Tierphysiologisches Praktikum (Teil Neurophysiologie) SS 2005 Johannes Gutenberg Universität Mainz

Protokoll zum 2.Kurstag am 09.05.2005

Versuch 2: „Fortgeleitete Aktionspotentiale einzeln er Nervenfasern“

Protokollant: Max Mustermann Matrikelnummer: X Studiengang: X ___________________________________________________________________ An diesem Versuchstag wird die aktive Erregungsfortleitung an Axonen untersucht. Als Versuchsobjekte werden der Nervus ischiadicus des Krallenfrosches (Xenopus laevis) und die Riesenfasern im Bauchmark des Regenwurms (Lumbricus terrestris) verwendet. ___________________________________________________________________

Einleitung Im ersten Versuchsteil dient der Nervus ischiadicus (wird freipräpariert: nach Versuchsanleitung) des Krallenfrosches als Versuchsobjekt. Dieser Nerv entspringt am Rückenmark des Frosches und verläuft bis zur Fußspitze. Er setzt sich sowohl aus efferenten als auch aus afferenten Nervenfasern zusammen. Zu bestimmen ist die Leitungsgeschwindigkeit von unterschiedlichen Axongruppen aus denen der Nerv besteht, in Abhängigkeit vom Axondurchmesser. Es soll auch die Dauer der absoluten- und der relativen Refraktärzeit bestimmt werden. Eine weitere Aufgabe ist es die Abhängigkeit des Summenpotentials von der Reizamplitude zu untersuchen. Ein Summenpotential (im Weiteren SP genannt) ist die Summe der elektrischen Aktivitäten am Ableitort. Im zweiten Teil des Versuches dient der Regenwurm als Versuchsobjekt. Untersucht werden die Riesenfasern im Bauchmark des Wurms. Es gibt eine Mediane (segmental gegliedert und über gap-junctions elektrisch gekoppelt) und zwei Laterale (über Querverbindungen gekoppelt � funktioniert als eine Einheit). Somit sind sie abgeleiteten Potentiale keine SP wie beim Nervus ischidicus, sondern Einzelpotentiale. Es werden, wieder die Leitungsgeschwindigkeit, die Dauer der absoluten und der relativen Refraktärzeit bestimmt. Die Latenzzeit (Zeit zwischen Reiz und AP) sollte eigentlich auch bestimmt werden, doch haben ich es versäumt den Abstand zwischen Reizelektroden und reiznahen Elektroden zu notieren �

Material und Methode Zur Messung der SP (Versuchsteil 1) bzw. der Einzelpotentiale (Versuchsteil 2) dient eine Ableitkammer. Diese ist alle 5mm von dünnen Platindrähten durchzogen, denen der freipräparierte Nerv (Versuchsteil 1) bzw. der Regenwurm (Der Regenwurm wird als Ganzes auf die Elektroden gelegt ) (Versuchsteil2) aufliegt.Über versetzt angebrachte Elektroden, die mit den Platindrähten in Verbindung stehen, können die Spannungen extrazellulär (in Versuchsteil 2 sogar von der Oberfläche des Wurms) abgegriffen werden. Diese werden über einen Verstärker mittels eines Oszilloskops sichtbar gemacht. Die Messelektroden werden auf dem Oszilloskop auf unterschiedlichen Kanälen (CH1 und CH2) dargestellt. Als Reizquelle dient ein Reizgerät. Das Oszilloskop wird mit dem Reizgerät synchronisiert. Dazu verbindet man den Triggerausgnag (sync. out Prepulse) des Reizgerätes mit dem external-trigger-Eingang des Oszilloskops. Die Form des beobachteten Potentials hängt dabei von der Art der Ableitung ab: Es ist diphasisch, wenn die absolute Differenz zwischen zwei am Nerv (Bauchmark) benachbart liegenden Ableitelektroden gemessen wird (+ und – Eingang am Differenzverstärker (siehe Abb.1), monophasisch wenn die zweite Elektrode auf Erdpotential gelegt wird und dafür gesorgt ist, dass an ihr möglichst keine Potentialänderungen stattfinden, d.h. sie sollte nicht am Nerv liegen. Das als Differenz abgeleitete Potential ist störungsfreier! (Deswegen wird auch diese Variante im Versuch gewählt) Der Versuchsaufbau ist bei allen Versuchen der Gleiche abgesehen vom Versuchsobjekt und dem Abstand zwischen den Messelektroden (Abb.1- und 2). Variiert werden je nach Versuch, die Reizstärke und die Reizabstände.

Abb.1: Versuchsaufbau Teil 1 (Nervus ischiadicus)

Abb.2: Versuchsaufbau Teil 2 (Regenwurm) Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindigkeit Reizdauer 0,1ms, Reizamplitude 0,5V, Wiederholungsfrequenz 10Hz. Der Abstand zwischen den reiznahen und reizfernen Ableitelektroden beträgt im Versuchsteil: 1: 30mm = ∆s frosch = ∆s1 2: 25mm = ∆swurm = ∆s2 Untersuchung der Abhängigkeit des Summenpotentials von der Reizamplitude Man variiert die Reizstärke und beobachtet das Signal von einem der Messelektrodenpaar. (Dieser Versuch wir nur am Nervus ischiadicus durchgeführt) Untersuchung der Refraktärzeit von Nervenfasern Reizung des Nervs bzw. des Bauchmarks mit einem Doppelreiz, Variation des Zeitabstands zwischen den beiden Reizen. Bei der Messung der absoluten Refraktärzeit verkürzt man die Zeit zwischen den beiden Reizen so lange, bis man gerade keine Antwort mehr auf den zweiten Reiz bekommt. Um die Länge der relativen Refraktärphase zu ermitteln, verlängert man wieder die Zeit zwischen den beiden Reizen bis die Antwort auf den zweiten Reiz genauso groß ist wie die auf den Ersten. Gemessen wird die Zeit zwischen den beiden Reizen bzw. Reizartefakten. Verwendet wird nur ein Messelektrodenpaar. Ermittlung der Latenzzeit: 1. Messung der Leitungsgeschwindigkeit 2. Messung der Zeit von Reizartefakt zu erster Auslenkung 3. Abziehen der Zeit, die für Fortleitung des Reizes von Reizelektroden zu reiznahen Elektroden gebraucht wird, von der tatsächlich benötigten Zeit = Latenzzeit

Ergebnisse

Teil 1: Untersuchungen am Nervus ischiadicus des Krallenfroschs (Xenopus laevis)

Versuch 1: Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindig keit Abb.4 - Kurve1: Nach dem Reizartefakt (R) fällt die Kurve steil ab, bis sie ein Minimum erreicht. Danach steigt sie wieder steil an fällt kurz ab (2.Minimum), steigt weiter über den Ausgangswert, fällt wieder ab (3.Minimum) und erreicht bald darauf wieder den Ausgangswert. Abb.4 - Kurve2: Nach dem Reizartefakt (R) fällt die Kurve steil ab, bis sie ein Minimum erreicht. Danach steigt sie wieder steil an, dann etwas langsamer bis zu ihrem Maximum. Danach fällt sie wieder langsam ab und erreicht ihren Ausgangswert. Abb.3 und Abb.4 zeigen denselben Sachverhalt, jedoch sieht man bei Abb.4 Kurve1 besser die einzelnen Minima als in Abb.3 Kurve1. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass diese Kurve in Abb.4 eine Mittelwertsdarstellung mehrerer aufgenommener Signale ist. ∆t1 = 0,6ms ∆t2 = 0,6ms ∆t3 = 2ms VAxongruppe1 = ∆s1/∆t1 = 30mm/0,6ms = 50m/s VAxongruppe2 = ∆s1/(∆t1+∆t2) = 30mm/1,2ms = 25m/s VAxongruppe3 = ∆s1/(∆t1+ ∆t3) = 30mm/2,6ms = 11,5m/s

Abb.3: Messung der Nervenleitungsgeschwindigkeit (Einzelsignale)

Abb.4: Messung der Nervenleitungsgeschwindigkeit (Mittelwert auf CH1) Versuch 2: Untersuchung der Abhängigkeit des Summen potentials von der Reizamplitude Es ist zu erkennen, dass mit zunehmender Spannung die Amplitude des Signals der reiznahen Elektroden zunimmt bis es ein Minimum erreicht (Abb.4 Kurve2); die Auslenkung des Signals der reizfernen Elektroden nimmt auch zu. Hier wird auch ein Minimum erreicht. Man sieht auch wie die Mehrgipfligkeit des SP’s am reizfernen Ableitort zunimmt (Abb.4 Kurve1). Versuch3: Untersuchung der Refraktärzeit von Nerven fasern Wenn man die Zeit zwischen den zwei Reizen des Doppelreizes immer kleiner werden lässt, beobachtet man wie die Antwort auf den zweiten Reiz immer kleiner wird, bis sie letztendlich verschwindet (absolute Refraktärzeit). Erniedrigt man dann wieder die Frequenz der Reizung, beobachtet man wie die Antwort auf den zweiten Reiz wieder erscheint (kleinere Amplitude als die Antwort auf den ersten Reiz) und größer wird, bis die beiden Amplituden (Antwort auf ersten und zweiten Reiz gleich groß sind (relative Refraktärzeit).

Abb.5: Kurz vor dem Ende der absoluten Refraktärzeit (schnelle Fasern).

Absolute Refraktärzeit (schnelle Fasern): tabsolut = 1,3ms

Abb.6: Ende der relativen Refraktärzeit (langsame Fasern)

Relative Refraktärzeit (langsame Fasern): trelativ = 6,5ms

Teil 2: Untersuchung der Riesenfasern im Bauchmark des Regenwurms (Lumbricus terrestris)

Versuch 1: Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindig keit Auf das Reizartefakt (R) folgt ein Minimum (mediane Riesenfaser), kurz danach ein Zweites (laterale Riesenfaser). Bei der reizfernen Ableitung geschieht genau das Selbe.

Abb.7: Leitungsgeschwindigkeit (Regenwurm)

∆t4 = 2,36ms ∆t5 = 2,4ms Vmedian = ∆s2/∆t4 = 25mm/2,36ms = 10,6m/s Vlateral = ∆s2/∆t5 = 25mm/2,4ms = 10,4m/s

Versuch2: Untersuchung der Refraktärzeit der Nerven fasern

Abb.8: Signale während der relativen Refratärzeit

Abb.9: Kurz vor dem Ende der absoluten Refraktärzeit

Absolute Refraktärzeit (mediane- und laterale Fasern): tabsolut = 2,2ms

Abb.10: Kurz nach dem Ende der relativen Refraktärzeit

Relative Refraktärzeit (mediane- und laterale Fasern): trelativ = 7ms

Auswertung

Teil 1: Untersuchungen am Nervus ischiadicus des Krallenfroschs (Xenopus laevis)

Versuch 1: Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindig keit In Abb.3 und Abb.4 wurden die getrennt aufgenommenen Signale (reiznahe und reizferne Ableitung) übereinander gelegt. Bei dem zuerst auftretenden Signal handelt es sich um ein Reizartefakt (R). Dies ist das Signal, dass gleichzeitig mit dem Reiz auf dem Oszilloskop erscheint. Man erkennt es daran, dass man bei Umpolung der Reizelektroden ein spiegelverkehrtes Signal erhält. Das zeitversetzt auftretende SP hingegen ändert seinen Verlauf dabei nicht. Man nimmt das Reizartefakt der jeweiligen Signale als Nullpunkt und legt sie übereinander. Das SP stellt sich aufgrund der Messung der absoluten Differenz zwischen den extrazellulär angelegten Elektroden (E1-E2=E) als diphasisches Signal dar. Da es sich beim Nervus ischiadicus um ein Nervenbündel mit Axongruppen unterschiedlichen Durchmessers handelt, erhalten wir reizfern ein SP mit drei Minima. Reiznah ist die Amplitude einheitlich, da die unterschiedlichen Leitungsgeschwindigkeiten der Axone noch nicht zum Tragen kommen . Mit zunehmender Entfernung vom Reizort werden die Abstände der einzelnen Ampilutden immer größer. Das liegt daran, dass die Leitungsgeschwindigkeit vom Durchmesser des Axons abhängt. Die Längskonstante λ = (Rm/Ri)

1/2 der Membran entspricht der Strecke auf der Um (Membranspannung) auf den e-ten Teil (37%) von U0 (Ausgangsspannung) abgefallen ist. Kabelgleichung: Um = U0 · e -x / λ . Je größer λ, desto weiter entfernt entstehen noch APs, was zu einer höheren Fortleitungsgeschwindigkeit entlang des

Axons führt. Bei dünneren Axonen ist λ klein, da der Innenwiderstand im Vergleich zum Membranwiderstand sehr hoch ist. Bei größeren Axonen verhält es sich genau umgelehrt. Hier ist Ri im Vergleich zu Rm sehr niedrig. Deshalb leiten größere Fasern schneller als dünnere Fasern. Aufgrund des Vergleichs der Ergebnisse mit den Daten aus dem Skript, handelt es sich bei Axongruppe1 wahrscheinlich um Verbände vom Fasertyp A1 mit dem Durchmesser 18,5µm (Skript), bei Axongruppe2 um Verbände vom Fasertyp A2 mit dem Durchmesser 14µm (Skript). Axongruppe3 sind wahrscheinlich Verbände vom Fasertyp A3 (ø = 11µm). Hierbei handelt es sich nur um Anhaltspunkte, da die Vergleichswerte von Rana spec. stammen. Axongruppe Leitungsgeschwindigkeit

(m/s) Axongruppe1 50 Axongruppe2 25 Axongruppe3 11,5

Tabelle1: Ermittelte Werte für Xenopus laevis Fasertyp Durchmesser (µm) Leitungsgeschwindigkeit

(ms) A1 18,5 42 A2 14 25 A3 11 17

Tabelle2: Vergleichswerte aus Skript

Versuch 2: Untersuchung der Abhängigkeit des Summen potentials von der Reizamplitude Aufgrund des unterschiedlichen Eingangswiderstandes ist das Schwellenpotential eines Axons bei dem ein AP ausgelöst wird abhängig vom Durchmesser. Der Eingangswiderstand ist umso größer je höher der Innenwiederstand, was bei dünnen Axonen der Fall ist. Deshalb feuern dickere Axone schon bei geringer Reizstärke. Die beobachtete, graduierte Erhöhung der Amplitude des SP am reiznahen Ableitort lässt sich dadurch erklären, dass das SP ja die Summe aller elektrischen Aktivitäten am Ableitort darstellt (AP sind additiv). Das heißt, es erhöht sich nicht die Amplitude der AP, sondern deren Anzahl, da mit zunehmender Reizstärke auch die dünneren Nervenfasern depolarisiert werden. Reiznah ist die Amplitude einheitlich, da die unterschiedlichen Leitungsgeschwindigkeiten der Axone noch nicht zum Tragen kommen. Mit zunehmender Entfernung vom Reizort werden die Abstände der einzelnen Amplituden immer größer. Es bilden sich Minima. Am reizfernen Ableitort sind drei Minima zu sehen (siehe Abb.4 Kurve1). Beobachtet man gleichzeitig die Änderung der beiden Signale (reiznah, reizfern) sieht man, dass beim ersten Signal (Kurve2) sich nur die Amplitude ändert, beim Zweiten (Kurve1) aber auch eine Aufteilung des Signals (synchron). Die maximale Amplitude des ersten Signals ist äquivalent zur Summe der AP aller Fasern am Ableitort (ab einer gewissen Reizstärke sind alle intakten Fasern aktiv).

Dies steht nicht im Widerspruch zum Alles-oder-Nichts-Prinzip, da es sich hierbei nicht um ein einzelnes AP handelt sondern um Mehrere (SP). Bei gegebenem Reiz werden nur solche Fasern gereizt, deren Schwelle erreicht wird. Deren Amplituden werden dann zu einem SP addiert. Die Amplitude des SP erreicht ihr Maximum, wenn durch ausreichende Reizstärke alle Fasern gereizt werden. Versuch3: Untersuchung der Refraktärzeit von Nerven fasern Die Refraktärphase eines Axons teilt sich in die absolute und die relative Refraktärphase auf. Während der absoluten Refraktärphase (RP) ist der Nerv überhaupt nicht erregbar, wobei bei der relativen Refraktärphase die Reizschwelle erhöht ist und die Amplitude des Signals geringer ist. Die absolute Refraktärphase ergibt sich aus der Inaktivierung der Na+-Kanäle (vom vorherigen AP). Deswegen können keine Na+-Ionen in die Zelle einströmen und eine erneute Depolaristaion hervorrufen. Während der relativen RP ist die Leitfähigkeit der K+-Kanäle von der vorherigen Hyperpolarisation noch erhöht, weshalb ein Teil des Reizstroms direkt wieder aus der Zelle heraus fließt und somit keinen Beitrag zur Depolarisation leistet. Wie man auch an den Beobachtungen erkennt, dauert die relative RP immer länger als die absolute RP. Die schnellen Axone weisen in der Regel eine kürzere absolute relative RP als die langsamen Fasern auf. Dies ist notwendig, da die schnellen Axone Informationen mit hoher Frequenz weiterleiten und eine zu lange RP dies verhindern würde. Gar keine RP würde zur Folge haben, dass in gewissen Situationen zu viele Erregungen auf einmal weitergeleitet werden und das ZNS zusammenbricht. Die RP limitiert die Frequenz des Axons. Die langsamen Fasern haben aufgrund ihrer langsamen Weiterleitungsgeschwindigkeit eine lange absolute und relative Refraktärzeit, und die schnellen Fasern jeweils eine Kurze. Also ist die absolute Refraktärzeit, die man in dem Versuch bestimmt, die der schnellen Fasern, die Relative, die der langsamen Fasern.

Teil 2: Untersuchung der Riesenfasern im Bauchmark des Regenwurms (Lumbricus terrestris)

Versuch1: Bestimmung der Nervenleitungsgeschwindigk eit Bei der Reizstärke, die verwendet wurde, wurden nur die beiden Riesenfasern erregt. Da der Innenwiderstand so gering ist (wegen des großen Durchmessers), ist der Schwellenwert der Axone gering gegenüber dem des N. ischiadicus. Man erkennt aus dem Signalverlauf auch, dass die Latenzzeit der lateralen Riesenfasern länger ist als die der Medianen. Versuch2: Untersuchung der Refraktärzeit von Nerven fasern Wenn man die Zeit zwischen den zwei Reizen des Doppelreizes immer kleiner werden lässt, beobachtet man wie die Antworten (mediane und laterale Faser) auf den zweiten Reiz immer kleiner wird, bis sie letztendlich verschwinden (absolute Refraktärzeit). Beim Regenwurm beobachtet man in der relativen Refraktärphase eine Überlagerung der Antwort der lateralen Faser auf den ersten Reiz mit der Antwort der medianen Faser auf den zweiten Reiz.

In Abb.8 sind die ersten beiden Signale die Reizartefakte (R) des ersten und zweiten Reizes. Das nächste Signal (1) ist die Antwort der medianen Faser auf den ersten Reiz. Das darauf folgende Signal (2) ist die bereits erwähnte Überlagerung der Antwort der lateralen Faser auf den ersten Reiz mit der Antwort der medianen Faser auf den zweiten Reiz. Das letzte Signal (3) ist die Antwort der lateralen Faser auf den zweiten Reiz. In Abb.9 sind die ersten beiden Signale wieder die Reizartefakte (R) des ersten und zweiten Reizes. Auf den ersten Reiz gibt es wieder eine Antwort der medianen- (M) und eine der lateralen (L) Riesenfaser. Auf den zweiten Reiz allerdings folgt kein Signal � absolute Refraktärphase. In Abb.10 folgt auf jeden Reiz eine Antwort (mediane (M)- und laterale (L) Riesenfaser) die beides mal identisch ist � Ende der relativen Refraktärphase.

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Literaturangaben -Skript: Programm zum Neurobiologischen Teil des Tierphysiologischen Kurses -Eckert; Tierphysiologie -Wehner Gehring; Zoologie -Penzlin; Lehrbuch der Tierphysiologie