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Transcript of Vergleich von SISPA und random-PCR als sequenzunabh£¤ngige ... Vergleich von SISPA und...

  • Aus dem Institut für Tierpathologie der Ludwig-Maximilians-Universität

    München

    Arbeit angefertigt unter der Leitung von Univ.-Prof. Dr. Kaspar Matiasek

    Vergleich von SISPA und random-PCR als sequenzunabhängige

    Amplifikationsmethoden zum schnellen und einfachen Nachweis

    unbekannter DNA-Viren

    Inaugural-Dissertation

    zur Erlangung der tierärztlichen Doktorwürde

    der Tierärztlichen Fakultät

    der Ludwig-Maximilians-Universität München

    vorgelegt von

    Eva Dittberner

    aus Burglengenfeld

    2015

  • Gedruckt mit der Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät

    der Ludwig-Maximilians Universität München

    Dekan: Univ.-Prof. Dr. Joachim Braun

    Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Kaspar Matiasek

    Korreferent: Priv.-Doz. Dr. Monika Rinder

    Tag der Promotion: 31.01.2015

  • Meinen Eltern

  • Inhaltsverzeichnis IV

    INHALTSVERZEICHNIS

    I. EINLEITUNG ............................................................................................ 1

    II. LITERATURÜBERSICHT ...................................................................... 2

    1. Neuauftretende Infektionskrankheiten ....................................................2

    1.1. Neuauftretende Zoonosen ............................................................................2

    1.2. Faktoren für Krankheitsausbrüche ...............................................................3

    1.3. Überwachung neuauftretender Infektionskrankheiten .................................4

    2. Diagnostik unbekannter oder nicht vermuteter Viren durch

    virologische Methoden ...............................................................................5

    2.1. Klassische virologische Methoden ...............................................................6

    2.2. Serologische Methoden ................................................................................7

    3. Diagnostik unbekannter oder nicht vermuteter Viren durch

    molekulargenetische Methoden ................................................................8

    3.1. Nicht-amplifizierende Methoden .................................................................8

    3.2. Amplifizierende Methoden ..........................................................................9

    3.2.1. Sequenzabhängige Methoden .......................................................................9

    3.2.1.1. Singleplex-PCR ............................................................................................9

    3.2.1.2. Multiplex-PCR ............................................................................................10

    3.2.1.3. Consensus-PCR ..........................................................................................10

    3.2.2. Sequenzunabhängige Methoden .................................................................11

    3.2.2.1. Rolling circle amplification ........................................................................11

    3.2.2.2. Representational difference analysis .........................................................12

    3.2.2.3. Sequence-independent single primer amplification ...................................14

    3.2.2.4. Random-PCR ..............................................................................................21

    4. Methoden zur Charakterisierung von PCR-Produkten .......................25

    4.1. Hybridisierung ............................................................................................25

    4.2. Screening von Expressionsbibliotheken.....................................................25

    4.3. DNA-Microarrays ......................................................................................26

    4.4. Sequenzierung und Datenbankabgleich .....................................................27

    4.4.1. Sequenzierungsverfahren und deren Automatisierung ..............................28

    4.4.2. Next-generation-sequencing.......................................................................30

    4.4.3. Datenbankabgleich .....................................................................................32

  • Inhaltsverzeichnis V

    III. GEWÄHLTE STRATEGIEN UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT 34

    IV. MATERIAL UND METHODEN ........................................................... 35

    1. Herstellung des Probenmaterials und real time-PCR ...........................35

    1.1. Zellkulturüberstand und Zellen ..................................................................35

    1.2. Liquor .........................................................................................................36

    1.3. Gewebeproben ............................................................................................36

    1.4. EHV-1-spezifische real time-PCR .............................................................36

    1.4.1. Freisetzung und Isolierung der EHV-1-DNA ............................................36

    1.4.2. Durchführung der PCR...............................................................................37

    1.4.3. Auswertung ................................................................................................38

    2. Vorversuche zum Enzymverdau .............................................................38

    2.1. Wirksamkeit der DNase .............................................................................39

    2.1.1. Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ...........................................................39

    2.1.2. Einfluss von Gewebe auf Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ..................39

    2.2. Nachweis der schützenden Wirkung des Viruskapsids ..............................40

    3. Anreicherung viraler Nukleinsäure und Vorbehandlung des

    Probenmaterials nach SISPA- bzw. random-PCR-Protokoll ...............40

    3.1. Filtration .....................................................................................................40

    3.2. DNase-Verdau ............................................................................................41

    3.3. Restriktionsenzymverdau ...........................................................................41

    3.4. Ligation ......................................................................................................42

    3.4.1. Herstellung des Adaptermoleküls ..............................................................42

    3.4.2. Ligation des Adapters an die Template-DNA ............................................43

    4. Sequenzunabhängige Amplifikation .......................................................43

    4.1. SISPA .........................................................................................................44

    4.2. Random-PCR ..............................................................................................45

    5. Charakterisierung der PCR-Produkte ...................................................46

    5.1. Auftrennung mittels Agarosegelelektrophorese .........................................46

    5.2. Klonierung ..................................................................................................47

    5.3. Sequenzierung ............................................................................................49

    5.4. BLAST-Suche ............................................................................................49

    5.5. Sequenzierungsergebnisse ..........................................................................49

  • Inhaltsverzeichnis VI

    V. ERGEBNISSE .......................................................................................... 52

    1. Wirksamkeit der DNase...........................................................................52

    1.1. Effekt der DNase auf EHV-1-DNA aus Zellkulturüberstand ....................52

    1.2. Einfluss von Gewebe auf den Effekt der DNase auf EHV-1-DNA ...........53

    2. Protektion viraler DNA durch Kapsid und Hülle vor enzymatischem

    Abbau ........................................................................................................54

    3. Verlust viraler DNA bei Durchführung des SISPA- bzw. random-

    PCR-Protokolls .........................................................................................56

    4. Ergebnisse des SISPA-bzw. random-PCR-Protokolls ...........................58

    4.1. Ausgangsmaterial .......................................................................................58

    4.2. Darstellung der Sequenzierungsergebnisse ................................................58

    4.3. Ergebnisse der SISPA ................................................................................59

    4.3.1. Vorversuche zur Ligation ...........................................................................59

    4.3.2. Zellkulturüberstand ....................................................................................61

    4.3.3. Zellsuspension ............................................................................................63

    4.3.4. Liquor .........................................................................................................64

    4.3.5. Gewebe ................................................