Aus dem Institut für Tierpathologie der Ludwig-Maximilians-Universität

München

Arbeit angefertigt unter der Leitung von Univ.-Prof. Dr. Kaspar Matiasek

Vergleich von SISPA und random-PCR als sequenzunabhängige

Amplifikationsmethoden zum schnellen und einfachen Nachweis

unbekannter DNA-Viren

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der tierärztlichen Doktorwürde

der Tierärztlichen Fakultät

der Ludwig-Maximilians-Universität München

vorgelegt von

Eva Dittberner

aus Burglengenfeld

2015

Gedruckt mit der Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät

der Ludwig-Maximilians Universität München

Dekan: Univ.-Prof. Dr. Joachim Braun

Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Kaspar Matiasek

Korreferent: Priv.-Doz. Dr. Monika Rinder

Tag der Promotion: 31.01.2015

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis IV

INHALTSVERZEICHNIS

I. EINLEITUNG ............................................................................................ 1

II. LITERATURÜBERSICHT ...................................................................... 2

1. Neuauftretende Infektionskrankheiten ....................................................2

1.1. Neuauftretende Zoonosen ............................................................................2

1.2. Faktoren für Krankheitsausbrüche ...............................................................3

1.3. Überwachung neuauftretender Infektionskrankheiten .................................4

2. Diagnostik unbekannter oder nicht vermuteter Viren durch

virologische Methoden ...............................................................................5

2.1. Klassische virologische Methoden ...............................................................6

2.2. Serologische Methoden ................................................................................7

3. Diagnostik unbekannter oder nicht vermuteter Viren durch

molekulargenetische Methoden ................................................................8

3.1. Nicht-amplifizierende Methoden .................................................................8

3.2. Amplifizierende Methoden ..........................................................................9

3.2.1. Sequenzabhängige Methoden .......................................................................9

3.2.1.1. Singleplex-PCR ............................................................................................9

3.2.1.2. Multiplex-PCR ............................................................................................10

3.2.1.3. Consensus-PCR ..........................................................................................10

3.2.2. Sequenzunabhängige Methoden .................................................................11

3.2.2.1. Rolling circle amplification ........................................................................11

3.2.2.2. Representational difference analysis .........................................................12

3.2.2.3. Sequence-independent single primer amplification ...................................14

3.2.2.4. Random-PCR ..............................................................................................21

4. Methoden zur Charakterisierung von PCR-Produkten .......................25

4.1. Hybridisierung ............................................................................................25

4.2. Screening von Expressionsbibliotheken.....................................................25

4.3. DNA-Microarrays ......................................................................................26

4.4. Sequenzierung und Datenbankabgleich .....................................................27

4.4.1. Sequenzierungsverfahren und deren Automatisierung ..............................28

4.4.2. Next-generation-sequencing.......................................................................30

4.4.3. Datenbankabgleich .....................................................................................32

Inhaltsverzeichnis V

III. GEWÄHLTE STRATEGIEN UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT 34

IV. MATERIAL UND METHODEN ........................................................... 35

1. Herstellung des Probenmaterials und real time-PCR ...........................35

1.1. Zellkulturüberstand und Zellen ..................................................................35

1.2. Liquor .........................................................................................................36

1.3. Gewebeproben ............................................................................................36

1.4. EHV-1-spezifische real time-PCR .............................................................36

1.4.1. Freisetzung und Isolierung der EHV-1-DNA ............................................36

1.4.2. Durchführung der PCR...............................................................................37

1.4.3. Auswertung ................................................................................................38

2. Vorversuche zum Enzymverdau .............................................................38

2.1. Wirksamkeit der DNase .............................................................................39

2.1.1. Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ...........................................................39

2.1.2. Einfluss von Gewebe auf Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ..................39

2.2. Nachweis der schützenden Wirkung des Viruskapsids ..............................40

3. Anreicherung viraler Nukleinsäure und Vorbehandlung des

Probenmaterials nach SISPA- bzw. random-PCR-Protokoll ...............40

3.1. Filtration .....................................................................................................40

3.2. DNase-Verdau ............................................................................................41

3.3. Restriktionsenzymverdau ...........................................................................41

3.4. Ligation ......................................................................................................42

3.4.1. Herstellung des Adaptermoleküls ..............................................................42

3.4.2. Ligation des Adapters an die Template-DNA ............................................43

4. Sequenzunabhängige Amplifikation .......................................................43

4.1. SISPA .........................................................................................................44

4.2. Random-PCR ..............................................................................................45

5. Charakterisierung der PCR-Produkte ...................................................46

5.1. Auftrennung mittels Agarosegelelektrophorese .........................................46

5.2. Klonierung ..................................................................................................47

5.3. Sequenzierung ............................................................................................49

5.4. BLAST-Suche ............................................................................................49

5.5. Sequenzierungsergebnisse ..........................................................................49

Inhaltsverzeichnis VI

V. ERGEBNISSE .......................................................................................... 52

1. Wirksamkeit der DNase...........................................................................52

1.1. Effekt der DNase auf EHV-1-DNA aus Zellkulturüberstand ....................52

1.2. Einfluss von Gewebe auf den Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ...........53

2. Protektion viraler DNA durch Kapsid und Hülle vor enzymatischem

Abbau ........................................................................................................54

3. Verlust viraler DNA bei Durchführung des SISPA- bzw. random-

PCR-Protokolls .........................................................................................56

4. Ergebnisse des SISPA-bzw. random-PCR-Protokolls ...........................58

4.1. Ausgangsmaterial .......................................................................................58

4.2. Darstellung der Sequenzierungsergebnisse ................................................58

4.3. Ergebnisse der SISPA ................................................................................59

4.3.1. Vorversuche zur Ligation ...........................................................................59

4.3.2. Zellkulturüberstand ....................................................................................61

4.3.3. Zellsuspension ............................................................................................63

4.3.4. Liquor .........................................................................................................64

4.3.5. Gewebe ................................................