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Vergleichende Untersuchung der Zellapoptose mononukleärer Zellen

aus Leukozytapheresen und Leukozyten-Reduktion-System-Kammern

Der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. med.

vorgelegt von

Bettina Ziehe

aus

Ingolstadt

Als Dissertation genehmigt von der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler

Gutachter: Prof. Dr. Erwin Strasser

Gutachter: Prof. Dr. Reinhold Eckstein

Tag der mündlichen Prüfung: 12. Januar 2015

In Liebe und Dankbarkeit für meine Familie

und in Gedenken an meinen Vater

Inhaltsverzeichnis Seite

1. Zusammenfassung und Abstract 1

1.1 Zusammenfassung 1

1.1.1 Hintergrund und Ziele 1

1.1.2 Methoden 1

1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen 1

1.1.4 Praktische Schlussfolgerung 2

1.2 Summary 3

1.2.1 Background and Objectives 3

1.2.2 Materials and Methods 3

1.2.3 Results 3

1.2.4 Conclusion 4

2. Einleitung 5

2.1 Tumorvakzinen aus mononukleären Zellen 5

2.2 Die Rolle mononukleärer Zellen im Immunsystem 5

2.2.1 Die Bedeutung des Immunsystems 5

2.2.2 Funktion der Immunzellen 6

2.2.3 Die Entwicklung der Immunzellen 7

2.2.4 Mononukleäre Zellen und ihre Funktion 8

2.2.4.1 Lymphozyten 8

2.2.4.2 Monozyten und antigenpräsentierende Zellen 9

2.3 Die Apoptose 9

2.3.1 Die Bedeutung der Apoptose 9

2.3.2 Die Stadien der Apoptose 10

2.3.3 Nachweismethoden der Frühapoptose 11

2.3.3.1 Veränderung des mitochondrialen Potentials 11

2.3.3.2 Veränderung an der Plasmamembran 11

2.3.4 Nachweismethoden der Spätapoptose 11

3. Fragestellung 13

4. Material und Methoden 14

4.1 Materialien 14

4.1.1 Geräte 14

4.1.2 Einmalmaterialien 14

4.1.3 Lösungen und Reagenzien 14

4.1.4 Antikörper 15

4.2 Studienbeschreibung 15

4.2.1 Gewinnung der Leukozytenkonzentrate 16

4.2.1.1 Leukozytapherese mittels COM.TEC Zellseparator 16

4.2.1.2 Thrombozytapherese mittels Trima Accel Zellseparator 17

4.2.2 Aufbereitung der Aphereseprodukte 18

4.3 Methoden 18

4.3.1 Grundlagen der FACS Messung 18

4.3.2 Apoptosedetektion mittels Annexin V und 7AAD 21

4.3.2.1 Messeinstellung für die Annexin V-7AAD Methode 22

4.3.3 Apoptosedetektion mittels JC 1 Markierung 24

4.3.3.1 Messeinstellung für die JC 1 Methode 25

4.3.4 Apoptosedetektion mittels Apo-BrdU Markierung 27

4.3.4.1 Messeinstellung für die Apo-BrdU Methode 29

5. Statistische Auswertung 32

6. Ergebnisse 34

6.1 Spenderdaten 34

6.2 Daten des Aphereselaufs 34

6.3 Produktspezifische Daten 35

6.4 Blutzellen vor der Spende 35

6.5 Blutzellen in den Aphereseprodukten 36

6.6 Vergleich von Spenderdaten und Produktdaten 37

6.6.1 Blutzellen vor der Spende und in LRS-Kammern 37

6.6.2 Blutzellen vor der Spende und in Leukozytenkonzentraten 38

6.6.3 Annexin V-7AAD-Messung von Tregs 39

6.6.4 JC 1 Messung von Lymphozyten und Monozyten 42

6.6.5 BrdU Messung von mononukleären Zellen 43

6.7 Darstellung mittels unterschiedlicher Analysen 44

6.7.1 Annexin V-7AAD positive Tregs 44

6.7.2 JC 1 detektierte Lymphozyten und Monozyten 51

6.7.3 BrdU detektierte mononukleäre Zellen 54

6.8 Einfluss der Kurzzeitlagerung 57

6.8.1 Annexin V-7AAD positive Zellen im Aphereseprodukt 57

6.8.2 JC 1 markierte Zellen im Aphereseprodukt 62

6.8.3 BrdU markierte Zellen im Aphereseprodukt 65

6.9 Biochemische Parameter in den Aphereseprodukten 66

6.9.1 Glukoseverbrauch 66

6.9.2 Laktatanstieg 69

7. Diskussion 73

8. Literaturverzeichnis 82

9. Anlage 89

1

1. Zusammenfassung und Abstract

1.1 Zusammenfassung

1.1.1 Hintergrund und Ziele

Der Einsatz mononukleärer Zellen in Immuntherapien zur Behandlung von Krebs-

und Autoimmunerkrankungen hat dazu geführt, diese Zellen in hoher Ausbeute und

maximaler Reinheit gewinnen zu wollen. Als Mittel der Wahl hat sich die Leukozyt-

apherese erwiesen, doch auch den Leukozyten-Reduktion-System-Kammern, in

denen Leukozyten während der Thrombozytapherese angereichert werden, kommt

immer größere Bedeutung zu. Ziel dieser Arbeit war es, die Zellqualität mono-

nukleärer Zellen aus Leukozytapheresaten und Leukozyten-Reduktion-System-

Kammern mittels drei verschiedener Apoptose-Methoden während einer Kurzzeit-

lagerung von 48 Stunden vergleichend zu untersuchen.

1.1.2 Methoden

Von zehn Spendern wurden jeweils 10 ml Blut, das bei der Leukozytapherese und

aus Leukozyten-Reduktion-System-Kammern gewonnen wurde, in Beutelsysteme

aus CO2 und O2 durchlässigem Fluorethylenpropylen Teflon überführt und gelagert.

Die Messungen erfolgten innerhalb von drei Stunden nach Gewinnung, sowie nach

sechs Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden Lagerung. Das Apoptoseverhalten der

mononukleären Zellen wurde mittels Annexin V und 7-Aminoactinomycin D (7AAD),

5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanin Jodid (JC 1) und 5-

Bromo-deoxyuridin (BrdU) analysiert. Zusätzlich wurden die biochemischen Para-

meter Glukose und Laktat bestimmt.

1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

Die Leukozytenkonzentration liegt in den LRS-Kammern signifikant höher als in den

Leukozytapheresaten. Bedingt durch das höhere Produktvolumen der Leukozyt-

apheresate weisen diese aber insgesamt mehr Leukozyten auf als die LRS-

Kammern. Während in den Leukozytaphereseprodukten die Verunreinigung mit re-

sidualen Thrombozyten sehr hoch war, zeigten die LRS-Kammern eine signifikant

höhere Verunreinigung mit Erythrozyten. Der Anteil apoptotischer und nekrotischer

mononukleärer Zellen lag in den Leukozytapheresaten signifikant höher als in den

2

LRS-Kammern. In beiden Leukozytenprodukten konnte ein starker Apoptoseanstieg

nach 24 Stunden nachgewiesen werden. Ebenfalls wurde eine starke Korrelation

zwischen dem Anstieg an apoptotischen mononukleären Zellen und der Zunahme

der Laktatkonzentration nachgewiesen.

1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen

Die Apoptose-Methoden zeigten für die LRS-Kammern eine höhere Zellviabilität als

die Leukozytapheresate. Es wird vermutet, dass bei der Gewinnung mononukleärer

Zellen der oxidative Stress bei der Zellanreicherung in den LRS-Kammern deutlich

geringer ist als bei der Leukozytapherese. Beide Leukozytenprodukte weisen teil-

weise noch eine hohe Verunreinigung mit unerwünschten Blutzellen auf. Sollte eine

weitere Reduktion dieser Zellen bei gleichzeitig hoher Leukozytenausbeute möglich

sein, könnte dies die Zellqualität weiterhin verbessern. Ebenso spielt die metaboli-

sche Aktivität der Zellen für die Qualität eine große Rolle. So konnte ein deutlicher

Zusammenhang zwischen Laktatkonzentration und der Apoptoserate nachgewiesen

werden.

3

1.2 Summary

1.2.1 Background and Objectives

The use of mononuclear cells in immunotherapy for the treatment of cancer and

autoimmune diseases has led to want to gain these cells in high yield and maximum

purity. As method of choice, the leukapheresis has proven, but also the leukocyte

reduction system chambers in which leukocytes are accumulated during platelet-

pheresis becomes more and more important. The aim of this study was to compare

the quality of mononuclear cells of leukapheresis and leukocyte reduction system

chambers using three different apoptosis methods during a short-term storage of 48

hours.

1.2.2 Materials and Methods

10 ml of blood of ten blood donors, which was obtained from leukapheresis products

and leukocyte reduction system chambers was transferred and stored into bag sys-

tems of CO2 and O2 permeable Fluorethylenpropylen Teflon. Measurements were

made within three hours after collection, and after six hours, 24 hours and 48 hours

of storage. The apoptosis of the mononuclear cells was analyzed by Annexin V and

7-Aminoactinomycin D (7AAD), 5,5´,6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'tetraethylbenzimidazol-

carbocyanine iodide (JC 1) and 5-Bromo-deoxyuridine (BrdU). In addition, the bio-

chemical parameters Glukose and lactate were measured.

1.2.3 Results

The leucocyte concentration in the LRS chambers was significantly higher than in

the leukapheresis products. Due to the higher product volume of leukocyte aphere-

sis products have leukocytes were obtained from it compared to the LRS chambers.

While in leukapheresis products the contamination with residual platelets was very

high, LRS chambers showed a significantly higher contamination with residual red

blood cells. The proportion of apoptotic and necrotic mononuclear cells was signifi-

cantly higher in leukapheresis products than in the LRS chambers. In both leukocyte

products a strong increase of apoptosis could be detected after 24 hours. In addi-

tion, a strong correlation between the increase of apoptotic mononuclear cells and

the increase in lactate concentration could be detected.

4

1.2.4 Conclusion

By use of three apoptosis methods leucocytes obtained from LRS chambers

showed higher cell viability than for the leukapheresis products. It is assumed that in

the recovery of mononuclear cells the oxidative stress in cell accumulation is in the

LRS chambers significantly lower than in the leukapheresis. Both leukocyte products

contain residual blood cells. If a further reduction of the residual cells should be pos-

sible without leucocyte loss, this could still improve cell quality. The metabolic activi-

ties of cells also play a major role for the quality. Thus, a significant correlation be-

tween the lactate concentration and the rate of apoptosis could be detected.

5

2. Einleitung

2.1 Tumorvakzinen aus mononukleären Zellen

Die intensive Forschung zur Krebsbehandlung in den letzten Jahren führte dazu,

dass den mononukleären Zellen heute eine bedeutende Rolle zukommt. Es wurden

bereits einige Vakzinen für die Tumortherapie hergestellt, deren immunologische

Grundlage auf mononukleären Zellen basieren. Nach Applikation autologer Tumor-

zellen oder daraus gewonnener Oligopeptide zur spezifischen Immunisierung, soll

es nach Bindung an potente antigenpräsentierende Zellen wie den dendritischen

Zellen zu einer T-Zell Antwort kommen [9; 60]. Im Jahr 2010 wurde in der USA Sipu-

leucel-T zugelassen, eine autologe therapeutische Tumorvakzine aus aktivierten

mononukleären Zellen des peripheren Blutes, welche zur Behandlung des hormon-

resistenen Prostatakarzinoms im metastasierten Stadiums eingesetzt wird [9]. Wei-

tere Tumorvakzinen aus mononukleären Zellen, die zur Immuntherapie bei Malig-

nem Melanom und Nierenzellkarzinom eingesetzt werden sollen, werden derzeit in

klinischen Studien erprobt. Man verspricht sich davon, dem Patienten Abwehrzellen,

die in vitro mit Tumorantigenen beladen wurden zu retransfundieren, um damit das

Immunsystem auf die noch nicht erkannten Krebszellen aufmerksam zu machen.

Auch monoklonale Antikörper, die aus einem B-Lymphozytenklon generiert werden,

werden heute in der Behandlung von Krebs und Autoimmunerkrankungen einge-

setzt [9]. Daher ist es von großer Bedeutung, eine maximale Ausbeute dieser Zellen

mit hoher Reinheit zu erhalten. Es gibt daher eine Reihe von Untersuchungen zu

verschiedenen Zellseparatoren, die sich mit der Optimierung der Geräteeinstellung

zur Verbesserung des Leukozytaphereseproduktes beschäftigen [34; 77]. Es zeigte

sich, dass nicht nur im Rahmen von Leukozytapheresen eine hohe Zellausbeute an

mononukleären Zellen erzielt werden kann, sondern dass eine hohe Zellkonzentra-

tion an mononukleären Zellen bei Thrombozytapheresen in den Leukozyten-

Reduktion-System-Kammern (LRSC, leucoreduction system chamber) angereichert

werden und somit als Leukozytenquelle zur Verfügung stehen [54].

2.2 Die Rolle mononukleärer Zellen im Immunsystem

2.2.1 Die Bedeutung des Immunsystems

Das Immunsystem spielt eine bedeutende Rolle in der Entwicklung der Lebewesen.

Die Homöostase zwischen Zellerneuerung und Zellapoptose ist dabei von entschei-

dender Bedeutung. Ohne Immunsystem gäbe es keine Schutzfunktion zum Erhalt

6

unseres körperlichen Wohlergehens. Menschen, mit schweren angeborenen oder

erworbenen Immundefekten, zeigen eine hohe Anfälligkeit gegenüber pathogenen

Keimen. Da das Immunsystem hier nicht in der Lage ist adäquat zu reagieren, er-

kranken diese Menschen an opportunistischen Infektionen, die häufig auch zum

Tode führen. Der Schutz des Immunsystems beschränkt sich aber nicht nur auf kör-

perfremde pathogene Keime, es bewahrt uns auch vor körpereigenen Prozessen,

die unter Umständen tödlich verlaufen könnten. So entstehen tagtäglich im gesun-

den Organismus Tumorzellen, die allerdings in der Regel sofort erkannt und elimi-

niert werden. Ebenso besitzt unser Immunsystem Mechanismen, um uns vor auto-

immunen Prozessen zu bewahren. Dies lässt darauf schließen, dass Menschen, die

an Tumorerkrankungen oder Autoimmunerkrankungen leiden, eine Fehlfunktion im

Immunsystem aufweisen [33].

2.2.2 Funktion der Immunzellen

Im Immunsystem besteht eine enge Beziehung zwischen zellulären und humoralen

Bestandteilen sowie zu den lymphatischen Organen. Es lassen sich sowohl eine

angeborene als auch eine erworbene Immunabwehr unterscheiden. Die angeborene

Immunabwehr agiert innerhalb von Stunden nach Aktivierung. Die Zellen der ange-

borenen Immunabwehr, die Granulozyten, Natürlichen Killerzellen, Monozyten und

Makrophagen erkennen mit speziellen Rezeptoren für pathogene Strukturen die

krankheitsverursachende molekulare Struktur, das sogenannte PAMP der Erreger

[68]. Zusätzlich werden humorale Abwehrmechanismen, wie das Komplementsys-

tem, Lysozyme und Interferone aktiviert. Im Gegensatz zur angeborenen Abwehr

muss sich die erworbene Immunabwehr erst entwickeln. Sie wird erst nach Tagen

aktiv. Hierbei spielen zwei Zelltypen eine große Rolle. Die T-Lymphozyten für die

zelluläre Immunantwort und die B-Lymphozyten für die humorale Immunantwort.

Beide Zelltypen erkennen spezielle Proteinstrukturen, die Antigene auf Krankheits-

erregern. Aktivierte B-Lymphozyten produzieren nach Antigenkontakt Antikörper,

während die T-Lymphozyten mittels einer Subpopulation selbst in der Lage sind die

infizierte Zelle abzutöten [55].

7

Abb.1: Übersicht über die Abwehrmechanismen

Abwehrmechanismus

Angeborene Abwehr Adaptive Abwehr

Unspezifische Erkennung Selektive Erkennung von

von Krankheitserreger Krankheitserregern

↓ ↓ ↓ ↓

humoral zellulär humoral zellulär

↓ ↓ ↓ ↓

Komplement Granulozyten B-Lymphozyten T-Lymphozyten

Interferone Makrophagen

Lysozyme Natürliche Killerzellen

Modifiziert nach Abb. 1.14 aus [55]

2.2.3 Die Entwicklung der Immunzellen

Die spezialisierten Zellen des Immunsystems entstehen im Knochenmark aus pluri-

potenten Stammzellen.

Abb.2: Hämatopoetischer Stammbaum

B-Lymphozyt

Lymphoide T-Lymphozyt

Vorläuferzelle

Pluripotente NK-Zellen

Stammzelle

Megakaryozyten Thrombozyten

Myeloische

Vorläuferzelle Erythropoetische Erythrozyten

Vorläuferzelle

Eosinophile

Vorläuferzelle Basophile Granulozytäre und Neutrophile Granulozyten

Vorläuferzelle Monozytäre Vorläuferzelle

Monozyten

Eosinophile Granulozyten Basophile Granulozyten

8

Aus den lymphoiden Vorläuferzellen entstehen die für die erworbene Immunabwehr

wichtigen T- und B-Lymphozyten sowie die Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen). Aus

den myeloischen Vorläuferzellen differenzieren sich über weitere Vorläuferzellen die

Granulozyten, Monozyten, Thrombozyten und Erythrozyten. Lymphozyten und Mo-

nozyten zählen zu den mononukleären Zellen, deren Bedeutung in der Tumorthera-

pie bereits erläutert wurde. Die Hämatopoese wird über unterschiedliche Wachs-

tumsfaktoren wie die Interleukine reguliert. Die Zufuhr dieser Faktoren ermöglicht

es, die Entwicklung der differenzierten Zellen, Vorläuferzellen und Stammzellen in

der Peripherie zu induzieren, um sie mittels Leukozytapherese zu gewinnen [62].

2.2.4 Mononukleäre Zellen und ihre Funktion

2.2.4.1 Lymphozyten

Die Lymphozyten entstehen im Knochenmark aus Lymphoblasten. Während B-

Lymphozyten im Knochenmark ausreifen, wandern T-Vorläuferzellen in den Thymus

aus, wo sie durch Zytokine proliferieren. Der Proliferation der Vorläuferzellen folgt

die Entwicklung von Antigenrezeptoren und anschließend die Selektion, damit kör-

pereigene Proteine nicht angegriffen werden. Durch die Aktivierung durch antigen-

präsentierende Zellen differenzieren sich aus den naiven T-Lymphozyten CD 4 posi-

tive T-Helferzellen, zytotoxische CD 8 positive T-Lymphozyten und regulatorische T-

Lymphozyten. Die Helferzellen aktivieren bevorzugt zytotoxische T-Zellen und Mak-

rophagen. Zytotoxische T-Zellen phagozytieren Krankheitserreger. Die B-Lympho-

zyten produzieren nach Aktivierung Antikörper und Gedächtniszellen [64]. Etwa 5-

10% der CD4 positiven T-Zellen beinhalten einen Teil regulatorischer T-Zellen

(Tregs), die sich entweder im Thymus ausbilden oder in der Peripherie aus naiven

CD4 positiven CD25 positiven T-Zellen durch den Transkriptionsfaktor Foxp3 indu-

ziert werden [14]. Regulatorische T-Zellen (Treg) schützen durch ihren supprimie-

rende Eigenschaft auf das Immunsystem vor autoimmunen Prozessen. Eine gestör-

te Immunabwehr könnte so ausufern, dass auf pathogene Keime mit einer verstärk-

ten Entzündungsreaktion reagiert wird, woraus sich weitere Erkrankungen entwi-

ckeln könnten [44]. Deshalb verhindern die CD4 positiven CD25 positiven Tregs

durch die Sekretion von Interleukin 10 und TGF β die Zytokinausschüttung von CD4

positiven und CD8 positiven T-Zellen und unterdrücken deren Proliferation [10]. Sie

wirken aber nicht nur auf Zellen, die sich gegen den eigenen Körper richten. Auf

natürliche Killerzellen und zytotoxische T-Zellen können sie ebenfalls einen suppri-

mierenden Effekt haben, wodurch ein Tumorwachstum gefördert werden kann. Da-

9

her haben sie einen hohen Stellenwert als Verlaufsmarker in der immunmodulieren-

den Tumortherapie, wobei eine hohe Anzahl an regulatorischen T-Zellen eine

schlechtere Prognose bedeuten kann [26]. Diverse Studien beschäftigen sich auch

im Rahmen der bei Transplantationen auftretenden Graft-versus-Host-Disease mit

dem Einsatz von regulatorischen T-Zellen. Die Tregs sollen die Immunantwort ge-

genüber den fremden Spenderantigenen unterdrücken, so dass eine lebenslange

medikamentöse Immunsuppression nicht mehr erforderlich ist [31; 42; 47].

2.2.4.2 Monozyten und antigenpräsentierende Zellen

Monozyten sind die größten Immunzellen im Blut. Sie entstehen im Knochenmark

aus Monoblasten und zirkulieren nur wenige Tage im Blut, bevor sie ins Gewebe

auswandern. Ungefähr zwei bis acht Prozent der Blutzellen stellen Monozyten dar.

Sie fungieren als antigenpräsentierende Zellen, betreiben Phagozytose und sezer-

nieren Zytokine. Die in ihrer Granula enthaltenen sauren Hydrolasen und Peroxi-

dasen sind für die intrazelluläre Fragmentierung von pathogenen Keimen notwen-

dig. Die Erkennung der antigenen Eigenschaften erfolgt dabei über spezifische Re-

zeptoren. Nach Auswanderung ins Gewebe differenzieren sie sich zu Makrophagen.

Auch von den Monozyten existieren mehrere Subpopulationen, deren gemeinsamer

Oberflächenmarker CD 14 ist. Zu dem Monozyten-Makrophagen-System zählen

auch noch andere antigenpräsentierende Zellen wie die Dendritischen Zellen, die

aus Monozyten generiert werden können. Wie die Monozyten und Makrophagen

sind sie auf die Aktivierung durch Zytokine aus infizierten Zellen angewiesen. Ihre

Aufgabe besteht darin, körperfremde Moleküle auf zu nehmen, zu phagozytieren

und anschließend die auf ihrer Oberfläche exprimierten Antigenfragmente T-Zellen

zu präsentieren. Dadurch kommt es zur Proliferation der T-Zellen und letztlich zur

spezifischen zellulären Immunantwort [37].

2.3 Die Apoptose

2.3.1 Die Bedeutung der Apoptose

Die Apoptose, auch programmierter Zelltod genannt, stellt einen komplexen Mecha-

nismus der Zelle dar kontrolliert abzusterben, um in ihrem Erbgut geschädigte Zel-

len gezielt zu eliminieren. Dieser Vorgang ist physiologisch und für die Gewebeho-

möostase von großer Bedeutung, da sich Zellproliferation und Zelltod im Gleichge-

wicht halten [84]. Im Gegensatz zur Nekrose, bei der die Zelle eine Schädigung

10

aufweist und daraufhin zugrunde geht, findet hier keine Entzündungsreaktion statt.

Die Apoptose ist für die Ausbildung von Körperstrukturen wichtig und sorgt dafür,

dass Zellzahl und Gewebegröße ausbalanciert bleiben [30]. Bedeutsam ist sie auch

für die Eliminierung von kanzerogenen Zellen und von T-Zellen mit fehlerhafter Dif-

ferenzierung oder solchen, die sich gegen körpereigene Strukturen richten [40]. Stö-

rungen dieses Prozesses begünstigen die Entstehung maligner Neoplasien, da

fehlgesteuerte Zellen überleben können.

2.3.2 Die Stadien der Apoptose

Eine apoptotische Zelle durchläuft verschiedene Phasen während ihres Absterbens.

Zunächst kommt es durch Dehydrierung zur Schrumpfung der Zelle (2).

Abb. 3: Stadien der Apoptose [64]

1 2 3 4

Durch Veränderungen im Kalzium- und pH-Haushalt der Zelle kommt es zur Verän-

derung des mitochondrialen Potentials. Die daraus resultierende Abflachung

des negativen Gradienten des mitochondrialen Potentials kann durchflußzytomet-

risch bestimmt werden. Auf molekularer Ebene kommt es zur Chromatinkondensie-

rung (2) mit folgender Fragmentierung des Chromatins (3). Durch die Zelldehydrie-

rung kommt es auch zur Kondensation des Zytoplasmas und einer Umverteilung der

Phospholipide an der Plasmamembran. Beendet wird der apoptotische Prozess mit

der Bildung sogenannter apoptotic bodies (4), membranumhüllte kleine Restteilstü-

cke, die letztendlich durch Phagozytose abgebaut werden [19; 33]. Sowohl die Ver-

änderung der Plasmamembran als auch die DNA-Fragmentierung sind durchflußzy-

tometrisch analysierbar.

11

2.3.3. Nachweismethoden der Frühapoptose

2.3.3.1 Veränderungen der mitochondrialen Funktion

Wie bereits erwähnt durchlaufen apoptotische Zellen verschiedene Stadien mit cha-

rakteristischen Veränderungen. Ein sehr früher Prozess während der Apoptose ist

die Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials. Poren in der Außenseite

der Mitochondrienmembran ermöglichen mitochondrialen Proteinen den Austritt ins

Zytosol. Während der Apoptose kommt es zur Öffnung dieser Poren, so dass Proto-

nen einem negativen Gradienten folgend ausströmen und somit eine Aufhebung der

asymmetrischen Verteilung bedingen. Sichtbar wird dieser Prozess durch die Ver-

änderung des mitochondrialen Membranpotentials. In nicht apoptotischen Zellen

können durch den negativen Gradienten kationische lipophile Fluorochrome wie JC1

oder Rhodamin 123 im Mitochondrium akkumulieren. Durch die Depolarisation der

Mitochondrienmembran ist die Zelle dazu allerdings nicht mehr in der Lage. Der

Verlust der Akkumulationsfähigkeit ist mittels Durchflußzytometrie durch Abnahme

der Fluorochromintensität nachweisbar [19; 85].

2.3.3.2 Veränderungen an der Plasmamembran

Relativ früh im apoptotischen Prozess transloziert Phosphatidylserin von der Innen-

seite der Plasmamembran auf die Außenseite. Zu Beginn bleibt die Membranintegri-

tät noch erhalten während der Verlust der Integrität ein Zeichen für Nekrose dar-

stellt. Proteine wie Annexin V, die eine hohe Affinität zu Phospholipiden und insbe-

sonder Phosphatidylserin haben, eignen sich daher besonders zum Nachweis. Da

der alleinige Nachweis mit Annexin V nicht beweisend für eine apoptotische Zelle

ist, wird mit 7AAD (7-Amino-Actinomycin D) oder anderen Kernfärbungen gegenge-

färbt. 7AAD ist nur bei Verlust der Membranintegrität in der Lage zwischen Guanin

und Cytosin in der DNA zu interkalieren und beweist somit einen nekrotischen Pro-

zess. Durch Markierung von Annexin V mit Phycoerythrin (PE) oder Fluoresceiniso-

thiocyanat (FITC) lässt sich der apoptotische Vorgang durchflußzytometrisch dar-

stellen [19; 86].

2.3.4 Nachweismethoden der Spätapoptose

Am Ende der Apoptose kommt es durch die Endonukleaseaktivität von Effektor-

caspasen zur Spaltung der DNA. Hierbei entstehen sowohl doppelsträngige, nie-

12

dermolekulare Fragmente als auch einzelsträngige, hochmolekulare DNA-Frag-

mente. Das entstehende 3`-Hydroxy-Ende dieser Fragmente kann mittels modifizier-

ter markierter Nukleotide in einer enzymatisch katalysierten Reaktion detektiert wer-

den. Als Enzym eignet sich TdT (terminal desoxynucleotidyl-transferase), das zu

einer matrizenunabhängigen Bindung von bromierten Deoxyuridintriphosphat

(BrdUTP) an das 3´-Hydroxy-Ende der Strangbrüche führt. Durch Zellfärbung mit

markiertem Antikörper gegen das bromierte dUTP erfolgt der Apoptosenachweis

mittels Durchflußzytometer [19; 30].

13

3. Fragestellung

Ziel der Arbeit war es, mononukleäre Zellen, die entweder durch Leukozytapherese

gewonnen, oder durch Thrombozytapherese in LRS-Kammern angereichert wurden,

hinsichtlich verschiedener Apoptose-Methoden, mit Annexin V/7-AAD, JC1 und

BrdUTP, während einer Kurzzeitlagerung von 48 Stunden zu analysieren.

Diese analytischen Methoden wurden am Durchflusszytometer durchgeführt.

Zusätzlich sollte die Qualität der Zellen und biochemische Parameter miteinander

vergleichen werden. Ebenso sollte der Zellverlust durch die Kurzzeitlagerung von 48

Stunden im Lagerbeutel ermittelt werden.

Auf Grundlage dieser Zielstellungen ergab sich folgende Fragestellung:

1. Wie unterscheiden sich die Spenderdaten bei Leukozytapherese und

Thrombozytapherese?

2. Welche Unterschiede zeigen die Leukozytenprodukte aus den jeweiligen

Spendearten, Leukozyt- und Thrombozytapherese?

3. Welche Unterschiede zeigen sich in der Zellqualität hinsichtlich lebender,

apoptotischer und nekrotischer Zellen, die konkret mit folgenden Methoden

ermittelt wurden:

a. Annexin V- und 7AAD- positive regulatorische T-Zellen

b. JC1 Nachweis bei der Lymphozyten- und Monozytenpopulation

c. Strangbrüche bei mononukleären Zellen mit der BrdU Methode

4. Welchen Einfluss hat die Kurzzeitlagerung auf die Zellqualität im jeweiligen

Aphereseprodukt, die mit den oben genannten Methoden ermittelt wurden?

5. Welchen Aussagewert haben die einzelnen Analysemethoden?

6. Wie unterscheiden sich die beiden Aphereseprodukte im Glukoseverbrauch

und in der Laktatkonzentration (biochemische Parameter) voneinander? Be-

steht ein Zusammenhang zwischen Apoptoserate und Laktatanstieg?

Ist es vorstellbar, dass die Massenspektrometrie als zusätzliche Analyseme-

thode für eine weitergehende Analyse spezifischer Moleküle (z.B.: Amino-

säuren) während der Zelllagerung sinnvoll ist?

14

4. Material und Methoden

4.1 Materialien

4.1.1 Geräte

Zur Probenmessung wurde ein automatisiertes Multicolor Durchflußzytometer

(FACS Calibur, BD Biosciences, Heidelberg) verwendet, welches sowohl zur Zel-

lanalyse als auch zur Zelldifferenzierung fähig ist. Für die Datenerfassung und Da-

tenanalyse wurde als Software Cellquest pro (BD Biosciences, Heidelberg) verwen-

det. Diese Software speichert formell alle Parametermessungen und Instrument

Settings automatisch in einem FCS (Flow Cytometry Standard) data file auf einem

Macintosh Computer ab. Die Blutbildbestimmung wurde an einem automatischen

Analysiergerät (Sysmex KX-21 N, Sysmex, Norderstedt) durchgeführt, welches 17

verschiedene hämatologische Parameter aus Vollblut mit einer Durchsatzrate von

60 Proben pro Stunde bestimmen kann. Reagenzien wurden im Kühlschrank bei

4°C (Kirsch, Offenburg) oder im Tiefkühlschrank bei -70°C (Heraeus, Hanau) auf-

bewahrt. Die Proben für den APO-BrdU Test lagerten bis zur Messung im -30°C

Tiefkühlschrank (Kirsch, Offenburg). Weiterhin wurden für die Probenaufbereitungen

ein 37°C warmes Wasserbad (GFL, Burgwedel), eine Zentrifuge (Hettich, Tuttlingen)

sowie eine Biofuge Fresco (Heraeus, Hanau) verwendet.

4.1.2 Einmalmaterialien

Die Blutprodukte wurden in 25 ml und 7 ml Beutelsystemen (CellGenix, Gaithers-

burg, USA), welche aus CO2 und O2 durchlässigem Fluorethylenpropylen (FEP)

Teflon bestehen und Gasaustausch im geschlossenen Beutel durch die FEP-

Teflonfolie vollziehen, gelagert. Zur Bestimmung der Glukose- und Laktatwerte wur-

den 1,3 ml fassende Natrium-Fluorid Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) verwendet.

Für die durchflußzytometrische Messung waren 5 ml Polystyrene Round-Bottom

Gefäße und Falcon Röhrchen (BD Biosciences, Heidelberg) notwendig. Ebenso

kamen Eppendorf Gefäße (Eppendorf, Hamburg) zum Einsatz.

4.1.3 Lösungen und Reagenzien

Zur Zelllyse wurde zehnfach konzentrierte Pharm Lyse (BD Biosciences, Heidel-

berg), ein Lysereagenz auf Ammoniumchlorid Basis, verwendet, die vor Gebrauch

15

mit Aqua dest. verdünnt wurde. Als Waschpuffer wurde PBS verwendet, der 140

mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4 enthält. Der JC1

Antikörper (Lyophilisat) wurde in 100% DMSO-Lösung aufgelöst und aliquotiert bei

-30°C bis zu sechs Monate gelagert. Zur Zellfixierung wird 10% Formaldehyd, das in

der Apotheke bezogen und verdünnt wurde. Zur Aufbewahrung der Zellen wurden

diese mit 70% Ethanol fixiert. Zur Messung und Reinigung des Durchflußzytometers

wurden die von BD Biosciences empfohlenen FACS Flow, FACS Rinse und FACS

Clean Reagenzien verwendet.

Die verwendeten Kits Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Mitoscreen Kit,

sowie APO-BRDU Kit wurden alle von BD Biosciences, Heidelberg bezogen [Anlage

1].

4.1.4 Antikörper

Gemäß Herstellerangaben stammt der CD 4 APC Antikörper Klon SK3 (BD

Biosciences, Heidelberg) aus der Hybridisierung von Maus NS-1 Myelomzellen mit

Zellen von der Milz von BALB/c Mäusen immunisiert mit menschlichen T-

Lymphozyten aus dem peripheren Blut. Der CD 25 PE Antikörper Klon CE (BD

Biosciences, Heidelberg) stammt ebenfalls aus der Hybridisierung von Maus NS-1

Myelomzellen mit Zellen von der Milz von BALB/c Mäusen immunisiert jedoch mit

PHA-aktivierten menschlichen T-Lymphozyten. Der 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D)

Antikörper (BD Biosciences, Heidelberg) dient der DNS Färbung.

4.2 Studienbeschreibung

Es wurden zehn Patienten (zwei Frauen, acht Männer) untersucht, die sowohl Mo-

nozytenspender als auch Thrombozytenspender sind. Der Zeitraum der Messungen

erstreckte sich von Januar 2011 bis Juli 2011. Für die Studie wurden mononukleäre

Zellen aus Leukozytenkonzentraten analysiert, welche durch Leukapherese gewon-

nen wurden. Als Zellseparator wurde COM.TEC (Fresenius, Bad Homburg) einge-

setzt. Jeweils 10 ml des Konzentrates wurden steril in 25 ml Beutelsysteme abge-

füllt. Von denselben Spendern wurden auch LRS-Kammern, die bei der Separation

von Thrombozytenkonzentraten als Nebenprodukt entstanden sind, hinsichtlich der

mononukleären Zellen untersucht. Für die Thrombozytapherese wurde der Zellsepa-

rator Trima Accel verwendet. Die Abfüllung des Inhalts der LRS-Kammern von 10 ml

erfolgte in jeweils zwei 7 ml Beutelsysteme. Die Proben wurden von den Blutspen-

dern der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung der Uni-

16

versität Erlangen zur Verfügung gestellt. Die Probanden waren über die Studie auf-

geklärt und mit der Untersuchung der Blutproben einverstanden. Die Probandenauf-

klärung ist Bestandteil des Ethikvotums Nr. 3489 vom 9.Mai 2006 mit dem Titel

„Evaluierung von Testsystemen für die Apoptosemessung von mononukleären Zel-

len in gelagerten Leukozytenkonzentraten“.

4.2.1 Gewinnung der Leukozytenkonzentrate

4.2.1.1 Leukozytapherese mittels COM.TEC Zellseparator

Die Leukozytapherese wurde mit dem COM.TEC Zellseparator (Fresenius Hemo-

care GmbH) mit dem Programm autoMNC durchgeführt. Ein Zweinadel-Verfahren

ermöglicht die kontinuierliche Blutentnahme aus dem arteriellen Schenkel und Blut-

rückführung über den venösen Schenkel des Apheresesets. Nachdem das ACD-A

zu Vollblut (Acid citrate dextrose Formula A) im Verhältnis eins zu zehn eingestellt

wurde, erfolgt die Auftrennung in thrombozytenreiches Plasma und Blutzellen in der

PL1-Separationskammer mittels Differentialzentrifugation bei einer Zentrifugendreh-

zahl von 1500 Umdrehungen pro Minute. Die Auftrennung der Blutzellen ist durch

unterschiedliche Größen-, Dichte- und Sedimentationseigenschaften der Zellen

möglich [17]. In der sogenannten Sammelphase und in der Verdichtungsphase ist

eine automatische Trenngrenzenregelung aktiv. Als Trenngrenzenregler fungieren

acht optische Ports, die die Phasengrenze zwischen thrombozytenreichem Plasma

und Zellphase der Leukozyten und Erythrozyten konstant bei einem Wert von sie-

ben zu eins halten. Dadurch wird die Stabilität der abzusammelnden Zellschicht in

der sogenannten Sammelphase gewährleistet. Aufrechterhalten wird dieser Wert

durch eine Software-kontrollierte Plasmapumpe. Sieben optische Ports registrieren

dabei die Zellphase, während der achte Port das thrombozytenreiche Plasma er-

fasst. In den nachfolgenden Phasen (Spillover-Phase und Buffy-Coat-Phase) ist die

Trenngrenzenregelung deaktiviert. Der Blutfluss beträgt hier 15 ml pro Minute im

Gegensatz zur Sammelphase mit 50 ml pro Minute. Die Plasmapumpe ermöglicht

die Retransfusion des Plasmas zusammen mit dem Restblut an den Spender. Wäh-

renddessen entsteht in der Separationskammer zwischen der Erythrozyten- und

Plasmaschicht der sogenannte Buffy Coat, der die Leukozyten beinhaltet. Unter

einer reduzierten Blutflussrate von 15 ml pro min wird der Buffy Coat in der Separa-

tionskammer verdichtet. Anschließend erfolgt der Transport des Buffy Coats mittels

Plasma- und Zellenpumpe in einen Produktbeutel. Nach Abschluss der Zellaphere-

se werden aus diesem Buffy Coat mononukleäre Zellen isoliert. Beim autoMNC

17

Programm arbeitet die Plasmapumpe mit einem optischen Sensor, dem sogenann-

ten Spillover-Sensor, der die durch das thrombozytenreiche Plasma entstehende

Trübung, misst. Durch diesen Sensor, der eine Spillover-Klemme kontrolliert, wird

automatisch das Spillover-Volumen, das Volumen, das von der Plasmapumpe benö-

tigt wird, um den Buffy Coat aus der Separationskammer zu befördern, kontrolliert.

Nach Erreichen der voreingestellten 15 Sammelzyklen wird die Zellapherese nach

Rückführung des Restblutes an den Spender automatisch beendet [77; 79].

4.2.1.2 Thrombozytapherese mittels Trima Accel Zellseparator

Die Gewinnung von Leukozyten aus LRS-Kammern erfolgte im Rahmen der Throm-

bozytenherstellung mit dem Trima Accel Zellseparator (Gambro BCT, Lakewood,

USA). Diese Leukozytengewinnung aus LRS-Kammern gelingt nur mit Hilfe des

Trima Accel Zellseparators, da gezeigt werden konnte, dass die LRS-Kammern der

Cobe Spectra nur einen verschwindend geringen Anteil an Leukozyten enthalten

[78]. Bei dem verwendeten Zellseparator erfolgt die Blutentnahme und Blutrückgabe

mittels Ein-Nadel-System. Die Separation der Erythrozyten, Leukozyten, Throm-

bozyten und des Plasmas nach spezifischem Gewicht erfolgt ebenfalls durch Zentri-

fugation. Die Erythrozyten werden durch den kontinuierlichen Blutfluss wieder aus

der Separationskammer befördert. Innerhalb der Zentrifuge befindet sich die konisch

geformte ungefähr 10 ml fassende LRS-Kammer, in der sich die Trennung von

Thrombozyten und Leukozyten vollzieht. Die LRS-Kammer dient hierbei der Abrei-

cherung der Leukozyten im Thrombozytenprodukt. Die Leukozyten verbleiben in der

Kammer, da sie über eine höhere Dichte als die Thrombozyten verfügen, während

die Thrombozyten in den Beutel für das Thrombozytenkonzentrat abgesammelt

werden. Das technische Prinzip hierbei beruht darauf, dass die Restleukozyten bei

der Thrombozytenseparation in dieser Kammer mittels Flußbettfiltration abgefangen

werden. Der überwiegende Anteil der in der Kammer verbleibenden Zellen sind mo-

nonukleäre Zellen [54]. Im Vergleich zur Leukozytapherese verbleibt in den LRS-

Kammern nur ein kleiner Teil der Leukozyten, während der Großteil dieser Zellen

dem Spender wieder zugeführt wird. Wie hoch die Ausbeute an mononukleären

Zellen ausfällt, hängt von den Separatoreinstellungen wie Zitratbeimengung zur An-

tikoagulation und Blutflussgeschwindigkeit und der Verfahrensdauer ab [13; 54]. Da

die Zellen der LRS-Kammer als Nebenprodukt bei der Thrombozytapherese gewon-

nen werden, unterscheidet sich vor allem ihr Volumenanteil von dem der Leukozy-

tenkonzentrate, während die Zellkonzentration pro Volumeneinheit teilweise sogar

höher liegt [78].

18

4.2.2 Aufbereitung der Aphereseprodukte

Zur Bestimmung der Leukozytenzahl wurde das Blutbild an einem Sysmex Analy-

sengerät bestimmt. Vor der durchflußzytometrischen Messung wurden sowohl die

Leukozytenkonzentrate als auch das LRS-Kammern Material auf 10000 Leukozyten

pro µl Blut eingestellt, wobei die Verdünnung mit PBS erfolgte. Die Lagerung der

abgefüllten Beutelsysteme erfolgte bei Raumtemperatur zwischen 22°C und 26°C.

Jedes Konzentrat und LRS-Kammern Material wurde in einem Zeitraum von drei,

sechs, 24 und 48 Stunden nach Gewinnung am FACS gemessen. Zur jeweils ersten

Messung aus dem Leukozytenkonzentrat wurde parallel ein vom Spender stam-

mendes EDTA-Blutröhrchen, welches vor der Leukozytenspende gewonnen wurde,

untersucht. Zusätzlich wurde das EDTA-Blut zusammen mit dem Konzentrat hin-

sichtlich des Gehalts an Leukozyten, CD14 positiven Monozyten, Erythrozyten,

Thrombozyten und des Hämatokrits analysiert. Der Leukozytenanteil sowohl in den

Leukozytenkonzentraten als auch im EDTA-Blut wurde auf 100% gesetzt. Da die

CD14 positiven Zellen eine Subpopulation der Leukozyten sind, wurden sie als pro-

zentualer Anteil bezogen auf die Leukozyten angegeben. Die Leukozytenzahlen vor

der Spende aller Probanden lagen im für die Spende erlaubten Bereich zwischen

3000 und 10000 Leukozyten pro µl, so dass eine Verdünnung des EDTA-Blutes

nicht notwendig war. Jedes verwendete Untersuchungsmaterial wurde nach dem-

selben Protokoll aufbereitet und analysiert. Zur Bestimmung der biochemischen

Parameter Glukose und Laktat wurden zu Beginn einer jeden Messung aus den

unverdünnten Untersuchungsmaterialien 500 µl Blut in ein Natriumfluorid Röhrchen

pipettiert. Die Fluoridröhrchen wurden bei 3800xg für 10 min zentrifugiert und das

Plasma bis zum Ende einer Messreihe, längstens bis zu zwei Wochen bei minus

70°C eingefroren. Anschließend erfolgte der Transport zur Kinderklinik der Universi-

tät Erlangen, die die Bestimmung der Glukose- und Laktatwerte durchführten.

4.3 Methoden

4.3.1 Grundlagen der FACS Messung

Die Abkürzung FACS steht für Fluorescence Analysing Cell Sorting. Das Durchfluß-

zytometer besteht aus einem Flüssigkeitssystem zum Transport und Fokussierung

der Zellen, sowie einer Optik zur Detektierung der Lichtsignale und Elektronik, wobei

die optischen in elektronische Signale umgewandelt werden. Die Durchflußzytomet-

rie am FACS Gerät ermöglicht es Zellen quantitativ anhand ihrer Streulicht- und

Fluoreszenzeigenschaften zu analysieren. Die Methode beruht auf der Messung

19

und Analyse von Signalen, die dadurch zustande kommen, dass Zellen in einer

Suspension, die eine Glaskapillare durchströmen, einen Laser passieren. Das Vor-

wärtsstreulicht (Forward Scatter FSC) steht in Relation zur Beugung des Lichts,

wodurch die Zellen nach ihrer relativen Größe differenziert werden können. Das

Vorwärtsstreulicht wird entlang der Achse des einfallenden Lichtes gemessen.

Abb. 4: Darstellung der Vorwärtsstreulichtmessung

Das Seitwärtsstreulicht (Sidewards Scatter SSC) korreliert mit der Brechung und

Reflexion des Lichts und differenziert dadurch die Zellen anhand ihrer relativen Gra-

nularität oder internen Komplexität. Es wird in einem 90°-Winkel zum einfallenden

Licht gemessen. Dabei gilt je größer eine Zelle ist, desto stärker ist das Signal des

Vorwärtsstreulichts bzw. je granulierter eine Zelle, desto größer das Seitwärtsstreu-

lichtsignal [8].

Laserstrahl Vorwärtsstreu- lichtdetektor

Große Zellen erzeugen ein großes Vorwärts- streulichtsignal

Probenfluß

20

Abb. 5: Darstellung der Seitwärtsstreulichtmessung

Die Markierung der Zellen mit Fluoreszenzmolekül gekoppelten Antikörpern er-

möglicht eine weitere Differenzierung. Als Fluoreszenzmoleküle werden häufig FITC

(Fluoreszein-Isothiocyanat), welches grün fluoresziert und Phycoerythrin (PE), wel-

ches gelbrot fluoresziert, verwendet. Die am Durchflußzytometer ermittelten Daten

werden graphisch als Dot Plot dargestellt. Das sog. „Gaten“, die Eingrenzung der

Zellpopulation, ermöglicht es spezielle Zellpopulationen einer genaueren Betrach-

tung zu unterziehen.

Abb. 6: Beispiel für einen Dot Plot

(rot: Lymphozyten; grün: Monozyten; schwarz: Granulozyten)

Laserstrahl

Seitwärtsstreu- lichtdetektor

Granulierte Zellen erzeugen ein großes Seitwärts- streulichtsignal

Probenfluß

21

4.3.2 Apoptosedetektion mittels Annexin V und 7-AAD

Mit der Annexin V Färbung, welches bevorzugt an negativ geladene Phospholipide

wie Phosphatidylserin bindet, kann eine Frühphase der Apoptose aufgezeigt werden

[24; 40]. Konjugiert mit dem Fluoreszenzmolekül PE oder FITC kann es als sensiti-

ver Apoptosemarker durchflußzytometrisch nachgewiesen werden. Die Plasma-

membran in lebenden Zellen zeigt eine asymmetrische Phospholipid Verteilung.

Phosphatidylcholin und Sphingomyelin befinden sich auf der Außenseite während

Phosphatidylserin auf der Innenseite lokalisiert ist. Durch Verlust dieser Asymmetrie

wird das Phosphytidylserin nach außen transloziert, so dass das Annexin V daran

binden kann. Eine Differenzierung zu nekrotischen Zellen ist durch die Verknüpfung

der Annexin V Färbung mit dem kationischen Farbstoff 7-Amino-Actinomycin-D

(7AAD) möglich, da 7AAD nur in die Zelle dringen kann, wenn die Zellintegrität ver-

loren geht [19]. 7-AAD weist spezifisch DNA nach, so dass es in Zellen mit noch

intakter Plasmamembran nicht eindringen kann. Demnach zeigen sich apoptotische

Zellen Annexin V positiv und 7AAD negativ, während nekrotische Zellen Annexin V

positiv und 7AAD positiv sind [84].

Gegenstand der vorliegenden Untersuchungsreihe war der Apoptosenachweis

in regulatorischen T-Zellen (Tregs), weshalb initial die Leukozytenkonzentrate mit

CD4 und CD25 Antikörpern versetzt wurden, um zwischen CD4 positiven CD25

positiven Tregs und CD4 positiven CD25 negativen Tregs differenzieren zu können.

Die prozentualen Anteile an CD25 positiven und negativen Zellen in den beiden

unterschiedlichen Leukozytenprodukten beziehen sich auf den Anteil an T-Helfer-

zellen. Das heißt der T-Helferzellenanteil wurde 100% gleichgesetzt. Davon wird der

prozentuale Anteil an CD4 und CD25 positiven T-Zellen angegeben, während der

prozentuale Anteil an CD4 positiven und CD25 negativen T-Zellen sich aus der Dif-

ferenz zu 100% errechnet.

Zunächst werden 50 µl des Leukozytenkonzentrats mit 10 µl CD25 PE und 2,5

µl CD4 APC versetzt und eine Viertelstunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inku-

biert. Das Leukozytenkonzentrat wurde zuvor mit PBS auf 10000 Leukozyten pro µl

Blut verdünnt. Anschließend erfolgt die zehnminütige Zelllyse mit 2 ml Pharm Lyse

(BD Biosciences) im Dunkeln. Vor Verwendung wird eine einfachkonzentrierte

Pharm Lyse mit Aqua dest. hergestellt. Nach Zentrifugation (5 min, 500 x g, 20°C)

wird der Überstand verworfen, das Zellpellet mit 2 ml PBS gewaschen und wie-

derum zentrifugiert (5 min, 500 x g, 20°C), mit anschließendem Dekantieren des

Überstandes. Es folgt die Apoptosefärbung mit 2,5 µl FITC Annexin V, 10 µl 7-AAD

und 100 µl Annexin Puffer. Der zehnfach konzentrierte Puffer muss vor Gebrauch

mit Aqua dest. zu einem einfach konzentrierten Puffer verdünnt werden. Es wird

22

eine Viertelstunde bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert. Nach an-

schließendem Zufügen von 400 µl einfachkonzentrierten Annexin Puffer wird die

Färbereaktion gestoppt, so dass die Probe durchflußzytometrisch gemessen werden

kann.

4.3.2.1 Messeinstellung für die Annexin V/ 7-AAD Methode

Zur optimalen Darstellung der einzelnen Zellpopulationen waren einige Einstellun-

gen am FACS Gerät notwendig. AMPS definiert die Spannungs- und Verstärkerein-

stellungen, welche sowohl vom FACS Typ als auch von der Art der Zellen und Pro-

benvorbereitung abhängig sind. Um die Lymphozyten optimal zwischen 400 und

600 im Dot Plot darzustellen, so dass auch die Monozyten- und Granulozytenpopu-

lation noch gut sichtbar sind, wurde AMPS im Vorwärtsscatter (FSC) auf 1,0 gestellt.

Im Seitwärtsscatter (SSC) wurden die Lymphozyten ebenfalls zur optimalen Darstel-

lung so eingestellt, dass sie im Bereich zwischen 100 und 200 liegen. Dies wurde

durch eine Voltageeinstellung im SSC Parameter auf 389 erreicht. Die Fluoreszenz-

intensitäten von Annexin V (FL-1) wurden in der Spannungseinstellung auf 638, von

CD25 PE (FL-2) auf 692, von 7AAD (FL-3) auf 813 und CD4 APC (FL-4) auf 675

eingestellt (siehe Tab. 1).

Tab.1: Darstellung der Instrumenteinstellungen („Instrument-Settings“)

Parameter Voltage AMPS Mode

FSC E00 1.00 Lin

SSC 389 1.00 Lin

FL-1 638 1.00 Log

FL-2 692 1.00 Log

FL-3 813 1.00 Log

FL1-A 1.00 Lin

FL-4 675 Log

Da mehr als eine Fluoreszenz simultan gemessen wird, ist auch eine Einstellung der

Kompensation erforderlich, um eine spektrale Überlappung auszugleichen. Die

Fluoreszenzintensität wird mit FL abgekürzt.

23

Eingestellte Kompensation:

Tab.2: Darstellung der Compensation

Zum besseren Vergleich der Ergebnisse wurden pro Messung 100000 kernhaltige

Zellen (Leukozyten) gemäß FSC-SSC-Blot gezählt. Sowohl das Messfile als auch

das Auswertefile wurde von der Firma BD Biosciences eingerichtet. Die Werte für T-

Helferzellen und apoptotische Zellen wurden prozentual angegeben.

Zellen, die sich in der Frühphase der Apoptose befinden, stellen sich Annexin V

positiv und 7-AAD negativ dar. Apoptotische Zellen oder bereits tote Zellen sind

sowohl Annexin V als auch 7-AAD positiv.

Abb. 7: Beispiel Dot Plot Leukozytenkonzentrat

Erläuterung zur Abbildung: Unten links: lebende Zellen, unten rechts: apoptotische

Zellen, oben rechts: nekrotische Zellen

FL1 3.1% FL2

FL2 16.1% FL1

FL2 6.0% FL3

FL3 20.0% FL2

FL3 4.5% FL4

FL4 3.7% FL3

24

4.3.3 Apoptosedetektion mittels JC-1 Markierung

Das Fluorochrom JC 1 ist ein lipophiles kationisches Fluorochrom, welches fähig ist

in Zellen zu penetrieren und durch seine Fluoreszenz das mitochondriale Potential

darzustellen. JC 1 liegt abhängig vom mitochondrialen Potential in zwei unterschied-

lichen Zustandsformen vor. Als Monomer oder Aggregat, die ein unterschiedliches

Emissionsspektrum aufweisen.

Abb.8: Emissionsspektrum von JC1 bei Bestrahlung mit Licht von einer Wellenlänge

von 488nm

530 590

Die Monomere emittieren Licht bei einer Wellenlänge von 527 nm (grüner Spektral-

bereich), die Aggregate bei einer Wellenlänge von 590 nm (roter Spektralbereich).

JC1 dringt als Monomer in die Plasmamembran ein. Die Aufnahme in die Mitochon-

drien ist Potential abhängig. Das Fluorochrom JC1 ist in der Lage in Zellen mit po-

larisiertem mitochondrialem Potential einzudringen und dort sogenannte J-Aggre-

gate zu bilden, die rot fluoreszieren. Im apoptotischen Prozess kommt es zur Depo-

larisation, so dass das mitochondriale Potential zusammenbricht. Das JC1 ist nicht

mehr zur Aggregatbildung befähigt und verbleibt als Monomer im Zytosol, welches

sich in einer Zunahme des grünen Fluoreszenzsignals zeigt [2; 43; 58]. Allerdings

führen nicht nur apoptotische Prozesse zur Depolarisation der Mitochondrienmem-

bran [15; 16].

Das lyophilisierte JC 1 muss vor der Benutzung mit 125 µl hundertprozentigem

DMSO aufgelöst werden. Es erfolgte eine Aliquotierung zu je 20 µl und Aufbewah-

rung bei -30°C. Der zehnprozentige Assay Puffer wird zusammen mit Aqua dest. im

Wasserbad auf 37°C erwärmt. Vor Benutzung muss der Assay Puffer mit dem Aqua

dest. zu einem einfach konzentrierten Assay Puffer verdünnt werden. Auch hier

muss das Leukozytenkonzentrat mit PBS auf 10000 Leukozyten pro µl Blut einge-

Flu

ore

sze

nzsig

na

l

Wellenlänge (nm)

25

stellt werden.100 µl verdünntes Konzentrat werden mit 2 ml Pharm Lyse 10 min bei

Raumtemperatur zum Lysieren der Erythrozyten inkubiert. Anschließend wird zentri-

fugiert (400 x g, 5 min, 20°C) und das durch dekantieren des Überstandes erhaltene

Zellpellet mit 2 ml PBS gewaschen. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt und

Dekantieren wird das Pellet mit 20 µl CD4 Antikörper resuspendiert und für 15 min

bei Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert. Es erfolgt eine Zugabe von 1 ml

PBS gefolgt von einer weiteren Zentrifugation. Anschließend wird eine einfach kon-

zentrierte JC 1 Arbeitslösung hergestellt, indem das in DMSO gelöste JC 1 mit dem

hergestellten Assay Puffer verdünnt wird. Für eine Probe werden 5 µl gelöstes JC 1

und 495 µl einfach konzentrierter Assay Puffer benötigt, die zusammen in ein Ep-

pendorf Gefäß pipettiert werden. Die Arbeitslösung wird dann in einer Microfuge

zentrifugiert (13000 x g, 3 min, 20°C). Verwendet wird nur der Überstand. Das Zell-

pellet wird mit 500 µl Überstand der JC 1 Arbeitslösung resuspendiert und im 37°C

warmen Wasserbad 15 min inkubiert. Nach Zugabe von 2 ml verdünntem Assay

Puffer erfolgt ein Zentrifugationsschritt (400 x g, 5 min, 20°C) und Verwerfung des

Überstandes. Es erfolgt noch ein Waschschritt mit 1ml verdünntem Assay Puffer

und Zentrifugation. Anschließend wird das Pellet mit 500 µl verdünntem Assay Puf-

fer gut resuspendiert und am Durchflußzytometer gemessen.

4.3.3.1 Messeinstellung für die JC 1 Methode

Auch hier waren zur optimalen Ergebnisdarstellung Einstellungen am FACS Gerät

notwendig. Unter anderem wurden die Verstärkereinstellungen (AMPS) für den

Vorwärtsscatter wie bereits bei der Annexin V/ 7AAD Messung auf 1,0 gesetzt, um

die Lymphozytenpopulation optimal im Dot Plot darzustellen. FL-2 (JC 1 orange)

wurde auf 530 gesetzt, damit die Population der lebenden Zellen noch gut sichtbar

ist und gleichzeitig die apoptotischen Zellen, die eine geringere orange Fluoreszenz

aufweisen, gut detektieren zu können.

Tab.3: Eingestellte Instrument Settings der JC1 Messung


FSC E00 1.00 Lin

SSC 387 1.00 Lin

FL-1 639 1.00 Log

FL-2 530 1.00 Log

FL-3 820 1.00 Log

FL1-A 1.00 Lin

FL-4 694 Log

26

Die JC 1 Messung benötigte auch eine Änderung der Treshold Einstellungen im

FSC-H Parameter auf 150. Treshold definiert den Schwellenwert, eine untere Sig-

nalgrenze, die vom entsprechenden Signal der Zelle überschritten werden muss,

damit die Zelldaten dargestellt werden können.

Tab.4: Treshold Einstellungen der JC1 Messung

Prim.Param. Sec.Param.

150 FSC-H FSC-H

52 SSC-H SSC-H

52 FL 1-H FL 1-H

52 FL 2-H FL 2-H

52 FL 3-H FL 3-H

52 FL 4-H

JC 1 Monomer emittiert bei 527 nm, nach Anregung bei 490 nm. Die Aggregate

emittieren bei 590 nm. Das Fluoreszenzspektrum beider JC 1 Zustandsformen liegt

im grünen Farbskalenbereich, der im FL-1 Kanal des Durchflußzytometers gemes-

sen wird. J-Aggregate bewirken eine reversible Verschiebung des Farbspektrums

von grün nach orange, die im FL-2 Kanal gemessen wird. Monomere sind nicht in

der Lage diese orange Fluoreszenz zu zeigen. Das Fluoreszenzsignal im FL-2 Ka-

nal ist deshalb sehr gering. Da sich die Aggregate nur bilden, wenn die Mitochon-

drienmembran polarisiert ist, kommt es bei Depolarisation zur Umwandlung in Mo-

nomere. Da die Depolarisation mit dem Apoptoseprozess in Verbindung steht,

nimmt in apoptotischen Zellen die orange Fluoreszenz ab.

Zum Vergleich der Leukozytenkonzentrate wurden pro Messung 10000 Ereig-

nisse gezählt.

27

Abb. 9: JC1 Darstellung von T-Helferzellen

Abb. 10: JC1 Darstellung von Monozyten

4.3.4 Apoptosedetektion mittels Apo-BrdU Markierung

Die DNA-Strangbruch Markierung mittels BrdU (5-Bromo-2´-deoxyuridin), die soge-

nannte TUNEL-Methode, stellt ein weiteres Verfahren zur Apoptosedetektion dar.

Am Ende des apoptotischen Prozesses kommt es durch die Aktivität von Nukleasen

zur Fragmentierung der DNA [1]. Das hierbei entstehende 3´-Hydroxyl-Ende der

DNA kann indirekt durch die Kopplung eines Fluorochroms identifiziert werden. Das

3´-Hydroxyl-Ende dient als Primer für die durch das Enzym terminale Deoxynukleo-

tidyltransferase (TdT) katalysierte Bindung des Thymidin-Analogons BrdUTP (bro-

molated deoxyuridine triphosphat) an das 3´-Hydroxyl Ende der Doppel- und Einzel-

28

strang-DNA. Diese Bindung kann durch einen Anti-BrdU Antikörper, der mit dem

Fluorochrom FITC (Fluoreszein Isothiocyanat) gekoppelt ist, kenntlich gemacht wer-

den [18]. Voraussetzung ist eine Fixierung der fragmentierten DNA mit Formaldehyd

und die Erhöhung der Zellpermeabilität mittels Ethanol.

Wieder wird zu Beginn das Leukozytenkonzentrat auf 10000 Leukozyten pro µl

Blut verdünnt. In einem ersten Schritt erfolgt die Fixierung der Zellen. Zu 300 µl Leu-

kozytenkonzentrat wird 3 ml Pharm Lyse gegeben, um die Erythrozyten zu lysieren.

Nach einer zehnminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird zentrifugiert (500 x

g, 5 min, 20°C) und der Überstand verworfen. Es erfolgt ein Waschschritt mit 5 ml

PBS und anschließender Zentrifugation. Die zehnprozentige Formaldehydlösung

wird mit PBS verdünnt, um eine einprozentige Lösung zu erhalten. Vor Zugabe von

1 ml Formaldehydlösung (1%) muss das durch Zentrifugation erhaltene Zellpellet

gut gevortext werden. Inkubiert wird für 30 min auf einem Eisblock im 4°C Kühl-

schrank. Anschließend wird zentrifugiert (500 x g, 5 min, 20°C) und der Überstand

verworfen. Das Zellpellet wird mit 5 ml PBS gewaschen und noch einmal zentrifu-

giert. Dann erfolgt das Aufträufeln von 1 ml kalten 70% Ethanol, wobei bereits vor

und während des Aufträufelns das Pellet gut gevortext werden muss. Die Proben

werden so bei -20°C aufbewahrt und gesammelt.

Im zweiten Schritt erfolgt die Markierung und Färbung der Zellen. Die gesam-

melten Proben werden zusammen mit jeweils 1 ml der positiven und negativen Kon-

trollzellen zentrifugiert (300 x g, 5 min, 20°C) und der Überstand zur Ethanolentfer-

nung abpipettiert. Das Pellet wird anschließend mit 1 ml Wash Buffer resuspendiert

und wieder zentrifugiert. Dieser Waschschritt wird ein zweites Mal durchgeführt.

Dabei kann der Überstand durch Dekantieren entfernt werden. Jedes Zellpellet wird

mit 50 µl DNA Labeling Solution resuspendiert und für 60 min im 37°C warmen

Wasserbad inkubiert. Die DNA Labeling Solution für eine Probe enthält 10 µl Re-

action Buffer, 0,75 µl TdT Enzyme, 8 µl Brd-UTP und 32,25 µl Aqua dest. Alle 15

min werden die Zellen im Wasserbad kurz aufgeschüttelt. Am Ende der Inkuba-

tionszeit wird jeder Probe 1 ml Rinse Buffer zugefügt und zentrifugiert. Der Über-

stand wird abpipettiert und das Pellet wiederum mit 1 ml Rinse Buffer resuspendiert.

Anschließend muss noch einmal zentrifugiert und der Überstand abpipettiert wer-

den. Das Zellpellet wird jetzt in 0,1 ml Antibody Staining Solution aufgenommen und

30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Antibody Staining Solution

besteht pro Probe aus 5 µl FITC-labeled Anti-BrdU und 95 µl Rinsing Buffer. An-

schließend wird jeder Probe 500 µl PI/RNase Staining Buffer zugefügt, 30 min im

Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und gemessen.

29

4.3.4.1 Messeinstellung für die Apo-BrdU

Sowohl für die Kontrollzellen, als auch für die Leukozytenkonzentrate bzw. LRSC

Proben und die vor der Leukozytapherese gewonnene EDTA-Blut Probe waren un-

terschiedliche Einstellungen am FACS Gerät nötig.

Tab.5: Eingestellte Instrument Settings der Apo-BrdU Messung von Kontrollzellen


FSC E-1 7.21 Lin

SSC 350 1.00 Lin

FL-1 485 1.00 Log

FL-2 535 1.00 Log

FL-3 505 1.00 Lin

FL2-A 1.00 Lin

FL2-W 7.04 Lin

Die Kontrollzellen benötigten zur guten Darstellung eine Verstärkereinstellung im

FSC Parameter auf 7,21. FL2-W wurde auf 7,04 gestellt, um die Zellen in den Be-

reich zwischen 150 und 250 bestmöglich darzustellen. Dadurch können die Zellen

so gegatet werden, dass nur nicht verklumpte Zellen und keine DNA- Dupletten er-

fasst werden.

Abb. 11: Nicht verklumpte Zellen werden gegatet

Apoptotische Zellen weisen ein hohes FITC Fluoreszenzsignal auf und lebende Zel-

len kaum.

30

Abb. 12: Gate R1 zeigt lebende Zellen, Gate R2 apoptotische Zellen

Für die Leukozytenkonzentrate reichte eine Verstärkereinstellung des FSC Parame-

ters auf 1,33, um die Zellen optimal darzustellen. FL-2 wurde wie bei den Kontroll-

zellen auf 7,04 eingestellt.

Tab.6: Eingestellte Instrument Settings von Leukozytenkonzentraten


FSC E00 1.33 Lin

SSC 410 1.00 Lin

FL-1 545 1.00 Log

FL-2 545 1.00 Log

FL-3 505 1.00 Lin

FL2-A 1.00 Lin

FL2-W 7.04 Lin

Von den Kontrollzellen wurden jeweils 5000 Ereignisse, von den Leukozytenkon-

zentraten jeweils 10000 Ereignisse gezählt. Die Ergebnisdarstellung der Lymphozy-

ten und Monozyten erfolgte sowohl im Dot Plot als auch im Histogramm.

31

Abb. 13: Dot Plot Darstellung eines Leukozytenkonzentrates

Gate R1 lebende Zellen im Leukozytenkonzentrat, Gate R2 apoptotische Zellen im

Konzentrat

Abb.14: Histogramm eines Leukozytenkonzentrates

M1: lebende Zellen; M2: apoptotische Zellen

32

5. Statistische Auswertung Zur Auswertung der Daten wurde das Statistikprogramm SPSS Version 19 für

Windows benutzt. Zunächst wurden mittels deskriptiver Analyse die Mittelwerte und

Standardabweichungen der einzelnen Datensätze errechnet. Anschließend folgte

die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung. Da eine kleine Spenderfallzahl (n

kleiner 50) vorlag, wurde zur Prüfung auf Normalverteilung der Shapiro-Wilks-Test

angewandt. Kam es zu einer Abweichung von der Normalverteilung mit einem Signi-

fikanzniveau von über 5%, d.h. der p-Wert ist kleiner als 0,05, lag keine Normalver-

teilung der Werte vor. Anschließend wurden die Daten, je nachdem ob Normalver-

teilung vorlag oder nicht, mit unterschiedlichen nicht-parametrischen Tests statist-

isch ausgewertet. Um die Mittelwerte zweier unterschiedlicher Stichproben zu ver-

gleichen, kam bei Normalverteilung der T-Test für zwei unabhängige Stichproben

zur Anwendung. Lag keine Normalverteilung vor, wurde der U-Test nach Wilcoxon-

Mann-Whitney für zwei unabhängige Stichproben verwendet. Signifikante Unter-

schiede wurden bei p-Werten kleiner als 0,05 und hochsignifikante Unterschiede bei

p-Werten kleiner als 0,01 angenommen. Die statistische Auswertung erforderte

auch den Vergleich mehrerer Messzeitpunkte bei denselben Probanden. Auch hier

wurde zuerst auf Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilks-Test geprüft. Bei Normal-

verteilung wurde zum Mittelwertvergleich die einfaktorielle Varianzanalyse mit Mess-

wiederholung für abhängige Werte verwendet. Dieser Test zeigt auf, ob sich Mittel-

werte einer Gruppe im Laufe der Zeit verändern. Die Verwendung der Varianzana-

lyse mit Messwiederholung setzt Sphärizität voraus. Unter Spärizität versteht man

die Homogenität der Varianzen der einzelnen Messzeitpunkte und Homogenität der

Kovarianzen der Zusammenhänge zwischen den Messzeitpunkten. Dies wird mit

dem Mauchly Test überprüft. Der Mauchly Test wird unter der Annahme durchge-

führt, dass die Varianz der Messzeitpunkte gleich ist und die Kovarianz einen Wert

von 0 aufweist. Bei einem nichtsignifikanten p-Wert von ›0,05, kann diese Annahme

beibehalten werden. Der Mauchly Test auf Sphärizität hat bei einer kleinen Fallzahl

nur eine begrenzte Aussagekraft, da die Sphärizität verletzt werden kann ohne sig-

nifikante Werte anzuzeigen. Im Gegensatz dazu zeigt er bei großen Fallzahlen oft

signifikante Werte auf, obwohl die Sphärizität nicht verletzt wurde. Um eine mög-

lichst genaue Auswertung zu erhalten und da es sich um eine kleine Fallzahl han-

delte, wurde deshalb der Signifikanzwert im Test auf Innersubjekteffekte immer un-

ter Annahme der Greenhouse-Geisser Korrektur angegeben. Unter Test auf In-

nersubjekteffekte versteht man einen Test für Messwiederholungsfaktoren und ihre

Interaktionen, d.h. beispielsweise der Einfluss der Lagerungszeit auf die Apoptose

der Zellen. Lag keine Normalverteilung vor, kam die Friedman Zweifach-Rang-

33

varianzenanalyse für abhängige Stichproben zur Anwendung. Auch hier wurde ein

signifikanter Unterschied bei einem p-Wert kleiner als 0,05 und ein hochsignifikanter

Unterschied bei einem p-Wert kleiner als 0,01 angenommen. Zur Überprüfung eines

Zusammenhangs zwischen zwei Variablen, wurde der Korrelationskoeffizient be-

stimmt. Bei Normalverteilung wurde die Korrelation nach Pearson berechnet, wäh-

rend bei nicht-normalverteilten Werten die Korrelation nach Kendall-Tau und Spear-

man-Rho verwendet wurde. Bei Werten nahe 0 bestand kein Zusammenhang zwi-

schen den Variablen, nahe ± 1 bestand ein starker Zusammenhang [11; 23; 57; 61;

65].

34

6.Ergebnisse

6.1 Spenderdaten

In die statistische Auswertung ging eine Spenderfallzahl von zehn ein, wovon acht

Spender männlich und zwei Spender weiblich waren. Das durchschnittliche Alter lag

bei 36 Jahren, wobei der jüngste Spender 22 Jahre und der älteste Spender 59 Jah-

re alt war. Das Körpergewicht betrug im Durchschnitt 76±11 kg. Das totale Blutvo-

lumen der Spender lag durchschnittlich bei 5037±798 ml. Für die Blutspende wer-

den nur qualifizierte Blutspender der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseo-

logischen Abteilung herangezogen [83].

6.2 Daten des Aphereselaufs

Bedingt durch die unterschiedliche Herstellung wurde bei den Leukozytenkonzen-

traten durchschnittlich 4831 ml Blutvolumen prozessiert, während bei den Throm-

bozytenkonzentraten im Durchschnitt 2965 ml Blutvolumen prozessiert wurde. Als

Antikoagulans wurde sowohl bei der Leukozytenspende, als auch der Thrombozy-

tenspende ACD-A („acid citrate dextrose“) verwendet. Der ACD-A-Verbrauch bei

den Thrombozytenspenden lag im Durchschnitt bei 322 ml, während der Verbrauch

bei den Leukozytenspenden um ungefähr 200 ml höher war. Die Spendezeit bei der

Leukozytenapherese dauerte doppelt so lange wie bei der Thrombozytapherese.

Tab.7: Daten der beiden Spendearten

Mittelwerte und Standardabweichung

Leukozytenkonzentrate N=10

Thrombozytenkonzentrate N=10

p-Werte

Prozessiertes Blutvo-lumen [ml]

4831±291 2965±720 ‹0,001‡ §

ACD-A im Thrombozy-tenkonz [ml]

- 45,50±15,33 -

ACD-A Zufuhr an Spender [ml]

- 213,8±74,7 -

ACD-A im Plasma [ml]

- 49,50±23,79 -

ACD-A-Verbrauch [ml] 521,8±21,8 321,8±73,2 ‹0,001§

Separationsdauer [min] 121±4 50,9±16,1 ‹0,001‡ §

T-Test ‡ Mann-Whitney-U-Test §

35

6.3 Produktspezifische Daten

Für die Thrombozytenspende wichtige Produktdaten waren der Thrombozytengehalt

im Konzentrat, der durchschnittlich 4,05 x1011 betrug und der Leukozytenrestgehalt,

der bei durchschnittlich 0,013x106 im Thrombozytenprodukt lag. Der Mindestwert für

den Thrombozytengehalt im Produkt darf 2 x1011 nicht unterschreiten und der ma-

ximale Restleukozytengehalt 106 Leukozyten nicht übersteigen. Das gesammelte

Plasmavolumen lag bei den Leukozytenapheresen bei 175 ml und somit um 39%

unter dem Durchschnittswert des gesammelten Plasmavolumens der Thrombozyt-

apheresen.

Tab 8: Produktdaten im Leukozytenkonzentrat und Thrombozytenkonzentrat



Thrombozytenkonzentrate N=10

p-Wert

Konzentratvolumen[ml] 124,6±28,8 319±113 ‹0,001 ‡ §

Plasmavolumen[ml] 175±121 289±144 0,08 §

Thrombozytengehalt im Produkt *10

11

- 4,05±1,24 -

Leukozytenrestgehalt im TK *10

6 - 0,013±0,018 -


6.4 Blutzellen vor der Spende

Im EDTA-Blut vor der Leukozytapherese konnte im Vergleich zum EDTA-Blut vor

der Thrombozytapherese keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Gehalts

an Blutzellen eruiert werden. Vor der Leukozytapherese zeigten sich Leukozyten-

werte von minimal 3,8 x10³ Leukozyten pro µl Blut und maximal 6,0 x10³ Leukozy-

ten pro µl Blut. Im EDTA-Blut vor der Thrombozytapherese bewegte sich der Be-

reich zwischen 3,5x10³ bis 6,7x10³ Leukozyten pro µl Blut. Die Thrombozytenwerte

lagen sowohl vor der Leukozytapherese als auch der Thrombozytapherese bei mi-

nimal 170 x10³ pro µl und erreichten maximal 247 x10³ pro µl (Leukozytapherese)

und 272 x10³ pro µl (Thrombozytapherese). Bei gleicher Spannweite der Erythrozy-

tenwerte von 0,98 x106 pro µl konnten im EDTA-Blut vor der Leukozytenkonzentrat

Gewinnung Werte zwischen 4,38 x106 pro µl und 5,36 x106 pro µl und im EDTA-Blut

vor Thrombozytapherese Erythrozytenwerte zwischen 4,29 x106 pro µl und 5,27

x106 pro µl ermittelt werden. Der Hämatokrit lag im EDTA-Blut vor Leukozytaphere-

se geringfügig höher bei durchschnittlich 43,5±2,52% als im Spenderblut vor Throm-

bozytapherese mit durchschnittlich 42,6±2,4%.

36

Abb.15: Hämatokrit im EDTA-Blut vor der Apherese

Tab 9: Blutzellen im EDTA-Blut vor der Apherese

Mittelwerte und

Standardabweichung

EDTA-Blut vor der

Leukozytapherese

EDTA-Blut vor der

Thrombozytapherese

p-Wert

Leukozyten x10³/µl 5,28±0,71 4,94±1,03 0,399‡

Thrombozyten x103/µl 217±25 223±30 0,620‡

Erythrozyten x106/µl 4,91±0,33 4,78±0,32 0,371‡

Hämatokrit [%] 43,5±2,5 42,6±2,4 0,430‡


6.5 Blutzellen in den Aphereseprodukten

Die Zellkonzentration pro Volumeneinheit lag in den LRS-Kammern teilweise höher

als in den Leukozytenkonzentraten. Es zeigte sich eine fast doppelt so hohe Leuko-

zytenkonzentration in den LRS-Kammern im Gegensatz zu den Leukozytenkon-

zentraten. Der Zellgehalt, berechnet nach der Formel Zellkonzentration in Zellen pro

ml x Produktvolumen in ml, lag allerdings in den Leukozytenkonzentraten bei 5,58

x109 im Gegensatz zu den LRS-Kammern mit 0,89 x109, da die LRS-Kammern le-

diglich ein Volumen von 10 ml enthalten, während die Leukozytenkonzentrationen

37

im Durchschnitt ein Volumen von knapp 125 ml aufweisen. Bei achtfach höherer

Erythrozytenkonzentration lag in den LRS-Kammern auch ein wesentlich höherer

Hämatokritwert vor. Der residuale Thrombozytenanteil lag mit gemittelten 2936±368

x10³ Zellen pro µl in den LRS-Kammern unter dem Wert der Leukozytenkonzentrate

mit durchschnittlich 4358±983 x10³ Zellen pro µl.

Tab 10: Zelluläre Bestandteile in den beiden Produkten

Mittelwerte und Stan-dardabweichung


LRS-Kammern N=10

p-Wert

Leukozyten x10³/µl 44,81±8,22 89,08±43,07 0,010‡

Erythrozyten x106/µl 0,81±0,34 5,77±1,07

‹0,001‡

Thrombozyten x10³/µl 4358±983 1719±921 ‹0,001‡

Hämatokrit [%] 6,54±2,66 52,0±10,6 ‹0,001‡


6.6 Vergleich von Spenderdaten und Produktdaten

6.6.1 Blutzellen vor der Spende und in LRS-Kammern

Vor der Thrombozytenapherese wurde den Spendern ein EDTA-Blutröhrchen zur

Bestimmung der Blutbildparameter abgenommen. Es zeigten sich Werte im Norm-

bereich für die zellulären Blutbestandteile mit durchschnittlich 4,94 x10³ Leukozyten

pro µl, 4,83 x106 Erythrozyten pro µl und 223 x10³ Thrombozyten pro µl. In den LRS-

Kammern waren deutlich mehr Leukozyten zu finden, ebenso mehr Thrombozyten.

Der Leukozytenwert im EDTA-Blut korrelierte schwach, aber hochsignifikant

(r=0,655; p=‹0,001) mit dem Wert in den LRS-Kammern. Der Erythrozytenanteil

zeigte zwar prozentual kaum einen Unterschied, die Erythrozyten in den LRS-

Kammern korrelierten aber nicht mit den Werten vor der Spende (r=-0,249).

Tab 11: Zelluläre Blutbestandteile im EDTA-Blut und in den LRS-Kammern


EDTA-Blut vor der Spende

N=10

LRS-Kammern

N=10

p-Werte

Leukozyten x10³/µl 4,94±1,03 89,08±43,07 ‹0,001‡

Erythrozyten x106/µl 4,83±0,34 5,77±1,07 0,019‡

Thrombozyten x10³/µl 223±30 1719±921 0,001‡

Hämatokrit [%] 42,9±3,0 52,0±10,6 0,022‡


38

6.6.2 Blutzellen vor der Spende und in Leukozytenkonzentraten

Es zeigte sich, dass die Leukozyten achteinhalbfach konzentrierter im Konzentrat

vorlagen als im EDTA-Blut. Daraus resultiert ein wesentlich höherer prozentualer

Anteil an CD14 positiven Zellen im Konzentrat als im EDTA-Blut. Es ließ sich kein

Zusammenhang feststellen zwischen Leukozytenzahl und Anteil der CD14 positiven

Zellen (r=0,120 (Spende), r=-0,083 (Konzentrat)). Wie aus Diagramm 1 ersichtlich

waren im EDTA-Blut durchschnittlich 10,99% von den durchschnittlich 5,28 x 10³

Leukozyten pro µl CD14 positive Monozyten und in den Leukozytenkonzentraten

waren es durchschnittlich 25,32% von durchschnittlich 44,81 x 10³ Leukozyten pro

µl.

Diagramm 1: Prozentualer Anteil der CD14 positiven Zellen an Leukozyten

Der Thrombozytengehalt im Konzentrat lag 20-fach konzentrierter vor als im Blut vor

der Spende. Der Anteil an Erythrozyten und folglich auch des Hämatokrits, der den

Anteil der Erythrozyten am Gesamtblutplasma in Prozent angibt, war durch die

Apherese im Konzentrat stark vermindert.

10,99%±5,20% 25,32%±6,61%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

EDTA-Blut Leukozytenkonzentrat

CD14 positive Zellen Leukozyten

39

Tab 12: Zelluläre Blutbestandteile im EDTA-Blut und in den Leukozytenkonzentraten

Mittelwerte und Stan-dardabweichung


N=10


p-Werte

Leukozyten x10³/µl 5,28±0,71 44,81±8,22 ‹0,001‡

CD14+ Zellen [%] 10,99±5,20 25,32±6,61 ‹0,001‡ §

Thrombozyten x10³/µl 217,1±25,3 4358±983 ‹0,001‡

Erythrozyten x106 /µl 4,91±0,33 0,81±0,34 ‹0,001‡

Hämatokrit [%] 43,51±2,52 6,54±2,66 ‹0,001‡


6.6.3 Annexin V- 7AAD Messung von Tregs

Der prozentuale Anteil der T-Helferzellen bezogen auf die 100000 ausgezählten

kernhaltigen Zellen betrug im EDTA-Blut gemittelt 41,32% und im Monozyten-

konzentrat durchschnittlich 43,69% und zeigte somit keinen signifikanten Unter-

schied, korrelieren dabei aber stark miteinander (r=0,879). Es zeigte sich, dass pro-

zentual nahezu gleich viele CD25 positive Zellen in den Leukozytenkonzentraten mit

minimal 38,60% und maximal 63,61% und im EDTA-Blut mit minimal 33,69% und

maximal 96,11% (Extremwert) vorlagen.

Abb. 16: Boxplot der CD25 positiven T-Zellen

40

Tab 12: Annexin V/7AAD markierte Helferzellen und Tregs zum initialen Zeitpunkt

Mittelwerte und

Standardabweichung


N=10

Leukozytenkonzentrate

N=10

p-Werte

T-Helferzellen [%] 41,32±6,03 43,69±5,87 0,384‡

0,315§

T-Helferzellen abs 6639±2218 10832±4613 0,022‡

CD25 pos [%] 52,49±18,10 49,42±9,07 0,639‡

0,971§

CD25 neg [%] 47,15±18,10 50,38±9,19 0,661‡

1,000§

CD25pos abs 3371±1421 5313±2655 0,061‡

CD25neg abs 3273±1941 5534±2483 0,037‡


Der prozentuale Anteil an Annexin V positiven 7AAD negativen (frühapoptotischen)

CD25 positiven T-Zellen wies keinen signifikanten Unterschiede auf, ebenso zeigte

sich bei den apoptotischen CD25 negativen T-Zellen keine signifikante Abweichung

der Werte mit minimal 0,67% und maximal 15,26% im EDTA-Blut und 1,92% bis

11,33% in den Leukozytenkonzentraten.

Abb.17: CD25 negative apoptotische Zellen

41

Im EDTA-Blut ließen sich signifikant mehr CD25 positive Annexin V positive 7AAD

positive (nekrotische) Zellen nachweisen als in den Leukozytenkonzentraten. Es

zeigte sich hierbei eine deutlich breitere Spannweite dieser Werte von 0,62% als in

den Leukozytenkonzentraten mit einer Spannweite von 0,25%. Der prozentuale An-

teil CD25 negativer nekrotischer Zellen fiel im EDTA-Blut mit durchschnittlich 0,24%

ebenfalls geringfügig höher aus als in den Leukozytenkonzentraten mit durchschnitt-

lich 0,16%. Es bestand dennoch ein signifikanter Unterschied, da in den Leukozy-

tenkonzentraten ein Extremwert von 0,60% vorlag, der den Mittelwert anhob. Unter

Ausschluss dieses Extremwertes ließen sich durchschnittlich 0,06% nekrotische

CD25 negative Zellen in den Konzentraten nachweisen.

Abb. 18: CD25 negative nekrotische Zellen

42

Tab 13: Annexin V/7AAD markierte Tregs zum initialen Zeitpunkt

Mittelwerte und

Standardabweichung


N=10


N=10

p-Werte

CD25 pos

apoptotisch [%] 9,39±3,59 10,09±2,33 0,611‡

CD25 neg

apoptotisch [%] 6,38±4,19 5,22±3,05 0,490‡

CD25 pos

nekrotisch [%] 0,31±0,20 0,16±0,82 0,041‡

CD25 neg

nekrotisch [%] 0,24±0,17 0,12±0,18

0,140‡

0,035§


6.6.4 JC1-Messung von Lymphozyten und Monozyten

Tabelle 14 zeigt die sowohl vitalen als auch apoptotischen Lymphozyten und Mo-

nozyten nach JC1 Markierung. Die vitalen Lymphozyten des EDTA-Blutes zeigten

einen Minimalwert von 86,22% und einen Maximalwert von 98,52% und unterschie-

den sich nicht signifikant von den Werten im Leukozytenkonzentrat, in welchem sich

die Werte über eine Spannbreite von 75,97% bis 96,60% verteilten. Ebenso zeigte

sich bei den vitalen Monozyten, die im EDTA-Blut einen Spannweitenbereich von

6,15% und im Leukozytenkonzentrat einen Bereich von 6,75% umfassen, kein signi-

fikantes Ergebnis.

Abb. 19: Boxplot der vitalen Monozyten

43

Dieser Spannweitenbereich blieb auch bei den apoptotischen Monozyten erhalten.

Die apoptotischen Lymphozyten zeigten eine wesentlich größere Streuung der Wer-

te im Leukozytenkonzentrat mit minimal 1,48% und maximal 13,14% apoptotischer

Zellen als im EDTA-Blut mit einem Minimalwert von 0,57% und einem Maximalwert

von 6,72%.

Tab 14: JC1 markierte mononukleäre Zellen zum initialen Zeitpunkt

Mittelwerte und

Standardabweichung


N=10


N=10

p-Werte

Lymphozyten vital

[%] 93,61±3,71 88,96±6,02 0,055‡

Monozyten vital

[%] 96,83±1,89 96,51±2,00 0,718‡

Lymphozyten apopto-

tisch [%] 6,25±3,58 11,05±6,02 0,047‡

Monozyten apopto-

tisch [%] 3,16±1,88 3,49±2,00 0,702‡


6.6.5 BrdU Messung von mononukleären Zellen

Die mit BRDU markierten mononukleären Zellen wurden hinsichtlich vitaler und

apoptotischer Zellen unterschieden. Es zeigte sich eine sehr große Spannweite der

Werte im EDTA-Blut sowohl bei den vitalen mononukleären Zellen mit minimal

65,68% (Extremwert) und maximal 98,80% als auch bei den apoptotischen Zellen

mit einem Minimalwert von 1,35% und einem Maximalwert von 34,32% (Extrem-

wert), während im Leukozytenkonzentrat die Spannweite bei den vitalen Zellen von

96,48% bis 99,63% und bei den apoptotischen Zellen zwischen 0,37% bis 3,42%

lag. Unter Vernachlässigung der Extremwerte ließ sich kein signifikanter Unter-

schied zwischen EDTA-Blut und Leukozytenkonzentraten nachweisen.

44

Tab 15: BRDU markierte mononukleäre Zellen zum initialen Zeitpunkt

Mittelwerte und

Standardabweichung


N=10


N=10

p-Werte

MNC vital

[%] 90,90±12,40 98,38±1,05

0,089‡

0,007§

MNC apoptotisch

[%] 8,92±12,48 1,61±1,04

0,098‡

0,019§


6.7 Darstellung mittels unterschiedlicher Analysen

6.7.1 Annexin V- 7AAD positive Tregs

Der prozentuale Anteil an T-Helferzellen in den Leukozytenkonzentraten betrug

durchschnittlich 43,69±5,87% und in den LRS-Kammern 45,30±6,11%. Davon wur-

de der prozentuale Anteil an regulatorischen T-Zellen ermittelt, die als Oberflä-

chenantigene CD4 positiv und CD25 positiv waren. Die folgenden Diagramme zei-

gen, dass sich die Anteile an regulatorischen T-Zellen in den Leukozytenkonzentra-

ten und in den LRS-Kammern nicht signifikant voneinander unterschieden.

Diagramm 2: Prozentuale Anteile der Tregs zum initialen Zeitpunkt

49,42±9,07% 51,40+16,85%

50,38±9,19% 48,60±16,85%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Leukozytenkonzentrate LRS-Kammern

CD25 positive T-Zellen CD25 negative T-Zellen

45

Diagramm 3: Prozentuale Anteile der Tregs nach 48-stündiger Lagerung

Drei Stunden nach Konzentratgewinnung befanden sich in den Leukozytenkon-

zentraten zwischen 6,30% bis 13,73% apoptotische CD25 positive T-Zellen und

somit hochsignifikant mehr als in den LRS-Kammern mit minimal 3,11% bis maximal

10,37%.

Abb. 20: Boxplot der apoptotischen CD25 positiven Zellen zum initialen Zeitpunkt

41,41±8,0% 49,80±17,44%

58,60±8,00% 50,20±17,44%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Leukozytenkonzentrate LRS-Kammern


46

Die apoptotischen CD25 negativen T-Zellen wiesen in den Leukozytenkonzentraten

eine Spannweite von 9,41% mit einem Maximalwert von 11,33% auf und waren so-

mit vergleichbar mit den Werten der LRS-Kammern, die eine Spannweite von 9,27%

und einen Maximalwert von 10,31% zeigten. Der Anteil nekrotischer CD25 positiver

T-Zellen zeigte zu Beginn mit Durchschnittswerten von 0,16±0,82% in den Leukozy-

tenkonzentraten und 0,27±0,24% in den LRS-Kammern sehr geringe Werte.

Abb. 21: Boxplot der nekrotischen CD25 positiven T-Zellen

Die prozentualen Anteile der nekrotischen CD25 negativen T-Zellen in den Leukozy-

tenkonzentraten und den LRS-Kammern zeigten ebenfalls keine signifikanten Un-

terschiede. Im Mittel lagen in den Leukozytenkonzentraten initial mehr Annexin V

positive und 7AAD negative regulatorische T-Zellen vor als in den LRS-Kammern,

während sich dieses Verhältnis bei den Annexin V positiven und 7AAD positiven

regulatorischen T-Zellen umkehrte.

47

Tab 16: Annexin V/7AAD positive CD25 T-Zellen zum initialen Zeitpunkt

Mittelwerte und

Standardabweichung


N=10

LRS Kammern

N=10 p-Werte

CD25 pos

apoptotisch [%] 10,09±2,33 6,10±2,33 ‹0,001‡

CD25 neg

apoptotisch [%] 5,22±3,04 3,21±2,69

0,135‡

§

CD25 pos

nekrotisch [%] 0,16±0,82 0,27±0,24

0,178‡

§

CD25 neg

nekrotisch [%] 0,12±0,18 0,14±0,15 0,649§


Nach sechs Stunden zeigten lediglich die Annexin V positiven und 7AAD positiven

CD25 positiven T-Zellen signifikante Abweichungen. Während in den Leukozyten-

konzentraten durchschnittlich 9,08±3,42% apoptotische CD25 positive Zellen nach-

weisbar waren, ließen sich in den LRS-Kammern nur 4,89±1,66% analysieren. Die

prozentualen Anteile der apoptotischen CD25 negativen T-Zellen zeigten keine sig-

nifikanten Unterschiede in den beiden Leukozytenprodukten. Der mediane Wert der

Leukozytenkonzentrate lag bei 3,07%, der der LRS-Kammern bei 2,07%.

Abb. 22: Apoptotische CD25 positive T-Zellen nach sechs Stunden Lagerung

48

In den prozentualen Anteilen der Annexin V positiven und 7AAD positiven Tregs

konnten keine signifikanten Unterschiede in den beiden Produkten nachgewiesen

werden.

Tab 17: Annexin V/7AAD positive CD25 T- Zellen nach sechs Stunden

Mittelwerte und

Standardabweichung


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

CD25 pos apoptotisch [%] 9,08±3,42 4,89±1,66 0,004‡

CD25 neg apoptotisch [%] 5,18±4,55 2,70±1,17 0,126‡

0,123§

CD25 pos nekrotisch [%] 0,30±0,18 0,25±0,13 0,529§

CD25 neg nekrotisch [%] 0,26±0,37 0,14±0,12 0,853§


Nach 24-stündiger Lagerung zeigten sowohl die apoptotischen CD25 positiven als

auch die apoptotischen CD25 negativen T-Zellen in den beiden Zellprodukten ähn-

liche durchschnittliche Werte. An Annexin V positiven und 7AAD positiven CD25

positiven Zellen konnten in den Leukozytenkonzentraten durchschnittlich

2,02±2,74% Zellen nachgewiesen werden, während bei den LRS-Kammern lediglich

im Durchschnitt 0,58±0,40% nekrotische Zellen nachzuweisen waren. Ebenfalls

zeigten sich deutlich mehr nekrotische CD25 negative Zellen in den Leukozyten-

konzentraten mit gemittelt 1,13±1,19% Zellen. In den LRS-Kammern fanden sich

durchschnittlich dreimal weniger nekrotische CD25 negative Zellen. Somit lag der

prozentuale Anteil an Annexin V positiven und 7AAD positiven regulatorischen T-

Zellen in den Leukozytenkonzentraten nach 24-stündiger Lagerung höher als in den

LRS-Kammern.

Tab 18: Annexin V/7AAD markierte CD25 T- Zellen nach 24-stündiger Lagerung

Mittelwerte und

Standardabweichung


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

CD25pos apoptotisch [%] 6,34±1,12 6,40±3,80 0,965‡

CD25neg apoptotisch [%] 3,92±2,46 3,75±2,47 0,221§

CD25pos nekrotisch [%] 2,02±2,74 0,58±0,40 0,047§

CD25neg nekrotisch [%] 1,13±1,19 0,37±0,29 0,079‡


49

Bei Betrachtung der 48 Stunden Werte wiesen die apoptotischen CD25 positiven T-

Zellen in den Leukozytenkonzentraten niedrigere Werte mit einem minimalen Wert

von 0,60% und einem maximalen Wert von 6,18% auf, als die LRS-Kammern mit

Werten zwischen 2,09% bis 10,93%. Ähnlich verhielt es sich mit den apoptotischen

CD25 negativen T-Zellen. Hier zeigten die Leukozytenkonzentrate Werte zwischen

0,28% bis maximal 5,32% und die LRS-Kammern Werte von minimal 1,22% und

maximal 10,15%. Die nekrotischen Zellen zeigten in den Leukozytenkonzentraten

im Gegensatz zu den LRS-Kammern signifikant höhere Werte. Während die Leuko-

zytenkonzentrate mit Durchschnittswerten von 6,69±9,10% nekrotischer CD25 posi-

tiver T-Zellen auffielen, waren in den LRS-Kammern lediglich Durchschnittswerte

von 0,97±0,73% zu verzeichnen. Die nekrotischen CD25 negativen T-Zellen zeigten

in den Leukozytenkonzentraten Werte bis maximal 19,76%, in den LRS-Kammern

fand sich ein maximaler Wert von 6,73%.

Diagramm 4: Darstellung der apoptotischen und nekrotischen CD25 positiven Zellen

LK= Leukozytenkonzentrat; LRSC= LRS-Kammern

012345678

apoptotisch LK apoptotisch LRSC nekrotisch LK nekrotisch LRSC

%

CD25 positive T-Zellen

48h Annexin

50

Diagramm 5: Apoptotische und nekrotische CD25 negativen Zellen

LK= Leukozytenkonzentrat; LRSC= LRS-Kammern

Nach 48 Stunden ließen sich signifikant mehr Annexin V positive und 7AAD positive

regulatorische T-Zellen in den Leukozytenkonzentraten auffinden als in den LRS-

Kammern, während sich die prozentualen Anteile Annexin V positiver und 7AAD

negativer regulatorischer T-Zellen nicht wesentlich unterschieden.

Tab 19: Annexin V/7AAD markierte CD25 T- Zellen nach 48-stündiger Lagerung

Mittelwerte und

Standardabweichung


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

CD25 pos

apoptotisch [%]

4,15±1,79 5,04±2,71 0,398‡

CD25 neg

apoptotisch [%]

2,74±1,39 3,06±2,68 0,739‡

0,427§

CD25 pos

nekrotisch [%]

6,69±9,10 0,97±0,73 0,078‡

0,002§

CD25 neg

nekrotisch [%]

8,26±6,98 1,61±2,13 0,015‡

0,026§


Zusammenfassend zeigte sich, dass bei ähnlichen prozentualen Anteilen an regula-

torischen T-Zellen in den beiden Leukozytenprodukten der Anteil an Annexin V posi-

tiven und 7AAD negativen (apoptotischen) CD25 positiven Helferzellen in den Leu-

kozytenkonzentraten zu den Messzeitpunkten drei Stunden nach Gewinnung und

sechs Stunden signifikant höher lag als in den LRS-Kammern. Nach einem La-

gerungsintervall von 24 und 48 Stunden allerdings keine signifikant unterschied-

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

apoptotisch LK apoptotisch LRSC nekrotisch LK nekrotisch LRSC

%

CD25 negative T-Zellen

48h Annexin

51

lichen Werte mehr zu finden waren. Bei den Annexin V positiven und 7AAD positi-

ven (nekrotischen) Tregs konnten im ersten Lagerungszeitraum keine signifikanten

Abweichungen der Werte in den beiden Produkten festgestellt werden. Erst nach 48

Stunden waren signifikant mehr nekrotische regulatorische Zellen in den Leukozy-

tenkonzentraten nachweisbar.

6.7.2 JC1 detektierte Lymphozyten und Monozyten

Mittels JC1 und CD4 Markierung konnten die beiden Populationen der mono-

nukleären Zellen hinsichtlich ihres Apoptoseverhaltens und erhaltener Vitalität in

einem Zeitraum von 48 Stunden beurteilt werden. Es zeigte sich, dass drei Stunden

nach Gewinnung bereits gemittelt 11,05% apoptotische Lymphozyten im Leuko-

zytenkonzentrat vorlagen. In den LRS-Kammern wurden signifikant dreifach höhere

Werte mit einer Spannweite von 4,74% bis 76,37% ersichtlich.

Abb. 23: Boxplot der apoptotischen Lymphozyten zum initialen Zeitpunkt

In den LRS-Kammern zeigten sich minimal 0,42% bis maximal 91,90% apoptotische

Monozyten und somit hochsignifikant mehr apoptotische Zellen als in den Leuko-

zytenkonzentraten mit Werte zwischen 1,37% und 8,12% und einer Spannweite von

6,75%.

52

Abb. 24: Boxplot der apoptotischen Monozyten

Nach sechsstündiger Lagerung zeigten sich apoptotische Lymphozytenwerte in den

LRS-Kammern mit minimal 1,64% und maximal 62,85%, während sich die Werte

der Leukozytenkonzentrate in einem Bereich von 3,59% bis 22,54% bewegten und

somit signifikant geringere Werte zeigten. An apoptotischen Monozyten wiesen die

LRS-Kammern durchschnittlich 30,83% Zellen und die Leukozytenkonzentrate ge-

mittelt 5,29% Zellen auf. Auch hier ließen sich in den LRS-Kammern signifikant

mehr apoptotische Monozyten aufzeigen.

Tab 20: Vitale und apoptotische Lymphozyten und Monozyten nach sechs Stunden

Messzeitpunkt: 6h

JC1


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

Lymphozyten vital [%] 89,72±6,57 73,34±19,76 0,030‡

Monozyten vital [%] 94,71±6,49 69,18±29,17 0,022‡

0,034§

Lymphozyten apoptotisch [%] 10,27±6,57 26,65±19,76 0,030‡

Monozyten apoptotisch [%] 5,29±6,50 30,83±29,17 0,022‡

0,034§


53

Mit längerer Lagerungsperiode wurden keine signifikanten Unterschiede mehr zwi-

schen den beiden untersuchten Zellprodukten ersichtlich. In den Leukozyten-

konzentraten befanden sich nach 24-stündiger Lagerung durchschnittlich 22,04%

apoptotische Lymphozyten, in den LRS-Kammern durchschnittlich 33,52%. Auch

nach weiteren 24 Stunden Lagerung zeigten sich weder in den LRS-Kammern noch

in den Leukozytenkonzentraten signifikante Abweichungen in den Lymphozyten-

werten.

Tab 21: Vitale und apoptotische Lymphozyten und Monozyten nach 48 Stunden

Messzeitpunkt: 48h

JC1


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

Lymphozyten vital [%]

50,28±29,47 66,58±22,91 0,185‡

Monozyten vital [%]

43,53±31,72 67,02±29,09 0,102‡

0,070§

Lymphozyten apoptotisch [%] 49,71±29,48 33,42±22,92 0,185‡

Monozyten apoptotisch [%] 56,44±31,76 32,96±29,09 0,102‡

0,070§

T-Test ‡ Mann-Whitney-U-Test

Die apoptotischen Monozyten verhielten sich ähnlich. In den Leukozytenkonzen-

traten zeigte sich nach 24-stündiger Lagerung eine Spannweite der Werte von

9,13% bis 23,46% und nach längerem Lagerungsintervall Werte von 12,41% bis

97,22%. Die LRS-Kammern wiesen innerhalb der Lagerungszeit Werte von anfangs

6,5% bis 91,95% und am Ende der Lagerung von 7,12% bis 85,30% auf.

Diagramm 6 und 7 zeigen deutlich die prozentualen Unterschiede des apop-

totischen Verhaltens der Lymphozyten und Monozyten. Während der Messzeitpunk-

te initial (drei Stunden nach Gewinnung), sechs Stunden und 24 Stunden lag der

Anteil an apoptotischen Zellen in den Leukozytenkonzentraten wesentlich niedriger

als in den LRS-Kammern. Zum Messzeitpunkt 48 Stunden waren deutlich mehr

apoptotische Zellen in den Leukozytenkonzentraten zu finden als in den LRS-

Kammern.

54

Diagramm 6: Vitale und apoptotische Lymphozyten in den Aphereseprodukten

LK= Leukozytenkonzentrate; LRSC= LRS-Kammern

Diagramm 7: Darstellung der vitalen und apoptotischen Monozyten

LK= Leukozytenkonzentrat; LRSC= LRS-Kammer

Insgesamt konnten mit der JC1 Methode innerhalb der ersten sechs Stunden des

Lagerungsintervalls signifikant mehr apoptotische Lymphozyten und Monozyten

nachgewiesen werden als in den Leukozytenkonzentraten. Zu den Messzeitpunkten

24 und 48 Stunden unterschieden sich die beiden Leukozytenprodukte hinsichtlich

der apoptotischen Zellen nicht mehr signifikant voneinander. Lediglich nach 48

Stunden lag der prozentuale Anteil an apoptotischen Zellen in den Leukozytenkon-

zentraten über dem der LRS-Kammern.

6.7.3 BrdU detektierte mononukleäre Zellen

Die mononukleären Zellen wurden mittels BRDU detektiert und im zeitlichen Verlauf

über 48 Stunden hinsichtlich Vitalität und Apoptoseverhalten untersucht. Zum ini-

tialen (drei Stunden nach Gewinnung) Zeitpunkt zeigten die Leukozytenkonzentrate

eine signifikant höhere Apoptoserate mit einem minimalen Wert von 0,37% und ei-

0

20

40

60

80

100

vital LK vital LRSC apoptotisch LK apoptotischLRSC

%

Lymphozyten in den Aphereseprodukten

initial JC1

6h JC1

24h JC1

48h JC1

0

20

40

60

80

100

120

vital LK vital LRSC apoptotischLK

apoptotischLRSC

%

Monozyten in den Aphereseprodukten

initial JC1

6h JC1

24h JC1

48h JC1

55

nem maximalen Wert von 3,42% im Gegensatz zu den LRS-Kammern mit einem

Wertebereich von 0,18% bis 1,49%.

Tab 22: Vitalität und Apoptose in den beiden Zellprodukten

Messzeitpunkt: initial

Apo BRDU


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

MNC vital

[%]

98,38±1,05 99,27±0,43 0,028‡

MNC apoptotisch

[%]

1,61±1,04 0,73±0,43 0,023‡


Nach sechsstündiger Lagerung bei Raumtemperatur zeigte sich ebenfalls ein hoch-

signifikanter Unterschied im prozentualen Anteil der apoptotischen Zellen in den

Leukozytenkonzentraten mit Werten zwischen 0,55% bis 5,50%, während die

apoptotischen mononukleären Zellen in den LRS-Kammern lediglich einen Maxi-

malwert von 1,90% erreichten.

Tab 23: Vitalität und Apoptose in beiden Zellprodukten

Messzeitpunkt: 6h

Apo BRDU


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

MNC vital

[%]

97,68±1,38 99,08±0,70 0,011‡

MNC apoptotisch

[%]

2,31±1,35 0,91±0,68 0,009‡


Zum Messzeitpunkt nach 24 Stunden zeigten die apoptotischen Zellen in den LRS-

Kammern mit durchschnittlich 1,16±1,16% und in den Leukozytenkonzentraten mit

durchschnittlich 2,30±0,92% einen signifikanten Unterschied.

56

Abb. 25: Apoptotische mononukleäre Zellen nach 24-stündiger Lagerung

Tab 24: Vitalität und Apoptose nach 24 Stunden Lagerung

Messzeitpunkt: 24h

Apo BRDU


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

MNC vital

[%]

97,70±0,94 98,84±1,15 0,026‡

0,003§

MNC apoptotisch

[%]

2,30±0,92 1,16±1,16 0,026‡

0,003§


Auch nach 48-stündiger Lagerung ließen sich in den Leukozytenkonzentraten pro-

zentual mehr apoptotische Zellen mit einem minimalen Wert von 1,84% und einem

maximalem Wert von 11,02% nachweisen als in den LRS-Kammern mit minimalen

0,17% und einem Maximalwert von 8,41%.

57

Tab 25: Vitalität und Apoptose nach 48-stündiger Lagerung

Messzeitpunkt: 48h

Apo BRDU


N=10

LRS Kammern

N=10

p-Werte

MNC vital

[%]

95,05±2,86 97,19±2,94 0,116‡

0,029§

MNC apoptotisch

[%]

5,01±2,82 2,82±2,96 0,107‡

0,029§


Bei der DNA-Strangbruchdetektierung mittels BrdU zeigten sich im gesamten La-

gerungsintervall signifikant mehr apoptotische mononukleäre Zellen in den Mono-

zytenkonzentraten als in den LRS-Kammern.

6.8 Einfluss der Kurzzeitlagerung

6.8.1 Annexin V/ 7AAD positive Tregs im Aphereseprodukt

Der prozentuale Anteil an CD4 positiven T-Helferzellen bezogen auf die durchfluß-

zytometrisch ausgezählten 100000 Leukozyten nahm in den Leukozytenkonzen-

traten im zeitlichen Verlauf hochsignifikant von durchschnittlich 43,48% Zellen auf

durchschnittlich 33,44% T-Helferzellen ab. Die CD25 positiven T-Zellen, die einen

prozentualen Anteil an den T-Helferzellen darstellen, zeigten ebenfalls eine signifi-

kante Abnahme mit anfänglich minimal 38,60% und maximal 63,61% CD25 positive

Zellen und sinkt dann nach 48 Stunden auf Werte von minimal 32,49% und maximal

56,88%. Aufgrund der Abnahme an CD25 positiven Zellen kam es zum signifikanten

Anstieg der CD25 negativen T-Zellen, da deren prozentualer Anteil zusammen mit

dem prozentualen Anteil der CD25 positiven T-Zellen auf 100% T-Helferzellen be-

zogen wurde.

58

Diagramm 8: Abnahme an CD25 positiven T-Zellen in Kurzzeitlagerung

Tab 26: Annexin V/7AAD positive Helferzellen und Tregs im Leukozytenkonzentrat

Mittelwerte und

Standardabweichung

Lagerung:

initial

Lagerung:

6h

Lagerung:

24h

Lagerung:

48h

p-Werte

THZ [%] 43,48±6,36 43,69±5,87 40,30±6,36 33,44±9,19 ‹0,001ɛ

CD25 pos [%] 49,42±9,07 48,39±8,72 44,57±9,22 41,41±8,00 0,025ɛ

‹0,001π

CD25 neg [%] 50,38±9,19 51,61±8,72 55,42±9,22 58,60±8,00 0,023ɛ

‹0,001π

THZ abs 10832±4613 12281±5230 15384±5633 15108±6295 ‹0,001ɛ

CD25 pos abs 5313±2655 5925±2971 7445±3878 6292±3239 0,025ɛ

CD25 neg abs 5534±2483 6377±2822 7964±2838 8828±3802 0,002ɛ

bei Normalverteilung:Verwendung von Messwiederholung; da kleine Stichprobe Verwendung der Greenhouse-Geisser-Korrektur ɛ keine Normalverteilung: Friedmans Zweifach-Rangvarianzenanalyse π

Die T-Helferzellen der LRS-Kammern zeigten ebenfalls eine signifikante prozentuale

Abnahme von anfangs durchschnittlich 45,30% auf 40,40% am Ende der Messreihe.

Die prozentualen Anteile an CD25 positiven und negativen T-Zellen bezogen auf die

CD4 positiven T-Helferzellen ließen ebenfalls einen signifikanten Abfall bzw. Anstieg

erkennen. Der prozentuale Anteil an CD25 positiven T-Zellen nahm im Verlauf um

1,60% auf durchschnittlich 49,80% ab.

49,42±9,07 48,39±8,72 44,57±9,22 41,41±8,00

50,38±9,19 51,61±8,72 55,42±9,22 58,60±8,00

0102030405060708090

100110

initial 6h 24h 48h

%

Lagerungszeit

CD25 posititve T-Zellen CD25 negative T-Zellen

59

Diagramm 9: CD25+ und CD25- Zellen in den LRS-Kammern in Kurzzeitlagerung

Tab 27: Annexin V/7AAD positive Helferzellen und Tregs in den LRS-Kammern

Mittelwerte und

Standardabweichung

Lagerung:

initial

Lagerung:

6h

Lagerung:

24h

Lagerung:

48h

p-Werte

THZ [%] 45,30±6,11 45,35±6,41 44,40±5,90 40,40±6,57 0,011ɛ

CD25 pos [%] 51,40±16,85 50,59±17,07 50,42±17,15 49,80±17,44 0,252ɛ

0,077π

CD25 neg [%] 48,60±16,85 49,41±17,07 49,58±17,15 50,20±17,44 0,252ɛ

0,077ɛ

THZ abs 17077±6616 17044±6938 17600±7434 17192±6987 0,496ɛ

CD25 pos abs 7795±1786 7907±2185 8032±1884 7733±1918 0,792ɛ

CD25 neg abs 5534±2483 9170±5450 9618±6072 9472±5446 0,016ɛ


Bei den apoptotischen regulatorischen CD25 positiven T-Zellen ließ sich in den

Leukozytenkonzentraten eine hochsignifikante Abnahme von Annexin V positiven

und 7AAD negativen Zellen (apoptotische Zellen) im Zeitverlauf nachweisen. Zum

ersten Messzeitpunkt konnte ein maximaler Wert von 13,73% von apoptotischen

Zellen verzeichnet werden. Nach 48-stündiger Lagerung ließen sich nur noch maxi-

mal 6,18% an apoptotischen CD25 positiven T-Zellen nachweisen. Auch bei den

regulatorischen CD25 negativen T-Zellen zeigte sich eine signifikante Abnahme von

51,40±16,85 50,59±17,07 50,42±17,15 49,80±17,44

48,60±16,85 49,41±17,07 49,58±17,15 50,20±17,44

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

initial 6h 24h 48h

%

Lagerungszeit


60

in Apoptose gegangenen T-Zellen von anfänglich 5,22% auf 2,74%. Folglich konnte

bei den Annexin V positiven und 7AAD positiven regulatorischen T-Zellen (nekro-

tische Zellen) eine hochsignifikante Zunahme des prozentualen Anteils verzeichnet

werden. Die CD25 positiven T-Zellen zeigten zu Beginn minimal 0,06% und maximal

0,31% nekrotische Tregs. Nach 48 Stunden ließen sich minimal 0,75% und maximal

31,64% nekrotische Zellen nachweisen. Die CD25 negativen regulatorischen T-

Zellen zeigten ebenfalls einen starken Anstieg von durchschnittlich 8,14% auf ge-

mittelte 8,26% nekrotische Zellen nach 48-stündiger Lagerung.

Diagramm 10: Apoptotische und nekrotische Tregs im Leukozytenkonzentrat

Tab 28: Annexin V/7AAD positive Tregs im Leukozytenkonzentrat

Mittelwerte und

Standardabweichung

Lagerung:

initial

Lagerung:

6h

Lagerung:

24h

Lagerung:

48h

p-Werte

CD25 pos Annexin V + 7AAD - [%]

10,09± 2,23 9,08±3,42 6,34±1,12 4,15±1,79 ‹0,001ɛ

CD25 neg Annexin V+ 7AAD- [%]

5,22±3,05 5,18± 4,55 3,92±2,46 2,74±1,39 0,054ɛ 0,160π

CD25 pos Annexin V+ 7AAD+ [%]

0,16±0,08 0,30±0,18 2,02±2,74 6,69±9,10 ‹0,001π 0,051ɛ

CD25 neg Annexin V+ 7AAD+ [%]

0,12±0,18 0,26± 0,37 1,13±1,19 8,26±6,98 0,005ɛ ‹0,001π

bei Normalverteilung:Verwendung von Messwiederholung; da kleine Stichprobe Verwen-dung der Greenhouse-Geisser-Korrektur ɛ keine Normalverteilung: Friedmans Zweifach-Rangvarianzenanalyse π

0

2

4

6

8

10

12

initial 6h 24h 48h

%

Lagerungszeit

CD25 positiveapoptotische T-Zellen

CD25 negativeapoptotische T-Zellen

CD25 positivenekrotische T-Zellen

CD25 negativenekrotische T-Zellen

61

Es konnte somit gezeigt werden, dass es in den Leukozytenkonzentraten zur konti-

nuierlichen Abnahme der apoptotischen Tregs im Zeitverlauf kam mit gleichzeitigem

Anstieg der prozentualen Anteile der nekrotischen Tregs.

In den LRS-Kammern zeigte sich keine signifikante Abnahme von Annexin V

positiven und 7AAD negativen regulatorischen T-Zellen im zeitlichen Verlauf. So-

wohl bei den CD25 positiven als auch bei den CD25 negativen T-Zellen zeigte sich

nach sechsstündiger Lagerung ein Abfall an Annexin V positiven und 7AAD negati-

ven Zellen (apoptotische Zellen) von durchschnittlich 1,21% (CD25 positiv) und

0,51% (CD25 negativ). Anschließend ließ sich nach weiterer 18-stündiger Lagerung

eine Zunahme an apoptotischen Zellen verzeichnen auf durchschnittlich 6,40%

(CD25 positiv) und 3,75% (CD25 negativ), bevor der prozentuale Anteil der apopto-

tischen Zellen bei weiterer Lagerung wieder abfällt.

Abb. 26: Apoptotische CD25 positive T-Zellen in den LRS-Kammern

Bei den nekrotischen CD25 positiven T-Zellen in den LRS-Kammern ließ sich eine

hochsignifikante Zunahme der prozentualen Anteile erkennen. Zu Beginn konnten

Werte von minimal 0,07% und maximal 0,92% verzeichnet werden. Nach 48-

stündiger Lagerung zeigte sich ein Anstieg der nekrotischen CD25 positiven Zellen

auf Werte von minimal 0,22% bis maximal 2,45%. Die nekrotischen CD25 negativen

T-Zellen zeigten ebenfalls einen hochsignifikanten prozentualen Anstieg von initial

maximal 0,39% auf maximal 6,73% nekrotischer Zellen nach 48 Stunden.

62

Diagramm 11: Apoptotische und nekrotische Tregs in den LRS-Kammern

Tab 29: Annexin V/7AAD positive Tregs in den LRS-Kammern

Mittelwerte und

Standardabweichung

Lagerung:

initial

Lagerung:

6h

Lagerung:

24h

Lagerung:

48h

p-Werte

CD25 pos Annexin V+ 7AAD- [%]

6,10±2,33 4,89±1,66 6,40±3,80 5,04±2,71 0,128ɛ

CD25 neg Annexin V+ 7AAD- [%]

3,21±2,69 2,70±1,17 3,75±2,47 3,06±2,68 0,516π 0,280ɛ

CD25 pos Annexin V+ 7AAD+ [%]

0,27±0,24 0,25±0,13 0,58±0,40 0,97±0,73 ‹0,001π 0,008ɛ

CD25 neg Annexin V+ 7AAD+ [%]

0,14±0,15 0,14±0,12 0,37±0,29 1,61±2,13 ‹0,001π 0,071ɛ


In den LRS-Kammern ließ sich nur bei den nekrotischen Tregs eine signifikante Zu-

nahme im Zeitverlauf nachweisen. Die apoptotischen Tregs zeigten nach 24 Stun-

den einen nicht signifikanten prozentualen Anstieg und fielen nur nach sechs Stun-

den und 48 Stunden nicht signifikant ab.

6.8.2 JC1 markierte Zellen im Aphereseprodukt

Die mit JC1 markierten Lymphozyten in den Leukozytenkonzentraten zeigten im

Zeitverlauf eine hochsignifikante Abnahme ihrer Vitalität, während der prozentuale

Anteil der in Apoptose gegangenen Zellen hochsignifikant zunahm. Zum ersten

0

1

2

3

4

5

6

7

initial 6h 24h 48h

%

Lagerungszeit

CD25 positiveapoptotische T-Zellen

CD25 negativeapoptotische T-Zellen

CD25 positivenekrotische T-Zellen

CD25 negativenekrotische T-Zellen

63

Messzeitpunkt konnten minimal 75,97% und maximal 96,60% vitale Lymphozyten

nachgewiesen werden. Nach 48-stündiger Kurzzeitlagerung wurden Werte für die

vitalen Lymphozyten zwischen 7,27% bis 84,86% sichtbar.

Abb. 27: Vitale Lymphozyten in den Leukozytenkonzentraten im Zeitverlauf

Die apoptotischen Lymphozyten in den Leukozytenkonzentraten wiesen am Beginn

der Messung Werte zwischen 3,40% und 24,03% auf. Während nach sechsstündi-

ger Lagerung ein maximaler Wert von 22,54% erreicht wurde, stieg mit längerer

Lagerungszeit der prozentuale Anteil apoptotischer Lymphozyten mit maximalen

30,46% nach 24-stündiger Lagerung und maximalen 92,73% nach 48-stündiger

Lagerung stetig an.

Abb. 28: Apoptotische Lymphozyten in den Leukozytenkonzentraten

64

Die Monozyten in den Leukozytenkonzentraten wiesen ebenfalls eine hochsignifi-

kante Abnahme ihrer Vitalität und eine hochsignifikante Zunahme der apoptotischen

Zellen auf. Zu Beginn der Messreihe konnten 91,88% bis 98,63% vitale Monozyten

nachgewiesen werden, die im Laufe der Kurzzeitlagerung auf Werte von 2,78% bis

87,49% abnahmen. Die Monozyten zeigten in ihrem apoptotischen Verhalten einen

konsequenten Anstieg von initial maximal 8,12%, über maximal 21,41% nach sechs-

stündiger Lagerung bis maximal 97,22% apoptotischer Zellen zum Messzeitpunkt-

ende. Auffällig zeigte sich die starke Zunahme der Streubreite der Werte nach 48

Stunden mit einem minimalen Wert der apoptotischen Lymphozyten von 15,14%

und maximalen 92,73%, sowie bei den apoptotischen Monozyten von minimal

12,41% bis maximal 97,22%.

Tab 30: JC1 markierte Lymphozyten und Monozyten im Leukozytenkonzentrat

Mittelwerte und

Standardabweichung

Lagerung:

initial

Lagerung:

6h

Lagerung:

24h

Lagerung:

48h

p-Werte

Lymphozyten vital

[%] 88,96±6,02 89,72±6,57 77,95±6,94 50,28±29,47 0,001ɛ

Monozyten vital

[%] 96,51±2,00 94,71±6,49 83,29±5,88 43,53±31,72

‹0,001ɛ

π

Lymphozyten

apoptotisch [%] 11,05±6,02 10,27±6,57 22,04±6,94 49,71±29,48 0,001ɛ

Monozyten

apoptotisch [%] 3,49±2,00 5,29±6,50 16,70±5,88 56,44±31,76

‹0,001ɛ

π


In den LRS-Kammern zeigten weder die vitalen Lymphozyten noch die vitalen Mo-

nozyten eine signifikante Abnahme. Die Werte der vitalen Lymphozyten nahmen

bereits zum Beginn der Messreihe mit 78,73% eine sehr breite Spannweite ein, die

sich auch bis zum Messzeitpunktende mit einer Spannweite von 67,21% hielten. Die

vitalen Monozyten zeigten ebenfalls eine große Spannweite der Werte mit 91,48%

zum anfänglichen Messzeitpunkt und von 78,18% nach 48-stündiger Lagerung. Im

apoptotischen Verhalten der Lymphozyten und Monozyten konnte keine signifikante

Zunahme verzeichnet werden. Beide Zelltypen zeigten ein sehr variables apopto-

tisches Verhalten. Die apoptotischen Lymphozyten wiesen anfangs Werte zwischen

4,73% bis 76,37% auf. Nach sechsstündiger Lagerung waren ein minimaler Wert

von 1,64% und ein maximaler Wert von 62,85% zu finden. Anschließend stieg der

Anteil der apoptotischen Zellen nach 48-stündiger Lagerung auf Werte zwischen

65

8,23% bis 75,44%. Die Monozyten zeigten zum anfänglichen Messzeitpunkt maxi-

mal 91,90% Apoptose. Dieser Maximalwert wird ebenfalls nach 24-stündiger La-

gerung erreicht, während nach sechsstündiger Lagerung ein maximaler Wert von

85,45% und am Ende der Messreihe maximal 85,30% erreicht werden.

Tab 31: JC1 markierte Lymphozyten und Monozyten in den LRS-Kammern

Mittelwerte und

Standardabweichung

Lagerung:

initial

Lagerung:

6h

Lagerung:

24h

Lagerung:

48h

p-Werte

Lymphozyten vital

[%] 68,53±22,05 73,34±19,76 66,48±24,87 66,58±22,91 0,547ɛ

Monozyten vital

[%] 59,45±33,48 69,18±29,17 58,46±34,73 67,02±29,09

0,489ɛ

0,339π

Lymphozyten

apoptotisch [%] 32,28±23,18 26,65±19,76 33,52±24,86 33,42±22,92 0,547ɛ

Monozyten

apoptotisch [%] 40,55±33,48 30,83±29,17 41,54±34,73 32,96±29,09

0,489ɛ

0,339π


6.8.3 BRDU markierte Zellen im Aphereseprodukt

Die mit BRDU markierten mononukleären Zellen in den Leukozytenkonzentraten

wiesen im Zeitverlauf eine hochsignifikante Abnahme ihrer Vitalität auf. Während zu

Beginn der Messreihe durchschnittlich 98,38% vitale Zellen nachgewiesen werden

konnten, lagen nach 48-stündiger Lagerung durchschnittlich 95,05% vitale Zellen

vor. Bei den mononukleären Zellen, die in Apoptose gegangen waren ließ sich eine

hochsignifikante Zunahme verzeichnen. Zum ersten Messzeitpunkt zeigten maximal

3,42% der Zellen Apoptose. Anschließend konnte eine stetige Steigerung des pro-

zentualen Anteils an apoptotischen Zellen bis auf maximal 11,02% nach 48 Stunden

gezeigt werden. Der relativ hohe Durchschnittswert nach sechsstündiger Lagerung

im Vergleich zum 24 Stunden Wert beruht auf einem Extremwert von 5,50%

Apoptose.

66

Tab 32: BRDU markierte mononukleäre Zellen in den Leukozytenkonzentraten

Mittelwerte und

Standardabweichung

Lagerung:

initial

Lagerung:

6h

Lagerung:

24h

Lagerung:

48h

p-Werte

MNC vital [%] 98,38±1,05 97,68±1,38 97,70±0,94 95,05±2,86 0,006ɛ

MNC apoptotisch [%] 1,61±1,04 2,31±1,35 2,30±0,92 5,01±2,82 0,005ɛ


Die LRS-Kammern zeigten eine signifikante Abnahme der Vitalität der mononukle-

ären Zellen bezogen auf die durchschnittlichen Werte von 99,27% vitale Zellen zu

Beginn der Messreihe und 97,19% am Ende der Kurzzeitlagerung. Hinsichtlich der

Apoptose konnte eine signifikante Zunahme an apoptotischen Zellen nachgewiesen

werden. Zum ersten Messzeitpunkt wurden minimal 0,18% und maximal 1,49%

apoptotische mononukleäre Zellen verzeichnet. Der prozentuale Anteil dieser Zellen

stieg im zeitlichen Verlauf über maximale Werte von 1,90% (sechs Stunden Wert)

und 4,20% (24 Stunden Wert) auf maximal 8,41% apoptotische Zellen nach 48-

stündiger Lagerung.

Tab 33: BRDU markierte mononukleäre Zellen in den LRS-Kammern

Mittelwerte und

Standardabweichung

Lagerung:

initial

Lagerung:

6h

Lagerung:

24h

Lagerung:

48h

p-Werte

MNC vital [%] 99,27±0,43 99,08±0,70 98,84±1,15 97,19±2,94 0,048ɛ

0,124π

MNC apoptotisch [%] 0,73±0,43 0,91±0,68 1,16±1,16 2,82±2,96 0,048ɛ

0,124π


6.9 Biochemische Parameter in den Aphereseprodukten

6.9.1 Glukoseverbrauch

Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Glukoseverbrauch zwischen den

Leukozytenkonzentraten und den LRS-Kammern. Der anfängliche Glukosegehalt

lag in den LRS-Kammern bei Werten zwischen 257,62 mg/dl und 321,52 mg/dl und

in den Leukozytenkonzentraten geringfügig niedriger zwischen 256,22 mg/dl und

296,73 mg/dl. Nach 48 Stunden ließen sich in den LRS-Kammern Werte von 0,72

67

mg/dl bis 191 mg/dl verzeichnen. In den Leukozytenkonzentraten zeigten sich ein

minimaler Wert von 1,33 mg /dl und ein maximaler Wert von 75,74 mg/dl.

Tab 34: Glukosegehalt in den Leukozytenkonzentraten und den LRS-Kammern

Mittelwerte und

Standardabweichung

[mg/dl]


N=10

LRS- Kammern

N=10

p-Werte

Glukose_initial 274,4±12,0 287,3±22,5 0,128‡

Glukose_6h 250,7±22,5 270,8±26,4 0,046‡

Glukose_24h 94,20±50,63 110,34±79,39 0,596‡

Glukose_48h 19,36±24,63 40,83±63,13 0,631§

T-Test ‡ Wilcox-Mann-Test §

In den Leukozytenkonzentraten zeigte sich ein hochsignifikanter Abfall des Gluko-

segehalts während der Kurzzeitlagerung. Durchschnittlich nahm der Glukosegehalt

von anfangs 274,4 mg/dl auf 19,36 mg/dl nach 48-stündiger Lagerung ab. In den

LRS-Kammern nahm der Glukosegehalt ebenfalls hochsignifikant von durchschnitt-

lich 287,3 mg/dl auf 40,83 mg/dl ab. In Diagramm 12 ist der parallele Abfall des Glu-

kosewertes in den beiden Aphereseprodukten dargestellt. Die Leukozytenkonzen-

trate zeigten während der gesamten Lagerungszeit geringfügig geringere Werte als

in den LRS-Kammern.

Diagramm 12: Glukoseverbrauch in den Aphereseprodukten in Kurzzeitlagerung

0

50

100

150

200

250

300

350

initial 6h 24h 48h

mg/

dl

Lagerungszeit


LRS-Kammern

68

Tab 35: Glukosegehalt in den Leukozytenkonzentraten bei Kurzzeitlagerung

Mittelwerte und

Standardabweichung

[mg/dl]


N=10

p-Werte

Glukose_initial 274,4±12,0 ‹0,001ɛ

‹0,001π Glukose_6h 250,7±22,5

Glukose_24h 94,20±50,63

Glukose_48h 19,36±24,63

bei Normalverteilung:Messwiederholung; da kleine Stichprobe Verwen-dung der Greenhouse-Geisser-Korrektur ɛ keine Normalverteilung: Friedmans Zweifach-Rangvarianzenanalyse π

Tab 36: Glukosegehalt in den LRS-Kammern bei Kurzzeitlagerung

Mittelwerte und

Standardabweichung

[mg/dl]

LRS- Kammern

N=10

p-Werte

Glukose_initial 287,3±22,5 ‹0,001ɛ

‹0,001π Glukose_6h 270,8±26,4

Glukose_24h 110,3±79,4

Glukose_48h 40,83±63,13


Da die Glukosewerte vom anfänglichen Messzeitpunkt an bis zum sechsstündigen

Lagerungszeitpunkt den geringsten Glukoseabfall aufwiesen und die Greenhouse-

Geisser-Korrektur nur einen Verlauf angibt, wurden diese beiden Messpunkte noch

einmal genauer analysiert. Es zeigte sich, dass Glukose in den Leukozytenkonzen-

traten, wie im gesamten Lagerungsintervall, auch zu den beiden ersten Messzeit-

punkten hochsignifikant verbraucht wird. In den LRS-Kammern wurde ein signifikan-

ter Glukoseabfall innerhalb der ersten sechs Stunden nachgewiesen, während in

der 48-stündigen Kurzzeitlagerung der Verbrauch hochsignifikant war.

69

Tab 37: Glukoseverbrauch der ersten beiden Messzeitpunkte

Mittelwerte und

Standardabweichung

Glukose_initial

[mg/dl]

Glukose_6h

[mg/dl]

p-Wert


N=10

274,4±12,0 250,7±22,5 ‹0,001‡

LRS-Kammern

N=10

287,3±22,5 270,8±26,4 0,151‡


6.9.2 Laktatanstieg

Zum ersten Messzeitpunkt konnte in den Leukozytenkonzentraten durchschnittlich

ein Laktatgehalt von 4,01 mg/dl nachgewiesen werden und somit signifikant mehr

als in den LRS-Kammern mit einem durchschnittlichen Laktatgehalt von 2,89 mg/dl.

Nach sechs Stunden zeigte sich in den Leukozytenkonzentraten ein hochsignifi-

kanter Anstieg von Laktat auf maximal 12,72 mg/dl im Gegensatz zu den LRS-

Kammern mit einem Laktatwert von maximal 6,05 mg/dl.

Abb. 29: Laktatgehalt nach sechsstündiger Lagerung in den Aphereseprodukten

70

Der Laktatgehalt nach 24 Stunden ließ keine signifikanten Unterschiede zwischen

den beiden Aphereseprodukten mehr erkennen. In den Leukozytenkonzentraten

zeigte sich ein maximaler Laktatgehalt von 38,91 mg/dl, in den LRS-Kammern ma-

ximal 40,59 mg/dl. Auch am Ende der Messreihe konnte in den Leukozytenkonzen-

traten ein Laktatwert mit durchschnittlich 33,17 mg/dl und in den LRS-Kammern mit

durchschnittlich 28,46 mg/dl kein signifikanter Unterschied festgestellt werden.

Tab 38: Laktatgehalt in den beiden Aphereseprodukten

Mittelwerte und

Standardabweichung

[mg/dl]


N=10

LRS-Kammern

N=10

p-Werte

Laktat_initial 4,01±1,05 2,89±0,80 0,015‡

Laktat_6h 8,96±2,94 4,52±0,83 0,001‡

Laktat_24h 25,54±8,72 23,53±9,61 0,630‡

Laktat_48h 33,17±11,84 28,46±8,96 0,329‡

T-Test ‡ Wilcox-Mann-Test §

In Kurzzeitlagerung zeigte sich in den Leukozytenkonzentraten ein hochsignifikanter

Anstieg des Laktatgehaltes von anfangs durchschnittlich 4,01 mg/dl auf durch-

schnittlich 33,17 mg/dl nach 48-stündiger Lagerung.

Tab 39: Laktatgehalt in den Leukozytenkonzentraten in Kurzzeitlagerung

Mittelwerte und

Standardabweichung

[mg/dl]


N=10

p-Werte

Laktat_initial 4,01±1,05 ‹0,001ɛ

Laktat_6h 8,96±2,94

Laktat_24h 25,54±8,72

Laktat_48h 33,17±11,84


71

Auch in den LRS-Kammern ließ sich ein hochsignifikanter Anstieg des Laktatge-

haltes von anfangs durchschnittlich 2,89 mg/dl auf durchschnittlich 28,46 mg/dl nach

48-stündiger Lagerung erkennen.

Tab 40: Laktatgehalt in den LRS-Kammern in Kurzzeitlagerung

Mittelwerte und

Standardabweichung

[mg/dl]

LRS- Kammern

N=10

p-Werte

Laktat_initial 2,89±0,80 ‹0,001ɛ

Laktat_6h 4,52±0,83

Laktat_24h 23,53±9,61

Laktat_48h 28,46±8,96


Da auch bei den Laktatwerten innerhalb der ersten sechs Stunden der geringste

Anstieg zu verzeichnen war, wurden die ersten beiden Messzeitpunkte gesondert

betrachtet. Sowohl in den Leukozytenkonzentraten als auch den LRS-Kammern

zeigte sich, wie im gesamten Lagerungsintervall, ein hochsignifikanter Anstieg des

Laktats.

Tab 41: Laktatanstieg der ersten beiden Messzeitpunkte

Mittelwerte und

Standardabweichung

Laktat_initial

[mg/dl]

Laktat_6h

[mg/dl]

p-Wert


N=10

4,01±1,05 8,96±2,94 ‹0,001‡

LRS Kammern

N=10

2,89±0,80 4,52±0,83 ‹0,001‡


Das folgende Diagramm zeigt den früheren Laktatanstieg in den Leukozyten-

konzentraten in den ersten sechs Stunden der Lagerung. Während den nächsten 18

Stunden Lagerung steigt der Laktatgehalt in beiden Aphereseprodukten stetig an.

Nach 24-stündiger Lagerung ist eine steilere Zunahme des Laktatgehalts in den

Leukozytenkonzentraten zu verzeichnen im Gegensatz zu den LRS-Kammern.

72

Diagramm 13: Laktatanstieg in den Aphereseprodukten in Kurzzeitlagerung

Es zeigte sich, dass der Laktatanstieg mit dem Glukoseverbrauch negativ korreliert,

sowohl in den Leukozytenkonzentraten (r=-0,859) als auch in den LRS-Kammern

(r=-0,950). Ebenfalls konnte nachgewiesen werden, dass der Laktatanstieg positiv

mit der prozentualen Zunahme von Annexin V positiven und 7AAD positiven Zellen

sowohl in den Leukozytenkonzentraten (r für CD25 positive Zellen 0,896; für CD25

negative Zellen 0,897) als auch in den LRS-Kammern (r für CD25 positive Zellen

0,941; für CD25 negative Zellen 0,798) signifikant korreliert. Während die Laktat-

konzentration in den Leukozytenkonzentraten mit den Annexin V positiven und

7AAD negativen Zellen eine negative Korrelation aufweisen (r=-0,994 (CD25 posi-

tiv); r=-0,974 (CD25 negativ)), konnte in den LRS-Kammern hier kein Zusammen-

hang festgestellt werden. Auch mit den anderen beiden verwendeten Apoptose-

Methoden konnte eine signifikante Korrelation zwischen dem Anteil an apopto-

tischen Zellen und Laktatgehalt in den Leukozytenkonzentraten ermittelt werden

(JC1: r=0,897 (Lymphozyten); r=0,878 (Monozyten); BrdU: r=0,821). In den LRS-

Kammern konnte mit der BrdU Methode ebenfalls ein Zusammenhang mit r=0,807

festgestellt werden, während mit der JC1 Methode lediglich die apoptotischen Lym-

phozyten mit dem Laktatanstieg korrelieren (r=0,662).

0

5

10

15

20

25

30

35

initial 6h 24h 48h

mg/

dl

Lagerungszeit


LRS-Kammern

73

7.Diskussion

Die Leukapherese gilt als die beste Methode, um effektiv Monozyten in hoher Aus-

beute und Reinheit zu gewinnen [73]. Anfang der sechziger Jahre begannen die

ersten Versuche die Zellseparation zu optimieren, um neue Therapieoptionen im

Rahmen der Leukämiebehandlung zu ermöglichen [25]. Körbling und Pflieger rekru-

tierten Ende der 70er Jahre Patienten und freiwillige Spender zur Stammzellaphere-

se und belegten mittels in vitro Kulturverfahren den Erhalt funktionstüchtiger und

proliferationsfähiger Zellen [41]. Durch die Möglichkeit mittels Zytokinen wie G-CSF

(granulocyte colony stimulating factor) hämatopoetische Vorläuferzellen zu mobili-

sieren, konnten Stammzellen in 100fach höherer Ausbeute durch Leukozytapherese

aus dem peripheren Blut gewonnen werden, als ohne Mobilisierung aus dem Kno-

chenmark. Im Laufe der Jahre wurden die unterschiedlichsten Zellseparatoren er-

probt, um eine ausreichende Anzahl mononukleärer Zellen zu sammeln. Daraus

können antigen-präsentierende Zellen generiert werden, die im Rahmen von Im-

muntherapien eingesetzt, das Überleben bei malignen Erkrankungen verbessern

sollen [88].

In dieser Arbeit wurden die mononukleären Zellen, die durch Leukozytapherese

mit dem ComTec Zellseparator gewonnen wurden und aus LRS-Kammern, die bei

der Thrombozytapherese mit dem Trima Accel Zellseparator als Nebenprodukt ent-

stehen, hinsichtlich ihrer Zellqualität und des Zellverlustes während der Kurzzeitla-

gerung untersucht. Die Leukozytenausbeute und der Restzellgehalt sind von den

eingestellten Parametern am Apheresegerät abhängig. Bei der Leukapherese dau-

erte die Separation durchschnittlich 121 Minuten mit einem gemittelten Verbrauch

von 522 ml Acid citrate dextrose Formula A (ACD-A) bei einem prozessierten Blut-

volumen von 4831 ml. Bei der Thrombozytapherese mittels Trima Accel Zellsepara-

tor wurde bei einer Separationsdauer von durchschnittlich 51 Minuten hochsignifi-

kant weniger ACD-A (322 ml) verbraucht bei einem prozessierten Blutvolumen von

2965 ml. Gemäß dem Transfusionsgesetz der Bundesärztekammer darf die Spen-

denfrequenz von maximal 26 Thrombozytapheresen pro Jahr nicht überschritten

werden [83]. Die beschriebene Möglichkeit eines Leukozytenverlustes von 1 bis 5

x109 Zellen pro Liter pro Spende mit daraus resultierendem klinisch bedeutsamem

Immundefizit bei hoher Blutspendefrequenz [80] konnte beim Vergleich des EDTA-

Blutes vor der Monozytenspende mit dem EDTA-Blut vor der Thrombozytenspende

nicht nachgewiesen werden. Die Spender zeigten durchschnittlich nur einen Leuko-

zytenverlust von 0,3 x109 Zellen pro Liter pro Spende.

74

Die Leukozytapherese mittels ComTec Zellseparator lieferte im Konzentrat

durchschnittlich eine Leukozytenkonzentration von 45 x109 Leukozyten pro Liter,

wobei der Zellgehalt bezogen auf das Produktvolumen 5,6 x109 Leukozyten beträgt.

Ähnliche Werte sind in der Literatur zu finden [66; 78]. Eine Studie von Strasser und

Mitarbeiter, die verschiedene Zellseparatoren miteinander verglich, zeigte, dass der

ComTec Zellseparator die höchste Sammeleffizienz aufwies [73]. In den untersuch-

ten Leukozyten-Reduktion-System Kammern (LRSC), die als neue Ressource für

mononukleäre Zellen durch die Entwicklung von leukozyten-reduzierender Filter bei

der Herstellung von Thrombozytenkonzentraten eingesetzt werden [20], enthielten

durchschnittlich eine Leukozytenkonzentration von 89 x109 Leukozyten pro Liter,

wobei der Zellgehalt aufgrund des kleinen Produktvolumens nur bei 0,89 x109 Leu-

kozyten lag.

Die unterschiedliche Herstellung der Leukozytenprodukte verursacht unter-

schiedliche Zellkonzentrationen. So unterschieden sich die Leukozytapheresepro-

dukte und LRS-Kammern nicht nur hochsignifikant in der Leukozytenausbeute, son-

dern auch im Anteil der Restblutzellen. Die durch Leukozytapherese gewonnenen

und untersuchten Leukozytenkonzentrate zeigten 4,4 x1012 Thrombozyten pro Liter

und 0,8 x1012 Erythrozyten pro Liter. Ähnliche Thrombozytenwerte wurden bereits in

der Literatur mit 5,0 x1012 Thrombozyten pro Liter beschrieben [74]. Es ist bekannt,

dass der ComTec Zellseparator im Vergleich zu anderen Zellseparatoren, wie dem

Fenwal Amicus Zellseparator, eine größere Verunreinigung mit Thrombozyten auf-

weist [3; 73]. Als mögliche Ursache hierfür wurde die zusätzliche Gewinnung von

thrombozytenreichem Plasma während der Konzentratherstellung angesehen [76].

Durch die hohe thrombozytäre Verunreinigung könnte es zu einem Verlust an mo-

nonukleären Zellen im Produkt kommen [29; 76], da Thrombozyten mit Monozyten

interagieren und dadurch deren Ausdifferenzierung beeinflussen können [39]. Der

geringe Erythrozytenanteil im Konzentrat war vergleichbar mit den Ergebnissen der

Leukozytapherese mit dem Cobe Spectra Zellseparator [77; 78]. Der Restzellgehalt

in den LRS-Kammern betrug 1,7 x1012 Thrombozyten und 5,8 x1012 Erythrozyten

pro Liter. Die Werte zeigten sich gut reproduzierbar mit den in einer von Strasser

und Mitarbeiter erhobenen Studie von durchschnittlich 2,5 x1012 Thrombozyten und

5,5 x1012 Erythrozyten pro Liter [79]. Im Vergleich mit dem Cobe Spectra Zellsepa-

rator liegt der Anteil an residualen Zellen in den LRS-Kammern bei der Trima Accel

wesentlich höher, allerdings steigt auch die Ausbeute an Leukozyten deutlich [79].

Im Vergleich zu den Leukozytenkonzentraten enthalten die LRS-Kammern anteils-

mäßig fünffach mehr residuale Erythrozyten, bei einem mittleren korpuskulären Vo-

lumen von 80,7 fl in den Leukozytenkonzentraten und 90,1 fl in den LRS-Kammern.

75

Die Zellqualität lässt sich mit unterschiedlichen Methoden zur Apoptosedetektion

untersuchen. Die Arbeit verglich drei unterschiedliche Apoptosemethoden mitein-

ander. Da nicht jede Zelle alle Apoptosestadien durchläuft, ist eine Kombination der

Methoden erforderlich, um sinnvolle Aussagen über die Qualität der Zellen zu erhal-

ten. Die Annexin V Färbung ist eine sehr sensitive und in zahlreichen Studien gut

etablierte Methode zur Apoptosedetektion [56; 84; 86; 89]. In der Frühphase der

Apoptose kommt es zur Umverteilung der Phospholipide in der Plasmamembran, so

dass Phosphatidylserin auf die Außenseite transloziert wird, woran Annexin V spezi-

fisch bindet. Da dieser Prozess auch in nekrotischen Zellen abläuft, wurde die Me-

thode mit der 7AAD Kernfärbung verknüpft, da in apoptotischen Zellen die Plasma-

membran noch intakt ist und 7AAD nicht eindringen kann [86]. Da allerdings auch

spätapoptotische Zellen ihre Zellintegrität meist verlieren, kann mit der Annexin V

Färbung allein nicht zwischen den verschiedenen Apoptosestadien, Frühapoptose,

Spätapoptose und Nekrose unterschieden werden [45]. Eine weitere Methode zur

Messung der Apoptose stellt die Detektion des mitochondrialen Potentials mittels

JC1 Färbung dar. Diese Methode ist zwingend an die noch bestehende Integrität

der Zelle gebunden, da sich die Mitochondrien im Zytoplasma befinden. Nekrotische

Zellen sollten demnach nicht erfasst werden, da es zum Austritt von Zytoplasma und

der Zellorganellen in den Extrazellularraum kommt und dadurch diese Zellen nicht

mehr durchflußzytometrisch messbar wären. Mit der JC 1 Methode wird eine sehr

frühe Phase der Apoptose erfasst. Allerdings ist nicht klar, ob die Änderung des

mitochondrialen Potentials generell auftritt [48; 51]. Es ist auch nicht auszuschlie-

ßen, dass lebende Zellen mit erfasst werden, da in dem Stadium der Veränderung

des mitochondrialen Potentials die Zellintegrität und die Funktion der Plasmamem-

bran noch weitestgehend erhalten sind [19]. Das dritte verwendete Nachweisverfah-

ren ist die DNA-Strangbruch-Markierung mit BrdU (5-Bromo-2´-deoxyuridin), die

sogenannte TUNEL-Methode. Lugli und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die DNA-

Fragmentierung im späteren apoptotischen Prozess stattfindet, so dass diese Me-

thode zum Nachweis der Spätapoptose dient [48]. Nekrotische Zellen werden nicht

erfasst, da diese bereits außerhalb des durchflußzytometrischen Messbereichs lie-

gen. Zu bedenken ist hierbei allerdings, dass mit dieser Methode nicht nur apoptoti-

sche Prozesse nachgewiesen werden, sondern auch Zellen, die aus anderen Grün-

den DNA-Strangbrüche aufweisen [22]. In der Literatur existieren einige Arbeiten,

die diese Methoden zur Detektion der unterschiedlichen Apoptosephasen einsetzen

[49; 63; 67].

Mit der Annexin V und 7AAD Methode wurden in dieser Studie speziell CD25

positive T-Helferzellen (regulatorische T-Zellen) hinsichtlich ihres apoptotischen Ver-

76

haltens untersucht. Es ließ sich zu Beginn der Messreihe in den Leukozytenkonzen-

traten bei den CD4 positiven und CD25 positiven T-Zellen eine Apoptoserate von

10% nachweisen und somit hochsignifikant mehr als in den LRS-Kammern mit nur

6%. Amer und Mitarbeiter wiesen nach, dass durch maschinelle Manipulation oxida-

tiver Stress ausgelöst wird und zu einem deutlichen Zellschaden führen kann [4].

Ein Unterschied am Anteil der Annexin V positiven und 7AAD positiven CD25 positi-

ven regulatorischen T-Zellen wurde in den beiden Leukozytenprodukten zu Beginn

nicht ersichtlich (0,2% versus 0,3%). Zum Messzeitpunkt nach 24 Stunden über-

steigt dann der Anteil an Annexin V positiven und 7AAD positiven CD25 positiven

Tregs in den Leukozytenkonzentraten mit 2% den Anteil in den LRS-Kammern mit

0,5% hochsignifikant. Der Unterschied im prozentualen Anteil an Annexin V positi-

ven und 7AAD positiven T-Zellen wird nach 48-stündiger Lagerung noch deutlicher

und zeigt in den Leukozytenkonzentraten hochsignifikant höhere Werte im Vergleich

zu den LRS-Kammern (7% versus 1%). Ein signifikant höherer Anteil an Annexin V

positiven und 7AAD positiven Lymphozyten nach 48-stündiger Lagerung im Leuko-

zytaphereseprodukt im Gegensatz zu den LRS-Kammern wurde bereits beschrie-

ben [87]. In der Studie wurden die unterschiedlichen Herstellungsverfahren der bei-

den Produkte als mögliche Ursache für den signifikant unterschiedlichen Anteil an

lebenden Zellen angesehen [87]. Da die Annexin V und 7AAD Konjugation an die

Zelle davon abhängig ist, wie intakt die Plasmamembran ist, binden nur Zellen mit

Verlust der Membranintegrität Annexin V und 7AAD und weisen so einen irreversib-

len Zellschaden auf. Es ist daher anzunehmen, dass die Zellen bei der Leukozyt-

apherese größeren Schaden nehmen als die Zellen bei der Gewinnung der LRS-

Kammern, da die Zellen der LRS-Kammern schonender gewonnen werden und

nicht so stark wie im Buffy coat komprimiert werden.

Durch die begrenzte Anzahl an Kanälen des verwendeten Durchflußzytometers,

war eine differenzierte Darstellung der Tregs mit der JC 1 Apoptosemessung limi-

tiert, so dass nur der Gesamtanteil an Lymphozyten und Monozyten analysiert wur-

de. Da Monozyten mehr Zellorganellen besitzen als Lymphozyten und somit mehr

JC1 aufnehmen können, ließen sich diese beiden Zellgruppen gut unterscheiden

[15]. Die Leukozytenkonzentrate in dieser Studie zeigten einen höheren Gehalt an

vitalen Lymphozyten (89% versus 69%) und Monozyten (97% versus 60%) als die

LRS-Kammern. Hierfür könnte die längere Separationszeit der Leukozytapherese,

bei der ein größeres Blutvolumen prozessiert wird, verantwortlich sein [12]. Bei der

Apoptosedetektion mittels JC1 Färbung ließ sich bereits zu Beginn mit 32% in den

LRS-Kammern ein dreimal so hoher Anteil an apoptotischen Lymphozyten nachwei-

sen als in den Leukozytenkonzentraten mit 11%. Der Gehalt an apoptotischen Mo-

77

nozyten lag in den LRS-Kammern sogar sechsfach höher vor als in den Leukozy-

tenkonzentraten. Im Vergleich zur Annexin V und 7AAD Methode wären in den LRS-

Kammern weniger apoptotische Zellen zu erwarten gewesen als in den Leukozyten-

konzentraten. Erst nach 48 Stunden ließen sich in den Leukozytenkonzentraten

prozentual mehr apoptotische Zellen mit 50% versus 33% Lymphozyten und 56%

versus 33% Monozyten nachweisen. Da die Verunreinigung mit Erythrozyten in den

LRS-Kammern höher ist, könnte dies als mögliche Ursache für die bereits anfäng-

lich hohe Apoptoserate in Erwägung gezogen werden. Auch andere zelluläre Vor-

gänge, die in der Lage sind das mitochondriale Potential zu verändern, wären denk-

bar. Ebenso sollte daran gedacht werden, dass nicht alle Mitochondrien in den Zel-

len zur selben Zeit depolarisieren [48], so dass sich gewisse apoptotische Unter-

schiede daraus ergeben könnten. Diese Hypothesen sollten Gegenstand weiterer

Untersuchungen sein und überprüft werden.

Mit der DNA-Strangbruchdetektion mittels BrdU konnten, bedingt durch die Limi-

tierung durch das Durchflußzytometers, nur mononukleäre Zellen detektiert werden.

Bereits zu Beginn ließ sich in den Leukozytenkonzentraten eine signifikant höhere

Apoptoserate der mononukleären Zellen im Vergleich zu den LRS-Kammern (2%

versus 1%) nachweisen. Auch nach 48-stündiger Lagerung lagen in den Leukozy-

tenkonzentraten signifikant mehr apoptotische Zellen vor als in den LRS-Kammern.

Der Anteil an apoptotischen Zellen lag hier bei 5% (Leukozytenkonzentraten) und

3% (LRS-Kammern). Da die DNA-Strangbruchdetektion ausschließlich Zellen in der

Spätapoptose erfasst, war entsprechend der Lagerungszeit mit niedrigen Werten für

die apoptotischen Zellen zu rechnen. Die Vermutung liegt nahe, dass noch nicht alle

Zellen in die Spätapoptose eingetreten sind und sich noch keine DNA-Strangbrüche

ereignet hatten. Mit der BrdU Methode zeigte sich wieder, wie bei der Annexin V

und 7AAD Methode, dass in den Leukozytenkonzentraten der Anteil an apopto-

tischen Zellen höher liegt als in den LRS-Kammern. Wie bereits erwähnt könnte

hierfür der durch die Apherese ausgelöste oxidative Stress verantwortlich sein.

Denkbar wäre auch, dass die gewonnenen Leukozytenkonzentrate durch den hohen

Restgehalt an Thrombozyten vermehrt apoptotische Zellen aufweisen. Einige Stu-

dien berichten über eine durch die Apherese bedingte Erhöhung der Stoffwech-

selaktivität der Thrombozyten, welche mit einer gesteigerten Apoptose korrelieren

[5; 7; 35]. Dadurch könnte der Stoffwechsel der Leukozyten beeinträchtigt werden,

so dass es vermehrt zur Zellschädigung kommen könnte [87].

Einen hohen Stellenwert für die Viabilität der Zellen haben die Lagerungs-

bedingungen hinsichtlich Temperatur, Lagerungsmedium und Lagerungszeit, wes-

78

halb viele Studien sich mit deren Optimierung befassen. Hubel und Mitarbeiter zeig-

ten beispielsweise, dass es bei der Lagerung von Plazentarestblut im Lagerungs-

medium über einen Zeitraum von 24 Stunden kaum zu Zellverlust kommt [36].

Garraud und Mitarbeiter wiesen nach, dass es keinen prozentualen Unterschied im

Anteil an T-Helferzellen und an T-Suppressorzellen gab im Vergleich von frischen

mit gelagerten (22°C) Blutprodukten [27]. Diese Studie evaluiert allerdings den spe-

ziellen Einfluss der Lagerung auf die Zellqualität in Leukozytenkonzentraten und

LRS-Kammern, die jeweils in Beutelsystemen aus CO2 und O2 durchlässigem Fluor-

ethylenpropylen-Teflon abgefüllt, bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 48

Stunden aufbewahrt wurden. Sowohl in den Leukozytenkonzentraten als auch in

den LRS-Kammern wurden innerhalb dieses Lagerungsintervalls der Anteil an

apoptotischen Zellen mittels der drei bereits beschriebenen Färbungen zum

Apoptosenachweis bestimmt.

Mit der Annexin V und 7AAD Nachweismethode konnte ein signifikanter Anstieg

an Annexin V positiven und 7AAD positiven regulatorischen T-Helferzellen innerhalb

der 48-stündigen Lagerung in beiden Leukozytenprodukten aufgezeigt werden. Da-

bei zeigte sich ein deutlich höherer Anteil Annexin V positiver und 7AAD positiver

Tregs in den Leukozytenkonzentraten mit maximal 8% im Vergleich zu den LRS-

Kammern mit maximal 2%. Dieser Unterschied scheint, wie bereits erwähnt, in der

schonenderen Gewinnung der LRS-Kammern und des damit verbundenen gering-

eren oxidativen Stresses begründet zu sein. Es zeigte sich, dass besonders nach 24

Stunden Lagerung der Anteil an Annexin V positiven und 7AAD positiven Tregs

stark ansteigt. Dies lässt vermuten, dass in den ersten 24 Stunden die Apoptose

dominiert bevor sie nach 24 Stunden in die Nekrose mündet. Lund und Mitarbeiter

zeigten denselben Effekt in ihrer Studie über die Kultivierung von Monozyten [49].

Auffällig zeigte sich ebenfalls ein wesentlich höherer Anteil an Annexin V positiven

und 7AAD negativen CD25 positiven Tregs mit anfangs 10% im Vergleich zu den

CD25 negativen T-Zellen mit einer initialen Apoptoserate von 5%. Die höhere

Apoptoserate der CD25 positiven Tregs im Vergleich zu den CD25 negativen T-

Zellen bleibt im Zeitverlauf bestehen und zeigt sich sowohl in den Leukozytenkon-

zentraten als auch in den LRS-Kammern. Da einige Studien darüber berichten, dass

CD25 positive T-Zellen die Proliferation von CD25 negativen T-Zellen supprimieren

können [46; 70], könnte dies die Ursache für den deutlich geringeren Anteil an

apoptotischen CD25 negativen T-Zellen sein.

Da bei der JC 1 Methode zur Detektion des mitochondrialen Potentials die Dif-

ferenzierung der T-Zellsubpopulation nicht möglich war, wurde der Gesamtanteil an

79

Lymphozyten und Monozyten analysiert. Auch diese Methode zeigte, dass in den

Leukozytenkonzentraten der Anteil an apoptotischen Zellen nach 24 Stunden La-

gerung stark ansteigt. Zu Beginn der Messreihe lagen für die Lymphozyten bereits

11% apoptotische Zellen vor. Auch die Annexin V und 7AAD Methode zeigte für die

CD25 positiven Tregs zu Beginn eine Apoptoserate von 10%. Der Anteil apopto-

tischer Monozyten lag in den ersten 24 Stunden deutlich unter dem Anteil apopto-

tischer Lymphozyten. Initial konnte nur eine Apoptoserate von knapp 4% nachge-

wiesen werden. Strasser und Mitarbeiter zeigten bereits, dass Lymphozyten im Ge-

gensatz zu Monozyten stabiler sind und den Apheresevorgang besser überstehen.

Auch die unterschiedliche Lebensdauer der Zellen in vivo könnte eine Rolle für die

unterschiedliche Apoptoserate spielen [49]. Möglich wäre auch, dass die Inkuba-

tionstemperatur einen Einfluss hat [82]. Die Untersuchung der apoptotischen Lym-

phozyten und Monozyten in den LRS-Kammern mit der JC 1 Methode zeigte vom

ersten Messzeitpunkt an ein Kontinuum im Anteil apoptotischer Zellen, so dass die-

se Ergebnisse im ersten Moment unplausibel erscheinen, weshalb diese Ergebnisse

zunächst kontrolliert werden müssen.

Limitiert durch die Durchflußzytometrie konnten mit der DNA-Strangbruch-

Markierung mittels des Thymidinanalogons BrdU nur mononukleäre Zellen darge-

stellt werden. Wie bei der Annexin V und 7AAD Methode zeigte die BrdU Methode

in den Leukozytenkonzentraten einen höheren Anteil an apoptotischen Zellen im

Vergleich zu den LRS-Kammern. Der Anteil apoptotischer mononukleärer Zellen lag

aber sowohl in den Leukozytenkonzentraten mit 5% und in den LRS-Kammern mit

knapp 3% nach 48 Stunden Lagerung noch recht niedrig. Da keine Apoptose indu-

zierenden Reagenzien verwendet wurden, ist davon auszugehen, dass das unter-

suchte Zeitintervall nicht ausreichend lang war, um Zellen in der Spätapoptose zu

detektiert. Da mit der JC 1 Methode nach 48-stündiger Lagerung mehr als 50%

apoptotische Zellen nachgewiesen werden konnten, liegt die Vermutung nahe, dass

bei dem Großteil der Zellen die Zellveränderungen der Spätapoptose noch nicht

aufgetreten sind.

Des Weiteren wurden die biochemischen Parameter Glukose und Laktat und

deren Bezug zur Apoptoserate in dieser Arbeit analysiert. In den letzten Jahren be-

schäftigten sich viele Studien [38; 69; 71] mit der optimalen Lagerung und den damit

verbundenen metabolischen Veränderungen der Zellen, da man weiß, dass kleinste

Abweichungen zum Verlust der Überlebensfähigkeit der Zelle führen können. Den

Zellen stehen zwei verschiedene Wege zur Energiegewinnung offen. Die sehr effek-

tive oxidative Verstoffwechselung von Glukose und Fettsäuren zu Adenosintriphos-

80

phat (ATP) und die wenig adäquate anaerobe Glykolyse. Unter hypoxischen Bedin-

gungen versuchen die Zellen deshalb ihren Energiebedarf mittels gesteigerter an-

aerober Glykolyse zu decken, wobei vermehrt Laktat als Stoffwechselprodukt anfällt

[28]. In dieser Studie verzeichneten die Leukozytenkonzentrate einen Glukosever-

brauch von 93% in 48 Stunden und einen achtfachen Anstieg der Laktatkonzentra-

tion. Während des Lagerungszeitraums kam es nach 24 Stunden rapide zum Zuk-

kerverbrauch bzw. Anstieg der Laktatkonzentrationen. Die LRS-Kammern, die unter

den gleichen Bedingungen wie die Leukozytenkonzentrate gelagert waren, zeigten

ebenfalls einen starken Abfall der Glukosekonzentration von 86% und einen neun-

fachen Anstieg der Laktatkonzentration. Auch hier kam es im Zeitintervall von sechs

Stunden bis 24 Stunden zur stärksten Veränderung. Es ist zu vermuten, dass in

dieser Zeitspanne die Zellen eine hohe metabolische Aktivität aufweisen, gekoppelt

an eine deutliche Zunahme an apoptotischen Zellen in diesem Zeitintervall [32]. In

dieser Arbeit wurde bereits mit der Annexin V und 7AAD Methode sowie mit dem JC

1 Nachweisverfahren gezeigt, dass der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen nach

24 Stunden stark ansteigt. Auch Kilkson und Mitarbeiter [38] sowie Murphy und Mit-

arbeiter [52] konnten in Studien nachweisen, dass die steigende Laktatproduktion

als Indikator für den Verlust der Viabilität der Zellen anzusehen ist. Diese Hypothese

konnte mit der starken Korrelation zwischen apoptotischen Zellen aller drei verwen-

deter Apoptose-Methoden und Laktatgehalt bestätigt werden. Da ein inverser Bezug

zwischen Annexin V positiver und 7AAD negativer Zellen und Laktatanstieg zu ver-

zeichnen war, ist zu vermuten, dass die Laktatproduktion mit Spätapoptose und

Nekrose von Zellen verbunden ist, da Annexin V positive und 7AAD negative Zellen

noch vollständig intakt sind und nur Annexin V positive und 7AAD positive Zellen,

die einen Verlust der Plasmamembran aufweisen, einen positiven Zusammenhang

aufzeigen. Da eine inverse Korrelation zwischen Glukoseverbrauch und Laktatan-

stieg besteht, kann darauf rückgeschlossen werden, dass mit zunehmendem Gluko-

severbrauch der Anteil an apoptotischen Zellen stetig steigt [74].

In wie weit zusätzliche Analysemethoden, wie die Massenspektrometrie zum

Nachweis molekularer Veränderungen, während der Zelllagerung eingesetzt werden

können, ist derzeit noch unklar. Die Veränderung der Glycerophospholipid-Zu-

sammensetzung der Zellmembran während der Apoptose wurde bereits nachgewie-

sen und mit Verfahren wie der Annexin V und 7AAD Methode dargestellt. Weitere

mögliche Veränderungen, wie der intrazelluläre Ceramid Gehalt, der darüber ent-

scheidet, ob eine Zelle in Apoptose geht oder überlebt [81], könnten massenspek-

trometrisch erfasst werden. Pienimäki-Römer und Mitarbeiter [59] wiesen mittels

Massenspektrometrie eine Verminderung des Sphingolipidspiegels und eine Um-

81

wandlung in Ceramide in gelagerten Thrombozyten nach. Erste massenspek-

trometrische Untersuchungen hinsichtlich des Gehaltes an Glycerophospholipiden,

Sphingolipiden, Acylcarnithinen, biogenen Aminen und Aminosäuren im Lagerungs-

zeitraum von 48 Stunden konnten noch keinen Ausblick auf die zu erwartenden Ver-

änderungen liefern.

Zusammenfassend zeigten die Apoptosemethoden einen höheren Anteil an

apoptotischen Zellen in den Leukozytenkonzentraten als die Zellen, die im Rahmen

der Thrombozytapherese in den LRS-Kammern gewonnen wurden, so dass sich die

Hypothese, dass die Zellen bei der Leukozytapherese einen größeren Schaden

nehmen als bei der Gewinnung durch Thrombozytapherese, zu bestätigen scheint.

Da mit der JC 1 Methode ein hoher prozentualer Anteil an apoptotischen Zellen

auch in den LRS-Kammern gemessen wurde, stellt sich die Frage, welche Apop-

toseereignisse durch die verglichenen Methoden mit welcher Sensitivität tatsächlich

nachgewiesen werden. Die Detektion eines sehr frühen Apoptosestadiums, in dem

sich die Zelle möglicherweise wieder erholen kann, ist hierbei von den späten

Apoptoseereignissen mit nachfolgender Zellnekrose zu unterscheiden. In einer neu-

en Fragestellung sollte daher untersucht werden, ob und in welchem Anteil früh-

apoptotische Zellen, erfasst durch JC-1 (mitochondriales Potential) oder Annexin-V-

positive Zellen, alle Phasen der Apoptose bis zum Zelltod durchlaufen oder nur pas-

sager geschädigt überleben können. Die BrdU Methode zeigte in dieser Studie gute

vergleichbare Daten mit der Annexin V und 7AAD Methode. Der Anteil apoptotischer

Zellen war allerdings gering, so dass davon auszugehen ist, dass ein Großteil der

apoptotischen Zellen außerhalb des durchflußzytometrischen Messfensters lag und

diese apoptotischen Ereignisse somit nicht erfasst wurden. Auf biochemischer

Ebene scheint mit abnehmender Glukosekonzentration und zunehmendem Laktat-

gehalt im gelagerten Produkt die Viabilität der Zellen verloren zu gehen. Besonders

nach 24 Stunden Lagerung steigt der Anteil apoptotischer Zellen rapide an. In der

Studie konnte eine starke Korrelation zwischen steigender Laktatkonzentration und

dem Anteil an apoptotischen Zellen mit den drei verwendeten Apoptose-Methoden

gezeigt werden. Weiterhin könnte die massenspektrometrische Analyse Gegen-

stand neuer Forschungsarbeiten sein, um molekulare Zellveränderungen während

der Zelllagerung spezifizieren zu können, Metabolite in der Zellkultur, die entweder

ab- oder zunehmen zu identifizieren, um die Zellkultur bedarfsgerecht gezielt mit

Stoffen zu versetzen und dadurch die Apoptoserate zu senken und die Zellqualität

weiter zu verbessern.

82

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89

Anlage 1

Bestandteile der verwendeten Kits:

Annexin V Apoptosis Detection

Kit I

10x Annexin V Binding Buffer

0,5ml PE Annexin V

BD Mitoscreen Kit lyophilisiertes JC-1 (5,5`,6,6`-tetrachloro-

1,1`,3,3`-

tetraethylbenzimidazolcarbocyanine io-

dide)

60ml 10x Assay Buffer

APO-BRDU Kit 0,3ml FITC-labeled Anti-BrdU mAb

30ml PI/RNase Staining Buffer

0,6ml Reaction Buffer

126ml Rinsing Buffer

120ml Wash Buffer

0,48ml Br-DUTP

5ml Negative Control Cells

5ml Positive Control Cells

0,045ml TdT Enzyme

90

Danksagung

Meinen herzlichsten Dank an Herrn Prof. Dr. med. R. Eckstein für die Überlassung

des Themas und der Bereitstellung eines Arbeitsplatzes in seiner Abteilung.

Herrn Prof. Dr. med. E. Strasser danke ich für die hervorragende Betreuung und

Förderung. Seine Hilfestellungen und geduldige Beantwortung aller Fragen haben

besonderen Dank verdient, da sie für das erfolgreiche Gelingen dieser Arbeit unver-

zichtbar waren.

In besonderem Maße möchte ich auch Frau Dr. rer. nat. A. Pfeiffer für ihre Hilfsbe-

reitschaft und Anleitung bei den durchflußzytometrischen Messungen danken, die

ohne sie nicht möglich gewesen wären.

Weiterhin danke ich den Schwestern und MTAs in der Blutspende und im Labor der

Kinderklinik für ihre Hilfe.

Nicht zuletzt danke ich ganz herzlich meiner Familie und meinem Freund für die

stetige Unterstützung und den motivierenden Einfluss.

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