Verteilung magnetischer Nanopartikel in einem ... · Magnetic Drug Targeting, where a...

Aus der Hals-Nasen-Ohren-Klinik

Kopf- und Halschirugie

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. H. Iro

Verteilung magnetischer Nanopartikel in einem Arterienströmungsmodell

in Abhängigkeit der Magnetfeldstärke und der Partikelgröße

- Vorarbeiten für das Magnetische Drug Targeting -

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Biancamaria Beck

aus

Bayreuth

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-

Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. Christoph Alexiou

Korreferent: PD Dr. med. Michael Koch

Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2013

Meinen Eltern

1

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS……………………………………………………....1

1. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................... 4

1.1. HINTERGRUND UND ZIELE ................................................................................................................ 4

1.2. METHODEN ................................................................................................................................... 4

1.3. ERGEBNISSE UND BEOBACHTUNGEN ................................................................................................... 5

1.4. PRAKTISCHE SCHLUSSFOLGERUNGEN .................................................................................................. 5

2. SUMMARY ........................................................................................................ 6

2.1. BACKGROUND AND INTENTIONS ........................................................................................................ 6

2.2. METHODS ..................................................................................................................................... 6

2.3. RESULTS ....................................................................................................................................... 7

2.4. CONCLUSION ................................................................................................................................. 7

3. EINLEITUNG .................................................................................................... 8

4. MATERIAL UND METHODEN ................................................................... 12

4.1 CHEMIKALIEN ................................................................................................................................ 12

4.2 MESSGERÄTE ................................................................................................................................ 15

4.3 NANOPARTIKEL ............................................................................................................................. 16

4.4 PRÄPARATION DER ARTERIEN ........................................................................................................... 19

4.5 FLUSSMODELL ............................................................................................................................... 20

4.6 PARTIKELGRÖßENMESSUNG ............................................................................................................. 24

4.7 EISENBESTIMMUNG........................................................................................................................ 24

4.8 MAGNETORELAXOMETRIE ............................................................................................................... 25

2

4.9 MIKRO-COMPUTERTOMOGRAFIE ...................................................................................................... 27

4.10 HISTOLOGIE ................................................................................................................................ 29

4.11 STATISTIK ................................................................................................................................... 30

5. ERGEBNISSE .................................................................................................. 32

5.1 BEOBACHTUNGEN WÄHREND DER VERSUCHE ...................................................................................... 32

5.2 PARTIKELGRÖßENMESSUNG ............................................................................................................. 34

5.3 EISENBESTIMMUNG........................................................................................................................ 37

5.4 MAGNETORELAXOMETRIE ............................................................................................................... 38

5.4.1 Relative Anreicherung in Abhängigkeit von der Magnetfeldstärke ...................................... 38

5.4.2 Absolute Anreicherung in Abhängigkeit von der Spülung der Arterien und der

Filtration der Partikel ............................................................................................................. 40

5.4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse aus den MRX-Messungen ............................................... 43

5.5 HISTOLOGIE .................................................................................................................................. 45

5.6 MIKRO-COMPUTERTOMOGRAFIE ...................................................................................................... 47

6. DISKUSSION................................................................................................... 52

6.1 PARTIKELANREICHERUNG IN ABHÄNGIGKEIT VON DER GRÖßE DER PARTIKEL .............................................. 52

6.2 PARTIKELANREICHERUNG IN ABHÄNGIGKEIT VOM MAGNETFELDGRADIENTEN ............................................ 55

6.3 AUSBLICK ..................................................................................................................................... 57

7. LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................... 60

8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ................................................................... 67

9. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..................................................................... 68

10. TABELLENVERZEICHNIS ....................................................................... 72

3

11. ANHANG ....................................................................................................... 73

11.1 ARTERIENÜBERSICHT .................................................................................................................... 73

11.3 AUSWERTUNG DER PARTIKELGRÖßENMESSUNG ................................................................................. 77

11.4 AUSWERTUNG DER EISENBESTIMMUNG ........................................................................................... 81

11.5 AUSWERTUNG DER MRX-MESSUNGEN ........................................................................................... 85

12. DANKSAGUNG .......................................................................................... 100

ERKLÄRUNG

LEBENSLAUF

4

1. Zusammenfassung

1.1. Hintergrund und Ziele

Krebs ist nach wie vor eine der Haupttodesursachen weltweit, wodurch die

dringende Notwendigkeit zur Entwicklung innovativer Therapiekonzepte

begründet wird. Einen neuen Ansatz stellt dabei das Magnetische Drug Targeting

dar, bei dem Zytostatika, die an magnetische Nanopartikel gekoppelt sind, in das

Blutgefäßsystem appliziert werden und sich durch Anlage eines externen

Magnetfeldes lokal konzentrieren lassen. Dadurch können vielfach höhere

Konzentrationen von Chemotherapeutika im Tumorgewebe, bei gleichzeitiger

Minimierung der Nebenwirkungen für gesundes Körpergewebe, erzielt werden.

Ziel dieser Arbeit war es, die Konzentration sowie die Verteilung der

magnetischen Nanopartikel in einem Arterienmodell, welches die physiologischen

Bedingungen in vivo simuliert, unter Variation der Partikelgröße und der

Magnetfeldstärke zu untersuchen.

1.2. Methoden

Chemotherapeutika, die an magnetische Nanopartikel gekoppelt wurden,

applizierte man unter Anlegen eines externen Magnetfeldes in das Lumen einer

Femoralarterie des Rindes. Dabei wurde in den Versuchsreihen sowohl die Größe

der Nanopartikel, als auch die Stärke des Magnetfeldes variiert. Im Anschluss

daran wurde die Größe der Nanopartikel mit dem Prinzip der Dynamischen

Lichtstreuung vor und nach Magnetisierung sowie der Eisengehalt der einzelnen

Partikelchargen bestimmt. Zur quantitativen Auswertung des Gehaltes und der

Verteilung von magnetischem Eisenoxid in den Arterien wurde eine

magnetorelaxometrische (MRX) Messung durchgeführt, deren Ergebnisse mit den

5

qualitativen Daten aus der Mikrocomputertomografie (µ-CT) und der Histologie

verglichen wurden.

1.3. Ergebnisse und Beobachtungen

Es konnte zum einen gezeigt werden, dass der Prozess der Magnetisierung die

Größe der nanopartikulären Teilchen erhöht. Überdies konnte man in den MRX-

Messungen statistisch signifikant (p≤0,05) unter Beweis stellen, dass mit

steigender magnetischer Flussdichte auch der Gehalt an magnetischem Eisenoxid

in den Arterien ansteigt und dass sich durch Einsatz größerer magnetischer

Nanopartikel sowie durch Fehlen eines Nachspülvorgangs am Ende des Versuches

deutlich mehr Aufnahme von magnetischem Eisenoxid erzielen lässt, als durch die

Verwendung kleinerer Partikel mit abschließendem Nachspülen. So konnten bei

größeren Partikeln ohne Spülung am Ende des Versuches bei der

Magnetfeldstärke 16T/m im Durchschnitt 77,02% aller magnetischen

Nanopartikel in den Segmenten -2 bis +2 nachgewiesen werden, die während des

Versuches direkt unter dem Polschuh des Magneten gelegen waren. Diese

Beobachtungen wurden sowohl durch die Resultate aus den histologischen

Schnittbildern, als auch durch die grafische Darstellung der µ-CT bestätigt.

1.4. Praktische Schlussfolgerungen

Somit lässt sich feststellen, dass die Methode des Magnetischen Drug Targetings

im Arterienmodell zur gezielten Anreicherung magnetischer Nanopartikel

geeignet ist, wobei für eine effektive Konzentration an Zytostatika relativ hohe

Magnetfeldstärken benötigt werden. Daher sind weiterführende Untersuchungen

der einzelnen Parameter unabdingbar, um eine effiziente Anwendung beim

Menschen erreichen zu können.

6

2. Summary

2.1. Background and intentions

Cancer is still one of the main causes of death in the world. Therefore it is

reasonable to develop new concepts for therapy. One of the recent approaches is

Magnetic Drug Targeting, where a chemotherapeutic agent bound to magnetic

nanoparticles is administered into the blood stream and focused in the region of

interest by a strong external magnetic field. This method enables to achieve a

much higher concentration of chemotherapeutic substances in the tumor tissue

while reducing the negative side effects for the rest of the body. The aim of this

study was to analyze the concentration and the distribution of the magnetic

nanoparticles in an artery model, which imitates the terms and conditions in vivo,

by altering the size of the nanoparticles as well as the force of the magnetic field.

2.2. Methods

Chemotherapeutic agents bound to magnetic nanoparticles were administered into

a bovine femoral artery while applying an external magnetic field. In the

experimental series both the size of the nanoparticles as well as the force of the

magnetic field were modified. Afterwards the size of the nanoparticles before and

after magnetization was detected by using the method of dynamic light scattering.

Moreover the content of iron in the particle loads was measured. To analyze the

concentration and the distribution of magnetic iron oxide in the arteries, we

conducted a magnetorelaxometric measurement and compared the results with the

qualitative information gained from microcomputertomography as well as

histology.

7

2.3. Results

First of all it could be shown that the process of magnetization increases the size

of the nanoparticular items. In the magnetorelaxometric measurements we could

moreover observe a statistically significant (p≤0,05) ascending concentration of

magnetic iron oxide in the arteries when increasing the magnetic flux density. For

example 77,02% of nanoparticles could be found in the artery segments from -2 to

+2 when applying a magnetic flux density of 16T/m on arteries that received

unstrained particles and were not flushed at the end of the test phase. Besides we

could demonstrate that arteries, which received unstrained nanoparticles and were

not flushed after the test phase, generally contained a higher amount of magnetic

iron oxide than arteries, which received filtrated particles and were flushed at the

end of the test phase. These observations could be confirmed by the histological

cross sections and in the illustrations of the µ-CT.

2.4. Conclusion

Thus it can be concluded that Magnetic Drug Targeting is a method appropriate

for the specific enrichment of magnetic nanoparticles in an artery model. To

achieve an effective concentration of chemotherapeutic agents, it is necessary to

apply high magnetic forces. Therefore more detailed investigation has to be done

to ensure an efficient implementation in patients.

8

3. Einleitung

Die dringende Notwendigkeit zur Entwicklung innovativer Konzepte bei der

Bekämpfung von Krebserkrankungen zeigt sich unter anderem in den aktuellen

Statistiken des Robert Koch Instituts. Danach traten in Deutschland im Jahr 2010

bei Männern insgesamt 246.200 bösartige Neuerkrankungen auf, bei Frauen

waren es 204.000. [5] Im Vergleich zum Jahr 1980 bedeutet dies eine Zunahme

der pro Jahr neu aufgetretenen Krebskrankheiten um 90% bei Männern und um

mehr als 40% bei Frauen. [4] Diese rapide ansteigenden Zahlen sind zum großen

Teil auf eine durch den demografischen Wandel immer älter werdende

Bevölkerungsstruktur zurückzuführen, da ein fortgeschrittenes Alter einen

bedeutenden Risikofaktor für fast alle Krebsarten darstellt.

Überdies gilt Krebs immer noch als eine der Haupttodesursachen weltweit. So

wurden im Jahr 2008 global gesehen 7,6 Millionen Todesfälle durch Malignome

verursacht, was einer Rate von 13% aller Todesfälle entspricht. [8] Abbildung 1

fasst die oben beschriebenen Tendenzen noch einmal graphisch zusammen.

Abbildung 1: Jährliche Neuerkrankungs- und Sterbefälle sowie altersstandardisierte

Neuerkrankungs- und Sterberaten (Europastandard) nach Geschlecht, Deutschland 1980 –

2004. (Robert Koch Institut (2010) Krebs in Deutschland 2005/2006 – Häufigkeiten und Trends:

156-164.)

9

Bei steigender Inzidenz der Krebserkrankungen lässt sich trotz einer intensivierten

Früherkennung, die es ermöglicht, Tumore in lokal begrenzten Stadien zu

entdecken, und dem Einsatz minimal-invasiver Techniken in Diagnostik und

Therapie insgesamt eine ungenügende Reduktion der Mortalität feststellen. Diese

Tatsache verdeutlicht die Notwendigkeit weiterführender Forschung zur

Entwicklung innovativer Therapien, welche die Mortalität der Krebserkrankungen

wirkungsvoll senken können. Eine Ausnahme stellt die Anwendung

personalisierter Therapiekonzepte, wie die Ermittlung des her2/neu-Status bei

Mammakarzinom, dar, durch die bereits ein Rückgang der Mortalität erzielt

werden konnte. [2, 41]

Weil in vielen Fällen eine systemische Ausbreitung der Krebserkrankung nicht

sicher auszuschließen oder bereits nachgewiesen ist, ergibt sich oftmals die

Notwendigkeit zur Durchführung einer Chemotherapie. Diese systemische

Tumortherapie zerstört aufgrund ihrer unselektiven Wirkung auch gesunde, vor

allem sich rasch teilende Zellen und kann damit zu einer Vielzahl von

Nebenwirkungen, wie Übelkeit, Erbrechen, Haarausfall oder Myelo- und

Immunsuppression führen. [64]

Durch das Auftreten dieser unerwünschten Nebenwirkungen erfährt die

Effektivität einer Chemotherapie häufig eine Limitierung, obwohl vielfach höhere

Dosierungen für eine effektive Behandlung nötig wären. Daraus ergibt sich die

dringende Notwendigkeit, zielgerichtete Therapiekonzepte zu entwickeln, die

gesundes Gewebe maximal schonen, aber Tumorzellen spezifisch und

hochwirksam zerstören. [20]

Nanopartikel sind hierbei als tragfähige Systeme ein vielversprechendes Konzept,

da sie einerseits den Zugriff auf lange erprobte Zytostatika erlauben, andererseits

durch ihre einzigartigen biochemischen Eigenschaften, ihre Biokompatibilität und

ihr kolloidales Verhalten aber auch den Einsatz neuer, bisher nicht bioverfügbarer

Stoffe ermöglichen. [9, 42]

Magnetische Nanopartikel, die ursprünglich im Bergbau und Hüttenwesen zur

Separation magnetischer von nicht-magnetischen Erzen Verwendung fanden,

10

werden bereits zur heutigen Zeit vielfach in Medizin und Technik eingesetzt,

beispielsweise zur magnetischen Zellseparation, zur Okklusion von Aneurysmen,

im Verfahren der magnetischen Hyperthermie oder als Kontrastmittel in der

Magnetresonanztomografie. [1, 13, 17]

Um das Konzept der lokalen Chemotherapie weiter zu entwickeln und Zytostatika

aktiv in spezifische Bereiche des Körpers transportieren zu können, wurde in den

1990er Jahren das Verfahren des Magnetischen Drug Targetings (=MDT)

entwickelt, bei dem Chemotherapeutika, die an superparamagnetische

Nanopartikel gebunden sind, nach intravenöser Applikation mittels eines externen

Magnetfeldes lokal konzentriert werden können. Der große Vorteil dieser

neuartigen Methode gegenüber der herkömmlichen systemischen Chemotherapie

liegt dabei in der regional vielfach höheren Konzentration an therapeutisch

wirksamem Agens bei gleichzeitiger Reduktion der systemischen Dosis und damit

auch der negativen Auswirkungen auf den gesamten Körper. Dieser Ansatz ist

beispielsweise gut für die Hals-Nasen-Ohrenheilkunde geeignet, da Tumore in

diesem Fachbereich meist oberflächlich gelegen sind und daher durch MDT gut

zu erreichen sind. [51, 66]

Um das Anreicherungsverhalten der Ferrofluide und deren Stabilität sowie

Interaktion mit dem umliegenden Gewebe in Anwesenheit eines externen

Magnetfeldes unter Simulation physiologischer Bedingungen genauer zu

beobachten und zu analysieren, wurde ein Arterienmodell entwickelt. Es

ermöglicht die gezielte Variation verschiedener Parameter, wie zum Beispiel der

Stärke und Dauer der Magnetfeldeinwirkung, des Abstandes des Magneten zur

Arterie, der Flussrate sowie der Flussrichtung oder der Temperatur, und trägt

somit zur Optimierung der gesamten Anwendung bei. [52, 66]

11

In den gegenwärtigen Versuchsreihen wurden unterschiedliche

Magnetfeldgradienten untersucht, wobei der höchste Gradient an der

Polschuhspitze des Magneten 72T/m betrug. Außerdem kamen diverse

Größenfraktionen der Ferrofluide zum Einsatz um deren Einfluss bezüglich der

maximal möglichen Anreicherung zu prüfen. Dabei wollte man zeigen, dass sich

sowohl zwischen den einzelnen Magnetfeldgradienten, als auch zwischen den

verwendeten Partikelgrößen Unterschiede in der Anreicherung der Nanopartikel

zeigen.

12

4. Material und Methoden

4.1 Chemikalien

Alle Chemikalien und Lösungen, welche in den durchgeführten Versuchsreihen

Verwendung fanden, sind in Tabelle 1 verzeichnet und ihren jeweiligen

Herstellern beziehungsweise Lieferanten zugeordnet.

Tabelle 1: Auflistung aller für die Versuchsreihen verwendeten Chemikalien und Stoffe mit

Herstellern.

Chemikalien und

Verbrauchsmittel

Hersteller

5-Sulfosalicylsäure Lösung 20% AppliChem, Darmstadt,

Deutschland

Albumin Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Ammoniak-Lösung 1,3% Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Ammoniak-Lösung 25% Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Aquatex® Wässriges

Eindeckmittel

AQUATEX GmbH,

Geilenkirchen, Deutschland

Calciumchlorid Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Cellulosemischester-Filter

0,22µm, Nr. P818.1

Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

13

Chemikalien und

Verbrauchsmittel

Hersteller

Diaminobenzidin Substratlösung Vector Laboratory, Burlingame,

Kanada

Eisen(II)-Chlorid-Hexahydrat Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Eisen(III)-Chlorid-Hexahydrat Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Ethanol 70% Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Ethanol 96% Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Formaldehydlösung Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Glucose AppliChem, Darmstadt,

Deutschland

Hydroxyammoniumchlorid Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Isopropanol Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Kaliumchlorid Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Kaliumdihydrogenphophat Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Kaliumhexacyanoferrat Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Kanüle Medtronic GmbH, Deutschland

Kernechtrot Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Konzentrierte Ammoniaklösung Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Konzentrierte Salzsäure Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

14

Chemikalien und

Verbrauchsmittel

Hersteller

Laurinsäure Fluka, Steinheim, Deutschland

Magnesiumsulfat Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Mitoxantron NC Neocorp Weilheim, Deutschland,

Gehalt 2mg/ml

Nahtmaterial ETHILON® II FS-

2 4/0

Ethicon Endo-Surgery Inc.,

Bremen, Deutschland

Natriumchlorid Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Natriumhydrogencarbonat Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Nitroprussid-Natrium Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Paraffin Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Ringer-Lösung DeltaSelect GmbH, Deutschland

Rotilabo®-Einmal-Küvette

PMMA 4,5ml

Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Sodium Nitroprussid Dihydrat Sigma Aldrich Chemie GmbH

München, Deutschland

Xylol Carl Roth, Karlsruhe,

Deutschland

Der verwendete BSA-Puffer setzt sich aus 0.114 M NaCl, 3mM KCl, 2.5mM

CaCl2, 1mM KH2PO4, 0.8mM MgSO4, 24mM NaHCO3, 1g/L Glucose und 6.25g

Albumin zusammen.

15

4.2 Messgeräte

Untenstehende Tabelle listet die genaue Bezeichnung der Messgeräte auf, die für

die Experimente verwendet wurden und ordnet sie ihren entsprechenden

Herstellern beziehungsweise Lieferanten zu.

Tabelle 2: Auflistung aller für die Versuchsreihen verwendeten Messgeräte mit Herstellern.

Messgeräte Hersteller

Analysenwaage KERN 770 Kern & Sohn GmbH, Balingen,

Deutschland

Digitaler Messschieber

digiMax®

Wiha Werkzeuge GmbH,

Schonach, Deutschland

Elektromagnet Siemens, Deutschland

Eppendorf Cup Eppendorf Vertrieb Deutschland

GmbH, Wesseling-Berzdorf

Mikrotom Leica Microsystems RM2255,

Wetzlar, Deutschland

Objektträger Thermo Scientific,

Menzel Gläser Superfrost® Plus

Gerhard Menzel GmbH,

Braunschweig, Deutschland

Peristaltische Pumpe Pharmacia

LKB-Pump P-1

Rhys Scientific, Lancashire,

Großbritannien

Photometer biochrom Libra 522 Biochrom AG, Berlin,

Deutschland

Präparationsbesteck Aesculap chirurgische

Instrumente, Tuttlingen,

Deutschland

16

Messgeräte Hersteller

Wärme- und Trockenschrank

Heraeus Function Line

Heraeus Holding, Hanau,

Deutschland

Zeta Potential / Particle Sizer

NICOMP TM

380 ZLS

PSS NICOMP, Particle Sizing

Systems, Santa Barbara,

California

4.3 Nanopartikel

Mit dem Begriff Nanopartikel werden Systeme bezeichnet, deren Teilchen eine

Größe von unter 100nm aufweisen, wobei die Partikelgröße stets den

hydrodynamischen Durchmesser bezeichnet. [18] Zur Anwendung in vivo ist es

entscheidend, die Partikelgröße einerseits klein genug zu wählen, um

Kapillarverschlüsse und die Phagozytose durch Zellen des mononukleären

phagozytierenden Systems (MPS) zu verhindern. Andererseits müssen die Partikel

groß genug sein, um durch ein externes Magnetfeld angezogen zu werden. [18,

42] Als ideal hat sich eine Größe von 100nm gezeigt, die im selben Bereich wie

die von Antikörpern, Nukleinsäuren und Proteinen liegt und den Nanopartikeln

somit biomimetische Eigenschaften verleiht. Maßgeblich für den Einsatz als

Therapeutikum ist darüber hinaus die Tatsache, dass Nanopartikel aus Eisen-Oxid

(Fe3O4) aufgrund ihrer Größe von etwa 30nm superparamagnetisch sind, also

ausschließlich während einer Magnetfeldwirkung magnetische Eigenschaften

besitzen. Da Nanopartikel überdies ein besonders großes Verhältnis von

Oberfläche zu Volumen aufweisen und durch ihre veränderliche

Oberflächenbeschaffenheit leicht biokompatibel gemacht werden können, stellen

sie ein leistungsstarkes Werkzeug für die Bildgebung, Diagnose und Therapie dar.

[17, 20, 22, 54]

17

Die für die Versuchsreihen verwendeten magnetischen Nanopartikel wurden nach

dem Verfahren von Khalafalla und Reimers synthetisiert. [39]

Dazu wog man 16,12g FeCl2 * 4 H2O und 32,33g FeCl3 * 6 H2O in ein 250ml

Becherglas ein und füllte dieses mit 133ml Wasser auf, so dass Fe2+

und Fe3+

im

Verhältnis von 2 zu 3 vorhanden waren. Nun folgte die Fällung der Partikel unter

Zutropfen von 67ml einer 25%igen NH3-Lösung. Während die Ferrofluide durch

einen Ringmagneten am Boden des Becherglases festgehalten wurden, wusch man

den Überstand so lange mit einer 1,3%igen NH3-Lösung, bis darin keine Cl- Ionen

mehr nachweisbar waren. [39]

Zur Verbesserung der Biokompatibilität und um ein Ausflocken in wässriger

Lösung zu verhindern, wurden die Nanopartikel nun mit Laurinsäure beschichtet.

[16] Zu diesem Zweck gab man auf 40ml Ferrofluide 1,066g Laurinsäure, welche

über ihre Carboxylgruppe chemisch an die Oberfläche der Eisenatome bindet. [45]

Im letzten Schritt gab man 0,132mg Mitoxantron auf 1ml Ferrofluide, welches als

eigentlich therapeutisch wirksames Agens in die DNA interkaliert und dort

sowohl DNA-Doppelstrangbrüche verursacht, als auch die Nukleinsäuresynthese

hemmt. [46] Da das Zytostatikum über eine elektrostatische Bindung reversibel an

die magnetischen Nanopartikel gebunden ist, wird es erst am gewünschten Zielort

freigesetzt und entfaltet dort seine Wirkung. [11, 57] Abbildung 2 verdeutlicht den

schematischen Aufbau eines Ferrofluides mit elektrostatischer Bindung an

Mitoxantron.

Abbildung 2: Schematischer Aufbau eines Ferrofluides mit Darstellung der ionischen Bindung

an Mitoxantron. (Second Else Kröner-Fresenius-Symposium: Nanomedicine – Basic and Clinical

Application in Diagnostics and Therapy. Universitätsklinikum Erlangen, 3.-5. September 2010.)

18

Entsprechend der unterschiedlichen Versuchsanordnungen wurden die

synthetisierten Partikel entweder unfiltriert appliziert oder mithilfe eines 0,22µm

Cellulosemischester-Filters gereinigt und erst in filtrierter Form zur Anwendung

gebracht.

Zur Ermittlung der allgemeinen Eigenschaften der magnetischen Nanopartikel

wurden die Partikelgröße und das Zetapotential mit dem Zeta Potential/Particle

Sizer NICOMP TM

380 ZLS bestimmt. Außerdem ermittelte man den pH-Wert des

Systems sowie den Feststoffgehalt, also den Gewichtsanteil an Feststoffen nach

einer definierten Trocknungszeit. [50] Des Weiteren erfolgte die Abschätzung des

magnetischen Moments der Nanopartikel mithilfe einer selbst konstruierten

Apparatur, die in Abbildung 3 dargestellt ist.

Abbildung 3: Apparatur zur Abschätzung des magnetischen Moments der Nanopartikel.

In der enthaltenen Spule herrscht nach Anlegen eines Wechselstroms ein

magnetischer Fluss. Je höher die magnetische Kraft der in einem Eppendorf Cup

eingesetzten Ferrofluide ist, desto stärker ist auch die Kraft, welche den

beweglichen Boden der Apparatur nach unten drückt.

19

Es wurde ein Zetapotential zwischen -20,7mV und -35,4mV gemessen. Der

Feststoffgehalt der einzelnen Chargen belief sich auf 5,8% bis 8,9%, das

Magnetische Moment auf 11,5mN/g bis 14,1mN/g und der pH-Wert lag zwischen

7,6 und 8,2. Die Bestimmung der Partikelgröße ergab für alle Chargen eine

Anordnung in zwei Größenfraktionen, von denen die erste im Durchschnitt bei

8,7nm (±8,6nm) und die zweite bei durchschnittlich 35,8nm (±33,3nm) lag. Die

dritte Fraktion, die einen höheren Wert aufwies, war prozentual vernachlässigbar

klein. Tabelle 3 gibt einen genauen Überblick über die erhaltenen Messwerte.

Tabelle 3: Mittelwerte der Partikelgrößenmessung filtrierter und unfiltrierter Chargen mit

Standardabweichung.

4.4 Präparation der Arterien

Für die Versuche kamen frisch isolierte Femoralarterien des Rindes zum Einsatz,

die täglich aus dem Schlachthof Erlangen abgeholt wurden. Zunächst präparierte

man die Arterien aus dem umliegenden Saum aus Bindegewebe und Fett frei und

verschloss die Seitenäste mit chirurgischem Fadenmaterial. Während des

gesamten Vorganges wurden die Arterien in einer Nitroprussid-Natrium Lösung

(0,3g/L) gehalten, welche durch Substitution von Stickstoffmonoxid zur

Aktivierung der Guanylatcyclase in der Gefäßmuskelzelle und somit zur

Vasodilatation führt. [43] Nach Erreichen einer Länge von etwa 15cm wurden die

Chargen filtriert Chargen unfiltriert

Mittelwert der

Fraktion 1 [nm] 10,36 (±10,91) 7,00 (±6,30)

Mittelwert der

Fraktion 2 [nm] 40,72 (±45,90) 30,96 (±20,70)

Mittelwert der

Fraktion 3 [nm] 291,1 (±370,24) 104,65 (±118,16)

20

Arterien an beiden Enden kanüliert, um sie in ein eigens dafür konstruiertes

Glasgefäß einspannen zu können. Zur Simulation physiologischer Bedingungen

durchspülte man schließlich den Innenraum der Arterien mit BSA-Puffer.

4.5 Flussmodell

Zur Realisierung eines Flussmodells, das in Abbildung 4 schematisch und in den

Abbildungen 6 und 7 als Fotografie dargestellt ist, wurden die im Glasgefäß

fixierten Arterien nun mit Ringer-Lösung umspült und der BSA-Puffer mittels

einer peristaltischen Pumpe (Fließgeschwindigkeit 5,128ml/Min) durch die

Arterie transportiert.

Abbildung 4: Schematische Zeichnung des Arterien-Flussmodells. (Lyer, S. (2009): Distribution of

Magnetic Nanoparticles after Magnetic Drug Targeting in an Ex Vivo Bovine Artery Model. IFMBE

Proceedings 25/VII: 484-487.)

Um die magnetischen Nanopartikel anzureichern, wurde ein Elektromagnet mit

einem maximalen Magnetfeldgradienten von 72T/m an der Polschuhspitze

verwendet. Dabei wurde sorgsam darauf geachtet, dass die topfförmig konstruierte

Polschuhspitze des Magneten mittig über der Arterie platziert war. Denn die

entscheidenden Parameter zur Anreicherung der Ferrofluide im Inneren der

Arterie sind bei gegebener magnetischer Flussdichte einerseits der Abstand von

der Quelle des Magnetfeldes und andererseits die magnetische Feldstärke. [19]

21

Diese wiederum verringert sich, wie in Abbildung 5 gezeigt, mit zunehmender

Entfernung von der Polschuhspitze und beträgt bei dem aktuell verwendeten

Elektromagneten in einem Abstand von 22mm noch 10T/m. [11] Überdies ist es

für eine gerichtete Bewegung der Partikel von entscheidender Bedeutung, dass der

Elektromagnet ein inhomogenes Magnetfeld erzeug. [12, 37, 70]

Abbildung 5: Abhängigkeit der magnetischen Feldstärke von der Entfernung zur Polschuhspitze eines Elektromagneten.

Durch unterschiedliche Voreinstellungen der Stromstärke zu 0A, 36A oder 72A

konnten die korrespondierenden Werte für die Magnetfeldstärke von 0T/m, 10T/m

oder 16T/m erreicht werden.

Es wurden je Experiment 1ml Ferrofluide über zehn Minuten in den Kreislauf

injiziert, welche die Arterie unter Einfluss eines verschieden stark gewählten

externen Magnetfeldes passierten. Danach ließ man das System weitere zehn

Minuten laufen, schaltete den Elektromagneten aus und zog anschließend den

Rückstand der Partikel aus dem Glaskolben ab. Je nach Versuchsbedingung

schloss sich nun eine zehnminütige Spülung der Arterie mit reinem BSA-Puffer

an, wonach der Rest der Nanopartikel als Überstand abgezogen werden konnte.

22

Abbildung 6: Fotografische Darstellung des Arterien-Flussmodells.

Abbildung 7: Ausschnittvergrößerung aus Abbildung 6 zur genaueren Darstellung des Glasgefäßes

mit innenliegender Arterie.

Anschließend wurde die Arterie wieder aus dem Kreislauf entnommen und in

Stücke von 1cm Länge geschnitten, die mit Nummern versehen wurden. Dabei

bekam das Stück, welches während der Versuche direkt unter der Polschuhspitze

des Magneten gelegen war, die Nummer 0. Das Segment, das der Injektionsstelle

Elektromagnet Polschuhspitze

des Magneten

Peristaltische Pumpe

Glasgefäß mit Arterie

Glasgefäß

Arterie

Polschuhspitze des

Elektromagneten

23

der Ferrofluide am nächsten lag erhielt die Bezeichnung -5. Die übrigen Zahlen

wurden, wie in Abbildung 8 schematisch dargestellt, aufsteigend bis +5 weiter

vergeben.

Abbildung 8: Schematische Zeichnung des Arterienflussmodells. Die Arterie wird in 11

Segmente zu je 1cm Länge geschnitten und nach obenstehendem Schema nummeriert. i=

Abstand von der Polschuhspitze zur Außenwand der fokussierten Arterie. (Tietze R., Rahn H.,

Lyer S., Schreiber E., Mann J., Odenbach S., Alexiou C. (2011): Visualization of superparamagnetic

nanoparticles in vascular tissue using XµCT and histology. Histochemistry and Cell Biology. 135:

153-158.)

Alle Stücke wurden in 4%iger Formaldehydlösung fixiert, in einer aufsteigenden

Alkoholreihe (zweimaliges Wässern mit destilliertem Wasser, 70% Ethanol über

Nacht, 90% Ethanol über Tag, Isopropanol über Nacht, zweimalig Xylol über je

zwei bis drei Stunden) dehydriert und schließlich für weitere histologische sowie

mikrostrukturelle Untersuchungen in Paraffin fixiert.

Außerdem ermittelte man Länge und Außendurchmesser jedes Arterienstückes

unter Zuhilfenahme eines Messschiebers und wog die Segmente mit einer

Analysenwaage.

24

4.6 Partikelgrößenmessung

Um die hydrodynamische Größe der magnetischen Nanopartikel vor und nach

Applikation im Flussmodell zu ermitteln bediente man sich eines Zetasizers,

welcher mit Hilfe der Dynamischen Lichtstreuung die Geschwindigkeit von

Partikeln in einer Lösung bestimmt. [28] Die Messung basiert dabei auf der

Erfassung der Brownschen Molekularbewegung, nach der kleine Teilchen eine

höhere Beweglichkeit aufweisen, als größere Teilchen. [34] Über die Bestimmung

der Partikelgeschwindigkeit kann so auf die Größenverteilung einer Dispersion

zurückgeschlossen werden. [6, 7]

Die Größenbestimmung der Partikelchargen erfolgte dabei in einer Verdünnung

von 1:100 mit destilliertem Wasser. Die Partikelgrößen der Rückstände sowie der

Überstände wurden in unverdünnter Form ermittelt.

4.7 Eisenbestimmung

Zur Ermittlung des Eisengehaltes der einzelnen Partikelchargen wurde die

Methode nach Dr. Dokuzovic angewandt. [27] Hierbei macht man sich den

Umstand zunutze, dass Eisen (II)- und Eisen (III)-Ionen im alkalischen Bereich

mit dem Reagenz 5-Sulfosalicylsäure gelb gefärbte Komplexe mit einem

Adsorbtionsmaximum bei 424nm bilden. [21, 56]

Der erste Reaktionsschritt umfasst das Herstellen einer Eichreihe mit bekannter,

aufsteigender Eisenkonzentration. Nach unten beschriebener Vorgehensweise und

photometrischer Messung der Extinktion der fünf Lösungen bei 424nm trägt man

die erhaltenen Messwerte in ein Diagramm ein, wobei die Konzentration auf der

X-Achse und die Extinktion auf der Y-Achse notiert werden. Im

Gültigkeitsbereich des Lambert-Beerschen Gesetzes erhält man daraus eine

Gerade, welche zur Kalibrierung dient. [27]

25

Im Anschluss daran erfolgt die Messung der Probe mit unbekannter

Eisenkonzentration. Dafür verwendet man 25µl Ferrofluide, kocht diese für 15

Minuten mit 0,5ml konzentrierter Salzsäure und fügt anschließend 2ml

Sulfosalicylsäure und 0,8ml Hydroxyammoniumchlorid hinzu. Nun wird

konzentrierte Ammoniaklösung bis zum Farbumschlag nach gelb zugetropft und

die Extinktion der erhaltenen Lösung bei 424nm im Photometer gemessen. Die

oben beschriebenen Reaktionsschritte sind auch für die Lösungen der Eichreihe

durchzuführen. Die Konzentration an Eisen in der Probe lässt sich schließlich

unter Zuhilfenahme der vormals erstellten Kalibrierkurve berechnen. [27]

4.8 Magnetorelaxometrie

Die Magnetorelaxometrie (= MRX) stellt eine sensitive Methode dar, um auf

nicht-invasive Weise die Konzentration biologischer Substanzen quantitativ zu

bestimmen. In der vorliegenden Versuchsanordnung dienen dabei magnetische

Nanopartikel als Marker, mithilfe derer auf den Gehalt an Mitoxantron in der

jeweiligen Probe zurückgeschlossen werden kann. [3]

Die Messung der einzelnen in Paraffin eingebetteten Arterienstücke erfolgte an

der Physikalisch-Technischen Bundesanstalt in Berlin mittels eines Ein-Kanal-

SQUID (superconducting quantum interference device) Gerätes. Dabei wird in

einem von magnetischen Einflüssen abgeschotteten Raum für eine Sekunde ein

externes homogenes Magnetfeld der Stärke 1,8 mT angelegt, wodurch die

magnetischen Momente der Nanopartikel in der Probe in Richtung des

Magnetfeldes ausgerichtet werden. Schaltet man das Magnetfeld nun ab, so geht

die oben beschriebene Magnetisierung der Teilchen wieder in ihren

Ausgangszustand zurück. [29, 30, 60]

26

Für das Verständnis dieser Relaxation sind dabei zwei physikalische

Mechanismen von grundlegender Bedeutung. Zum einen existiert die Brownsche

Relaxation, welche die volumenabhängige Rotation der Nanoteilchen in

Trägerflüssigkeiten beschreibt. Da die Proben im gegenwärtigen Fall durch

Paraffin immobilisiert sind, kommt diesem Zusammenhang nur eine geringe

Bedeutung zu. Andererseits muss die Neelsche Relaxation berücksichtigt werden,

bei der nur die magnetischen Momente und nicht die Nanopartikel selbst rotieren

und die somit den Großteil der Relaxation in festen Medien ausmacht. [48, 49]

Der Abfall der magnetischen Induktion B (t) der Partikel kann nun gegen die

Relaxationszeit, die dafür benötigt wird, durch einen hochempfindlichen SQUID

Sensor erfasst werden. Dadurch erhält man eine sogenannte Relaxationskurve, die

beispielhaft in Abbildung 9 dargestellt ist. Zur Bestimmung des Eisengehalts in

der Probe führt man zusätzlich eine Vergleichsmessung mit bekanntem

Eisengehalt durch und vergleicht beide Kurven miteinander. [60, 71]

Abbildung 9: Beispielhafte Darstellung von Relaxationskurven der SQUID-Messung. (Richter H.,

Wiekhorst F., Schwarz K., Lyer S., Tietze R., Alexiou C., Trahms L. (2009): Magnetorelaxometric

quantification of magnetic nanoparticles in an artery model after ex vivo magnetic drug targeting.

Physics in Medicine and Biology 54: N417-N424.)

27

Aus der Relaxationskurve lassen sich wichtige Kenngrößen quantitativ ablesen.

Die initiale Signalamplitude der Relaxationskurve stellt dabei die direkte Messung

des Gehalts an Eisenoxid in der Probe dar. Der Kurvenverlauf reflektiert die

Größenverteilung der gemessenen Partikel. [67]

Überdies kann durch wiederholte SQUID-Messungen das Signal-Rausch-

Verhältnis verbessert werden, um störende Hintergrundsignale zu verrechnen und

somit die Qualität des Ergebnisses optimieren zu können. [30]

4.9 Mikro-Computertomografie

Die Computertomografie (= CT) ist heutzutage als essentieller nicht-invasiver

Bestandteil vieler wissenschaftlicher Disziplinen, wie beispielsweise der

Geologie, der Materialwissenschaften oder auch der Medizin, nahezu ubiquitär

etabliert. [25, 31, 44] Grundlage dieser Methode ist die Erzeugung von

Röntgenstrahlen, die beim Durchtritt durch Materie mit dieser in Wechselwirkung

treten und in ihrer Intensität je nach Dichte des Gewebes abgeschwächt werden,

so dass sich beim Auftreffen der Strahlen auf den Detektor unterschiedliche

Graustufen präsentieren. Um dreidimensionale Informationen über verdeckte

Strukturen zu erhalten, rotieren bei der CT Strahlenquelle und Detektor. [59]

Für die hier beschriebene Versuchsreihe wurde diese Technik genutzt, um in

Ergänzung zur quantitativen Bestimmung des Eisengehaltes mittels MRX auch

die räumliche Anordnung der magnetischen Nanopartikel in einem

Arteriensegment bildlich darstellen zu können.

Da die Auflösung konventioneller CT-Geräte allerdings in der Größenordnung

von etwa 0,5mm liegt und damit ungeeignet zur Erfassung von Nanopartikeln ist,

ergab sich die Notwendigkeit auf die µ-CT zurückzugreifen. [58]

28

Durchgeführt wurden die Messungen an Arterienstücken am Lehrstuhl für

Magnetofluiddynamik der Technischen Universität Dresden (Inhaber: Prof. Dr.

rer. nat. Stefan Odenbach). Der dabei verwendete µ-CT Apparat, dessen Prinzip in

Abbildung 10 dargestellt ist, basiert auf einer Röntgenstrahlungsquelle, die einen

polychromatischen Strahlenkegel emittiert. Die Strahlung wird beim Durchtritt

durch die Probe je nach Dichte des Gewebes unterschiedlich abgeschwächt und

trifft auf den Detektor. Im Gegensatz zu einem klassischen CT ist dabei zu

bemerken, dass das zu untersuchende Arterienstück um die Strahlungsquelle

rotiert. [25, 58, 59] Die magnetischen Nanopartikel weisen im Gegensatz zum

umliegenden Gewebe eine hohe Absorption für die Röntgenstrahlen auf und

fungieren somit als intrinsisches Kontrastmittel. [25, 32]

Abbildung 10: Grundlegender Aufbau eines µ-CT Gerätes. (Rahn H., Gomez-Morilla I., Jurgons R.,

Alexiou C., Eberbeck D., Odenbach S. (2009): Tomografic examination of nanoparticles used as

drug carriers. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 321: 1517-1520.)

Mit der Technologie des µ-CT lässt sich also eine wesentlich geringere räumliche

Auflösung, die etwa bei 20µm liegt, erzielen. [59] Allerdings bringt die

Verwendung eines polychromatischen Röntgenstrahlenkegels auch einen

wichtigen Nachteil gegenüber der herkömmlichen CT Bildgebung mit sich. Durch

die bevorzugte Absorption niedrigenergetischer Photonen beim Durchtritt durch

Materie kommt es zu einer Aufhärtung, also einer Anreicherung

hochenergetischer Photonen, im restlichen Röntgenstrahl. Dieser Effekt führt zu

verschiedensten Artefakten im resultierenden Bild. Er kann jedoch durch die

Verwendung von Aluminium-Filtern gering gehalten werden. [24, 25]

29

4.10 Histologie

Als weitere Methode, die Verteilung der magnetischen Nanopartikel visuell

darzustellen, wurden von relevanten Arterienstücken histologische Schnitte

angefertigt und lichtmikroskopisch beurteilt. Der große Vorteil dieser Technik

gegenüber dem µ-CT besteht in der ausgezeichneten räumlichen Auflösung im

Bereich einiger Mikrometer sowie der Möglichkeit, neben der reinen

Anreicherung auch die Infiltration der Ferrofluide in das Endothel der Arterie

beobachten zu können. Allerdings stellt die Histologie nur eine zweidimensionale

Aufnahme eines bestimmten Bereiches dar und limitiert durch die im Prozess

nötige Gewebsaufarbeitung die weitere Verwendung und Untersuchung der

Proben. [25, 58]

Im ersten Schritt der histologischen Aufarbeitung wurde das in Paraffin fixierte

Arteriensegment unter Zuhilfenahme eines Mikrotoms in Schichten von vier µm

Dicke geschnitten, die auf einen Objektträger aufgezogen und bei 37 Grad Celsius

über Nacht getrocknet wurden. Anschließend entparaffinierte man die Abschnitte

in einer absteigenden Alkoholreihe mit wiederholten Lagerungen in 100%igem

Xylol, 100%igem Isopropanol, 96%ig vergälltem Ethanol, 70%ig vergälltem

Ethanol und schließlich destilliertem Wasser.

Danach schlossen sich verschiedene histologische Spezialfärbungen zur besseren

Kontrastierung des Gewebes an. Um eingelagertes Eisen spezifisch nachweisen zu

können wurde eine Berliner-Blau-Färbung durchgeführt, bei der die Objektträger

für 30 Minuten in einer Lösung mit Kaliumhexacyanoferrat und Salzsäure im

Mischverhältnis 1:1 inkubiert wurden. [38] Die ablaufende Reaktion lässt sich

folgendermaßen durch eine chemische Formel beschreibe: [62]

4FeCl3 + 3K4Fe(CN)6 Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl

Dreiwertiges Eisen präsentiert sich dabei als blaues Pigment, während die übrigen

Strukturen rot angefärbt werden. [40]

Nach Waschen mit destilliertem Wasser führte man eine Diaminobenzidin

(=DAB)-Färbung mittels eines Substrat-Kits, welches für zehn Minuten auf die

Arterienstücke gegeben wurde, durch. Dieses immunhistochemische Verfahren

30

beruht auf der Oxidation des DAB durch die gewebeständige

Meerrettichperoxidase, wodurch sich ein Präzipitat mit brauner Farbe bildet, und

dient dem Zweck, die Intensität der Farbreaktion für Eisen zu erhöhen. [63]

Als letzte Färbemethode wurde eine Kernechtrot-Färbung ausgeführt. Nach

Waschen der Objektträger mit destilliertem Wasser und fünfminütiger

Inkubationszeit in der Lösung mit Kernechtrot koloriert man hierbei zur besseren

Differenzierung des Gewebes die vorhandenen Zellkerne in der Farbe Rot. [33,

61]

Schließlich wurden die histologisch bearbeiteten Arterienstücke erneut mit

destilliertem Wasser ausgewaschen, in einer aufsteigenden Alkoholreihe

dehydriert und nach ausreichender Trocknungszeit im Wärmeschrank bei 60°C

zur weiteren lichtmikroskopischen Betrachtung mit Aquatex® Eindeckmittel

fixiert.

4.11 Statistik

Alle in dieser Arbeit aufgeführten Diagramme wurden mit Microsoft Excel in den

Versionen 2007 beziehungsweise 1997 erstellt.

Zur Analyse der MRX-Messungen wurden verschiedene statistische Tests unter

Zuhilfenahme des Programmes PASW 18.0 durchgeführt. Zum

nichtparametrischen Vergleich zweier unabhängiger Stichproben, deren Daten

nicht an die Normalverteilungsvoraussetzung geknüpft sein müssen, wandte man

den U-Test nach Mann-Whitney-Wilcoxon an. Dieser basiert auf einer

gemeinsamen Rangreihe der Werte beider Stichproben, wobei das Ergebnis bei

einem p-Wert von ≤0,05 als signifikant betrachtet wird.[23, 26, 55]

Um mehr als zwei unabhängige Stichproben miteinander vergleichen zu können

führte man den H-Test nach Kruskal und Wallis durch, der eine Ausweitung des

U-Testes darstellt und ebenfalls auf einer gemeinsamen Rangreihe der Werte

31

beider Stichproben beruht. Auch bei diesem Test nimmt man signifikante

Unterschiede bei einem p-Wert von ≤0,05 an. [26]

Zum Vergleich zweier Mittelwerte wurde der Zwei-Stichproben t-Test

durchgeführt, der bei Gültigkeit der Normalverteilungsannahme durch

Berechnung einer Prüfgröße aus den Daten eine Analyse des zweiseitig

formulierten Testproblems liefert. Statistisch signifikante Unterschiede ergeben

sich hierbei bei einem p-Wert von ≤0,05. [65]

32

5. Ergebnisse

5.1 Beobachtungen während der Versuche

Insgesamt wurden in der vorliegenden Versuchsreihe 62 Experimente mit Arterien

durchgeführt. Davon entfielen, neben einer Negativkontrolle, 29 Versuche auf

Arterien, bei denen filtrierte Nanopartikel eingesetzt wurden und die nach

Applikation dieser Partikel gespült wurden. 32 Arterien wurden unter

Verwendung unfiltrierter Partikel und ohne abschließende Spülung ausgeführt.

Tabelle 4 gibt einen genauen Überblick über die durchgeführten Versuche und die

Anzahl an Experimenten je Versuchsanordnung.

Tabelle 4: Übersicht über die durchgeführten Versuche und Anzahl der Experimente je

Versuchsanordnung.

Magnetische Feldstärke

0T/m 10T/m 16T/m

Ungespülte

Arterien mit

unfiltrierten

Partikeln

5 13 14

Gespülte

Arterien mit

filtrierten

Partikeln

5 12 12

33

Die Konstruktionsweise des Arterienmodelles ermöglicht es, schon während der

Applikation der magnetischen Nanopartikel Untersuchungen über deren

Anreicherungsverhalten anzustellen. So konnte man unter Einwirkung des

externen Magnetfeldes, neben dem reinen Fluss der Partikel durch die Arterie,

bereits makroskopisch eine Anreicherung der schwarz gefärbten Ferrofluide im

Inneren der Arterie beobachten. Die meisten Partikel lagerten sich dabei direkt

unter der Polschuhspitze des Magneten an. Außerhalb der Arterie waren visuell

keine Partikel sichtbar.

Außerdem war es möglich, die Anziehung der Nanopartikel in Anwesenheit des

Magnetfeldes zu veranschaulichen. Wie in Abbildung 11 gezeigt, lagerten sich die

Ferrofluide durch die Einwirkung des Magnetfeldes bevorzugt an der Seite des

Glasgefäßes an, die der Polschuhspitze zugewandt war.

Abbildung 11: Anlagerung der magnetischen Nanopartikel im Glasgefäß während der Versuche

unter Anwesenheit eines externen Magnetfeldes.

34

5.2 Partikelgrößenmessung

Durch die Messung des hydrodynamischen Durchmessers der Partikel mittels

Dynamischer Lichtstreuung war es möglich, die filtrierten sowie die unfiltrierten

Partikelchargen in jeweils drei Größenfraktionen einzuteilen, die in Tabelle 5

aufgeführt sind. Dabei wurde die Auswertung der Partikelgröße stets nach dem

Volumen der Partikel in der jeweiligen Probe durchgeführt.

Nach Analyse der ursprünglichen Messwerte ließ sich feststellen, dass die

Größenfraktion der kleinsten Partikel bei den filtrierten wie auch den unfiltrierten

Chargen am stärksten vertreten war. So wiesen anfänglich 58% der unfiltrierten

Partikel eine Größe von 7,0nm (±6,3nm) und 51,1% der filtrierten Partikel eine

Größe von 10,3nm (±10,9nm) auf. Bei 38,3% der unfiltrierten Partikelchargen

wurde eine Partikelgröße von 30,9nm (±20,7nm) und bei 46,7% der filtrierten

Partikelchargen eine Größe von 40,7nm (±45,9nm) ermittelt. In der

Größenfraktion der größten Partikel ließen sich 3,7% der unfiltrierten Partikel mit

einer Größe von 104,6nm (±118,2nm) sowie 1,8% der filtrierten Partikel mit einer

Größe von 291,1nm (±370,2nm) nachweisen.

Tabelle 5: Mittelwerte der Partikelgrößenmessung der unfiltrierten und filtrierten

Partikelchargen jeweils vor sowie nach Magnetisierung im Arterienflussmodell. Dabei wurden

32 Experimente mit unfiltrierten Partikeln ohne abschließende Spülung der Arterien sowie 29

Experimente mit filtrierten Partikeln und mit abschließender Spülung der Arterien

durchgeführt.

Nanopartikel

Suspensionen

Ursprüngliche

Größe

Größe nach

Magnetisierung

[nm] % [nm] %

Unfiltrierte

Partikel-

chargen

7,0±6,3 58,0 8,27±3,9 2,3

30,9±20,7 38,3 19,3±15,3 15,6

104,6±118,2 3,7 107,0±61,4 82,1

Filtrierte

Partikel-

chargen

10,3±10,9 51,5 21,6±13,7 5,1

40,7±45,9 46,7 120,6±85,12 34

291,1±370,2 1,8 518,5±428,7 60,9

35

Nach der Magnetisierung im Arterienflussmodell kehrte sich die eben

beschriebene Verteilung um. So konnte bei 82,1% der unfiltrierten Partikel eine

mittlere Größe von 107,0nm (±61,4nm) gemessen werden und bei 60,9% der

filtrierten Partikel wurde eine Größe von 518,5nm (±428,7nm) festgestellt.

Es konnte also belegt werden, dass die Magnetisierung die Größe der

nanopartikulären Teilchen erhöht. Dieser Effekt war bei den unfiltrierten

Partikelchargen eindeutiger nachweisbar, da sich hier die relative Verteilung der

Größenfraktionen zugunsten der größeren Partikelchargen veränderte. Allerdings

war die effektive Größenzunahme bei den filtrierten Chargen deutlicher

ausgeprägt, deren maximale Größe sich annähernd verdoppelte.

Die oben beschriebenen Resultate sind in den Abbildungen 12 und 13 an zwei

relevanten Chargen für unfiltrierte und filtrierte Partikel veranschaulicht.

Abbildung 12: Darstellung der Partikelgrößenverteilung vor und nach Magnetisierung an einer

exemplarisch ausgewählten filtrierten Partikelcharge (pink = Ursprüngliche Partikelgröße, blau

= Größe der Partikel nach der Magnetisierung).

36

Abbildung 13: Darstellung der Partikelgrößenverteilung vor und nach Magnetisierung an einer

exemplarisch ausgewählten unfiltrierten Partikelcharge (pink = Ursprüngliche Partikelgröße,

blau = Größe der Partikel nach der Magnetisierung).

37

5.3 Eisenbestimmung

Bei der Bestimmung des Eisengehaltes der magnetischen Nanopartikel ergab sich

für die unfiltrierten Partikelchargen ein durchschnittlicher Eisengehalt von

6,74mg/ml (±3,09mg/ml). Der Mittelwert für die filtrierten Partikelchargen lag bei

4,03mg/ml (±1,19mg/ml). Die Messwerte der Einzelbestimmungen sind der

Tabelle 6 zu entnehmen.

Tabelle 6: Eisengehalt der unfiltrierten und filtrierten Partikelchargen mit Angabe des

Mittelwertes sowie der Standardabweichung.

Eisengehalt der

unfiltrierten Chargen

[mg/ml]

Eisengehalt der

filtrierten Chargen

[mg/ml]

9,54 5,04

9,06 4,53

3,11 4,66

5,25 4,20

4,05

1,72

6,74 (±3,09) 4,03 (±1,19) Mittelwert

(±Stabw)

Vergleicht man nun die beiden Mittelwerte miteinander, so lässt sich feststellen,

dass der Eisengehalt der unfiltrierten Chargen deutlich höher liegt, als der

Eisengehalt der filtrierten Chargen.

38

5.4 Magnetorelaxometrie

5.4.1 Relative Anreicherung in Abhängigkeit von der

Magnetfeldstärke

Die Verteilung des Eisengehaltes in den einzelnen Arteriensegmenten hängt stark

vom jeweils extern angelegten Magnetfeld ab.

So fiel bei der vergleichenden Betrachtung der verschiedenen

Magnetfeldgradienten auf, dass sich bei 0T/m nur eine geringe Anreicherung von

magnetischem Eisenoxid zeigte. Dabei nahmen Arterien, die am Ende des

Versuches filtriert wurden, durchschnittlich 0,01% der ingesamt applizierten

magnetischen Nanopartikel auf. Bei unfiltrierten Arterien lagerten sich

durchschnittlich 0,12% der insgesamt applizierten magnetischen Nanopartikel an.

Mit zunehmendem magnetischem Feldgradienten stieg auch der Gehalt an

magnetischem Eisenoxid in allen Segmenten der Arterien an. Für alle Segmente -

5 bis +5 ergaben sich dabei nach dem H-Test nach Kruskal und Wallis

signifikante Unterschiede zwischen den Feldstärken 0T/m, 10T/m und 16T/m mit

einem p-Wert von jeweils ≤0,05. Verglich man nun die Partikelanreicherung bei

den Feldstärken 10T/m und 16T/m nochmals mithilfe des U-Tests nach Mann-

Whitney-Wilcoxon, so konnte man vor allem in den Segmenten -1, 0 und +1

signifikante Unterschiede mit einem p-Wert von ≤0,05 ausmachen. Bei

Betrachtung der Mittelwerte aller Segmente mithilfe des t-Tests zeigten sich für

ungespülte Arterien mit unfiltrierten Partikeln beim Vergleich der Feldstärken

10T/m und 16T/m sowie der Feldstärken 0T/m und 10T/m statistisch hoch-

signifikante Unterschiede mit einem p-Wert von ≤0,005. Bei Arterien, die am

Ende des Versuches gespült wurden und bei denen filtrierte Partikel zum Einsatz

kamen, konnte man im t-Test bei Vergleich der Feldstärken 0T/m und 10T/m

ebenfalls einen signifikanten Unterschied bei der Anreicherung magnetischer

Nanopartikel mit einem p-Wert von 0,006 nachweisen. Bei Vergleich der

Feldstärken 10T/m und 16T/m ließ sich bei einem p-Wert von 0,08 lediglich ein

Trend feststellen.

39

Abbildung 14 stellt den mittleren Gehalt an magnetischem Eisenoxid bei den drei

verwendeten Magnetfeldstärken für ungespülte Arterien unter Verwendung

unfiltrierter Partikel gegenüber und ermöglicht es, den deutlichen

Konzentrationsunterschied von durchschnittlich 59,0µg Eisenoxid bei 16T/m im

Segment 1 im Vergleich zu durchschnittlich 7,3µg Eisenoxid bei 10T/m im

Segment 1 zu erfassen.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

abs/

µg

Sections

0T/m, unfil, unges

10T/m, unfil, unges

16T/m, unfil, unges

Abbildung 14: Zusammenfassender Vergleich des mittleren Gehaltes an magnetischem

Eisenoxid in den Arteriensegmenten -5 bis +5 bei ungespülten Arterien unter Verwendung

unfiltrierter Partikel mit den Feldstärken 0T/m, 10T/m und 16T/m.

Um den Erfolg der durchgeführten Versuche zu beurteilen, kann man die

tatsächlich erzielte mit der theoretisch maximal möglichen Anreicherung der

magnetischen Nanopartikel in den Segmenten -2 bis +2 vergleichen. Für die 5cm

lange Strecke zwischen den Segmenten -2 bis +2 ergibt sich bei einem

Feststoffgehalt von 7,5mg/ml, unter Abzug des Gehaltes an Mitoxantron

(0,13mg/ml) sowie des Gehaltes an Laurinsäure (3,14mg/ml), eine maximal

mögliche Anreicherung von 4,23mg/ml an magnetischen Nanopartikeln. Zu

bedenken ist dabei, dass im theoretischen Konstrukt der komplette Hohlzylinder

40

mit Nanopartikeln ausgefüllt ist, während im Experiment trotz Anlagerung der

Partikel ein steter Fluss durch das Innere der Arterie herrscht.

Tatsächlich konnten bei ungespülten Arterien mit unfiltrierten Partikeln bei der


Nanopartikel in den Segmenten -2 bis +2 nachgewiesen werden. Bei 10T/m fand

man nur noch durchschnittlich 57,07% aller magnetischen Nanopartikel in den

Segmenten -2 bis +2. Es lässt sich also schlussfolgern, dass in der vorliegenden

Versuchsanordnung eine große Anzahl an magnetischen Nanopartikeln lokal

konzentriert werden kann.

Im Aufnahmeprofil der Arterien zeigt sich ebenso mit steigendem

Magnetfeldgradienten eine stärkere Anreicherung von magnetischem Eisenoxid in

Polschuh-nahen Segmenten. So fand sich bei 16T/m die höchste Konzentration

von magnetischem Eisenoxid vor allem im Arteriensegment mit der Nummer +1.

Ausgehend von diesem Punkt der höchsten Konzentration ließen sich

glockenförmig zu beiden Seiten abfallende Werte für den Gehalt an

magnetischem Eisenoxid in den übrigen Arterienstücken darstellen.

Während dieses Verteilungsmuster bei nahezu allen Arterien mit der Feldstärke

16T/m nachzuweisen war, wichen bei einem Magnetfeldgradienten von 10T/m

einige Arterien ab und zeigten eine größere Streubreite bezüglich des Gehaltes an

magnetischem Eisenoxid. Bei 0T/m war lediglich eine diffuse Anreicherung von

magnetischen Nanopartikeln festzustellen, so dass sich bei dieser Feldstärke keine

gezielte Anreicherung der Partikel in den Polschuh-nahen Arteriensegmenten

beschreiben ließ.

5.4.2 Absolute Anreicherung in Abhängigkeit von der Spülung

der Arterien und der Filtration der Partikel

Beim Vergleich der beiden für die Versuche gewählten Bedingungen konnte man

eindeutig feststellen, dass diejenigen Arterien, bei denen filtrierte Nanopartikel

zur Anwendung kamen und die nach Applikation dieser Partikel gespült wurden,

41

deutlich weniger Aufnahme von Ferrofluiden zeigten, als ungespülte Arterien

unter Verwendung unfiltrierter Nanopartikel.

Es wurde unter der Magnetfeldstärke 16T/m bei gespülten Arterien mit filtrierten

Partikeln eine durchschnittliche Aufnahme von 2,38% aller applizierter

Nanopartikel gemessen, während ungespülte Arterien mit unfiltrierten Partikeln

im Durchschnitt 4,28% der applizierten Nanopartikel aufnahmen.

Die Unterschiede der Partikelanreicherung in Abhängigkeit von der gewählten

Magnetfeldstärke werden in den Abbildungen 15 bis 17 nochmals gezeigt. Dabei

wird klar ersichtlich, dass ungespülte Arterien mit unfiltrierten Partikeln in nahezu

allen untersuchten Segmenten, unabhängig von der eingesetzten Magnetfeldstärke

eine deutlich höhere Aufnahme von magnetischem Eisenoxid aufweisen, als

gespülte Arterien mit filtrierten Partikeln.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

abs/

µg

Sections

0T/m, unfil, unges

0T/m, fil, ges

Abbildung 15: Gegenüberstellung des mittleren Gehaltes an magnetischem Eisenoxid in den

Segmenten -5 bis +5 unter der Magnetfeldstärke 0T/m bei ungespülten Arterien mit

unfiltrierten Nanopartikeln sowie gespülten Arterien mit filtrierten Nanopartikeln. (Es wurden

5 Experimente mit ungespülten Arterien und unfiltrierten Partikeln sowie 5 Experimente mit

gespülten Arterien und filtrierten Partikeln durchgeführt.)

42

0,000

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

30,000

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

abs/

µg

Sections

10T/m, unfil, unges

10T/m, fil, ges






0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

abs/

µg

Sections

16T/m, unfil, unges

16T/m, fil, ges






43

Am deutlichsten wurde dieser Unterschied bei der Magnetfeldstärke 16T/m

ersichtlich. Am Punkt der maximalen Konzentration im Arteriensegment +1

konnte man bei gespülten Arterien mit filtrierten Partikeln eine durchschnittliche

Aufnahme von 8,36µg Eisenoxid messen, während dieser Wert bei den

ungespülten Arterien unter Verwendung unfiltrierter Partikeln mit 59,0µg mehr

als sechsmal so hoch lag.

5.4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse aus den MRX-

Messungen

Um alle Resultate aus den MRX-Messungen nochmals übersichtlich in einer

Grafik darzustellen, sind im Folgenden die Abbildungen 18 und 19 angefügt.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich bei 0T/m sowohl bei gespülten

Arterien mit filtrierten Partikeln, als auch bei ungespülten Arterien mit

unfiltrierten Partikeln annähernd keine Anreicherung von magnetischem

Eisenoxid zeigt und dass mit steigender magnetischer Flussdichte eine verstärkte

Anreicherung von magnetischem Eisenoxid zu beobachten ist. Auch die relative

Anreicherung der Nanopartikel in den Polschuh-nahen Segmenten steigt mit

zunehmendem Magnetfeldgradienten. Überdies verschmälert sich das

Aufnahmeprofil der Arterien mit steigendem Magnetfeldgradienten. Schließlich

lässt sich feststellen, dass ungespülte Arterien mit unfiltrierten Partikeln deutlich

mehr Aufnahme von magnetischem Eisenoxid aufweisen, als gespülte Arterien

mit filtrierten Partikeln.

44

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_a

bs/µ

g

Sections

0T/m, unfil, unges

10T/m, unfil, unges

16T/m, unfil, unges


Eisenoxid in den Arteriensegmenten -5 bis +5 bei ungespülten Arterien unter Verwendung

unfiltrierter Partikel mit den Feldstärken 0T/m, 10T/m und 16T/m.

0

10

20

30

40

50

60

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

abs/

µg

Sections

0T/m, fil, ges

10T/m, fil, ges

16T/m, fil, ges


Eisenoxid in den Arteriensegmenten -5 bis +5 bei gespülten Arterien unter Verwendung

filtrierter Partikel mit den Feldstärken 0T/m, 10T/m und 16T/m.

45

5.5 Histologie

Mittels der angefertigten histologischen Schnitte aus relevanten

Arteriensegmenten war es möglich, die Ablagerung der magnetischen

Nanopartikel im Inneren der Arterie zu visualisieren und somit detaillierte

Informationen über deren Verteilung zu erhalten.

Die histologischen Schnitte zeigten mithilfe der Berliner-Blau-Färbung eine

Ablagerung der Nanopartikel im endoluminalen Bereich der Arterien, wobei

freies Eisen in besonderem Maße in den Arteriensegmenten nachgewiesen werden

konnte, die während der Versuche unter der Polschuhspitze gelegen waren.

Abbildung 20 verdeutlicht die Ablagerung der magnetischen Nanopartikel im

Inneren der Arterie.

Abbildung 20: Histologisches Schnittbild einer Arterie mit Berliner-Blau-Färbung zum Nachweis

von freiem Eisen. Die Pfeile markieren die Ablagerung der magnetischen Nanopartikel im

endoluminalen Bereich der Arterie. 400-fache Vergrößerung.

In einigen Segmenten (Abbildung 21) wurde eine positive Färbereaktion für

Berliner-Blau in Endothelzellen nachgewiesen, so dass von einer intrazellulären

Aufnahme der magnetischen Nanopartikel ausgegangen werden muss.

46

Abbildung 21: Histologisches Schnittbild einer Arterie mit Berliner-Blau-Färbung zum Nachweis

von freiem Eisen. Die Pfeile markieren die intrazelluläre Ablagerung von Eisen in einer

exemplarisch ausgewählten Endothelzelle. 1250-fache Vergrößerung.

In weitergehenden histologischen Untersuchungen konnte überdies eine

Infiltration des arteriellen Gewebes durch magnetische Nanopartikel beobachtet

werden. So fand man bei einem magnetischen Feldgradienten von 16T/m eine

Ablagerung der Nanopartikel im Bereich der Media der Arterienwand.

Untenstehende Abbildung 22 stellt diese Tatsache heraus und macht die

Ablagerung der Nanopartikel im Bereich des Endothels der Arterie sichtbar.

Abbildung 22: Histologisches Schnittbild einer Arterie nach Magnetisation mit einer Feldstärke

von 16T/m im Segment 0 mit Berliner-Blau-Färbung. a) 25-fache Vergrößerung. b) 60-fache

Ausschnittvergrößerung aus Bild a mit Nachweis von freiem Eisen im Bereich der Media der

Arterienwand (weiße Pfeile). c) 200-fache Vergrößerung. Die Pfeile zeigen die Ablagerung der

Ferrofluide im Bereich des Endothels.

47

5.6 Mikro-Computertomografie

Die Technik der µ-CT ermöglichte es, einen detaillierten Gesamtüberblick über

die Anordnung der magnetischen Nanopartikel im Arteriensegment zu erlangen

und somit die dreidimensionale Partikelverteilung darstellen zu können.

Abbildung 23 zeigt eine Serie von Schnittbildern, die mit der µ-CT erzeugt

werden konnten. Die verschiedenen Graustufen repräsentieren unterschiedliche

Dichteverteilungen des Gewebes in der Probe und wurden zur besseren

Kennzeichnung farbcodiert. Dabei konnten außerhalb der Arterie keine

Nanopartikel festgestellt werden. Im Inneren der Arterie zeigte sich jedoch eine

deutliche Anreicherung der Partikel, die sowohl am Endothel, als auch in der

Arterienwand nachweisbar war. Ebenfalls mit erfasst wurde ein Seitenast der

Arterie, in dem sich gleichermaßen eine Akkumulation der Nanopartikel zeigte.

Neben dem reinen Nachweis der Nanopartikel in ihrer Einbettung im

Arterienstück wurde auch eine Subtraktionsbildgebung durchgeführt. Hierbei

wurden übereinstimmende Graustufen der Arterienwand sowie der umliegenden

Gewebe digital entfernt, so dass lediglich die Nanopartikel selbst übrig blieben

und sich daher noch deutlicher in ihrer Verteilung darstellen ließen.

48

Abbildung 23: Serie von µ-CT Schnittbildern des Arteriensegmentes 0, die zur besseren

Kennzeichnung eingefärbt wurden. braun = Gewebe, blau = Nanopartikel. Die Graustufen des

umgebenden Paraffins wurden digital entfernt. a) Äußere frontale Ansicht des Arterienstückes.

b) Longitudinalschnitt des Arteriensegmentes mit Anreicherung der Nanopartikel am Endothel,

in der Arterienwand sowie in einem Seitenast. c) Subtraktionsbildgebung mit alleiniger

Darstellung der magnetischen Nanopartikel.

Überdies fiel bei Betrachtung der Schnittbilder eine inhomogene Verteilung der

magnetischen Nanopartikel innerhalb eines Arteriensegmentes auf. Diese

Tatsache erklärt, dass oftmals kein freies Eisen in den histologischen

Untersuchungen nachgewiesen werden konnte, obwohl durch die quantitative

Messung des Eisengehaltes mittels MRX im entsprechenden Arterienstück eine

hohe Konzentration an magnetischem Eisen-Oxid festgestellt wurde.

Wie das µ-CT in Abbildung 24 zeigt, kann die Partikelverteilung im Arterienstück

sehr inhomogen sein, so dass im angefertigten korrespondierenden histologischen

Schnittbild, trotz insgesamt hoher Konzentration an Eisen im gesamten Segment,

kein freies Eisen nachgewiesen werden konnte. Dadurch wird deutlich, dass die µ-

CT ein wichtiges Instrument zur Bestimmung der qualitativen Partikelverteilung

darstellt und somit als Entscheidungskriterium für die Anfertigung von

histologischen Schnittbildern herangezogen werden kann.

49

Abbildung 24: Bild eines µ-CT und korrepondierendes histologisches Schnittbild. Die Pfeile

markieren die Stelle im Arterienstück, von der das histologische Schnittbild angefertigt wurde.

Trotz insgesamt hohem Eisengehalt im gesamten Arterienstück ist aufgrund der Schnittebene

im histologischen Bild kein freies Eisen nachweisbar.

Um einen Vergleich beider bildgebender Verfahren anführen zu können, sind in

Abbildung 25 die Bilder aus den µ-CT Untersuchungen mit den

korrespondierenden histologischen Schnittbildern aus demselben Arteriensegment

vergleichend gegenübergestellt.

50

Abbildung 25: Vergleichende Gegenüberstellung der Bilder aus dem µ-CT sowie der

korrespondierenden histologischen Schnittbilder aus demselben Arteriensegment -3. a) – c)

Histologische Schnittbilder einer Arterie nach Magnetisation mit 16T/m im Segment -3 mit

Berliner-Blau-Färbung zum Nachweis von freiem Eisen. 25-fache Vergrößerung. Die Pfeile

markieren die Anlagerung von Eisen-Oxid im Inneren der Arterie. d) – f) Korrespondierende µ-

CT Bilder in demselben Arteriensegment. Blau gefärbt zeigt sich die Anreicherung von

Nanopartikeln im Inneren der Arterie. Die Pfeile markieren ein durch eine zu enge Ligatur

nahezu vollständig okkludiertes Endolumen ohne Partikelanreicherung mit konsekutivem

Aufstau von magnetischen Nanopartikeln im davorliegenden Bereich.

Dabei erkennt man, dass diejenigen Bereiche, in denen sich in der µ-CT die

höchste Anreicherung von magnetischen Nanopartikeln gezeigt hatte, mit den

Regionen übereinstimmen, in denen auch in der histologischen Beurteilung die

höchste Konzentration an Ferrofluiden gefunden wurde. Während die µ-CT einen

dreidimensionalen Eindruck der Partikelverteilung liefert, weist die Histologie ein

höheres räumliches Auflösungsvermögen auf.

Überdies fand man am Ende der Bilderserie eine wesentlich geringere

Konzentration an Nanopartikeln, als in den vorangehenden Schnitten. Betrachtet

man die µ-CT Bilder, so fällt dort ein verengtes beziehungsweise nahezu

vollständig okkludiertes Endolumen auf, das ein erhebliches Passagehindernis für

51

die magnetischen Nanopartikel darstellt und somit, durch einen Aufstau der

Partikel vor der Verengung, die in den MRX-Messungen teilweise gefundenen

abweichenden Verteilungsfunktionen im Gehalt an magnetischem Eisenoxid

erklären könnte. In der Histologie ließ sich das verengte Lumen jedoch nur noch

ansatzweise erkennen, da die Verarbeitungsprozesse zur Herstellung des

Schnittbildes eine Entspannung des Gewebes begünstigen. Somit stellt die µ-CT

ein sensitives Verfahren zur Erkennung von Passagehindernissen dar und kann

ergänzend zur Histologie wichtige Informationen über die Verteilung der

magnetischen Nanopartikel im Arteriensegment liefern.

52

6. Diskussion

6.1 Partikelanreicherung in Abhängigkeit

von der Größe der Partikel

Eine eingangs aufgestellte Arbeitshypothese, dass sich zwischen den verwendeten

Partikelgrößen Unterschiede in der Anreicherung der Nanopartikel zeigen, kann

validiert werden. So lässt sich feststellen, dass ungespülte Arterien mit

unfiltrierten Partikeln deutlich mehr Aufnahme von magnetischem Eisenoxid

aufweisen, als gespülte Arterien mit filtrierten Partikeln, was überwiegend durch

Unterschiede in der Partikelgröße zu erklären ist.

Der vorliegende Versuchsaufbau vermag dabei allerdings nicht zu unterscheiden,

ob die höhere Aufnahme von magnetischem Eisenoxid in ungespülten Arterien

mit unfiltrierten Partikeln tatsächlich nur von der unterschiedlichen Größe der

Nanopartikel abhängt oder ob das Ergebnis nicht vielmehr hauptsächlich durch

die fehlende Spülung am Ende des Versuches zu erklären ist. Es ist daher eine

weiterführende getrennte Untersuchung dieser beiden Faktoren nötig, um

festzustellen, ob die Spülung oder die Filtration entscheidend für die

Anreicherung der magnetischen Nanopartikel ist.

Um die Ablagerung magnetischer Nanopartikel nachvollziehen zu können, ist es

entscheidend, die Kräfte, die auf ein Teilchen im Inneren einer Arterie wirken, zu

beurteilen. Die Hydrodynamische Kraft, die durch die Druckdifferenz der

peristaltischen Pumpe erzeugt wird, bestimmt die Fließgeschwindigkeit der

Partikel. Die Magnetische Kraft, die durch den extern angelegten

Magnetfeldgradienten bestimmt wird, wirkt in Richtung des größten Gradienten.

Somit stellen die Strömungsgeschwindigkeit und das Magnetfeld die vorrangigen

Einflussgrößen auf die Partikelanreicherung dar. Diese Einflussgrößen sind jedoch

abhängig vom Durchmesser der Nanopartikel. [36, 66]

53

Somit ergeben sich drei grundlegende Modelle bei der Anreicherung der

magnetischen Nanopartikel im Inneren einer Arterie. Zum einen kann die

Magnetische Kraft dominieren und den Transport der Nanopartikel unabhängig

von der Strömungsgeschwindigkeit kontrollieren. Andererseits kann die

Strömungsgeschwindigkeit so stark sein, dass sie die Nanopartikel aus dem

Inneren der Arterie auswäscht, bevor diese durch das Magnetfeld angezogen

werden können. Schließlich kann es zur Bildung einer Grenzschicht kommen,

wenn die Hydrodynamische und die Magnetische Kraft äquivalent sind. Dabei

formieren sich die Nanopartikel entweder entlang der Gefäßwand, wo die

Strömungsgeschwindigkeit sehr langsam ist, oder treten durch Diffusion in das

umliegende Gewebe ein. [53]

Es konnte desweiteren belegt werden, dass die Magnetisierung die Größe der

nanopartikulären Teilchen erhöht. Dabei ist davon auszugehen, dass sich die

magnetischen Nanopartikel durch den Verlust der kolloidalen Stabilität in

Anwesenheit des physiologischen BSA-Puffers zu größeren Agglomeraten

formieren. Ursächlich für diese Anziehung ist die Wirkung der magnetischen

Kraft sowie die elektromagnetische Anziehungskraft. Größere Aggregate könnten

sich außerdem durch Schäden an der äußeren stabilisierenden Hülle der

Nanopartikel bilden, die typischerweise bei älteren Chargen auftreten. Als

sensitiver Indikator für die Stabilität der Ferrofluide kann dabei die MRX dienen,

die es durch den Vergleich der Relaxationskurven verschiedener Partikelchargen

ermöglicht, instabile Nanopartikel zu erkennen. [30, 42] Ob die gebildeten

Agglomerate irreversibel sind oder ob sie lediglich kurzzeitig existieren und sich

wieder auflösen muss durch zusätzliche Analysen, beispielsweise durch

nachfolgende Partikelgrößenmessungen, erforscht werden.

Das in den gegenwärtigen Versuchsreihen angewandte Arterienmodell ist gut

geeignet, um die Anreicherung der magnetischen Nanopartikel unter

verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Es stellt ein einfaches Flussmodell

dar, mit Hilfe dessen sich grundlegende physikalische Vorgänge bei dem Konzept

des MDT verstehen lassen. Durch die Möglichkeit, verschiedene Einflussgrößen

der Partikelanreicherung, beispielsweise den Magnetfeldgradient, die Größe der

54

magnetischen Nanopartikel, aber auch deren Konzentration, zu variieren, ergeben

sich eine Vielzahl möglicher Experimente mit unterschiedlicher Zielsetzung.

Die Grenzen dieses einfachen Flussmodelles zeigen sich jedoch mit zunehmender

Komplexität der Vaskularisierung. Da das Arterienmodell auf lediglich einer

linearen Flussrichtung basiert, können die Gegebenheiten in dem weit

verzweigten Kapillarsystem eines Tumors nicht in ausreichendem Maße

untersucht werden und lassen sich daher nur schwer auf komplexe Systeme

übertragen. Gitter et al. erweitern das Arterienmodell bereits um eine

Verzweigung und analysieren die daraus resultierende Veränderung in der

Anreicherung magnetischer Nanopartikel. [35] Dennoch sind vor der Anwendung

beim Menschen noch weitergehende Untersuchungen mit komplexeren

Flussmodellen nötig, um die vielfältigen Einflussfaktoren auf die Anlagerung der

magnetischen Nanopartikel noch besser verstehen und eine ausreichende

Sicherheit in der Anwendung des MDT gewährleisten zu können.

Trotz dieser Einschränkungen lassen sich aus dem Arterienmodell in

Zusammenschau mit der MRX, der µ-CT und der Histologie wichtige

Erkenntnisse über die räumliche sowie die quantitative Anordnung der

magnetischen Nanopartikel innerhalb der Arterie gewinnen. Die Sensitivität und

Eignung aller angewandten Methoden wurde bereits vielfach unter Beweis

gestellt. [60, 68]

Während die MRX vor allem die Verteilung der Nanopartikel in einem

Arteriensegment erfasst und die Quantifizierung des Gehaltes an magnetischem

Eisenoxid bis auf den µg Bereich genau ermöglicht, visualisieren die µ-CT und

die Histologie die räumliche Verteilung der Nanopartikel. Die µ-CT bietet

besonders die Möglichkeit die dreidimensionale Partikelverteilung in einem

kompletten Arteriensegment auf nichtinvasive Weise darzustellen. Der Vorteil der

Histologie liegt vor allem in ihrem ausgezeichneten Auflösungsvermögen und

ermöglicht damit die Beurteilung der Partikelverteilung auf zellulärer Ebene. Alle

Techniken ergänzen einander und schaffen so die Möglichkeit, die Anordnung der

Nanopartikel auf verschiedensten Ebenen zu untersuchen.

55

6.2 Partikelanreicherung in Abhängigkeit

vom Magnetfeldgradienten

Zwischen den einzelnen Magnetfeldgradienten 0T/m, 10T/m und 16T/m zeigen

sich Unterschiede in der Anreicherung der magnetischen Nanopartikel, womit

auch die zweite dieser Arbeit zugrunde liegende Hypothese bestätigt werden kann.

So kann man durch die MRX-Messungen unter Beweis stellen, dass sich bei 0T/m

annähernd keine Anreicherung von magnetischem Eisenoxid zeigt und dass mit

steigender magnetischer Flussdichte eine verstärkte Anreicherung von

magnetischem Eisenoxid zu beobachten ist. Überdies zeigt sich im

Aufnahmeprofil der Arterien mit steigendem Magnetfeldgradienten eine stärkere

Anreicherung von magnetischem Eisenoxid in Polschuh-nahen Segmenten.

Diese Ergebnisse belegen die Tatsache, dass die Anreicherung der Nanopartikel

im Inneren der Arterie entscheidend von der Stärke des extern angelegten

Magnetfeldes abhängt, durch das die Partikel aus ihrer Flussrichtung abgelenkt

und am Endothel der Arterie angelagert werden. Die Anreicherung der Ferrofluide

wird jedoch nicht ausschließlich von der Magnetischen Kraft bestimmt. Auch die

Hydrodynamische Kraft, welche die Nanopartikel in Flussrichtung ablenkt, trägt

zur Ablagerung der Ferrofluide bei. So würde man die maximale Konzentration

von magnetischen Nanopartikeln theoretisch im Segment 0, welches während der

Versuche direkt unter der Polschuhspitze des Magneten gelegen war, erwarten.

Tatsächlich findet man beispielsweise bei ungespülten Arterien mit unfiltrierten

Partikeln die höchste Konzentration an Nanopartikeln im Segment +1, also um ein

Segment in Flussrichtung verschoben.

Mit steigender magnetischer Flussdichte lassen sich also zum einen absolut

gesehen mehr Nanopartikel im Inneren der Arterie nachweisen. Andererseits

verschmälert sich das Verteilungsprofil, was vor allem durch den höheren Gehalt

an magnetischem Eisenoxid in den Segmenten -2 bis +2 zu erklären ist, die den

Hauptteil der Partikelanreicherung ausmachen.

Tatsächlich können bei ungespülten Arterien mit unfiltrierten Partikeln bei der


Nanopartikel in den Segmenten -2 bis +2 nachgewiesen werden. Da sich also

56

77,02% aller Ferrofluide in unmittelbarer Nähe der Polschuhspitze des Magneten

anlagern, lässt sich schlussfolgern, dass in dieser Versuchsanordnung eine große

Anzahl an magnetischen Nanopartikeln lokal konzentriert werden kann.

Da es zur Vermeidung von Agglomeraten günstig ist, einen möglichst geringen

Magnetfeldgradienten wählen zu können, sind jedoch noch breiter angelegte

Studien zum Auffinden des Schwellenwertes zwischen 10T/m und 16T/m nötig,

ab dem die Partikelanreicherung deutlich ansteigt.

Trotz der insgesamt eindeutigen Unterschiede weisen nicht alle durchgeführten

Arterien vergleichbare Mengen an Nanopartikeln beziehungsweise die

gewünschte Idealverteilung der Partikel über die einzelnen Segmente auf. Diese

Abweichungen lassen sich einerseits durch die Bildung von Stenosen in den

Arterien erklären, die entweder durch Agglomeration der magnetischen

Nanopartikel in Anwesenheit des externen Magnetfeldes oder durch Fehler bei der

Präparation der Arterien, zum Beispiel das zu feste Abbinden eines Seitenastes,

entstehen können. Die Bildung dieser Stenosen kann sowohl in der µ-CT als auch

in der Histologie nachgewiesen werden.

Außerdem ist es denkbar, dass sich bei der Präparation der Arterien geringe

Verschleppungen von magnetischen Nanopartikeln ergeben, die zu einer

Veränderung des Gehaltes an magnetischem Eisenoxid führen können.

Überdies muss die Beschaffenheit der verwendeten Arterien in Betracht gezogen

werden. So bestimmt der Durchmesser der Arterie einerseits die

Fließgeschwindigkeit der Partikel durch die Arterie und auch, durch eine

Erhöhung der Oberfläche, die theoretisch mögliche maximale Anreicherung von

magnetischen Nanopartikeln. Daher bringt eine Veränderung des Durchmessers

unter Umständen enorme Abweichungen im Gehalt und in der Verteilung von

magnetischem Eisenoxid mit sich.

Schließlich muss bedacht werden, dass die magnetischen Nanopartikel ihre

Eigenschaften während des Versuches durch den Kontakt mit Wasser und die

daraus resultierende Bildung einer Hydrathülle um die Partikel verändern können.

So wird beschrieben, dass die magnetische Oberfläche der Partikel mit dem

57

umliegenden Wasser in erster Lage vor allem mit den dissoziierten Derivaten des

Wassers, also H3O+ und OH

-, interagiert und dabei möglicherweise auch reaktive

Sauerstoff- beziehungsweise Hydroxyl-Spezies an der Oberfläche des Eisenoxides

entstehen, die an verschiedenen Reaktionen teilnehmen können. In den weiteren

Schichten lagert sich das Wasser in strikter Lagenstruktur um die Nanopartikel an,

wodurch eine relativ spröde Oberfläche entsteht, die zu einem veränderten

Verhalten der Partikel führen kann. Die Bildung einer hydrophoben Oberfläche

führt außerdem zu einem verlängerten Aufenthalt der magnetischen Nanopartikel

in der Blutzirkulation und erhöht die Wahrscheinlichkeit der Aufnahme ins

Interstitium. [47, 69]

6.3 Ausblick

Um in Zukunft eine effiziente Anwendung des MDT am Menschen gewährleisten

zu können, sind noch eine Vielzahl offener Fragestellungen durch weiterführende

Versuchsreihen zu analysieren und mit den heutigen Erkenntnissen in Einklang zu

bringen.

Die Biokompatibilität magnetischer Nanopartikel wurde bereits in vielen Studien,

unter anderem in einer Phase I Studie an 14 Patienten, unter Beweis gestellt und

es wurde nachgewiesen, dass Ferrofluide keine Toxizität im Organismus entfalten,

sondern in der Leber metabolisiert und zur Hämoglobinsynthese genutzt werden.

[10, 15, 18]

Um die Anwendung zu optimieren muss jedoch die Bioverfügbarkeit der

Nanopartikel noch weiter erhöht werden. Außerdem benötigt man ein System zur

individuellen Dosisbestimmung, das sich beispielweise am Tumorgefäßvolumen

orientieren könnte. MDT bietet dabei die Möglichkeit, mit Applikation einer

geringeren systemischen Dosis bessere Ergebnisse als eine herkömmliche

Chemotherapie zu erzielen, wovon insbesondere Patienten mit schlechter

Konstitution profitieren. So konnte in tierexperimentellen Studien gezeigt werden,

dass die intraarterielle Gabe von lediglich 20% der normalen systemischen Dosis

58

von Mitoxantron zu einer kompletten und permanenten Tumorremission ohne

negative systemische Auswirkungen führt. [11, 14]

Eine noch zu lösende Aufgabe für den klinischen Einsatz stellt die mögliche

intravasale Thrombenbildung nach MDT dar. Als Verursacher sind dafür zwei

grundlegende Mechanismen denkbar. Zum einen setzt die Oberfläche der

Partikelsuspensionen die Gerinnungskaskade in Gang und aktiviert damit direkt

das thrombotische System. Andererseits kann es durch Instabilität der Lösungen

in Interaktion mit dem äußeren Magnetfeld zur Bildung größerer

Partikelagglomerate kommen, die zu einem Verschluss der proximal gelegenen

Kapillaren führen könnten. Diese Beobachtungen basieren allerdings auf einem

ex-vivo-Modell, welches die realen Gegebenheiten im Blutgefäßsystem des

Menschen nicht vollständig wiedergeben kann, und können damit nicht ohne

weitere Überprüfung auf die klinische Anwendung beim Menschen übertragen

werden. [42]

Schließlich müssen die externen Magnetfelder entsprechend stark gewählt

werden, um auch tiefer im Körper gelegene Strukturen wirkungsvoll erreichen zu

können. [11]

Um diese Fragestellungen ausreichend beantworten zu können, sind genauere

Untersuchungen der einzelnen Einflussgrößen nötig. Beispielsweise ist es

entscheidend zu analysieren, welchen Einfluss die Strömungsgeschwindigkeit

oder das Vorhandensein von Verzweigungen im Modell auf die Anreicherung der

Nanopartikel hat und ob und in welcher Weise eine Viskositätsabhängigkeit

besteht. Auch durch die Beobachtung der Partikelanreicherung in den

verschiedenen Medien Serum, Plasma sowie in unterschiedlichen Pufferlösungen

lassen sich wichtige Erkenntnisse für das MDT gewinnen.

Doch trotz umfassender Untersuchungen stellt die breite Anwendung einer

Technik in Lebewesen stets einen großen Unterschied zur Testung unter

kontrollierten Laborbedingungen dar. Denn selbst das komplexeste in-vitro

Modell kann die tatsächlichen Gegebenheiten in vivo nicht ausreichend

wiedergeben. Hierbei ist es entscheidend, die bereits durchgeführten Tierversuche

59

noch weiter fortzuführen, um die daraus gewonnenen vielversprechenden

Erkenntnisse in naher Zukunft auch auf den Menschen übertragen zu können.

60

7. Literaturverzeichnis

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67

8. Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

CT Computertomografie

DAB Diaminobenzidin

in vivo im Lebenden

MDT Magnetisches Drug Targeting

MPS Mononukleäres

phagozytierendes System

MRX Magnetorelaxometrie

pH pondus hydrogenii

68

9. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Jährliche Neuerkrankungs- und Sterbefälle sowie

altersstandardisierte Neuerkrankungs- und Sterberaten

(Europastandard) nach Geschlecht, Deutschland 1980 – 2004. (Robert

Koch Institut (2010) Krebs in Deutschland 2005/2006 – Häufigkeiten

und Trends: 156-164.) ............................................................................................. 8

Abbildung 2: Schematischer Aufbau eines Ferrofluides mit

Darstellung der ionischen Bindung an Mitoxantron. (Second Else

Kröner-Fresenius-Symposium: Nanomedicine – Basic and Clinical

Application in Diagnostics and Therapy. Universitätsklinikum

Erlangen, 3.-5. September 2010.) .......................................................................... 17

Abbildung 3: Apparatur zur Abschätzung des magnetischen Moments

der Nanopartikel. ................................................................................................... 18

Abbildung 4: Schematische Zeichnung des Arterien-Flussmodells.

(Lyer, S. (2009): Distribution of Magnetic Nanoparticles after

Magnetic Drug Targeting in an Ex Vivo Bovine Artery Model.

IFMBE Proceedings 25/VII: 484-487.) ................................................................. 20

Abbildung 5: Abhängigkeit der magnetischen Feldstärke von der

Entfernung zur Polschuhspitze eines Elektromagneten. ....................................... 21

Abbildung 6: Fotografische Darstellung des Arterien-Flussmodells. ................... 22

Abbildung 7: Ausschnittvergrößerung aus Abbildung 6 zur genaueren

Darstellung des Glasgefäßes mit innenliegender Arterie. ..................................... 22

Abbildung 8: Schematische Zeichnung des Arterienflussmodells. Die

Arterie wird in 11 Segmente zu je 1cm Länge geschnitten und nach

obenstehendem Schema nummeriert. i= Abstand von der

Polschuhspitze zur Außenwand der fokussierten Arterie. (Tietze R.,

Rahn H., Lyer S., Schreiber E., Mann J., Odenbach S., Alexiou C.

(2011): Visualization of superparamagnetic nanoparticles in vascular

tissue using XµCT and histology. Histochemistry and Cell Biology.

135: 153-158.) ....................................................................................................... 23

Abbildung 9: Beispielhafte Darstellung von Relaxationskurven der

SQUID-Messung. (Richter H., Wiekhorst F., Schwarz K., Lyer S.,

Tietze R., Alexiou C., Trahms L. (2009): Magnetorelaxometric

69

quantification of magnetic nanoparticles in an artery model after ex

vivo magnetic drug targeting. Physics in Medicine and Biology 54:

N417-N424.) .......................................................................................................... 26

Abbildung 10: Grundlegender Aufbau eines µ-CT Gerätes. (Rahn H.,

Gomez-Morilla I., Jurgons R., Alexiou C., Eberbeck D., Odenbach S.

(2009): Tomografic examination of nanoparticles used as drug

carriers. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 321: 1517-

1520.) ..................................................................................................................... 28

Abbildung 11: Anlagerung der magnetischen Nanopartikel im

Glasgefäß während der Versuche unter Anwesenheit eines externen

Magnetfeldes. ........................................................................................................ 33

Abbildung 12: Darstellung der Partikelgrößenverteilung vor und nach

Magnetisierung an einer exemplarisch ausgewählten filtrierten

Partikelcharge (pink = Ursprüngliche Partikelgröße, blau = Größe der

Partikel nach der Magnetisierung)......................................................................... 35

Abbildung 13: Darstellung der Partikelgrößenverteilung vor und nach

Magnetisierung an einer exemplarisch ausgewählten unfiltrierten

Partikelcharge (pink = Ursprüngliche Partikelgröße, blau = Größe der

Partikel nach der Magnetisierung)......................................................................... 36

Abbildung 14: Zusammenfassender Vergleich des mittleren Gehaltes

an magnetischem Eisenoxid in den Arteriensegmenten -5 bis +5 bei

ungespülten Arterien unter Verwendung unfiltrierter Partikel mit den

Feldstärken 0T/m, 10T/m und 16T/m. .................................................................. 39

Abbildung 15: Gegenüberstellung des mittleren Gehaltes an

magnetischem Eisenoxid in den Segmenten -5 bis +5 unter der

Magnetfeldstärke 0T/m bei ungespülten Arterien mit unfiltrierten

Nanopartikeln sowie gespülten Arterien mit filtrierten Nanopartikeln.

(Es wurden 5 Experimente mit ungespülten Arterien und unfiltrierten

Partikeln sowie 5 Experimente mit gespülten Arterien und filtrierten

Partikeln durchgeführt.) ......................................................................................... 41








70










ungespülten Arterien unter Verwendung unfiltrierter Partikel mit den




gespülten Arterien unter Verwendung filtrierter Partikel mit den


Abbildung 20: Histologisches Schnittbild einer Arterie mit Berliner-

Blau-Färbung zum Nachweis von freiem Eisen. Die Pfeile markieren

die Ablagerung der magnetischen Nanopartikel im endoluminalen

Bereich der Arterie. 400-fache Vergrößerung. ...................................................... 45

Abbildung 21: Histologisches Schnittbild einer Arterie mit Berliner-

Blau-Färbung zum Nachweis von freiem Eisen. Die Pfeile markieren

die intrazelluläre Ablagerung von Eisen in einer exemplarisch

ausgewählten Endothelzelle. 1250-fache Vergrößerung. ...................................... 46

Abbildung 22: Histologisches Schnittbild einer Arterie nach

Magnetisation mit einer Feldstärke von 16T/m im Segment 0 mit

Berliner-Blau-Färbung. a) 25-fache Vergrößerung. b) 60-fache

Ausschnittvergrößerung aus Bild a mit Nachweis von freiem Eisen im

Bereich der Media der Arterienwand (weiße Pfeile). c) 200-fache

Vergrößerung. Die Pfeile zeigen die Ablagerung der Ferrofluide im

Bereich des Endothels. .......................................................................................... 46

Abbildung 23: Serie von µ-CT Schnittbildern des Arteriensegmentes

0, die zur besseren Kennzeichnung eingefärbt wurden. braun =

Gewebe, blau = Nanopartikel. Die Graustufen des umgebenden

Paraffins wurden digital entfernt. a) Äußere frontale Ansicht des

Arterienstückes. b) Longitudinalschnitt des Arteriensegmentes mit

Anreicherung der Nanopartikel am Endothel, in der Arterienwand

sowie in einem Seitenast. c) Subtraktionsbildgebung mit alleiniger

Darstellung der magnetischen Nanopartikel. ........................................................ 48

71

Abbildung 24: Bild eines µ-CT und korrepondierendes histologisches

Schnittbild. Die Pfeile markieren die Stelle im Arterienstück, von der

das histologische Schnittbild angefertigt wurde. Trotz insgesamt

hohem Eisengehalt im gesamten Arterienstück ist aufgrund der

Schnittebene im histologischen Bild kein freies Eisen nachweisbar..................... 49

Abbildung 25: Vergleichende Gegenüberstellung der Bilder aus dem

µ-CT sowie der korrespondierenden histologischen Schnittbilder aus

demselben Arteriensegment -3. a) – c) Histologische Schnittbilder

einer Arterie nach Magnetisation mit 16T/m im Segment -3 mit

Berliner-Blau-Färbung zum Nachweis von freiem Eisen. 25-fache

Vergrößerung. Die Pfeile markieren die Anlagerung von Eisen-Oxid

im Inneren der Arterie. d) – f) Korrespondierende µ-CT Bilder in

demselben Arteriensegment. Blau gefärbt zeigt sich die Anreicherung

von Nanopartikeln im Inneren der Arterie. Die Pfeile markieren ein

durch eine zu enge Ligatur nahezu vollständig okkludiertes

Endolumen ohne Partikelanreicherung mit konsekutivem Aufstau von

magnetischen Nanopartikeln im davorliegenden Bereich. .................................... 50

72

10. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Auflistung aller für die Versuchsreihen verwendeten

Chemikalien und Stoffe mit Herstellern. ............................................................... 12

Tabelle 2: Auflistung aller für die Versuchsreihen verwendeten

Messgeräte mit Herstellern. ................................................................................... 15

Tabelle 3: Mittelwerte der Partikelgrößenmessung filtrierter und

unfiltrierter Chargen mit Standardabweichung. .................................................... 19

Tabelle 4: Übersicht über die durchgeführten Versuche und Anzahl

der Experimente je Versuchsanordnung. ............................................................... 32

Tabelle 5: Mittelwerte der Partikelgrößenmessung der unfiltrierten

und filtrierten Partikelchargen jeweils vor sowie nach Magnetisierung

im Arterienflussmodell. Dabei wurden 32 Experimente mit

unfiltrierten Partikeln ohne abschließende Spülung der Arterien sowie

29 Experimente mit filtrierten Partikeln und mit abschließender

Spülung der Arterien durchgeführt. ....................................................................... 34

Tabelle 6: Eisengehalt der unfiltrierten und filtrierten Partikelchargen

mit Angabe des Mittelwertes sowie der Standardabweichung. ............................. 37

73

11. Anhang

11.1 Arterienübersicht

Arterien-

nummerVersuch Spezifikation

Ferrofluid-

Charge

Wässern

1

Wässern

2

Ethanol

70%

Ethanol

90%

Isopropa

nolXylol 1 Xylol 2 Paraffin Partikelgröße Partikel-Charge

Eisengehalt

ChargeMRX µCT

Histol.

Auswertun

gRAB 0B1 19.08.2009 Negativkontrolle entfällt x x x x x x x x entfällt entfällt entfällt RAB0B1

RAB 001 19.08.2009 0A, filtriert, gespült Charge 1 x x x x x x x x Rückstand: 15,3% mit 193,5nm / 84,7% mit 795nmunfiltriert: 100% mit 19,8nm

filtriert: 100% mit 26,3nm5,04 mg/ml RAB001 x

RAB 002 20.08.2009 0A, filtriert, gespült Charge 1 x x x x x x x x

Rückstand: 16,3% mit 170,4nm / 83,7% mit 861,3nm

Überstand: 3,8% mit 100nm / 6,4% mit 401,8nm /

89,8% mit 3342,8nm

RAB002 x


Rückstand: 5,4% mit 61,3nm / 10,6% mit 303,4nm /

84% mit 1210,2nm

Überstand: 99,9% mit 5,3nm / 0,1% it 634nm

unfiltriert: 72,1% mit 74,1nm / 27,9%

mit 188,2nm

filtriert: 60% mit 26,8nm / 36,8% mit

133,4nm / 3,2% mit 552,9nm

4,53 mg/ml RAB003 x


Rückstand: 14,1% mit 216,6nm / 58,9% mit 990nm

Überstand: 7% mit 86nm / 2,7% mit 317,3nm / 90,4%

mit 1414,6nm

RAB004 x

RAB 005 27.08.2009 0A, filtriert, gespült Charge 2 x x x x x x x xRückstand: 18,8% mit 135,7nm / 81,2% mit 634nm

Überstand: 22,2% mit 94,3nm / 77,8% mit 631,2nm RAB005 x

RAB 006 02.09.2009 72A, filtriert, gespült Charge 3 x x x x x x x x Rückstand: 100% mit 21,7nm


mit 20,2nm

filtriert: 62,2% mit 1,1nm / 29,8% mit

13,1nm / 8% mit 29,3nm

4,66 mg/ml RAB006 x

RAB 007 03.09.2009 72A, filtriert, gespült Charge 3 x x x x x x x xRückstand: 9,8% mit 11,2nm / 8,8% mit 43,3nm /

81,4% mit 242,4nmRAB007 x

RA 008 07.09.2009 36A, unfiltriert, ungespült Charge 4 x x x x x x x x Rückstand: 21,1% mit 20,4nm / 78,9% mit 103,2nmunfiltriert: 62,8% mit 7nm / 37,2% mit

29,5nm9,54 mg/ml RA008 x

RA 009 08.09.2009 36A, unfiltriert, ungespült Charge 4 x x x x x x x x Rückstand: 10,2% mit 22,7nm / 89,8% mit 95,8nm RA009 x

74

RA 010 09.09.2009 36A, unfiltriert, ungespült Charge 4 x x x x x x x x Rückstand: 28,2% mit 15,2nm / 71,8% mit 92,4nm RA010 x x

RA 011 15.09.2009 36A, unfiltriert, ungespült Charge 4 x x x x x x x x Rückstand: 17,1% mit 18nm / 82,9% mit 120nm RA011 x x




RA 015 22.09.2009 0A, unfiltriert, ungespült Charge 4 x x x x x x x xRückstand: 97,9% mit 0,6nm / 0,3% mit 18,1nm /

1,7% mit 58,4nmRA015 x


1,6% mit 215nmRA016 x

RAB 008 24.09.2009 72A, filtriert, gespült Charge 5 x x x x x x x xRückstand: 99% mit 0,5nm / 0,1% mit 38,3nm / 0,9%

mit 204,4nm


mit 27,4 nm


23,9nm

4,20 mg/ml RAB008 x



Überstand: 96,8% mit 0,8nm / 2,9% mit 2,3nm / 0,4%

mit 27,3nm

RAB009 x x

RAB 010 29.09.2009 72A, filtriert, gespült Charge 5 x x x x x x x xRückstand: 6,1% mit 34,6nm / 93,9% mit 348,5nm

Überstand: 24,3% mit 21,3nm / 75,7% mit 82,8nmRAB010 x

RAB 011 05.10.2009 72A, filtriert, gespült Charge 5x

(11 Tage!)x x x x x x x



mit 192,9nm

RAB011 x

RAB 012 06.10.2009 72A, filtriert, gespült Charge 5x

(11 Tage!)x x x x x x x

Rückstand: 44,8% mit 2nm / 14,1% mit 38,4nm /

41,1% mit 208nm

Überstand: 99,1%mit 1,1nm / 0,3% mit 15,3nm /

RAB012 x

RAB 013 07.10.2009 72A, filtriert, gespült Charge 5 x x x x x x x xRückstand: 15,3% mit 34nm / 84,7% mit 164,9nm


RAB 014 08.10.2009 72A, filtriert, gespült Charge 5 x x x x x x x x Rückstand: 14,7% mit 22,2nm / 85,3% mit 105,2nm RAB014 x


75,2% mit 80nm

unfiltriert: 99,9% mit 0,8nm/ 0,1% mit

18,5nm9,06 mg/ml RA017 x



RA 020 07.12.2009 72A, unfiltriert, ungespült Charge 6 x x x x x x x x Rückstand: 21,9% mit 14nm / 78,1% mit 89,2nm RA020 x

RA 021 14.12.2009 72A, unfiltriert, ungespült Charge 6 x x x x x x x xRückstand: 8,8% mit 8,7nm / 2,8% mit 8,4nm / 88,4%

mit 80,5nmRA021 x x

75


RA 023 16.03.2010 72A, unfiltriert, ungespült Charge 7 x x x x x x x xRückstand: 23,7% mit 13nm / 5% mit 5,9nm / 71,3%

mit 80,4nm


mit 64,8nm3,11 mg/ml RA023 x

RA 024 17.03.2010 36A, unfiltriert, ungespült Charge 7 x x x x x x x x Rückstand: 100% mit 80,3nm RA024 x



87,4% mit 81,4nmRA026 x



Rückstand: 12,2% mit 14,5nm / 5,7% mit 13nm /

82,1% mit 81,3nm

Überstand: 13,3% mit 14,3nm / 86,7% mit 80,8nm


31,4nm 4,05 mg/ml RAB015 x


Rückstand: 54,4% mit 4nm / 4,1% mit 32,1nm / 41,5%

mit 81,2nm


mit 81,3nm

RAB016 x




Rückstand: 97,4% mit 0,8nm / 0,5% mit 31,1nm / 2,1%

mit 73,7nm

Überstand: 100% mit 4,9nm

RAB018 x


Überstand: 84% mit 0,2nm / 16% mit 80,5nmRAB019 x x

RAB 020 14.04.2010 36A, filtriert, gespült Charge 8 x x x x x x x xRückstand: 41% mit 8,9nm / 59% mit 82,3nm







Rückstand: 100% mit 80,7nm


mit 81,3nm

RAB023 x






mmit 80,6nmRA028 x

76



mit 81,3nm


unfiltriert: 77,7% mit 0,7nm / 20,9% mit

10,1nm / 1,5% mit 21,1nm


16,2nm

1,72 mg/ml x


Überstand: 27,6% mit 14,3nm / 72,4% mit 79,8nmx


Rückstand: 96,6% mit 18nm / 3,4% mit 72,7nm


mit 80,8nm

x



mit 83,9nm


x

RA 029 17.11.2010 72A, unfiltriert, ungespült Charge 10 x x x x x x x x Rückstand: 99,7% mit 20nm / 0,3% mit 61nm 5,25 mg/ml x

RA 030 18.11.2010 72A, unfiltriert, ungespült Charge 10 x x x x x x x xRückstand: 37,2% mit 6,5nm / 2% mit 5,1nm / 60,8% mit

80,5nmx

RA 031 23.11.2010 36A, unfiltriert, ungespült Charge 10 x x x x x x x xRückstand: 92,6% mit 0,7nm / 3,9% mit 8,4nm / 3,5% mit

46,9nmx


mit 82,8nm x

Farbgebung: Aug 09

Sep 09

Okt 2009-Feb 2010

März 2010-Mai 2010

Okt 2010-Dez 2010

77

11.2 Auswertung der Partikelgrößenmessung

Chargen unfiltriert

%1. Fraktion

[nm]%

2. Fraktion

[nm]%

3. Fraktion

[nm]

100 19,8

72,1 74,1 27,9 188,2

59,5 5 40,5 20,2

62,8 7 37,2 29,5

64,5 12,2 35,5 27,4

99,9 0,8 0,1 18,5

99,7 16,3 0,3 48,1

77,7 0,7 20,9 10,1 1,5 21,1

Mittelwert 7 30,9625 104,65

Standardabweichung 6,255557529 20,70320455 118,1575431

Summe 464,1 306,6 29,4

Prozent 58,01 38,32 3,67

Chargen filtriert

%1. Fraktion

[nm]%

2. Fraktion

[nm]%

3. Fraktion

[nm]

100 26,3

60 26,8 36,8 133,4 3,2 552,9

62,2 1,1 29,8 13,1 8 29,3

51,1 6,9 48,9 23,9

81,5 15,6 18,5 31,4

55,2 1,4 44,8 16,2

Mittelwert 10,36 40,71666667 291,1


Summe 310 278,8 11,2

Prozent 51,67 46,47 1,86

78

Rückstand (filtriert, gespült)

% Fraktion 1 [nm] % Fraktion 2 [nm] % Fraktion 3 [nm]

15,3 193,5 84,7 795

16,3 170,4 83,7 861,3

5,4 61,3 10,6 303,4 84 1210,2

14,1 216,6 58,9 990

18,8 135,7 81,2 634

100 21,79,8 11,2 8,8 43,3 81,4 242,4

14,6 27,8 85,4 165,5

6,1 34,6 93,9 348,5

16,6 38,7 83,4 192,9

44,8 2 14,1 38,4 41,1 208

15,3 34 84,7 164,9

14,7 22,2 85,3 105,2

12,2 14,5 5,7 13 82,1 81,3

54,4 4 4,1 32,1 41,5 81,2

26,9 16,5 73,1 100,8

100 80,7

15,5 24,5 84,5 80,7

41 8,9 59 82,3

15,8 29,2 84,2 80,7

24,8 7,3 75,2 80,5

96,6 18 3,4 72,7

21,1 18,2 78,9 91,5

14,8 20,6 85,2 74,7

12,1 16,6 8,5 25,8 79,5 81,3

Mittelwert 21,59 120,575 518,47


Summe 431,8 2893,8 5184,7

Prozent 5,09 34 60,93

* 86,3 1,7 13,7 80,5

* 90,3 0,8 1,9 23,6 7,8 83,9

* 97,4 0,8 0,5 31,1 2,1 73,7

* Messfehler, da die Partikel durch Agglomeration während der Messung (20 Minuten) auf den

Boden der Küvette gesunken sind und somit vom Messgerät nicht detektiert werden konnten.

79

Rückstand (unfiltriert,

ungespült)


21,1 20,4 78,9 103,2

10,2 22,7 89,8 95,8

28,2 15,2 71,8 92,4

17,1 18 82,9 120

15,3 18,1 84,7 158,5

21,4 25,6 78,6 148,1

4,6 25,1 95,4 339,7

23,3 6,7 1,4 6,9 75,2 80

11,4 15,1 88,6 86,5

4,1 11,3 95,9 80,3

21,9 14 78,1 89,2

8,8 8,7 2,8 8,4 88,4 80,5

56,8 5,1 43,2 80,2

5 5,9 23,7 13 71,3 80,4

23,7 14,5 76,3 75,3

10,9 8,4 1,7 18,4 87,4 81,4

16,4 18,1 83,6 99,2

8,5 16,6 4,7 15,8 86,8 80,6

99,7 20 0,3 61

37,2 6,5 2 5,1 60,8 80,5

Mittelwert 8,271428571 19,295 106,9789474


Summe 57,9 385,9 2032,6

Prozent 2,34 15,59 82,07

* 99 0,5 0,1 38,3 0,9 204,4

* 99,5 0,9 0,8 22,3 3,8 82,8

* 92,6 0,7 3,9 8,4 3,5 46,9

* 98,2 0,4 0,2 26,4 1,6 215

* 97,9 0,6 0,3 18,1 1,7 58,4



80

Überstand (filtriert, gespült)


3,8 100 6,4 401,8 98,8 3342,8

7 86 2,7 317,3 90,4 1414,6

22,2 94,3 77,8 631,2

24,3 21,3 75,7 82,2

13,3 14,3 86,7 80,8

5,1 12,6 9,8 23,3 85,1 81,3

26,6 10,5 73,4 74,3

42,4 12,1 57,6 80,8

13,5 17,9 86,5 80,8

24,7 13,3 7,7 13,5 67,6 81,3

19,8 11,3 80,2 80,7

20,2 8,7 79,8 80,6

27,6 14,3 72,4 79,8

11,1 9,8 5,1 9,1 83,8 80,8

38,4 8,6 61,6 63,1

Mittelwert 29 139,9533333 1000,16


Summe 435 2099,3 5000,8

Prozent 5,8 27,8 66,4

* 89,4 3,4 10,6 80,5

* 100 4,9

* 84 0,2 16 80,5

* 95,8 0,6 4,1 2,5 0,1 192,9

* 99,9 5,3 0,1 634

* 99,1 1,1 0,3 15,3 0,6 54,2

* 99,8 0,5 0,2 129,7

* 96,8 0,8 2,9 2,3 0,4 27,3

* 92,3 1,7 7,7 80,4



81

11.3 Auswertung der Eisenbestimmung

08. Aug 11Biochrom Ltd.

13:36:35

Sulfosalicylsaeure Fe

Instrument nanotechnologie

Anwender Schreiber

Datum 01. Sep 09

Zeit 12:29:16

Zubehör 8-fach Küvettenwechsler

Wellenlänge 424 nm

Konzentration µg/ml Absorption

1 3,94 0,392

2 7,88 0,816

3 11,82 1,23

4 15,76 1,641

5 23,64 2,445

Ergebnis [mg/ml]

Charge 1 6,303088803 0,653 5,04

Charge 2 2,268339768 0,235 50ml!! 5,675 4,536

Charge 3 2,326254826 0,241 50ml!! 5,825 4,66

Charge 5 5,250965251 0,544 4,2

y = 0,1036xR² = 0,9998

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30

Ex

tin

kti

on

be

i 4

24

nm

Konzentration (µg/ml]

Eisenbestimmung

Datenreihen1

82


13:38:18

Absorption


Anwender Schreiber

Datum 18. Jan 10

Zeit 16:19:05


Wellenlänge 424 nm


1 3,4921 0,156

2 6,9842 0,307

3 10,4763 0,618

4 13,9684 0,918

5 17,4605 1,222

Ergebnis [mg/ml]

Charge 4 10,9287 0,706 8,74

Charge 6 10,3869 0,671 8,31

y = 0,0646xR² = 0,9499

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 5 10 15 20

Exti

nkti

on

bei

424n

m

Konzentration [µg/ml]

Eisenbestimmung

Datenreihen1

83


13:38:43

Absorption


Anwender Schreiber

Datum 18. Jan 10

Zeit 16:19:05


Wellenlänge 424 nm


1 3,6325 0,124

2 7,265 0,275

3 10,8975 0,569

4 14,53 0,888

5 18,1625 0,752

Ergebnis [mg/ml]

Charge 7 12,4536 0,604 9,96

Charge 8 16,1856 0,785 12,95

y = 0,0485xR² = 0,8518

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 5 10 15 20

Exti

nkti

on

bei

424n

m


Eisenbestimmung

ADk

Linear (ADk)

84


Sulfosalicylsaeure Fe


Anwender Schreiber

Datum 01. Sep 09

Zeit 12:29:16


Wellenlänge 424 nm


1 0,028 0,148

2 0,056 0,291

3 0,113 0,668

4 0,169 0,902

5 0,226 1,202

Ergebnis [mg/ml]

Charge 9 0,71 0,13135 5,254

y = 5,3985xR² = 0,9948

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Exti

nkti

on

bei

424n

m


Eisenbestimmung

85

11.4 Auswertung der MRX-Messungen

ID file preparation N m_abs(μg) Sum m_abs(μg) % of applied

Applied MNP (μg) 16 T/m 171,4 2,7

6300

pumped,

flushed

delta 0,06 0,9

1 F2_rab013002 rab013 -5 0,12 1,9 0,0

2 F3_rab013004 rab013 -4 0,6 9,4 0,1

3 F4_rab013006 rab013 -3 0,24 3,8 0,1

4 F5_rab013008 rab013 -2 1,13 17,7 0,3

5 F6_rab013010 rab013 -1 2,2 34,5 0,5

6 F7_rab013012 rab013 0 4,14 65,0 1,0

7 F8_rab013014 rab013 1 1,64 25,7 0,4

8 F9_rab013016 rab013 2 0,15 2,4 0,0

9 F10_rab013018 rab013 3 0,34 5,3 0,1

10 F11_rab013020 rab013 4 0,18 2,8 0,0

11 F12_rab013022 rab013 5 0,18 2,8 0,0

12 Ref 5

Ref 1:10, 25

ul, immob. 1 15,7

25 μl Ref-> m(Fe) (mg)

0,0157

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

ab

s/u

g

sections

RAB013

Dat…

86

ID file preparation N m_abs(μg) Sum m_abs(μg) % of applied


6300

pumped,

flushed

delta 0,06 0,9

1 F2_rab022002 rab022 -5 0 0,0 0,0

2 F3_rab022004 rab022 -4 0 0,0 0,0

3 F4_rab022006 rab022 -3 0 0,0 0,0

4 F5_rab022008 rab022 -2 0,12 1,9 0,0

5 F6_rab022010 rab022 -1 0,12 1,9 0,0

6 F7_rab022012 rab022 0 0,14 2,2 0,0

7 F8_rab022014 rab022 1 0,13 2,0 0,0

8 F9_rab022016 rab022 2 0,11 1,7 0,0

9 F10_rab022018 rab022 3 0,00 0,0 0,0

10 F11_rab022020 rab022 4 0 0,0 0,0

11 F12_rab022022 rab022 5 0,07 1,1 0,0

12 Ref 8

Ref 1:10, 25

ul, immob. 1 15,7


0,0157

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

ab

s/u

g

sections

RAB022

Dat…

87

ID file preparation N m_abs(μg) Sum m_abs(μg)% of applied


6300 pumped

delta 0,03 0,5

1 F2_ra013002 ra013 -5 0,06 0,9 0,0

2 F3_ra013004 ra013 -4 0,05 0,8 0,0

3 F4_ra013006 ra013 -3 0,04 0,6 0,0

4 F5_ra013008 ra013 -2 0,06 0,9 0,0

5 F6_ra013010 ra013 -1 0 0,0 0,0

6 F7_ra013012 ra013 0 0,1 1,6 0,0

7 F8_ra013014 ra013 1 0,05 0,8 0,0

8 F9_ra013016 ra013 2 0,03 0,5 0,0

9 F10_ra013018 ra013 3 0 0,0 0,0

10 F11_ra013020 ra013 4 0 0,0 0,0

11 F12_ra013022 ra013 5 0,03 0,5 0,0

12 Ref 6

Ref 1:10, 25 ul,

immob. 1 15,7


0,0157

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

ab

s/u

g

sections

RA013

Dat…

88



6300 pumped

delta 0,03 0,5

1 F2_ra019002 ra019 -5 0,15 2,4 0,0

2 F3_ra019004 ra019 -4 0,17 2,7 0,0

3 F4_ra019006 ra019 -3 0,16 2,5 0,0

4 F5_ra019008 ra019 -2 0,24 3,8 0,1

5 F6_ra019010 ra019 -1 3,57 56,0 0,8

6 F7_ra019012 ra019 0 5,8 91,1 1,3

7 F8_ra019014 ra019 1 3,66 57,5 0,8

8 F9_ra019016 ra019 2 0,71 11,1 0,2

9 F10_ra019018 ra019 3 1,22 19,2 0,3

10 F11_ra019020 ra019 4 0,77 12,1 0,2

11 F12_ra019022 ra019 5 0,55 8,6 0,1

12 Ref 6

Ref 1:10, 25

ul, immob. 1 15,7


0,0157

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

ab

s/u

g

sections

RA019

Dat…

89



6300 pumped

delta 0,03 0,5

1 F2_ra026002 ra026 -5 0,03 0,5 0,0

2 F3_ra026004 ra026 -4 0,03 0,5 0,0

3 F4_ra026006 ra026 -3 0 0,0 0,0

4 F5_ra026008 ra026 -2 0,03 0,5 0,0

5 F6_ra026010 ra026 -1 0,15 2,4 0,0

6 F7_ra026012 ra026 0 0,2 3,1 0,0

7 F8_ra026014 ra026 1 0,08 1,3 0,0

8 F9_ra026016 ra026 2 0,04 0,6 0,0

9 F10_ra026018 ra026 3 0,05 0,8 0,0

10 F11_ra026020 ra026 4 0 0,0 0,0

11 F12_ra026022 ra026 5 0 0,0 0,0

12 Ref 7

Ref 1:10, 25

ul, immob. 1 15,7


0,0157

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

m_

ab

s/u

g

sections

RA026

Dat…

90

Ungespülte Arterien mit unfiltrierten Partikeln

RA001 RA003 RA004 RA005 RA019 RA020 RA021 RA022 RA023 RA028 RA029 RA030

m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg)

Paraffin 0,320 0,471 0,5 0,471 0,5 0,471 0,471 0,000 0,000

-5 2,24 2,56 6,08 7,36 2,36 5,34 4,08 9,73 6,28 2,98 6,5835 0,000

-4 3,20 2,24 5,44 8,64 2,67 3,61 174,27 2,36 2,51 2,67 7,938 1,717

-3 5,44 1,92 6,40 35,84 2,51 21,35 1,26 7,22 0,63 12,09 10,773 1,859

-2 15,04 4,80 9,28 62,40 3,77 9,89 1,41 13,19 1,10 14,60 19,19925 2,567

-1 17,28 20,48 23,36 64,96 56,05 70,65 3,45 84,78 1,73 12,09 114,54975 7,198

0 24,64 18,56 165,76 175,68 91,06 45,53 1,41 13,19 1,41 15,70 78,561 6,426

1 27,52 7,36 80,32 78,72 57,46 222,94 1,26 20,88 0,79 17,43 189,63 3,670

2 9,92 1,60 7,04 30,40 11,15 32,81 1,41 329,70 0,47 10,99 74,655 3,560

3 8,64 2,56 3,20 16,96 19,15 15,39 1,88 47,10 0,63 2,04 11,97 3,733

4 7,68 1,92 4,16 16,32 12,09 65,63 1,26 21,20 0,47 3,14 10,12725 1,969

5 6,72 2,88 2,24 8,00 8,64 28,89 0,79 16,01 0,63 1,26 6,66225 2,048

Gesamt

abgelagert128,320 66,880 313,280 505,280 266,900 522,025 192,482 565,357 16,642 94,985 530,649 34,745

72A

16T/m

Mittelwerte StabW SEM n

m_abs(μg) m_abs(μg)

4,63 2,73 0,789 12

18,11 49,23 14,212 12

8,94 10,36 2,992 12

13,10 16,64 4,804 12

39,71 37,19 10,735 12

53,16 62,07 17,918 12

59,00 74,72 21,569 12

42,81 92,78 26,784 12

11,10 13,10 3,781 12

12,16 18,07 5,216 12

7,06 8,20 2,369 12

269,795

91

RA006 RA008 RA009 RA010 RA011 RA017 RA018 RA024 RA025 RA026 RA027 RA031 RA032 Mittelwerte

m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg)

Paraffin 0,320 0,200 0,200 0,200 0,200 0,471 0,471 0,471 0,471 0,471 0,471 0,471 0,471

-5 1,600 0,300 1,600 1,300 1,000 16,485 8,635 0,000 0,000 0,471 0,000 0 0 2,415

-4 1,600 0,700 1,600 1,000 1,200 4,396 2,041 3,297 0,628 0,471 0,471 0,504 2,331 1,557

-3 2,240 1,000 2,100 1,100 0,800 33,284 1,413 0,628 0,628 0,000 0,000 22,995 2,78775 5,306

-2 1,600 1,400 3,800 2,000 6,700 10,676 1,570 0,000 0,471 0,471 0,628 6,678 3,402 3,030

-1 2,880 2,200 4,600 5,500 11,300 4,239 2,198 0,000 0,628 2,355 0,471 24,8535 0,882 4,777

0 2,560 2,000 3,700 5,200 10,700 9,734 4,239 0,471 0,942 3,140 0,785 20,2545 3,6855 5,185

1 1,600 1,900 18,100 12,700 5,700 15,543 2,512 0,000 0,942 1,256 0,942 28,9485 4,11075 7,250

2 1,280 1,900 6,000 10,600 7,500 9,891 4,082 0,471 0,628 0,628 0,471 6,34725 5,84325 4,280

3 1,280 4,100 6,900 1,800 5,500 7,536 3,611 0,000 0,000 0,785 0,000 16,821 6,9615 4,253

4 0,640 1,100 4,900 1,500 2,700 4,867 4,396 0,000 0,000 0,000 0,000 5,7015 2,25225 2,158

5 0,640 1,400 6,900 1,300 2,700 2,512 1,727 1,570 1,570 0,000 0,000 12,8205 2,75625 2,761

Ablagerung

gesamt17,9 18,0 60,2 44,0 55,8 119,2 36,4 6,4 6,4 9,6 3,8 145,9 35,0 43,0

36A

10T/m

StabW SEM n

m_abs(μg)

4,819 1,336 13

1,205 0,334 13

10,382 2,879 13

3,187 0,884 13

6,727 1,866 13

5,510 1,528 13

8,899 2,468 13

3,673 1,019 13

4,710 1,306 13

2,145 0,595 13

3,488 0,968 13

92

RA012 RA013 RA014 RA015 RA016

m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg)

Paraffin 0,500 0,471 0,471 0,471 0,471

-5 1,413 0,942 8,164 0,000 0,471 2,198 1,510

-4 0,471 0,785 0,942 0,000 0,942 0,628 0,179

-3 0,471 0,628 0,942 0,785 0,785 0,722 0,080

-2 1,884 0,942 0,471 0,000 0,000 0,659 0,352

-1 0,628 0,000 1,256 0,000 0,000 0,377 0,251

0 0,000 1,570 2,512 0,000 0,471 0,911 0,492

1 0,000 0,785 0,471 0,785 0,785 0,565 0,154

2 0,000 0,471 2,355 0,000 0,000 0,565 0,457

3 0,471 0,000 0,000 0,785 0,000 0,251 0,162

4 0,000 0,000 0,628 0,471 0,628 0,345 0,144

5 0,471 0,471 0,471 0,785 0,785 0,597 0,077

Abgelagert

gesamt5,809 6,594 18,212 3,611 4,867 7,819

Mittlewert SEM

0A

0T/m

93

Zusammenfassung

0T/m (0A) 10T/m (36A) 16T/m (72A)

Mittelwerte Mittelwerte Mittelwerte

m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg)

-5 2,198 1,510 2,415 1,336 4,633 0,789

-4 0,628 0,179 1,557 0,334 18,105 14,212

-3 0,722 0,080 5,306 2,879 8,941 2,992

-2 0,659 0,352 3,030 0,884 13,104 4,804 0,002340

-1 0,377 0,251 4,777 1,866 39,715 10,735 0,000108

0 0,911 0,492 5,185 1,528 53,161 17,918 0,001444

1 0,565 0,154 7,250 2,468 58,998 21,569

2 0,565 0,457 4,280 1,019 42,809 26,784

3 0,251 0,162 4,253 1,306 11,105 3,781

4 0,345 0,144 2,158 0,595 12,163 5,216

5 0,597 0,077 2,761 0,968 7,063 2,369

Ablagerung

gesamt7,82 42,97 269,80

Ablagerung

gesamt

Ablagerung

gesamt %0,12 0,68

% von

gesamt

abgelagert

4,28

% von

gesamt

abgelagert

Ablagerung

gesamt %

Appliziert

Abgelagert

von

-2 bis +2

3,08 24,52

57,07

207,79

77,02

Abgelagert

von

-2 bis +2

6300

Abgelagert

von

-2 bis +2 (%)

0,049 0,39 3,30

Abgelagert

von

-2 bis +2 (%)

SEMParaffin

SEMSEM

T-Test 10T/m - 16T/m

T-Test 0T/m - 10T/m

T-Test 0T/m - 16T/m

94

Gespülte Arterien mit filtrierten Partikeln

RAB006 RAB007 RAB008 RAB009 RAB010 RAB011 RAB012 RAB013 RAB014 RAB015 RAB026 RAB027

m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg)

Paraffin 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,94 0,00 0,00

-5 1,57 2,04 0,94 0,94 0,00 1,10 3,14 1,88 2,36 3,45 52,49475 4,70925

-4 2,98 1,57 1,41 1,57 0,00 1,57 1,73 9,42 3,93 5,65 29,37375 5,8905

-3 2,51 1,57 1,57 1,88 1,41 1,26 1,88 3,77 9,58 12,40 23,07375 9,009

-2 4,40 1,73 1,41 1,88 1,57 0,94 2,67 17,74 3,30 411,34 16,2855 3,98475

-1 122,46 5,81 2,20 10,05 2,98 3,45 2,51 34,54 3,61 188,40 88,46775 5,65425

0 135,18 7,85 1,73 16,33 6,28 6,59 4,87 65,00 13,35 21,04 40,0365 7,22925

1 5,18 3,93 1,57 17,90 5,81 2,67 4,24 25,75 8,32 10,52 7,85925 6,615

2 2,51 2,04 1,41 10,21 1,73 1,10 1,88 2,36 2,51 18,84 25,94025 3,024

3 1,41 17,58 0,00 3,14 2,04 2,04 2,04 5,34 1,57 32,97 8,2845 3,3705

4 1,73 2,36 0,00 2,04 1,41 1,10 0,94 2,83 1,26 8,64 5,6385 6,97725

5 2,83 2,51 0,00 3,93 1,88 0,00 1,57 2,83 1,10 14,29 4,67775 3,7485Abgelagert

gesamt 282,8 49,0 12,2 69,9 25,1 21,8 27,5 171,4 50,9 727,5 302,1 60,2

Abgelagert

gesamt in % 4,5 0,8 0,2 1,1 0,4 0,3 0,4 2,7 0,8 11,5 4,8 1,0

16T/m

72A

95

Mittelwert StABW SEM n


6,22 14,63 4,223 12

5,42 7,99 2,306 12

5,83 6,66 1,922 12

38,94 117,42 33,895 12

39,18 61,28 17,689 12

27,12 38,59 11,141 12

8,36 6,96 2,010 12

6,13 8,10 2,339 12

6,65 9,54 2,754 12

2,91 2,69 0,778 12

3,28 3,76 1,087 12

150,038708

150,04

96

RAB016 RAB017 RAB018 RAB019 RAB020 RAB021 RAB022 RAB023 RAB024 RAB025 RAB028 RAB029

m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg)

Paraffin 0,942 0,942 0,942 0,942 0,942 0,942 0,942 0,942 0,942 0,942 0 0

-5 1,099 0,942 5,652 3,454 3,14 0 0 0 0 0 6,93 3,0555

-4 0 6,594 1,413 32,185 1,413 0 0 0 0 0 4,9455 3,906

-3 0 8,792 1,57 262,19 1,727 1,099 0 0 0 0 6,993 10,72575

-2 0 5,652 1,413 3,768 3,611 0 1,884 1,413 0 0 5,6385 24,6645

-1 0 2,198 1,413 4,867 3,768 1,099 1,884 5,338 1,413 0 3,591 21,735

0 0 1,413 1,099 2,983 2,983 1,727 2,198 2,198 1,884 2,355 8,7885 28,161

1 1,099 1,884 1,099 2,983 3,297 0 2,041 1,099 2,041 1,884 13,167 39,312

2 1,884 1,727 0 5,181 5,338 0 1,727 0 2,355 0 7,0875 22,63275

3 1,727 1,099 0 4,553 2,983 0 0 1,099 1,413 0 1,638 31,73625

4 0,0 1,6 0,0 3,0 13,5 0,0 0,0 29,8 0,0 0,0 6,426 32,949

5 0,0 0,0 0,9 0,0 1,9 0,0 1,1 1,3 0,0 0,0 0 11,82825Abgelagert

gesamt 5,8 31,9 14,6 325,1 43,6 3,9 10,8 42,2 9,1 4,2 65,2 230,7

10T/m

36A

97

Mittelwert

STA

B SEM n


2,02 2,41 0,697 12

4,20 9,10 2,627 12

24,42 74,97 21,643 12

4,00 6,84 1,974 12

3,94 5,87 1,694 12

4,65 7,71 2,225 12

5,83 11,08 3,198 12

3,99 6,33 1,829 12

3,85 8,89 2,565 12

7,27 11,97 3,455 12

1,42 3,34 0,965 12

65,610083

98

RAB001 RAB002 RAB003 RAB004 RAB005 Mittelwert SEM n

m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg)

Paraffin 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

-5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

-4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

-3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

-2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

-1 0,00 0,00 0,00 0,94 0,00 0,188 0,188 5

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,000 0,000 5

5 0,00 0,00 0,00 2,67 0,00 0,534 0,534 5

Abgelagert

gesamt 0,00 0,00 0,00 3,61 0,00 0,7222

0A

0T/m

99

Zusammenfassung

0T/m (0A) 10T/m (36A) 16T/m (72A)Mittelwert SEM Mittelwert SEM Mittelwert SEM

m_abs(μg) m_abs(μg) m_abs(μg)

Paraffin

-5 0,00 0,00 2,02 0,70 6,22 4,22

-4 0,00 0,00 4,20 2,63 5,42 2,31

-3 0,00 0,00 24,42 21,64 5,83 1,92

-2 0,00 0,00 4,00 1,97 38,94 33,90 0,077

-1 0,19 0,19 3,94 1,69 39,18 17,69 0,005905

0 0,00 0,00 4,65 2,23 27,12 11,14 0,004980

1 0,00 0,00 5,83 3,20 8,36 2,01

2 0,00 0,00 3,99 1,83 6,13 2,34

3 0,00 0,00 3,85 2,57 6,65 2,75

4 0,00 0,00 7,27 3,46 2,91 0,78

5 0,53 0,53 1,42 0,97 3,28 1,09

Ablagerung

gesamt0,72 65,61 150,04

Ablagerung

gesamt

Ablagerung

gesamt %0,01 1,04 2,38

Ablagerung

gesamt %

Appliziert

Abgelagert von

-2 bis +20,19 22,41

34,16119,73

79,80Abgelagert von

-2 bis +2

6300Abgelagert von

-2 bis +2 (%)0,003 0,36 1,90

Abgelagert von

-2 bis +2 (%)

T-Test 10T/m - 16T/m

T-Test 0T/m - 10T/m

T-Test 0T/m - 16T/m

100

12. Danksagung

Mein Dank gilt Allen, die mich bei der Durchführung der Versuche, der

Auswertung und dem Schreiben der Arbeit unterstützt und somit zum Gelingen

dieser Arbeit beigetragen haben.

Zunächst möchte ich Prof. Dr. med. Heinrich Iro für die Möglichkeit zur

Durchführung meiner Doktorarbeit an der von ihm geleiteten Klinik danken.

Außerdem danke ich meinem Doktorvater Prof. Dr. med. Christoph Alexiou für

die Möglichkeit zur Durchführung dieser Arbeit in der von ihm geleiteten

Arbeitsgruppe und die stets gute Zusammenarbeit und Betreuung.

Besonderer Dank gilt meinem Betreuer Dr. rer. nat. Rainer Tietze für seine

zuverlässige Unterstützung in allen Phasen dieser Arbeit und für die konstruktiven

Vorschläge und die vielen Denkanstöße bei der Überarbeitung des Manuskripts.

Ganz herzlich möchte ich auch meiner gesamten Arbeitsgruppe danken, die mir

stets bei der Durchführung und Auswertung der Versuche mit Rat und Tat zur

Seite stand, immer ein offenes Ohr für Probleme aller Art hatte und so ein

wirklich gutes Arbeitsklima geschaffen hat. Dr. rer. nat. Stefan Lyer danke ich

besonders für die Hilfe bei der Auswertung der µ-CT, Jenny Mann danke ich für

die Unterstützung in der Histologie und Eveline Schreiber für die Hilfe bei

Problemen aller Art, vor allem aber bei Tätigkeiten im Labor. Gabriele Nepf

danke ich für die wertvolle Mitarbeit in den letzten Monaten und Dr. med.

Stephan Dürr für die netten Gespräche.

Ich danke dem Schlachthof Erlangen, vor allem Dr. Mircea Buda, Dr. Gerhard

Schaller, Dr. Walter Wolf, Frau Petra Fischer und allen Fleischbeschauern, für die

freundliche Bereitstellung der Arterien.

Darüber hinaus danke ich unseren Kooperationspartnern bei der Physikalisch-

Technischen Bundesanstalt in Berlin für die Durchführung der MRX-Messungen,

besonders Dr. Lutz Trahms, Dr. Frank Wiekhorst und Dr. Heike Richter.

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Außerdem möchte ich den Kooperationspartnern am Lehrstuhl für

Magnetofluiddynamik der Technischen Universität Dresden für die Durchführung

der µ-CT Messungen danken, insbesondere Prof. Dr. Stefan Odenbach und Dipl.-

Ing. Helena Rahn.

Für die Auswertung der MRX-Ergebnisse mit PASW danke ich Prof. Dr.-Ing.

Micheal Döllinger recht herzlich.

Allen meinen Freunden danke ich von ganzem Herzen für die wertvolle

moralische und seelische Unterstützung auch in schwierigen Zeiten und für die

konstruktiven Gespräche und Hilfestellungen. Fabian Ammon danke ich dafür,

dass er auch in schwierigen Zeiten immer für mich da war und sich alle Probleme

und Erfolge meiner Arbeit stets geduldig angehört hat. Karolin Kempf danke ich

besonders für die langen und fruchtbaren Unterhaltungen, die zu so manchem

Denkanstoß führten sowie für die grenzenlose Motivation. Jessica Kliem danke

ich für das Korrekturlesen der Arbeit. Melanie Müller möchte ich herzlich für die

häufigen aufbauenden Gespräche, die gute moralische Unterstützung und die

wertvollen Hinweise zur Ausgestaltung der Arbeit danken.

Mein äußerster Dank gilt zuletzt meinen Eltern und meiner ganzen Familie, die

mich bei der Erstellung dieser Arbeit sowie im gesamten Medizinstudium stets

voll unterstützt haben, immer ein offenes Ohr für alle anfallenden Probleme hatten

und somit das Gelingen dieser Arbeit erst ermöglicht haben.

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig verfasst und keine

anderen, als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.

Alle Stellen der Arbeit, die aus anderen Werken dem Wortlaut oder dem Sinn

nach entnommen worden sind, wurden eindeutig unter Angabe der Quellen als

Entlehnung gekennzeichnet.

_________________________________

Biancamaria Beck, Erlangen den 06. Januar 2013

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Biancamaria Beck

Geburtsdatum 05.08.1987

Geburtsort Bayreuth

Familienstand ledig

Religion römisch-katholisch

Schulausbildung

1993-1997 Volksschule Marktschorgast

1997-2006 Gymnasium in Kulmbach, Abschluss: Abitur, Note 1,1

Hochschulausbildung

seit 2006 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-

Alexander- Universität Erlangen-Nürnberg

September 2008 Physikum, Gesamtnote „gut“

Promotion

seit 2009 „Verteilung magnetischer Nanopartikel in einem

Arterienströmungsmodell in Abhängigkeit der

Magnetfeldstärke und der Partikelgröße – Vorarbeiten

für das Magnetische Durg argeting“,

Betreuer Prof. Dr. Alexiou,

HNO-Klinik Erlangen

Famulaturen

19.02.2009-23.03.2009 Kardiologie-Zentrum Dr. med. Hornig, Bayreuth

15.03.2010-16.04.2010 Prof. Dr. Iro, HNO-Klinik Erlangen

18.08.2010-01.09.2010 Prof. Dr. Kruse, Augenklinik Erlangen

03.09.2010-17.09.2010 Prof. Dr. Höher, Kardiologie, Klinikum Bayreuth

29.09.2010-13.10.2010 Radiologie-Praxis im Dürerhof, Bayreuth

14.03.2011-28.03.2011 Augenarzt-Praxis PD Dr. Kamppeter, Bayreuth

Praktisches Jahr

15.08.2011-02.12.2011 Prof. Dr. Kruse, Augenklinik Erlangen

05.12.2011-23.03.2012 Prof. Dr. Hohenberger, Chirurgie Erlangen

26.03.2012-13.07.2012 Prof. Dr. Henneking, Innere Medizin Bayreuth

Besondere Kenntnisse

Sprachen Englisch fließend, Großes Latinum

EDV Windows Office (Word, Excel, Power Point)

2005-2008 Tätigkeit als Nachhilfelehrerin

Hobbys und Interessen

Tanzen, Wandern, Malen, Lesen

Erlangen, 06. Januar 2013

Verteilung magnetischer Nanopartikel in einem ... · Magnetic Drug Targeting, where a...

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