Was, bitte, bedeutet GroEL?

Prof. Dr. Eva Kathrin SinnerJohannes Gutenberg Universität Mainz

Proteinbiochemie SS2010

Was sagt der „Karlson“?

• „Eine gesonderte Klasse der Chaperone sind die Chaperonine

• Diese oligomeren Proteine bilden eine zylindrische Struktur, in deren Innerem die ungefalteten proteinebinden,m vor Aggregation geschützt und unter ATpAufwand in ihre native Konformation Überführt werden.

• Chaperonine kommen in Eukaryonten und prokaryontenvor und zwar GroEL und GroES in Prokaryonten und deren eukaryonte Homologe (HSP 60 HSP 10) in endosymbiotisch entstandenen Organellen, Mitochondrien und Chloroplasten vor)“

GroEL gehört zu den Chaperoninen…

• Chaperon: aus dem Französischen: die „Anstandsdame“ (der Proteinfaltung)

DENN: haben Proteine im zustand ihrer Entstehung unkontrollierten „Kontakt“ zu anderen Proteinspezies, könnten sie aggregieren…

• Kurz: ein Chaperonin ist ein Protein, das hilft, die Faltung anderer Proteine aufrechtzuerhalten, bzw. diese davor bewahrt, zu aggregieren und damit nicht mehr zu funktionieren.

Chaperonine

• GroEL wird bei der Synthese von schätzungsweise einem Drittel aller mittelgroßen (30–60 kDa) Bakterienproteine benötigt.

Ein ungefaltetes Protein bindet in Inneren des Hohlraums, der durch die Untereinheiten des Chaperons GroEL gebildet wird, indem vermutlich die hydrophoben Anteile des Proteins (die ja normalerweise im Inneren liegen würden), erkannt werden.

www.chemgapedia.de

Was ist jetzt aber GroEL (für ein Chaperonin)?

Chaperonin aus E. Coli aus der Gruppe der Hsp60, Auf und Seitenansicht.H. Wegele; L. Muller; J. Buchner: Hsp70 and Hsp90 - a

relay team for protein folding. Rev Physiol. Biochem. Pharmacol. 151. 2004, 1-44 (Springer Verlag).

Struktur und Aufbau von GroEL

Unter ATP-Verbrauch werden fehlerhafte intramolekulare Interaktionen gelöst und so eine Neufaltung des Proteins ermöglicht.

GroES beeinflusst die Faltungsaktivität von GroEL, indem es die ATPase-Aktivität reguliert.

Ohne gebundenes Substratprotein wird diese ATPase durch GroESinhibiert.

Hypothetischer Weg eines Proteins durch GroEL

Vertikaler Schnitt durch das Funktionsmodell des GroEL-GroES-Faltungskäfigs: A. Die apikalen Domänen (a) besitzen hydrophobe Bindestellen für unvollständig gefaltete Proteine (blaue Bereiche). B. Ein solches Fehlerhaftes Proteinsubstrat dockt an dem Faltungskäfig an. C. Eine GroES-Einheit bindet an das Ende des GroEL-Zylinders und schließt das Substrat ein. Die hydrophoben Bereiche werden dabei zurückgezogen. Das Proteinsubstrat gelangt in eine hydrophile "Kammer". Es verbirgt daraufhin seine hydrophoben Bereiche und erreicht so den richtig gefalteten Zustand. Nach etwa 15 Sekunden öffnet sich der Deckel des Käfigs und das fertige Protein (orange) kann entweichen.

U.Hartl, MPIB

Weg der Proteinfaltung in einer Säugerzelle…

www.cobocards.com

Evolution und Proteinfaltung

Wiederholung: Proteinfaltung

• Sie erinnern sich: Ribosomen?• Sie erinnern sich: Primär – Sekundär –

Tertierstruktur von Proteinen?• Sie erinnern sich: FALTUNG?• Dann kennen Sie auch den Wirkungsort der

Chaperone.

Zitat: „Es ist eine der großen Herausforderungen der modernen Biologie, die Mechanismen zu entschlüsseln, durch die eine dem Ribosomentwachsende Polypeptidkette ihre dreidimensionale Struktur erreicht.“ (Daniel Klunker, MPIB, 2003)

Wiederholung: Aufbau von Proteinen

Die Peptidbindung - Bindungsgeometrie

Peptidbindung ist planar !!

Abbau von Proteinen durch Proteasen – Ubiquitinylierung als „Signal“

Chaperone und Proteasen bilden ein „Aktivitätsgleichgewicht“ in einer Zelle

Aminosäuren – Polypeptide - Proteine

H-Brücken Akzeptoren

H-Brücken Donoren

N-Terminus C-Terminus

Der Translokon Komplex

Modell des cotranslationalen Proteintransportes durch die ER-Membran in

Säugerzellen.

http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/meyer-hellmuth-alexander-2001-05-18/HTML/meyer-ch2.html

Genaues Prozedere• (1) Die Signalsequenz der wachsenden Polypeptidkette wird vom SRP

erkannt und gebunden. Gleichzeitig interagiert das SRP auch mit dem Ribosom, wodurch es zu einem Elongationsarrest kommt. (2)

• Der Komplex aus Ribosom, naszierender Polypeptidkette und SRP bindet an die ER-Membran, wobei das SRP mit seinem membranständigen Rezeptor und das Ribosom mit dem Sec61-Komplex interagiert. (3)

• Unter GTP-Hydrolyse wird die Signalsequenz vom SRP auf den Sec61-Komplex übertragen. Es erfolgt ein zweiter Signalsequenzerkennungsschritt durch den Sec61-Komplex. (4)

• Der Translokationskanal öffnet sich zum ER-Lumen. Der N-Terminus der naszierenden Kette liegt in einer Haarnadelkonformation vor, wobei der eine Teil der Schleife von der Signalsequenz und der andere Teil von den C-terminal nachfolgenden Abschnitten der Polypeptidkette gebildet wird. Die Signalsequenz interagiert dabei mit Sec61 , TRAMp und Membranlipiden. Durch die weitere Elongation der Polypeptidkette wird der C-terminaleBereich der Schleife durch die Membran geschoben. Die Signalsequenz wird dabei vom restlichen Protein durch den Signalpeptidase-Komplex (SP-Komplex) abgespalten. (5)

• Anschließend wird die restliche naszierende Polypeptidkette direkt durch den von Ribosom und Sec61-Komplex gebildeten Kanal ins Lumen des ER transportiert.

Die Tertiärstruktur ist die „funktionale“ Ebene….

• Zugabe von Detergenz und reduzierendem Agenz (Mercaptoethanol) im Rahmen von Proteinaufreinigung.

• Chaperone und Proteasen bilden ein „Aktivitätsgleichgewicht“ in einer Zelle

Proteinfaltung in Prokaryoten

U. Hartl MPI für Biochemie, Martinsried

Proteinfaltung in Prokaryoten

U. Hartl MPI für Biochemie, Martinsried

Hitzeschockproteine

• Hitzeschockproteine sind wichtige Bestandteile des Chaperonsystems

• Die verschiedenen Hitzeschockproteinfamilien sind untereinander sowohl von Funktion als auch von ihrer Struktur oder Genetik her nicht verwandt, innerhalb einer Familie gibt es aber signifikante Homologien. Auch zwischen verschiedenen Organismen können sie funktionell unterschiedlich sein.

Wiederholung

• Christian Anfinsen entdeckt in den 50/60ern, dass sich Proteine spontan nach dentaurierung zurückfalten können.

• ABER wie sieht es aus mit grösserenProteinen?

Levinthal Paradoxon:

Das Levinthal Paradoxon

Für ein Protein mit 100 AS und jeweils 3 Möglichkeiten für jeden Winkel an einer Peptidbindung (dihedral) ergäben sich 3200 mögliche Konformationen. Bei einer Proteinfaltungsgeschwindigkeit von 10 -15 sec würde es 1080 sec dauern, alle Möglichkeiten auszuprobieren, um die energetisch günstigste Konformation zu finden. Ein solcher Prozeßwürde das Alter des Universums um 60 Größenordnungen übersteigen.

Die Lösung:

Es gibt mehrere „Wege“ in dem Weg einer ungefalteten Proteinkette zum funktionsfähigen Protein – Eine Trichterform der Energieniveaus

Konkretes Besipiel für ein „mechanisches Beispiel in Proteinfaltung: GFP

Das gezielte Anlegen von Kraft an wohldefinierte Punkte an der Oberfläche des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) erlaubt es, zwischen zwei Entfaltungspfaden mit unterschiedlichen Entfaltungsintermediaten zu schalten. Einer dieser Pfade ist ein faltungsartiger Pfad, während der andere bei Importvorgängen eine Rolle spielen könnte. Das Bild zeigt die GFP-Energielandschaft mit Intermediaten und Reaktionswegen. Mechanische Kontrolle des Entfaltungspfades des grün fluoreszierenden Proteins (p 8314-8317)Morten Bertz, Andrea Kunfermann, Matthias RiefPublished Online: Sep 11 2008 4:23AMDOI: 10.1002/ange.200802987

Evolution der Chaperone

• Die Gene, die für HSPs codieren, sind stark konserviert. Viele sind in sämtlichen Spezies innerhalb der Eukarya, Bakteria und Archaea vertreten.

• Interessanterweise konnte festgestellt werden, dass im Laufe der Evolution komplexere Lebewesen auch eine größere Anzahl von Chaperonen aufweisen. So enthält beispielsweise die Hefe Saccharomyces cerevisiae 14 verschiedene Hsp70 Proteine, während das Bakterium E.coli lediglich zwei verschiedene Vertreter aufweist (Pahl et al. 1997). (Daniel Klunker)

Der WEG in Eukaryonten…..

Golgi; zentrale Fertigungs-, Sortier-, Versand- und Lagerabteilung einer Zelle.

Summer der Dictyosomen….

cis

trans

Medial region

Zusammenfassung: Weg der Proteinfaltung in einer Zelle…

Golgi complex, or dictyosome, isan organelle found in typicaleukaryotic cells. It was identifiedin 1898 by the Italian physicianCamillo Golgi and was namedafter him. The primary functionof the Golgi apparatus is to process and packagemacromolecules synthesised bythe cell, primarily proteins and lipids. The Golgi apparatusforms a part of theendomembrane system presentin eukaryotic cells.

Wikipedia.org

Der „secretory pathway“• Das ER bildet zusammen mit dem Golgi-Apparat, den Lysosomen, den

Endosomen und der Plasmamembran die Kompartimente des secretorypathway.

• Membranproteine und luminale Proteine dieser Kompartimente werden an der ER-Membran synthetisiert, wie auch Proteine, die aus der Zelle durch Sekretion abgegeben werden.

• Diese Proteine tragen meist aminoterminale Zielsequenzen, die als Signalsequenzen bezeichnet werden. Diese werden bei der Synthese im Cytosol von Signalerkennungspartikeln erkannt und mitsamt den translatierenden Ribosomen an die ER-Membran dirigiert. Dies ermöglicht einen kotranslationalen Transport der synthetisierten Polypeptidketten durch das Translokon.

• Bereits während dieses Transports in das ER werden meist die Signalpeptide durch Signalpeptidasen entfernt und die entstehenden Proteine glykolysiert, wobei Zuckerketten an Asparaginreste(NGlykosylierung) oder an Serin- oder Threoninreste (O-Glykosylierung) angehängt werden.

• Im ER-Lumen erfolgt dann die Faltung dieser Proteine durch luminaleChaperone.

Alberts, Lehrbuch der molekularen Zellbiologie, Wiley-VCH, 3. Aufl.,

Zusammenfassung

• Das Chaperonsystem ist ein Proteinfaltungssystem, GroEL ist ein prokaryotischer „Unterzweig“ dieses Systems.

• Qualitätskontrolle für Proteine (Zusammen mit dem Ubiquitin-Proteasom System)

• Damit werden proteine in einer Zelle vor Aggregation geschützt und unter ATP Verbrauch in die „Funktionsstruktur“ überführt.