Vorkommen und Bedeutung mehrerer Isoformen des ... · lichen Polypeptidketten bestehende Enzym hat...

VorkommenundBedeutungmehrererIsoformendes

mitochondrialenAcyl CarrierProteins

Inaugural-Dissertation

zurErlangungdesDoktorgrades

derMathematisch-NaturwissenschaftlichenFakultät

derHeinrich-Heine-UniversitätDüsseldorf

vorgelegt von

Hans-Georg Hennemann

ausNeuss

Düsseldorf2000

Gedrucktmit derGenehmigungderMathematisch-NaturwissenschaftlichenFakultätder

Heinrich-Heine-UniversitätDüsseldorf

1. Referent:Prof.Dr. HannsWeiss

2. Referent:PD Dr. ThomasLisowsky

TagdermündlichenPrüfung:19.Dezember2000

3

In buntenBildern wenigKlarheit,

Viel Irrtum undein FünkchenWahrheit,

Sowird derbesteTrankgebraut,

deralle Welt erquicktundauferbaut.

JohannWolfgangGoethe,FaustI

Alles Vergängliche

Ist nurein Gleichnis.

DasUnzulängliche,

Hier wirdsEreignis,

DasUnaussprechliche,

Hier istsgetan.

DasEwig-Weibliche

Ziehtunshinan.

JohannWolfgangGoethe,FaustII

5

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung 1

2 Einleitung 3

2.1 Die Fettsäuresynthasein Pro-undEukaryonten . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.2 Acyl CarrierProteineundihre BeteiligunganBiosynthesewegen . . . . . . 5

2.3 MitochondrialeAcyl CarrierProteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.4 Die Beteiligungder bakteriellenundmitochondrialenFettsäuresynthasean

derLiponsäurebiosynthese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.5 DasmitochondrialeACPalsUntereinheitdesAtmungsketten-Komplex I . . 9

2.6 DerAufbaudesAtmungsketten-Komplex I . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.7 Die BiosynthesedesKomplex I in Neurospora crassa . . . . . . . . . . . . 12

2.8 ThemaderArbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3 Material und Methoden 16

3.1 Lösungen,Puffer undMedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

3.2 MikroorganismenundVektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.3 ZuchtundradioaktiveMarkierungvonMikroorganismen. . . . . . . . . . 22

3.4 TransformationvonMikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.5 UmwandlungderPhagenbibliothekλAD5 in diePlasmidgenbibliothekpYA-

DE5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.6 IsolationgenomischerDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3.7 AllgemeinemolekularbiologischeMethoden. . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.8 BestimmungvonLiponsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.9 PräparationundAuftrennungvon MitochondrienmembranenausN. crassa 28

3.10 IsolierungundSpaltungvon Komplex I ausN. crassa . . . . . . . . . . . . 29

3.11 Präparationund Aktivitätsbestimmungder α-KetoglutaratDehydrogenase

ausN. crassa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.12 VerschiedeneanalytischeMethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

4 Ergebnisse 32

6

4.1 Liponsäuregehaltundα-KetoglutaratDehydrogenase-AktivitätdesN. cras-

saWildtyps unddermtACP-Deletionsmutante. . . . . . . . . . . . . . . . 32

4.2 NachweisvonmtACP2durchin vivoMarkierungvon

N. crassamit [14C]-Pantothensäure. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

4.3 SuchenachdemGenfür einzweitesmtACP . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4.4 Codon-GebrauchundExpressionshäufigkeit vonmtACP . . . . . . . . . . 39

4.5 VersuchderKlonierungdesGensfür mtACP2in N. crassa . . . . . . . . . 41

4.5.1 VersuchderGenidentifizierungüberdie DNA-Sequenz. . . . . . . 42

4.5.2 Versuchder heterologenKomplementationder ∆acp-Mutantevon

SaccharomycescerevisiaedurchPlasmid-Shuffling . . . . . . . . . 46

4.6 Untersuchungder Atmungsfähigkeit und desLiponsäuregehaltesverschie-

denerDeletionsmutantenvon S. cerevisiae mit beeinträchtigtermitochon-

drialerFAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

5 Diskussion 56

5.1 Im Gegensatzzur ∆acp-Mutantevon S.cerevisiaebesitztdie acp1-Mutante

vonN. crassaLiponsäurein bioverfügbarerForm . . . . . . . . . . . . . . 56

5.2 Nachweisvon mtACP2 in N. crassadurch [14C]-Pantothenat-Markierung

derMutanteacp1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

5.3 EukaryontenkönnenmehreremtACP-Geneenthalten. . . . . . . . . . . . 57

5.4 Die BedeutungdesmtACPfür Komplex I . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

5.5 Die Bedeutungder mitochondrialenFettsäuresynthesefür die Atmung von

S.cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

5.6 Gibt esweitereFunktionendesmtACPin S.cerevisiae? . . . . . . . . . . . 61

6 Literatur 63

1. Zusammenfassung 1

1 Zusammenfassung

Die Fettsäuresynthasen(FAS) aller Organismenfolgen einemeinheitlichenReaktionsme-

chanismus,unterscheidensich jedochin ihrem molekularenAufbau.Die im Cytosolgele-

geneFAS der Vertebraten,Insektenund Pilze (FAS Typ I) sind als multifunktionellePro-

teineorganisiert.Die FAS der Prokaryontenund PlastidenhöhererPflanzen(FAS Typ II)

hingegenbestehenausstrukturellgetrenntenEnzymen.In denvergangenenJahrenwurden

in verschiedenenEukaryontenmitochondrialeProteinebzw. derenGenemit hohemVer-

wandtschaftsgradzudenEnzymenderFAS Typ II gefunden.DazugehörendasAcyl Carrier

Protein,die Malonyl-CoA-ACP-Transferase,die β-Ketoacyl-ACPSynthase,die 3-Oxoacyl-

ACP-Reduktase,die 3-Hydroxyacyl-Dehydrataseunddie Enoyl-Reduktase.

DasmitochondrialeAcyl CarrierProtein(mtACP)wurdeausBostaurusundNeurospora

crassaalsUntereinheitdesAtmungsketten-Komplex I isoliert.Die genetischeInaktivierung

diesesmtACPführtein demobligataerobenPilz N. crassazueinemVerlustvonKomplex I,

dessenFunktionvoneinemalternativenAtmungsenzymübernommenwurde.In derfakulta-

tiv aerobenHefeSaccharomycescerevisiae, die keinenKomplex I besitzt,liegt dasmtACP

als freiesMatrix-Proteinvor. SeinegenetischeInaktivierungführtezumVerlustderLipon-

säuresyntheseunddamitzuvollständigerAtmungsdefizienz.

DiesezuBeginnderDoktorarbeitvorliegendenBefundeließenvermuten,daßdasmtACP

in N.crassabzw. S.cerevisiaeeineunterschiedlicheFunktionausübt.Um dieseThesezube-

legenund die Funktionder mitochondrialenFAS weiter aufzuklärenwurdenverschiedene

Ansätzeverfolgt.

In S.cerevisiaewurdenDeletionsmutantenverschiedenerEnzymeder mitochondrialen

FAS hergestelltund hinsichtlich ihrer Phänotypenmiteinanderverglichen.Es zeigtesich,

daßdie bei einigenMutantenauftretendeAtmungsdefizenzmit der Unterschreitungeines

kritischenSchwellenwertesdesLiponsäuregehalteskorreliert.

Für die mtACP-Deletionsmutantewurdeein zusätzlicher, von der Liponsäuresynthese

unabhängigerStoffwechseldefektgefunden.

In dermtACP-DeletionsmutantevonN. crassawurdeeinnormalerLiponsäuregehaltge-

funden.Durch in vivo Markierungmit [14C]-Panthotenatwurdein diesemOrganismusein

zweitesmtACP identifiziert und mtACP2genannt.Diesesliegt in der mtACP1-Deletions-

1. Zusammenfassung 2

mutantesowohl als freiesMatrix-Protein,als auchin kleinenMengenmit Komplex I-Vor-

stufenassoziiertvor. Durch den Versuchder heterologenKomplementationder mtACP-

DeletionsmutantevonS.cerevisiaewurdedasGenfür mtACP2vonN. crassagesucht.

In denzur Zeit verfügbarenGenomdatenbanken andererEukaryontenwurdenje nach

Organismusbis zu drei verschiedenemtACP-Genegefunden.Der Codon-Gebrauchjeweils

einesdiesermtACP-GeneentsprichtdemandererGenefür Komplex I-Untereinheiten.Aus

diesenBefundenwurdeder Schlußgezogen,daßeukaryontischeOrganismenin der Regel

zwei verschiedeneVariantendesmtACPbesitzen.

2. Einleitung 3

2 Einleitung

2.1 Die Fettsäuresynthasein Pro- und Eukaryonten

Die denovo Synthesevon Fettsäurenwird von einemalsFettsäuresynthase(FAS) bezeich-

netenEnzym-Verbundkatalysiert.In denBakterienunddenChloroplastenhöhererPflanzen

bestehtdieseraus6 bis7 diskretenEnzymen,die zusammenalsFAS vomTyp II bezeichnet

werden(McCarthy& Hardie,1984).Tiere und Pilze dagegenenthaltenin ihrem Cytosol

großemultifunktionelleEnzyme,bei denenalle katalytischenZentrenin Nachbarschaftauf

ein bis zwei Proteinkettenlokalisiert sind. DiesewerdenFAS vom Typ I genannt.Beide

FAS-TypenarbeitennachdemgleichenMechanismus(Abb. 1).

Ein Acetyl-CoAwird durchdieAcetyl-CoA-CarboxylasezuMalonyl-CoA carboxyliert.

Durch diesenSchritt erfolgt die Regulationder Fettsäurebiosynthese.Ein Acetyl- und ein

Malonyl-Rest werdenvon der Acetyl- bzw. Malonyl-Transferaseauf je ein Acyl-Carrier-

Protein(ACP) übertragen,dasdieseResteals Thioesteranein Panthetheinbindet.(Wakil,

1970).Die KondensationdesAcetyl- undMalonyl-ResteszumACP-gebundenenAcetoace-

tat wird durchdie β-Ketoacyl-ACP Synthasekatalysiert.Dabeiwird dasim erstenSchritt

durch CarboxylierungeingeführteCO2-Molekül abgespalten,so daßnur die ausAcetyl-

CoA stammendenKohlenstoffatomezur Verlängerungder Fettsäurekettebeitragen.Die β-

KetofunktiondesACP-gebundenenAcetoacetatswird durchdieβ-Ketoacyl-ACP-Reduktase

unterNADPH-Oxidationzur Hydroxyl-Funktionreduziert.Esentstehtdasβ-Hydroxyacyl-

ACP, dessenHydroxyl-Gruppenun durch die β-Hydroxyacyl-ACP-Reduktaseals Wasser

eliminiert wird. EsentstehtEnoyl-ACP, welchesuntererneutemNADPH-Verbrauchdurch

die Enoyl-ACP-Reduktasezu Acyl-ACPreduziertwird. Damit ist derersteSynthesezyklus

abgeschlossen.Die resultierendeC4-Fettsäurewird in weiterenZyklen durchReaktionmit

Malonyl-ACP verlängert.Fettsäurenmit mehr als sechzehnKohlenstoffatomensind kein

Substratmehr für die β-Keto-Acyl-ACP-Synthase.Die Fettsäuresynthesewird auf unter-

schiedlicheWeiseabgebrochen.In denmeistenEukaryontenwerdendie Fettsäurendurch

spezifischeThioesterasenfreigesetzt.In Pilzen,denendie Thioesterasenfehlen,wird die

Terminationdurch die Malonyltransferasekatalysiert,so daßPalmitoyl-ACP als Endpro-

dukt entsteht(Lynen,1980).In BakterienwerdenACP-gebundeneFettsäurendirekt für die

anschließendenReaktionenverwendet.NebendenEnzymenzurdenovoSynthesevonFett-

2. Einleitung 4

säurenbesitzenZellenElongasen,dieschonsynthetisierteoderausdemumgebendenMedi-

um aufgenommeneFettsäurenverlängern(Dittrich et al., 1998).UnterdenFAS vom Typ I

H O2

Acetyl-CoA

Acetyl-ACP Malonyl-ACP

Acetyl-CoA

Acetyl-CoA-

Carboxylase

Transferase

Acetyl-CoA-

Transferase

Malonyl-CoA-

Ketoacyl-ACPβ−

Ketoacyl-ACP-β−Synthase

Reduktase

Ketoacyl-ACP-β−

ACP-

Reduktase

Enoyl-

DehydrataseACP-

HCO3

Malonyl-CoA

CO2

Hydroxyacyl-ACPβ−

Hydroxyacyl-β−

NADP

NADP

+

+

NADPH

NADPH

Enoyl-ACP

Acyl-ACP Termination

-

Abbildung1: SchematischeDarstellungderFettsäurebiosynthese

ist die derHefeSaccharomycescerevisiaeambestenuntersucht.Dasauszwei unterschied-

lichenPolypeptidkettenbestehendeEnzymhateineα6β6-Struktur. Die beidenUntereinhei-

ten β und α werdenvon denGenenFAS1und FAS2codiert(Stoopset al., 1978).Elovson

(1975)fandauchin Neurospora crassaeinenentsprechendaufgebautenFAS-Multienzym-

Komplex. Die α-Ketteenthältin diesemPilz alsDomänenein ACP, die β-Keto-Acyl-ACP-

Synthaseund die β-Ketoacyl-ACP-Reduktase.Die β-Kette enthält die Acetyl-CoA:ACP

Transacylase,die Malonyl-CoA:ACP Transacylase,die Hydroxyacyl Dehydrataseund die

2. Einleitung 5

Enoyl Reduktase.

Im Gegensatzzur FAS ausPilzenbestehtdie FAS derTiereauszwei identischenProte-

inketten,die eineα2-Strukturbilden.JedederKettenbesitztalle notwendigenkatalytischen

Zentren(Wakil, 1989).In Euglenagracilis existiereneineFAS vomTyp I im Cytosolundei-

neFAS vomTyp II in denChloroplastennebeneinander(Deloetal., 1970;Hendren& Bloch,

1980).HöherePflanzenenthaltenallein eineFAS vom Typ II in ihren Chloroplasten.Alle

EnzymederFettsäuresynthasesind im Kerncodiert.EineAusnahmebildenzwei ACPein-

zelliger Algen und eineβ-Keto-Acyl-ACP-SynthaseeinerRotalge,die im Plastidengenom

codiertsind(Wang& Liu, 1991;Reith,1993).

2.2 Acyl Carrier Proteineund ihr eBeteiligungan Biosynthesewegen

Acyl CarrierProteine(ACP)sindsaureProteinemit einermolekularenMassevonca.10kDa.

An einemkonserviertenSerinetwain derMitte desPolypeptidsist dieprosthetischeGruppe

4’ -Phosphopantetheingebunden.Die StrukturdesACP ausEscherichia coli wurdedurch

2D-NMR-Spektroskopiebestimmt.Siezeigtvier amphipatischeHelices,von denendrei ei-

nehydrophobeTaschebilden.Am BodendieserTaschebefindetsichdaskonservierteSerin

mit demPhosphopantethein,andemdiewachsendeAcylgruppesynthetisiertwird (Holaket

al., 1988).E. coli bestitztnureineinzigesACP, dasaußerderFettsäuresynthesenochandere

biosynthetischeFunktionenhat(Cronan& Rock,1986;Magnusonet al., 1993).Sosinddie

Lipid A-Syntheseunddie SynthesederMembranlipidein E. coli ACP-abhängig.In diesem

BakteriumwurdeauchdieersteACP-abhängigeProteinacylierungentdeckt,dieAktivierung

von ProhaemolysinzumreifenHaemolysin(Issartelet al., 1991).Nebenihrer Rolle bei der

Fettsäuresynthesesind Acyl CarrierProteineauchan der Syntheseder heterogenenStoff-

klasseder Polyketidebeteiligt (Hopwood & Sherman,1990).Im Gegensatzzur Fettsäure-

synthese,bei dernachjedemKondensationsschrittdie neuhinzukommendeβ-Keto-Gruppe

durchReduktion,Dehydratisierungund erneuteReduktionzur Alkylgruppeumgewandelt

wird, findet diesbei der Polyketidsynthesenicht odernur zum Teil statt.Zu denPolyketi-

dengehörensoverschiedeneStoffe wie die FlavonoideundPhytoalexine derPflanzen,die

Mycotoxine der Pilze und diversein ActinomycetensynthetisierteAntibiotika. Auch die

Produktedernod-Gene,diediegegenseitigeErkennungvonRhizobienundPflanzenbeider

Nodulationvermitteln,sind Polyketide(Göttfert,1993).Die Enzymeder Fettsäure-(FAS)

2. Einleitung 6

und Polyketidsynthase(PKS) zeigenausgeprägteVerwandschaftenund könnenzum Teil

ihre Funktion in beidenBiosynthesewegenausüben.So läßt sich ein PKS-ACP durchein

FAS-ACPersetzen(Khoslaetal., 1992).DasNodF-GenproduktausRhizobiumleguminosa-

rum kanndurchdasACPausE. coli ersetztwerden,wenndie Signaldomänevon NodF, die

dieAnbindungdesNodF-Genproduktesandieβ-Keto-Acyl-ACP-Synthaseermöglicht,gen-

technischandasACPausE. coli angefügtwird (Ritsemaetal., 1997).In Streptomycesglau-

censis, einemgram-positivenBodenbakterium,kanneineMalonyl-CoA:ACPTransacylase

(MAT) der FettsäuresynthasedasACP der Polyketidsynthasemit Malonatbeladen.Diese

PolyketidsynthaseproduziertdasaromatischePolyketid-Antibiotikum TetracenomycinC.

Es wird vermutet,daßdie MAT an beidenBiosynthesewegenteilnimmt (Summerset al.,

1995).Acyl CarrierProteinesindnicht nur Trägerfür Acylreste,sondernauchfür Peptidre-

stebeidernicht-ribosomalenSynthesevonPeptidantibiotika,wie GramicidinundTyrocidin

(Lipmann,1980;Gocht& Marahiel,1994).Ein ACPwurdeauchalsBestandteilderCitrat

LyaseausKlebsiellaaerogenesidentifiziert(Dimroth et al., 1973).

2.3 Mitochondriale Acyl Carrier Proteine

Währenddie cytosolischeFAS vom Typ I langeals einzigeFettsäuresynthasevon Pilzen

und höherenEukaryontengalt, weiß manheute,daßin denMitochondriender Eukaryon-

ten eine FAS vom Typ II existiert. Ein mitochondrialesACP (mtACP) wurde zuerstvon

Brody und Mikolajczek(1988) in N. crassadurchMarkierugmit [14C]-Pantothenatiden-

tifiziert. HomologeProteineoderderenGenewurdenspäterunteranderemin Bos taurus

(Runswicket al., 1991),S.cerevisiae, Arabidopsisthaliana (Shintani& Ohlrogge,1994),

Caenorhabditiselegans(Wilsonetal., 1994)undSchizosaccharomycespombe(unveröffent-

licht, Acc. No. Z69380)gefunden.Alle bisheridentifiziertenmtACPswerdendurchKern-

genecodiertund besitzeneineN-TerminalemitochondrialeImportsequenz(von Heijne et

al., 1989).Im Zugeder verschiedeneneukaryontischenGenomprojekteundmolekularbio-

logischenUntersuchungenanunseremInstitut wurdennebendemmtACPin S.cerevisiae,

C. elegansundN. crassadieGenefür einemitochondrialeβ-Ketoacyl-ACPSynthase,sowie

eine β-Ketoacyl-ACP Reduktaseidentifiziert (Schneideret al., 1997; F. Bürger, Disserta-

tion 1999und dieseDissertation).In Hefe kommenGenefür möglicheweiteremitochon-

drialeFettsäuresynthese-Enzymevor. WegendergeringenKonservierungdieserEnzymeist

2. Einleitung 7

eineeindeutigeZuordnungder Genejedochnochnicht möglich (Schneideret al., 1997).

Die Hefe-Mutante∆acp, bei der dasmtACP-Geninaktiviert wurde,bildet einenrespirato-

rischdefizientenPhänotyp.Dasgleichewurdefür die Mutanten∆cemund∆oar gefunden,

denendie mitochondrialeβ-Ketoacyl-ACPSynthasebzw. mitochondrialeβ-Ketoacyl-ACP

Reduktasefehlen.Alle dieseMutantensind nicht mehrin der Lage,auf nicht vergärbaren

C-Quellenwie GlycerinoderLactatzu wachsenundschaltenvon Atmungauf Gärungum

(Schneideret al., 1995;Schneideret al., 1997).Dies konnte1997von Brody et al. erklärt

werdenalssichherausstellte,daßdasmtACPin HefeeinewichtigeRolle in derLiponsäu-

rebiosynthesespielt.

2.4 Die Beteiligung der bakteriellen und mitochondrialen Fettsäure-

synthasean der Liponsäurebiosynthese

Liponsäureist einschwefelhaltigerCo-FaktorverschiedenerMultienzym-Komplexewie der

Glycin-Decarboxylase,der Branched-Chain-Keto-Acyl Dehydrogenase,der Pyruvat Dehy-

drogenaseund der α-KetoglutaratDehydrogenase.Letzteresind SchlüsselenzymedesCi-

tratcyclus.Die CarboxylgruppederLiponsäureist durcheineAmidbindungandieε-Amino-

gruppeeinesLysinrestesin derAcetyl-Transferase-Untereinheit(E2) der Keto-Acyl Dehy-

drogenasenbzw. desH-Proteinsder Glycin Decarboxylasegebunden(Reed,1998;Douce

et al., 1994). Die Liponsäuredient dort der ÜbernahmedesAcyl-Restesder benachbar-

ten Untereinheit(E1) bei der Decarboxylierungsreaktion.Weiterewichtige Funktionender

LiponsäuresindnachneuerenUntersuchungenihreantioxidanteWirkunggegenüberreakti-

vemSauerstoff, sowie dieReduktionandererAntioxidantienwie VitaminC, Glutathionund

Vitamin E (Packeret al., 1995).

LiponsäurebestehtausOktansäure,derenC6-Atom durcheineDisulfidbrücke mit dem

C8-Atom verknüpft ist. In prokaryontischenZellen wurdedurchMarkierungsexperimente

gezeigt,daßOktansäureeine direkte Vorstufeder Liponsäureist (White, 1980).Die bei-

denSchwefelatomewerdendurchdaslipA-Genprodukt,dieLipoat-Synthase,eingefügt.Das

lipB-Genprodukt,die Lipoat-Ligase,überträgtdie Liponsäureauf ein entsprechendesapo-

Protein(Reed& Cronan,1992;Abb. 2).SiebenötigtalsSubstratLipoyl-ACP(Jordan& Cro-

nan,1997).EineweitereausBakterienbekannteLipoat-Ligaseist daslplA-Genproduktund

2. Einleitung 8

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Abbildung 2: Liponsäurebiosyntheseund Prozessierungin Bakterien(Morris et al., 1994;

Jordan& Cronan,1997)

wird als Lipoyltransferasebezeichnet.Dieseist in der Lagefreie Liponsäure,die auchaus

demumgebendenMediumstammenkann,zuadenylierenundaufeinpassendesapo-Protein

zu übertragen.Gleichzeitigist mit dieserTransferasedie Umgehungder lipB-Lipoat-Ligase

möglich(Morris et al., 1994;Abb. 2). Mit lip5 wurde1993von Sulo& Martin dasGenfür

einemitochondrialeLipoatsynthasein S.cerevisiaeidentifiziert.Ein homologesProteinwur-

dein A. thalianaalsTranslationsproduktdesGensLIP1 gefunden(Yasuno& Wada,1998).

Ein entsprechendescytosolischesPeptidist in keinemeukaryontischenOrganismusbekannt.

DaebenfallskeinecytosolischenLiponsäure-abhängigenEnzymebeschriebensind,wird an-

genommen,daßdie LiponsäurebiosynthesederEukaryontenmitochondrialabläuft(Sulo&

Martin, 1993).Hefe-Mutantenmit Deletionenin Genenfür Enzymeder mitochondrialen

FAS sindnicht in derLagezu atmenundzeigendenpet-Phänotyp(Schneideret al., 1997;

Tzagoloff & Diekmann,1990).DasFehlenderLiponsäureverhindertdie FunktiondesCi-

tratcyclusundbeeinträchtigtdamitdie Atmung(Brody et al., 1997).Esgilt daherheuteals

2. Einleitung 9

ncmtacp MFRTAALTAARVARPAVASAVRAGVARPAFVQAVPKVA---AFQAVRFYSAGGHLKKDEV

scmtacp MFRSVCRISSRVA-P---SAYRTIMGRSVMSN---------TILAQRFYSAN--LSKDQV

anmtacp MFRSAVVRSLRASVPRAVKTPAPFQIRSSPVARPAQFAPRFAYQGVRLYSAPAGLNKDEV

***. . * . * . * . * *** * **.*

ncmtacp FSRIAQVLSGFDKVN---DPKNITETAHFANDLGLD[S]LDTVEVVMAIEEEFSIEIPDK

scmtacp SQRVIDVIKAFDKNSPNIANKQISSDTQFHKDLGLD[S]LDTVELLVAIEEEFDIEIPDK

anmtacp EGRIVNLLKNFDKVS---DASKINVASHFANDLGLD[S]LDTVEVVMAIEEEFSIEIPDK

*. .. *** * ..* ***** * *****...****** ******

ncmtacp DADQIHSVDKAVEYILSQPDAN

scmtacp VADELRSVGETVDYIASNPDAN

anmtacp EADSIHSVDKAVEYILGQPD--

** ..** .*.** .**

Abbildung 3: AminosäuresequenzdesmtACP ausN. crassa(ncacp),S.cerevisiae (scacp)

und Aspergillus niger (anacp).Die Sternestehenfür identische,die Punktefür ähnliche

Aminosäuren.DaskonservierteSerin,dasdenPhosphopantethein-Restträgt,stehtin eckigen

Klammern[S].

gesichert,daßauchdie LiponsäurevorstufeOktanoyl-(mt)ACP mitochondrialsynthetisiert

wird. In N. crassaMitochondrienwie auchim Cytosolvon E. coli erfolgt die Ligation der

Liponsäurean ein apo-Proteinhauptsächlichdurchdie Lipoat-Ligase,die Lipoyl-ACP als

Substratbenötigt(Jordan& Cronan,1997;Abb. 2). Diesgilt nachneuerenUntersuchungen

auchfür dieMitochondrienausErbsen(Gueguenetal., 2000).DasmtACPübtdamitgleich

zweiwichtigeFunktionenim Liponsäurestoffwechselaus.

2.5 Dasmitochondriale ACP alsUntereinheit desAtmungsketten-Kom-

plex I

In N.crassaundB. tauruswurdedasmtACPalsUntereinheitdesAtmungsketten-Komplex I

isoliert. Der größteTeil desmtACP in dieserPosition trägt einenHydroxymyristat-Rest

(Sackmannet al., 1991).Auch in A. thalianafindetmandie größteMengedesmtACPacy-

liert und mit der mitochondrialenMembranassoziiert,währendein kleiner Teil deacyliert

2. Einleitung 10

frei in der mitochondrialenMatrix vorkommt,so daßauchhier auf eineIntegrationin den

Komplex I geschlossenwird (Shintani& Ohlrogge,1994).Eswird vermutet,daßdasmtACP

in allenOrganismeneineUntereinheitdesKomplex I ist, sofernsie ihn besitzen.Die Hefe

S.cerevisiaebesitztkeinenKomplex I, wohl abereinmtACP, dasfrei in dermitochondrialen

Matrix vorliegt (Cherétet al., 1993).Diesesist nur um eineAminosäurelängeralsdasaus

N. crassa. Die Sequenzidentitätzwischenbeidenbeträgt45 %. Im Bereichvon 20 Amino-

säurenumdenkonserviertenSerinrestherumbeträgtdieSequenzidentitätsogar85 % (Abb.

3).

2.6 Der Aufbau desAtmungsketten-Komplex I

Die NADH:UbichinonOxidoreduktase(E.C.1.6.99.3),derKomplex I deroxidativenPhos-

phorylierung,verbindetdieElektronenübertragungvonNADH aufUbichinonmit derTrans-

lokationvonvier Protonenüberdie innereMitochondrienmembran.DerKomplex kommtin

der innerenMitochondrienmembrandermeistenEukaryontenund in derCytoplasmamem-

branvieler Eubakterienvor. Gut untersuchtist bisherder mitochondrialeKomplex ausB.

taurus(Walker, 1992)undN. crassa(Weissetal., 1991),sowie derbakterielleKomplex aus

E. coli (Leif et al., 1995)und Paracoccusdenitrificans(Yagi et al., 1993).Der Komplex I

in Bakterienbestehtaus14 Untereinheiten.Diesesind in zwei Armenangeordnet,die eine

L-förmigeStrukturbilden(Guénebautetal., 1998,Abb. 4).SiebenhydrophobeUntereinhei-

tendurchspannendie CytoplasmamembranundbildendensogenanntenMembranarm.Die

verbleibendensiebenUntereinheitenbildendenausderMembranins Cytoplasmaragenden

peripherenArm.

Der mitochondrialeKomplex I enthältnebenden 14 Homologenzu den bakteriellen

Komplex I-Untereinheiten,die alsminimaleUntereinheitenbezeichnetwerden,nochbis zu

28 sogenannteakzessorischeUntereinheiten.Diesesind um dasGrundgerüstausdenzum

bakteriellenKomplex I homologenUntereinheitenangeordnet(Abb. 4).

Alle bisherim Komplex I identifiziertenprosthetischenGruppensindaufdenperipheren

Untereinheitenlokalisiert. Es handeltsich dabeium ein Flavinmononukleotid(FMN) und

bis zu sechsESR-spektroskopischsichtbareEisen-Schwefel-Cluster(FeS-Cluster).Bis auf

die Ubichinon-Bindestelle(Friedrichet al., 1990)konntedenUntereinheitendesMembran-

armskeineeindeutigeFunktionzugeordnetwerden(Weisset al., 1991;Fearnley & Walker,

2. Einleitung 11

1992).UV-VIS-spektroskopischeUntersuchungenvorangegangenerDoktorarbeitengeben

jedochHinweiseauf dasVorhandenseineinerweiteren,strukturelljedochnochunbestimm-

tenRedoxgruppe(Schulteet al., 1999;Friedrichetal., 2000;N. Amling, Dissertation1996;

A. Abelmann,Dissertation1999;V. Haupt,Dissertation1999).

Abbildung4: ÜberlagerungderauselektronenmikroskopischenBildernrekonstruiertendrei-

dimensionalenModelle desKomplex I ausE. coli (ausgefüllt)und N. crassa(Gittermo-

dell). Der Membranarmist dunkel, der periphereArm hell dargestellt(nachGuénebautet

al., 1998).

2. Einleitung 12

2.7 Die BiosynthesedesKomplex I in Neurosporacrassa

Der mitochondrialeKomplex I ist dualengenetischenUrsprungs.Die Homologenzu den

siebendieMembrandurchspannendenUntereinheitendesbakteriellenKomplex I werdenin

Eukaryontenvon dermitochondrialenDNA (mtDNA) codiert.Alle übrigenUntereinheiten

sind im Kern codiertund werdennachihrer Synthesean cytosolischenRibosomenin die

Mitochondrientransportiert.Die AssemblierungdesKomplex I verläuftüberdie unabhän-

gig gebildetenTeileMembranarmundperiphererArm, dieenbloczusammengefügtwerden.

DerMembranarmseinerseitswird auszweizueinanderkomplementärenSubkomplexen,der

großenund der kleinen Vorstufe,gebildet(Schulteet al., 1994;Abb. 5). DiesesBild der

ACB�DFE�GIHJG�KMLCB NPO�NPB�KRQPDCB SUT@V�WG

XZY G�[ O\G]HJGPK�LFB N�O\N�B�K+Q�DFB SZT@V\WG

^�GPB�[ ^C_\G�B GPBZ`�B�K

HJGPK�LFB N�O�NPB�K

a DFK�^ Y GUb]c

Abbildung5: SchemazurAssemblierungvonKomplex I in N. crassa(Schulteetal., 1994).

AssemblierungdesKomplex I ergabsichausderUntersuchungvon N. crassaMutanten,in

denenGenevonKomplex I-Untereinheitenausgeschaltetwordenwaren(Nehlsetal., 1992).

Diese Mutantenwerdenals nuoX bezeichnet,wobei sich nuo auf [N]ADH:[U]bichinon

[O]xidoreduktaseundX auf die molareMassederbetroffenenUntereinheitin kDa bezieht.

DasAusschaltenvon Genenvon UntereinheitendesperipherenArms führt zu Mutanten,

2. Einleitung 13

in denendie AssemblierungdesMembranarmsnocherfolgt, die desperipherenArms je-

dochunvollständigist. Diesreichtvom FehleneinzelnerUntereinheitenwie in derMutante

nuo51(Fecke et al., 1994)bis zum FehlendesgesamtenperipherenArms in der Mutan-

te nuo49(K. Cernus,Diplomarbeit).DasAusschaltenvon Genen,die Untereinheitendes

Membranarmscodieren,führt zueinergestörtenAssemblierungdesMembranarms.Derpe-

riphereArm wird in solchenMutantennochvollständiggebildet.So reichertdie Mutante

nuo20.9die kleineVorstufedesMembranarmsan,die aus7 kerncodiertenund2 mitochon-

drial codiertenUntereinheitenbesteht.Die Mutantenuo21.3bildet nochdie großeVorstufe

desMembranarmsaus6 kerncodiertenund 5 mitochondrialcodiertenUntereinheiten,die

kleine Vorstufeabernur nochunvollständig.Die Anhäufungder Vorstufenin diesenMu-

tantenermöglichtedie IsolierungundbiochemischeCharakterisierungvon TeilendesKom-

plex I.

ZweiderakzessorischenUntereinheitendeseukaryontischenKomplex I sindhomologzu

biosynthetischaktivenProteinen.Eine40kDagroßeperiphereUntereinheitzeigtVerwandt-

schaftzu einerheterogenenFamilie von Reduktasen/Isomerasenund trägt wie dieseeinen

NADPH-Co-Faktor, der nicht am ElektronentransportdesKomplex I beteiligt ist (Walker,

1992;Schulteet al., 1999).EineDeletionsmutante,in der dieseUntereinheitgenetischin-

aktiviert wurde,bildeteinenbis aufdieseUntereinheitvollständigassembliertenKomplex I

mit intakterNADH DeydrogenaseAktivität und allen bekanntenprosthetischenGruppen.

DerMutanten-Komplex I ist jedochnicht in derLageUbichinonzu reduzieren.Eswird dis-

kutiert, daßdie 40 kDa Untereinheitan der Biosyntheseeine im Membranarmgelegenen

strukturellnochnicht bestimmtenRedoxgruppebeteiligt ist (Schulteet al., 1999).Eineca.

10 kDa großeakzessorischeUntereinheitdesperipherenArms ist dasobenbeschriebene

bisherbekanntemtACP von N. crassa(Sackmannet al., 1991;Runswicket al., 1991).In

der Mutantenuo9.6oderacp1, bei der dasGenfür dasmtACP ausgeschaltetwurde,wird

keinerder beidenArme desKomplex I korrekt assembliert.Für diesesmtACP wird daher

eineFunktionbei der AssemblierungbeiderArme angenommen(Schneideret al., 1995).

EineÜbersichtüberKomplex I-Mutantenin N. crassagibt Tabelle1.

2. Einleitung 14

Tabelle1: Deletionsmutantenvon Komplex I mit unvollständigerAssemblierungdesKom-

plexesMutante Lokalisation der

ausgeschalteten

Untereinheit

AkkumulierteTeiledesKomplex I Literatur

nuo78 PeriphererArm Membranarm,Restedesperipheren

Arms

Harkness et al., 1995;

U. Wobschall,Dissertati-

on 1997

nuo51 PeriphererArm Membranarmohne51 kDa Unter-

einheit

Fecke etal., 1994

nuo49 PeriphererArm Membranarm K. Cernus,Diplomarbeit

nuo40 PeriphererArm Komplex I ohne40 kDa Unterein-

heit

W. Fecke, Dissertation

1993

nuo29.9 PeriphererArm Membranarm Duarteet al., 1995

nuo21.3a Kleine Membran-

armvorstufe

PeriphererArm, große Membran-

armvorstufe, kleine Membranrm-

vorstufe ohne 21.3 kDa Unterein-

heit

Nehlsetal., 1992

nuo21.3b PeriphererArm Komplex I ohne21.3kDaUnterein-

heit

Alves& Videira,1994

nuo20.9 Große Membran-

armvorstufe

PeriphererArm, kleine Membran-

armvorstufe

C. Krüll, Dissertation

1995

nuo12.3 Membranarm PeriphererArm, Membranarmohne

die 12.3kDaUntereinheit

Duarteet al., 1995

nuo10.4 Große Membran-

armvorstufe

PeriphererArm, kleine Membran-

armvorstufe

C. Krüll, Dissertation

1995

nuo9.6

(acp1)

PeriphererArm unvollständigerMembranarm Schneideret al., 1995

2. Einleitung 15

2.8 Thema der Arbeit

In N. crassaund B. taurus ist dasmtACP eineperiphere,akzessorischeUntereinheitdes

Atmungsketten-Komplex I. Die genetischeInaktivierungdesmtACPführt zu einergestör-

ten AssemblierungdesKomplex I. DasProdukteinesSyntheseweges,an demdasmtACP

beteiligt ist, scheintfür die AssemblierungdesKomplexesnotwendigzusein.Weitergehen-

deAtmungsdefekteliegenin dieserN. crassa-Mutantenicht vor. Die HefeS.cerevisiae, die

ohneKomplex I auskommt,besitzteinmtACPalsfreiesMatrix-Protein.SeineInaktivierung

führt überdenVerlustderLiponsäuresynthesezurvollständigenAtmungsdefizienz.Dasbis-

her bekanntemtACPscheintdemnachin N. crassaundS.cerevisiaeeineunterschiedliche

Funktionauszuüben.DaN. crassaaufeineeigeneLiponsäuresyntheseangewiesenist, sollte

dieserPilz einezweitemtACP-Isoformbesitzen.

In dieserArbeit solltezunächstdieLiponsäuresynthesein derN.crassamtACP-Deletions-

mutanteuntersuchtwerden.Durch in vivo Markierungmit [14C]-Panthotenatsollte eine

zweite mtACP-Isoformnachgewiesenwerden.Genefür mtACP-Isoformensollten in den

zugänglichenGenomdatenbankengesuchtwerden.

Mit S. cerevisiae sollten Deletionsmutantender anderenEnzymeder mitochondrialen

FAS erzeugtwerden.Die BeziehungzwischendemVerlustderAtmungundderLiponsäu-

rebiosynthesesolltegeklärtwerden.

3. MaterialundMethoden 16

3 Material und Methoden

3.1 Lösungen,Puffer und Medien

Vogels-Minimalmedium(Vogel,1956)

3 g/l Natrium-Citrat

5 g/l KH2PO4

2 g/l NH4NO3

0,2g/l MgSO4 d 7 H2O

0,1g/l CaCl2 d 2 H2O

5 µg/l Biotin

0,1ml/l Spurenelementlösung

20g/l Saccharose

Spurenelementlösung

50g/l Citronensäure

50g/l ZnSO4 d 7 H2O

2,5g/l CuSO4 d 5 H2O

0,5g/l H3BO3

10g/l Fe(NH4)2(SO4)2 d 6 H2O

0,5g/l MnSO4

Kreuzungsmedium(Davis & deSerres,1970)

1 g/l KNO3

0,7g/l KH2PO4

0,5g/l KH2PO4


0,1g/l CaCl2


0,1g/l NaCl

5 µg/l Biotin

0,1ml/l Spurenelementlösung

20g/l Saccharose

PBS

50mM Na-Phosphat,pH 7,2

0.9%NaCl

SSC

150mM NaCl

15mM Na-Citrat,pH 7,0

SM-Medium

100mM NaCl

50mM Tris-Cl (Tris[hydroxymethyl]-aminomethan)-Chlorid,pH 7,5

10mM MgSO4

0,01%(w/v) Gelatine

DNA-Probenpuffer 5x

10mM EDTA (Ethylendiamintetraacetat)

445mM Tris-Borat,pH 8,3

0,25%(w/v) Bromphenolblau

0,25%(w/v) Xylencyanol

50%(v/v) Glycerin

Protein-Probenpuffer 4x


1 M Saccharose

200mM Tris-Acetat,pH 6,8

5 mM EDTA

7 mM DTE (Dithioerytritol)

5%(w/v) SDS(Natriumdodecylsulfat)

0,1%(w/v) Bromphenolblau

Kammerpuffer

2 M Glycin

0,25M Tris-Cl, pH 8,3

0,5%(w/v) SDS

TBE

89mM Tris-Borat,pH 8,3

1 mM EDTA

Luria-Broth(LB)

10g/l Casein-Hydrolysat(PeptonNo. 140,Gibco)

5 g/l NaCl

5 g/l Hefe-Extrakt(Gibco),pH 7,5

TOP-Agarose

0,7%Agarosein LB

YP

1%(w/v) Hefe-Extrakt

2%(w/v) Bacto-Pepton

mit 2%Glucose(YPD) oder3% Glycerin(YPG)


YNB

0,67%YeastNitrogenBase(Difco)

mit 2%Glucose(SD)

AminosäurenundandereSupplementeje nachAuxotrophien

Sporulationsmedium

1%K-Acetat

0,1%Hefe-Extrakt

0,05%Glucose

AminosäurenundandereSupplementeje nachAuxotrophien

BGM 2x - BasalGrowth Medium(Herbert& Guest,1970)

4 g/l Casein-Hydrolysat

14g/l K2HPO4

6 g/l KH2PO4

1 g/l Na3 citratd 3 H2O


2 g/l (NH4)2SO4

8 g/l L-Asparaginsäure

0,2g/l L-Arginin

0,2g/l L-Glutaminsäure

0,2g/l Glycin

0,2g/l L-Histidin

0,2g/l L-Prolin

0,36g/l L-Tryptophan

0,16g/l L-Cystein


0,2g/l Na thioglycolat

200mg/l Kanamycin

STET

50mM Tris-Cl, pH 8,0

50mM EDTA

8%Saccharose

5%Triton-X-100

TE

10mM Tris-Cl, pH 8,0

1 mM EDTA

SOB(Hanahan,1983)

2%Casein-Hydrolysat

1,5%Hefe-Extrakt

10mM NaCl

2,5mM KCl

10mM MgCl2

10mM MgSO4, pH 6,7-7,0

TB

10mM Pipes[1,4 Piperazinbis(ethansulfonsäure)]

55mM MnCl2

15mM CaCl2

250mM KCl

Für festeNährbödenwurde1,8%(w/v) Agar(SERVA) zugegeben.Ampicillin wie Kanamy-

cin wurdenzueinerEndkonzentrationvon 100mg/l zugegeben.Leucin,Uracil, Tryptophan

undHistidin wurdenin Endkonzentrationenvon20 mg/l eingesetzt.


3.2 Mikr oorganismenund Vektoren

Mikroorganismen

E. coli DH5α (Hanahan,1983)

E. coli MB 406(Woodcocket al., 1989)

E. coli KER 176(vandenBoomet al., 1991)

E. coli BNN 132(Elledgeet al., 1991)

N. crassaWildtyp SL 74-OR23-1A& OR8-1a(FGSC987& 988)

N. crassaMutantepan-2A& a(FGSC4103& 4104)

N. crassaMutanteacp1(Schneideretal., 1995)

S.cerevisiaeVW1 [MATa,∆his3,leu2-3,ura3-52,trp1-289]

S.cerevisiaeVW1 [2n, ∆his3,leu2-3,ura3-52,trp1-289](zurVerfügunggestellt

vonKD Entian)

S.cerevisiaeMutante∆cem(F. Bürger, Dissertation,1999)

Vektoren

pT7T319U(Meadet al., 1986(Pharmacia)

YEp352,YEp351(Hill etal., 1986)

pSCmtACP-P/SX(SchneiderR, Dissertation,1995)

PTSCmtACP(SchneiderR, Dissertation,1995)

YCp50(Roseet al., 1987)

λJ1(Orbachet al., 1986)

λAD5 (Brunelli etal., 1993)

Oligonucleotide

HmtACP-AS3x5’-GCTCTAGAGAYYTXGGXYTXGAYWSXY

TXGA-3’ (W=A,T; R=A,G; Y=C,T; S=G,C)


HmtACP-C2e5’-AAGAATTCATYTGRTCXGCRCTYTTRTCX

GG-3’

leu2-R5’-GTCAGAAACGGCCTTAACGACGTA-3’

3.3 Zucht und radioakti veMarkierung von Mikr oorganismen

Zur Zuchtvon E. coli wurdendie Bakterien16 h bei 37 oC geschüttelt.Für Stammkulturen

wurden0,5ml steriles80% Glycerinmit 300µl einerBakterienkulturvermischt,bei-196oC

schockgefrorenundbei -70oC aufbewahrt.Die AnzuchtvonS.cerevisiaeerfolgtebei30 oC

in Batch-Kulturenvon50ml. Stammkulturenwurdenwie beiE.coli angelegt.Die Zuchtvon

N. crassaerfolgteübereinenZeitraumvon 20 bis 40 h bei 28 oC in mit Pressluft(20 l/min)

belüfteten8 l Batch-Kulturen oder in 100 ml Schüttelkulturenin Vogels-Medium(Weiss

et al., 1970;Davis & de Serres,1970).Zur radioaktiven Markierungwurden5 µCi [14C]-

Pantothensäure(BioTrend)in 100 ml Medium gegeben.Zur Verfolgungder Abnahmeder

Aktivität im Mediumwurden100µl desMediumsmit 1 ml QuicksafeA (Zinser)gemischt

undin einemFlüssigkeitsszintillationszählergemessen.Zur GewinnungvonMakrokonidien

wurden8 ml Schrägagarröhrchen(3ml Vogelsmediummit 1,5%Agar)oder350ml Weithals

Erlenmeyerkolben(100ml Vogels-Mediummit 1,5 % Agar) mit Makrokonidienangeimpft

und5-10TageunterBelichtungbei30oC inkubiert.Die GewinnungvonAscosporenerfolg-

te in Petrischalenmit Kreuzungsmedium.Die Agarplattenwurdenmit Makrokonidender

beidenStämmeunterschiedlicherPaarungstypenan gegenüberliegendenSeitenangeimpft

und 21 Tageim Dunkeln bei 22 oC und anschließendfür 7 Tagebei 30 oC unterBelich-

tunginkubiert.Die andenDeckeln derPetrischalenhaftendenAscosporenwurdenmit 1 ml

sterilemWasserabgewaschenundbei 4 oC gelagert.Zur VereinzelunghomokaryonterPil-

zewurdenAscosporenauf Vogels-Agarplattenausplattiert,2 h bei 60 oC hitzeaktiviert und

anschließendüberNachtbei30 oC inkubiert.EinzelneausgekeimteAscosporenwurdenmit

einersterilenPlatinnadelaufSchrägagarröhrchenübertragen.

3.4 Transformation von Mikr oorganismen

Zur GewinnungkompetenterE. coli-Zellenwurden1000ml SOB-Mediummit 200µl einer

Übernachtkulturin LB-Medium angeimpftundbei 18 oC bis zu einerOD600 von 0,6ange-


zogen.Die Zellenwurden10 min auf Eis inkubiert undanschließend10 min bei 4 oC und

2500g abzentrifugiert.DasSedimentwurdein 80 ml TB resuspendiert,erneutnachzehn-

minütigerInkubationauf Eis abzentrifugiertundin 20 ml TB aufgenommen.NachZugabe

von DMSO bis zu einerEndkonzentrationvon 7 % wurdendie Zellen in flüssigemStick-

stoff schockgefrorenundbei -70 oC gelagert.Die TransformationerfolgtenachInoueet al.

(1990).200µl tiefgefrorene,kompetenteZellenwurdenaufgetautundmit 10-200ng DNA

in maximal10 µl Volumenfür mindestens15 min auf Eis inkubiert.Anschließendwurden

dieZellenin einemEppendorfgefäßfür 90sauf42 oC erwärmt,dannaufEisabgekühltund

nachZugabevon1 ml LB-Medium60min bei37oC geschüttelt.Die Bakterienwurdenkurz

abzentrifugiert,in 50-150µl LB-Mediumresuspendiertundausplattiert.

Die Transformationvon S.cerevisiaeerfolgtenachSoniet al. (1993)in Gegenwart von

Lithiumacetat.1,5ml einerÜbernachtkulturvonHefewurdenfür 5 min bei5000g abzentri-

fugiert.Die zu transformierendeDNA und50 µg Herings-Sperma-DNA wurdein möglichst

kleinemVolumenzum Zellsedimentgegebenund gut mit diesemgemischt.Anschließend

wurden0,5 ml 40 % Polyethylenglycol3350(Sigma),100mM Li-Acetat, 10 mM Tris-Cl,

pH 7,5,1 mM EDTA undDMSO bis zu einerEndkonzentrationvon 10 % zugegebenund

15 min bei Raumtemperaturinkubiert.Anschließendwurdendie Zellen 15 min bei 42 oC

inkubiert,abzentrifugiert,in TE gewaschenundnachResuspendierenin TE ausplattiert.

Diploide Hefe wurde nachder Transformationzur ErhaltunghaploiderMutantender

Tetradenanalyseunterzogen.Dazuwurdedie Hefeauf Sporulations-Agardurchmehrtägige

Inkubationbei30oC zurSporulationgebracht.EinekleineZellmengewurdein 50µl Wasser

resuspendiertundnachZugabevon5 µl Zymolase-Lösung(10mg/ml)10min beiRaumtem-

peraturinkubiert. Anschließendwurdedie Zellsuspensionin einemschmalenStreifenauf

einerYPD-Platteausgestrichen.Mit einemMikromanipulatorwurdendie einzelnenSporen

einerTetradesepariertundandefiniertenPunktenaufderPlatteabgelegt.

3.5 Umwandlung der PhagenbibliothekλAD5 in die Plasmidgenbiblio-

thek pYADE5

In dieserArbeit wurdedie exprimierendeN. crassacDNA-GenbibliothekλAD5 verwen-

det.Siekombiniertdie VorteileeinerGenbibliothekim Phagenλ, wie leichteVermehrung,


hoheInfektionsrateundeffiziente in vitro-Verpackung,mit derMöglichkeit, durchcre/lox-

vermittelteautomatischeSubklonierungPlasmidezu erhalten,die zur Transformationso-

wohl von E. coli als auchS. cerevisiae eingesetztwerdenkönnen.Die in vivo Plasmid-

Excision wird durch die katalytischeAktivität der cre-Rekombinasevermittelt, die durch

ortsspezifischeRekombinationan 24 Bp langen,sogenanntenlox-Sequenzendie Plasmid-

KomponentedesPhagenλAD5 mit demcDNA-InsertherausschneidetundzumPlasmidring

schließt.DenerhaltenenPlasmidenfehlt einelox-Sequenz(Brunelli & Pall, 1993).

EineEinzelkoloniedescre-RekombinaseproduzierendenE. coli StammsBNN 132wur-

de in 100 ml LB, 10 mM MgSO4, 0,2 % MaltoseüberNachtbei 30 oC geschüttelt.Die

Bakterienwurdenbei 5000g sedimentiertund zu einerOD600 von 1,0 in 10 mM MgSO4

resuspendiert.1 ml dieserBakteriensuspensionwurdemit 108 Phagenbei 30 oC für 30 min

infiziert. NachZugabevon 2 ml LB wurdebei 30 oC für 1 h geschüttelt.Dannwurdeein

Aliquot derSuspensionzurBestimmungderInfektionseffizienzaufeinerLB-Plattemit Am-

picillin ausplattiert.Der Restder Bakterienwurdein 1000ml LB mit der halbenüblichen

Ampicillinkonzentrationbei 28 oC angezogen.Anschließendwurdedie Plasmid-DNA mit

demQIAGEN Midi Kit (Qiagen,Hilden) nachHerstellervorschrift isoliert undzur Tranfor-

mationvonS.cerevisiaeeingesetzt.

3.6 Isolation genomischerDNA

Zur IsolationgenomischerDNA ausN. crassawurden300-500mg (Feuchtmasse)frisches

oder tiefgefrorenesMycel in flüssigemStickstoff fein gemörsert.200-300mg wurdenin

2 ml Safelock-Eppendorf-Gefäßenmit 0,9 ml Lysepuffer (50 mM EDTA, pH 8,0, 0,2 %

SDS,100 µg/ml RNAse A) versetztund geschüttelt.Die wässrigePhasewurde zweimal

mit ca.1 Volumenäquilibriertem(0,1M Tris-Cl,pH 8,0)Phenolundeinmalmit Chloroform

extrahiert.AnschließendwurdedieDNA mit ca.1 VolumenIsopropanolgefälltundmit einer

Pasteurpipetteausgewickelt.NachWaschenin 70% EthanolundAbzentrifugationderDNA

wurdedasSedimentkurzanderLuft getrocknetundin 50-200µl Wasseraufgenommen.Die

Ausbeutebetrug10-30µg.

Zur Isolationvon genomischerundPlasmid-DNA ausS.cerevisiaewurdedie Methode

nachHoffmann& Winston (1987)verwendet.10 ml einerÜbernacht-Kultur von Hefe in

YPD wurdeabzentrifugiert.DerÜberstandwurdeabgegossenunddieHefeim RestdesMe-


diumsresuspendiert.NachZugabevon0,3gGlasperlen( /0 0,5mm),200µl Quick-Lysepuffer

(2 % Triton X-100, 1 % SDS,100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA) und

200µl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1),wurdendie Zellen für 5 min auf dem

Vortex aufgeschlossen.Die Trümmerwurdendurch10 min Zentrifugationbei 12 000g se-

dimentiertunddie DNA ausderwässrigenPhasemit 0,7 VolumenIsopropanolgefällt. Die

DNA wurdefür 10 min bei 12 000g zentrifugiert,kurz anderLuft getrocknetundin 50 µl

Wasseraufgenommen.5 µl dieserDNA-LösungwurdenzurTransformationvonE. coli ein-

gesetzt.FüreinenSouthernblottwurden20µl derDNA-Lösungverwendet.

3.7 AllgemeinemolekularbiologischeMethoden

FürdiePlasmidisolierungausBakterienwurdedie“Boiling-Lysis”-Methodeverwendet(Sam-

brook et al., 1989).1,5 ml einerÜbernacht-Kultur von E. coli wurdenabzentrifugiertund

dasSedimentin 0,5ml STETresuspendiert.NachZugabevon 20 µl Lysozymstammlösung

(50mg/ml)wurde15min aufEis inkubiert.AnschließendwurdedieSuspensionfür 3,5min

in einemkochendenWasserbaderhitzt und dannauf Eis abgekühlt.Nach10 min Zentri-

fugationbei 12 000 g wurdedasSedimentmit einemZahnstocherausdem verwendeten

Eppendorf-Gefäßentfernt.DerÜberstandwurdemit 0,5ml Isopropanolversetztund10min

auf Eis inkubiert.Die Plasmid-DNA wurde10 min bei 12 000 g abzentrifugiertund kurz

an der Luft getrocknet.Anschließendwurdedie DNA in 50 µl Wasseraufgenommen.Die

präparative Plasmid-Isolationwurdeaus50 ml Bakterienkulturmit demQIAGEN Midi Kit

(Qiagen,Hilden)nachHerstellervorschriftdurchgeführt.

Zur SuchenachgenomischenFragmentenwurde eine genomischeGenbibliothekim

BakteriophagenλJ1 (Orbachet al., 1986) verwendet.Der E. coli-StammMB 406 wurde

über Nacht bei 37 oC in 50 ml LB-Medium mit 0,2 % Maltoseangezogen.Nach 5 min

Zentrifugationbei 5000g wurdedasBakteriensedimentin 10 mM MgSO4 aufgenommen

undeineOD600 von 1,0 eingestellt.Je150µl derBakteriensuspensionwurdenmit 2 x 104

Phagenin 10-100µl SM 30 min bei 37 oC inkubiert,anschließendmit 5 ml TOP-Agarose

auf LB-PlattenausplattiertundüberNachtbei 37 oC inkubiert.BiodyneA Membranwur-

de für 3 min auf die Plattengelegt und die Lageder Filter auf denPlattenmarkiert.Von

jedemFilter wurdedurchAuflegeneinerweiterenMembraneineKopiehergestellt.Die Ny-

lonmembranenwurdendann5 min mit 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl benetztund dannmit


2 x SSCneutralisiert.NachdemTrocknenfür 60 min wurdedie DNA durchBestrahlenmit

UV-Licht (254nm) für 3 min aufdenMembranenfixiert. Die Nylonmembranenwurdenmit

einerradioaktiv markiertenDNA-Sondehybridisiert.Plaquesmit positivenSignalenwurden

durchAutoradiographiemit demBioAnalyzing-SystemBAS 1800der Firma Fuji identifi-

ziert. SolchePlaqueswurdenausgestochen,mit 500µl SM undeinemTropfenChloroform

über Nacht inkubiert und erneutzur Infektion von E. coli verwendet,bis einzelnepositi-

ve Klone identifiziertwerdenkonnten.Diesewurdenebenfalls ausgestochenund in 200µl

SM Medium mit einemTropfenChloroforminkubiert und zur Isolationvon Phagen-DNA

eingesetzt.

Phagen-DNA wurdeausFlüssig-Lysatenisoliert (Lockett,1990).1 ml einerÜbernacht-

Kultur MB 406in LB mit 0,2% Maltoseund10 mM MgSO4 wurdenmit 50 µl derPhagen-

suspensionausdenals positiv identifiziertenEinzelplaquesversetztund 10 min bei 37 oC

inkubiert. Anschließendwurdedie Suspensionin 100 ml LB Medium mit 0,2 % Maltose

und10 mM MgSO4 gegebenundbei 37 oC geschüttelt.Die OD600 wurdeverfolgt, bis sie

nachdemerstenAnstieg auf 0,3-0,4gesunken war. 100 ml diesesFlüssig-Lysateswurden

mit 250 µl Chloroform und NaCl bis zu einer Endkonzentrationvon 0,9 M versetztund

geschüttelt.Nach10min InkubationaufEiswurdendieBakterienrestedurch10min Zentri-

fugationbei 10 000g entfernt.NachZugabevon 7,5g Polyethylenglycol6000und30 min

Inkubationauf Eis wurdendie präzipitiertenPhagen10 min bei 12 000 g abzentrifugiert.

DasPhagensedimentwurdein 2,5ml SM resuspendiert.Zur EntfernungbakteriellerNukle-

insäurenwurden50 µg RNAseA und12,5µg DNAsezugegebenundfür 30 min bei 37 oC

inkubiert.ZumAufschlußderPhagenköpfewurden2,5ml 300mM Tris-Cl,pH 9,0,100mM

EDTA, 1,25% SDSzugegebenund10min bei65oC inkubiert.Anschließendwurden2,5ml

eiskaltes3 M Kaliumacetat,pH 4,8zugegebenund10 min aufEis inkubiert.GefällteProte-

ine wurdenbei 10 min bei 12 000g abzentrifugiert.7 ml desÜberstandeswurdenmit 5 ml

Isopropanolversetztunddie DNA 5 min bei 12 000g abzentrifugiert.DasDNA-Sediment

wurdemit 70% EthanolgewaschenundnachdemTrocknenin 150µl TE gelöst.

Restriktionsverdausvon 0,2-2 µg Plasmid-DNA wurdenin 20 µl Gesamtvolumenmit

1-10U Enzymfür 1-2 h nachHerstellerangabendurchgeführt.GrößereMengenDNA, so-

wie Phagen-undgenomischeDNA wurdenin 50-100µl Gesamtvolumenverdaut.Die De-

phosphorylierungvon DNA wurdemit alkalischerPhosphatase(CIP, Roche),die Ligation


von DNA mit T4 DNA-Ligase (Roche)nachHerstellerangabendurchgeführt.Zur DNA-

Fragment-Isolationwurdedie DNA mit demjeweiligenRestriktionsenzymgeschnittenund

in einemAgarosegel aufgetrennt.Unter UV-Licht wurdedie gewünschteBandelokalisiert

undmit einemSkalpellausdemGel ausgeschnitten.Die ExtraktionderDNA ausdemGel-

block wurdemit dem QIAEX-II Gel ExtractionKit (Qiagen,Hilden) nachHerstellervor-

schrift durchgeführt.

Die radioaktive Markierungvon DNA-FragmentenwurdenachFeinberg & Vogelstein

(1983) durchgeführt.Für die Markierung wurde [α32P]-dATP (3 Ci/mmol, ICN) einge-

setzt.Die AufreinigungmarkierterDNA-FragmenteerfolgtedurchGelfiltration übereine

Sephadex-G50Säule.EswurdenspezifischeAktivitätenvon5 x 108 cpm/µg DNA erzielt.

DerTransfervonDNA-FragmentenausAgarosegelenaufNylonmembranen(BiodyneA

für Plasmid-undPhagen-DNA, BiodyneB für genomischeDNA, Fa.Pall) erfolgtein 0,4M

NaOHüberNachtbei Raumtemperatur(Southern,1975).Bei Verwendungvon BiodyneA

wurdedie DNA durcheinekurzeUV-Bestrahlung(254nm, 10 W, 15 cm Abstand,3 min)

aufderMembranfixiert.

ZurHybridisierungmit radioaktiv markierterDNA wurdedieNylonmembranin 250mM

Na-Phosphat,pH 7,2, 7 % SDS und 2,5 mM EDTA 1 h bei 65 oC prähybridisiert.Nach

Zugabeder hitzedenaturierten,radioaktiv markiertenDNA-Sondeund 10 ml frischerHy-

bridisierungslösungwurdeüberNachtunterdengleichenBedingungenhybridisiert(Church

& Gilbert, 1984).Die Nylonmembranenwurdenanschließenddreimalmit 2 x SSC,0,3 %

SDSbei Raumtemperaturgewaschen.Die autoradiographischeAnalyseerfolgtemit einer

ImagePlate(BAS-IPMP 2025,Fuji) unddemelektronischenBioAnalyzerFuji BAS 1800.

Die Amplifikation spezifischerDNA-Fragmentedurchdie Polymerase-Ketten-Reaktion

(PCR)wurdemit einemGeneAmp2400Thermocycler (Perkin-Elmer)in einemGesamtvo-

lumenvon 50 µl in dünnwandigenReaktionsgefäßendurchgeführt.Reaktionspuffer, dNT-

Psund Taq-PolymerasewurdendemQIAGEN Taq CoreKit (QiagenHilden) entnommen

und nach Herstellervorschrift eingesetzt.Als DNA-Matrize dienten250 ng genomischer

oderPlasmid-DNA. Primerwurdenin einerEndkonzentrationvon je 2 µM eingesetzt.Fol-

gendesProgrammzumunspezifischenPrimer-Annealingwurdeverwendet:[94 oC 5 min];

[37 oC 0:45min] [72 oC 3:00min] [94 oC 0:45min] 3 e ; [55 oC 0:45min] [72 oC 3:00min]

[94 oC 0:45min] 30 e ; [55 oC 2:00min] [72 oC 7:00min] [4 oC].


3.8 Bestimmungvon Liponsäure

Die BestimmungdesLiponsäuregehaltesvonHefeundN. crassawurdenachderVorschrift

vonHerbert& Guest(1970)durchgeführt.VerschiedeneHefe-Mutantenwurdenin YPD bei

30 oC für 24-36h bis in die stationärePhaseihresWachstumsangezogenund durchAb-

zentrifugierengeerntet.NachdreimaligemWaschenmit WasserwurdedasFeuchtgewicht

bestimmt.N. crassa-Hyphenwurdenin 100ml Batchkulturenin VogelsmediumüberNacht

angezogenundanschließendgetrocknet.Die Zellenwurdenin 2 ml 9 N H2SO4 für 2 h bei

121oC autoklaviert. DasHydrolysatwurdemit 10N NaOHneutralisiertundmit Wasserauf

ein definiertesVolumengebracht.Die ZellrestewurdengrobdurchGlaswolle abfiltriert und

dasFiltrat anschließenddurcheinen0,25µm-Sterilfiltergedrückt.UnterschiedlicheMengen

derLysatewurdenin DoppelbestimmungenalsSupplementfür denliponsäureauxotrophen

E. coli-StammKER 176eingesetzt:1 ml Basal-Growth-Medium(BGM) wurdemit 100µl

1 M Na-Succinat,pH 7,0 und einer definiertenLysatmengeversetztund mit Wasserauf

1990µl aufgefüllt. Eine Übernacht-Kultur von KER 176 in 2 ml BGM und Succinatmit

20 ng Liponsäurewurdeabzentrifugiertunddreimalmit steriler0,9%igerNaCl-Lösungge-

waschen.DasSedimentwurde in 0,9 % NaCl-Lösungaufgenommenund auf eineOD600

von 1,0 gebracht.JedeMeßkulturwurdemit 10 µl dieserBakteriensuspensionangeimpft.

GleichzeitigwurdenEichkulturenmit bekanntenLiponsäuremengenangesetzt.Nach40 h

Wachstumwurdendie optischenDichtenderKulturenbei 600nm bestimmt.

3.9 Präparation und Auftr ennungvon Mitochondrienmembranen aus

N. crassa

Zur Isolierungvon Mitochondrienwurden2-6 g Hyphenmit 30 ml Isolationsmediumaus

50mM Tris-Cl, pH 7,5,15% Saccharoseund0,1mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)

für 3 x 20 s in einemGlasperlen-Homogenisator(Braun-Melsungen)aufgeschlossen.Hy-

phenmengenbis 50 g wurden in 8-10 Portionenverarbeitet.Die Mitochondrienwurden

durchdifferentielleZentrifugationisoliert (Nehlset al., 1992).Zur IsolationgrößererMito-

chondrienmengenwurde400 g tiefgefroreneHyphenmit einemHammerzerschlagenund

in insgesamt3 l Isolationsmedium(s.o.)in einemKüchenmixer homogenisiert.Die Zellen

wurdendannmit einerKorundmühleaufgeschlossen(Weisset al., 1970)unddie Zelltrüm-


merdurcheineZentrifugationfür 5 min bei6000g abgetrennt.DerÜberstandwurde60min

bei14000g zentrifugiert,wobeidieMitochondriensedimentierten.DasMitochondriensedi-

mentwurdein 180ml 0,2M Na-Phosphatpuffer, pH 7,5aufgenommen,in einemTeflon-in-

Glas-Homogenisatorresuspendiertundauf 220 ml aufgefüllt.DieseSuspensionwurdebis

zurWeiterverarbeitungbei -70 oC gelagert.

Die AuftrennungderMitochondrienproteinewurden300-500µl derMitochondriensus-

pensiondurchZugabevon20% Triton X-100aufeineDetergenzkonzentrationvon5 % ge-

brachtundnachHomogenisation20 min bei 4 oC inkubiert.Unlöslicheswurdenfür 15 min

bei 12 000g abzentrifugiert.DerÜberstandwurdeaufeinenDichtegradientenvon 10-30%

Saccharosein 50mM Tris-Cl,pH 7,5und0,1% Triton X-100aufgetragen.Nach16h Zentri-

fugationbei 150000g (36 000rpm,RotorSW40Ti, UltrazentrifugeL7-65,Fa.Beckmann)

wurdendie Gradientenin 0,6ml Portionenfraktioniert.GrößereMengenMitochondrienex-

trakt wurdenauf biszusechsGradientenaufgetragen.

3.10 Isolierung und Spaltung von Komplex I ausN. crassa

Komplex I wurdeausdemExtraktderMitochondrienmembranenisoliert.NachderZucker-

gradienten-ZentrifugationundFraktionierungdesGradientenwurdedie Positionvon Kom-

plex I durchMessender NADH:Ferricyanid-Redoxaktivität bestimmt.Die entsprechenden

Fraktionenwurdenvereinigtund Komplex I durchAnionenaustausch-Chromatographiean

einer4 ml ResourceQ-Säule(Amersham-Pharmacia)weitergereinigt.Die Säulewar zuvor

mit 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 0,1 % Dodecyl β-D-maltosidoderTriton X-100 und 50 mM

NaCl mit 0,5 ml/min äquilibriertworden.Die Proteinewurdenmit einerFlußgeschwindig-

keit von0,5ml/min aufdieSäulegepumpt,mit einemkontinuierlichenNaCl-Gradientenvon

50-400mM NaCl eluiertundin 0,5ml Fraktionenaufgefangen.Komplex I-haltigeFraktio-

nenwurdewiederumdurchMessungderNADH:Ferricyanid-Redoxaktivität festgestellt.Die

Gipfelfraktionenwurdenvereinigtundmit kristallinemKalium-Rhodanidauf eineEndkon-

zentrationvon0,6M KSCNgebracht.Die Proteinlösungwurdeanschließendaufeinen12ml

Zuckergradientenvon 10-30% Saccharosein 50 mM Tris-Cl, pH 7,5,0,1 % Triton X-100

und 0,6 M KSCN aufgetragenund 16 h bei 150 000 g zentrifugiert.Der Gradientwurde

mit einerFlußgeschwindigkeit von 0,6 ml/min durcheineDurchflußküvettein 600 µl Pro-

benfraktioniert.KontinuierlichwurdenSpektrenmit einemDiodenarray-Spektrometermit


LichtleiteroptikderFirmaJ&M Analysetechnik(Aalen)von200-600nmmit einerIntegrati-

onszeitvon50msundeinemIntervall von4 sübereineMeßzeitvon30min aufgenommen.

Die GipfelfraktionendesMembranarmswurdenvereinigt,eingeengtundnachBedarfaufei-

ner 14-ml-TSK-Gel-G4000SW-Säule(Fa. TosoHaas)weiter aufgereinigt.Die Säulewurde

zuvor mit einemSäulenvolumen50 mM Tris-Cl, pH 7,5,0,1 % Triton X-100 und200mM

NaClequilibriert.DasEluatwurdein 0,5ml-Fraktionengesammelt.

3.11 Präparation und Akti vitätsbestimmungder α-Ketoglutarat Dehy-

drogenaseausN. crassa

Die Präparationvonα-KetoglutaratDehydrogenaseausMitochondrienwurdenachderVor-

schrift von Marecket al. (1986)durchgeführt.In einerMitochondriensuspensionwurdemit

kristallinemDigitonin einDigitonin:Protein-Verhältnisvon0,5(w/w) eingestelltund20min

bei Raumtemperaturinkubiert.Anschließendwurdendie Mitochondrienin einemHandho-

mogenisatoraufgeschlossen.Die Suspensionwurdemit 2 VolumenExtraktionspuffer aus

10 mM Tris-Cl, pH 7,2,440mM Saccharose,10 mM MgCl2, 100mM NH4Cl, 1 mM ED-

TA, 1 mM PMSFund1,5µM Leupeptinverdünntund15min mit 15000g zentrifugiert.Der

ÜberstandwurdeportionsweiseaufeineEndkonzentrationvon3%Polyethylenglycol(PEG)

6000gebrachtund 20 min bei Raumtemperaturauf einemRollenschüttlerinkubiert.Nach

AbzentrifugierenderausgefälltenProteinefür 10min bei15000g wurdederÜberstandauf

5 % PEG6000gebrachtundwiederum20min beiRaumtemperaturaufdemRollenschüttler

inkubiert.Die ausgefallenenProteinewurdenfür 10min bei 15 000g abzentrifugiertundin

50mM KH2PO4, pH 7,4,8 mM MgCl2, 0,05mM CaCl2, 0,05mM TPP, und0,5mM PMSF

resuspendiert.Die ProteinkonzentrationwurdenachderMethodevonBiuret festgestellt.

DieBestimmungderα-KetoglutaratDehydrogenaseerfolgtedurchspektrometrischeVer-

folgungderNADH-Bildung durchdenUmsatzvonα-Ketoglutarat.In einerKüvettewurden

990µl desMeßpuffersaus50 mM KH2PO4, pH 7,4,0,8mM DTE, 0,05mM CaCl2 8 mM

MgCl2, 0,2 mM Co-EnzymA, 0,4 mM TPPund2 mM NAD f mit 5 µl derα-Ketoglutarat

Dehydrogenase-Suspensiongemischtund die Reaktionmit 5 µl einer1 M α-Ketoglutarat-

Lösunggestartet.Die Extinktion bei 340 nm wurdeüber600 s verfolgt. Zur Auswertung

wurdemit einemmolarerExtinktionskoeffizientvon ε340 = 6,3mM g 1cmg 1 gerechnet.


3.12 VerschiedeneanalytischeMethoden

Routinemäßigwurdedie Aktivität von Komplex I mit Hilfe derNADH:Ferricyanid-Redox-

aktivität, einer artifiziellen Aktivität desperipherenArms von Komplex I, bestimmt.In

50mM Tris-Cl, pH 7,5,0,1% Triton X-100,1 mM K3[Fe(CN)6], 0,1mM NADH wurdebei

20 oC die Extinktionsänderungbei 410nm gemessen.EswurdedermolareExtinktionsko-

effizient ε410 = 1 mM g 1cmg 1 verwendet(Friedrichet al., 1989).

Zur Immunpräzipitationwurden150-500µl der FraktioneneinesZuckergradientenmit

700µl 100mM Na-Phosphat,pH 7,3,0,05% Triton X-100,10µl Antiserumund50µl einer

Suspensionaus50 mg/ml ProteinA-SepharoseCl-4B (Amersham-Pharmacia)in 100 mM

Na-Phosphatgemischt.DerAnsatzwurde3-5 h bei 4 oC auf einemKippschüttlerinkubiert.

NachkurzemZentrifugierenwurdedreimalmit 100mM Na-Phosphat,pH 7,3,0,05% Tri-

tonX-100gewaschen.Die Sedimentewurdenmit 50µl Protein-Probenpuffer für 30min auf

einemSchüttlerbei20oC inkubiert.Die Lösungwurdeaufeinem16% SDS-Polyacrylamid-

gelaufgetragenundelektrophoretischaufgetrennt(SDS-PAGE)(Lämmli, 1970).Probenvon

Zuckergradienten,die SDS-Gel-elektrophoretischanalysiertundautoradiographiertwerden

sollten,wurdenerstüberNachtgegen10mM Tris-Cl,pH 7,5dialysiertundanschließendly-

ophilisiert,um dasProteinaufzukonzentrieren.DastrockeneProteinwurdein Probenpuffer

aufgenommenundauf dasSDS-Gelaufgetragen.

ProteinkonzentrationenwurdenspektrometrischodernachderMethodevonBiuret (Bei-

senherzet al., 1953)bestimmt.Als StandarddienteRinderserumalbumin.

Zur ElutionvonProteinausgetrocknetemSDS-Polyacrylamid-Gelwurdedieinteressan-

te BandeausdemGel ausgeschnittenundmit wenigWasserrehydriert.DasGel wurdeab-

zentrifugiertunddasWasserabgesaugt.NachZusatzvon 200µl 50 mM Na2HPO4, pH 8,0,

10 mM EDTA und 0,2 % SDSwurdefür 30 min bei 40 oC inkubiert.DasGel wurdeab-

zentifugiertundderÜberstandgegen10 mM Tris-Cl pH 8,0dialysiert.DasDialysatwurde

anschließendlyophilisiert.

ZurDeacylierungvonACPwurdedieProteinprobenachLyophilisierenmit 50mM DTT,

100mM Na2CO3, pH10für 90minbei37oCinkubiert.NachderReaktionwurdederAnsatz

mit SalzsäureneutralisiertundderSDS-PAGE-Analysezugeführt.

4. Ergebnisse 32

4 Ergebnisse

4.1 Liponsäuregehaltund α-Ketoglutarat Dehydrogenase-Aktivitätdes

N. crassaWildtyps und der mtACP-Deletionsmutante

Das Gen für dasmitochondrialeAcyl Carrier Protein in N. crassawar in einer vorange-

gangenenDoktorarbeitinaktiviert worden(Schneideret al., 1995;R. Schneider, Disserta-

tion 1995).DiesesGenbestehtausvier Exons,von denenin dermtACP-Deletionsmutante

acp1drei durchdasbakterielleGenfür die HygromycinB Phosphotransferaseersetztsind.

HyphendieserMutanteunddesWildtyps wurdengetrocknet,hydrolysiertund in verschie-

denenMengenals Supplementfür den Liponsäure-auxotrophenE. coli-StammKER 176

eingesetzt.

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Abbildung 6: Relativer Liponsäuregehaltder Mutanteacp1 und desWildtyps (WT) von

N. crassa. DerLiponsäuregehaltdesWildtypswurdegleich100% gesetzt.

Die optischeDichte der Bakterienkulturenwurdemit Eichkulturen,in denendefinierte

Mengenan Liponsäurezugesetztwurden,verglichenund darausder Liponsäuregehaltder

Hyphenerrechnet.Genausowurdemit isoliertenMitochondrienausWildtyp und Mutante

acp1von N. crassaverfahren.Es zeigtesich,daßdie Absolutwerteder Liponsäuregehalte

4. Ergebnisse 33

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Abbildung7: RelativerLiponsäuregehaltisolierterMitochondrienderMutanteacp1unddes

Wildtyps(WT) vonN.crassa. DerLiponsäuregehaltderWildtypmitochondrienwurdegleich

100% gesetzt.

vonMessungzuMessungin einemweitenBereichschwankten.Die VerhältnissederLipon-

säuregehalteverschiedenerMutantenwareninnerhalbeinerMessreihejedochimmergleich.

SolcheSchwankungensind auchin der Literatur zu finden,wo verschiedeneAutorenun-

terschiedlicheAbsolutwertefür denLiponsäuregehaltin Hefebeschreiben(Sulo& Martin,

1993),Brody et al., 1997).Aus diesemGrund sind alle hier gezeigtenDatenals relative

Werteangegeben.Der LiponsäuregehaltdesWildtyps wurdegleich100% gesetzt.Die Zel-

len der Mutanteacp1enthieltendreimalsoviel Liponsäurewie die desWildtyps (Abb. 6).

Die Mitochondrienzeigtenjedochin beidenFällendiegleichenLiponsäuregehalte(Abb. 7).

Vermutlichbesitztdie Mutanteacp1mehrMitochondrienalsderN. crassaWildtyp.

Um die biologischeVerfügbarkeit derLiponsäurein Wildtyp- undacp1-Mitochondrien

zu untersuchen,wurdedie Aktivität derα-KetoglutaratDehydrogenasebestimmt.Die Mit-

ochondrienmembranenwurden dazu durch Digitoninbehandlungzerstörtund abzentrifu-

4. Ergebnisse 34

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Abbildung8: Spezifischeα-KetoglutaratDehydrogenaseAktivitätderMitochondrienextrak-

te der Mutanteacp1 und Wildtyp (WT) von N. crassa. Als Kontrolle wurdeder Wildtyp

Extraktfür 5 MinutenHitze-inaktiviert undvermessen.

giert. Durch fraktioniertesFällenmit PEG6000wurdedie α-KetoglutaratDehydrogenase

ausgefällt.DieseSchrittewurdenfür Wildtyp und Mutanteacp1 parallel mit den selben

Puffern und Gerätendurchgeführt.Die Sedimentenach der PEG-Fällungwurden resus-

pendiertund ihre Proteinkonzentrationnachder Biuret-Methodebestimmt.Anschließend

wurdendie α-KetoglutaratDehydrogenaseAktivitätendurchMessungder zeitabhängigen

NADH-ZunahmenachZusatzvon α-Ketoglutaratbei 340 nm festgestellt.Aus den Mit-

ochondrienderMutanteacp1konnteα-KetoglutaratDehydrogenasemit einerspezifischen

Aktivität von 0,42 U/mg extrahiertwerden.Der Extrakt ausWildtyp-Mitochondrienhatte

einespezifischeAktivität von 0,27U/mg (Abb. 8). Die Kontrolledurchhitzedenaturierteα-

KetoglutaratDehydrogenase-PräparationausdemWildtyp zeigt,daßdie gemessenenWerte

auf enzymatischeAktivität zurückzuführensind.Die Mutanteacp1besitztalsoLiponsäu-

re in bioverfügbarerForm. Die Vermutunglag nahe,daßN. crassaein zweitesGenfür ein

mtACPenthältunddasProduktdiesesGensfür dieLiponsäuresynthesezuständigist.

4. Ergebnisse 35

4.2 Nachweisvon mtACP2durch in vivo Markierung von

N. crassamit [14C]-Pantothensäure

Um dieeffizienteAufnahmevon[14C]-Pantothensäurezugewährleisten,wurdedieN.crassa

Mutanteacp1zuvor mit derPantothenat-auxotrophenMutantepan2(FGSC4103)gekreuzt.

Die Doppelmutanteacp1x pan2wurdeanhandihrer Pantothensäure-Auxotrophieund des

Selektionsmarkersidentifiziert.Die Doppelmutantewurdein Vogelsmediumin Gegenwart

von [14C]-Pantothensäureangezogen.Nach 20 h Wachstumwurdendie Hyphengeerntet

unddieMitochondrienisoliert.Die Mitochondrienproteinewurdenmit Triton X-100solubi-

lisiert unddurchZuckergradientenzentrifugationderGrößenachaufgetrennt.Die Zentrifu-

gationsbedingungenwurdensogewählt,daßKomplex I in dasuntereDrittel desGradienten

sedimentierenwürde.NADH:Ferricyanid-Redoxaktivität konntein diesemBereichdesGra-

dientenerwartungsgemäßnichtnachgewiesenwerden,dadieN.crassaMutanteacp1keinen

Komplex I mehrbilden kann(Schneideret al., 1995).Die Proteineder Gradientenfraktio-

nenwurdendurchSDS-PAGE aufgetrennt,die Gelegetrocknetund für 14 Tageauf einer

ImagePlate(BAS-IP MP 2025,Fuji) exponiert,die in einemBioAnalyser(BAS 1800,Fuji)

ausgelesenwurde.DasErgebnisderradioaktivenMarkierungzeigtAbb. 9. Im vorderenTeil

desGradientenwurdenvier Proteinemit einer scheinbarenmolekularenMassezwischen

12 und 18 kDa gefunden.Die Bandemit der kleinstenMolmassezieht sich durchdenge-

samtenGradientenhindurch.Da die Mutanteacp1x pan2dasGenfür dasmtACP1nicht

mehrbesitzt,mußessichhierumeinanderesPantothensäure-haltigesProteinhandeln.Zum

Nachweis,daßessichbei demmarkiertenProteintatsächlichum ein ACPhandelt,wurden

die markiertenBandenderletztenfünf FraktionendesZuckergradientenausdemGel (Abb.

9) ausgeschnittenunddasProteineluiert.Ein Teil desProteinswurdealkalischdeacyliert,

währendderandereunbehandeltalsKontrollediente.Die Proteinewurdenlyophilisiertund

anschließenderneutaufeinemSDS-PAGE aufgetrennt.Die Autoradiographieist in Abb. 10

gezeigt.Wie für Acyl CarrierProteinebekanntwar, erhöhtesich die scheinbareMolmas-

se desmarkiertenProteinsdurch Deacylierung von ca. 12 kDa auf ca. 18 kDa (Shintani

& Ohlrogge,1994).Den gleichenBefundergabdie Deacylierung der in Abb. 9 gezeigten

[14C]-Pantothensäure-markiertenProteinbandenausdemvorderenDrittel desZuckergradi-

enten.Damit handeltessichbei allenmarkiertenBandenum ein mtACP in verschiedenen

Acylierungsstufen.DasgefundeneProteinwurdemtACP2genannt.

4. Ergebnisse 36

Abbildung 9: Verteilung von [14C]-Pantothensäure markiertem Protein nach

Zuckergradienten-Zentrifugationund anschließenderSDS-PAGE von Triton X-100

solubilisiertenMitochondrienausderMutanteacp1x pan2in N. crassa.

Mit Antiserengegendie 21.3 kDa bzw. 49 kDa Komplex I Untereinheitenwurdever-

sucht,markiertesProteinausdenZuckergradientenfraktionen(vgl. Abb. 9) zupräzipitieren.

DasErgebnisist in Abb. 11 gezeigt.

Mit beidenAntiserenkonntemtACP2präzipitiertwerden.DasmtACP2mußdaherin

Protein-Clusterassembliertsein,die einmaldie Komplex I-UntereinheitNuo21.3undzum

anderenmalNuo49enthalten.DasPositiondeserstgenanntenClustersim Zuckergradienten

entsprichtdemSedimentationsverhaltenvon teilweiseaggregiertemMembranarm.Markier-

tesProtein,dasmit der 49 kDa Untereinheitassoziiertist, ist in demBereichdesZucker-

Abbildung10: Deacylierungdes[14C]-Pantothensäure-markiertenProteinsausderMutante

acp1. Links ist dasProteinvor undrechtsnachderDeacylierunggezeigt.

4. Ergebnisse 37

Abbildung 11: Immunpräzipitation solubilisierter Proteine aus [14C]-Pantothensäure-

markiertenMitochondrienvonacp1x pan2. VerwendetwurdeAntiserumgegendie21.3kDa

(A) bzw. die49 kDa (B) Untereinheitvon Komplex I.

gradientenzu finden,in demderperiphereArm erwartetwürde,sowie in denletztenFrak-

tionendesGradienten.Hier sedimentierenhochaggregierteProteine.Nur hierwurdedasmit

anderenKomplex I UntereinheitenassoziiertemtACP2in mehrals einerAcylierungsstufe

identifiziert(Abb. 11(B)).

4.3 SuchenachdemGen für ein zweitesmtACP

Mit dem ProgrammBLAST (Altschul et al., 1990) wurde in den bis Oktober2000 zu-

gänglichenProtein-undGenomdatenbankenverschiedenerEukaryontennacheinemzwei-

tenGenfür einmtACPgesucht.Die ProteinsequenzdesmtACPausHefewurdealsAnfrage

eingesetzt.NebenSequenzidentitätenund -ähnlichkeiten ist dasVorhandenseineinermit-

ochondrialenImportsequenzdaswichtigsteKriterium für die Identifizierungeinesweiteren

4. Ergebnisse 38

mtACP. Kennzeichnenddafür ist eineN-terminalePräsequenz,in der saureAminosäuren

vermieden,aberArginin, Alanin und Serin bevorzugt verwendetwerden.Ein Argininrest

ist fast immer zwei und/oderzehnPositionenvor der reifen Proteinsequenzzu findenund

scheintder Erkennungdurch eine Proteasezur Abspaltungder Importsequenzzu dienen

(Heijneet al., 1988).EswurdentatsächlichverschiedeneGenproduktemit Ähnlichkeit zum

mtACPausHefeidentifiziert.

|

cemtacp(A) MKEPHSFRRVKMFGRQVGRVVFRTASVVVQRRSVSASVPQMVKLVAPSVNFIQTRGSKIE

cemtacp(B) ----------------MLRVAVSAALRTVSVRALSNASVQQR-VITPILLSAQKPSFQIR

. ** .* * *..* . * ...* . * .*

cemtacp(A) VFGPFDPPKQLTFKQVEDRVLKAVRSWDRFPADKESLLKLDADLSKDFGFD[S]LDQVEI

cemtacp(B) QYSAKAP---LTKKTLEERIVLVLSLYDKIDAKK---LTMDSDFSKDLGLD[S]LDHVEV

.| * ** * .*.*.. . *. * * * .*.* *** * * * **.**.

cemtacp(A) VMALEDEFGFEIPLQDSDKFKTIRDAFKYICEREDVYE

cemtacp(B) VMAMEEEFGFEIPDGDADRFKTPRDIFQYIADKEDVFE

***.*.******* *.*.*** ** *.**...***.*

Abbildung12:CLUSTAL W-AlignmentvonmtACP1(EMBL U00033))undmtACP2(EM-

BL AL132860)in Caenorhabditiselegans. Die vermuteteersteAminosäuredesreifenPro-

teinsist mit | markiert.

DasGenomvon C. elegansenthältzwei mtACP-Gene(Abb. 12). Die Benennungder

zugehörigenProteinemit mtACP1und2 erfolgtewillkürlich. Die Aminosäuresequenzum

dasAktive Zentrumzeigt guteÜbereinstimmung.Die Sequenzidentitätbeträgthier 42 %.

A. thalianabesitztsogardrei Genefür Acyl CarrierProteine,die ihrer Sequenznachnicht

zudenplastidären,sondernzudenmitochondrialengehören(Abb. 13).Zwei Positionenvor

demSerinim aktivenZentrumbesitzenplastidäreACPsin A. thalianaein hochkonservier-

tesAlanin, währendalle bekanntenmitchondrialenAcyl CarrierProteinean dieserStelle

einenLeucinrestbesitzen(vgl. Abb. 13,Position[-2]). EbensobesitzenplastidäreA. thalia-

naACPsneunPositionenhinterdemdasPhosphopantetheintragendenSerineinenhochkon-

serviertenGlycinrest,derin allenbekanntenmtACPsdurchein Alanin ersetztist (vgl. Abb.

4. Ergebnisse 39

13, Position[+9]; Shintani& Ohlrogge,1994).In dendrei gefundenenSequenzenwerden

andenentsprechendenPositionendiefür mtACPstypischenAminosäurerestegefunden.Für

DrosophilamelanogasterwurdewährendderAnfertigungdieserArbeit bekannt,daßdurch

alternativesSpliceneineseinzigenGeneszwei verschiedenemRNA-Formenfür mtACPs

hergestelltwerden(Ragoneet al., 1999). Im Genomvon Aspergillus niger konntedurch

Datenbank-Suchebishernurein Genfür ein mtACPidentifiziertwerden(Abb. 16).

4.4 Codon-Gebrauchund Expressionshäufigkeit von mtACP

Für die Codierungder20 möglichenAminosäurenin einemProteinstehen61 verschiedene

Codonszur Verfügung.Diesewerdenjedochnicht gleichmäßigbenutzt.JederOrganismus

verwendet,abhängigvon derHäufigkeit seinerverschiedenentRNAs, einenSatzoptimaler

Codons.Dieserkann wie bei A. thaliana Gewebe-oderWachstumsstadien-abhängigsein

(Chiapelloet al., 1998).Im Genomvon C. elegansist die Expressionshäufigkeit derProte-

ine jedochengandie VerwendungoptimalerCodonsin ihrenGenengekoppelt(Stenicoet

al., 1994).HoheWertefür denCodonBias Index (CBI; Bennetzen& Hall, 1982)und die

Frequencyof optimalcodons(Fop; Ikemura,1981)einesGenssindZeichenfür die häufige

VerwendungoptimalerCodonsund somit für einehoheExpressionsratedesentsprechen-

denProteins.Der Fop-Wert ist dasVerhältnisderSummeoptimalerCodonseinesGenszur

SummederAminosäurendeszugehörigenProteins.Der größtmöglicheWert ist 1,0 für die

ausschließlicheBenutzungoptimalerCodons.Bei völliger VermeidungoptimalerCodonsist

derFop-WertgleichNull.

Der CBI ist der Fop ähnlich,benutztjedocheineandereSkalierung.Die Vermeidungop-

timaler Codonsäußertsich hier in negativen Werten,währenddie alleinige Verwendung

optimalerCodonseinenCBI-Wert von 1,0liefert.

Der Codon-GebrauchverschiedenermtACP-Genewurdemit demProgrammCodonW

(John Peden,CMLEUN, Dept. of Genetics,University of Nottingham;http://www.mol-

biol.ox.ac.uk/cu/codonW.html) untersucht(Stenicoet al., 1994).Da vermutlichbei C. ele-

ganswie bei N. crassaein mtACPmit Komplex I assoziiertist, wurdenzumVergleich ei-

nige Genefür Komplex I-Untereinheitenmit in die Untersuchungeinbezogen(Tabelle2).

Die mtACP-homologenGenein C. elegansunterscheidensichnachdenzur Verfügungste-

hendenDatendeutlichin ihremCodon-Gebrauch.DasmtACP1wird dieserAnalysezufolge

4. Ergebnisse 40

|

atmtacp1 -MALRNAILRHLRVPVQTLGLN--QSKIGFLGT-IRSFSSHDD--HLSREAVVDRVLDVV

atmtacp2 -MAARGAMLRYLRVNVNPTIQNPRECVLPFSIL-LRRFSEEVRGSFLDKSEVTDRVLSVV

atmtacp3 MHCIRSSILQHLRLRVSVRPTSLLQNENGFKSIGIFNFTSEAAA-DGGQDQILSRVIELV

. * ..*. **. * | . * . *. . . **. .*

atcpacp1 <DLGAD[S]LDTVEIVMGLEEEF>

^ ^

atmtacp1 KSFPKVDPSKVTPEVHFQNDLGLD[S]LDTVEIVMAIEEEFKLEIPDKEADKIDSCSLAI

atmtacp2 KNFQKVDPSKVTPKANFQNDLGLD[S]LDSVEVVMALEEEFGFEIPDNEADKIQSIDLAV

atmtacp3 KKYDKTNTSEVTERADFQKDLSLD[S]LDKTELVMAIEEEFSIEIPDEKADKLTCCGDVA

* . * * ** ** ** ** * ** *.***.**** **** ***. .

-2 +9

atmtacp1 EYVYNHPMSS----

atmtacp2 DFIASHPQAK----

atmtacp3 TYILSETPTKASES

.. .

Abbildung13:CLUSTAL W-Alignmentvon mtACP1(AAC27139.1;Shintani& Ohlrogge,

1994),mtACP2(AAC27464.1)undmtACP3(BAB090989.1)ausA. thaliana. Für mtACP1

undmtACP2liegt die vermuteteersteAminosäuredesreifenProteinsim Alignmentander

gleichenPosition.Sie ist für alle drei mtACP mit | markiert.Mit atcpacp1ist eine typi-

scheSequenzfür dasaktive Zentrumder plastidärenAcyl CarrierProteinevon A. thalia-

na gezeigt.Die Pfeilekennzeichnenin plastidärenundmitochondrialenACPverschiedene,

aberjeweils hoch konservierteAminosäurenan denPositionen[-2] und [+9] relativ zum

Phosphopantethein-tragendenSerinim aktivenZentrum.

4. Ergebnisse 41

Tabelle2: UntersuchungdesCodon-GebrauchsderGenederbeidenmtACPim Vergleichzu

Genenfür verschiedeneKomplex I-Untereinheiten(nuo14.8bis nuo78)unddermitochon-

drialenβ-Keto-Acyl-ACP-Synthase(mtcem)in C. elegans. Die Komplex I-Untereinheiten

sindmit “nuo” für [N]ADH:[U]bichinon [O]xidoreduktasebezeichnet.Die angestellteZahl

beschreibtdie Molmasseder jeweiligenUntereinheitin kDa. Die SpalteCBI gibt denCo-

don Bias Index an (Bennetzen& Hall, 1982).Fop stehtfür Frequencyof optimal codons

(Ikemura,1981).Die Größenwerdengenauerim Text beschrieben.

Gen CBI Fop

nuo10.5(CAB02765.1) -0,009 0,328

nuo14.8(CAB16513.1) 0.416 0,656

nuo19.3(CAB02132.1) 0,146 0,455

nuo51(CAA90435.1) 0,305 0,573

nuo78(AC006768) 0,217 0,504

mtcem(CAB02284.1) -0,187 0,231

cemtacp1(U00033) 0,227 0,512

cemtacp2(AL132860) 0,074 0,404

deutlichstärker exprimiert als mtACP2.Für mtACP1werdenetwa mit gleicherHäufigkeit

optimaleCodonsverwendetwie für die Komplex I-UntereinheitenNuo51undNuo78.Eine

Untersuchungfür dieentsprechendenGenein N. crassa, in demdasGenfür mtACP2bisher

nicht identifiziertwerdenkonnte,zeigtdie gleicheTendenz(Tabelle3).

Eine Untersuchungder genauenFunktionder gefundenenGeneund ihre Genprodukte

durchKonstruktionvon knock-out-Mutantenerfolgtebisherwederin A. thaliana noch in

C. elegans. BeideOrganismensind molekularbiologischnicht in ausreichendemMaßezu-

gänglich.DasGenfür ein zweitesmtACPwurdedaherin N. crassagesucht.

4.5 Versuchder Klonierung desGensfür mtACP2 in N. crassa

DasGenomvon N. crassawar bis zur FertigstellungdieserDoktorarbeitnur zu 30 % be-

kannt.Zur IdentifizierungdesGensfür ein zweitesmtACPwurdendeshalbandereMetho-

4. Ergebnisse 42

Tabelle3: UntersuchungdesCodon-GebrauchsdesGensfür dasmtACP im Vergleich mit

Genenfür verschiedeneKomplex I-Untereinheiten(nuo14.8bis nuo78)und für die mit-

ochondrialeβ-Keto-Acyl-ACP-Synthase(mtcem)in N. crassa.

Gen CBI Fop

nuo10.5(X69929.1) 0,258 0,554

nuo14.8(X76344.1) 0,307 0,600

nuo19.3(AJ001520) 0,361 0,627

nuo51(X56227.1) 0,494 0,716

nuo78(X57602.1) 0,380 0,634

mtcem(AF021234.1) 0,214 0,524

ncmtacp1(X83578) 0,578 0,742

denversucht,die in denfolgendenKapitelnbeschriebensind.KeinedieserMethodenführte

zurKlonierungdergesuchtenDNA-Sequenz.

4.5.1 Versuchder Genidentifizierung über die DNA-Sequenz

Mit Hilfe einesradioaktiv markierten,102Bp langenPshAI/SalI-Fragmentesausder

cDNA vonmtACP1ausN. crassawurdediegenomischeGenbibliothekλJ1durchheterolo-

geHybridisierungdurchsucht.DasFragmentcodiertfür dendasaktive Zentrumumgeben-

denBereich.Um die geeigneteHybridisierungstemperaturzu ermitteln,wurdegenomische

DNA desWildtypsundderMutanteacp1mit EcoRI geschnittenundin einemSouthernblott

bei verschiedenenTemperaturenmit derSondehybridisiert(Abb. 14).

Bei stringenterHybridisierungwurdeein 9 kBp-Fragmentim Wildtyp und ein 2kBp-

Fragmentin der Mutantevon der Sondeerkannt.Die Sondehybridisierteim Wildtyp mit

demdrittenundviertenExondesGensfür dasmtACP1.Die Mutanteacp1besitztlediglich

dasvierte Exon,dasvon der Sondeerkanntwurde.Durch daseingesetzteHygromycinB-

GenwurdeeinezusätzlicheEcoRI-Schnittstellein dasGenomdesPilzeseingefügt,sodaß

dasvon derSondeerkannteDNA-Fragmentsehrviel kleiner ist alsdasim Wildtyp. Bei ei-

nerHybridisierungstemperaturvon 47 oC wurdein beidenGenomenein zusätzlichesDNA-

Fragmentmit einerLängevon ca.3,3 kBp erkannt.DasGenfür die cytosolischeFAS, die

4. Ergebnisse 43

Abbildung14: Southernblottvon genomischerDNA desWildtyps (links) undder Mutante

acp1(rechts)von N. crassa. Die DNA wurdemit EcoRI geschnittenundbei verschiedenen

Temperaturenmit einer102Bp SondeausdercDNA desmtACP1hybridisiert.

eineACP-Domänebesitzt,welcheebenfalls von der Sondeerkanntwerdenkönnte,würde

aufeinemEcoRI-Fragmentvonmehrals9 kBp Längeliegen(B. Brors,persönlicheMittei-

lung).DieseswurdejedochbeikeinerdergewähltenHybridisierungstemperaturenmarkiert.

Bei dergefundenenHybridisierungstemperaturvon47 oC wurdenca.150000Phagenklone

derGenbankλJ1durchsucht.18 Klone hybridisiertenmit derSonde.Fünf davon enthielten

dasGenfür mtACP1.Keinerderanderenenthieltjedochein Genmit Ähnlichkeit zu einem

ACP-Gen.

In einemzweitenExperimentwurdedie KlonierungdesgesuchtenmtACP2-Gensdurch

PCRversucht.Aus der Aminosäuresequenzder mtACPausdenPilzenA. niger, N. crassa

und S.cerevisiaewurdendie degeniertenPrimerHmtACP-AS3xund HmtACP-C2eabge-

leitet (Abb. 16) undzur Amplifikation von TeilendergenomischenDNA derMutanteacp1

unddesWildtypsvonN.crassaverwendet(Abb. 15).Als internePositiv-Kontrolledientedie

Amplifikation einesTeils desGensfür mtACP1zu einemPCR-Produktvon 240Bp Länge

bei Verwendungvon genomischerWildtyp-DNA alsTemplate.

DiesesFragmentbestehtnichtnurauscodierenderDNA, sondernenthälteinIntron(Abb.

16) von 156 Bp Länge.Die durchschnittlicheIntrongrößefür filamentösePilze liegt zwi-

schen100und200Bp (Gurr et al., 1987),sodaßauchein PCR-Produktmit Sequenzteilen

einesGensfür ein zweitesmtACP zwischen150 und 300 Bp lang seinsollte.Ein solches

PCR-Fragmentwurde jedochnicht identifiziert. DasnächstgrößerePCR-Produktwar ein

4. Ergebnisse 44

Abbildung15: Mit degeneriertenPrimern(Abb. 16) erhaltenePCR-Produkte.Genomische

DNA derMutanteacp1(links) unddesWildtyps(rechts)vonN.crassawurdenalsTemplate

verwendet.Ein 240Bp-Fragmentin derWT-Spurwird für mtACP1erwartetundfehlt in der

SpurderMutanteacp1.

400 Bp-Fragment.Dieseswurdekloniert und sequenziert.Die erhalteneSequenzenthielt

keineverwertbareStrukturinformation.

4. Ergebnisse 45

<

ncmtacp MFRTAALTAARVARPAVASAVRAGVARPAFVQAVPKVA---AFQAVRFYSAGGHLKKDEV

scmtacp MFRSVCRISSRVA-P---SAYRTIMGRSVMSN---------TILAQRFYSAN--LSKDQV

anmtacp MFRSAVVRSLRASVPRAVKTPAPFQIRSSPVARPAQFAPRFAYQGVRLYSAPAGLNKDEV

***. . * . * . * . * *** * **.*

>< >< ><

ncmtacp LKKDEV FSRIAQVLSGFDKVN---DPKNITETAHFANDLGLDSLDTVEVVMAIEEEFSI

scmtacp LSKDQV SQRVIDVIKAFDKNSPNIANKQISSDTQFHKDLGLDSLDTVELLVAIEEEFDI

anmtacp LNKDEV EGRIVNLLKNFDKVS---DASKINVASHFANDLGLDSLDTVEVVMAIEEEFSI

* **. *. .. *** * ..* ***********...****** *

________

>

ncmtacp EIPDKDADQIHSVDKAVEYILSQPDAN

scmtacp EIPDKVADELRSVGETVDYIASNPDAN

anmtacp EIPDKEADSIHSVDKAVEYILGQPD--

***** ** ..** .*.** .**

_______

Abbildung 16: PositiondegenerierterPrimer für die Amplifikation desGensfür mtACP2

durchPCR.Zum Designwurdendie bekanntenSequenzenfür mtACPvon A. niger (anm-

tacp),N. crassa(ncmtacp)undS.cerevisiae(scmtacp)herangezogen.Die Pfeile(<>) kenn-

zeichnendie Exonsder N. crassa-Sequenz.Aminosäuresequenzen,die dengewähltenPri-

mernentsprechen,sindunterstrichen.

4. Ergebnisse 46

4.5.2 Versuchder heterologenKomplementationder ∆acp-Mutante von Saccharomy-

cescerevisiaedurch Plasmid-Shuffling

DadasgesuchteGenaufDNA-Ebenenicht identifiziertwerdenkonnte,wurdedieGensuche

auf der EbenedesProteinsfortgesetzt.Im Gegensatzzu heterologenHybridisierungsme-

thodenwird zur heterologenKomplementationnicht die Ähnlichkeit derDNA-Sequenzzur

IdentifizierungdesgesuchtenGensherangezogen,sonderndie Funktion deszugehörigen

Proteins.DasentsprechendeGenwird in S.cerevisiae inaktiviert undder Phänotypderer-

haltenenMutanteuntersucht.NachTransformationderHefe-Mutantemit einerexprimieren-

denN.crassa-GenbibliothekwerdenKlonegesucht,beidenenderWildtyp-Phänotypwieder

hergestelltist. DieseKlone enthaltenein GenausN. crassa, dasfür ein Proteincodiert,das

denDefektin derHefekomplementierenkann.

Die ∆acp-Mutantein Hefeist wie dieanderenDeletionsmutanten,dieEnzymedermito-

chondrialenFAS betreffen,nichtmehrin derLagezuatmen.WährenddieDeletionsmutante

∆cemder mitochondrialenβ-Ketoacyl-ACP Synthasedurch Transformationmit dem ent-

sprechendenGenausN. crassain einemgeeignetenExpressionsvektorihre Atmungsfähig-

keit wiedererlangt(F. Bürger, Dissertation1999),tut die Mutante∆acpdiesnicht. Sie gibt

zu schnellihre mtDNA unddamit jedeMöglichkeit zumWiedererlangenderAtmungsauf.

Die Auswirkungder∆acp-Mutationscheintschwererzuwiegenalsdieder∆cem-Mutation.

EineTransformationmit derexprimierendenN. crassa-Genbibliothekkannnurdannzur

IdentifizierungeineszweitenmtACP in N. crassadienen,wenndie Hefe bis zur Expres-

sionderN. crassa-cDNA nicht auf ihr eigenesmtACPverzichtenmußundso ihre mtDNA

erhält.DazuwurdediemtACP-Deletionsmutantein diploiderHefeerzeugt,sodaßeinintak-

terChromosomensatzden∆acp-Defektdesmutierteninternhomologkomplementiert.Eine

zweiteintakteGenkopiefür dasmtACPin einemgeeignetenExpressionsvektor, deralsSe-

lektionsmarkerdasURA3-Genträgt,wurdezusätzlichin die Hefeeingebracht.Die diploide

MutantewurdenunzurSporulationgebrachtunddie gebildetenTetradenmit einemMikro-

manipulatorzerlegt. Anwachsende,haploideSporen,die die defekteGenkopie im Genom

und daskomplementierendePlasmidim Cytosolbesitzen,wurdenmit der exprimierenden

N. crassa-Genbibliothektransformiert.Die Transformantenwurdenauf 5-Fluoro-Orotsäure

inkubiert. DieseSubstanzist einemodifizierteUracil-Vorstufe,die durchdasGenprodukt

desURA3-Gensin ein toxischesUracil-Analogonumgewandeltwird. Damitwird einSelek-

4. Ergebnisse 47

tionsdruckaufgebaut,derdieHefeveranlaßt,dashomologkomplementierendePlasmid,das

zur SelektiondasURA3-Genträgt, aufzugeben(Boeke et al. 1984).Hefezellen,die diese

Behandlungüberleben,solltennur nochdasPlasmidderN. crassa-Genbibliothekbesitzen.

Eine Selektionauf Atmungskompetenzzeigt nun,welcheKlone einecDNA ausN. crassa

besitzen,die denDefekt in der ∆acp-Mutantein Hefe komplementierenkann.DasPrinzip

dieses“PlasmidShuffling” genanntenProzessesist in Abb. 17 zusammengefaßt.

4. Ergebnisse 48

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Þ-ß Ú ß Ì�Ñ,Ò Ó(ËÕÐÎÍÝàá�Ñ,ÔÕÍ(Ë(â�ãÎÌÎÓ(ÔÕä ß Ñ ß Ë(å

æ ß Ñ@ÛçÐÎè ß Ë�ÐÎË(Ð Ú é ã ß

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Abbildung 17: SchematischeDarstellungdesPlasmidShufflings zur Identifizierungeiner

∆acp-komplementierendencDNA von N. crassa. Mit ”K” ist daskomplementierendePlas-

mid YEp352SCmtACPundmit ”PB” ein PlasmidderGenbibliothekpYADE5 bezeichnet.

4. Ergebnisse 49

Das PlasmidpTSCmtACP (Abb. 18), in dem dasHefe-Genfür dasmtACP teilweise

durchdasLEU2-Genersetztwordenwar, wurdemit Hpa I/SacI gschnittenundin dendiploi-

denHefestammVW1 eingebracht.Die TransformantenwurdenaufLeucin-Prototrophiese-

lektioniert.HomologeRekombinationsereignissewurdendurchSouthernblott-Analysenach-

gewiesen.GenomischeDNA derTransformantenwurdemit Pst I verdautundmit einemra-

dioaktiv markiertenHinc II/EcoRI-FragmentausdemVektorpSCmtACP-P/SXhybridisiert

(Schneideret al., 1995;Abb. 19).��

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Abbildung 18: Replacementvektor pTSCmtACP zur Inaktivierung des mtACP-Gensvon

S.cerevisiae. Aus demVektorpSCmtACP-P/SX(oben)wurdeein zentralesStyI-Fragment

entferntund die überstehendenEndengeglättet.Das LEU2-Gen auf einemSmaI/Hpa I-

FragmentausYEp351wurdeeingesetzt.Die Transformationwurdemit einemHpa I/SacI-

Fragmentdurchgeführt(Schneideretal., 1995).Die PfeilegebendieTranskriptionsrichtung

an.

Zur zunächstnotwendigenhomologenKomplementationdesGen-Defekteswurdedas

mtACP-Genzusammenmit seinemPromotorals Eco RI/BamHI-FragmentausdemPlas-

mid pSCmtACP-P/SX(Abb. 18)geschnittenundin denEcoRI/BamHI linearisiertenVektor

YEp352ligiert. YEp352besitztdasURA3-GenalsSelektionsmarker. Dasfertige Komple-

mentations-PlasmidwurdeYEp352SCmtACPgenanntundin die diploidemtACP-Mutante

∆acp2n transformiert.Eine Uracil-prototropheTransformantewurde zur Sporulationge-

brachtund die einzelnenSporensepariert.Durch Selektionauf gleichzeitigeLeucin- und

Uracil-Prototrophiewurden10 haploide∆acp-Mutantenmit demhomologkomplementie-

rendenPlasmidYEp352SCmtACPidentifiziert.Alle 10 wuchsenauf Glycerinals Kohlen-

4. Ergebnisse 50

Abbildung19:SouthernblottderdiploidenHefe-Mutante∆acp2n.GenomischeDNA wurde

mit Pst I verdautund mit einemradioaktiv markiertenHinc II/Eco RI-Fragmentausdem

Vektor pSCmtACP-P/SXhybridisiert.In Pst I-gespaltenerDNA repräsentiertein 2,7 kBp-

FragmentdasintakteGen.DasdefekteGenwurdedurcheinezusätzlichePst I-Schnittstelle

in ein 0,5 kBp und ein 3,1 kBp Fragmentgespalten.Die Sondehybridisiertenur mit dem

0,5kBp Fragment.Links ist genomischeDNA ausdemWildtyp undrechtsauseinerdiploi-

denMutante∆acp2naufgetragen.

stoffquelle und warendamit in der Lage zu atmen.Die intern komplementierteMutante

∆acp , YEp352SCmtACPwurdezurweiterenGensucheeingesetzt.

Zur Identifizierungderacp2-cDNA ausN. crassawurdezunächstdie Genbibliothekim

PhagenλAD5 in die Plasmid-cDNA-Bibliothek pYADE5 umgewandelt.Hierzu wurdeder

spezielleE. coli WirtsstammBNN 132 mit demPhagenλAD5 infiziert. BNN 132 enthält

dasGendercre-Rekombinase,diedurchortsspezifischeRekombinationansogenanntenlox-

Sequenzendie in denPhagenenthaltenePlasmidkomponentemit dencDNA-Insertsheraus-

schneidetundzumzirkulärenPlasmidschließt.Die in vivoausdemPhagenausgeschnittenen

PlasmideenthaltenN. crassacDNA-InsertsalsEcoRI/Xho I FragmenteunddasTRP1Gen

ausHefealsSelektionsmarker (Brunelli & Pall, 1993;Elledgeet al., 1991).

Die GenbibliothekpYADE5 wurdein die Hefemutante∆acp , YEp352SCmtACPtrans-

formiertundanschließendaufTryptophan-Prototrophieselektioniert.Ca.250000Transfor-

manten,die auf dementsprechendenSelektions-Mediumanwuchsen,wurdenvon denPlat-

4. Ergebnisse 51

ten genommenund nachResuspendierenauf SD-MediumohneLeucin-Supplementierung

mit 5-Fluoro-Orotsäureausplattiert.Hefezellen,die auf diesemMediumanwachsen,sollten

daskomplementierendePlasmidverlorenhabenundnur nochdasPlasmidderexprimieren-

denN. crassa-Genbibliothekbesitzen.WenndieseseinGenträgt,daßdenDefektim Genom

der Hefe-Mutantekomplementiert,kanndie entsprechendeZelle auf Glycerin als Kohlen-

stoffquellewachsen.Auf dem5-Fluoro-Orotsäure-MediumanwachsendeZellenwurdenvon

denPlattengenommenundauf YPG-Mediummit 5-Fluoro-Orotsäureausplattiert.Hierauf

wachsendeKolonienwurdenvon der Plattegenommenundnochmalsauf Leucin-,Uracil-

und Tryptophan-Prototrophiegetestet.Hefeklone,die Leucin- und Tryptophan-prototroph

sowie Uracil-auxotrophwarenund dennochatmeten,wurdenin Flüssigkulturangezogen.

Ihre Plasmid-DNA wurde isoliert und E. coli damit transformiert.Durch Restriktionskar-

tierungwurdefestgestellt,welchePlasmideidentischeInsertstrugen.48 von 64 Plasmiden

enthieltennachRestriktionskartierungkein cDNA-Insert. Von den 16 übrigenPlasmiden

wurdendie Insertssequenziert.KeineshattejedochÄhnlichkleit mit demGeneinesAcyl

CarrierProteins.NachRetransformationder gefundenenPlasmidein die ∆acp2n-Mutante

und anschließenderTetradenanalysewarenin allen Fällennur zwei der vier Sporenin der

Lagezu atmen.DasscheinbareErhaltender Atmungsfähigkeit durchheterologeKomple-

mentationwardamitartifiziell (Boeke et al., 1984).

4.6 Untersuchung der Atmungsfähigkeit und des Liponsäuregehaltes

verschiedenerDeletionsmutantenvon S.cerevisiaemit beeinträch-

tigter mitochondrialer FAS

Die Hefeist in derLageihrenStoffwechselaufGärungumzustellenundkanndamitauchoh-

neAtmungauskommen.So ist sieein sehrgeeignetereukaryontischerModell-Organismus

um die Abhängigkeit der Atmungsfähigkeit vom Liponsäuregehaltzu untersuchen.Neben

der ∆acp-Mutanteexistierenin unseremInstitut die Mutanten∆cemund ∆oar. Bei ∆cem

fehlt dasGender mitochondrialenβ-Ketoacyl-ACP Syntase(Harringtonet al., 1993),die

auch[C]ondensing[E]nzymewith [M]itoc hondrial functiongenanntwird. Die β-Ketoacyl-

ACPReduktase(Abb. 1),dieauchals3-[O]xoacyl-[A]CP [r]eductasebezeichnetwird, fehlt

in derMutante∆oar (Schneideretal., 1997).VonderHefe-Mutante∆cemwarbekannt,daß

4. Ergebnisse 52

sie sich auchheterologmit dementsprechendenGenausN. crassakomplementierenläßt

(Tabelle4).

Eine heterologeKomplementationder Hefe-Mutante∆acp mit dem mtACP1-Genaus

N. crassawurdein dieserArbeit versucht.DazuwurdediecDNA in einemYCp50-Plasmid,

dasdasURA3-GenalsSelektionsmarkerenthält,hintereinenADH-Promotorkloniert(Schnei-

der, persönlichMitteilung). Mit diesemPlasmid(pYCp50ADH-NCmtACP) wurdedie di-

ploide Hefe-Mutante∆acp2n transformiert.Die Transformantenwurdenauf Uracil-Proto-

trophieselektioniertund zur Sporulationgebracht.NachTetradenanalysewurdendie aus-

gekeimtenSporenauf gleichzeitigeUracil- undLeucin-Prototrophieselektioniert.Von acht

zerlegtenTetradenzeigtennur insgesamtzwei angewachseneSporenbeidePrototrophien.

Die erhalteteneMutante(∆acp , YCp50ADH-NCmtACP)war nicht in derLageauf Glyce-

rin alsKohlenstoffquellezuwachsen.

VondendreiHefe-Mutanten∆acp, ∆cemund∆oar, sowie denheterologkomplementier-

tenMutanten∆acp , YCp50ADH-NCmtACPund∆cem , pYPGE15-cem1, undderhomolog

komplementiertenMutante∆cem , pYCp50-CEM1 wurdendie Liponsäuregehaltegemes-

sen.Die Ergebnissesind in Tabelle4 zusammengestellt.Auch hier sinddie relativenWerte

angegeben,beidenenderWildtyp-Liponsäuregehalt100% gesetztwurde(vgl. 4.1).

4. Ergebnisse 53

Tabelle4: LiponsäuregehaltundAtmungsfähigkeit verschiedenerHefestämme.Der Lipon-

säuregehaltdesWildtyps wurde100% gesetzt.Die MutantenwurdennachderReihenfolge

derbetroffenenEnzymein derFettsäuresynthasegeordnet.Die BezeichnungenderMutanten

sindim Text erklärt.

Mutante Liponsäuregehalt Atmungsfähigkeit Literatur

WT (VW1a) 100% +

∆acp <5% - Schneideret al., 1995

∆acp , YCp50ADH-

NCmtACP (heterolog

komplementiert)

50% - dieseArbeit

∆cem <5% - Haringtonet al., 1993

∆cem , pYCp50-CEM1

(homolog komplemen-

tiert)

80% + Bürger, Dissertation

1999

∆cem , pYPGE15-cem1

(heterologkomplemen-

tiert)

65% + Bürger, Dissertation

1999

∆oar 55% - Bürger, Diplomarbeit

1997

4. Ergebnisse 54

InteressanterweisewardasN.crassa-mtACPin derHefe-Mutante∆acpzwarin derLage,

die Liponsäuresynthesewiederherzustellen,führte jedochnicht zur Atmungsfähigkeit der

Hefe.

Die beidenMutanten∆acpund∆cemunterscheidensich in denbisheruntersuchtenEi-

genschaftennicht.Siesindnicht in derLagezuatmenundbesitzenkeineLiponsäure.Trotz-

demverliert ∆acp ihre mtDNA schnellerals∆cem, sodaßderVerlustdesmtACPschwerer

zuwiegenscheintalsderderβ-Ketoacyl-ACPSynthase.

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Abbildung 20: Wachstumskurven desHefe-Wildtyps und der beidenMutanten∆acp und

∆cemin Hefe-Vollmedium(YP) mit GlucosealsKohlenstoffquelle.Die OptischeDichtebei

600nmwurdegemessen.

Wie in derEinleitungbeschriebenwurde,könnenAcyl CarrierProteineansehrverschie-

denenStoffwechselwegenbeteiligt sein.Für die β-Ketoacyl-ACPSynthasensindaußerder

FettsäuresynthsenurdiePolyketidsyntheseeinbeschriebenerWirkungsbereich.Um dieDe-

fektein denbeidenMutanten∆acpund∆cemgenauerzucharakterisieren,wurdedasWachs-

tum dieserMutantenund dasdesWildtyps verglichen.Ein-Liter-Kulturgefäßewurdenmit

750 ml YPD-Mediumgefüllt, mit gleichenMengenZellmaterialauseinerYPD-Vorkultur

in derstationärenPhaseangeimpftundbei 30 oC gutgerührtsowie steril belüftet.Alle zwei

4. Ergebnisse 55

Stundenwurdedie optischeDichte einerProbebestimmt(Abb. 20). Währendder Wildtyp

nach10 h seinlogarithmischesWachstumbegann,dauertedasbei der∆cem-Mutante16 h

undbeider∆acp-Mutantesogar30h. DerWildtyp unddie∆cem-Mutantezeigteninnerhalb

der logarithmischenPhaseein vergleichbaresWachstum,während∆acp langsamerwuchs.

Die Verdopplungszeitenbetrugenfür denWildtyp 120min, für ∆cem140min undfür ∆acp

210 min. Der Wildtyp erreichtein der stationärenPhaseeineoptischeDichte von 11, die

Mutanten∆acpund∆cemjedochnurvon4. DasdeutlichlangsamereWachstumderMutan-

te ∆acpdeutetauf einezusätzlichenStoffwechseldefekthin, der in derMutante∆cemnicht

vorliegt.

5. Diskussion 56

5 Diskussion

5.1 Im Gegensatzzur ∆acp-Mutante von S. cerevisiaebesitzt die acp1-

Mutante von N. crassaLiponsäure in bioverfügbarer Form

DasmtACPist in derHefeS.cerevisiaeessentiellfür die Synthesevon Liponsäure(Brody

et al., 1997)undderenBindungandie E2-UntereinheitderPyruvat Dehydrogenasebzw. α-

KetoglutaratDehydrogenase(Jordan& Cronan,1997).Die mtACP-Deletionsmutante∆acp

enthältdeswegenkeineLiponsäureund ist atmungsdefizient.Die genetischeInaktivierung

von mtACP1in N. crassaführt hingegennicht zur Atmungsdefizienz.Der Liponsäurege-

halt der acp1-Mutanteist im Vergleich zum Wildtyp nicht verringertund funktionsfähige

α-KetoglutaratDehydrogenaseist in ihr nachweisbar. Die Synthesevon Liponsäureundde-

renBindungandieentsprechendenapo-Enzymeverlaufenin N. crassaalsounabhängigvon

mtACP1.Die Ligation wird möglicherweisewie in Bakterienvon einerACP-unabhängigen

Lipoat-Transferasekatalysiert(Abb. 2). Dasdazunotwendige,zumbakteriellenlplA homo-

logeGenist im Neurospora-Genomvorhanden(b8b20.410;CAB 91488.1).In einerande-

ren Doktorarbeitan unseremInstitut wurde gezeigt,daßder Verlust der mitochondrialen

β-Ketoacyl-ACP Synthasefür N. crassatödlich ist. Die entsprechendeDeletionsmutante

konntenicht isoliert werden(F. Bürger, Dissertation1999).EsscheintN. crassasomitnicht

möglich zu sein,cytosolischsynthetisierteOktansäurein denMitochondrienals Vorstufe

von Liponsäurezu verwenden.Eine entsprechendeBeobachtungwar schonfrüher in Hefe

gemachtworden(Haringtonet al., 1994).

DiesenErgebnissenzufolgesolltedieN. crassaMutanteacp1auchohnedasKomplex I-

assoziiertemtACP1einefunktionierendemitochondrialeFAS besitzen.Diebisherbekannten

mtACP-FormenvonHefeundN.crassasindalsofunktionellverschieden.Damitmußesent-

wedereineweiteremtACP-Isoformvon N. crassageben,welchein die Liponsäuresynthese

eingebundenist, odereinenanderenLiponsäuresyntheseweg.

5. Diskussion 57

5.2 Nachweisvon mtACP2 in N. crassadurch [14C]-Pantothenat-Mar-

kierung der Mutante acp1

Durch in vivo Einbauvon [14C]-markierterPantothensäurewurdenin denMitochondrien

der N. crassa-Doppelmutanteacp1 G pan2 vier Proteinemit einer scheinbarenMolmas-

sezwischen12 und18 kDa markiertunddurchalkalischeBehandlungin ein einheitliches

Proteinder scheinbarenmolekularenMassevon 18 kDa überführt.DieserBefundist cha-

rakteristischfür Acyl CarrierProteine.SieverlierendurchHydrolysedenamPhosphopan-

tetheingebundenenAcylrest, der bei SDS-PAGE durchvermehrteSDS-Bindungzu einer

schnellerenWanderungführt alsesdemtatsächlichenMolekulargewicht entspricht.Die vier

[14C]-Pantothenat-markiertenProteinestellenalsomtACP-Formenin verschiedenenAcy-

lierungsstufendar. DasscheinbarleichtesteProteinträgtdenlängstenAcyl-Rest.Da in der

untersuchtenMutantedasGenfür mtACP1inaktiviert ist, mußessichhier um ein zweites

mtACPhandeln,dasmtACP2genanntwurde(Abb. 9).

5.3 Eukaryonten können mehreremtACP-Geneenthalten

In N. crassaundB. taurusist dasmtACP1eineUntereinheitvonKomplex I. FürA. thaliana

undHomosapiensgibt esHinweiseaufeineähnlicheOrganisationdesmtACP1(Shintani&

Ohlrogge,1994;Triepelsetal., 1999),sodaßnaheliegt,daßderKomplex I jedesEukaryon-

tenein mtACPalsUntereinheitbesitzt.Mit derN. crassa-Mutanteacp1wurdeklar gezeigt,

daßdie Funktionvon mtACP1mit derBiogenesevon Komplex I undnicht mit derLipon-

säuresyntheseverknüpftist. Alle Eukaryonten,die einenKomplex I haben,solltendemnach

ein zweitesmtACP(mtACP2)besitzen.Dafürgibt esverschiedeneHinweise.

D. melanogastererzeugtdurchalternativesSpliceneinesGenszweiverschiedenemRNA-

Variantenfür zwei verschiedenemtACP(Ragoneet al., 1999).

Im Genomvon C. eleganskommenzwei mtACP-Genemit verschiedenemCodon-Ge-

brauchvor. Danachwird einesder beidenGene,dasfür mtACP1,in relativ großenMen-

gen, entsprechendden Komplex I-Untereinheiten,exprimiert. Das anderecodiert für ein

Minoritäts-Protein,dasmtACP2,dasin ähnlichenMengenwie z.B. die mitochondrialeβ-

Ketoacyl-ACPSynthasevorliegt (Tabelle2). DieserBefundentsprichtdemvon N. crassa.

Genefür die Komplex I-UntereinheitenNuo51,Nuo78undmtACP1zeigengleichermaßen

5. Diskussion 58

hoheWertefür CBI undFop(Tabelle3), währenddieentsprechendenWertefür dasGender

β-Ketoacyl-ACPSynthasesehrviel niedrigersind.AufgrunddieserDatenist eswahrschein-

lich, daßin C. elegansmtACP1in denKomplex I integriert ist, währendmtACP2für die

Liponsäurebiosynthesesorgt.

In A.thalianakommengleichdreimtACP-Genevor. DieExistenzeinesmtACPin A.tha-

liana wurdeerstmals1994von Shintani& Ohlroggebeschrieben.Die Autorennanntendas

ProteinmtACP1.Durch Westernblot-Analysewiesensie nach,daßviermal soviel mtACP

mit dermitochondrialenMembranassoziiertist, wie frei in derMatrix vorliegt. Die Mem-

branassoziationwurdealsHinweisaufeineIntegrationin Komplex I gewertet.Esist jedoch

wahrscheinlich,daßder im WesternblotverwendeteAntikörpermit allendrei Translations-

produktender mtACP-Genekreuzreagierte,so daßunklar bleibt, welchesmtACP tatsäch-

lich in den Komplex I integriert ist. Die Autoren weisendaraufhin, daßein Antikörper

z.B. gegendasmtACP1ausN. crassaKreuzreaktionenselbstmit entsprechendenProteinen

ausErbsblätter- undKartoffelknollenmitochondrienzeigt.Hinweisedarauf,welchesmtACP

Komplex I-assoziiertvorliegt, könnenauchdurch UntersuchungendesCodon-Gebrauchs

derentsprechendenGenenicht gewonnenwerden,dadie Expressionshäufigkeit von Genen

in A. thaliananicht direktandenCodon-Gebrauchgekoppeltist (Chiapelloet al., 1998).

In N. crassawurde dasGen für daszweite mtACP bishernicht gefunden.In einem

genomischenSouthernblottmit einemradioaktiv markiertenFragmentausder cDNA für

mtACP1 wurde unter nicht-stringentenBedingungennebendem für mtACP1 erwarteten

DNA-FragmenteinweiteresFragmentgefunden.DieseskonntealsHinweisfür dasmtACP2-

Gengewertetwerden,auchwennin der durchsuchtenPhagen-GenbibliothekλJ1kein ent-

sprechenderKlon gefundenwurde.Es ist jedochdamit zu rechnen,daßdasGeninnerhalb

dernächstenMonateim RahmendesNeurospora-Genomprojektesidentifiziertwird.

Überraschenderweisewurdeim GenomvonA.niger nureineinzigesmtACP-Genidenti-

fiziert,obwohl dieserPilz einenKomplex I besitzt.DasGenomwurdeim shot-gun-Verfahren

flächendeckendsequenziert.Auch wennesmöglich ist, daßein zweitesmtACP-Genin den

vorhandenenDatennicht erfaßtwurde,ist eherdavon auszugehen,daßdieserOrganismus

nur ein mtACPbesitzt.Diesdecktsichmit demErgebniseinerfrüherenDoktorarbeitin un-

seremInstitut, in der esnicht gelang,eineMutantevon A. niger zu konstruieren,der das

Komplex I-assoziiertemtACPfehlt (R. Schneider, persönlicheMitteilung). Möglicherweise

5. Diskussion 59

ist in A.niger nicht jedesmtACP-MolekülfestandenKomplex I gebunden,sodaßeineklei-

ne Mengefrei in der mitochondrialenMatrix vorliegt und dort an der Liponsäuresynthese

beteiligt ist.

Auch wenndie bishernur ausSequenzdatenabgeleiteteExpressionund Zielsteuerung

dieserAcyl CarrierProteinenochbiochemischnachgewiesenwerdenmuß,erhärtetsichdie

Annahme,daßEukaryontenmit Komplex I in derRegelwenigstenszweimtACP-Isoformen

besitzen.

5.4 Die BedeutungdesmtACP für Komplex I

Für die BiogenesedesAtmungsketten-Komplex I in N. crassaist dasmtACP1zwingend

erforderlich.WederderperiphereArm, nochderMembranarmdesKomplex I werdenin der

N. crassa-Mutanteacp1korrektassembliert.

Währendin derMutantenuo49, in derdasGenfür die49kDa-Untereinheitdesperiphe-

renArmsvonKomplex I inaktiviert wurde,derMembranarmvonKomplex I korrektassem-

bliert wird (Tabelle1), kanndieMutanteacp1nurunvollständige,zurAggregationneigende

Teile desMembranarmszusammenbauen.Wie durchMarkierungmit [14C]-Pantothenatge-

zeigtwurde,ist dasmtACP1in derMutantenuo49vorhandenundliegt frei in dermitochon-

drialenMatrix vor (R. Schneider, Dissertation1995).Der Schlußliegt nahe,daßmtACP1

einekatalytischeFunktionbei derBiogenesedesMembranarmsvon Komplex I ausübt.Da

mtACP1eineUntereinheitdesperipherenArmsvonKomplex I ist, kanndessengestörteAs-

semblierungin derMutanteacp1auf einefehlendestrukturelleKomponentezurückgeführt

werden.Zum korrektenZusammenbaudesperipherenArms sindstöchiometrischeMengen

von mtACP1notwendig.KatalytischeMengenwürdennichtausreichen.

DieseAnnahmenwerdendurchdie in dieserArbeit durchgeführtenVersucheder Co-

Immunpräzipitationuntermauert.Damit wurdegezeigt,daßmtACP2in der Mutanteacp1

mit der Komplex I-UntereinheitNuo49im einenbzw. Nuo21.3im anderenFall assoziiert

ist.NachderPositionderpräzipitierbarenKomplexeim Zuckergradientenhandeltessichda-

bei umkleineMengenvon peripherembzw. aggregiertemMembranarm.DamtACP1in der

Mutanteacp1nichtvorhandenist, übernimmtmtACP2möglicherweisedessenRollebeider

Biogenesevon Komplex I, ohneseinekompletteFunktionausübenzu können.Vermutlich

ist mtACP2nicht in derLage,diezurMembranarmbildungnötigeKatalysezuunterstützen,

5. Diskussion 60

sodaßdie Assemblierungstehenbleibt,derMembranarminstabilwird undaggregiert.Vom

peripherenArm werdennursehrkleineMengengefunden,diedurchdieNADH:Ferricyanid

Reduktaseaktivität diesesTeils vonKomplex I nichtnachgewiesenwerdenkönnen.Vermut-

lich entstehtdurchdie zu geringeExpressiondesmtACP2-Genszu wenig mtACP für die

BildungdesperipherenArms.

Es ist weiterhinunklar, welchekatalytischeFunktiondasmtACP1für die Bildung des

Komplex I ausübt.Eswurdeangenommen,daßdie mitochondrialeFAS mtACP1-abhängig

ist undein zurAssemblierungvon Komplex I notwendigesProduktbereitstellt.Wie anhand

derLiponsäuresynthesein dermtACP-Deletionsmutantegezeigtwurde,funktioniertdiemit-

ochondrialeFAS auchohnemtACP1.NebendermitochondrialenFAS kommenjedochnoch

andereACP-abhängigeSynthesewege für die BereitstellungeinesKomplex I-spezifischen

Produktesin Frage.UV-VIS-spektroskopischeUntersuchungengebenHinweiseauf eine

strukturell nochunbestimmteRedoxgruppeim Membranarmvon Komplex I, für die eine

chinoideStrukturangenommenwird (Schulteetal., 1999;Friedrichetal., 2000).Einesolche

GruppekönnteauchübereinemtACP-abhängigePolyketidsyntheseodernichtribosomalen

Peptidsynthesebereitgestelltwerden.Über dasVorhandenseinsolcherSynthesesystemein

denMitochondrienvonEukaryontenist jedochbishernichtsbekannt.

5.5 Die Bedeutungder mitochondrialen Fettsäuresynthesefür die At-

mung von S.cerevisiae

Die bekannteFunktionder mitochondrialenFAS in S.cerevisiae ist die Bereitstellungvon

Octanoat-Restenzur Liponsäuresynthese(Brody et al., 1997).Veränderungenim Enzym-

Verbund der mitochondrialenFAS führenzu einerunterschiedlichstarkausgeprägtenVer-

minderungdesLiponsäuregehaltesderHefezellen.Diemit demGenfür mtACP1vonN.cras-

saheterologkomplementierte∆acp-Mutantebesitzt50% desLiponsäuregehaltesdesWild-

typs,ist jedochnichtin derLagezuatmen.DerVerlustdermitochondrialenβ-Ketoacyl-ACP

Reduktaseführt ebenfallszueinemumetwa50% reduziertenLiponsäuregehalt.Offensicht-

lich wurdedie verlorengegangeneReduktase-Aktivität durchdie einesanderen,wenigeref-

fizientenEnzymsersetzt.AuchdieseMutanteist atmungsdefizient.Die mit demGenfür die

β-Ketoacyl-ACP Synthasevon N. crassaheterologkomplementierteHefe-Mutante∆cem

5. Diskussion 61

enthältnoch65% desnormalenLiponsäuregehaltesundist in derLagezuatmen.Demnach

liegt zwischen50 % und65 % desNormalwertesein kritischerLiponsäure-Schwellenwert,

bei dessenUnterschreitungdie Hefeatmungsdefizientwird.

VerschiedeneAutorenvermutenmindestenseineweitereFunktiondermitochondrialen

FAS, die unabhängigvom Liponsäuregehaltfür die Erhaltungder Atmung notwendigist

(Hoja et al., 1998).DieseAnnahmeist jedochfraglich, da für die Syntheseeinesweiteren

FAS-Produktesdie gleichenEnzymeverwendetwerdenmüßtenwie für die Syntheseder

Liponsäure-VorstufeOktansäure.Ist der LiponsäuregehalteinerHefe-Mutantedurcheinen

Fehlerin dermitochondrialenFAS verringert,sollte jedesandereProduktdiesesSynthese-

wegesebenfalls in reduzierterMengevorliegen.Wenndie Atmungskompetenztatsächlich

aneinweiteresProduktdermitochondrialenFAS gekoppeltwäre,sollteesdeshalbauchhier

einenähnlichenkritischenSchwellenwertgeben,dessenUnterschreitungzur Atmungsdefi-

zienzführt. Der Grundfür dasEinstellender Atmung bei UnterschreitungdesSchwellen-

wertesfür Liponsäureist vermutlichauf die verringerteAktivität desCitratcyclus undden

damitabsinkendenNADH-Spiegel in denMitochondrienzurückzuführen.

Die heterologeKomplementationder∆acp-Mutantevon Hefeschienzur Identifizierung

desmtACP2-Gensvon N. crassadie geeigneteMethodezu sein. DiesesVerfahrensetzt

die Ausprägungeineszur SelektiongeeignetenPhänotypsder komplementiertenMutante

voraus.Die atmungsdefizienteMutante∆acp verliert jedochihre mtDNA so schnell,daß

die WiederherstellungderAtmungdurchTransformationmit N. crassa-DNA nicht möglich

ist. DiesesProblemsolltedurchdie AnwendungdesPlasmidShufflingsumgangenwerden.

DaßselbstdabeikeinedurchKomplementationatmungskompetente∆acp-Mutanteidentifi-

ziert werdenkonnte,ist ein weitererHinweisauf die ExistenzeineskritischenLiponsäure-

Schwellenwertes.Dieserwird durchdie möglicherweiseerfolgteExpressiondesmtACP2

von N. crassain derHefe-Mutantenichterreicht.

5.6 Gibt esweitere Funktionen desmtACP in S.cerevisiae?

DasWachstumder ∆acp-Mutanteunterscheidetsich deutlichvon demder ∆cem-Mutante,

obwohl beidegleichermaßenkeine Liponsäuresynthetisierenkönnen(Abb. 20). Im Ver-

gleichzu∆cemhat∆acpeineverlängertelag-Phase,wie aucheinelängereVerdopplungszeit.

DasdeutetaufeinezusätzlicheStörungin der∆acp-Mutantehin, dernicht in dermitochon-

5. Diskussion 62

drialenFAS liegt. WelcherStoffwechselweg betroffen ist, bleibt unklar. Möglicherweiseist

derVerlustdieserzusätzlichenmtACP-Funktionin Hefeauchverantwortlich für die auffäl-

lige InstabilitätdermtDNA.

In A. thalianawurdendreiGenefür mtACP-Isoformengefunden.In diesemOrganismus

erfolgteoffensichtlichim Laufe der Evolution eineweiter fortgeschritteneAufteilung der

Funktionenvon einemmtACPauf drei Isoformen.EinedieserIsoformenist mit Komplex I

assoziiertundfür dessenBiogeneseerforderlich.Einezweiteist für dieSynthesevonLipon-

säureund derenÜbertragungauf ein entsprechendesapo-Enzymnotwendig,währenddie

drittemtACP-IsoformeinenochunbekannteFunktionhat(Abb. 21).

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Abbildung21: SchematischeDarstellungeinerevolutionärenFunktionsaufspaltungvon ei-

nemmtACPaufdrei verschiedeneIsoformen.

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6. Literatur 76

Ja!diesemSinnebin ich ganzergeben,

Dasist derWeisheitletzterSchluß:

Nur derverdientsichFreiheitwie dasLeben,

Der täglichsieerobernmuß.

JohannWolfgangGoethe,FaustII

Vorkommen und Bedeutung mehrerer Isoformen des ... · lichen Polypeptidketten bestehende Enzym hat...

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