Vergleichende tierexperimentelle Studie zur ossären ... · [40, 95, 129] Diabetes mellitus stellt...

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Aus der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie des Universitätsklinikums Erlangen Direktor: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. F.W. Neukam Vergleichende tierexperimentelle Studie zur ossären Einheilung oberflächenmodifizierter Implantate im diabetischen Schwein Inaugural-Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae dentariae der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Christian Seidl geb. am 21.07.1985 in Passau Erlangen, November 2011

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Aus der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie

des Universitätsklinikums Erlangen

Direktor: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. F.W. Neukam

Vergleichende tierexperimentelle Studie zur ossären Einheilung oberflächenmodifizierter

Implantate im diabetischen Schwein

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor medicinae dentariae

der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Christian Seidl

geb. am 21.07.1985 in Passau

Erlangen, November 2011

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-

Universität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Karl Andreas Schlegel

Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich Wilhelm Neukam

Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2011

Meiner Mutter, meinem verstorbenen Vater und meinem Bruder

in aller Liebe und Dankbarkeit gewidmet.

Inhaltsverzeichnis

1 ZUSAMMENFASSUNG / ABSTRACT .............................................................................................. 3

1.1 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................................... 3

1.1.1 Hintergrund und Ziele ..................................................................................................... 3

1.1.2 Material und Methode.................................................................................................... 3

1.1.3 Ergebnisse ...................................................................................................................... 3

1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen ........................................................................................ 4

1.2 ABSTRACT ................................................................................................................................... 5

1.2.1 Background and objective............................................................................................... 5

1.2.2 Material and methods .................................................................................................... 5

1.2.3 Results ............................................................................................................................ 5

1.2.4 Conclusion ...................................................................................................................... 6

2 EINLEITUNG ................................................................................................................................. 7

2.1 HINTERGRUND ............................................................................................................................. 7

2.2 IMPLANTATEINHEILUNG ................................................................................................................. 9

2.2.1 Kollagen I...................................................................................................................... 10

2.2.2 Osteocalcin ................................................................................................................... 11

3 ZIELE DER STUDIE ....................................................................................................................... 14

4 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................................... 15

4.1 WAHL DER VERSUCHSTIERE........................................................................................................... 15

4.2 ANZAHL DER VORGESEHENEN TIERE ................................................................................................ 15

4.3 BILDUNG DER VERSUCHSGRUPPEN UND ZEITLICHER ABLAUF ................................................................. 16

4.4 VORSTELLUNG DER IMPLANTATSYSTEME .......................................................................................... 18

4.5 ART, DURCHFÜHRUNG UND DAUER DER EINGRIFFE ............................................................................ 18

4.5.1 Induktion des experimentellen Diabetes ....................................................................... 18

4.5.2 Ablauf des operativen Eingriffes ................................................................................... 19

4.5.3 Sektion und Entnahme der Knochenproben .................................................................. 20

4.6 AUFBEREITUNG DER KNOCHENPROBEN ............................................................................................ 21

4.7 MIKRORADIOGRAPHIE ................................................................................................................. 22

4.7.1 Herstellung der Mikroradiographien ............................................................................. 22

4.7.2 Auswertung der Mikroradiographien ............................................................................ 23

4.8 IMMUNHISTOCHEMIE .................................................................................................................. 25

4.8.1 Anfertigung der Mikrotomschnitte ............................................................................... 25

4.8.2 Labeled Streptavidin Biotin Methode ............................................................................ 26

4.8.3 Auswertung der immunhistologischen Schnitte............................................................. 28

4.9 STATISTIK ................................................................................................................................. 29

5 ERGEBNISSE ............................................................................................................................... 30

5.1 MIKRORADIOGRAPHIE ................................................................................................................. 30

5.1.1 Schädelkalotten ............................................................................................................ 30

5.1.2 Unterkiefer ................................................................................................................... 31

5.2 IMMUNHISTOLOGIE ..................................................................................................................... 33

5.2.1 Kollagen I...................................................................................................................... 33

5.2.1.1 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 30 Tage ......................................................................... 33

5.2.1.2 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 90 Tage ......................................................................... 34

5.2.1.3 Opferungszeitpunkte im Vergleich .......................................................................................... 35

5.2.2 Osteocalcin ................................................................................................................... 36

5.2.2.1 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 30 Tage ......................................................................... 36

5.2.2.2 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 90 Tage ......................................................................... 37

5.2.2.3 Opferungszeitpunkte im Vergleich .......................................................................................... 38

5.3 WERTETABELLE .......................................................................................................................... 39

6 DISKUSSION ............................................................................................................................... 40

7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................ 51

8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... 73

9 ANHANG .................................................................................................................................... 74

10 DANKSAGUNG ........................................................................................................................... 76

11 LEBENSLAUF............................................................................................................................... 77

3

1 Zusammenfassung / Abstract

1.1 Zusammenfassung

1.1.1 Hintergrund und Ziele

Diabetes mellitus wird momentan als relative Kontraindikation für die Insertion

dentaler Implantate angesehen, da beim Diabetiker im Vergleich zum gesunden

Kollektiv höhere Verlustraten beobachtet werden. Ziel dieser Studie war es, die

periimplantäre Knochenbildung anhand eines etablierten diabetischen

Tiermodelles am Hausschwein zu untersuchen und die Auswirkungen

oberflächenmodifizierter Implantate (SLActive®) auf die Osseointegration zu

eruieren.

1.1.2 Material und Methode

15 Hauschweinen (11 diabetische Tiere und 4 gesunde Kontrolltiere) wurden

oberflächenmodifizierte (SLActive®) und konventionelle (SLA

®)

Implantate in die

Schädelkalotte und den Unterkiefer gesetzt. 30 und 90 Tage nach der

Implantatinsertion wurde die periimplantäre Knochenmineralisation durch die

Anfertigung von Mikroradiografien und die Expression von Kollagen I und

Osteocalcin durch immunhistochemische Nachweisverfahren bestimmt.

1.1.3 Ergebnisse

Die quantitative Evaluierung der Hartgewebe zeigte pathologische

Veränderungen. Die periimplantäre Knochenmineralisationsrate der Schädel-

kalotten und Unterkiefer der diabetischen Versuchstiere war im Vergleich zur

gesunden Kontrollgruppe nach 30 und 90 Tagen verringert. Die SLActive®

-

Implantate zeigten im Vergleich zu den SLA®

-Implantaten eine signifikant höhere

periimplantäre Knochenmineralisationsrate in der Kalotte, wohingegen kein

Unterschied bei den Unterkieferpräparaten beobachtet werden konnte. Die

4

Kollagen I-Expression war in der diabetischen Gruppe nach 30 und 90 Tagen

erhöht, während die Osteocalcin-Expression im Vergleich zur gesunden

Kontrollgruppe zu beiden Zeitpunkten erniedrigt war.

1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Im vorliegenden Modell führt Diabetes mellitus zu einer Abnahme der

periimplantären Knochenmineralisation und beeinflusst die Expression ossärer

Matrixproteine. Es konnte gezeigt werden, dass eine modifizierte Oberfläche

(SLActive®) zu einer verbesserten Implantateinheilung bei den diabetischen

Tieren führt. Die Oberflächenmodifizierung dentaler Implantate stellt damit einen

vielversprechenden Ansatz dar, Heilungsvorgänge im kompromittierten Knochen

zu verbessern.

5

1.2 Abstract

1.2.1 Background and objective

Diabetes mellitus is currently classified as a relative contraindication for implant

treatment, due to higher failure rates which have been seen in diabetic patients

compared to the general population. Aim of this study was to investigate peri-

implant bone formation in a diabetic animal model and to evaluate the effects of

surface-modified implants (SLActive®) on the osseointegration.

1.2.2 Material and methods

In 15 domestic pigs (11 diabetic and 4 healthy controls) surface-modified

(SLActive®) and conventional (SLA

®) implants were placed in the calvaria and

lower jaw. 30 and 90 days after implant placement the peri-implant bone

mineralization rate (BMR) and the expression of collagen type-I and osteocalcin

were evaluated by microradiography and immunhistochemistry.

1.2.3 Results

Quantitative evaluation of the hard tissue revealed pathological changes. BMR in

the calvaria and lower jaw was reduced in the diabetic group after 30 and 90 days.

SLActive®

-implants showed a significant higher BMR in the calvaria compared to

the SLA®

-implants, whereas no difference could be observed in the lower jaw.

Collagen type-I protein expression was higher in the diabetic group after 30 and

90 days, while protein expression of osteocalcin was reduced in the diabetic group

at both time points.

6

1.2.4 Conclusion

In this model Diabetes mellitus leads to a decreased peri-implant bone

mineralisation and influences the expression of osseous matrix proteins. A

modified surface (SLActive®) improves the implant healing in diabetic animals.

The surface modification of dental implants displays an auspicious approach to

enhance the healing processes in a compromised bone.

7

2 Einleitung

2.1 Hintergrund

Weltweit sind knapp 250 Millionen Menschen an Diabetes mellitus erkrankt.

Schätzungen zu Folge wird sich die Zahl der Erkrankten in den nächsten 15

Jahren um mehr als die Hälfte erhöhen. Allein in Deutschland ist nach Angaben

der International Diabetes Federation von ca. 7,5 Millionen Diabetikern

auszugehen, wobei die Dunkelziffer undiagnostizierter Erkrankter auf bis zu 50%

geschätzt wird. [40, 95, 129] Diabetes mellitus stellt damit die häufigste

endokrine Stoffwechselerkrankung in Deutschland dar. Die hohe und weiter

steigende Prävalenz lässt dieses Krankheitsbild zunehmend in den Fokus der

Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie rücken. Hier haben sich seit einigen Jahren

dentale Implantate als effektive Methode zur Versorgung von teil- und

unbezahnten Patienten etabliert [2, 97]. Diese weisen neben einem breitem

Indikationsspektrum auch ein hohes Maß an Langzeitstabilität auf [32, 58].

Klinische Studien zeigen zwar, dass Implantate bei Diabetikern erfolgreich gesetzt

werden können [7, 39, 56, 113], die Verlustrate im Vergleich zum gesunden

Patienten aber erhöht ist [101, 113]. Morris et al. beobachteten in einem

Dreijahreszeitraum eine etwas geringere Überlebensrate beim Typ 2-Diabetiker

(7,8 % Implantatverluste im Vergleich zu 6,8 % bei der stoffwechselgesunden

Kontrollgruppe) [101]. Die Fünfjahres-Überlebensrate bei Typ 2-Diabetikern

beträgt 90% [113]. Diabetes wird daher als relative Kontraindikation für die

Insertion von Implantaten angesehen [39, 73] und schränkt damit gerade bei den

Patienten die Behandlungsmöglichkeiten ein, die aufgrund ihres Krankheitsbildes

a priori eine höhere Inzidenz für Parodontopathien und Zahnverlust aufweisen

[152].

In der Vergangenheit wurden zwar Tierversuchsstudien durchgeführt, die den

Einfluss eines experimentell induzierten Diabetes auf die Osseointegration von

Implantaten untersuchten, jedoch sind deren Ergebnisse und Schlussfolgerungen

diskrepant. So beobachteten sowohl Deeb et al. [37] als auch Giglio et al. [50]

eine Zunahme an Knochenvolumen im periimplantären Bereich diabetischer

Ratten, wohingegen andere Forschungsgruppen eine Verringerung des

8

Knochenvolumens und einen niedrigeren Knochen-Implantat-Kontakt nachweisen

konnten [70, 108, 114, 146]. Eine Studie an Kaninchen kam dagegen zu dem

Ergebnis, dass der Diabetes keinen signifikanten Einfluss auf die Wundheilung

des Weichgewebes und das Knochen-Implantat-Interface hat [48].

Die Diskrepanz der Ergebnisse mag sich durch die Tatsache erklären, dass diese

Studien zwei grundlegende Probleme nicht berücksichtigt haben: Zum einen ist

die Übertragbarkeit tierexperimenteller Ergebnisse auf den Menschen nur dann

gewährleistet, wenn das Versuchstier in seinen morphologischen und

physiologischen Charakteristika dem Menschen möglichst nahe kommt. Obwohl

die Ratte in der Diabetesforschung das häufigste Versuchtier darstellt, weist sie im

Vergleich zum menschlichen Organismus doch größere Unterschiede, u.a. im

Knochenaufbau und im Knochenstoffwechsel, auf [111]. Das Schwein hingegen

zeigt in den knochenspezifischen Parametern eine hohe Analogie zum humanen

Stoffwechsel [65, 82]. Unsere Studie basiert daher auf einem von Wilmowsky et

al. etablierten diabetischen Tiermodell am Hausschwein [163].

Das zweite grundsätzliche Problem liegt in dem kurzen Zeitfenster zwischen der

experimentellen Diabetes-Induktion und der Implantatinsertion. In früheren

Studien wurden die Implantate einige Tage bis Wochen nach der Streptozotocin-

Gabe gesetzt [37, 48, 50]. Wie unsere eigenen Ergebnisse aber zeigen konnten,

dauert es 6-12 Monate bis sich signifikante pathologische Veränderungen der

Hartgewebe und Gefäße einstellen [88, 163]. Auf Basis dieser Ergebnisse wurde

in der vorliegenden Studie ein Zeitrahmen von 15 Monaten von der Diabetes-

Induktion bis zur Implantatinsertion gewählt, um sicher zu gehen, dass sich

pathologische Veränderungen manifestiert hatten.

Wie schon erwähnt ist die Verlustrate dentaler Implantate beim Diabetiker im

Vergleich zum stoffwechselgesunden Kollektiv erhöht [101]. Wissenschaftlich

belegt ist, dass Modifikationen des Implantatdesigns und der –oberfläche zu einer

verbesserten Osseointegration und damit zu einer höheren Erfolgsrate beim

gesunden Patienten führen [100, 112, 144, 149]. Der Erfolg moderner

Implantatsysteme basiert dabei auf der Entwicklung einer Implantatoberfläche,

welche die Bildung eines direkten Knochen-Implantat-Verbundes begünstigt [53,

55, 77, 100, 156, 162]. Um die Verbindung zwischen Implantat und Knochen zu

optimieren, werden die Implantate auf viele Arten modifiziert: (Mikro-)

9

Maschinierung, Titan-Plasma-Beschichtung, Bestrahlung mit verschiedenen

Molekülen unter Druck, chemische und elektrochemische Ätzung, Bestrahlung in

Kombination mit Ätzung, elektrochemische Anodisierung oder pulsierende

Abtragung mit einem Laser [25, 78, 117, 135, 158, 165, 175]. Die Auswirkungen

dieser Oberflächenmodifikationen auf die Osseointegration dentaler Implantate

beim diabetischen Patienten sind weitestgehend unerforscht. Hier setzt der zweite

Grundgedanke unserer Studie an: Welchen Effekt hat eine modifizierte

Oberfläche auf die Implantateinheilung und den periimplantären

Knochenstoffwechsel bei einem diabetisch kompromittierten Knochen?

2.2 Implantateinheilung

Das Setzen eines Implantates in den Knochen ist mit einem unvermeidbaren

lokalen Knochentrauma verbunden [24]. Der anschließende Prozess der

Implantateinheilung kann vereinfacht in folgende Schritte unterteilt werden [107]:

Bildung eines Blutkoagulums mit lokaler Hypoxie und der Entstehung

eines sauren Milieus

Knochenresorption durch Osteoklasten

Neovaskularisation

Migration und Proliferation von Osteoprogenitorzellen

Differenzierung zu Osteoblasten

Osteoid-/Knochenmatrixbildung

Mineralisation des Knochenmatrix

Der Prozess der Knochenheilung wird dabei von einer Vielzahl an Faktoren wie

etwa Hormonen, Zytokinen oder Wachstumsfaktoren beeinflusst und gesteuert.

Obwohl der genaue Ablauf der ossären Heilung immer noch wenig verstanden ist,

hat es in den letzten Jahren doch große Fortschritte gegeben, spezifische ossäre

Marker zu identifizieren und in den zeitlichen Verlauf der Knochenentwicklung

einzuordnen [116, 140, 147]. Hier haben sich insbesondere

Knochenmatrixproteine als zuverlässige und gut nachweisbare Marker etabliert.

Diese sind substanziell an Knochenregenerations- und -umbauprozessen beteiligt.

Deren quantitativer Nachweis lässt somit Rückschlüsse auf ablaufende

10

Knochenstoffwechselprozesse zu.

Im Rahmen dieser Studie wurden dabei zwei Proteine gewählt, die ihr

Expressionsmaximum zu unterschiedlichen Zeitpunkten haben: Kollagen I, das zu

Beginn der de novo Knochenformation exprimiert wird und Osteocalcin als

Vertreter der Mineralisationsphase. Die Struktur und Bedeutung der beiden

Proteine soll im folgenden Abschnitt dargestellt werden.

2.2.1 Kollagen I

Die extrazelluläre Matrix (EZM) von Bindegeweben zeichnet sich durch eine

komplexe Anordnung verschiedener Proteine aus und ist für die strukturelle

Integrität und physiologische Funktion von Geweben unerlässlich. Die häufigsten

Proteine der EZM sind die Kollagene. Das gemeinsame Strukturmerkmal aller

Kollagene ist die Ausbildung einer charakteristischen Tripelhelix aus drei

Polypeptidketten. Bis heute sind 26 verschiedene Kollagene identifiziert worden

[47]. Kollagen I, das zur Gruppe der Fibrillen-bildenden Kollagene gehört, findet

sich in nahezu allen Bindegewebsformen (Knochen, Haut, Sehnen, Bänder,

Skleren, Gefäße) mit Ausnahme des hyalinen Knorpels [47, 160]. Im Knochen

stellt es mit einem Anteil an der organischen Matrix von ca. 95% das quantitativ

wichtigste Protein dar [41].

Das Typ-1-Kollagen ist ein Heterotrimer aus drei Polypeptidketten (zwei α1-

Ketten und eine α2-Kette). Die drei α-Ketten bilden für sich jeweils eine

linksgängige Helix (Tropokollagen) aus; drei solcher linksgängiger Helices

winden sich umeinander zu einer rechtsgängigen Tripel-Helix. Um diese

Anordnung in eine Tripelhelix zu ermöglichen, besitzen Kollagenprotomere eine

spezielle Primärstruktur. Die charakteristische Aminosäureabfolge der α-Ketten

besteht aus einer sich monoton wiederholenden Triplet-Sequenz Gly-X-Y, wobei

X und Y häufig für Prolin und Hydroxyprolin stehen. [83]

Die Biosynthese der Kollagenfibrillen beginnt im rauen endoplasmatischen

Retikulum (ER) der Osteoblasten. Hier wird das Vorläufermolekül Prokollagen

gebildet, welches am N- und C-Terminus je ein Propeptid enthält. Das

Prokollagen wird dann im ER und Golgi-Apparat durch Hydroxylierungen und

11

Glykosylierungen modifiziert. Nach der anschließenden Zusammenlagerung von

drei α-Ketten zu einer Tripelhelix wird das Kollagenmonomer in den

Extrazellularraum sezerniert. Hier werden die Propeptide abgespalten, wodurch

Tropokollagen entsteht. Diese Tropokollagenmoleküle lagern sich nun zu

Fibrillen zusammen und werden über Schiff´sche Basen quervernetzt. [47]

Die Bildung von Knochen beginnt mit der Synthese und Anordnung eines

Kollagengerüstes, welches hauptsächlich aus Kollagen I-Fasern besteht und ca.

10 Tage dauert [41]. Diese richten sich nach dem Wolff´schen Gesetz dabei

entlang biomechanischer Kraftlinien aus [41]. Im Anschluss wird das Osteoid

mineralisiert, indem sich Apatitkristalle entlang der Längsachse der

Kollagenfasern, die als Kristallisationszentrum dienen, anordnen [166]. Der

Mineralisationsvorgang nimmt ca. zwei bis drei Monate in Anspruch [41].

Die Hauptfunktion des Kollagen I im Knochen besteht also in der Ausbildung

einer geordneten Leitstruktur für die anschließende Mineralisation. Die

Organisation und Struktur der Fibrillen limitiert zudem die Größe der

Mineralisationskristalle und hat einen Einfluss auf deren Orientierung [160].

Interessanterweise konnten mehrere Studien zeigen, dass die Bruchfestigkeit bzw.

Frakturresistenz zum großen Teil von der Kollagenmatrix beeinflusst wird [15,

164], wohingegen die Knochenhärte hauptsächlich vom Grad der Mineralisation

abhängt [29-30]. Entgegen der früheren Meinung, dass Kollagen I auch die

Mineralablagerung initiieren würde [96], weiß man heute, dass diese Aufgabe den

nicht-kollagenen Proteinen (Osteocalcin, Osteopontin, Osteonectin etc.)

zuzurechnen ist [13, 153].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Kollagen I das Grundgerüst des sich

neubildenden Knochens stellt und als wichtiger Marker der frühen

Knochenentwicklung dient.

2.2.2 Osteocalcin

Mitte der 1970er Jahre haben zwei Forschungsgruppen unabhängig voneinander

ein neues Protein im Knochen entdeckt, welches reich an γ-Carboxyglutamat ist.

Die komplette Primärstruktur des bovinen „γ-carboxyglutamic acid-containing

12

protein from bone“ wurde von denselben Autoren im Jahr 1976 veröffentlicht und

später abgekürzt zu bone-GLA-protein (BGP) oder Osteocalcin (OC) [61, 124-

125]. Schon zum Zeitpunkt seiner Entdeckung wusste man, dass γ-

Carboxglutamat essentiell für die Bindung von Prothrombin an Ca2+

-Ionen ist und

man vermutete, dass das neu entdeckte Osteocalcin eine wichtige Rolle im

Stoffwechsel von mineralisierten Geweben spielt [106]. Das humane Gen, das für

Osteocalcin codiert, wurde 1986 identifiziert und befindet sich auf dem distalen

Arm von Chromosom 1 (1q25-q31) [127].

In den folgenden Jahren wurde das Protein aus verschiedenen Tieren wie dem

Schwein [67], der Maus [33] , der Ziege [67], dem Hund [27] oder dem Frosch

[23] isoliert und zeigt große Ähnlichkeiten im Vergleich zum humanen BGP. Die

Primärstruktur des OC ist unter diesen Tieren v.a. in der zentralen γ-

Carboxyglutamat-Domäne hochgradig konserviert [64, 66, 155]. Die

evulotorische Konservierung zeigt sich darin, dass jedes Vertebraten-OC die

Fähigkeit besitzt Ca2+

-Ionen zu binden.

Osteocalcin wird hauptsächlich von reifen Osteoblasten [69, 76] und zum Teil

auch von Osteozyten [1], hypertrophen Chondrozyten [86], Zementoblasten [19]

und Odontoblasten [52] gebildet. Ein Großteil des neu synthetisierten Proteins

wird in die extrazelluläre Knochenmatrix inkorporiert, eine kleine Fraktion geht in

die Zirkulation über und kann daher mit Immunoassays nachgewiesen werden

[145]. Es gibt zudem Hinweise, dass auch nicht-osseoide Gewebe wie z.B. das

Gehirn [76] oder Blutplättchen [154] OC sezernieren, wenngleich man aber

anmerken muss, dass die Expressionsraten mehrere Größenordnungen unter denen

der Knochenzellen liegen und BGP deshalb als Knochen-spezifisches Protein gilt

[44].

Osteocalcin wird nicht während früher Stufen der Osteoblastenentwicklung

gebildet, sondern ist ein Marker der späten, reifen Osteoblasten [11]. OC wird

speziell in mineralisierter Knochenmatrix gefunden und nicht in neu geformtem,

nichtmineralisiertem Osteoid [94]. Es ließ sich zudem eine positive Korrelation

zwischen OC-Expression und dem Grad der Mineralisation zeigen [133]. BGP

erscheint in calcifizierenden Geweben ca. zwei Wochen nach Mineralablagerung

etwa zur der Zeit, in der die Mineralien zu Hydroxylapatit reifen [123]. OC ist

dabei v.a. im Bereich der Mineralisationsfront lokalisiert [74, 105]. In vitro

13

Untersuchungen bestätigen die Tatsache, dass BGP zu Beginn der Mineralisation

induziert wird, deutlich nach der Expression früher osteoblastischer Marker wie

dem Kollagen I oder der Alkalischen Phosphatase [115].

Das hohe Vorkommen in der mineralisierten Knochenmatrix - es ist das häufigste

nicht-kollagene Knochenmatrixprotein [75] - und die hoch konservierte

Aminosäuresequenz lassen auf die Wichtigkeit des Proteins für den

Knochenstoffwechsel schließen. Umso erstaunlicher ist es, dass die biologische

Funktion noch immer unklar ist. Evident ist, dass Osteocalcin mit hoher Affinität

über die γ-Carboxyglutamat-Seitenketten Hydroxylapatit bindet [120, 125]. In

vitro ist nachgewiesen, dass Osteocalcin das Wachstum und die Formation von

Hydroxylapatitkristallen inhibiert [14, 132]. Eine Experimentelle Studie an mit

Warfarin (Vitamin K-Antagonist) vergifteten Ratten zeigte, dass es in

Abwesenheit von OC zu einer überschießenden Mineralisation im Bereich der

Epiphysenfuge kam [126]. Demnach könnte die Funktion darin liegen, eine

überschießende Mineralisation des Knochens durch eine Verzögerung des

Kristallisationsprozesses zu verhindern. Ducy et al. hingegen kam zu dem

Schluss, dass Osteocalcin die Knochenformation limitiere, aber keinen

inhibierenden Effekt auf die Knochenmineralisierung habe [35]. OC weist auch

einen chemotaktischen Einfluss auf Osteoklasten auf, wobei aber die

Auswirkungen auf knochenresorptive Prozesse weitgehend unverstanden sind

[103]. So fand sich bei Knockout-Mäusen zwar eine erhöhte Zahl von

Osteoklasten, aber keine gesteigerte Knochenresorption [35].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Osteocalcin eine wichtige Rolle bei der

Regulation der Knochenmineralisation und -formation spielt und als wichtiger

Marker der Osteoblastenaktivität und der späten Knochenreifung dient [26].

14

3 Ziele der Studie

Ziele dieser tierexperimentellen Studie waren:

1.) Die Gewinnung quantitativer Daten zur Einheilung dentaler Implantate im

diabetischen Schwein unter besonderer Berücksichtigung der

Knochenmineralisation und der Expression von Knochenmatrixproteinen

(Kollagen I, Osteocalcin).

2.) Der Vergleich der Implantateinheilung zwischen diabetischen und

stoffwechselgesunden Versuchstieren.

3.) Der Vergleich zweier unterschiedlicher Implantatoberflächen (SLA® und

SLActive®

, Straumann AG, Basel, Schweiz) und deren Einfluss auf die

Implantateinheilung und den periimplantären Knochenstoffwechsel bei

einer diabetischen Stoffwechsellage.

15

4 Material und Methoden

4.1 Wahl der Versuchstiere

Als Versuchstier wurde das Hausschwein gewählt, da dessen anatomische,

morphologische und physiologische Charakteristika eng mit denen des Menschen

korrelieren. Gerade im Hinblick auf die Ähnlichkeiten im Knochenstoffwechsel

gilt das Schwein als etabliertes und verlässliches Modell, welches die

Übertragung experimentell gewonnener Daten auf den menschlichen Organismus

erlaubt [65, 138, 167]. So ist die Knochenneubildungsrate mit 1,2 - 1,5 µm/Tag

nur geringfügig höher als die des Menschen mit 0,8 – 1,0 µm/Tag [82]. Ebenso

finden sich Gemeinsamkeiten im Aufbau des trabekulären Knochens [8].

Gewebedurchblutung, Frakturheilung und Heilungszeit sind mit den Vorgängen

im menschlichen Organismus vergleichbar. In unserer Studie spielte speziell die

Antwort des Organismus auf die Induktion des Diabetes eine entscheidende Rolle.

So lassen sich beim Schwein einige Analogien zum Menschen aufzeigen wie eine

ähnliche Pharmakokinetik nach Medikamentenverabreichung und eine

vergleichbare gastrointestinale Funktion und Pankreasmorphologie [10, 85]. Es

entwickeln sich Artherosklerosen in anatomisch relevanten Regionen wie der

Aorta oder den Koronargefäßen und zeigen dabei die gleichen

histopathologischen Veränderungen (Akkumulation von Plaque, Schaumzellen,

Makrophagen, Lymphozyten etc.) wie beim Menschen [18, 49, 109, 121-122].

Darüber hinaus hat sich das Schwein mit Streptozotozin-induziertem Diabetes in

verschiedenen tierexperimentellen Studien zu kardiovaskulären, renalen und

opthalmologischen Fragestellungen durchgesetzt [5, 49, 54, 88, 104, 150, 173].

4.2 Anzahl der vorgesehenen Tiere

In die Studie wurden nach Genehmigung des Tierversuches (Genehmigungsnr.

54-2531-25/07) durch die zuständige Tierversuchskommision der Regierung von

Mittelfranken, Ansbach, 15 Tiere aufgenommen.

16

4.3 Bildung der Versuchsgruppen und zeitlicher Ablauf

Die 15 Versuchstiere wurden in zwei Gruppen unterteilt: Der einen

Versuchstiergruppe wurde zur Induktion des Diabetes Streptozotocin infundiert,

die andere Gruppe diente als stoffwechselgesunde Kontrollgruppe. 15 Monate

nach der Streptozotocin-Gabe wurden die Implantate in die Schädelkalotte und

den Unterkiefer inseriert. Es kamen dabei zwei unterschiedliche

Oberflächenmodifikationen (SLA® und SLActive

®, Straumann AG, Basel,

Schweiz) zum Einsatz. Die Verteilung der Implantate erfolgte randomisiert. Nach

einer postoperativen Phase von 30 Tagen wurden sieben der 15 Tiere geopfert. An

Tag 90 p.o. folgten die restlichen acht Versuchstiere.

Abbildung 1: Einteilung der Versuchsgruppen. Angegeben sind jeweils die

Versuchstiernummer und die Anzahl der inserierten Implantate in der

Schädelkalotte (gelb) und dem Unterkiefer (blau).

17

Abbildung 2: Zeitlicher Ablauf der Studie.

Abbildung 3: Darstellung der Implantationsstellen im Unterkiefer und in der

Schädelkalotte. Die Lokalisation der SLA®/SLActive

®-Implantate wechselte durch

Randomisierung innerhalb eines Untersuchungszeitpunktes.

18

4.4 Vorstellung der Implantatsysteme

In dieser Studie wurden Standard-Schraubenimplantate (Bone Level) mit einem

Durchmesser von 4,1 mm und einer Länge von 10 mm der Firma Straumann

(Straumann AG, Basel, Schweiz) verwendet. Es kamen dabei mit SLA® und

SLActive® zwei verschiedene Oberflächenmodifikationen zum Einsatz. SLA

®

zeichnet sich dadurch aus, dass das Titanimplantat mit grobem Korn (0,25 - 0,5

mm) sandgestrahlt und anschließend mit Säure (HCl/H2SO4) behandelt wird

(Sandblasting with Large grit followed by Acid etching) [134]. Dies führt zu einer

Vergrößerung der Oberfläche und zu einer verbesserten Topographie der

Implantatoberfläche im Hinblick auf die Adhäsion von Knochenzellen [174].

SLActive® wird unter Reinraumbedingungen zusätzlich mit Stickstoff

konditioniert und sofort in einer isotonen NaCl-Lösung konserviert, um eine

Kontamination mit Molekülen aus der Umgebungsluft zu verhindern, welche sich

in die Mikroporen des Implantats ablagern und so zu einer heterogenen, weniger

benetzbaren Oberfläche führen [134]. Die chemische Behandlung erhöht die

Benetzbarkeit und Oberflächenladung der Implantatoberfläche und beeinflusst den

Kontakt mit dem umgebenden Gewebe [22, 134]. Es konnte gezeigt werden, dass

die modifizierte SLActive®

-Oberfläche stark hydrophil ist, eine hohe

Oberflächenaktivität aufweist und damit bei der initialen Implantateinheilung zu

einer raschen Adhäsion von Blut und ossären Zellen führt [42, 174].

4.5 Art, Durchführung und Dauer der Eingriffe

4.5.1 Induktion des experimentellen Diabetes

Analog zu den Studien von Wilmowsky et al. und Koopmans et al. wurde

Streptozotocin (Zanosar®, Pharmacia & Upjohn Company, Kalamazoo, USA) in

einer physiologischen Kochsalzlösung auf 1g/10ml verdünnt und 90mg/kg

Körpergewicht über einen intravenösen Zugang am Ohr über 30 min infundiert

[79, 163]. Die Kanülenapplikation und Infusionsgabe fand nach Analgosedierung

mit Midazolam (1mg/kg KG) (Dormicum®, Hoffmann-La Roche, Grenzach-

Wyhlen, Deutschland) und Ketamin HCL (5mg/kg KG) (Ketavet®, Pharmacia,

Erlangen, Deutschland) 4-5 Stunden nach der morgendlichen Fütterung statt. Um

19

eine Hypoglykämie zu vermeiden, wurde innerhalb der ersten fünf Tage nach der

Diabetes-Induktion Futter ad libitum gewährt.

Zweimal wöchentlich wurde der Blutzuckerspiegel gemessen und drei Monate

nach der Streptozotocin-Gabe ein intravenöser Blutglucosetoleranztest (IvGTT)

durchgeführt. Die Hausschweine erfüllten demnach die drei Diabetes-Kriterien

der World Health Organization [169] und der American Diabetes Association [4]:

1.) Symptome wie Polydipsie, Polyurie und Polyphagie in Verbindung

mit Blutzuckerwerten über 200 mg/dl

2.) Nüchternblutzucker mehr als 125 mg/dl

3.) Blutzuckerwerte über 200 mg/dl nach einer standardisierten Glucose-

Testlösung

15 Monate nach der Diabetes-Induktion erfolgte die Insertion der Implantate in

die Schädelkalotte und den Unterkiefer.

4.5.2 Ablauf des operativen Eingriffes

Die Insertion der Implantate in die Schädelkalotte und den Unterkiefer fand unter

Allgemeinanästhesie mit Ketamin HCL (5 mg/kg KG i.v) (Ketavet®, Pfizer

GmbH, Karlsruhe, Deutschland) statt. Durch die Applikation von Articain mit

Adrenalinzusatz (Ultracain DS forte®, Sanofi‐Aventis Deutschland GmbH,

Frankfurt a.M., Deutschland) erzielte man eine zusätzliche Vasokonstriktion im

Operationsgebiet. Außerdem erhielten die Versuchstiere eine antibiotische

Abschirmung eine Stunde präoperativ und drei Tage postoperativ mit

Streptomycin (15mg/kg KG) (Streptomycin "Grünenthal" 1 g®, Grünethal,

Stolberg, Deutschland). Zur Schmerzkontrolle wurde Buprenorphin (0,1mg/kg

KG s.c.) (Temgesic®, Essex Pharma GmbH, München, Deutschland) alle zwölf

Stunden für drei Tage verabreicht.

Die randomisierte Implantation in die Schädelkalotte erfolgte über einen

perkutanen Zugang. Dazu wurden die Haut im Bereich des Os frontale sagittal

inzidiert und nach subperiostaler Lappenmobilisation ein Zugang zu den

knöchernen Anteilen des Stirnbeins geschaffen. Nach der Markierung der

20

Insertionsstelle mit einem Rosenbohrer Ø 1,4 mm wurde das Implantatbett unter

permanenter Wasserkühlung mit einem Pilotbohrer Ø 2.2 mm auf die endgültige

Tiefe präpariert und mit einem weiteren Pilotbohrer auf 2,8 mm erweitert. Die

grundlegende Präparation wurde mit einem Spiralbohrer Ø 3,5 mm

abgeschlossen. Nach der anschließenden Gewindeschneidung wurde das

Implantat (Ø 4,1 mm; Länge 10 mm) mit einer Ratsche inseriert und das Periost

und Weichgewebe mit resorbierbaren Vicrylfäden (Vicryls 3.0®, Ethicon GmbH

& Co. KG, Norderstedt, Deutschland) vernäht.

Die Implantatsetzung in den Unterkieferkörper erfolgte nach submandibulärer

Inzision und Aufklappen der Haut analog zu dem Vorgehen in der Kalotte. Die

Implantate heilten auch hier subkutan ein.

Abbildung 4: Intraoperative Bilder der Schädelkalotte (links) und des

Unterkiefers (rechts) nach der Insertion der Implantate.

4.5.3 Sektion und Entnahme der Knochenproben

Nach 30 bzw. 90 Tagen erfolgte die Opferung der Versuchstiere. Nach

Prämedikation durch eine intramuskuläre Injektion von Azaperone (1mg/kg KG)

(Stresnil®, Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Deutschland) und Midazolam (1mg/kg

KG) (Dormicum®

, Hoffmann-La Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) wurden

die Schweine durch eine intravasale Injektion von 20%iger Pentobarbitallösung in

21

die Ohrvene getötet. Im Anschluss wurden die Kalotten und Unterkiefer reseziert

und bis zur Aufbereitung bei -80° C tiefgefroren.

4.6 Aufbereitung der Knochenproben

Nach dem Auftauen der Kalotten und Unterkiefer wurden ca. 15 cm3 große

Knochenblöcke mit einer Diamantbandsäge (Exakt 310, Exakt Apparatebau

GmbH, Norderstedt, Deutschland) so separiert, dass sich die Implantate möglichst

zentral im jeweiligen Knochenblock befanden. Zur Lokalisation der

Implantatposition wurden zuvor Röntgenaufnahmen mit einem Tischröntgengerät

(Faxitron R®, Faxitron x-ray Corporation, Illinois, USA) (45kV, 0,25 mA, 5 min

Belichtungszeit) angefertigt.

Die Fixierung der Proben fand für 4 Tage in 1,4%igem Paraformaldehyd (PFA)

bei -4°C statt, um die Proteine in ihrer biologischen Aktivität zu konservieren und

die organische Matrix zu insolubilisieren. Da Paraformaldehyd an Proteine bindet

und somit verbraucht wird, wurde das Reagenz täglich erneuert. Die weitere

Behandlung der Proben erfolgte nach dem von Heraeus‐Kulzer beschriebenen

Immersionsverfahren für Technovit 9100 NEU® [63]. Dieses Kaltpolymerisat auf

Methylmethacrylat-Basis hat sich v.a. im Hinblick auf den Erhalt von Antigenen

und der Speicherung der Enzymaktivität als Polymerisationssystem in der

histologischen Untersuchung von mineralisierten Geweben etabliert und erlaubt

das nach Donath und Breuner beschriebene Trenn-Dünnschliffverfahren [34, 168,

170]. Im ersten Schritt wurden dabei die Proben in einer aufsteigenden

Alkoholreihe im Entwässerungsautomaten (Shandon Citadel 1000®, Shandon

GmbH, Frankfurt, Deutschland) bei Zimmertemperatur dehydriert. Nach dem

Einsatz von Xylol als Intermedium erfolgte eine zweistufige Präinfiltration mit

anschließender Infiltration der Prüfkörper durch Technovit 9100 NEU® in

Kunststoffeinbettformen (Heraeus‐Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland). Die

Auspolymerisation unter Sauerstoffausschluss bei -4°C im Gefrierschrank dauerte

72 Stunden.

Nach Reduzierung der Kunststoffüberschüsse mit einer Diamantbandsäge (Exakt

310®, Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) wurden die Proben

22

so gesägt, dass zwei Knochenhälften mit jeweils einem längshalbierten Implantat

entstanden sind. Aus den einen Hälften wurden die Mikroradiografien angefertigt

und aus den anderen die immunhistologischen Schnitte.

4.7 Mikroradiographie

4.7.1 Herstellung der Mikroradiographien

Die Knochenproben wurden an ihren Außenflächen plan angeschliffen und unter

der Verwendung einer Klebepresse (Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt,

Deutschland) mit Technovit 4000®

(Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer, Werheim,

Deutschland) auf zuvor angeraute Plexiglas-Objektträger fixiert. Im nächsten

Schritt wurden die Probenoberflächen mithilfe einer Präzisions-Schleifmaschine

(Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) und Schleifpapier

aufsteigender Körnung (320, 800, 1200 und 4000) unter Wasserkühlung

hochglanzpoliert. Danach wurden die Knochenblöcke mit ihrer polierten

Implantatseite mit Technovit 7200® (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer,

Werheim, Deutschland) auf planparellele Objektträger geklebt. Nach der

Erstellung ca. 300 μm dünner Probenscheiben mit einer Diamantbandsäge (Exakt

310, Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) wurden diese mit der

Schleifmaschine auf eine Dicke von ca. 100 μm reduziert und anschließend mit

einem Tischröntgengerät (Faxitron R®, Faxitron x- ray Corporation, Illinois,

USA) (13,5 kV, 2,5 mA, 150s) belichtet. Um möglichst hohe Auflösungen zu

erreichen, wurde der Objekt-Film-Abstand so klein wie möglich gehalten. Die

Röntgenbilder wurden dann entwickelt, mit einem Flachbrettscanner (Epson 4990

Photo®, Epson GmbH, Meerbusch, Deutschland) in Graustufen (8bit, 1200dpi)

digitalisiert und im unkomprimierten tiff-Format gespeichert.

23

Abbildung 5: Die Schliffpräparate wurden mit dem Tischröntgengerät Faxitron®

geröntgt, mit einem hochauflösenden Scanner digitalisiert und mit einer

Bildbearbeitungssoftware zugeschnitten und kontrastiert.

4.7.2 Auswertung der Mikroradiographien

Die Auswertung der Mikroradiographien erfolgte mit dem Bildanalyse-Programm

Bioquant Osteo® (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, USA). Mit

dieser Software lassen sich gleiche Farbwerte bzw. Graustufen markieren, so dass

es möglich ist, Knochenstrukturen quantitativ zu erfassen. Es wurde je eine gleich

große region of interest (ROI) links und rechts des Implantates definiert und der

mineralisierte Knochen markiert. Bioquant OSTEO errechnete daraus den

prozentualen Flächenanteil der markierten Bereiche an der Gesamtfläche der ROI.

Die ermittelten Werte geben die Knochenmineralisationsrate wieder [12].

24

Abbildung 6: Darstellung der regions of interest (ROI) zur Auswertung der

Mikroradiographien. Pro Implantatseite wurde eine ROI gleicher Größe

definiert.

Abbildung 7: Auswertung einer ROI mit Bioquant Osteo®

. Nach der Festlegung

der ROI (grünes Rechteck) wird der mineralisierte Knochen (rotgefärbter

Bereich) und die Implantatfläche innerhalb der ROI (blaugefärbter Bereich)

markiert. Das Bildanalyseprogramm errechnet daraus den prozentualen

Flächenanteil des mineralisierten Knochens an der Gesamtfläche der ROI

abzüglich der Implantatfläche. Die Knochenmineralisationsrate beträgt in diesem

Beispiel 34,74 % (P3 BV/T-1

).

25

4.8 Immunhistochemie

Unter Immunhistochemie versteht man ein Verfahren zur spezifischen

Markierung von Proteinen durch mono- oder polyklonale Antikörper, das mit

einem Detektionssystem kombiniert wird [84]. Durch die Spezifität der

verwendeten Antikörper lässt sich die Verteilung bestimmter Antigene im

histologischen Schnitt lichtmikroskopisch sichtbar machen.

Knochenmatrixproteine sind substanziell an Knochenregenerations- und

Knochenumbauprozessen beteiligt. Die quantitative Detektierung dieser Proteine

im Knochen lässt daher Rückschlüsse auf die ablaufenden

Knochenstoffwechselprozesse zu.

4.8.1 Anfertigung der Mikrotomschnitte

Um die Mikrotomschnitte herstellen zu können, mussten im ersten Schritt die

Implantate aus den Knochenproben entfernt werden. Die Explantation erfolgte

unter permanenter Wasserkühlung mithilfe eines chirurgischen Handstücks und

einer Lindemannfräse, indem periimplantär vorsichtig Kunststoff und Knochen

abgetragen wurde bis das Implantat soweit mobil war, dass es mit einer

Flachspitzzange entnommen werden konnte. Die Knochenabtragung erfolgte

dabei nur in den Probenbereichen, die für die Auswertung irrelevant waren. Im

nächsten Schritt wurden die Hohlräume, die durch die Entfernung der Implantate

entstanden sind, wieder mit Technovit 9100 NEU® aufgefüllt. Die

Auspolymerisation des Kunststoffes im Gefrierschrank bei -4°C dauerte 72

Stunden. Die Resektate wurden dann mit einem Kaltpolymerisat (Technovit

3040®, Heraeus‐Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) auf einem Objekthalter

(Simport®, Beloeil QC, Canada) befestigt, um anschließend am

Rotationsmikrotom (Leica RM2165®, Leica Microsystems, Nussloch‐Heidelberg,

Deutschland) Gewebeschnitte herstellen zu können. Mit dem Mikrotom wurden

ca. 5 μm dünne Präparateschnitte hergestellt, mit 60%igem Alkohol auf

Objektträger (SuperfrostPlus®, Menzel GmbH & CoKG, Braunschweig,

Deutschland) geschwemmt und mit einer 0.025 mm dicken Polyethylenfolie

abgedeckt. Die Gewebeschnitte wurden anschließend in einer Spindelpresse bei

26

57°C für 24 Stunden komprimiert. Nach dem Trocknen wurde die

Polyethylenfolie entfernt und die Proben bis zur immunhistologischen Färbung in

Präparatekästen aufbewahrt.

4.8.2 Labeled Streptavidin Biotin Methode

Die Färbevorgänge in dieser Versuchreihe wurden mit dem Dako REAL®

Detection System Peroxidase/AEC Rabbit/Mouse im Dako Autostainer Plus®

(Dako GmbH, Glostrup, Dänemark) durchgeführt. Dieser Kit beruht auf der

Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode (LSAB), einem indirekten immunhisto-

chemischen Nachweisverfahren. Hierbei bindet zunächst ein spezifischer,

unkonjugierter Primärantikörper an das nachzuweisende Antigen der Probe.

Danach gibt man einen spezifisch gegen die Tierspezies des Primärantikörpers

gerichteten, mehrfach biotinylierten Sekundär- bzw. Brückenantikörper hinzu. Im

nächsten Schritt wird meerrettichperoxidase-konjugiertes Streptavidin beigefügt,

wobei man sich hier die Affinität von Streptavidin zu Biotin zunutze macht. Das

aus dem Bakteriengattung Streptomyces avidinii isolierte Protein Avidin besitzt

vier identische Untereinheiten, die jeweils ein Molekül Biotin irreversibel binden

können. Dadurch, dass jeder der Brückenantikörper mehrfach biotinyliert ist und

somit mehrere Bindungsstellen für das peroxidasekonjugierte Streptavidin

aufweist, kommt es zu einer Amplifikation und Erhöhung der Empfindlichkeit des

Detektionsverfahrens. Im letzten Schritt wird eine Chromogenlösung bestehend

aus 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC) und Wasserstoffperoxid zugegeben. AEC

wird nun, unter der katalytischen Wirkung der an Streptavidin gebundenen

Peroxidase, durch H2O2 in ein rotbraunes Farbprodukt umgesetzt. Damit sind im

histologischen Schnitt die Bereiche des Zielgens (Kollagen I und Osteocalcin)

rotbraun gefärbt. Nach der Detektierung des Zielgens erfolgte eine selektive

Kernfärbung mit Haemalaun. [84, 110]

Eine Negativkontrolle wurde für jede Probe mitgeführt. Detaillierte

Färbeprotokolle sind dem Anhang zu entnehmen.

27

Antikörper Hersteller Typ gewonnen Konzentr.

Aus

Kollagen I Abcam, Cambridge, monoklonal Maus 1:10´000

(Col- I) USA

Osteocalcin Takara, Bio Inc., monoklonal Maus 1:10´000

(OC 4-30) Japan

Tabelle 1: Beschreibung der verwendeten Antikörper.

Abbildung 8: Schematische Darstellung der Labeled-Streptavidin-Biotin-Methode

(LSAB-Methode).

28

4.8.3 Auswertung der immunhistologischen Schnitte

Die ROIs der gefärbten Gewebeschnitte wurden unter dem Mikroskop (AX10®,

Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) bei 20-facher Vergrößerung mit einer

Digitalkamera (Axio Cam®, Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) fotografiert

und im unkomprimierten tiff-Format gespeichert. Die Evaluierung der digitalen

Bilder erfolgte, wie die der Mikroradiografien, mit Bioquant Osteo®

(Bioquant

Image Analysis Corporation, Nashville, USA). Die gewählten

Auswertungsbereiche und das Vorgehen sind den Abb. 9 und 10 zu entnehmen.

Abbildung 9: Darstellung der regions of interest (ROI) zur Auswertung der

immunhistochemischen Schnitte. Pro Implantatseite wurden zwei ROIs identischer

Größe im Bereich des Knochen-Implantat-Interfaces definiert (ROI 1-4).

Zusätzlich wurde ein weiterer Bereich im ortständigen Knochen gewählt, der zur

Bestimmung der Standardexpression der Knochenmatrixproteine diente (ROI 5).

29

Abbildung 10: ROI-Auswertung einer Osteocalcin-Färbung mit Bioquant Osteo®.

Immunhistologisch angefärbte Osteocalcin-Bereiche (rote Flächen) wurden mit

Hilfe des Bildanalyseprogrammes markiert und daraus der prozentuale

Flächenanteil der Osteocalcin-exprimierenden Bereiche an der Gesamtfläche der

ROI berechnet. In diesem Beispiel liegt die Osteocalcin-Expressionsrate bei

20,38% (P3 BV/T-1

).

4.9 Statistik

Die Auswertung der Proben erfolgte durch zwei Untersucher, wobei die Werte für

jede Probe aggregiert und mit arithmetischem Mittelwert und

Standardabweichung angegeben wurden. Für die graphische Darstellung der

gewonnenen Daten kam das Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2007®

(Microsoft Corp., Redmond, USA) zur Anwendung. Zur Verifizierung der

Ergebnisse wurde der Wilcoxon-Rank-Test mit dem Programm AXUM® (Math-

Software, Cambridge, USA) durchgeführt. Ab einem p-Wert < 0.05 wurden die

verglichenen Daten als signifikant betrachtet.

30

5 Ergebnisse

5.1 Mikroradiographie

5.1.1 Schädelkalotten

Abbildung 11: Periimplantäre Knochendichte [%] in der Schädelkalotte.

Gesunde Stoffwechsellage:

30 Tage p.o. ließ sich bei den Schädelkalottenproben mit SLA®

-beschichteten

Implantaten eine Knochenmineralisationrate von 58,58% ± 7,09% und in der mit

SLActive®

-beschichteten Implantatgruppe von 69,30% ± 8,44% nachweisen.

An Tag 90 zeigte die SLA®

-Gruppe eine periimplantäre Knochendichte von

56,75% ± 14,23% und die SLActive®

-Gruppe von 68,96% ± 12,20%.

Diabetische Stoffwechsellage:

30 Tage p.o. betrug die periimplantäre Knochendichte der SLA®

-Gruppe 55,77%

± 7,15% und die der SLActive®

-Proben 62,80% ± 8,91%.

Nach 90 Tagen fiel die Knochenmineralisationsrate in der SLA®

-Gruppe auf

48,86% ± 17,68% und in der SLActive®-Gruppe auf 61,13% ± 18,43% ab.

31

Signifikante Unterschiede ergaben sich beim Vergleich von:

SLA®

, 30 Tage, gesund und SLActive®, 30 Tage, gesund (p= 0,0034)

SLA®

, 30 Tage, diabetisch und SLActive®

30 Tage, diabetisch (p=0,0443)

SLA®

, 90 Tage, gesund und SLActive®, 90 Tage, gesund (p= 0,0343)

SLA®

, 90 Tage, diabetisch und SLActive®

90 Tage, diabetisch (p=0,050)

5.1.2 Unterkiefer

Abbildung 12: Periimplantäre Knochendichte [%] im Unterkiefer.

Gesunde Stoffwechsellage:

30 Tage p.o. zeigten die Unterkieferproben mit SLA®

-beschichteten Implantaten

eine Knochenmineralisationrate von 74,94% ± 2,26% und die mit SLActive®

-

beschichtete Implantatgruppe von 66,73% ± 8,67%.

An Tag 90 ließ sich in der SLA®

-Gruppe eine periimplantäre Knochendichte von

77,81% ± 9,31% und in der SLActive®

-Gruppe von 75,06% ± 10,54%

nachweisen.

32

Diabetische Stoffwechsellage:

30 Tage p.o. betrug die periimplantäre Knochendichte der SLA®

-Gruppe 71,52%

± 10,62% und die der SLActive®

-Proben 62,78% ± 14,84%.

Zum Opferungszeitpunkt nach 90 Tagen stieg die Knochenmineralisationsrate in

der SLA®

-Gruppe auf 73,31% ± 11,89% und in der SLActive®

auf 74,59% ±

10,26% an.

Signifikante Unterschiede ergaben sich beim Vergleich von:

SLA®

, 30 Tage gesund und SLActive®, 30 Tage, gesund (p=0,0248)

SLA®

, 30 Tage, diabetisch und SLActive®

, 30 Tage, diabetisch (p=0,0386)

SLActive®

, 30 Tage, gesund und SLActive®

, 90 Tage, gesund (p=0,0334)

SLActive®

, 30 Tage, diabet. und SLActive®

, 90 Tage, diabet. (p=0,0038)

Abbildung 13: Halbierte Schliffprobe mit korrespondierender Mikroradiografie.

33

5.2 Immunhistologie

5.2.1 Kollagen I

5.2.1.1 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 30 Tage

Abbildung 14: Periimplantäre Kollagen I-Expression / Fläche [%] der

Schädelkalotten nach 30 Tagen.

30 Tage p.o. betrug die periimplantäre Kollagen I-Expression der Schädelkalotten

der stoffwechselgesunden Versuchstiere in der SLA®

-Gruppe 24,19% ± 9,94%. In

der SLActive®

-Gruppe belief sich der Wert für die Kollagen I-Expression auf

23,75% ± 9,89%.

Bei den diabetischen Tieren lag der Mittelwert in der SLA®

-Gruppe bei 28,26% ±

7,71% und in der SLActive®

-Fraktion bei 22,54% ± 6,06%. Die Standard-

Kollagen I-Expression der stoffwechselgesunden Tieren betrug im Mittel 23,75%

± 3,15% , die der diabetischen Tiere 25,63% ± 7,01%.

Die diabetische SLA®

-Gruppe zeigte im Vergleich zur SLActive®

-Gruppe eine

signifikant höhere Kollagen I-Expression (p=0,0189).

34

5.2.1.2 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 90 Tage

Abbildung 15: Periimplantäre Kollagen Typ I-Expression/Fläche [%] der

Schädelkalotten nach 90 Tagen.

90 Tage p.o. betrug die periimplantäre Kollagen I-Expression der Schädelkalotten

der stoffwechselgesunden Tiere in der SLA®

-Gruppe 25,51% ± 2,77%. In der

SLActive®

-Fraktion ließ sich ein Mittelwert von 21,15% ± 5,43% nachweisen.

Die Standard-Kollagen I-Expression bei stoffwechselgesunden Tieren lag im

Mittel bei 23,00% ± 2,80%.

Bei den diabetischen Tieren zeigte sich in der SLA®

-Gruppe ein Mittelwert von

25,81% ± 5,02% und in der SLActive®-Fraktion von 21,97% ± 8,47%. Die

Standardexpression der diabetischen Versuchstiergruppe nach 90 Tagen lag bei

23,18% ± 8,84%.

Es konnte ein signifikanter Unterschied zwischen der SLA®

- und SLActive®

-

Beschichtung der gesunden Tiere nachgewiesen werden (p=0,0254).

35

5.2.1.3 Opferungszeitpunkte im Vergleich

Abbildung 16: Periimplantäre Kollagen Typ I-Expression/Fläche [%] der

Schädelkalotten.

Abbildung 17: Exemplarische Kollagen I-Färbung (20x Vergrößerung). Die

Kollagen I-Fasern sind im immunhistologischen Schnitt als rotgefärbte Bereiche zu erkennen.

36

5.2.2 Osteocalcin

5.2.2.1 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 30 Tage

Abbildung 18: Periimplantäre Osteocalcin-Expression/Fläche [%] der

Schädelkalotten nach 30 Tagen.

Am Opferungstag 30 betrug die periimplantäre Osteocalcin-Expression der

Schädelkalotten der stoffwechselgesunden Versuchstiere in der SLA®

-Gruppe

16,48% ± 5,24%. In der SLActive®

-Gruppe belief sich der Mittelwert auf 19,94%

± 5,44%. Die Standard-Osteocalcin-Expression bei stoffwechselgesunden Tieren

im ortständigen Knochen lag im Mittel bei 17,75% ± 5,25%.

Bei den diabetischen Versuchstieren ließ sich in der SLA®

-Gruppe eine

Osteocalcin-Expression von 22,10% ± 3,44% und in der SLActive®

-Fraktion von

17,64% ± 6,23% nachweisen. Die Standard-Expression bei den diabetischen

Tieren betrug 14,06% ± 6,09%.

Signifikante Unterschiede ließen sich nachweisen zwischen:

SLA®

, gesund und SLA®, diabetisch (p=0,0002)

SLA®

, diabetisch und SLActive® diabetisch (p=0,0189)

37

5.2.2.2 Ergebnisse zum Opferungszeitpunkt 90 Tage

Abbildung 19: Periimplantäre Osteocalcin-Expression/Fläche [%] der

Schädelkalotten nach 90 Tagen.

An Tag 90 betrug die periimplantäre Osteocalcin-Expression der Schädelkalotten

der stoffwechselgesunden Tiere in der SLA®

-Gruppe 25,36% ± 5,70%. In der

SLActive®

-Fraktion ließ sich ein Mittelwert von 20,80% ± 5,81% nachweisen.

Die Standard-Osteocalcin-Expression bei stoffwechselgesunden Tieren im

ortständigen Knochen lag im Mittel bei 17,04% ± 5,76%.

Bei den diabetischen Tieren zeigte sich in der SLA®

-Gruppe ein Mittelwert von

20,21% ± 4,73% und in der SLActive®-Fraktion von 20,79% ± 5,14%. Die

Standard-Expression der diabetischen Tieren betrug 15,16% ± 5,11%.

Es konnten keine Signifikanzen nachgewiesen werden.

38

5.2.2.3 Opferungszeitpunkte im Vergleich

Abbildung 20: Periimplantäre Osteocalcin-Expression/Fläche [%] der

Schädelkalotten.

Beim Vergleich der beiden Opferungszeitpunkte ergab sich ein signifikanter

Anstieg der Osteocalcin-Expression der SLA®

-beschichteten Implantate der

stoffwechselgesunden Tiere (p=0,023).

Abbildung 21: Exemplarische Osteocalcin-Färbung (20x Vergrößerung).

Osteocalcin-exprimierende Bereiche stellen sich im immunhistologischen Schnitt

als Rotfärbung dar.

39

5.3 Wertetabelle

Knochendichte [%] Kollagen I-Expr. [%] Osteocal.-Expr. [%]

Kalotte Unterkiefer Kalotte Unterkiefer

30 Tage

Diabetisch SLA®

55,77 ± 7,15 71,52 ± 10,62 28,26 ± 7,71 22,10 ± 3,44

SLActive® 62,79 ± 8,91 62,78 ± 14,84 22,54 ± 6,06 17,64 ± 6,23

Gesund SLA® 58,85 ± 7,09 74,94 ± 2,26 24,19 ± 9,94 16,48 ± 5,24

SLActive® 69,30 ± 8,43 66,73 ± 8,67 23,75 ± 9,89 19,94 ± 5,44

90 Tage

Diabetisch SLA® 48,86 ± 17,63 73,31 ± 11,89 25,81 ± 5,02 20,21 ± 4,73

SLActive®

61,13 ± 18,43 74,59 ± 10,26 21,97 ± 8,47 20,79 ± 5,14

Gesund SLA® 56,75 ± 14,23 77,81 ± 9,31 25,51 ± 2,77 25,36 ± 5,70

SLActive® 68,96 ± 12,20 75,06 ± 10,54 21,15 ± 5,43 20,80 ± 5,81

Tabelle 2: Wertetabelle zur Knochendichte und der Expression von Kollagen I

und Osteocalcin.

40

6 Diskussion

Diabetes mellitus ist eine endokrine Stoffwechselstörung mit dem Leitbefund

einer chronischen Hyperglykämie, der ein relativer oder absoluter Insulinmangel

zugrunde liegt [141]. Es wird dabei zwischen zwei Hauptformen unterschieden:

Beim Diabetes mellitus Typ 1 können in Folge einer progredienten Zerstörung der

insulinproduzierenden β-Zellen in den Langerhansschen Inseln des Pankreas

physiologische Insulinkonzentrationen nicht aufrecht erhalten werden. Die

Ursache der autoimmunologischen Destruktion der β-Zellen des Pankreas ist noch

nicht vollkommen verstanden, eine genetische Prädisposition gilt jedoch als

gesichert [20, 28, 45, 119]. Zu Beginn der Erkrankung kommt es zu einer

periinsulären Infiltration von Lymphozyten, die dann durch eine zytotoxische T-

Zellreaktion eine entzündliche Reaktion der β-Zellen hervorrufen. Dieser als

Insulitis bezeichnete Zustand führt im weiteren Verlauf zu einer Zerstörung der

insulinproduzierenden Zellen [46, 60, 137]. Beim Typ 2-Diabetes kommt es zu

keinem autoimmunologisch vermittelten Untergang der β-Zellen. Die Ursache für

die Hyperglykämie liegt hier in einer Insulinresistenz der Zielgewebe

(Muskulatur, Fettgewebe, Leber) und einer gestörten Insulinsekretion [38, 130,

157]. Als mögliche Ursachen werden genetische Defekte der Rezeptoren, eine

verminderte Rezeptorendichte der Zielgewebe oder Störungen der intrazellulären

Signaltransduktion diskutiert [141].

Diabetes mellitus gilt als relative Kontraindikation für die Insertion dentaler

Implantate, da die Verlustrate im Vergleich zum gesunden Patienten erhöht ist

[39, 73, 101]. Über die pathologischen Mechanismen, die beim Diabetiker zu

einem erhöhten Implantatverlust-Risiko führen, wird in der Literatur zur Zeit

kontrovers diskutiert [73, 80, 98, 131]. Dies mag an der Tatsache liegen, dass die

tierexperimentellen Studien zu dieser Problematik bislang widersprüchlich sind

und klinische Studien a priori nur eingeschränkte Möglichkeiten besitzen, die

genauen pathologischen Ursachen für die veränderte biologische Reaktion auf die

Implantatsetzung zu eruieren. Unser Versuchsaufbau basiert daher auf einem

diabetischen Tiermodell, das die Diabetes-Kriterien der WHO [169] und ADA [4]

einschließt und somit eine hohe Übertragbarkeit auf den Menschen gewährleistet.

41

Das Ziel dieser Studie war es, aufzuzeigen, welche Auswirkungen der Diabetes

auf den periimplantären Knochenstoffwechsel hat. Darüber hinaus wurde der

Einfluss einer modifizierten Oberfläche auf die Osseointegration eines

Implantates bei einem diabetisch veränderten Knochen untersucht.

Die Auswertung der Mikroradiografien zeigt, dass die periimplantäre

Knochendichte bei den diabetischen Tieren im Vergleich zur

stoffwechselgesunden Kontrollgruppe zu beiden Opferungszeitpunkten verringert

war. Dies deckt sich mit den Ergebnissen nach Gerritsen et al. und Takeshita et

al., die an diabetischen Ratten ebenfalls signifikant geringere periimplantäre

Knochendichtewerte nachgewiesen haben [48, 151]. Iyama et al. konnte in einer

der ersten Studien an diabetischen Ratten, in der Hydroxylapatit-beschichtete

Implantate gesetzt wurden, zeigen, dass Diabetes die Knochenbildung und

Knochenmineralisierung deutlich einschränkt [70]. Neugebildeter periimplantärer

Knochen wird zudem als unreif und weniger organisiert beschrieben [108]. Giglio

et al. bestätigte in einer späteren Studie, dass Diabetes den periimplantären

Knochenheilungsprozess verzögert und zu qualitativen und quantitativen

Einschränkungen des neu gebildeteten Knochen führt [50]. So wurde bei den

diabetischen Versuchstieren 14 Tage postoperativ immer noch Geflechtknochen

und 30 Tage p.o. nur eine dünne Schicht lamellären Knochens gefunden. In der

gesunden Kontrollgruppe hingegen konnte nach 14 Tagen fast ausschließlich

lamellärer Knochen nachgewiesen werden [50].

Hauptursache für die klinischen Folgen des Diabetes ist die chronische

Hyperglykämie [72], jedoch sind die Mechanismen auf molekularer Basis noch

nicht vollständig verstanden. Nachgewiesen ist aber, dass sog. „advanced

glycation endproducts“ (AGEs) pathophysiologisch eine Schlüsselrolle bei der

Entstehung diabetischer Begleiterkrankungen einnehmen [3, 72, 118]. AGEs sind

eine heterogene Gruppe von Molekülen, die bei der nicht-enzymatischen Reaktion

von reduzierten Zuckern (Glucose) mit freien Aminogruppen von Proteinen,

Lipiden und Nukleinsäuren entstehen. Das Produkt dieser Reaktion ist eine

Schiff´sche Base, welche sich spontan zu einem Amadori-Produkt umwandelt.

Bekanntestes Beispiel dafür ist das Hämoglobin HbA1c, das aufgrund seiner

schnellen Nachweisbarkeit als wichtiger diagnostischer Marker für die Diabetes-

Erkrankung dient. In der letzten Phase der Glykierung entstehen aus diesen

42

Amadori-Produkten die irreversiblen und protease-resistenten Komplexe der

AGEs. Der Überschuss an Glucose im Blut beim Diabetiker führt über die oben

genannten Reaktionen zu einem irreversiblen Anstieg der AGEs [57, 118]. Der

erhöhte Spiegel an AGEs führt nun zu einigen Veränderungen, wobei die

Auswirkungen auf das Gefäßsystem am besten erforscht sind. Es gibt drei

wesentliche wissenschaftliche Hinweise, die für die Beteiligung der advanced

glycation endproducts an der Entstehung von Mikroangiopathien sprechen:

Erstens ließ sich ein direkter Zusammenhang zwischen der Akkumulation von

AGE-modifizierten Proteinen und dem Ausprägungsgrad der Mikroangiopathie

bei diabetischen Tieren und Menschen nachweisen [9, 90].

Zweitens entwickelten nicht-diabetische Tiere nach Injektionen von AGE-

modifizierten Proteinen Mikroangiopathien [161].

Drittens konnte gezeigt werden, dass der AGE-Inhibitor Aminoguanidin die

Entwicklung und das Fortschreiten von mikrovaskulären Veränderungen

verhindern kann [59, 148].

Die eingeschränkte Wundheilung beim Diabetiker ist zu großen Teilen auf eine

gestörte Angiogenese zurückzuführen [89]. Da eine gute Vaskularisation die

Grundvoraussetzung für eine regelrechte Knochenheilung und –mineralisation ist

[21, 51], limitieren angiopathische Veränderungen somit auch die periimplantären

Stoffwechselprozesse im Knochen und haben damit womöglich auch einen

inhibierenden Effekt auf die Knochenmineralisierung. Dies deckt sich mit der

Tierversuchsstudie von Quintero et al., die zu dem Schluss kamen, dass erhöhte

AGE-Konzentration sowohl zu einem verringerten Knochenumsatz, als auch zu

einer verzögerten Osseointegration führen [128]. Neben den Auswirkungen der

AGEs auf das Gefäßsystem wird auch über den Einfluss auf die Expression von

Knochenmatrixproteinen und Zytokinen diskutiert. So berichten Javed et al. in

diesem Zusammenhang von einer Abnahme der Osteocalcin-Expression und

einem Anstieg bestimmter proinflammatorischer Zytokine wie IL-1β oder IL-6

[73]. Die Idee, dass der Knochen eine inflammatorische Reaktion auf den

Diabetes zeigt, wurde schon von Iacopino et al. formuliert [68]. Diese führen im

Allgemeinen zu einer vermehrten Formation von Osteoklasten und einem

erhöhten Knochenabbau [73].

43

Neben der gestörten Angiogenese und der dadurch eingeschränkten Wundheilung

[89], hat der Diabetes auch Auswirkungen auf den Osteoblasten. Die

Hyperglykämie beeinflusst osteoblastäre Signalwege und behindert die

Expression von Genen, die essentiell für die Osteoblastenreifung sind, dies führt

zu einer verminderten Calciumaufnahme im Osteoblasten und dadurch zu einer

geringeren Knochenmineralisation [6, 172]. Wie Lu et al. berichten, produzieren

diabetische Mäuse zwar die selbe Menge an unreifem mesenchymalen Gewebe

wie gesunde Tiere, jedoch sind sie nicht in der Lage, adäquat Gene zu

exprimieren, die die Osteoblastenreifung regulieren [87]. Santana et al. konnten

zeigen, dass Diabetes die Differenzierung von Osteoblasten inhibiert und negative

Auswirkungen auf die Sezernierung des Parathormones hat, das den Kreislauf von

Phosphat und Calcium reguliert [136]. Einhorn et al. wiesen in diesem

Zusammenhang geringere Mengen an Phosphat und Calcium sowie eine gestörte

Hydroxylapatit-Struktur nach [36]. Auch die oben beschriebenen AGEs scheinen

direkt das Wachstum, die Differenzierung und die Aktivität von Osteoblasten zu

beeinflussen. Eine entscheidende Rolle wird dabei speziellen osteoblastären

Rezeptoren für AGEs (RAGEs) zugeschrieben [91, 131]. Es wird zudem darüber

diskutiert, dass AGE-Modifikation des Kollagen I die Integrin-vermittelte

Adhäsion von Osteoblasten an die Extrazelluläre Matrix behindern und somit die

Knochenbildung beeinträchtigen [92-93].

Die Änderungen im Glukosestoffwechsel können beim Diabetiker zu einer

erhöhten Laktat-Bildung führen. Jahr et al. und Brandao-Burch et al. konnten

nachweisen, dass Osteoblasten pH-empfindliche Kanäle exprimieren, die auf

einen pH-Abfall mit einer verminderten Genexpression und Mineralisation

antworten [17, 71]. Dies könnte die Tatsache erklären, dass bei Experimenten mit

diabetischen Tieren unter gleichzeitiger Insulingabe keine Unterschiede

hinsichtlich der Implantateinheilung beschrieben wurden [81, 146]. Auch klinisch

ist bei gut eingestellten Diabetikern keine erhöhte Verlustrate zu beobachten [73].

Insofern kann die Implantattherapie bei einem suffizient kontrollierten Diabetiker

nicht als kontraindiziert gelten [99].

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die gestörte Differenzierung und

Proliferation der Osteoblasten zu einer qualitativ und quantitativ eingeschränkten

Knochenbildung führen und damit den Heilungsprozess verzögern.

44

Dass sich Diabetes negativ auf die Osteoid- und Knochenbildung als auch auf die

Knochenmineralisation auswirkt, wurde bereits in einigen experimentellen

Studien festgestellt [48, 50, 70, 108, 151]. Ob die Knochendichte in diesem

Zusammenhang eine Rolle spielt, wurde unseres Wissens bis jetzt noch nicht

erforscht. Der Knochen setzt sich histologisch aus zwei grundlegenden

Knochenformen zusammen, der Spongiosa und der Kompakta [41]. Die Kalotte

des Schweines ist mit ihrem hohen Anteil an spongiösem Knochen mit der

Makrostruktur des menschlichen Oberkieferknochens vergleichbar und weist

hinsichtlich der Knochenregeneration ein hohe Analogie zum menschlichen

Oberkiefer auf [139]. In unserer Studie zeigte sich, dass die periimplantäre

Knochendichte sowohl in der Kalotte als auch im Unterkiefer bei den diabetischen

niedriger ist als bei den stoffwechselgesunden Tieren. Diabetes scheint also

unabhängig von der Knochenmakrostruktur einen negativen Effekt auf die

Knochenmineralisierung zu haben.

Interessanterweise zeigten sich aber Unterschiede zwischen den SLA®

- und

SLActive®

-Implantaten. In der Schädelkalotte weisen die SLActive®

-Implantate

sowohl bei der diabetischen als auch bei der Kontrollgruppe eine signifikant

höhere periimplantäre Knochendichte auf. Im Unterkiefer ist dieser Effekt nicht

zu beobachten. Spongiöser Knochen, wie der der Schädelkalotte, zeichnet sich

durch eine große Oberfläche, den Kontakt zu mensenchymalen Stammzellen und

ein überdurchschnittlich gut ausgebildetes Gefäßsystem aus [31]. Während

konventionelle Titanoberflächen wie SLA® hydrophob sind, ist die SLActive

®-

Oberfläche durch ihre chemische Behandlung hydrophil. Die chemische

Modifikation der Oberfläche erhöht u.a. die Benetzbarkeit des Implantates und

beeinflusst damit den Kontakt zwischen der Implantatoberfläche und der

biologischen Umgebung [22, 134]. Bei der initialen Implantateinheilung führen

die hydrophilen Eigenschaften zu einer schnellen Adhäsion von Blut und ossären

Zellen [22]. Ursache der erhöhten Knochendichte der SLActive®

-Implantate in

der Kalotte könnte demnach in der guten Durchblutung des spongiösen Knochens

liegen. In Verbindung mit der hydrophilen Oberfläche des Implantates kommt es

zu einer erhöhten Migration von Blut und Knochenzellen und damit zu einer

vermehrten Knochenbildung. Das weniger gut differenzierte Gefäßsystem im

kortikalen Knochen kann als Erklärung dienen, dass die SLActive®

-Oberfläche

45

im Unterkiefer nicht zu einer erhöhten Knochenmineralisation führt.

Davies kam zudem zu dem Schluss, dass der spongiöse Knochen im Vergleich

zum kortikalen Knochen eine deutlich schnellere Knochenheilungszeit und

Remodelling-Geschwindigkeit aufweist [31]. Dass kein Anstieg der

Knochenmineralisationsrate in der Kalotte vom ersten zum zweiten

Opferungszeitpunkt zu beobachten war, könnte daran liegen, dass ein Großteil der

Heilungsprozesse schon innerhalb der ersten 30 Tage stattgefunden hatten. Bei

den SLActive®

-Implantaten im Unterkiefer kam es dagegen zu einem

signifikanten Anstieg der periimplantären Knochendichte nach 90 Tagen sowohl

bei den diabetischen als auch bei den gesunden Schweinen. Die Einheilung der

Implantate bzw. das Knochen-Remodelling ist hier anscheinend langsamer

abgelaufen und somit ist auch ein Anstieg der Knochendichte zum zweiten

Opferungszeitpunkt sichtbar.

In der Dissertationsarbeit von Herrn Möst wurde zusätzlich lichtmikroskopisch

der Knochen-Implantat-Kontakt (KIK) bestimmt. Hier zeigte sich bei den

diabetischen Versuchstieren analog zur niedrigeren Knochendichte auch ein

geringerer Knochen-Implantat-Kontakt [102]. In einer Reihe von Studien an

diabetischen Ratten wurde ebenfalls von einem geringeren Knochen-Implantat-

Kontakt berichtet. Siquera et al. konnten 30 Tage nach der Implantation einen um

50% geringeren Knochen-Implantat-Kontakt der diabetischen Ratten im

Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe nachweisen [146]. In zwei weiteren

Studien wurden ebenfalls signifikant geringere KIK-Werte nach 4 und 8 Wochen

beobachtet [108, 114]. Auch zu einem späteren Opferungszeitpunkt nach 12

Wochen ließ sich ein verringerter KIK finden [48]. Die Abnahme des Knochen-

Implantat-Kontaktes deutet darauf hin, dass Diabetes die Osseointegration negativ

beeinflusst [43].

Vergleicht man die beiden Opferungszeitpunkte, so ist im Unterkiefer sowohl bei

den gesunden als auch bei den diabetischen Tieren ein deutlicher Anstieg des KIK

vom ersten zum zweiten Opferungszeitpunkt zu beobachten, wohingegen sich die

Werte in der Kalotte nur geringfügig ändern [102]. Ein ähnliches Verhalten

wurde, wie oben beschrieben, auch bei der periimplantären Knochendichte

beobachtet. Auch hier mag die schnellere Knochenheilung des spongiösen

Kalottenknochens als Erklärung dienen. Die Osseointegration der Implantate

46

scheint hier zu großen Teil schon nach 30 Tagen abgeschlossen zu sein, so dass

nur geringfügige Änderungen der KIK- und Knochendichte-Werte hin zum

zweiten Opferungszeitpunkt festzustellen waren. Kotsovilis et al. kamen zu dem

Schluss, dass Diabetes zwar den Einheilungsprozess eines Implantates verzögert,

nach Abschluss der Osseointegration aber keine Unterschiede im Knochen-

Implantat-Interface erkennbar sind [80]. Diese Folgerung kann in unserer Studie

nicht bestätigt werden, da die Knochenmineralisationsrate und der Knochen-

Implantat-Kontakt bei den diabetischen Tieren auch nach 3 Monaten noch

deutlich verringert sind.

Beim Vergleich der beiden Implantatmodifikationen zeigte sich ein signifikant

höherer KIK der SLActive®

-Oberfläche in der Schädelkalotte der diabetischen

Tiere nach 90 Tagen. Wie bereits oben beschrieben, erklärt sich dies durch die

ausgeprägte Hydrophilie der Implantatoberfläche im Zusammenspiel mit der

guten Vaskularisation des spongiösen Knochens. Im Unterkiefer ließ sich nach 30

und 90 Tagen zwar auch ein höherer KIK der SLActive-Implantate bei den

diabetischen Tieren nachweisen, jedoch waren diese statistisch nicht signifikant.

Die positiven Einflüsse der SLActive®

-Oberfläche auf die Implantateinheilung

bzw. auf das Knochen-Implantat-Interface konnten schon von Buser et al. gezeigt

werden [22]. Sie berichteten von einem signifikant höheren KIK im Vergleich zur

konventionellen SLA®

-Oberfläche nach 2 und 4 Wochen Einheilungszeit und

einer früheren Formation von reifem, mineralisiertem Knochen. Ebenso konnte

eine vermehrte Knochenbildung und eine Proliferation vaskulärer Strukturen

nachgewiesen werden [143]. Auch ließen sich bis 8 Wochen nach der

Implantatsetztung höhere Ausdrehmomente bei den SLActive®

-Implantaten

finden [42]. Eine weitere Studie zeigte bei Dehiszenz-Defekten signifikant mehr

Knochen um SLActive®

-Implantate als um SLA®

-Implantate. Nach zwölf

Wochen war der Defekt um die SLActive®

-Implantate vollständig durch neuen

Knochen aufgefüllt, während sich die Knochenneubildung um die SLA®

-

Implantate auf den apikalen Bereich des Defektes beschränkte [142].

Die immunhistochemische Untersuchung der Kalottenproben muss vor dem

Hintergrund betrachtet werden, dass sowohl bei der Knochenmineralisationsrate

als auch beim Knochen-Implantat-Kontakt nur geringe Veränderungen vom ersten

zum zweiten Opferungszeitpunkt zu beobachten waren. Insofern waren auch bei

47

der immunhistologischen Untersuchung keine großen Änderungen der

Expressionsraten festzustellen.

Bei der Untersuchung der Proben zeigte sich eine höhere Kollagen I-Expression

der diabetischen Tiere im Vergleich zu den stoffwechselgesunden Tieren bei den

SLA®

-Implantaten nach 30 und 90 Tagen und bei den SLActive®

-Implantaten

nach 90 Tagen. Dies kann durch die geringere Mineralisationsrate des

diabetischen Knochens erklärt werden. Die Bildung von Knochen beginnt mit der

Synthese und Anordnung eines Kollagen I-Gerüstes. Im Anschluss wird das

Osteoid mineralisiert, indem sich Apatitkristalle entlang der Längsachse der

Kollagenfasern anordnen. Immunhistologisch anfärbbar sind v.a. die Kollagen-

Fasern, die noch nicht durch die Hydroxylapatitkristalle maskiert sind, d.h. es

werden die Kollagenfasern detektiert, die noch nicht von mineralisierter Substanz

umschlossen sind. In der Studie von Wilmowsky et al. konnte durch Trichrom-

Goldner-Färbungen gezeigt werden, dass der diabetische Knochen im Vergleich

zum gesunden Knochen größere, unmineralisierte, aber kollagenreiche Bereiche

aufweist [163]. Dies korreliert mit den Ergebnissen der mikroradiographischen

Untersuchung, bei der sich ebenfalls eine geringere Knochenmineralisation des

diabetischen Knochens zeigte. Der Abfall der Kollagen I-Expression zum zweiten

Opferungszeitpunkt lässt sich dadurch erklären, dass Kollagen I einen frühen

Marker des Knochenstoffwechsels darstellt.

Beim Vergleich der Implantatoberflächen zeigten sich nach 30 Tagen signifikant

höhere Kollagen I-Werte bei der SLA®

-Oberfläche ggü. der SLActive®

-

Modifikation. Analog dazu ließ sich eine signifikant geringere periimplantäre

Knochenmineralisation der SLA®

-Implantate nachweisen. Der höher

mineralisierte Knochen bei den SLActive®-Implantaten hat wahrscheinlich auch

hier zu einer geringeren Nachweisbarkeit von Kollagen I geführt. Zu diesem

frühen Zeitpunkt der Implantateinheilung scheint die SLActive®

-Oberfläche also

Vorteile hinsichtlich der Knocheneinheilung zu haben. Eine weitere Erklärung für

die geringere Kollagen I-Expression der SLActive®

-Implantate könnte die

beschleunigte Osseointegration der SLActive-Oberfläche® liefern. Die hohe

Hydrophilie dieser Oberfläche führt zu einer schnellen Migration von Blut und

ossären Zellen und stabilisiert dadurch das Blutkoagulum nach der

Implantatinsertion [143]. Dadurch kommt es zu einer beschleunigten initialen

48

Implantateinheilung [112, 143]. Insofern ist auch eine frühere Expression von

Knochenmatrixproteinen wie z.B. dem Kollagen I zu erwarten. Womöglich lag

das Expressionsmaximum bei den SLActive®

-Implantaten schon vor dem 30. Tag,

so dass zu diesem Untersuchungszeitpunkt aufgrund der schnelleren Heilungszeit

nur noch geringere Kollagen I-Werte gemessen werden konnten. Zum

Opferungszeitpunkt nach 90 Tagen ließ sich sowohl bei den gesunden als auch bei

den diabetischen Tieren eine höhere Kollagen I-Expression der SLA®

-Implantate

im Vergleich zu den SLActive®

-Implantaten finden. Die höheren Kollagen I-

Werte lassen sich durch den langsameren Heilungsprozess der SLA-Oberfläche

erklären, wodurch es zu einer länger anhaltenden Kollagen I-Expression kommt.

In unserer Studie zeigte sich bei den diabetischen Tieren mit SLActive®

-

Beschichtung nach 30 Tagen und mit SLA®

-Beschichtung nach 90 Tagen eine

ggü. der Kontrollgruppe verringerte Osteocalcin-Expression. He et al. konnten in

einer Studie an diabetischen Mäusen ebenfalls eine reduzierte Osteocalcin-

Expression nachweisen [62], wohingegen Verhaeghe et al. zwar von verminderten

Serum-Osteocalcin-Werten berichteten, aber keine Änderungen des Knochen-

Osteocalcins beobachteten [159]. Die verminderte Osteocalcin-Expression des

diabetischen Knochens lässt sich auf eine reduzierte osteoblastäre Aktivität

rückführen [131], die sich in unserer Studie auch bei der periimplantären

Knochendichte und dem Knochen-Implantat-Kontakt angedeutet hat. Lu et al.

konnten in diesem Zusammenhang eine verminderte Osteocalcin-mRNA-

Expression nachweisen [87]. Als mögliche Ursache der verminderten

Osteocalcin-Expression könnten auch die anfangs beschriebenen AGEs in Frage

kommen [131]. So konnten Zayzafoon et al. und Botolin & McCabe zeigen, dass

osteoblastäre Zellen unter hyperglykämischen Bedingungen eine veränderte

Genexpression zeigen, die u.a. in einer Reduktion der Osteocalcin-Expression

resultiert [16, 171-172].

Betrachtet man die zeitliche Expression von Osteocalcin, so ließ sich bis auf die

diabetische SLA®

-Gruppe ein Anstieg der Osteocalcin-Expression zum zweiten

Opferungszeitpunkt finden. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Osteocalcin

ein Marker der späten Osteoblastenaktivität ist. Zudem konnte gezeigt werden,

dass die Osteocalcin-Expression mit dem Mineralisationgrad des Knochens

korreliert [133]. Insofern war aufgrund der höheren Mineralisation zum zweiten

49

Opferungszeitpunkt auch eine erhöhte Osteocalcin-Expression festzustellen.

Beim Vergleich der beiden Implantatoberflächen ergibt sich ein uneinheitliches

Bild. Die SLActive®

-Oberfläche weist nach 90 Tagen im diabetischen Knochen

eine annähernd gleiche Osteocalcin-Expression auf wie in der gesunden

Kontrollgruppe, was auf den hohen Mineralisationsgrad des periimplantären

Knochens zurückzuführen ist. Zudem ist ein Anstieg der Osteocalcin-Expression

bei der SLActive®

-Oberfläche sowohl bei den gesunden als auch bei den

diabetischen Tieren zu beobachten, was vor dem Hintergrund, dass Osteocalcin

einen späten osteoblastären Marker darstellt, nachvollziehbar ist. Demgegenüber

stehen zwei signifikante Unterschiede in der Osteocalcin-Expression, die sich nur

schwer erklären lassen. Zum einen sind das die erhöhten Osteocalcin-Werte der

SLA-Oberfläche der diabetischen Tiere ggü. der gesunden Kontrollgruppe nach

30 Tagen. Zum anderen ließ sich eine signifikant höhere Osteocalcin-Expression

der SLA-Implantate ggü. der SLActive-Implantate bei den diabetischen Tieren

nach 30 Tagen finden. In beiden Fällen wäre eigentlich mit verminderten

Osteocalcin-Werten zu rechnen gewesen. Die Ursache für die erhöhte

Osteocalcin-Expression konnte in unserem Arbeitskreis nicht geklärt werden.

Hierbei muss angemerkt werden, dass die Regulation der Knochenbildung auf

molekularer Ebene bislang nur wenig verstanden ist, da diese Prozesse von einer

Vielzahl an Faktoren beeinflusst werden [147].

Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass der Diabetes im vorliegenden

Modell die Osseointegration dentaler Implantate negativ beeinflusst. Dies zeigt

sich sowohl in einer verminderten periimplantären Knochenmineralisation als

auch in einem verringerten Knochen-Implantat-Kontakt. Pathologische

Veränderungen sind dabei auch auf der Ebene der Knochenmatrixproteine zu

beobachten. Die steigende Zahl an Diabetikern wird den implantologisch tätigen

Zahnarzt in Zukunft immer mehr vor die Frage stellen, wie sich die

Implantattherapie und der Implantaterfolg bei diesen Patienten verbessern lässt.

Wie unsere Daten zeigen, hat die neue SLActive®

-Oberfläche einen positiven

Effekt auf die Implantateinheilung im diabetischen Knochen. Die

Oberflächenmodifizierung stellt dabei einen vielversprechenden Ansatz dar,

Heilungsvorgänge im kompromittierten Knochen zu verbessern. Die

unkomplizierte Herstellung und Anwendung könnte dieser Form der

50

Verbesserung der Implantateinheilung in Zukunft einen hohen Stellenwert

einräumen.

51

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73

8 Abkürzungsverzeichnis

ADA American Diabetes Association

AEC 3-Amino-9-Ethylcarbazol

AGE advanced glycation endproduct

BGP bone gamma carboxyglutamate protein

Bit binary digit

BV/TV bone volume/tissue volume ratio

Dpi dots per inch

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EZM Extrazellularmatrix

IL 1β Interleukin 1β

IL 6 Interleukin 6

LSAB Labeled-Streptavidin-Biotin

MEA Methoxyethylacetat

mRNA messenger Ribonucleinsäure

OC Osteocalcin

p.o. post operationem

PBS Potassium buffered salt solution

PMMA Polymethacrylmethacrylat

ROI region of interest

SLA sandblasting with large grit followed by acid etching

Tiff tagged image file format

WHO World Health Organization

74

9 Anhang

Färberezept Kollagen I

manuell: 3 x 20 min

Entacrylierung in MEA

5 x 3min

absteigende Alkoholreihe (Ethanolkonz.: 100%, 100%, 97%,90%,70%)

3 min

Aqua dest

20 min

Entkalken in 10%iger EDTA-Lösung

10 min

Ausspülen unter fließendem Leitungswasser

3 x 2 min

Aqua dest

3 x 2 min

DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4

25 min

Kochen im Citrat-Puffer mit pH 6,0 bei 95°C

25 min

Abkühlen im Citratpuffer mit pH 6,0

3 x 2min

DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4

im Autostainer: 15 min

Avidin (DAKO X0590)

Spülen mit Aqua dest

15 min

Biotin (DAKO X0590)

Spülen mit Aqua dest

20 min

Proteinblock (DAKO X 0909)

60 min

Primärantikörper Osteocalcin 1:10´000 verdünnt mit Antibody Diluent

Spülen mit Aqua dest

15 min

biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A)

Spülen mit Aqua dest

15 min

Streptavidin-AP-Komplex (Lösung B)

Spülen mit Aqua dest

8 min

Chromogen RED (DAKO K5005)

Spülen mit Aqua dest

4 min

Chromogen RED (DAKO K5005)

10 min

Spülen mit Aqua dest

manuell: 5 min

Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO S3301)

5 min

Ausspülen unter fließendem Leitungswasser

5 min

Aqua dest

Mit Aquatex eindecken

75

Färberezept Osteocalcin

manuell: 3 x 20 min

Entacrylierung in MEA

5 x 3min

absteigende Alkoholreihe (Ethanolkonz.: 100%, 100%, 97%,90%,70%)

3 min

Aqua dest

20 min

Entkalken in 10%iger EDTA-Lösung

10 min

Ausspülen unter fließendem Leitungswasser

3 x 2 min

Aqua dest

3 x 2 min

DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4

25 min

Kochen im Citrat-Puffer mit pH 6,0 bei 100°C

25 min

Abkühlen im Citratpuffer mit pH 6,0

3 x 2min

DAKO-Waschpuffer mit pH 7,4

im Autostainer: 15 min

Avidin (DAKO X0590)

Spülen mit Aqua dest

15 min

Biotin (DAKO X0590)

Spülen mit Aqua dest

30 min

Proteinblock (DAKO X 0909)

60 min

Primärantikörper Osteocalcin 1:10´000 verdünnt mit Antibody Diluent

Spülen mit Aqua dest

15 min

biotinylierter Sekundärantikörper (Lösung A)

Spülen mit Aqua dest

15 min

Streptavidin-AP-Komplex (Lösung B)

Spülen mit Aqua dest

8 min

Chromogen RED (DAKO K5005)

Spülen mit Aqua dest

6 min

Chromogen RED (DAKO K5005)

10 min

Spülen mit Aqua dest

manuell: 5 min

Gegenfärbung mit Hämalaun (DAKO S3301)

5 min

Ausspülen unter fließendem Leitungswasser

5 min

Aqua dest

Mit Aquatex eindecken

wasser

5 min

Aqua dest

Mit Aquatex eindecken

76

10 Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Dr.

Karl Andreas Schlegel für die freundliche Überlassung des Themas und für die

Unterstützung bei der Verfassung der Dissertation bedanken.

Herrn Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Dr. h.c. Friedrich Wilhelm Neukam möchte

ich für die Möglichkeit danken, die Doktorarbeit an der Mund-, Kiefer-,

Gesichtschirurgischen Klinik der FAU Erlangen - Nürnberg durchführen zu

können.

Ein besonderer Dank gilt meinem Betreuer Herrn Dr. med. dent. Cornelius von

Wilmowsky für die engagierte Betreuung und die fachliche Unterstützung. Mein

ganz persönlicher Dank gilt meinem Projektpartner Tobias Möst für die

freundschaftliche und erfolgreiche Zusammenarbeit.

Ich danke Frau S. Schönherr, Frau H. Heider und Frau E. Diebel für die wertvolle

Einarbeitung und die tatkräftige Unterstützung im Labor.

Darüber hinaus möchte ich all jenen danken, die mit Rat und persönlicher

Unterstützung zur Entstehung dieser Arbeit beigetragen haben.

Ganz besonders danke ich meinen lieben Eltern, die mir mein Studium und damit

auch diese Arbeit ermöglicht haben. Meiner Mutter bin ich für die liebevolle

Unterstützung in jeglicher Hinsicht sehr verbunden.

77

11 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Christian Seidl

Geburtsdatum und -ort: 21.07.1985 in Passau

Wohnort: Rosenstr. 1, 91781 Weißenburg in Bayern

Eltern: Markus Seidl, Schreinermeister

Erika Seidl, geb. Freier, Schneiderin

Geschwister: Florian Seidl, Donauhof-Werkstätten Passau

(Werkstatt für Behinderte / WfB)

Staatsangehörigkeit: deutsch

Schulbildung

1992-1996: Grundschule Haselbach

1996-2005: Auersperg Gymnasium Passau-Freudenhain

06/2005: Allgemeine Hochschulreife

Berufsausbildung

2005-2006: Wirtschaftsingenieurwesen-Studium

2006-2011: Studium der Zahnmedizin

03/2007: Naturwissenschaftliche Vorprüfung

08/2008: Zahnärztliche Vorprüfung

10/2009 - 06/2011: Anstellung als studentische Hilfskraft in der

Zahnklinik 1 – Zahnerhaltung und Parodontologie

03-04/2010: Famulatur am Addis Ababa College of Dental

Sciences und am Zewditu Memorial Hospital

in Addis Ababa / Äthiopien

07/2011: Staatsexamen und Approbation als Zahnarzt

08-09/2011: Famulatur am Department of Oral and Maxillo-

facial Surgery und am Department of Maxillofacial

Prosthetics der Mahidol University

in Bangkok / Thailand

seit 10/2011: Vorbereitungsassistent Praxis Dr. Schönwälder in

Weißenburg in Bayern