Von-Willebrand-Faktor-Aktivität und von-Willebrand-Faktor ... · Abdomensonographie, Röntgen...

Aus der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. W. Hohenberger

durchgeführt in der

Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung


Leiter: Prof. Dr. R. Eckstein

Von-Willebrand-Faktor-Aktivität und von-Willebrand-Faktor-

Multimerenverteilung bei Patienten mit kolorektalem

Karzinom

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

an der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Christian Eiche

aus Bad Hersfeld

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der


Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. R. Zimmermann

Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger

Tag der mündlichen Prüfung: 01.08.2012

Gewidmet meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung und Summary..................................................... 1

1.1 Zusammenfassung ............................................................................ 1

1.2 Summary ........................................................................................... 3

2 Einleitung .......................................................................................... 4

2.1 Kolorektales Karzinom ...................................................................... 4

2.2 Von-Willebrand-Faktor und ADAMTS13 ............................................ 8

2.2.1 Historisches ................................................................................ 8

2.2.2 Biosynthese des von-Willebrand-Faktors .................................... 9

2.2.3 Funktionen des von-Willebrand-Faktors ................................... 11

2.2.4 ADAMTS13 ............................................................................... 11

2.2.5 Veränderung der vWF-Multimeren-Verteilung bei

verschiedenen Krankheiten ...................................................... 13

2.3 Faktor VIII ........................................................................................ 15

2.4 Ristocetin-Cofaktor .......................................................................... 16

2.5 Von-Willebrand-Faktor und kolorektales Karzinom ......................... 16

2.6 Zielsetzung der vorliegenden Studie ............................................... 19

3 Material und Methoden .................................................................... 20

3.1 Patienten ......................................................................................... 20

3.2 Gelelektrophorese ........................................................................... 20

3.3 ADAMTS13-ELISA .......................................................................... 24

3.4 Bestimmung des Von-Willebrand-Faktor-Antigens,

des Faktor VIII und des Ristocetin-Cofaktors .................................. 26

3.5 Statistik ............................................................................................ 27

4 Ergebnisse ...................................................................................... 28

4.1. Vergleich zwischen den UICC-Stadien ............................................ 28

4.1.1 Faktor VIII ................................................................................. 28

4.1.2 Von-Willebrand-Faktor .............................................................. 30

4.1.3 Ristocetin-Cofaktor ................................................................... 31

4.1.3 ADAMTS13 ............................................................................... 32

4.2 Korrelation der vWF- und der Faktor-VIII-Aktivität zu

Werten des Blutbilds ...................................................................... 33

4.3 Korrelation der vWF- und der Faktor-VIII-Aktivität zum

ADAMTS13-Spiegel ........................................................................ 34

4.4 Multimerenanalyse .......................................................................... 34

4.4.1 Gerinnungsanalysen bei den Patienten der

Multimerenanalyse .................................................................... 35

4.4.2 Elektrophorese-Abbildungen ..................................................... 37

5 Diskussion ....................................................................................... 46

6 Literaturverzeichnis ......................................................................... 52

7 Abkürzungsverzeichnis ................................................................... 63

8 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen ............................................ 64

9 Danksagung .................................................................................... 65

1

1 Zusammenfassung und Summary

1.1 Zusammenfassung

Hintergrund

Bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen wurde in mehreren Studien ein

erhöhter Wert der von-Willebrand-Faktor-Aktivität beschrieben. Sogar ein

Nutzen der von-Willebrand-Faktor-Aktivität als Prognosefaktor für diese

Tumorentität wurde diskutiert.

Wie es zu diesem Anstieg kommt und ob eine Veränderung in der Multi-

merenverteilung auftritt, ist bisher allerdings völlig ungeklärt. In der

vorliegenden Studie wurden deshalb die Aktivität des Gerinnungsfaktors VIII,

die Konzentration und die Aktivität des von-Willebrand-Faktors, die Multi-

merenverteilung des von-Willebrand-Faktors und die Konzentration der

ADAMTS13, einer Protease, die die großen Multimere spaltet, in den

unterschiedlichen Tumorstadien des kolorektalen Karzinoms untersucht.

Studiendesign und Methoden

Bei insgesamt 126 Patienten wurde die Aktivität des von-Willebrand-Faktors,

seine Aktivität, bestimmt als Ristocetin-Cofaktor, und die Aktivität des Gerin-

nungsfaktors VIII bestimmt. Bei 9 Patienten pro UICC Stadium, also insge-

samt bei 36 Patienten, erfolgte zusätzlich die Untersuchung der Multimeren-

verteilung mittels einer speziellen Gelelektrophorese. Hierzu wurden die den

einzelnen Tumorstadien zugehörenden Plasmen gepoolt und in mehreren

Elektrophoreseläufen untersucht. Zusätzlich erfolgte die Bestimmung der

Konzentration der ADAMTS13 in den Einzelplasmen mittels ELISA.

2

Ergebnisse

Wie in einigen anderen Studien zeigen die Aktivitäten des von-Willebrand-

Faktors, des Ristocetin-Cofaktors und des Faktors VIII die Tendenz, mit

höheren Tumorstadien anzusteigen. Signifikant war dieser Zusammenhang

bei einer sehr großen Streubreite der Werte jedoch nicht. Die Verteilung der

Multimeren sowie die Konzentration der ADAMTS13 zeigten keinen Unter-

schied zwischen den verschiedenen Stadien des kolorektalen Karzinoms.

Auch ein Zusammenhang zwischen ADAMTS13 und der Konzentration des

von-Willebrand-Faktors konnte nicht gezeigt werden. Das Verfahren der

Multimerenanalyse an Probenpools erwies sich als der Multimerenanalyse an

jedem Einzelplasma überlegen, da der Vergleich von einzelnen Plasmen in

der Gelelektrophorese zu sehr durch technische Variabilität gestört wird.

Schlussfolgerung

Aufgrund der starken interindividuellen Streubreite der von-Willebrand-

Faktor-Aktivität ist dieser nicht als Prognosemarker bei Patienten mit

kolorektalem Karzinom geeignet. Bei dauerhaft erhöhten Werten sollte

allerdings differentialdiagnostisch an das Vorliegen einer Tumorerkrankung

gedacht werden. Die Multimerenanalyse des von-Willebrand-Faktors sowie

die Bestimmung der ADAMTS13 bringen keinen zusätzlichen Nutzen bei

Patienten mit kolorektalem Karzinom.

3

1.2 Summary

Background

Many studies observed elevated levels of von Willebrand factor in patients

with colorectal cancer (CRC). Some authors even suggested that elevated

levels of von Willebrand factor can be used as an indicator for estimating

survival probability. Why von Willebrand factor is elevated in patients with

CRC is absolutely unclear. In this study we measured the vWF multimer

distribution, and the concentration of the vWF-cleaving protease ADAMTS13

as well as factor VIII and ristocetin-cofactor levels.

Study design an methods

In 126 Patients vWF activity, ristocetin-cofactor and factor VIII were

measured. In nine patients of each UICC stage we visualised the distribiution

of vWF multimers using electrophoretic multimer analysis. This is the first

study to use pooled patient samples for multimer analysis, so we could

compare all 36 patients in a single run of electrophoresis. ADAMTS13 levels

were measured by using an ELISA.

Results

We found higher levels of vWF in higher UICC stages. Ristocetin-cofactor

and factor VIII were also elevated. However, because of the remarkable

interindividual variability of these coagulation factors, the diffeneces between

the stages were not significant. In electrophoresis we found no differences

between the UICC stages. The concentration of ADAMTS13 also did not

show any differences and there was no association to vWF levels.

Conclusions

Because of the large interindividual variability vWF levels are not appropriate

for staging colorectal cancer. Also it is not helpful as an prognostic indicator.

The distribution of vWF multimers was not different in all UICC stages of

CRC. There was therefore no evidence of acquired von Willebrand disease

type 2 in these patients.

4

2 Einleitung

2.1 Kolorektales Karzinom

Dickdarmkrebs stellt in Deutschland die häufigste Krebserkrankung dar. 2006

wurden 68.740 neue Fälle diagnostiziert. Im selben Zeitraum entfielen 27.225

Todesfälle auf diese Erkrankung [59].

Die meisten kolorektalen Karzinome entwickeln sich aus Adenomen. Eine

Erklärung hierfür liefert die so genannte Adenom-Karzinom-Sequenz [49].

Diese besagt, dass ein Karzinom dadurch entsteht, dass mehrere Gen-

veränderungen in einer Zelle zusammentreffen. Durch den Verlust oder eine

Mutation des Adenomatous-polyposis-coli-Gens (APC-Gens), eines Tumor-

suppressorgens auf dem langen Arm von Chromosom 5, wird das normale

Epithel zu hyperproliferativem Epithel. Hypomethylierungen der DNS

induzieren nun ein frühes Adenom, ras-Mutationen das intermediäre Adenom

und der Verlust des 18q Allels das späte Adenom. Durch den Verlust von

p53 auf dem langen Arm von Chromosom 17 entsteht schließlich ein

Karzinom. Weitere Mutationen führen zur Metastasierung [20,63].

Das Risiko, an einem kolorektalen Tumor zu erkranken, ist bei Vorhanden-

sein von Adenomen enorm gesteigert. Hierbei kann nicht nur aus den Adeno-

men direkt ein Karzinom entstehen, sondern auch nach Abtragung auffindba-

rer Adenome bleibt das individuelle Risiko, ein Karzinom zu entwickeln, circa

um den Faktor 4 erhöht [2]. Einen anderen Risikofaktor stellt das Alter dar.

So sind Erkrankungsfälle bei Personen unter 50 Jahren noch relativ selten,

nehmen aber tendenziell zu. Danach nimmt die Inzidenz stark zu und erreicht

bei Männern zwischen 80 und 84 Jahren ein Maximum von über 500

Neuerkrankungen pro 100.000 Personen pro Jahr [59]. Auch die Ernährung

spielt bei der Entwicklung von kolorektalen Karzinomen eine wichtige Rolle.

Eine hohe Zufuhr an Ballaststoffen sowie der Verzehr von Obst und Gemüse

reduzieren das Risiko, an einem Kolonkarzinom zu erkranken [4,74].

5

Neben den erworbenen Risiken bestehen erbliche Risiken mit nicht genau

nachgewiesenen genetischen Grundlagen. So haben Verwandte ersten

Grades von Patienten mit kolorektalen Tumoren ein zwei- bis dreifach

erhöhtes Risiko, ebenfalls an einem Kolonkarzinom zu erkranken [35]. Aber

auch genetisch genau definierte, monogene Defekte spielen eine Rolle. Bei

der familiären adenomatösen Polyposis (FAP) entstehen durch einen Defekt

am APC-Gen über 100 Adenome im Dickdarm, was zu einer nahezu

hundertprozentigen Wahrscheinlichkeit führt, einen malignen Tumor zu

entwickeln. Da diese Mutation mit ein bis zwei Patienten pro 10.000

Personen aber relativ selten ist, entstehen insgesamt gesehen nur etwa 5

Prozent der kolorektalen Tumore bei Patienten mit FAP.

Neben dieser phänotypisch leicht zu identifizierenden Krankheit stellt das

hereditäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) eine diagnostische

Herausforderung dar. 80 Prozent der Patienten mit HNPCC entwickeln ein

kolorektales Karzinom [35]. Definiert wird die Erkrankung durch

anamnestische Kriterien.

Eine dritte große Patientengruppe mit hohem Risiko für die Entwicklung

eines kolorektalen Karzinoms stellen Patienten mit chronisch entzündlichen

Darmerkrankungen dar. Besonders zu erwähnen ist die Colitis ulcerosa, wo

bei einer Pancolitis das Karzinomrisiko bei 18 Prozent nach 30 Jahren liegt

[17]. Bei Morbus Crohn ist die Datenlage uneinheitlich, es liegt aber wohl

ebenfalls ein erhöhtes Risiko für kolorektale Karzinome vor [67,68].

Um kolorektale Tumore möglichst frühzeitig zu entdecken, sollte ab einem

Alter von 50 Jahren auch bei asymptomatischen Personen ohne besondere

Risikofaktoren ein Screening angeboten werden. Hierzu eignet sich der

fäkale okkulte Bluttest (FOBT, Guaiak Test), welcher in einem

systematischen Review eine durchschnittliche Reduktion der Sterblichkeit um

23 Prozent zeigen konnte [68,75]. Den Goldstandard zur frühen Erkennung

von kolorektalen Tumoren stellen allerdings endoskopische Verfahren dar.

Diese sind dem Test auf Blut im Stuhl in Sensitivität und Spezifität deutlich

überlegen und bieten die Möglichkeit, entdeckte Adenome sogleich

abzutragen und so die Entstehung von Karzinomen zu verhindern. Da durch

6

die Koloskopie alle Darmabschnitte eingesehen werden können, ist diese der

Sigmoidoskopie vorzuziehen und sollte als Standardverfahren empfohlen

werden. Die Vorsorgekoloskopie wird in Deutschland derzeit ab dem 56.

Lebensjahr von den gesetzlichen Krankenkassen bezahlt. So kann die

Inzidenz von malignen Tumoren durch Polypektomie um 66 bis 90% gesenkt

werden. Eine einmalige Wiederholung der Untersuchung wird nach 10

Jahren empfohlen [8,68,87]. Bei familiären Formen des kolorektalen

Karzinoms ist die erste Vorsorgekoloskopie bereits vor dem 20. Lebensjahr

sinnvoll. In diesen Fällen sind auch häufigere Wiederholungen angebracht. In

jüngster Zeit wird wegen steigender Erkrankungszahlen im Alter zwischen 40

und 50 Jahren diskutiert, ob die Altersgrenze für die erstmalige

Screeningrekto-, -sigmoido- oder -koloskopie auf 40 Jahre gesenkt werden

sollte [16,64].

Die Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms erfolgt nach Dukes oder

nach der TNM-Klassifikation der UICC (Union International Contre le

Cancer). Hierbei stehen die Buchstaben T für die Tiefe der Tumorinfiltration

in die Darmwand, N für den Lymphknotenstatus und M für das

Vorhandensein von Fernmetastasen (Tab. 1) [80,89]. Aus dem TNM System

lässt sich eine Stadiengruppierung ableiten, welche die Prognose der

Erkrankung maßgeblich beeinflusst (Tab. 2) [77].

Vor der Therapie des Tumors erfolgt das so genannte Staging. Hierbei wird

die Ausdehnung des Tumors möglichst genau bestimmt. Zunächst wird

zwischen Kolon- und Rektumkarzinomen unterschieden. Die Grenze

zwischen beiden verläuft nach UICC 16cm oral der Anokutanlinie, gemessen

mit einem starren Rektoskop [89]. Zur präoperativen Ausbreitungsdiagnostik

des Tumors werden folgende Untersuchungen als essentiell angesehen:

digital-rektale Untersuchung, komplette Koloskopie mit Biopsie, im Falle einer

nicht passierbaren Stenose eine Koloskopie 3-6 Monate postoperativ,

Abdomensonographie, Röntgen Thorax in 2 Ebenen und CEA Bestimmung.

Im Einzelfall werden die Untersuchungen durch ein Spiral-CT oder MRT des

Abdomens und ein Spiral-CT der Lunge ergänzt [67].

7

Tabelle 1: TNM-Klassifikation der kolorektalen Karzinome

T Primärtumor

TX Primärtumor kann nicht beurteilt werden

T0 Kein Anhalt für einen Primärtumor

Tis Carcinoma in situ

T1 Tumor infiltriert die Submukosa

T2 Tumor infiltriert die Muscularis propria

T3 Tumor infiltriert die Subserosa bzw. das nicht peritonealisierte

parakolische bzw. pararektale Gewebe

T4 Tumor perforiert das viszerale Peritoneum und / oder infiltriert direkt

andere Organe

N Regionale Lymphknoten

NX Regionale Lymphknoten können nicht beurteilt werden

N0 Keine regionalen Lymphknotenmetastasen

N1 Metastasen in 1-3 parakolischen bzw. pararektalen Lymphknoten

N2 Metastasen in 4 oder mehr parakolischen bzw. pararektalen

Lymphknoten

M Fernmetastasen

MX Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden

M0 Keine Fernmetastasen

M1 Fernmetastasen

Tabelle 2: TNM-Stadieneinteilung der kolorektalen Karzinome

Stadium T-Stadium N-Stadium M-Stadium 5-JÜR*

0 Tis N0 M0

I T1, T2 N0 M0 92%

IIA T3 N0 M0 85%

IIB T4 N0 M0

IIIA T1, T2 N1 M0

64% IIIB T3,T4 N1 M0

IIIC Jedes T N2 M0

IV Jedes T Jedes N M1 12%

*5-JÜR = relative 5-Jahresüberlebensrate im Vergleich zur Normalbevölkerung

8

Bei Patienten mit Rektumkarzinom kommen noch die starre Rektoskopie

sowie die Endosonografie hinzu. Durch diese Maßnahmen lassen sich die

Tumorausdehnung und eventuell vorhandene Metastasen bereits vor der

Operation erkennen. Der Eingriff kann dann dementsprechend geplant und

durchgeführt werden [68].

Die Therapie des kolorektalen Karzinoms hängt wesentlich vom Tumor-

stadium zum Zeitpunkt der Erstdiagnose ab. Das Ziel besteht immer in einer

kompletten Resektion des Tumors. Bei sehr kleinen Tumoren (T1) mit

niedrigem Risiko für Lymphknotenmetastasen ist eine lokale endoskopische

Resektion ausreichend. Bei größeren Tumoren ist ein standardisiertes

operatives Vorgehen indiziert [29,30]. Hierbei sollte nicht nur der lokale

Tumor reseziert werden, sondern ebenfalls das Lymphabflussgebiet. Hieraus

ergibt sich ein notwendiger Sicherheitsabstand vom Tumor von 10 cm oral

und aboral.

Eine adjuvante Chemotherapie ist bei allen Patienten mit Kolonkarzinom im

Stadium III indiziert. Hierbei sollte ein Oxiplatin-haltiges Therapieschema

eingesetzt werden. Im Stadium II kann eine adjuvante Chemotherapie

durchgeführt werden, wobei hier nur ein geringer Überlebensvorteil besteht

und der Nutzen genau abgewogen werden muss.

Die Therapie von Patienten mit Rektumkarzinom unterscheidet sich

dahingehend, dass hier eine neoadjuvante Radio/-Chemotherapie

durchgeführt werden sollte. Hierdurch kann eine signifikante Reduzierung

von Lokalrezidiven erreicht werden [67,68].

2.2 Von-Willebrand-Faktor und ADAMTS13

2.2.1 Historisches

1924 beschrieb der finnische Arzt Erik von Willebrand eine Blutungsneigung

bei einem 5-jährigen Mädchen [82]. Nach der Untersuchung der gesamten

9

Familie erkannte er, dass einige Unterschiede zu der bis dahin bekannten

Hämophilie bestanden:

- Die Patienten hatten insbesondere Schleimhautblutungen.

- Gelenkblutungen und Blutungen in die Muskulatur waren selten

- Der Erbgang war autosomal-dominant und nicht X-chromosomal

rezessiv wie bei der Hämophilie

- Die Blutungszeit war im Gegensatz zur Hämophilie verlängert

Deshalb schloss von Willebrand auf eine bis dahin unbekannte Krankheit. Er

fand heraus, dass die Thrombozytenkonzentration der Patienten normal war,

und folgerte daraus, dass ein qualitativer Defekt in der Thrombusbildung

vorliegen müsse.

In den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts konnte gezeigt werden, dass bei

einigen Patienten mit dem heute „von-Willebrand-Syndrom“ (vWS)

genannten Krankheitsbild ein Mangel an Faktor VIII besteht [41].

Interessanterweise konnten die Symptome des vWS allerdings durch die

Gabe von Plasma von Hämophilie-A-Patienten gebessert werden. Dies

lieferte erste Hinweise auf das Vorhandensein eines eigenständigen „von-

Willebrand-Faktors“ (vWF) [52,53]. Isoliert werden konnte der von-

Willebrand-Faktor erst in den 1970er Jahren. 1986 wurde schließlich über

DNS-Sequenzierung erkannt, dass vWF und Faktor VIII zwei völlig

verschiedene Proteine sind [62].

2.2.2 Biosynthese des von-Willebrand-Faktors

Der von-Willebrand-Faktor ist ein großes Glykoprotein, das in Endothelzellen,

die im gesamten Körper verteilt sind, und in Megakaryozyten synthetisiert

wird [31,50]. Das primäre Translationsprodukt ist der Prä-pro-von-Willebrand-

Faktor, ein Monomer aus 2813 Aminosäuren. Nach verschiedenen

Umbauvorgängen, insbesondere der Glykosylierung, erfolgt der Transport in

das endoplasmatische Retikulum, wo eine Dimerisierung durch

Disulfidbrücken stattfindet [44,83]. Im Anschluss werden die Dimere (Pro-

vWF-Dimer) im Golgi-Apparat zu Multimeren zusammengesetzt und das

10

vWF-Propeptid entfernt. Ein Multimer besteht aus bis zu 20 Dimeren, so dass

lange Ketten von bis zu 2mm Länge und einem Gewicht von bis zu

20.000.000 Da entstehen (siehe Abb. 1). Damit ist der vWF das größte

lösliche Protein im menschlichen Körper [61]. Die fertig zusammengesetzten

Multimere werden nun entweder direkt sezerniert (etwa 95%) oder in den so

genannten Weibel-Palade-Körperchen des Endothels [71,84] oder in den

Alpha-Granula der Thrombozyten gespeichert [14]. Die normale

Konzentration im Blut beträgt ca. 10 µg/ml [7].

Abbildung 1: Biosynthese des von-Willebrand-Faktor. Modifiziert nach [69]

11

2.2.3 Funktionen des von-Willebrand-Faktors

Der von-Willebrand-Faktor spielt eine äußerst wichtige Rolle bei der

Blutstillung. Hierbei bestehen die zentralen Funktionen in der Ermöglichung

der Plättchenadhäsion an verletztem Endothel über das Thrombozyten-

Oberflächenglykoprotein Ib (Gp Ib) und in deren Aggregation unter hohen

Scherkräften über GPIIb/IIIa [60]. Des Weiteren handelt es sich um ein

Trägerprotein für den Gerinnungsfaktor VIII, welcher so vor einem zu

schnellen Abbau geschützt wird [22]. Für die Vernetzung der Thrombozyten

sind die großen Multimere essentiell. Durch die Verbindung vieler Dimere

entsteht ein multiplikativer Effekt, da jede Einheit Bindungsstellen für

subendotheliales Kollagen einerseits und Thrombozyten andererseits besitzt.

Als Träger von Faktor VIII können auch einzelne Dimere dienen [23].

2.2.4 ADAMTS13

Abgebaut wird der von-Willebrand-Faktor durch die vWF-spaltende Protease

ADAMTS13 (A disintegrin-like and-metalloprotease with thrombospondin

type 1 motif 13) [70]. ADAMTS13 spaltet die Verbindung zwischen den

Aminosäuren Tyr1605 und Met1606 in der A2-Domäne des vWF. Hierdurch

werden aus sehr großen Multimeren Einheiten aus kleineren Multimeren.

Das erworbene Fehlen dieser Protease löst die thrombotisch-thrombozyto-

penische Purpura, auch Moschcowitz-Syndrom genannt, aus [24]. Bei dieser

seltenen und lebensbedrohlichen Erkrankung entstehen thrombozytenreiche

Blutgerinnsel, die Kapillaren besonders von Gehirn und Niere verlegen und

zu schwerwiegenden Organschäden führen.

Der Hauptsyntheseort von ADAMTS13 sind die Sternzellen in der Leber [78].

Die Verteilung der unterschiedlich großen Multimere des von-Willebrand-

Faktors im Blut lässt sich besonders gut mittels Gelelektrophorse darstellen

(siehe Abb. 2). Die Multimere werden hierbei in einem Gel mittels elektrischer

Spannung ihrer Größe nach aufgeteilt und lassen sich anschließend

anfärben. So lässt sich darstellen, ob eine gleichmäßige Verteilung der

verschieden großen Multimere vorliegt [86].

12

Abbildung 2: vWF-Gelelektrophorese mit nach Größe aufgetrenntem vWF

In Abhängigkeit von der Anzahl an Dimeren lassen sich die Multimere in

folgende Gruppen einteilen: (Abb. 2)

- niedermolekularer / leichter vWF aus bis zu 5 Dimeren

- mittelschwerer vWF aus 6-10 Dimeren

- hochmolekularer / schwerer VWF aus 11-16 Dimeren.

- Multimere aus mehr als 16 Dimeren (Ultra Large Von-Willebrand-

Faktor ULVWF)

Das Vorhandensein von ULVWF-Multimere weist auf eine Störung des

Abbaus durch ADAMTS13 hin. Die Multimere sollten im Blut relativ

gleichmäßig verteilt sein. Eine ungleichmäßige Verteilung findet sich bei

verschiedenen Erkrankungen.

Schwere Multimere

Mittelschwere Multimere

Leichte Multimere

13

2.2.5 Veränderung der vWF-Multimeren-Verteilung bei verschiedenen

Krankheiten

Das von-Willebrand-Syndrom (vWS) zeichnet sich durch eine verminderte

Aktivität des vWF aus. Es lässt sich in 3 Hauptgruppen einteilen [69]. Beim

von-Willebrand-Syndrom Typ 1 besteht eine erniedrigte Konzentration des

qualitativ normalen vWF. Bei Typ 3 fehlt der vWF praktisch komplett. Die

Subtypen 1 und 3 des vWS sind also vorrangig quantitative Störungen. Beim

Subtyp 2 des vWS, von dem es mehrere Unterformen, die Typen 2A, 2B, 2M

und 2N, gibt, ist vorwiegend durch qualitative Veränderungen des vWF

gekennzeichnet. Bei Typ 2A ist vor allem die primäre Hämostase

beeinträchtigt, da die großen von-Willebrand-Faktor-Multimere fehlen (siehe

Abb. 3). Varianten mit einer erhöhten Affinität für Glykoprotein-Ib (Gp1b)

gehören zum Typ 2B des vWS und umfassen Phänotypen mit einem Verlust

großer Multimere, aber auch solche mit einem normalen Multimerenmuster.

Durch die erhöhte Affinität zu Gp1b kommt es zu erhöhtem

Thrombozytenumsatz und oft zur Thrombozytopenie. Der Typ 2M des vWS

beruht auf plättchenabhängigen funktionellen Defekten des vWF. Eine

defekte Faktor-VIII-Bindung des vWF kennzeichnet den Subtyp 2N des vWS

[69].

Abbildung 3: Multimerenverteilung des von vWF bei den 3 Subtypen des vWS (Nach [1])

14

Bei der so genannten thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP)

kommt es durch einen Mangel von ADAMTS13 zu einer starken Zunahme

der ULVWF und in Folge dessen zu einer pathologischen Steigerung der

Thrombozytenadhäsion und -aggregation (siehe Abb. 4) [46,47]. Zahlreiche

thrombozytenreiche Blutgerinnsel verlegen insbesondere die Kapillaren von

Gehirn und Niere und verursachen dort schwerwiegende Organschäden. Ein

eng verwandtes Krankheitsbild ist das hämolytisch-urämische Syndrom

(HUS), bei dem thrombozytenreiche Blutgerinnsel vorwiegend in der Niere

auftreten, so dass die Niereninsuffizienz ausgeprägter, neurologische

Schäden dagegen oft geringer sind als bei TTP. Während die ADAMTS13-

Spiegel bei HUS meist nicht erniedrigt sind, spielt hier die gesteigerte

Freisetzung von ULVWF und die Verzögerung ihres Abbaus durch Toxine

bestimmter enterohämorrhagischer Bakterien die Schlüsselrolle [47].

Abbildung 4: Zunahme der sehr großen vWF Multimere bei TTP.

Modifiziert aus [10]

15

2.3 Faktor VIII

Bei Faktor VIII (Antihämophiler Faktor A) handelt es sich um einen

essentiellen Blutgerinnungsfaktor. Faktor VIII bildet nach Aktivierung durch

Thrombin zusammen mit Faktor IX einen als Tenase bezeichneten Komplex,

welcher Faktor X zu Faktor Xa aktiviert [19].

Die Primärstruktur des Faktor VIII wurde 1984 aufgeklärt [27,28,81]. Das

Hauptprotein besteht aus einer Kette von 2332 Aminosäuren [42]. Der

Hauptsyntheseort für Faktor VIII ist die Leber, wobei über den genauen

Produktionsort noch immer Uneinigkeit herrscht [72,88].

Im Blut besteht eine enge Verbindung zwischen Faktor VIII und dem von-

Willebrand-Faktor, weshalb der Faktor VIII in der vorliegenden Studie mit

untersucht wurde. Zwischen vWF und Faktor VIII bildet sich ein nicht

kovalenter Komplex. So wird Faktor VIII vor zu schnellem Abbau geschützt.

Besonders eindrücklich zeigt sich dies bei Patienten mit von-Willebrand-

Syndrom Typ 3 mit fast vollständigem Fehlen des von-Willebrand-Faktors.

Betroffene Patienten haben auch ganz niedrige Faktor-VIII-Spiegel. Auch die

Halbwertszeit von infundiertem Faktor VIII ist stark erniedrigt, sie beträgt bei

vWS Typ 3 nur ca. 2,5 Stunden. Bei Patienten mit Hämophilie A, also

Patienten mit vorhandenem von-Willebrand-Faktor, beträgt die Halbwertszeit

des infundierten Faktor VIII ca. 12 Stunden [76]. Inaktiviert wird Faktor VIII

insbesondere durch aktiviertes Protein C [39,73].

Bekannt ist der Faktor VIII durch seine Rolle bei der Hämophilie A, wo infolge

eines Gendefekts die Faktor-VIII-Synthese gestört ist. Kodiert wird Faktor VIII

auf dem X-Chromosom (Xq28), das Gen macht 0,1% der Erbinformation auf

diesem Chromosom aus [28]. Das Gen besteht aus 186.000 Basenpaaren,

wobei 95% zu Introns gehören. Die Exons kodieren für ein Protein, welches

aus 2351 Aminosäuren besteht und eine Molekularmasse von ca. 400 kDa

hat [81]. Die Mutationen, welche zur Hämophilie A führen, sind sehr

heterogen. So gibt es viele unterschiedliche Ausprägungen und

Schweregrade der Hämophilie A [13].

16

2.4 Ristocetin-Cofaktor

Bei Ristocetin handelt es sich um ein mit Vancomycin verwandtes

Antibiotikum. Klinische Verwendung findet es allerdings nur noch bei der

Differentialdiagnostik des von-Willebrand-Faktors, da die Wirkung gegen

Staphylokokken von vielen Nebenwirkungen begleitet war.

Ristocetin führt über den GP-1b-Komplex zu einer Bindung des von-

Willebrand-Faktors an aktivierte Thrombozyten. Hierdurch kommt es zur

Agglutination. Fehlt nun von-Willebrand-Faktor wie beim von-Willebrand-

Syndrom, bleibt diese Agglutination aus. Somit lassen sich durch Messung

der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität (vWF:RCo) Rückschlüsse auf die Affinität

des vWF zum Thrombozytenglykoprotein Ib ziehen [69,79].

2.5 Von-Willebrand-Faktor und kolorektales Karzinom

Thrombozyten spielen eine entscheidende Rolle bei der Angiogenese. So

werden im Falle einer Verletzung bereits bei der Aggregation der

Thrombozyten unterschiedlichste Wachstumsfaktoren ausgeschüttet.

Insbesondere sind dies: Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF),

Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Insulin Like Growth Faktor (IGF) und

Transforming Growth Factor (TGF-β) [9,12]. Diesen bei der Wundheilung

unerlässlichen Prozess machen sich allerdings auch maligne Tumoren

zunutze, welche für ein Wachstum über 2 mm unbedingt eine eigene

mitwachsende Gefäßversorgung benötigen [21]. Wie wichtig hierbei die

Thrombozyten sind, demonstrierten mehrere Tierversuchsstudien. Diese

zeigten, dass bei schwerer Thrombozytopenie der Primärtumor und

Metastasen nicht weiter proliferieren konnten [51]. Ein direkter Zusammen-

hang mit den Thrombozyten konnte bestätigt werden, da die Tumore durch

eine Thrombozyteninfusion wieder weiter wachsen konnten [56]. Die aus den

Thrombozyten freigesetzten Wachstumsfaktoren spielen hierbei eine ganz

entscheidende Rolle, da sie durch gezielte Interaktion der Tumorzellen mit

den Thrombozyten eine Vaskularisierung induzieren [32,36,37]. Aber auch

17

der von-Willebrand-Faktor spielt eine wichtige Rolle. So konnte gezeigt

werden, dass sich durch Antikörper gegen vWF und den Rezeptor GP IIb/IIIa

die metastasierungsbegünstigende Wirkung der Thrombozyteninfusion stark

vermindern lässt [37].

Im Jahre 2002 publizierten Damin et al., dass die Plasmakonzentration des

von-Willebrand-Faktors bei Patienten mit kolorektalem Karzinom höher sei

als bei einer Kontrollgruppe [15]. Des Weiteren konnten sie zeigen, dass das

Tumorstadium nach Dukes einen signifikanten Einfluss auf die vWF-

Konzentration hat. Patienten im Stadium Dukes D mit Fernmetastasen hatten

die höchsten vWF-Konzentrationen im Blut. Ein solcher Effekt ist auch bei

anderen Krankheiten, wie zum Beispiel der hypertrophen Kardiomyopathie

zu beobachten [11]. 2005 publizierten Wang et al., dass die Konzentration

des vWF bei Patienten mit metastasiertem Kolonkarzinom als

Prognosemarker anzusehen sei und Patienten mit hoher Konzentration (Cut-

off Wert: 160%) signifikant kürzer leben [85]. Allerdings war diese Studie

umstritten. So bemängelten Gil-Bazo et al. in einem Leserbrief, dass

Thrombozytenzahlen, aber auch Einflussgrößen wie Begleitkrankheiten,

Geschlecht und Alter nur unzureichend betrachtet wurden [26].

Die Ursache der Erhöhung des von-Willebrand-Faktors ist weitestgehend

ungeklärt. Auch über eventuelle Änderungen in der Multimerverteilung oder

ADAMTS13 Konzentration gibt es nur wenige Daten. In einigen Studien

wurden einzelne Patienten untersucht, was aufgrund der heterogenen

Multimerverteilung und schlechter Vergleichbarkeit der Gelelektrophorese als

zweifelhaft erscheint.

Es könnte sich bei der Erhöhung der von-Willebrand-Faktor Aktivität also um

paraneoplastische Erhöhungen handeln, welche in erster Linie dadurch

zustande kommen, dass es sich bei dem von-Willebrand-Faktor um ein Akut-

Phase-Protein handelt, welches ähnlich wie das CRP unspezifisch auch bei

verschiedenen Infektionen erhöht ist [26,57].

Ein möglicher Faktor mit Einfluss auf die Multimerenverteilung stellt die

Stimulation der Endothelzellen dar, wodurch insbesondere sehr große

Multimere ausgeschüttet werden [71]. Auch ein Einfluss der Aktivierung von

18

Thrombozyten, welche von-Willebrand-Faktor speichern, ist denkbar. Wie

bereits erwähnt, interagieren Tumorzellen stark mit Thrombozyten und

sorgen so für eine Angioneogenese durch Ausschüttung von Wachstumsfak-

toren aus thrombozytären Granula. Andere Erklärungen wären, dass die

erhöhte Konzentration des von-Willebrand-Faktors durch eine vermehrte

Synthese in Endothelzellen während der Angiogenese zustande kommt [90].

Außerdem wurde gezeigt, dass Zellen von kolorektalen Tumoren die

Freisetzung von vWF aus kultivierten Endothelzellen in vitro stimulieren

können [48].

Von einer südkoreanischen Arbeitsgruppe wurden die vWF-Multimere und

die Aktivität der vWF-spaltenden Protease ADAMTS13 bei Patienten mit

unterschiedlichen Tumorerkrankungen untersucht [40]. Hierbei zeigten sich

erniedrigte Spiegel der ADAMTS13 und erhöhte Spiegel großer vWF-

Multimere insbesondere in fortgeschrittenen Tumorstadien. Eine weitere

Arbeitsgruppe beschrieb ebenfalls eine diskrete Verminderung der

ADAMTS13-Aktivität bei einem kleinen Teil untersuchter Tumorpatienten.

Hierbei wurde allerdings nicht die tatsächliche Konzentration der ADAMTS13

gemessen, sondern aus erhöhter Ristocetin-Cofaktor-Aktivität in verdünnten

Plasmaproben auf verminderte ADAMTS13-Aktivität zurückgeschlossen [6].

Inwieweit dieser Ansatz durch starke Erhöhungen des vWF gestört wird, ist

unklar. Bei einem Patienten mit Nebennierenkarzinom wurde eine entgegen-

gesetzte Veränderung der Multimerenverteilung des vWF beschrieben [18].

In diesem Fall kam es durch Anreicherung der sehr großen von-Willebrand-

Multimere im Tumor zu erniedrigten zirkulierenden Spiegeln dieser Multimere

mit der klinischen Symptomatik eines erworbenen von-Willebrand-Syndroms.

19

2.6 Zielsetzung der vorliegenden Studie

Der Stand des Wissens zum Zusammenhang zwischen kolorektalen

Karzinomen und Veränderungen der zirkulierenden Spiegel des vWF und

des Faktor VIII sowie der Multimerenverteilung des vWF und der Aktivität der

vWF-spaltenden Protease ADAMTS13 ist nach wie vor äußerst lückenhaft.

Publizierte Studienergebnisse sind zum Teil widersprüchlich. Ob sich Mes-

sungen dieser Proteine für Aussagen zum Tumorstadium und zur Prognose

im Einzelfall eignen, ist völlig offen.

Im Zuge der aktuellen Studie sollten deshalb die Multimerenverteilung des

vWF bei einer Serie von Patienten mit kolorektalen Karzinomen in ver-

schiedenen Tumorstadien nach UICC untersucht sowie der Zusammenhang

zwischen Thrombozytenzahl, der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität und den von-

Willebrand-Faktor-, Faktor-VIII- und ADAMTS13-Spiegeln beleuchtet werden.

20

3 Material und Methoden

3.1 Patienten

Die Blutentnahme erfolgte bei Patienten der Chirurgischen Universitätsklinik

Erlangen, welche durch Frau Dr. Vera Schellerer ausgewählt und über die

Studie aufgeklärt wurden. Es handelte sich um Patienten mit der

Erstdiagnose eines kolorektalen Karzinoms vor Beginn der Therapie. Die

Studie erfolgte mit Zustimmung der Ethikkommission der Medizinischen

Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg. Es wurden

folgende Proben mit S-Monovetten® der Firma Sarstedt AG & Co.,

Nürmbrecht, Deutschland entnommen (Tab. 3)

Tabelle 3: Für die Studie entnommene Blutproben

Citratblut Zentrifugieren und sofortige Testung im Gerinnungslabor auf

Faktor VIII, vWF und Ristocetin-Cofaktor im Citratplasma

Citratblut Zentrifugieren und Überstand einfrieren für Multimerenanalyse

im Citratplasma

Citratblut Zentrifugieren und Überstand einfrieren für ADAMTS13-ELISA

im Citratplasma

Das Tumorstadium nach UICC sowie der TNM-Status wurden aus der

Datenbank des Tumorzentrums Erlangen-Nürnberg entnommen. Die Werte

des Blutbildes wurden routinemäßig mit einer präoperativen Blutentnahme

angefertigt. Insgesamt wurden 124 Patienten getestet. Einige Daten wurden

allerdings nur bei Subgruppen erhoben.

3.2 Gelelektrophorese

Die Multimerenanalyse erfolgte mittels Gelelektrophorese als Western Blot,

grundlegend beschrieben von Raines [58], modifiziert nach Weiss [86].

21

Zunächst wurden die Proben der einzelnen Patienten getrennt voneinander

untersucht. Dabei zeigte sich allerdings, dass ein Vergleich der Patienten nur

schwer möglich war. Es waren keine offensichtlichen Unterschiede zwischen

den einzelnen UICC-Stadien sichtbar. Ein genauer Vergleich zwischen allen

Patienten war verfahrensbedingt nicht durchführbar. Dies lag zum Beispiel an

der immer etwas unterschiedlichen Anfärbbarkeit der Banden, Laufunregel-

mäßigkeiten resultierend aus der Gelbeschaffenheit und anderen physikali-

schen Faktoren.

Deshalb wurde das Citratplasma der Patienten für weitere Multimerenanaly-

sen gemischt. Jeweils 9 Patientenproben aus dem gleichen UICC-Stadium I,

II, III oder IV wurden zusammengegeben und mit einer Standardprobe auf

die 20 Fächer des Gelelektrophoresegerätes verteilt. Somit erfolgten für jede

Mischung 4 Einzelläufe, welche zusätzlich miteinander verglichen wurden.

Die benötigten Stoffe und Materialien sind in Tabelle 4 angegeben.

Zunächst wurden 200 ml Trenngel (siehe Tab. 4) zubereitet und aufgekocht,

bis keine Schlieren mehr sichtbar waren, und in den Apparat für die horizon-

tale Gelelektrophorese gegeben (Horizon 20-25, Life technologies inc.,

Gaithersburg, MD, USA). Nachdem das Gel ausgehärtet war, wurden 50ml

gekochtes Auftragungsgel hinzugefügt, in welchem durch Einsatz eines

Kammes 20 Taschen für die Proben frei gelassen wurden. Über die gesamte

Masse wurden nun 200 ml Isolationsgel gegeben. Anschließend wurden die

gemischten Plasmaproben der Patienten im Verhältnis 1:2 mit Probenpuffer

verdünnt und jeweils 3µl in die vorgefertigten Taschen gegeben. (siehe Abb.

5) Nun wurde bis knapp unter den Gelrand Elektrodenpuffer eingefüllt und

die Elektrophorese mit einer Elektrodenspannung von 110V gestartet. Nach

ca. 10 Minuten waren die Proben weit genug in das Trenngel gewandert.

Nun wurde das gesamte Gel mit kaltem Elektrodenpuffer überschüttet und

über einen Kühlkreislauf durch eiskaltes Wasser geführt. Nachdem die

Proben, erkennbar an der blauen Front, nach ungefähr 60 Minuten circa

einen Zentimeter in das Trenngel gewandert waren, konnte die Spannung

auf 200V erhöht werden. Die gesamte Elektrophorese dauerte circa 3

Stunden.

22

Tabelle 4: Benötigte Gels und Lösungen [86]

Trenngelpuffer 200mM Tris, 100mM Gylcin, 0,4%SDS w/v, pH 9,0

(ergibt sich spontan)

Trenngel 1,2% Agarose w/v mit niedriger Elektroendosmose in

Trenngelpuffer

Auftragsgelpuffer 70mM Tris, 0,4% SDS w/v, 4mM EDTA.Na2.2H2O, pH

6,7 mit HCl einstellen

Auftragsgel 0,8% Agarose w/v mit niedriger Elektroendosmose in

Auftragsgelpuffer

Isoliergel 1% Agarose w/v mit niedriger Elektroendosmose in

destilliertes Wasser

Elektrodenpuffer 200mM Tris, 200mM Glycine, 0,4% SDS w/v, pH 9,2

(ergibt sich spontan)

Probenpuffer 4,5ml Auftragsgelpuffer, 5,5 ml 87% Glycerol, 50 mg

Bromphenolblau

Blottingpuffer

(nach Towbin)

25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS w/v, 20%

Methanol v/v pH 9,2 (ergibt sich spontan)

Phosphate buffe-

red saline (PBS)

140 mM NaCl, 5 mM NaH2PO4, 1mM MgCl2, pH 7,4

mit NaOH einstellen

PBS-BSA PBS mit 1% w/v bovinem Serumalbumin, 0,1% w/v

NaN3

Färbelösung

100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5mM MgCl2, 3 mM

Levamisol, pH 9,5 einstellen.

Direkt vor Gebrauch:

200µl 4-Nitroblau-Tetrazolium Lösung (100 mg/ml in

70% Dimethylfomamid) und 200µl 5-bromo-4chloro-3-

indolyl-phosphat (50 mg/ml in 100%

Dimethylfomamid) in 80ml der Grundlösung geben

23

Abbildung 5: Aufbau der Gelelektorphorese (nach [86])

Im Anschluss an die Elektrophorese folgte das Blotting. Hierbei wurden die

Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen (0,45µm, Protran BA

85, Whatman GmbH, Dassel, Germany). Die Nitrozellulose wurde auf das

Gel geklebt, indem ein noch flüssiges „Klebegel“ (0,8% Agarose w/v in 100ml

Trenngelpuffer) auf die Unterseite der gedrehten Gelplatten geschüttet und

sofort Nitrocellulose unter strenger Vermeidung von Luftblasen aufgedrückt

wurde (siehe Abb. 6).

Abbildung 6: Vorbereitung zum Blotting (nach [86])

Nachdem das Gel ausgehärtet war, wurde die gesamte Platte für 25 Minuten

in Towbinpuffer + 70µl Mercaptoethanol eingelegt. Durch diesen Schritt

depolimerisiert der vWF, die großen Multimere lassen sich leichter auf die

24

Nitrozellulose übertragen [34]. Im Anschluss wurde die Gelplatte noch 5

Minuten in reinem Towbinpuffer inkubiert.

Sodann wurde die Gelplatte bei einer Spannung von 6V für 6 Stunden in das

Blottinggerät (Perfect Blue Web M, peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen,

Germany) eingelegt. Hierbei wurden die Proteine in die Nitrozellulose über-

tragen. Nach Ablauf der Zeit wurde die Nitrozellulose von der Agarosegel-

platte abgezogen und für eine Stunde in eine Wanne mit PBS-BSA gelegt.

Nun war es wichtig, die verbliebenen Gelreste möglichst vollständig zu ent-

fernen. Die Nitrozellulose wurde hierzu eine kurze Zeit in kochende 0,9%ige

NaCl-Lösung gegeben und anschließend mit heißer 0,9%iger NaCl-Lösung

abgewaschen. Nun folgte die Färbung. Zunächst wurde für circa ein bis zwei

Stunden mit Hase-Anti-Human-vWF-Antikörpern (Sigma, St. Louis, MO,

USA) inkubiert. Nach einer Waschung wurden mit alkalischer Phosphatase

konjugierte Anti-Hasen-IgG-Antikörper zugegeben, um die Anti-vWF-Anti-

körper zu markieren. Nach einer weiteren Waschung wurde die Färbelösung

zugegeben und so lange inkubiert, bis die vWF-Banden deutlich sichtbar

waren. Die so entstandenen Abbildungen wurden eingescannt und am

Computer mittels Software ausgewertet. (Phoretix 1D software, Version 10.4,

biostep, Jahnsdorf, Deutschland)

3.3 ADAMTS13-ELISA

Die Konzentrationsbestimmung der ADAMTS13 wurde mit dem „Imubind®

ADAMTS13-ELISA“ (Product No.813, American diagnosica GmbH,

Pfungstadt, Deutschland) nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Für

den Test wurde Blut in S-Monovetten® (Sarstedt AG & Co., Nürmbrecht,

Deutschland) abgenommen. Diese enthielten 0,5 ml Tri-Natriumcitratlösung

(0,106 M) und wurden mit 4,5 ml Blut aufgefüllt. Im Anschluss wurden die

Proben mit 10.000 x g für 15 Minuten scharf zentrifugiert. Sodann wurde das

Citratplasma abpipettiert und bis zur Testung tiefgefroren gelagert.

Durch die Anwendung eines ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent

Assay) lassen sich sehr geringe Konzentrationen eines Stoffes nachweisen.

25

Dies geschieht auf Basis einer immunologischen Reaktion. Hierzu wird die

zu untersuchende Probe auf eine mit monoklonalen Fängerantikörpern

gegen ADAMTS13 beschichtete Mikrotiterplatte gegeben. Parallel hierzu wird

eine Standardlösung mit vorgegebener Konzentration von ADAMTS13

angesetzt. Durch mehrfache Verdünnung erhält man Proben mit 100 ng/ml,

50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml und 3,12 ng/ml. Diese werden

ebenfalls in die Vertiefungen der Mikrotitterplatte gegeben, sowie reiner

Testpuffer ohne ADAMTS13 als Nullwert.

Die zu untersuchenden Plasmaproben werden mit einem Testpuffer im

Verhältnis 1 auf 20 verdünnt und in die Vertiefungen pipettiert. Dieser Ansatz

wird eine Stunde inkubiert. In dieser Zeit heftet sich vorhandene Protease

ADAMTS13 an die fest mit der Platte verbundenen Antikörper. Im Anschluss

wird das Plasma entfernt und die Platte gründlich gewaschen. ADAMTS13

haftet weiterhin an den Antikörpern auf der Platte.

Nun wird ein biotinylierter polyklonaler Kaninchen-Detektionsantikörper,

welcher ebenfalls gegen ADAMTS13 gerichtet ist, zugegeben. Während

einer 30 minütigen Inkubationszeit bindet der Antikörper an das an die Platte

gebundene ADAMTS13. Der Überstand wird wieder gründlich von der Platte

gewaschen. Übrig bleiben die an ADAMTS13 gebunden Detektions-

antikörper. Anschließend wird der biotinylierte Zweitantikörper durch ein

Streptavidin – Meerrettichperoxidase- (SA-HRP-)Konjugat nachgewiesen.

Dieses bindet sich während einer weiteren 30-minütigen Inkubationsphase

an den Detektionsantikörper. Nach einem weiteren Waschschritt wird das

Substrat 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin Perborat (TMB) zugegeben. Dieses

wird durch die Meerrettichperoxidase umgesetzt, was zu einer Blaufärbung

führt. Dies geschieht sowohl bei den zu untersuchenden Plasmaproben als

auch bei den parallel untersuchten Standardproben mit den definierten

ADAMTS13-Konzentrationen. Durch Zugabe von Schwefelsäure wird die

Reaktion gestoppt und die Färbung schlägt von blau nach gelb um. Aus dem

Grad der Färbung lässt sich in einem Photometer durch Messung der

optischen Dichte bei 450 nm eine Standardkurve ermitteln, und so die

Konzentration von ADAMTS13 in den Proben bestimmen. Im Anschluss wird

die ermittelte Konzentration noch mit 20 multipliziert, um die vorher

26

durchgeführte Verdünnung herauszurechnen, und so die tatsächliche

Konzentration im Plasma zu erhalten.

3.4 Bestimmung des Von-Willebrand-Faktor-Antigens,

des Faktor VIII und des Ristocetin-Cofaktors

Die Messung des von-Willebrand-Faktor-Antigens, des Faktor VIII und des

Ristocetin-Cofaktors erfolgte im Labor der Transfusionsmedizinischen und

Hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen.

Die immunologische Bestimmung des von-Willebrand-Faktor-Antigens

erfolgte mit Latexpartikeln in einem so genannten Liatest am

Gerinnungsautomaten STA (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim).

Diese immunturbidimetrische Methode basiert auf der Agglutination von

Latexpartikeln, die mit einem polyklonalen Antikörper gegen humanen vWF

beschichtet sind. Die Agglutination der Latexpartikel in Abhängigkeit von der

Menge vorhandenen vWFs führt zu einer stärkeren Lichtstreuung, die als

Zunahme der optischen Dichte gemessen wird. Innerhalb des Messbereichs

ist die Änderung der optischen Dichte direkt dem Gehalt der Probe an vWF-

Antigen proportional.

Die Bestimmung des funktionell aktiven vWF als Ristocetin-Cofaktor erfolgte

am Gerinnungsautomaten BCS (Fa. Siemens, Erlangen). Der vWF in der

Untersuchungsprobe verursacht in Gegenwart des Antibiotikums Ristocetin

eine Agglutination der im Reagenz enthaltenen Thrombozyten. Die

ablaufende Agglutinatbildung vermindert die durch nicht agglutinierte

Thrombozyten bedingte Trübung des Reagenzes. Das Analysegerät misst

die Veränderung der optischen Dichte (OD) und bestimmt unter Bezug auf

eine mit verschiedenen Verdünnungen von Normalplasma erstellte

Bezugskurve automatisch die Ristocetin-Kofaktor-Aktivität der Probe in % der

Norm.

Die Bestimmung der Faktor-VIII-Aktivität erfolgt wie die Bestimmung der

Aktivitäten aller endogenen Gerinnungsfaktoren, also der Faktoren VIII, IX, XI

und XII anhand von Clotting-Tests am Gerinnungsautomaten STA-R (Fa.

27

Roche Diagnotics GmbH, Mannheim). Der Mangel jedes dieser

Gerinnungsfaktoren des intrinsischen Systems führt zu einer verlängerten

partiellen Thromboplastinzeit (aPTT). Zur Einzelfaktorbestimmung wird die

aPTT einer Mischung des entsprechenden Mangelplasmas mit dem

Patientenplasma gemessen. Ein Patientenplasma, dem der entsprechende

Faktor fehlt, ist nicht in der Lage, die Abwesenheit dieses Faktors im

Mangelplasma auszugleichen. Es resultiert eine verlängerte aPTT. Die

Aktivität des Gerinnungsfaktors in % der Norm wird über eine Bezugskurve

ermittelt, die mit Verdünnungen von Standard-Humanplasma in Mischung mit

diesem Mangelplasma erstellt wird. Der Verfahrensablauf für die

Untersuchung der endogenen Gerinnungsfaktoren VIII, IX, XI und XII ist im

Ablauf nahezu identisch. Die Untersuchungen entsprechen dem Prinzip der

aPTT- Bestimmung und werden mit den entsprechenden Mangelplasmen

durchgeführt. Die Kalibrierung erfolgt mit Standard-Human-Plasma (Fa.

Siemens, Erlangen).

3.5 Statistik

Die erhobenen Messwerte wurden in das Tabellenkalkulationsprogramm

Microsoft Office Excel 2010 für Windows eingegeben. Die statistische

Auswertung der Daten erfolgte mittels einer Analyse-Software für Windows

(PASW Statistics, Version 19, IBM® SPSS®; Chicago, IL, USA). Zuerst

wurden die Ergebnisse mit Hilfe des Shapiro-Wilk-Tests auf Normalverteilung

untersucht. Waren die Werte nicht normalverteilt, wurden für

Gruppenvergleiche nichtparametrische Methoden angewendet und der

Vergleich der Mittelwerte erfolgte mit dem Mann-Whitney-U-Test. Ergab sich

aus den oben genannten Tests eine Normalverteilung der Werte in beiden zu

vergleichenden Gruppen, so wurde für den Vergleich der verschiedenen

Gruppen je nach Eignung der t-Test für verbundene bzw. unverbundene

Stichproben herangezogen. Die Korrelation zwischen zwei Variablen wurde

mit dem Pearson-Test überprüft. Als P-Wert zur Erkennung signifikanter

Gruppenunterschiede bzw. signifikanter Korrelationen wurde p<0,05

festgelegt.

28

4 Ergebnisse

4.1. Vergleich zwischen den UICC-Stadien

Zur Untersuchung der Frage, ob sich die Aktivität von vWF, Faktor VIII und

Ristocetin-Cofaktor in Abhängigkeit vom UICC-Stadium verändert, wurden in

der vorliegenden Arbeit Daten von 126 Patienten ausgewertet. 30 von ihnen

befanden sich im Tumorstadium I nach UICC, 36 im Tumorstadium II, 33 im

Stadium III und 25 hatten einen metastasierten Tumor und somit Stadium IV.

Bei allen Patienten wurde die Aktivität des von-Willebrand-Faktors, des

Faktor VIII und des Ristocetin-Cofaktors untersucht. Die Konzentration der

Metalloprotease ADAMTS13 wurde bei 47 Patienten aus diesem

Gesamtkollektiv untersucht.

Des Weiteren wurde bei jeweils 9 Patienten der einzelnen UICC-Stadien,

also insgesamt bei 36 Patienten die aufwendige Multimerenanalyse des vWF

durchgeführt.

4.1.1 Faktor VIII

Die Konzentration des Faktor VIII war in den Tumorstadien 2, 3 und 4 nach

UICC signifikant höher als im frühen, wenig fortgeschrittenen Tumorstadium

1. Am höchsten lagen Mittelwert und Medianwert der gemessenen Faktor-

VIII-Spiegel im UICC-Stadium 4. Allerdings waren die Unterschiede

zwischen den UICC-Stadien 2, 3 und 4 nicht signifikant (siehe Tab. 5).

29

Tabelle 5: Faktor-VIII-Aktivität in [%] in den jeweiligen UICC Stadien

Faktor VIII Gesamt UICC 1

§ || ¶

UICC 2

‡

UICC 3

‡

UICC 4

‡

N 126 30 36 33 25

Mittelwert 166,14 138,63 175,47 166,03 186,0

Median 158,5 129,00 160,50 161,00 202,0

Standardabweichung 60,64 44,98 68,1 44,38 74,18

Minimum 56 56 67 91 78

Maximum 420 250 410 258 420

‡ = Signifikant zu Stadium 1 § = Signifikant zu Stadium 2

|| = Signifikant zu Stadium 3 ¶ = Signifikant zu Stadium 4

Abbildung 7: Mittelwerte der Faktor-VIII-Aktivität in den

unterschiedlichen Tumorstadien nach UICC

30

4.1.2 Von-Willebrand-Faktor

Die Aktivität des von-Willebrand-Faktors steigt tendenziell mit fortschreiten-

dem Tumorstadium. Die höchsten Mittel- und Medianwerte fanden sich im

Stadium IV, die niedrigsten im Stadium I. Die Unterschiede waren aber nicht

signifikant (siehe Tab. 6).

Tabelle 6: von-Willebrand-Faktor-Aktivität in [%] in den vier UICC-Stadien

Von-Willebrand-Faktor

Gesamt UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4

N 126 30 36 33 25

Mittelwert 166,32 152,77 170,31 163,12 182,20

Median 159,50 143,00 164,00 161,00 173,00


Minimum 57 66 57 81 68

Maximum 405 293 405 289 367

Abbildung 8: Mittelwert der von-Willebrand-Faktor Aktivität in den


31

4.1.3 Ristocetin-Cofaktor

Auch der Ristocetin-Cofaktor lag in fortgeschrittenen UICC-Stadien höher,

am höchsten im Stadium IV. Allerdings war hier die Standardabweichung der

Messwerte relativ groß. Deshalb waren die Unterschiede der Ristocetin-

Cofaktor-Aktivität nur zwischen den UICC- Stadien I und II sowie I und III

signifikant (siehe Tab. 7).

Tabelle 7: Ristocetin-Cofaktor-Aktivität in [%] in den vier UICC-Stadien

Ristocetin-Cofaktor-Aktivität

Gesamt UICC 1

§ ||

UICC 2

‡

UICC 3

‡

UICC 4

N 126 30 36 33 25

Mittelwert 145,4 126,60 148,00 152,18 154,80

Median 119,50 106,50 124,00 141,00 123,00


Minimum 48 48 61 82 70

Maximum 427 299 320 299 427

‡ = Signifikant zu Stadium 1 § = Signifikant zu Stadium 2

|| = Signifikant zu Stadium 3 ¶ = Signifikant zu Stadium 4

Ristocetin-Cofaktor in [%]

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

Gesamt UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4

Abbildung 9: Mittelwert der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität in den


32

4.1.3 ADAMTS13

Die gemessenen Konzentrationen der Protease ADAMTS13 zeigten in allen

vier UICC-Stadien zeigte eine relativ große Spannbreite sowie eine hohe

Standardabweichung. Signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen

Stadien fanden sich nicht (siehe Tab. 8).

Tabelle 8: ADAMTS13-Konzentrationen [ng/ml] in den vier UICC-Stadien

ADAMTS13 Gesamt UICC 1 UICC 2 UICC 3 UICC 4

N 47 15 11 9 11

Mittelwert 841,11 964,76 765,29 895,52 745,71

Median 814,14 921,46 711,40 995,48 809,86


Minimum 239,22 466,12 239,22 346,54 395,60

Maximum 1628,0 1628,0 1460,9 1191,98 1036,44

Abbildung 10: Mittelwert der ADAMTS13-Konzentrationen

in den unterschiedlichen Tumorstadien nach UICC

33

4.2 Korrelation der vWF- und der Faktor-VIII-Aktivität zu Werten

des Blutbilds

Da bei Patienten mit kolorektalem Karzinom verschiedene Veränderungen im

Blutbild wie Thrombozytose, Leukozytose oder Tumoranämie vorkommen,

wurde der Zusammenhang zwischen Faktor VIII, vWF, Ristocetin-Cofaktor

und den Werten des Blutbildes untersucht. Die Faktor-VIII-Spiegel und der

immunologisch bestimmte vWF sind positiv mit Leukozytenzahl und

Thrombozytenzahl korreliert und negativ mit Erythrozytenzahl, Hämoglobin

und Hämatokrit, also positiv mit Anämiezeichen. Allerdings ist der

Zusammenhang schwach.

Tabelle 9: Korrelation zwischen Faktor VIII, vWF und Ristocetin-Cofaktor

(RiCoF) und Werten des Blutbildes

Faktor VIII vWF RiCoF

Leukozyten

Korrelation nach Pearson

0,276 0,193 0,064

p-Wert 0,002 0,030 0,480

N 126 126 126

Erythrozyten


-0,244 -0,209 -0,139

p-Wert 0,006 0,019 0,120

N 126 126 126

Thrombozyten


0,305 0,019 -0,083

p-Wert 0,001 0,829 0,357

N 126 126 126

Hämoglobin


-0,329 -0,247 -0,023

p-Wert 0,000 0,005 0,794

N 126 126 126

Hämatokrit


-0,302 -0,239 -0,038

p-Wert 0,001 0,007 0,674

N 126 126 126

34

4.3 Korrelation der vWF- und der Faktor-VIII-Aktivität zum

ADAMTS13-Spiegel

Die Konzentration von ADAMTS13 zeigt keinerlei signifikanten Zusam-

menhang zur Aktivität des vWF oder des Gerinnungsfaktors VIII. (Tab. 10)

Tabelle 10: Korrelation zwischen Faktor VIII, vWF und Ristocetin-

Cofaktor (RiCoF) und der ADAMTS13

Faktor VIII vWF RiCoF

ADAMTS13 Korrelation nach Pearson

-0,086 -0,012 -0,240

p-Wert 0,565 0,937 0,105

N 47 47 47

4.4 Multimerenanalyse

Bei jedem Lauf der Gelelektrophorese des von-Willebrand-Faktors treten

verfahrensbedingt Schwankungen im Aussehen der Banden auf. Dies liegt

unter anderem an immer etwas unterschiedlicher Gelbeschaffenheit, Unter-

schieden in der Laufdauer und unterschiedlicher Anfärbbarkeit der Banden.

Dies macht den Nachweis kleiner Unterschiede der Multimerenverteilung

schwierig. Daher wurden verschiedene Möglichkeiten getestet, um möglichst

gute Vergleichbarkeit zu ermöglichen. Als die beste Möglichkeit stellte es

sich heraus, die Proben mehrerer Patienten vor dem Lauf zu mischen und so

die Patienten im gleichen Tumorstadium nach UICC auf physikalischem

Wege zu mitteln. Deshalb wurden jeweils gleiche Plasmamengen von 9

verschieden Patienten gleichen Tumorstadiums gemischt. Die so gepoolten

Proben wurden zusammen mit einer Standardprobe eines gesunden

Probanden auf die 20 Taschen des Gelelektrophoresegerätes verteilt.

Hieraus ergibt sich, dass jede Probe 4-mal untersucht wurde und so weitere

Schwankungen eliminiert werden konnten.

Die einzelnen Banden wurden mit dem Programm „Phoretix 1D Software

Version 10.4“ (biostep, Jahnsdorf, Deutschland) analysiert. Bande eins bis

vier wurden aufgrund der starken Artefakte nicht berücksichtigt (Abb. 11).

35

In den einzelnen Läufen wurden die unterschiedlich großen Multimere

markiert und die Stärke ihrer Färbung gemessen. Pro Stadium eigneten sich

3 Einzelläufe zur Auswertung.

4.4.1 Gerinnungsanalysen bei den Patienten der Multimerenanalyse

Da die Untersuchung der von-Willebrand-Faktor-Multimere nicht bei allen

Patienten vorgenommen wurde, sondern nur an einer Gruppe von jeweils 9

zufällig ausgewählten Patienten pro UICC-Stadium, wurden die

Konzentrationen der unterschiedlichen Faktoren erneut aus den bekannten

Werten berechnet.

Faktor VIII

Die Konzentration von Faktor VIII in der Gruppe der für die

Gelelektrophorese genutzten Patienten war ähnlich wie im Gesamtkollektiv.

Es ließ sich wiederum eine Tendenz zu höheren Werten mit steigendem

Tumorstadium feststellen, die Unterschiede zwischen den vier UICC-Stadien

waren allerdings nicht signifikant.

Tabelle 11: Faktor-VIII-Aktivität in % in den unterschiedlichen UICC-Stadien

bei den für die Gelelektrophorese verwendeten Patienten.

Faktor VIII Gesamt UICC I UICC II UICC III UICC IV

N 36 9 9 9 9

Mittelwert 147,75 124,78 152,89 151,22 162,11

Median 138,00 125,00 137,00 154,00 140,00


Minimum 56 56 100 91 96

Maximum 261 208 242 234 261

36


Die Konzentration des vWF war im Stadium IV deutlich höher als bei

Patienten im Stadium I. Stadium II und III hatten ähnlich hohe Werte, welche

zwischen Stadium I und IV lagen. Signifikant war aber keiner der Unter-

schiede.

Tabelle 12: von-Willebrand-Faktor Aktivität in % in den unterschiedlichen

UICC Stadien bei den für die Gelelektrophorese verwendeten Patienten.


Gesamt UICC I UICC II UICC III UICC IV

N 36 9 9 9 9

Mittelwert 165,06 151,11 166,33 165,00 177,78

Median 154,00 137,00 149,00 174,00 206,00


Minimum 66 66 101 94 80

Maximum 267 257 267 229 248

Ristocetin-Cofaktor

Wie bei den anderen Faktoren war die Aktivität des Ristocetin-Cofaktors im

Stadium IV höher als in den anderen Stadien. Auch hier war der Unterschied

allerdings nicht signifikant.

Tabelle 13: Ristocetin-Cofaktor Aktivität in % in den unterschiedlichen UICC

Stadien bei den für die Gelelektrophorese verwendeten Patienten.

Ristocetin-Cofaktor Gesamt UICC I UICC II UICC III UICC IV

N 36 9 9 9 9

Mittelwert 112,81 100,89 102,89 121,11 126,33

Median 98,00 96,00 96,00 112,00 98,00


Minimum 48 48 82 82 72

Maximum 279 180 140 217 279

37

ADAMTS13

Bei der ADAMTS13 war die Konzentration im UICC Stadium I am höchsten.

Allerdings war die Standardabweichung recht groß, die Unterschiede

zwischen den UICC-Stadien waren nicht signifikant.

Tabelle 14: ADAMTS13 Konzentration in ng/ml in den unterschiedlichen

UICC Stadien bei den für die Gelelektrophorese verwendeten Patienten.

ADAMTS13 Gesamt UICC I UICC II UICC III UICC IV

N 36 9 9 9 9

Mittelwert 841,5708 928,137 782,65 895,52 759,98

Median 818,74 921,46 711,40 995,48 809,86


Minimum 239,22 466,12 239,22 346,54 395,60

Maximum 1535,7 1535,7 1460,9 1191,98 1036,44

4.4.2 Elektrophorese-Abbildungen

Die Multimerenanalyse wurde eingescannt und die einzelnen Banden wurden

markiert und nach Intensität der Färbung ausgewertet. Hieraus ließen sich

Rückschlüsse auf die Verteilung der einzelnen Multimerengrößen ziehen.

Von jedem Stadium eigneten sich 3 Einzelläufe zur Auswertung. (Abb. 11)

Die einzelnen Banden der Multimerenanalyse wurden nun getrennt vonein-

ander mit Hilfe der Software ausgewertet, indem die Intensität der Färbung

gemessen wurde. Aufgrund starker Artefakte konnten die Banden 1 bis 5

nicht zur Auswertung herangezogen werden. Somit blieben 3 Einzelläufe pro

UICC-Stadium, welche untereinander verglichen werden konnten. Hierbei

zeigten sich keine gravierenden Unterschiede zwischen den einzelnen

Läufen und keine Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Stadien.

Somit liegt bei den untersuchten Patienten keine Veränderung der

Multimerverteilung des von-Willebrand-Faktors vor. (Abb. 12 – Abb. 23).

38

Abbildung 11: Eingescannte Multimerenanalyse mit Beschriftung der

Banden *=aufgrund starker Artefakte nicht zur Auswertung geeignet.

Bande 1* Stadium 1

Bande 2* Stadium 2

Bande 3* Stadium 3

Bande 4* Stadium 4

Bande 5* Standard

Bande 6 Stadium 1

Bande 7 Stadium 2

Bande 8 Stadium 3

Bande 9 Stadium 4

Bande 10 Standard

Bande 11 Stadium 1

Bande 12 Stadium 2

Bande 13 Stadium 3

Bande 14 Stadium 4

Bande 15 Standard

Bande 16 Stadium 1

Bande 17 Stadium 2

Bande 18 Stadium 3

Bande 19 Stadium 4

Bande 20 Standard

39

UICC Stadium I:

Abbildung 12: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im

UICC Stadium I, Bande 6



40



UICC Stadium II:

Abbildung 15: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC

Stadium II, Bande 7

41


Stadium II, Bande 12


Stadium II, Bande 17

42

UICC Stadium III:


Stadium III, Bande 8



43



UICC Stadium IV:


Stadium IV, Bande 9

44


Stadium IV, Bande 14


Stadium IV, Bande 19

45

Zur besseren Übersicht und Vergleichbarkeit wurden jeweils ein Lauf der

unterschiedlichen Stadien, sowie ein Kontrolllauf, in demselben Bild

aufgetragen (Abb. 24). Hierbei zeigt sich besonders deutlich, dass

hinsichtlich der Multimerenverteilung keine Unterschiede zwischen den

Probenpools mit Plasma von je 9 Patienten eines jeden der vier UICC-

Stadien des kolorektalen Karzinoms bestehen.

Abbildung 24: Zusammenfassung der Multimerenanalysen der

verschiedenen Tumorstadien

46

5 Diskussion

Die Konzentration, Aktivität und Multimerenverteilung des von-Willebrand-

Faktors bei Patienten mit kolorektalem Karzinom ist seit längerer Zeit

Gegenstand der Forschung. Die Ergebnisse sind jedoch zum Teil

widersprüchlich. Damin et al. beschrieben im Jahr 2002, dass die Plasma-

konzentration des vWF bei Patienten mit kolorektalem Karzinom höher ist als

bei gesunden Patienten [15]. Auch das Tumorstadium nach Dukes habe

einen Einfluss auf die Konzentration des vWF. Patienten mit Fernmetastasen

hatten in dieser Arbeit die höchsten vWF-Werte. Wang et al. schlugen auf

der Basis gleicher Befunde 2005 vor, die Plasmakonzentration des vWF als

Prognoseparameter zu verwenden [85]. In einer ersten kleineren Fallserie

aus dem Universitätsklinikum Erlangen wurde wie von Danin et al. und Wang

et al. auch gesehen, dass Patienten mit kolorektalen Karzinomen höhere

Plasmakonzentrationen des vWF und des Faktor VIII aufweisen [65,66].

Allerdings beeinflussen Begleitkrankheiten, Alter und die AB0-Blutgruppe

diese Laborwerte, so dass zwar Aussagen über Patientenkollektive getroffen

werden können, der Einzelwert beim individuellen Patienten dagegen schwer

zu interpretieren ist [26,54]. Vor diesem Hintergrund ist eine Wiederholung

der Untersuchung mit größeren Fallzahlen sinnvoll.

Auch bei anderen fortgeschrittenen Tumoren, zum Beispiel Prostata-, Zervix-

und Ovarialkarzinomen sowie Tumoren des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs

wurden erhöhte Aktivitäten des vWF beschrieben [5]. Lediglich bei etlichen

Fällen mit fortgeschritten Bronchialkarzinom fanden sich nicht erhöhte, son-

dern im Gegenteil deutlich erniedrigte Plasmakonzentrationen des vWF [45].

Bei den in die vorliegende Arbeit eingeschlossenen 126 Patienten mit

kolorektalen Karzinomen konnte erneut gezeigt werden, dass der vWF mit

fortschreitendem Tumorstadium tendenziell ansteigt. Bei Patienten im

Stadium I nach UICC betrug der vWF durchschnittlich im Mittel 153 %, im

Stadium II 170 %, in Stadium III 163 % und im Stadium IV 182 %. Statistisch

signifikant waren diese Unterschiede allerdings nicht. Besonders zu

beachten ist, dass die gemessene Variabilität des vWF sehr hoch war. So

47

fanden wir den höchsten in dieser Fallserie gemessenen vWF-Wert von 405

% bei einem Patienten im UICC-Stadium 2. Der niedrigste gemessene Wert

bei Patinten im UICC-Stadium IV lag bei 68 %, den niedrigsten in der ganzen

Fallserie gemessenen vWF-Wert gab es mit 57% ebenfalls in einem Fall im

UICC-Stadium 2. Da der vWF ein Akut-Phase-Protein ist und eine so

ausgeprägte interindividuelle Bandbreite der Konzentration besteht, scheint

der vWF als Prognosemarker oder als Screeningparameter für Patienten mit

kolorektalem Karzinom nicht geeignet.

Die Untersuchung des Faktor VIII zeigte ebenfalls in den fortgeschritteneren

Tumorstadien tendenziell höhere Werte. Die Aktivität des Faktor VIII betrug

im Mittel 139 % im Stadium I nach UICC, 175 % im Stadium II, 166 % im

Stadium III und 186 % im Stadium IV. Des Weiteren fand sich der niedrigste

insgesamt gemessene Wert mit 56% im Stadium I, der höchste insgesamt

gemessene Wert mit 420% im Stadium IV. Allerdings fanden sich auch im

Stadium II mit 410 % sehr hohe Werte sowie im Stadium IV mit 78% recht

niedrige Werte. Faktor VIII zeigt somit einen etwas engeren Zusammenhang

zum Tumorstadium als der von-Willebrand-Faktor. Von einer anderen

Arbeitsgruppe konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Konzentration von

Faktor VIII bei Patienten mit kolorektalem Karzinom erhöht ist [3]. Eine

Aufschlüsselung nach Tumorstadium fand dort aber nicht statt.

Die Messung des Ristocetin-Cofaktors, also die indirekte Aktivitätsmessung

des von-Willebrand-Faktors, zeigte ebenfalls eine Tendenz zu höheren

Werten in höheren Tumorstadien, allerdings war auch diese nicht signifikant.

Im Stadium I betrug der mittlere Ristocetin-Cofaktor 127 %, im Stadium II 148

%, im Stadium III 152 % und im Stadium IV 155 %. Die höchste

Konzentration wurde mit 427 % bei einem Patienten im Stadium IV

gemessen, die niedrigste Konzentration mit 48% bei einem Patienten im

Stadium I.

Aufgrund der großen Streubreite der Werte und dem Vorkommen von

niedrigen Werten in fortgeschrittenen Stadien des kolorektalen Karzinoms

und hohen Werten in niedrigen Stadien ist die Verwendung als Screening-

oder Prognoseparameter für den einzelnen Patienten sehr kritisch zu sehen.

48

Allerdings sollte bei hohen Werten an das Vorhandensein von Tumoren

gedacht werden.

In der vorliegenden Untersuchung wurden die Plasmakonzentrationen der

genannten Faktoren vor Beginn einer Therapie gemessen. Bekannt ist, dass

die Operation eines kolorektalen Karzinoms zu einem signifikanten Anstieg

des vWF führt, was typisch ist für ein Akut-Phase-Protein [25]. Ob

Polychemotherapie die Plasmakonzentrationen des vWF erhöht oder im

Gegenteil erniedrigt, ist völlig unklar. Beides ist beschrieben worden [25,33].

Erschwert werden Aussagen über die mögliche klinische Bedeutung erhöhter

Plasmakonzentrationen des vWF oder des Gerinnungsfaktors VIII auch noch

von unterschiedlichen Normbereichsangaben der Labors, auf die sich der

Kliniker natürlich zu beziehen hat. So finden sich zum Beispiel bei Damin et

al. in allen Stadien des kolorektalen Karzinoms wesentlich höhere Mittelwerte

der vWF-Plasmakonzentration [15]. Diese sind allerdings sehr kritisch zu

sehen, da in der gleichen Arbeit die mittlere vWF-Plasmakonzentration bei 87

Kontrollpersonen, als welche gesunde Blutspender fungierten, mit 150,2 ±

58,1 U/dl angegeben wird. Das ist aber Unsinn, da die Untersuchung von

Normalpersonen den Normalwert der vWF-Plasmakonzentration des Labors

ergeben müsste, also in etwa 1 U/ml oder 100 U/dl. Vor dem Hintergrund

solcher Bezugsfehler ist es doppelt kritisch, wie Wang et al. vorzuschlagen,

vWF-Plasmaspiegel über 160 % als prognostisch ungünstig bei kolorektalem

Karzinom zu werten [85].

Eine Analyse des Multimerenmusters bei maligenen Erkrankungen fand

bisher nur bei wenigen Patienten beziehungsweise an kleinen Fallserien statt

[6,40,43,55]. Bei vielen Erkrankungen wie dem erworbenen vWS oder der

thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP) kommt es zu Verände-

rungen der Verteilung der Multimere des von-Willebrand-Faktors [69].

Erworbene Formen des vWS können auf Autoantikörper zurückgehen, die

maligne immunkompetente Zellen bilden. Andere erworbene Formen

zeichnen sich durch eine Verminderung schwerer vWF-Multimere aus.

Adsorption dieser großen Multimere an Tumorzellen ist hierbei der

angenommene pathophysiologische Mechanismus [38]. Sollte bei einem

49

erworbenen vWS mit Verlust großer Multimere allerdings auch eine

Veränderung der ADAMTS13 eine Rolle spielen, so müsste diese

Metalloprotease tendenziell erhöht sein.

Bei der thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP) sind dagegen

ultragroße Multimere des vWF vermehrt vorhanden, weil die Aktivität der

diese spaltenden Protease ADAMTS13 stark vermindert ist.

Die wenigen Berichte über Multimerenanalysen und ADAMTS13-Messungen

ergeben hier kein klares Bild. Zum Teil werden verminderte große vWF-

Multimere und erniedrigte ADAMTS13-Spiegel bei denselben Patienten

gefunden [40]. In einer anderen kleinen Serie wurde, was konsistenter ist,

eine Erhöhung der großen vWF-Multimere bei erniedrigter ADAMTS13

gefunden [43]. In einer weiteren Studie bei Patienten mit Hirn- und Prostata-

Tumoren wurde eine reduzierte Aktivität der ADAMTS13 beschrieben, die

aber nicht mit erhöhten großen vWF-Multimeren assoziiert war [6]. Typische

Fallberichte eines erworbenen VWS mit Blutungsneigung und Assoziation zu

einem kolorektalen Karzinom sind dagegen gar nicht beschrieben.

Viele dieser vorangegangenen Studien weisen methodische Schwächen auf,

da nie eine tatsächliche Konzentration der ADAMTS13 gemessen wurde,

sondern nur aufgrund von Gelelektrophoresen oder anderer Methoden

indirekte Rückschlüsse auf die ADAMTS13-Aktivität gezogen wurden

[6,40,43]. In der aktuellen Studie wurde die Konzentration von ADAMTS13

mittels ELISA direkt bestimmt. Die ADAMTS13-Konzentration in Citratplasma

von 49 Normalspendern betrug bei Verwendung des in der vorliegenden

Studie eingesetzten Elisa-Verfahrens nach nicht publizierten Angaben des

Herstellers American Diagnostika 740 ± 110 ng/mL. Im Vergleich dazu

fanden wir eine nicht bis gering erhöhte Gesamtkonzentration der

ADAMTS13 in verschiedenen Tumorstadien. Am höchsten war sie im

Stadium I nach UICC mit durchschnittlich 965 ng/ml. Im Stadium II betrug die

mittlere Konzentration 765 ng/ml, im Stadium III 896 ng/ml und im Stadium IV

746 ng/ml. Signifikant waren diese Unterschiede nicht, und es ist auch nicht

anzunehmen, dass die geringe Erhöhung gegenüber Gesunden klinisch von

Bedeutung ist.

50

Wie bei den anderen untersuchten Parametern sind die interindividuellen

Unterschiede der ADAMTS13-Werte innerhalb der vier UICC-Stadien

wesentlich größer als die Unterschiede der Mittelwerte zwischen den UICC-

Gruppen. Wir fanden ADAMTS13-Konzentrationen mit einer Spannweite im

von 466 ng/ml bis 1628 ng/ml im Stadium I und zwischen 396 ng/ml und

1036 ng/ml im Stadium IV.

Bei Patienten mit malignen Erkrankungen sind nicht nur quantitative, sondern

auch qualitative Veränderungen des vWF beschrieben, wie bereits

ausgeführt. In der Studie von Koo et al. findet sich aber nur ein einziger

Patient mit einem kolorektalen Karzinom [40]. Bei ihm zeigte sich eine

geringe Verminderung der großen vWF-Multimere. Eine systematische

Untersuchung der vWF-Multimere bei einer größeren Serie von Patienten mit

kolorektalen Tumoren fehlt bisher.

Die Beschreibungen einzelner Fälle sind nur wenig hilfreich. Des Weiteren

sind einzelne Läufe der Gelelektrophorese des von-Willebrand-Faktors sehr

heterogen und machen den Vergleich zwischen verschiedenen Läufen nur

schwer möglich. Dieses methodische Problem wurde in der vorliegenden

Arbeit innovativ durch das Mischen von jeweils gleichvolumigen Plasma-

aliquots von 9 Patienten im selben UICC-Stadium behoben. Dies ermöglichte

einen optimalen Vergleich zwischen Proben der verschiedenen UICC-

Stadien, da alle Proben in demselben Lauf untersucht werden konnten.

Hierbei konnten keine stadienabhängigen Veränderungen der Multimeren-

verteilung beobachtet werden. Der direkte Vergleich in einem einzigen

Diagramm zeigte, dass die Darstellung der Färbeintensität in allen Stadien

parallel verlief. Dies zeigt, dass die Verteilung der Multimere sowohl

zwischen den einzelnen UICC Stadien sowie im Vergleich zu einer gesunden

Referenzperson keinerlei ungewöhnliche Merkmale aufweist. Insbesondere

das Auftreten von sehr schweren Multimeren hätte mit dieser Methode gut

nachgewiesen werden können, da diese sich so gut von den restlichen

Banden abgehoben hätten. Schwächen zeigt die Mischung der

Patientenproben eventuell im Nachweis von geringen Veränderungen bei

einzelnen Patienten, da diese durch Mittelung der Ergebnisse ausgeglichen

51

werden. Allerdings gab es hierfür in den parallel durchgeführten

Untersuchungen der Einzelplasmen keine Hinweise.

Zusammenfassend ließ sich bestätigen, dass die Plasmakonzentrationen des

von-Willebrand-Faktors und auch des Gerinnungsfaktors VIII bei Patienten

mit kolorektalen Karzinomen erhöht sind. Das Ausmaß der Erhöhung

korreliert jedoch nicht mit dem Stadium der Erkrankung und ist beim

individuellen Patienten nicht für prognostische Aussagen verwendbar.

Darüber hinaus ist die erhöhte vWF-Konzentration nicht mit einer Änderung

der vWF-Multimeren-Verteilung bei kolorektalem Karzinom assoziiert.

Schließlich ist das kolorektale Karzinom auch keine Tumorentität, bei der

sich Zeichen eines erworbenen von-Willenbrand-Syndroms finden. Bei

dauerhaft erhöhter Plasmakonzentration des von-Willebrand-Faktors und

auch des Gerinnungsfaktors VIII sollte differentialdiagnostisch auch an ein

malignen Geschehens gedacht werden. Speziellen Vorhersagewert im

Screening auf kolorektale Karzinome oder im Staging bei diagnostiziertem

kolorektalem Karzinom haben aber weder der vWF, der Faktor VIII oder der

Ristocetin-Cofaktor noch die Metalloprotease ADAMTS13. Und eine

Multimerenanalyse bringt bei kolorektalen Karzinomen keine relevante

Zusatzinformation.

52

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63

7 Abkürzungsverzeichnis

ADAMTS13: A disintegrin-like and-metalloprotease with thrombospondin

type 1 motif 13

APC-Gen: Adenomatous-polyposis-coli Gen

CTAD: Zitrat/Theophyllin/Adenosin/Dipyridamol

DNS: Desoxyribonukleinsäure

ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FAP: Familiäre adenomatöse Polyposis

FOBT: fäkaler okkulter Bluttest

HNPCC: Hereditäres nicht-polypöses kolorektales Karzinom

IGF: Insulin Like Growth Faktor

UICC: Union internationale contre le cancer

KRK: kolorektales Karzinom

PDGF: Platelet-Derived Growth Factor

TGF: Transforming Growth Factor

TNM: Tumor, Node (Lymphknoten), Metastasen

TTP: Thrombotisch-thrombozytopenische Purpura

VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor

vWF: von-Willebrand-Faktor

vWS: von-Willebrand-Syndrom

64

8 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

1. Weiss DR, Eiche C, Hupke C, Schellerer VS, Keller AK, Strasser EF,

Ringwald J, Zimmermann R, Eckstein R. The structure of the von-

Willebrand factor is not altered in patients with colorectal carcinoma.

Colorectal Dis. 2012 Apr 16. doi: 10.1111/j.1463-1318.2012.03049.x.

[Epub ahead of print]

2. Weiss DR, Eiche C, Hupke C, Schellerer V, Zimmermann R, Eckstein

R. Von-Willebrand-factor elevation and multimeric pattern in colorectal

carcinoma do not significantly correlate with UICC stage. 54. Jahres-

kongress der Gesellschaft für Thrombose- und Hämostaseforschung

(GTH) Wiesbaden, 2011. Abstract in: Hämostaseologie 2011; 31(1):

A67

65

9 Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Zimmermann für die Bereitstellung

des Themas sowie die wertvolle Unterstützung während der gesamten Zeit

der Arbeit. Herrn Prof. Eckstein danke ich dafür, dass ich diese Arbeit in

seiner Abteilung durchführen durfte.

Frau Dr. Schellerer danke ich für die Organisation der Blutentnahmen sowie

die Aufklärung der Patienten, Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Hohenberger für die Er-

laubnis, Patienten seiner Klinik zu untersuchen.

Herrn Dr. Weiss danke ich für die Einarbeitung in die Gelelektrophorese zur

Auftrennung und Analyse der Multimere des von-Willebrand-Faktors sowie

die Zusammenarbeit bei der Erstellung der Publikation.

Insbesondere bedanken möchte ich mich bei den Patienten, welche sich

bereiterklärt haben, trotz ihrer schweren Erkrankung an dieser Studie mitzu-

wirken.

Ebenfalls danke ich allen Mitarbeitern der Transfusionsmedizinischen und

Hämostaseologischen Abteilung, insbesondere den medizinisch-technischen

Laborangestellten, die immer ein offenes Ohr für Fragen zur Gelelektropho-

rese oder zu den ELISAs hatten und mit kompetentem Rat zur Seite standen.

Von-Willebrand-Faktor-Aktivität und von-Willebrand-Faktor ... · Abdomensonographie, Röntgen...

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