Vorlesungsskript Biochemie I

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Scriptum zur Vorlesung Biochemie I auch Teile aus Biochemie II enthaltend (Kap. 3.) Herausgegeben von der Fachschaft Biologie Stand: 09.94 Durchgesehen: 01.08 (Trommer/Philipp) ohne Garantie für Fehlerfreiheit

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Scriptum zur Vorlesung

Biochemie I

auch Teile aus Biochemie II enthaltend (Kap. 3.)

Herausgegeben von der Fachschaft Biologie Stand: 09.94

Durchgesehen: 01.08 (Trommer/Philipp)

ohne Garantie für Fehlerfreiheit

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Inhalt:

1. Proteine 1 1.1. Hierarchie der Zellkomponenten.............................................................................................1 1.2. Allgemeiner Aufbau der Proteine ............................................................................................1 1.3. Analyse der Raumstruktur von Proteinen .............................................................................1 1.4. Die 20 Aminosäuren ...................................................................................................................2 1.5. Struktur der Proteine ................................................................................................................3 1.6. Analyse von Proteingemischen.................................................................................................4

1.6.1. Molekülgröße........................................................................................................................... 5 1.6.2. Elektrische Ladung................................................................................................................. 6 1.6.3. Absorptionsverhalten.............................................................................................................. 6 1.6.4. Löslichkeit ............................................................................................................................... 7 1.6.5. Affinität ................................................................................................................................... 8

1.7. Nachweis mit Ninhydrin ...........................................................................................................9 1.8. Bestimmung der Aminosäuresequenz .....................................................................................9

2. Enzyme / Coenzyme 15 2.1. Enzyme........................................................................................................................................15

2.1.1. Wirkungsweise von Enzymen............................................................................................... 15 2.1.2. Einheiten der Enzymaktivität.............................................................................................. 16 2.1.3. Regulation der Enzymaktivität ............................................................................................ 17 2.1.4. Hemmkinetik......................................................................................................................... 18 2.1.5. Das Michaelis-Menten Modell .............................................................................................. 19

2.2. Coenzyme und prosthetische Gruppen..................................................................................21 2.2.1. Wasserstoffübertragende Coenzyme .................................................................................... 21 2.2.2. Gruppenübertragende Coenzyme......................................................................................... 23 2.2.3. Coenzyme für C1-Transfer .................................................................................................... 24 2.2.4. Coenzyme für C2-Transfer .................................................................................................... 25 2.2.5. Coenzym der Isomerasen und Lyasen.................................................................................. 25

2.3. Hämoglobin / Myoglobin..........................................................................................................25

3. Chemische Modifizierung von Proteinen 28 3.1. Unspezifische Reagenzien.......................................................................................................29 3.2. Gruppenspezifische Reagenzien ............................................................................................30 3.3. Reagenzien zur Änderung der Ladung.................................................................................31 3.4. Hydrophobisierung von Enzymen..........................................................................................31 3.5. Reversible Reagenzien .............................................................................................................31 3.6. Active-Site Labeling .................................................................................................................32 3.7. Suizid - Substrate .....................................................................................................................32 3.8. Photoaffinity - Label ................................................................................................................32 3.9. Bifunktionelle Reagenzien......................................................................................................33 3.10. Semireversible Reagenzien .....................................................................................................34 3.11. Trägergebundene Enzyme.......................................................................................................34

4. Lipide 36 4.1. Allgemeine Übersicht ...............................................................................................................36 4.2. Fette ............................................................................................................................................36 4.3. Glykolipide.................................................................................................................................36 4.4. Phospholipide ...........................................................................................................................37 4.5. Isoprenoidlipide........................................................................................................................37 4.6. Biomembranen..........................................................................................................................38

5. Monosaccharide 39 5.1. Nomenklatur .............................................................................................................................39 5.2. Zyklische Zucker.......................................................................................................................40 5.3. Nucleotide ..................................................................................................................................41

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6. Stoffwechsel 42

7. Kohlenstoff-Stoffwechsel 44 7.1. Glykogen.....................................................................................................................................44

7.1.1. Abbau des Glykogens durch Glykogen-Phosphorylase........................................................ 44 7.1.2. Synthese von Glykogen......................................................................................................... 45

7.2. Glykolyse ....................................................................................................................................46 7.2.1. Ablauf der Glykolyse............................................................................................................. 46 7.2.2. Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose ............................................................ 47 7.2.3. Bildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat............................................................................ 48 7.2.4. Regulation der Glykolyse...................................................................................................... 49 7.2.5. Weiterverarbeitung des Pyruvats ........................................................................................ 50

7.3. Oxidative Decarboxylierung...................................................................................................51 7.3.1. Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes........................................................... 53

7.4. Hormonelle Steuerung.............................................................................................................53 7.4.1. Übersicht zur Wirkung der Hormone................................................................................... 54 7.4.2. Stimulierung der Adenylat-Cyclase durch ein G-Protein ................................................... 54 7.4.3. Aktivierung der Protein-Kinase A und der Phosphorylase................................................. 55 7.4.4. Aktivierungskaskade zum Glykogenstoffwechsel................................................................ 56

7.5. Gluconeogenese.........................................................................................................................56 7.5.1. Enzymatische Unterschiede zwischen Glykolyse und Gluconeogenese ............................. 57

7.6. Der Citratzyklus .......................................................................................................................58 7.6.1. Citrat-Malat-Shuttle ............................................................................................................. 59

7.7. Oxidative Phosphorylierung und Atmung ...........................................................................60 7.7.1. Elektronen-Carrier der Atmungskette................................................................................. 60 7.7.2. Glycerinphosphat-Shuttle..................................................................................................... 61 7.7.3. Chemiosmotische Hypothese von MITCHELL ....................................................................... 61 7.7.4. Oxidative Phosphorylierung (ATP-Synthese) ...................................................................... 61 7.7.5. Entkopplung der Atmung von der oxidativen Phosphorylierung ....................................... 62 7.7.6. Definition des Atmungsquotienten (respiratorischer Quotient) ......................................... 62 7.7.7. ATP-Bilanz für Glucose ........................................................................................................ 62

7.8. Der Pentosephosphatweg ........................................................................................................62 7.8.1. Verwertung von Glucose-6-phosphat ................................................................................... 63 7.8.2. Mechanismus der Transketolase.......................................................................................... 63 7.8.3. Mechanismus der Transaldolase .......................................................................................... 64

8. Der Fettsäurestoffwechsel 66 8.1. Fettsäureabbau.........................................................................................................................66

8.1.1. Hydrolyse von Triacylglycerinen durch cAMP-gesteuerte Lipasen: ................................... 66 8.1.2. Aktivierung der Fettsäuren durch CoA: .............................................................................. 67 8.1.3. Transport in die Matrix der Mitochondrien durch Carnitin: .............................................. 67 8.1.4. β-Oxidation ............................................................................................................................ 67 8.1.5. Oxidation ungesättigter Fettsäuren..................................................................................... 68 8.1.6. Abbau ungeradzahliger Fettsäuren ..................................................................................... 68

8.2. Ketonkörper entstehen bei vorherrschendem Fettabbau...................................................68 8.3. Fettsäure-Synthese ...................................................................................................................69

9. Aminosäureabbau und Harnstoffzyklus 70 9.1. Transaminierung .....................................................................................................................70 9.2. Oxidative Desaminierung .......................................................................................................71 9.3. Der Harnstoffzyklus .................................................................................................................71

10. Biosynthese von Makromolekülen 72 10.1. Tetrahydrofolat als C1-Überträger ........................................................................................72 10.2. Zyklus der aktivierten Methylgruppe....................................................................................73 10.3. Purin-Biosynthese.....................................................................................................................73 10.4. Pyrimidin-Biosynthese.............................................................................................................75 10.5. Abbau der Purine .....................................................................................................................76 10.6. NAD-Biosynthese.......................................................................................................................77

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10.7. Synthese von Sphingolipiden und Gangliosiden ................................................................77 10.8. Biosynthese von Phospholipiden............................................................................................78 10.9. Cholesterin-Synthese................................................................................................................79

11. Photosynthese 81 11.1. Lichtreaktion ............................................................................................................................81 11.2. Dunkelreaktion.........................................................................................................................84

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Proteine Hierarchie der Zellkomponenten 1

1. Proteine

1.1. Hierarchie der Zellkomponenten

• Zelle • Organellen z. B. Mitochondrien, Chloroplasten, Zellkern • Supramolekulare Strukturen Multienzymkomplexe, Ribosomen, kontraktile Systeme • Makromoleküle Nucleinsäuren, Proteine, Polysaccharide, Lipide • Bildungsblöcke Nucleotide, Aminosäuren, Monosaccharide,

Glycerin und Fettsäuren • metabolische Zwischenprodukte Pyruvat, Citrat, Malat • Vorstufen aus der Umwelt CO2, N2, NH3, H2O

1.2. Allgemeiner Aufbau der Proteine

Proteine sind Heteropolymere der Aminosäuren (d. h. aus verschiedenen Molekülen zusammengesetzt). Ein weiterer wichtiger Typ kovalenter Bindungen in Proteinen sind die Disulfidbrücken zwischen Cystein-Hälften (cross linkage). Die Bindungen können von Proteasen hydrolysiert werden.

Nomenklatur: Außer beim Glycin ist das α-C-Atom asymmetrisch substituiert, es tritt daher optische Aktivität auf. Man unterscheidet zwei sterische Reihen, die L- und die D-Reihe, sowie zweierlei Konfigurationszuweisungen, die S- und die R-Konfiguration. Nur L-Aminosäuren, die fast alle (Ausnahme L-Cystein) S-Konfiguration besitzen, sind Bausteine der Proteine. Der optische Drehungssinn ist unabhängig von der Zugehörigkeit zu einer sterischen Reihe.

1.3. Analyse der Raumstruktur von Proteinen

1.) Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie: (NMR = Kernmagnetische Resonanz) Das Protein wird in ein magnetisches Feld gebracht und die unterschiedliche Resonanz der Atomkerne gemessen. Vorteil: Es ergibt sich ein 3D-Bild, welches sich aus der Summe von Einzelmolekülen in Lösung ergibt.

2.) Röntgenstrukturanalyse eines Kristalls der Verbindung: Bestrahlung des Moleküls mit Röntgenstrahlen, wobei die Strahlen bei unterschiedlicher Elektronendichteverteilung unterschiedlich gebeugt werden. Durch die Mobilität ergeben sich allerdings Unschärfen im Kristall. Die Struktur des Myoglobins (ähnlich dem Hämoglobin) wurde durch diese Methode aufgeklärt. Vorteil: Auflösungsgrenze = 0,15 nm (bzw. 0,2-0,35 nm) (beim LM: » 400 nm) Nachteil: eingeschränkte Dynamik

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Proteine Die 20 Aminosäuren 2

1.4. Die 20 Aminosäuren

Neutrale hydrophobe Aminosäuren:

Neutrale hydrophile Aminosäuren:

Saure Aminosäuren:

Basische Aminosäuren:

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Proteine Struktur der Proteine 3

1.5. Struktur der Proteine

Primärstruktur: Die Aminosäuresequenz in der Polypeptidkette.

Sekundärstruktur: Bei der α-Helix-Struktur sind Wasserstoffbrücken intramolekular zwischen der NH- und der 4 AS-Reste entfernten CO-Gruppe ausgebildet. Dadurch entsteht die schraubenförmige Anordnung der Aminosäuren. Ganghöhe (pitch): Länge, die die α-Helix bei voller Drehung zunimmt. Eine Aminosäure bringt eine Drehung von 100°, daher nach 3,6 AS eine volle Umdrehung. Bei der β-Faltblattstruktur kommt es zu einer zur Kettenrichtung senkrechten Ausbildung der H-Brücken (bei α-Helix: parallel zur Helixachse) zwischen verschiedenen Polypeptidketten oder gefalteten Kettenteilen. Seide: - reine Faltblattstruktur (fast nur Gly, Ser, Ala) - an jeder zweiten Position Gly - Ketten parallel zur Faserachse Kollagen: - häufigstes Protein in Wirbeltieren (Haut, Knochen, Knorpel) - spezielle Helixstruktur - mechanisch stark beanspruchbar - denaturiertes Kollagen » Gelatine

Tertiärstruktur: 3D-Knäuelung der α-Helix und der Faltblattstruktur. Stabilisierung durch Disulfidbrücken:

Besonders wichtig bei kleinen Polypeptiden, da Struktur stabilisierend (Insulin, Chymotrypsin, Trypsin, α-Keratin (Haar)) Siehe auch Anfinsen-Experiment.

Wasserstoffbrücken: Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen schwach acidem Donor und schwach basischem Akzeptor im Inneren des Proteins: a) zwischen Peptidbindungen (α-Helix, β-Faltblatt) b) zwischen Seitenketten der einzelnen AS und an der Oberfläche mit Wasser. Wechselwirkung mit Wasser ist energetisch günstiger.

Ionische Wechselwirkungen: Relativ geringe Bedeutung für die Struktur, da meist an Enzymoberfläche → hauptsächlich Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel

Hydrophobe Wechselwirkungen: AS mit unpolaren Seitenketten: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro

• Versuch den Kontakt mit H2O zu vermeiden • intramolekulare Gruppierung / Ausschluß von H2O • hydrophobe AS innen, hydrophile außen (dadurch gute H2O-Löslichkeit)

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Proteine Analyse von Proteingemischen 4

Anfinsen-Experiment: Untersuchung der Gründe für die Ausbildung einer Tertiärstruktur globulärer Proteine. Ausgangsmaterial: RNase: 124 AS, 4 S-S-Brücken Denaturierung in 8 M Harnstoff und Reduktionsmittel → Spaltung der Disulfidbrücken 1.) Erst oxidiert und dann Harnstoff entfernt → falsche zufällige Renaturierung (keine Enzymaktivität) 2.) Erst Entfernung des Harnstoffs (partielle Renaturierung) → richtige Faltung und richtige Disulfidbrücken (Enzymaktivität) Ergebnis: Die Aminosäuresequenz spezifiziert die Tertiärstruktur globulärer Proteine.

Domänen: Proteine bestehen oft aus mehreren Faltungseinheiten, die als Domänen bezeichnet werden.

Quartärstruktur: Anlagerung mehrerer Polypeptidketten (Untereinheiten) aneinander → polymere Proteine Bindungen wie bei der Tertiärstruktur. z. B. Virenhüllen, Hämoglobin, Multienzymkomplexe

1.6. Analyse von Proteingemischen

Probleme: • Vorkommen oft in sehr kleinen Mengen (1% vom Trockengewicht)

(Peptidhormone wie z. B. Insulin in noch kleineren Mengen) • Stabilität: labil gegen pH (Bsp.: LDH dissoziiert bei pH < 6 → Denaturierung) • Temperatur:

kältelabil (z. B. F1-ATPase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase einiger Spezies) wärmelabil: die meisten Enzyme

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Proteine Analyse von Proteingemischen 5

Um Substanzgemische aufzutrennen, kann man 5 Eigenschaften der Moleküle benutzen: 1. Molekülgröße 2. Elektrische Ladung 3. Absorptionsverhalten 4. Löslichkeit 5. Affinität

Chromatographie: Physikalisch-chemisches Verfahren zur analytischen und präparativen Trennung gelöster oder gasförmiger Verbindungen. Die chromatographische Trennung beruht darauf, daß eine mobile Phase über eine stationäre Phase wandert und dabei die zu trennende Substanz mit unterschiedlicher Geschwindigkeit transportiert. An der stationären Phase, dem Trägermaterial (z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Stärke, Zellulose, Silikonöl, Ionenaustauschern) tritt eine unterschiedliche Verteilung der zu trennenden Substanzen mit der mobilen Phase (meist organische Lösungsmittel) auf.

HPLC: (High Pressure Liquid Chromatography) Säulenchromatographie unter hohem Druck. Dadurch kann ein feineres Trennmaterial verwendet werden, bei dem die Durchlaufzeit ohne Druck zu hoch wäre.

1.6.1. Molekülgröße

Zentrifugation (differentielle bzw. fraktionierte Zentrifugation): Voraussetzung: Molekulargewichtsunterschiede. Der Faktor S entspricht dabei der Sedimentationskonstante, ist also ein Maß für das Gewicht (ist aber auch abhängig von der Form der Moleküle).

Ultrazentrifugation (Dichtezentrifugation): Sedimentierung der Proteine durch extreme Zentrifugation (bis 300 000 g). Träger: Sucrosegradient

Dialyse: Durch Osmose werden mit Hilfe einer semipermeablen Membran kleine Moleküle aus der Lösung entfernt. Zurück bleiben nur die großen Moleküle (z. B. Proteine).

Ultrafiltration: Durch Druck oder Zentrifugationskraft werden kleine Moleküle und Wasser durch eine semipermeable Membran gepreßt.

Gelfiltration (Gelchromatographie): Das Substanzgemisch läuft über eine Säule aus stark hydratisiertem, polymeren Material wie z. B. Sephadex (Polysaccharid-Derivat), BioGel (Polyacrylamid-Derivat) oder Agarose (Polysaccharid). Die Gelpartikel werden mit verschieden großen Poren hergestellt. Die Substanzen mit unterschiedlicher Größe dringen mit unterschiedlichem Maße in die Gelpartikel ein. Große Substanzen laufen daher schneller durch die Säule als kleine Substanzen.

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Proteine Analyse von Proteingemischen 6

1.6.2. Elektrische Ladung

Ionenaustauschchromatographie (Ionenaustauscher): Das in der Säule befindliche Trägermaterial ist in der Lage, einen Teil der an austauschaktiven Gruppen gebundenen Ionen gegen andere Ionen reversibel zu tauschen. Trägermaterial:

• Sulfoniertes Polystyrol • Polyacrylamid • Zellulose • andere Zucker (Dextrane "Sephadex")

Kationenaustauscher: CM (Carboxymethyl / schwach sauer): R-CH2-COO-

Sulfonyl: RSO3H + NaCl → RSO3Na + HCl Anionenaustauscher: DEAE (Diethylaminoethyl / schwach basisch): R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+OH- + NaCl → R-CH2-CH2-NH-(CH2-CH3)2]+Cl- + NaOH Das im Austauscher verbleibende Substanzion kann durch Elution (Lösen) mit geeigneten Ionen je nach Dissoziationskonstante abgelöst werden (z. B. durch pH-Gradienten / Ionenstärkegradienten).

Elektrophorese: Bewegung elektrisch geladener Teilchen im elektrischen Feld. Die negativ geladenen Teilchen wandern dabei zur Anode und die positiv geladenen zur Kathode. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt vom Verhältnis Masse/Ladung ab. Hochspannung - Trägermaterial:

(1) Papier (2) Kieselgelplatte

Niederspannung:

(1) Polyacylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) (2) Zelluloseacetat-Folien

Isoelektrische Fokussierung: Durch den isoelektrischen Punkt (IEP) lassen sich Proteingemische auftrennen (s. a. isoelektrische Fällung). In Verbindung mit einer Elektrophorese wandern die Proteine im elektrischen Feld. Dabei ist der pH-Gradient im Gel von Bedeutung: Die Proteine wandern bis zu der Stelle, wo der pH-Wert ihrem IEP entspricht. Da sie an diesem Punkt keine Ladung mehr tragen, können sie nicht weiterwandern.

1.6.3. Absorptionsverhalten

Adsorptionschromatographie: Die Trennung erfolgt über eine Säule, auf die die Substanzmenge gegeben wird. Der obere Teil der Säule adsorbiert nun die Substanzmenge. Durch Zugabe von Lösungsmittel wird die Substanz wieder gelöst und fließt in der Säule ein kleines Stück weiter, bis sie erneut adsorbiert wird. Dieser Vorgang wiederholt sich kontinuierlich, wodurch es durch die unterschiedlichen Adsorptionsverhalten der verschiedenen Stoffe zu einer klaren Trennung der Substanzmenge kommt. Durch die Zugabe entsprechender Mengen an Lösungsmittel können die einzelnen Fraktionen des Eluats in einem Fraktionssammler entnommen werden.

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Proteine Analyse von Proteingemischen 7

1.6.4. Löslichkeit

Aussalzen: z. B. Fällung (fraktioniert) mit Ammoniumsulfat (bis 3 M löslich in Wasser)

• zunächst Anstieg der Löslichkeit des Proteins bei Zugabe von Salz → Einsalz-Effekt • bei hoher Salzkonzentration → Aussalz-Effekt

(Lösungsmittel reicht nicht mehr aus, Proteine fallen nacheinander aus und werden abzentrifugiert)

Fällung: Aceton-Fällung und Ethanol-Fällung; durch niedrige Dielektrizitätskonstante wird die Solvatationskraft des Wassers herabgesetzt, die Proteine fallen aus. Aber: Fällung normalerweise bei niedrigen Temperaturen

→ Limitierung bei kältelabilen Proteinen

Isoelektrische Fällung: Am isoelektrischen Punkt (IEP) ist die Zahl der positiven Ladungen im Protein gleich der Zahl der negativen Ladungen. Bei diesem pH-Wert ist die Löslichkeit des Proteins minimal. Durch die Veränderung des pH-Wertes können Proteine mit unterschiedlicher Ladungsverteilung nacheinander abgetrennt werden.

Verteilungschromatographie: Wie bei der Adsorptionschromatographie wird auch hier in einer Säule gearbeitet. Als Adsorptionsmittel dienen Kieselgur, Zellulosepulver, Stärke oder Glaspulver, die mit Wasser befeuchtet werden. Das zu trennende Substanzgemisch wird gelöst und auf die Säule gegeben. Mit einem organischen Lösungsmittel wird das Substanzgemisch langsam durch die Säule gespült. Eine Trennwirkung kommt dabei nicht durch die Adsorption der Substanzen an dem Trägermaterial zustande, sondern durch das Eindringen der Stoffe in den Wasserfilm auf der Oberfläche des Trägers. Dabei verteilen sich die Substanzen zu einem bestimmten Verhältnis in den beiden Phasen. Substanzen, die in organischen Lösungsmitteln leichter löslich sind als in Wasser, wandern schneller durch die Säule als leicht wasserlösliche Substanzen.

Gas-Chromatographie: Das Substanzgemisch wird verdampft und mit einem inerten Trägergas (Helium, Argon oder Stickstoff) durch ein langes, dünnes Rohr geleitet. Die einzelnen Komponenten des Gasgemisches lösen sich mehr oder weniger gut in der stationären Phase (Flüssigkeitsfilm auf der Innenseite des Rohrs) und können somit am Ende der Kolonne nach kürzerer oder längerer Strömungszeit nachgewiesen werden.

Papierchromatographie: Sie ist eine Verteilungschromatographie, die Trennwirkung beruht auf unterschiedlicher Löslichkeit der Substanzmenge in dem Lösungsmittel. Das Lösungsmittel-Substanzgemisch steigt durch Kapillarkräfte auf. Während des Vorgangs kommt es zur Bildung zweier Laufmittelphasen (eine hydrophile und eine hydrophobe Schicht). Durch die Wechselwirkung zwischen hydrophilem Trägermaterial und hydrophilem Laufmittel wandert der hydrophobe Teil des Substanzgemisches schneller und weiter an der Säule hinauf. Als stationäre Phase dient dabei mit Wasser getränktes Filterpapier. Die Auftrennung (Entwicklung) erfolgt in einer gut verschlossenen Chromatographieapparatur.

Dünnschichtchromatographie: Als Trennschicht verwendet man oft Kieselgel, Kieselgur und Aluminiumoxid, das mit Wasser unter Zusatz von Gips als dünnflüssige Suspension auf eine rechteckige Glas- oder Kunststoffplatte aufgetragen wird.

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Proteine Analyse von Proteingemischen 8

Das Trennverfahren läuft wie bei der Papierchromatographie ab, jedoch sind die Zeitersparnis und eine empfindlichere Auftrennung Vorteile der Dünnschichtchromatographie. Bei der 2D-Dünnschichtchromatographie wird nach Abschluß des ersten Laufes (a.) die Platte um 90° gedreht und ein zweiter Lauf (b.) in einem anderen Fließmittel durchgeführt.

a.) b.)

1.6.5. Affinität

Affinitätschromatographie: Die Proteine können gezielt aus einem Proteingemisch isoliert werden. Das Prinzip basiert auf der Fähigkeit der Proteine, bestimmte Moleküle (Liganden) spezifisch zu binden. Dabei dient als Säulenmaterial z. B. das Polysaccharid Agarose, an dessen Oberfläche die Liganden chemisch gebunden werden. Wird die Proteinmischung nun auf die Säule gegeben, so bleibt nur das dem Liganden entsprechende Protein hängen, der Rest fließt nach Zugabe von Pufferlösung durch die Säule hindurch. Das gewünschte Protein kann dann durch Zugabe einer hohen Konzentration des Liganden in löslicher Form von dem Trägermaterial eluiert werden. Dadurch besteht mit dieser Methode die Möglichkeit, bestimmte Proteine extrem hoch zu reinigen.

gruppenspezifische Affinitätschromatographie:

z. B. AMP-Säulen zur Reinigung von NAD-abhängigen Proteinen

hochspezifische Affinitätschromatographie: z. B. Reinigung von Antikörpern, Substratsäulen (Zur Aktivierung der Agarose siehe Kap. 3.11!)

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Proteine Nachweis mit Ninhydrin 9

1.7. Nachweis mit Ninhydrin

1.8. Bestimmung der Aminosäuresequenz

Erste vollständige AS-Sequenz 1953 am Rinder-Insulin durch FREDERICK SANGER. Warum ist das Wissen über die AS-Sequenz wichtig? • Aufklärung der Kristallstruktur • Verständnis molekularer Mechanismen • Vergleich anderer Proteine → Hinweise auf Funktion / evolutionäre Zusammenhänge

Versuchsplan:

1. Bruttozusammensetzung der AS (Aminosäureanalyse) 2. Bestimmung der Endgruppen (Hinweis auf verschiedene Polypeptidketten) 3. Trennung in Einzelketten 4. Spaltung der Polypeptidketten in kleine Fragmente 5. Sequenzierung der kleinen Fragmente 6. Wiederholung von 4. unter Bildung anderer Fragmente

→ Überlappungsfragmente 7. Zuordnung der Disulfid-Gruppen innerhalb oder zwischen Untereinheiten

1.) Aminosäureanalyse Zur Analyse wird eine Totalhydrolyse unter sauren und/oder basischen Bedingungen durchgeführt.

a.) sauer: Erhitzen der Polypeptide in Gegenwart eines Überschusses an 6 N HCl bei 100-120°C für 10-100 Stunden in einem evakuierten, unter Vakuum zugeschmolzenen Röhrchen ist die normale Methode der Totalhydrolyse. Unter diesen Bedingungen findet keine Racemisierung und keine O2-Oxidation statt. Für die Freisetzung von Val, Leu, Ile sind lange Zeiten erforderlich.

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Proteine Bestimmung der Aminosäuresequenz 10

Nachteil: - teilweise Zerstörung von Ser, Thr, Tyr

- weitgehende Zerstörung von Trp - aus den Amid-Gruppen von Asn und Gln entstehen Carboxylgruppen und

Ammoniumionen, die in die Messung von Glu und Asp mit eingehen b.) basisch:

Durch Kochen der Peptide in 2-4 M NaOH bei 100°C für 4-8 h kann Trp getrennt bestimmt werden. Nachteil: - Zerstörung von Cys, Ser, Thr, Arg

- andere AS werden teilweise desaminiert und racemisiert Vorteil: - liefert die Trp-Werte

2.) Endgruppenbestimmung Die Endgruppen geben Hinweise auf unterschiedliche Polypeptidketten. So besteht z. B. Insulin aus zwei AS-Ketten, die über zwei Disulfid-Brücken verbunden sind. Es ergeben sich also zwei Aminosäuren vom C-Terminus und zwei vom N-Terminus.

N-Terminus

Prinzipien:

Sanger / Dansylierung a) AS-Kette b) Markierung c) Hydrolyse → einzelne AS

Edman-Abbau

a) AS-Kette Markierung Hydrolyse → AS-Kette + 1 AS b) Erneuter Ablauf

a.) Sanger-Reaktion (1945)

Reaktion der freien α-Amino-Gruppe der Proteine mit 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) unter Bildung von gelben 2,4-Dinitrophenyl-Derivaten. Durch die Hydrolyse der so entstandenen Peptide mit 6 N HCl werden alle Peptidbindungen gespalten. Es bleibt also als einzige farbige Verbindung das 2,4-Dinitrophenyl-Derivat mit der N-terminalen Aminosäure übrig, welches abgetrennt und durch chromatographischen Vergleich (2D-Dünnschichtchromatographie) mit bekannten 2,4-Dinitrophenyl-Derivaten der einzelnen AS identifiziert werden kann. Problem: Nucleophile AS-Seitenketten können ebenfalls reagieren.

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Proteine Bestimmung der Aminosäuresequenz 11

b.) Dansylierung

Statt dem DNFB wird Dansylchlorid (5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid) als Markie-rungsreagenz verwendet. Nach der Hydrolyse können die Dansyl-Derivate durch deren fluoreszieren-den Charakter bestimmt werden. Diese Methode ist 100mal empfindlicher als die Methode von SANGER.

c.) Edman-Abbau

Großer Vorteil des Edman-Abbaus: Der Rest der AS-Kette bleibt nach der Abtrennung der terminalen AS intakt und kann daher weiter untersucht werden. Somit kann das Protein Schritt für Schritt abgebaut werden. Das entstandene Phenylthiohydantoin (PTH) wird über die Gas-Chromatographie (oder HPLC) getrennt und bestimmt. Dieser Vorteil wurde benutzt, um einen "Sequenator" (Solid-Phase) zu bauen. Dieses Gerät führt die AS-Bestimmung automatisch durch und bestimmt die entstehenden PTH-Derivate im Anschluß durch Chromatographie.

C-Terminus:

a.) Hydrazinolyse (Akabori-Reaktion)

Alle Peptidbindungen werden durch Umwandlung der AS in Hydrazide gespalten. Es liegen daher nur noch Aminosäure-Hydrazide vor. Einzige Ausnahme dazu ist die AS des C-terminalen Endes der ursprünglichen Proteinkette. Sie besitzt als einzige noch eine Carboxylgruppe und kann als freie Säure leicht chromatographisch identifiziert werden.

H+

Phenylthiohydantoin

-Peptid

-Peptid

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Proteine Bestimmung der Aminosäuresequenz 12

b.) Reduktion der AS durch Lithiumborhydrid zum entsprechenden α-Aminoalkohol. Nach der Hydrolyse kann dieser Alkohol chromatographisch identifiziert werden.

c.) Abspaltung der C-terminalen AS durch Carboxypeptidase (eine Exopeptidase). Nachteil: das Enzym spaltet schnell die nächste AS ab.

3.) Trennung in Einzelketten (falls erforderlich) a) Entfaltung der AS-Kette durch Harnstoff → Aufhebung der Tertiär- und Quartärstruktur. b) Spaltung der S-S-Bindungen durch - Reduktion (z. B. NaBH4) - Umsetzung mit Jodacetat: Bildung von stabilen Derivaten (Carboxymethylcystein) R-SH + I-CH2-COOH → R-S-CH2-COOH + HI

4.) Spaltung in Fragmente (Partialhydrolyse) Zur späteren Identifizierung der Fragmente ist es wichtig, spezifische Spaltstellen zu erhalten.

a.) Bromcvan-Spaltung: Spaltung der Peptidbindungen an denen ein Methionin beteiligt ist.

b.) Enzvmatische Spaltung durch Proteasen (Hydrolyse der Peptidbindungen) Peptidasen (= Exopeptidasen) spalten AS vom Ende ab

1.) Carboxypeptidase (C-Terminus) 2.) Aminopeptidase (N-Terminus)

Proteinasen (= Endopeptidasen) spalten an spezifischer Spaltstelle innerhalb der AS-Kette

spaltet am C-terminalen Ende von: Trypsin Lys, Arg Chymotrypsin Phe, Trp, Tyr Pepsin Phe, Trp, Tyr und verschiedene andere

Thermolysin spaltet am N-terminalen Ende von Leu, Ile, Val

Viele Proteasen werden als inaktive Vorstufen (Zymogene, Proenzyme) sezerniert und dann proteolytisch aktiviert.

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Proteine Bestimmung der Aminosäuresequenz 13

Beispiele: • Bildung von Chymotrypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Chymotrypsin

im Dünndarm durch Spaltung einer Arg—Ile-Bindung mittels Trypsin. • Bildung von Trypsinogen als inaktive Vorstufe im Pankreas, Aktivierung zu Trypsin im Darm

durch Enteropeptidase oder Trypsin selbst (autokatalytische Aktivierung).

5.) Sequenzierung der Fragmente a) chemisch:

• Edman-Abbau b) physikalisch:

• FAB (fast atom bombardment) + Variante der Massenspektroskopie, bis 25 AS + bombardiert in Glycerin gelöste Peptide mit Ar- oder Xe-Atomen. + Fragmentieren in verschieden große Teilstücke + Vergleich zwischen Massen und Fragmenten → Sequenz Vorteil:

- mehrere Peptide (Gemisch, Verunreinigungen) möglich - Untersuchung posttranslational veränderter Proteine

(z. B. blockierter N-Terminus) - sehr hohe Empfindlichkeit

Nachteil: - hohe Gerätekosten

c) enzymatisch: • Exopeptidasen

6.) Überlappungsfragmente Durch die Bildung weiterer, mit den bisherigen überlappender Fragmente kann auf die Sequenz des ganzen Proteins zurückgeschlossen werden. Um andere Fragmente zu erhalten, wird die Spezifität der entsprechenden Enzyme geändert. Dadurch kommt es zu einer anderen Spaltung und zu anderen Überlappungsfragmenten.

Spaltung am Beispiel von Trypsin: a.) normale Spaltstellen: Spaltung nach Lys und Arg b.) weniger Spaltstellen: Blockierung von Lys → nur noch Spaltung bei Arg • Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid:

Lys-(CH2)4-NH2 + → Lys-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-COOH

• Reaktion mit Jodessigsäure: Lys-(CH2)4-NH2 + I-CH2COOH → Lys-(CH2)4-NH-CH2-COOH + HI

c.) mehr Spaltstellen: • Umwandlung von Cystein in Pseudolysin,

dadurch Spaltung nach Cystein, Lys und Arg:

Cys-CH2-SH + → Cys-CH2-S-CH2-CH2-NH2

Page 18: Vorlesungsskript Biochemie I

Proteine Bestimmung der Aminosäuresequenz 14

7.) Zuordnung der Disulfid-Brücken 1.) Carboxylierung der SH-Gruppen (mit Jodessigsäure) 2.) Tryptische Verdauung ohne Reduktion der S-S-Brücken 3.) Isolierung der vernetzten Peptide 4.) Reduktion der S-S-Brücken (NaBH4 / pH 3) 5.) Trennung der Oligopeptidketten in Gegenwart von Mercaptoethanol

(Schutz der freien SH-Gruppen) 6.) Sequenzierung der Einzelketten

→ Carboxymethylierte Cysteine = frühere freie SH-Gruppen → freie SH-Gruppen = frühere S-S-Brücken

Page 19: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Enzyme 15

2. Enzyme / Coenzyme

2.1. Enzyme

2.1.1. Wirkungsweise von Enzymen

Enzyme sind meist Proteine (seltener Ribonucleinsäuren). • Wirken als Katalysator • Verändern nicht die Lage des Gleichgewichts • Erhöhen die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung durch

Erniedrigung der Aktivierungsenergie ∆G • Ermöglichen milde Reaktionsbedingungen • Fähigkeit zur Regulation • Große Reaktionsspezifität

Die Bindung der Substrate erfolgt am aktiven Zentrum durch • ionische oder hydrophobe

Wechselwirkungen • kovalente Zwischenstufen

Isoenzyme: Enzyme gleicher Funktion, die sich aber in ihrer Struktur und infolgedessen in manchen Eigen-schaften voneinander unterscheiden.

Lactat-Dehvdrogenase: Tetramer aus 4 identischen Untereinheiten pro "Typ". Der H-Typ dominiert im Herzmuskel, der M-Typ im Skelettmuskel und in der Leber. Diese Untereinheiten setzen sich zu verschiedenen Tetrameren (multiplen Formen) zusammen:

H4, H3M, H2M2, HM3, M4

Der H4-Typ besitzt eine höhere Affinität zu Pyruvat als der M4-Typ. Deshalb wird der H4-Typ durch hohe Pyruvatkonzentrationen gehemmt (Substrathemmung). Diese homologen Enzyme sind durch Genduplikation entstanden:

LDH-H4 (Mensch) — LDH-H4 (Schwein): höhere Homologie als: LDH-H4 (Mensch) — LDH-M4 (Mensch)

Unterschiede bei Chymotrypsin und Trypsin Substratbindungszentrum: Chymotrypsin benötigt eine aromatische oder eine sperrige unpolare Seitenkette auf der Aminoseite der abzuspaltenden Peptidkette. Die Nische (eine unpolare Tasche) ist dagegen bei Trypsin verändert (Aspartat statt Serin). Das Aspartat kann eine starke elektrostatische Bindung mit einer positiv geladenen Lysin- oder Argininseitenkette des Substrats eingehen.

Page 20: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Enzyme 16

Katalytische Triade von Trypsin Beispiel für kovalente Katalyse, Säure-Base-Katalyse, Deformation des Substrats. Beim Trypsin (und Chymotrypsin) bilden Histidin 57, Aspartat 102 und Serin 195 eine katalytische Triade, wodurch die Reaktionsfähigkeit von Serin gesteigert wird. Wirkungsweise: Nach Zugabe eines Substrats wird ein Proton vom Serin 195 auf das Histidin 57 übertragen und der Imidazolring durch Aspartat 102 stabilisiert.

2.1.2. Einheiten der Enzymaktivität

Definition der Enzymaktivität: 1 µmol Substratumsatz

1 Unit (U) = min (absolute Enzymaktivität)

U / ml: Volumenaktivität U / mg Enzym: spezifische Aktivität

SI-Einheiten: 1 mol Substratumsatz

1 Katal (kat) = s (absolute Enzymaktivität)

kat / kg: spezifische Aktivität

1 U = 16,67 nkat

Page 21: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Enzyme 17

2.1.3. Regulation der Enzymaktivität

1.) Aktivierung von Vorstufen Viele proteolytische Enzyme liegen in einer inaktiven Form vor. Man bezeichnet sie als Zymogene oder Proenzyme. Die Aktivierung erfolgt durch die Hydrolyse einer oder mehrerer Peptidbindungen. In diese Gruppe fallen viele Verdauungs- und Blutgerinnungsenzyme. Beispiel: Zymogen des Trypsins = Trypsinogen N-terminales Hexapeptid wird abgespalten Spaltstelle = Lys — Ile

→ Lys = natürliche Spaltstelle des Trypsins → Die Protease Enteropeptidase braucht nur wenig aktives Trypsin herzustellen, dann: → autokatalytische Aktivierung (Trypsin ist sein eigener Katalysator)

2.) Allosterische Regulation (z. B. Feedback-Inhibition) Allosterie ist die Erscheinung, daß Makromoleküle (insbesondere Proteine) ihre Konformation und Aktivität ändern, wenn ein bestimmtes Molekül (ein Effektor - kann auch gleichzeitig Substrat oder Produkt sein) an das Makromolekül gebunden wird. Die Bindung erfolgt an einer separaten Effektorbindungsstelle außerhalb des aktiven Zentrums (AZ), was eine Konformationsänderung im AZ bewirkt und somit einen hemmenden (Effektor ist ein Inhibitor) oder aktivierenden (Effektor ist Aktivator) Einfluß ausübt. Die allosterische Hemmung unterscheidet sich dabei von der kompetitiven Hemmung, bei der der Inhibitor im AZ selbst bindet, durch ihre Kinetik. Bei der Feedback-Hemmung treten Endprodukte einer Reaktionskette als Inhibitoren früherer Reaktionsschritte auf, um den Reaktionsweg abzuschalten. Beispiel: Regelung der ACTase bei der Pyrimidinbiosynthese, Hämoglobin etc.

Umsatzdiagramme (Substratproduktion über Zeit):

a) heterotrop: Effektor ≠ Substrat b) homotrop: Effektor = Substrat

1: Substrat = Aktivator / 2: Substrat = Inhibitor

Modelle zur Erklärung der Kooperativität bei oligomeren Proteinen:

a.) MONOD, WYMAN, CHANGEUX: "Symmetriemodell" "Alles-oder-Nichts"-Umwandlung, kann aber nicht negative Kooperativität erklären!

Voraussetzungen: - Es gibt für jede Untereinheit zwei mögliche Konformationszustände (T bzw. R) - Die Untereinheiten können immer nur in einer Form vorliegen, d. h. nur RR oder TT-Dimere, keine RT-Dimere! (T = "inaktiv" R = "aktiv")

b.) KOSHLAND, NÉMETHY, FILMER: "Sequenzmodell" Voraussetzungen: - Es gibt für jede Untereinheit zwei mögliche Konformationszustände (T bzw. R)

- Diese Konformationsänderung kann die Substratbindungsaffinität der anderen Untereinheiten erhöhen oder erniedrigen

Page 22: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Enzyme 18

bindet S leichter → positive Kooperativität

bindet S schwerer → negative Kooperativität

3.) Kovalente Modifikation Die Aktivität wird durch eine Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines speziellen Serinrestes festgelegt. Beispiel: Phosphorylase-Kinase

4.) Assoziation - Dissoziation Es findet eine Regulation durch andere Proteine statt. Manche Enzyme werden aktiv, wenn der Ca2+-Spiegel in der Zelle steigt. Das entsprechende Regulatorprotein ist das Calmodulin; es bindet im Calcium-beladenen Zustand an die Proteine und aktiviert sie dadurch.

5.) Regulation in Form von Abbau (Proteolyse) durch spezielle Proteasen

6.) Regulation durch "de novo"-Synthese

2.1.4. Hemmkinetik

a.) kompetitive Hemmung Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert ein Inhibitor mit dem Substrat um die Bindung an das aktive Zentrum. Dies verläuft nach dem Massenwirkungsgesetz, wodurch die Hemmung durch eine hohe Substratkonzentration ausgeglichen werden kann.

b.) unkompetitive Hemmung Hier bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex, nicht aber an das freie Enzym. Der ternäre Komplex ESI ist nicht produktiv.

mit unkompetitivem Inhibitor

I I

ESI

I I

Page 23: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Enzyme 19

c.) nicht-kompetitive Hemmung Die Bindung des Inhibitors erfolgt allosterisch, d. h. an einem anderen Zentrum (nicht dem aktiven Zentrum) des Enzyms. Der Inhibitor verändert das aktive Zentrum, daher ergibt sich eine kleinere oder keine Aktivität. Der ternäre Komplex ESI ist nicht produktiv.

d.) partiell nicht-kompetitive Hemmung Wie c.), aber auch aus ESI Produktbildung möglich. Die Substrat- und allosterische Bindungsstelle überlappen teilweise.

2.1.5. Das Michaelis-Menten Modell

Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentration: Herleitung der Michaelis-Menten-Gleichung:

E + S ES E + P k = Geschwindigkeitskonstante

Für die Anfangsgeschwindigkeit spielt k4 keine Rolle und wird vernachlässigt. Weitere Annahme:

[S] >> [E] Stotal ≈ Sfrei

Dann gilt:

ES-Bildungsrate = k1 [E] [S] ES-Zerfallsrate = k2 [ES] + k3 [ES]

Im steady state (Fließgleichgewicht):

-I +I -I +I

k1 k3

k2 k4

Definition der Michaelis-Konstanten: KM

-I +I -I +I

-I

Page 24: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Enzyme 20

Bestimmung der Konstanten KM und vmax

1.) Lineweaver/Burk: 1/v über 1/[S] Kehrwert der Michaelis-Menten-Gleichung:

→ lineare Darstellung möglich

2.) Hanes: [S] / v0 über [S] 3.) Eadie/Hofstee: v0 über v0 / [S] 4.) Cornish-Bowden

Kinetik bei allosterischen Enzymen Allosterische Enzyme halten sich nicht an das Michaelis-Menten-Modell und zeigen oft eine sigmoide (S-förmige) Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.

Page 25: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Coenzyme und prosthetische Gruppen 21

Zwei- (oder Mehr-)Substrat-Reaktionen

1.) Single Displacement a.) random order

b.) compulsory order

2.) Double Displacement Ping-Pong-Mechanismus (siehe Fettsäure-Synthese)

2.2. Coenzyme und prosthetische Gruppen

Coenzyme sind Nicht-Eiweißverbindungen. Fast alle hier aufgeführten Substanzen enthalten ADP als Baustein! Die klassische Definition des Katalysators trifft auf Coenzyme nicht zu, da sie aktiv verändert werden und erst in einem zweiten (ebenfalls enzymatischen) Schritt wieder ihre ursprüngliche Form erhalten. Die prosthetische Gruppe ist eine Nicht-Eiweißverbindung, die fest (kovalent oder ionisch) an das Enzym gebunden ist. Sie kann eventuell nur ein einfaches Ion sein, was jedoch benötigt wird, um die volle Kapazität des Enzyms herzustellen.

2.2.1. Wasserstoffübertragende Coenzyme

1.) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP)

Oxidierte Formen (NAD+ bzw. NADP+):

Wasserstoffaufnahme → reduzierte Formen (NADH bzw. NADPH):

+ 2 e

Page 26: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Coenzyme und prosthetische Gruppen 22

2.) Flavin-Adenin-Dinucleotid (FAD)

FAD kann auch durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden.

3.) Flavinmononucleotid (FMN) - Wasserstoffaufnahme wie bei FAD (FMN → FMNH2) - prosthetische Gruppe bei der Elektronentransportkette Auch FMN kann (wie FAD) durch Übertragung einzelner Elektronen über eine radikalische Zwischenstufe reduziert werden.

4.) Ubichinon (Coenzym Q) - 2 Ein-Elektronen-Übergänge mit radikalischer Zwischenstufe - Redoxsystem in der Atmungskette - n = 6 - 10

5.) Plastochinon - Redoxsystem in der Atmungskette - Wasserstoffaufnahme wie bei Ubichinon - n = 9

+ 2 e+ 2 H

FAD

FADH2

O

H3C–O

H3C–O

H3C–O

H3C–O

Page 27: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Coenzyme und prosthetische Gruppen 23

6.) Liponsäure - Wasserstoff-Übertragung bei der oxidativen

Decarboxylierung in Form von Liponamid (enzymgebunden):

2.2.2. Gruppenübertragende Coenzyme

1.) Adenosintriphosphat (ATP) - Energieträger biochemischer Reaktionen - Liegt normalerweise in Metallkomplexen (Mg2+) vor - Freisetzung von Energie durch Hydrolyse der Anhydrid-Bindungen

Vergleich der Standardreaktionsenthalpien der Hydrolyse:

kJ/mol kcal/mol Phosphoenolpyruvat (PEP) -61,9 -14,8 Carbamoylphosphat -51,5 -12,3 1,3-Bisphosphoglycerat -49,4 -11,8 Acetylphosphat -43,1 -10,3 Creatinphosphat -43,1 -10,3 Pyrophosphat -33,5 -8,0 ATP → ADP, Pi -30,5 -7,3 Glucose-l-P -20,9 -5,0 Glucose-6-P -13,8 -3,3 Glycerin-3-P -9,2 -2,2

Durch seine Mittelstellung ist ATP als Phosphatgruppenüberträger geeignet. PEP kann wiederum eine Phosphorylgruppe unter Bildung von ATP auf ADP übertragen.

H H

Dihydrolipoylrest

Page 28: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Coenzyme und prosthetische Gruppen 24

2.) Pyridoxalphosphat (PLP) - Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6) - Die Aldehydgruppe dieses Coenzyms bildet eine Schiff'sche Base

mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des Enzyms. - Bei Phosphorylase fungiert PLP wahrscheinlich als Säure-Base-

Katalysator (Protonenakzeptor und -donator). Hauptfunktion ist die Aktivierung der verschiedenen Bindungen am Cα von Aminosäuren (z. B. bei Transaminierung).

2.2.3. Coenzyme für C1-Transfer

1.) Tetrahydrofolat (THF) (siehe "Biosynthese von Makromolekülen")

2.) S-Adenosyl-Methionin (siehe "Biosynthese von Makromolekülen")

3.) Biotin - Beteiligung am Carboxyltransfer - Isolierung als Vitamin H aus Leberextrakten - Inaktivierung durch Bindung an Avidin (Protein des Eiklars) - peptidartige Bindung an Lysinrest → prosthetische Gruppe

Page 29: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Hämoglobin / Myoglobin 25

N

Phosphopantethein

2.2.4. Coenzyme für C2-Transfer

1.) Coenzym A - Übertragung von Resten der Carbonsäuren - bei Acetyl-CoA: R = CH3

2.) Thiaminpyrophosphat (TPP) - Decarboxylierung von Pyruvat - Enthält Vitamin B1 (Thiamin)

2.2.5. Coenzym der Isomerasen und Lyasen

Cobalamin - Radikalische Umlagerungen von Funktionellen Gruppen (-COO , -NH3 Methylgruppenübertragung

2.3. Hämoglobin / Myoglobin

Kooperativität Die Veränderung (Erhöhung/Erniedrigung) der Bindungsaffinitäten der Untereinheiten eines oligomeren Proteins zu kleinen Molekülen (wie hier zum Sauerstoffmolekül) durch die Bindung dieser Moleküle an benachbarte Untereinheiten bezeichnet man als (positive/negative) Kooperativität.

Page 30: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Hämoglobin / Myoglobin 26

Hämoglobin (Hb) Das Hämoglobin kommt in den Erythrocyten vor und übernimmt den Sauerstofftransport im Blut. Es besteht aus dem Protein Globin und der prosthetischen Gruppe Häm. Das Häm ist der Eisenkomplex eines Porphyrins (des Protoporphyrins IX). Das Fe(II) im Molekül wird durch die hydrophobe Umgebung gegen Oxidation geschützt.

Aufnahme von Sauerstoff durch das Häm Im Häm kann das Eisen unter Ausbildung einer sechsten (koordinativen) Bindung Sauerstoff reversibel binden. Das Eisen verändert dabei nicht seine Ladungszahl, sondern Salzbrücken zwischen den Untereinheiten α1 und β1 brechen auf. Dadurch können die nachfolgenden Sauerstoff-Moleküle leichter gebunden werden (positive Kooperativität). Es entsteht Oxyhämoglobin. Jedes Hämoglobin kann daher 4 Sauerstoff-Moleküle aufnehmen. Im Desoxyhämoglobin liegt das Eisenatom etwa 0,04 nm außerhalb der Hämebene. Bei der Oxygenierung bewegt sich das Eisenatom in die Häm-Ebene hinein (d. h. das proximale His verschiebt sich), um mit dem Sauerstoff eine feste Bindung einzugehen.

Durch diese Verschiebung wird eine H-Brücke zwischen Asp-94 und His-146 aufgebrochen, und Protonen werden frei (s. weiter unten Bohr-Effekt).

Wirkung von Bisphosphoglycerat 2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) hat eine wichtige Rolle bei der Regulation der Sauerstoffaufnahme. Das Desoxyhämoglobin kann ein Molekül BPG binden; die negativ geladenen Phosphatgruppen treten mit positiv geladenen Gruppen von Histidin und Lysin in Wechselwirkung, wodurch die Raumstruktur so stark verändert wird, daß die Sauerstoffaffinität stark sinkt. Bei der Sauerstoffbeladung wird das BPG wieder abgegeben. Befindet sich im Blut nur eine geringe Menge an BPG, so enthält ein Teil des Desoxyhämoglobins kein BPG und bindet den Sauerstoff entsprechend fester. Daher kann der Sauerstoff dann nicht in den zu versorgenden Geweben abgegeben werden und das Hämoglobin erfüllt seine Transportfunktion nicht.

Abhängigkeit der Sättiqung vom O2-Partialdruck Bei der Beladung des Hämoglobins wird der hohe Sauerstoffpartialdruck der Lunge ausgenutzt, um Sauerstoff zu binden und in die Bereiche mit geringerem Sauerstoffpartialdruck zu transportieren.

Bohr-Effekt Der Bohr-Effekt ist die nach dem dänischen Physiologen benannte Sauerstoffaustreibung aus dem Oxyhämoglobin durch Kohlendioxid, d. h. das Vorliegen einer höheren Konzentration an CO2 und H+-Ionen in einem stoffwechselaktivem Gewebe erleichtert die Freisetzung von O2.

H H

proximales His proximales HisHN

N

distales His

Häm

- Ebene

N

Häm b

CH3

Page 31: Vorlesungsskript Biochemie I

Enzyme / Coenzyme Hämoglobin / Myoglobin 27

Die Aufnahme von O2 in der Lunge, durch die Protonen freigesetzt werden, hat dabei die Austreibung von CO2 zur Folge. Auf molekularer Ebene kommt es beim Übergang von Oxy- zu Desoxyhämoglobin zu einer Verschiebung des Aspartat 94 in die Nähe des Histidins 146. Durch die Erhöhung der lokalen negativen Ladung wird der pK-Wert von Histidin 146 erhöht, d. h. die Wasserstoffaffinität nimmt zu: Es kommt leichter zur Aufnahme von H+.

Fötales Hämoglobin Der Fötus besitzt einen eigenen Hämoglobin-Typ, das Hämoglobin F (α2γ2) welches sich von dem der Erwachsenen unterscheidet. Hämoglobin F bindet BPG schwächer und besitzt daher eine höhere Sauerstoffaffinität als Hämo-globin A. Daher kann O2 vom mütterlichen Hämoglobin A auf das Hämoglobin F des Fötus übertragen werden.

Myoglobin (Mb) Das Myoglobin bindet ebenfalls den Sauerstoff durch das Häm. Es transportiert und speichert ihn jedoch in der Muskelzelle und zeigt als Monomer keine Kooperativität.

Page 32: Vorlesungsskript Biochemie I

Chemische Modifizierung von Proteinen Hämoglobin / Myoglobin 28

3. Chemische Modifizierung von Proteinen

Zweck: • Bestimmung katalytisch relevanter AS • Veränderung der Proteineigenschaften (durch Veränderung der Oberfläche)

a) Ladungsveränderung b) hydrophobe Oberfläche

• Quervernetzung mit bifunktionellen Gruppen a) Abstandsmessungen im AZ (zwischen katalytisch relevanten AS) b) Verknüpfung von Untereinheiten

α.) zur Stabilisierung des Proteins β.) Bestimmung der Geometrie des Aufbaus aus der Verteilung der

Quervernetzungsprodukte c) Lokalisierung relativ zu anderen Proteinen

(in der Membran, in Multienzymkomplexen, im Aufbau des Ribosoms)

Welche AS-Seitenreste können reagieren?

In allen Fällen werden elektrophile Reagenzien benötigt, (bei -COOH nur, wenn , sonst

eventuell Nucleophile)

Probleme: - Kann überhaupt eine Seitenkette selektiv modifiziert werden?

(z. B. bei LDH eine von 5 SH-Gruppen oder oft eine von mehr als 20 Lys-NH2-Gruppen) - Sterische Zugänglichkeit:

Besondere Reaktivität durch spezifischen pK-Wert durch Nachbargruppen → kinetische Kontrolle (z. B. Lys-NH2 normal pK = 11; im AZ Teile mit pK = 8)

Wahl des Reagenz: - Spezifität - reversible Reaktion? - milde Reaktionsbedingungen

Page 33: Vorlesungsskript Biochemie I

Chemische Modifizierung von Proteinen Unspezifische Reagenzien 29

Bestimmung des Einbaus: - Farbige Reagenzien - Radioaktive Markierung (3H, 14C, 35S ...)

1.) Bestimmung katalytisch relevanter AS: Korrelation der Aktivität mit dem Einbau:

Probleme: Trotz 1:1-Relation kann es zu allosterischen Effekten kommen. Bsp.: Bei der Modifizierung der "essentiellen SH-Gruppe" bei der LDH wird eine Seitenkette verschoben, an die ein "essentielles His" geknüpft ist → Verlust der Aktivität!

2.) Identifizierung der Art der modifizierten AS: z. B. durch die pH-Abhängigkeit (der pK-Wert von 6,5 deutet eventuell auf His)

3.1. Unspezifische Reagenzien

- Jodessigsäure:

- Jodacetamid:

- Acet(yl)imidazol:

(bei His, Cys Produkte instabil)

I CH2 CO

NH2

analog wie oben

I CH2 CO

ONH2 CH2 C

O

ONH

SH S CH2 C O

O

NH

N

N

N

CH2 CO

O

N

N

C CH3

O

NH2 NH C CH3

O

OH O C CH3

O

Page 34: Vorlesungsskript Biochemie I

Chemische Modifizierung von Proteinen Gruppenspezifische Reagenzien 30

3.2. Gruppenspezifische Reagenzien

Lys-NH2: Imidoester: (entsteht aus: R-CN + MeOH/HCl)

Tyr-OH: Tetranitromethan:

Alternativ: Umsetzung mit Diazoniumsalzen → Azofarbstoffe

Cys-SH: Male(in)imide, z. B. N-Ethylmaleimid:

Umsetzung auch mit Lys bei pH = 6,5 - 7, Geschwindigkeit aber 1000mal langsamer.

Serin-OH: Diisopropylfluorophosphat:

Parathion (E 605) wirkt analog:

Tryptophan: Sulfenylchlorid (Koshland-Reagenz): Reaktion auch mit Cys-SH, das "reversibel" geschützt werden muß.

Arginin: Butandion (Diacetyl):

S OH

NO2

NH

Ser—O—P—O

O

O

Page 35: Vorlesungsskript Biochemie I

Chemische Modifizierung von Proteinen Reagenzien zur Änderung der Ladung 31

Aspartat, Glutamat: - Dicyclohexylcarbodimid (DCCD)

3.3. Reagenzien zur Änderung der Ladung

3.4. Hydrophobisierung von Enzymen

3.5. Reversible Reagenzien

Histidin:

Urethan (zerfällt hydrolytisch)

Page 36: Vorlesungsskript Biochemie I

Chemische Modifizierung von Proteinen Active-Site Labeling 32

Cystein:

a.) HgCl2 Cl-Hg-S-Cys HS-Cys

b.) p-Chlormercuribenzoat reagiert analog

c.) Ellman's Reagenz:

analog:

3.6. Active-Site Labeling

3.7. Suizid - Substrate

Werden am aktiven Zentrum reaktiv

3.8. Photoaffinity - Label

analog: Diazoketone —N2 → Carben

Diazirino—NAD+:

→ Carben

R-SH Cys-SH

gute, stabile Austrittsgruppe großerExtinktionskoeffizient(~11000 cm-1 M-1)

Page 37: Vorlesungsskript Biochemie I

Chemische Modifizierung von Proteinen Bifunktionelle Reagenzien 33

3.9. Bifunktionelle Reagenzien

Kriterien für die Anwendung: a.) Abstandsmessungen (im AZ) starr

- spezifisch für bestimmte Aminosäuren - für Reste eventuell unterschiedlich spezifisch

b.) Lokalisierung von ''Nachbarn"; kovalente Verbindungen von Untereinheiten - flexibel - unspezifisch

Reagenz von ZAHN:

o,p- aktiviert für nucleophile Substitution des F

HUGO FASOLD:

spaltbare Reagenzien

mit Lys: Harnstoffderivate mit —OH: Urethane

speziell zur Vernetzung von UE via Lys

Bei Verwendung von statt Spaltung mit IO4- möglich

Probleme: - viele Produkte

- Reaktion nur an Rest A oder nur an Rest B - Quervernetzung zwischen A und B - weitere Reste können entsprechend reagieren - bei asymmetrische Reagenzien kann u. U. die eine oder die andere Seite mit Rest A

reagieren Beispiel:

Stufenweise Reaktion:

Belichtung nach Entfernung des nicht umgesetzten Überschusses durch z. B. Dialyse oder Gelchromatographie. Aktivierung einfach durch pH > 8,5 nach Reaktion mit -SH und Dialyse

Page 38: Vorlesungsskript Biochemie I

Chemische Modifizierung von Proteinen Semireversible Reagenzien 34

3.10. Semireversible Reagenzien

Protein—SH + R’—Se—C—R’’ → Protein—S—C—R’’ (später wieder spaltbar) + R’—SeH (→ R’—Se—Se—R’)

3.11. Trägergebundene Enzyme

Vorteile:

• Erhöhte Stabilität (z. B. Proteasen, Schutz vor Selbstverdauung) • Wiedergewinnung

Probleme:

• Zugänglichkeit des AZ • Kinetik: Diffusionsprobleme:

Spezifische Aktivität kleiner als im löslichen Enzym, auch wenn Zugang zum AZ frei, denn nach Teilverdau des Trägers steigt die spezifische Aktivität bis zum Normalwert

• Reaktion an der richtigen UE

Arten der Verknüpfung:

• kovalent • Adsorption • Einschlußverbindungen • Aggregation

a.) Kovalente Bindung an welche AS?

− Keine seltenen, da diese oft katalytisch relevant − Schutz des AZ durch Komplexe (LDH: NAD+ / Oxalat) − z. B. direkt an BrCN-aktivierte Agarose: − (dargestellte Reaktion verläuft über Spacer + R-COOH, es geht auch mit Lys-NH2)

O O

Page 39: Vorlesungsskript Biochemie I

Chemische Modifizierung von Proteinen Trägergebundene Enzyme 35

− Bifunktionelle Reagenzien:

Müssen erst mit Enzym reagieren und nur das "aktive", modifizierte an Träger

binden!

b.) Adsorption an:

poröses Glas / Ti02 / Collagen

c.) Einschlußverbindungen:

z. B. Copolymerisation (Acrylamid mit Bisacrylamid)

d.) Chemische Aggregation:

z. B. durch bifunktionelle Reagenzien

H

H H

Page 40: Vorlesungsskript Biochemie I

Lipide Allgemeine Übersicht 36

4. Lipide

4.1. Allgemeine Übersicht

4.2. Fette

Fette bestehen in der Regel aus Glycerin und 3 Fettsäuren, z. B. die nebenstehenden. Für die Bezeichnung der Fettsäuren verwendet man eine Kurzschreibweise, bei der die Zahl der C-Atome und die Zahl der Doppelbindungen angegeben werden.

4.3. Glykolipide

Sie enthalten kein Phosphat, sondern stattdessen einen Mono- oder Oligosaccharidrest, der meist mit Sphingosin (oder Glycerin) verknüpft ist und den hydrophilen Anteil bildet.

Glyceringlykolipide: 1.2-Diacylglycerin und ein Mono- oder Oligosaccharid in 3-Stellung des Glycerins glykosidisch gebunden.

Sphingosinglykolipide: Als Sphingolipide enthalten sie als zentralen Baustein statt des dreiwertigen Alkohols Glycerin einen Amino-dialkohol, das Sphingosin, welches ein C18-Molekül mit einer trans-Doppelbindung ist. Durch Amidbildung mit einer Fettsäure kommt es zu Ceramiden, deren Glykoside die neutralen Glykosphingolipide sind.

Glycerin-phospholipide

Sphingosin-phospholipide

Glycerin-glykolipide

Sphingosin-glykolipide

Glykolipide

ein Ceramid

Sphingosin

Page 41: Vorlesungsskript Biochemie I

Lipide Phospholipide 37

Einfachste Vertreter: Cerebroside. Bei den Cerebrosiden des Gehirns meist Galaktose, bei Leber und Milz meist Glucose.

4.4. Phospholipide

Glycerinphospholipide Phosphodiester; die Phosphorsäure ist einerseits mit einem Sphingosin- oder Glycerinderivat (meist Diacylglycerin), andererseits mit Cholin Ethanolamin, Serin, Inosit oder Glycerin verestert.

Sphingosinphospholipide Sphingomyeline: In den Myelinscheiden vorkommende Sphingosinphospholipide, bei denen die endständige Hydroxygruppe des Ceramids (s. o.) mit Phosphorylcholin verestert ist.

4.5. Isoprenoidlipide

Die Steroide und Terpene gehören zu dieser Stoffklasse und werden wegen ihrem ähnlichen Lösungsverhalten zu den Lipiden gerechnet.

Steroide Cholesterin: Das Cholesterin leitet sich vom Cyclopentano-perhydrophenanthren ab, welches

auch als Steran bezeichnet wird. Durch die OH-Komponente liegt Cholesterin als Alkohol vor (engl.: Cholesterol). Cholesterin verleiht der Membran Starrheit und schließt auftretende Löcher.

Sphingosin

ein Sphingomyelin

O

o

ein Cerebrosid o o

Page 42: Vorlesungsskript Biochemie I

Lipide Biomembranen 38

Terpene Zu dieser Stoffklasse gehören die Carotine und die Xanthophylle, die hier aber nicht weiter besprochen werden.

4.6. Biomembranen

Membranfunktion • Geben den Zellen Individualität durch Abtrennung der Umwelt • Bei Eukaryonten: Strukturierung von Zellorganellen durch interne Membranen

Eukaryonten: Einzellige oder mehrzellige Organismen, die einen vom Cytoplasma durch eine Membran abgegrenzten Zellkern besitzen.

Prokaryonten: Kein Zellkern. • Kompartimentierung bestimmter Prozesse • Extrem spezifische Permeabilitätsbarrieren • Bewirken geordnete räumliche Anordnung bestimmter Enzyme zueinander (Reaktionsketten

möglich) • Enthalten Pumpen (molekulare), Rezeptoren (Hormone) zur Steuerung interner Prozesse

Bau der Membranen • Keine kovalenten oder festen Strukturen, sondern eine „Flüssigkeitsschicht“, die durch

Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel entsteht. • Bestehen aus: Lipiden (v. a. Phospholipide, Glykolipide und Cholesterin)

Proteinen − Bau der Phospholipide: polarer, hydrophiler Kopf

unpolarer, hydrophober Schwanz − Micellen: (z. B. freie Fettsäuren und viel Wasser) − Doppelschichten: a.) periphere Proteine

b.) membranintegrale Proteine (z. B. Hormonrezeptoren) c.) membranintegrale Proteine (membrandurchspannend, z. B. Ionen-Pumpen)

Die Flächen können Vesikel (kugelförmige Doppelschichten) bilden. Die Doppelschicht liegt nicht starr vor, sondern befindet sich ständig im Fluß, wobei die Proteine ihre Positionen verändern können. Laterale Diffusion einfach, hochmobile Schicht. Transversale Diffusion (flip-flop) energetisch ungünstig.

Page 43: Vorlesungsskript Biochemie I

Monosaccharide Nomenklatur 39

5. Monosaccharide

5.1. Nomenklatur

Carbonylfunktion: Ketosen / Aldosen Anzahl der C-Atome: 3: Triosen 4: Tetrosen 5: Pentosen 6: Hexosen 7: Heptosen

Aldose mit n C-Atomen: 2n-2 stereoisomere Formen

Pentosen: n = 5 → 23 = 8 Isomere (4 L-Formen und 4 D-Formen) Hexosen: n = 6 → 24 = 16 Isomere

Fischer-Projektion: - D-Zucker haben an ihrem Carbonyl-fernsten Asymmetriezentrum die gleiche absolute Konfiguration wie D-Glycerinaldehyd - L-Zucker sind Spiegelbilder der D-Zucker

Epimere: Zucker, die sich in der Konfiguration nur an einem C-Atom unterscheiden. (z. B. Glucose / Mannose)

Acetale und Ketale Acetale entstehen bei der Reaktion von Aldehydgruppen mit Alkoholen:

Aldehyd Halb-Acetal Voll-Acetal

(z. B. offene Aldose) (z. B. ringförmige Aldose) (z. B. Glucose im Stärkemolekül)

Page 44: Vorlesungsskript Biochemie I

Monosaccharide Zyklische Zucker 40

Ketale: Entstehen bei der Reaktion von Ketogruppen mit Alkoholen.

Ketogruppe Halb-Ketal Voll-Ketal (z. B. offene Ketose) (z. B. ringförmige Ketose) (z. B. Fructose in der Saccharose)

Saccharose:

5.2. Zyklische Zucker

5-Ring-Zucker

6-Ring-Zucker

β-D-Ribofuranose

O

Page 45: Vorlesungsskript Biochemie I

Monosaccharide Nucleotide 41

5.3. Nucleotide

Nucleoside: Zucker und eine Base Nucleotide: Zucker, Base und ein oder mehr Phosphatreste

Purinbasen:

Pyrimidinbasen:

H

H H

Page 46: Vorlesungsskript Biochemie I

Stoffwechsel Nucleotide 42

6. Stoffwechsel

Die grundlegenden Stoffwechselwege sind in den meisten Organismen identisch!

Aufklärung durch • Fütterungsversuche mit durch Isotope markierten Substanzen • Verwendung von Stoffwechselinhibitoren (Hemmstoffe) • Verwendung von auxotrophen Mutanten (benötigen bestimmten Nährstoff für ihr Wachstum)

Mutanten durch • mutagene Substanzen • Strahlung, z. B. Röntgenstrahlung • molekularbiologische Methoden

Ein Beispiel für die Wirkung von Mutanten ist die Arginin-Biosynthese im Harnstoff-Zyklus mit folgenden Enzymdefekten:

Mutante 1 wächst auf: Ornithin oder Citrullin oder Arginin Mutante 2 wächst auf: Citrullin oder Arginin Mutante 3 wächst auf: Arginin Cross-feeding: Mutante 2 reichert Ornithin an und wächst mit Filtrat von Mutante 3 (da in diesem Citrullin angereichert ist), aber nicht umgekehrt Metabolismus: Stoffwechsel; Bedeutung i. a. Anabolismus und Katabolismus Anabolismus: Aufbau von Körpersubstanzen Katabolismus: Abbau von Körpersubstanzen und Nahrungsbestandteilen Speicherung der Energie als: ATP / hochreduzierte Verbindungen (z. B. Glucose)

reduzierte Elektronenüberträger (NADH, FADH2, NADPH) Verwendung der Energie für: Biosynthesen (Anabolismus) / Muskelarbeit (ATP) /

Transportprozesse

Page 47: Vorlesungsskript Biochemie I

Stoffwechsel Nucleotide 43

Unterscheidung der Lebewesen: 1.) Nach der Kohlenstoffquelle: autotroph: "sich selbst ernährend";

C-Quelle ist CO2 heterotroph: C-Quelle sind andere Zellen bzw. deren

Bestandteile 2.) Nach der Energiequelle: phototroph: Licht

chemotroph: Redoxprozesse 3.) Nach den Elektronendonatoren: lithotroph: anorganische Verbindungen:

(H2S, NH3, S, Co, Fe2+, H2O) organotroph: organische Verbindungen

Organismen C-Quelle E-Quelle e--Donatoren Bsp. Photolithotroph CO2 Licht anorg. Verb. Bakterien Photoorganotroph org. Verb./CO2 Licht org. Verb. Purpurbakterien Chemolithotroph CO2 Redoxprozesse anorg. Verb. Archaebakterien Chemoorganotroph org. Verb. Redoxprozesse org. Verb. alle höheren Tiere

Page 48: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykogen 44

7. Kohlenstoff-Stoffwechsel

7.1. Glykogen

Glykogen ist eine leicht mobilisierbare Speicherform der Glucose. Es ist ein großes, verzweigtes Polymer aus Glucoseeinheiten in α-1,4-glykosidischer Bindung.

Die Synthese und der Abbau von Glykogen sind aus mehreren Gründen von Bedeutung: • Regulation des Blutzuckerspiegels • Glucosereservoir für anstrengende Muskelaktivität • Synthese und Abbau laufen auf unterschiedlichen Reaktionswegen, dies verdeutlicht ein

wichtiges Prinzip der Biochemie • generelle Bedeutung der Regulationsmechanismen auf hormoneller Ebene • Reversible Phosphorylierung der Enzyme

7.1.1. Abbau des Glykogens durch Glykogen-Phosphorylase

Phosphorolyse bedeutet die Spaltung einer Bindung durch Einbau von Orthophosphat (im Gegensatz zur Hydrolyse, einer Spaltung durch Wasser).

Für den Ablauf der Spaltung ist als Coenzym das Pvridoxal-5-phosphat (PLP), ein Derivat des Pyridoxins (Vitamin B6) erforderlich. Die Aldehydgruppe dieses Coenzyms bildet eine Schiff'sche Base mit einer spezifischen Lysin-Seitenkette des Enzyms. PLP spaltet mit seiner Phosphatgruppe zunächst die glykosidische Bindung und wird durch anorganisches Phosphat wieder freigesetzt (doppelte Inversion am C1).

Abbau des Glykogens durch Phosphorylase: Phosphorylase kann die Kette nur solange abbauen, bis sie einen endständigen Glucoserest erreicht, der nur 4 Einheiten bis zu einer Verzweigung entfernt ist.

Übertragung durch eine Transferase: Die Transferase überträgt einen Block von 3 Glucoseeinheiten von einem äußeren Zweig auf einen anderen.

Page 49: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykogen 45

Abbau durch ein debranching enzyme: (= Aufhebung der Verzweigung) Das dritte Abbauenzym, die α-1,6-Glucosidase (unter dem Namen debranching enzyme bekannt), hydrolysiert die Bindung des einzelstehenden Glucosemoleküls, es entsteht ein Molekül Glucose.

Somit liegt das Glykogen wieder in einer linearen Form vor und kann weiter von der Phosphorylase abgebaut werden.

7.1.2. Synthese von Glykogen

Die Synthese hat als erste Vorstufe die UDP-Glucose. Glucose-1-P + UTP → UDP-Glucose + PPi

Glykogen(n) + UDP-Glucose → Glykogen(n+1) + UDP

UDP-Glucose: Die Verzweigungen (α-1,6-Bindungen) werden durch ein branching enzyme gebildet.

Page 50: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 46

7.2. Glykolyse

7.2.1. Ablauf der Glykolyse

Page 51: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 47

Die Glykolyse ist eine Folge von Reaktionen in denen im Cytosol (Cytoplasma) Glucose in Pyruvat umgewandelt wird und gleichzeitig ATP entsteht. In aeroben Organismen geht sie dem Citratzyklus und der Atmungskette voraus. Unter anaeroben Bedingungen tritt das Pyruvat in die Mitochondrien über und wird hier vollständig zu CO2 und H2O oxidiert. Bei ungenügendem Sauerstoffangebot, etwa in einem Muskel, wird das Pyruvat in Lactat überführt. Bei einigen anaeroben wird das Pyruvat in Ethanol umgewandelt. Die Bildung von Lactat oder Ethanol aus Glucose sind Beispiele für Gärungen.

Netto-Stoffbilanz der Glykolyse: Glucose + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ → 2 Pyruvat + 2 ATP + 2 NADH/H+ + 2 H2O

7.2.2. Bildung von Fructose-1,6-bisphosphat aus Glucose

Die Umwandlung besteht aus drei Reaktionen: einer Phosphorylierung, einer Isomerisierung und einer zweiten Phosphorylierung. Der Sinn dieser Reaktionen ist die Überführung der Glucose in eine reaktionsfähige Form, welche sich in zwei C3-Einheiten spalten läßt. Gesamtreaktion:

Phosphorylierung der Glucose durch Hexokinase:

Isomerisierung von Glucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat durch Glucosephosphat-Isomerase: (Umwandlung einer Aldose in eine Ketose)

Phosphorylierung zu Fructose-l,6-bisphosphat durch Phosphofructokinase:

Glucose

Page 52: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 48

7.2.3. Bildung von Glycerinaldehyd-3-phosphat

Spaltung von Fructose-1,6-bisphosphat in Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) durch Aldolase:

Mechanismus der Aldolase:

Aldolase führt die umgekehrte Reaktion einer Aldolkondensation (z. B. Aldehyd+Keton) durch. Die Reaktion läuft nur mit GAP weiter, daß DHAP wird durch Triosephosphatisomerase in GAP überführt.

1. energiegewinnender Schritt: Phosphorylierung und Oxidation des GAP (keine ATP-Bildung!) Umwandlung von Glycerinaldehyd-3-phosphat in 1,3-Bisphosphoglycerat durch Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase:

Page 53: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 49

Mechanismus der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase:

2. enerqieqewinnender Schritt:

Dies ist die erste ATP-bildende Reaktion, katalysiert durch Phosphoglycerat-Kinase:

Bildung von Pyruvat und eines zweiten Moleküls ATP:

7.2.4. Regulation der Glykolyse

Glykolyse und Gluconeogenese sind so koordiniert, daß beide Vorgänge nicht gemeinsam anlaufen. Bei dieser Kontrolle spielt ein Signalmolekül, das Fructose-2,6-bisphosphat eine wichtige Rolle.

energiereiche Anhydrid-Bindung

- : F-2,6-BP - : AMP + : Citrat

Thioester

Thiohalbacetal

gemischtes Anhydrid

+ : AMP + : F-2,6-BP - : ATP - : NADH - : Citrat

6-Phosphofructo-1-Kinase Fructose-1,6-bisphosphatase

Page 54: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Glykolyse 50

1. Regulation der Glykolyse / Gluconeogenese durch F-2,6-BP: F-2,6-BP aktiviert die 6-Phosphofructo-1-Kinase der Leber, indem sie deren Affinität zu Fructose-6-Phosphat steigert und die Hemmwirkung von ATP herabsetzt. Dies hat die Synthese von F-1.6-BP durch die Phosphorylierung von Fructose-6-phosphat zur Folge. Gleichzeitig wird Fructose-1,6-bisphosphatase durch F-2,6-BP gehemmt.

2. Regulation der Konzentration von F-2,6-BP: F-2,6-BP wird durch Phosphorylierung (durch 6-Phosphofructo-2-Kinase) synthetisiert und kann von der Fructose-2,6-bisphosphatase zu Fructose-6-phosphat hydrolysiert werden. Beide Enzyme befinden sich auf einer einzigen Peptidkette, die man auch als Tandem-Enzvm bezeichnet.

3. Regulation des Tandem-Enzyms: Die Aktivitäten von 6-Phosphofructo-2-Kinase und Fructose-2,6-bisphosphatase werden durch die Phosphorylierung eines Serinrestes kontrolliert. Bei Glucosemangel löst ein Konzentrationsanstieg des Hormons Glucagon eine Reaktionskaskade aus, die zur Phosphorylierung dieses bifunktionellen Enzyms führt (> Fructose-6-phosphat → Gluconeogenese). Ist dagegen Glucose im Überschuß vorhanden, verliert das Enzym seine Phosphorylgruppe, wodurch der F-2,6-BP-Spiegel ansteigt (→ Glykolyse). unphosphoryliert: aktiviert Kinase, hemmt Bisphosphatase → Aufbau von F-2,6-BP phosphoryliert: aktiviert Bisphosphatase, hemmt Kinase → Abbau von F-2,6-BP

7.2.5. Weiterverarbeitung des Pyruvats

Aerobier: → Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex • Acetyl-CoA • Citronensäure-Zyklus → → oxidative Phosphorylierung • CO2 + H2O

Page 55: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Oxidative Decarboxylierung 51

höhere Organismen und Bakterien bei O2-Mangel (anaerob): → homolaktische Fermentation → Lactat (Muskel) (Glucose + 2 ADP + 2 Pi → 2 Lactat + 2 ATP + 2 H2O)

Hefe und Mikroorganismen (anaerob) → alkoholische Gärung > Ethanol (Glucose + 2 ADP + 2 P, + 2 FT → 2 Ethanol + 2 ATP + 2 CO2 + 2 H2O) Decarboxylierung durch Pyruvat-Decarboxylase Reduktion durch Alkohol-Dehydrogenase mit NADH

7.3. Oxidative Decarboxylierung

Die Funktion dieses Reaktionsweges ist die Bildung von Acetyl-CoA aus Pyruvat in den Mitochondrien, welches anschließend im Citratzyklus vollständig zu CO2 oxidiert wird. Die Reaktion wird durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex katalysiert. Es handelt sich dabei um einen sehr großen Multienzymkomplex aus drei eng zusammenwirkenden Enzymen. (Vorteil Multienzymkomplex: Höhere Geschwindigkeit, kaum Nebenreaktionen)

Komponente Abk. Ketten Coenzyme Reaktion Pyruvat-Dehydrogenase El 24 TPP oxidative Decarboxylierung von Pyruvat Dihydrolipoyl-Transacetylase E2 24 Liponamid Transfer der Acetylgruppe auf CoA Dihydrolipoyl-Dehydrogenase E3 12 FAD

NAD+ Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids

1. Decarboxylierung des Pyruvats nach Bindung an das TPP Gesamt: Pyruvat + TPP → Hydroxyethyl-TPP + CO2

Durch die Ionisierung des TPP kommt es zur Bildung eines Carbanions, das nucleophil mit Pyruvat reagiert:

H

Page 56: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Oxidative Decarboxylierung 52

2. Oxidation der Hydroxyethylgruppe und Übertragung auf Liponamid Genaue Struktur des Liponamids siehe Kap. Coenzyme!

3. Übertragung der Acetylgruppe auf Coenzym A:

4. Regenerierung der oxidierten Form des Liponamids:

FADH2 FAD

NADH + H+ NAD+

Page 57: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Hormonelle Steuerung 53

7.3.1. Regulation des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes

1. Produkthemmung: Die Produkte der Pyruvatoxidation, Acetyl-CoA und NADH, hemmen den Enzymkomplex. Acetyl-CoA hemmt die Transacetylase-Komponente, NADH die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase.

2. Feedback-Regulation durch Nucleotide (Rückkopplungshemmung): Die Aktivität des Enzymkomplexes wird durch die Energieladung kontrolliert. AMP aktiviert den Komplex, GTP hemmt ihn, d. h. der Komplex wird gehemmt, wenn unmittelbar verfügbare Energie vorhanden ist.

3. Regulation durch reversible Phosphorylierung: Der Komplex wird enzymatisch inaktiv, wenn ein spezifischer Serinrest durch eine Kinase phosphoryliert wird. Dabei hemmt AMP und Pyruvat die Kinase. Die Phosphorylierung kann durch eine Phosphatase rückgängig gemacht werden. Es liegt also ein reversibler Regulationsmechanismus vor.

7.4. Hormonelle Steuerung

Der Glykogenstoffwechsel wird von bestimmten Hormonen stark beeinflußt. Insulin: Ein Polypeptidhormon, welches die Fähigkeit der Leber steigert, Glykogen zu

synthetisieren. Insulin wird in den B-Zellen der Langerhansschen Inseln im Pankreas gebildet und ins Blut abgegeben. Ein hoher Insulinspiegel im Blut signalisiert Sättigung, ein geringer einen Hungerzustand.

Adrenalin: (Epinephrin) Entgegengesetzte Wirkung von Insulin, bewirkt also den Abbau von Glykogen in der Muskulatur. Freisetzung aus dem Nebennierenmark.

Glucagon: Stimulierung des Glykogenabbaus in der Leber. Wird von den α-Zellen des Pankreas abgegeben, wenn der Blutzucker niedrig ist. Durch den Abbau des Glykogens wird der Blutzuckerspiegel wieder angehoben.

EARL SUTHERLAND entdeckte, daß die Wirkung von Adrenalin und Glucagon auf den Stoffwechsel durch cAMP vermittelt wird. Diese und andere Hormone wirken fast augenblicklich, indem sie mit an den Membranen der Zellen des Erfolgsorgans lokalisierten Rezeptoren reagieren und dadurch eine Aktivierung der membrangebundenen Adenylat-Cyclase hervorrufen. Unter der Wirkung der Adenylat-Cyclase kommt es zu einem Anstieg der cAMP-Konzentration in der Zelle (durch Umwandlung von ATP in cAMP), welches als allosterischer Aktivator auf Enzyme wirkt (second messenger).

Durch die erhöhte Konzentration kommt es z. B. zur Aktivierung der Phosphorylase und zur Hem-mung der Glykogen-Synthase im Glykogenstoffwechsel.

O

Page 58: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Hormonelle Steuerung 54

7.4.1. Übersicht zur Wirkung der Hormone

• Die Bindung des Hormons (hier Adrenalin) bewirkt eine Konformationsänderung am Rezeptor. • Der Hormon-Rezeptor-Komplex (nicht aber der unbesetzte Rezeptor) bindet das G-Protein. • Dieses veranlaßt den Austausch von GDP gegen GTP, die Gα-Untereinheit dissoziiert ab und

stimuliert die Adenylat-Cyclase zur Bildung von cAMP, bis das GTP hydrolysiert wird. • Der erhöhte intrazelluläre cAMP-Spiegel aktiviert nun eine Protein-Kinase, die ihrerseits

Zellproteine phosphoryliert und damit von einer inaktiven in eine aktive Form überführt.

• Antagonist zu der Protein-Kinase ist eine Phosphatase, die durch Dephosphorylierung die Proteine wieder inaktiviert.

• Das cAMP kann von einer Phosphodiesterase wieder gespalten werden. Theophyllin (R = H) und Coffein (R = CH3) sind Inhibitoren der Phosphodiesterase, wirken daher wie Adrenalin anregend.

7.4.2. Stimulierung der Adenylat-Cyclase durch ein G-Protein

Der Hormon-Rezeptor-Komplex aktiviert aber nicht direkt die Adenylat-Cyclase, sondern stimuliert ein G-Protein (guanylnucleotidbindendes Protein), welches das Erregungssignal auf die Adenylat-Cyclase überträgt. Das G-Protein besteht aus einer α, einer β- und einer γ-Untereinheit. Es kommt in der GDP- und der GTP-gebundenen Form vor. Die GTP-Form aktiviert die Adenylat-Cyclase, die GDP-Form jedoch nicht. Ohne Hormon liegt das G-Protein fast nur in der GDP-Form vor. Der Hormon-Rezeptor-Komplex bindet an das G-Protein, bewirkt den Austausch von GDP gegen GTP und die Freisetzung von GDP, d. h. ermöglicht die Bindung von GTP (aktive Form). Die α-Unter-einheit mit dem GTP (Gα-GTP) dissoziiert von der βγ-Untereinheit ab. Gα-GTP aktiviert nun die Adenylat-Cyclase. Der Informationsfluß läuft also vom Hormon-Rezeptor-Komplex über ein G-Protein zu der Adenylat-Cyclase. Dabei erzeugt jedes gebundene Hormonmolekül viele GTP-Moleküle, was die Hormonwirkung verstärkt.

Page 59: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Hormonelle Steuerung 55

Die Aktivierung der Adenylat-Cyclase wird durch Hydrolyse der α-Untereinheit des G-Proteins von der GTP-Form in die GDP-Form abgestellt. Das G-Protein ist also eine GTPase.

7.4.3. Aktivierung der Protein-Kinase A und der Phosphorylase

Protein-Kinase A ist ein allosterisches Enzym, welches cAMP an Phosphorylase koppelt. Seine inaktive Form enthält zwei Sorten von Untereinheiten, einer katalytischen (C) und einer regulatorischen Untereinheit (R), die die katalytische hemmt. Bei der Aktivierung durch cAMP wird cAMP an eine spezifische Stelle der R-Untereinheit gebunden, wodurch der inaktive CR-Komplex zu R-cAMP und der freien C-Untereinheit dissoziiert, die nun katalytisch aktiv ist (cAMP hebt also die Hemmung auf) und Phosphorylase-Kinase durch Phosphorylierung aktiviert.

Phosphorylase-Kinase ist ein sehr großes Protein und aktiviert durch Phosphorylierung des Serins 14 die Phosphorylase. Diese Kinase wird zweifach kontrolliert: 1.) Phosphorylierung: Aktivierung durch Protein-Kinase 2.) Regulation durch Ca2+-Ionen:

Eine Untereinheit der Kinase, das Calmodulin (ein calciumbindendes Protein), verändert bei der Bindung mit Ca2+-Ionen seine Struktur. Diese Form der Kinaseaktivierung besitzt im Muskel Bedeutung, wo die Kontraktion durch Ca2+-Freisetzung ausgelöst wird. Glykogenabbau und Muskelkontraktion werden also über den Anstieg der Ca2+-Konzentration im Cytosol kontrolliert.

Wirkung von Ca2+:

Page 60: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Gluconeogenese 56

7.4.4. Aktivierungskaskade zum Glykogenstoffwechsel

Aktive Formen sind unterstrichen. Die Reaktionsfolge bis zur Aktivierung der Protein-Kinase ist in beiden Mechanismen gleich. Die Protein-Kinase inaktiviert außerdem die Glykogen-Synthase durch Phosphorylierung. Durch die Aktivierungskaskade kommt es zu einer gut 100fachen Verstärkung des Hormonsignals.

1.) Hormone wie Adrenalin und Glucagon binden an Rezeptoren in der Plasmamembran der

Zielzelle (→ Konformationsänderung) und lösen die Aktivierung der Adenylat-Cyclase aus. 2.) Die Adenylat-Cyclase in der Plasmamembran katalysiert die Bildung von cAMP. 3.) Der erhöhte intrazelluläre cAMP-Spiegel aktiviert eine Protein-Kinase. 4.) Die Protein-Kinase phosphoryliert sowohl Phosphorylase-Kinase als auch die Glykogen-

Synthase.

7.5. Gluconeogenese

Die Gluconeogenese ist die Glucosesynthese aus Nicht-Kohlenhydrat-Vorstufen. Dieser Vorgang ist bei einer Hungerperiode oder extremer körperlicher Belastung von Bedeutung, wenn benötigte Glucose nicht durch den Abbau von Glykogen bereitgestellt werden kann. In der Gluconeogenese entsteht Glucose aus Pyruvat. Der Ablauf entspricht dabei mit drei Ausnahmen dem umgekehrten Weg der Glykolyse:

Page 61: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Gluconeogenese 57

1.) Phosphoenolpyruvat wird aus Pyruvat über Oxalacetat gebildet Glykolyse: PEP + ADP → Pyruvat + ATP Gluconeogenese: Pyruvat + CO2 + ATP → Oxalacetat + ADP + Pi

(Pyruvat- Carboxylase) Oxalacetat + GTP → PEP + GDP + CO2

(PEP-Carboxykinase)

2.) Fructose-6-phosphat entsteht durch Hydrolyse von Fructose-1,6-bisphosphat Glykolyse: Fructose-6-phosphat + ATP → Fructose-1,6-bisphosphat + ADP Gluconeogenese: Fructose-1,6-bisphosphat + H2O → Fructose-6-phosphat + Pi

(Fructose-1,6-bisphosphatase) 3.) Glucose entsteht durch Hydrolyse von Glucose-6-phosphat Glykolyse: Glucose + ATP → Glucose-6-phosphat Gluconeogenese: Glucose-6-phosphat + H2O → Glucose + Pi

(Glucose-6-phosphatase)

7.5.1. Enzymatische Unterschiede zwischen Glykolyse und Gluconeogenese

Glykolyse Gluconeogenese Hexokinase Glucose-6-phosphatase Phosphofructokinase Fructose-6-bisphosphatase Pyruvat-Kinase Pyruvat-Carboxylase Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase

Pyruvat-Carboxylase (PC) enthält eine kovalent gebundene prosthetische Gruppe, das Biotin (Struktur siehe Coenzyme), das als Carrier von aktiviertem CO2 dient. Biotin wird nicht carboxyliert, wenn kein Acetyl-CoA vorhanden ist, d. h. PC wird durch Acetyl-CoA allosterisch aktiviert. Glucose-6-phosphatase ermöglicht den Austritt der Glucose aus der Zelle in die Blutbahn, da normalerweise Glucose-6-phosphat nicht aus den Zellen heraus diffundieren kann. Sie ist für die Gluconeogenese essentiell.

Page 62: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Der Citratzyklus 58

7.6. Der Citratzyklus

Kondensation von Oxalacetat und Acetyl-CoA: Der Kreislauf beginnt mit der Bildung von Citrat. Die Reaktion ist eine Aldolkondensation mit nachfolgender Hydrolyse.

Isomerisierung von Citrat zu Isocitrat: Um eine oxidative Decarboxylierung zu ermöglichen, muß Citrat zu Isocitrat isomerisiert werden. Dies wird durch eine Dehydratisierung und anschließende Hydratisierung erreicht.

oxidative Decarboxylierung von Isocitrat: Bei diesem Schritt wird NADH gebildet!

HO H

L-

HC

Page 63: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Der Citratzyklus 59

2-Oxoglutarat zu Succinyl-CoA: analog Pyruvat zu Acetyl-CoA; weitere Schritte analog β-Oxidation der Fettsäuren

7.6.1. Citrat-Malat-Shuttle

Viele Stoffwechselvorgänge laufen im Cytosol ab, während andere - z. B. die β-Oxidation oder der Citratzyklus - in den Mitochondrien stattfinden. Wichtigstes Substrat der Mitochondrien aus dem Kohlenhydrat-Stoffwechsel ist Pyruvat, das ohne Schwierigkeiten in die Mitochondrien gelangt und dort oxidativ zum Acetyl-CoA decarboxyliert wird. Diese oxidative Decarboxylierung ist gleichzeitig eine Schlüsselreaktion bei der Umwandlung von Kohlenhydrat in Fett. Da aber die Fettsäuresynthese extramitochondrial erfolgt, muß die "aktivierte Essigsäure" (Acetyl-CoA) wieder herausgeschleust werden. Dies geschieht durch Kondensation mit Oxalacetat zu Citrat; Citrat verläßt die Mitochondrien und wird im Cytosol durch ATP-Citrat-Lyase wieder in Acetyl-CoA und Oxalacetat gespalten. Das Oxalacetat wird wieder zu Malat reduziert, welches die Mitochondrienmembran passiert. Der Trans-port von Citrat ist mit dem von Malat gekoppelt: Pro Mol ausgeschleustes Citrat wird 1 mol Malat in die Mitochondrien hineintransportiert.

ATP

ADP + Pi

Page 64: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Oxidative Phosphorylierung und Atmung 60

7.7. Oxidative Phosphorylierung und Atmung

Atmung: Ein ATP-erzeugender Prozeß, bei dem im Rahmen einer Elektronentransportkette eine anorganische Verbindung (etwa O2) als letzter Elektronenakzeptor fungiert. Der Donator kann sowohl eine organische als auch eine anorganische Verbindung sein.

Die freie Energie der Oxidation: Die treibende Kraft der oxidativen Phosphorylierung ist das Elektronenübertragungspotential des NADH oder des FADH2 gegenüber O2.

Die relevanten Teilreaktionen lauten: ½ O2 + 2 H+ + 2 e- → H2O E'0 = +0,82 V NAD+ + H+ + 2 e- → NADH E'0 = -0.32 V ½ O2 + H+ + NADH H2O + NAD+ ∆E'0 = +1,14 V

∆G'0 = -53 kcal/mol

7.7.1. Elektronen-Carrier der Atmungskette

Die Pfeile bedeuten Elektronenübertragung:

Komplex I: Komplex III: NADH-Q-Reduktase Cytochrom-c-Reduktase (NADH-Dehydrogenase, Flavoprotein N) (Cytochrom c1b) Blockierung durch Rotenon o. Amytal Blockierung durch

Antimycin A

Komplex II: Komplex IV: Succinat-Q-Reductase Cytochrom-c-Oxidase (Flavoprotein S) (Cytochrom a + a3)

Blockierung durch Cyanid Die Elektronen werden von der NADH-Q-Reduktase auf Cytochrom-c-Reduktase durch Ubichinon (Coenzym Q) übertragen. Dieses Chinon überträgt auch Elektronen vom FADH2. Von der Reduktase werden die Elektronen dann über das Protein Cytochrom c zur Cytochrom-c-Oxidase übertragen.

Lokalisation in der Membran:

Die Komplexe der Atmungskette als Protonenpumpen: Die Koplexe I, III und IV übertragen Elektronen innerhalb der Membran und pumpen in gekoppelten Prozessen Protonen durch die Membran von innen nach außen.

Page 65: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Oxidative Phosphorylierung und Atmung 61

7.7.2. Glycerinphosphat-Shuttle

Die innere Mitochondrienmembran ist für NADH und NAD+ vollständig undurchlässig. Das bei der Glykolyse gebildete NADH muß aber für den weiteren Ablauf der Glykolyse wieder zu NAD+ regeneriert werden. Dies erfolgt durch Transport von Elektronen des NADH (nicht des NADH selbst!) in die innere Mitochondrienmembran. Überträger dafür sind Glycerin-3-phosphat und Dihydroxyaceton-Phosphat (DHAP): 1.) Elektronentransport vom NADH zum DHAP und

Bildung von Glycerin-3-phosphat 2.) Diffusion zur inneren Mitochondrienmembran 3.) Oxidation zu DHAP durch FAD 4.) Rück-Diffusion von DHAP in das Cytosol Netto-Reaktion: NADH + H+ + E-FAD → NAD+ + E-FADH2

(Cytosol) (Mitochondrien) (Cytosol) (Mitochondrien) Ein weiteres Transportsystem verwendet Malat und Aspartat, für die es spezielle Transportsysteme in der inneren Mitochondrienmembran gibt:

7.7.3. Chemiosmotische Hypothese von MITCHELL

Nach MITCHELL wird über die Schaffung eines elektrochemischen Gradienten (mit H+-Ionen) quer zur inneren Mitochondrienmembran der Energiefluß vom Elektronentransport zur ATP-Gewinnung gekoppelt. Vor dieser Hypothese ging man von einem Modell mit einem chemischen Zwischenprodukt aus, welches aber nie isoliert werden konnte.

7.7.4. Oxidative Phosphorylierung (ATP-Synthese)

Die bei der Glykolyse, der Fettsäureoxidation und im Citratzyklus entstehenden NADH und FADH2 sind energiereiche Moleküle. Bei der Übertragung ihrer Elektronen auf molekularen Sauerstoff wird sehr viel Energie frei, die zur Bildung von ATP verwendet werden kann (NADH: 3 ATP; FADH2: 2 ATP).

Atmung: Die in Stufen ablaufende Übertragung der Elektronen vom NADH oder FADH2 zum Sauerstoff führt dazu, daß Protonen aus der mitochondrialen Matrix herausgepumpt werden. Dabei wird eine

Page 66: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Der Pentosephosphatweg 62

protonenmotorische Kraft (proton motive force, pmf) erzeugt, die sich aus einem pH-Gradienten und einem elektrischen Potential über die Membran zusammensetzt.

ATP-Synthese: Diese pmf wird nun von der ATP-Synthase ausgenutzt, die wieder H+-Ionen in die Mitochondrien läßt und dabei ATP aufbaut. Der dafür notwendige Enzymkomplex besteht aus zwei Einheiten: 1.) F1: ATPase 2.) FO: geregelter Protonenkanal Oxidation und Phosphorylierung sind also über einen Protonengradienten an der inneren Mitochondrien-membran gekoppelt.

7.7.5. Entkopplung der Atmung von der oxidativen Phosphorylierung

Entkoppler transportieren Protonen in die Mitochondrien, wodurch keine ATP-Synthese mehr stattfindet, da kein Protonengradient mehr vorhanden ist.

künstlich: Durch 2,4-Dinitrophenol. Eignet sich zu Stoffwechseluntersuchungen.

natürlich: Durch Thermogenin (uncoupling Protein). Die natürliche Entkopplung ist ein Mechanismus zur Wärmeerzeugung, welchen Winterschlaf haltende Tiere, einige neugeborenen Tiere (auch Babys) und kälteangepaßte Tiere zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur nutzen. Das braune Fettgewebe ist für diese Thermogenese spezialisiert. Das Thermogenin bildet einen Nebenweg für den Protonenfluß vom Cytosol zur Matrix, bildet also einen Kurzschluß. Aronstabgewächse bilden auf diesem Weg Wärme zur Erzeugung eines faulen Geruchs, um Insekten anzulocken.

7.7.6. Definition des Atmungsquotienten (respiratorischer Quotient)

mol CO2 (die entstehen) RQ =

mol O2 (die verbraucht werden)

Beispiel-RQs: Glucose = 1 / Fette = 0,71 / Protein = 0,8

7.7.7. ATP-Bilanz für Glucose

Glykolyse Gewinn von 2 ATP Gewinn von 2 NADH 2 FADH2 4 ATP

(Substratketten-Phosphorylierung) (oxidative Phosphorylierung)

'Pvruvat-Dehvdrogenase Gewinn von 2 NADH 6 ATP " Citrat-Zyklus Gewinn von 6 NADH 18 ATP

Gewinn von 2 FADH2 4 ATP " "

Gewinn von 2 ATP (Substratketten- Phosphorylierung) 36 ATP

7.8. Der Pentosephosphatweg

Im Pentosephosphatweg entsteht NADPH bei der Oxidation von Glucose-6-phosphat zu Ribose-5-phosphat:

Glucose-6-phosphat + 2 NADP+ + H2O → Ribose-5-phosphat + 2 NADPH + 2 H+ + CO2

Page 67: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Der Pentosephosphatweg 63

7.8.1. Verwertung von Glucose-6-phosphat

Die Art der Verwertung hängt vom Bedarf an NADPH, Ribose-5-phosphat und ATP ab.

1.) Es wird mehr Ribose-5-phosphat als NADPH benötigt: Durch die Glykolyse wird das meiste Glucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat (GA-3-P) umgewandelt. Transaldolase und Transketolase überführen dann zwei Moleküle Fructose-6-phosphat und ein Molekül GA-3-P in drei Moleküle Ribose-5-phosphat.

5 Glucose-6-phosphat + ATP → 6 Ribose-5-phosphat + ADP + Pi

2.) Der Bedarf an Ribose-5-phosphat und NADPH ist ungefähr gleich: Die vorherrschende Reaktion ist die Bildung von zwei NADPH und einem Ribose-5-phosphat durch den oxidativen Zweig des Pentosephosphatzyklus.

Glucose-6-phosphat + 2 NADP+ → Ribose-5-phosphat + 2 NADPH + 2H+ + CO2

3.) Es wird mehr NADPH als Ribose-5-phosphat benötigt: Glucose-6-phosphat wird vollständig zu CO2 oxidiert: Gesamtreaktion:

Glucose-6-phosphat + 12 NADP+ → 12 NADPH + 12 H+ + 6 CO2 + Pi

1.) Bildung von Ribose-5-P und NADPH im oxidativen Zweig 2.) Umwandlung von Ribulose-5-P in Fructose-6-P und GA-3-P durch Transaldolase

und Transketolase 3.) Resynthese von Glucose-6-P durch die Gluconeogenese

7.8.2. Mechanismus der Transketolase

Transketolase enthält ein fest gebundenes Thiaminpyrophosphat (TPP) als prosthetische Gruppe (siehe auch Decarboxylierung und Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex). Bei dem katalytischen Mechanismus wird eine aktivierte Aldehydeinheit auf einen Akzeptor übertragen. Der Akzeptor in der Transketolasereaktion ist eine Aldose, der in der Pyruvat-Dehydrogenase-Reaktion jedoch ein Liponamid.

Xylulose-5-phosphat + Ribose-5-phosphat → GA-3-P + Sedoheptulose-7-phosphat

oder Xylulose-5-phosphat + Erythrose-4-phosphat → GA-3-P + Fructose-6-phosphat

Page 68: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Der Pentosephosphatweg 64

Bildung der Additionsverbindung:

Bildung des aktivierten Glykolaldehyds:

Kondensation mit einem Aldehydakzeptor und Bildung einer neuen Ketose:

7.8.3. Mechanismus der Transaldolase

Transaldolase überträgt eine Dihydroxyaceton-Einheit von einem Ketosedonator (Sedoheptulose-7-P) auf einen Aldoseakzeptor (GA-3-P). Sie enthält keine prosthetische Gruppe.

Sedoheptulose-7-phosphat + GA-3-P → Erythrose-4-phosphat + Fructose-6-phosphat

Bildung einer Schiff-Base durch Lysin-Rest des Enzyms und Carbonylgruppe:

R1

R1

R1

R2

R2

R2

Page 69: Vorlesungsskript Biochemie I

Kohlenstoff-Stoffwechsel Der Pentosephosphatweg 65

Freisetzung der Aldose:

Addition von Aldosesubstrat:

Freisetzung der Ketose:

Page 70: Vorlesungsskript Biochemie I

Der Fettsäurestoffwechsel Fettsäureabbau 66

8. Der Fettsäurestoffwechsel

Aufgaben der Fettsäuren: • Bausteine von Phospholipiden und Glykolipiden • Hormone und intrazelluläre Signalmoleküle • Brennstoffmoleküle

Sie werden als Neutralfette (Triacylglycerine, Triglyceride) im Cytosol der Fettzellen gespeichert. Palmitinsäure Stearinsäure Ölsäure

8.1. Fettsäureabbau

FRANZ KNOOP lieferte 1904 einen entscheidenden Beitrag zur Aufklärung der Fettsäureoxidation. Er verfütterte geradkettige Phenyl-Fettsäuren an Hunde und untersuchte im Anschluß den Urin. Ergebnis: • Bei der Fütterung mit geradzahligen Fettsäuren (n = 1, 3, 5 …) entstand immer Phenylessigsäure • Bei der Fütterung mit ungradzahligen Fettsäuren (n = 2, 4, 6 …) entstand immer Benzoesäure.

geradzahlig:

ungeradzahlig: → der Abbau der Kette geschieht in C2-Schritten

8.1.1. Hydrolyse von Triacylglycerinen durch cAMP-gesteuerte Lipasen:

Ausgangspunkt der Fettverwertung zur Energiegewinnung ist die Hydrolyse der Triacylglycerine.

Triacylglycerin + 3 H2O

Adrenalin, Glucagon und ACTH stimulieren die Adenylat-Cyclase der Fettzellen, wodurch cAMP gebildet wird, welches die Proteinkinase A stimuliert. Diese stimuliert durch Phosphorylierung die Lipasen, welche die Esterbindungen spalten.

Page 71: Vorlesungsskript Biochemie I

Der Fettsäurestoffwechsel Fettsäureabbau 67

8.1.2. Aktivierung der Fettsäuren durch CoA:

Vor der Oxidation der Fettsäuren werden diese in der äußeren Mitochondrienmembran an Coenzym A gebunden. Die Reaktion läuft in zwei Schritten ab:

In Acyladenylat ist der Acylrest über den Phosphorsäurerest des AMP gebunden (gemischtes Anhydrid).

8.1.3. Transport in die Matrix der Mitochondrien durch Carnitin:

Da die Acyl-CoA-Moleküle nicht ohne weiteres die Membran passieren können, ist ein besonderer Transportmechanismus erforderlich. Dieser erfolgt mit Carnitin: Übertragung der Acyl-Gruppe von Acyl-CoA auf das Carnitin:

Acylcarnitin wird dann von einer Translokase durch die innere Mitochondrienmembran geschleust. Auf der Matrixseite wird die Acyl-Gruppe wieder auf CoA übertragen. Carnitin wird dann im Austausch mit einem Acylcarnitin wieder in das Cytoplasma transportiert.

8.1.4. β-Oxidation

Ein gesättigtes Acyl-CoA wird durch eine immer wiederkehrende Sequenz von vier Reaktionen abgebaut: • Oxidation unter Beteiligung von FAD • Wasseranlagerung • Oxidation unter Beteiligung von NAD+ • Thiolyse durch CoA

+

Page 72: Vorlesungsskript Biochemie I

Der Fettsäurestoffwechsel Ketonkörper entstehen bei vorherrschendem Fettabbau 68

8.1.5. Oxidation ungesättigter Fettsäuren

Zum Abbau von ungesättigten Fettsäuren sind zwei zusätzliche Enzyme - eine Isomerase und eine Epimerase - erforderlich. Die Oxidation der Palmitoleinsäure (C16-Fettsäure / cis-∆9) verläuft in den drei ersten Abbauzyklen normal. Das in der dritten Runde entstehende cis-∆3-Enoyl-CoA verhindert aber nun durch seine Doppelbindung die Ausbildung einer weiteren Doppelbindung bei der Spaltung. Eine Isomerase wandelt diese Doppelbindung in eine trans-∆2-Doppelbindung um. Die so entstandene Verbindung entspricht dem regulären Substrat und wird weiter abgebaut.

Der Abbau mehrfach ungesättigter Fettsäuren erfordert noch eine weitere Umwandlung. Eine mehrfach ungesättigte aktivierte C18-Fettsäure mit cis-∆6 und cis-∆9-Doppelbindungen wird bis zum cis-∆2-Enoyl-CoA abgebaut. Dann hydratisiert Enoylhydratase das entstandene cis-Enoyl-CoA (das gleiche Enzym, das trans-∆2-Doppelbindungen bei gesättigten Fettsäuren hydratisiert). Dabei entsteht jedoch D-Hydroxyacyl-CoA, das nicht weiter abgebaut werden kann. Dieses Hindernis beseitigt eine Epimerase, welche das D-Hydroxyacyl-CoA zu L-Hydroxyacyl-CoA umwandelt (Konfigurationsumkehr).

8.1.6. Abbau ungeradzahliger Fettsäuren

Ungeradzahlige Fettsäuren werden in der gleichen Weise abgebaut wie die geradzahligen mit dem Unterschied, daß in der letzten Abbaurunde statt zwei Molekülen Acetyl-CoA je ein Molekül Propionyl-CoA und Acetyl-CoA entstehen. Die aktivierte C3-Einheit des Propionyl-CoA tritt nach Umwandlung in Succinyl-CoA in den Citrat-Zyklus ein.

8.2. Ketonkörper entstehen bei vorherrschendem Fettabbau

Ist der Fett- und Kohlenhydratabbau in einem ausgewogenen Verhältnis, so tritt das in der β-Oxidation entstandene Acetyl-CoA in den Citratzyklus ein. Sind jedoch Kohlenhydrate nicht verfügbar, d. h. überwiegt der Fettabbau, so ist kein Oxalacetat für den Citratzyklus vorhanden und das Acetyl-CoA wird zur Bildung von Acetoacetat, D-3-Hydroxybutyrat und Aceton verwendet. Diese drei Verbindungen bezeichnet man auch als Ketonkörper.

H

C C H

H H

A

oA

1.) Kondensation zweier Acetyl-CoA unter Bildung von Acetoacetyl-CoA 2.) Dies reagiert mit Wasser und Acetyl-CoA zu 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-

CoA (HMG-CoA) und CoA 3.) Spaltung von HMG-CoA zu Acetyl-CoA und Acetoacetat

Page 73: Vorlesungsskript Biochemie I

Der Fettsäurestoffwechsel Fettsäure-Synthese 69

8.3. Fettsäure-Synthese

Unterschiede zum Fettsäure-Abbau durch β-Oxidation: 1.) Die Synthese erfolgt im Cytosol; dagegen läuft der Abbau in den Mitochondrien 2.) Bindung der Zwischenstufe an die Sulfhydrylgruppe eines Acyl-Carrier-Proteins (ACP); beim

Abbau findet die Bindung mit Coenzym A statt 3.) Verwendung von D-Hydroxyacyl-CoA; im Abbau Verwendung von L-Hydroxyacyl-CoA 4.) Synthese wird durch einen Multienzymkomplex (Fettsäure-Synthase) katalysiert; beim Abbau

sind die entsprechenden Enzyme nicht assoziiert 5.) Verlängerung der Kette durch Addition von C2-Einheiten aus Malonyl-CoA statt aus Acetyl-CoA 6.) NADPH als Reduktionsmittel 7.) Maximale durch die Fettsäure-Synthase gebildete Fettsäurekette ist Palmitat (C16); eine weitere

Verlängerung und das Einführen von Doppelbindungen durch andere Enzyme

Bildung von Malonyl-CoA (Carboxylierung): Späterer Verlust von CO2 (irreversible Reaktion) ist der treibende Schritt (committed step) in der Fettsäuresynthese.

Die Reaktion verläuft mit dem Coenzym Biotin in einem sog. Ping-Pong-Mechanismus. d. h. daß ein oder mehrere Produkte freigesetzt werden, bevor alle Substrate gebunden sind.

Acyl-Carrier-Protein (ACP): Die Zwischenprodukte der Fettsäure-synthese werden an ein ACP gebunden.

Page 74: Vorlesungsskript Biochemie I

Aminosäureabbau und Harnstoffzyklus Transaminierung 70

9. Aminosäureabbau und Harnstoffzyklus

Überschüssige Aminosäuren, die nicht zur Synthese von Proteinen verwendet werden, lassen sich nicht speichern. Sie werden auch nicht ausgeschieden, sondern dienen im Stoffwechsel als Brenn-stoffe. Die α-Aminogruppe wird entfernt und das Kohlenstoffskelett in Stoffwechselzwischen-produkte überführt. (Acetyl-CoA, Acetoacetyl-CoA, Pyruvat, Oxalacetat)

Der Abbau der Aminosäuren findet hauptsächlich in der Leber statt. Dabei wird zunächst im Rah-men der Transaminierung die Aminogruppe auf α-Ketoglutarat oder Oxalacetat übertragen, wobei Glutamat entsteht. Dieses wird dann oxidativ desaminiert und liefert so NH4+. Weitere Verarbeitung von NH4+:

- Harnsäure (Vögel / Reptilien) "uricotelisch" - NH3 (Fische) "ammonotelisch" - Harnstoff (übrige landlebende Vertebraten) "ureotelisch"

9.1. Transaminierung

Die Aminogruppen werden von Transaminasen auf deren prosthetische Gruppe, das Pyridoxalphosphat, übertragen.

− Pyridoxalphosphat ist im Enzym als Schiff'sche Base an E-NH2 (Lys) gebunden − Ebenso in Glykogen-Phosphorylase, aber dort dient Pyridoxalphosphat als Säure-Base-

Katalysator

+

Page 75: Vorlesungsskript Biochemie I

Aminosäureabbau und Harnstoffzyklus Oxidative Desaminierung 71

9.2. Oxidative Desaminierung

Während bei der Transaminierung die Aminogruppe gebunden bleibt, wird der Stickstoff bei der Desaminierung in Form von Ammoniak frei. Dessen Entgiftungsprodukt ist bei Landwirbeltieren Harnstoff.

9.3. Der Harnstoffzyklus

Im Harnstoff-Zyklus wird Harnstoff synthetisiert. Das benötigte Carbamoylphosphat wird aus CO2, NH4+ und einem Mol ATP als P-Donator gebildet. Dadurch wird ein weiteres Mol ATP verbraucht (→ insgesamt 2 ADP + 1 Pi)

Arginino-succinat

Page 76: Vorlesungsskript Biochemie I

Biosynthese von Makromolekülen Tetrahydrofolat als C1-Überträger 72

10. Biosynthese von Makromolekülen

10.1. Tetrahydrofolat als C1-Überträger

Die Bindung der C1-Einheit erfolgt am N5- oder N10-Stickstoffatom oder an beiden. Es dient z B. bei der Purin- oder Pyrimidin-Biosynthese als CH3-Donator. Von Tetrahydrofolat transportierte Gruppen: maximal reduziert -CH3 Methyl- mittel (=Formaldehyd) -CH2- Methylen- maximal oxidiert -CHO Formyl- -CHNH Formimino- -CH= Methenyl-

Tetrahydrofolat (THF)

Formiat + ATP

Page 77: Vorlesungsskript Biochemie I

Biosynthese von Makromolekülen Zyklus der aktivierten Methylgruppe 73

10.2. Zyklus der aktivierten Methylgruppe

Da Tetrahydrofolat für die meisten biochemischen Methylierungen ein zu geringes Gruppenübertra-gungspotential besitzt, dient als direkter Methylgruppendonator das S-Adenosylmethionin. Das Coenzym, das in einigen Organismen die Methylgruppenübertragung auf Homocystein vermittelt, ist das Vitamin B12 (Methylcobalamin).

10.3. Purin-Biosynthese

Der Purinring wird aus einer Vielzahl von Vorstufen zusammengesetzt. Daran beteiligt sind:

Aktivierung der Ribose:

Page 78: Vorlesungsskript Biochemie I

Biosynthese von Makromolekülen Purin-Biosynthese 74

NH2

Inosin-Monophosphat (IMP)

Bildung von Inosinat (IMP)

Bildung von AMP und GMP aus IMP:

Page 79: Vorlesungsskript Biochemie I

Biosynthese von Makromolekülen Pyrimidin-Biosynthese 75

AMP, GMP und IMP als Feedback-Inhibitoren:

10.4. Pyrimidin-Biosynthese

Auch hier dient PRPP als Donor des Ribosephosphates. Die Bausteine des Pyrimidinringes sind Carbamoylphosphat und Aspartat.

Bildung von Carbamoylphosphat: Glutamin + 2 ATP + HCO3- → Carbamoylphosphat + 2 ADP + Pi + Glutamat

Transfer von Carbamoylphosphat auf Aspartat durch Aspartat-Transcarbamoylase:

Bildung von Orotidin-Monophosphat (OMP):

Umwandlung von UMP zu UTP. anschließende Aminierung zu CTP:

IMP Xanthylat GMP

GMP

IMP Adenylosuccinat AMP

AMP

Ribose-5-Phosphat PRPP Phosphoribosylamin IMP

IMP, AMP, GMP IMP, AMP, GMP

Page 80: Vorlesungsskript Biochemie I

Biosynthese von Makromolekülen Abbau der Purine 76

10.5. Abbau der Purine

1. Weg: • Desaminierung von AMP zu IMP • Hydrolytische Spaltung in Nucleoside (Inosin) • Phosphorolytische Spaltung

→ entstehendes Ribose-1-P wird zu Ribose-5-P isomerisiert, das als Substrat zur PRPP-Synthese dient

2. Weg: • Abspaltung einer Phosphatgruppe vom AMP zu Adenosin • Desaminierung zu Inosin • Hydrolytische Abspaltung der Ribose • Oxidation zu Xanthin und anschließend zu Harnsäure

+ bei nicht zu den Primaten gehörenden Säugetieren Weiterverarbeitung zu Allantoin + bei nicht-Säugern Abbau zu NH4+ und CO2

Nicht mehr bei Primaten:

Bei Nicht-Säugern:

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Biosynthese von Makromolekülen NAD-Biosynthese 77

10.6. NAD-Biosynthese

10.7. Synthese von Sphingolipiden und Gangliosiden

Kondensation von Palmitoyl-CoA und Serin, Umwandlung zu Sphingosin:

Reaktion mit Acyl-CoA zu Ceramid: Im Sphingomyelin tritt als Substituent Phosphorylcholin auf, das aus CDP-Cholin stammt.

Bei den Gangliosiden dienen die Oligosaccharidketten als Membranrezeptoren. Störungen des Gangliosidabbaus können ernste Konsequenzen haben. Bei der Tay-Sachs-Krankheit werden die Symptome sichtbar. Es findet dabei kein Abbau von N-Acetyl-Galactosamin statt, da eine Gangliosidase fehlt.

OH

Palmitoyl-CoA

Page 82: Vorlesungsskript Biochemie I

Biosynthese von Makromolekülen Biosynthese von Phospholipiden 78

10.8. Biosynthese von Phospholipiden

In tierischen Geweben kann Phosphatidylcholin (PC) auf zwei Wegen synthetisiert werden.

1. Direkte Methylierung durch S-Adenosylmethionin • Bildung von Phosphatidsäure aus Glycerin-3-P • Aktivierung durch CTP • Abspaltung vom CMP, Anlagerung von Serin • Decarboxylierung, dreifache Methylierung

2. Aktivierung von Cholin: • Phosphorylierung von Cholin • Aktivierung durch CTP • Abspaltung vom CMP, Anlagerung von Diacylglycerin

Page 83: Vorlesungsskript Biochemie I

Biosynthese von Makromolekülen Cholesterin-Synthese 79

10.9. Cholesterin-Synthese

Alle 27 C-Atome des Cholesterins stammen aus Acetyl-CoA.

Bildung von Mevalonat:

Phosphorylierung zu Isopentenylpyrophosphat:

Isomerisierung:

Bildung von Squalen:

2

Page 84: Vorlesungsskript Biochemie I

Biosynthese von Makromolekülen Cholesterin-Synthese 80

Bildung von Cholesterin:

Page 85: Vorlesungsskript Biochemie I

Photosynthese Lichtreaktion 81

11. Photosynthese

Ort der Photosynthese: Chloroplasten der grünen Pflanzen; sie stellen nach der Endosymbiontenhypothese eingewanderte Bakterien dar (ähnlich wie die Mitochondrien) und beinhalten Grana mit der Thylakoid-Membran.

Ablauf der Photosynthese: 1.) Lichtreaktion: Absorption von Lichtenergie durch Chlorophylle in der

Thylakoidmembran. → Bildung von NADPH, ATP, Wasserspaltung und O2-Freisetzung

2.) Dunkelreaktion: CO2-Assimilation, dabei ATP- und NADPH-Verbrauch → Bildung von Kohlenhydraten

11.1. Lichtreaktion

Struktur von Chlorophyll: R = CH3 Chlorophyll a

= CHO Chlorophyll b

Absorptionsspektren: Chlorophyll a und b haben unterschiedliche Absorptionsspektren, die sich in weiten Teilen aber ergänzen.

n H2O + n CO2 (CH2O)n + n O2

H2C

Granum

Page 86: Vorlesungsskript Biochemie I

Photosynthese Lichtreaktion 82

Antennenpigmente: "flash"-Bestrahlung zeigt, daß die Photosynthese schon bei 1/2500 Chlorophyll-Anregung gesättigt ist. Die Lichtenergie wird von vielen Pigmenten (nicht nur Chlorophyll) gesammelt und einem Reaktionszentrum (RZ) zugeführt (z. B. P680, "P" = Pigment), welches dann angeregt wird.

Photosystem I und II: Bei der Untersuchung der Photosyntheseleistung in bezug auf die Wellenlänge des verwendeten Lichts fand man, daß die Quantenausbeute bei einer Bestrahlung mit λ > 680 nm drastisch abnahm, obwohl noch bei λ = 700 nm eine Absorption stattfand. Bei gleichzeitiger Einstrahlung von Licht mit λ = 680 nm und λ = 700 nm ergab sich eine erhebliche Steigerung der Photosynthese im Vergleich zu den jeweils einzelnen Wellenlängen. Daher schließt man auf zwei unterschiedliche Reaktionszentren (P680 und P700).

PS I: • P700 • Lichtabsorption (max) bei λ - 700 nm • Chlorophyll a

PS II: • P680 • Lichtabsorption (max) bei λ = 680 nm • Chlorophyll a und b

Page 87: Vorlesungsskript Biochemie I

Photosynthese Lichtreaktion 83

Elektronentransportkette der Photosynthese

Plastochinon: ● Struktur siehe Kap. 2.2.1 ● PQb (fest gebunden) PQl (löslich) ● Elektronenfluß vom PQl zum P700 generiert H+-Gradient über die Thyla-

koidmembran! → ATP-Synthese durch Abbau des Gradienten mit CF1-CFO-ATPase

Plastocyanin (PC): ● Cu-Protein mit 2 His, einem Met und einem Cys als Liganden Ferredoxin: ● Fe—S—Protein

Cyclische Photophosphorylierung: Ohne NADPH-Bildung fließen Elektronen vom Ferredoxin über Cyt bf → PC auf P700 zurück; dabei wird ein H+-Gradient errichtet, der zur ATP-Synthese genutzt wird.

Protonen-gradient Photon 2

Doppelpfeile: e -Transfer

Photon 1

Cyt bf

Page 88: Vorlesungsskript Biochemie I

Photosynthese Dunkelreaktion 84

11.2. Dunkelreaktion

CO2-Fixierung: Ein Schlüsselenzym der Dunkelreaktion ist die Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase).

Calvin-Zyklus:

Enzyme: Zwischenstufen: 1 Rubisco Ru-l,5-BP Ribulose-1,5-bisphosphat 2 Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase 3-PG 3-Phosphoglycerat 3 Aldolase GA-3-P Glycerinaldehyd-3-phosphat 4 Transketolase 1,6-F-BP Fructose-1,6-bisphosphat 5 Fructosebisphosphatase DHAP Dihydroxyacetonphosphat 6 Sedoheptulosebisphosphatase E-4-P Erythrose-4-phosphat 7 Phosphopentose-Epimerase S-l,7-P Sedoheptulose-1,7-BP 8 Ribosephosphat-Isomerase R-5-P Ribose-5-P 9 Phosphoribulokinase X-5-P Xylulose-5-P