Vereinfachte Thalassämie-Diagnostik durch -3.7-Deletions-Detektion auf dem LightCycler 2.0

1. Zusammenfassung

Auf der Abteilung für medizinische Genetik werden wöchentlich Thalassämieabklärungen durchführen. Am meisten Probenmaterial fällt bei Abklärungen der -3.7-

Thalassämie an. Bisher wurde die Detektion der -3.7-Thalassämie mittels Gap-PCR und anschliessender Gel-Elektrophorese durchgeführt. Diese Methode nimmt in der

Routine viel Zeit und technischen Aufwand in Anspruch. Eine Möglichkeit diese Faktoren zu vermindern, bietet sich die -Thalassämie-Genotypisierung mittels

Schmelzkurvenanalyse auf dem LightCycler zu detektieren. Ich habe mir zur Aufgabe gemacht, die bisherige Routine-Analyse der –3.7-Thalassämie auf dem LightCycler

2.0 von Roche zu übertragen. Dabei sind vier Experimente mit zwei verschiedenen Primerpaaren durchgeführt worden. Die Experimente beinhalten pro Primerpaar zwei

SYBR-PCR und zwei High-Resolution-Meltings wobei LightCycler-green verwendet wird. Der momentane Stand der Übertragung der Methode zeigt sich für die Routine als

nicht geeignet und die erhaltenen Resultate stimmen nur teilweise mit der Zielsetzung überein. Es wurde nach Optimiereungsmöglichkeiten für weitere Experimente

recherchiert. Diese stehen nun im Fokus der Abteilung für medizinische Genetik.

2. Einleitung

Die -Thalassämie ist eine autosomal-rezessiv vererbte Krankheit welche mit einer hypochrom-mikrozytären Anämie einhergeht. Der Phänotyp äussert sich von einer

symptomfreien bis hin zu einer letalen Anämie. Die Biosynthese des -Globins findet über die HBA1-und HBA2-Gene statt. Bei der -Thalassämie ist das HBA1- und HBA2-

Gen auf Chromosom 16p betroffen. Diese -Gene liegen in doppelter Form vor, also pro Chromosom zwei Gene, welche für das -Globin codieren. Die beiden Gene liegen

unmittelbar nebeneinander und die codierenden Sequenzen für HBA2 und HBA1 sind nahezu identisch und ergeben das genau gleiche Protein. Das klinische Bild einer -

Thalassämie ist abhängig von der Anzahl der Betroffenen Gene. Bei der -3.7-Deletion ist die Sequenz zwischen den zwei -Genen um 3.7kbp deletiert, wobei in beiden

Genen nicht alle Exons deletiert sind. Da die -Gene identisch sind, kann trotz der Deletion, durch die Fusion an den Bruchpunkten, eine(statt 2) -Kette biosynthetisiert

werden. Der Genotyp äussert sich demnach wie folgt; Homozygot-Wildtyp: /,Homozygot-3.7-del.: -/-(Thal. minor), Heterozygot-3.7.del.: -/ (Thal. minima).

Die -3.7-Schmelzkurvenanalytik erweist sich als schwieriges Unterfangen, welches einerseits durch die Homologie der Genregionen zwischen HBA1 und HBA2 und damit

verbundenen Problematik der Primerauswahl und des Schmelzverhaltens auszeichnet. Andererseits amplifiziert man lange Produkte im Bereich zwischen 1.9kbp und

2.3kbp. Es wurden Primer der Routine verwendet und Primer von Liu et al.2004.

3. Ziele und Fragestellung

Meine Zielsetzung: Etablierung der -3.7-Deletions-Detektion mittels Schmelzkurve auf dem LC 2.0 (LightCycler®).

Fragestellungen:

Ist diese Methode in der Routine Umsetzbar?

Wie verhält sich die Spezifität und Sensitivität?

Die Aussagekraft der ermittelten Resultate, und die Sicherheit keine falschen Ergebnisse erzielt zu haben.

Sind alle, bisherig mit der Gap-PCR-Methode detektierten -3.7-Thal.-Mutationen auch mit der Schmelzkurvenanalytik feststellbar?

Spart die Schmelzkurvendetektion an Zeit und finanziellem Aufwand? Ist es insbesondere möglich, die -3.7-Schmelzkurvenanalytik in nur einer Reaktion umzusetzen?

6. Diskussion

Mit den Experimenten 1,2 und 4 konnten keine Unterscheidungsmerkmale zwischen; homozygot-Wildtyp, homozygot-3.7-del, heterozygot-3.7-del, erzielt werden. Einzig

und allein das Experiment3 zeigt unterscheidbare Merkmale zwischen den Genotypen.

Experiment3, Umsetzbarkeit in der Routine: Das Experiment3 ist momentan noch nicht so weit um es in der Routine einzusetzen. Es fehlt noch ein gewisser Feinschliff wie

beispielsweise der Zwischenschritt , bei dem die Glaskapillaren aus der Position entnommen werden müssen und das LightCycler-green pipettiert werden muss wobei eine

hohe Verwechslungsgefahr der Proben besteht. Andererseits müssen die Schmelzkurven deutlich unterscheidbar sein damit das auch automatisch zum jeweiligen Genotyp

zugeordnet werden kann. Somit ist das LightCycler-Experiment3 in der Routine nicht einsetzbar.

Gepalant war eine Ermittlung der Sensitivität und Spezifität des Lightcycler-Experiment3, dies fiel jedoch aus zeitlichen Gründen aus.

5. Ergebnisse

Experiment3, Doppelansatz

5.3. A Die Schmelzkurven stellen

Jeweils den homozygoten-Wildtyp dar.

Diese Schmelzkurven bestehen aus

zwei Peaks in der Schmelzkurve. Der

erste Peak erscheint bei 87.5°C,

der zweite bei 91.0°C.

5.3. B Bei diesen Schmelzkurven

handeltes sich um den homozygot-

deletierten Genotyp. Diese weisen vier

Peaks in der Schmelzkurve auf. Die ersten zwei fallen bei 76.5°C und 82.0°C auf. Es folgen danach zwei deutliche Schmelzkurven bei 87.5°C und bei 91.0°C, welche

hinsichtlich der Intensität einen gleichmässigen Verlauf aufweisen.

5.3. C Hier werden die Schmelzkurven der heterozygot-deletierten Genotypen aufgezeigt. Diese sind in der Schmelzkurve durch drei Peaks gekennzeichnet. Der erste

Peak erscheint bei 76.0°C. Der zweite Peak erscheint bei 87.5°C, der dritte bei 91°C. Der Verlauf des zweiten und des dritten Peaks zeigen einen ähnlichen Verlauf wie

beim homozygoten-Wildtyp auf. Die Länge der Amplikons haben den Erwartungen (homozygot-Wildtyp: 2.2kbp homozygot-3.7-del.:1.9kbp, heterozygot-3.7-del.: 1.9kbp und

2.2kbp) entsprochen und wurden mittels Gel-Elektrophorese bestätigt.

4. Material, Methodik, Vorgehen

Insgesamt wurden vier Hauptexperimente veranlasst. Dabei wurden zwei Primerpaare(A,B) mit zwei verschiedenen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert:

Experiment1: Primerpaar A(Routine-Primer) + SYBR-green, Experiment2: Primerpaar B(Liu et al., 2004) + SYBR-Green Experiment3: Primerpaar A + LightCycler-green,

Experiment4: Primerpaar B + LightCycler-green

Komponenten des Mastermix: Dest. Wasser, Q-Solution, PCR-Buffer, DMSO 99.5%, dNTP Mix 10mM, Primerpaar(A oder B), SYBR-green(Experiment 1 und 2),

LightCycler-green(Eperiment 3 und 4)

Das Cycling-Programm war abhängig von den Primerpaaren. Dabei wurde die Annealingtemperatur jeweils berücksichtigt, der restliche Teil des Cycling-Programms war

identisch: Pre-Denaturierung:15' 95°C; Amplifikation: 40x (1' 94°C / 1' 63°C(Experiment 1, 3) oder 65°C(Experiment 2, 4) / 2' 30" 72°C); Post-Elongation: 10' 72°C;

Schmelzkurve: 5' 95°C / 5' 65°C / 95°C mit einer Ramprate von 0.05°C /sec

Experiment 3 und 4 wurden mittels HighResolutionMelting veranlasst. Da wird statt SYBR-green LCGreen verwendet, bei dem die Signale um ein vielfaches stärker sind, da

es die DNA besser sättigt. In der Packungsbeilage des LightCycler-Greens ist zu entnehmen, dass das LCG PCR-inhieberende Eigenschaften aufweist. Das konnte in

einem Nebenexperiment bestätigt werden. So war man gezwungen, zwischen der Post-Elongation und der Schmelzkurve die LightCycler-Glaskapillaren zu öffnen und das

LCG reinzupipettiren. Bei allen Experimenten wurde anschliessend eine Gel-Elektrophorese mit 1%igem Agarosegel veranlasst.

Für alle Experimente wurde bereitgestellte humane Kontroll-DNA verwendet, welche mittels dem MagNA Pure compact maschinell aus EDTA-Vollblut extrahiert wurde. Die

Kontroll-DNA entnehme ich von bekannten Genotypen(homozygot-Wildtyp, homozygot-deletiert, heterozygot-deletiert) aus der Routine. Als negativ-Kontrolle wurde

DNAse/RNAse freies Wasser verwendet. Pro Experiment/LightCycler-Run wurden vier Proben verwendet; die drei obgenannten Genotypen + negativ-Kontrolle.

Kantonsspital Aarau, Abteilung für medizinische Genetik Latif Memedi, BMA10-13