Methoden

Biologische Verfahren:

- Bioteste mit LebewesenFischtest, Bakterientest, Algentest

Mikrobiologische Verfahren:

- Bestimmung der Kolonienzahl- Bestimmung coliformer

Keime- Bestimmung ausgewählter Bakterienstämme (Escheria

coli,Fäkalstreptokokken z.B.)

Biochemische Verfahren:

-

Immunochemische

Verfahren

Ökotoxikologische Tests

Organismus Methode, Messgröße Zeit, Parameter

Akute ToxizitätBakterien

Leuchtbakterientest, Stoffwechselaktivität

15-60 min, EC50

1Algen

Wachstumshemmtest

72 h, EC50Daphnien

Immobilisierung, Mortalität

24 h, LC50Fische

akute Toxizität, Mortalität

96 h, LC50

Chronische ToxizitätBakterien

Wachstumshemmung

Stunden, NOEC2

Algen

Wachstumshemmung

72 h, NOECDaphnien

Reproduktion

21 d, NOECFische

verlängerter Fischtest, Mortalität

14 d, 21 d, NOEC

Toxizitätsprüfung an Fischen

Algentest mit Fluoreszenzmessung

Grundlage:Eigenschaft des Chlorophylls grüner Pflanzen nach einer Anregungim sichtbaren Teil des Spektrums (rotes oder blaues Licht) eineFluoreszenzstrahlung (rot) bei 685 nm auszusenden

Verfahren zur Bestimmung von toxischen Effekten chemischer Verbindungen auf das Wachstum planktonischer

Süßwasseralgen

- zur Beurteilung der Photosyntheseaktivität- zum Nachweis von Photosyntheseblockern wie z.B. Herbiziden

Biolumineszenz

-

Strahlungsemission wird oft im biologischen System beobachtet (Leuchtkäfer, Glühwürmchen) Intensität der Lichtemission bei enzymkatalysierten Reaktionen messen:z.B. Luciferase

(aus Leuchtkäfern) katalysiert die Oxidation des

Luciferinsin einer ATP verbrauchten Reaktion (Bestimmung von ATP):

Luciferin + (ATP) + O2 —Luciferase →

Oxyluciferin + (AMP + Ppi) + CO2 + h·v

AMP = Adenosis-5-monophosphatATP = Adenosin-5-triphosphatPpi

= anorg. Diphosphat

Leuchtbakterientest

- gram-negative fakultativ-anaerobe Meeresbakterien aus der Familie der Vibronaceae(Verwandt mit terrestrischen Bakterien die in Böden und Gewässern

leben)- Leuchtvorgang (Biolumineszenz) Teil des Bakterienstoffwechsels-

Leuchten: Oxidation der Leuchtstoffe (Luciferine) unter katalytischer Wirkung des Enzyms Luciferase-

wird Stoffwechsel durch Anwesenheit toxischer Stoffe gestört, verringert sich die Leuchtkraft- Prinzip:

Abnahme der Biolumineszenz

während der 30minütigen Testzeit im Vergleich zu unbehandelten Bakterienproben(Bakterien-Lagerung bei -20°C)

Schematischer Ablauf des LUMISmini - Test

Reaktivieren und Vorbereiten

Start bei 0

Minuten4,5 ml Reaktivierungslösungzur Bakterienkonserve geben

1Je 0,5 ml Kontrolllösung(2%) NaCl) in MessküvettenReihe A geben

2

AB

Probe aufsalzen

und je 0,5 mlin Messküvetten

Reihe Bgeben

Ende nach15

Minuten

3

AB

Je 0,5 ml Bakterien zuMessküvetten

in Reihe A und B geben

Testen

15 Minuten warten

Messen:Kontrolle ProbeErgebnisKontrolle ProbeErgebnisusw.

Leuchtbakterientest

Beispiele:

- Toxizität von Schwermetallen- Toxizität von Kohlenwasserstoffen, Pestiziden, org. Lösungsmitteln

Test von:- Wässern- Klärschlämmen- Gewässersedimenten- Böden (Altlasten)

- Leuchtbakterien sind bisher nie als Krankheitserreger aufgetreten ! -

Immunologie

- beschäftigt sich mit Mechanismen der Immunantworten, mit der sich derlebende Organismus gegen eine Infektion durch Fremdkörper zur Wehr

setzt

- zwei grundsätzliche Immunantworten* humorale

Abwehr (durch Antikörper vermittelt)* zellständige Abwehr

- Prozessdringt Antigen oder artfremde Verbindung in Organismus ein, so

kommt es zur Teilung und Differenzierung von Lymphozytenbei humoraler

Abwehr kommt es zur Reifung von Plasmazellen, die ihrerseits

spezifische Antikörpermoleküle generieren, diese verbinden sich mit demAntigen und bewirken seine Ausfällung, seine Neutralisation oder seinen

Tod, abhängig ob Antigen ein Makromolekül, ein Toxin oder ein Mikroorganismus ist

kaum kovalente

Bindungen, sterische

Effekte –

Schlüssel/Schloss/Prinzip –Antikörper sind Mitglieder der Familie der Immunoglobuline(4 Polypeptidketten)

Immunologie (Fortsetzung 2)

- Herstellung von Antikörpern:Injektion einer Lösung oder Suspension des Antigens (z.B. Klasse der

Protoine,Polysaccharide, hohe MG) in ein Kaninchen, nach erforderlicher Zeit werden5-50 mL Blut vom immunisierten Tier abgenommnen, Blutgerinnung, Serumetwa 2-25 mL durch Zentrifugation

abgetrennt, bei ca. 56°C inkubiert,portioniert und bei -20°C eingefroren

- Radioimmunoassayklinische Praxis, biochemische Forschungz.B. quantitative Analyse von Hormonen, Steroiden, MedikamentenVerbund von Spezifität

der Immunreaktion mit der Empfindlichkeit derRadioaktivitätsmessung*Bestimmung: unmarkiertes Antigen (unbekannte Menge) und radioaktivmarkiertes Antigen (bekannte Menge) konkurrieren um die begrenzte Anzahlvon Antikörperbindungsstellen in einer vorgegebenen Menge Antiserum,bei Steigerung des unmarkierten Antigens (Menge radioaktiv markiertenAntigen bleibt gleich) wird die Menge an Radioaktivität im gebundenen Antikörper-Antigenkomplex abnehmen, aus Eichkurve ist die zu

bestimmendeAntigenmenge ermittelbar

Bioimmunoassay

-

Prinzip ist dem Immunsystem von Mensch und Tier abgeschaut, körperfremde Stoffe nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip

zu erkennen und durch spezifische Antikörper zu binden- bisher insbesondere Drogen und Hormone analysiert- Fortschritte in der Antikörpertechnologie ermöglichen auch die Analyse von

nichtimmunogenen, d.h. niedermolekularen Stoffen –

die Haptene

–

durchEntwicklung dafür spezifischer Antikörper

ELISA-Verfahren: (enzyme

linked

immunoabsorbent

assay)-

Antikörper an festen Phase sorbiert, aber auch durch kovalente

Bindung nach Reaktion z.B. mit Cyanogenbromid

(Cellulose, quervernetzte Dextrane,Polystyrol, Propylen u.a.) Festphase nur einmal einsetzbar

Anwendung:-

Klinische Biochemie: Globuline

im Blut, Insulin, verschiedene Viren, usw.

-

Umweltanalytik:

Atrazin, Huminsäuren, TNT, Pyrene, Sulfonylharnstoffherbizide, PAH z.B.

Immunochemische Verfahren

Motivation:Immunochemische

Reaktionsprinzipien auch zum Nachweisumweltrelevanter Stoffe (z.B. Pflanzenschutzmittel, Sprengstoffe

usw.)zu nutzenEntwicklung von relativ unkomplizierten Testbestecken vor allem zurvor-Ort-Analytik

Grundlagen:Sind immunochemischer

Reaktionen:Antigen (AG) provoziert die Bildung von Antikörpern (AK), Antigen undAntikörper bilden einen Komplex AGAK, ist ein Bestandteil AG oder AKin irgend einer Form markiert, dann ist Komplex quantifizierbar(radioaktiv –

RIA, Fluoreszenz –

FIA)

Immunochemische Methoden