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Aus dem Institut für Tierpathologie der Ludwig-Maximilians-Universität
München
Arbeit angefertigt unter der Leitung von Univ.-Prof. Dr. Kaspar Matiasek
Vergleich von SISPA und random-PCR als sequenzunabhängige
Amplifikationsmethoden zum schnellen und einfachen Nachweis
unbekannter DNA-Viren
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der tierärztlichen Doktorwürde
der Tierärztlichen Fakultät
der Ludwig-Maximilians-Universität München
vorgelegt von
Eva Dittberner
aus Burglengenfeld
2015
Gedruckt mit der Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät
der Ludwig-Maximilians Universität München
Dekan: Univ.-Prof. Dr. Joachim Braun
Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Kaspar Matiasek
Korreferent: Priv.-Doz. Dr. Monika Rinder
Tag der Promotion: 31.01.2015
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis IV
INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG ............................................................................................ 1
II. LITERATURÜBERSICHT ...................................................................... 2
1. Neuauftretende Infektionskrankheiten ....................................................2
1.1. Neuauftretende Zoonosen ............................................................................2
1.2. Faktoren für Krankheitsausbrüche ...............................................................3
1.3. Überwachung neuauftretender Infektionskrankheiten .................................4
2. Diagnostik unbekannter oder nicht vermuteter Viren durch
virologische Methoden ...............................................................................5
2.1. Klassische virologische Methoden ...............................................................6
2.2. Serologische Methoden ................................................................................7
3. Diagnostik unbekannter oder nicht vermuteter Viren durch
molekulargenetische Methoden ................................................................8
3.1. Nicht-amplifizierende Methoden .................................................................8
3.2. Amplifizierende Methoden ..........................................................................9
3.2.1. Sequenzabhängige Methoden .......................................................................9
3.2.1.1. Singleplex-PCR ............................................................................................9
3.2.1.2. Multiplex-PCR ............................................................................................10
3.2.1.3. Consensus-PCR ..........................................................................................10
3.2.2. Sequenzunabhängige Methoden .................................................................11
3.2.2.1. Rolling circle amplification ........................................................................11
3.2.2.2. Representational difference analysis .........................................................12
3.2.2.3. Sequence-independent single primer amplification ...................................14
3.2.2.4. Random-PCR ..............................................................................................21
4. Methoden zur Charakterisierung von PCR-Produkten .......................25
4.1. Hybridisierung ............................................................................................25
4.2. Screening von Expressionsbibliotheken.....................................................25
4.3. DNA-Microarrays ......................................................................................26
4.4. Sequenzierung und Datenbankabgleich .....................................................27
4.4.1. Sequenzierungsverfahren und deren Automatisierung ..............................28
4.4.2. Next-generation-sequencing.......................................................................30
4.4.3. Datenbankabgleich .....................................................................................32
Inhaltsverzeichnis V
III. GEWÄHLTE STRATEGIEN UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT 34
IV. MATERIAL UND METHODEN ........................................................... 35
1. Herstellung des Probenmaterials und real time-PCR ...........................35
1.1. Zellkulturüberstand und Zellen ..................................................................35
1.2. Liquor .........................................................................................................36
1.3. Gewebeproben ............................................................................................36
1.4. EHV-1-spezifische real time-PCR .............................................................36
1.4.1. Freisetzung und Isolierung der EHV-1-DNA ............................................36
1.4.2. Durchführung der PCR...............................................................................37
1.4.3. Auswertung ................................................................................................38
2. Vorversuche zum Enzymverdau .............................................................38
2.1. Wirksamkeit der DNase .............................................................................39
2.1.1. Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ...........................................................39
2.1.2. Einfluss von Gewebe auf Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ..................39
2.2. Nachweis der schützenden Wirkung des Viruskapsids ..............................40
3. Anreicherung viraler Nukleinsäure und Vorbehandlung des
Probenmaterials nach SISPA- bzw. random-PCR-Protokoll ...............40
3.1. Filtration .....................................................................................................40
3.2. DNase-Verdau ............................................................................................41
3.3. Restriktionsenzymverdau ...........................................................................41
3.4. Ligation ......................................................................................................42
3.4.1. Herstellung des Adaptermoleküls ..............................................................42
3.4.2. Ligation des Adapters an die Template-DNA ............................................43
4. Sequenzunabhängige Amplifikation .......................................................43
4.1. SISPA .........................................................................................................44
4.2. Random-PCR ..............................................................................................45
5. Charakterisierung der PCR-Produkte ...................................................46
5.1. Auftrennung mittels Agarosegelelektrophorese .........................................46
5.2. Klonierung ..................................................................................................47
5.3. Sequenzierung ............................................................................................49
5.4. BLAST-Suche ............................................................................................49
5.5. Sequenzierungsergebnisse ..........................................................................49
Inhaltsverzeichnis VI
V. ERGEBNISSE .......................................................................................... 52
1. Wirksamkeit der DNase...........................................................................52
1.1. Effekt der DNase auf EHV-1-DNA aus Zellkulturüberstand ....................52
1.2. Einfluss von Gewebe auf den Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ...........53
2. Protektion viraler DNA durch Kapsid und Hülle vor enzymatischem
Abbau ........................................................................................................54
3. Verlust viraler DNA bei Durchführung des SISPA- bzw. random-
PCR-Protokolls .........................................................................................56
4. Ergebnisse des SISPA-bzw. random-PCR-Protokolls ...........................58
4.1. Ausgangsmaterial .......................................................................................58
4.2. Darstellung der Sequenzierungsergebnisse ................................................58
4.3. Ergebnisse der SISPA ................................................................................59
4.3.1. Vorversuche zur Ligation ...........................................................................59
4.3.2. Zellkulturüberstand ....................................................................................61
4.3.3. Zellsuspension ............................................................................................63
4.3.4. Liquor .........................................................................................................64
4.3.5. Gewebe ................................................