Vergleich von Messmethoden fur photosynthetische

Gasflusse und Entwicklung eines neuen orts-

auflosenden Verfahrens mit dem

Massenspektrometer

Diplomarbeitder Mathematischen-Naturwissenschaftlichen Fakultat

der Christian-Albrechts-Universitatzu Kiel

vorgelegt vonJessica Spors

Kiel, Februar 2001

2 INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 4

2 Theorie der Photosynthese 62.1 Einfuhrung in die Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.2 Ort der Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72.3 Die Elektronentransportkette . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.4 Die Mehler-Reaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.5 Der Calvin-Zyklus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.6 Die Photorespiration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.7 C4-Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.8 Verwendete Pflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.8.1 Maispflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.8.2 Bohnenpflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.8.3 Gierschpflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.8.4 Grunalge Chara corallina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

3 Die Clark-Elektrode 153.1 Motivation fur den Einsatz der Clark-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.2 Messaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.2.1 Aufbau der Clark-Elektroden-Einheit von Hansatech . . . . . . . . . . . . 163.3 Funktionsweise der Clark-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183.4 Das Bespannen der Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.5 Reinigung der Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4 Die Clark-Elektrode im Messbetrieb 234.1 Verstarkung und Rauschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234.2 Driftverhalten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

4.2.1 Driftverhalten einer neu bespannten Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . 254.3 Prufung der Kammer auf Gasdichte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254.4 Kalibrierung der Clark-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274.5 Auswirkung von Licht- und Warmestrahlung der LED’s . . . . . . . . . . . . . . 274.6 Sauerstoffentwicklung von Blattern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

5 Die Clark-Elektrode im Photoakustikaufbau 305.1 Motivation f. d. Parallelmessung v. Photoakustik u. Clark-Elek. . . . . . . . . . . 305.2 Photoakustik (PA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 325.3 Parallelmessungen von Photoakustik und Clark-Elektrode . . . . . . . . . . . . . 345.4 Messbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365.5 Die Langzeitmessung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

INHALTSVERZEICHNIS 3

6 Das Microx 406.1 Messprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406.2 Aufbau des Messgerates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

6.2.1 Datenaufnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426.3 Messspitzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 426.4 Kalibrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446.5 Testmessungen mit den Optoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

6.5.1 Auswirkung des Hintergrundlichtes auf den PMT . . . . . . . . . . . . . . 446.5.2 Temperatureffekt auf den Farbstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 456.5.3 Einfluss der Lichtqualitat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 486.5.4 Abschatzung der Eignung des Microx . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

7 Messungen mit dem Microx 547.1 Parallelmessung Microx und Clark-Elektrode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

7.1.1 Aufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 547.1.2 Messungen an Blattern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

7.2 Messung an isolierten Zellen von Maispflanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577.2.1 Motivation fur die Messungen an Bundelscheiden- und Mesophyllzellen . . 587.2.2 Isolation von Bundelscheiden- und Mesophyllzellen von Maispflanzen . . . 597.2.3 Messaufbau zur Elimination des Temperatureffektes . . . . . . . . . . . . 597.2.4 Messungen an isolierten Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

7.3 Messung an der Grunalge Chara corallina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 617.3.1 Messaufbau und Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

7.4 Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

8 Das Massenspektrometer 668.1 Motivation fur die Messungen mit dem Massenspektrometer . . . . . . . . . . . . 668.2 Aufbau und Funktionsweise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

8.2.1 Das Quadrupol-Massenspektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 688.2.2 Die Messpipetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

8.3 Vorversuche mit dem Massenspektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 708.3.1 Untersuchung des Messaufbaues auf Undichtigkeiten . . . . . . . . . . . . 708.3.2 Leckratenbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 708.3.3 Drift . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 718.3.4 Bestimmung der Gasempfindlichkeit des Massenspektrometers . . . . . . 738.3.5 Kontrollmessung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

8.4 Beispiele hochortsaufgeloster Messungen an Blattern . . . . . . . . . . . . . . . . 788.4.1 Messverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 788.4.2 Gasdetektionsverhalten versch. Pipetten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 798.4.3 Blattnahe Gasatmosphare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 808.4.4 Einfluss altern. Hell-Dunkel-Ph. auf die photosyn. Gasflusse . . . . . . . . 81

9 Fazit und Ausblick 84

10 Zusammenfassung 86

Literaturverzeichnis 89

4 Kapitel 1 Einleitung

Kapitel 1

Einleitung

Im Jahre 1894 konstruierte T. W. Engelmann (1843-1909) aus einem modifizierten Mikro-skopkondensor eine Vorrichtung, mit der er Teile photosynthesaktiver Zellen (der Grunal-ge Spirogyra) durch einen feinen Lichtstrahl beleuchtete, um zu klaren, welche Kompo-nenten der Zelle als Lichtrezeptoren wirken. Um eine Sauerstoffproduktion zu messen,tauchte er den Spirogyra-Faden in eine bakterienhaltige Suspension. Wurden Teile desChloroplasten illuminiert, konzentrierten sich die Bakterien in der belichteten (und somitsauerstoffreichen) Zone. Bei Belichtung anderer (farbloser) Bereiche der Zelle blieb dieAnlockung der Bakterien aus.

Heutzutage sind andere Messmethoden als Bakterien vorhanden, um photosynthetischeSauerstoffentwicklung zu messen. Jedoch existiert noch kein einzelnes Verfahren, mitwelchem alle Einsatzgebiete abgedeckt werden konnen.

Das Standardgerat ist die Clark-Elektrode, bei der der Sauerstoff polarometrisch in einerwassrigen Losung bestimmt wird (Delieu und Walker, 1981). Da eine Konzentration ge-messen wird, kann nur der Summeneffekt von Flussen in und aus dem photosynthetischaktiven System gemessen werden. Die Photoakustische Spektroskopie (PAS) misst hinge-gen mit einem Mikrophon die Druckwelle, die O2 erzeugt, wenn es nach einem Lichtblitzaus dem Blatt herausquillt, und das CO2, das sich im Stroma lost. Der Vergleich dieses un-idirektionalen O2-Flusses mit dem O2-Netto-Fluss der Clark-Elektrode soll hier der Auf-klarung eines Phanomens dienen, dass der Netto-Fluss bei CO2-Erschopfung fallt, nichtaber der Elektronenfluss durch die photosynthetische Elektronentransportkette (Schinneret al., 2001).

Eine ortsaufgeloste Messung der Sauerstoffentwicklung war schon das Anliegen beim obengenannten Experiment von Engelmann. Die damals angesprochenen Fragen sind naturlichschon lange mit großer Detailkenntnis uber das photosynthetische System (Buschmannund Grumbach, 1985) gelost, aber trotzdem sind noch viele Fragen offen. Zum einengibt es in einem Blatt Zellen mit verschiedenen Stoffwechselfunktionen, wie die Bundel-scheidenzellen und Mesophyllzellen bei C4-Pflanzen (Heldt, 1999). Bei abgezogener Epi-dermis musste man bei Beleuchtung ihre verschiedenen Gasflusse mit einem raumlichhochauflosenden Instrument studieren konnen. Zum anderen ist eine Ortsauflosung wich-tig fur das Studium der Wirkung von Krankheiten, wie z.B. Pilzbefall, die zu starkverandertem Stoffwechsel fuhren, so dass Licht bei befallenen und unbefallenen Regionenauf einem Blatt vollig andere Gasflusse auslosen konnte (Bastiaans, 1991; Jakob et al.,1997; Madrid et al., 1999; Raggi, 1995; Zuckermann et al., 1997). Die Messung solcherEffekte soll in einen neuen Projekt der Arbeitsgruppe Biophysik mit den Arbeitsgruppen

Kapitel 1 Einleitung 5

Heege und Veerret aus der agrarwissenschaftlichen Fakultat Aufschlusse daruber geben,welche Abwehrmechanismen die Pflanze besitzt bzw. wie der Pilz die Pflanze zur eigenenNahrstofferzeugung manipuliert (Koch et al., 2000).Fur solche ortsaufgelosten Messungen sollte das Microx eingesetzt werden, das an derSpitze eines dunnen Lichtleiters die Loschung eines Fluoreszenzstoffes durch O2 misst.Es wird hier gezeigt, dass das Microx aus vielen Grunden nicht geeignet ist. Stattdessenwird im Rahmen dieser Arbeit ein neues Messverfahren fur diesen Zweck entwickelt: EinePatch-Clamp-Elektrode an einem Massenspektrometer erfasst mit Mikrometerauflosungdie Gaskonzentrationen an einem Blatt.Massenspektrometer waren in der Photosynthese bisher nur eingesetzt, um die Gasflussevon mit Isotopen angereicherten Zellsuspensionen zu messen, jedoch ohne Ortsauflosung(Avelange et al., 1991). Insofern wurde in Kooperation mit der AG Kipp/Skibowskiim IEAP mit der Schaffung eines neuen Instrumentes mit hoher Orts- und erweiterterGasanalyse bei Blattern mit großen Erwartungen begonnen.In der vorliegenden Arbeit werden die oben genannten Verfahren in Hinblick auf ihreLeistungsfahigkeit bei der Messung photosynthetischer Gasflusse verglichen.

6 2.1 Einfuhrung in die Photosynthese

Kapitel 2

Theorie der Photosynthese

In diesem Kapitel werden die fur diese Arbeit relevanten Teile der Photosynthese dar-gestellt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Messung der Sauerstoffentwicklung vonunterschiedlichen photosyntheseaktiven Materialien unter verschiedenen Rahmenbedin-gungen. Aus diesem Grund werden die Gasflusse der Photosynthese besonders betrachtet.

2.1 Einfuhrung in die Photosynthese

In der Photosynthese wird Lichtenergie durch die so genannten Antennenpigmente (Chlo-rophyll a, Chlorophyll b) absorbiert und zur Reduktion von Kohlendioxid zu Kohlenhy-draten genutzt. Die Grundgleichung fur den Stoffumsatz in der Photosynthese lautet:

6CO2 + 18H2Ohν−→ C6H12O6 + 12H2O + 6O2 (2.1)

Die Photosynthese lasst sich in Licht- und Dunkelreaktion unterteilen. In der Lichtreak-tion, bei der die Lichtenergie in eine chemische Form umgewandelt wird, werden

Abbildung 2.1: Zusammenwirken von Licht- und Dunkelreaktion in der Photosynthese (Busch-mann und Grumbach, 1985).

2.2 Ort der Photosynthese 7

NADPH/H+ (reduziertes Nicotinadenindinucleotidphosphat mit Proton) und ATP (Ade-nosintriphosphat) synthetisiert. NADPH dient als Trager von Redoxenergie und Lieferantvon Protonen, ATP als eigentlicher Energietrager. In der Dunkelreaktion (Substanz-umwandlung, Calvin-Zyklus) werden Kohlenhydrate gebildet, indem die in ATP undNADPH/H+ gespeicherte Energie CO2-Molekule reduziert. Abbildung 2.1 zeigt die Ver-kopplung von Licht- und Dunkelreaktion uber ATP und NADPH/H+.

2.2 Ort der Photosynthese

Die Photosynthese findet in den Chloroplasten der grunen Pflanzen statt. Der Chloroplastist mit einer Doppelmembran, der Envelope, umgeben. Im Inneren der Chloroplastenbefindet sich die Thylakoidmembran, eine 7 nm dicke Doppellipidschicht. Diese tritt inungestapelter Form (Stromathylakoid) oder in gestapelter Form (Granathylakoid) auf(Abbildung 2.2). Die in sich geschlossene Thylakoidmembran unterteilt den Innenraumdes Chloroplasten in zwei Bereiche. Der außere Bereich wird als Stroma und der innereals Lumen bezeichnet.

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung eines Chloroplasten (Buschmann und Grumbach,1985). Das Granathylakoid (Granum) liegt in gestapelter Form vor.

In der Thylakoidmembran sind alle Komponenten der Elektronentransportkette (Ab-schnitt 2.3) lokalisiert, unter anderem:

• die lichtsammelnden Proteine

• die Photosysteme I und II

• das Elektroenzym ATPase.

Im Stroma befinden sich die Enzyme, die fur die Substanzumwandlung notwendig sind:

• Enzyme des Calvin-Zyklus

• Enzyme weiterer Stoffwechselprozesse, wie Mehler-Reaktion (Abschnitt 2.4) undStickstoffwechsel.

8 2.3 Die Elektronentransportkette

2.3 Die Elektronentransportkette

Die lineare Elektronentransportkette des Photosyntheseapparates, das so genannte Z-Schema, ist in Abbildung 2.3 dargestellt. Die Elektronentransportkette (ETC) beginntmit der Absorption von Licht in den Antennenpigmenten von Photosystem II (Dau, 1994).Dadurch wird das Reaktionszentrum P680 in den angeregten Zustand P680∗ uberfuhrt.Es findet eine Ladungstrennung statt, bei der P680 durch Oxidation in P680+ ubergehtund der Akzeptor Pheophytin zu Pheo− reduziert wird. Anschließend wird P680+ von derDonorseite des PS II reduziert. Das Reaktionszentrum liefert die Energie fur die Photolysedes Wassers, d.h. die Bildung von Sauerstoff durch die Spaltung von Wassermolekulen. DiePhotolyse des Wassers findet an einem manganhaltigen Enzymsystem, dem wasserspal-tenden Enzym (WSE), statt (Dittmer und Dau, 1996). Es werden zwei Molekule Wasserin ein Molekul Sauerstoff, vier Protonen und vier Elektronen umgewandelt. Der entstan-dene Sauerstoff kann von einem O2-empfindlichen Messgerat (Clark-Elektrode, Kapitel3) detektiert werden. Da gleichzeitig O2-verbrauchende Prozesse, z.B. Mehler-Reaktion(Abschnitt 2.4) und Photorespiration, ablaufen, lasst sich haufig nur die Nettosauerstoff-

Abbildung 2.3: Schema des linearen Elektronentransportes. Die Komponenten sind in derReihenfolge der Elektronentransportkette in der Hohe ihres jeweiligen Redoxpotentials (E0)aufgetragen (Buschmann und Grumbach, 1985).

2.4 Die Mehler-Reaktion 9

entwicklung registrieren. Im weiteren Verlauf der ETC werden auf der Akzeptorseite desPS II der primare Chinonakzeptor QA und anschließend der sekundare ChinonakzeptorQB durch Pheo− reduziert. Der Quencher QB kann im zweifach negativ geladenen Zu-stand das Photosystem II verlassen. Nach der Bindung von zwei H+ aus dem Stromatritt Q2−

B als Plastohydrochinol (PQH2) in den Plastoquinonpool (PQ-Pool) ein. Nach-dem das PQH2 durch die Thylakoidmembran diffundiert ist und dort zwei Protonenabgegeben hat, reagiert es mit den Cytochromen (Cyt f, Cyt b6) und dem Rieske-Eisen-Schwefel-Zentrum des Cytochrom b6/f-Komplexes unter Abgabe von Elektronen. Uberdas Plastocyanin (PC) werden die Elektronen schließlich zum Photosystem I (PS I) wei-tergeleitet. Das Reaktionszentrum P700 ubernimmt die Elektronen und fuhrt eine weiterelichtgetriebene Ladungstrennung durch. Die Elektronen vom PS I konnen auf verschiede-ne Akzeptoren ubergehen. Hier sei erst einmal der in Abbildung 2.3 dargestellte Hauptwegbesprochen. Durch das Elektron von PS I wird Ferredoxin (Fd) reduziert. Das Fd gibtseine Redoxenergie an das Enzym Ferredoxin-NADP-Reduktase (FNR) weiter. DiesesEnzym katalysiert die Reduktion von NADP zu NADPH2 mit Hilfe zweier reduzierterFerredoxin-Molekule (Fd−). Dabei werden zwei Protonen aufgenommen.An den Elektronentransport durch die ETC ist ein Protonentransport gekoppelt, dereinen pH-Gradienten uber der Thylakoidmembran aufbaut. Der H+-Fluss besteht ausden mit PQH2 transportierten Protonen, der H+-Abgabe vom WSE innen und der H+-Bindung an das NADPH außen. Der dadurch aufgebaute Protonengradient dient der sogenannten ATPase als treibende Kraft fur die ATP-Synthese (Mitchell, 1977; Witt, 1979).Das entstandende ATP steht der Dunkelreaktion zur Verfugung (Abbildung 2.1).

2.4 Die Mehler-Reaktion

Die Mehler-Reaktion liefert neben Calvin-Zyklus (Abschnitt 2.5) und Photerespiration(Abschnitt 2.6) einen weiteren Akzeptor fur Elektronen aus dem PS I. Bei Akzeptoren-mangel gibt das PS I sein Elektron an den molekularen Sauerstoff ab. Dieser Elektro-nenubergang wird als Mehler-Reaktion bezeichnet (Mehler, 1951a, 1951b; Schreiber undNeubauer, 1990), bei der Superoxidradikale erzeugt werden. Um diese abbauen zu konnen,sind eine Reihe von Entgiftungsreaktionen notwendig. Die Einzelreaktionen (Asada undTakahashi, 1987; Schreiber und Neubauer, 1990; Reising, 1994) sind wie folgt:

4H2OPSII−→ 8e− + 8H+ + 2O2 ↑ (2.2)

4O2 ↓ +4e−PSI−→ 4O−.

2 (2.3)

4O−.2 + 4H+ −→ 4HO2 (2.4)

4HO2SOD−→ 2H2O2 + 2O2 ↑ (2.5)

2H2O2 + 4AsAAPO−→ 4MDA + 4H2O (2.6)

4MDA + 4e− + 4H+ MDR−→ 4AsA (2.7)

Die erste Gleichung beschreibt die Wasserspaltung an PS II. Die hierbei entstehendenElektronen werden fur die an PS I stattfindenden Reaktionen 2.3 und 2.7 zur Verfugunggestellt. Bei Reaktion 2.3, der eigentlichen Mehler-Reaktion, wird pro Elektron ein Sau-erstoffmolekul zum Superoxidradikal reduziert. Aufgrund seiner negativen Oberflachen-ladung kann das Superoxidradikal nicht in das Stroma gelangen (Hormann et al., 1993).

10 2.5 Der Calvin-Zyklus

Daher wird es zunachst im Lumen protoniert (Gleichung 2.4). Das entstandene HO2-Molekul diffundiert ins Stroma, wo unter Beteiligung der Superoxiddismutase (SOD) ei-ne Dismutasereaktion stattfindet (Gleichung 2.5). Hierbei entsteht Wasserstoffsuperoxid(H2O2) und molekularer Sauerstoff. Das Zellgift H2O2 wird unter Mitwirkung des EnzymsAscorbatperoxidase (APO) durch das Ascorbat AsA (Vitamin C) reduziert (Gleichung2.6). Dabei wird gleichzeitig Monodehydroascorbat (MDA) gebildet. Fur die Regenerati-on von Ascorbat aus MDA (Gleichung 2.7) sind wiederum vier Elektronen, die aus derWasserspaltung (Gleichung 2.2) stammen, notwendig.Bei den oben aufgefuhrten Reaktionsgleichungen fallt auf, dass stochiometrisch betrach-tet, die Netto-O2-Entwicklung null ist: vier Sauerstoffmolekule wurden am PS I aufge-nommen (Gleichung 2.3) und vier Sauerstoffmolekule wieder freigesetzt (jeweils zwei ausden Reaktionen 2.2 und 2.5).

2.5 Der Calvin-Zyklus

Der Calvin-Zyklus besteht aus den Prozessen Carboxylierung, Reduktion und Regenerie-rung (Abbildung 2.4).

Abbildung 2.4: Calvin-Zyklus: Der Calvin-Zyklus besteht aus den Prozessen Carboxylierung,Reduktion und Regenerierung. Er dient der Bereitstellung von Triosephosphat fur Stoffwech-selprozesse außerhalb des Chloroplasten (Heldt, 1999).

Durch die Bindung von CO2 an Ribulose-1,5-bisphosphat (Carboxylierung) wird unterVerbrauch von ATP und NADPH/H+ Triosephosphat (Reduktion) erzeugt. Triosephos-phat benotigt die Pflanze fur weitere Stoffwechselprozesse (z.B. fur den Aufbau vonZucker) außerhalb des Chloroplasten. Der großte Teil von Triosephosphat wird jedochunter Verbrauch von ATP zur Regenerierung von Ribulose-1,5-bisphosphat benutzt. ATPund NADPH/H+ werden durch die Lichtreaktion bereitgestellt.

2.6 Die Photorespiration 11

2.6 Die Photorespiration

Die Photorespiration ist ein O2-verbrauchender Prozess im Calvin-Zyklus in Konkur-renz zur CO2-Bindung steht. Neben CO2 kann auch O2 an Ribulose-1,5-bisphosphatgebunden werden. Dies geschieht, wenn eine relativ hohe Konzentration von O2, abereine geringe Menge von CO2 vorhanden ist. Um aus dem entstandenen Nebenprodukt2-Phosphoglycolat wieder Ribulose-1,5-bisphosphat zu regenerieren, ist eine Stoffwech-selkette notwendig, die sich uber mehrere Organellen (Chloroplasten, Peroxisomen, Mit-ochondrien) verteilt und mit hohem Energieverbrauch verbunden ist.

2.7 C4-Pflanzen

Bei Trockenheit und hohen Temperaturen sind die Stromata (Schließzellen) von Pflan-zen fast geschlossen, um den Wasserverlust fur die Pflanze gering zu halten. Damit C4-Pflanzen trotzdem ausreichend CO2 aufnehmen konnen, haben sie einen so genanntenTurbolader fur CO2. CO2 wird bei den C4-Pflanzen selbst aus niedrigen Konzentrationenan Phosphenolpyruvat (PEP) gebunden, statt an Ribulose-1,5-bisphosphat wie bei denC3-Planzen.

Abbildung 2.5: CO2-Konzentrierungsmechanismus von C4-Pflanzen (NADP-Malatenzym-Typ). Im Cytosol der Mesophyllzellen reagiert HCO−

3 mit Phosphenolpyruvat zu Oxalacetat,das in den Chloroplasen zu Malat reduziert wird. Das Malat diffundiert nach Austritt aus denChloroplasten in die Bundelscheidenzellen, wo es unter Bildung von CO2 zu Pyruvat oxidativdecarboxyliert wird. Das CO2 wird vom Calvin-Zyklus aufgenommen. Das Pyruvat wird in denChloroplasten der Mesophyllzellen wieder zu Phosphenolpyruvat phosphoryliert. Der Transportvon Malat und Pyravat wird durch Translokatoren [T] bewirkt (Heldt, 1999).

12 2.7 C4-Pflanzen

Deshalb ist bei den C4-Pflanzen, zu denen die Mais-Pflanzen gehoren, der Photosynthe-seprozess auf zwei spezialisierte Zelltypen verteilt: Mesophyllzellen und Bundelscheiden-zellen.

In den Mesophyllzellen, deren Hauptaufgabe in der effektiven CO2-Aufnahme besteht,wird PEP (Phosphoenolpyruvate) nach der CO2-Bindung in einen C4-Korper umgewan-delt (Malat in Abb. 2.5). PEP hat eine sehr hohe Affinitat zu CO2. Dadurch kann CO2

auch bei geringen Konzentrationen gebunden werden. Dies ermoglicht der Pflanze, beigering geoffneten Stomata CO2 aufzunehmen und damit den Wasserverlust zu minimie-ren.

In den Bundelscheidenzellen sind die Photosysteme II nur wenig aktiv (Heldt, 1999)und es wird daher eine geringe O2-Entwicklung erwartet. Mais-Pflanzen sind fur dievorliegende Arbeit interessant, da sich Mesophyll- und Bundelscheidenzellen in den O2-Entwicklung unterscheiden mussten. Die raumliche Trennung beider Zelltypen (Abbil-dung 2.6) ermoglicht die getrennte Untersuchung ihrer Gasflusse.

Abbildung 2.6: Querschnitt eines Maisblattes: Bundelscheiden- (BS) und Mesophyllzellen (M)liegen raumlich getrennt. E bezeichnet die Epidermiszellen.

Die Funktion der Bundelscheidenzellen besteht in erster Linie in der Bereitstellung vonATP durch zyklische Photophosphorylierung uber das Photosystem I. In den Bundelschei-denzellen findet, da alle benotigten Enzyme vorhanden sind, der komplette Calvin-Zyklusstatt.

Das benotigte CO2 entsteht dadurch, dass das von den Mesophyllzellen exportierte Malatzu Pyruvat oxidativ decarboxyliert wird. Das Pyruvat wird in den Chloroplasten derMesophyllzellen wieder zu Phosphenolpyruvat phosphoryliert. Der Transport von Malatund Pyravat wird durch Translokatoren [T] bewirkt.

Die erwahnte Umwandlung des PEP durch Bindung von CO2 in einen C4-Korper ver-schafft den Pflanzen die Bezeichnung C4-Pflanze. Diese C4-Korper konnen verschiedensein. Bei Mais-Pflanzen ist der C4-Korper Malat.

Bei den C3-Pflanzen ist das erste Photosyntheseprodukt eine C3-Verbindung: 3-Phosphoglycerat. CO2 wird hier direkt in den Calvin-Zyklus eingebracht.

Es wird angenommen, dass bei C4-Pflanzen aufgrund der besseren CO2-Fixierung wenigerPhotorespiration als bei C3-Pflanzen ablauft.

2.8 Verwendete Pflanzen 13

2.8 Verwendete Pflanzen

Verschiedene Pflanzen standen als Messobjekte zur Verfugung: Mais, Bohne, Giersch unddie Grunalge Chara corallina.

Die folgenden Abschnitte fuhren in die Aufzucht der in dieser Arbeit verwendeten Pflan-zen ein.

Mais und Bohne wurden vom Institut fur Pflanzenernahrung und Bodenkunde derChristian-Albrechts-Universitat (AG Prof. Sattelmacher) zur Verfugung gestellt.

2.8.1 Maispflanzen

Die Aufzucht der Mais-Pflanzen der Sorte L. cv. Helix wurde wie folgt durchgefuhrt: DieSamen quollen ca. sechs Stunden in luftdurchflutetem Leitungswasser vor. Anschließendlagerten sie vier Tage auf mit 0.5 mM CaSO4 befeuchteten Zellstoff, bevor die Keim-linge fur eine Woche in beluftetes Leitungswasser gestellt wurden. Hiernach wurden dieWurzeln der Maispflanzen mit Schaumstoff umwickelt und jeweils vier Pflanzen in einen5 l Eimer mit Apoplastennahrlosung (0.5 mM NH4NO3, 0.7 mM K2SO4, 0.1 mM KCl,2 mM Ca(NO3)2, 0.5 mM MgSO4, 0.1 mM KH2PO4, 1 µM H3BO3, 0.5 µM MnSO4,0.1 µM ZnSO4, 0.2 µM SnSO4, 10 nM (NH4)6MO7O24, 1µM FeEDTA) unter Normallichtin einem Gewachshaus (Arbeitsgruppe Sattelmacher) aufgezogen. Die Nahrlosung wurdezweimal pro Woche gewechselt.

2.8.2 Bohnenpflanzen

Die Bohnenpflanzen (Vicia faba) wurden unter normalen Tageslichtbedingungen folgen-dermaßen aufgezogen: Das Saatgut wurde in einer mit Vermiculite gefullten Wanne aus-gesat. Drei bis vier Wochen nach dem Keimen wurden die Keimlinge getrennt und ineinzelnen Gefaßen weiter aufgezogen. Nach weiteren zwei Wochen, wenn die Wurzeln ei-ne Lange von ca. 12 cm erreicht hatten, wurden die Pflanzen in kleine mit Kies gefullteFilmdosen umgetopft. Die Dosen besitzen an der Unterseite eine kleine Offnung, so dassdie Wurzeln herausragen konnen. Je zwei solcher Dosen wurden in die Deckeloffnungeneines beluftbaren Nahrlosungsgefaßes (Volumen: 5 Liter) gesetzt. Etwa zwei Wochen nachEinsetzen in die Nahrflussigkeit (0.3 mM KH2PO4, 1.0 mM K2SO4, 0.5 mM MgSO4, 2.5mM CaSO4, 0.001 mM MnSO4, 0.01 mM H3BO3, 0.001 mM CuSO4, 0.001 mM ZnSO4,0.0001 mM (NH4)6Mo7O24, 0.045 mM Sequestren, 2.5 mM Ca(NO3)2) waren die Pflanzenfur Messungen geeignet.

2.8.3 Gierschpflanzen

Der Giersch oder Geißfuß (Aegopodium podagraria) stammt aus der Familie der Dolden-gewachse (Apiaceae). Giersch ist haufig an Ufern, in Garten, Wegrandern usw. auf grund-oder sickerfrischen nahrstoff- und basenreichen, lockeren, tiefgrundigen mild-maßig sau-ren humosen Lehm und Tonboden (Oberdorfer, 1990) zu finden. Ganzjahrig ist er einfachauf der Fensterbank in Blumentopfen weiterzuzuchten.

Giersch wird als Halbschatten-Schattenpflanze charakterisiert (Ellenberg, 1992), hat aberin dieser Beziehung eine breite okologische Amplitude und kann auch an tiefschattigen

14 2.8 Verwendete Pflanzen

oder offenen Standorten vorkommen. Giersch als Schattenpflanze liefert daher insbeson-dere bei Messungen mit geringen Lichtintensitaten ein ausreichend großes Sauerstoffsignal(Abschnitt 5.4).

2.8.4 Grunalge Chara corallina

Chara corallina ist eine Sußalge aus der Familie der Characeen. Sie ist aufgebaut ausInternodialzellen, von denen radial sogenannte Axialzellen abzweigen. Da die Internodi-alzellen von Chara corallina in der Patch-Clamp-Technik in der Kieler Arbeitsgruppe furBiophysik fur elektrophysiologische Untersuchungen benutzt werden, standen diese Pflan-zen, die in mit Sand und Wasser gefullten Bottichen angezogen werden, zur Verfugung.Die erforderlichen Nahrstoffe werden durch autoklavierten Buchenmulch und Muttererde,die unter den Sand gefugt werden, geliefert.

Kapitel 3 Die Clark-Elektrode 15

Kapitel 3

Die Clark-Elektrode

Die Clark-Elektrode (Abbildung 3.3 Abschnitt 3.3) wurde ursprunglich von T. Delieu undD.A. Walker (1981) konstruiert, um die Sauerstoffentwicklung von Blattern bei hohenCO2-Konzentrationen messen zu konnen. Das Messprinzip beruht auf der Bildung vonH2O2 und OH− aus H2O plus molekularem Sauerstoff unter Aufnahme zweier Elektronenvon einer Platinkathode, wie in Abschnitt 3.3 erklart wird.

In dieser Arbeit kam die Clark-Elektroden-Einheit von Hansatech (LD2/2, Bachofer,Reutlingen, Deutschland) zum Einsatz. Sie ist ein klassisches Messgerat (Abbildung 3.2Abschnitt 3.2.1), mit dem sich die Sauerstoffentwicklung eines Blattes unter verschiedenenBedingungen in der Gasphase messen lasst (Abschnitte 4.6 und 5.1).

3.1 Motivation fur den Einsatz der Clark-Elektrode

Die Motivation fur den Einsatz der Clark-Elektrode ist die robuste, zuverlassige Funk-tion und die Eichbarkeit in % O2. Die Fahigkeit, die Netto-Sauerstoffentwicklung einesBlattes messen zu konnen, wurde beim Vergleich mit den Messungen des Photoakusti-kaufbaus (Abschnitt 5.2) genutzt. Aus diesem Grunde wurde die Clark-Elektrode auchfur die Uberprufung der Eignung oder zur Erganzung der anderen in dieser Arbeit unter-suchten Messverfahren benutzt. In Abschnitt 7.1 wird durch einen gemeinsamen Aufbauvon Microx und Clark-Elektrode die O2-Empfindlichkeit des Microx fur Messungen anBlattern uberpruft. Bevor Messungen an Blattern mit der neuen Messmethode mit demMassenspektrometer (Kapitel 8) durchgefuhrt wurden, wurde die Vitalitat der Pflanzenmit der Clark-Elektroden-Einheit von Hansatech getestet.

3.2 Messaufbau

Je nach Fragestellung wurde die Clark-Elektrode in verschiedene Messaufbauten einge-baut. Den klassischen Aufbau, der fur Messungen mit unterschiedlichen Gaszusammen-setzungen und Vitalitatsmessungen an Blattern geeignet ist, zeigt Abbildung 3.1. DerMessaufbau fur Parallelmessungen mit dem Photoakustik-Aufbau ist in Abschnitt 5.2und fur Parallelmessungen mit dem Microx in Abschnitt 7.1.1 dargestellt.

Die Clark-Elektroden-Einheit von Hansatech ist auf der rechten Seite der Abbildung 3.1skizziert.

16 3.2 Messaufbau

In der 5.22 ml großen Kammer der Clark-Elektroden-Einheit lassen sich verschiedeneGasatmospharen durch Flutung mit entsprechenden Gaskonzentrationen einstellen. DasGas gelangt durch spezielle CO2-dichte Schlauche (Polyethylen und Teflon), die mit denGasreglern verbunden sind, uber einen der beiden Gashahne in die Kammer. CO2-dichteSchlauche fuhren ebenfalls von den Gasreglern zu den Gasflaschen (N2, CO2 und O2), dieals Kreise in Abbildung 3.1 angedeutet sind.Die Gaszusammensetzung wird uber drei Gasflussregler (Tylan GmbH, Eichingen, FC2900/ FC 280-SA) kontrolliert. Uber ein Kontrollgerat (Bruning, 1990) lassen sich die ent-sprechenden Durchflusswerte einstellen. Die Eichung des Tylan-Reglers ist gasspezifisch,da sie mit der Warmekapazitat des Gases zusammenhangt (Prinzip der Tylan-Regler:Abkuhlung eines geheizten Drahtes durch das stromende Gas).

Abbildung 3.1: Aufbau zur Einstellung spezieller Gasatmospharen (schematisch dargestellt):Uber ein Kontrollgerat (Bruning, 1990) (links eingezeichnet) lassen sich die Durchflusswerte furdie Tylan-Regler (Tylan GmbH, Eichingen, FC 2900/ FC 280-SA) einstellen. Von den Reglernfuhren CO2-dichte Schlauche zur Messapparatur der Clark-Elektrode. CO2-dichte Schlauchefuhren ebenfalls von den Gasreglern zu den Gasflaschen (N2, CO2 und O2), die als Kreiseangedeutet sind. Die Durchmischung des CO2-Gases mit den beiden anderen vorgemischtenGasen (O2 und N2) findet kurz vor der Blattkammer der Messapparatur statt.

3.2.1 Aufbau der Clark-Elektroden-Einheit von Hansatech

Die klassische Clark-Elektroden-Einheit von Hansatech besteht im wesentlichen aus zweiSegmenten (Abbildung 3.2). Das untere Segment enthalt die Clark-Elektrode. Im oberenSegment befindet sich die Beleuchtung. Als aktinisches Licht (Licht zur Anregung derphotosynthetischen Aktivitat) konnen wahlweise 55 rote LED’s (HP HLMP 81030, 5 mmLED 3CD Red von Hewlett Packard) oder Halogenlicht verwendet werden. Die roten

3.2.1 Aufbau der Clark-Elektroden-Einheit von Hansatech 17

LED’s befinden sich in den Bohrungen der Kuppel der Clark-Elektroden-Einheit (Abbil-dung 3.2). Die Ansteuerung der LED’s erfolgt uber eine vorhandene Schaltung (Plieth,1995). Die Lichtintensitat der LED’s betragt maximal 300 µmol m−2 s−1 (ungefahr 60

W/m2).Das Halogenlicht wird durch einen Lichtleiter geleitet. Mit einer Stativhalterung kann derLichtleiter uber der Linse, die sich uber der Kuppel fur die LED’s befindet, positioniertwerden. Die Linse gewahrleistet die optimale Ausleuchtung des Blattes. Die Intensitatdes Halogenlichtes ist einstellbar.Bei den Messungen wurden mindestens 200 µmol m−2 s−1 verwendet, da eine geringe-re Intensitat zu verrauschten Messungen (zu geringe Sauerstoffentwicklung) fuhrt. EineAusnahme bilden die Parallelmessungen mit dem Photoakustikaufbau (Kapitel 5), da dieverwendete Pflanze Giersch als Schattengewachs schon bei geringer Lichtintensitat einausreichend großes O2-Signal liefert.Der Bereich zwischen oberem und unterem Segment wird im folgenden als

”Blattkammer“

bezeichnet. Das ausgestanzte Blattstuck (Durchmesser 3.57 cm) befindet sich in diesemBereich auf verschiedenen, ebenfalls kreisrunden Abstandhaltern. Die einzelnen Funktio-nen der verschiedenen Abstandhalter sind folgende: Der mit etwas Nahrlosung angefeuch-tete Filz direkt unter dem Blatt verhindert das Austrocknen des Messobjekts wahrendder Messung und absorbiert zusatzlich die Warmestrahlung der Beleuchtung (Abschnitt4.5). Das Gitter mit der geschlossenen Mitte verhindert eine direkte Beleuchtung derKathode. Der Abstandhalter aus Schaumstoff dient zur Positionierung des Blattes undbewirkt, dass das Blatt direkt gegen das Glas des oberen Segments gedruckt wird.

18 3.3 Funktionsweise der Clark-Elektrode

Abbildung 3.2: Schematischer Aufbau der Clark-Elektroden-Einheit von Hansatech: Daskreisrunde Blattstuck befindet sich auf runden Abstandhaltern zwischen oberen und unterenSegment der Apparatur. Der O2-Sensor (Clark-Elektrode) liegt unterhalb des Blattes, wobeidie Platinkathode, die in der Kuppe der Elektrodenscheibe eingefasst ist, der Atmosphare derBlattkammer ausgesetzt wird. Die Silberanode ist ebenfalls in die Elektrodenscheibe eingefasst.Die schwarzen Punkte stellen Dichtungs-O-Ringe dar.

3.3 Funktionsweise der Clark-Elektrode

Die Clark-Elektrode besteht aus einer 2 mm großen Platinkathode und einer Silberan-ode, die beide in einen Plexiglaskorper eingefasst sind (Abbildung 3.3). Die Platinkathodebefindet sich in der Erhebung (Kuppe) des Plexiglaskorpers. Die Kathode ist der Atmo-sphare der Blattkammer der Clark-Elektroden-Einheit (Abbildung 3.2 Abschnitt 3.2.1)ausgesetzt. Ein Elektrolyt stellt die Verbindung zwischen Anode und Kathode her. Miteinem Applikator (Abbildung 3.5 Abschnitt 3.4), uber den ein O-Ring gestulpt ist, wirdeine Teflonmembran (PTFE-Folie, 12.5 µm dick, Bachhofer GmbH) von der Große 2×2cm2 auf die Elektrode gespannt (Abschnitt 3.4).

3.3 Funktionsweise der Clark-Elektrode 19

Abbildung 3.3: 3-dimensionale Darstellung der Clark-Elektrode. In der Kuppe des Plexi-glaskorpers befindet sich die Kathode.

Die Teflonmembran ist sauerstoffdurchlassig. Unter der Membran befindet sich der Spacer(feines Zigarettenpapier) (Abbildung 3.4). Die Starke und Gleichmaßigkeit des Zigaret-tenpapiers wirkt sich auf die Messempfindlichkeit der Elektrode aus. Die Funktion desSpacers ist es, den Elektrolyten aufzusaugen, um eine Elektrolytbrucke zwischen derSilberanode und der Platinkathode aufzubauen. Bei dem Spacer ist darauf zu achten,dass der gummierte Teil des Zigarettenpapiers nicht verwendet wird, da sich sonst dieGummierung im Elektrolyten losen konnte. Die Große des Spacers ist identisch mit derTeflonfolie. Die angelegte Spannung von 0.6 bis 0.7 V liefert die treibende Kraft fur dieReaktionen an der Platinkathode und an der Silberanode:

• an der Platinkathode

O2 + 2H2O + 2e− −→ H2O2 + 2OH− (3.1)

H2O2 + 2e− −→ 2OH− (3.2)

• an der Silberanode

4Ag −→ 4Ag+ + 4e− (3.3)

4Ag+ + 4Cl− −→ 4AgCl (3.4)

Eine niedrigere Spannung ist nicht geeignet, da dann kein Sauerstoff an der Platin-oberflache reduziert werden kann. Durch die Gleichungen 3.2 und 3.4 wird in der LosungCl− durch OH− ersetzt. Es bildet sich KOH (Kaliumlauge). Der resultierende Stromist proportional zum Sauerstoffverbrauch an der Kathode und lasst sich im Strom-Spannungswandler in eine Spannung umwandeln (Abschnitt 4.1).Der Elektrolyt setzt sich folgendermaßen zusammen:

20 3.4 Das Bespannen der Elektrode

Abbildung 3.4: Die angelegte Spannung von 0.6 bis 0.7 V bewirkt eine Polarisation derPlatinkathode. Sauerstoff kann durch die Membran diffundieren und wird an der Oberflacheder Kathode reduziert.

1. eine Volumeneinheit Boraxlosung (Na2B4O7 · 10H2O) bei pH 9.0 ; 0.4 M

2. zwei Volumeneinheiten Natriumhydrogencarbonat (1.0 M), angepasst an pH 9.0durch das Hinzufugen von Natriumcarbonat (1.0 M)

3. eine Volumeneinheit gesattigte KCl-Losung

Beim Erstellen des Elektrolyten ist es notwendig, den Boraxpuffer zu erwarmen, um seineLoslichkeit zu gewahrleisten. Der Borax-Puffer verhindert, dass der Elektrolyt wahrendder Messung in der Nahe der Kathode durch die Erzeugung von OH−-Ionen alkali-scher wird. Anderenfalls konnte CO2 durch die Membran diffundieren und die Messungverfalschen. Da sich diese Verfalschung im Ansteigen oder Absinken des gemessenen Stro-mes zeigt, wird sie im folgenden als elektrische Drift bezeichnet.

3.4 Das Bespannen der Elektrode

Da nur eine sorgfaltig bespannte Elektrode interpretierbare und reproduzierbare Messwer-te liefert, folgt eine detaillierte Beschreibung der Bespannung.

3.4 Das Bespannen der Elektrode 21

Die Kuppe der unbespannten Elektrodenscheibe wird mit einem Tropfen Elektrolyt auseiner Pipette versehen. Der Tropfen sollte nicht uber die Kuppe herunterlaufen, sondernsich auf der Kuppe halten. Dadurch wird der Spacer (2×2 cm2), der auf den Tropfengelegt wird, gleichmaßig von dem Elektrolyten durchtrankt. Hierbei entsteht eine stabileelektrolytische Brucke zwischen Kathode und Anode.Um die Membran (2×2 cm2) fettfrei zu halten und um Fingerabdrucke zu vermeiden,wird diese mit einer Pinzette faltenfrei uber den Spacer gelegt. Der Membranapplikator(Abbildung 3.5), ein Hilfsgerat zum Straffen der Membran und Einsetzen des O-Rings,wird mit dem O-Ring versehen. Anschließend wird der Applikator fest auf die Kuppe derElektrodenscheibe gedruckt und die beiden Teile des Applikators auseinander gezogen,bis der O-Ring in der Einkerbung der Kuppe sitzt.Die Membran muss unbedingt faltenlos uber der Kuppe sitzen. Insbesondere durfen kei-ne Luftblasen unter der Membran sein, selbst wenn ihre Große sehr gering ist. Faltenund Luftblasen fuhren zu Fehlmessungen, insbesondere zu einer Drift im Sauerstoffsignal(Abschnitt 4.2). Seitliche Falten in der Umgebung des O-Ringes sind unbedeutend, dadie Sauerstoffreduktion fast ausschließlich in der Nahe der Platinkathode stattfindet.

Abbildung 3.5: Bespannung der Elektrode: Der uber der Elektrodenscheibe dargestellte Ap-plikator wird mit einem O-Ring bespannt. Die Kuppe der Elektrode wird mit einem Tropfenversehen. Anschließend werden Spacer und Membran nacheinander mit einer Pinzette uber dieKuppe gelegt. Der Applikator wird auf die Kuppe gedruckt und auseinandergezogen, so dasssich der O-Ring uber die Kuppe stulpt, bis er in der Einkerbung der Elektrode sitzt.

Die Membran und der Spacer werden nach jedem Messtag von der Elektrode entfernt.Anschließend wird die Elektrode mit destilliertem Wasser im Bereich der Anode und derKathode abgespult. Dabei ist besonders darauf zu achten, dass der Elektrodensteckernicht nass wird. Bei Nichtbeachtung sind Kriechstrome und Drift zu erwarten. Die nasseElektrode wird mit einem Tuch oder ahnlichem getrocknet.Die Elektrode sollte auf keinen Fall langere Zeit ungenutzt bespannt sein. Elektrolytkonnte in die feinen Poren des Kunststoffes eindringen und ihn poros machen.

22 3.5 Reinigung der Elektrode

3.5 Reinigung der Elektrode

Um die oxidierte Silberanode zu reinigen, wird Aluminiumoxid verwendet. Dieses weißePulver wird auf die Silberanode gestreut und mit etwas destilliertem Wasser zu einer Mas-se von breiiger Konsistenz vermischt. Nach einiger Einwirkzeit wird die Anode mit einemLeinentuch mit diesem Gemisch poliert. Dieser Vorgang wird bei einer stark oxidiertenElektrode wiederholt (gegebenenfalls mehrmals). Hat die Anode ihre silbrige Farbe wiederangenommen, wird sie mit destillierten Wasser so lange gespult, bis kein Aluminiumoxidmehr vorhanden ist. Die Elektrode ist nach dem Trocknen wieder einsatzfahig. Jedochdauert es etwas langer als im Normalfall, bis die Elektrode driftfrei arbeitet (Abschnitt4.2).

Kapitel 4 Die Clark-Elektrode im Messbetrieb 23

Kapitel 4

Die Clark-Elektrode im Messbetrieb

4.1 Verstarkung und Rauschen

Als Ansteuerungsgerat fur die Clark-Elektrode stand eine Weiterentwicklung der ur-sprunglichen Version von H. Tabrizi, die von H. Schluter gebaut wurde, zur Verfugung. Esenthalt eine Spannungsversorgung fur die Elektrode und einen Strom-Spannungswandlermit umschaltbarer Empfindlichkeit (Abbildung 4.1).

Abbildung 4.1: Schaltplan der Messelektronik der Clark-Elektrode. Enthalten sind eine Span-nungsversorgung fur die Elektrode und einen Strom-Spannungswandler mit umschaltbarer Emp-findlichkeit.

Die Elektrodenvorspannung wird auf den positiven Eingang des OP’s gegeben. Die Re-gelung des Strom-Spannungswandlers legt dann auch den negativen Eingang und damitdie Clark-Elektrode auf diese Spannung gegen Masse (Ag-Elektrode). Der nachfolgen-

24 4.2 Driftverhalten

de Differenzverstarker bewirkt durch die Subtraktion der Sollwertspannung, dass demElektrodenstrom i = 0 die Ausgangsspannung Null entspricht.Um die Daten mit moglichst hoher Datenbreite mittels einer A/D-Wandlerkarte sampelnzu konnen, wurde eine externe Verstarkung mit nachgeschaltetem Tiefpass hinzugefugt.Der Tiefpass diente zur Glattung der durch die hohe Verstarkung stark verrauschtenSignale. Die so gewonnenen Daten wurden mittels eines PC’s in einem Auswertungspro-gramm, das der A/D-Wandlerkarte angepasst wurde, dargestellt.

4.2 Driftverhalten

Nach einer neuen Bespannung der Elektrode benotigt diese einen Vorlauf von zwei Stun-den, um mit keiner zu großen Drift im Ausgangssignal zu arbeiten. Diese Zeit dient derlangsamen Generierung der AgCl-Schicht. Daruber hinaus konnen weitere Ursachen furdie Entstehung einer Drift im Signal genannt werden: Die unter Punkt 1. aufgefuhrtenUrsachen sind als eine erste

”Checkliste“ zu verstehen, bevor uber andere Ursachen der

Driftentstehung spekuliert werden soll.

1. Undichte Kammer (das Einstromen von Sauerstoff ist mit einem Anstieg im Aus-gabesignal verbunden):

• Fehlen des Dichtungsrings der Blattkammer

• Klippverschlusse der Kammer sind geoffnet

• Gashahne sind geoffnet

2. Elektrodenbespannung ist unsachgemaß (die Storung der Sauerstoffreduktion istmit einem Abfallen des Signals gekoppelt):

• Falten oder Risse sind vorhanden

• kleine Luftblasen befinden sich in der Nahe der Platinkathode

• Spacer enthalt nur eingetrockneten Elektrolyten

3. Silberanode ist stark oxidiert (Alterungsprozess, der sich durch eine negative Driftoder ein sehr schwaches Signal bemerkbar macht. Das liegt daran, dass die Reak-tionen an der Anode herabgesetzt werden).

Die haufigste Driftquelle sind die unter 2. aufgefuhrten Falten in der Elektrodenbespan-nung. Diese entstehen zum einen, wenn sich die Teflonfolie bzw. der Spacer ungleichmaßiguber die Kuppe der Elektrode gelegt haben.Zum anderen kann unsachgemaßes Einfugen der Elektrode in die Messkammer undzusatzliches zu starkes Schließen dieser dafur verantwortlich sein, dass die Teflonfolie zu-sammengedruckt wird und sich faltet. Solche Falten konnen extrem große Schwankungenim Ausgabesignal verursachen. Dies bedeutet, dass zur starken Drift in der Einlaufphasenoch zusatzliche Sprunge im Ausgangssignal auftreten. Abbildung 4.2 verdeutlicht diesenZustand, bei dem es nicht mehr moglich ist zu messen.

4.2.1 Driftverhalten einer neu bespannten Elektrode 25

Abbildung 4.2: Unsachgemaße Elektrodenbespannung: Luftblasen und Falten fuhren zumAbfallen des Ausgangssignals mit zusatzlichen

”Sprungen“. Kalibrierung siehe Abschnitt 4.4.

4.2.1 Driftverhalten einer neu bespannten Elektrode

Abbildung 4.3 zeigt das Driftverhalten einer einwandfrei (ohne Luftblasen und Falten)bespannten Elektrode nach verschiedenen Zeiten. Die Kurven wurden bei geschlossenenGashahnen der Messapparatur vorgenommen.Das Driftverhalten der frisch gereinigten und bespannten Elektrode wurde nach einerStunde (Kurve 1.), nach drei Stunden (Kurve 2.) und nach vier Stunden mit Blatt (Kurve3.) aufgetragen. Die Driftkurve mit Blatt entsteht durch zusatzliche Dunkelatmung desBlattes. Es wurde eine gleitende Mittelwertbildung uber jeweils 10 Werte (15 s) derKurven vorgenommen.

4.3 Prufung der Kammer auf Gasdichte

Die Kammer der Clark-Elektrode ließ sich folgendermaßen auf ihre Gasdichte uberprufen.Ohne Blatt wurde die Kammer mit reinem Stickstoff funf Minuten geflutet. Bei geschlos-sener Kammer wurde anschließend die Anderung des Sauerstoffgehalts der Kammer de-tektiert.Abbildung 4.4 dokumentiert das Verhalten einer dichten Messkammer im Vergleich zueiner undichten.

26 4.3 Prufung der Kammer auf Gasdichte

Abbildung 4.3: Driftverhalten der Clark-Elektrode nach verschiedenen Zeiten. Kurve 3. istmit Blatt gemessen. Es wurde eine gleitende Mittelwertbildung uber jeweils 10 Messpunkte(15 s) vorgenommen.

Abbildung 4.4: Uberprufung der Gasdichtigkeit: Nach dem Fluten der Kammer wurde dieSauerstofferhohung in der dichten und undichten Kammer gemessen.

4.4 Kalibrierung der Clark-Elektrode 27

Deutlich ist zu erkennen, dass der Sauerstoffgehalt in der undichten Kammer in 45 s um0.5% ansteigt, hingegen bei der dichten Kammer die Sauerstoffkonzentration unverandertbleibt.

4.4 Kalibrierung der Clark-Elektrode

Die Clark-Elektrode lasst sich durch eine O2-Eichmessung kalibrieren. Dazu wurde wiefolgt vorgegangen: Die leere Kammer wurde mit Stickstoff geflutet und anschließend miteinem Gasgemisch mit 2% O2 und 98% N2 gespult. Der Vergleich beider Signale ergab:1% ∆O2± 0.2% ∆(∆O2) = 4.7 V. Die Abweichung kommt dadurch zustande, dass mitden Tylan-Reglern ein definierter Gasfluss schwer einzustellen ist.

4.5 Auswirkung von Licht- und Warmestrahlung der

LED’s

Um das Verhalten der Elektrode durch Einwirken von Licht- und Warmestrahlung derLED’s bzw. des Halogenlichtes zu untersuchen, wurde nachstehende Kontrollmessungvorgenommen. Abbildung 4.5 dokumentiert das Verhalten der Elektrode nach dem Ein-schalten der LED’s bzw. des Halogenlichtes (Lichtintensitat 300 µmol m−2 s−1), ohne dasssich ein Blatt in der Kammer befindet.

Abbildung 4.5: Scheinbare Erhohung der O2-Konzentration in der Kammer durch das Ein-schalten der LED’s bzw. des Halogenlichtes bei einer Lichtintensitat von 300 µmol m−2 s−1.

28 4.6 Sauerstoffentwicklung von Blattern

Es ist ein scheinbarer Anstieg des Sauerstoffgehalts in der Kammer um 0,01% zu erkennen.Zustande kommt dieser Effekt durch Warmeabstrahlung, obwohl diese weitestgehenddurch den Filz absorbiert wird. Wird ein

”Ersatzblatt“ (bestehend aus Papier) in der

Kammer positioniert, ist die scheinbare Erhohung der O2-Konzentration im Vergleichgeringer.

4.6 Sauerstoffentwicklung von Blattern

In diesem Abschnitt wird die Sauerstoffentwicklung eines Blattes gemessen mit der Clark-Elektrode vorgestellt (Abbildung 4.6).

Es wurde folgendermaßen vorgegangen: Ein Bohnenblatt wurde 25 Minuten dunkeladap-tiert. Dabei wurde in den letzten funf Minuten der Dunkelzeit die Kammer inklusive Blattmit Gaszusammensetzungen von: 2% CO2, 20% O2 und 78% N2 geflutet. Zum Zeitpunktt = 0 begann eine Beobachtungsphase von 150 s, um den Sauerstoffverbrauch, der durchdie Dunkelatmung des Blattes verursacht wird, aufzuzeichnen. Anschließend wurden dieLED’s (55 rote LED’s, 300 µmol m−2 s−1) angeschaltet und der O2-Verlauf registriert.Dasselbe Messprotokoll wurde fur Messungen unter verschiedenen Gaszusammensetzun-gen (Abschnitt 5.1) verwendet.

Abbildung 4.6: Sauerstoffentwicklung eines Bohnenblattes bei einem ausreichenden CO2 Ge-halt (2% CO2) in der Messkammer. ∆O2 bezeichnet die Anderung der Sauerstoffkonzentrationin der Messkammer. Der Nullpunkt liegt bei ca. 21% O2.

Dargestellt ist die Anderung der Sauerstoffkonzentration (∆O2) der Messkammer in Pro-zent. Der Nullpunkt der Grafik liegt bei einer O2-Konzentration von ungefahr 21%.

4.6 Sauerstoffentwicklung von Blattern 29

Vor der Beleuchtung verursacht der O2-Verbrauch der Dunkelatmung des Blattes einAbsinken der O2-Konzentration in der Kammer (negative Steigung der Kurve). Das hori-zontale Kurvenstuck zwischen 150 s und 300 s spiegelt die Anlaufphase der Photosynthe-seprozesse wider. Diese tritt auf, wenn ein Blatt mindestens 15 Minuten dunkeladaptiertwird, weil die Prozesse des Photosyntheseapparates erst wieder vollstandig aktiviert wer-den mussen. Bei vollstandig angelaufenen Prozessen erhoht sich die Konzentration in derKammer schnell (maximale Steigung der Kurve).Um die eigentliche O2-Entwicklungsrate des Blattes zu erhalten, musste die Kurve nachder Zeit differenziert werden.Die Clark-Elektrode detektiert die Netto-Sauerstoffentwicklung der Blatter, da sie denvorhandenen Sauerstoff in der Messkammer registriert. Dabei kann nicht detektiert wer-den, ob bereits entwickelter Sauerstoff wieder durch das Blatt verbraucht wird.Ebenso kann nicht zwischen den Prozessen Photorespiration, Mehler-Reaktion bzw. Dun-kelatmung im Licht unterschieden werden, die den Sauerstoff verbrauchen.

30 5.1 Motivation f. d. Parallelmessung v. Photoakustik u. Clark-Elek.

Kapitel 5

Die Clark-Elektrode imPhotoakustikaufbau

5.1 Motivation fur die Parallelmessung von Photo-

akustik und Clark-Elektrode: Die O2-Sattigung

in der geschlossenen Kammer gemessen mit der

Clark-Elektrode

Mit der Clark-Elektrode wurde die Sauerstoffentwicklung von Blattern unter verschiede-nen CO2-Konzentrationen untersucht (Abbildung 5.1). Hierbei tauchte ein Effekt auf, derbesonderer Untersuchung bedarf: Die Sattigung des O2-Anstiegs bei anfanglicher Luftat-mosphare. Im Folgenden sind die Messungen mit der Clark-Elektrode mit dem Aufbauaus Abbildung 3.1 (Abschnitt 3.2) ohne Photoakustikaufbau aufgefuhrt. In Abschnitt 5.5wird der Effekt mit Simultanmessungen von Photoakustik und Clark-Elektrode disku-tiert.Es wurde nach dem in Abschnitt 4.6 beschriebenen Messprotokoll vorgegangen und dieKammer mit Luft oder CO2-Konzentrationen von 2% oder 5% geflutet. Die resultierendenSauerstoffentwicklungen sind in Abbildung 5.1 aufgefuhrt.In der Zeit von t = 0 bis 150 s wird der durch die Dunkelatmung des Blattes erzeugteSauerstoffverbrauch detektiert. Zum Zeitpunkt t = 150 s werden die LED’s zugeschal-tet. Die Steigungen der drei Kurven des Sauerstoffsignals verandern sich aufgrund derbeginnenden Sauerstoffentwicklung des Blattes. Der identische Verlauf der drei Sauer-stoffsignale in den ersten 150 s nach der Beleuchtung spiegelt ein ubereinstimmendesVerhalten fur Luft, 2% CO2 und 5% CO2 in der ersten Phase der Sauerstoffentwicklungwider. Unterschiede zeigen sich erst in der anschließenden Phase.

5.1 Motivation f. d. Parallelmessung v. Photoakustik u. Clark-Elek. 31

Abbildung 5.1: Sauerstoffentwicklung in Abhangigkeit von verschiedenen Anfangsgaszusam-mensetzungen. ∆O2 bezeichnet die Anderung der O2-Konzentration in der Kammer. Der Null-punkt liegt bei ca. 21% O2. Die Messkurven sind parallel verschoben worden, um eine Deckungim Anfangsbereich zu erhalten.

Tabelle 5.1 zeigt die Mittelwerte fur Luft aus funf, fur 2% CO2 aus sieben und fur 5%CO2 aus sechs Messungen. In der ersten Zeile der Tabelle ist die Rate der Dunkelatmungdargestellt. Die zweite Zeile gibt die O2-Rate direkt nach eingeschalteter Beleuchtung an.In Zeile drei wurde jeweils fur die einzelnen Kurven die Differenz der Steigungen vor undnach Beleuchtung gebildet. Die Ergebnisse in der Tabelle bestatigen, dass die anfanglicheNetto-O2-Entwicklung nicht von der CO2-Konzentration abhangt.

Luft 2% CO2 5% CO2

Dunkelatmung [ppm/s] -5.7 ± 1.4 -6.4 ± 0.9 -7.1 ± 2.2O2-Rate nach Beleuchtung (t=150 bis 300 s) [ppm/s] 0.9 ± 1.5 1.1 ± 0.1 1.5 ± 2.9Netto O2-Entwicklung [ppm/s] 7.2 ± 1.9 7.6 ± 0.9 7.6 ± 2.8

Tabelle 5.1: Die anfangliche Rate der O2-Entwicklung wurde aus der Anderung der Anfangs-steigung bestimmt. Die dargestellten Mittelwerte wurden fur Luft aus funf, fur 2% CO2 aussieben und fur 5% CO2 aus sechs Messungen gebildet.

Bei der unter Luft gemessenen Kurve ist zunachst ein fruherer Anstieg der Sauerstoff-entwicklung zu erkennen als bei den unter 2% CO2 und 5% CO2 gemessenen Kurven.

32 5.2 Photoakustik (PA)

Bei der 5% Kurve fallt auf, dass das Blatt im mittleren Bereich sauerstoffverbrauchendeProzesse aktiviert. Je geringer die CO2-Konzentration in der Kammer ist, desto schnellerwird die maximale O2-Entwicklungsrate erreicht. Die maximale O2-Entwicklungsrate istbei allen drei Kurven gleich.Es lasst sich folgern, dass erhohte CO2-Werte bei einem dunkeladaptierten Blatt zwareine verzogerte Sauerstoffentwicklung bewirken, jedoch die nach dieser Induktionsphaseauftretende Sauerstoffrate unbeeinflusst bleibt.Auffallig ist, dass das unter Luftbedingungen gemessene Sauerstoffsignal aufgrund desgeringeren CO2-Vorrates in der Kammer ungefahr nach 300 s in Sattigung geht. Andiesem Punkt ist die Sauerstoffentwicklung des Blattes durch den geringen CO2-Gehaltin der Kammer limitiert.Die Sattigung konnte dadurch zustande kommen, dass aufgrund des CO2-Mangels dieAktivitat der Photosynthese zuruck geht oder dass der im PS II freigesetzte Sauerstoffdurch andere im Blatt stattfindende Prozesse wieder verbraucht wird und daraus eineNetto-Sauerstoffentwicklung von ca. Null resultiert. Um diese Frage zu klaren, wurdendie folgenden Messungen durchgefuhrt.

5.2 Photoakustik (PA)

Dieser Abschnitt fuhrt kurz in die Methode der Photoakustik (PA) Messungen ein.In der Arbeitsgruppe wurde die Photoakustik (Canaani et al., 1988; Malkin und Cahen,1979; Bults et al., 1982; Buschmann et al., 1984; Poulet et al., 1983; Snel et al., 1990; Dauund Hansen, 1990) in Verbindung mit den Fluoreszenz-Clamp-Messungen zum Vergleichvon Sauerstoffentwicklung und Exzitonenfluss genutzt (Schinner, 1997; Tabrizi, 1997).Bei diesem Messverfahren wird ein dunkeladaptiertes Blatt durch einen 1 ms kurzen

Abbildung 5.2: Schematische Darstellung der PA-Antwort eines Blattes auf einen Lichtimpulsvon 1 ms Dauer. Hierbei uberlagern sich die drei Komponenten th (thermische Komponente),ev (Komponente der O2-Entwicklung) und up (Gasaufnahmekomponente).

5.2 Photoakustik (PA) 33

Lichtpuls von 350 µmol m−2 s−1 in einer geschlossenen Kammer angeregt (Kolbowski etal., 1990; Tabrizi et al., 1998). Das entstehende akustische Signal wird mit einem Mikro-phon detektiert. Der zeitliche Verlauf des Signals ist in Abbildung 5.2 dargestellt. Dasphotoakustische Signal besteht aus einem photothermischen und einem photobarischenAnteil.

• Unter dem photothermischen Anteil wird die thermisch (th) verursachte Druckwelleverstanden.

• Der photobarische Anteil entsteht durch die photochemische Nutzung der Licht-energie. Er besteht aus einer Gasaufnahmekomponente up (= uptake), der CO2-Aufnahme, und einer O2-Entwicklungskomponente ev. Die ev-Komponente re-prasentiert den bei der Wasserspaltung entstandenen Sauerstoff.

Nach Kolbowski et al. (1990) lasst sich die photoakustische Antwort auf einen Lichtblitz(ca. 1 ms) durch folgenden Fitansatz darstellen:

f(t) = k1th(t) + k2ev(t) + k3up(t) (5.1)

Hierbei handelt es sich um die oben beschriebenen Komponenten (Beschreibung der Ko-effizienten k1, k2 und k3 siehe weiter unten). Jedoch hatten Kolbowski et al. (1990) keineeindeutige Erklarung fur die Aufnahmekomponente up. Es wurde die Sauerstoffaufnahmedurch die Mehler-Reaktion (Mehler, 1951a, 1951b; Schreiber und Neubauer, 1990) oderCO2-Losung ins Stroma (Oja et al., 1986) erwogen. Durch Reising (1994) bzw. Reisingund Schreiber (1994) wurde die Aufnahmekomponente als CO2-Aufnahme ins Stromaidentifiziert.Aus der Kenntnis der Normkurven fur th, ev und up lassen sich die Koeffizienten k1,k2 und k3 im Fit mit Gleichung 5.1 bestimmen. Die Methoden zur Bestimmung derNormkurven sind wie folgt:

• th wird bei sattigendem Hintergrundlicht gemessen, wenn der Blitz keine zusatzlichephotochemische Aktivitat auslosen kann.

• ev ergibt sich nach Vorbeleuchtung in geschlossener Kammer. Alternativ kann evin CO2-freier Atmosphare bestimmt werden.

• up kann nach langer Dunkeladaption in geschlossener Kammer oder unter sattigen-der (6%) CO2-Konzentration gemessen werden.

Allerdings verandert sich die Form der Normkurve fur up mit der CO2-Konzentration(Reising, 1994). Darum wurde es notwendig, einen Spreizungsfaktor a einzufuhren (Ta-brizi, 1997; Tabrizi et al., 1998), der im Fit mitbestimmt wird:

f(t) = k1th(t) + k2(t)ev + k3up(at). (5.2)

Dies ermoglicht es, das Messsignal f(t) in die drei Komponenten th, ev und up aufzu-spalten und die gemessenen photoakustischen Blitzantworten quantitativ auszuwerten.Die in Abschnitt 5.3 beschriebenen Parallelmessungen mit der Clark-Elektrode solleneinen direkten Aufschluss uber die Sauerstoffentwicklung im Vergleich zu den indirektgemessenen Sauerstoffwerten aus dem Photoakustikaufbau geben.

34 5.3 Parallelmessungen von Photoakustik und Clark-Elektrode

5.3 Parallelmessungen von Photoakustik und Clark-

Elektrode

Um Parallelmessungen mit Photoakustik bzw. Microx durchfuhren zu konnen, wird dieClark-Elektrode (Abbildung 3.3 Abschnitt 3.3) in die Ruckwand der PA-Kammer fest ein-gesetzt. Abbildung 5.3 zeigt die von H. Tabrizi entworfene, jedoch nicht mehr eingesetzte,Messkammer.Die O-Ringe der Clark-Elektrode schließen den Gasraum der PA-Kammer nach außengasdicht ab. Die Kathode der Clark-Elektrode bildet eine Flache mit der Ruckseite desGasraumes.In Abbildung 5.4 ist die Vorderwand der PA-Kammer dargestellt.Die PA-Kammer ist aus einer Kombination aus optischen Glaszylindern und Plexiglasgefertigt. Die beiden Messkammern liegen jeweils zwischen einem optisch transparentenGlaszylinder (Schott, B 270) und einer aus Plexiglas bestehenden Ruckwand.Eine der beiden Kammern dient als Referenzkammer, um Storeinflusse durch die Umge-bung zu minimieren.Die Glaszylinder enthalten an ihrer Stirnflache eine Ringnut, in die ein O-Ring einge-setzt ist. Dieser presst die Messprobe gegen die Ruckwand und dichtet den so gebildetenMessraum, der 250 µl umfasst, hermetisch ab.In die Glaszylinder sind zur Signalaufnahme Mikrophone (Knowles Electronic, UK, BL1785) eingefasst. Die Mikrophone sind exzentrisch angeordnet, um die Laufzeitunterschie-de zwischen Mess- und Referenzsignal minimal zu halten. Die Aufsicht der messbereitenKammer ist in Abbildung 5.5 dargestellt.

Abbildung 5.3: 3-dimensionale Darstellung der Ruckwand der PA-Kammer mit Ausfrasungfur die Clark-Elektrode.

5.3 Parallelmessungen von Photoakustik und Clark-Elektrode 35

Abbildung 5.4: 3-dimensionale Darstellung der Vorderwand der PA-Kammer. Die auf dieGlaszylinder montierten O-Ringe schließen mit der Messprobe ein Messvolumen von ca. 100 µlein.

Abbildung 5.5: Aufsicht der aus Ruck- und Vorderwand zusammengesetzten PA-Kammer.

36 5.4 Messbedingungen

Die PA-Kammer lasst sich vor der jeweiligen Messung uber die Ventile mit verschiedenenGaszusammensetzungen fluten. Photoakustik-Messungen sowie Messungen mit der Clark-Elektrode konnen nur bei geschlossener Kammer und nicht bei Gasfluss durchgefuhrtwerden.Wie in Abschnitt 3.2 beschrieben wurde, lasst sich die Gaszusammensetzung mit den dreiGasflussreglern uber das Kontrollgerat von Bruning (1990) einstellen.

5.4 Messbedingungen

Im Gegensatz zur Clark-Elektrode, die meist mit kontinuierlichem Messlicht betriebenwird, benotigt die photoakustische Messmethode Lichtblitze wie in Abschnitt 5.2 be-schrieben als Messlicht. Bei den durchgefuhrten Messungen hatten die Lichtblitze eineLange von 1 ms und wiederholten sich alle 200 ms. Die PA-Antworten auf diese Blit-ze wurden uber 50 Messintervalle gemittelt und die resultierende Kurve abgespeichert.Dadurch ergaben sich Messabschnitte von 10 s, nach denen jeweils ein Signal der Clark-Elektrode aufgenommen und abgespeichert wurde.Mit den Lichtblitzen lasst sich eine durchschnittliche Lichtstarke von 30 µmol m−2 s−1

erzeugen. Die ublicherweise verwendeten Bohnenblatter zeigen erst bei uber100 µmol m−2 s−1 ein ausreichendes Sauerstoffsignal. Daher wurde bei den PA-MessungenGiersch (Abschnitt 2.8.3) benutzt. Bei dieser Schattenpflanze zeigte sich schon bei25 µmol m−2 s−1 ein gut erkennbares Sauerstoffsignal (Abbildung 5.6).

0 50 100 150 200 250 300200

220

240

260

280

300

320

340

O2

[a.u

.]

t [s]

Abbildung 5.6: O2-Entwicklung eines Gierschblattes in der PA-Kammer gemessen mit derClark-Elektrode bei einer mittleren Lichtintensitat von 25 µmol m−2 s−1.

5.5 Die Langzeitmessung 37

Um sicherzustellen, dass der Anstieg des Signals durch das Blatt verursacht wurde, wurdeanstatt des Blattes ein doppelt gelegtes Zellstofftuch verwendet. Abbildung 5.7 zeigt, dassdas Signal unverandert weiter driftet bei Beleuchtung mit 435 µmol m−2 s−1.

0 50 100 150 200

1550

1560

1570

1580

1590

1600

Licht an

O2

[a.u

.]

t [s]

Abbildung 5.7: Um Temperatureffekte auszuschließen, wurde anstatt eines Blattes ein doppeltgelegtes Zellstofftuch verwendet und mit 435 µmol m−2 s−1 beleuchtet. Das Signal wurde mitder Clark-Elektrode gemessen.

5.5 Die Langzeitmessung

In diesem Abschnitt wurde eine Langzeitmessung parallel mit beiden Methoden durch-gefuhrt, um den in Abschnitt 5.1 dargestellten Sattigungseffekt der O2-Konzentration ineiner geschlossenen Kammer aufzuklaren.Die geringe Lichtintensitat der photoakustischen Blitze bewirkt einen niedrigeren CO2-Verbrauch des Blattes als in Abbildung 5.1. Um trotzdem den durch CO2-Mangel beding-ten Sattigungseffekt in der O2-Konzentration zu sehen, wurde eine CO2-Konzentrationunter 0.03% eingestellt. Weil mit den Tylan-Reglern (Abschnitt 3.2) kleine CO2-Konzentrationen nicht einstellbar sind, wurde die Kammer inklusive Blatt funf Minu-ten lang, nachdem das Blatt in der Kammer 20 Minuten dunkeladaptiert wurde, miteiner Gaszusammensetzung von 20% O2 und 80% N2 (weiterhin in Dunkelheit) geflutet.Anschließend wurde in der geschlossenen Kammer weitere 10 Minuten dunkeladaptiert.Wahrend dieser Dunkelphase steigt die CO2-Konzentration in der Kammer aufgrund derDunkelatmung des Blattes.Aus Abbildung 5.8 ist zu erkennen, dass die mit der Clark-Elektrode gemessene O2-Konzentration ca. 400 s lang stark zunimmt. Danach geht das Signal in Sattigung uber.

38 5.5 Die Langzeitmessung

Der durch die Photoakustik gemessene k2-Wert (Gleichung 5.1), der die Sauerstoffevolu-tion im PS II beschreibt, steigt ca. 75 s lang an, bleibt dann fur kurze Zeit bei einem Ma-ximalwert stehen, sinkt anschließend etwas ab und bleibt ab ungefahr t = 400 s konstant.Die ebenfalls mit der photoakustischen Messmethode erhaltene CO2-Aufnahmekurve, diein Abbildung 5.8 als Gasaufnahme negativ aufgetragen ist, steigt wahrend der ersten170 s steil an und beginnt dann, mit konstanter Steigung zu sinken.

Abbildung 5.8: Parallele Messung von Photoakustik und Clark-Elektrode an einemGierschblatt bei einer Lichtintensitat von 30 µmol m−2 s−1.

Obwohl sich nach 400 s die Sauerstoffkonzentration in der Kammer nicht verandert undsomit der Nettofluss Null ist, bleibt die Sauerstoffevolution im PS II konstant. Zusatzlichist anhand der CO2-Aufnahmekurve zu erkennen, dass zum selben Zeitpunkt das Blattweiterhin CO2 aufnimmt. Diese Aufnahme nimmt langsam und relativ linear ab.Dass die Brutto-Sauerstoffentwicklung im Blatt gleich Null ist (ab t = 400 s), bedeutet,dass der im PS II generierte Sauerstoff von anderen Prozessen wieder verbraucht wird.Verschiedene Prozesse kommen dafur in Frage: Mit zunehmender CO2-Verarmung derKammer erhoht sich die Aktivitat des sauerstoffverbrauchenden Prozesses der Photorespi-ration (Abschnitt 2.6). Um das bei der Photorespiration entstandene 2-Phosphoglycolatwieder abzubauen, wird unter anderem im Peroxisom weiter Sauerstoff aufgenommenund in den Mitochondrien CO2 freigesetzt. Jedoch spricht das Gleichbleiben der CO2-Aufnahme dagegen. Die Bindungsrate von Ribulose-1,5-bisphosphat (Abschnitt 2.6) istbegrenzt und damit die Summe aus O2- und CO2-Bindung konstant. Wenn CO2 nurwenig abnimmt, kann O2 nicht wesentlich steigen und umgekehrt. Also mussen andereProzesse aktiv werden, wie z.B. Redox-Export aus den Chloroplasten in die Mitochon-drien (Noctor und Foyer, 1998). Dann wurde der Elektronentransport (O2-Entwicklung)aufrechterhalten und die Mitochondrien wurden CO2 an den Calvin-Zyklus liefern. Teil-weise ist damit sogar eine Erhohung des Elektronenflusses verbunden (Schinner et al.,

5.5 Die Langzeitmessung 39

2001).Das bedeutet, dass diese alternierenden Prozesse den im PS II entstandenen Sau-erstoff verbrauchen und dadurch die von der Clark-Elektrode registrierte Brutto-Sauerstoffentwicklung Null ist.Damit liefert die simultane Messung von Clark-Elektrode und Photoakustik sehr guteMoglichkeiten, die Elektronenflussverzweigungen hinter PS I zu studieren.

40 6.1 Messprinzip

Kapitel 6

Das Microx

Das Microx 1 (PreSens, Neuburg a.d. Donau, Deutschland) ist ein Gerat, bei dem derHersteller damit wirbt, dass eine hoch ortsaufgeloste Messung der Sauerstoffkonzentra-tion moglich sei. Aus diesem Grunde sollte es zur Untersuchung der unterschiedlichenphotosynthetischen Aktivitat von Bundelscheiden- und Mesophyllzellen von Maispflan-zen eingesetzt werden (Abschnitt 2.7).Weiter behauptet der Hersteller, dass ein weiterer Vorteil des Microx gegenuber der klassi-schen O2-Messmethode der Clark-Elektrode darin bestunde, dass kein Sauerstoff wahrendder Messung konsumiert wird. Daruberhinaus soll das Microx unabhangig von der Fliess-geschwindigkeit des Messmediums messen. Der besondere Vorteil bestunde in der hohenStabilitat des Signals in Langzeitmessungen. Die Messung sei unbeeinflusst durch elek-tromagnetische Felder.

6.1 Messprinzip

Das Messprinzip des Microx beruht auf der dynamischen bzw. Kollisions-Loschung (Colli-sional Quenching) der Fluoreszenz eines Farbstoffes. Fluoreszenz bezeichnet den Elektro-nenubergang von einem Energieniveau S1 nach einem Energieniveau S0 unter Aussendungeines Photons. Bei der vorliegenden Optode (optischer Sensor des Microx) wird durchKollision zwischen Molekulen des angeregten Farbstoffes (Fluorophoren) und Sauerstoff-Molekulen der Anteil von strahlungslosen Ubergangen der Elektronen in den Grundzu-stand erhoht. Seit Kautsky et al. (1939) ist molekularer Sauerstoff als guter Loscher vonFluoreszenz, ebenso fur Phoshoreszenz, bekannt. Der vorliegende Farbstoff hat die Eigen-schaft, dass die Loschung der Fluoreszenz durch andere Substanzen nicht auftritt. Durchdie Kollisions-Loschung wird sowohl die Fluoreszenz-Intensitat als auch ihre Dauer, dieAbklingzeit, verandert. Die Abklingzeit ist definiert als der Zeitraum, der vergeht, bis dieAnfangsintensitat des emittierten Lichtes auf das 1/e-fache abgefallen ist.Der Quotient aus Abklingzeit bzw. Lebensdauer des Fluorophors im angeregten Zustandbei Anwesenheit von Sauerstoff und der Abklingzeit unter Abwesenheit von Sauerstoffergibt sich nach der Stern-Volmer-Gleichung (Stern und Volmer, 1919):

τ

τ0

=1

1 + kqτ0[O2]=

1

1 + KD[O2](6.1)

Hierbei bezeichnet:τ - Abklingzeit bzw. Lebensdauer des Fluorophors im angeregten Zustand bei Anwesen-

6.2 Aufbau des Messgerates 41

heit von Sauerstoffτ0 - Lebensdauer des Fluorophors im angeregten Zustand unter Abwesenheit vonSauerstoffkq- molekulare Loschkonstante[O2]- Sauerstoff-KonzentrationKD- Stern-Volmer- oder bimolekulare Loschkonstante

Der Vorteil, die Lebensdauer τ anstatt die Intensitat des Fluoreszenzlichtes zu messen, be-steht darin, dass τ unabhangig von der Farbstoffkonzentration ist. Dadurch haben Effektewie photochemischer Zerfall, Herauswaschen des Farbstoffes oder chemische Reaktionenmit anderen Molekulen keinen Einfluss.

6.2 Aufbau des Messgerates

In Abbildung 6.1 ist der schematische Aufbau des Microx dargestellt.

Abbildung 6.1: Schematische Darstellung des Messsystems der Optode: light emitting diodes(LED), photomultiplier tube (PMT), optical filters (OF), standard fiber connectors (ST).

Der Indikator-Farbstoff der Messspitzen, der in eine Glasmatrix eingebunden ist, absor-biert Licht bei 450 nm und emittiert Licht bei 610 nm. Der Farbstoff wird deshalb miteiner blauen LED (LEDsig in Abb. 6.1) angeregt. Vor der LEDsig ist ein BG12-Filtergesetzt, um den roten Anteil des Emissions-Spektrum abzutrennen. Die Signalubertra-gung erfolgt in beide Richtungen uber sehr dunne Glaslichtleiter von der LEDsig zurMicrox-Optode uber eine Glasfaser-Kopplung zur Standard-Glasfaser-Verbindung. DieGlasfaser-Kopplung verbindet die beiden Glasfaserstrange LEDsig-Optode und PMT-LEDref , indem die beiden Kerne der Glasfasern, die jeweils einseitig von der Reflexi-onsschicht befreit worden sind, sich beruhren. Dadurch ist eine Signalubertragung vonder Optode zum PMT und von der LEDref zum PMT moglich. Vor dem PMT ist einOG570-Filter geschaltet, um das Licht der LEDsig auszuloschen.

42 6.3 Messspitzen

Der Farbstoff wird mit einem sinusformigen Signal der Frequenz fmod der LEDsig an-geregt. Die Fluoreszenz-Lebensdauer bewirkt ein zeitverzogertes Sensor-Signal. Um denPhasenwinkelunterschied ∆Φ zwischen Sensor-Signal und dem modulierten Signal derLEDsig zu bestimmen, wird das Sensor-Signal zusammen mit der roten Referenz-LED(LEDref in Abb. 6.1) im Photomultiplier registriert. Das Signal wird mit einer Elektro-nik (schematischer Aufbau in Holst et al. (1997) Fig. 3) verstarkt und gefiltert und mitdem modulierten Signal der LEDsig verglichen. Die Lebensdauer τ des Fluorophors hangtmit dem gemessenen Phasenwinkelunterschied ∆Φ folgendermaßen zusammen:

tan(∆Φ) = 2πfmodτ (6.2)

Fur den vorliegenden Optodentyp betragt die Modulations-Frequenz fur LEDsig undLEDref 37.5 kHz.Der Phasenwinkelunterschied ∆Φ lasst sich direkt mit einer Optode messen. Soll die O2-Konzentration auf dem Ausgabegerat dargestellt werden, ist es notwendig, eine vom Her-steller vorgeschriebene Zwei-Punkt-Kalibrierung fur Sauerstoff vorzunehmen (Abschnitt6.4). Ein großer werdender Wert fur ∆Φ, bedeutet, dass eine geringere O2-Konzentrationvorliegt (Gleichung 6.3).Aus Gleichung 6.2 und der Stern-Volmer-Gleichung 6.1 (Abschnitt 6.1) ergibt sich dieSauerstoffkonzentration zu:

[O2] =1

KD

(2πfmodτ0

tan(∆Φ)− 1

)(6.3)

Diese lasst sich bei einer kalibrierten Optode (Abschnitt 6.4) messen.

6.2.1 Datenaufnahme

Die aufgenommenen Daten wurden uber die serielle Schnittstelle RS232 einem PC uber-mittelt. Diese Daten konnten im vorhandenen Auswerteprogramm Microx 1 v2.01

”onli-

ne“ betrachtet werden oder die erstellte Textdatei mit weiteren Programmen ausgewertetwerden.

6.3 Messspitzen

Der Messkopf der Messspitzen hat eine Große von ca. 30 bis 60 µm und ware dadurchklein genug, um hochortsaufgelost die photosynthetische Aktivitat der unterschiedlichenMaiszellen (Abbildung 2.6 Abschnitt 2.7), deren Großen im selben Bereich liegen, zudetektieren.Bei den Messspitzen ist der Farbstoff in eine Glasmatrix eingebettet (siehe kleinen KastenAbb. 6.2), die mit einer optischen Isolierung beschichtet sein kann (siehe im Text weiterunten). Zur Weiterleitung des Signals ist die Glasmatrix mit einem sehr dunnen Lichtleiterverbunden. Der Lichtleiter ist durch eine Spritze gefadelt, so dass beim Drucken derSpritze das Glasfaserende mit Farbstoff aus der Stahlkapillare heraus geschoben werdenkann (Abb. 6.2). Die Messspitze darf nicht zu weit hinausgefahren werden, da sonst derdunne Lichtleiter innerhalb der Spritze durchbricht.

6.3 Messspitzen 43

Abbildung 6.2: Fotographie einer Optode und schematische Darstellung (vergroßert) ihrerMessspitze. Der Farbstoff ist in eine Glasmatrix eingebunden (siehe kleiner Kasten). Es gibtOptoden mit und ohne optische Isolierung um die Glasmatrix.

Aufgrund der Nutzung fur hoch ortsaufgeloste Messung ist die Glasmatrix mit dem Farb-stoff und entsprechend der Lichtleiter so dunn, dass sie abbrechen, wenn sie auf großerenmechanischen Widerstand treffen. Die Messspitze bricht insbesondere, wenn sie schragauf ein Objekt trifft. Die Optode wird dadurch zerstort. Messungen mit den Optodenkonnen dadurch nur mit dem Mikromanipulator und außerster Vorsicht durchgefuhrtwerden.Zur Lagerung kann bei eingezogenem Lichtleiter uber die Stahlkapillare eine Plastik-schutzkappe gesteckt werden.Die 1. Version der Optoden hatten eine schwarze optische Isolierung aus Teflon umdie Glasmatrix, in die der Farbstoff eingebracht war. Diese war zum einen optisch un-durchlassig und dennoch im Vergleich zu anderen Gasen gut sauerstoffdurchlassig. DieIsolierung sollte verhindern, das photosynthetisch aktives Material durch die LEDsig (Ab-bildung 6.1 Abschnitt 6.2) des Microx angeregt wird. Diese Beschichtung hat den Nachteil,mechanisch sehr anfallig zu sein. Das bedeutet, es muss nicht nur auf ein Abbrechen derOptoden geachtet werden, sondern auch ein Gegensetzen der Optoden verhindert werden.Ansonsten ist die optische Isolierung sofort beschadigt.Daruber hinaus zeigte sich, dass die Isolierung durch Wassereinwirkung (langer als eineStunde) aufgeweicht wird und sich dann nur durch Ein- und Ausfahren der Spitze ausder Kapillare von der Glasfaser ablost.Bei der zweiten Version der Optoden wurde das Material der Glasmatrix, in die der Farb-stoff eingebettet war, durch den Hersteller extra robust und mechanisch stabil gewahlt.Dennoch mussen die Optoden mit außerster Sorgfalt benutzt werden, da auch hier diedunnen Glaslichtleiter zerbrechen konnen. Auf diesen Optoden ist keine zusatzliche Tef-lonbeschichtung aufgebracht.Bei Messungen in feuchten oder nassen Medien mit den Optoden der zweiten Versionwird Wasser von dem porosen Glasmaterial aufgenommen. Durch diese Wasseraufnahmeverandert sich die Diffusionsgeschwindigkeit der Gase innerhalb des Glassubstrates; dieOptoden weisen eine Drift auf. Daher sollte am Abend vor dem nachsten Messtag in dieSchutzkappe der Optoden ein Tropfen Wasser getraufelt werden. Dies sollte insbesonderedann durchgefuhrt werden, wenn die Messspitzen lange Zeit nicht benutzt wurden. Ein

44 6.5 Testmessungen mit den Optoden

langes trockenes Lagern der Messspitzen beeintrachtigt ihre Messeigenschaften jedochnicht.Fur Messungen in absolut trockener Luft sollte das Porenwasser moglichst wieder entferntwerden, z.B. durch Lagerung in einem Trockenschrank oder Heizofen bei 90C.Das Anfeuchten ist bei den Messspitzen der 1. Version nicht notwendig, da sie aus einemanderen Material bestehen.Ein Herausschwemmen des Fluoreszenzfarbstoffes aus der Glasmatrix ist auch nach lange-rer Lagerung der Messspitze in Wasser laut Hersteller nicht moglich.

6.4 Kalibrierung

Das Messsystem des Microx bietet die Moglichkeit, entweder den Phasenwinkelunter-schied ∆Φ (Gleichung 6.2 Abschnitt 6.2) direkt zu betrachten oder die sich daraus berech-nende O2-Konzentration (Gleichung 6.3 Abschnitt 6.2). Fur letztere Darstellung werden0% O2 und 20% O2 die entsprechenden Phasenwinkel in einer durch den Hersteller vor-geschriebene Zwei-Punkt-Kalibrierung zugewiesen. Dies geschieht folgendermaßen: ZurEinstellung von 0% O2 wird die Messspitze mit Stickstoff geflutet. Alternativ kann furnachfolgende Messungen in Flussigkeiten eine 5%-ige Losung mit Natriumsulfit (Na2SO3)genommen werden. Natriumsulfit verbraucht den Sauerstoff, indem es zu Natriumsulfatoxidiert wird.Fur 20% O2 wird die Messspitze mit einem Gasgemisch entsprechend der Luftzusammen-setzung geflutet. Alternativ kann entsprechend mit Luft gesattigtes Wasser genommenwerden.Insbesondere ist bei der Kalibrierung auf eine konstante Temperatur der Gasgemischebzw. Testflussigkeiten zu achten. Anderenfalls treten die im nachfolgenden Abschnitt 6.5ausfuhrlich erlauterten temperaturabhangigen Fehler auf.

6.5 Testmessungen mit den Optoden

In diesem Abschnitt werden die Probleme, die beim Messen mit den Optoden auftraten,dargestellt. Bei diesen Messungen wurde insbesondere deutlich, dass der Farbstoff imgroßeren Maße auf Temperatur- als auf Sauerstoffkonzentrationschwankungen reagiert.Fur die Messungen standen Optoden mit und ohne optische Isolierung (Abschnitt 6.3)zur Verfugung.

6.5.1 Auswirkung des Hintergrundlichtes auf den PMT

Bei den Messungen mit Optoden ohne optische Isolierung oder mit beschadigter Isolie-rung tritt das Problem auf, dass der Photomultiplier (PMT) durch das Hintergrundlichtubersteuert und sich ausschaltet, wenn zur Anregung des Photosyntheseapparates Halo-genlicht uber 300 µmol m−2 s−1 eingestrahlt wird. Dieses Phanomen tritt ausschließlichbei Hintergrundlicht mit Anteilen im roten Wellenlangenbereich auf. Dies liegt daran,dass der Farbstoff Licht bei 610 nm emittiert und dementsprechend der Messbereich desPMT gewahlt ist. Abbildung 6.3 zeigt das Rauschen des PMT bei Beleuchtung einerunisolierten Messspitze mit einer roten LED mit einer Intenstat von 160 µmol m−2 s−1.Das Rauschen reduziert sich sofort, wenn die rote LED ausgeschaltet wird.

6.5.2 Temperatureffekt auf den Farbstoff 45

0 200 400 600 800 1000 120018

19

20

21

22

23

24

25

26

Licht aus

O2

[%]

t [s]

Abbildung 6.3: Rauschen des PMT bei Beleuchtung einer unisolierten Messspitze mit einerroten LED (Intensitat: 160 µmol m−2 s−1). Das Rauschen ist bei ausgeschaltetem Licht sofortreduziert.

Dieses zusatzliche Rauschen lasst sich folgendermaßen erklaren: Wenn Licht auf den PMTfallt, steigt der Gleichstrom des PMT an und dadurch das stromabhangige Rauschen desPMT. Ware das Gleichlicht das eigentliche Signal, hatte dieses keine negative Auswir-kung, da im Signal-Rausch-Verhaltnis SR = Signal

Rauschender Zahler starker wachsen wurde

als der Nenner. Da der PMT aber die Antwort auf das Messlicht LEDsig (Abbildung6.1 Abschnitt 6.2) misst, hat der Gleichlichtanteil keinen positiven Effekt auf das SRdes Messsignals. Denn vom Rauschen fallt ein großer Teil in den Frequenzbereich desMesssignals.Aus diesem Grund muss der PMT vor Gleichlicht geschutzt werden. Da sich vor dem PMTein Rotfilter befindet (Abbildung 6.1 Abschnitt 6.2), genugt es, durch einen Blaufilter(BG12) den Rotanteil des Halogenlichtes heraus zu filtern. Alternativ lasst sich durchdas Benutzen von blauen LED’s das zusatzliche Rauschen durch den Gleichlichtanteil imroten Wellenlangenbereich bei unisolierten bzw. beschadigten Optoden umgehen.

6.5.2 Temperatureffekt auf den Farbstoff

Neben der direkten Wirkung des Hintergrundlichtes auf den PMT ist noch ein weitererstorender Effekt, der temperaturabhangig ist, vorhanden.Da Messungen an isolierten Maiszellen durchgefuhrt werden sollten, wurden Kontroll-messungen in destilliertem Wasser vorgenommen. Bei Messungen mit einer in destillier-tes Wasser gestellten Messspitze zeigte sich jedoch ein Effekt durch die Beleuchtung mitBG12-gefiltertem Halogenlicht bei einer Intensitat von ungefahr 300 µmol m−2 s−1. Es

46 6.5 Testmessungen mit den Optoden

ergab sich ein ausgepragtes Signal bei Lichteinstrahlung, obwohl kein photosynthetischaktives Material vorhanden war (Abbildung 6.4). Beim Ausschalten des Lichtes sank dasSignal sofort wieder ab. Dieser Effekt ließ sich wie dargestellt periodisch wiederholen. DerPMT kann als Ursache fur dieses Signal ausgeschlossen werden, da sich ein Blaufilter vordem Halogenlicht befand.

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

18

19

20

21

22

23

24

Licht anLicht an

Licht anLicht an

Licht ausLicht ausLicht aus

O2

[%]

t [s]

Abbildung 6.4: Kontrollmessung ohne photosynthetisch aktives Material in destilliertem Was-ser mit BG12-gefiltertem Halogenlicht bei einer Intensitat von ungefahr 300 µmol m−2 s−1.

Um auszuschließen, dass das Licht die Gaszusammensetzung im Wasser beeinflusst, wur-de die Kontrollmessung in Luft mit identischer Beleuchtung mit BG12-gefiltertem Halo-genlicht bei einer Intensitat von ungefahr 300 µmol m−2 s−1 wiederholt. Die Messspitzewurde uber grunem Computerpapier mit einem Mikromanipulator positioniert.Deutlich ist der Signalanstieg bei Lichtzugabe zu erkennen. Beim Ausschalten der Be-leuchtung sank das Signal wieder (in Abbildung 6.5 nicht dargestellt). Wie bei der Mes-sung in destilliertem Wasser (Abbildung 6.4) ließ sich das Verhalten bei Einschalten undAusschalten der Beleuchtung mehrfach wiederholen.

6.5.2 Temperatureffekt auf den Farbstoff 47

0 400 800 1200 1600 2000

20

21

22

23

24

Licht an

O2

[%]

t [s]

Abbildung 6.5: Kontrollmessung mit Messspitze uber grunem Computerpapier. Beleuchtungmit BG12-gefiltertem Halogenlicht bei einer Intensitat von ungefahr 300 µmol m−2 s−1.

Die vermutete direkte Temperaturabhangigkeit der Optode wurde mit nachfolgendemAufbau uberpruft. Zwei in Serie geschaltete 20Ω-Widerstande wurden durch einen ange-legten Strom von 150 mA erwarmt. Die Messspitze befand sich im Abstand von 2 mmuber den Widerstanden. Messspitze und Thermometer wurden mit Hilfe des Mikroma-nipulators in Position gehalten. Das Thermometer kann nur qualitativ den Tempera-turanstieg belegen, da die Positionen von Messspitze und Thermometermesskopf nichtidentisch sind. Daruber hinaus weisen beide verschiedene Absorptionseigenschaften auf.Allerdings zeigt Abbildung 6.6 nach 1000 s eine Sattigung des O2-Signals. Der Sattigungs-effekt lasst erwarten, dass sich eine stabile Luftschicht um die Widerstande gebildet hat,deren Temperatur von Thermometer und Messspitze gleichermaßen aufgenommen wird.

48 6.5 Testmessungen mit den Optoden

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 160018

20

22

24

26

28

Strom an

O2

[%]

t [s]

Abbildung 6.6: Erwarmung der Messspitze: Die Messspitze wurde mit den Mikromanipulatoruber den in Serie geschalteten 20Ω-Widerstanden positioniert. Nach dem Einschalten des Stro-mes, erwarmten sich die Widerstande. Dieses hatte den dargestellten scheinbaren O2-Anstiegzufolge.

Die hier durchgefuhrte Messung ergab, dass sich die Anfangstemperatur von 23,5 Cauf 28 C erhohte und gleichzeitig die angezeigte O2-Konzentration von 20% auf 26.5%zunahm.

(∆O2)T

∆T=

(O2)T2 − (O2)T1

T2 − T1

=1.5%

1C(6.4)

Das bedeutet, dass bei einer Temperaturerhohung von 1 C eine O2-Konzentrationsande-rung von ca. 1.5% vorgetauscht wird. In Abschnitt 6.5.4 wird abgeschatzt, inwieweit sichTemperatureffekte auf die Empfindlichkeit des Microx auswirken.

6.5.3 Einfluss der Lichtqualitat

Zur Klarung, inwieweit die Lichtqualitat einen Einfluss auf die scheinbare O2-Erhohunghat, wurden Messungen mit blauen LED’s mit unterschiedlicher Lichtintensitat durch-gefuhrt. Bei den Messungen wurden die Messspitze und das Thermometer mit einemMikromanipulator uber der jeweiligen Beleuchtung positioniert. Zur Temperaturkontrol-le wurde die Temperatur durch ein Thermometer registriert. Der Vergleich zwischen denalten und neuen blauen LED’s zeigte, dass es sich um einen Temperatureffekt handelt. Beigleichem Strom von 16 mA betrug die Lichtintensitat der alten LED’s 80 µmol m−2 s−1

und die der neuen 300 µmol m−2 s−1. Aus mehreren Wiederholungsmessungen bestatigtesich, dass, obwohl die Lichtintensitat fast viermal so hoch ist, der scheinbare Anstieg in

6.5.3 Einfluss der Lichtqualitat 49

0 200 400 600 800

18,0

18,5

19,0

19,5

20,0

20,5

21,0

21,5alte LED´s

neue LED´s

Licht an

O2

[%]

t [s]

Abbildung 6.7: Vergleich der scheinbaren O2-Entwicklung bei alten und neuen LED’s.

0 200 400 600 800 1000

17,5

18,0

18,5

19,0

19,5

20,0

ohne Wärmefilter

mit Wärmefilter

Licht an

O2

[%]

t [s]

Abbildung 6.8: Scheinbare O2-Entwicklung mit und ohne Warmefilter bei identischer Lichtin-tensitat von 300 µmol m−2 s−1. Es wurde eine gleitende Mittelwertbildung uber jeweils 100 svorgenommen.

50 6.5 Testmessungen mit den Optoden

der Sauerstoffentwicklung annahernd gleich war. Reprasentativ sind die Messungen zumVergleich in Abbildung 6.7 aufgefuhrt. Weitere Messungen ergaben, dass sich die schein-bare O2-Entwicklung durch ein Warmefilter (3 mm) (Schott) reduzieren lasst. Der Stromdurch die neuen LED’s wurde so geregelt, dass jeweils mit und ohne Warmefilter eineidentische Lichtintensitat von 300 µmol m−2 s−1 erreicht wurde.In Abbildung 6.8 ist zu erkennen, dass die scheinbare Sauerstoffentwicklung mit Warmefil-ter geringer als ohne ist. Es ergab sich gemittelt uber jeweils 6 Messungen eine scheinbareErhohung ohne Filter um 1% und mit Filter um nur 0.2%.Zur weiteren Absicherung, dass es sich um einen Temperatureffekt handelt und Licht imblauen Wellenlangenbereich keinen Einfluss auf den scheinbaren O2-Anstieg hat, wurdenMessungen mit den Filtern der Firma Schott BG18 und RG780 durchgefuhrt.Abbildung 6.9 zeigt die Intensitat aufgetragen gegen die Wellenlange fur neue blaueLED’s (Ruser, FTZ Westkuste). Neben dem erwarteten Intensitatsmaximum um die Wel-lenlangen im blauen Bereich besitzen die LED’s Intensitatsanteile im Bereich zwischen850 und 1000 nm. Dieser Infrarot-Anteil lasst sich durch ein BG18-Filter eliminieren.

Abbildung 6.9: Emissionsspektrum der neuen blauen LED. Neben dem Intensitatsmaximumbei 475 nm besitzt die LED Anteile im Infrarot-Bereich zwischen 850 und 1000 nm.

In Abbildung 6.10 ist der Grad der Transmission adiabatisch (normiert auf 1) gegen dieWellenlange fur ein BG18 und ein RG780-Filter (jeweils 2 mm dick) aufgetragen. BG18-Filter konnen nur Wellenlangen zwischen 320 und 650 nm den Filter passieren. Wirdnun die Optode mit dem Micromanipulator uber drei neue blaue LED’s, deren Licht miteinem BG18-Filter gefiltert wird, positioniert, so ist keine scheinbare O2-Erhohung mehrzu registrieren (Abbildung 6.11).Hingegen ist bei RG780 gefiltertem Licht eine scheinbare O2-Erhohung vorhanden. Der

6.5.3 Einfluss der Lichtqualitat 51

Filter RG780 (Abbildung 6.10) lasst nur Wellenlangen großer als 780 nm durch, d.h.nur den Infraroten-Anteil des Lichtes. Abbildung 6.12 belegt, dass beim Ausschalten desLichtes die scheinbare O2-Erhohung zuruckgeht.

Abbildung 6.10: Transmissionsgrad diabatisch aufgetragen gegen die Wellenlange fur einBG18 und RG780-Filter.

In Abbildung 6.3 (Abschnitt 6.5.1) wurde das Ubersteuern des PMT bei Licht im rotenWellenlangenbereich dargestellt. Interessant an dem Kurvenverlauf ist, dass keine schein-bare Sauerstofferhohung zu erkennen ist. Dies konnte darin begrundet liegen, dass dieroten LED’s keinen infraroten Anteil aussenden und dadurch der Effekt des Lichtes derroten LED’s deutlich geringer ist. Bei Verwendung von roten LED’s wurde daher keinzusatzlicher Infrarot-Filter verwendet.Die aufgefuhrten Kontrollmessungen wurden sowohl mit der 1. als auch mit der 2. Ver-sion der Optoden durchgefuhrt. Es ergaben sich keine Unterschiede zwischen beidenAusfuhrungen der Messspitzen.

52 6.5 Testmessungen mit den Optoden

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 180021,0

21,5

22,0

22,5

23,0

23,5

24,0

Licht an

O2

[%]

t [s]

Abbildung 6.11: Beleuchtung der Messspitze mit dem Licht von drei BG18-gefilterten blau-en LED’s. Es ist keine scheinbare O2-Erhohung mehr zu erkennen. Es wurde eine gleitendeMittelwertbildung uber jeweils 400 s vorgenommen.

0 200 400 600 800 1000 120021,0

21,5

22,0

22,5

23,0

23,5

24,0

Licht aus

O2

[%]

t [s]

Abbildung 6.12: Der Infrarot-Anteil der BG780-gefilterten LED’s bewirkt die scheinbare O2-Erhohung, die sich nach dem Ausschalten der LED’s reduziert. Es wurde eine gleitende Mittel-wertbildung uber jeweils 100 s vorgenommen.

6.5.4 Abschatzung der Eignung des Microx 53

6.5.4 Abschatzung der Eignung des Microx

Um abschatzen zu konnen, ob das Microx fur photosynthetische Messungen an Blatterngeeignet ist, wird erneut Gleichung 6.4 (Abschnitt 6.5.1) betrachtet. Pro 1C Tempe-raturerhohung wird von der Optode eine scheinbare O2-Erhohung von 1.5% gemessen.Mit der klassischen Messmethode, der Clark-Elektrode, misst man fur ein Bohnenblatt in1000 s eine Konzentrationserhohung in geschlossener Kammer von ca. 2.5% (Abbildung4.6 Abschnitt 4.6). Nimmt man bei den Messungen mit Licht eine Temperaturerhohungvon 1C in 1000 s an, so ergibt sich:

YT =1.5%

1C·∆T =

1.5%

1C· 1C = 1.5% < 2.5% = YO2 (6.5)

YT bezeichnet die Veranderung der O2-Konzentration in 1000 s verursacht durch dieTemperatur und YO2 die Anderung in 1000 s durch das Bohnenblatt.Zwar ist die durch die Temperatur bedingte O2-Anderung geringer als die durch das Blatt,aber ein weiteres Problem ist, dass der O2-Gradient bei Messungen ohne Kammer zuschnell abgebaut wird. Aus den Photoakustischen Messungen ist bekannt, dass der durchdas Blatt entstandene Gasgradient außerhalb des Blattes in nur 30 ms wegdiffundiert.Das bedeutet, das Microx musste, wenn von einer O2-Anderung von 2.5% in 1000 sausgegangen wird, eine Anderung von 7.5·10−5% detektieren:

∆O2

t=

2, 5%

1000s=

7.5 · 10−5%

30ms(6.6)

Diese geringe Anderung kann selbst mit der Clark-Elektrode nicht mehr aufgelost werden.Das bedeutet, dass Messungen direkt an Blattern mit dem Microx nicht moglich sind. Umdas Problem des schnellen Abbaus des O2-Gradienten umgehen zu konnen, wird wie beimAufbau fur die Clark-Elektrode Sauerstoff in einer geschlossenen kleinen Messkammerdurch photosynthetisches Material angereichert und detektiert (Abschnitt 7.1).

54 7.1 Parallelmessung Microx und Clark-Elektrode

Kapitel 7

Messungen mit dem Microx

7.1 Parallelmessung Microx und Clark-Elektrode

In diesem Abschnitt wurde getestet, ob sich Microx und Clark-Elektrode vergleichenlassen. Ein wesentlicher Unterschied ist, dass die Clark-Elektrode die Erhohung der Sau-erstoffkonzentration eines kleinen abgeschlossenen Gasvolumens misst, wenn photosyn-thetisch aktives Material beleuchtet wird.Mit einer entsprechenden Messanordnung soll geklart werden, ob die Empfindlichkeit desMicrox hierbei ausreicht, die photosynthetische Aktivitat von Blattern zu detektieren.Der Vorteil, hoch ortsaufgeloste Messungen mit dem Microx durchfuhren zu konnen,wurde aufgegeben.

7.1.1 Aufbau

Abbildung 7.1 a) zeigt die Seitenansicht der Messanordnung. Eine Stahlkapillare, in diedie Stahlkapillare der Optode (Abbildung 6.2 Abschnitt 6.3) gesteckt wird, ist in einBundel von Lichtleiterfasern eingebettet worden. Diese Lichtleiterfasern sind in zwei ge-trennte Lichtleiterstrange zusammengefasst.Durch die beiden Lichtleiterstrange kann das Blatt wahlweise durch rote LED’s oderdurch gefiltertes Halogenlicht zur photosynthetischen Aktivitat angeregt werden.In Abbildung 7.1 b) ist der Messaufbau von unten dargestellt, und die Aussparung furdie Messspitze der Optode ist als Loch zu erkennen. Die Aussparung wird durch dieStahlkapillare erzeugt. In dieses Stahlkapillare kann die vom Durchmesser etwas kleinereStahlkapillare der Optode gesteckt werden. Das Plastikgehause der Optode kann mit derHalterung fixiert werden. Die Kapillare schließt mit dem Rohrchen nicht ganz ab. Dadurchkann die Messspitze der Optode, wenn sie etwa ausgefahren ist, nicht abbrechen, weil einGegensetzen ausgeschlossen ist.

7.1.2 Messungen an Blattern 55

Abbildung 7.1: a) Seitenansicht der Messanordnung b) Messanordnung von unten.

Die einzelnen Lichtleiter sind in einem Metallzylinder so gebundelt (Abb. 7.1 b)), dasssie nicht mit der Unterkante abschließen und dadurch ein kleines Volumen erzeugt wird.An der Unterkante des Zylinders sitzt ein O-Ring, so dass beim Aufsetzen auf ein Blattdas kleine Gasvolumen (ca. 5 ml) abgeschlossen wird.Weiterhin wird bei diesen Messaufbau gewahrleistet, dass auf den Farbstoff kein direktesLicht fallt und somit eine Ubersteuerung bei unisolierten Optoden vermieden (Abschnitt6.5.1).Um Parallelmessungen mit der Clark-Elektrode durchfuhren zu konnen, wird diese indie in Abschnitt 5.3 beschriebene Ruckwand der PA-Kammer eingespannt. Das Loch derVorderseite der Ruckwand der PA-Kammer schließt mit dem kleinen Gasvolumen desLichtleiterbundels ab, so dass sich ein abgeschlossener Messraum ergibt.

7.1.2 Messungen an Blattern

Fur Messungen an Blattern wird das Blatt zwischen dem O-Ring des Zylinders (Abb. 7.1b) Abschnitt 7.1.1), der die Lichtleiter bundelt, und der Vorderseite der Ruckwand derPA-Kammer eingeklemmt, so dass sich ein abgeschlossener Gasraum ergibt.Als Lichtquelle zur Anregung des Photosyntheseapparates des Blattes wird Halogenlichtverwendet, das durch ein Warme- und ein BG18-Filter gefiltert wird. Die Lichtintensitatbetragt 200 µmol m−2 s−1.

56 7.1 Parallelmessung Microx und Clark-Elektrode

Bei den Messungen an Bohnenblattern ergab sich, dass die Clark-Elektrode den erwar-teten Effekt zeigte, die Optode hingegen nicht. Abbildung 7.2 zeigt die ansteigende O2-Konzentration in dem kleinem geschlossenem Volumen bei Beleuchtung des Blattes.

0 200 400 600 800 1000

1068

1072

1076

1080

Licht an

O2

[a.

u.]

t [s]

Abbildung 7.2: Steigende O2-Konzentration in dem Messvolumen bei Beleuchtung eines Boh-nenblattes gemessen mit der Clark-Elektrode. Es wurde eine gleitende Mittelwertbildung uberjeweils 100 s vorgenommen.

Kontrollmessungen ohne Bohnenblatt zeigten bei der Clark-Elektrode bei Lichtzugabe,wie in Abschnitt 4.5 und Abschnitt 5.4 bereits diskutiert wurde, keine Erhohung desSignals.Die parallel zu Abbildung 7.2 aufgenommenen Messwerte der Optode (Abbildung 7.3)zeigen zwar ebenfalls eine Erhohung der O2-Konzentration in dem Messvolumen. Je-doch zeigten Testmessungen ohne photosynthetisch aktives Material bei Beleuchtung einescheinbare Sauerstoffentwicklung, die etwa so groß war wie die mit Bohnenblatt. In Abbil-dung 7.3 sind beide Messungen fur den Phasenwinkel ϕ := ∆Φ dargestellt. Phasenwinkelund O2-Konzentration hangen uber Gleichung 6.3 Abschnitt 6.2 miteinander zusammen.Fallende Werte fur den Phasenwinkel bedeuten einen Anstieg der O2-Konzentration. AusAbbildung 7.3 wird deutlich, dass mit und ohne Blatt das Fallen der Werte des Phasen-winkels und somit das Steigen der Sauerstoffkonzentration identisch sind.

7.2 Messung an isolierten Zellen von Maispflanzen 57

0 400 800 1200 1600 200031,0

31,1

31,2

31,3

31,4

31,5

31,6

31,7

31,8

Licht an

Messung an Bohne

Testmessung an

Computerpapier

[D

EG

]

t [s]

Abbildung 7.3: Messungen mit dem Microx mit und ohne Blatt. Fallende Phasenwinkelwertebedeuten einen Anstieg in der O2-Konzentration.

Trotz warmegefilterten Halogenlichts ist der Kurvenverlauf charakteristisch fur einenTemperatureffekt. Dies zeigt, dass selbst eine Anreicherung des Sauerstoffes nicht aus-reicht, damit die Empfindlichkeit des Microx die der Clark-Elektrode erreicht.

7.2 Messung an isolierten Bundelscheiden- und Me-

sophyllzellen von Maispflanzen

Da das Microx eine raumlich aufgeloste Messung uber dem Blatt nicht ermoglicht, wiedie Vorversuche zeigten, wird hier ein alternativer Weg gesucht. Die Bundelscheiden-und Mesophyllzellen werden isoliert (Abschnitt 7.2.2) und in der Nahrlosung dem Lichtausgesetzt. Sie geben dann, wie aus entsprechenden Messungen mit Algenzellen (z.B.im Praktikumsversuch der Kieler Arbeitsgruppe fur Biophysik) bekannt ist, O2 an dasWasser ab, der dort nachgewiesen wird. Hier allerdings soll der Nachweis nicht mit derClark-Elektrode gefuhrt werden, sondern mit dem Microx, da die Messsonde von denAusmaßen sehr klein ist. Aufgrund der Schwierigkeit des Isolationsverfahrens lassen sichnicht sehr viele Zellen herstellen, deshalb ist es wunschenswert, in einem sehr kleinenVolumen zu messen, in dem vorher die Zellen durch ein Filter aufkonzentriert werden.Fur diese Messungen musste das Microx sich besser eignen.

58 7.2 Messung an isolierten Zellen von Maispflanzen

7.2.1 Motivation fur die Messungen an Bundelscheiden- undMesophyllzellen

In Abschnitt 2.7 wurde die ortliche Trennung der Photosyntheseprozesse auf Mesophyll-und Bundelscheidenzellen bei C4-Pflanzen beschrieben. Durch diese ortliche Trennungkonnen mit geeigneter Messmethode an den C4-Pflanzen die Bedeutung und Abhangig-keiten der Prozesse untersucht werden. Diese Moglichkeit gibt es bei C3-Pflanzen nicht,da deren Photosyntheseprozesse nicht raumlich getrennt stattfinden.Eine Motivation fur die getrennte Untersuchung von Mesophyll- und Bundelscheidenzel-len sind die Ergebnisse der O2-Messung mit der Clark-Elektrode an C4-Pflanzen unterCO2-Verarmung. In Abschnitt 5.1 wurde die Sattigung der O2-Konzentration in einerMesskammer mit dem Blatt einer C3-Pflanze gemessen mit der Clark-Elektrode betrach-tet. Bei den C4-Pflanzen ist dieser Sattigungseffekt zuerst ebenso vorhanden, jedochtritt ein weiterer Anstieg in der O2-Konzentration auf (Abbildung 7.4, gemessen von K.Schinner). Dargestellt ist die O2-Rate, die sich durch Differenzierung aus der mit derClark-Elektrode gemessenen Anderung der O2-Konzentration der Messkammer ergibt.Diese Zweiphasigkeit wirft die Frage auf, ob durch die Mesophyllzellen zeitverzogert CO2

bereitgestellt worden ist und dadurch erneut eine O2-Entwicklung durch das Blatt statt-fand. Dies musste sich vermutlich in unterschiedlicher O2-Entwicklung von Mesophyll-und Bundelscheidenzellen zeigen.

0 200 400 600 800 1000 1200

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

d/d

tO

2[p

pm

/s]

t [s]

Abbildung 7.4: Vorhandensein einer zweiten O2-Sattigung bei C4-Pflanzen. Dargestellt ist dieO2-Rate, die sich durch Differenzierung aus der mit der Clark-Elektrode gemessenen Anderungder O2-Konzentration der Messkammer ergibt.

7.2.2 Isolation von Bundelscheiden- und Mesophyllzellen von Maispflanzen 59

7.2.2 Isolation von Bundelscheiden- und Mesophyllzellen vonMaispflanzen

Die Isolation von Bundelscheiden- und Mesophyllzellen der Maispflanzen habe ich nachdem von Keunecke (1999) weiterentwickelten Verfahren durchgefuhrt. Das vorletzte Blatt(meist das 4. von 5) von zwischen 3 bis 4 Wochen alten Maispflanzen wurde ein etwa 5cm langes Stuck aus der Mitte des Blattes herausgeschnitten. Damit die Enzymlosung biszu den Mesophyll- und Bundelscheidenzellen diffundieren kann, wurde mit einer wasser-gefullten 50 ml Spitze, in denen sich die Blattabschnitte befanden, ein Uberdruck ange-legt, der die Luft aus den Interzellularen presst. Beim langsamen Nachlassen des Druckeslauft in das Blatt Wasser. Eine dreimalige Wiederholung des Vorgangs genugte, um dieLuft nahezu vollstandig aus dem Blatt zu entfernen. Anschließend wurde vorsichtig miteiner Pinzette die Epidermis abgezogen. Bevor die Blattstucke in die Enzymlosung (1.5%Zellulase, 0.5% Macerozyme (Yakult Honsha), 2.0% Pectinase (Sigma Chemie), 0.5%BSA (Sigma Chemie), 5 mM CaCl2, 0.5 M Sorbitol, pH 6.5, gepuffert mit Tris/Mes)gesetzt wurden, wurden sie in der Langsrichtung angeritzt. Nach 70 Minuten in der En-zymlosung bei einer Temperatur von 33C wurden die Blattstucke in eine kleine Schalemit einer Losung aus (alle Angaben in mM) 10 KCl, 2 MgCl2, 5 CaCl2, pH 7.2 (Tris/Mes),550 mOsm (Sorbitol) umgefullt. Dort wurden die Leitbundelstrange mit Prapariernadelnauseinandergezogen. Bei diesem Vorgang losten sich nur die Mesophyllzellen von denStrangen, da die Bundelscheidenzellen von einer Suberin-Schicht umgeben sind und erstdurch langeres Einwirken der Enzymlosung vom Faserstrang abgelost werden. Um dieBundelscheidenzellen von den Leitbundelstrange zu trennen und die noch vorhandenenMesophyllzellen zu zerstoren, wurden die Strange 60 Minuten lang in erneut in die En-zymlosung gegeben. Nach dieser Zeit wurden die Leitbundelstrange ohne Enzymlosung inein Schalchen mit einer Losung wie bei den Bundelscheidenzellen umgefullt. Nach einerVerweildauer von 15 Minuten wurden die Fasern auf ein Sieb (100 µm) gelegt und mitgleicher Losung, aber geringerer Osmolaritat (450 mOsm) aus den Fasern gespult.

7.2.3 Messaufbau zur Elimination des Temperatureffektes

Um an isolierten Maiszellen mit dem Microx messen zu konnen, ist es notwendig, einenVersuchsaufbau so zu gestalten, dass bei den Optoden kein Temperatureffekt auftretenkann.Die Optode wird mit dem Mikromanipulator so positioniert, dass ihre Messspitze in einkleines Messgefaß ragt. Dieses Gefaß wird fur Kontrollmessungen mit destilliertem Wassergefullt. Die Flussigkeitsmenge entspricht der bei Messungen an isolierten Bundelscheiden-bzw. Mesophyllzellen verwendeten. Die Beleuchtung, bestehend aus drei neuen blauenLED’s, wird unter das Messgefaß positioniert. Somit ergibt sich eine Lichtintensitat vonca. 400 µmol m−2 s−1 im destillierten Wasser bzw. in der Flussigkeit mit den isoliertenZellen.An Abbildung 7.5 ist zu erkennen, dass das Rauschen zwar weiterhin noch groß ist,jedoch ist kein Aufwartstrend bei Licht zu erkennen. Mit diesem Versuchsaufbau war esalso moglich, Messungen an isolierten Maiszellen ohne Temperatureffekt vorzunehmen.

60 7.2 Messung an isolierten Zellen von Maispflanzen

0 200 400 600 800 100012,5

13,0

13,5

14,0

14,5

15,0

15,5 Licht anO

2[%

]

t [s]

Abbildung 7.5: Kontrollmessung im destillierten Wasser. Die Flussigkeitsmenge entsprachder bei Messungen an isolierten Bundelscheiden- bzw. Mesophyllzellen verwendeten. Beleuch-tet wurde durch 3 neue blaue LED’s, die sich unterhalb des Messgefaßes befanden, mit einerIntensitat von ca. 400 µmol m−2 s−1.

7.2.4 Messungen an isolierten Zellen

Mesophyll- und Bundelscheidenzellen wurden nach dem in Abschnitt 7.2.2 beschriebenenVerfahren isoliert.Weder bei Lichtzugabe noch bei Dunkelheit war bei den Messungen an isoliertenBundelscheiden- bzw. Mesophyllzellen ein Trend in den Werten der O2-Konzentrationzu erkennen. Zur Veranschaulichung ist ein typischer Messverlauf fur Mesophyllzellen inAbbildung 7.6 dargestellt.Dieser dargestellte Verlauf ist identisch zu dem von Bundelscheidenzellen.Diese Messungen haben gezeigt, dass sich mit vorliegendem Aufbau zwar der Tempera-tureffekt auf die Optoden umgehen lasst, jedoch reicht die Empfindlichkeit der Optodefur Messungen an isolierten Zellen nicht aus.

7.3 Messung an der Grunalge Chara corallina 61

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 140018,0

18,5

19,0

19,5

20,0

20,5

21,0

Licht an

O2

[%]

t [s]

Abbildung 7.6: Messung an isolierten Mesophyllzellen. Weder bei Lichtzugabe noch bei Dun-kelheit ist ein Trend in den Werten der O2-Konzentration zu erkennen.

7.3 Messung an der Grunalge Chara corallina

Nachfolgende Messungen an der Grunalge Chara corallina wurden auf Anraten des Her-stellers des Microx vorgenommen. Seiner Meinung nach sollte sich im Wasser ein O2-Gradient starker und stabiler auspragen. Obwohl sich dieser Effekt in den Messungendes Abschnittes 7.2.4 nicht bestatigte, sollte dies noch einmal uberpruft werden, da esMessungen von den Entwicklern des Microx gibt, die fur dieses Prinzip sprechen. DieEntwickler fuhrten O2-Messungen mit den Optoden am Meeresgrund an phototrophenMicroalgen in einem kustennahen sandigen Sediment durch (Klimant et al., 1996).Aufgrund der dort gemachten Aussagen schien es moglich, dass die Empfindlichkeit derOptode ausreichen konnte. Doch die nachfolgenden Messungen warfen starke Zweifel auf.

7.3.1 Messaufbau und Messung

Ein paar Pflanzenstrange der Grunalge Chara corallina wurden in ein Becherglas mitNahrlosung gesetzt. Die Beleuchtung erfolgte unterhalb des Becherglases mit mehrerenroten LED’s, so dass im Becherglas eine Lichtintensitat von ca. 300 µmol m−2 s−1 vorlag.Mit dem Micromanipulator wurde die Messspitze der Optode moglichst dicht vor einemPflanzenstrang positioniert.Aus Abbildung 7.7 ist ein linearer Anstieg der Sauerstoffkonzentration bei Lichtzugabezu erkennen. Wie bereits in Abschnitt 7.1.2 erwahnt, bedeutet ein sinkender Wert furden Phasenwinkel ϕ ein Steigen in der Sauerstoffkonzentration.

62 7.3 Messung an der Grunalge Chara corallina

0 500 1000 1500 2000 250030,2

30,4

30,6

30,8

31,0

31,2

31,4

31,6Licht an

[D

EG

]

t [s]

Abbildung 7.7: Messung an Chara corallina: Die Messspitze der Optode wurde dicht vor einenStrang der Alge Chara corallina positioniert. Unterhalb des Becherglas, in dem sich die Alge inNahrlosung befand, wurde mit roten LED’s eine Lichtintensitat von 300 µmol m−2 s−1 erzeugt.Fallende Phasenwinkelwerte bedeuten das Steigen der O2-Konzentration. Bei den Messwertenwurde eine gleitende Mittelwertbildung uber 100 s vorgenommen.

Wird jedoch die Messung mit der Optode im destilliertem Wasser ohne photosynthe-tisch aktives Material wiederholt, so ist bei Lichtzugabe ebenso ein Anstieg in der O2-Konzentration vorhanden (Abbildung 7.8). Die Steigung der Kontrollmessung ist zwargeringer, aber da die Form der Kurven bei beiden Messungen identisch ist, ist daraus zuschließen das die gleiche Ursache diese bedingt. Dass die an Chara corallina gemesseneKurve eine großere Steigung hat, konnte dadurch zustande kommen, dass die grune Algedas Licht besser absorbiert und dadurch die Veranderung der O2-Konzentration starkerist.

7.3.1 Messaufbau und Messung 63

-1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

32,1

32,2

32,3

32,4

32,5

Licht aus

[D

EG

]

t [s]

Abbildung 7.8: Kontrollmessung im destillierten Wasser ohne Chara corallina: Bei Lichtzuga-be fallen die Phasenwinkelwerte, das heißt, dass die O2-Konzentration in dem mit destilliertenWasser ohne Alge gefullten Becherglas anwachst. Der Effekt ist mit identischer Steigung oh-ne Licht rucklaufig. Bei den Messwerten wurde eine gleitende Mittelwertbildung uber 500 svorgenommen.

Abbildung 7.9: Veranderung der O2-Konzentration gemessen von Klimant et al. (1996)wahrend alternierenden Licht-Dunkelphasen an einer kustennahen Meeresschicht mit Zyanbak-terien.

64 7.3 Messung an der Grunalge Chara corallina

Diese Ergebnisse ließen an den im Folgenden vorgestellten Messungen von Klimant etal. (1996) zweifeln. Ebenso wie bei den Messungen an Chara corallina scheint das Lichtden Anstieg in der O2-Konzentration hervorzurufen und nicht das photosyntetisch aktiveMaterial.Die Veranderung der O2-Konzentration wurde von Klimant et al. (1996) wahrend al-ternierenden Licht-Dunkelphasen an einer kustennahen Meeresschicht mit Zyanbakteriengemessen. In Abbildung 7.9 ist das Ergebnis der Messung dargestellt.Auffallig an dem Kurvenverlauf ist, dass innerhalb von funf Minuten die O2-Konzentration um ca. 25% ansteigt und ca. in sieben Minuten auf den ursprunglichenO2-Konzentrationswert zuruckfallt.Vergleicht man diesen Kurvenverlauf mit dem in Abbildung 6.4 (Abschnitt 6.5.2) darge-stellten Temperatureffekt der Optoden, so fallt auf, dass die Kurvenverlaufe fast identischsind. Es ist daher die Frage, ob es sich bei dem von Klimant et al. (1996) gemessenen Kur-venverlauf nicht eher um die Auszeichnung eines Temperatureffekt der Optoden handelt.Zudem der Anstieg in der O2-Konzentration mit 25% sehr hoch ist. Es ist bemerkens-wert, dass von Klimant et al. (1996) keine Kontrollmessungen ohne photosynthetischesMaterial aufgefuhrt wurden.

7.4 Fazit 65

7.4 Fazit

Bei den erwahnten Messungen in Luft mit offenem Volumen (Abschnitt 6.5.4) und beiden Messungen in Flussigkeiten (Abschnitte 7.2.4 und 7.3) ist der Sauerstoffgradientzu gering, weil die Gradienten durch die Gasdiffusion schnell abgebaut werden. Jedochselbst bei den Messungen an einem geschlossenem Volumen reicht die Empfindlichkeitdes Microx nicht aus, um den Anstieg der O2-Konzentration bei Beleuchtung an Blatternzu detektieren (Abschnitt 7.1.2).Zur Problematik der zu geringen Empfindlichkeit des Microx kommt das in Abschnitt6.5.2 diskutierte Problem hinzu, dass die Optoden im großeren Maße auf Temperaturun-terschiede reagieren als auf Konzentrationanderungen von Sauerstoff.Die einzige Moglichkeit mit dem Microx zu messen, ist an Prozessen, die zum einen nichtsynchron zum Lichtprogramm laufen, zum anderen Prozesse, deren Zeitkonstanten imMinutenbereich liegen, da aufgrund des starken Rauschen des Microx die Effekte im Se-kundenbereich uberdeckt werden. Ein Beispiel fur solch einen Prozess sind Schwingungenin der Atmungskette. Diese Schwingungen konnen spontan auftreten.Abbildung 7.10 zeigt moglicherweise eine solche Schwingung in der Atmungskette gemes-sen an isolierten Bundelscheidenzellen.

0 1000 2000 3000 4000

13

14

15

16

17

18

O2

[%]

t [s]

Abbildung 7.10: Bei der dargestellten Messung konnte es sich moglicherweise um einen spon-tan aufgetretenden Schwingungsprozess in der Atmungskette, gemessen an isolierten Bundel-scheidenzellen, handeln.

66 8.1 Motivation fur die Messungen mit dem Massenspektrometer

Kapitel 8

Das Massenspektrometer

Das Microx erwies sich als ungeeignet fur hochortsaufgeloste O2-Messungen (Kapitel6 und 7). Ein neuer Ansatz, der hier erstmals realisiert wurde, besteht darin, mit ei-nem Massenspektrometer durch Koppelung mit einer Patch-Clamp-Pipette hohe Orts-auflosung zu erreichen. Anwendungsbeispiele ergeben sich, wie bereits in der Einleitungerwahnt, aus der ortsaufgelosten Verteilung von Gasflussen an Blattern. So konnten dieunterschiedlichen photosynthetischen Aktivitaten von Bundelscheiden- und Mesophyll-zellen (Abbildung 2.6 Abschnitt 2.7) der Maispflanze unterschieden werden (allerdingsnur nach Abziehen der Epidermis). Am intakten Blatt konnte die Unterscheidung in denGasflussen von Blattregionen, die von einem Pathogen (Pilz, Virus) befallen sind, vor-genommen werden. Hier weiß man, dass die Gasflusse verandert sind (Bastiaans, 1991;Jakob et al., 1997; Madrid et al., 1999; Raggi, 1995; Zuckermann et al., 1997).

Bei diesem neuen Messverfahren wird die Gasatmosphare des Messobjektes durch eineArt kunstliches Leck detektiert, welches durch Messpipetten mit Offnungen von weni-gen µm erzeugt, und in einer auf Ultrahochvakuum evakuierten Kammer mittels einesMassenspektrometers analysiert. Mit diesem neuen Messverfahren kann die gesamte Gas-zusammensetzung untersucht werden.

8.1 Motivation fur die Messungen mit dem Massen-

spektrometer

Zwar sind Massenspektrometer zur Detektion der Gasflusse von photosynthetisch aktivenMaterial bereits eingesetzt worden, jedoch nie mit hochster Ortsauflosung an intaktenPflanzen. Den bisher benutzten Verfahren gemeinsam ist die Benutzung von Isotopen,denn in Abschnitt 6.5.4 ist abgeschatzt worden, dass die Anderung der O2-Konzentrationdirekt an Luft gemessen bei Beleuchtung von photosynthetisch aktivem Material aufgrunddes schnellen Abbaus des Gasgradienten sehr gering ist.

Zum Beispiel ist von Avelange et al. (1991) der Gasaustausch einer Zellsuspension aus Di-anthus Caryophyllus mit kunstlichen Isotopen von Sauerstoff und CO2 (18O2 und 13CO2)gemessen worden. Dazu befand sich die Zellsuspension in einem mit einer Teflonmembranbespannten Messgefaß. Das aus der Zellsuspension in das Massenspektrometer diffundie-rende Gas wurde so ohne Ortsauflosung analysiert.

Das Neue im hier vorgestellten Aufbau sind Glaspipetten als auswechselbare Messson-den, die in der Kieler Arbeitsgruppe fur Biophysik fur Patch-Clamp Versuche verwendet

8.2 Aufbau und Funktionsweise 67

werden und einen Spitzendurchmesser von einem bis funf µm aufweisen. Weiterhin solluberpruft werden, ob Messungen ohne zusatzliche kunstliche Isotope durchgefuhrt wer-den konnen. So konnten dann Messungen an Blattern von intakten Pflanzen vollzogenwerden.

8.2 Aufbau und Funktionsweise

Der verwendete Messaufbau ist in Abbildung 8.1 dargestellt. Durch eine Messpipette(Abschnitt 8.2.2), deren Offnung ca. 1 µm groß ist, wird in der Ultrahochvakuumkammerein kunstliches Leck erzeugt. Die Messpipetten sind auswechselbar. Eine Quetschdichtungermoglicht die vakuumgeeignete Verbindung der Messpipette mit dem Rohr, das zurMesskammer fuhrt.

Abbildung 8.1: Schematischer Aufbau der Apparatur: Durch die Messpipette (Kunstleck)kann die Gasatmosphare des Messobjektes in die durch eine Drehschieber- und eine Turbomole-kularpumpe (rechts in der Abbildung) auf Ultrahochvakuum evakuierte Messkammer gelangen.Eine Quetschdichtung ermoglicht die vakuumgeeignete Verbindung der Messpipette mit demRohr, das zur Messkammer fuhrt. An dem Filament des Massenspektrometers werden die Gas-molekule ionisiert. Das Ventil trennt die Messkammer von den Pumpen ab, so dass die Leckrate(Abschnitt 8.1) bestimmt werden kann.

So kann, wenn die ubrige Apparatur leckfrei ist (Abschnitt 8.3.1), nur Gas durch dieSpitze der Messpipette in die Kammer gelangen. Die Molekule des Gases werden an

68 8.2 Aufbau und Funktionsweise

dem Filament des Massenspektometers ionisiert (Abschnitt 8.2.1) und im Massenspek-trometer ihre Anzahl, nach Elementen getrennt, bestimmt. Die Anzahl wird als jeweiligerPartialdruck auf dem Ausgabegerat des Massenspektrometers angezeigt.Das Massenspektrometer muss bei einem Druck kleiner 10−4 mbar (Hochvakuum-Bereich)betrieben werden. Um diesen Druck zu erreichen, wird die Apparatur mit zwei in Reihegeschalteten Vakuumpumpen, einer Vorvakuumpumpe und einer Ultrahochvakuumpum-pe, evakuiert. Als Vorvakuumpumpe dient eine Drehschieberpumpe, die Drucke bis 10−3

mbar ermoglicht. Sie erzeugt einen Vorvakuumdruck, der den Einsatz einer vorgeschal-teten Turbomolekularpumpe ermoglicht. Sonst konnten hohe Teilchendichten bei hohenDrucken die Turbomolekularpumpe bei den erforderlichen Geschwindigkeiten thermischzerstoren bzw. ihre hohen Laufgeschwindigkeiten unterbinden. Die direkt an die Kammerangeflanschte Turbomolekularpumpe ermoglicht so einen Enddruck in diesem Aufbau vonca. 10−7 mbar.Zur Leckratenbestimmung (Abschnitt 8.3.2) ist in die Apparatur extra ein Ventil, das dieMesskammer von den Pumpen abtrennt, eingebaut worden.Die Lange des Rohres, an dem die oben erwahnte Quetschdichtung befestigt ist,ermoglicht es mit einem Mikroskop gleichzeitig dicht genug unter die Messkammer undvor die Messpipette zu gelangen.Das Messobjekt kann durch einen in xyz-Richtung verstellbaren Tisch (in Abbildung 8.1nicht dargestellt) unter der Messpipette verschoben werden.Ein solcher Aufbau, in welchem ein Druckgradient von bis zu zehn Großenordnungen ohnedifferentielle Pumpstufen anliegt, ist auch in der Oberflachenphysik, die standardmaßigmit Ultrahochvakuumanlagen arbeitet, neuartig und stellt einerseits hohe Anforderun-gen an die Vakuumpumpen und andererseits an die Qualitat der verwendeten Messpipet-ten. Die zu beseitigenden technischen Schwierigkeiten sind unter anderem die Dampfungvon Vibrationen, die Integration eines Mikroskops in den Messaufbau zur Analyse vonMessspitze und Probe, die Kombination geeigneter Manipulatoren zur Verstellung desProbenortes und schließlich die Auswahl geeigneter Vakuumbauteile.

8.2.1 Das Quadrupol-Massenspektrometer

Der schematische Aufbau des Massenspektrometer VG Quadrupoles (VG QuadrupolesLtd., Cheshire, England) ist in Abbildung 8.2 dargestellt, und die Funktionsweise wirdkurz erlautert (Edelmann, 1998).In der Elektronenstoß-Ionenquelle (1) (Abb. 8.2 a)), dem Filament, werden die eintreten-den Gase an einem dunnen Metallfaden ionisiert. Die entstandenen Ionen werden durchdie Extraktorblende (4) als feiner Strahl langs der z-Achse in das von den vier parallelenStaben (Abb. 8.2 b)) erzeugte elektrische Feld geschossen. Diese vier zylindrischen Stabedienen als Analysator, von denen jeweils gegenuberliegende gleiches elektrisches Potentialbesitzen. Die beiden zueinander senkrecht angeordneten Stabpaare haben gegenuber Erdeeine Spannung von +(U + V cos ωt) bzw. -(U + V cos ωt). Wobei U eine Gleichspan-nung und V eine Wechselspannungsamplitude ist. Durch diese Anordnung von Gleich-und Wechselspannungsfeld werden nur Ionen mit bestimmtem Masse/Ladungsverhaltnisauf einer stabilen Bahn durch das Feld zur Nachweiselektronik gefuhrt. Alle anderen Io-nen beschreiben eine instabile Bahn und treffen auf einem der vier parallelen Stabe. Dortwerden sie entladen und tragen so nicht zum Ausgangssignal bei.

8.2.2 Die Messpipetten 69

Abbildung 8.2: Schematischer Aufbau des Quadrupol-Massenspektrometers: a) 1 Kathode, 2Anode, 3 und 4 Extraktionselektroden, 6 Ionenfanger, 5 zur Nachweiselektronik. b) Querschnittdes Analysators mit zwei Stabpaaren, die einen Abstand von 2r0 haben (Edelmann, 1998).

8.2.2 Die Messpipetten

Die Messspitzen, die das erwunschte Leck erzeugen, sind aus Glasrohrchen gezogene Pi-petten. Ausgangsmaterial sind ca. 5 cm lange Glasrohrchen, die einen 1,0 mm großenInnendurch- und einen 1,5 mm großen Außendurchmesser besitzen. Diese werden in dasPipettenziehgerat (PIP5, Heka, Lambrecht, Deutschland) jeweils unten und oben einge-spannt. Der mittlere Teil ist von einer Gluhwendel umschlossen. Der einzustellende Strom(ca. 20 A) durch die Gluhwendel beeinflusst die Große der Spitzen. Beim Ziehen wird dasGlas in der ersten Stufe durch Hitzeeinwirkung in der Mitte verjungt. In der zweiten Stufewird es soweit erhitzt, dass das Glas abreißt und die Pipetten entstehen. Die gezogenenSpitzen haben einen Durchmesser im Bereich von 1 µm (nach ElektronenmikroskopischenAufnahmen von Plieth (1995)) und wurden bei Werten von A = 6.55 und B = 4.15 Ska-lenteile des Pipettenziehgerates hergestellt. Spitzen, die bei Werten kleiner als B = 4.15gezogen werden, sind ungeeignet. Ihre Spitzendurchmesser sind zu groß (entsprechend dieLeckrate), so dass die Messkammer aufgrund einer zu großen Leckrate (Abschnitt 8.1)nicht auf einen geeigneten Druck evakuiert werden kann. Die bei Werten großer als B =4.15 erzeugten Spitzen haben einen zu kleinen Durchmesser, so dass keine ausreichendeGasmenge in die Kammer eintreten kann.

Selbst Spitzen, die bei gleichen Einstellungen am Gerat gezogen werden, konnen aufgrunddes Geratefehlers in ihrer Große geringfugig variieren. Die Eignung der Messpipetten kannmit dem Massenspektrometer an der Gaszusammensetzung bzw. der zugehorigen Parti-aldrucke erkannt werden. Das Gas in der Kammer setzt sich zusammen aus dem durch dieSpitze eintretenden Gas und von den Wanden desorbierenden Gas (uberwiegend Wasser,siehe auch Abschnitt 8.1). Die durch die Spitze eintretenden Gase sind uberwiegend N2

und O2 im Verhaltnis der Luftzusammensetzung. Eine Spitze wird fur geeignet befunden,wenn die einstromenden Gase N2 und O2 mit ihren Partialdrucken oberhalb dem vonWasser liegen. Dadurch ist gewahrleistet, dass die im Massenspektrometer analysierteGasmenge im wesentlichen durch die Pipette einstromt. Dabei ist allerdings zu beach-ten, dass ein Druck von 10−5 mbar nicht uberschritten wird, weil sonst eine zu geringeAnderungsempfindlichkeit vorliegt.

Grundsatzlich wurden hier zwei verschiedene Typen von Messpipetten verwendet. Un-

70 8.3 Vorversuche mit dem Massenspektrometer

veranderte Messpipetten und Messpipetten, die mit einem Glasrohrchen ummantelt sind.Anfangs wurde vermutet, dass sich mit den normalen Messpipetten die direkte Gaszu-sammensetzung ermitteln lasst und sich mit den ummantelten Messpipetten Akkumula-tionsmessungen durchfuhren lassen. Dies geschieht, indem das knapp uber die Messspitzehervorstehende Glasrohrchen direkt auf das Messobjekt aufgesetzt wird. So entsteht einkleines Volumen zwischen der Spitze und der Probe, in dem sich Gase sammeln.Messungen aus Abschnitt 8.4.2 zeigen jedoch, dass sich nicht ummantelte und ummantelteMesspipetten, wenn der Abstand Messpitze-Glasrohrchenrand um 40 µm liegt, in ihremDetektionsverhalten fur Gase nicht unterscheiden. Der Grund ist wahrscheinlich, dass dieTiefe des Volumens bei ummantelten Spitzen wegen des langen Verjungungsabschnittesder Pipetten zu groß ist im Vergleich zum Spitzendurchmesser.Vorteilhaft allerdings ist, dass die Glasummantelung gegen Einflusse, wie z.B. Kollision,schutzt und die Pipetten somit praxistauglicher sind. Die Pipetten werden im folgendenVerfahren ummantelt: Das Glas der Pipette wird an der Stelle, zu der das Glasrohr-chen ubergestulpt werden soll, mit UHU-Endfest Kleber (UHU Vertrieb Buhl (Baden),Deutschland) bestrichen. Danach wird das Glasrohrchen uber das Glas geschoben. An-schließend wird unter dem Mikroskop die Position der Pipettenspitze im Glasrohrchenuberpruft. Die ummantelten Pipetten kommen, um den Kleber auszuharten, fur funfMinuten in einen Heizofen bei 180C.Um die Apparatur auf Undichtigkeiten zu uberprufen (Abschnitt 8.3.1) und um die Leck-rate bestimmen zu konnen (Abschnitt 8.3.2), wird die Spitze einer Messpipette mit demKleber abgedichtet und wie oben im Heizofen ausgehartet.

8.3 Vorversuche mit dem Massenspektrometer

8.3.1 Untersuchung des Messaufbaues auf Undichtigkeiten

Um den Messaufbau auf unerwunschte Undichtigkeiten zu uberprufen, wird eine abge-dichtete Messpipette (Abschnitt 8.2.2) in die Apparatur gespannt und die Apparatur mitHelium bespruht. Helium hat aufgrund seiner geringen Massenzahl und des Edelgascha-rakters einen geringen Querschnitt, so dass es selbst durch kleinste Lecks in die Kammerdiffundieren kann.Wenn Helium-Gas durch ein Leck in die Apparatur gelangt, wird dies durch einen Anstiegdes Partialdruckes fur Helium auf dem Ausgabegerat des Massenspektrometers sichtbar.Nach Beseitigung aller unerwunschten Lecks und Montage einer durchlassigen Pipettekann getestet werden, ob Stickstoff durch das kunstlich erzeugte Leck in die Kammerdiffundieren kann. Stickstoff hat aufgrund der Massenzahl 28 fast so große Molekule wiez.B. Sauerstoff (Massenzahl 32), der bei den Messobjekten detektiert werden soll, undist damit besser geeignet als Helium (Massenzahl 4) zum Testen der Durchlassigkeit derMessspitze.

8.3.2 Leckratenbestimmung

Um abschatzen zu konnen, wie viel Gas durch das kunstlich erzeugte Leck in die Kammerdiffundiert im Gegensatz zur Desorptionsrate von den Kammerwanden, wurde die Leck-rate sowohl mit normaler Messspitze als auch mit abgedichteter Messspitze (Abschnitt8.2.2) aufgenommen.

8.3.3 Drift 71

Die Leckrate L ist definiert als die Gasmenge, die durch reelle und/oder virtuelle Lecksverursacht wird (Gleichung 8.1). Unter reellen Lecks werden solche verstanden, die durchGaseinstromung von außen zustande kommen. Bei virtuellen Lecks entsteht ein Druck-anstieg aufgrund der Gasabgabe der Behalterwande. Bei der Bestimmung der Leckrate Lwird der Druckanstieg ∆p in der Zeit ∆t im Rezipienten mit dem Volumen V gemessen:

L =∆p · V

∆t(8.1)

Hierzu mussen die beiden Pumpen von dem Volumen, in dem sich das Massenspektro-meter befindet, mittels des Ventils (Abbildung 8.1) abgetrennt werden.Bei der Messung mit abgedichteter Messspitze wird die Leckrate durch die virtuellenLecks bestimmt.Anschließend wird die Leckrate mit einer normalen Messspitze aufgenommen. Die Diffe-renz der beiden Leckraten gibt Aufschluss daruber, wie oben erwahnt, wie viel Gas durchdie Messspitze stromt.Das Volumen des Rezipienten entspricht ungefahr V = 2.5 l.

∆p[mbar] ∆t[s] L[mbar·ls

]virtuelle Lecks 1.6·10−7 4.4 9.1·10−8

virtuelle L. + Pipette 3.2·10−7 2.7 2.96·10−7

Pipette 2.1·10−7

Tabelle 8.1: Leckratenbestimmung: Aus der gemessenen Druckanderung ∆p pro Zeitintervall∆t lassen sich mit Gleichung 8.1 die Leckraten L berechnen.

Der Tabelle 8.1 ist zu entnehmen, dass das durch die Pipette registrierte Gas um mehrals das Doppelte großer ist als das durch Desorbtion verursachte Gas.

8.3.3 Drift

Die beiden Vakuumpumpen evakuieren den Rezipienten permanent wahrend der Betriebs-zeit. Eine vollstandig abgedichtete Vakuumkammer erreicht gewohnlich ihren Enddruckerst nach ca. drei Wochen aufgrund fortwahrender Desorbtion von Gasen aus den Kam-merwanden. Das bedeutet, dass sich die Partialdrucke der detektierten Elemente trotzgleichbleibender externer Gasatmosphare geringfugig verkleinern. Abbildung 8.3 zeigtbeispielhaft die zeitliche Veranderung der Partialdrucke von CO2,

13CO2 und O2.Bei den spateren Messungen der Gasflusse von Pflanzenblattern sind jedoch nicht die Ab-solutwerte der Partialdrucke, sondern nur die Sprungantworten dieser auf Licht-Dunkel-Wechsel entscheidend.

72 8.3 Vorversuche mit dem Massenspektrometer

Abbildung 8.3: Diftverhalten der Apparatur. Die permanente Evakuierung des Rezipientenbewirkt ein langsames Sinken der Partialdrucke der Gase.

8.3.4 Bestimmung der Gasempfindlichkeit des Massenspektrometers 73

8.3.4 Bestimmung der Gasempfindlichkeit des Massenspektro-meters

Die Gasempfindlichkeit des Massenspektrometers kann mit dem Aufbau zur Einstellungspezieller Gasatmospharen (Abbildung 3.1 Abschnitt 3.2) bestimmt werden. Der Gas-schlauch wird anstatt in die Clark-Elektroden-Einheit in einen der beiden seitlich ange-brachten Gaszuflusse eines 250 ml großen Becherglases gefuhrt. Das Becherglas ist miteiner Folie verschlossen, die zusatzlich mit Klebeband am Becherglas befestigt ist, um dasBecherglas weitestgehend gasdicht abzuschließen. Eine mit einem Glasrohrchen umhullteMesspipette (Abschnitt 8.2.2) wird durch ein vorgestanztes Loch in der Folie gesteckt.Das Glasrohrchen wird so umklebt, dass kein Gas zwischen Glasrohrchen und Folie indas Becherglas diffundieren kann. Die mit den Tylan-Reglern (Abschnitt 3.1) eingestellteGasflussrate von 100 ml/min gewahrleistet zum einen, dass durch Undichtigkeiten ent-lang des Folienrandes bzw. dem anderen offenen Gaszufluss, der hier als Gasabfluss dient,kein Gas von der Umgebung in das Becherglas gelangen kann und zum anderen, dass dieMessung durch das langsam stromende Gas unbeeinflusst bleibt. Die Wichtigkeit dieserMaßnahme zeigt folgender Test: Lasst man verschiedene Gaskonzentrationen (Tabelle8.2) schnell aus einem Ballon stromen, so ist nicht die Konzentration von z.B. Sauerstoffentscheidend fur den angezeigten Partialdruck. Wahrscheinlich resultiert die mangelndeKorrelation mit den Ballonfullungen aus verschiedenen Stromungsgeschwindigkeiten, dieu.U. einen Unterdruck an der Pipettenspitze erzeugt haben konnten.

19% O2 81% N2 20% O2 80% N2 21% O2 79% N2

Anfangsdruck [10−6mbar] 5.68 5.63 5.62Verandeter Druck [10−6mbar] 5.38 5.00 5.42

Enddruck [10−6mbar] 5.66 5.64 5.59

Tabelle 8.2: Ballonmessungen: Sich einstellender Anfangs-, End- und veranderter Druck beischnellem Ausstromen von verschiedenen Gaszusammensetzungen aus Ballons, die vorher mitden Tylanreglern gefullt wurden. Anfangsdruck = Druck vor dem Austromen, veranderter Druck= Druck beim Ausstromen, Enddruck = Druck nach dem Ausstromen.

In der folgenden Messreihe werden mit den Tylan-Reglern verschiedene Mischungsverhalt-nisse zwischen Sauerstoff und Stickstoff eingestellt, um die Reproduzierbarkeit zu prufenund eine Kalibrierkurve zu erhalten. Tabelle 8.3 zeigt die nacheinander erzeugten Mi-schungsverhaltnisse.

A B C D E18% O2 82% N2 19% O2 81% N2 20% O2 80% N2 21% O2 79% N2 22% O2 78% N2

Tabelle 8.3: Mit den Tylan-Reglern eingestellte Konzentrationsverhaltnisse zwischen Sauer-stoff und Stickstoff.

Die von dem Ausgabegerat des Massenspektrometers angezeigten Partialdrucke zu denKonzentrationen von A-E sind nacheinander in funf Durchgangen bestimmt worden. Ab-bildung 8.4 zeigt die graphische Auswertung fur Sauerstoff. Die mit den Tylan-Reglerneingestellten O2-Konzentrationen sind gegen die Partialdruckanderung bezogen auf 18%

74 8.3 Vorversuche mit dem Massenspektrometer

O2 aufgetragen, da fur die Messungen an photosynthetisch aktivem Material nur dieAnderung der O2-Konzentration von Interesse ist und nicht die Absolutkonzentratio-nen. Die Partialdruckanderungen fur die Konzentrationsverhaltnisse A-E sind in diesemKonzentrationsbereich linear. Von einem Durchgang zum nachsten ist die Anderung derPartialdrucke fur 18%, 19%, 20%, 21% und 22% O2 nahezu identisch. Die Abweichungenentstehen durch die Ungenauigkeit der Tylan-Regler. Damit ist einerseits bewiesen wor-den, dass der vorgenommene Messaufbau geeignet ist, Gaszusammensetzungen zu messenund andererseits ein Verfahren entwickelt, welches aufgrund seiner Linearitat zeigt, dasses zur Kalibrierung von Gasmengenanderungen verwendet werden kann.

18,0 18,5 19,0 19,5 20,0 20,5 21,0 21,5 22,0 22,5

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

pp

[x1

0-7m

ba

r]

O2

[%]

Durchgang 1

Durchgang 2

Durchgang 3

Durchgang 4

Durchgang 5

Abbildung 8.4: Kalibrierkurve: Die mit den Tylan-Reglern eingestellte O2-Konzentration istgegen die Partialdruckanderung bezogen auf 18% O2 aufgetragen.

Tabelle 8.3 zeigt, dass die mit den Tylan-Reglern eingestellten O2-Konzentrationen je-weils um ein 1% gesteigert wurden. Um den Partialdruckunterschied fur ∆O2 = 1% zubestimmen, wurde die Differenz der Partialdrucke, die vom Massenspektrometer ange-zeigt wurden, ermittelt und gemittelt:

1% ∆O2 = 0.25± 0.023 · 10−6mbar (8.2)

Zur Bestimmung der CO2-Empfindlichkeit wurde analog zu der von O2 vorgegangen undmit den Tylan-Reglern verschiedene Konzentrationsverhaltnisse zwischen N2 und CO2

eingestellt (Tabelle 8.4).Aus den gemessenen Partialdrucken der Konzentrationen in Tabelle 8.4, ließ sich derPartialdruckunterschied fur 1% CO2 bestimmen zu:

1% ∆CO2 = 0.45± 0.03 · 10−7mbar (8.3)

8.3.5 Kontrollmessung 75

A B C1% CO2 99% N2 2% CO2 98% N2 3% CO2 97% N2

Tabelle 8.4: Mit den Tylan-Reglern eingestellte Konzentrationsverhaltnisse zwischen CO2 undN2.

8.3.5 Kontrollmessung

Bei der Untersuchung von photosynthetischen Gasflussen ist ihre Veranderung auf Licht-Dunkel-Phasen entscheidend. Die nachfolgenden Kontrollmessungen an Papier stellensicher, dass die in Abschnitt 8.4 gemessenen Effekte auf Licht-Dunkel-Phasen von demphotosynthetischen Material stammen.Bei der in Abbildung 8.5 dargestellten Messung ist eine nicht ummantelte Pipette direktuber Papier positioniert worden. Abbildung 8.6 zeigt das typische Messergebnis einessolchen Versuches mit einer ummantelten Pipette (Abschnitt 8.2.2), die auf das Papieraufgesetzt worden ist. In den Abbildungen und im Nachfolgenden steht CO2 stets fur12CO2 und O2 fur 16O2. Das Einschalten des Lichts hat keinen Einfluss auf den Verlaufder Messwerte. Das gleichmaßige Fallen der Werte nach dem starken Abfallen in derStartphase des Gerates in den ersten zehn Minuten ist einzig auf die bereits in Abschnitt8.3.3 erwahnte Drift zuruckzufuhren.

76 8.3 Vorversuche mit dem Massenspektrometer

Abbildung 8.5: Kontrollmessung einer nicht ummantelten Spitze uber Papier.

8.3.5 Kontrollmessung 77

Abbildung 8.6: Kontrollmessung mit einer ummantelten Spitze auf Papier.

78 8.4 Beispiele hochortsaufgeloster Messungen an Blattern

8.4 Beispiele hochortsaufgeloster Messungen an

Blattern

8.4.1 Messverfahren

Fur Messungen an Blattern wird das Blatt zwischen zwei kleine Metallplatten, die jeweilseine runde Offnung haben, eingespannt. Das so fixierte Blatt wird auf einen kleinen, inxyz-Richtung beweglichen Tisch gelegt, der sich unterhalb der Messpipette des Mess-aufbaues (Abbildung 8.1, Tisch nicht dargestellt) befindet. Die Blattunterseite mit denSpaltoffnungen ist zur Messpipette hin ausgerichtet. Durch die Offnung der Platte desTisches kann die Oberseite des Blattes mit BG-18 gefiltertem Halogenlicht mit einerIntensitat von ca. 300 µmol m−2 s−1 beleuchtet werden. Da die Position der Pipettenspit-ze zu der Spaltoffnung entscheidend ist, werden die Spaltoffnungen mit einem Mikroskopidentifiziert. Die Position des Blattes kann durch einen in xyz-Richtung beweglichen Tischverandert werden, um so die Messspitze annahernd uber einer Spaltoffnung zu positio-nieren. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit zunachst zu ersten Testzwecken zur Verfugunggestellten Mikroskops erweist es sich als problematisch, den Abstand zwischen Messspitzeund Blatt einzustellen. Ist der Abstand Spitze-Blatt zu klein, kann sich die Spitze mitBlattflussigkeit fullen und wird gasundurchlassig. Dies ist daran zu erkennen, dass diePartialdrucke um ein oder zwei Großenordnungen spontan kleiner werden (Abb. 8.7).Zum anderen kann die Spitze abbrechen, so dass sich ihre Offnung erweitert, was dengegenlaufigen Effekt zur Folge hat. Ein uber 10−4 mbar angestiegener Druck bewirktdas Ausschalten des Filamentes durch die Massenspektrometerelektronik oder fuhrt zunichtlinearen Verzerrungen, wie sie am Detektionsverhalten von H2O beobachtet werdenkonnen. Wird der Abstand Messspitze-Blatt zu groß gewahlt, kann das Gas, das ausden Spaltoffnungen diffundiert, nicht mehr detektiert werden, da der Gasgradient schnellabnimmt (Abschnitt 6.5.4) und eine entsprechend geringe raumliche Ausdehnung hat.

8.4.2 Gasdetektionsverhalten versch. Pipetten 79

Abbildung 8.7: Spontaner Partialdruckabfall fur CO2 und O2 bei einer sich mit Blattflussigkeitverschließenden Spitze einer Pipette.

8.4.2 Gasdetektionsverhalten ummantelter und nicht umman-telter Pipetten

In Abschnitt 8.2.2 wurde uber den Einfluss der Glasumhullung auf die Messeigenschaftender Pipetten spekuliert.In Abbildung 8.8 ist das Detektionsergebnis einer ummantelten und einer nicht um-mantelten Pipette bei der Anderung der CO2-Atmosphare eines Maisblattes bei Licht-Dunkel-Phasen dargestellt. Hier zeigt sich kein Unterschied in den Messungen. Oben warbereits diskutiert worden, dass moglicherweise die Tiefe des Volumens zu groß fur eineeffektive Anreicherung und somit das Detektionsverhalten als gleich anzusehen ist. Diephotosynthetische Bedeutung des CO2-Verlaufes ist in Abschnitt 8.4.4 erlautert.

80 8.4 Beispiele hochortsaufgeloster Messungen an Blattern

Abbildung 8.8: Identisches Detektionsverhalten ummantelter und nicht ummantelter Pipet-ten.

8.4.3 Blattnahe Gasatmosphare

Aus Abbildung 8.9 ist zu erkennen, dass nach Annaherung der Messpipette an ein be-leuchtetes Maisblatt eine erhohte O2-Konzentration detektiert wurde. Dieses zeigt diedurch photosynthetischen Sauerstoff angereicherte blattnahe Atmosphare bei Beleuch-tung. Die Phase der langsamen Annaherung mit der Messspitze an das Maisblatt ist aufder Zeitachse mit A gekennzeichnet.

8.4.4 Einfluss altern. Hell-Dunkel-Ph. auf die photosyn. Gasflusse 81

Abbildung 8.9: Detektion einer Erhohung der O2-Konzentration bei Annaherung der Messpi-pette an ein Blatt.

8.4.4 Einfluss alternierender Hell-Dunkel-Phasen auf die Zu-sammensetzung der photosynthetischen Gasflusse

Abbildung 8.10 zeigt zwei Messreihen, die zu verschiedenen Tageszeiten an Maisblatternaufgenommen wurden. In der linken Halfte der Abbildung ist die Reaktion der Gasflusseauf alternierende Licht-Dunkel-Phasen fur CO2,

13CO2, O2 und 18O2 fur mittags und inder rechten Halfte fur abends dargestellt (hierbei ist CO2 die verkurzte Schreibweise fur12CO2 bzw. O2 fur 16O2).Die bereits vorgestellten Messungen der Drift der Apparatur (Abschnitt 8.3.3) und dieMessungen an Papier belegen (Abschnitt 8.3.5), dass die dargestellten Veranderungender Partialdrucke von CO2 und 13CO2 tatsachlich durch das Blatt verursacht werden,denn sie sind direkt mit den Licht-Dunkel-Phasen korreliert. Insbesondere lassen sichdeutlich ausgepragte Sprungantworten auf einen Wechsel zwischen Licht und Dunkelbei CO2 und 13CO2 beobachten. Sowohl bei der Mittags- (Abb. 8.10 A,B) als auch beider Abendmessung (Abb. 8.10 E,F) ist bei Licht ein Absinken der gemessenen CO2-Konzentration zu beobachten. Sofort nach Ausschalten der Lichtquelle steigt die CO2-Konzentration wieder rapide an. Dieses Verhalten ist genau das, welches fur die CO2-Fixierung im Licht erwartet wird (Abschnitt 2.5).Weiterhin sind keine unterschiedlichen Effekte bei den Kohlenstoffisotopen zu beobachten.

82 8.4 Beispiele hochortsaufgeloster Messungen an Blattern

Abbildung 8.10: Mittags- und Abendmessungen an einem Maisblatt bei einer Beleuchtungvon 300 µmol m−2 s−1.

8.4.4 Einfluss altern. Hell-Dunkel-Ph. auf die photosyn. Gasflusse 83

Die Kurvenverlaufe fur CO2 und 13CO2 verhalten sich jeweils zu den beiden Tageszeitenim Rahmen der Messgenauigkeit gleichartig.Hingegen sind weder bei den Mittagsmessungen (Abb. 8.10 C,D) noch bei den Abend-messungen beim Sauerstoffisotop signifikante Reaktionen auf die Hell-Dunkel-Modulationzu sehen. Der Kurvenverlauf entspricht dem der Driftmessungen.Allerdings zeigt sich bei der Messung am Abend (Abb. 8.10 G) ein unerwarteter Effekt.Die O2-Konzentration steigt in der Dunkelheit ahnlich wie die CO2-Konzentration.Zu erwarten ist unter Beleuchtung ein Anstieg oder die Stagnation (durch die Drift derApparatur entspricht eine Stagnation absolut gesehen einem leichten Anstieg) des O2

Wertes. Dies ist bei der Mittagsmessung zu sehen, im Gegensatz dazu zeigt jedoch dieAbendmessung einen deutlichen unerwarteten Abfall des Sauerstoffwertes.Zur Zeit kann nicht festgestellt werden, ob die Beobachtung in Abb. 8.10 G auf einemArtefakt beruht oder tatsachlich eine echte Aussage enthalt. Zu erwarten ware das ge-genteilige Verhalten, allerdings war bereits beim Microx (Abschnitt 6.5.4) abgeschatztworden, dass die geringen O2-Anderungen vor dem Hintergrund von 20 % Luftsauerstoffkaum zu beobachten sind. Somit entsprechen eigentlich die Messungen in Abb. 8.10 C,Dden Erwartungen. Allerdings konnte man in Abb. 8.10 C auch einen kleinen Anstieg inder Dunkelphase hinein interpretieren.Die Frage ist, ob es irgendwelche Stoffwechselprozesse gibt, die zu einen O2-Burst imDunkeln fuhren. Ein bekannter Effekt ist ein CO2-Burst bei dem ins Cytosol abgegebeneProdukte nach Beleuchtung in den Mitochondrien verbrannt (Prays und Romanowska,2000) werden. Das wurde aber eher zu einer O2-Aufnahme fuhren. In Mais jedoch gibtes keinen Postillumination-Burst fur CO2 (Peterson, 1987). Dass ein Postillumination-O2-Burst mit der Clark-Elektrode nicht beobachtet wurde, kann daran liegen, dass dieneue Methode hier direkt an der Spaltoffnung misst (was es vorher nicht gab) und dassdieses Signal sich von dem integralen Signal, welches vielleicht noch O2-Flusse aus denEpidermiszellen enthalt, unterscheidet.Wahrscheinlich ist der Effekt in Abb. 8.10 G ein Artefakt, obwohl dessen Ursache nichtgeklart ist. Es kommt aber in der Wissenschaft auch vor, dass ein vollig unerwarteterEffekt auf einen neuen unbekannten Mechanismus fuhrt, wenn eine neue Messtechnikneue Moglichkeiten erschließt.

84 Kapitel 9 Fazit und Ausblick

Kapitel 9

Fazit und Ausblick

Die Clark-Elektrode konnte in den Untersuchungen ihre Eignung als Standardmessme-thode beweisen. Ihre Empfindlichkeit und ihr Zeitauflosungsvermogen sind mindestens sogut wie die der anderen Gesamtflussmessgerate. Sie wurde in allen Untersuchungen alsein verlasslicher Standard benutzt.

Die Photoakustische Spektroskopie (PAS) stellte sich als eine exzellente Erganzung zurClark-Elektrode heraus. Die Simultanmessung mit beiden Verfahren zeigte, dass dieserAnsatz zu neuen Aussagen fuhren kann, die gerade fur die jetzt im aktuellen Interessestehende, aber messtechnisch sehr schwer zugangliche Verzweigung der Elektronen hinterPS I neue Zugange eroffnet. Messungen dieser Art sollten weitergefuhrt werden, umherauszufinden, wie viele der Elektronen zu den Mitochondrien oder zum Calvin-Zyklusfließen.

Das Microx wurde zunachst als vielversprechender Ansatz fur hochortsaufgeloste Mes-sungen gesehen. Denn der Einsatz von Fluoreszenzmessstoffen hat in der Biophysik vieleneue Wege mit phantastischen Ergebnissen eroffnet, wie raumlich aufgeloste Messungenvon Ionen-Verteilungen (Plieth et al., 1999) oder die Vermessung der Bewegung in einemProtein gezeigt haben. Doch diese Erwartungen konnte das Microx nicht erfullen. DieTechnik des Microx ist nicht einmal ansatzweise fur die vom Hersteller versicherte Eig-nung fur Photosynthesemessungen ausgereift. Es ist zu bewundern, dass es dem Herstellergelingt, nicht-funktionsfahige Gerate fur 17.000 DM zu verkaufen. Jedoch schwerer als derfinanzielle Verlust wiegt die verlorene Zeit (mehrere Monate), bis herausgefunden wer-den konnte, dass alle Vorschlage des Herstellers zur Verbesserung nicht auf Erfahrungenberuhten.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass mindestens eine damit durchgefuhrteveroffentliche Untersuchung (Klimant et al., 1996) mit großer Wahrscheinlichkeit falschist. Die Autoren hatten keine Kontrollmessungen aufgefuhrt. Diese hatten, wie in meinerArbeit dargestellt, gezeigt, dass das Microx im Wesentlichen ein Temperaturmessgerat ist.Selbst bei ausgeschaltetem Temperatureffekt kam das Microx bei Anreicherung von O2

durch ein Blatt in einem kleinen Gasvolumen eines Parallelaufbaues mit Clark-Elektrodenicht annahernd an die Empfindlichkeit der Clark-Elektrode heran.

Das in dieser Arbeit neu entwickelte Verfahren ist die Gasanalyse durch eine Kombinationaus einer Patch-Clamp-Pipette mit einem Massenspektrometer. Im Gegensatz zu fruherenEinsatzen des Massenspektrometers in der Photosynthese-Messtechnik (Avelange et al.,1991) ist hier eine hohe raumliche Auflosung und die Messung an intakten Pflanzenmoglich.

Kapitel 9 Fazit und Ausblick 85

Durch geeignete Wahl der Spitzengroße konnte gewahrleistet werden, dass der fur dasMassenspektrometer erforderliche Druck aufrecht erhalten werden konnte und dennochdie durch die Messpipette diffundierende Gasmenge großer ist als die durch Desorptionvon den Kammerwanden entstandene. Die bei diesem Messverfahren eigentlich lastigeAbhangigkeit vom Erfolg beim Auffinden offener Spaltoffnungen des Blattes ist zugleichdie Starke des Verfahrens, denn die raumliche Auflosung soll den Vorteil gegenuber PASund Clark-Elektrode bringen. Die Ergebnisse bei der Messung der Veranderung der CO2-Atmosphare des Blattes auf Licht-Dunkel-Anderungen sind bereits zufrieden stellend.Bei O2 ist zwar das Problem, dass gegenuber einem Hintergrund von 21% Luftsauerstoffgemessen werden muss und sich dadurch nur geringe relative Veranderungen der O2-Konzentration ergeben, jedoch zeigen die O2-Messungen abends in der Dunkelphase einenEffekt, der zuvor in der Literatur nicht erwahnt wurde: Das Steigen der O2-Entwicklungin der Dunkelphase.Alternativ konnen Messungen mit der Isotopentechnik durchgefuhrt werden (das Blattwird vor der Messung mit H2

18O manipuliert). Eine weitere Untersuchungsmoglichkeitist, dass die O2-Konzentration der Umgebungsatmosphare bei einigen Fragestellungenauf 2% gesenkt werden kann (darunter brechen Teile des Stoffwechsels des Blattes zu-sammen).Die raumlich aufgeloste CO2-Messung bietet bereits interessante Anwendungen. Beiabgezogener Epidermis konnten an Maispflanzen die unterschiedlichen Gasflusse vonMesophyll- und Bundelscheidenzellen untersucht werden.Die Unterscheidung der CO2-Flusse von mit Pilzen befallenen und unbefallenen Blattre-gionen mit dem Messaufbau aus Patch-Clamp-Pipette und Massenspektrometer konntedas Verstandnis fur die durch den Befall erzeugten Anderungen im Stoffwechsel einenwichtigen Beitrag liefern. Das Fernziel in diesem mit den Arbeitsgruppen Heege undVeerret von der Agrarwissenschaftlichen Fakultat ist die Entwicklung eines Systems, dasdie

”online“ Analyse der photosynthetischen Signale von einem Traktor ermoglicht, um

so einen gezielten Einsatz von Pestiziden durchfuhren zu konnen.

86 Kapitel 10 Zusammenfassung

Kapitel 10

Zusammenfassung

Die Aufgabe dieser Arbeit war der Vergleich verschiedener Methoden zur Messung vonGas-Flussen (insbesondere Sauerstoff), welche mit dem licht-gesteuerten Stoffwechselvon Blattern zusammenhangen. Dazu wurden vier Verfahren betrachtet: die klassischeClark-Elektrode, die photoakustische Gasflussbestimmung, Fluoreszenz-Loschung im Mi-crox und ein hier neu entwickeltes Verfahren aus einer Kombination von Patch-Clamp-Elektrode und Massenspektrometer.

Die Messungen bestatigten die sehr gute Eignung der Clark-Elektrode fur die Erfas-sung von Netto-Sauerstoffflussen von Pflanzen, so dass die Clark-Elektrode auch beianderen Methoden als Vergleichsstandard hinzugezogen wurde. Allerdings liefert dieClark-Elektrode keine Ortsauflosung in zellularen Dimensionen und keine Unterschei-dung von unidirektionalen Flussen. Unidirektionale Flusse konnen mit der Photoakusti-schen Spektroskopie (PAS) gemessen werden. Dies wird am Beispiel der Sattigung derO2-Konzentration bei CO2-Erschopfung in geschlossener Messkammer gezeigt. Um zuklaren, warum in diesem Bereich der Elektronenfluss aus PS II unverandert bleibt, wur-den unter diesen Bedingungen Simultanmessungen mit Clark-Elektrode und mit der PASdurchgefuhrt. Dazu wurde die Clark-Elektrode in die Ruckwand der Photoakustikkam-mer eingesetzt. Das Problem, dass die PAS im Gegensatz zu der Clark-Elektrode nurmit Lichtbiltzen einer mittleren Intensitat von 25 µmol m−2 s−1 arbeitet, wurde dadurchgelost, dass Giersch als Schattenpflanze auch unter diesen Bedingungen genug Sauerstoffliefert.

Die Messungen der PAS konnten klaren, wie sich bei der O2-Sattigung die O2-Entwicklungvom PS II und die CO2-Aufnahme ins Stroma verhalten. Die simultanen Ergebnissevon Clark-Elektrode und PAS fuhrten zu der Aussage, dass der Elektronenfluss zu denMitochondrien umgelenkt wird. Ein Teil des dort erzeugten CO2 wird wieder im Calvin-Zyklus verarbeitet. Weiterhin folgte, dass die Photorespiration keine sehr große Rollespielen kann. Dies Beispiel zeigt, dass die simultane Messung von Clark-Elektrode undPAS sehr gute Moglichkeiten eroffnet, die Elektronenflussverzweigungen hinter PS I zustudieren.

Eine hohe raumliche Auflosung wurde von dem Microx erwartet. Die Untersuchungendieser Arbeit zeigten sowohl technische als auch prinzipielle Probleme, so dass sich dasGerat als untauglich erwies. Zum einen sind die dunnen Glasfasern sehr zerbrechlich unddeshalb konnten die Optoden in der Anwendung nur mit einem Mikromanipulator undaußerster Vorsicht benutzt werden. Weiterhin stellte sich heraus, dass die optische Iso-lierung, die um den Farbstoff einiger Optoden war, mechanisch sehr anfallig ist (unter

Kapitel 10 Zusammenfassung 87

anderem loste sich die Isolierung unter Wassereinwirkung). Zum anderen wurde gezeigt,dass das Gerat außerst empfindlich auf Temperaturschwankungen im Gegensatz zu Sau-erstoffschwankungen reagiert. Mit verschiedenen Methoden wurde der Temperatureffektdokumentiert.

Bei unisolierten oder beschadigten Optoden ubersteuerten rote LED’s den Photomulti-plier. Blaue LED’s erzeugen einen starken Nebenpeak im Infraroten, der durch Warme-filter und optische Filter unterdruckt werden musste. Trotz der Unterdruckung des Tem-peratureffektes erwies sich die Empfindlichkeit gegenuber Sauerstoff als so gering, dassnicht am photosynthetischen System gemessen werden konnte. Auch eine Aufintegra-tion des Sauerstoffs in einem kleinen Gasvolumen in einem eigens dazu entwickeltenAufbau, der Parallelmessungen zwischen Clark-Elektrode und Microx ermoglichte, zeigteeindeutig, dass das Microx zu unempfindlich gegenuber Anreicherungen ist, die fur einenSauerstoffnachweis der Clark-Elektrode ausreichen. Ebenso bestatigten Messungen in ei-ner Suspension isolierter Mesophyll- und Bundelscheidenzellen die Unempfindlichkeit desMicrox. Weiterhin gelang es nachzuweisen, dass eine Messreihe, die mit dem Microx vonKlimant et al. (1996) an Algen im Sediment bei alternierenden Licht-Dunkel-Phasen auf-genommen wurde, sich identisch mit den dabei auftretenden Temperaturschwankungenverhalt und somit keinen Sauerstoffnachweis darstellen kann.

Aufgrund des Versagens des Microx wurde ein neues Messverfahren zur hochortsauf-gelosten Gasanalyse entwickelt. Hier ist eine hochortsaufgeloste Gasanalyse mittels Pro-bennahme uber eine Patch-Clamp-Elektrode (Pipette) aufgebaut worden, die uber einevakuumgeeignete Kammer mit einem Massenspektrometer gekoppelt ist. Die Messappa-ratur ermoglicht, mit der Messspitze in der Nahe von Schließzellen von Blattern untermikroskopischer Beobachtung zu messen. Es wurde gezeigt, welche Probleme in einem sol-chen Aufbau zu eliminieren und welche Voruntersuchungen notwendig sind. So muss einesolche Apparatur auf ihre Gasdichtigkeit uberpruft werden. Der Durchmesser von Mes-spipetten muss geeignet gewahlt werden. Zu große Durchmesser fuhren dazu, dass mitden Vakuumpumpen kein geeigneter Arbeitsdruck fur das Massenspektometer erreichtwird. Bei zu kleinem Durchmesser diffundiert eine zu geringe Menge Gas der zu untersu-chenden Atmosphare in die Messkammer. Das Problem, dass Messspitzen abbrechen odersich mit Blattflussigkeit fullen und dadurch untauglich werden, lasst sich durch die Um-mantelung der Spitzen der Messpipetten mit Glasrohrchen losen. Vergleichsmessungenzwischen ummantelten und nicht ummantelten Messpipetten zeigten, dass die Messei-genschaften durch die Ummantelung aufgrund der Tiefe des Volumens unbeeinflusst blei-ben. Eine durchgefuhrte Leckratenbestimmung ergab, dass der Gasfluss, der durch diePipetten in die Kammer gelangt, großer ist als die durch Desorption der Wande entstan-dene Gasmenge. Die so charakterisierte Apparatur wurde mit Hilfe einer Testatmosphareauf ihre Gasempfindlichkeit kalibriert. Der Vergleich mit Driftmessungen und Kontroll-messungen an Papier zeigt, dass die an Mais gemessene CO2-Aufnahme eindeutig durchdas Blatt verursacht wurde und mit den Licht-Dunkel-Phasen korreliert ist. Bei den O2-Messungen verdeckt die hohe Luftkonzentration von 21% die licht-induzierten Verande-rungen. Hier wird man auf Isotope zuruckgreifen mussen. Allerdings zeigten die O2-Flussebei Messungen am Abend ein Verhalten, das nicht erwartet wurde: Eine Erhohung derO2-Entwicklung bei Dunkelheit. Es konnte nicht geklart werden, ob dieser Effekt auf ei-nem Artefakt beruht, oder ob hier ein neues Phanomen auftaucht, das mit den bisherigennicht-ortsauflosenden Methoden nicht entdeckt werden konnte. Die Messungen an Maiszeigen jedoch die Eignung des Messaufbaus fur hochortsaufgeloste CO2- und Isotopen-

88 Kapitel 10 Zusammenfassung

Messungen. Der vorliegende Messaufbau ist somit geeignet, sowohl die unterschiedlichenGasflusse von Mesophyll- und Bundelscheidenzellen bei abgezogener Epidermis von Mais-blattern, als auch die vermutlich regionalen Veranderungen der CO2-Flusse z.B. bei einermit Pilz befallenen Pflanze nachzuweisen.

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Danksagung

An erster Stelle mochte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Hansen fur die interessante undaußerst vielfaltige Aufgabenstellung und die außerordentlich gute Betreuung gerade inder Endphase dieser Arbeit bedanken.Mein besonderer Dank geht an Maike Keunecke und Katrin Schinner fur die zahlreichenAnregungen und das grundliche Korrekturlesen.Mein Dank geht auch Christian Wulff fur die gute Zusammenarbeit.Der gesamten Arbeitsgruppe danke ich fur das angenehme Arbeitsklima und die hilfrei-chen Diskussionen.Rainer Adelung mochte ich besonders danken fur seine immer gegenwartige Un-terstutzung.

Die eidesstattliche Erklarung:

Hiermit erklare ich an Eides Statt, dass ich die vorliegende Diplomarbeit selbstandigunter Anleitung meiner akademischen Lehrer angefertigt und dabei nur die genanntenQuellen als Hilfsmittel verwendet habe.

Kiel, den.....................................................